發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及多種方法，這些方法包括液化步驟，用于從含淀粉材料產(chǎn)生乙醇，使用酵母將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為乙醇。本發(fā)明還涉及具有改進的將糖發(fā)酵為乙醇能力的酵母菌屬菌株，涉及用于生產(chǎn)具有改進的將糖發(fā)酵為乙醇能力的酵母菌屬菌株的方法，以及具有改進的將糖發(fā)酵為乙醇能力的酵母菌屬酵母菌株在乙醇生產(chǎn)中的用途。本發(fā)明還涉及用于從乙醇生產(chǎn)方法的后段使用本發(fā)明的酵母菌屬菌株回收/提取油的方法。最后，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的酵母菌屬酵母菌株和天然發(fā)生的和/或非天然發(fā)生的組分的組合物。對序列表的引用本申請包含一個計算機可讀形式的序列表。該計算機可讀形式通過引用結(jié)合在此。發(fā)明背景從含淀粉材料生產(chǎn)乙醇是本領(lǐng)域中熟知的。生產(chǎn)作為生物燃料的乙醇已經(jīng)成為了一大產(chǎn)業(yè)，其中2012年全世界生產(chǎn)了超過210億加侖的乙醇。工業(yè)上最常使用的商業(yè)方法，通常被稱作“傳統(tǒng)方法”，包括在高溫(約85℃)下典型地使用一種細菌α-淀粉酶液化糊化淀粉，隨后在葡糖淀粉酶和釀酒酵母的存在下厭氧進行同時糖化發(fā)酵。用于生產(chǎn)用作燃料的乙醇的酵母，如在玉米乙醇工業(yè)中，要求若干特性，以確保乙醇有效生產(chǎn)的成本。這些特性包括乙醇耐受性、低副產(chǎn)品產(chǎn)量、快速發(fā)酵、和限制殘留在發(fā)酵中的剩余糖量的能力。這些特性對工業(yè)方法的可行性具有明顯的作用。酵母菌屬的酵母表現(xiàn)出生產(chǎn)乙醇所需的許多特性。具體而言，釀酒酵母菌株在燃料乙醇工業(yè)中廣泛用于乙醇生產(chǎn)。釀酒酵母的菌株被廣泛用于燃料乙醇工業(yè)，具有在發(fā)現(xiàn)于，例如，玉米醪發(fā)酵中的發(fā)酵條件下生產(chǎn)高產(chǎn)量乙醇的能力。這種菌株的實例是在稱為ethanolredtm的可商購乙醇酵母產(chǎn)品中使用的酵母。將釀酒酵母的菌株用于燃料乙醇工業(yè)中來發(fā)酵糖如葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖，以通過糖酵解途徑來生產(chǎn)乙醇。這些糖從如下來源中獲得，如：玉米和其他谷物、糖汁、糖蜜、葡萄汁、果汁、和淀粉根菜類，并且可以包括將纖維素材料分解成葡萄糖。盡管目前用于燃料乙醇工業(yè)中的釀酒酵母的菌株非常適合乙醇生產(chǎn)，但是由于作為燃料的乙醇的需求量增加，和玉米的新菌株中可用性的增加，對乙醇生產(chǎn)的效率的改進存在越來越多的需求。因此，需要能夠改進工業(yè)規(guī)模發(fā)酵中乙醇生產(chǎn)的效率的酵母菌屬的新的菌株。與當前商業(yè)菌株(如，ethanolredtm)相比，還需要在發(fā)酵后減少乙醛水平的酵母菌屬的新菌株。此外，盡管在過去數(shù)十年乙醇生產(chǎn)方法有顯著的改進，但是仍然希望并需要提供可以提供更高乙醇產(chǎn)量的從含淀粉材料生產(chǎn)乙醇的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及使用酵母從含淀粉材料生產(chǎn)乙醇。在第一方面，本發(fā)明涉及從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用α-淀粉酶液化該含淀粉材料；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或發(fā)酵生物菌株，該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法，具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037(即，釀酒酵母mbg4851)的衍生物大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株，尤其是釀酒酵母，具有以下性質(zhì)和定義特性中的一種或多種，如所有：-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，增加乙醇產(chǎn)量；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，產(chǎn)生降低水平的乳酸；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，產(chǎn)生降低水平的甘油；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，降低了發(fā)酵中乙醛水平；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，增加油產(chǎn)量；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，具有更快的發(fā)酵動力學。在一個實施例中以及在本發(fā)明的一方面中，油是從發(fā)酵下游回收/提取的。該油回收/提取可以在本發(fā)明方法的后段進行，例如，在乙醇回收后，如從酒糟水和/或糖漿/蒸發(fā)的分離液中。回收可以，例如，通過提取，如己烷提取，或通過使用本領(lǐng)域中熟知的另外的油回收/提取技術(shù)進行。在一方面，本發(fā)明涉及用于從本發(fā)明乙醇生產(chǎn)方法中回收/提取油的方法，該方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用α-淀粉酶液化該含淀粉材料；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵。iv)回收該發(fā)酵產(chǎn)物以形成全酒糟；v)將該全酒糟分離為酒糟水和濕餅；vi)任選地將該酒糟水濃縮為漿料；其中油是從發(fā)酵步驟iii)下游回收/提取并且其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或發(fā)酵生物菌株，該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個實施例中，在糖化和/或發(fā)酵或ssf中添加蛋白酶。如實例40中所示，使用mbg4851增加油回收/提取并且當?shù)鞍酌?，具體而言金屬蛋白酶，存在或添加時，油回收/提取會進一步增加。步驟ii)和iii)可以依序或同時進行。在一個優(yōu)選實施例中，同時進行步驟ii)和iii)，即同時糖化發(fā)酵(ssf)。根據(jù)本發(fā)明的乙醇生產(chǎn)方法，步驟i)中的液化是通過使含淀粉材料處于高于初始糊化溫度的溫度下，典型地在80℃-90℃之間，使用α-淀粉酶來進行的。液化的ph優(yōu)選地是在4.5和6.0之間，如在4.8和5.8之間。α-淀粉酶的實例可以發(fā)現(xiàn)于下文的“液化過程中存在的和/或添加的α-淀粉酶”-部分中。在一個實施例中，該a-淀粉酶是熱穩(wěn)定性細菌α-淀粉酶。在一個優(yōu)選的實施例中，該α-淀粉酶來自芽胞桿菌屬，如嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的一種變體，如wo99/019467中的seqidno:3或在此的seqidno:1中所示的一種。適合的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體的實例可以在下文“熱穩(wěn)定性α-淀粉酶”部分中發(fā)現(xiàn)，并且包括來自具有以下突變的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體的下組中的一種：-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-i181*+g182*+n193f+v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；及-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用seqidno:1進行編號)。在ph4.5和5.5，0.12mmcacl2下，與參照α-淀粉酶(被截斷至約491個氨基酸的具有突變i181*+g182*+n193f的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶)相比，具有增加耐熱性的其他適合的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的實例可以在通過引用結(jié)合在此的wo2011/082425中發(fā)現(xiàn)。(還參見如下的實例1)步驟i)中的液化可以使用α-淀粉酶和蛋白酶的組合來進行。該蛋白酶可以是這樣一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值。適合的蛋白酶的實例描述于下文“液化過程中存在的和/或添加的蛋白酶”部分中。該蛋白酶可以是真菌來源的，如絲狀真菌來源的。適合的真菌蛋白酶的具體實例是從嗜熱子嚢菌屬的菌株衍生的金屬蛋白酶，優(yōu)選地金黃色嗜熱子囊菌的菌株，尤其是菌株金黃色嗜熱子囊菌cgmccno.0670，其被披露為wo2003/048353中披露為seqidno.2的成熟部分或wo2010/008841中seqidno:1的成熟部分或在此具有以下突變的seqidno:3：-d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+d142l；或-a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。其他適合的蛋白酶變體的實例可以發(fā)現(xiàn)于通過引用結(jié)合在此的wo2011/072191中(還參見以下實例2)。適合的蛋白酶還包括細菌蛋白酶。適合的細菌蛋白酶可以是從火球菌屬菌株，優(yōu)選地強烈火球菌菌株衍生。在一個優(yōu)選實施例中，蛋白酶是us6,358,726中的seqidno:1或在此的seqidno:13中示出的蛋白酶。在一個優(yōu)選的實施例中，在液化步驟i)中存在或添加0.5-50微克強烈火球菌蛋白酶/克ds，如1-5微克強烈火球菌蛋白酶/克ds，如約1.5或3微克強烈火球菌蛋白酶/克ds。在本發(fā)明的實施例中，將液化步驟i)中添加的α-淀粉酶和/或蛋白酶進一步與葡糖淀粉酶組合。因此，在液化步驟i)期間，還可以存在和/或添加葡糖淀粉酶。該葡糖淀粉酶優(yōu)選地是熱穩(wěn)定性的。這意味著在85℃，ph5.3下，該葡糖淀粉酶具有至少20％，如至少30％，優(yōu)選地至少35％的熱穩(wěn)定性，如在實例4(熱穩(wěn)定性)中描述進行測定。在一個實施例中，液化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶在ph5.0下具有至少90％，優(yōu)選地至少95％，優(yōu)選地至少97％的相對活性ph最佳值。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶在ph5.0下具有至少80％、至少85％、至少90％的ph穩(wěn)定性，如在實例4(ph最佳值)中描述進行測定。根據(jù)本發(fā)明，液化步驟i)中存在的和/或添加的適合的葡糖淀粉酶可以衍生自青霉屬菌株，尤其是披露為wo2011/127802中seqidno:2或在此的seqidno:9或14的草酸青霉菌的菌株。在一個優(yōu)選的實施例中，該葡糖淀粉酶是wo2011/127802中seqidno:2所示的、具有k79v取代(使用seqidno:14中所示成熟序列進行編號)的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，如wo2013/053801中所披露的變體。在一個優(yōu)選的實施例中，該草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有k79v取代(使用seqidno:14進行編號)，并且進一步具有以下各項之一：-p11f+t65a+q327f；-p2n+p4s+p11f+t65a+q327f(使用seqidno:14進行編號)。其他適合的草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體的實例可以發(fā)現(xiàn)于通過引用結(jié)合的wo2013/053801中(還參見以下實例15)。在一個實施例中，在液化中使用的葡糖淀粉酶，如草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體，具有在ph4.0下如實例15中所描述的確定為dsctd的至少70℃，優(yōu)選地至少75℃、如至少80℃、如至少81℃、如至少82℃、如至少83℃、如至少84℃、如至少85℃、如至少86℃、如至少87％、如至少88℃、如至少89℃、如至少90℃的耐熱性。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體)具有在ph4.0下如實例15中所描述的確定為dsctd的在70℃和95℃之間范圍內(nèi)的(如在80℃和90℃之間)耐熱性。在一個實施例中，在液化中使用的葡糖淀粉酶，如草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體，具有在ph4.8下如實例15中所描述的確定為dsctd的至少70℃，優(yōu)選地至少75℃、如至少80℃、如至少81℃、如至少82℃、如至少83℃、如至少84℃、如至少85℃、如至少86℃、如至少87％、如至少88℃、如至少89℃、如至少90℃、如至少91℃的耐熱性。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體)具有在ph4.8下如實例15中所描述的確定為dsctd的在70℃和95℃之間范圍內(nèi)的(如在80℃和90℃之間)耐熱性。在一個實施例中，液化中使用的葡糖淀粉酶，如草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體，具有如實例16中描述所確定的至少100％，如至少105％、如至少110％、如至少115％、如至少120％、如至少125％的殘余活性。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體)具有如實例16中所描述的確定為殘余活性的在100％和130％之間范圍內(nèi)的耐熱性。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，在液化期間，與α-淀粉酶、蛋白酶和/或葡糖淀粉酶組合，還可以存在支鏈淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明的方法，在糖化和/或發(fā)酵或同時糖化發(fā)酵中存在和/或添加葡糖淀粉酶。該葡糖淀粉酶可以與液化中使用的熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶相同。在一個實施例中，在糖化和/或發(fā)酵中存在和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌來源的，如絲狀真菌來源的。在一個優(yōu)選實施例中，葡糖淀粉酶源自曲霉屬的菌株，優(yōu)選黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉屬的菌株，優(yōu)選里氏木霉；或籃狀菌屬的菌株，優(yōu)選埃默森籃狀菌；或密孔菌屬的菌株；或粘褶菌屬的菌株，例如籬邊粘褶菌或密粘褶菌，或黑層孔屬的菌株。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶源自埃默森籃狀菌，如在此的seqidno:19所示的那種。在另一個實施例中，糖化和/或發(fā)酵中存在和/或添加的葡糖淀粉酶源自籬邊粘褶菌，如在此的seqidno:15所示的那種。在另一個實施例中，糖化和/或發(fā)酵中存在和/或添加的葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，如在此的seqidno:17所示的那種。在實施例中，該葡糖淀粉酶是wo2014/177546(通過引用結(jié)合于此)中所披露的密粘褶菌葡糖淀粉酶的變體，尤其是具有以下取代之一的變體：v59a；s95p；a121p；t119w；s95p+a121p；v59a+s95p；s95p+t119w；v59a+s95p+a121p；或s95p+t119w+a121p，尤其是s95p+a121p(使用在此的seqidno:17進行編號)。在一個優(yōu)選的實施例中，在糖化和/或發(fā)酵中，與α-淀粉酶和任選地蛋白酶組合，存在和/或添加葡糖淀粉酶。該α-淀粉酶可以是真菌或細菌來源。在糖化和/或發(fā)酵中，與葡糖淀粉酶組合，存在的和/或添加的α-淀粉酶可以源自根毛霉屬菌株，優(yōu)選地是微小根毛霉菌株，如wo2013/006756中seqidno:3所示的一種，如具有黑曲霉接頭和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的微小根毛霉α-淀粉酶雜合體，如在此的seqidno:16所示的那種。在一個優(yōu)選的實施例中，該α-淀粉酶源自微小根毛霉的菌株，優(yōu)選地是具有黑曲霉葡糖淀粉酶連接子和淀粉結(jié)合域(sbd)的，優(yōu)選地是披露為在此的seqidno:16的那種，優(yōu)選具有以下取代中的一個或多個：g128d、d143n，優(yōu)選g128d+d143n(使用seqidno:16進行編號)。在一個實施例中，在糖化和/或發(fā)酵或ssf中存在和/或添加蛋白酶。這導致了增加的乙醇產(chǎn)量。如，例如，在美國專利號5,231,017(通過引用結(jié)合于此)中所描述的，該蛋白酶可以，例如，是酸性真菌蛋白酶。根據(jù)本發(fā)明的方法，在糖化和/或發(fā)酵或ssf中還可以存在和/或添加蛋白酶，以改進油產(chǎn)量?？梢匀鐚嵗?0中所見，當添加蛋白酶(例如，實例40中所使用的蛋白酶x)時，該油產(chǎn)量增加。還可以使用其他蛋白酶。在一個實施例中，該蛋白酶時金屬蛋白酶，如源自嗜熱子嚢菌屬菌株的那種，如金黃色嗜熱子囊菌的菌株。當使用本發(fā)明的酵母菌株時，與使用ethanolredtm的相應的方法相比，該油產(chǎn)量甚至增加更多。這描述于實例40中。可商購蛋白酶產(chǎn)品包括來自丹麥諾維信公司(novozymesa/s,denmark)的olexatm。在一個實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶液化該含淀粉材料；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物具有以下性質(zhì)中的一種或多種，如所有：-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，增加乙醇產(chǎn)量；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，產(chǎn)生降低水平的乳酸；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，產(chǎn)生降低水平的甘油；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，降低了發(fā)酵中乙醛水平；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，增加油產(chǎn)量；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，具有更快的發(fā)酵動力學。在一個實施例中，該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)。在一個實施例中，該發(fā)酵生物是具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)的菌株。在本發(fā)明的實施例中，在糖化、發(fā)酵或同時糖化發(fā)酵(ssf)中存在和/或添加纖維素分解組合物。此類組合物的實例可以發(fā)現(xiàn)于以下“在糖化和/或發(fā)酵期間存在和/或添加的纖維素分解組合物”部分中。在一個優(yōu)選的實施例中，該纖維素分解組合物與葡糖淀粉酶一起存在和/或添加，如以下“在糖化和/或發(fā)酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶”部分中所披露的一種葡糖淀粉酶。第二方面提供了在布達佩斯條約下保藏的并且具有nmi登錄號v14/004037的酵母菌屬酵母菌株(釀酒酵母mbg4851)或具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)的菌株。第三方面提供了生產(chǎn)具有菌株v14/004037的定義特性的酵母屬菌株的方法，該方法包括：(a)提供：(i)第一酵母菌株；和(ii)第二酵母菌株，其中該第二酵母菌株是菌株v14/004037或菌株v14/004037的衍生物；(b)在允許組合第一酵母菌株和第二酵母菌株之間的dna的條件下，培養(yǎng)第一酵母菌株和第二酵母菌株；(c)篩選或選擇菌株v14/004037的衍生物；(d)任選地用從步驟(c)篩選或選擇的菌株作為第一和/或第二菌株重復步驟(b)和(c)，直到獲得顯示出菌株v14/004037的定義特性的衍生物。第四方面提供了由第三方面的方法產(chǎn)生的酵母菌屬菌株。第五方面提供了生產(chǎn)乙醇的方法，該方法包括用包括可發(fā)酵糖的底物在促進可發(fā)酵糖發(fā)酵生成乙醇的條件下孵育第二或第四方面的菌株。第六方面提供了第二或第四方面的菌株在乙醇生產(chǎn)中的用途。第七方面提供了生產(chǎn)蒸餾酒糟的方法，該方法包括：(a)用包括可發(fā)酵糖的底物在允許可發(fā)酵糖發(fā)酵生成乙醇和蒸餾酒糟的條件下，孵育第二或第四方面的酵母菌屬菌株；(b)分離該蒸餾酒糟。第八方面提供了由第七方面的方法產(chǎn)生的蒸餾酒糟。第九方面提供了第二或第四方面的菌株在蒸餾酒糟生產(chǎn)中的用途。第十方面提供了第二或第四方面的菌株在生產(chǎn)顯示出菌株v14/004037的一種或多種定義特性的酵母菌屬菌株中的用途。第十一方面提供了包括第二或第四方面的酵母菌屬菌株的組合物。第十二方面提供了在第一方面的方法中使用第二或第四方面的酵母菌屬菌株的方法。在第十三方面中，本發(fā)明涉及菌株v14/004037(釀酒酵母mbg4851)或菌株v14/004037的衍生物在相同的方法條件下，與ethanolredtm相比，用于減少發(fā)酵中乙醛水平的用途。最后，本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的酵母菌屬酵母菌株(例如，mbg4851或其衍生物)和天然發(fā)生的和/或非天然發(fā)生的組分的組合物。附圖簡述圖1示出在用α-淀粉酶a液化的1l玉米醪發(fā)酵期間的乳酸滴度水平。圖2示出在用α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和0.0385μgeppfu/gds的共混物液化的1l玉米醪發(fā)酵期間的乳酸水平。圖3示出在發(fā)酵中甘油水平，在工業(yè)制備的α-淀粉酶a液化的玉米醪中比較mbg4851與ethanolredtm(er)。圖4示出在發(fā)酵中甘油水平，在工業(yè)制備的用α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和0.0385μgeppfu/gds的共混物液化的玉米醪中比較mbg4851與ethanolred(er)。圖5和6示出在玉米醪發(fā)酵20小時、44小時和50小時后，通過菌株v14/004037(黑色)和ethanolredtm(灰色)的乙醇生產(chǎn)(頂部)和葡萄糖消耗(底部)的圖。發(fā)明詳述本發(fā)明的方法在此方面，本發(fā)明涉及在包括液化、糖化和發(fā)酵的過程中從含淀粉材料生產(chǎn)乙醇。在發(fā)酵期間，通過酵母將在糖化期間產(chǎn)生的可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為乙醇。在第一方面，本發(fā)明涉及從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用α-淀粉酶液化該含淀粉材料；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種發(fā)酵生物菌株，該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。步驟ii)和iii)可以依序或同時(ssf)進行。在一個優(yōu)選的實施例中，步驟ii)和iii)同時(ssf)進行。在發(fā)酵期間添加的氮源一般，發(fā)酵生物體如酵母(包括釀酒酵母)需要充分的氮源用于增殖和發(fā)酵?？墒褂迷S多氮源，且這些氮源是本領(lǐng)域熟知的。根據(jù)本發(fā)明，該氮源可以是有機的，如尿素、ddg、濕濾餅(wetcake)或玉米醪(cornmash)，或無機的，如氨或氫氧化銨。在一個優(yōu)選的實施例中，該氮源是尿素。在本發(fā)明的一個實施例中，在糖化和/或發(fā)酵或ssf中可以添加少于3,000ppm，如少于2,000ppm、如少于1,000ppm、如少于800ppm、如少于600ppm、如少于500ppm、如少于400ppm、如少于300ppm、如少于200ppm、如少于100ppm氮源，尤其是尿素。在一個優(yōu)選的實施例中，在糖化和/或發(fā)酵或同時糖化發(fā)酵(ssf)中可以添加從100至600ppm的氮源，如尿素。在本發(fā)明的一個實施例中，在糖化和/或發(fā)酵或ssf中，沒有添加氮源，如尿素。諸位發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，當使用酵母菌屬mbg4851酵母時，與使用工業(yè)標準酵母ethanolredtm(er)相比，在發(fā)酵或ssf中，減少了添加補充的氮源(如尿素)的需要。例如，當在添加3μgpfus/gds液化的醪液中使用mbg4851時，不需要添加的尿素來發(fā)酵至干燥。此外，該mbg4851酵母比ethanolredtm酵母提供了乙醇產(chǎn)量的至少1％的增加。這點在以下實例中進行了描述。減少的所產(chǎn)生的乳酸諸位發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，當在液化的醪液中使用酵母菌屬mbg4851酵母時，在發(fā)酵期間獲得乳酸累積減少約15％-20％。這將幫助減少乙醇工廠經(jīng)歷的一些問題并且將增加乙醇產(chǎn)量。以下工作實例顯示出，當使用mbg4851酵母時，與使用工業(yè)標準酵母ethanolredtm(er)的發(fā)酵相比，不同α-淀粉酶液化的醪液的發(fā)酵在發(fā)酵結(jié)束時給出了較低乳酸。減少的甘油諸位發(fā)明人還出人意料地發(fā)現(xiàn)，與ethanolredtm(er)相比，用mbg4851酵母發(fā)酵導致減少的甘油水平。例如，當發(fā)酵中存在0至3,000ppm之間尿素時，在用α-淀粉酶液化的玉米醪54小時發(fā)酵后，將mbg4851與ethanolredtm(er)進行比較時，甘油水平減少了至少10％(參見實例31)。通常，以下工作實例顯示出，當使用mbg4851酵母時，與使用工業(yè)標準酵母ethanolredtm(er)的發(fā)酵相比，用不同α-淀粉酶制備的醪液的發(fā)酵在發(fā)酵結(jié)束時給出了較低的甘油水平。降低的乙醛水平諸位發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，與當在相同條件下用ethanolredtm(er)發(fā)酵時相比，用mbg4851酵母的發(fā)酵導致發(fā)酵中減少的乙醛水平。這使得降低高乙醛水平所需要的添加的化學品減少。以下實例39顯示出，與ethanolredtm(er)相比，當使用mbg4851時，在使用α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶液化的醪液中發(fā)現(xiàn)減少的乙醛累積。具體地，與ethanolredtm(er)相比，當使用mbg4851時，實例39顯示出乙醛水平下降52％。增加的油產(chǎn)量諸位發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，當與ethanolredtm(er)相比時，用mbg4851酵母發(fā)酵導致油產(chǎn)量的增加。當額外向發(fā)酵添加蛋白酶(如衍生自嗜熱子嚢菌屬菌株的金屬蛋白酶)時，產(chǎn)量甚至增加更多。因此，在本發(fā)明的一個實施例中，在糖化和/或發(fā)酵或ssf中添加蛋白酶。實例40顯示出，在玉米醪發(fā)酵期間，該油產(chǎn)量增加近20％。當添加蛋白酶時，與使用ethanolredtm的發(fā)酵(即，無蛋白酶)相比，觀察到了超過45％的增加。如果蛋白酶已經(jīng)存在，那么可以獲得多出約20％的油。液化步驟i)根據(jù)本發(fā)明的方法，步驟i)中的液化是通過使含淀粉材料處于高于初始糊化溫度的溫度下，經(jīng)受α-淀粉酶和任選地蛋白酶、和/或葡糖淀粉酶來進行。液化中還可以存在和/或添加其他酶如支鏈淀粉酶和植酸酶。液化步驟i)可以進行0.5-5小時，例如1-3小時，例如典型地約2小時。術(shù)語“初始糊化溫度”表示含淀粉材料糊化開始的最低溫度。通常，在水中加熱的淀粉在約50℃與75℃之間開始糊化；糊化的準確溫度依賴于具體的淀粉，并能夠由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。因此，初始糊化溫度可根據(jù)植物種類、植物種類的具體品種、以及生長條件而變化。在本發(fā)明的上下文中，給定的含淀粉材料的初始糊化溫度是使用古林斯坦(gorinstein)和李(lii)，1992，淀粉(starch/)44(12):461-466所描述的方法，使5％的淀粉顆粒喪失雙折射的溫度。根據(jù)本發(fā)明，液化典型地是在從70℃-100℃范圍內(nèi)的溫度下進行。在一個實施例中，液化中的溫度是在75℃-95℃之間，如在75℃-90℃之間，優(yōu)選地在80℃-90℃之間，如82℃-88℃，如約85℃。根據(jù)本發(fā)明，在步驟i)中的液化之前，可以進行蒸汽加壓蒸煮步驟。該噴射蒸煮可以在110℃-145℃之間，優(yōu)選120℃-140℃，例如125℃-135℃，優(yōu)選約130℃的溫度下進行約1-15分鐘，優(yōu)選進行約3-10分鐘，尤其是約5分鐘左右。液化期間ph可以是在4-7之間，如在ph4.5-6.5之間、如在ph5.0-6.5之間、如在ph5.0-6.0之間、如在ph5.2-6.2之間、如在5.2之間、如約5.4、如約5.6、如約5.8。在一個實施例中，本發(fā)明的方法在步驟i)之前進一步包括以下步驟：a)優(yōu)選地通過干式碾磨來減小含淀粉材料的粒度；b)形成一種包含該含淀粉材料和水的漿料。該含淀粉起始材料(如全谷物)可以例如經(jīng)過碾磨減少粒度，以便展開結(jié)構(gòu)、增大表面積并且允許進一步加工。通常，存在以下兩種類型的方法：濕式和干式碾磨。在干式碾磨中，整個谷粒被碾磨并且使用。濕式碾磨使胚芽與粗粉(淀粉顆粒和蛋白質(zhì))良好分離。濕式碾磨時常應用于在例如糖漿的生產(chǎn)中使用淀粉水解產(chǎn)物的，場所。干磨和濕磨在淀粉加工領(lǐng)域都是眾所周知的。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選干式碾磨。在一個實施例中，該粒度被減小至0.05至3.0mm、優(yōu)選0.1-0.5mm之間，或使得至少30％、優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少70％、甚至更優(yōu)選至少90％的含淀粉材料適合通過一個具有0.05至3.0mm篩網(wǎng)、優(yōu)選0.1-0.5mm篩網(wǎng)的篩子。在另一個實施例中，至少50％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，尤其是至少90％的含淀粉材料適合通過一個具有#6篩網(wǎng)的篩子。該水性漿料可以包含含淀粉材料的從10w/w-％-55w/w-％干固體(ds)，優(yōu)選25w/w-％-45w/w-％干固體(ds)，更優(yōu)選30w/w-％-40w/w-％干固體(ds)。最初，可以將α-淀粉酶，任選地蛋白酶，任選地葡糖淀粉酶添加到水性漿料中來開始液化(稀釋)。在一個實施例中，這些酶中僅有一部分(例如，約1/3)被添加到該水性漿料中，而這些酶中的剩余部分(例如，約2/3)在液化步驟i)過程中添加。α-淀粉酶的實例的非窮盡列表可以發(fā)現(xiàn)于下文的“液化期間存在的和/或添加的α-淀粉酶”-部分中。在一個實施例中，該a-淀粉酶是細菌α-淀粉酶。細菌α-淀粉酶典型地是熱穩(wěn)定性的。在一個優(yōu)選的實施例中，該α-淀粉酶來自芽胞桿菌屬，如嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的一種變體，如wo99/019467中的seqidno:3或在此的seqidno:1中所示的那種。在一個實施例中，與參照α-淀粉酶(具有突變i181*+g182*、任選地具有n193f取代、截短至約491個氨基酸，即，從480-495個氨基酸的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(使用在此的seqidno:1進行編號))相比，通過在ph4.5和5.5下以及在溫度75℃和85℃下用0.12mmcacl2進行參照α-淀粉酶和變體孵育，隨后使用底物(超級淀粉酶測定試劑盒，e33651，分子探針公司(molecularprobes))進行殘余活性確定所確定的，該α-淀粉酶具有改進的穩(wěn)定性。這描述于實例1中。適合的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體的實例可以在下文“熱穩(wěn)定性α-淀粉酶”部分中發(fā)現(xiàn)，并且包括來自具有以下突變的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體的下組中的一種：-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-i181*+g182*+n193f+v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；及-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用seqidno:1進行編號)。在ph4.5和5.5，0.12mmcacl2下，與參照α-淀粉酶(被截斷至491個氨基酸的具有突變i181*+g182*+n193f的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶)相比，具有增加耐熱性的其他適合的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的實例可以在通過引用結(jié)合在此的wo2011/082425中。(還參見如下的實例1)根據(jù)本發(fā)明的方法，步驟i)中的液化可以使用α-淀粉酶和蛋白酶的組合來進行。該蛋白酶可以是一種蛋白酶，該蛋白酶具有如實例1中描述所確定的(相對活性)確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值。適合的蛋白酶的實例描述于下文“液化過程中存在的和/或添加的蛋白酶”部分中。該蛋白酶可以是真菌來源的，如絲狀真菌來源的。適合的真菌蛋白酶的具體實例是從嗜熱子嚢菌屬的菌株衍生的金屬蛋白酶，優(yōu)選地金黃色嗜熱子囊菌的菌株，尤其是菌株金黃色嗜熱子囊菌cgmccno.0670，其被披露為wo2003/048353中披露為seqidno.2的成熟部分或wo2010/008841中seqidno:1的成熟部分或在此具有以下突變的seqidno:3：-d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+d142l；或-a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。金黃色嗜熱子囊菌蛋白酶的適合變體的更多實例可以發(fā)現(xiàn)于通過引用結(jié)合于此的wo2011/072191中(還參見以下實例2)。適合的蛋白酶還包括細菌蛋白酶。適合的細菌蛋白酶可以是從火球菌屬菌株，優(yōu)選地強烈火球菌菌株衍生。在一個優(yōu)選實施例中，蛋白酶是us6,358,726中的seqidno:1或在此的seqidno:13中示出的蛋白酶。在本發(fā)明的實施例中，將液化步驟i)中添加的α-淀粉酶和/或蛋白酶進一步與葡糖淀粉酶組合。因此，在液化步驟i)期間，還可以存在或添加葡糖淀粉酶。該葡糖淀粉酶優(yōu)選地是熱穩(wěn)定性的。這意味著在85℃，ph5.3下，該葡糖淀粉酶具有至少20％，如至少30％，優(yōu)選地至少35％的熱穩(wěn)定性，如在實例4(熱穩(wěn)定性)中描述進行測定。在一個實施例中，液化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶在ph5.0下具有至少90％，優(yōu)選地至少95％，優(yōu)選地至少97％的相對活性ph最佳值。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶在ph5.0下具有至少80％、至少85％、至少90％的ph穩(wěn)定性，如在實例4(ph穩(wěn)定性)中描述進行測定。根據(jù)本發(fā)明，液化步驟i)中存在的和/或添加的適合的葡糖淀粉酶可以衍生自青霉屬菌株，尤其是披露為wo2011/127802中seqidno:2或在此的seqidno:9或14的草酸青霉菌的菌株。在一個優(yōu)選的實施例中，該葡糖淀粉酶是wo2011/127802中seqidno:2所示的、具有k79v取代(使用在此的seqidno:14中所示成熟序列進行編號)的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，如wo2013/053801中所披露的變體。在一個優(yōu)選的實施例中，該草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有k79v取代(使用seqidno:14進行編號)，并且進一步具有以下各項之一：-p11f+t65a+q327f；-p2n+p4s+p11f+t65a+q327f(使用seqidno:14進行編號)。其他適合的草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體的實例可以發(fā)現(xiàn)于通過引用結(jié)合的wo2013/053801中(還參見以下實例10-16，如表15中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體)。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，在液化期間，與α-淀粉酶、蛋白酶和/或葡糖淀粉酶組合，還可以存在支鏈淀粉酶。糖化與發(fā)酵在糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)或同時糖化發(fā)酵(ssf)中存在和/或添加葡糖淀粉酶。在糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)或同時糖化發(fā)酵(ssf)中添加的葡糖淀粉酶典型地不同于任選地在液化步驟i)中添加的葡糖淀粉酶。在一個優(yōu)選的實施例中，葡糖淀粉酶是與真菌α-淀粉酶一起添加的。葡糖淀粉酶的實例可以發(fā)現(xiàn)于下文的“在糖化和/或發(fā)酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶”-部分中。當依序進行糖化和發(fā)酵時，糖化步驟ii)可以在本領(lǐng)域中熟知的條件下進行。例如，糖化步驟ii)可以持續(xù)達從約24至約72小時。在一個實施例中，進行預糖化。預糖化在30℃-65℃之間，典型地是約60℃的溫度下典型地持續(xù)40-90分鐘。在一個實施例中，在同時糖化發(fā)酵(ssf)中，預糖化之后是發(fā)酵過程中的糖化。糖化典型地在從20℃-75℃、優(yōu)選地從40℃-70℃，典型地約60℃的溫度下并且在4與5之間的ph下、一般在約ph4.5下進行。同時糖化發(fā)酵(“ssf”)廣泛地用于工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)方法中，尤其是乙醇生產(chǎn)方法中。當進行ssf時，同時進行糖化步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)。不存在針對糖化的保持階段，意指一起添加發(fā)酵生物(例如酵母)以及一種或多種酶。然而，還考慮了分開添加發(fā)酵生物以及一種或多種酶。根據(jù)本發(fā)明，ssf可典型地在從25℃至40℃、如從28℃至35℃、如從30℃至34℃、優(yōu)選地約32℃的一個溫度下進行。在一個實施例中，發(fā)酵進行6至120小時，尤其是24至96小時。在一個實施例中，ph是在4-5之間。在本發(fā)明的實施例中，在糖化、發(fā)酵或同時糖化發(fā)酵(ssf)中存在和/或添加纖維素分解組合物。此類組合物的實例可以發(fā)現(xiàn)于以下“在糖化和/或發(fā)酵期間存在和/或添加的纖維素分解組合物”部分中。該纖維素分解組合物與葡糖淀粉酶一起存在和/或添加，如以下“在糖化和/或發(fā)酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶”部分中所披露的一種葡糖淀粉酶。含淀粉材料根據(jù)本發(fā)明，可使用任何合適的含淀粉材料。通?；谄谕陌l(fā)酵產(chǎn)物(在此是乙醇)來選擇起始材料。適合用于本發(fā)明的方法的含淀粉起始材料的實例包括谷類、塊莖或谷物。確切地，含淀粉材料可以是玉米、小麥、大麥、黑麥、買羅高粱、西米、木薯、木薯粉、高粱、燕麥、水稻、豌豆、豆類、或甘薯、或它們的混合物。還考慮了糯與非糯類型的玉米與大麥。在一個優(yōu)選實施例中，含淀粉起始材料是玉米。在一個優(yōu)選實施例中，含淀粉起始材料是小麥。在一個優(yōu)選實施例中，含淀粉起始材料是大麥。在一個優(yōu)選實施例中，含淀粉起始材料是黑麥。在一個優(yōu)選實施例中，含淀粉起始材料是買羅高粱。在一個優(yōu)選實施例中，含淀粉起始材料是西米。在一個優(yōu)選實施例中，含淀粉起始材料是木薯。在一個優(yōu)選實施例中，含淀粉起始材料是木薯粉。在一個優(yōu)選實施例中，含淀粉起始材料是高粱。在一個優(yōu)選實施例中，含淀粉起始材料是水稻，在一個優(yōu)選實施例中，含淀粉起始材料是豌豆。在一個優(yōu)選實施例中，含淀粉起始材料是豆類。在一個優(yōu)選實施例中，含淀粉起始材料是甘薯。在一個優(yōu)選實施例中，含淀粉起始材料是燕麥。發(fā)酵在發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基包括發(fā)酵底物，即被發(fā)酵生物代謝的碳水化合物源。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)酵培養(yǎng)基可以包括針對發(fā)酵生物的營養(yǎng)素和生長刺激劑。營養(yǎng)物和生長刺激物在發(fā)酵領(lǐng)域中廣泛使用，且包括氮源如氨；尿素，維生素和礦物質(zhì)，或其組合。發(fā)酵生物體在本發(fā)明的方法中使用釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種發(fā)酵生物菌株，該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851的大致一樣的性質(zhì)或釀酒酵母mbg4851的定義特性。在一個實施例中，該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851大致一樣的性質(zhì)，在相同方法條件下，與ethanolredtm(er)相比，因為它提供了增加的乙醇產(chǎn)量。在一個實施例中，該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851大致一樣的性質(zhì)，在同時糖化發(fā)酵(ssf)中不存在和/或添加尿素的相同條件下，與ethanolredtm(er)相比，因為它提供了增加的乙醇產(chǎn)量。在一個實施例中，具有與釀酒酵母mbg4851的大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株，在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，因為它產(chǎn)生了減少的乳酸水平。在一個實施例中，具有與釀酒酵母mbg4851的大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株，在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，因為它產(chǎn)生了減少的甘油水平。在一個實施例中，具有與釀酒酵母mbg4851的大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株，在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，減少了發(fā)酵中乙醛水平。在一個實施例中，具有與釀酒酵母mbg4851的大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株，在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，增加了油產(chǎn)量。在一個實施例中，具有與釀酒酵母mbg4851的大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株，在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，具有更快的發(fā)酵動力學。在一個實施例中，具有與釀酒酵母mbg4851的大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株具有以下性質(zhì)和定義特性中的一種或多種，如所有：-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，增加乙醇產(chǎn)量；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，產(chǎn)生降低水平的乳酸；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，產(chǎn)生降低水平的甘油；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，降低了發(fā)酵中乙醛水平；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，增加油產(chǎn)量；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，具有更快的發(fā)酵動力學。在本發(fā)明的一個實施例中，當使用實例19中所使用的方法設(shè)置和條件來確定時，具有與釀酒酵母mbg4851的大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株，在0ppm尿素下并且在3μgep/gds的蛋白酶pfu劑量(液化中添加的)下，提供了超過ethanolredtm(er)大于1.0％的乙醇產(chǎn)量提升，如在0ppm尿素下并且在1.5μgep/gds的pfu劑量下大于1.5％，如在0ppm尿素下并且在0.0385μgep/gds的蛋白酶pfu劑量下大于4.0％。在本發(fā)明的一個實施例中，當使用實例21中所使用的方法設(shè)置和條件來確定時，具有與釀酒酵母mbg4851的大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株，在300ppm的尿素水平下提供了超過ethanolredtm大于1.0％的乙醇產(chǎn)量提升，如在150ppm的尿素水平下大于3.0％，如在0ppm的尿素水平下大于10.0％。在本發(fā)明的一個實施例中，當使用實例23中所使用的方法設(shè)置和條件來確定時，具有與釀酒酵母mbg4851的大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株，在0ppm的尿素水平下并且在0.0385μg/gds的蛋白酶pfu劑量(液化中添加的)下，在54小時發(fā)酵中提供了超過ethanolred大于50％的乳酸減少，如在0ppm的尿素水平下并且在3μg/gds的蛋白酶pfu劑量下大于50％。在本發(fā)明的一個實施例中，當使用實例34中所使用的方法設(shè)置和條件來確定時，具有與釀酒酵母mbg4851的大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株在60小時發(fā)酵中提供了超過ethanolredtm(er)大于2.0％的甘油水平減少，如大于3.0％、如大于4.0％。在本發(fā)明的一個實施例中，當使用實例39中所使用的方法設(shè)置和條件來確定時，具有與釀酒酵母mbg4851的大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株，在54小時發(fā)酵中，提供了超過ethanolredtm(er)大于30％的乙醛水平減少，如大于40％、如大于50％。在本發(fā)明的一個實施例中，當使用實例40中所使用的方法設(shè)置和條件來確定時，具有與釀酒酵母mbg4851的性質(zhì)或其定義特性大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株，在64小時發(fā)酵后，提供超過ethanolredtm(er)大于10％的油產(chǎn)量的增加，如大于12％、如大于14％、如大于16％、如大于18％、如大于20％、如在10％-20％之間、如在10％-15％之間、如在15％-20％之間?；厥赵诎l(fā)酵(例如，ssf)后，可以將乙醇從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離?？梢哉麴s該漿料以回收/提取所希望的發(fā)酵產(chǎn)物(即，乙醇)。可替代地，可以通過微濾或膜過濾技術(shù)從發(fā)酵培養(yǎng)基中提取希望的發(fā)酵產(chǎn)物(即，乙醇)。還可以通過汽提或本領(lǐng)域中熟知的其他方法來回收發(fā)酵產(chǎn)物(即，乙醇)。在一個實施例中，本發(fā)明涉及從本發(fā)明乙醇生產(chǎn)方法中回收/提取油的方法，該方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用α-淀粉酶液化該含淀粉材料；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵。iv)回收該發(fā)酵產(chǎn)物以形成全酒糟；v)將該全酒糟分離為酒糟水和濕餅；vi)任選地將該酒糟水濃縮為漿料；其中油是從發(fā)酵步驟iii)下游回收/提取并且其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或發(fā)酵生物菌株，該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施例中，從酒糟水中回收/提取該油。在一個優(yōu)選的實施例中，從漿體/蒸發(fā)的分離液中回收/提取該油。在一個實施例中，在糖化和/或發(fā)酵或ssf中添加蛋白酶。在一個實施例中，本發(fā)明涉及從乙醇生產(chǎn)方法中回收/提取油的方法，該方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶；-任選地強烈火球菌蛋白酶；-任選地草酸青霉菌葡糖淀粉酶；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵。iv)回收該發(fā)酵產(chǎn)物以形成全酒糟；v)將該全酒糟分離為酒糟水和濕餅；vi)任選地將該酒糟水濃縮為漿料；其中油是從發(fā)酵步驟iii)下游回收/提取并且其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或發(fā)酵生物菌株，該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個實施例中，在糖化和/或發(fā)酵或ssf中添加蛋白酶。液化中存在的和/或添加的α-淀粉酶根據(jù)本發(fā)明，在液化中存在和/或添加α-淀粉酶，任選地與蛋白酶和/或葡糖淀粉酶、和/或任選的支鏈淀粉酶一起。在液化步驟i)中添加的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。優(yōu)選地是細菌α-淀粉酶，其在液化過程中使用的溫度下典型地是穩(wěn)定的。細菌α-淀粉酶術(shù)語“細菌α-淀粉酶”意指在ec3.2.1.1項下分類的任何細菌α-淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明使用的細菌α-淀粉酶可以例如來源于芽孢桿菌屬的菌株，芽孢桿菌屬有時也稱作土芽孢桿菌屬。在一個實施例中，該芽孢桿菌屬α-淀粉酶來源于解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌的菌株，但是也可以來源于其他芽孢桿菌屬物種。細菌α-淀粉酶的具體實例包括wo99/19467中的seqidno:3的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，wo99/1946中的seqidno:5的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶，以及wo99/19467中的seqidno:4的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶或在此的seqidno:21(所有序列都通過引用結(jié)合于此)。在實施例中，該α-淀粉酶可以是與wo99/19467中的seqidno:3、4或5所示的任何序列分別具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性程度的酶。在一個實施例中，該α-淀粉酶可以是一種與wo99/19467中的seqidno:3、或在此的seqidno:1所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性程度的酶。在優(yōu)選的實施例中，該α-淀粉酶來源自嗜熱脂肪芽孢桿菌。該嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶可以是成熟野生型或其成熟變體。該成熟嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶可以是在重組產(chǎn)生過程中天然地截短的。例如，該嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶可以是截短的，因此它具有約491個氨基酸，例如，因此它缺乏功能性淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(與wo99/19467中的seqidno:3比較)或在此的seqidno:1。該芽孢桿菌α-淀粉酶還可以是一種變體和/或雜合體。這樣一種變體的實例可以發(fā)現(xiàn)于以下任一項中：wo96/23873、wo96/23874、wo97/41213、wo99/19467、wo00/60059、以及wo02/10355(所有文獻都通過引用而特此結(jié)合)。具體的α-淀粉酶變體披露于美國專利號6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723中(通過引用而特此結(jié)合)并且包括具有以下改變的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(通常稱作bsgα-淀粉酶)變體：在位置r179、g180、i181和/或g182處的一個或兩個氨基酸的缺失，優(yōu)選披露于wo96/23873中的一種雙缺失–參見例如第20頁，第1-10行(通過引用而特此結(jié)合)，優(yōu)選與披露于wo99/19467的seqidno:3闡述的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比對應于位置i181和g182的缺失，或使用wo99/19467(該參考文獻通過引用而特此結(jié)合)中的seqidno:3或在此的seqidno:1進行編號的氨基酸r179和g180的缺失。甚至更優(yōu)選的是芽孢桿菌α-淀粉酶，尤其是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，它與披露于wo99/19467中的seqidno:3或在此的seqidno:1闡述的野生型bsgα-淀粉酶氨基酸序列相比具有對應于位置181和182的缺失的一種雙缺失并且進一步包括n193f取代(也被表示為i181*+g182*+n193f)。細菌α-淀粉酶還可以在對應于wo99/19467中的seqidno:4所示的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶或在此的seqidno:21、或wo99/19467中的seqidno:3的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的s242和/或e188p變體或在此的seqidno:1中的s239的位置處具有取代。在一個實施例中，該變體是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的s242a、e或q變體，優(yōu)選s242q變體(使用在此的seqidno:1進行編號)。在一個實施例中，該變體是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的e188變體，優(yōu)選e188p變體(使用在此的seqidno:1進行編號)。在一個實施例中，細菌α-淀粉酶可以是截短的芽胞桿菌屬α-淀粉酶。尤其地，截短是這樣的，例如，以使得wo99/19467中的seqidno:3或在此的seqidno:1中所示的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶是約491個氨基酸長，例如從480至495個氨基酸長，或者因此其缺乏功能性淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。細菌雜合α-淀粉酶該細菌α-淀粉酶可以是一種雜合細菌α-淀粉酶，例如一種包括地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(示于wo99/19467的seqidno:4中)的445個c末端氨基酸殘基和來源于解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶(示于wo99/19467的seqidno:5中)的37個n末端氨基酸殘基的α-淀粉酶。在一個優(yōu)選的實施例中，該雜合體具有下列取代中的一個或多個，尤其是全部：g48a+t49i+g107a+h156y+a181t+n190f+i201f+a209v+q264s(使用wo99/19467的seqidno:4中的地衣芽孢桿菌進行編號)或在此的seqidno:21。還優(yōu)選的是具有以下突變(或在其他芽孢桿菌α-淀粉酶中的對應突變)中的一個或多個的變體：h154y、a181t、n190f、a209v以及q264s和/或在位置176與179之間的兩個殘基的缺失，優(yōu)選e178和g179的缺失(使用wo99/19467的seqidno:5進行位置編號)。在一個實施例中，該細菌α-淀粉酶是嵌合α-淀粉酶的成熟部分，披露于理查森(richardson)等人(2002)，生化雜志(thejournalofbiologicalchemistry)，277卷，29期，7月19日發(fā)表，267501-26507頁中，稱作bd5088或其變體。這種α-淀粉酶與wo2007134207的seqidno:2所述的相同。成熟酶序列在位置1處的起始“met”氨基酸之后開始。熱穩(wěn)定性a-淀粉酶根據(jù)本發(fā)明，α-淀粉酶可以是一種熱穩(wěn)定性α-淀粉酶，例如一種熱穩(wěn)定性細菌α-淀粉酶，優(yōu)選來自嗜熱脂肪芽孢桿菌。在一個實施例中，如實例1中描述所確定的，根據(jù)本發(fā)明使用的α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少10的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少15的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少20的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少25的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少30的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少40的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少50的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少60的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有在10-70之間的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有在15-70之間的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有在20-70之間的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有在25-70之間的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有在30-70之間的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有在40-70之間的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有在50-70之間的t1/2(min)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有在60-70之間的t1/2(min)。在本發(fā)明的一個實施例中，α-淀粉酶是一種細菌α-淀粉酶，優(yōu)選來源于芽胞桿菌屬，尤其是嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種菌株，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌，如在wo99/019467中披露為seqidno:3(在此的seqidno:1)，其中在位置r179、g180、i181和/或g182處缺失一個或兩個氨基酸，特別是r179和g180缺失、或i181和g182缺失，具有如下突變列表中的突變。在優(yōu)選的實施例中，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶具有雙缺失i181+g182，以及任選的取代n193f，進一步包括選自以下列表的突變：在一個優(yōu)選的實施例中，該α-淀粉酶選自嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體的組：-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-i181*+g182*+n193f+v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；及-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)。應理解當提及嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶及其變體時，它們是以截短形式正常地生產(chǎn)的。特別地，截短是這樣的以使得wo99/19467中的seqidno:3或在此的seqidno:1中所示的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶或其變體在c-末端截短并且典型地是約491個氨基酸長，例如從480至495個氨基酸長，或這樣使得其缺乏功能性淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個優(yōu)選的實施例中，該α-淀粉酶變體可以是一種與wo99/19467中的seqidno:3、或在此的seqidno:1所示的序列具有至少60％，例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％一致性程度的酶。在一個實施例中，將該細菌α-淀粉酶，例如，芽胞桿菌屬α-淀粉酶，如尤其是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，或其變體，以在0.01-10knu-a/gds之間的濃度給出到液化中，例如，在0.02和5knu-a/gds之間，如0.03和3knu-a，優(yōu)選地0.04和2knu-a/gds，如尤其是0.01和2knu-a/gds。在一個實施例中，將該細菌α-淀粉酶，例如，芽胞桿菌屬α-淀粉酶，如尤其是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，或其變體，以在0.0001-1mgep(酶蛋白)/gds之間的濃度給出到液化中，例如，0.0005-0.5mgep/gds，如0.001-0.1mgep/gds。液化中存在的和/或添加的蛋白酶根據(jù)本發(fā)明，蛋白酶任選地與α-淀粉酶、和任選的葡糖淀粉酶、和/或支鏈淀粉酶一起存在和/或添加到液化中。蛋白酶根據(jù)其催化機制分為以下幾類：絲氨酸蛋白酶(s)、半胱氨酸蛋白酶(c)、天冬氨酸蛋白酶(a)、金屬蛋白酶(m)以及未知或還未分類的蛋白酶(u)，參見催化酶手冊(handbookofproteolyticenzymes)，巴雷特(a.j.barrett)，羅林斯(n.d.rawlings)，沃森納(j.f.woessner)(編)，學術(shù)出版社(1998)，尤其是概述部分。在一個優(yōu)選的實施例中，根據(jù)本發(fā)明使用的熱穩(wěn)定性蛋白酶是“金屬蛋白酶”，其被定義為屬于ec3.4.24(金屬內(nèi)肽酶)的蛋白酶；優(yōu)選ec3.4.24.39(酸性金屬蛋白酶)。為了確定給定的蛋白酶是否是金屬蛋白酶，參照上述“催化酶手冊”以及其中指定的原則?？梢詫λ蓄愋偷牡鞍酌高M行這樣的測定，而不論其是天然存在的或野生型蛋白酶；還是基因工程化的或合成的蛋白酶?？梢允褂萌魏芜m合的測定來測量蛋白酶活性，其中采用一種底物，該底物包括與所討論的蛋白酶的特異性相關(guān)的肽鍵。ph測定和溫度測定同樣適用于所討論的蛋白酶。測定ph值的實例是ph6、7、8、9、10或11。測定溫度的實例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、或80℃。蛋白酶底物的實例為酪蛋白，如azurine-crosslinkedcasein(azcl-酪蛋白)。在下文的“材料與方法”-部分中描述了兩種蛋白酶測定法，其中所謂的“azcl-酪蛋白測定法”是優(yōu)選的測定法。在一個實施例中，通過在“材料與方法”部分中描述的azcl-酪蛋白測定法確定的，該熱穩(wěn)定性蛋白酶具有蛋白酶196變體或蛋白酶pfu的至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％的蛋白酶活性。對于在本發(fā)明的方法中使用的蛋白酶的來源沒有限制，只要其滿足下文定義的熱穩(wěn)定性特性。在一個實施例中，該蛋白酶是真菌來源。該蛋白酶可以是，例如，野生型蛋白酶的一種變體，只要該蛋白酶具有在此定義的熱穩(wěn)定性特性。在一個優(yōu)選的實施例中，該熱穩(wěn)定性蛋白酶是如上定義的金屬蛋白酶的一種變體。在一個實施例中，在本發(fā)明的方法中使用的熱穩(wěn)定性蛋白酶是真菌來源，例如真菌金屬蛋白酶，例如來源于嗜熱子囊菌屬的菌株，優(yōu)選金黃色嗜熱子囊菌的菌株，尤其是金黃色嗜熱子囊菌cgmccno.0670(分類為ec3.4.24.39)。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性蛋白酶是披露于wo2003/048353中的seqidno:2所示的金屬蛋白酶的成熟部分的或wo2010/008841的seqidno:1以及在此的seqidno:3所示的成熟部分的變體，進一步具有選自以下列表的突變：-s5*+d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+a112p+t124v+d142l；-s5*+n26r+d79l+s87p+a112p+d142l；-n26r+t46r+d79l+s87p+a112p+d142l；-t46r+d79l+s87p+t116v+d142l；-d79l+p81r+s87p+a112p+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+s87p+a112p+t124v+a126v+d142l；-d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+d142l；-s38t+d79l+s87p+a112p+a126v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+a126v+d142l；-d79l+s87p+n98c+a112p+g135c+d142l；-d79l+s87p+a112p+d142l+t141c+m161c；-s36p+d79l+s87p+a112p+d142l；-a37p+d79l+s87p+a112p+d142l；-s49p+d79l+s87p+a112p+d142l；-s50p+d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+d104p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+a112p+d142l；-s70v+d79l+y82f+s87g+y97w+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+y97w+d104p+a112p+d142l；-s70v+d79l+y82f+s87g+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+a112p+a126v+d142l；-y82f+s87g+s70v+d79l+d104p+a112p+d142l；-y82f+s87g+d79l+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+y82f+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+y82f+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+d142l。在一個優(yōu)選的實施例中，熱穩(wěn)定性蛋白酶是披露為以下的金屬蛋白酶的變體:wo2003/048353中披露的seqidno:2的成熟部分或wo2010/008841中seqidno:1的成熟部分或在此的seqidno:3，具有以下突變：d79l+s87p+a112p+d142l；d79l+s87p+d142l；或a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。在一個實施例中，該蛋白酶變體與wo2003/048353中披露的seqidno:2的多肽的成熟部分或wo2010/008841中seqidno:1的成熟部分或在此的seqidno:3具有至少75％一致性，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少91％，更優(yōu)選至少92％，甚至更優(yōu)選至少93％，最優(yōu)選至少94％，并且甚至最優(yōu)選至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％一致性。該熱穩(wěn)定性蛋白酶還可以來源于任何細菌，只要該蛋白酶具有根據(jù)本發(fā)明定義的熱穩(wěn)定性特性。在一個實施例中，該熱穩(wěn)定性蛋白酶來源于火球菌屬的一種細菌菌株，例如強烈火球菌的一種菌株(pfu蛋白酶)。在一個實施例中，該蛋白酶是如美國專利號6,358,726-b1(寶酒造公司(takarashuzocompany))的seqidno:1、或在此的seqidno:13所示的一種。在另一個實施例中，該熱穩(wěn)定性蛋白酶是披露于此的seqidno:13或是與美國專利號6,358,726-b1中的seqidno:1或在此的seqidno:13具有至少80％一致性，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％一致性的一種蛋白酶。激烈熱球菌蛋白酶可以購買自日本寶酒造生物公司(takarabio,japan)。強烈火球菌蛋白酶是一種根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定性蛋白酶。發(fā)現(xiàn)商用產(chǎn)品強烈火球菌蛋白酶(pfus)在ph4.5下具有110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)的熱穩(wěn)定性，如實例2中所述的進行測定。在一個實施例中，在本發(fā)明方法中使用的熱穩(wěn)定性蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值，如實例2中所述的進行測定。在一個實施例中，蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的，超過30％、超過40％、超過50％、超過60％、超過70％、超過80％、超過90％、超過100％，例如超過105％，例如超過110％，例如超過115％，例如超過120％的熱穩(wěn)定性。在一個實施例中，蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的，在20％與50％之間，例如在20％與40％之間，例如20％與30％的熱穩(wěn)定性。在一個實施例中，蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的，在50％與115％之間，例如在50％與70％之間，例如在50％與60％之間，例如在100％與120％之間，例如在105％與115％之間的熱穩(wěn)定性。在一個實施例中，蛋白酶具有確定為在85℃/70℃下的相對活性的、超過10％的熱穩(wěn)定性值，如實例2中所述的進行測定。在一個實施例中，蛋白酶具有確定為在85℃/70℃下的相對活性的，超過10％，例如超過12％、超過14％、超過16％、超過18％、超過20％、超過30％、超過40％、超過50％、超過60％、超過70％、超過80％、超過90％、超過100％、超過110％的熱穩(wěn)定性。在一個實施例中，蛋白酶具有確定為在85℃/70℃下的相對活性的，在10％與50％之間，例如在10％與30％之間，例如在10％與25％之間的熱穩(wěn)定性。在一個實施例中，蛋白酶具有超過20％、超過30％、超過40％、超過50％、超過60％、超過70％、超過80％、超過90％的測定為在80℃下的殘余活性；和/或在一個實施例中，蛋白酶具有超過20％、超過30％、超過40％、超過50％、超過60％、超過70％、超過80％、超過90％的測定為在84℃下的殘余活性?！跋鄬钚浴币约啊皻堄嗷钚浴钡臏y定是如在實例2中描述的進行的。在一個實施例中，蛋白酶在85℃下可以具有高于90，例如高于100的熱穩(wěn)定性，如使用實例3中披露的zein-bca測定法確定的。在一個實施例中，蛋白酶在85℃下具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的熱穩(wěn)定性，如使用zein-bca測定法確定的。在一個實施例中，蛋白酶在85℃下具有在60-120之間，例如在70％-120％之間，例如在80％-120％之間，例如在90％-120％之間，例如在100％-120％之間，例如110％-120％的熱穩(wěn)定性，如使用zein-bca測定法確定的。在一個實施例中，通過azcl-酪蛋白測定法確定的，該熱穩(wěn)定性蛋白酶具有jtp196蛋白酶變體或蛋白酶pfu的至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％的活性。液化步驟i)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶根據(jù)本發(fā)明，葡糖淀粉酶可任選地存在于和/或添加到液化步驟i)中。在一個優(yōu)選的實施例中，該葡糖淀粉酶與α-淀粉酶和/或蛋白酶和/或支鏈淀粉酶一起或單獨添加。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶在85℃下具有至少20％、至少30％，優(yōu)選至少35％的相對活性熱穩(wěn)定性，如實例4(熱穩(wěn)定性)中描述的進行測定。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶，在ph5.0的ph最佳值下具有至少90％，優(yōu)選至少95％，優(yōu)選至少97％，例如100％的相對活性，如實例4(ph最佳值)中描述的進行測定。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶在ph5.0下具有至少80％、至少85％、至少90％的ph穩(wěn)定性，如在實例4(ph穩(wěn)定性)中描述進行測定。在一個實施例中，在液化中使用的葡糖淀粉酶，如草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體，具有在ph4.0下如實例15中所描述的確定為dsctd的至少70℃，優(yōu)選地至少75℃、如至少80℃、如至少81℃、如至少82℃、如至少83℃、如至少84℃、如至少85℃、如至少86℃、如至少87％、如至少88℃、如至少89℃、如至少90℃的耐熱性。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體)具有在ph4.0下如實例15中所描述的確定為dsctd的在70℃和95℃之間范圍內(nèi)的(如在80℃和90℃之間)耐熱性。在一個實施例中，在液化中使用的葡糖淀粉酶，如草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體，具有在ph4.8下如實例15中所描述的確定為dsctd的至少70℃，優(yōu)選地至少75℃、如至少80℃、如至少81℃、如至少82℃、如至少83℃、如至少84℃、如至少85℃、如至少86℃、如至少87％、如至少88℃、如至少89℃、如至少90℃、如至少91℃的耐熱性。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體)具有在ph4.8下如實例15中所描述的確定為dsctd的在70℃和95℃之間范圍內(nèi)的(如在80℃和90℃之間)耐熱性。在一個實施例中，液化中使用的葡糖淀粉酶，如草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體，具有如實例16中描述所確定的至少100％，如至少105％、如至少110％、如至少115％、如至少120％、如至少125％的殘余活性。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶(如草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體)具有如實例16中所描述的確定為殘余活性的在100％和130％之間范圍內(nèi)的耐熱性。在一個具體并優(yōu)選的實施例中，該葡糖淀粉酶，優(yōu)選真菌來源，優(yōu)選絲狀真菌，是來自青霉屬的一種菌株，尤其是草酸青霉菌的一種菌株，特別是在wo2011/127802(特此將其通過引用結(jié)合)中披露為seqidno:2的以及顯示于在此的seqidno:9或14中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶與wo2011/127802的seqidno:2中所示的成熟多肽或在此的seqidno:9或14具有至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少91％，更優(yōu)選至少92％，甚至更優(yōu)選至少93％，最優(yōu)選至少94％，并且甚至最優(yōu)選至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在一個優(yōu)選的實施例中，該葡糖淀粉酶是wo2011/127802中披露為seqidno:2以及顯示于在此的seqidno:9或14中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的一種變體，具有k79v取代(使用在此的seqidno:14中所示的成熟序列進行編號)。如披露wo2013/036526(將其特此通過引用結(jié)合)中的，該k79v葡糖淀粉酶變體相對于親本對蛋白酶降解具有降低的敏感度。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶源自草酸青霉菌。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶是wo2011/127802中披露為seqidno:2以及顯示于在此的seqidno:9或14中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的一種變體。在一個優(yōu)選的實施例中，該草酸青霉菌葡糖淀粉酶是wo2011/127802中披露為seqidno:2以及顯示于在此的seqidno:9或14中的，在位置79處具有val(v)(使用在此的seqidno:14進行編號)。考慮的草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體披露于wo2013/053801(特此將其通過引用結(jié)合)中。在一個實施例中，這些變體具有對蛋白酶降解的降低的敏感度。在一個實施例中，這些變體與親本相比具有改進的熱穩(wěn)定性。更具體地，在一個實施例中，該葡糖淀粉酶具有對應于pe001變體的k79v取代(使用在此的seqidno:14進行編號)，并且進一步包括至少一種以下取代或取代的組合：t65a；或q327f；或e501v；或y504t；或y504*；或t65a+q327f；或t65a+e501v；或t65a+y504t；或t65a+y504*；或q327f+e501v；或q327f+y504t；或q327f+y504*；或e501v+y504t；或e501v+y504*；或t65a+q327f+e501v；或t65a+q327f+y504t；或t65a+e501v+y504t；或q327f+e501v+y504t；或t65a+q327f+y504*；或t65a+e501v+y504*；或q327f+e501v+y504*；或t65a+q327f+e501v+y504t；或t65a+q327f+e501v+y504*；e501v+y504t；或t65a+k161s；或t65a+q405t；或t65a+q327w；或t65a+q327f；或t65a+q327y；或p11f+t65a+q327f；或r1k+d3w+k5q+g7v+n8s+t10k+p11s+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或r1e+d3n+p4g+g6r+g7a+n8a+t10d+p11d+t65a+q327f；或p11f+t65a+q327w；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或t65a+q327f+e501v+y504t；或t65a+s105p+q327w；或t65a+s105p+q327f；或t65a+q327w+s364p；或t65a+q327f+s364p；或t65a+s103n+q327f；或p2n+p4s+p11f+k34y+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+d445n+v447s；或p2n+p4s+p11f+t65a+i172v+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+n502*；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+n502t+p563s+k571e；或p2n+p4s+p11f+r31s+k33v+t65a+q327f+n564d+k571s；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s377t；或p2n+p4s+p11f+t65a+v325t+q327w；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+d445n+v447s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+i172v+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s377t+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+d26n+k34y+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+i375a+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k218a+k221d+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+s103n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+t10d+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+f12y+t65a+q327f+e501v+y504t；或k5a+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+t10e+e18n+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+t10e+e18n+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+t568n；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+k524t+g526a；或p2n+p4s+p11f+k34y+t65a+q327f+d445n+v447s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+r31s+k33v+t65a+q327f+d445n+v447s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+d26n+k34y+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+f80*+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k112s+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+t516p+k524t+g526a；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+n502t+y504*；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+s103n+q327f+e501v+y504t；或k5a+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+t516p+k524t+g526a；或p2n+p4s+p11f+t65a+v79a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+v79g+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+v79i+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+v79l+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+v79s+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+l72v+q327f+e501v+y504t；或s255n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+e74n+v79k+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+g220n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+y245n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q253n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+d279n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s359n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+d370n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+v460s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+v460t+p468t+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+t463n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s465n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+t477n+e501v+y504t。在一個優(yōu)選的實施例中，該草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體具有對應于pe001變體的k79v取代(使用在此的seqidno:14進行編號)，并且進一步包括以下突變中的一種：p11f+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p11f+t65a+q327w+e501v+y504t。該葡糖淀粉酶能以從0.1-100微克ep/g，例如0.5-50微克ep/g，例如1-25微克ep/g，例如2-12微克ep/gds的量添加。液化步驟i)中存在的和/或添加的支鏈淀粉酶任選地支鏈淀粉酶，連同α-淀粉酶和/或蛋白酶和/或葡糖淀粉酶可以是液化步驟i)期間存在的和/或添加的。如以上提及的，在液化步驟i)期間，還可以存在或添加葡糖淀粉酶。支鏈淀粉酶可以是在液化步驟i)和/或糖化步驟ii)或同時糖化發(fā)酵(ssf)中存在的和/或添加的。支鏈淀粉酶(e.c.3.2.1.41，支鏈淀粉6-葡聚糖-水解酶)是去分支酶，其特征在于它們在例如分支淀粉和支鏈淀粉中水解α-1,6-糖苷鍵的能力。根據(jù)本發(fā)明考慮的支鏈淀粉酶包括來自美國專利號4,560,651(特此通過引用結(jié)合)中披露的淀粉脫支芽孢桿菌(bacillusamyloderamificans)的支鏈淀粉酶、wo01/151620(特此通過引用結(jié)合)中披露為seqidno:2的支鏈淀粉酶、wo01/151620(特此通過引用結(jié)合)中披露為seqidno:4的脫支芽孢桿菌(bacillusderamificans)的支鏈淀粉酶，以及來自wo01/151620(特此通過引用結(jié)合)中披露為seqidno:6的嗜酸性普魯蘭芽孢桿菌的支鏈淀粉酶，以及還有描述于fems微生物學通訊(femsmic.let.)(1994)115,97-106中的支鏈淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明考慮的另外的支鏈淀粉酶包括來自沃斯氏熱球菌、特別是來自wo92/02614中披露的沃斯氏熱球菌dsmno.3773的支鏈淀粉酶。在一個實施例中，該支鏈淀粉酶是gh57家族支鏈淀粉酶。在一個實施例中，該支鏈淀粉酶包括x47結(jié)構(gòu)域，如披露于作為wo2011/087836公開的us61/289,040(將其特此通過引用結(jié)合)中。更具體地該支鏈淀粉酶可以來源于熱球菌屬的菌株，包括嗜熱高溫球菌(thermococcuslitoralis)和熱水高溫球菌，例如熱水高溫球菌支鏈淀粉酶，示于seqidno:11中，剛好在x47結(jié)構(gòu)域之后的x4位點截短(即，在此的seqidno:11和12中的氨基酸1-782)。該支鏈淀粉酶還可以是嗜熱高溫球菌和熱水高溫球菌支鏈淀粉酶雜合體或具有截短位點x4的、披露于作為wo2011/087836公開的us61/289,040(特此將其通過引用結(jié)合)中的以及披露于在此的seqidno:12中的熱水高溫球菌/嗜熱高溫球菌雜合酶。在另一個實施例中，該支鏈淀粉酶是包括披露于wo2011/076123(諾維信公司)中的x46結(jié)構(gòu)域的一種支鏈淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明，該支鏈淀粉酶能以有效量添加，包括約0.0001-10mg酶蛋白/克ds的優(yōu)選量，優(yōu)選0.0001-0.10mg酶蛋白/克ds，更優(yōu)選0.0001-0.010mg酶蛋白/克ds。支鏈淀粉酶活性可以確定為npun。用于確定npun的測定法描述于下文的“材料與方法”-部分中。適合的可商購支鏈淀粉酶產(chǎn)品包括promozymed、promozymetmd2(諾維信公司，丹麥)、optimaxl-300(杜邦-丹尼斯克(dupont-danisco)，美國)、以及amano8安能滿公司，日本)。在糖化和/或發(fā)酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶糖化、發(fā)酵或同時糖化發(fā)酵(ssf)中存在和/或添加的葡糖淀粉酶可以源自任何適合的來源，例如，源自微生物或植物。優(yōu)選的葡糖淀粉酶是真菌或細菌來源的，選自下組，該組由以下各項組成：曲霉屬葡糖淀粉酶，特別是黑曲霉g1或g2葡糖淀粉酶(博埃爾(boel)等人，1984，歐洲分子生物學學會雜志3(5):1097-1102)，或其變體，例如披露于wo92/00381、wo00/04136和wo01/04273中的那些(來自諾維信，丹麥)；披露于wo84/02921中的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(農(nóng)業(yè)、生物學與化學(agric.biol.chem.)(1991)，55(4)，p.941-949)，或其變體或片段。其他曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括具有增強熱穩(wěn)定性的變體：g137a和g139a(陳(chen)等人(1996)，蛋白質(zhì)工程(prot.eng.)9，499-505)；d257e和d293e/q(陳等人(1995)，蛋白質(zhì)工程8，575-582)；n182(陳等人(1994)，生物化學雜志(biochem.j)301，275-281)；二硫鍵、a246c(費艾洛伯(fierobe)等人(1996)，生物化學(biochemistry)，35，8698-8704)；以及在a435和s436位置導入pro殘基(李(li)等人(1997)，蛋白質(zhì)工程(proteineng.)10，1199-1204)。其他葡糖淀粉酶包括羅耳阿太菌(以前命名為羅爾伏革菌)葡糖淀粉酶(參見美國專利號4,727,026和長坂(nagasaka)等人，(1998)，“來自羅爾伏革菌的生淀粉降解葡糖淀粉酶的純化和特性”(“purificationandpropertiesoftheraw-starch-degradingglucoamylasesfromcorticiumrolfsii”)應用微生物學與生物技術(shù)(appl.microbiol.biotechnol.)50:323-330)，籃狀菌屬葡糖淀粉酶，特別是來源于埃默森籃狀菌(wo99/28448)、talaromycesleycettanus(美國專利登記號32,153)、talaromycesduponti、以及嗜熱籃狀菌(美國專利號4,587,215)。在一個優(yōu)選的實施例中，糖化和/或發(fā)酵過程中使用的葡糖淀粉酶是披露于wo99/28448中的埃默森籃狀菌葡糖淀粉酶?？紤]的細菌葡糖淀粉酶包括來自梭狀芽孢桿菌屬，具體地是嗜熱解淀粉梭狀芽孢桿菌(c.thermoamylolyticum)(ep135,138)和嗜熱硫化氫梭狀芽孢桿菌(c.thermohydrosulfuricum)(wo86/01831)的葡糖淀粉酶。考慮的真菌葡糖淀粉酶包括都披露于wo2006/069289中的瓣環(huán)栓菌(seqidno:20)、紙質(zhì)厚孢孔菌、和大白樁菇；或披露于wo2007/124285中的紅邊隔孢伏革菌(peniophorarufomarginata)；或其混合物。根據(jù)本發(fā)明，還考慮了雜合葡糖淀粉酶。實例包括披露于wo2005/045018中的雜合體葡糖淀粉酶。具體實例包括披露于實例1的表1和4中的雜合葡糖淀粉酶(這些雜合體通過引用而特此結(jié)合)。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶來源于密孔菌屬的一種菌株，特別是來源于如描述于wo2011/066576中的密孔菌屬的一種菌株(seqidno2、4或6)，例如在此的seqidno:18，或來自粘褶菌屬的一種菌株，例如籬邊粘褶菌或密粘褶菌的菌株，特別是來源于如描述于wo2011/068803中的粘褶菌屬的一種菌株(seqidno:2、4、6、8、10、12、14或16)。在一個優(yōu)選實施例中，該葡糖淀粉酶是wo2011/068803中的seqidno:2或在此的seqidno:15(即，籬邊粘褶菌葡糖淀粉酶)。在一個優(yōu)選實施例中，該葡糖淀粉酶是在此的seqidno:17(即，wo2014/177546中披露為seqidno:3的密粘褶菌葡糖淀粉酶)。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶來源自黑層孔屬的菌株，特別是披露于wo2012/064351中的黑層孔屬的菌株(seqidno:2)(全部參考文獻特此通過引用結(jié)合)。還考慮了如下葡糖淀粉酶，該葡糖淀粉酶展現(xiàn)與上述葡糖淀粉酶中的任一種的高一致性，即，分別與上述酶序列的成熟部分中的任一個，例如在此的seqidno:15、17、18或19中的任一個，優(yōu)選在此的seqidno:15或在此的seqidno:17具有至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性。在一個實施例中，葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或發(fā)酵中：0.0001-20agu/gds，優(yōu)選0.001-10agu/gds，尤其是0.01-5agu/gds之間，例如0.1-2agu/gds。在一個實施例中，葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或發(fā)酵中：1-1,000μgep/gds，優(yōu)選地10-500μg/gds，尤其是在25-250μg/gds之間。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶作為進一步包含α-淀粉酶的共混物添加。在一個優(yōu)選的實施例中，該α-淀粉酶是一種真菌α-淀粉酶，尤其是一種酸性真菌α-淀粉酶。該α-淀粉酶典型地是副活性的。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶是一種共混物，包括wo99/28448中披露為seqidno:7的埃默森籃狀菌葡糖淀粉酶和在wo06/069289中披露為seqidno:2的瓣環(huán)栓菌葡糖淀粉酶以及在此的seqidno:20。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶是一種共混物，包括披露于wo99/28448中的埃默森籃狀菌葡糖淀粉酶、在wo06/69289中披露為seqidno:2的瓣環(huán)栓菌葡糖淀粉酶和在此的seqidno:20、以及在wo2006/069290的表5中披露為v039的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接頭和sbd的微小根毛霉α-淀粉酶或在此的seqidno:16。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶是一種共混物，包括披露于wo99/28448中的埃默森籃狀菌葡糖淀粉酶、披露于wo06/69289中的瓣環(huán)栓菌葡糖淀粉酶、以及在wo2006/069290的表5中披露為v039的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接頭和sbd的微小根毛霉α-淀粉酶或在此的seqidno:16。在一個實施例中，該葡糖淀粉酶是一種共混物，包括如在wo2011/068803中的seqidno:2所示的籬邊粘褶菌葡糖淀粉酶以及wo2013/006756的seqidno:3披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接頭和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(sbd)的微小根毛霉(具有以下取代：g128d+d143n)。在一個實施例中，該α-淀粉酶可以是來源于根毛霉屬的一種菌株，優(yōu)選微小根毛霉的一種菌株，例如wo2013/006756的seqidno:3中所示的，或是來源于亞灰樹花菌屬，優(yōu)選大型亞灰樹花菌的一種菌株。在一個優(yōu)選實施例中，該α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接頭和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(sbd)的微小根毛霉，披露為wo2006/069290的表5中的v039或在此的seqidno:16。在一個實施例中，微小根毛霉α-淀粉酶或具有黑曲霉葡糖淀粉酶接頭和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(sbd)的微小根毛霉具有以下取代或取代組合中的至少一種：d165m；y141w；y141r；k136f；k192r；p224a；p224r；s123h+y141w；g20s+y141w；a76g+y141w；g128d+y141w；g128d+d143n；p219c+y141w；n142d+d143n；y141w+k192r；y141w+d143n；y141w+n383r；y141w+p219c+a265c；y141w+n142d+d143n；y141w+k192rv410a；g128d+y141w+d143n；y141w+d143n+p219c；y141w+d143n+k192r；g128d+d143n+k192r；y141w+d143n+k192r+p219c；g128d+y141w+d143n+k192r；或g128d+y141w+d143n+k192r+p219c(使用wo2013/006756中的seqidno:3或在此的seqidno:16進行編號)。在一個優(yōu)選的實施例中，該葡糖淀粉酶共混物包括籬邊粘褶菌葡糖淀粉酶(例如，wo2011/068803中的seqidno:2或在此的seqidno:15)和微小根毛霉α-淀粉酶。在一個優(yōu)選的實施例中，該葡糖淀粉酶共混物包括如在wo2011/068803中的seqidno:2所示的籬邊粘褶菌葡糖淀粉酶或在此的seqidno:15，以及wo2013/006756的seqidno:3披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接頭和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(sbd)的微小根毛霉和在此的seqidno:16(具有以下取代：g128d+d143n)?？缮藤彨@得的包括葡糖淀粉酶的組合物包括amg200l；amg300l；santmsuper、santmextral、spirizymetmplus、spirizymetmfuel、spirizymetmb4u、spirizymetmultra、spirizymetmexcel、spirizymeachievetm、和amgtme(來自諾維信公司(novozymesa/s))；optidextm300、gc480、gc417(來自杜邦-丹尼斯克公司)；amigasetm和amigasetmplus(來自帝斯曼公司(dsm))；g-zymetmg900、g-zymetm和g990zr(來自杜邦-丹尼斯克公司)。糖化和/或發(fā)酵過程中存在的和/或添加的纖維素分解組合物根據(jù)本發(fā)明，在糖化、發(fā)酵或同時糖化發(fā)酵(ssf)中可以存在纖維素分解組合物。該纖維素分解組合物包括β-葡糖苷酶、纖維二糖水解酶、和內(nèi)切葡聚糖酶。適合的纖維素分解組合物的實例可以發(fā)現(xiàn)于wo2008/151079和wo2013/028928中，將其通過引用結(jié)合。在優(yōu)選的實施例中，纖維素分解組合物來源于木霉屬、腐質(zhì)霉屬、或金孢子菌屬的菌株。在一個實施例中，該纖維素分解組合物來源于里氏木霉、特異腐質(zhì)霉、和/或盧克諾文思金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)。在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種β-葡糖苷酶，優(yōu)選源自以下各項的β-葡糖苷酶：曲霉屬的菌株，如米曲霉，如披露于wo2002/095014中的β-葡糖苷酶或披露于wo2008/057637中具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或煙曲霉，如披露于wo2005/047499中的β-葡糖苷酶或在wo2012/044915中所披露的煙曲霉β-葡糖苷酶變體(諾維信公司)，如具有以下取代的β-葡糖苷酶：f100d、s283g、n456e、f512y；或青霉屬的菌株，如披露于wo2007/019442中的巴西青霉菌株，或木霉屬的菌株，如里氏木霉菌株。在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括具有纖維素分解增強活性的gh61多肽，例如來源于嗜熱子囊菌屬，如金黃色嗜熱子囊菌菌株，例如，在wo2005/074656中描述為seqidno:2的gh61多肽；或源自梭孢殼屬例如土生梭孢殼菌株的gh61多肽，例如在wo2005/074647中描述為seqidno:7和seqidno:8的gh61多肽；或源自曲霉屬的菌株例如煙曲霉菌株的gh61多肽，例如在wo2010/138754中描述為seqidno:1和seqidno:2的gh61多肽；或源自青霉屬的菌株例如埃默森青霉菌菌株的gh61多肽，例如在wo2011/041397中披露的gh61多肽。在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種纖維二糖水解酶i(cbhi)，例如來源于曲霉屬的菌株的纖維二糖水解酶i，例如煙曲霉的菌株，例如披露于wo2011/057140的seqidno:2中的cel7acbhi，或來源于木霉屬的菌株，例如里氏木霉的菌株。在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括纖維二糖水解酶ii(cbhii)，例如來源于曲霉屬的菌株的纖維二糖水解酶ii，例如煙曲霉的菌株；或木霉屬的菌株，例如里氏木霉，或梭孢殼屬的菌株，例如土生梭孢殼霉的菌株，例如來自土生梭孢殼霉的纖維二糖水解酶iicel6a。在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強活性的gh61多肽以及一種β-葡糖苷酶。在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強活性的gh61多肽、一種β-葡糖苷酶、以及一種cbhi。在一個實施例中，該纖維素分解組合物包括一種具有纖維素分解增強活性的gh61多肽、一種β-葡糖苷酶、一種cbhi、以及一種cbhii。在一個實施例中，該纖維素分解組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，進一步包括具有纖維素分解增強活性的金黃色嗜熱子囊菌gh61a多肽(wo2005/074656中的seqidno:2)、以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(wo2008/057637)。在一個實施例中，該纖維素分解組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，進一步包括具有纖維素分解增強活性的金黃色嗜熱子囊菌gh61a多肽(wo2005/074656中的seqidno:2)、以及煙曲霉β-葡糖苷酶(wo2005/047499的seqidno:2)。在一個實施例中，該纖維素分解組合物是一種里氏木霉纖維素分解酶組合物，進一步包括在wo2011/041397中披露的具有纖維素分解增強活性的埃默森青霉菌gh61a多肽、和煙曲霉β-葡糖苷酶(wo2005/047499的seqidno:2)或其具有以下取代的變體：f100d、s283g、n456e、f512y。在一個優(yōu)選的實施例中，該纖維素分解組合物包括一種或多種以下組分：(i)煙曲霉纖維二糖水解酶i；(ii)煙曲霉纖維二糖水解酶ii；(iii)煙曲霉β-葡糖苷酶或其變體；及(iv)一種具有纖維素分解增強活性的青霉屬gh61多肽；或其同系物。在一個優(yōu)選實施例中，該纖維素分解組合物源自里氏木霉，其包括具有纖維素分解增強活性、源自wo2012/044915中所披露的埃默森青霉菌菌株(wo2011/041397中的seqidno:2，具有以下取代的煙曲霉β-葡糖苷酶(wo2005/047499中的seqidno:2)變體：f100d、s283g、n456e、f512y)的gh61a多肽；在wo2011/057140中披露為seqidno:6的煙曲霉cel7acbh1和wo2011/057140中披露為seqidno:18的煙曲霉cbhii。在一個實施例中，該纖維素分解組合物按以下量給予：從0.0001-3mgep/gds，優(yōu)選地，0.0005-2mgep/gds，優(yōu)選0.001-1mg/gds，更優(yōu)選0.005-0.5mgep/gds，并且甚至更優(yōu)選0.01-0.1mgep/gds。本發(fā)明優(yōu)選方法的實例在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶液化該含淀粉材料；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個實施例中，在糖化和/或發(fā)酵或ssf中添加蛋白酶。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，其包括在位置i181+g182處的雙缺失、以及任選的n193f取代；(使用seqidno:1進行編號)；ii)使用源自粘褶菌屬菌株(如籬邊粘褶菌或密粘褶菌)的葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-一種源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶；-一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值，優(yōu)選來源于強烈火球菌和/或金黃色嗜熱子囊菌；及-任選地一種草酸青霉菌葡糖淀粉酶；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-一種α-淀粉酶，優(yōu)選地源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，其包括在位置i181+g182處的雙缺失，和任選地n193f取代(使用seqidno:1進行編號)并且具有在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下的至少10的t1/2(min)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下液化該含淀粉材料：-一種α-淀粉酶，優(yōu)選源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少10的t1/2(min)；-一種蛋白酶，優(yōu)選來源于強烈火球菌和/或金黃色嗜熱子囊菌，具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值；-任選地一種草酸青霉菌葡糖淀粉酶；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，具有在位置i181+g182處的雙缺失、以及任選的取代n193f；以及任選地以下取代集合中的另一種：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶，如來自粘褶菌屬菌株(如籬邊粘褶菌菌株)的葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，具有在位置i181+g182處的雙缺失、和任選的取代n193f、以及任選地以下取代集合中的另一種；-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)。-一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值，優(yōu)選來源于強烈火球菌和/或金黃色嗜熱子囊菌；及-任選地一種如在seqidno:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有選自下組的取代：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(使用seqidno:14進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，其具有在位置i181+g182處的雙缺失、和任選的取代n193f、以及進一步任選地以下取代集合中的一種；-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)，-一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值，優(yōu)選來源于強烈火球菌和/或金黃色嗜熱子囊菌；-一種如在seqidno:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有選自下組的取代：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(使用seqidno:14進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，其具有在位置i181+g182處的雙缺失、以及任選的取代n193f；-一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值，優(yōu)選來源于強烈火球菌和/或金黃色嗜熱子囊菌；及-任選地一種支鏈淀粉酶；-具有k79v取代的草酸青霉菌葡糖淀粉酶(使用seqidno:14進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-一種α-淀粉酶，優(yōu)選源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少10的t1/2(min)；-在0.5和10微克之間的強烈火球菌蛋白酶/gds；ii)使用選自下組的葡糖淀粉酶進行糖化，該組是以下各項：源自曲霉屬菌株的葡糖淀粉酶，優(yōu)選地黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉屬的菌株，優(yōu)選里氏木霉；或籃狀菌屬的菌株，優(yōu)選埃默森籃狀菌；或密孔菌屬的菌株；或粘褶菌屬的菌株，例如籬邊粘褶菌或密粘褶菌，或黑層孔屬的菌株；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料；-一種α-淀粉酶，優(yōu)選地源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，其具有在位置i181+g182處的雙缺失，和任選地取代n193f，并且在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少10的t1/2(min)；-在0.5和10微克之間的強烈火球菌蛋白酶/gds；-任選地一種支鏈淀粉酶；-一種草酸青霉菌葡糖淀粉酶；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料；-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，其具有雙缺失i181+g182、以任選的取代n193f；以及任選地以下取代集合中的另一種：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)；-在0.5和10微克之間的強烈火球菌蛋白酶/gds；及-任選地一種支鏈淀粉酶；-一種如在seqidno:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有選自下組的取代：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(使用seqidno:14進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，其具有雙缺失i181+g182、以任選的取代n193f；以及另外地以下取代集合中的一種：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)。-一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值，優(yōu)選來源于強烈火球菌和/或金黃色嗜熱子囊菌；及-任選地一種支鏈淀粉酶；-一種如在seqidno:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有選自下組的取代：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(使用seqidno:14進行編號)；ii)使用選自下組的葡糖淀粉酶進行糖化，該組是以下各項：源自曲霉屬菌株的葡糖淀粉酶；或木霉屬菌株；籃狀菌屬菌株、密孔菌屬菌株；粘褶菌屬菌株；以及黑層孔屬菌株；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下，在5.0和6.5之間的ph下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，其具有雙缺失i181+g182、以任選的取代n193f；以及任選地以下取代集合中的另一種：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)。-一種來源于強烈火球菌的蛋白酶，優(yōu)選在此的seqidno:13中所示的蛋白酶；-一種如在seqidno:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有選自下組的取代：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(使用seqidno:14進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下，在5.0和6.5之間的ph下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，其具有雙缺失i181+g182、以及任選的取代n193f；以及任選地以下取代集合中的另一種：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)。-源自強烈火球菌的蛋白酶，優(yōu)選地在此的seqidno:13中所示的蛋白酶，其以1-5微克蛋白酶/克ds(如約1.5或3微克蛋白酶/克ds)的劑量存在和/或添加；-一種如在seqidno:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有選自下組的取代：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(使用seqidno:14進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶液化該含淀粉材料；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物具有以下性質(zhì)和定義特性中的一種或多種，如所有：-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，增加乙醇產(chǎn)量；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，產(chǎn)生降低水平的乳酸；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，產(chǎn)生降低水平的甘油；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，降低了發(fā)酵中乙醛水平；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，增加油產(chǎn)量；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，具有更快的發(fā)酵動力學。在一個實施例中，本發(fā)明涉及從本發(fā)明乙醇生產(chǎn)方法中回收/提取油的方法，該方法包括以下步驟：在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料來生產(chǎn)乙醇的方法，這些方法包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料；-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，任選地具有雙缺失i181+g182、和任選的取代n193f、以及任選地以下取代集合中的另一種；-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)；-任選地強烈火球菌蛋白酶；及-任選地一種草酸青霉菌葡糖淀粉酶，任選地具有seqidno:14中所示的序列，該序列具有選自下組的取代：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(使用seqidno:14進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；iv)回收該發(fā)酵產(chǎn)物以形成全酒糟；v)將該全酒糟分離為酒糟水和濕餅；vi)任選地將該酒糟水濃縮為漿料；其中油是從發(fā)酵步驟iii)下游回收/提取并且其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種發(fā)酵生物菌株，該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。在一個實施例中，該發(fā)酵生物是一種非重組酵母菌屬菌株，優(yōu)選非重組釀酒酵母菌株。在一個優(yōu)選的實施例中，該發(fā)酵生物是一種非重組酵母菌屬菌株，優(yōu)選地是使用美國專利號8,257,959-bb中所描述和涉及的方法產(chǎn)生的非重組釀酒酵母菌株。菌株v14/004037(釀酒酵母mbg4851)或菌株v14/004037衍生物的用途根據(jù)本發(fā)明，可以將菌株v14/004037(釀酒酵母mbg4851)或菌株v14/004037的衍生物用于增加發(fā)酵中乙醇產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明，可以使用菌株v14/004037(釀酒酵母mbg4851)或菌株v14/004037的衍生物以在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，產(chǎn)生降低水平的乳酸。根據(jù)本發(fā)明，可以使用菌株v14/004037(釀酒酵母mbg4851)或菌株v14/004037的衍生物以在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，產(chǎn)生降低水平的甘油；根據(jù)本發(fā)明，可以將菌株v14/004037(釀酒酵母mbg4851)或菌株v14/004037的衍生物用于降低發(fā)酵中乙醛水平。在一個實施例中，本發(fā)明涉及菌株v14/004037(釀酒酵母mbg4851)或菌株v14/004037的衍生物在相同的方法條件下，與ethanolredtm相比，用于減少發(fā)酵中乙醛水平的用途。已經(jīng)使待發(fā)酵的液化醪液經(jīng)受α-淀粉酶和從0.5-50微克蛋白酶/克ds，如1-5微克蛋白酶/克ds、如約1.5或3微克蛋白酶/克ds。該蛋白酶可以是細菌蛋白酶。該蛋白酶可以源自細菌火球菌屬菌株，如強烈火球菌菌株(pfu蛋白酶)，如或在此的seqidno:13。該蛋白酶可以是在此的seqidno:13中所披露的蛋白酶或是與在此的seqidno:13具有至少80％一致性，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％一致性的一種蛋白酶。用于液化的α-淀粉酶可以是細菌來源的，如來自芽胞桿菌屬，如嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的一種變體，如在此的seqidno:1中所示的α-淀粉酶。在一個優(yōu)選實施例中，該嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體選自具有以下突變的組：-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-i181*+g182*+n193f+v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；及-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用seqidno:1進行編號)。在一個實施例中，已經(jīng)使待發(fā)酵的液化醪液經(jīng)受α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和從0.5-50微克蛋白酶/克ds，如1-5微克蛋白酶/克ds、如約1.5或3微克蛋白酶/克ds。該葡糖淀粉酶可以源自青霉屬菌株，尤其是在此的seqidno:9或14中所披露的草酸青霉菌菌株。該葡糖淀粉酶可以是具有k79v取代的草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體(使用seqidno:14中所示的成熟序列進行編號)。在一個優(yōu)選的實施例中，該草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有k79v取代(使用seqidno:14進行編號)，并且進一步具有以下各項之一：-p11f+t65a+q327f；-p2n+p4s+p11f+t65a+q327f(使用seqidno:14進行編號)。本發(fā)明的酵母在一個實施例中，本發(fā)明涉及在國家計量研究所(nmi)布達佩斯條約下保藏的、具有保藏登錄號v14/004037的釀酒酵母菌株。世界燃料乙醇的大部分是在底物(如玉米醪)中通過工業(yè)規(guī)模發(fā)酵基于淀粉的糖來生產(chǎn)。在工業(yè)規(guī)模發(fā)酵期間，酵母遇到各種各樣的生理挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)包括可變濃度的糖，高濃度的酵母代謝產(chǎn)物如乙醇、甘油、有機酸、滲透脅迫、連同來自污染微生物(如酵母和細菌)的潛在競爭。其結(jié)果是，許多酵母菌屬菌株不適合用于工業(yè)發(fā)酵。酵母菌屬的最廣泛使用的可商購的工業(yè)菌株(即，用于工業(yè)規(guī)模發(fā)酵)是，例如，在產(chǎn)品ethanolred中所使用的釀酒酵母菌株。該菌株非常適合于工業(yè)乙醇生產(chǎn)，然而需要改進的釀酒酵母的菌株。wo2011/035392描述了菌株nmiv09/024011，其是一種釀酒酵母菌株，該菌株從玉米醪中比在燃料乙醇工業(yè)中使用的釀酒酵母菌株(如ethanolredtm)產(chǎn)生更高水平乙醇。然而，菌株nmiv09/024011的限制是其發(fā)酵動力學比ethanolred的那些更慢。此外，相對于ethanolred，僅當玉米醪大量補充外源糖源如糊精時發(fā)現(xiàn)v09/024011產(chǎn)生較高水平的乙醇。在這種條件下，醪液發(fā)酵需要進行持續(xù)延長時間段，超出了在工業(yè)方法中通常遇到的。如此，高濃度糖補充并不一定是工業(yè)關(guān)聯(lián)的，并且可能不會大規(guī)模遭遇。諸位發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)生產(chǎn)了菌株號v14/004037，相比于v09/024011或乙醇工業(yè)中所使用的可商購的工業(yè)釀酒酵母菌株，其能夠從在工業(yè)規(guī)模發(fā)酵中遇到的條件(如發(fā)酵玉米醪期間遇到的那些)下所消耗的內(nèi)源性發(fā)生的玉米糖產(chǎn)生甚至更高乙醇產(chǎn)量。相比于菌株號v09/024011，菌株號v14/004037還表現(xiàn)出更快的發(fā)酵動力學。如在此描述的，在玉米醪的工業(yè)發(fā)酵期間遇到的條件下由菌株號v14/004037產(chǎn)生的乙醇水平比可商購酵母菌株(如ethanolred)產(chǎn)生的乙醇水平以及菌株v09/024011產(chǎn)生的乙醇水平更高。因此，菌株號v14/004037具有用于從底物(如玉米醪)工業(yè)生產(chǎn)乙醇的必須特性。菌株號v14/004037是通過育種形成的非重組釀酒酵母菌株，其：(a)在玉米醪發(fā)酵的相同條件下，在50hr發(fā)酵時，比菌株v09/024011和ethanolred產(chǎn)生更高滴度乙醇；(b)在玉米醪發(fā)酵的相同條件下，在20h時，比v09/024011產(chǎn)生更大量的乙醇；(c)在玉米醪發(fā)酵的相同條件下，比ethanolred和v09/024011產(chǎn)生更少甘油。(d)在玉米醪發(fā)酵的相同條件下，在發(fā)酵后比ethanolred和v09/024011留下更少的葡萄糖剩余；(e)在玉米醪發(fā)酵的相同條件下，在發(fā)酵后比ethanolred和v09/024011留下更少的麥芽糖剩余。在此使用的，菌株號v14/004037的定義特性是以下特性中任一種或多種：(a)在32℃下，在玉米醪發(fā)酵的44小時中，產(chǎn)生了從13.0％w/v至14.0％w/v范圍內(nèi)的量的乙醇；(b)在32℃下，在玉米醪發(fā)酵的44小時中，產(chǎn)生了從1.300％w/v至1.400％w/v范圍內(nèi)的量的甘油；(c)在32℃下，玉米醪發(fā)酵50小時后，產(chǎn)生從9至11范圍內(nèi)的所產(chǎn)生的％w/v乙醇與所產(chǎn)生的％w/v甘油的比率；(d)在32℃下，玉米醪發(fā)酵50小時后，產(chǎn)生從100至900、200至850、300至850、400至850范圍內(nèi)的所產(chǎn)生的％w/v乙醇與％w/v葡萄糖剩余的比率；(e)在32℃下，玉米醪發(fā)酵50小時后，產(chǎn)生從30至50范圍內(nèi)的所產(chǎn)生的％w/v乙醇與％w/v麥芽糖剩余的比率。典型地，從玉米醪發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇是從與玉米醪同源的糖發(fā)酵產(chǎn)生的。與玉米醪同源的糖是源自玉米的糖，而不是從外源性來源添加的糖。菌株v14/004037還能夠在木糖是唯一碳源的介質(zhì)中生長。在此方面，當在測試t1中所指定的條件下生長時，菌株v14/004037產(chǎn)生約7倍增加的生物質(zhì)。其結(jié)果是，菌株v14/004037可以很容易與以下各項區(qū)分：(a)酵母菌屬的天然發(fā)生菌株；(b)不利用木糖的酵母菌屬的污染菌株；及(c)用于乙醇工業(yè)中的其他菌株，這些其他菌株不具有菌株v14/004037的乙醇生產(chǎn)能力和/或沒有表現(xiàn)出測試t1中約7倍增加的生物質(zhì)。因為酵母菌屬的當前野生型和工業(yè)菌株不能夠以菌株v14/004037在木糖上生長的比率在木糖上生長，菌株v14/004037很容易區(qū)別于酵母菌屬的當前野生型菌株和在本發(fā)明之前在乙醇工業(yè)中使用的酵母菌屬菌株(如ethanolred)。本發(fā)明還涉及酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物。在此使用的，“菌株v14/004037的衍生物”是源自菌株v14/004037的菌株，包括通過誘變、重組dna技術(shù)、交配、細胞融合、或在酵母菌株之間的胞導。源自菌株v14/004037的菌株可以是直接后代(即，在菌株v14/004037和另一種菌株或自身之間交配的產(chǎn)物)、或遙遠的后代(其由v14/004037和另一種菌株或自身之間初始交配，隨后大量后續(xù)交配產(chǎn)生)。在一個實施例中，菌株v14/004037的衍生物是通過在允許第一酵母菌株和菌株v14/004037之間的dna組合的條件下用菌株v14/004037培養(yǎng)第一酵母菌株產(chǎn)生的雜合菌株。在一個實施例中，菌株v14/004037的衍生物可以通過以下各項來制備：(a)在允許第一酵母菌株和第二酵母菌株之間dna組合的條件下，用第二酵母菌株培養(yǎng)第一酵母菌株，其中該第二酵母菌株是菌株v14/004037或菌株v14/004037的衍生物；及(b)分離雜合菌株；并且(c)任選地使用步驟(b)中分離的雜合菌株作為第一酵母菌株和/或菌株v14/004037的衍生物來重復步驟(a)和(b)。在一個實施例中，菌株v14/004037的衍生物表現(xiàn)出菌株v14/004037的一種或多種定義特性。使用菌株v14/004037生產(chǎn)表現(xiàn)出菌株v14/004037的一種或多種定義特性的酵母菌屬衍生物。在此方面，菌株v14/004037形成了用于制備具有菌株v14/004037定義特性的其他菌株的基礎(chǔ)。例如，表現(xiàn)出菌株v14/004037的一種或多種定義特性的酵母菌屬菌株可以源自菌株v14/004037，使用如下方法，如：經(jīng)典交配、細胞融合、或在酵母菌株之間的胞導、誘變或重組dna技術(shù)。在一個實施例中，表現(xiàn)出菌株v14/004037的一種或多種定義特性的菌株v14/004037的衍生物可以通過如下來產(chǎn)生：(a)在允許第一酵母菌株和第二酵母菌株之間dna組合的條件下，用第二酵母菌株培養(yǎng)第一酵母菌株，其中該第二酵母菌株是菌株v14/004037或菌株v14/004037的衍生物；(b)篩選或選擇菌株v14/004037的衍生物，如篩選或選擇與第一菌株相比在玉米醪中具有增加的乙醇生產(chǎn)的衍生物、和/或篩選或選擇與第一菌株相比在玉米醪中產(chǎn)生較少甘油的雜合體；(c)任選地用篩選的或選擇的菌株作為第一酵母菌株和/或第二酵母菌株重復步驟(a)和(b)，直到獲得表現(xiàn)出菌株v14/004037的一種或多種定義特性的菌株v14/004037的衍生物。如果可以使用方法(如經(jīng)典交配、細胞融合或胞導)將菌株dna與第二酵母菌株組合，該第一酵母菌株可以是酵母的任何菌株。典型地，該第一酵母菌株是酵母菌屬菌株。更典型地，該第一酵母菌株是釀酒酵母菌株。釀酒酵母是如由庫茲曼(kurtzman)(2003)fems酵母研究(femsyeastresearch)第4卷，第233-245頁所定義的。第一酵母菌株可以具有所希望的性質(zhì)，這些性質(zhì)旨在與菌株v14/004037的定義特性結(jié)合。該第一酵母菌株可以是，例如，任何釀酒酵母菌株，像例如ethanolred、v09/024011。還應當理解的是，第一酵母菌株可以是菌株v14/004037或表現(xiàn)出菌株v14/004037的一種或多種定義特性的菌株。在允許酵母菌株之間dna組合的條件下，培養(yǎng)該第一和第二酵母菌株。在此使用的，在酵母菌株之間的“dna的組合”是指酵母菌株的所有或部分基因組的組合。酵母菌株之間dna組合可以通過適用于組合至少兩個酵母細胞的dna的任何方法來進行，并且可以包括，例如，交配方法，該交配方法包括酵母菌株的孢子形成以產(chǎn)生單倍體細胞，并且隨后將兼容單倍體細胞進行雜交；胞導；或細胞融合如原生質(zhì)體融合。在一個實施例中，在允許組合第一酵母菌株和第二酵母菌株之間的dna的條件下，培養(yǎng)第一酵母菌株與第二酵母，該培養(yǎng)包括：(i)使該第一酵母菌株和該第二酵母菌株形成孢子；(ii)用由該第二酵母菌株產(chǎn)生的孢子萌發(fā)并且雜交由第一酵母菌株產(chǎn)生的孢子。在一個實施例中，生產(chǎn)表現(xiàn)菌株v14/004037的一種或多種定義特性的菌株v14/004037的衍生物的方法包括：(a)提供：(i)第一酵母菌株；和(ii)第二酵母菌株，其中該第二酵母菌株是菌株v14/004037或菌株v14/004037的衍生物；(b)使該第一酵母菌株和該第二酵母菌株形成孢子；(c)用該第二酵母菌株萌發(fā)的孢子來萌發(fā)并且雜交該第一酵母菌株的孢子；(d)篩選或選擇菌株v14/004037的衍生物，如篩選或選擇與第一菌株相比在玉米醪中具有增加的乙醇生產(chǎn)的衍生物、和/或篩選或選擇與第一菌株相比在玉米醪中產(chǎn)生較少甘油的雜合體；(e)任選地用篩選或選擇的菌株作為第一和/或第二酵母菌株來重復步驟(b)至(d)。用于將酵母菌株，并且具體地是酵母菌屬菌株形成孢子、萌發(fā)和雜交的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且描述于，例如，奧蘇貝爾(ausubel)，f.m.等人，(1997)當代分子生物學實驗手冊(currentprotocolsinmolecularbiology)，第2卷，第13.2.1至13.2.5頁約翰&威利父子公司(johnwilley&sonsinc)；第7章，“酵母的孢子形成和雜交(sporulationandhybridisationofyeast)”由r.r.福韋爾(fowell)，在“酵母(theyeasts)”第1卷，a.h.羅斯(rose)和j.s.哈里森(harrison)(編輯)，1969，學術(shù)出版社。在一個實施例中，該酵母菌株可以在允許細胞融合的條件下進行培養(yǎng)。使用細胞融合技術(shù)用于產(chǎn)生種內(nèi)或種間雜合體的方法描述于，例如，斯潘塞(spencer)等人，(1990)，酵母技術(shù)(yeasttechnology)，斯潘塞jft和斯潘塞dm(編輯)，施普林格出版公司，紐約。在另一個實施例中，該酵母菌株可以在允許胞導的條件下進行培養(yǎng)。用于胞導的方法描述于，例如，英格-雅克摩夫(inge-vechymov)等人，(1986)遺傳學(genetika)22:2625-2636；約翰斯頓(johnston)(1990)，酵母技術(shù)(yeasttechnology)，斯潘塞jft和斯潘塞dm(編輯)，施普林格出版公司，紐約。在一個實施例中，篩選或選擇菌株v14/004037的衍生物包括篩選或選擇與第一菌株相比在玉米醪中具有增加的乙醇生產(chǎn)的衍生物、和/或篩選或選擇與第一菌株相比在玉米醪中產(chǎn)生較少甘油的雜合體。在另一個實施例中，可以針對具有以下特性中的一種或多種的菌株篩選或選擇這些酵母細胞：(a)在相同條件下，在玉米醪發(fā)酵中，生產(chǎn)一定量的乙醇，該量處于從高于由菌株ethanolred所產(chǎn)生的量至由菌株v14/004037所產(chǎn)生的量的范圍內(nèi)；(b)在相同條件下，在玉米醪發(fā)酵中，生產(chǎn)一定量的甘油，該量少于由ethanolred產(chǎn)生的量至由菌株v14/004037產(chǎn)生的量(c)在相同條件下，在玉米醪發(fā)酵中，生產(chǎn)一定比率的乙醇與甘油，該比率是在從高于ethanolred的乙醇與甘油比率的比率至與菌株v14/004037的乙醇與甘油比率大致一樣比率的范圍內(nèi)。(d)在相同條件下，在玉米醪發(fā)酵中，生產(chǎn)一定比率的乙醇與葡萄糖，該比率是在從高于ethanolred的乙醇與葡萄糖比率的比率至與菌株v14/004037的乙醇與葡萄糖比率大致一樣比率的范圍內(nèi)。(e)在相同條件下，在玉米醪發(fā)酵中，生產(chǎn)一定比率的乙醇與麥芽糖，該比率是在從高于ethanolred的乙醇與麥芽糖比率的比率至與菌株v14/004037的乙醇與麥芽糖比率大致一樣比率的范圍內(nèi)。用于確定有菌株產(chǎn)生乙醇和甘油的量的方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如，測試來確定在發(fā)酵玉米醪期間由菌株產(chǎn)生的乙醇和甘油的量的方法描述于，例如，wo2011/035392中。一旦所產(chǎn)生的乙醇和甘油的量是已知的，那么乙醇/甘油的比率可以很容易確定。因此，使用已知的方法，可以很容易地針對乙醇和/或甘油的生產(chǎn)水平來篩選菌株。在一個實施例中，表現(xiàn)出菌株v14/004037的一種或多種定義特性的菌株v14/004037的衍生物可以是菌株v14/004037的突變體。用于生產(chǎn)酵母菌屬酵母突變體，并且尤其是釀酒酵母突變體的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且描述于，例如，勞倫斯(lawrence)c.w.(1991)酶學方法(methodsinenzymology)，194:273-281中。在另一個實施例中，表現(xiàn)出菌株v14/004037的一種或多種定義特性的菌株v14/004037的衍生物可以是菌株v14/004037的重組衍生物。菌株v14/004037的重組衍生物是通過使用重組dna技術(shù)將核酸引入菌株v14/004037產(chǎn)生的菌株。用于將核酸引入酵母菌屬酵母細胞、并且具體地是酵母菌屬菌株的方法是本領(lǐng)域中已知的并且描述于，例如，奧蘇貝爾(ausubel)，f.m.等人(1997)，當代分子生物學實驗手冊(currentprotocolsinmolecularbiology)，第2卷，第13.7.1至13.7.7頁中，其由約翰&威利父子公司(johnwiley&sonsinc)出版。本發(fā)明還涉及使用在此描述的菌株用于生產(chǎn)乙醇的方法。在一個形式中，將菌株v14/004037或表現(xiàn)出菌株v14/004037的定義特性的衍生菌株，在允許發(fā)酵可發(fā)酵糖的條件下，使用包括可發(fā)酵糖的底物進行孵育。該可發(fā)酵糖可以是葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、果糖和蔗糖中的一種或多種。典型地，該可發(fā)酵糖是葡萄糖。當菌株v14/004037非常適合于在玉米醪中的發(fā)酵時，可以設(shè)想該菌株還可以適用于其他發(fā)酵方法。因此，底物中可發(fā)酵糖的來源可以是，例如，水解淀粉、水解纖維素、糖蜜、蔗汁、葡萄汁、果汁、葡萄糖、麥芽糊精、原糖汁、半乳糖、蔗糖、或任何其他形式的可發(fā)酵糖。在一個形式中，底物中的可發(fā)酵糖的來源是水解淀粉。典型地，該淀粉獲得自底物如玉米醪。在制備底物中，典型地研磨谷物，并且在導致淀粉水解和釋放可發(fā)酵糖(如葡萄糖)的條件下，將水和一種或多種水解酶混合。用于水解淀粉的典型的酶包括α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、支鏈淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、或其混合物。適用于水解的酶可以從，例如，諾維信或杰能科公司獲得。在一個形式中，以玉米醪形式提供底物。玉米醪典型地通過以下各項來生產(chǎn)：(a)研磨玉米以形成粉；(b)將該粉與水混合；和(c)水解玉米粉中的淀粉。用于制備玉米醪的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且描述于，例如，托馬斯(thomas)，k.c.等人，(2001)應用生物學雜志(journalofappliedmicrobiology)，第90卷，第819-828頁。用于制備其他基于淀粉的底物(包括高粱、淀粉流及其組合)的方法在本領(lǐng)域中也是已知的，并且描述于，例如，克維亞特科夫斯基(kwiatkowski)j.r.等人，(2003)工業(yè)作物和產(chǎn)物(industrialcropsandproducts)23:288-296和布薩斯特(bothast)r.j.和施利澈(schlicher)m.a.(2005)應用微生物技術(shù)(appliedmicrobialbiotechnology)67:19-25在允許可發(fā)酵糖發(fā)酵的溫度下進行發(fā)酵。典型地，進行發(fā)酵的溫度是從25℃-34℃。該發(fā)酵產(chǎn)生在溶液中包括乙醇和剩余糖的酒精醪液和包括殘余固體(包括酵母)的顆粒部分。使用本領(lǐng)域中已知的方法(如蒸餾或過濾)將乙醇從醪液中分離。用于發(fā)酵和蒸餾的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且描述于，例如，克維亞特科夫斯基(kwiatkowski)j.r.等人，(2003)工業(yè)作物和產(chǎn)物(industrialcropsandproducts)23:288-296和布薩斯特(bothast)r.j.和施利澈(schlicher)m.a.(2005)應用微生物技術(shù)(appliedmicrobialbiotechnology)67:19-25本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)蒸餾酒糟的方法。蒸餾酒糟可以從發(fā)酵中所產(chǎn)生的殘余固體使用本領(lǐng)域中已知的并且描述于，例如，美國專利7,572,353中的方法來生產(chǎn)。因為酵母菌屬菌株v14/004037減少了發(fā)酵后殘余的剩余糖的水平，因此使用菌株v14/004037從發(fā)酵產(chǎn)生的蒸餾酒糟具有降低的葡萄糖含量，并且因此更穩(wěn)定其不易發(fā)生炭化、焦糖化或被不想要的微生物污染。此外，蒸餾酒糟中的較低甘油含量是一種方法優(yōu)勢，因為需要較少時間干燥蒸餾酒糟。此外，蒸餾酒糟中較少甘油導致改進的可流動性，并且進一步導致具有較高營養(yǎng)含量(例如，較高蛋白)的蒸餾酒糟。如在此使用的，單數(shù)形式“一種(a)”、“一種(an)”以及“該”包括復數(shù)個指示物，除非上下文中另外明確指明。因此，例如，提及“細胞”包括多種此類細胞。除非另外定義，否則在此使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。如在此使用的，除了由于表達語言或必需含義情況下另有要求外，詞語“包含(comprise)”或變形如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”以包容性意義使用，即指定所述特征的存在，但不排除本發(fā)明各種實施方式中存在或加入了其他特征。測試t1步驟1：使用標準微生物學技術(shù)，將酵母菌株劃線到使用2％瓊脂固化的2％w/vd-葡萄糖、1％細菌蛋白胨和0.5％酵母膏培養(yǎng)基上。步驟2：在30℃下孵育72小時后，使用無菌微生物環(huán)將酵母細胞從板中取出并且接種于50ml的肉湯中至介于0.1和0.2單位(處于t0的od600)之間的od600(處于600nm的光密度)，該肉湯在250ml埃倫邁爾(erlenmeyer)燒瓶中包含在蒸餾水中的木糖(5％w/v)、difco酵母氮源w/o氨基酸(0.67％)、檸檬酸(0.3％)和檸檬酸三鈉(0.7％)。0.1單位的od600等于約9x105酵母細胞/ml。d-(+)-木糖(最低99％)可從西格瑪-奧德里奇(sigma-aldrich)公司獲得。步驟3：在30℃下，在220rpm(10cm軌道直徑)的震蕩下，將培養(yǎng)物孵育48小時。步驟4：在48小時孵育后，測量培養(yǎng)物的od600(在t48處的od600)。步驟5：通過以下公式確定生物質(zhì)的倍數(shù)增加：在t48處的od600/在t0處的od600。本發(fā)明的組合物在此方面中，本發(fā)明涉及一種配制的酵母菌屬酵母組合物，該酵母菌屬酵母組合物包括本發(fā)明的酵母菌株和天然發(fā)生的和/或非天然發(fā)生的組分。如以上提及的，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的酵母菌屬酵母菌株，具體地釀酒酵母菌株可以是任何活力形式，包括粉碎、干燥，包括活性干燥和即食、壓縮、膏狀(液體)形式等。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的釀酒酵母菌株是干酵母，如活性干酵母或即食酵母。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的釀酒酵母菌株是粉碎的酵母。在一個優(yōu)選的實施例中，釀酒酵母菌株是壓縮的酵母。在一個實施例中，本發(fā)明的釀酒酵母菌株是膏狀酵母。在一個實施例中，本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包括本發(fā)明的酵母菌屬酵母(具體地酵母菌屬mbg4851)和選自下組的一種或多種組分，該組由以下各項組成：表面活性劑、乳化劑、樹膠、溶脹劑、和抗氧化劑及其他加工助劑。表面活性劑根據(jù)本發(fā)明，該組合物可以包括本發(fā)明的酵母菌屬酵母(具體地酵母菌屬mbg4851)和任何適合的表面活性劑。在一個實施例中，該一種或多種表面活性劑是陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、和/或非離子表面活性劑。乳化劑根據(jù)本發(fā)明，該組合物可以包括本發(fā)明的酵母菌屬酵母(具體地酵母菌屬mbg4851)和任何適合的乳化劑。在一個實施例中，該乳化劑是山梨聚糖的脂肪酸酯。在一個實施例中，該乳化劑選自下組：脫水山梨糖醇單硬脂酸酯(sms)、單雙甘酯的檸檬酸酯、聚甘油酯、丙二醇的脂肪酸酯。在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括本發(fā)明的酵母菌屬酵母(具體地酵母菌屬mbg4851)、和olindronalsms、olindronalsk、或olindronalspl，包括歐洲專利號1,724,336(特此通過引用結(jié)合)中涉及的組合物。針對活性干酵母，這些產(chǎn)品可以從布塞蒂，奧地利商購獲得。樹膠根據(jù)本發(fā)明，該組合物可以包括本發(fā)明的酵母菌屬酵母(具體地酵母菌屬mbg4851)和任何適合的樹膠。在一個實施例中，樹膠選自下組：槐樹豆膠、瓜爾膠、黃芪膠、阿拉伯膠、黃原膠和阿拉伯樹膠，具體地針對膏狀、壓縮和干酵母。溶脹劑根據(jù)本發(fā)明，該組合物可以包括本發(fā)明的酵母菌屬酵母(具體地酵母菌屬mbg4851)和任何適合的溶脹劑。在一個實施例中，該溶脹劑是甲基纖維素或羧甲基纖維素。抗氧化劑根據(jù)本發(fā)明，該組合物可以包括本發(fā)明的酵母菌屬酵母(具體地酵母菌屬mbg4851)和任何適合的抗氧化劑。在一個實施例中，該抗氧化劑是丁羥茴醚(bha)和/或丁羥甲苯(bht)、或抗壞血酸(維生素c)，具體地針對活性干酵母。如在此使用的，單數(shù)形式“一個(a)”、“一種(an)”以及“該(the)”包括復數(shù)個指示物，除非上下文中另外明確指明。因此，例如，提及“細胞”包括多種此類細胞。除非另外定義，否則在此使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。如在此使用的，除了由于表達語言或必需含義情況下另有要求外，詞語“包含(comprise)”或變形如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”以包容性意義使用，即指定所述特征的存在，但不排除本發(fā)明各種實施方式中存在或加入了其他特征。在此引用了不同的參考，其披露通過引用以其全部內(nèi)部結(jié)合在此。材料與方法材料：α-淀粉酶a(“aaa”)：嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，具有突變i181*+g182*+n193f，截短至491個氨基酸(使用在此的seqidno:1進行編號)α-淀粉酶f：在商品名fuelzymetm下由美國verenium公司銷售的商業(yè)α-淀粉酶。α-淀粉酶369(“aa369”)：嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，具有突變：i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v，截短至491個氨基酸(使用在此的seqidno:1進行編號)；草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體pe498(“poamg498”)：草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體具有以下突變：k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f(使用在此的seqidno:14進行編號)：蛋白酶pfu(“pfu”)：在此的seqidno:13中示出的源自強烈火球菌的蛋白酶。蛋白酶x：源自金黃色嗜熱子囊菌cgmccno.0670的、披露為在此的seqidno:3中的氨基酸1-177以及wo2003/048353的seqidno:2中的氨基酸1至177的金屬蛋白酶。葡糖淀粉酶sa(“gsa”)包括一種共混物，該共混物包括wo99/28448中所披露的埃默森籃狀菌葡糖淀粉酶(在此的seqidno:19)、wo06/69289中披露為seqidno:2和在此的seqidno:20的瓣環(huán)栓菌葡糖淀粉酶、和具有黑曲霉葡糖淀粉酶連接體的微小根毛霉α-淀粉酶和披露為在此的seqidno:16、具有以下突變的sbd：g128d+d143n(活度比agu:agu:fau(f)：約30:7:1)。纖維素酶vd(“cvd”)：纖維分解組合物源自里氏木霉，包括具有纖維素分解增強活性的gh61a多肽(該多肽源自埃默森青霉菌菌株(wo2011/041397中的seqidno:2))，wo2012/044915中所披露的、具有以下取代的煙曲霉β-葡糖苷酶變體(wo2005/047499中的seqidno:2)：f100d、s283g、n456e、f512y；在wo2011/057140中披露為seqidno:6的煙曲霉cel7acbh1和wo2011/057140中披露為seqidno:18的煙曲霉cbhii。酵母：ethanolredtm(“er”)：可從美國富酶泰斯公司/樂斯福公司(fermentis/lesaffre)獲得的釀酒酵母。mbg4851：由微生物基因(microbiogen)私人公司，e2單元，巷灣商務園，火星路16號，巷灣，nsw2066，澳大利亞，依據(jù)布達佩斯條約的條款，在澳大利亞維多利亞計量研究所下保藏的以及給出的以下登錄號的釀酒酵母(非重組)：保藏物登錄號保藏日期mbg4851v14/0040372014年2月17日該菌株于下述條件下保藏：確保在本專利申請未決期間，由專利與商標委員依據(jù)37c.f.r.§1.14和35u.s.c.§122授權(quán)的人能夠獲得該培養(yǎng)物。所述保藏物代表所保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。需要按一些國家的國外專利法要求提供保藏物，在這些國家提交該主題申請的副本，或其后續(xù)文本。然而應理解，保藏物的可用性不構(gòu)成將本發(fā)明主題用于由政府行為批準的專利權(quán)的實踐的許可。在此描述并且要求保護的本發(fā)明不限于在此披露的特定方面的范圍，因為這些方面旨在作為本發(fā)明若干方面的說明。預期任何等效方面都處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實際上，除在此所示和描述的那些之外，本發(fā)明的不同修改對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言從前述描述將變得清楚。此類修改也旨在落入所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。在有沖突的情況下，以包括定義的本披露為準。在此引用了不同的參考，其披露通過引用以其全部內(nèi)部結(jié)合在此。方法一致性：兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)“一致性”描述。出于本發(fā)明的目的，可以通過程序“比對”確定兩個氨基酸序列之間的一致性程度以及兩個核苷酸序列之間的一致性程度，所述程序是尼德爾曼-翁施比對(needleman-wunschalignment)(即總體對比)。使用該程序進行多肽以及核苷酸序列的比對。使用缺省評分矩陣blosum50進行多肽比對，使用缺省一致性矩陣進行核苷酸比對。對多肽而言，缺口第一個殘基的罰分為-12，對核苷酸而言該罰分為-16。對多肽而言，缺口另外殘基的罰分為-2，對核苷酸而言該罰分為-4?！氨葘Α笔莊asta包版本v20u6的一部分(參見皮爾遜(w.r.pearson)和利普曼(d.j.lipman)(1988)，用于生物序列分析的改進的工具(“improvedtoolsforbiologicalsequenceanalysis”)，pnas85:2444-2448，和皮爾遜(1990)使用fastp和fasta進行的快速且靈敏的序列比較(“rapidandsensitivesequencecomparisonwithfastpandfasta”)酶學方法(methodsinenzymology)183:63-98)。fasta蛋白比對使用史密斯-沃特曼算法(smith-watermanalgorithm)進行，對缺口大小沒有限制(參見史密斯-沃特曼算法(“smith-watermanalgorithm”)，史密斯(t.f.smith)和沃特曼(m.s.waterman)(1981)分子與生物學雜志(j.mol.biol.)147:195-197)。蛋白酶測定azcl-酪蛋白測定邊攪拌邊將藍色底物azcl-酪蛋白的0.2％溶液懸浮于ph9的borax/nah2po4緩沖液中。邊攪拌邊將該溶液分散在微量滴定板(每孔100微升)上，添加30微升酶樣品并且將這些板在艾本德熱混器(eppendorfthermomixer)中在45℃和600rpm下孵育30分鐘。使用變性的酶樣品(100℃煮沸20min)用作空白對照。孵育之后通過將微量滴定板轉(zhuǎn)移到冰上來終止該反應并且通過在4℃下以3000rpm離心5分鐘將著色的溶液與固體分離。將60微升的上清液轉(zhuǎn)移到微量滴定板并且使用伯樂酶標儀(bioradmicroplatereader)測量在595nm處的吸光度。pna測定將50微升含蛋白酶樣品添加到微量滴定板并且通過添加100微升1mmpna底物(5mg溶解于100微升dmso中并進一步用ph9.0的borax/nah2po4緩沖液稀釋至10ml)開始該測定。od405在室溫下的增加被監(jiān)測為蛋白酶活性的一個量度。葡糖淀粉酶活性(agu)可以按葡糖淀粉酶單位(agu)來測量葡糖淀粉酶活性。novo葡糖淀粉酶單位(agu)定義為在以下標準條件下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量：37℃，ph4.3，底物：麥芽糖23.2mm，緩沖液：乙酸鹽0.1m，反應時間5分鐘?？梢允褂米詣臃治鰞x系統(tǒng)。將變旋酶添加到葡萄糖脫氫酶試劑中，這樣使得存在的任何α-d-葡萄糖變?yōu)棣?d-葡萄糖。葡萄糖脫氫酶在以上提到的反應中與β-d-葡萄糖特異性反應，形成nadh，在340nm下使用光度計測定該nadh作為原始葡萄糖濃度的量度。amg孵育：底物：麥芽糖23.2mm緩沖液：乙酸鹽0.1mph：4.30±0.05孵育溫度：37℃±1℃反應時間：5分鐘酶工作范圍：0.5-4.0agu/ml顏色反應：glucdh：430u/l變旋酶：9u/lnad：0.21mm緩沖液：磷酸鹽0.12m；0.15mnaclph：7.60±0.05孵育溫度：37℃±1℃反應時間：5分鐘波長：340nm更詳細描述這種分析方法的文件(eb-sm-0131.02/01)可從丹麥的諾維信公司索取得到，通過引用將該文件結(jié)合在此。酸性α-淀粉酶活性(afau)能以afau(酸性真菌α-淀粉酶單位)測量酸性α-淀粉酶活性，相對于酶標準品而確定afau。1afau被定義為在下述標準條件下每小時降解5.260mg淀粉干物質(zhì)的酶量。酸性α-淀粉酶是內(nèi)-α-淀粉酶(1,4-α-d-葡聚糖-葡糖水解酶，e.c.3.2.1.1)，它水解在淀粉分子的內(nèi)部區(qū)域中的α-1,4-糖苷鍵以形成具有不同鏈長度的糊精和寡糖。與碘形成的顏色的強度跟淀粉的濃度成正比。使用反向比色法將酶活性測定為在指定的分析條件下淀粉濃度的減小。藍色/紫色t＝23秒脫色標準條件/反應條件：更詳細地描述這種分析方法的文件夾eb-sm-0259.02/01可以從丹麥的諾維信公司索取得到，通過引用將該文件夾包括在此。α-淀粉酶活性(knu)可釆用馬鈴薯淀粉作為底物來測定α-淀粉酶活性。此方法是基于由酶分解改性的馬鈴薯淀粉，并且該反應隨后是將淀粉/酶溶液的樣品與碘溶液混合。最初形成微黑藍色，但淀粉分解過程中藍色變?nèi)醪⑶抑饾u變?yōu)榧t褐色，將其與有色玻璃標準品比較。1個kilonovoα-淀粉酶單位(knu)定義為在標準條件(即，在37℃+/-0.05℃；0.0003mca2+；和ph5.6下)下，糊精化5260mg淀粉干物質(zhì)默克公司(merck)可溶性淀粉的酶量。更詳細地描述這種分析方法的文件夾eb-sm-0009.02/01可以從丹麥的諾維信公司索取得到，通過引用將該文件夾包括在此。α-淀粉酶活性(knu-a)相對于所聲明強度的酶標準，以knu(a)kilonovozymes單位(a)測量α淀粉酶活性。樣品中的α淀粉酶和試劑盒中的α-葡糖苷酶將底物(4,6-亞乙基(g7)-對硝基苯基(g1)-α、d-麥芽七糖苷(亞乙基-g7pnp)水解成葡萄糖和黃色對硝基苯酚。通過konelab30觀察對硝基酚的形成速率。這是反應速率及其酶活性的表達。該酶是具有酶分類號ec3.2.1.1的α-淀粉酶。關(guān)于確定knu-a活性的文件夾eb-sm-5091.02-d可以從丹麥的諾維信公司索取得到，通過引用將該文件夾包括在此。α-淀粉酶活性knu(s)樣品中的bs-淀粉酶和試劑盒中的酶α-葡糖苷酶將底物(4,6-亞乙基(g7)-對硝基苯基(g1)-α-d-麥芽七糖苷(亞乙基-g7pnp))水解成葡萄糖和黃色對硝基苯酚。通過konelab30觀察對硝基酚的形成速率。這是反應速率及其酶活性的表達。反應條件反應：ph：7.15溫度：37℃反應時間：180秒檢測波長：405nm測量時間：120秒單位定義相對于具有聲明強度的酶標準品，以knu(s)kilonovo單位(嗜熱脂肪(sterarothermophilus))測量嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶(bs-淀粉酶)活性。這種分析方法更詳細的描述于可從丹麥的諾維信公司索取得到的eb-sm-0221.02(通過引用結(jié)合)中。fau(f)確定相對于具有聲明強度的酶標準品，測量fau(f)真菌α-淀粉酶單位(真菌淀粉(fungamyl))。更詳細地描述這種標準方法的文件夾(eb-sm-0216.02)可以從丹麥的諾維信公司索取得到，通過引用將該文件夾包括在此。支鏈淀粉酶活性(npun)的確定相對于諾維信支鏈淀粉酶標準品測量npun中的內(nèi)切-支鏈淀粉酶活性。一個支鏈淀粉酶單位(npun)定義為在標準條件下(0.7％紅色支鏈淀粉(redpullulan)(麥格酶公司(megazyme)，ph5，40℃，20分鐘)每分鐘釋放1微摩爾葡萄糖的酶量。使用紅色普魯蘭以npun/ml測量該活性。將1ml稀釋的樣品或標準品在40℃下孵育2分鐘。添加0.5ml2％紅色普魯蘭、0.5mkcl、50mm檸檬酸，ph5并混合。將這些管在40℃下孵育20分鐘并且通過添加2.5ml80％乙醇終止。將這些管在室溫下靜置10-60分鐘，隨后以4000rpm離心10分鐘。然后在510nm處測量上清液od并且使用標準品曲線計算活性。本發(fā)明將在以下實例中進行更詳細的描述，這些實例被提供用以說明本發(fā)明而決不意圖限制本發(fā)明要求的范圍。在此引用的所有參考文獻針對在本文中進行的描述通過引用具體結(jié)合。實例實例1α-淀粉酶變體的穩(wěn)定性通過將參比α-淀粉酶(具有突變i181*+g182*+n193f的、截短至491個氨基酸的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(以seqidno:1進行編號))及其α-淀粉酶變體在ph4.5和5.5下以及在溫度75℃和85℃下用0.12mmcacl2進行孵育，隨后使用底物(超級淀粉酶測定試劑盒(ultraamylaseassaykit)，e33651，分子探針公司(molecularprobes))進行殘余活性測量來測量該參比α-淀粉酶及變體的穩(wěn)定性。使純化的酶樣品在酶稀釋緩沖液(10mm乙酸鹽、0.01％tritonx100、0.12mmcacl2，ph5.0)中稀釋至0.5和1或5和10ppm(微克/毫升)的工作濃度。將二十微升酶樣品轉(zhuǎn)移至48孔pcrmtp并且將180微升穩(wěn)定性緩沖液(150mm乙酸鹽、150mmmes、0.01％tritonx100、0.12mmcacl2，ph4.5或5.5)添加至每個孔并且混合。測定使用兩種濃度的酶來重復兩次執(zhí)行。在75℃或85℃孵育之前，取出20微升并且儲存在冰上作為對照樣品。在pcr儀(在75℃和85℃下)中進行孵育。孵育之后，將樣品在殘余活性緩沖液(100mm乙酸鹽、0.01％tritonx100、0.12mmcacl2，ph5.5)中稀釋至15ng/ml并且將25微升稀釋酶轉(zhuǎn)移至黑色384-mtp。使用enzchek底物通過將25微升底物溶液(100微克/毫升)添加至每個孔來測量殘余活性。使用485-pnm下的激發(fā)濾光器以及555nm下的發(fā)射濾光器(熒光讀取器是polarstar，bmg)每分鐘測量熒光持續(xù)15分鐘。對于每個設(shè)置，將殘余活性相對于對照樣品標準化。假定對數(shù)式衰減，那么使用方程t1/2(min)＝t(min)*ln(0.5)/ln(％ra/100)來計算半衰期時間(t1/2(min))，其中t是以分鐘為單位的測定孵育時間，并且％ra是在測定中確定的％殘余活性。使用此測定設(shè)置，針對參比α-淀粉酶及其變體確定半衰期時間，如表1中所示。表1nd未檢測到這些結(jié)果證明α-淀粉酶變體比參比α-淀粉酶具有顯著更高的半衰期和穩(wěn)定性。實例2蛋白酶變體的制備以及熱穩(wěn)定性測試菌株與質(zhì)粒使用大腸桿菌dh12s(可獲得自吉博科公司(gibcobrl))用于酵母質(zhì)粒拯救。pjtp000是一種在tpi啟動子的控制之下的釀酒酵母和大腸桿菌穿梭載體，構(gòu)建自描述于wo01/92502中的pjc039，其中已經(jīng)插入了金黃色嗜熱子囊菌m35蛋白酶基因(wo03048353)。將釀酒酵母yng318感受態(tài)細胞：matadpep4[cir+]ura3-52、leu2-d2、his4-539用于蛋白酶變體表達。這被描述于生物化學雜志272(15)，第9720-9727頁，1997中。培養(yǎng)基與底物10x基礎(chǔ)溶液：酵母氮基w/o氨基酸(difco)66.8g/l，琥珀酸鹽100g/l，naoh60g/l。sc-葡萄糖：20％葡萄糖(即，終濃度為2％＝2g/100ml)100ml/l，5％蘇氨酸4ml/l，1％色氨酸10ml/l，20％酪蛋白氨基酸25ml/l，10x基礎(chǔ)溶液100ml/l。使用孔徑大小為0.20微米的過濾器將溶液滅菌。將瓊脂(2％)和h2o(大約761ml)一起熱壓處理，并且向瓊脂溶液中添加分開滅菌的sc-葡萄糖溶液。ypd：細菌蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，20％葡萄糖100ml/l。ypd+zn：ypd+0.25mmznso4。peg/liac溶液：40％peg400050ml，5m乙酸鋰1ml。96孔玉米素微滴度板：每個孔包含200微升的0.05％-0.1％的玉米素(西格瑪公司(sigma))，0.25mmznso4以及1％的瓊脂于20mm乙酸鈉緩沖液中，ph4.5。dna操縱除非另外說明，否則使用如以下所述的分子生物學標準方法來進行dna操縱和轉(zhuǎn)化：薩拉布魯克等人(1989)，分子克?。簩嶒炇沂謨?，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；奧蘇貝爾·f·m(ausubel,f.m.)等人(編輯)“分子生物學實驗指南(currentprotocolsinmolecularbiology)”，約翰威立父子公司，1995；哈伍德·c·r(harwood,c.r.)&卡廷·s·m(cutting,s.m.)(編輯)。酵母轉(zhuǎn)化使用乙酸鋰法進行酵母轉(zhuǎn)化?；旌?.5微升載體(由限制性內(nèi)切核酸酶消化)以及1微升的pcr片段。將dna混合物、100微升的yng318感受態(tài)細胞、以及10微升的酵母標記載體dna(yeastmakercarrierdna)(克羅泰克公司(clontech))添加到12ml聚丙烯管(獵鷹(falcon)2059)中。添加0.6mlpeg/liac溶液并溫和混合。在30℃下并且200rpm孵育30min，并且隨后在42℃下30min(熱休克)。轉(zhuǎn)移至埃彭道夫管中并且離心5秒。移去上清液并且溶解于3ml的ypd中。在30℃以200rpm孵育該細胞懸浮液45min。將懸浮液傾倒在sc-葡萄糖板上并在30℃孵育3天以生長菌落。通過zymoprep酵母質(zhì)粒小提試劑盒提取酵母總dna(zymo研究公司(zymoresearch))。dna測序通過電穿孔(伯樂基因脈沖發(fā)生器(bio-radgenepulser))進行用于dna測序的大腸桿菌轉(zhuǎn)化。通過堿法(分子克隆，冷泉港)或使用質(zhì)粒試劑盒制備dna質(zhì)粒。通過凱杰凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收dna片段。使用ptc-200dna引擎(ptc-200dnaengine)進行pcr。使用abiprismtm310基因分析器來測定所有的dna序列。蛋白酶表達載體的構(gòu)建使用引物對protf(seqidno:4)和protr(seqidno:5)擴增嗜熱子囊菌屬m35蛋白酶基因。將所得pcr片段連同pjc039載體引入釀酒酵母yng318(描述于wo2001/92502中)，用限制性內(nèi)切酶消化以去除特異腐質(zhì)霉角質(zhì)酶基因?；厥赵趕c-葡萄糖板上的酵母克隆中的質(zhì)粒以確認內(nèi)部序列并稱作pjtp001。酵母文庫和定點變體的構(gòu)建通過soepcr法(重疊延伸剪接(splicingbyoverlapextension)，參見“pcr：一種實用方法(pcr:apracticalapproach)”，第207-209頁，牛津大學出版社(oxforduniversitypress)，編輯麥克弗森(mcpherson)、夸克(quirke)、泰勒(taylor))構(gòu)建酵母文庫和定點變體，隨后進行酵母體內(nèi)重組。用于擴增和測序的通用引物使用引物am34(seqidno:6)和am35(seqidno:7)通過soe法與簡并引物(am34+反向引物和am35+正向引物)一起制備包含任何突變的片段的dna片段或僅僅擴增整個蛋白酶基因(am34+am35)。通過凱杰凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收dna片段。將所得純化的片段與載體消化物混合。將混合溶液引入釀酒酵母中，以通過體內(nèi)重組構(gòu)建文庫或定點變體。相對活性測定將sc-葡萄糖上的酵母克隆接種進包含ypd+zn培養(yǎng)基的96孔微滴度板的孔中并在28℃下培養(yǎng)3天。將培養(yǎng)物上清液施加到96孔玉米素微滴定板并在至少2個溫度(例如，60℃和65℃、70℃和75℃、70℃和80℃)下孵育超過4小時或過夜。玉米素在板中的濁度被測量為a630并且相對活性(較高/較低溫度)被確定為熱穩(wěn)定性改進的一個指示。選擇比親本變體具有更高相對活性的克隆并確定該序列。殘余活性測定將sc-葡萄糖上的酵母克隆接種進96孔微滴度板的孔中并在28℃下培養(yǎng)3天。將該培養(yǎng)物上清液在特定溫度(80℃或84℃，4℃作為一個參考)下于20mm乙酸鈉緩沖液、ph4.5中孵育10min之后，使用偶氮-酪蛋白(麥格酶公司)在65℃下測定蛋白酶活性，從而確定殘余活性。選擇比親本變體具有更高殘余活性的克隆并確定這些序列。偶氮-酪蛋白測定將20微升樣品與150微升底物溶液(4ml的在乙醇中的12.5％偶氮-酪蛋白，在96ml的20mm乙酸鈉(ph4.5)中，包含0.01％曲通-100和0.25mmznso4)混合并孵育4小時或更久。添加20微升/孔的100％三氯乙酸(tca)溶液之后，將該板離心并且吸取100微升的上清液以測量a440。蛋白酶變體在米曲霉中的表達使用包括蛋白酶變體基因的構(gòu)建體來構(gòu)建用于曲霉屬的表達載體。曲霉屬表達載體由一個表達盒組成，該表達盒是基于融合至構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的非翻譯前導序列的黑曲霉中性淀粉酶ii啟動子(pna2/tpi)和黑曲霉淀粉糖苷酶終止子(tamg)。質(zhì)粒上還存在使得可以在作為唯一氮源的乙酰胺上生長的來自構(gòu)巢曲霉的曲霉屬選擇性標記amds。如描述于拉森(lassen)等人(2001)，應用與環(huán)境微生物學(appliedandenvironmentalmicorbiology)，67，4701-4707中，將蛋白酶變體的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進曲霉屬中。用于每個構(gòu)建體，分離、純化并在搖瓶中培養(yǎng)10-20個菌株。所表達的變體的純化1.調(diào)節(jié)0.22μm經(jīng)過濾的發(fā)酵樣品的ph至4.0。2.將樣品置于冰浴中，伴隨磁力攪拌。以小量的等分部分添加(nh4)2so4(對應于大約2.0-2.2m(nh4)2so4，當添加該化合物時未考慮體積增加)。3.(nh4)2so4的最終添加之后，將該樣品于冰浴中伴隨輕柔的磁力攪拌孵育min.45min。4.離心：日立(hitachi)himaccr20g高速冷凍離心機，配備有r20a2轉(zhuǎn)頭，5℃，20,000rpm，30min。5.將形成的沉淀溶解于200ml50mm乙酸鈉(ph4.0)中。6.通過真空吸引器(易威奇公司(iwaki))使用0.22μmpesplus膜過濾該樣品。7.在冷室中，使用超濾法(來自賽多利斯公司(vivascience)的vivacell250，配備有5kdamwcopes膜)將樣品脫鹽/緩沖液-過夜交換到50mm乙酸鈉(ph4.0)中。使用50mm乙酸鈉(ph4.0)將殘余樣品稀釋至200ml。樣品的導電性優(yōu)選地小于5ms/cm。8.將樣品加載到用50mm乙酸鈉(ph4.0)平衡的陽離子交換柱上。使用3倍柱體積的結(jié)合緩沖液(50mm乙酸鈉ph4.0)將未結(jié)合樣品從該柱洗出，并且使用線性梯度(0-100％洗脫緩沖液(50mm乙酸鈉+1mnacl，ph4.0))，以10倍柱體積對樣品進行洗脫。9.通過內(nèi)切-蛋白酶測定(參見下文)測定所收集的級分，隨后對所選擇的級分進行標準sds-page(還原條件)。基于內(nèi)切-蛋白酶測定和sds-page匯集多個級分。內(nèi)切-蛋白酶測定1.通過磁力攪拌溶解protazymeol片/5ml250mm乙酸鈉(ph5.0)(底物：來自麥格酶公司的、目錄號prak11/08的內(nèi)切-蛋白酶protazymeak片)。2.邊攪拌邊將250微升的底物溶液轉(zhuǎn)移到1.5ml的艾本德管。3.向每個管中添加25微升的樣品(空白對照是樣品緩沖液)。4.將這些管在50℃下在熱混器中振蕩(1000rpm)孵育15分鐘。5.向每個管中添加250微升的1mnaoh，隨后進行渦旋。6.以16,100×g并且在25℃下離心3min。7.將200微升的上清液轉(zhuǎn)移到mtp，并且記錄590nm處的吸光度。結(jié)果實例3使用純化的酶，所選擇變體的溫度特征曲線純化所選擇的顯示良好熱穩(wěn)定性的變體并且將經(jīng)純化的酶用于如下所述的玉米素-bca測定中。將該酶在如所指出的升高的溫度下孵育60min之后，在60℃確定殘余蛋白酶活性。玉米素-bca測定：在不同溫度下通過變體蛋白酶進行玉米素-bca測定以檢測釋放自玉米素的可溶性蛋白的定量。方案：1)混合10ul的10ug/ml酶溶液和100ul的0.025％玉米素溶液于微滴定板(mtp)中。2)在不同溫度下孵育60min。3)添加10ul的100％三氯乙酸(tca)溶液。4)以3500rpm離心mtp5min。5)取15ul至一個新的包含100ulbca測定溶液的mtp中(皮爾斯公司(pierce)目錄號：23225,bca蛋白測定試劑盒)。6)在60℃下孵育30min。7)測量a562。結(jié)果示于表6中。與野生型蛋白酶相比較，所有的經(jīng)測試的變體均顯示改進的熱穩(wěn)定性。表6.玉米素-bca測定實例4草酸青霉菌葡糖淀粉酶的表征該草酸青霉菌葡糖淀粉酶披露于在此的seqidno:9中。底物。底物：1％可溶性淀粉(西格瑪(sigma)s-9765)于去離子水中反應緩沖液：0.1m乙酸鹽緩沖液，ph5.3葡萄糖濃度測定試劑盒：和光葡萄糖測定試劑盒(labassay葡萄糖，和光株式會社，目錄號298-65701)。反應條件。將20微升的可溶性淀粉與50微升的乙酸鹽緩沖液(ph5.3)混合。添加30微升的酶溶液(50μg酶蛋白質(zhì)/ml)達到100微升最終體積，隨后在37℃下孵育15分鐘。葡萄糖濃度是通過和光試劑盒(wakokits)測定。所有這些工作都平行進行。最適溫度。為了評估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的最適溫度，以上描述的“反應條件”-測定是在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、90℃以及95℃下進行的。結(jié)果示于表7中。表7最適溫度從這些結(jié)果可知草酸青霉菌葡糖淀粉酶在給定條件下的最適溫度是在50℃與70℃之間并且該葡糖淀粉酶在95℃維持超過80％活性。熱穩(wěn)定性。為了評估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性，對反應條件測定進行修改，其中將酶溶液和乙酸緩沖液在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃和95℃下預孵育15min。孵育之后，向該溶液中添加20微升淀粉并且如上所述進行該測定。結(jié)果示于表8中。表8熱穩(wěn)定性從這些結(jié)果可知草酸青霉菌葡糖淀粉酶在預孵育15min后在高達70℃下是穩(wěn)定的，因為它維持超過80％活性。ph最佳值。為了評估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的ph最佳值，在如下ph下進行上述反應條件測定：ph2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.07.0、8.0、9.0、10.0和11.0。使用以下緩沖液來代替在該反應條件測定中所描述的乙酸鹽緩沖液：100mm的琥珀酸、hepes、ches、capso、1mmcacl2、150mmkcl、0.01％tritonx-100，ph用hcl或naoh調(diào)整到2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或11.0。結(jié)果示于表9中。表9ph最佳值從這些結(jié)果可知在給定條件下草酸青霉菌葡糖淀粉酶在ph5.0下具有最高活性。該草酸青霉菌葡糖淀粉酶在寬泛的ph范圍內(nèi)是有活性的，因為它在從ph2至7維持超過50％活性。ph穩(wěn)定性。為了評估草酸青霉菌葡糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性，將反應條件測定進行修改，其中使用上述ph最佳值下的緩沖液，在具有ph2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.07.0、8.0、9.0、10.0和11.0的緩沖液中將酶溶液(50微克/ml)預孵育20小時。預孵育之后，向該溶液中添加20微升可溶性淀粉至100微升的最終體積并且如上所述進行該測定。結(jié)果示于表10中。表10ph穩(wěn)定性從這些結(jié)果可知草酸青霉菌葡糖淀粉酶在預孵育20小時后從ph3至ph7是穩(wěn)定的并且其在ph8下降低活性。實例5蛋白酶pfu的熱穩(wěn)定性購買自日本寶酒造生物公司的強烈火球菌蛋白酶(pfus)的熱穩(wěn)定性使用如與實例2中相同的方法進行檢測。發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定性(相對活性)在ph4.5下是110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)。實例6草酸青霉菌菌株的葡糖淀粉酶基因的克隆草酸青霉菌菌株cdna的制備。通過按照cdna末端系統(tǒng)(美國加利福尼亞州卡爾斯巴德市的英杰公司(invitrogencorp.))的3’快速擴增技術(shù)的說明來合成cdna。草酸青霉菌菌株的葡糖淀粉酶基因的克隆。使用下文所示的、被設(shè)計成用來從5’端放大葡糖淀粉酶基因的寡核苷酸引物來克隆草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因。正義引物：5’-atgcgtctcactctattatcaggtg-3’(seqidno:22)通過pcr用正義引物和auap(由cdna末端系統(tǒng)的3’快速擴增技術(shù)提供)、通過使用platinumhifitaqdna聚合酶(美國加利福尼亞州卡爾斯巴市的英杰公司)來擴增全長基因。擴增反應是由5μl的10xpcr緩沖液、2μl的25mmmgcl2、1μl的10mmdntp、1μl的10um正義引物、1μl的10umauap、2μl的第一鏈cdna、0.5μl的hifitaq、以及37.5μl的去離子水構(gòu)成的。pcr程序是：94℃，3min；10個循環(huán)：94℃持續(xù)40sec，60℃40sec、每循環(huán)降低1℃，68℃持續(xù)2min；25個循環(huán)：94℃持續(xù)40sec，50℃40sec，68℃持續(xù)2min；在68℃下進行最終延伸持續(xù)10分鐘。使用一個pgem-t載體系統(tǒng)(美國威斯康星州麥迪遜市的普洛麥格公司(promegacorporation))將獲得的pcr片段克隆到pgem-t載體(美國威斯康星州麥迪的遜市普洛麥格公司)中以產(chǎn)生質(zhì)粒amg1。對插入到質(zhì)粒amg1中的葡糖淀粉酶基因進行測序確認。將含有質(zhì)粒amg1(表示為nn059173)的大腸桿菌菌株top10于2009年11月23日保藏在德國微生物與菌種保藏中心(dsmz)并且指定保藏號為dsm23123。實例7克隆的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的表達通過pcr使用以下所示的兩種克隆引物f和引物r將草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因重新從質(zhì)粒amg1克隆到曲霉菌表達載體中，這兩種克隆引物是基于已知的序列和添加的標志來設(shè)計以用于通過in-fusiontm策略直接克隆。引物f:5’acacaactggggatccaccatgcgtctcactctattatc(seqidno:23)引物r:5’agatctcgagaagcttaaaactgccacacgtcgttgg(seqidno:24)用質(zhì)粒amg1來進行pcr反應以便擴增全長基因。pcr反應是由40μg的質(zhì)粒amg1dna、1μl的每種引物(100μm)、12.5μl的2x擴展劑高保真主體混合物(extensorhi-fidelitymastermix，英國拜力公司(abgene))、以及9.5μl的pcr級水組成。使用dyadpcr儀(美國加利福尼亞州赫拉克勒斯的伯樂實驗室有限公司(bio-radlaboratories,inc.))進行pcr反應，該儀器的程序為：在94℃下持續(xù)2分鐘，隨后進行94℃持續(xù)15秒、50℃持續(xù)30秒、以及72℃持續(xù)1分鐘的25次循環(huán)；并且然后在72℃下10分鐘。通過1.0％瓊脂糖凝膠電泳使用1×tae緩沖液來分離反應產(chǎn)物，其中將約1.9kb的pcr產(chǎn)物帶從該凝膠中切除并根據(jù)制造商的說明使用pcrdna和凝膠帶純化試劑盒(通用電氣醫(yī)療集團(gehealthcare)，英國)進行純化。根據(jù)制造商的說明，使用in-fusiontmdry-downpcr克隆試劑盒(美國加利福尼亞州帕洛阿爾托(paloalto)的bd生物科學公司(bdbiosciences))將與草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因?qū)膁na克隆到用bamhi和hindiii線性化的曲霉菌表達載體中。這一線性化的載體構(gòu)建是如wo2005/042735a1所述的。將2μl體積的連接混合物用于轉(zhuǎn)化25μl的融合藍色(fusionblue)大腸桿菌細胞(包括在n-fusiontmdry-downpcr克隆試劑盒中)。在42℃下熱休克45秒并在冰中冷卻之后，添加250μl的soc培養(yǎng)基，并且將這些細胞在225rpm下在37℃下孵育90分鐘，隨后鋪在每ml含50μg氨芐西林的lb瓊脂板上，并在37℃下培養(yǎng)過夜。在每毫升補充有50μg氨芐西林的3mllb培養(yǎng)基中接種所選擇的菌落，并在225rpm下在37℃下孵育過夜。根據(jù)制造商的說明使用微型jetstar(德國genomed公司)純化來自所選擇的菌落的質(zhì)粒dna。在異源表達之前通過桑格測序(sangersequencing)來驗證草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因序列。選擇這些質(zhì)粒之一用于進一步表達，并將其命名為xyzxyz1471-4。如wo95/02043所述地制備黑曲霉mbin118的原生質(zhì)體。將一百μl的原生質(zhì)體懸浮液與2.5μg的xyz1471-4質(zhì)粒相混合，并且添加250微升的60％peg4000(艾普利公司(applichem))(聚乙二醇，分子量4,000)、10mmcacl2、以及10mmtris-hcl(ph7.5)并輕輕混合。在37℃下孵育該混合物30分鐘并且在補充有10mm乙酰胺和15mmcscl的cove蔗糖(cove(科夫)，1996，biochim.biophys.acta(生物化學與生物物理學報)133:51-56)(1m)板上將原生質(zhì)體與6％的低熔瓊脂糖(惠泰克生物分子應用公司(biowhittakermolecularapplications))相混合，并將其作為一個頂層添加在補充有10mm乙酰胺和15mmcscl的cove蔗糖(1m)板以用于轉(zhuǎn)化株選擇(每板4ml頂層瓊脂)。在37℃下孵育5天之后，挑取十六個轉(zhuǎn)化株的孢子并將其接種在96深孔mt板中的750μlyp-2％麥芽糖培養(yǎng)基上。在30℃下靜止培養(yǎng)5天之后，在sds-page(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)凝膠，即gritonxtprecast凝膠(伯樂公司(biorad)，美國加利福尼亞州)上分析來自每個孔的10μl培養(yǎng)液，以便基于產(chǎn)生大量葡糖淀粉酶的能力鑒別最好的轉(zhuǎn)化株。在原始轉(zhuǎn)化板上鑒別所選擇的轉(zhuǎn)化株并將其作為孢子保存在20％甘油貯備物中并冷凍保存(-80℃)。培養(yǎng)。在100ml的mlc培養(yǎng)基中接種所選擇的轉(zhuǎn)化株并在30℃下在旋轉(zhuǎn)振蕩器上的500ml搖瓶中培養(yǎng)2天。將3ml的培養(yǎng)液接種到100ml的m410培養(yǎng)基中并在30℃下培養(yǎng)3天。將培養(yǎng)液離心并使用0.2μm的膜濾器過濾上清液。α-環(huán)糊精親和凝膠。使10克環(huán)氧基活化的瓊脂糖6b(英國查爾方特圣吉爾斯(chalfontst.giles)的通用電氣醫(yī)療集團)粉末懸浮在蒸餾水中并在燒結(jié)玻璃過濾器上用蒸餾水進行洗滌。使凝膠懸浮于偶合溶液(100ml的12.5mg/mlα-環(huán)糊精，0.5mnaoh)并在室溫下孵育一天，同時輕輕振蕩。在燒結(jié)玻璃過濾器上使用蒸餾水洗滌該凝膠，并使其懸浮在ph10的100ml1m乙醇胺中，并在50℃下孵育4小時以進行封閉。隨后使用ph8的50mmtris-hcl和可替代地ph4.0的50mmnaoac洗滌該凝膠若干次。最后使用平衡緩沖液(50mmnaoac，150mmnacl，ph4.5)將該凝膠裝填在35-40ml的柱中。從培養(yǎng)液純化葡糖淀粉酶。通過0.22μmpes過濾器過濾來自具有葡糖淀粉酶基因的黑曲霉mbin118的發(fā)酵的培養(yǎng)液，并施加在之前在50mmnaoac、150mmnacl、ph4.5緩沖液中平衡的α-環(huán)糊精親和凝膠柱上。使用平衡緩沖液將未結(jié)合的材料從該柱中洗出，并且使用3倍柱體積以上的含有10mmβ-環(huán)糊精的相同緩沖液洗脫葡糖淀粉酶。檢查洗脫液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已結(jié)合至α-環(huán)糊精親和凝膠。然后相對于ph5.0的20mmnaoac透析純化的葡糖淀粉酶樣品。最后通過sds-page檢查純度并且僅發(fā)現(xiàn)一條單獨的帶。實例8草酸青霉菌葡糖淀粉酶的定點變體的構(gòu)建和表達用實例7所述的質(zhì)粒xyz1471-4、使用以下所示的引物k79vf和k79vr(這些引物被設(shè)計成用于將成熟序列的位置79處的賴氨酸(k)取代為纈氨酸(v))以及以下所示的引物f-np003940和r-np003940(這兩個引物基于已知的序列和添加的標志來設(shè)計以用于通過in-fusiontm策略直接克隆)進行兩個pcr反應。引物k79vf18mergcagtctttccaattgac(seqidno:25)引物k79vr18meraattggaaagactgcccg(seqidno:26)引物f-np003940:5’acacaactggggatccaccatgcgtctcactctattatc(seqidno:27)引物r-np003940:5’agatctcgagaagcttaaaactgccacacgtcgttgg(seqidno:28)在以下所述的條件下使用ptc-200dna引擎進行pcr。根據(jù)制造商的說明通過凱杰凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收dna片段。根據(jù)制造商的說明，使用n-fusiontmdry-downpcr克隆試劑盒(美國加利福尼亞州帕洛阿爾托的bd生物科學公司)將所得的純化的兩個片段克隆到用bamhi和hindiii線性化的曲霉菌表達載體中。這一線性化的載體構(gòu)建是如wo2005/042735a1所述的。使用連接混合物來轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α細胞(東洋公司(toyobo))。在每毫升補充有50μg氨芐西林的3mllb培養(yǎng)基中接種所選擇的菌落，并在225rpm下在37℃下孵育過夜。根據(jù)制造商的說明使用凱杰質(zhì)粒微型試劑盒(凱杰公司)從所選擇的菌落純化質(zhì)粒dna。在異源表達之前驗證草酸青霉菌葡糖淀粉酶定點變體基因序列的序列，并選擇這些質(zhì)粒之一來用于進一步表達并且將其命名為ppope001。如wo95/02043所述地制備黑曲霉mbin118的原生質(zhì)體。將一百μl的原生質(zhì)體懸浮液與2.5μg的ppope001質(zhì)粒相混合，并且添加250微升的60％peg4000(艾普利公司(applichem))(聚乙二醇，分子量4,000)、10mmcacl2、以及10mmtris-hcl(ph7.5)并輕輕混合。在37℃下孵育該混合物30分鐘，并且在補充有10mm乙酰胺和15mmcscl的cove蔗糖(科夫，1996，生物化學與生物物理學報133:51-56)中將原生質(zhì)體與1％的瓊脂糖l(日本基因公司(nippongene))相混合，并將其作為一個頂層添加在補充有10mm乙酰胺和15mmcscl的cove蔗糖板上以用于轉(zhuǎn)化株選擇(每板4ml頂層瓊脂)。在37℃下孵育5天之后，挑取十六個轉(zhuǎn)化株的孢子并將其接種在96深孔mt板中的750μlyp-2％麥芽糖培養(yǎng)基上。在30℃下靜止培養(yǎng)5天之后，在sds-page凝膠上分析來自每個孔的10μl培養(yǎng)液以便基于產(chǎn)生大量葡糖淀粉酶的能力來鑒別最好的轉(zhuǎn)化株。實例9定點poamg變體pe001的純化將所選擇的變體轉(zhuǎn)化株和表達實例6所述的野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶的菌株培養(yǎng)在100ml的yp-2％麥芽糖培養(yǎng)基中，并且培養(yǎng)物通過0.22μmpes過濾器過濾，并施加在之前于50mmnaoac、150mmnacl、ph4.5緩沖液中平衡的α-環(huán)糊精親和凝膠柱上。使用平衡緩沖液將未結(jié)合的材料從該柱中洗出，并且使用3倍柱體積以上的含有10mmβ-環(huán)糊精的相同緩沖液洗脫葡糖淀粉酶。檢查洗脫液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已結(jié)合至α-環(huán)糊精親和凝膠。隨后相對于ph5.0的20mmnaoac透析純化的葡糖淀粉酶樣品。實例10pe001蛋白酶穩(wěn)定性的表征將40μl在50mm乙酸鈉緩沖液(ph4.5)中的酶溶液(1mg/ml)與1/10體積的1mg/ml蛋白酶溶液相混合，該蛋白酶是例如在生物化學雜志(biochemj.)1975年4月；147(1):45-53中所述的曲霉酸性蛋白酶i(aspergillopepsini)、或從西格瑪公司(sigma)可商購的產(chǎn)品以及在生物化學雜志(biochemicaljournal)[0264-6021]八幡町市島(ichishima)2003年第371卷iss:pt2第541頁中所述的奧瑞素(aorsin)，并且在4℃或32℃下孵育過夜。作為對照實驗，將h2o而不是蛋白酶添加到樣品之中。將樣品裝載在sds-page上以查看葡糖淀粉酶是否被蛋白酶切割。在sds-page中，pe001僅示出與完整分子相對應的一條帶，而野生型葡糖淀粉酶被蛋白酶降解并且示出60kca的更低分子大小的一條帶。表11蛋白酶處理之后的sds-page結(jié)果n.d.：未檢測到。實例11培養(yǎng)過程中更少切割在32℃下將變體和野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶的曲霉菌轉(zhuǎn)化株在含有4x稀釋的、補充有10mm乙酸鈉緩沖液的yp-2％麥芽糖培養(yǎng)基(ph4.5)的6孔mt板中培養(yǎng)1周。將培養(yǎng)物上清液裝載在sds-page上。表12培養(yǎng)物上清液的sds-page結(jié)果n.d.：未檢測到。在發(fā)酵過程中野生型葡糖淀粉酶被宿主蛋白酶切割，而變體則僅產(chǎn)生完整的分子。實例12變體與親本相比的葡糖淀粉酶活性針對野生型草酸青霉菌的純化的酶和變體葡糖淀粉酶檢查如上文所述作為agu測量的葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶單位(agu)被定義為在標準條件下(37℃，ph4.3，底物：100mm麥芽糖，緩沖液：0.1m醋酸鹽，反應時間：6分鐘)每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶的量。表13實例13具有增強的熱穩(wěn)定性的葡糖淀粉酶變體的純化可以類似于實例8中描述的程序構(gòu)建并表達顯示出增加的熱穩(wěn)定性的變體。所有變體菌來源于pe001。在ypm培養(yǎng)基中表達以后，將包括t65a或q327f取代的變體如下進行微純化：通過經(jīng)由0.22μm過濾器過濾除去菌絲體。向濾板(華特曼(whatman)，uni過濾器(unifilter)800μl，25-30μmmbpp)的孔中添加50μl柱材料(根據(jù)制造商的推薦，與mini-leak二乙烯砜-活化的瓊脂糖培養(yǎng)基偶聯(lián)的α-環(huán)糊精)。通過兩次添加200μl緩沖液用結(jié)合緩沖液(200mm乙酸鈉，ph4.5)平衡該柱材料，劇烈震蕩10min(海道夫(heidolph)，titramax101搖床，1000rpm)并且通過真空除去緩沖液(華特曼，univac3)。隨后，添加400μl培養(yǎng)上清液和100μl結(jié)合緩沖液，并且在劇烈振蕩下將板孵育30min。通過真空除去未結(jié)合的材料并且重復結(jié)合步驟。通常地，每個變體使用4個孔。然后通過添加200μl具有減少的離子強度的緩沖液(50/10/5mm乙酸鈉，ph4.5)進行三個洗滌步驟，振蕩15min并且通過真空除去緩沖液。通過兩次添加100μl洗脫緩沖液(250mm乙酸鈉，0.1％α-環(huán)糊精，ph6.0)洗脫結(jié)合的amg，振蕩15min并且通過真空收集在微量滴定板中的洗脫材料。將合并的洗脫物濃縮并且使用具有10kda截留單位的離心過濾器(milliporemicroconultracelym-10)將緩沖液變?yōu)?0mm乙酸鈉，ph4.5。將微純化的樣品保存在-18℃下直到熱穩(wěn)定性測試。實例14蛋白質(zhì)熱解折疊分析(tsa，熱轉(zhuǎn)變測定(thermalshiftassay))。使用寶石橙(syproorange)(英杰公司，s-6650)監(jiān)測t65a和q327f變體的蛋白質(zhì)熱解折疊并且使用實時pcr儀(應用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems)；一步一加(step-one-plus))進行。在一個96孔板中，將25微升微純化的、處于約100微克/ml的50mm乙酸鹽(ph4,5)中的樣品與寶石橙(5:1)相混合(所得濃度＝5x；來自供應商的母液＝5000x)。用光學pcr密封件密封該平板。將pcr儀的掃描速率設(shè)置為每小時76℃，起始于25℃并且結(jié)束于96℃。使用寶石橙(syproorange)(英杰公司，s-6650)監(jiān)測e501v+y504t變體的蛋白質(zhì)熱解折疊并且使用實時pcr儀(應用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems)；一步一加(step-one-plus))進行。在一個96孔板中，在具有或不具有200ppm阿卡波糖(acarbose)(西格瑪公司a8980)的情況下，將15微升純化的、處于約50微克/ml的50mm乙酸鹽(ph4,5)中的樣品與寶石橙(1:1)相混合(所得濃度＝5x；來自供應商的母液＝5000x)。用光學pcr密封件密封該平板。將pcr儀的掃描速率設(shè)置為每小時76℃，起始于25℃并且結(jié)束于96℃。使用用于激發(fā)的內(nèi)置(in-built)led藍光和rox-濾波器(610nm，發(fā)射)每20秒監(jiān)測熒光。將tm值計算為第一衍生物的最大值(df/dk)(參考：格雷戈里(gregory)等人；生物分子篩選雜志(jbiomolscreen)200914:700)。表14a.實例15通過差示掃描量熱法(dsc)分析熱穩(wěn)定性基本如在實例8中所描述構(gòu)建在特定位置處具有取代和/或缺失的額外的位點特異性變體并且如在實例11中所描述進行純化。使用vp-毛細管差示掃描量熱器(美國新澤西州的皮斯卡塔韋的米克羅卡公司(microcalinc.))，通過差示掃描量熱法(dsc)在ph4.0或4.8處(50mm乙酸鈉)測定純化的po-amgpe001衍生的變體的熱穩(wěn)定性。在以200k/hr的恒定的程序化加熱速率下，在選擇的緩沖液(50mm乙酸鈉，ph4.0或4.8)中加熱酶溶液后獲得的熱分析圖(cp對t)中，將熱變性溫度td(℃)當作變性峰(主要的吸熱峰)的頂端。將樣品和參比溶液(約0.3ml)從10℃下的儲存條件裝載到量熱儀中(參考：不具有酶的緩沖液)，并且在20℃下熱預平衡10分鐘，隨后從20℃到110℃進行dsc掃描。以約+/-1℃的精確度測定變性溫度。分離的變體以及dsc數(shù)據(jù)披露于下表15中。表15實例16通過熱應激測試和pnpg測定分析熱穩(wěn)定性從來自實例15的經(jīng)鑒別的取代變體之一(被鑒別為ga008)開始，通過熱應激測定測試額外的變體，在該熱應激測定中在83℃下熱休克5min后，測定來自生長培養(yǎng)物的上清液的葡糖淀粉酶(amg)活性。在熱休克以后，測量變體連同在非應激樣品中的變體的殘余活性。po-amgpnpg活性測定的說明：草酸青霉菌葡糖淀粉酶pnpg活性測定是一種光譜端點測定(spectrometricendpointassay)，其中將樣品一分為二并且進行熱應激地和非熱應激地測量。所以，數(shù)據(jù)輸出是應激樣品中的殘余活性的量度。生長：向無菌微量滴定板(mtp)的每個孔中添加200μl富生長培養(yǎng)基(沒有dowfax的ftx-14)。將來自凍存物的感興趣的菌株一式三份地直接接種在mtp中。在20個孔中接種基準物。將具有培養(yǎng)基的未接種的孔用作測定空白。將mtp放在包含濕巾的塑料箱中，以阻止孵育過程中這些孔的蒸發(fā)。將塑料箱在34℃下放置4天。測定：將50μl上清液轉(zhuǎn)移至50μl0.5mnaac(ph4.8)中，以獲得的準確的樣品ph。將50μl稀釋物轉(zhuǎn)移至pcr板上并且在pcr儀中在83℃下熱應激5分鐘。將剩余的一半稀釋物保持在室溫下。將20μl的應激的和非應激的樣品轉(zhuǎn)移至標準mtp中。添加20μlpnpg-底物，以起始該反應。將該板在室溫下孵育1小時。終止該反應并且通過添加50μl0.5mna2co3進行顯色。在405nm處，在酶標儀(分子設(shè)備公司(moleculardevices))上測量黃色。緩沖液：0.5mnaacph4.80.25mnaacph4.8底物，6mmpnpg：15mg在10ml0.25naac(ph4.8)中的4-硝基苯基d-吡喃葡萄糖苷終止/顯色溶液：0.5mna2co3數(shù)據(jù)處理：在excel中，來自應激和非應激樣品兩者的原始abs405數(shù)據(jù)是用其對應的空白進行空白消減的。計算殘余活性(％殘余活性＝(abs非應激-(abs非應激-abs應激))/abs非應激*100％)并且相對于基準po-amg0008繪圖。表16表17實例17熱穩(wěn)定性變體的葡糖淀粉酶活性測試已經(jīng)使用在實例16中描述的pnpg測定證實了在表15、16、和17中披露的所有以上描述的變體在培養(yǎng)上清液上的葡糖淀粉酶活性。實例18在用不同的水平的pfu蛋白酶產(chǎn)生的醪液中改進的乙醇生產(chǎn)。與ethanolredtm相比，評估m(xù)bg4851在用一種共混物液化的液化物中的性能，該共混物具有α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和增加水平的pfu蛋白酶(0.0385、1.5、和3.0μgeppfu/gds)。液化通過將研磨的玉米、逆流與自來水組合，至160g的總目標重量，干固體(ds)為32.50％，來制備液化；將逆流以30％w/w(逆流重量/醪液總重量)共混。將在2012年12月12日接收的來自林肯道能源(lincolnwayenergy)的逆流和研磨的玉米用于所有液化。初始漿料ph為5.0，并且因此無需進一步調(diào)整。然后，添加水和酶，隨后密封所有l(wèi)abomat罐并且開始200ml程序：5℃/min。漸變，15分鐘漸變至80℃，保持1min，以1℃/min漸變至85℃并且保持103min，40rpm向左轉(zhuǎn)30秒并且向右轉(zhuǎn)30秒。將所有醪液罐在冰浴中冷卻并且根據(jù)以下描述的ssf程序制備用于發(fā)酵。添加2.1μgepaa369/gds和4.5μgeppoamg498/gds。在液化中測試三個pfu劑量：0.0385、1.5、和3.0μgep/gds。酵母菌株和制劑該實驗中所測試的兩種酵母菌株是ethanolredtm(富酶泰斯公司)和mbg4851。將酵母在過濾器消毒的液體培養(yǎng)基(2％w/vd-葡萄糖、1％蛋白胨、和0.5％酵母提取物)中進行增殖。在uv防護罩下使用無菌環(huán)，將來自菌苔的細胞轉(zhuǎn)移到50ml頂部鉆有一個孔的無菌離心管中的25ml的液體培養(yǎng)基中，并且在150rpm下，在30℃空氣震蕩器中進行孵育。將管傾斜約30度以增加通氣。在18小時處，通過在3000rpm下旋轉(zhuǎn)10分鐘獲得細胞，并且傾析上清液。將細胞在25ml水中洗滌一次，并且將得到的細胞沉淀再懸浮于1.5ml自來水中。重復使用yc-100確定總酵母濃度。同時糖化發(fā)酵(ssf)將青霉素添加到各醪液中至3ppm的終濃度。液化后的ph為5.1并且不用針對ssf進一步調(diào)節(jié)。將尿素添加到各醪液中至500ppm的終濃度。將約5克的各醪液轉(zhuǎn)移至試管中，這些試管具有在頂部鉆的1/64洞，以允許co2釋放。將葡糖淀粉酶sa和纖維素酶vd的共混物以110μgepgsa/gds和30μgepcvd/gds給予到各醪液管中。將酵母以10e6細胞/g醪液給出。將milli-q水添加到各管中，這樣使得添加到各管的液體(酶+mq水)的總體積與醪液重量是等比例的。在32℃水浴中進行發(fā)酵54小時。在整個發(fā)酵中，將樣品進行定期渦旋(在早上和在晚上)。hplc分析在發(fā)酵54小時后通過每個處理舍棄3個管進行發(fā)酵取樣。每個管通過用50μl的40％v/vh2so4失活、渦旋、以1460×g離心10分鐘，并且通過0.45μm沃特曼pp過濾器(whatmanppfilter)過濾進行處理用于hplc分析。無需進一步稀釋，處理所有54小時樣品。在hplc分析之前和過程中將樣品儲存在4℃下。表18：hplc系統(tǒng)針對糖(dp4+、dp3、dp2、葡萄糖、和果糖)、有機酸(乳酸和乙酸)、甘油、和乙醇分析樣品。在結(jié)果的基礎(chǔ)上，使用jmp軟件(sas公司，卡里(cary)，北卡羅來納州)進行圖基-克雷默(tukey-kramer)分析。結(jié)果下表2顯示出在三個制備的醪液中的每個在發(fā)酵54小時處針對兩種酵母的滴度。圖基-克雷默分析指示出所有三個醪液中的最終乙醇滴度針對mbg4851無統(tǒng)計學差異。然而，當發(fā)酵生物是ethanolred時，隨著液化期間pfu增加，可見統(tǒng)計學顯著改善。表19：乙醇滴度和圖基-克雷默分析*不是由相同字母連接的水平是顯著不同的在所測試的條件下，mbg4851具有比ethanolred更高的乙醇滴度。與ethanolred相比，當mbg4851是發(fā)酵生物時可見乙醇提升，參見下表20。在液化期間用mbg4851看到的最終乙醇滴度的提升下降為pfu，并且因此醪液中可用的氮增加。表20：在不同水平的pfu下乙醇提升超過ethanolred當發(fā)酵生物是mbg4851時，pfu劑量對乙醇產(chǎn)量沒有顯著影響。當ethanolred是發(fā)酵生物時，增加的pfu劑量和因此可用的氮增加乙醇至少2％。實例19在用不同水平的pfu蛋白酶產(chǎn)生的醪液中改進的乙醇生產(chǎn)和減少的pfu需求。與ethanolredtm相比，評估m(xù)bg4851在用一種共混物液化的液化物中的性能，該共混物具有α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和增加水平的pfu蛋白酶(0.0385、1.5、和3.0μgeppfu/gds)。將與ethanolred相比的mbg4851性能在液化物中與增加水平的pfu蛋白相比。本實驗用兩個水平的n、0和500ppm尿素進行，以確定在較低水平的所添加的尿素下，不同pfu水平是否具有作用。液化通過將研磨的玉米、逆流與自來水組合，至160g的總目標重量，干固體(ds)為32.50％，來制備液化；將逆流以30％w/w(逆流重量/醪液總重量)共混。將在2012年12月12日接收的來自林肯道能源(lincolnwayenergy)的逆流和來自奧羅拉(aurora)的研磨的玉米用于所有液化。初始漿料ph為5.0，并且因此無需進一步調(diào)整。然后，添加水和酶，隨后密封所有l(wèi)abomat罐并且開始200ml程序：5℃/min。漸變，15分鐘漸變至80℃，保持1min，以1℃/min漸變至85℃并且保持103min，40rpm向左轉(zhuǎn)30秒并且向右轉(zhuǎn)30秒。將所有醪液罐在冰浴中冷卻并且根據(jù)以下描述的ssf程序制備用于發(fā)酵。添加2.1μgepaa369/gds和4.5μgeppoamg498/gds。在液化中測試三個pfu劑量：0.0385、1.5、和3.0μgep/gds。酵母菌株和制劑該實驗中所測試的兩種酵母菌株是ethanolred(富酶泰斯公司)和mbg4851。將酵母在過濾器消毒的液體培養(yǎng)基(2％w/vd-葡萄糖、1％蛋白胨、和0.5％酵母提取物)中進行增殖。在uv防護罩下使用無菌環(huán)，將來自菌苔的細胞轉(zhuǎn)移到50ml頂部鉆有一個孔的無菌離心管中的25ml的液體培養(yǎng)基中，并且在150rpm下，在30℃空氣震蕩器中進行孵育。將管傾斜約30度以增加通氣。在18小時處，通過在3000rpm下旋轉(zhuǎn)10分鐘獲得細胞，并且傾析上清液。將細胞在25ml水中洗滌一次，并且將得到的細胞沉淀再懸浮于1.5ml自來水中。重復使用yc-100確定總酵母濃度。同時糖化發(fā)酵(ssf)將青霉素添加到各醪液中至3ppm的終濃度。液化后的ph為5.1并且不用針對ssf進一步調(diào)節(jié)。將尿素添加到各醪液的一半中至0ppm的終濃度，并且添加到各醪液的另一半中至500ppm的終濃度。將約5克的得到的6個醪液中的每個轉(zhuǎn)移至試管中，這些試管具有在頂部鉆的1/64洞，以允許co2釋放。將葡糖淀粉酶sa(gsa)和纖維素酶vd(cvd)的共混物以110μgepgsa/gds和30μgepcvd/gds給予到各醪液管中。將酵母以10e6細胞/g醪液給出。將milli-q水添加到各管中，這樣使得添加到各管的液體(酶+mq水)的總體積與醪液重量是等比例的。在32℃水浴中進行發(fā)酵54小時。在整個發(fā)酵中，將樣品進行定期渦旋(在早上和在晚上)。hplc分析在發(fā)酵54小時后通過每個處理舍棄3個管進行發(fā)酵取樣。每個管通過用50μl的40％v/vh2so4失活、渦旋、以1460×g離心10分鐘，并且通過0.45μm沃特曼pp過濾器(whatmanppfilter)過濾進行處理用于hplc分析。無需進一步稀釋，處理所有54小時樣品。在hplc分析之前和過程中將樣品儲存在4℃下。表21：hplc系統(tǒng)針對糖(dp4+、dp3、dp2、葡萄糖、和果糖)、有機酸(乳酸和乙酸)、甘油、和乙醇分析樣品。在結(jié)果的基礎(chǔ)上，使用jmp軟件(sas公司，卡里(cary)，北卡羅來納州)進行圖基-克雷默分析結(jié)果分析54小時乙醇滴度并且下表22示出了結(jié)果。表22：54小時乙醇滴度*不是由相同字母連接的水平是顯著不同的在所測試的條件下，mbg4851具有比ethanolred更高的乙醇滴度。與ethanolred相比，當mbg4851是發(fā)酵生物時可見乙醇提升，參見下表23。在液化期間用mbg4851看到的最終乙醇滴度的提升下降為pfu，并且因此醪液中可用的氮增加。表23：在不同n和pfu水平下超過ethanolred的乙醇提升當使用500ppm尿素時，mbg4851再一次不需要更高的pfu劑量以達到最大乙醇。當不添加尿素時，mbg4851性能隨著pfu劑量增加，但是通過1.5μgep/gds達到最大限度。在兩種水平的氮下，當ethanolred是發(fā)酵生物時，更高劑量pfu增加乙醇產(chǎn)量。實例20在用不同水平的pfu蛋白酶產(chǎn)生的無逆流的醪液中改進的乙醇生產(chǎn)和減少的氮需求。與ethanolred相比，評估m(xù)bg4851在用一種共混物液化的液化物中的性能，該共混物具有α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和增加水平的pfu蛋白酶(0.0385和3.0μgeppfu/gds)。實例19顯示出mbg4851酵母比ethanolred酵母具有更低的氮需求。當將3μgpfu/gds用于液化中時，mbg4851不需要任何添加的尿素；然而，針對er，添加500ppm尿素增加了乙醇產(chǎn)量。當在液化中使用0.0385μgpfu/gds時，在發(fā)酵中mbg4851需要在0和500ppm之間的某個量的添加的尿素。此前實例在液化中使用了工廠逆流，這可能貢獻了一些尿素(連同肽和氨基酸)。因此，這不是一個真正的無尿素測試；如果工廠消除了尿素使用，那么在逆流中將不存在尿素。此實例在無逆流液化物中測試了5種不同尿素水平(0、200、300、500、和1000ppm)。液化通過將研磨的玉米和自來水合并至160g的目標總重量，干固體(ds)為32.50％，來制備液化。使用來自奧羅拉的研磨的玉米用于所有液化。使用40％v/v硫酸和50％w/w氫氧化鉀調(diào)節(jié)ph至5.1。然后，添加酶，隨后密封所有l(wèi)abomat罐并且開始200ml程序：5℃/min。漸變，15分鐘漸變至80℃，保持1min，以1℃/min漸變至85℃并且保持103min，40rpm向左轉(zhuǎn)30秒并且向右轉(zhuǎn)30秒。將所有醪液罐在冰浴中冷卻并且根據(jù)以下描述的ssf程序制備用于發(fā)酵。添加2.1μgepaa369/gds和4.5μgepdspoamg498。在液化中測試兩個pfu劑量：0.0385和3.0μgep/gds。酵母菌株和制劑該實驗中所測試的兩種酵母菌株是ethanolred(富酶泰斯公司)和mbg4851。通過將2.75g的干酵母稱重到在125ml埃倫邁爾燒瓶中50ml的32℃自來水中，來將酵母再水化。然后將燒瓶用封口膜覆蓋，并且允許在32℃水浴中進行孵育。在15分鐘后，渦旋這些燒瓶，但是不進行其他攪動。在總計30分鐘后，將這些燒瓶從水浴中去除。重復使用yc-100確定總酵母濃度。同時糖化發(fā)酵(ssf)將青霉素添加到各醪液中至3ppm的終濃度。液化后的ph為5.1并且不用針對ssf進一步調(diào)節(jié)。將尿素調(diào)節(jié)到所希望的水平，并且添加水以保持醪液之間一致的固體水平。將約5克的得到的醪液中的每個轉(zhuǎn)移至試管中，這些試管具有在頂部鉆的1/64洞，以允許co2釋放。將葡糖淀粉酶sa(gsa)和纖維素酶vd(cvd)的共混物以110μgepgsa/gds和30μgepcvd/gds給予到各醪液管中。將酵母以10e6細胞/g醪液給出。將milli-q水添加到各管中，這樣使得添加到各管的液體(酶+mq水)的總體積與醪液重量是等比例的。在32℃水浴中進行發(fā)酵54小時。在整個發(fā)酵中，將樣品進行定期渦旋(在早上和在晚上)。hplc分析在發(fā)酵54小時后通過每個處理舍棄3個管進行發(fā)酵取樣。每個管通過用50μl的40％v/vh2so4失活、渦旋、以1460×g離心10分鐘，并且通過0.45μm沃特曼pp過濾器(whatmanppfilter)過濾進行處理用于hplc分析。無需進一步稀釋，處理所有54小時樣品。在hplc分析之前和過程中將樣品儲存在4℃下。表24：hplc系統(tǒng)針對糖(dp4+、dp3、dp2、葡萄糖、和果糖)、有機酸(乳酸和乙酸)、甘油、和乙醇分析樣品。在結(jié)果的基礎(chǔ)上，使用jmp軟件(sas公司，卡里(cary)，北卡羅來納州)進行圖基-克雷默(tukey-kramer)分析。結(jié)果分析54小時乙醇滴度，并且所觀察到的結(jié)果和乙醇提升示于下表8中。當使用較低水平的pfu時，針對兩種酵母、直到高達500ppm所添加的尿素，所添加的尿素增加了乙醇滴度，在500ppm所添加的尿素這一點，mbg4851乙醇滴度保持一致。當添加1000ppm尿素時，ethanolred滴度繼續(xù)增加。當在液化期間使用更高水平pfu時，所添加的尿素對mbg4851發(fā)酵沒有作用。在該水平下，針對這種酵母，所發(fā)酵的0ppm添加的尿素與1000ppm添加的尿素處于相同水平。在更高的pfu醪液中，ethanolred需要至少500ppm尿素來發(fā)酵至最大乙醇量。表25：在54個小時下的乙醇滴度和所觀察到的提升實例21在工業(yè)生產(chǎn)的玉米醪中減少氮(尿素)需求來發(fā)酵至最大乙醇量在具有不同尿素補充水平的工業(yè)生產(chǎn)的、α-淀粉酶(α-淀粉酶a)液化的玉米醪中，與ethanolred相比，評估m(xù)bg4851的性能。玉米醪從lincolnland獲得工業(yè)制備的玉米醪。通過105℃干燥箱，測量醪液的固體為31.5％。酵母菌株和制劑該實驗中所測試的兩種酵母菌株是ethanolred(富酶泰斯公司)和mbg4851。通過將2.75g的干酵母稱重到在125ml埃倫邁爾燒瓶中50ml的32℃自來水中，來將酵母再水化。然后將燒瓶用封口膜覆蓋，并且允許在36.5℃水浴中進行孵育。在15分鐘后，渦旋這些燒瓶，但是不進行其他攪動。在總計30分鐘后，將這些燒瓶從水浴中去除。重復使用yc-100確定總酵母濃度。同時糖化發(fā)酵(ssf)將青霉素添加到各醪液中至3ppm的終濃度。液化后的ph為5.1并且不用針對ssf進一步調(diào)節(jié)。將尿素調(diào)節(jié)到所希望的水平，并且添加水以保持醪液之間一致的固體水平。將約5克的得到的醪液中的每個轉(zhuǎn)移至試管中，這些試管具有在頂部鉆的1/64洞，以允許co2釋放。將葡糖淀粉酶sa(gsa)和纖維素酶vd(cvd)的共混物以110μgepgsa/gds和30μgepcvd/gds給予到各醪液管中。將酵母以10e6細胞/g醪液給出。將milli-q水添加到各管中，這樣使得添加到各管的液體(酶+mq水)的總體積與醪液重量是等比例的。在32℃水浴中進行發(fā)酵54小時。在整個發(fā)酵中，將樣品進行定期渦旋(在早上和在晚上)。hplc分析在發(fā)酵54小時后通過每個處理舍棄3個管進行發(fā)酵取樣。每個管通過用50μl的40％v/vh2so4失活、渦旋、以1460×g離心10分鐘，并且通過0.45μm沃特曼pp過濾器(whatmanppfilter)過濾進行處理用于hplc分析。無需進一步稀釋，處理所有54小時樣品。在hplc分析之前和過程中將樣品儲存在4℃下。表26：hplc系統(tǒng)針對糖(dp4+、dp3、dp2、葡萄糖、和果糖)、有機酸(乳酸和乙酸)、甘油、和乙醇分析樣品。在結(jié)果的基礎(chǔ)上，使用jmp軟件(sas公司，卡里(cary)，北卡羅來納州)進行圖基-克雷默(tukey-kramer)分析。結(jié)果54小時結(jié)果示于下表27中。表27：54小時乙醇滴度*不是由相同字母連接的水平是顯著不同的當沒有向發(fā)酵中添加尿素時，兩種酵母發(fā)酵成最低乙醇滴度。當向發(fā)酵中添加極高水平的尿素(3000ppm)時，在兩種酵母之間另一個相似點是乙醇滴度的下降。mbg4851示出，其需要150ppm或更少添加的尿素來發(fā)酵這種玉米醪至最大乙醇。ethanolredtm并沒有達到其頂峰，直到添加在300和600ppm之間某個量的尿素。這意味著用這種酵母，尿素添加減少至少2倍是可能的。下表28示出，在各種水平的氮補充下，mbg4851性能超過ethanolred最少1.25％。表28：在各種水平的氮補充下，當mbg4851與ethanolred相比時，乙醇提升。實例22在用不同水平pfu蛋白酶產(chǎn)生的醪液的發(fā)酵中的乳酸減少。當使用mbg4851時，與ethanolredtm相比，評估在用一種共混物液化的液化物中的乳酸水平，該共混物具有α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和增加水平的pfu蛋白酶(0.0385、1.5、和3.0μgeppfu/gds)。液化通過將研磨的玉米、逆流與自來水組合至160g的總目標重量，干固體(ds)為32.50％，來制備實驗1液化；逆流以30％w/w(逆流重量/醪液總重量)共混。將在2012年12月12日接收的來自林肯道能源(lincolnwayenergy)的逆流和研磨的玉米用于所有液化。初始漿料ph為5.0，并且因此無需進一步調(diào)整。然后，添加水和酶，隨后密封所有l(wèi)abomat罐并且開始200ml程序：5℃/min。漸變，15分鐘漸變至80℃，保持1min，以1℃/min漸變至85℃并且保持103min，40rpm向左轉(zhuǎn)30秒并且向右轉(zhuǎn)30秒。將所有醪液罐在冰浴中冷卻并且根據(jù)以下描述的ssf程序制備用于發(fā)酵。添加2.1μgepaa369/gds和4.5μgepdspoamg498。在液化中測試三個pfu劑量：0.0385、1.5、和3.0μgep/gds。通過將研磨的玉米、逆流與自來水組合至160g的總目標重量，干固體(ds)為32.50％，來制備實驗2液化；逆流以30％w/w(逆流重量/醪液總重量)共混。將在2012年12月12日接收的來自林肯道能源(lincolnwayenergy)的逆流和來自奧羅拉(aurora)的研磨的玉米用于所有液化。初始漿料ph為5.0，并且因此無需進一步調(diào)整。然后，添加水和酶，隨后密封所有l(wèi)abomat罐并且開始200ml程序：5℃/min。漸變，15分鐘漸變至80℃，保持1min，以1℃/min漸變至85℃并且保持103min，40rpm向左轉(zhuǎn)30秒并且向右轉(zhuǎn)30秒。將所有醪液罐在冰浴中冷卻并且根據(jù)以下描述的ssf程序制備用于發(fā)酵。在液化中測試三個pfu劑量：0.0385、1.5、和3.0μgep/gds。酵母菌株和制劑該實驗中所測試的兩種酵母菌株是ethanolred(富酶泰斯公司)和mbg4851。將酵母在過濾器消毒的液體培養(yǎng)基(2％w/vd-葡萄糖、1％蛋白胨、和0.5％酵母提取物)中進行增殖。在uv防護罩下使用無菌環(huán)，將來自菌苔的細胞轉(zhuǎn)移到50ml頂部鉆有一個孔的無菌離心管中的25ml的液體培養(yǎng)基中，并且在150rpm下，在30℃空氣震蕩器中進行孵育。將管傾斜約30度以增加通氣。在18小時處，通過在3000rpm下旋轉(zhuǎn)10分鐘獲得細胞，并且傾析上清液。將細胞在25ml水中洗滌一次，并且將得到的細胞沉淀再懸浮于1.5ml自來水中。重復使用yc-100確定總酵母濃度。同時糖化發(fā)酵(ssf)將青霉素添加到各醪液中至3ppm的終濃度。液化后的ph為5.1并且不用針對ssf進一步調(diào)節(jié)。在實驗1中，將尿素添加到各醪液中至500ppm的終濃度。在實驗2中，將各醪液的一半調(diào)節(jié)至500ppm尿素，并且另一半用水調(diào)節(jié)以維持一致的固體。將約5克的各醪液轉(zhuǎn)移至試管中，這些試管具有在頂部鉆的1/64洞，以允許co2釋放。將葡糖淀粉酶sa(gsa)和纖維素酶vd(cvd)的共混物以110μgepgsa/gds和30μgepcvd/gds給予到各醪液管中。將酵母以10e6細胞/g醪液給出。將milli-q水添加到各管中，這樣使得添加到各管的液體(酶+mq水)的總體積與醪液重量是等比例的。在32℃水浴中進行發(fā)酵54小時。在整個發(fā)酵中，將樣品進行定期渦旋(在早上和在晚上)。hplc分析在發(fā)酵54小時后通過每個處理舍棄3個管進行發(fā)酵取樣。每個管通過用50μl的40％v/vh2so4失活、渦旋、以1460×g離心10分鐘，并且通過0.45μm沃特曼pp過濾器(whatmanppfilter)過濾進行處理用于hplc分析。無需進一步稀釋，處理所有54小時樣品。在hplc分析之前和過程中將樣品儲存在4℃下。表29：hplc系統(tǒng)針對糖(dp4+、dp3、dp2、葡萄糖、和果糖)、有機酸(乳酸和乙酸)、甘油、和乙醇分析樣品。結(jié)果下表30示出在發(fā)酵54小時處，針對實驗1中的兩種酵母的乳酸滴度和減少百分比。表30：54小時乳酸結(jié)果下表31示出在發(fā)酵54小時處，針對實驗2中的兩種酵母的乳酸滴度和減少百分比。表31：54小時乳酸結(jié)果實例23在用不同水平pfu蛋白酶產(chǎn)生的無逆流醪液的發(fā)酵中的乳酸減少當使用mbg4851時，與ethanolredtm相比，評估在用一種共混物液化的無逆流液化物中的乳酸水平，該共混物具有α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和增加水平的pfu蛋白酶(0.0385和3.0μgeppfu/gds)。液化通過將研磨的玉米和自來水合并至160g的目標總重量，干固體(ds)為32.50％，來制備液化。使用來自奧羅拉的研磨的玉米用于所有液化。使用40％v/v硫酸和50％w/w氫氧化鉀調(diào)節(jié)ph至5.1。然后，添加酶，隨后密封所有l(wèi)abomat罐并且開始200ml程序：5℃/min。漸變，15分鐘漸變至80℃，保持1min，以1℃/min漸變至85℃并且保持103min，40rpm向左轉(zhuǎn)30秒并且向右轉(zhuǎn)30秒。將所有醪液罐在冰浴中冷卻并且根據(jù)以下描述的ssf程序制備用于發(fā)酵。添加2.1μgepaa369/gds和4.5μgepdspoamg498。在液化中測試兩個pfu劑量：0.0385和3.0μgep/gds。酵母菌株和制劑該實驗中所測試的兩種酵母菌株是ethanolred(富酶泰斯公司)和mbg4851。通過將2.75g的干酵母稱重到在125ml埃倫邁爾燒瓶中50ml的32℃自來水中，來將酵母再水化。然后將燒瓶用封口膜覆蓋，并且允許在32℃水浴中進行孵育。在15分鐘后，渦旋這些燒瓶，但是不進行其他攪動。在總計30分鐘后，將這些燒瓶從水浴中去除。重復使用yc-100確定總酵母濃度。同時糖化發(fā)酵(ssf)將青霉素添加到各醪液中至3ppm的終濃度。液化后的ph為5.1并且不用針對ssf進一步調(diào)節(jié)。將尿素調(diào)節(jié)到所希望的水平，并且添加水以保持醪液之間一致的固體水平。將約5克的得到的醪液中的每個轉(zhuǎn)移至試管中，這些試管具有在頂部鉆的1/64洞，以允許co2釋放。將葡糖淀粉酶sa(gsa)和纖維素酶vd(cvd)的共混物以110μgepgsa/gds和30μgepcvd/gds給予到各醪液管中。將酵母以10e6細胞/g醪液給出。將milli-q水添加到各管中，這樣使得添加到各管的液體(酶+mq水)的總體積與醪液重量是等比例的。在32℃水浴中進行發(fā)酵54小時。在整個發(fā)酵中，將樣品進行定期渦旋(在早上和在晚上)。hplc分析在發(fā)酵54小時后通過每個處理舍棄3個管進行發(fā)酵取樣。每個管通過用50μl的40％v/vh2so4失活、渦旋、以1460×g離心10分鐘，并且通過0.45μm沃特曼pp過濾器(whatmanppfilter)過濾進行處理用于hplc分析。無需進一步稀釋，處理所有54小時樣品。在hplc分析之前和過程中將樣品儲存在4℃下。表32：hplc系統(tǒng)針對糖(dp4+、dp3、dp2、葡萄糖、和果糖)、有機酸(乳酸和乙酸)、甘油、和乙醇分析樣品。結(jié)果下表33示出針對該實驗的乳酸結(jié)果。在所有醪液中可見顯著的減少。表33：54小時乳酸結(jié)果實例24在用α-淀粉酶a作為液化酶工業(yè)生產(chǎn)的玉米醪的發(fā)酵中的乳酸減少當使用mbg4851時，在具有不同尿素補充水平的工業(yè)生產(chǎn)的、α-淀粉酶(α-淀粉酶a)液化的玉米醪中，與ethanolred相比，評估乳酸水平。玉米醪從lincolnland獲得工業(yè)制備的玉米醪。通過105℃干燥箱，測量醪液的固體為31.5％。酵母菌株和制劑該實驗中所測試的兩種酵母菌株是ethanolredtm(富酶泰斯公司)和mbg4851。通過將2.75g的干酵母稱重到在125ml埃倫邁爾燒瓶中50ml的32℃自來水中，來將酵母再水化。然后將燒瓶用封口膜覆蓋，并且允許在36.5℃水浴中進行孵育。在15分鐘后，渦旋這些燒瓶，但是不進行其他攪動。在總計30分鐘后，將這些燒瓶從水浴中去除。重復使用yc-100確定總酵母濃度。同時糖化發(fā)酵(ssf)將青霉素添加到各醪液中至3ppm的終濃度。液化后的ph為5.1并且不用針對ssf進一步調(diào)節(jié)。將尿素調(diào)節(jié)到所希望的水平，并且添加水以保持醪液之間一致的固體水平。將約5克的得到的醪液中的每個轉(zhuǎn)移至試管中，這些試管具有在頂部鉆的1/64洞，以允許co2釋放。將葡糖淀粉酶sa(gsa)和纖維素酶vd(cvd)的共混物以110μgepgsa/gds和30μgepcvd/gds給予到各醪液管中。將酵母以10e6細胞/g醪液給出。將milli-q水添加到各管中，這樣使得添加到各管的液體(酶+mq水)的總體積與醪液重量是等比例的。在32℃水浴中進行發(fā)酵54小時。在整個發(fā)酵中，將樣品進行定期渦旋(在早上和在晚上)。hplc分析在發(fā)酵54小時后通過每個處理舍棄3個管進行發(fā)酵取樣。每個管通過用50μl的40％v/vh2so4失活、渦旋、以1460×g離心10分鐘，并且通過0.45μm沃特曼pp過濾器(whatmanppfilter)過濾進行處理用于hplc分析。無需進一步稀釋，處理所有54小時樣品。在hplc分析之前和過程中將樣品儲存在4℃下。表34：hplc系統(tǒng)針對糖(dp4+、dp3、dp2、葡萄糖、和果糖)、有機酸(乳酸和乙酸)、甘油、和乙醇分析樣品。結(jié)果下表35示出了54小時乳酸結(jié)果。表35：54小時乳酸結(jié)果實例25在用α-淀粉酶f(fuelzymetm)作為液化酶工業(yè)生產(chǎn)的玉米醪的發(fā)酵中的乳酸減少當使用mbg4851時，與ethanolredtm相比，在工業(yè)制備的α-淀粉酶f(fuelzymetm)液化的玉米醪中，評估乳酸水平。玉米醪從松湖獲得工業(yè)制備的玉米醪。通過105℃干燥箱，測量醪液的固體為31.5％。酵母菌株和制劑該實驗中所測試的兩種酵母菌株是ethanolred(富酶泰斯公司)和mbg4851。通過將2.75g的干酵母稱重到在125ml埃倫邁爾燒瓶中50ml的36.5℃自來水中，來將酵母再水化。然后將燒瓶用封口膜覆蓋，并且允許在36.5℃水浴中進行孵育。在15分鐘后，渦旋這些燒瓶，但是不進行其他攪動。在總計30分鐘后，將這些燒瓶從水浴中去除。重復使用yc-100確定總酵母濃度。同時糖化發(fā)酵(ssf)將青霉素添加到各醪液中至3ppm的終濃度。將尿素調(diào)節(jié)至762ppm，并且使用硫酸調(diào)節(jié)ph至5.0。將約5克的醪液轉(zhuǎn)移至試管中，這些試管具有在頂部鉆的1/64洞，以允許co2釋放。將葡糖淀粉酶sa(gsa)和纖維素酶vd(cvd)的共混物以110μgepgsa/gds和30μgepcvd/gds給予到各醪液管中。將酵母以10e6細胞/g醪液給出。將milli-q水添加到各管中，這樣使得添加到各管的液體(酶+mq水)的總體積與醪液重量是等比例的。在32℃水浴中進行發(fā)酵52小時。在整個發(fā)酵中，將樣品進行定期渦旋(在早上和在晚上)。hplc分析在發(fā)酵52小時后通過每個處理舍棄3個管進行發(fā)酵取樣。每個管通過用50μl的40％v/vh2so4失活、渦旋、以1460×g離心10分鐘，并且通過0.45μm沃特曼pp過濾器(whatmanppfilter)過濾進行處理用于hplc分析。無需進一步稀釋，處理所有52小時樣品。在hplc分析之前和過程中將樣品儲存在4℃下。表36：hplc系統(tǒng)針對糖(dp4+、dp3、dp2、葡萄糖、和果糖)、有機酸(乳酸和乙酸)、甘油、和乙醇分析樣品。結(jié)果下表37示出了52小時結(jié)果。表37：52小時乳酸結(jié)果實例26在用液化酶共混物的工業(yè)生產(chǎn)的玉米醪的發(fā)酵中乳酸的減少當使用mbg4851時，與ethanolredtm相比，在工業(yè)制備的用(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和0.0385μgeppfu/gds的共混物液化的玉米醪中，評估乳酸水平。玉米醪實驗1-從flinthillsshellrock獲得工業(yè)制備的玉米醪。通過105℃干燥箱，測量醪液的固體為32.8％。實驗2-從oneearthenergy獲得工業(yè)制備的玉米醪。通過105℃干燥箱，測量醪液的固體為33.95％。酵母菌株和制劑這些實驗中所測試的兩種酵母菌株是ethanolred(富酶泰斯公司)和mbg4851。將酵母在過濾器消毒的液體培養(yǎng)基(2％w/vd-葡萄糖、1％蛋白胨、和0.5％酵母提取物)中進行增殖。在uv防護罩下使用無菌環(huán)，將來自菌苔的細胞轉(zhuǎn)移到50ml頂部鉆有一個孔的無菌離心管中的25ml的液體培養(yǎng)基中，并且在150rpm下，在30℃空氣震蕩器中進行孵育。將管傾斜約30度以增加通氣。在18小時處，通過在3000rpm下旋轉(zhuǎn)10分鐘獲得細胞，并且傾析上清液。將細胞在25ml水中洗滌一次，并且將得到的細胞沉淀再懸浮于1.5ml自來水中。重復使用yc-100確定總酵母濃度。同時糖化發(fā)酵(ssf)將青霉素添加到各醪液中至3ppm的終濃度。在實驗1中，將尿素調(diào)節(jié)至275ppm，并且使用氫氧化鉀調(diào)節(jié)ph至5.0。在實驗2中，將尿素調(diào)節(jié)至644ppm，并且使用硫酸調(diào)節(jié)ph至5.0。將約5克的醪液轉(zhuǎn)移至試管中，這些試管具有在頂部鉆的1/64洞，以允許co2釋放。將葡糖淀粉酶sa(gsa)和纖維素酶vd(cvd)(110μgepgsa/gds和30μgepcvd/gds)的共混物和單獨的葡糖淀粉酶sa(110μgepgsa/gds)給出到各醪液管中。將酵母以10e6細胞/g醪液給出。將milli-q水添加到各管中，這樣使得添加到各管的液體(酶+mq水)的總體積與醪液重量是等比例的。在32℃水浴中進行發(fā)酵52小時。在整個發(fā)酵中，將樣品進行定期渦旋(在早上和在晚上)。hplc分析在發(fā)酵54小時后通過每個處理舍棄3個管進行發(fā)酵取樣。每個管通過用50μl的40％v/vh2so4失活、渦旋、以1460×g離心10分鐘，并且通過0.45μm沃特曼pp過濾器(whatmanppfilter)過濾進行處理用于hplc分析。無需進一步稀釋，處理所有52小時樣品。在hplc分析之前和過程中將樣品儲存在4℃下。表38：hplc系統(tǒng)針對糖(dp4+、dp3、dp2、葡萄糖、和果糖)、有機酸(乳酸和乙酸)、甘油、和乙醇分析樣品。結(jié)果下表39示出來自實驗1的結(jié)果表39：shellrock乳酸結(jié)果下表40示出來自實驗2的結(jié)果表40：oneearth乳酸結(jié)果實例27在工業(yè)生產(chǎn)的α-淀粉酶a玉米醪的生物反應器發(fā)酵期間減少的乳酸積累當使用mbg4851時，與ethanolred相比，在工業(yè)制備的α-淀粉酶a液化的玉米醪中，評估乳酸水平。玉米醪從lincolnland獲得工業(yè)制備的玉米醪。通過水分平衡，測量醪液的固體為32.95％。酵母菌株和增殖該實驗中所測試的兩種酵母菌株是ethanolred(富酶泰斯公司)和mbg4851。增殖中目標固體百分比是20％，將607ml的醪液添加到393ml水中以達到20％固體的1000ml增殖體積。以0.024克/升的濃度添加lactrol。通過添加3ml50％尿素溶液，以1500ppm的濃度添加尿素氮。葡糖淀粉酶劑量被計算為0.075g/1l發(fā)酵罐。作為接種物，稱出2.08克干酵母，添加到預熱至36.5℃的40ml水中，并且允許在15分鐘在渦旋的條件下再水合30分鐘。然后向該增殖中添加10ml這種再水合物。增殖時間為在33.3℃下8小時，在該時間，將15.2ml的增殖轉(zhuǎn)移至發(fā)酵容器中，為約1.6％接種。所有增殖和發(fā)酵是在1l賽多利斯(sartorius)q+生物反應器中進行。同時糖化發(fā)酵(ssf)以0.024克/升的濃度添加lactrol到各發(fā)酵罐中。向600ppm總尿素中添加尿素。將葡糖淀粉酶sa以110μgepgsa/gds給出到各醪液反應器中。為了模擬工廠規(guī)模的酶添加，將55％的葡糖淀粉酶和50％的發(fā)酵尿素在接種時給予。在發(fā)酵8小時后，將剩余的45％葡糖淀粉酶和50％尿素添加到發(fā)酵罐中。溫度曲線所有發(fā)酵在32℃下開始，并且然后如以下描述啟動溫度曲線。表41：溫度曲線hplc分析在發(fā)酵的0、2、4、6、8、12、16、24、30、48、54、和60小時處，通過將5克醪液取樣到15ml管中來進行發(fā)酵取樣。每個管通過用150μl的40％v/vh2so4失活、渦旋、以1460×g離心10分鐘，并且通過0.45μm沃特曼pp過濾器(whatmanppfilter)過濾進行處理用于hplc分析。在hplc分析之前和過程中將樣品儲存在4℃下。表42：hplc系統(tǒng)針對糖(dp4+、dp3、dp2、葡萄糖、和果糖)、有機酸(乳酸和乙酸)、甘油、和乙醇分析樣品。結(jié)果以下圖1中示出了整個發(fā)酵過程中乳酸滴度。發(fā)酵結(jié)束時的水平示于下表26中。表43示出在用α-淀粉酶a液化的1l發(fā)酵期間的乳酸滴度。表43：在發(fā)酵60小時處乳酸結(jié)果實例28在工業(yè)生產(chǎn)的玉米醪的生物反應器發(fā)酵期間減少的乳酸積累。當使用mbg4851時，與ethanolredtm相比，在工業(yè)制備的、用α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和0.0385μgeppfu/gds的共混物液化的玉米醪中，評估乳酸積累。玉米醪從huskerag獲得工業(yè)制備的玉米醪。通過水分平衡，測量醪液的固體為34.05％。酵母菌株和增殖該實驗中所測試的兩種酵母菌株是ethanolred(富酶泰斯公司)和mbg4851。增殖中目標固體百分比是20％，將587ml的醪液添加到413ml水中以達到20％固體的1000ml增殖體積。以0.024克/升的濃度添加lactrol。通過添加3ml50％尿素溶液，以1500ppm的濃度添加尿素氮。葡糖淀粉酶劑量被計算為0.075g/1l發(fā)酵罐。作為接種物，稱出2.08克干酵母，添加到預熱至36.5℃的40ml水中，并且允許在15分鐘在渦旋的條件下再水合30分鐘。然后向該增殖中添加10ml這種再水合物。增殖時間為在33.3℃下8小時，在該時間，將15.2ml的增殖轉(zhuǎn)移至發(fā)酵容器中，為約1.6％接種。所有增殖和發(fā)酵是在1l賽多利斯(sartorius)q+生物反應器中進行。同時糖化發(fā)酵(ssf)以0.024克/升的濃度添加lactrol到各發(fā)酵罐中。向600ppm總尿素中添加尿素。將葡糖淀粉酶sa以110μgepgsa/gds給出到各反應器中。為了模擬工廠規(guī)模的酶添加，將30％的葡糖淀粉酶和50％的發(fā)酵尿素在接種時給予。在發(fā)酵8小時后，將剩余的70％葡糖淀粉酶和50％尿素添加到發(fā)酵罐中。溫度曲線所有發(fā)酵在32℃下開始，并且然后如以下描述啟動溫度曲線。表44：溫度曲線hplc分析在發(fā)酵的0、2、4、6、8、12、16、24、30、48、54、和60小時處，通過將5克醪液取樣到15ml管中來進行發(fā)酵取樣。每個管通過用150μl的40％v/vh2so4失活、渦旋、以1460×g離心10分鐘，并且通過0.45μm沃特曼pp過濾器(whatmanppfilter)過濾進行處理用于hplc分析。在hplc分析之前和過程中將樣品儲存在4℃下。表45：hplc系統(tǒng)針對糖(dp4+、dp3、dp2、葡萄糖、和果糖)、有機酸(乳酸和乙酸)、甘油、和乙醇分析樣品。結(jié)果以下圖2中示出了整個發(fā)酵過程中乳酸滴度。發(fā)酵結(jié)束時的水平示于下表46中。圖3示出在用α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和0.0385μgeppfu/gds的共混物液化的1l玉米醪發(fā)酵期間的乳酸水平。表46：60小時乳酸結(jié)果。實例29在用不同水平pfu蛋白酶產(chǎn)生的醪液的發(fā)酵中的甘油減少。使用以上實例22中所描述的實驗裝置進行該實例。當使用mbg4851時，與ethanolredtm相比，評估在用一種共混物液化的液化物中的甘油水平，該共混物具有α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和增加水平的pfu蛋白酶(0.0385、1.5、和3.0μgeppfu/gds)。結(jié)果針對實驗1，54小時甘油結(jié)果示于下表47中，并且針對實驗2示于下表48中。mbg4851具有顯著的甘油減少，甚至是在最高水平的pfu補充下。表47：實驗1的54小時甘油結(jié)果表48：實驗2的54小時甘油結(jié)果實例30在用不同水平pfu蛋白酶產(chǎn)生的無逆流醪液的發(fā)酵中的甘油減少使用以上實例24中所描述的實驗裝置進行該實例。當使用mbg4851時，與ethanolredtm相比，評估在用一種共混物液化的、無逆流液化物中的甘油水平，該共混物具有α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和增加水平的pfu蛋白酶(0.0385和3.0μgeppfu/gds)。54小時甘油結(jié)果示于下表49中。與ethanolred相比，無論所添加的尿素，mbg4851具有顯著的甘油降低。表49：54小時甘油結(jié)果實例31在用α-淀粉酶a作為液化酶工業(yè)生產(chǎn)的玉米醪的發(fā)酵中甘油的減少使用以上實例23中所描述的實驗裝置進行該實例。當使用mbg4851時，在具有不同尿素補充水平的工業(yè)生產(chǎn)的、α-淀粉酶(α-淀粉酶a)液化的玉米醪中，與ethanolredtm相比，評估甘油水平。甘油結(jié)果可以在下表50中發(fā)現(xiàn)。表50：54小時甘油結(jié)果實例32在用α-淀粉酶f(fuelzymetm)作為液化酶工業(yè)生產(chǎn)的玉米醪的發(fā)酵中甘油減少使用以上實例25中所描述的實驗裝置進行該實例。當使用mbg4851時，與ethanolred相比，在工業(yè)制備的α-淀粉酶f(fuelzymetm)液化的玉米醪中，評估甘油水平。52小時甘油結(jié)果可以在下表51中發(fā)現(xiàn)。表51：52小時甘油結(jié)果ermbg4851％減少10.9748.51822.37％實例33在用液化酶共混物的工業(yè)生產(chǎn)的玉米醪的發(fā)酵中的甘油減少使用以上實例26中所描述的實驗裝置進行該實例。當使用mbg4851時，與ethanolred相比，在工業(yè)制備的、用α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和0.0385μgeppfu/gds的共混物液化的玉米醪中，評估甘油水平。。針對實驗1和2，54小時甘油結(jié)果可以分別發(fā)現(xiàn)于表52和53中。表52：實驗1的54小時甘油結(jié)果表53：實驗2的54小時甘油結(jié)果gaermbg4851％減少gsa+cvd15.068313.307511.69％gsa15.236213.476311.55％實例34在工業(yè)生產(chǎn)的α-淀粉酶a玉米醪的生物反應器發(fā)酵期間的甘油水平。使用以上實例27中所描述的實驗裝置進行該實例。當使用mbg4851時，與ethanolred相比，在工業(yè)制備的α-淀粉酶a液化的玉米醪中，評估甘油水平。在整個發(fā)酵中醪液中甘油積累可以見于圖3。60小時值可以在表54中發(fā)現(xiàn)。圖3示出了發(fā)酵期間甘油水平。表54：60小時甘油值ermbg4851％減少14.42913.7994.37％實例35在工業(yè)生產(chǎn)的玉米醪的生物反應器發(fā)酵期間的甘油水平。使用以上實例28中所描述的實驗裝置進行該實例。當使用mbg4851(v14/004037)時，與ethanolred相比，在工業(yè)制備的、用α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和0.0385μgeppfu/gds的共混物液化的玉米醪中，評估甘油水平。在整個發(fā)酵中醪液中甘油積累可以見于圖4。60小時值可以在表55中發(fā)現(xiàn)。圖4示出了發(fā)酵期間甘油水平表55：60小時甘油值ermbg4851％減少16.91615.6437.53％實例36菌株v14/004037(mbg4851)的生產(chǎn)使用wo2005/121337中描述的方法并且通過與釀酒酵母的各種菌株交配，結(jié)合以選擇包括低甘油和高乙醇產(chǎn)生的特性，來生產(chǎn)菌株v14/004037。菌株v14/004037，當萌發(fā)的孢子與釀酒酵母的標準菌株(包括釀酒酵母的測試菌株)交配時，通過其形成孢子和產(chǎn)生子代的能力被證實是釀酒酵母菌株。一個這樣的單倍體測試菌株是w303-1a。確切地，當與測試菌株w303-1a交配時，菌株v14/004037的萌發(fā)的孢子能夠產(chǎn)生雜合后代。更詳細地，單倍體菌株w303-1a獲得自在美國atcc的酵母遺傳庫存中心(atcc#208352)，如奧蘇貝爾，f.m.等人，(1997)，(currentprotocolsinmolecularbiology)，第2卷，第13.2.1至13.2.5頁，由約翰&威利父子公司出版中所描述的，培養(yǎng)菌株v14/004037以形成單倍體酵母菌屬酵母。隨后，將孢子在固體培養(yǎng)基(如包含1％w/vd-葡萄糖、0.5％酵母提取物、1％w/v細菌蛋白胨和1.5％w/v瓊脂的gyp)上進行萌發(fā)，并且在30℃下孵育3至5天。然后使用以下方法，將來自菌株v14/004037的分離的、萌發(fā)的孢子與單倍體w303-1a一起交配，例如，該方法描述于奧蘇貝爾，f.m.等人，(1997)，分子生物學現(xiàn)代方法(currentprotocolsinmolecularbiology)，第2卷，第13.2.1至13.2.5頁，由約翰&威利父子公司出版中。雜合合子的形成可以在顯微鏡下觀察到，證實了菌株v14/004037是釀酒酵母菌株。菌株v14/004037于2014年2月17日在布達佩斯條約下保藏于國家計量研究院，1/153伯蒂街伯蒂街，墨爾本港，維多利亞州3207，澳大利亞，并且被指定登錄號為v14/004037。實例37在木糖基本培養(yǎng)基上的菌株v14/004037(mbg4851)的生長使用測試t1來確定菌株v14/004037在為唯一碳源的木糖上的生長。使用標準微生物學技術(shù)，將釀酒酵母菌株v14/004037劃線到使用2％瓊脂固化的2％w/vd-葡萄糖、1％細菌蛋白胨和0.5％酵母膏培養(yǎng)基上。在30℃下孵育72小時后，使用無菌微生物環(huán)將酵母細胞從板上取出，并且在50ml肉湯中接種至0.1和0.2單位(在t0下的od600)之間的od600(在600nm下的光密度)。0.1單位的od600等于約9x105酵母細胞/ml。在250ml埃倫邁爾燒瓶中，該肉湯包含在蒸餾水中的木糖(5％w/v)、difco酵母氮源w/o氨基酸(0.67％)、檸檬酸(0.3％)和檸檬酸三鈉(0.7％)。檸檬酸和檸檬酸三鈉被提供為不能用作為酵母菌屬生長基質(zhì)的緩沖劑。99％純的d-(+)-木糖獲得自西格瑪-奧德里奇公司(目錄編號x1500-500g)。在測量od600(在t48hr處的od600)之前在30℃下，在220rpm(10cm軌道直徑)的震蕩下將培養(yǎng)物孵育48小時。通過以下公式確定生物質(zhì)的倍數(shù)增加：t48hr處的od600除以t0處的od600。以0.149的初始od600接種菌株v14/004037，并且在48小時內(nèi)增加超過7倍。在相同條件下，ethanolred酵母的生物質(zhì)增加少于2倍。實例38玉米醪的發(fā)酵玉米醪可以獲得自生產(chǎn)乙醇的公司，如描述于德萬迪爾(devantier)等人，應用微生物學和生物技術(shù)(appliedmicrobiologyandbiotechnology)2005，68:622-629。用于制備玉米醪的方法還描述于托馬斯(thomas)等人，應用微生物學雜志(journalofappliedmicrobiology)2001,90:819-828。還可以按以下方法制備玉米醪：取決于所希望的玉米醪干物質(zhì)靶標，將以下成分置于玻璃燒杯中，并且記錄成分加燒杯的總重量。表56α-淀粉酶可以是，例如，liquozymesctm(諾維信，巴格斯瓦德，丹麥)。將該漿料在85℃下繼續(xù)攪拌3.5小時。然后冷卻該醪液，并且稱重燒杯的質(zhì)量并且基于燒杯和成分的原始重量在煮醪液期間考慮蒸發(fā)用水進行補償。將醪液冷卻至32℃并且調(diào)節(jié)至ph5.2。添加葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶可以是，例如，spirizymeexceltm(諾維信)并且以0.05％干玉米固體給予?；旌显擋惨?，然后分配于在50ml的塑料螺旋加蓋試管中的15g等分試樣中。在添加酵母前，在所希望的溫度(典型地32℃)下，將醪液樣品置于靜態(tài)孵育器中保持30分鐘。通過在37℃下將0.1g活性干酵母懸浮于5ml水中并且靜置30min來制備酵母。在渦旋混合以將酵母均勻分散后，每15g如以上所描述的制備的玉米醪接種190微升的懸浮的酵母。將接種的玉米醪靜態(tài)孵育50小時，并且如wo2011/035392中所描述的通過hplc進行測定。在發(fā)酵20小時(表57)、44hr(表58)和50小時(表59)后，使用wo2011/035392中所描述的方法確定發(fā)酵中的乙醇、甘油、葡萄糖和麥芽糖的水平。這些結(jié)果還圖形繪制于圖5和6中。所有酵母是活性干酵母。ethanolre是來自富酶泰斯公司，bp3029-137加布里埃爾街，f-59703馬爾康巴勒爾，法國(fermentis,bp3029-137ruegabrielpéri,f-59703marcq-en-baroeul,cedexfrance)的商業(yè)樣本。如wo2011/035392中所描述的生長并且干燥v09/024011和v14/004037(mbg4851)。ethanolred的代表性樣品于2014年3月19日在布達佩斯條約下保藏于國家計量研究院，1/153伯蒂街墨爾本港，維多利亞州3207，并且被指定登錄號為v14/007039。值表示百分比重量/體積(％w/v)。表57：將玉米醪發(fā)酵20小時如可以從表57所見，在玉米醪發(fā)酵20小時后，菌株v14/004037比ethanolred產(chǎn)生更大量的乙醇，并且菌株v09/024011比ethanolred產(chǎn)生更少甘油。針對v14/004037，發(fā)酵產(chǎn)物乙醇與甘油的比率也顯著更高。表58：將玉米醪發(fā)酵44小時如可以從表58所見，在玉米醪發(fā)酵44小時后，菌株v14/004037比ethanolred以及菌株v09/024011產(chǎn)生更大量的乙醇，并且比ethanolred和菌株v09/024011產(chǎn)生更少甘油。表59：將玉米醪發(fā)酵50小時圖5和6顯示出，在20小時處，菌株v14/004037的乙醇生產(chǎn)比率比ethanolred和菌株v09/024011顯著更大，指示出在乙醇生產(chǎn)時菌株v14/004037更有效。這可以有利于減少必要的發(fā)酵時間。此外，v14/004037的乙醇與甘油的最終比率更高。此外，即使剩余葡萄糖與乙醇的轉(zhuǎn)換處于最大理論水平(0.51g乙醇/g葡萄糖)，指示出菌株v14/004037的乙醇產(chǎn)量比ethanolred或v09/024011更好。實例39在用pfu蛋白酶產(chǎn)生的醪液中減少的乙醛積累。與ethanolredtm(er)相比，評估m(xù)bg4851在用一種共混物液化的液化物中的性能，該共混物具有α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和pfu蛋白酶(3.0μgeppfu/gds)。液化通過將研磨的玉米、逆流與自來水組合，至185g的總目標重量，干固體(ds)為32.50％，來制備液化；將逆流以30％w/w(逆流重量/醪液總重量)共混。將在2012年12月12日接收的來自林肯道能源(lincolnwayenergy)的逆流和從中央市，內(nèi)布拉斯加州，美國的gpre接收的內(nèi)部研磨的玉米用于所有液化。初始漿料ph為5.0，并且因此無需進一步調(diào)整。然后，添加水和酶，隨后密封所有l(wèi)abomat罐并且開始200ml程序：5℃/min。漸變，15分鐘漸變至80℃，保持1min，以1℃/min漸變至85℃并且保持103min，40rpm向左轉(zhuǎn)30秒并且向右轉(zhuǎn)30秒。將所有醪液罐在冰浴中冷卻并且根據(jù)以下描述的ssf程序制備用于發(fā)酵。添加2.1μgepaa369/gds、4.5μgeppoamg498/gds、和3.0μgeppfu/gds。酵母菌株和制劑該實驗中所測試的兩種酵母菌株是ethanolredtm(富酶泰斯公司)和mbg4851。通過將3.52g的干酵母稱重到在125ml埃倫邁爾燒瓶中40ml的37℃自來水中，來將酵母再水化。然后將燒瓶用封口膜覆蓋，渦旋混合，并且允許在32℃水浴中進行孵育。在15分鐘后，將燒瓶從水浴中去除，并且再一次渦旋混合。同時糖化發(fā)酵(ssf)液化后的ph為5.1并且不用針對ssf進一步調(diào)節(jié)。通過水分平衡，醪液固體被計算為31.6％。在500ml釜中，針對每種酵母，設(shè)置一個350ml增殖。將醪液固體調(diào)整為約27％，并且針對細菌對照添加0.024g/llactrol。ga劑量被計算為0.018g/350ml增殖。然后添加5ml再水合酵母來開始該增殖。增殖時間為在33.3℃下8小時，在該時間，將18ml的增殖轉(zhuǎn)移至發(fā)酵容器中，為約1.8％接種。在1l賽多利斯q+反應器中，設(shè)置發(fā)酵。每個發(fā)酵容器用1000ml上述玉米醪進行設(shè)置。將醪液保持在12℃下，直到接種前約一小時，在該時間將其加熱至32℃。將lactrol以0.024g/l添加到各發(fā)酵罐，來限制細菌污染。將尿素添加到各醪液中至200ppm的終濃度。將葡糖淀粉酶sa以110μgepgsa/gds給出到各醪液反應器中。為了模擬工廠規(guī)模的酶添加，將30％的葡糖淀粉酶在接種時給予。在發(fā)酵8小時后，將剩余的70％葡糖淀粉酶添加到發(fā)酵罐中。兩個生物反應器的溫度都在32℃下開始，并且然后遵循以下曲線來模擬工業(yè)設(shè)置中經(jīng)歷的溫度。取樣和gc分析發(fā)酵54小時后進行發(fā)酵取樣。在發(fā)酵期間，反應器沒有取樣。在最終時間點，從每個反應器取3個樣品。將5ml醪液取樣到15ml離心管中。在取樣后，使用150μl的40％h2so4來停止發(fā)酵。渦旋樣品進行混合，并且然后在3000rpm下離心5-10分鐘來沉淀玉米碎片。然后將上清液通過0.45μm過濾器進行過濾。無需進一步稀釋，處理所有54小時樣品。在提交之前將樣品儲存在4℃下以用于分析。通過焓值分析公司(enthalpyanalyticalinc.)(達拉謨(durham)，北卡羅來納州)分析乙醛水平。結(jié)果以下示出了乙醛水平的結(jié)果。在該實驗中，與ethanolredtm(er)相比，mbg4851發(fā)酵顯示出了乙醛水平下降52％。實例40用mbg4851進行的發(fā)酵中增加的油產(chǎn)量。酵母菌株和制劑該實驗中所測試的兩種酵母菌株是ethanolredtm(富酶泰斯公司)和mbg4851。通過將5.5g的干酵母稱重到在250ml埃倫邁爾燒瓶中100ml的37℃自來水中，來將酵母再水化。然后將燒瓶用封口膜覆蓋，渦旋混合，并且允許在32℃水浴中進行孵育。在15分鐘后，將燒瓶從水浴中去除，并且再一次渦旋混合。同時糖化發(fā)酵(ssf)針對這種實驗，使用用α-淀粉酶(2.1μgepaa369/gds)、葡糖淀粉酶(4.5μgeppoamg498/gds)和蛋白酶(0.0385μgeppfu/gds)的共混物液化的工業(yè)生產(chǎn)的玉米醪。液化后的ph為5.1并且不用針對ssf進一步調(diào)節(jié)。通過水分平衡，醪液固體被計算為28.30％。將醪液調(diào)節(jié)至1000ppm尿素和3mg/l青霉素，并且等分到50ml螺帽離心管中的25g樣品中，總計24個樣品。在所有管中以0.6agu/gds給予葡糖淀粉酶sa(“gsa”)。在管4-6和10-12中，以5μg/gds給予蛋白酶x。在管1-6中，添加150μl的再水合mbg4851酵母。在管7-12中，添加150μl的再水合ethanolred酵母。在32℃震蕩水浴中進行發(fā)酵64小時。取樣和油分析油提取：以0.125ml己烷/1g起始材料的劑量將己烷添加至每個樣品。將每個管覆蓋在封口膜(dura-seal)中以防止樣品漏泄，并且充分混合。在具有js-5.3轉(zhuǎn)子的avantije系列離心機中，將管在3,000xg下離心10分鐘。在離心之后，使用正位移移液管去除油/己烷層(上清液)，轉(zhuǎn)移至預稱重的5ml掀蓋式管，并且再稱重。使用魯?shù)婪蜓芯糠治雒芏扔嫓y量樣品密度。然后使用標準曲線等式計算上清液的密度，以發(fā)現(xiàn)上清液中油％。從該值衍生出起始材料中油的總％。結(jié)果油測定的結(jié)果列于下表中。在以下編號的段落中進一步描述本發(fā)明：1.一種用于從含淀粉材料生產(chǎn)乙醇的方法，該方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用α-淀粉酶液化該含淀粉材料；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或發(fā)酵生物菌株，該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。2.如段落1所述的方法，其中氮源，優(yōu)選地尿素，添加于糖化、發(fā)酵、或同時糖化發(fā)酵(ssf)中。3.如段落1所述的方法，其中在糖化或發(fā)酵或ssf中添加少于3,000ppm，如少于2000ppm、如少于1,000ppm、如少于800ppm、如少于600ppm、如少于500ppm、如少于400ppm、如少于300ppm、如少于200ppm、如少于100ppm氮源、如無氮源，尤其是尿素。4.如段落1所述的方法，其中在糖化或發(fā)酵或ssf中添加從100至600ppm尿素。5.如段落1-4中任一項所述的方法，其中在糖化或發(fā)酵或ssf中添加蛋白酶。6.如段落1-5中任一項所述的方法，在液化步驟i)之前進一步包括以下步驟：x)優(yōu)選地通過干磨來減小含淀粉材料的粒度；y)形成了包含該含淀粉的材料和水的漿液。7.如段落1-6中任一項所述的方法，其中至少50％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，尤其是至少90％的含淀粉材料適合通過一個具有#6篩網(wǎng)的篩子。8.如段落1-3中任一項所述的方法，其中液化中的ph在4-7之間，如在ph4.5-6,5之間、如在ph5.0-6.5之間、如在ph5.0-6.0之間、如在ph5.2-6.2之間、如約5.2、如約5.4、如約5.6、如約5.8。9.如段落1-8中任一項所述的方法，其中在液化中的溫度范圍是從70℃-100℃，例如在75℃-95℃之間，例如在75℃-90℃之間，優(yōu)選在80℃-90℃之間，例如在82℃-88℃之間，例如約85℃。10.如段落1-9中任一項所述的方法，其中在步驟i)中的液化之前進行噴射蒸煮步驟。11.如段落10所述的方法，其中該噴射蒸煮是在110℃-145℃、優(yōu)選120℃-140℃、例如125℃-135℃、優(yōu)選約130℃的溫度下進行持續(xù)約1-15分鐘，優(yōu)選持續(xù)約3-10分鐘，尤其是約5分鐘左右。12.如段落1-11中任一項所述的方法，其中糖化和發(fā)酵是順序進行或同時(ssf)進行。13.如段落1-12中任一項所述的方法，其中糖化是在從20℃-75℃、優(yōu)選從40℃-70℃、例如約60℃的溫度下，并且在4和5之間的ph下進行。14.如段落1-13中任一項所述的方法，其中發(fā)酵或同時糖化發(fā)酵(ssf)在從25℃至40℃、例如從28℃至35℃、例如從30℃至34℃，優(yōu)選約32℃左右的溫度下進行。在一個實施例中，發(fā)酵進行6至120小時，尤其是24至96小時。15.如段落1-14中任一項所述的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物是在發(fā)酵之后，例如通過蒸餾回收的。16.如段落1-15中任一項所述的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物是醇，優(yōu)選乙醇，尤其是燃料乙醇、飲用乙醇和/或工業(yè)乙醇。17.如段落1-16中任一項所述的方法，其中該含淀粉起始材料是全谷物。18.如段落1-17中任一項所述的方法，其中該含淀粉材料來源于玉米、小麥、大麥、黑麥、蜀黍、西米、木薯、樹薯、木薯淀粉、高粱、燕麥、稻或馬鈴薯。19.如段落1-18中任一項所述的方法，其中在液化步驟i)中使用或添加的α-淀粉酶是細菌來源的。20.如段落1-19中任一項所述的方法，其中該α-淀粉酶來自芽胞桿菌屬，例如嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的一種變體，例如wo99/019467中的seqidno:3或在此的seqidno:1中所示的那種。21.如段落20所述的方法，其中該嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶或其變體是截短的，優(yōu)選地截短以具有從485-495個氨基酸，如約491個氨基酸。22.如段落20或21中任一項所述的方法，其中該嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶具有在位置i181+g182處的雙缺失，并且任選地具有n193f取代、或r179+g180缺失(使用seqidno:1進行編號)。23.如段落20-22中任一項所述的方法，其中該嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶在位置s242具有取代，優(yōu)選s242q取代(使用seqidno:1進行編號)。24.如段落20-23中任一項所述的方法，其中該嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶在位置e188具有取代，優(yōu)選e188p取代(使用seqidno:1進行編號)。25.如段落1-24中任一項所述的方法，其中該α-淀粉酶在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少10的t1/2(min)，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如在10-70之間，例如在15-70之間，例如在20-70之間，例如在25-70之間，例如在30-70之間，例如在40-70之間，例如在50-70之間，例如在60-70之間。26.如段落1-25中任一項所述的方法，其中在液化步驟i)中存在和/或添加的α-淀粉酶選自嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體的組，這些變體除i181*+g182*以及任選地n193f之外具有以下突變：27.如段落1-26中任一項所述的方法，其中在液化步驟i)中存在和/或添加的α-淀粉酶選自嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體的下組：-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-i181*+g182*+n193f+v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v以及-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)。28.如段落1-27中任一項所述的方法，其中在糖化和/或發(fā)酵過程中存在和/或添加葡糖淀粉酶。29.如段落28所述的方法，其中在糖化、發(fā)酵或同時糖化發(fā)酵(ssf)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌來源的，優(yōu)選來自曲霉屬的菌株，優(yōu)選黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉的菌株；或木霉屬的菌株，優(yōu)選里氏木霉；或籃狀菌屬的菌株，優(yōu)選埃默森籃狀菌；或密孔菌屬的菌株；或粘褶菌屬的菌株，例如籬邊粘褶菌或密粘褶菌，或黑層孔屬的菌株。30.如段落1-29中任一項所述的方法，其中葡糖淀粉酶源自埃默森籃狀菌，例如示于在此的seqidno：19中的那種。31.如段落1-29中任一項所述的方法，其中該葡糖淀粉酶選自下組，該組由以下各項組成：(i)一種葡糖淀粉酶，包括在此的seqidno:19的成熟多肽；(ii)一種葡糖淀粉酶，包括以下氨基酸序列，該氨基酸序列與在此的seqidno:19的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性。32.如段落1-29中任一項所述的方法，其中糖化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶源自籬邊粘褶菌，例如示于在此的seqidno：15中的那種。33.如段落1-29中任一項所述的方法，其中在糖化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶選自下組，該組由以下各項組成：(i)一種葡糖淀粉酶，包括在此的seqidno:15的成熟多肽；(ii)一種葡糖淀粉酶，包括以下氨基酸序列，該氨基酸序列與在此的seqidno:15的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性。34.如段落1-29中任一項所述的方法，其中糖化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，例如示于在此的seqidno:17中的那種。35.如段落1-29中任一項所述的方法，其中在糖化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶選自下組，該組由以下各項組成：(i)一種葡糖淀粉酶，包括在此的seqidno:17的成熟多肽；(ii)一種葡糖淀粉酶，包括以下氨基酸序列，該氨基酸序列與在此的seqidno:17的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性。36.如段落1-29中任一項所述的方法，其中葡糖淀粉酶是在糖化和/或發(fā)酵過程中與α-淀粉酶結(jié)合存在的和/或添加的。37.如段落36所述的方法，其中在糖化和/或發(fā)酵過程中存在的和/或添加的α-淀粉酶是真菌或細菌來源的。38.如段落36或37所述的方法，其中在糖化和/或發(fā)酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶源自根毛霉屬菌株，優(yōu)選的是菌株微小根毛霉，例如示于wo2013/006756中的seqidno:3中的那種，例如具有黑曲霉連接子和淀粉結(jié)合域的微小根毛霉α-淀粉酶雜合體，例如示于在此的seqidno:16中的那種。39.如段落36-38中任一項所述的方法，其中在糖化和/或發(fā)酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶選自下組，該組由以下各項組成：(i)一種α-淀粉酶，包括在此的seqidno:16的成熟多肽；(ii)一種α-淀粉酶，包括以下氨基酸序列，該氨基酸序列與在此的seqidno:16的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性。40.如段落36-39中任一項所述的方法，其中該α-淀粉酶是示于seqidno:16中的具有以下取代或取代組合中的至少一種的α-淀粉酶變體：d165m；y141w；y141r；k136f；k192r；p224a；p224r；s123h+y141w；g20s+y141w；a76g+y141w；g128d+y141w；g128d+d143n；p219c+y141w；n142d+d143n；y141w+k192r；y141w+d143n；y141w+n383r；y141w+p219c+a265c；y141w+n142d+d143n；y141w+k192rv410a；g128d+y141w+d143n；y141w+d143n+p219c；y141w+d143n+k192r；g128d+d143n+k192r；y141w+d143n+k192r+p219c；g128d+y141w+d143n+k192r；或g128d+y141w+d143n+k192r+p219c(使用seqidno:16進行編號)。41.如段落36-40中任一項所述的方法，其中該α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶連接子和淀粉結(jié)合域(sbd)的微小根毛霉，優(yōu)選披露為在此的seqidno:16，優(yōu)選具有以下取代中的一個或多個：g128d、d143n，優(yōu)選g128d+d143n(使用seqidno:16進行編號)。42.如段落36-41中任一項所述的方法，其中該α-淀粉酶變體與在此的seqidno:16的多肽的成熟部分具有至少75％一致性，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少91％，更優(yōu)選至少92％，甚至更優(yōu)選至少93％，最優(yōu)選至少94％，并且甚至最優(yōu)選至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性。43.如段落1-42中任一項所述的方法，其中使用以下各項進行液化步驟i)：-α-淀粉酶；-一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值；以及-任選地一種葡糖淀粉酶。44.如段落43所述的方法，其中該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過25％的熱穩(wěn)定性值。45.如段落43-44所述的方法，其中該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的，超過30％、超過40％、超過50％、超過60％、超過70％、超過80％、超過90％、超過100％，例如超過105％，例如超過110％，例如超過115％，例如超過120％的熱穩(wěn)定性。46.如段落43-45中任一項所述的方法，其中該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的，在20％與50％之間，例如在20％與40％之間，例如20％與30％的熱穩(wěn)定性。47.如段落43-46中任一項所述的方法，其中該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的，在50％與115％之間，例如在50％與70％之間，例如在50％與60％之間，例如在100％與120％之間，例如在105％與115％之間的熱穩(wěn)定性。48.如段落43-47中任一項所述的方法，其中該蛋白酶具有確定為在85℃/70℃下的相對活性的，超過10％，例如超過12％、超過14％、超過16％、超過18％、超過20％、超過30％、超過40％、超過50％、超過60％、超過70％、超過80％、超過90％、超過100％、超過110％的熱穩(wěn)定性。49.如段落43-48中任一項所述的方法，其中該蛋白酶具有確定為在85℃/70℃下的相對活性的，在10％與50％之間，例如在10％與30％之間，例如在10％與25％之間的熱穩(wěn)定性。50.如段落43-49中任一項所述的方法，其中該蛋白酶在85℃下具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的熱穩(wěn)定性，如使用zein-bca測定法確定的。51.如段落43-50中任一項所述的方法，其中該蛋白酶在85℃下具有在60-120之間，例如在70％-120％之間，例如在80％-120％之間，例如在90％-120％之間，例如在100％-120％之間，例如110％-120％的熱穩(wěn)定性，如使用zein-bca測定法確定的。52.如段落43-51中任一項所述的方法，其中蛋白酶是真菌來源的。53.如段落43-52中任一項所述的方法，其中蛋白酶是源自嗜熱子囊菌屬的菌株，優(yōu)選金黃色嗜熱子囊菌的菌株，尤其是金黃色嗜熱子囊菌cgmccno.0670的金屬蛋白酶的變體。54.如段落43-53中任一項所述的方法，其中該蛋白酶是披露為以下的金屬蛋白酶的變體：wo2003/048353中披露的seqidno:2的成熟部分或wo2010/008841中seqidno:1的成熟部分或在此的seqidno:3，突變選自下組：-s5*+d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+a112p+t124v+d142l；-s5*+n26r+d79l+s87p+a112p+d142l；-n26r+t46r+d79l+s87p+a112p+d142l；-t46r+d79l+s87p+t116v+d142l；-d79l+p81r+s87p+a112p+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+s87p+a112p+t124v+a126v+d142l；-d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+d142l；-s38t+d79l+s87p+a112p+a126v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+a126v+d142l；-d79l+s87p+n98c+a112p+g135c+d142l；-d79l+s87p+a112p+d142l+t141c+m161c；-s36p+d79l+s87p+a112p+d142l；-a37p+d79l+s87p+a112p+d142l；-s49p+d79l+s87p+a112p+d142l；-s50p+d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+d104p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+a112p+d142l；-s70v+d79l+y82f+s87g+y97w+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+y97w+d104p+a112p+d142l；-s70v+d79l+y82f+s87g+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+a112p+a126v+d142l；-y82f+s87g+s70v+d79l+d104p+a112p+d142l；-y82f+s87g+d79l+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+y82f+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+y82f+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+d142l；以及-d79l+s87p+d142l。55.如段落43-54中任一項所述的方法，其中該蛋白酶是披露為以下的金屬蛋白酶的變體：wo2003/048353中披露的seqidno:2的成熟部分或wo2010/008841中seqidno:1的成熟部分或在此的seqidno:3，具有以下突變：d79l+s87p+a112p+d142l；d79l+s87p+d142l；或a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。56.如段落43-55中任一項所述的方法，其中該蛋白酶變體與wo2003/048353中披露的seqidno:2的多肽的成熟部分或wo2010/008841中seqidno:1的成熟部分或在此的seqidno:3具有至少75％一致性，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少91％，更優(yōu)選至少92％，甚至更優(yōu)選至少93％，最優(yōu)選至少94％，并且甚至最優(yōu)選至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％一致性。57.如段落43-56中任一項所述的方法，其中示于在此的seqidno:3中的金黃色嗜熱子囊菌蛋白酶的蛋白酶變體是以下項中的一種：-d79ls87pd142l-d79ls87pa112pd142l-d79ly82fs87pa112pd142l-s38td79ls87pa112pa126vd142l-d79ly82fs87pa112pa126vd142l-a27kd79ls87pa112pa126vd142l-s49pd79ls87pa112pd142l-s50pd79ls87pa112pd142l-d79ls87pd104pa112pd142l-d79ly82fs87ga112pd142l-s70vd79ly82fs87gy97wa112pd142l-d79ly82fs87gy97wd104pa112pd142l-s70vd79ly82fs87ga112pd142l-d79ly82fs87gd104pa112pd142l-d79ly82fs87ga112pa126vd142l-y82fs87gs70vd79ld104pa112pd142l-y82fs87gd79ld104pa112pa126vd142l-a27kd79ly82fs87gd104pa112pa126vd142l58.如段落43-57中任一項所述的方法，其中蛋白酶是細菌來源的。59.如段落43-58中任一項所述的方法，其中其中該蛋白酶是來源于火球菌屬菌株，優(yōu)選強烈火球菌菌株。60.如段落1-41中任一項所述的方法，其中蛋白酶是在us6,358,726中的seqidno:1、或在此的seqidno:13中示出的蛋白酶。61.如段落43-60中任一項所述的方法，其中該蛋白酶是與us6,358,726中的seqidno:1或在此的seqidno:13具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％一致性的蛋白酶。62.如段落43-61中任一項所述的方法，其中在液化步驟i)中存在和/或添加0.5-100微克強烈火球菌蛋白酶/克ds，例如1-50微克強烈火球菌蛋白酶/克ds、例如1-10微克強烈火球菌蛋白酶/克ds、例如1.5-5微克強烈火球菌蛋白酶/克ds、例如約或大于1.5微克強烈火球菌蛋白酶/克ds。63.如段落43-62中任一項所述的方法，其中在液化步驟i)中存在和/或添加2-100微克強烈火球菌蛋白酶/克ds，例如2.5-50微克強烈火球菌蛋白酶/克ds、例如2.5-10微克強烈火球菌蛋白酶/克ds、例如2.5-5微克強烈火球菌蛋白酶克ds，尤其約3微克強烈火球菌蛋白酶/克ds。64.如段落43-63中任一項所述的方法，其中在液化步驟i)期間存在和/或添加葡糖淀粉酶。65.如段落43-64中任一項所述的方法，其中液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶在85℃、ph5.3下具有至少20％、例如至少30％，優(yōu)選至少35％的熱穩(wěn)定性。66.如段落43-65中任一項所述的方法，其中液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶在ph5.0的ph最佳值下具有至少90％，優(yōu)選至少95％，優(yōu)選至少97％的相對活性。67.如段落43-66中任一項所述的方法，其中液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶在ph5.0下具有至少80％、至少85％、至少90％的ph穩(wěn)定性。68.如段落43-67中任一項所述的方法，其中液化步驟i)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶源自青霉屬菌株，尤其是如wo2011/127802中披露為seqidno:2的或在此的seqidno:9或14的草酸青霉菌菌株。69.如段落43-68中所述的方法，其中該葡糖淀粉酶與wo2011/127802中的seqidno:2中所示的成熟多肽或在此的seqidno:9或14具有至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少91％，更優(yōu)選至少92％，甚至更優(yōu)選至少93％，最優(yōu)選至少94％，并且甚至最優(yōu)選至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。70.如段落43-69中任一項所述的方法，其中該葡糖淀粉酶是示于wo2011/127802中的seqidno:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的、具有k79v取代(使用在此的seqidno:14中所示的成熟序列進行編號)的一種變體，例如wo2013/053801中披露的變體。71.如段落43-70中任一項所述的方法，其中該草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有k79v取代(使用seqidno:14進行編號)，并且進一步具有以下之一：t65a；或q327f；或e501v；或y504t；或y504*；或t65a+q327f；或t65a+e501v；或t65a+y504t；或t65a+y504*；或q327f+e501v；或q327f+y504t；或q327f+y504*；或e501v+y504t；或e501v+y504*；或t65a+q327f+e501v；或t65a+q327f+y504t；或t65a+e501v+y504t；或q327f+e501v+y504t；或t65a+q327f+y504*；或t65a+e501v+y504*；或q327f+e501v+y504*；或t65a+q327f+e501v+y504t；或t65a+q327f+e501v+y504*；e501v+y504t；或t65a+k161s；或t65a+q405t；或t65a+q327w；或t65a+q327f；或t65a+q327y；或p11f+t65a+q327f；或r1k+d3w+k5q+g7v+n8s+t10k+p11s+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或r1e+d3n+p4g+g6r+g7a+n8a+t10d+p11d+t65a+q327f；或p11f+t65a+q327w；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或t65a+q327f+e501v+y504t；或t65a+s105p+q327w；或t65a+s105p+q327f；或t65a+q327w+s364p；或t65a+q327f+s364p；或t65a+s103n+q327f；或p2n+p4s+p11f+k34y+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+d445n+v447s；或p2n+p4s+p11f+t65a+i172v+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+n502*；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+n502t+p563s+k571e；或p2n+p4s+p11f+r31s+k33v+t65a+q327f+n564d+k571s；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s377t；或p2n+p4s+p11f+t65a+v325t+q327w；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+d445n+v447s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+i172v+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s377t+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+d26n+k34y+t65a+q327f；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+i375a+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k218a+k221d+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+s103n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+t10d+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+f12y+t65a+q327f+e501v+y504t；或k5a+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+t10e+e18n+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+t10e+e18n+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+t568n；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+k524t+g526a；或p2n+p4s+p11f+k34y+t65a+q327f+d445n+v447s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+r31s+k33v+t65a+q327f+d445n+v447s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+d26n+k34y+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+f80*+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k112s+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+t516p+k524t+g526a；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+n502t+y504*；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+s103n+q327f+e501v+y504t；或k5a+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t+t516p+k524t+g526a；或p2n+p4s+p11f+t65a+k79a+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k79g+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k79i+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k79i+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+k79i+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+l72v+q327f+e501v+y504t；或s255n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+e74n+v79k+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a-+g220n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+y245n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q253n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+d279n+q327f+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s359n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+d370n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+v460s+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+v460t+p468t+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+t463n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+s465n+e501v+y504t；或p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+t477n+e501v+y504t。72.如段落43-71中任一項所述的方法，其中液化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有k79v取代(使用seqidno:14進行編號)，并且進一步具有以下之一：-p11f+t65a+q327f；-p2n+p4s+p11f+t65a+q327f(使用在此的seqidno:14進行編號)。73.如段落43-72中任一項所述的方法，其中該葡糖淀粉酶變體與在此的seqidno:14的多肽的成熟部分具有至少75％一致性，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少91％，更優(yōu)選至少92％，甚至更優(yōu)選至少93％，最優(yōu)選至少94％，并且甚至最優(yōu)選至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性。74.如段落1-73中任一項所述的方法，進一步地其中在液化和/或糖化期間存在支鏈淀粉酶。75.根據(jù)段落1-74中任一項所述的方法，包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶液化該含淀粉材料；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。76.根據(jù)段落1-74中任一項所述的方法，包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，包括在位置i181+g182處的雙缺失、以及任選的n193f取代；(使用在此的seqidno:1進行編號)；ii)使用源自粘褶菌屬菌株，如籬邊粘褶菌或密粘褶菌的葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。77.根據(jù)段落1-76中任一項所述的方法，包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-一種源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶；-一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值，優(yōu)選來源于強烈火球菌和/或金黃色嗜熱子囊菌；并且-任選地一種草酸青霉菌葡糖淀粉酶；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。78.如段落1-77所述的方法，包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-一種α-淀粉酶，優(yōu)選地源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，包括在位置i181+g182處的雙缺失，和任選地n193f取代(使用seqidno:1進行編號)并且具有在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下的至少10的t1/2(min)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。79.如段落1-78所述的方法，包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下液化該含淀粉材料：-一種α-淀粉酶，優(yōu)選源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少10的t1/2(min)；-一種蛋白酶，優(yōu)選來源于強烈火球菌和/或金黃色嗜熱子囊菌，具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值；-任選地一種草酸青霉菌葡糖淀粉酶；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。80.如段落1-79所述的方法，包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，具有在位置i181+g182處的雙缺失、以及任選的取代n193f；以及任選地以下取代集合中的另一種：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶，如來自粘褶菌屬菌株(如籬邊粘褶菌菌株)的葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。81.如段落1-80所述的方法，包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，具有在位置i181+g182處的雙缺失、和任選的取代n193f、以及任選地以下取代集合中的另一種；-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)。-一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值，優(yōu)選來源于強烈火球菌和/或金黃色嗜熱子囊菌；以及-任選地一種如在seqidno:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有選自下組的取代：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(使用seqidno:14進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。82.如段落1-81所述的方法，包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，其具有在位置i181+g182處的雙缺失、和任選的取代n193f、以及進一步任選地以下取代集合中的一種；-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)，-一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值，優(yōu)選來源于強烈火球菌和/或金黃色嗜熱子囊菌；-一種如在seqidno:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有選自下組的取代：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(使用seqidno:14進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。83.根據(jù)段落1-82中任一項所述的方法，包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，具有在位置i181+g182處的雙缺失、以及任選的取代n193f(使用在此的seqidno:1進行編號)；-一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值，優(yōu)選來源于強烈火球菌和/或金黃色嗜熱子囊菌；以及-任選地一種支鏈淀粉酶；-具有k79v取代的草酸青霉菌葡糖淀粉酶(使用在此的seqidno:14進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。84.如段落1-63所述的方法，包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-一種α-淀粉酶，優(yōu)選源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少10的t1/2(min)；-在0.5和10微克之間的強烈火球菌蛋白酶/gds；ii)使用選自下組的葡糖淀粉酶進行糖化，該組是以下各項：源自曲霉屬菌株的葡糖淀粉酶，優(yōu)選地黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉；或木霉屬的菌株，優(yōu)選里氏木霉；或籃狀菌屬的菌株，優(yōu)選埃默森籃狀菌；或密孔菌屬的菌株；或粘褶菌屬的菌株，例如籬邊粘褶菌或密粘褶菌，或黑層孔屬的菌株；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。85.如段落1-84所述的方法，包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料；-一種α-淀粉酶，優(yōu)選地源自嗜熱脂肪芽孢桿菌，其具有在位置i181+g182處的雙缺失，和任選地取代n193f，并且在ph4.5、85℃、0.12mmcacl2下具有至少10的t1/2(min)；-在0.5和10微克之間的強烈火球菌蛋白酶/gds；-任選地一種支鏈淀粉酶；-一種草酸青霉菌葡糖淀粉酶；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。86.如段落1-85所述的方法，包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料；-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，其具有雙缺失i181+g182、以任選的取代n193f；以及任選地以下取代集合中的另一種：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)；-在0.5和10微克之間的強烈火球菌蛋白酶/gds；以及-任選地一種支鏈淀粉酶；-一種如在seqidno:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有選自下組的取代：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(使用seqidno:14進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。87.如段落1-86所述的方法，包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，其具有雙缺失i181+g182、以任選的取代n193f；以及另外地以下取代集合中的一種：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)。-一種蛋白酶，該蛋白酶具有確定為在80℃/70℃下的相對活性的、超過20％的熱穩(wěn)定性值，優(yōu)選來源于強烈火球菌和/或金黃色嗜熱子囊菌；以及-任選地一種支鏈淀粉酶；-一種如在seqidno:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有選自下組的取代：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(使用seqidno:14進行編號)；ii)使用選自下組的葡糖淀粉酶進行糖化，該組是以下各項：源自曲霉屬菌株的葡糖淀粉酶；或木霉屬菌株；籃狀菌屬菌株、密孔菌屬菌株；粘褶菌屬菌株；以及黑層孔屬菌株；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。88.根據(jù)段落1-87中任一項所述的方法，包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下，在5.0和6.5之間的ph下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，其具有雙缺失i181+g182、以任選的取代n193f；以及任選地以下取代集合中的另一種：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)；-一種來源于強烈火球菌的蛋白酶，優(yōu)選在此的seqidno:13中所示的蛋白酶；-一種如在seqidno:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有選自下組的取代：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(使用seqidno:14進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。89.如段落1-88中任一項所述的方法，其中在糖化、發(fā)酵或同時同時糖化發(fā)酵(ssf)中存在纖維分解組合物。90.如段落1-89中任一項所述的方法，其中該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)，因為與ethanolredtm相比，在相同方法條件下，它提供了乙醇產(chǎn)量的增加。91.如段落1-90中任一項所述的方法，其中該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)，因為與ethanolredtm(er)相比，在同時糖化發(fā)酵(ssf)中沒有尿素存在和/或添加的相同條件下，它提供了乙醇產(chǎn)量的增加。92.如段落1-91中任一項所述的方法，其中該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)，因為與ethanolredtm相比，在相同方法條件下，它產(chǎn)生了降低水平的乳酸。93.如段落1-92中任一項所述的方法，其中該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)，因為與ethanolredtm相比，在相同方法條件下，它產(chǎn)生了降低水平的甘油。94.如段落1-93中任一項所述的方法，其中該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)，因為與ethanolredtm相比，在相同方法條件下，它具有較快發(fā)酵動力學。95.如段落1-94中任一項所述的方法，其中該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)，因為與ethanolredtm相比，在相同方法條件下，它減少了發(fā)酵中的乙醛水平。96.如段落1-95中任一項所述的方法，其中該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)，因為與ethanolredtm相比，在相同方法條件下，它增加了油回收水平。97.如段落1-96中任一項所述的方法，其中該具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株具有以下性質(zhì)和定義特性中的一種或多種，如所有：-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，增加乙醇產(chǎn)量；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，產(chǎn)生降低水平的乳酸；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，產(chǎn)生降低水平的甘油；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，降低了發(fā)酵中乙醛水平；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，增加油回收水平；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，具有更快的發(fā)酵動力學。98.如段落1-97中任一項所述的方法，其中該發(fā)酵生物是一種非重組酵母菌屬菌株，優(yōu)選地非重組釀酒酵母菌株。99.如段落1-98中任一項所述的方法，其中該發(fā)酵生物是一種非重組酵母菌屬菌株，優(yōu)選地是使用美國專利號8,257,959-bb中所描述和涉及的方法產(chǎn)生的非重組釀酒酵母菌株。100.如段落1-99中任一項所述的方法，其中當使用實例19中所使用的方法設(shè)置和條件確定時，該具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)的發(fā)酵生物菌株，在0ppm尿素下和在3μgep/gds的pfu劑量下提供了超過ethanolredtm(er)的大于1.0％的乙醇產(chǎn)量提升，如在0ppm尿素下和在1.5μgep/gds的蛋白酶pfu劑量下大于1.5％，如在0ppm尿素下和在0.0385μgep/gds的蛋白酶pfu劑量下大于4.0％。101.如段落1-100中任一項所述的方法，其中當使用實例21中所使用的方法設(shè)置和條件來確定時，具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)發(fā)酵生物菌株，在300ppm的尿素水平下提供超過ethanolredtm(er)大于1.0％的乙醇產(chǎn)量提升，如在150ppm的尿素水平下大于3.0％，如在0ppm的尿素水平下大于10.0％。102.如段落1-101中任一項所述的方法，其中當使用實例23中所使用的方法設(shè)置和條件來確定時，具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)發(fā)酵生物菌株，在0ppm的尿素水平下并且在0.0385μg/gds的蛋白酶pfu劑量下提供了超過ethanolredtm(er)的大于50％的54小時發(fā)酵中的乳酸減少，如在0ppm的尿素水平下并且在3μg/gds的pfu劑量下大于50％。103.如段落1-102中任一項所述的方法，其中當使用實例34中所使用的方法設(shè)置和條件來確定時，具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)發(fā)酵生物菌株，提供超過ethanolredtm(er)大于2.0％的60小時發(fā)酵中甘油水平的降低，如大于3.0％、如大于4.0％。104.如段落1-103中任一項所述的方法，其中當使用實例39中所使用的方法設(shè)置和條件來確定時，具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)發(fā)酵生物菌株，提供超過ethanolredtm(er)大于30％的54小時發(fā)酵中乙醛水平的降低，如大于40％、如大于50％。105.一種用于從含淀粉材料生產(chǎn)乙醇的方法，該方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶液化該含淀粉材料；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物具有以下性質(zhì)和定義特性中的一種或多種，如所有：-在相同方法條件下，與ethanolredtm(er)相比，增加乙醇產(chǎn)量；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，產(chǎn)生降低水平的乳酸；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，產(chǎn)生降低水平的甘油；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，降低了發(fā)酵中乙醛水平；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，增加油回收水平；-在相同方法條件下，與ethanolredtm相比，具有更快的發(fā)酵動力學。106.如段落103所述的方法，其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母。107.如段落105或106所述的方法，其中該發(fā)酵生物是非重組釀酒酵母。108.如段落1-107中任一項所述的方法，包括以下步驟：i)在80℃-90℃之間的溫度下，在5.0和6.5之間的ph下，使用以下項液化該含淀粉材料：-源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的一種α-淀粉酶，其具有雙缺失i181+g182、以任選的取代n193f；以及任選地以下取代集合中的另一種：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用在此的seqidno:1進行編號)。-源自強烈火球菌的蛋白酶，優(yōu)選地在此的seqidno:13中所示的蛋白酶，其以1-5微克蛋白酶/克ds(如約1.5或3微克蛋白酶/克ds)的劑量存在和/或添加；-一種如在seqidno:14中所示的草酸青霉菌葡糖淀粉酶，具有選自下組的取代：-k79v；-k79v+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f；或-k79v+p11f+d26c+k33c+t65a+q327f；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t；或-k79v+p2n+p4s+p11f+t65a+q327f+e501v+y504t；或-k79v+p11f+t65a+q327w+e501v+y504t(使用seqidno:14進行編號)；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵；其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種菌株，該菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。109.如段落105-108中任一項所述的方法，其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或一種發(fā)酵生物菌株，該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。110.一種從發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)過程中回收油的方法，該方法包括以下步驟：i)在高于初始糊化溫度的溫度下，使用α-淀粉酶液化該含淀粉材料；ii)使用葡糖淀粉酶進行糖化；iii使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵。iv)回收該發(fā)酵產(chǎn)物以形成全酒糟；v)將該全酒糟分離為酒糟水和濕餅；vi)任選地將該酒糟水濃縮為漿料；其中油是從發(fā)酵步驟iii)下游回收/提取并且其中該發(fā)酵生物是釀酒酵母mbg4851(在澳大利亞維多利亞州國家計量研究所登錄號v14/004037下保藏)或發(fā)酵生物菌株，該發(fā)酵生物菌株具有與釀酒酵母mbg4851或具有菌株v14/004037的定義特性的酵母菌屬菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)。111.如段落110所述的方法，其中在糖化和/或發(fā)酵或同時糖化發(fā)酵(ssf)中存在或添加蛋白酶。112.一種在布達佩斯條約下保藏的并且具有nmi登錄號v14/004037的酵母菌屬酵母菌株(釀酒酵母mbg4851)或一種具有與釀酒酵母mbg4851或菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)的菌株，其表現(xiàn)出一種或多種，如所有，菌株v14/004037的定義特性。113.如段落112所述的菌株，其中該菌株是菌株v14/004037(mbg4851)。114.一種生產(chǎn)表現(xiàn)出菌株v14/004037的定義特性的菌株v14/004037衍生物的方法，該方法包括：(a)提供：(i)第一酵母菌株；并且(ii)第二酵母菌株，其中該第二酵母菌株是菌株v14/004037或菌株v14/004037的衍生物；(b)在允許組合第一和第二酵母菌株之間的dna的條件下，培養(yǎng)該第一酵母菌株和該第二酵母菌株；(c)篩選或選擇菌株v14/004037的衍生物。115.如段落114所述的方法，其中步驟(c)包括篩選或選擇表現(xiàn)出菌株v14/004037的一種或多種定義特性的一種雜合菌株。116.如段落114所述的方法，該方法包括進一步步驟：(d)用從步驟(c)篩選或選擇的菌株作為該第一和/或第二菌株重復步驟(b)和(c)，直到獲得顯示出菌株v14/004037的定義特性的衍生物。117.如段落114或115所述的方法，其中該培養(yǎng)步驟(b)包括：(i)使該第一酵母菌株和該第二酵母菌株形成孢子；(ii)將該第一酵母菌株產(chǎn)生的萌發(fā)的孢子與該第二酵母菌株產(chǎn)生的萌發(fā)的孢子進行雜交。118.一種通過如段落114所述的方法產(chǎn)生的酵母菌屬菌株。119.一種生產(chǎn)乙醇的方法，該方法包括用包括可發(fā)酵糖的底物在允許可發(fā)酵糖發(fā)酵生成乙醇的條件下孵育如段落112或118所述的菌株。120.如段落112或118所述的菌株在乙醇生產(chǎn)中的用途。121.一種生產(chǎn)蒸餾酒糟的方法，該方法包括：(a)用包括可發(fā)酵糖的底物在允許可發(fā)酵糖發(fā)酵生成乙醇和蒸餾酒糟的條件下，孵育如段落112或118所述的酵母菌屬菌株；(b)分離該蒸餾酒糟。122.通過如段落121所述的方法產(chǎn)生的蒸餾酒糟。123.如段落112或118所述的菌株在蒸餾酒糟生產(chǎn)中的用途。124.菌株v14/004037(釀酒酵母mbg4851)在生產(chǎn)具有與釀酒酵母mbg4851大致一樣的性質(zhì)或表現(xiàn)出菌株v14/004037的一種或多種定義特性的酵母菌屬菌株中的用途。125.菌株v14/004037(釀酒酵母mbg4851)或一種具有與釀酒酵母mbg4851或菌株v14/004037的衍生物大致一樣的性質(zhì)的菌株在根據(jù)段落1-111中任一項所述的方法中的用途。126.菌株v14/004037(釀酒酵母mbg4851)或菌株v14/004037的衍生物在相同的方法條件下，與ethanolredtm相比，用于減少發(fā)酵中乙醛水平的用途。127.根據(jù)段落126所述的用途，其中發(fā)酵中的醪液已經(jīng)經(jīng)受了α-淀粉酶和從0.5-50微克蛋白酶/克ds，如1-5微克蛋白酶/克ds、如約1.5或3微克蛋白酶/克ds。128.根據(jù)段落127所述的用途，其中該蛋白酶是一種細菌蛋白酶。129.根據(jù)段落127-128所述的用途，其中該蛋白酶源自細菌火球菌屬菌株，如強烈火球菌菌株(pfu蛋白酶)，如或在此seqidno:13。130.根據(jù)段落129所述的用途，其中該蛋白酶是在此的seqidno:13中所披露的蛋白酶或是與在此的seqidno:13具有至少80％一致性，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％一致性的一種蛋白酶。131.根據(jù)段落125-128所述的用途，其中該α-淀粉酶是細菌來源的，如來自芽胞桿菌屬，例如嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的一種變體，例如在此的seqidno:1中所示的α-淀粉酶。132.根據(jù)段落130所述的用途，其中該嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體選自具有以下突變的下組：-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-i181*+g182*+n193f+v59a+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；以及-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用seqidno:1進行編號)。133.根據(jù)段落125-132中任一項所述的用途，其中待發(fā)酵的醪液已經(jīng)經(jīng)受了α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和從0.5-50微克蛋白酶/克ds，如1-5微克蛋白酶/克ds、如約1.5或3微克蛋白酶/克ds。134.根據(jù)段落133所述的用途，其中該葡糖淀粉酶源自青霉屬菌株，尤其是在此的seqidno:9或14中所披露的草酸青霉菌菌株。135.根據(jù)段落134所述的用途，其中該葡糖淀粉酶是具有k79v取代的草酸青霉菌葡糖淀粉酶變體(使用seqidno:14中所示的成熟序列進行編號)。136.根據(jù)段落135所述的用途，其中該草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有k79v取代(使用seqidno:14進行編號)，并且進一步具有以下之一：-p11f+t65a+q327f；-p2n+p4s+p11f+t65a+q327f(使用seqidno:14進行編號)。137.菌株v14/004037(釀酒酵母mbg4851)或菌株v14/004037的衍生物在相同的方法條件下，與ethanolredtm相比，在乙醇生產(chǎn)方法中用于增加油回收/提取的用途。138.一種組合物，包括如段落112或118中任一項所述的酵母菌屬酵母菌株和一種或多種天然發(fā)生的和/或非天然發(fā)生的組分。139.如段落138所述的組合物，其中該組分選自下組，該組由以下各項組成：表面活性劑、乳化劑、樹膠、溶脹劑、和抗氧化劑。140.如段落138-139所述的組合物，其中該酵母菌屬酵母菌株是酵母菌屬mbg4851。141.如段落138-140所述的組合物，其中該酵母菌屬酵母菌株是處于活力形式，具體地處于干燥、膏狀或壓縮形式。當前第1頁12