本申請(qǐng)要求2014年3月21日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)第61/968,437號(hào)的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益。上述申請(qǐng)的內(nèi)容據(jù)此通過引用整體并入。

背景

由于能夠同時(shí)靶向多個(gè)抗原，雙特異性抗原結(jié)合多肽(如抗體和抗體樣分子)為治療學(xué)帶來巨大希望。然而，制備這些分子是一種挑戰(zhàn)。就雙特異性抗體而言，重鏈和輕鏈的錯(cuò)配在產(chǎn)生期間經(jīng)常發(fā)生，這降低雙特異性抗體的產(chǎn)量并且使純化具有挑戰(zhàn)性。

為了克服與雙特異性抗體的制備相關(guān)的問題，已經(jīng)嘗試了抗體恒定區(qū)或可變區(qū)的復(fù)雜的工程化。例如，已經(jīng)生成這樣的雙特異性抗體，其中各個(gè)抗體的VH和VL經(jīng)由連接物在基因上融合(參見例如，US2010/0254989A1)。在另一方法中，制備的各個(gè)抗體在負(fù)責(zé)Fab交換的人IgG4的殘基的Fc中的突變(參見例如，Van der Neut等,Science(2007)317:1554)。在另一方法中，采用小鼠四元雜交瘤(quadromas)生成雙特異性抗體。在該方法中，小鼠和大鼠抗體主要形成最初的VH/VL配對(duì)，并且雙特異性抗體由大鼠和小鼠Fc組成(參見例如，Lindhofer等,J Immunol.(1995)155:1246–1252)。最后，已經(jīng)生成了使用不會(huì)促成抗原結(jié)合的單個(gè)常見輕鏈的雙特異性抗體(參見例如，Merchant等,Nature Biotechnology(1998)16:677–681)。然而，盡管在抗體工程方面做出了大量努力，雙特異性抗體仍然遭受差的穩(wěn)定性和低的功能性表達(dá)產(chǎn)量。

因此，本領(lǐng)域需要高度表達(dá)并且容易純化的新型抗原結(jié)合多肽。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供雙特異性抗原結(jié)合多肽，其是高度表達(dá)的、容易純化的、高度穩(wěn)定的以及對(duì)它們的靶抗原具有高親和力。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗原結(jié)合多肽以高親和力結(jié)合PDGFRβ和HER2兩者，并且拮抗PDGFRβ和HER2兩者的活性。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗原結(jié)合多肽以高親和力結(jié)合PDGFRβ和VEGF兩者，并且拮抗PDGFRβ和VEGF兩者的活性。本發(fā)明還提供特異性結(jié)合HER2并且拮抗HER2激活的新型抗原結(jié)合多肽(例如，VH結(jié)構(gòu)域)。此類抗原結(jié)合多肽尤其可用于治療癌癥。本發(fā)明還提供編碼抗原結(jié)合多肽的核酸，用于制備此類抗原結(jié)合多肽的重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涵蓋使用本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽治療疾病(例如，癌癥)的方法。

因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供分離的雙特異性抗原結(jié)合多肽，其包含抗體重鏈，所述抗體重鏈包含第一VH結(jié)構(gòu)域并在其C-末端連接第二VH結(jié)構(gòu)域，所述第一VH結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合第一抗原，所述第二VH結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合第二抗原，其中所述多肽不含抗體輕鏈。

在某些實(shí)施方案中，抗體重鏈通過氨基酸連接物與第二VH結(jié)構(gòu)域基因連接。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，連接物包含SEQ ID No:23所示的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽還包含抗體輕鏈，所述輕鏈包含特異性結(jié)合抗原的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述重鏈和所述輕鏈天然配對(duì)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，VL結(jié)構(gòu)域結(jié)合第一抗原。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，VL結(jié)構(gòu)域結(jié)合第三抗原。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，第一抗原和第三抗原在同一分子的不同區(qū)域中。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，第一抗原和第三抗原在不同分子上。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗原結(jié)合多肽，其包含本文公開的兩個(gè)抗原結(jié)合多肽的二聚體，所述兩個(gè)抗原結(jié)合多肽通過重鏈恒定區(qū)天然二聚化。

在某些實(shí)施方案中，第一抗原和第二抗原是不同的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，第一抗原和第二抗原在同一分子的不同區(qū)域中。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，第一抗原和第二抗原在不同分子上。

在某些實(shí)施方案中，第一抗原是人PDGFRβ或HER2。在某些實(shí)施方案中，第二抗原是人PDGFRβ或HER2。

在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含VH結(jié)構(gòu)域，所述VH結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合人HER2并且包含含有選自SEQ ID NO:1、4、7和10的氨基酸序列的HCDR3。在某些實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域還包含含有選自SEQ ID NO:2、5、8或11的氨基酸序列的HCDR2。在某些實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域還包含含有選自SEQ ID NO:3、6、9或12的氨基酸序列的HCDR1。在某些實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與選自SEQ ID NO:13、14、15和16的VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列共有至少80％的氨基酸序列同一性。在某些實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域包含選自SEQ ID NO:13、14、15和16的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含VH結(jié)構(gòu)域，所述VH結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合人PDGFRβ并且包含含有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的HCDR3。在某些實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域還包含含有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的HCDR2。在某些實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域還包含含有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的HCDR1。在某些實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含含有SEQ ID NO:18或20所示的氨基酸序列的重鏈。

在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含VL結(jié)構(gòu)域，所述VL結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合人PDGFRβ并且包含含有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的LCDR3。在某些實(shí)施方案中，VL結(jié)構(gòu)域還包含含有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的LCDR2。在某些實(shí)施方案中，VL結(jié)構(gòu)域還包含含有SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的LCDR1。在某些實(shí)施方案中，VL結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含含有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的抗體輕鏈。

在另一方面，本發(fā)明提供特異性結(jié)合HER2的分離的抗原結(jié)合多肽，其包含含有選自SEQ ID NO:1、4、7和10的氨基酸序列的CDR3。

在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含VH結(jié)構(gòu)域，所述VH結(jié)構(gòu)域包含含有選自SEQ ID NO:1、4、7和10的氨基酸序列的CDR3。在某些實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域還包含含有選自SEQ ID NO:2、5、8或11的氨基酸序列的CDR2。在某些實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域還包含含有選自SEQ ID NO:3、6、9或12的氨基酸序列的CDR1。在某些實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域包含與選自SEQ ID NO:13、14、15和16的氨基酸序列共有至少80％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域包含選自SEQ ID NO:13、14、15和16的氨基酸序列。

在另一方面，本發(fā)明提供抗原結(jié)合多肽，其與具有選自SEQ ID NO:13、14、15和16的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域結(jié)合HER2上的同一表位。在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含VH結(jié)構(gòu)域。

在另一方面，本發(fā)明提供抗原結(jié)合多肽，其與具有選自SEQ ID NO:13、14、15和16的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域競爭結(jié)合HER2。在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含VH結(jié)構(gòu)域。

在其它方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽的分離的核酸。

在其它方面，本發(fā)明提供重組表達(dá)載體，其包含編碼本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽的分離的核酸。

在其它方面，本發(fā)明提供表達(dá)本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽的宿主細(xì)胞。

在其它方面，本發(fā)明提供制備本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽的方法，其包括在使得宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗原結(jié)合多肽的條件下培養(yǎng)能夠表達(dá)本發(fā)明的結(jié)合多肽的宿主細(xì)胞。

在其它方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽和一種或多種藥學(xué)可接受的載體。

在其它方面，本發(fā)明提供用于治療疾病或病癥的方法，所述方法包括向有需要的對(duì)象施用本發(fā)明的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，所述疾病或病癥是癌癥(例如，乳腺癌和卵巢癌)。

附圖簡述

圖1是本發(fā)明的示例性雙特異性抗原結(jié)合多肽的圖示。

圖2是本發(fā)明的示例性雙特異性抗原結(jié)合多肽的圖示。

圖3是本發(fā)明的示例性雙特異性抗原結(jié)合多肽的圖示。

圖4是本發(fā)明的示例性雙特異性抗原結(jié)合多肽的圖示。

圖5顯示在還原和非還原條件下本發(fā)明的示例性雙特異性抗原結(jié)合多肽的SDS-PAGE凝膠。

圖6顯示檢測HEK293細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HER2/PDGFRβ雙特異性抗原結(jié)合多肽的表達(dá)的ELISA分析的結(jié)果。

圖7顯示測量HER2/PDGFRβ雙特異性抗原結(jié)合多肽同時(shí)結(jié)合HER2和PDGFRβ的ELISA分析的結(jié)果。

圖8顯示測量HER2/PDGFRβ雙特異性抗原結(jié)合多肽同時(shí)結(jié)合細(xì)胞表面表達(dá)的HER2和PDGFRβ的基于FACS的結(jié)合分析的結(jié)果。

圖9顯示本文公開的示例性抗-HER2VH結(jié)構(gòu)域的Biacore和FACS分析的結(jié)果。

圖10顯示本文公開的示例性抗-HER2VH結(jié)構(gòu)域和scFv衍生物的Biacore和FACS分析的結(jié)果。

圖11顯示測量抗-HER2VH B12、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗以及它們的組合對(duì)SK-BR-3細(xì)胞增殖的影響的MTS細(xì)胞增殖分析的結(jié)果。

圖12是本發(fā)明的示例性抗-HER2雙特異性抗原結(jié)合多肽的圖示。

詳述

本發(fā)明提供雙特異性抗原結(jié)合多肽，其是高度表達(dá)的、容易純化的、高度穩(wěn)定的以及對(duì)它們的靶抗原具有高親和力。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗原結(jié)合多肽以高親和力結(jié)合PDGFRβ和HER2兩者并且拮抗PDGFRβ和HER2兩者的活性。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗原結(jié)合多肽以高親和力結(jié)合PDGFRβ和VEGF兩者并且拮抗PDGFRβ和VEGF兩者的活性。本發(fā)明還提供特異性結(jié)合HER2并且拮抗HER2激活的新型抗原結(jié)合多肽(例如，VH結(jié)構(gòu)域)。此類抗原結(jié)合多肽尤其可用于治療癌癥。本發(fā)明還提供編碼抗原結(jié)合多肽的核酸，用于制備此類抗原結(jié)合多肽的重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涵蓋使用本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽治療疾病(例如，癌癥)的方法。

I.定義

為了可以更容易地理解本發(fā)明，首先定義了某些術(shù)語。

如本文所用，術(shù)語“PDGFRβ”是指血小板衍生的生長因子受體β。PDGFRβ的核苷酸和多肽序列是本領(lǐng)域熟知的。示例性人PDGFRβ的氨基酸序列示于GenBank保藏號(hào)GI:4505683，以及示例性小鼠PDGFRβ的氨基酸序列示于GenBank保藏號(hào)GI:226371752。

如本文所用，術(shù)語“HER2”是指受體酪氨酸蛋白激酶erbB-2。HER2的核苷酸和多肽序列是本領(lǐng)域熟知的。示例性人HER2的氨基酸序列示于GenBank保藏號(hào)GI:54792096，以及示例性小鼠HER2的氨基酸序列示于GenBank保藏號(hào)GI:54873610。

如本文所用，術(shù)語“VEGF”是指血管內(nèi)皮生長因子家族的所有成員，其包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF、它們的蛋白和剪接變體，其包括VEGF₁₂₁、VEGF₁₂₁b、VEGF₁₄₅、VEGF₁₆₅、VEGF₁₆₅b、VEGF₁₈₉和VEGF₂₀₆。VEGF的核苷酸和多肽序列是本領(lǐng)域熟知的。示例性人VEGF的氨基酸序列示于GenBank保藏號(hào)GI:32699990，以及示例性小鼠VEGF的氨基酸序列示于GenBank保藏號(hào)GI:GI:160358815。

如本文所用，術(shù)語“雙特異性抗原結(jié)合多肽”是指能夠同時(shí)特異性結(jié)合兩種或更多種不同抗原的抗原結(jié)合多肽。

如本文所用，術(shù)語“抗原”是指抗原結(jié)合多肽識(shí)別的結(jié)合位點(diǎn)或表位。

如本文所用，術(shù)語“抗體”是指免疫球蛋白分子，其包含四條多肽鏈(通過二硫鍵互相連接的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈)以及它們的多聚體(例如，IgM)。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域(CL1)。VH和VL區(qū)可以被進(jìn)一步細(xì)分為被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，其間穿插有較保守的被稱為框架區(qū)(FR)的區(qū)域。

如本文所用，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”包括特異性結(jié)合抗原以形成復(fù)合物的任何天然存在的、可酶促獲得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白?？贵w的抗原結(jié)合片段可以使用任何合適的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如蛋白水解性消化或涉及編碼抗體可變結(jié)構(gòu)域以及任選地恒定結(jié)構(gòu)域的DNA的操作和表達(dá)的重組基因工程技術(shù)從例如完整的抗體分子得到?？乖Y(jié)合部分的非限制性實(shí)例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')₂片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模擬抗體的高變區(qū)的氨基酸殘基(例如，分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))組成的最小識(shí)別單位。其它工程化分子，如雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體和微抗體也涵蓋在表述“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。

如本文所用，術(shù)語“VH結(jié)構(gòu)域”和“VL結(jié)構(gòu)域”分別指單個(gè)抗體的可變重鏈結(jié)構(gòu)域和可變輕鏈結(jié)構(gòu)域，其包含F(xiàn)R(框架區(qū))1、2、3和4以及CDR(互補(bǔ)決定區(qū))1、2和3(參見Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest.(NIH公開號(hào)91-3242,Bethesda)。

如本文所用，術(shù)語“天然二聚化”是指抗原結(jié)合多肽的二聚體，其中重鏈恒定區(qū)以與天然存在的四聚體抗體分子相同的方式締合。

如本文所用，術(shù)語“天然配對(duì)”是指以與天然存在的四聚體抗體分子相同的方式通過天然重鏈/輕鏈相互作用界面締合的抗體重鏈和輕鏈配對(duì)。

如本文所用，術(shù)語“CDR”或“互補(bǔ)決定區(qū)”意指重鏈和輕鏈多肽的可變區(qū)內(nèi)存在的非連續(xù)抗原結(jié)合位點(diǎn)。這些特定區(qū)域已經(jīng)由Kabat等,J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977).Kabat等,Sequences of protein of immunological interest.(1991),Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)以及MacCallum等,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)(其各自通過引用整體并入本文)描述，其中當(dāng)彼此比較時(shí)，定義包括氨基酸殘基的重疊或子集。為了比較，示出了氨基酸殘基，其涵蓋如以上引用的每個(gè)參考文獻(xiàn)所定義的CDR。優(yōu)選地，基于序列比較，術(shù)語“CDR”是Kabat定義的CDR。

如本文所用，術(shù)語“框架(FR)氨基酸殘基”是指在免疫球蛋白鏈的框架區(qū)中的那些氨基酸。本文使用的術(shù)語“框架區(qū)”或“FR區(qū)”包括是可變區(qū)的一部分，但不是CDR(例如，使用Kabat定義的CDR)的一部分的氨基酸殘基。

如本文所用，術(shù)語“基因連接”是指使用重組DNA技術(shù)連接兩個(gè)或更多個(gè)多肽。在某些實(shí)施方案中，這涉及編碼兩個(gè)或更多個(gè)多肽的融合物的嵌合基因的產(chǎn)生。

如本文所用，術(shù)語“特異性結(jié)合”是指結(jié)合多肽以至少約1×10^-6M、1×10^-7M、1×10^-8M、1×10^-9M、1×10^-10M、1×10^-11M、1×10^-12M或更多的Kd結(jié)合抗原的能力，和/或結(jié)合多肽以比對(duì)非特異性抗原的親和力大至少兩倍的親和力結(jié)合抗原的能力。然而，應(yīng)理解，結(jié)合多肽能夠特異性結(jié)合兩種或更多種序列相關(guān)的抗原。例如，本發(fā)明的結(jié)合多肽能夠特異性結(jié)合人抗原和該抗原的非人直系同源物。

如本文所用，術(shù)語“載體”意指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)其已經(jīng)連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！?，其是指其中可以連接額外DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA區(qū)段可以被連接至病毒基因組中。某些載體能夠在其被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自我復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體以及附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如，非附加型哺乳動(dòng)物載體)可以在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合至宿主細(xì)胞的基因組中，由此隨宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠引導(dǎo)與其可操作連接的基因表達(dá)。此類載體在本文被稱為“重組表達(dá)載體”(或簡稱為“表達(dá)載體”)。通常，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體通常呈質(zhì)粒形式。術(shù)語“質(zhì)粒”和“載體”可以互換使用。然而，本發(fā)明意圖包括起等價(jià)功能的此類其它形式的表達(dá)載體，如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。

如本文所用，術(shù)語“宿主細(xì)胞”意指已經(jīng)導(dǎo)入重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)理解，該術(shù)語不僅意指特定的主體細(xì)胞，而且意指此類細(xì)胞的后代。因?yàn)樵诤罄m(xù)傳代中由于突變或環(huán)境影響而可能發(fā)生某些修飾，所以此類后代可能實(shí)際上并不等同于親代細(xì)胞，但仍被包括在本文所用術(shù)語“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。

如本文所用，術(shù)語“PDGFRβ-相關(guān)的疾病或病癥”包括與PDGFRβ活性相關(guān)的疾病狀態(tài)和/或癥狀。示例性PDGFRβ-相關(guān)的疾病或癥狀包括但不限于年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)和癌癥。

如本文所用，術(shù)語“HER2-相關(guān)的疾病或病癥”包括與HER2活性相關(guān)的疾病狀態(tài)和/或癥狀。示例性HER2-相關(guān)的疾病或病癥包括但不限于癌癥(例如，乳腺癌和卵巢癌)。

如本文所用，術(shù)語“VEGF-相關(guān)的疾病或病癥”包括與VEGF活性相關(guān)的疾病狀態(tài)和/或癥狀。示例性VEGF-相關(guān)的疾病或病癥包括但不限于與新血管形成相關(guān)的病況，例如，年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)和癌癥。

如本文所用，術(shù)語“治療(treat)”、“治療(treating)”和“治療(treatment)”是指本文所述的治療性或預(yù)防性措施?！爸委煛钡姆椒ú捎孟?qū)ο?，例如患有疾病或病癥(例如，癌癥)或者易患疾病或病癥的對(duì)象，施用本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分，以便預(yù)防、治療、延遲或降低疾病或病癥或者復(fù)發(fā)性疾病或病癥的一種或多種癥狀的嚴(yán)重性，或者減輕疾病或病癥或者復(fù)發(fā)性疾病或病癥的一種或多種癥狀，或者以便延長超過不存在此類治療下預(yù)期的對(duì)象的存活。

如本文所用，術(shù)語“有效量”是指當(dāng)施用于對(duì)象時(shí)，足以使疾病或病癥的治療、預(yù)后或診斷生效的結(jié)合多肽的量。治療有效量將根據(jù)以下變化：正治療的對(duì)象和疾病狀況、對(duì)象的體重和年齡、疾病狀況的嚴(yán)重性、施用方式等，所述治療有效量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。根據(jù)本發(fā)明，施用的劑量范圍可以為，例如，約1ng至約10,000mg、約1μg至約5,000mg、約1mg至約1,000mg或者約10mg至約100mg結(jié)合多肽?？梢哉{(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳治療反應(yīng)。有效量也是其中結(jié)合多肽的任何毒性作用或有害作用(即，副作用)最小化和/或被有益作用超過的量。

如本文所用，術(shù)語“對(duì)象”包括任何人或非人動(dòng)物。

II.抗-HER2抗原結(jié)合多肽

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供特異性結(jié)合HER2并且抑制HER2活性的抗原結(jié)合多肽(例如，雙特異性抗原結(jié)合多肽、抗體或其抗原結(jié)合片段)。此類結(jié)合多肽尤其可用于治療HER2-相關(guān)的疾病或病癥(例如，癌癥，如乳腺癌和卵巢癌)。

通常，本發(fā)明的抗-HER2抗原結(jié)合多肽包含特異性結(jié)合HER2的重鏈CDR3(HCDR3)氨基酸序列。適合用于本發(fā)明的結(jié)合多肽的非限制性HCDR3序列包括SEQ ID NO:1、4、7或10所示的HCDR3氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，HCDR3序列是SEQ ID NO:1、4、7或10的變體，其包含相對(duì)于SEQ ID NO:1、4、7或10的至少一個(gè)(例如，一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)等)保守性氨基酸取代。

能夠摻入本文公開的HER2-結(jié)合HCDR3序列的任何多肽可以被用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽，其包括但不限于抗體或其片段(例如，VH結(jié)構(gòu)域)和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。合適的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域包括但不限于纖連蛋白結(jié)構(gòu)域(參見，例如，Koide等(2007),Methods Mol.Biol.352:95–109，將其通過引用整體并入本文)、DARPin(參見，例如，Stumpp等(2008)Drug Discov.Today 13(15–16):695–701，將其通過引用整體并入本文)、蛋白A的Z結(jié)構(gòu)域(參見，Nygren等(2008)FEBS J.275(11):2668–76，將其通過引用整體并入本文)、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(Lipocalins)(參見，例如，Skerra等(2008)FEBS J.275(11):2677–83，將其通過引用整體并入本文)、人泛素(Affilins)(參見，例如，Ebersbach等(2007)J.Mol.Biol.372(1):172–85，將其通過引用整體并入本文)、Affitins(參見，例如，Krehenbrink等(2008).J.Mol.Biol.383(5):1058–68，將其通過引用整體并入本文)、Avimers(參見，例如，Silverman等(2005)Nat.Biotechnol.23(12):1556–61，將其通過引用整體并入本文)、Fynomers(參見，例如，Grabulovski等(2007)J Biol Chem 282(5):3196–3204，將其通過引用整體并入本文)和Kunitz結(jié)構(gòu)域肽(參見，例如，Nixon等(2006)Curr Opin Drug Discov Devel 9(2):261–8，將其通過引用整體并入本文)。

在某些實(shí)施方案中，抗-HER2抗原結(jié)合多肽包含抗體或含有VH結(jié)構(gòu)域的抗體片段。適用于本發(fā)明的示例性CDR和VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列示于此處的表1和2中。

表1.示例性抗-HER2VH結(jié)構(gòu)域的CDR氨基酸序列。

表2.示例性抗-HER2VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方案中，抗-HER2VH結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:1、4、7或10所示的HCDR3氨基酸序列，以及獨(dú)立地選自表1中所示的重鏈HCDR2或HCDR1氨基酸序列中任一個(gè)的HCDR2和/或HCDR1序列。

在某些實(shí)施方案中，抗-HER2抗原結(jié)合多肽包含分別選自SEQ ID NO:1、2和3；4、5和6；7、8和9；以及10、11和12的HCDR3、HCDR2和HCDR1氨基酸序列。

在某些實(shí)施方案中，抗-HER2抗原結(jié)合多肽包含SEQ ID NO:13、14、15或16所示的VH氨基酸序列中的至少一個(gè)。

在某些實(shí)施方案中，抗-HER2抗原結(jié)合多肽包含一個(gè)或多個(gè)選自SEQ ID NO:1-12的CDR氨基酸序列，其中一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)氨基酸序列包含至少一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸取代(例如，1、2、3、4或5個(gè)保守性氨基酸取代)。保守性氨基酸取代包括在一個(gè)類別中的氨基酸被同一類別的氨基酸取代，其中通過常見的物理化學(xué)氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)和自然中發(fā)現(xiàn)的同源蛋白中的高取代頻率(如通過例如標(biāo)準(zhǔn)Dayhoff頻率交換矩陣或BLOSUM矩陣測定的)定義類別。已經(jīng)被分類成六個(gè)一般類別的氨基酸側(cè)鏈并且包括：I類(Cys)；II類(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；III類(Asn、Asp、Gln、Glu)；IV類(His、Arg、Lys)；V類(Ile、Leu、Val、Met)；和VI類(Phe、Tyr、Trp)。例如，Asp取代另一III類殘基，如Asn、Gln或Glu是保守性取代。因此，預(yù)測的抗-PDGFRβ抗體中的非必需氨基酸殘基優(yōu)選被來自同一類別的另一氨基酸殘基替換。鑒定不會(huì)消除抗原結(jié)合的氨基酸保守性取代的方法是本領(lǐng)域熟知的(參見，例如，Brummell等,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；以及Burks等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，將其各自通過引用整體并入本文)。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗-HER2抗原結(jié)合多肽，其包含與SEQ ID NO:13、14、15或16所示的VH區(qū)氨基酸序列具有約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的VH和/或VL區(qū)氨基酸序列。

在某些實(shí)施方案中，抗-HER2抗原結(jié)合多肽以1.2nM的Kd結(jié)合HER2。在某些實(shí)施方案中，抗-HER2抗原結(jié)合多肽以1.39×10⁵M^-1s^-1的結(jié)合速率結(jié)合HER2。在某些實(shí)施方案中，抗-HER2抗原結(jié)合多肽以1.67×10⁴s^-1的解離速率結(jié)合HER2。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)呈scFv分子形式時(shí)，抗-HER2抗原結(jié)合多肽以0.87nM的Kd結(jié)合HER2。

在某些實(shí)施方案中，抗-HER2抗原結(jié)合多肽與曲妥珠單抗(CAS#180288-69-1)和/或帕妥珠單抗(CAS#380610-27-5)結(jié)合HER2上的不同表位。在某些實(shí)施方案中，抗-HER2抗原結(jié)合多肽與曲妥珠單抗和/或帕妥珠單抗結(jié)合HER2上的同一表位。在某些實(shí)施方案中，抗-HER2抗原結(jié)合多肽與曲妥珠單抗和/或帕妥珠單抗競爭結(jié)合HER2。

在某些實(shí)施方案中，本文公開的抗-HER2抗原結(jié)合多肽在結(jié)合HER2后內(nèi)化。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，內(nèi)化的抗-HER2抗原結(jié)合多肽與細(xì)胞毒性部分(例如，抗癌劑)連接。本文公開了合適的非限制性細(xì)胞毒性部分。

在另一方面，本發(fā)明提供抗-HER2抗原結(jié)合多肽，其與包含SEQ ID NO:13、14、15或16所示的VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的抗原結(jié)合多肽結(jié)合HER2上的同一表位和/或與其交叉競爭。可以使用常規(guī)的競爭結(jié)合分析鑒定此類抗體，所述競爭結(jié)合分析包括例如，基于表面等離子體共振(SPR)的競爭分析。

III.雙特異性抗原結(jié)合多肽

在另一方面，本發(fā)明提供特異性結(jié)合第一靶抗原和第二靶抗原的雙特異性抗原結(jié)合多肽。使用本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合多肽可以靶向任何兩種抗原。通常，本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合多肽包含抗體重鏈，所述重鏈包含特異性結(jié)合第一抗原的第一VH結(jié)構(gòu)域，其中所述重鏈與特異性結(jié)合第二抗原的第二VH結(jié)構(gòu)域連接。

可以使用本領(lǐng)域公認(rèn)的手段(化學(xué)的和/或基因的)，將抗體重鏈與第二VH結(jié)構(gòu)域連接。在某些實(shí)施方案中，抗體重鏈和第二VH結(jié)構(gòu)域是基因連接的。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體重鏈的C-末端氨基酸與第二VH結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸連接。該連接可以是直接的，或者通過連接物連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體重鏈通過包含SEQ ID No:23所示的序列的氨基酸連接物與第二VH結(jié)構(gòu)域的N-末端氨基酸連接。

在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗原結(jié)合多肽是兩條抗體重鏈的二聚體，每個(gè)抗體重鏈包含特異性結(jié)合第一抗原的第一VH結(jié)構(gòu)域，并且其中每個(gè)抗體重鏈與特異性結(jié)合第二抗原的第二VH結(jié)構(gòu)域連接。二聚體中的兩條抗體重鏈以與天然存在的四聚體抗體分子中存在的締合相同的方式通過天然重鏈二聚體界面締合。具有該結(jié)構(gòu)的示例性雙特異性抗原結(jié)合多肽描述在本文的圖2和圖3中。

在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗原結(jié)合多肽還包含抗體輕鏈。在某些實(shí)施方案中，輕鏈以與天然存在的四聚體抗體分子中存在的配對(duì)相同的方式通過天然輕鏈/重鏈二聚體界面與重鏈天然配對(duì)。具有該結(jié)構(gòu)的示例性雙特異性抗原結(jié)合多肽描述在本文的圖1和圖4中。

第一抗原和第二抗原可以是相同或不同的。如果抗原是不同的，它們可以在同一分子的不同區(qū)域中，或者在不同分子上。在某些實(shí)施方案中，第一抗原和第二抗原是細(xì)胞表面受體。在某些實(shí)施方案中，第一抗原是PDGFRβ或HER2(例如，人PDGFRβ或HER2)。在某些實(shí)施方案中，第二抗原是PDGFRβ或HER2(例如，人PDGFRβ或HER2)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，第一抗原是PDGFRβ，并且第二抗原是HER2。在另一具體實(shí)施方案中，第一抗原是HER2，并且第二抗原是PDGFRβ。

在某些實(shí)施方案中，一個(gè)抗原(第一抗原或第二抗原)是細(xì)胞表面受體，并且一個(gè)抗原(第一或第二)是配體(例如，生長抑制，如VEGF、PDGF或EGF)。在某些實(shí)施方案中，第一抗原是PDGFRβ或VEGF(例如，人PDGFRβ或VEGF)。在某些實(shí)施方案中，第二抗原是PDGFRβ或VEGF(例如，人PDGFRβ或VEGF)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，第一抗原是PDGFRβ，并且第二抗原是VEGF。在另一具體實(shí)施方案中，第一抗原是VEGF，并且第二抗原是PDGFRβ。此類雙特異性抗原結(jié)合多肽尤其可用于治療PDGFRβ-相關(guān)的病癥和VEGF-相關(guān)的病癥，如AMD和癌癥。

第一抗原和第三抗原可以在同一分子的不同區(qū)域中或在不同分子上。在某些實(shí)施方案中，輕鏈結(jié)合第一抗原，并且重鏈和輕鏈合作以產(chǎn)生第二抗原的單一結(jié)合位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，輕鏈結(jié)合第三抗原。應(yīng)注意，如果第一抗原、第二抗原和第三抗原是不同的，則這允許具有三個(gè)特異性的抗原結(jié)合多肽的產(chǎn)生。本發(fā)明也涵蓋此類分子。

可以將任何抗體重鏈、輕鏈、VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域或CDR氨基酸序列用于本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽中。示例性抗體重鏈、輕鏈、VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域和CDR氨基酸序列示于本文的表1-4中。

在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗原結(jié)合多肽包含本文公開的抗-PDGFRβVH結(jié)構(gòu)域(例如，如SEQ ID No:24所示)以及結(jié)合EGFR家族受體蛋白(例如，EGFR、HER2、HER3和/或HER4)的抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域?？梢垣@得VH和VL結(jié)構(gòu)域的合適的治療性抗體包括但不限于曲妥珠單抗(CAS#180288-69-1)、帕妥珠單抗(CAS#380610-27-5)和西妥昔單抗(CAS#205923-56-4)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，雙特異性抗原結(jié)合多肽呈圖4所示的形式。

在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗原結(jié)合多肽包含本文公開的抗-HER2VH結(jié)構(gòu)域(例如，SEQ ID NO:13-16所示的那些)以及結(jié)合EGFR家族成員(例如，EGFR、HER2、HER3和/或HER4)的抗體的VH和VL。可以獲得VH和VL結(jié)構(gòu)域的合適的治療性抗體包括但不限于曲妥珠單抗(CAS#180288-69-1)、帕妥珠單抗(CAS#380610-27-5)和西妥昔單抗(CAS#205923-56-4)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，雙特異性抗原結(jié)合多肽呈圖12所示的形式。

表3.示例性抗-PDGFRβVH和VL結(jié)構(gòu)域的CDR、VH和VL氨基酸序列。

表4.示例性雙特異性抗原結(jié)合多肽的重鏈和輕鏈氨基酸序列。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合多肽包含特異性結(jié)合人HER2的第一VH結(jié)構(gòu)域和/或第二VH結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，抗-HER2VH結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:1、4、7或10示出的HCDR3氨基酸序列，以及獨(dú)立地選自表1中所示的重鏈HCDR2或HCDR1氨基酸序列中任一個(gè)的HCDR2和/或HCDR1序列。在某些實(shí)施方案中，抗-HER2VH結(jié)構(gòu)域包含分別選自SEQ ID NO:1、2和3；4、5和6；7、8和9；以及10、11和12的HCDR3、HCDR2和HCDR1氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，抗-HER2VH結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:13、14、15或16所示的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合多肽包含特異性結(jié)合人PDGFRβ的第一VH結(jié)構(gòu)域和/或第二VH結(jié)構(gòu)域。可以將結(jié)合PDGFRβ的任何VH結(jié)構(gòu)域用于本發(fā)明的方法中。合適的VH結(jié)構(gòu)域包括2012年12月5日提交的美國申請(qǐng)第13/705,978號(hào)(將其通過引用整體并入本文)中所示的那些。在某些實(shí)施方案中，抗-PDGFRβVH結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:25所示的HCDR3氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，抗-PDGFRβVH結(jié)構(gòu)域包含分別在SEQ ID NO:25、26和27所示的HCDR3、HCDR2和HCDR1氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，抗-PDGFRβVH結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合多肽包含特異性結(jié)合人PDGFRβ的VL。可以將結(jié)合PDGFRβ的任何VL結(jié)構(gòu)域用于本發(fā)明的方法中。合適的VL結(jié)構(gòu)域包括2012年12月5日提交的美國申請(qǐng)第13/705,978號(hào)所示的那些。在某些實(shí)施方案中，抗-PDGFRβVH結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:25所示的HCDR3氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，抗-PDGFRβVL結(jié)構(gòu)域包含分別在SEQ ID NO:29、30和31所示的HCDR3、HCDR2和HCDR1氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，抗-PDGFRβVL結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合多肽包含SEQ ID NO:18或20所示的重鏈。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合多肽包含SEQ ID NO:22所示的抗體輕鏈。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合多肽包含含有至少一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸取代(例如，1、2、3、4或5個(gè)保守性氨基酸取代等)的CDR、VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域、重鏈或輕鏈中的一個(gè)或多個(gè)。保守性氨基酸取代包括在一個(gè)類別中的氨基酸被同一類別的氨基酸取代，其中通過常見的物理化學(xué)氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)和自然中發(fā)現(xiàn)的同源蛋白中的高取代頻率(如通過例如標(biāo)準(zhǔn)Dayhoff頻率交換矩陣或BLOSUM矩陣測定的)定義類別。已經(jīng)被分類成六個(gè)一般類別的氨基酸側(cè)鏈并且包括：I類(Cys)；II類(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；III類(Asn、Asp、Gln、Glu)；IV類(His、Arg、Lys)；V類(Ile、Leu、Val、Met)；和VI類(Phe、Tyr、Trp)。例如，Asp取代另一III類殘基，如Asn、Gln或Glu是保守性取代。因此，預(yù)測的抗-PDGFRβ抗體中的非必需氨基酸殘基優(yōu)選被來自同一類別的另一氨基酸殘基替換。鑒定不會(huì)消除抗原結(jié)合的氨基酸保守性取代的方法是本領(lǐng)域熟知的(參見，例如，Brummell等,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；以及Burks等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，將其各自通過引用整體并入本文)。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供雙特異性抗原結(jié)合多肽，其包含與本文公開的CDR、VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域、重鏈或輕鏈氨基酸序列具有約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的CDR、VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域、重鏈或輕鏈氨基酸序列。

IV.修飾的抗原結(jié)合多肽

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽可以包含一個(gè)或多個(gè)修飾?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的任何技術(shù)制備本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽的修飾形式。

i)降低免疫原性

在某些實(shí)施方案中，利用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)對(duì)本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽(例如雙特異性抗原結(jié)合多肽、抗體或其抗原結(jié)合片段)進(jìn)行修飾，以降低它們的免疫原性。例如，可將抗體或其片段嵌合化、人源化和/或去免疫化。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段可以是嵌合的。嵌合抗體是抗體的不同部分來源于不同的動(dòng)物物種的抗體，如具有來源于鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。生產(chǎn)嵌合抗體或其片段的方法在本領(lǐng)域是已知的。參見，例如Morrison,Science229:1202(1985)；Oi等,BioTechniques 4:214(1986)；Gillies等,J.Immunol.Methods 125:191-202(1989)；美國專利第5,807,715號(hào)，第4,816,567號(hào)以及第4,816,397號(hào)，將其通過引用整體并入本文?？蓪樯a(chǎn)“嵌合抗體”所開發(fā)的技術(shù)(Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855(1984)；Neuberger等,Nature 312:604-608(1984)；Takeda等,Nature 314:452-454(1985))用于所述分子的合成。例如，可將編碼小鼠抗PDGFRβ抗體分子的結(jié)合特異性的基因序列與來自具有合適的生物活性的人抗體分子的序列融合在一起。如本文所使用的，嵌合抗體是不同部分來源于不同的動(dòng)物物種的分子，如具有來源于鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的那些抗體，例如人源化抗體。

在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分是人源化的。人源化抗體具有結(jié)合特異性，其包含來自非人抗體的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和來自人抗體分子的框架區(qū)。通常，將用CDR供體抗體的相應(yīng)殘基取代人框架區(qū)的框架殘基，從而改變以及優(yōu)選地提高抗原結(jié)合。通過本領(lǐng)域熟知的方法來確定這些框架取代，例如通過對(duì)CDR與框架殘基之間的相互作用進(jìn)行建模以確定對(duì)抗原結(jié)合而言重要的框架殘基，以及通過序列比較確定位于具體位置的不尋常的框架殘基。(參見，例如Queen等，美國專利第5,585,089號(hào)；Riechmann等,Nature 332:323(1988),將它們通過引用整體并入本文)。可以利用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)將抗體人源化，包括例如，CDR移植(EP 239,400；PCT公開WO 91/09967；美國專利第5,225,539號(hào)，第5,530,101號(hào)以及第5,585,089號(hào)，將它們通過引用整體并入本文)、鑲飾(veneering)或表面重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnicka等,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；Roguska等,PNAS91:969-973(1994)，將它們通過引用整體并入本文)以及鏈替換(美國專利第5,565,332號(hào)，將其通過引用整體并入本文)。

在一些實(shí)施方案中，可將去免疫用于降低PDGFRβ抗原結(jié)合多肽(例如抗體或其抗原結(jié)合部分)的免疫原性。本文使用的術(shù)語“去免疫”包括為修飾T細(xì)胞表位進(jìn)行的多肽(例如抗體或其抗原結(jié)合部分)改變(參見，例如WO9852976A1、WO0034317A2，將它們通過引用整體并入本文)。例如，可對(duì)來自本發(fā)明的起始PDGFRβ特異性抗體的VH和VL序列或其抗原結(jié)合部分進(jìn)行分析，以及可由各V區(qū)產(chǎn)生顯示與序列內(nèi)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以及其它關(guān)鍵殘基相關(guān)的表位的位置的人T細(xì)胞表位“圖譜”。對(duì)來自T細(xì)胞表位圖譜的各T細(xì)胞表位進(jìn)行分析，以確定具有低的改變最終抗體的活性的風(fēng)險(xiǎn)的可選氨基酸取代。設(shè)計(jì)包含氨基酸取代的組合的一系列可選VH和VL序列，并且隨后將這些序列并入一系列抗原結(jié)合多肽，以用于本文公開的診斷和治療方法，然后對(duì)其功能進(jìn)行測試。然后將包含修飾的V區(qū)和人C區(qū)的完整重鏈和輕鏈基因克隆進(jìn)表達(dá)載體，并將后續(xù)質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞系以產(chǎn)生全抗體。然后在合適的生物化學(xué)和生物分析中對(duì)抗體進(jìn)行比較，并確定最佳變體。

ii)效應(yīng)子功能和Fc修飾

本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽通常包含介導(dǎo)一種或多種效應(yīng)子功能的抗體恒定區(qū)(例如IgG恒定區(qū)，例如人IgG恒定區(qū)，例如人IgG1、2、3或4恒定區(qū))。例如，補(bǔ)體的C1組分與抗體恒定區(qū)的結(jié)合可以激活補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體的激活在調(diào)理作用(opsonisation)和細(xì)胞病原體的裂解中至關(guān)重要。補(bǔ)體的激活也刺激炎癥應(yīng)答，并且還可能參與自身免疫性過敏。此外，抗體經(jīng)Fc區(qū)與不同細(xì)胞上的受體結(jié)合，其中抗體Fc區(qū)上的Fc受體結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞上的Fc受體(FcR)結(jié)合。存在許多對(duì)不同類別的抗體具有特異性的Fc受體，所述抗體包括IgG(γ受體)、IgE(ε受體)、IgA(α受體)和IgM(μ受體)?？贵w與細(xì)胞表面上的Fc受體的結(jié)合引發(fā)了許多重要且不同的生物反應(yīng)，包括抗體包被顆粒的吞入與破壞、免疫復(fù)合物的清除、通過殺傷細(xì)胞的抗體包被的靶細(xì)胞的裂解(被稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用或ADCC)、炎癥介質(zhì)的釋放、胎盤轉(zhuǎn)移以及免疫球蛋白產(chǎn)生的控制。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽(例如抗體或其抗原結(jié)合片段)與Fc-γ受體結(jié)合。在可選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽可以包含缺乏一種或多種效應(yīng)子功能(例如ADCC活性)和/或不能與Fcγ受體結(jié)合的恒定區(qū)。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括這樣的抗原結(jié)合多肽：一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸被缺失或被以其它方式改變，以當(dāng)與具有近似相同的免疫原性的全、未改變的抗體相比時(shí)，提供期望的生物化學(xué)特性，如降低的或增強(qiáng)的效應(yīng)子功能、非共價(jià)二聚化的能力、增強(qiáng)的定位于腫瘤部位的能力、降低的血清半衰期或增加的血清半衰期。例如，用于本文所述的診斷和治療方法的某些抗體或其片段是結(jié)構(gòu)域缺失的抗體，其包含與免疫球蛋白重鏈類似的多肽鏈，但缺乏一個(gè)或多個(gè)重鏈結(jié)構(gòu)域的至少一部分。例如，在某些抗體中，可以缺失修飾的抗體的恒定區(qū)的一整個(gè)結(jié)構(gòu)域，例如可以缺失CH2結(jié)構(gòu)域的全部或部分。

在某些其它實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含來源于不同抗體同種型的恒定區(qū)(例如來自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的兩種或更多種的恒定區(qū))。在其它實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含嵌合鉸鏈(即包含來源于不同抗體同種型的鉸鏈結(jié)構(gòu)域的鉸鏈部分的鉸鏈，例如來自IgG4分子的上鉸鏈結(jié)構(gòu)域和IgG1中交聯(lián)結(jié)構(gòu)域)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含來自人IgG4分子的Fc區(qū)或其部分以及所述分子的核心鉸鏈區(qū)內(nèi)的Ser228Pro突變(EU編號(hào))。

在某些實(shí)施方案中，可利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)對(duì)Fc部分進(jìn)行突變，以增加或減少效應(yīng)子功能。例如，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的缺失或失活(通過點(diǎn)突變或其它方式)可以降低Fc受體與循環(huán)的修飾抗體的結(jié)合，從而增強(qiáng)腫瘤定位。在其它情況下，可能的是，與本發(fā)明一致的恒定區(qū)修飾減輕了補(bǔ)體結(jié)合，從而減少了血清半衰期以及綴合的細(xì)胞毒素的非特異性締合。但是可將恒定區(qū)的其它修飾用于修飾允許由于增加的抗原特異性或柔性而增強(qiáng)定位的二硫鍵或寡糖部分。利用熟知的免疫學(xué)技術(shù)可以容易地測量和定量修飾所產(chǎn)生的生理學(xué)特征、生物利用度和其它生物化學(xué)效應(yīng)，如腫瘤定位、生物分布和血清半衰期，而無需過度實(shí)驗(yàn)。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體中使用的Fc結(jié)構(gòu)域是Fc變體。本文使用的術(shù)語“Fc變體”指這樣的Fc結(jié)構(gòu)域：相對(duì)于所述Fc結(jié)構(gòu)域所來源的野生型Fc結(jié)構(gòu)域，其含有至少一個(gè)氨基酸取代。例如，其中Fc結(jié)構(gòu)域來源于人IgG1抗體，相對(duì)于所述Fc結(jié)構(gòu)域，所述人IgG1Fc結(jié)構(gòu)域的Fc變體包含至少一個(gè)氨基酸取代。

Fc變體的氨基酸取代可以位于Fc結(jié)構(gòu)域內(nèi)的任何位置(即任何EU約定的氨基酸位置)。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體包含位于鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分的氨基酸位置處的取代。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體包含位于CH2結(jié)構(gòu)域或其部分的氨基酸位置處的取代。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體包含位于CH3結(jié)構(gòu)域或其部分的氨基酸位置處的取代。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體包含位于CH4結(jié)構(gòu)域或其部分的氨基酸位置處的取代。

本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽可以使用已知賦予效應(yīng)子功能和/或FcR結(jié)合的改進(jìn)(例如降低或增強(qiáng))的任何本領(lǐng)域公認(rèn)的Fc變體。Fc變體可以包括，例如公開于下述的氨基酸取代的任何一種：國際PCT公開WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2和WO06/085967A2，或者美國專利第5,648,260號(hào)、第5,739,277號(hào)、第5,834,250號(hào)、第5,869,046號(hào)、第6,096,871號(hào)、第6,121,022號(hào)、第6,194,551號(hào)、第6,242,195號(hào)、第6,277,375號(hào)、第6,528,624號(hào)、第6,538,124號(hào)、第6,737,056號(hào)、第6,821,505號(hào)、第6,998,253號(hào)以及第7,083,784號(hào)，將其各自通過引用整體并入本文。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽可以包含含有在EU位置268處的氨基酸取代(例如H268D或H268E)的Fc變體。在另一示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽可以包含在EU位置239處的氨基酸取代(例如S239D或S239E)和/或在EU位置332處的氨基酸取代(例如I332D或I332Q)。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽可以包含含有氨基酸取代的Fc變體，所述氨基酸取代改變了抗體的抗原獨(dú)立的效應(yīng)子功能，特別是結(jié)合多肽的循環(huán)半衰期。當(dāng)與缺乏這些取代的抗原結(jié)合多肽相比時(shí)，此類抗原結(jié)合多肽顯示出增加的或降低的與FcRn的結(jié)合，因此分別具有增加的或降低的血清半衰期。對(duì)FcRn具有增加的親和力的Fc變體預(yù)期具有更長的血清半衰期，并且此類分子可應(yīng)用于期望施用的抗原結(jié)合多肽具有長半衰期的治療哺乳動(dòng)物的方法中，例如以治療慢性疾病或病癥。相反地，具有降低的FcRn結(jié)合親和力的Fc變體預(yù)期具有較短的半衰期，并且此類分子也可用于例如縮短循環(huán)時(shí)間可能有利的向哺乳動(dòng)物的施用，例如用于體內(nèi)診斷成像或者用于當(dāng)長時(shí)間存在于循環(huán)中時(shí)起始抗體具有毒副作用的情況。具有降低的FcRn結(jié)合親和力的Fc變體也不太可能穿過胎盤，因此也可用于孕婦的疾病或病癥的治療。此外，期望降低的FcRn結(jié)合親和力的其它應(yīng)用包括期望定位腦、腎和/或肝臟的那些應(yīng)用。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的改變的抗原結(jié)合多肽顯示出降低的由脈管系統(tǒng)穿過腎的腎小球上皮的運(yùn)輸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的改變的抗原結(jié)合多肽顯示出降低的由腦穿過血腦屏障(BBB)至脈管間隙的運(yùn)輸。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有改變的FcRn結(jié)合的抗體包含在Fc結(jié)構(gòu)域的“FcRn結(jié)合環(huán)”內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的Fc結(jié)構(gòu)域。FcRn結(jié)合環(huán)由氨基酸殘基280-299(根據(jù)EU編號(hào))組成。改變了FcRn結(jié)合活性的示例性的氨基酸取代公開于國際PCT公開第WO05/047327號(hào)中，將其通過引用并入本文。在某些示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽包含具有下述取代的一個(gè)或多個(gè)的Fc結(jié)構(gòu)域：V284E、H285E、N286D、K290E和S304D(EU編號(hào))。

在其它實(shí)施方案中，用于本文描述的診斷和治療方法的抗原結(jié)合多肽具有恒定區(qū)，例如IgG1重鏈恒定區(qū)，將其改變以降低或消除糖基化。例如，本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽還可以包含含有改變抗體Fc的糖基化的氨基酸取代的Fc變體。例如，所述Fc變體可以具有降低的糖基化(例如N-或O-連接的糖基化)。在示例性實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體包含通常見于氨基酸位置297(EU編號(hào))的N-連接的聚糖的降低的糖基化。在另一實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽具有鄰近糖基化基序或者在糖基化基序內(nèi)的氨基酸取代，例如含有氨基酸序列NXT或NXS的N-連接的糖基化基序。在具體實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含具有在氨基酸位置228或299(EU編號(hào))處的氨基酸取代的Fc變體。在更具體的實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含含有S228P和T299A突變(EU編號(hào))的IgG1或IgG4恒定區(qū)。

賦予降低的或改變的糖基化的示例性的氨基酸取代公開于國際PCT公開第WO05/018572號(hào)，將其通過引用整體并入本文。在優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽以消除糖基化。此類抗原結(jié)合多肽可被稱作“agly”抗原結(jié)合多肽。盡管不受理論束縛，據(jù)信“agly”抗原結(jié)合多肽在體內(nèi)可能具有提高的安全性和穩(wěn)定性特征。示例性的agly抗原結(jié)合多肽包含IgG4抗體的非糖基化的Fc區(qū)域，其缺乏Fc-效應(yīng)子功能，從而消除了Fc介導(dǎo)的對(duì)表達(dá)PDGFRβ的正常生命器官的毒性的可能性。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽包含改變的聚糖。例如，抗原結(jié)合多肽在Fc區(qū)的Asn297處的N-聚糖上可以含有降低數(shù)量的海藻糖殘基，即是無海藻糖基化的(afucosylated)。在另一實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽在Fc區(qū)的Asn297處的N-聚糖上可以具有改變數(shù)量的唾液酸殘基。

iii)共價(jià)連接

可以通過下述對(duì)本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽進(jìn)行修飾：將分子共價(jià)連接至結(jié)合多肽以使共價(jià)連接不阻止結(jié)合多肽與其同源表位的特異性結(jié)合。例如但不限于，可以通過下述對(duì)本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽進(jìn)行修飾：糖基化、乙?；?、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通過已知保護(hù)/阻斷基團(tuán)的衍生、蛋白水解剪切、與細(xì)胞配體或其它蛋白連接等。可以通過已知的技術(shù)進(jìn)行任何大量化學(xué)修飾，包括但不限于特定的化學(xué)剪切、乙?；?、甲?；?。此外，衍生物可以包含一種或多種非經(jīng)典氨基酸。

還可將本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽在N-或C-端與異源多肽重組融合或者與多肽或其它組合物化學(xué)綴合(包括共價(jià)和非共價(jià)連接綴合)。例如，可將抗原結(jié)合多肽與可用作檢測分析中的標(biāo)記的分子以及效應(yīng)分子重組融合或綴合，所述分子如異源多肽、藥物、放射性核素或毒素。參見，例如PCT公開WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624，美國專利第5,314,995號(hào)以及EP 396,387，將其各自通過引用整體并入本文。

利用本領(lǐng)域已知的方法，可將抗原結(jié)合多肽與異源多肽融合以增加體內(nèi)半衰期或用于免疫分析。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可將PEG與本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽綴合，以增加它們?cè)隗w內(nèi)的半衰期(參見Leong,S.R.等,Cytokine 16:106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54:531(2002)；或Weir等,Biochem.Soc.Transactions 30:512(2002)，將它們通過引用整體并入本文。

此外，可將本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽與標(biāo)志物序列(例如肽)融合，以促進(jìn)它們的純化或檢測。在優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)志物氨基酸序列為六個(gè)組氨酸的肽，如pQE載體(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)中提供的標(biāo)簽等，其中許多可商購得到。如Gentz等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824(1989)(將其通過引用整體并入本文)中所述的，例如六個(gè)組氨酸提供了方便的融合蛋白純化。可用于純化的其它肽標(biāo)簽包括但不限于“HA”標(biāo)簽和“flag”標(biāo)簽，所述“HA”標(biāo)簽與來源于流感血細(xì)胞凝集素蛋白的表位相對(duì)應(yīng)(Wilson等,Cell 37:767(1984)，將其通過引用整體并入本文)。

本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽可以以非綴合的形式使用或者可以與多種分子的至少一種綴合，例如以改善所述分子的治療特性，以促進(jìn)靶標(biāo)檢測或者用于成像或患者的治療。當(dāng)進(jìn)行純化時(shí)，可在純化之前或之后將本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽進(jìn)行標(biāo)記或綴合。特別地，可將本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽與下述綴合：治療劑、前藥、肽、蛋白、酶、病毒、脂類、生物效應(yīng)調(diào)節(jié)物、藥劑或PEG。

本發(fā)明還涵蓋與診斷劑或治療劑綴合的本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽。可將抗原結(jié)合多肽作為臨床測試程序的一部分，診斷性地用于例如監(jiān)測免疫細(xì)胞病癥(例如CLL)的發(fā)展或進(jìn)展，從而例如確定給定的治療和/或預(yù)防方案的效力。可以通過將抗原結(jié)合多肽與可檢測的物質(zhì)結(jié)合來促進(jìn)檢測?？蓹z測的物質(zhì)的實(shí)例包括不同的酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、利用不同的正電子發(fā)射斷層掃描的正電子發(fā)射型金屬以及非放射性順磁金屬離子。對(duì)于根據(jù)本申請(qǐng)可與抗體綴合以被用作診斷劑的金屬離子參見，例如美國專利第4,741,900號(hào)(將其通過引用整體并入本文)。合適的酶的實(shí)例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的實(shí)例包括鏈霉親和素/生物素和親和素/生物素；合適的熒光材料的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實(shí)例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實(shí)例包括熒光素酶、螢光素和水母素；以及合適的放射性材料的實(shí)例包括¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In或⁹⁹Tc。

可將用于本文公開的診斷和治療方法的抗原結(jié)合多肽與下述綴合：細(xì)胞毒素(如放射性同位素、細(xì)胞毒性藥物或毒素)治療劑、細(xì)胞抑制劑、生物毒素、前藥、肽、蛋白、酶、病毒、脂類、生物效應(yīng)調(diào)節(jié)物、藥劑、免疫活性配體(例如淋巴因子或其它抗體，其中產(chǎn)生的分子既與贅生性細(xì)胞結(jié)合又與效應(yīng)細(xì)胞如T細(xì)胞結(jié)合)或PEG。

在另一實(shí)施方案中，可將用于本文公開的診斷和治療方法的抗原結(jié)合多肽與降低腫瘤細(xì)胞生長的分子綴合。在其它實(shí)施方案中，公開的組合物可以包含與藥物或前藥結(jié)合的抗體或其片段。本發(fā)明的其它實(shí)施方案還包括與特定的生物毒素或其細(xì)胞毒性片段綴合的抗原結(jié)合多肽的用途，所述生物毒素如蓖麻毒素、白樹毒素、假單胞菌外毒素或白喉毒素。選擇使用綴合的或未綴合的抗體將取決于癌癥的類型和階段、輔助治療的使用(例如化療或外部輻射)以及患者的狀況。將會(huì)理解，鑒于本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地做出此類選擇。

將會(huì)理解，在之前的研究中，用同位素標(biāo)記的抗腫瘤抗體已被成功地用于破壞動(dòng)物模型中的腫瘤細(xì)胞，以及在一些情況下破壞人體中的腫瘤細(xì)胞。示例性的放射性同位素包括：⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹¹¹In、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re以及¹⁸⁸Re。放射性核素通過產(chǎn)生引起核DNA中多處鏈斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡的電離輻射發(fā)揮作用。用于產(chǎn)生治療綴合物的同位素通常產(chǎn)生具有短路徑長度的高能量α-或β-顆粒。此類放射性核素殺死其緊密靠近的細(xì)胞，例如結(jié)合物與之接觸或者已經(jīng)進(jìn)入的贅生性細(xì)胞。它們對(duì)非局部化的細(xì)胞影響小或者無影響。放射性核素基本上是非免疫原性的。

V.抗原結(jié)合多肽的表達(dá)

在對(duì)提供如上文所述的本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽的分離的遺傳材料進(jìn)行操作之后，通常將基因插入表達(dá)載體以導(dǎo)入可用于產(chǎn)生期望量的抗原結(jié)合多肽的宿主細(xì)胞。

出于說明書和權(quán)利要求的目的，本文使用術(shù)語“載體”或“表達(dá)載體”意為，根據(jù)本發(fā)明用作用于將期望的基因?qū)爰?xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)的媒介物的載體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可從質(zhì)粒、噬菌體、病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒中容易地選擇此類載體。通常，與本發(fā)明相容的載體將包含選擇標(biāo)志物、促進(jìn)期望的基因的克隆的合適的限制性位點(diǎn)以及進(jìn)入和/或在真核或原核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的能力。

出于本發(fā)明的目的，可以使用許多表達(dá)載體系統(tǒng)。例如，利用來源于動(dòng)物病毒的DNA元件的一類載體，所述動(dòng)物病毒如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其它的涉及使用具有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)的多順反子系統(tǒng)。此外，可以通過導(dǎo)入允許選擇轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的一種或多種標(biāo)志物來選擇已將DNA整合進(jìn)它們的染色體的細(xì)胞。所述標(biāo)志物可以向營養(yǎng)缺陷型宿主提供原養(yǎng)，提供抗微生物抗性(例如抗生素)或?qū)χ亟饘偃玢~的抗性?？蓪⒖蛇x擇的標(biāo)志物基因與待表達(dá)的DNA序列直接相連，或者通過共轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入同一細(xì)胞。mRNA的優(yōu)化合成可能還需要其它元件。這些元件可以包括信號(hào)序列、剪接信號(hào)、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、增強(qiáng)子以及終止信號(hào)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將克隆的可變區(qū)基因與如上文所討論合成的重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因(優(yōu)選人的)一起插入表達(dá)載體中。

在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，可以利用多順反子構(gòu)建體來表達(dá)本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽。在此類表達(dá)系統(tǒng)中，可由單一多順反子構(gòu)建體產(chǎn)生多種目標(biāo)基因產(chǎn)物，如抗體的重鏈和輕鏈。這些系統(tǒng)有利地利用了內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，以在真核宿主細(xì)胞中提供相對(duì)高水平的本發(fā)明的多肽。相容的IRES序列公開于美國專利第6,193,980號(hào)，將其通過引用整體并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，可將此類表達(dá)系統(tǒng)用于有效地產(chǎn)生本申請(qǐng)中公開的全部范圍的多肽。

更普遍而言，一旦制備了編碼抗體或其片段的載體或DNA序列，則可將表達(dá)載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞。即，可以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種技術(shù)來完成質(zhì)粒向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入。這些包括但不限于：轉(zhuǎn)染(包括電泳和電穿孔)、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣沉淀、用包封的DNA進(jìn)行的細(xì)胞融合、顯微注射以及用完整病毒進(jìn)行的感染。參見，Ridgway,A.A.G."Mammalian Expression Vectors"第24.2章，470-472頁，Vectors,Rodriguez and Denhardt,Eds.(Butterworths,Boston,Mass.1988)，將其通過引用整體并入本文。最優(yōu)選地，經(jīng)電穿孔將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在適于輕鏈和重鏈產(chǎn)生的條件下生長，并分析重鏈和/或輕鏈蛋白的合成。示例性的分析技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)或者熒光激活細(xì)胞分選儀分析(FACS)、免疫組織化學(xué)等。

本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”應(yīng)在廣義上被用于指DNA向受體宿主細(xì)胞的導(dǎo)入，所述導(dǎo)入改變了基因型并隨后導(dǎo)致受體細(xì)胞的變化。

同樣地，“宿主細(xì)胞”指利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的轉(zhuǎn)化有載體并編碼至少一種異源基因的細(xì)胞。在用于從重組宿主中分離多肽的過程的描述中，術(shù)語“細(xì)胞”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，以表示抗體來源，除非另外明確指定。換言之，從“細(xì)胞”回收多肽可以意為從離心的全細(xì)胞或者從既含有培養(yǎng)基又含有懸浮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物回收多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用于表達(dá)抗原結(jié)合多肽的宿主細(xì)胞系是哺乳動(dòng)物來源的；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定最適合期望的基因產(chǎn)物在其中表達(dá)的具體宿主細(xì)胞系。示例性的宿主細(xì)胞系包括但不限于：DG44和DUXB11(中國倉鼠卵巢細(xì)胞系，DHFR陰性)、HELA(人宮頸癌)、CVI(猴腎細(xì)胞系)、COS(含有SV40T抗原的CVI的衍生物)、R1610(中國倉鼠成纖維細(xì)胞)BALBC/3T3(小鼠成纖維細(xì)胞)、HAK(倉鼠腎細(xì)胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛內(nèi)皮細(xì)胞)、RAJI(人淋巴細(xì)胞)、293(人腎細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞系提供了由其表達(dá)的抗體的改變的糖基化，例如無海藻糖基化(例如PER.C6.RTM.(Crucell)或FUT8敲除的CHO細(xì)胞系(Potelligent.RTM.Cells)(Biowa,Princeton,N.J.))。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用NS0細(xì)胞。特別優(yōu)選CHO細(xì)胞。宿主細(xì)胞系通?？捎缮虡I(yè)服務(wù)(美國組織培養(yǎng)庫)得到或由公開的文獻(xiàn)得到。

體外生產(chǎn)允許擴(kuò)大，以給出大量的期望多肽。在組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并且包括均勻懸浮培養(yǎng)(例如在氣升式反應(yīng)器或在連續(xù)攪拌反應(yīng)器中)或者固定化或包裹的細(xì)胞培養(yǎng)(例如在中空纖維、微囊體中，在瓊脂糖微珠或陶瓷盒(ceramic cartridge)上)。如果需要和/或期望，可通過常規(guī)層析法純化多肽溶液，例如凝膠過濾、離子交換層析、經(jīng)DEAE-纖維素的層析和/或(免疫-)親和層析。

編碼本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽的基因也可在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞如細(xì)菌或酵母或植物細(xì)胞中表達(dá)。就這一點(diǎn)而言，將會(huì)理解，也可轉(zhuǎn)化不同的單細(xì)胞非哺乳動(dòng)物微生物，如細(xì)菌；即能夠在培養(yǎng)物或發(fā)酵中生長的微生物。易于轉(zhuǎn)化的細(xì)菌包括腸桿菌科成員，如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)菌株；芽孢桿菌(Bacillaceae)，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎雙球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)以及流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)。還將會(huì)理解，當(dāng)在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)，多肽可以成為包涵體的一部分。必須將多肽分離、純化，然后組裝成功能性分子。

除原核生物之外，也可以使用真核微生物。盡管通?？色@得許多其它菌株，但是在真核微生物中，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常規(guī)的面包酵母是最常用的。對(duì)于在酵母中的表達(dá)，例如通常使用質(zhì)粒YRp7(Stinchcomb等,Nature,282:39(1979)；Kingsman等，Gene,7:141(1979)；Tschemper等，Gene,10:157(1980)，將其各自通過引用整體并入本文)。該質(zhì)粒已經(jīng)包含了TRP1基因，所述基因提供了缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變菌株(例如ATCC第44076號(hào)或PEP4-1(Jones,Genetics,85:12(1977))的選擇標(biāo)志物，將其通過引用整體并入本文)。作為酵母宿主細(xì)胞基因組的特征的trpl缺陷的存在，然后提供了通過在色氨酸不存在的情況下生長來檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。

VI.抗原結(jié)合多肽的藥物制劑和施用方法

在另一方面，本發(fā)明提供了包含本文公開的抗原結(jié)合多肽的藥物組合物。

制備和向?qū)ο笫┯帽景l(fā)明的抗原結(jié)合多肽的方法對(duì)本領(lǐng)域人員而言是熟知的，或者可以容易地確定。本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽的施用途徑可以是口服施用、腸胃外施用、吸入施用或局部施用。本文使用的術(shù)語腸胃外施用包括靜脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施用、皮下施用、直腸或陰道施用。通過優(yōu)選靜脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用、皮下施用和肌肉內(nèi)施用的腸胃外施用形式。盡管所有這些施用形式均被明確地考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但是對(duì)于注射特別是對(duì)于靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)注射或滴注，施用形式將是溶液。通常，用于注射的合適的藥物組合物可以包含緩沖液(例如醋酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液)、表面活性劑(例如聚山梨酯)，任選地穩(wěn)定劑(例如人白蛋白)等。然而，在與本文的教導(dǎo)相容的其它方法中，可將抗原結(jié)合多肽直接遞送至不良細(xì)胞群的部位，從而增加病變組織對(duì)治療劑的暴露。

腸胃外施用的制劑包括無菌水溶液或非水性溶液、懸浮液和乳狀液。非水性溶劑的實(shí)例為丙二醇，聚乙二醇，植物油(如橄欖油)和可注射的有機(jī)酯類(如油酸乙酯)。水性載體包括水、醇/水溶液、乳狀液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。在本發(fā)明中，藥學(xué)可接受的載體包括但不限于0.01-0.1M的磷酸鹽緩沖液以及優(yōu)選地0.05M的磷酸鹽緩沖液或者0.8％的鹽水。其它常規(guī)腸胃外媒介物包括磷酸鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格式液或固定油。靜脈內(nèi)媒介物包括液體和營養(yǎng)補(bǔ)充物、電解質(zhì)補(bǔ)充物(如基于林格氏葡萄糖的那些)等。也可存在防腐劑和其它添加物，如例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。更具體地，適于注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(如果可溶于水)或分散體以及用于無菌可注射的溶液或分散體臨時(shí)制備的無菌粉末。在此類情況下，組合物必須是無菌的，并且應(yīng)是達(dá)到易于注射程度的流體。其在制備和儲(chǔ)存條件下應(yīng)是穩(wěn)定的，并且將優(yōu)選保存不受微生物(如細(xì)菌和真菌)的污染作用。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散介質(zhì)?？梢岳缤ㄟ^使用包衣如卵磷脂，通過維持所需的顆粒尺寸(在分散體的情況下)以及通過使用表面活性劑來維持合適的流動(dòng)性?？梢酝ㄟ^不同的抗細(xì)菌劑和抗真菌劑來實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物作用的預(yù)防，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，將優(yōu)選在組合物中包含等滲劑，例如糖/多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中包含延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)而導(dǎo)致可注射的組合物的延長的吸收。

在任何情況下，可以通過下述來制備無菌可注射的溶液：在合適的溶劑中以需要的量摻入活性化合物(例如抗體自身或與其它活性劑組合的抗體)和按需要本文列舉的成分中一種或組合，然后過濾除菌。通常，通過將活性化合物摻入包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來自上文所列的那些的所需其它成分的無菌媒介物來制備分散體。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，所述方法由活性成分和任何其它期望成分的預(yù)先無菌過濾溶液得到了活性成分和任何其它期望成分的粉末。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，處理用于注射的制劑，將其填充至容器(如安瓿、包、瓶、注射器或小瓶)中，并在無菌條件下密封。此外，可以如共同未決的美國系列號(hào)09/259,337和美國系列號(hào)09/259,338中所述的那些(將其各自通過引用并入本文)，以試劑盒的形式包裝并出售制劑。此類制品將優(yōu)選包含指示相關(guān)組合物可用于治療罹患或者易患自身免疫病癥或贅生性病癥的對(duì)象的標(biāo)簽或包裝嵌入物。

用于治療上文所述病況的本發(fā)明的穩(wěn)定的抗原結(jié)合多肽的有效劑量根據(jù)許多不同的因素而改變，包括施用方式、靶標(biāo)位置、患者的生理狀態(tài)、患者是人還是動(dòng)物、施用的其它藥物以及治療是預(yù)防性的還是治療性的。通常，患者是人，但是也可治療非人類的哺乳動(dòng)物包括轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來滴定治療劑量，以優(yōu)化安全性和效力。

對(duì)于用本發(fā)明的抗體進(jìn)行的被動(dòng)免疫，劑量范圍可以是，例如約0.0001至100mg/kg對(duì)象體重，以及更通常為0.01mg/kg對(duì)象體重至5mg/kg對(duì)象體重(例如0.02mg/kg對(duì)象體重、0.25mg/kg對(duì)象體重、0.5mg/kg對(duì)象體重、0.75mg/kg對(duì)象體重、1mg/kg對(duì)象體重、2mg/kg對(duì)象體重等)。例如，劑量可以是1mg/kg體重或10mg/kg體重或者在1-10mg/kg范圍內(nèi)，優(yōu)選地至少1mg/kg。以上范圍中間的劑量也意圖在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

可以每天、隔天、每周或者根據(jù)通過經(jīng)驗(yàn)分析確定的任何其它安排向?qū)ο笫┯么朔N劑量。示例性的治療需要在例如至少六個(gè)月的長時(shí)間內(nèi)以多個(gè)劑量施用。其它示例性的治療方案需要每兩周施用一次或者每個(gè)月施用一次或者每3至6個(gè)月施用一次。示例性的劑量安排包括連續(xù)幾天1-10mg/kg或15mg/kg，隔天30mg/kg或者每周60mg/kg。在一些方法中，同時(shí)施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或更多種抗原結(jié)合多肽，在這種情況下，施用的各抗體的劑量可能落入指示的范圍內(nèi)。

可以在多個(gè)時(shí)機(jī)施用本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽。單劑量之間的間隔可以是，例如每天、每周、每月或每年。如通過測量患者的多肽或靶標(biāo)分子的血液水平所示的，間隔也可以是無規(guī)律的。在一些方法中，調(diào)整劑量以達(dá)到某血漿抗體或毒素濃度，例如1-1000μg/ml或25-300μg/ml?？蛇x地，可以作為緩釋制劑施用抗原結(jié)合多肽，在此種情況下，需要較低頻率施用。劑量和頻率根據(jù)患者中的抗原結(jié)合多肽的半衰期而改變。通常而言，人源化的抗原結(jié)合多肽顯示出最長的半衰期，然后是嵌合的抗原結(jié)合多肽和非人類抗原結(jié)合多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以施用未綴合形式的本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽。在另一實(shí)施方案中，可以多次施用綴合形式的本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽。在另一實(shí)施方案中，可以施用未綴合形式的本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽，然后施用綴合形式，或者反之亦然。

施用的劑量和頻率可以根據(jù)治療是預(yù)防性的還是治療性的而改變。在預(yù)防性應(yīng)用中，向還未處于疾病狀態(tài)的患者施用包含本發(fā)明抗體或其混合物的組合物，以增強(qiáng)患者的抵抗力。將此量定義為“預(yù)防有效劑量”。在該用途中，精確的量再次取決于患者的健康和全身免疫狀態(tài)，但是通常范圍為每劑量0.1mg至25mg，特別是每劑量0.5mg至2.5mg。在長時(shí)間段內(nèi)，以相對(duì)不頻繁的間隔施用相對(duì)低的劑量。一些患者在其余生繼續(xù)接受治療。

在治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要在相對(duì)短的間隔的相對(duì)高劑量(例如每劑量約1至400mg/kg抗體，其中對(duì)于放射免疫綴合物，更常使用5mg至25mg的劑量，以及對(duì)于細(xì)胞毒素-藥物綴合的分子，更常使用更高的劑量)，直至疾病進(jìn)展減緩或終止，以及優(yōu)選地直至患者顯示出疾病癥狀的部分或完全改善。此后，可以向患者施用預(yù)防性方案。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以用編碼本發(fā)明的多肽的核酸(例如在載體內(nèi))來治療對(duì)象。編碼多肽的核酸的劑量范圍為每位患者約10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg或者30-300μg DNA。傳染性病毒載體的劑量為每劑量10個(gè)-100個(gè)或者更多個(gè)。

對(duì)于預(yù)防性和/或治療性治療，可以通過下述方式施用治療劑：腸胃外施用、局部施用、靜脈內(nèi)施用、口服施用、皮下施用、動(dòng)脈內(nèi)施用、顱內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、鼻內(nèi)施用或肌肉內(nèi)施用。對(duì)于施用本發(fā)明的抗體，優(yōu)選肌肉內(nèi)注射或靜脈灌輸。在一些方法中，將治療性抗體或其片段直接注射進(jìn)顱內(nèi)。在一些方法中，將抗體或其片段作為緩釋組合物或裝置(如Medipad^TM裝置)來施用。

任選地，可將本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽與有效治療需要治療(例如預(yù)防性的或治療性的)的病癥或病況的其它藥劑組合施用。優(yōu)選的其它藥劑為本領(lǐng)域公認(rèn)的以及規(guī)范地施用于具體病癥的那些藥劑。

本發(fā)明的⁹⁰Y-標(biāo)記的抗體的有效單一治療劑量(即治療有效量)的范圍為約5mCi至約75mCi，更優(yōu)選約10mCi至約40mCi。¹³¹I-標(biāo)記的抗原結(jié)合多肽的有效單一治療非骨髓消融劑量的范圍為約5mCi至約70mCi，更優(yōu)選約5mCi至約40mCi。¹³¹I-標(biāo)記的抗體的有效單一治療消融劑量(即可能需要自體骨髓移植)的范圍為約30mCi至約600mCi，更優(yōu)選約50mCi至小于約500mCi。

盡管已經(jīng)用¹³¹I和⁹⁰Y獲得了大量臨床經(jīng)驗(yàn)，但是其它放射性標(biāo)記在本領(lǐng)域也是已知的并已用于類似的目的。其它放射性同位素仍被用于成像。例如，與本發(fā)明的范圍相容的其它放射性同位素包括但不限于：¹²³I、¹²⁵I、³²P、⁵⁷Co、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁷⁷Br、⁸¹Rb、⁸¹Kr、⁸⁷Sr、¹¹³I_n、¹²⁷Cs、¹²⁹Cs、¹³²I、¹⁹⁷Hg、²⁰³Pb、²⁰⁶Bi、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、²¹²Pb、²¹²Bi、⁴⁷Sc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹⁵³Sm、¹⁸⁸Re、¹⁹⁹Au、²²⁵Ac、²¹¹A以及²¹³Bi。在這一方面，α、γ和β發(fā)射體均與本發(fā)明相容。此外，鑒于本公開，認(rèn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定哪種放射性核素與選擇的療程相容，而無需過度實(shí)驗(yàn)。為此，已用于臨床診斷的其它放射性核素包括¹²⁵I、¹²³I、⁹⁹Tc、⁴³K、⁵²Fe、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga以及¹¹¹In。對(duì)于在靶向免疫療法中的可能用途，也用各種放射性核素對(duì)抗體進(jìn)行了標(biāo)記(Peirersz等.Immunol.Cell Biol.65:111-125(1987)，將其通過引用整體并入本文)。在較小程度上，這些放射性核素包括¹⁸⁸Re和¹⁸⁶Re以及¹⁹⁹Au和⁶⁷Cu。美國專利第5,460,785號(hào)提供了關(guān)于此類放射性同位素的其它數(shù)據(jù)，并將其通過引用整體并入本文。

如之前所討論的，對(duì)于哺乳動(dòng)物病癥的體內(nèi)治療，可以以藥學(xué)有效的量施用本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽。就這一點(diǎn)而言，將會(huì)理解，可以配制公開的抗原結(jié)合多肽，從而促進(jìn)施用以及促進(jìn)活性劑的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含藥學(xué)可接受的無毒無菌載體，如生理鹽水、無毒緩沖液、防腐劑等。出于本申請(qǐng)的目的，與治療劑綴合或未綴合的本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽的藥學(xué)有效量應(yīng)被理解為意為這樣的量：其足以實(shí)現(xiàn)與靶標(biāo)的有效結(jié)合以及足以達(dá)到例如改善疾病或病癥的癥狀的益處或者足以檢測物質(zhì)或細(xì)胞。在腫瘤細(xì)胞的情況下，多肽將優(yōu)選地能夠與贅生性細(xì)胞或免疫反應(yīng)性細(xì)胞上選擇的免疫反應(yīng)性抗原相互作用，以及提供這些細(xì)胞的死亡的增加。當(dāng)然，可以單劑量或多劑量施用本發(fā)明的藥物組合物，以提供藥學(xué)有效量的多肽。

與本公開的范圍一致，根據(jù)前述的治療方法，可以以足以產(chǎn)生治療或預(yù)防效果的量向人或其它動(dòng)物施用本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽。可以以通過根據(jù)已知的技術(shù)將本發(fā)明的抗體與常規(guī)藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑組合而制備的常規(guī)劑型，向此類人或其它動(dòng)物施用本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑的形式和特征由與之組合的活性成分的量、施用途徑以及其它熟知的變量決定。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，包含根據(jù)本發(fā)明的多肽的一種或多種的混合物可被證明特別有效。

VII.治療疾病或病癥的方法

本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽可用于拮抗細(xì)胞表面受體如HER2和/或PDGFRβ的活性。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了通過向需要的對(duì)象施用包含本發(fā)明的一種或多種抗原結(jié)合多肽的藥物組合物來治療PDGFRβ-和/或HER2-相關(guān)疾病或病癥的方法。

在某些實(shí)施方案中，將本文公開的抗PDGFRβ、抗HER2和/或雙特異性抗原結(jié)合多肽(例如SEQ ID No:13-16、17-22和/或24中所示的那些)與其它治療劑組合施用。合適的治療劑包括而不限于EGFR家族受體活性抑制劑(例如曲妥珠單抗(CAS#180288-69-1)、帕妥珠單抗(CAS#380610-27-5)、西妥昔單抗(CAS#205923-56-4)和埃羅替尼(CAS#183321-74-6)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將抗PDGFRβ/抗HER2雙特異性抗原結(jié)合多肽與曲妥珠單抗和/或帕妥珠單抗組合施用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將抗HER2單特異性抗原結(jié)合多肽與曲妥珠單抗和/或帕妥珠單抗組合施用。

適于治療的疾病或病癥包括而不限于癌癥，例如乳腺癌和卵巢癌。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定出于治療PDGFRβ-和/或HER2-相關(guān)疾病或病癥的目的的抗體(或其它治療劑)的有效無毒的量將是多少。例如，多肽的治療有效量可以根據(jù)下述因素而改變：諸如疾病階段(例如階段I對(duì)比階段IV)、年齡、性別、醫(yī)學(xué)并發(fā)癥(例如免疫抑制的病況或疾病)和對(duì)象的體重以及抗體在對(duì)象中引發(fā)期望的應(yīng)答的能力。可以調(diào)整劑量方案以提供最佳治療應(yīng)答。例如，可以每天施用若干分劑量，或者可以如治療狀況的緊急情況所指示的按比例降低劑量。然而，通常，期望有效劑量在每天每千克體重約0.05至100毫克，以及更優(yōu)選地每天每千克體重0.5毫克至10毫克的范圍內(nèi)。

VIII.實(shí)施例

通過下述實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)被解釋為進(jìn)一步限定。將序列表、附圖以及貫穿本申請(qǐng)所引用的全部參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請(qǐng)的內(nèi)容通過引用明確并入本文。

實(shí)施例1.HER2/PDGFRβ雙特異性抗原結(jié)合多肽的產(chǎn)生

合成編碼不同HER2/PDGFRβ雙特異性抗原結(jié)合多肽形式的基因，并將其克隆進(jìn)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案將構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞。收集上清液并檢測表達(dá)。圖5顯示了表達(dá)的雙特異性形式2(表4中的SEQ ID No 18)的二聚物的SDS-PAGE凝膠。凝膠顯示，在非還原條件下，表達(dá)了期望的125Da的多肽(泳道2)，以及在還原條件下其解離為期望的62.5kDa的單體(泳道1)。

實(shí)施例2.利用ELISA評(píng)估HER2/PDGFRβ雙特異性抗原結(jié)合多肽的表達(dá)

開發(fā)ELISA分析以測定細(xì)胞上清液中HER2/PDGFRβ雙特異性抗原結(jié)合多肽的表達(dá)。簡言之，在Maxisorp Immulon板上過夜捕獲2μg/mL抗人Fc抗體，并用Superblock封閉。將上清液連續(xù)稀釋，并負(fù)載于板上。將培養(yǎng)基類似地稀釋，并作為陰性對(duì)照平行負(fù)載。用抗人Fab特異性HRP檢測雙特異性抗原結(jié)合多肽。圖6中所示的結(jié)果顯示，ELISA分析能夠檢測HEK293細(xì)胞上清液中的雙特異性抗原結(jié)合多肽。

實(shí)施例3.利用ELISA檢測HER2/PDGFRβ雙特異性抗原結(jié)合多肽的同時(shí)抗原結(jié)合

開發(fā)ELISA分析以檢測HER2/PDGFRβ雙特異性抗原結(jié)合多肽與HER2和PDGFRβ的同時(shí)結(jié)合。簡言之，將2μg/mL人Her2-Fc融合蛋白(不含His表位標(biāo)簽)固定化于Maxisorp Immulon板上過夜，并用Superblock封閉。將包含雙特異性抗原結(jié)合多肽的HEK293細(xì)胞上清液連續(xù)稀釋，并負(fù)載于板上。孵育1小時(shí)之后，洗滌板，并將100nM人PDGFRβ-Fc融合物(含His表位標(biāo)簽)加載于板，孵育1小時(shí)。利用抗His HRP檢測雙特異性Ab與Her2和PDGFRb的結(jié)合。圖7中所示的結(jié)果顯示，雙特異性抗原結(jié)合多肽能夠同時(shí)與HER2和PDGFRβ結(jié)合。

實(shí)施例4.HER2/PDGFRβ雙特異性抗原結(jié)合多肽的基于FACS的結(jié)合分析

開發(fā)基于FACS的結(jié)合分析，以檢測當(dāng)表達(dá)于細(xì)胞表面上時(shí)，HER2/PDGFRβ雙特異性抗原結(jié)合多肽與HER2和PDGFRβ的同時(shí)結(jié)合。具體地，以1百萬個(gè)細(xì)胞/ml將200μl組成型過表達(dá)HER2的HEK293細(xì)胞或瞬時(shí)過表達(dá)PFGFRβ的HEK293細(xì)胞或者模擬轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞鋪于新的96孔板上。將細(xì)胞維持在4℃以避免受體內(nèi)化。將包含形式-2或形式-3的HER2/PDGFRβ雙特異性抗原結(jié)合多肽(參見表4以及圖2和3)的HEK293細(xì)胞上清液與25nM重組人PDGFRβ-CF647或重組人Her2-CF647孵育，以允許形成雙特異性/標(biāo)記的蛋白復(fù)合物。孵育后，向適當(dāng)表達(dá)HER2的細(xì)胞、表達(dá)PDGFRβ的細(xì)胞或者對(duì)照細(xì)胞添加100μl各上清液，在4℃孵育并震動(dòng)2小時(shí)，以允許雙特異性/標(biāo)記的蛋白復(fù)合物與細(xì)胞表面HER2和PDGFRβ的結(jié)合。孵育之后，通過在1500rpm離心4min使細(xì)胞成團(tuán)，用200μl新鮮完全培養(yǎng)基洗滌一次，并在200μl終體積的新鮮完全培養(yǎng)基中重懸。利用Guava流式細(xì)胞儀(Millipore)確定熒光標(biāo)記的PDGFRβ-CF647或Her2-CF647與細(xì)胞的結(jié)合。沿X-軸的正向位移被認(rèn)為指示標(biāo)記的PDGFRβ-CF647或Her2-CF647與細(xì)胞的締合。

在這些實(shí)驗(yàn)中，將抗PDGFR抗體或抗HER2抗體、僅培養(yǎng)基以及CF647標(biāo)記的受體用作陰性對(duì)照。將25nM CF647標(biāo)記的HER2抗體或者50nM CF647標(biāo)記的PDGFRβ抗體分別用作表達(dá)HER2和PDGFRβ的細(xì)胞的陽性對(duì)照。

這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖8中。該數(shù)據(jù)顯示形式-2和形式-3的HER2/PDGFRβ雙特異性抗原結(jié)合多肽均能同時(shí)結(jié)合細(xì)胞表面的HER2和PDGFRβ。

實(shí)施例4.示例性抗HER2VH結(jié)構(gòu)域與HER2的結(jié)合分析

利用表面等離子體共振分析(Biacore)分析B8抗HER2VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:13)與HER2的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。如圖9所示，B8VH結(jié)構(gòu)域顯示出1.2nM的Kd，1.39×10⁵M^-1s^-1的結(jié)合速率以及1.67×10⁴s^-1的解離速率。

利用基于FACS的分析來分析B8VH結(jié)構(gòu)域與曲妥珠單抗和/或帕妥珠單抗的競爭結(jié)合的能力。圖9所示的結(jié)果證明B8VH結(jié)構(gòu)域可與曲妥珠單抗和帕妥珠單抗同時(shí)結(jié)合HER2。這些數(shù)據(jù)證明抗HER2VH結(jié)構(gòu)域與不同于曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的HER2上的表位結(jié)合。

將B8VH結(jié)構(gòu)域重新格式化進(jìn)scFv，并確定對(duì)HER2的結(jié)合親和力。圖10所示的結(jié)果顯示，B8scFv顯示出0.87nM的Kd。

實(shí)施例5.細(xì)胞增殖分析

利用MTS細(xì)胞增殖分析確定B12抗HER2VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:14)、曲妥珠單抗或帕妥珠單抗單獨(dú)或者組合抑制SK-BR-3細(xì)胞的增殖的能力。圖11所示的結(jié)果顯示，B12VH、曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的組合導(dǎo)致比單獨(dú)各試劑或僅曲妥珠單抗與帕妥珠單抗的組合獲得的更強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制。這些數(shù)據(jù)證明B12VH可被用于增加曲妥珠單抗和帕妥珠單抗的細(xì)胞增殖抑制。