本發(fā)明涉及可用作藥物組合物(例如用于治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的藥物組合物)的有效成分的4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(異喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸(以下，有時稱為“化合物A”。)、或其鹽。

背景技術：

已知前列腺素E2(以下稱為“PGE2”。)是花生四烯酸級聯(lián)的代謝產物之一。PGE2顯示出各種生理活性，并且參與致痛增強作用、炎癥促進作用、炎癥抑制作用、子宮收縮作用、消化道蠕動運動促進作用、催醒作用、胃酸分泌抑制作用、降血壓作用、血小板聚集抑制作用、骨再吸收促進作用、血管新生作用等。

PGE2的受體存在EP1、EP2、EP3和EP4四種亞型，它們廣泛分布在各種組織中。EP1受體的激活會引起細胞內Ca²⁺的增加。EP3受體的激活在引起細胞內Ca²⁺的增加的同時，還會引起腺苷酸環(huán)化酶的抑制，從而使細胞內的cAMP水平減少。EP2和EP4受體的激活會引起腺苷酸環(huán)化酶的激活，從而使細胞內的cAMP水平增加。特別是EP4受體被認為與平滑肌的松弛、炎癥反應的促進或抑制、淋巴細胞的分化、系膜細胞的肥大或增殖、胃腸的粘液分泌等有關。(Pharmacology&Therapeutics 2013,138:485-502；Pharmacological Reviews 2013,65:1010-1052；American Journal of Physiology Renal Physiology 2004,287,F673-F681)。

PGE2受體的抑制劑，即EP受體拮抗劑對于EP受體具有結合活性，從而抑制PGE2的EP受體介導的作用。因此，EP受體拮抗劑作為治療由PGE2所引起的疾病的藥劑備受期待。其中，EP4受體拮抗劑作為針對人和動物的與EP4相關的疾病(例如腎病、炎癥性疾病、各種疼痛等)的治療藥物備受期待(Journal of American Society Nephrology 2010,21:1678-1690；Proceedings of the National Academy of Sciences,2010,107:12233-12238；The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2008,325:425-434)。此外，從能夠避免基于其它的EP1、EP2和EP3的拮抗的副作用的觀點出發(fā)，優(yōu)選EP4受體選擇性拮抗劑(Physiological Reviews 1999,79:1193-1226；Annual Reviews Physiology 2001,63:579-605)。

在專利文獻1中報道了由下式(B)表示的化合物作為EP4受體拮抗劑。

[化學式1]

(式中，環(huán)D為下式(III)的基團等，在下式中，環(huán)D¹表示可被苯基取代的單環(huán)或雙環(huán)的含氮雜環(huán)，R⁴¹表示-X²-B⁴，X²表示C_1-6的亞烷基等，B⁴表示可被選自R⁴的1至5個相同或不同的基團分別取代的芳基、雜環(huán)等。其它符號參照該專利文獻。)

[化學式2]

在該專利文獻的實施例205中公開了下述實施例化合物，作為環(huán)D¹為吡唑的具體化合物，公開了該實施例化合物。

[化學式3]

在專利文獻2中報道了由下式(C)表示的化合物作為EP4受體拮抗劑。

[化學式4]

(式中，R²表示甲基、氟甲基等，R⁴表示氟甲基、甲氧基等。其它符號參照該專利文獻。)

在專利文獻3中報道了由下式(D)表示的化合物作為EP4受體拮抗劑。

[化學式5]

(式中，R²表示甲基、氟甲基(例如單氟甲基、二氟甲基、三氟甲基)等，R⁴表示氟甲基、甲氧基等。其它符號參照該專利文獻。)

在專利文獻4中報道了由下式(E)表示的化合物作為EP4受體配體。

[化學式6]

(式中的符號參照該專利文獻。)

在專利文獻5中報道了由下式(F)表示的化合物作為EP4受體拮抗劑。

[化學式7]

(式中，環(huán)B和環(huán)D相同或彼此不同，表示可被取代的芳基、可被取代的雜環(huán)，X表示單鍵、-R⁰⁰-等，R⁰⁰表示低級亞烷基，R¹表示H等。A為下式(II)的基團，下式中，Y表示CH等，R²表示R⁰等，R⁰表示低級烷基，Z表示單鍵等，R³表示-COOH等。其它符號參照該專利文獻。)

[化學式8]

在該專利文獻中，沒有公開環(huán)D為吡唑的具體化合物。

從專利文獻1到專利文獻5中，在具體的實施例中公開的化合物與化合物A的結構不同。

現(xiàn)有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：國際公開第2009/139373號

專利文獻2：國際公開第2012/103071號

專利文獻3：國際公開第2012/039972號

專利文獻4：國際公開第2008/017164號

專利文獻5：國際公開第2009/005076號

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的課題

提供了一種可用作藥物組合物(例如用于治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的藥物組合物)的有效成分的化合物。解決課題的方案

本發(fā)明人對具有EP4受體拮抗作用的化合物進行了深入地研究，發(fā)現(xiàn)由式(1)所示的4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(異喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸(化合物A)或其鹽顯示出優(yōu)異的EP4受體拮抗作用，從而完成了本發(fā)明。

[化學式9]

即，本發(fā)明涉及化合物A或其鹽、以及含有化合物A或其鹽以及可藥用的賦形劑的藥物組合物。

另外，本發(fā)明涉及一種含有化合物A或其鹽以及可藥用的賦形劑的、用于預防或治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的藥物組合物。需要說明的是，該藥物組合物包含含有化合物A或其鹽以及可藥用的賦形劑的、慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的預防或治療劑。

另外，本發(fā)明涉及化合物A或其鹽在制造用于預防或治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的藥物組合物中的應用、化合物A或其鹽用于預防或治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的應用、用于預防或治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的化合物A或其鹽、以及包括將有效量的化合物A或其鹽施用至對象的慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的預防或治療方法。需要說明的是，“對象”為需要該預防或治療的人或其他動物，作為一個實施方式，為需要該預防或治療的人。

本發(fā)明的效果

由于化合物A或其鹽具有EP4受體拮抗作用，因此其可作為用于預防和/或治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的藥物組合物的有效成分使用。

具體實施方式

本發(fā)明的化合物A或其鹽的某些實施方式表示如下。需要說明的是，本說明書中簡記為化合物A的情況表示沒有形成鹽而作為游離化合物的化合物A。

(1)化合物A或其鹽。

(1-1)化合物A。

(1-2)化合物A的甲磺酸鹽。

(2)(1)中記載的化合物A或其鹽的晶體。

(3)(1-1)中記載的化合物A的晶體。

(3-1)(3)中記載的化合物A的晶體，其在差示掃描量熱分析(DSC分析)中的吸熱峰的起始溫度為253℃附近。

(3-2)(3)中記載的化合物A的晶體，其特征在于，在采用Cu作為管球的粉末X射線衍射中，在2θ(°)＝5.7附近、7.9附近、11.5附近、13.1附近以及17.9附近處顯示出峰。

(3-3)(3)中記載的化合物A的晶體，其特征在于，在采用Cu作為管球的粉末X射線衍射中，在2θ(°)＝5.7附近、7.9附近、8.3附近、8.9附近、9.2附近、11.5附近、12.5附近、13.1附近、15.8附近、16.3附近、16.7附近、17.2附近、17.9附近、18.5附近以及19.5附近處顯示出峰。

(3-4)(3)中記載的化合物A的晶體，其特征在于，在DSC分析中的吸熱峰的起始溫度為253℃附近，并且在采用Cu作為管球的粉末X射線衍射中，在2θ(°)＝5.7附近、7.9附近、11.5附近、13.1附近以及17.9附近處顯示出峰。

(3-5)(3)中記載的化合物A的晶體，其特征在于，在DSC分析中的吸熱峰的起始溫度為253℃附近，并且在采用Cu作為管球的粉末X射線衍射中，在2θ(°)＝5.7附近、7.9附近、8.3附近、8.9附近、9.2附近、11.5附近、12.5附近、13.1附近、15.8附近、16.3附近、16.7附近、17.2附近、17.9附近、18.5附近以及19.5附近處顯示出峰。

(4)(1-2)中記載的化合物A的甲磺酸鹽的晶體。

(4-1)(4)中記載的化合物A的甲磺酸鹽的晶體，其在DSC分析中的吸熱峰的起始溫度為192℃附近。

(4-2)(4)中記載的化合物A的甲磺酸鹽的晶體，其特征在于，在采用Cu作為管球的粉末X射線衍射中，在2θ(°)＝4.7附近、9.5附近、12.0附近、13.2附近、13.7附近、15.3附近、18.8附近、20.3附近、20.9附近以及22.8附近處顯示出峰。

(4-3)(4)中記載的化合物A的甲磺酸鹽的晶體，其特征在于，在DSC分析中的吸熱峰的起始溫度為192℃附近，并且在采用Cu作為管球的粉末X射線衍射中，在2θ(°)＝4.7附近、9.5附近、12.0附近、13.2附近、13.7附近、15.3附近、18.8附近、20.3附近、20.9附近以及22.8附近處顯示出峰。

(5-1)一種藥物組合物，其含有在(1)至(1-2)的任一項中記載的化合物、以及可藥用的賦形劑。

(5-2)一種藥物組合物，其含有在(2)至(4-3)的任一項中記載的晶體、以及可藥用的賦形劑。

(5-3)一種藥物組合物，其含有用于預防或治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的在(1)至(1-2)的任一項中記載的化合物、以及可藥用的賦形劑。

(5-4)一種藥物組合物，其含有用于預防或治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的在(2)至(4-3)的任一項中記載的晶體、以及可藥用的賦形劑。

(6-1)在(1)至(1-2)的任一項中記載的化合物在制造用于預防或治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的藥物組合物中的應用。

(6-2)在(2)至(4-3)的任一項中記載的晶體在制造用于預防或治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的藥物組合物中的應用。

(7-1)在(1)至(1-2)的任一項中記載的化合物，其用于預防或治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病。

(7-2)在(2)至(4-3)的任一項中記載的晶體，其用于預防或治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病。

(8-1)在(1)至(1-2)的任一項中記載的化合物用于預防或治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的應用。

(8-2)在(2)至(4-3)的任一項中記載的晶體用于預防或治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的應用。

(9-1)一種慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的預防或治療方法，包括將有效量的(1)至(1-2)的任一項中記載的化合物施用至對象。

(9-2)一種慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的預防或治療方法，包括將有效量的(2)至(4-3)的任一項中記載的晶體施用至對象。

此外，本發(fā)明也包含化合物A或其鹽所表示的化合物的藥學上可接受的前藥。藥學上可接受的前藥是指具有通過加溶劑分解或在生理條件下可轉化為羧基的基團的化合物。作為形成前藥的基團，例如可以舉出Prog.Med.,5,2157-2161(1985)及“醫(yī)藥品的開發(fā)”(廣川書店，1990年)第7卷分子設計163-198中記載的基團。

在本發(fā)明中，化合物A的鹽是指在藥學上可接受的鹽，有時形成酸加成鹽或與堿形成鹽。具體而言，可以舉出：與鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸，或與甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、扁桃酸、酒石酸、二苯甲酰酒石酸、二甲苯酰酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸等有機酸的酸加成鹽；與鈉、鉀、鎂、鈣、鋁等無機堿，或與甲胺、乙胺、乙醇胺、賴氨酸、鳥氨酸等有機堿的鹽；與乙酰亮氨酸等各種氨基酸及氨基酸衍生物的鹽、或銨鹽等。

此外，本發(fā)明還包含化合物A或其鹽的各種水合物或溶劑合物、以及多晶態(tài)物質。另外，本發(fā)明也包含用各種放射性或非放射性同位素標記的化合物A或其鹽。

本說明書中，粉末X射線衍射圖中的衍射角(2θ(°))以及DSC分析中的吸熱峰的起始溫度(℃)的記載中所含的“附近”表示在該數(shù)據(jù)測定法中包括通常上被容許的誤差范圍，從而大致上表示該衍射角以及吸熱峰的起始值。在粉末X射線衍射中的衍射角(2θ(°))的誤差范圍作為一個實施方式為±0.2°，作為另一個實施方式為±0.1°。在DSC分析中的吸熱峰的起始溫度(℃)的誤差范圍作為一個實施方式為±2℃，作為另一個實施方式為±1℃。

需要說明的是，對于粉末X射線衍射圖，在數(shù)據(jù)的性質上以及晶體的同一性認定上，晶格間隔或整體的圖案是重要的，衍射角以及衍射強度可根據(jù)晶粒生長方向、晶粒的大小或測定條件而略有變化。

(制造方法)

化合物A或其鹽可以利用基于其基本結構或者取代基的種類的特征，并應用各種公知的合成法制造。此時，根據(jù)官能團的種類，在從原料至中間體的階段將該官能團置換為適當?shù)谋Ｗo基(可容易地轉化為該官能團的基團)有時在制造技術上很有效。作為這樣的保護基，例如可以舉出：ウッツ(P.G.M.Wuts)及グリーン(T.W.Greene)著的“Greene's Protective Groups in Organic Synthesis(第四版),2006年”中記載的保護基等，只要根據(jù)這些反應條件適宜選擇使用即可。在這樣的方法中，可通過引入該保護基并進行反應后，根據(jù)需要除去保護基，從而得到期望的化合物。

另外，化合物A的前藥可通過與上述保護基同樣的方式在從原料至中間體的階段引入特定的基團、或者使用所得到的化合物A進一步進行反應來制造。反應可以通過應用通常的酯化、酰胺化、脫水等本領域技術人員公知的方法來進行。

下面，對化合物A的代表性的制造方法進行說明。各制法也可以參照該說明所附帶的參考文獻進行。需要說明的是，本發(fā)明的制造法不限定于以下示出的例子。另外，除非另有說明，在該制造方法的結構式中所示的符號中，同一符號表示相同的含義。

(第一制法)

[化學式10]

(式中，Ra為碳原子數(shù)為1至6的直鏈或支鏈狀的烷基，例如甲基、乙基等。)

式(I)所示的化合物A可通過通式(2)所示的化合物的水解來制造。在此，水解反應可參照前述“Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis(第4版、2006年)”而進行實施。

(原料合成)

原料制法1

[化學式11]

原料化合物(5)可通過化合物(3)和化合物(4)的酰胺化反應來制造。

該反應中，使用等量的或一方過量的化合物(3)和化合物(4)，在縮合劑的存在下，在對反應惰性的溶劑中，在從冷卻至加熱、優(yōu)選-20℃～60℃下通常攪拌0.1小時～5天。在此，作為溶劑沒有特別的限定，例如，可列舉出苯、甲苯或二甲苯等的芳香族烴類；二氯甲烷(DCM)、1,2-二氯乙烷(DCE)或氯仿等的鹵代烴類；二乙醚、四氫呋喃(THF)、二噁烷、二甲氧基乙烷(DME)等的醚類；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、乙酸乙酯、乙腈或水、或者它們的混合物。作為縮合劑，有時優(yōu)選使用1-[雙(二甲氨基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-1-鎓-3-氧化物六氟磷酸鹽(HATU)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺、二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)、1,1’-羰基二咪唑(CDI)、疊氮磷酸二苯酯、三氯氧磷、或者諸如PS-碳化二亞胺(PS-Carbodiimide)(アルゴノートテクノロジー(Argonaut Technologies)，美國)等擔載縮合劑的聚苯乙烯樹脂，但并不限定于這些。另外，有時使用諸如1-羥基苯并三唑(HOBt)等的添加劑對于反應是有利的，另外，為了使反應順利地進行，有時有利的是，在例如三乙胺(TEA)、N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)或N-甲基嗎啉(NMM)等有機堿，或者碳酸鉀、碳酸鈉或氫氧化鉀等無機堿的存在下進行反應。此外，為了除去反應結束后剩余的胺，可使用諸如PS-異氰酸酯(PS-Isocyanate)(アルゴノートテクノロジー，美國)等的擔載有異氰酸酯的聚苯乙烯樹脂。進而，為了除去反應結束后剩余的羧酸及前述的添加劑等，可使用諸如MP-碳酸酯(MP-Carbonate)(アルゴノートテクノロジー，美國)等的擔載有季銨鹽的聚苯乙烯樹脂。

另外，也可使用將化合物(3)衍生為反應性衍生物后，再使其與化合物(4)反應的方法。在此，作為化合物(3)的反應性衍生物，可列舉出與三氯氧磷、亞硫酰氯等的鹵化劑反應而得到的酰鹵化物；與氯甲酸異丁酯等反應而得到的混合酸酐、與HOBt等縮合而得到的活性酯等。這些反應性衍生物與化合物(4)的反應可在前述的鹵化烴類、芳香族烴類、醚類等對反應惰性的溶劑中，在冷卻～加熱下(優(yōu)選-20℃～60℃下)進行。

原料制法2

[化學式12]

(式中，X表示離去基團。)

原料化合物(2)可以通過化合物(5)和化合物(6)的烷基化反應來制造。

作為由X表示的離去基團的具體例子，包括鹵素、甲磺酰氧基、對甲苯磺酰氧基、三氟甲磺酰氧基等。

在該反應中，使用等量的或一方過量的化合物(5)和化合物(6)，在對反應惰性的溶劑中，或者無溶劑下，在冷卻至加熱回流下、優(yōu)選0℃～80℃下將它們的混合物通常攪拌0.1小時～10天。作為在此使用的溶劑的例子，沒有特別的限定，可列舉出苯、甲苯、二甲苯等的芳香族烴類；二乙醚、THF、二噁烷、DME等的醚類；DCM、DCE、氯仿等的鹵代烴類；DMF、DMSO、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、丙酮、乙酸乙酯、乙腈以及它們的混合物。為了使反應順利地進行，有時有利的是，在TEA、DIPEA或NMM等的有機堿，或者叔丁醇鉀、碳酸銫、碳酸鉀、碳酸鈉或氫氧化鉀等無機堿的存在下進行反應。

化合物A被分離、純化為游離化合物、它的鹽、水合物、溶劑合物、或多晶態(tài)物質?；衔顰的鹽可通過進行常規(guī)的成鹽反應而制備。

可通過應用萃取、分步結晶、各種分級層析法等常規(guī)的化學操作進行分離、純化。

可通過外消旋體的一般的光學拆分法(例如，誘導與光學活性的堿或酸形成非對映異構體鹽以便分步晶體、使用手性柱等的色譜法等)而得到光學異構體，另外，可由適當?shù)墓鈱W活性的原料化合物來制造光學異構體。

通過以下試驗確認化合物A的藥理活性。

試驗例1：大鼠EP4受體親和性評價試驗

大鼠EP4受體表達載體的構建：

將大鼠EP4受體基因(GenBank登錄號：NM_032076.1)導入到表達載體pcDNA3.1-V5-His-TOPO(Invitrogen)中。

大鼠EP4受體的瞬時表達：

將大鼠EP4受體的表達載體導入到HEK-293細胞(ATCC編號：CRL-1573)中。導入使用Lipofectoamine(注冊商標)2000試劑(Invitrogen)，并按照附帶的說明書進行。導入后通過α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)20至24小時。

膜組分的制備：

吸除培養(yǎng)基，在每15cm的培養(yǎng)皿中加入10ml的冷卻的磷酸緩沖生理鹽水(Phosphate buffered saline(PBS))，使用細胞刮刀(Sumitomo Bakelite)將細胞刮下。回收并離心(250x g、4℃、5min)細胞后，使其懸浮于每培養(yǎng)皿6ml的冷卻20mmol/L的Tris-HCl(pH7.4；ナカライテスク，包含5mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA，ナカライテスク))中，使用ポリトロン(注冊商標)進行勻漿，并將該均漿物離心(69,000x g，20min，4℃)。將所得的沉淀再次懸浮在冷的20mmol/L的Tris-HCl中，再次勻漿，并將該均漿物離心(69,000x g，20min，4℃)。將所得的沉淀懸浮于每個培養(yǎng)皿的1ml的50mmol/L的HEPES-NaOH(Dojindo Laboratories)(pH7.5)中，然后進行勻漿，將勻漿物作為膜組分在-80℃進行冷凍保存。此時，使用一部分用于蛋白質濃度的測定。使用Bio-Rad蛋白測定試劑盒(Bio-Rad Laboratories)進行蛋白質濃度的測定，并按照附帶的標準操作規(guī)程以一式兩份(duplicate)進行。

結合測定：

[³H]PGE2及膜組分通過測定緩沖液(50mmol/L HEPES-NaOH，10mmol/L MgCl₂，pH7.5)進行稀釋，被檢測化合物及未標記的PGE2(Cayman)通過DMSO及測定緩沖液進行稀釋。將反應液(200μL)的組成設為50mmol/L HEPES-NaOH(pH7.5)、10mmol/L MgCl₂、0.3nmol/L[³H]PGE2(Perkin Elmer)50μL、大鼠EP4細胞膜組分(200μg蛋白質/mL)100μL、以及被檢測化合物(最終濃度為0.1、0.3、1、3、10、30及100nmol/L)50μL。在非特異性結合測定中，添加未標記的PGE2(Cayman)而使其最終濃度為1μmol/L。將DMSO的最終濃度設為1％。將反應液在96孔微孔板(Sumitomo Bakelite)中于室溫下孵育1小時。采用FilterMate收集器通過濾紙UniFilter-96GF/B(Perkin Elmer)將反應液進行過濾。利用300μL/孔的冷卻的測定緩沖液將過濾后的濾紙洗凈3次后，再通過干燥機干燥一晚，加入50μL/孔的液體閃爍體MicroScint20(Perkin Elmer)。使用TopCount(Perkin Elmer)測定放射活性。測定全部以一式兩份(duplicate)實施1次。從總結合量中減去非特異性結合量從而求得特異性結合量。Ki值按照常規(guī)方法進行計算。

對于評價的結果，化合物A對大鼠EP4受體的Ki值為0.874nmol/L。需要說明的是，專利文獻1的實施例205的化合物對大鼠EP4受體的Ki值為140nmol/L。

試驗例2：人EP4受體親和性評價試驗

結合測定：

[³H]PGE2及人EP4細胞膜組分(Chemicon)通過測定緩沖液(50mmol/L HEPES-NaOH、5mmol/L MgCl₂，1mmol/L CaCl₂(pH7.4)、0.5％牛血清白蛋白(Bovine serum albumin(BSA))進行稀釋，被檢測化合物及未標記的PGE2(Sigma)通過DMSO及測定緩沖液進行稀釋。將反應液(250μL)的組成設為175μL的包含[³H]PGE2(最終濃度2.9nmol/L)的測定緩沖液、50μL的膜組分(Chemicon、40μg蛋白質/mL)、以及25μL的被檢測化合物(最終濃度為0.1、1、10、100及1000nmol/L)。在非特異性結合測定中，添加未標記的PGE2而使其最終濃度為10μmol/L。將DMSO的最終濃度設為1％。在25℃下將反應液進行孵育60分鐘。采用細胞收集器(ブランデル)通過濾紙GF/C(Whatman)將該反應液過濾。利用1ml的包含50mmol/L HEPES-NaOH(pH7.4)、500mmol/L NaCl、0.1％BSA的溶液將過濾后的濾紙洗凈3次。將濾紙GF/C置入測定小瓶中，加入5ml的液體閃爍體Atomlight。使用液體閃爍計數(shù)器(Perkin Elmer)測定放射活性。測定全部以一式兩份(duplicate)實施一次。從總結合量中減去非特異性結合量從而求得特異性結合量。Ki值按照常規(guī)方法進行計算。

對于評價的結果，化合物A對人EP4受體的Ki值為1.46nmol/L。

試驗例3：基于人Jurkat細胞中cAMP量測定的人EP4受體拮抗作用評價試驗

細胞培養(yǎng)：

使用添加有10％胎牛血清(fetal bovine serum(FBS))的RPMI1640培養(yǎng)基(產品編號11879020，Invitrogen)，在37℃、5％CO₂的條件下對Jurkat細胞(來自于人白血病T淋巴瘤)進行培養(yǎng)。使細胞增殖至匯合(Confluent)前，添加最終濃度為5μmol/L的吲哚美辛，進一步培養(yǎng)18小時。將該細胞回收至15ml的Spitz管中，通過セルバンカー(三菱化學ヤトロン)調制為1×10⁶個/ml，然后在-80℃進行保存。

化合物處理：

利用包含0.5％BSA的測定緩沖液(1×HBSS(漢克斯緩沖鹽溶液，日水制藥)、20mmol/L HEPES-NaOH(ナカライ)(pH 7.4)、0.5mmol/L IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、WAKO)、0.02％CHAPS(Sigma)、0.5％BSA(Sigma)和2μmol/L吲哚美辛(Sigma))將被檢測化合物稀釋調整為最終濃度的3倍的濃度。利用包含0.5％BSA的測定緩沖液將PGE2調整為300nm/L。將冷凍保存的Jurkat細胞在37℃下解凍，并利用包含0.5％BSA的測定緩沖液將其調制成1×10⁶個/ml。將被檢測化合物(最終濃度為0.01、0.03、0.1、0.3、1、3及10nmol/L)、細胞、PGE2以此順序以每孔5μL添加到384孔U型底黑色微孔板(コーニング)中，利用板振蕩器攪拌后，在室溫下孵育30分鐘。為求出PGE2非刺激狀態(tài)的cAMP的量，設計PGE 2未添加組。

cAMP量的測定及分析：

在cAMP的測定中，使用cAMP HiRange試劑盒(Cisbio international)。孵育后，將通過Lysis緩沖液(50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)、0.8mol/L KF、1％TritonX-100、0.2％BSA)稀釋為0.6倍的試劑盒的d2試劑以每孔5μL添加到各孔中，利用板振蕩器攪拌。接著，將通過Lysis緩沖液稀釋為0.6倍的試劑盒的銪穴狀化合物試劑以每孔5μL添加到各孔中，通過板振蕩器攪拌后，避光下于室溫孵育60分鐘。孵育后，使用ARVO1420(Perkin Elmer)測定穴狀化合物在620nm下的熒光強度，d2在665nm下的熒光強度。將標準曲線制作用的280、70、17.5、4.38、1.09、0.27、0.068nmol/L的cAMP分別添加至孔中，與上述同樣地測定熒光強度。測定全部以一式三份(triplicate)進行。將PGE2添加時的cAMP的量設為100％，將PGE2未添加時的cAMP的量設為0％，由化合物處理時的cAMP的量，通過Logistic回歸法算出化合物的IC₅₀值。由3次的實驗結果算出平均值。

對于評價的結果，在人Jurkat細胞中，化合物A對于基于PGE2(100nmol/L)的cAMP產生作用的IC₅₀值為0.16nmol/L。

試驗例4：基于cAMP量測定的大鼠EP4受體拮抗作用評價試驗

大鼠EP4受體表達載體的構建：

與試驗例1同樣地進行。

大鼠EP4受體穩(wěn)定表達細胞的構建：

將大鼠EP4受體的表達載體導入到CHO-K1細胞(ATCC編號：CCL-61)中。導入使用Lipofectoamine(注冊商標)2000試劑(Invitrogen)，并按照所附的說明書進行。在導入后用含有G418(ナカライテスク)的α-MEM培養(yǎng)基(產品編號12571063，Invitrogen)進行培養(yǎng)，從而取得耐藥性克隆。

細胞培養(yǎng)及化合物處理：

將穩(wěn)定表達大鼠EP4的CHO-K1細胞以0.5×10⁴個/100μL接種在96孔平板上，并進行徹夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)基替換為2μmol/L的吲哚美辛/0.5％BSA/α-MEM培養(yǎng)基，再過60分鐘后，替換為1mmol/L的IBMX/2μmol/L的吲哚美辛/0.5％BSA/α-MEM培養(yǎng)基。10分鐘后，添加被檢測化合物(最終濃度為0.1、0.3、1、3及10nmol/L)，再過10分鐘后，以最終濃度成為100nmol/L的方式添加PGE2(最終DMSO濃度為0.1％)。為了計算出基于PGE2添加的cAMP的生成量，設計PGE2未添加組。將細胞在CO₂培養(yǎng)箱(37℃，5％CO₂)中培養(yǎng)并進行反應。在30分鐘后除去培養(yǎng)基，添加0.2％的TritonX-PBS 100μL/孔從而裂解細胞。試驗以一式兩份(duplicate)實施2次。

cAMP量的測定及分析：

使用cAMP HiRange試劑盒測定細胞裂解液中所含的cAMP量。將各孔的細胞裂解液以每個10μL分別注入到384孔U型底黑色微孔板，再按d2試劑和銪穴狀化合物試劑的順序分別添加5μL后，在遮光下于室溫孵育60分鐘。孵育后，使用ARVO1420在620nm處測定穴狀化合物的熒光強度，在665nm處測定d2的熒光強度。將標準曲線制作用的280、70、17.5、4.38、1.09、0.27及0.068nmol/L的cAMP添加至各個孔中，與上述同樣地測定熒光強度。將添加最終濃度為100nmol/L的PGE2時的cAMP的量設為100％，將PGE2未添加時的cAMP的量設為0％，由被檢測化合物處理時的cAMP的量，通過Logistic回歸法算出被檢測化合物的IC₅₀值。由2次的實驗結果算出平均值。

對于評價的結果，在大鼠EP4受體表達CHO-K1細胞中，化合物A對于基于PGE2(100nmol/L)的cAMP產生作用的IC₅₀值為1.04nmol/L。

試驗例5：體內大鼠EP4受體拮抗作用評價試驗

將非禁食SD大鼠(雄性，6周齡)用于試驗。將溶解于PEG400:20％Tween80:1mol/L NaHCO₃水溶液＝1:4:5的混合液中的被檢測化合物以0.03mg/kg經口給藥(po)(5mL/kg)。1小時后，將溶解于生理鹽水的EP4激動劑ONO-4819的活性代謝物(ONO-AE1-437(CAS No.256382-23-7))以0.01mg/kg皮下給藥(sc)到背部(5mL/kg)。30分鐘后將脂多糖(LPS，0.01mg/kg)進行尾靜脈內給予(2mL/kg)，60分鐘后在麻醉下采集約0.5mL的血液到含有肝素的管中。通過離心操作(1000×g，10分鐘，4℃)從血液樣品中分離血漿。利用ELISA試劑盒(DuoSet ELISA，R&D Systems)測定血漿中的大鼠TNF-α濃度。將ONO-AE1-437未處理組(n＝5)的TNF-α的濃度設為抑制率100％，將ONO-AE1-437處理組(n＝5)的TNF-α的濃度設為抑制率0％，從而計算出被檢測化合物組(n＝5)對于EP4激動劑的TNF-α產生抑制作用的抑制率。

對于評價的結果，化合物A(0.03mg/kg，po)抑制了38％的EP4激動劑ONO-AE1-437(0.01mg/kg，sc)的TNF-α產生抑制作用。

試驗例6：對于大鼠血漿中腎素活性的作用評價試驗

將非禁食SD大鼠(雄性，7周齡)用于試驗。將溶解于PEG400:20％Tween80:1mol/L NaHCO₃水溶液＝1:4:5的混合液中的被檢測化合物以0.3mg/kg經口給藥(5mL/kg)。1小時后，將溶解于生理鹽水的EP4激動劑ONO-4819的活性代謝物(ONO-AE1-437)以0.01mg/kg皮下投藥到背部(5mL/kg)。10分鐘后在無麻醉下斷頭并采集約2mL的血液到含有3mg的EDTA·2Na的管中。通過離心操作(1000×g，10分鐘，4℃)將血漿從血液樣品中分離。將10μL的測定緩沖液(用蒸餾水將20.4mL的2mol/L的NaH₂PO₄、9.3mL的1mol/L的Na₂HPO₄、15mL的0.5mol/L的EDTA·2Na、0.1g的CHAPS混合并稀釋為50mL，PH 5.55)及1μL的100mmol/L的4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽添加到100μL的血漿中。分取一半的量在37℃下孵育90分鐘。剩下的一半的量在4℃下保存并作為空白反應用。通過ELISA法測定兩個樣品中的血管緊張素(Angiotensin)I的濃度，將37℃孵育樣品的值減去空白反應的值而得的濃度作為血漿中腎素活性(plasma renin activity(PRA))。將ONO-AE1-437未處理組(n＝5)的PRA設為抑制率100％，將ONO-AE1-437處理組(n＝4)的PRA設為抑制率0％，從而計算出被檢測化合物組(n＝4)的抑制率。

對于評價的結果，化合物A(0.3mg/kg，po)抑制了102％的基于EP4激動劑ONO-AE1-437(0.01mg/kg，sc)的PRA上升。

試驗例7：對于2型糖尿病db/db小鼠的尿中白蛋白的效果檢驗試驗

在試驗中使用2型糖尿病db/db小鼠(雄性，8周齡)。采集24小時尿液，通過使用抗小鼠白蛋白抗體(RAM/Alb/7S、Nordic Immunology)的ELISA法測定所得尿液樣本的白蛋白濃度，并使用CRE-EN康佳諾(カイノス)測定尿液中肌酐濃度。計算出尿液中白蛋白-肌酐比(ACR)，以不偏重ACR的方式進行分組成為被檢測化合物非處理組(n＝12)及被檢測化合物處理組(n＝12)。1日1次并持續(xù)1周地將懸濁于0.5％的甲基纖維素(MC)溶液的被檢測化合物以0.3mg/kg經口給藥至被檢測化合物處理組(10mL/kg)。1日1次并持續(xù)1周地將0.5％的MC溶液以10mL/kg的給藥劑量經口給藥至被檢測化合物非處理組。在最終給藥結束后實施24小時尿液采集，將計算出的ACR作為指標檢驗被檢測化合物對于2型糖尿病小鼠的早期腎病的改善效果。求得將被檢測化合物非處理組的ACR值設為100％時的被檢測化合物處理組的ACR的抑制率。

對于評價的結果，化合物A(0.3mg/kg，po)通過一周時間的經口投藥從而抑制了44％的2型糖尿病db/db小鼠的ACR。

試驗例8：對于5/6腎臟摘除(5/6Nx)慢性腎功能衰竭大鼠的腎功能的效果檢驗試驗

在試驗中使用Wistar大鼠(雄性，8周齡)。在戊巴比妥麻醉下切除左腎的三分之二，并在一周后把整個右腎摘除(5/6Nx)。在5/6Nx的兩周時間后，采集24小時尿液，使用Bio-Rad蛋白測定試劑盒測定所得尿液樣本的尿蛋白濃度，并使用デタミナーL CRE(協(xié)和メデックス)測定尿液中的肌酐濃度。計算出尿液中尿蛋白-肌酐比(UPCR)，以不偏重UPCR的方式進行分組成為被檢測化合物非處理組(n＝12)及被檢測化合物處理組(n＝12)。其后，1日1次并持續(xù)6周地將懸濁于0.5％的MC溶液的被檢測化合物以0.2mg/kg經口給藥至被檢測化合物處理組(5mL/kg)。1日1次并持續(xù)6周地將0.5％的MC溶液以5mL/kg的給藥劑量經口給藥至被檢測化合物非處理組。在最終給藥結束后實施24小時尿液采集，將計算出的UPCR作為指標檢驗被檢測化合物對于慢性腎功能衰竭大鼠的腎功能的改善效果。求得將被檢測化合物非處理組的UPCR設為100％時的被檢測化合物處理組的UPCR的抑制率。

對于評價的結果，化合物A(0.2mg/kg，po)通過6周時間的經口投藥從而抑制了47％的5/6腎臟摘除慢性腎功能衰竭大鼠的UPCR。

試驗例9：對于大鼠EP1/EP2/EP3受體的受體拮抗作用評價試驗(選擇性試驗)

評價化合物A對于來自大鼠的PGE2受體的其它亞型(EP1、EP2、EP3)的拮抗作用。對于EP1及EP3來說以細胞內Ca²⁺的量為指標，對于EP2來說以細胞內cAMP的量為指標，從而檢驗被檢測化合物的作用。

大鼠EP1、EP2或EP3受體表達載體的構建：

將大鼠EP1受體基因(GenBank登錄編號：D88751.1)、大鼠EP2受體基因(GenBank登錄編號：NM_031088.1)、或大鼠EP3受體基因(GenBank登錄編號：NM_012704.1)分別導入到表達載體pcDNA3.1-V5-His-TOPO(Invitrogen)。

大鼠EP1、EP2或EP3受體穩(wěn)定表達細胞的構建：

將大鼠EP1、EP2或EP3受體的表達載體導入到HEK-293細胞(大鼠EP1或EP3受體穩(wěn)定表達用，ATCC編號：CRL-1573)或CHO-K1細胞(大鼠EP2受體穩(wěn)定表達用，ATCC編號：CCL-61)。導入使用Lipofectoamine(注冊商標)2000試劑(Invitrogen)，并按照附帶的說明書進行。導入后通過含有G418(ナカライテスク)的D-MEM培養(yǎng)基(大鼠EP1或EP3受體穩(wěn)定表達用)(產品編號11885084，Invitrogen)或含有G418的α-MEM培養(yǎng)基(大鼠EP2受體穩(wěn)定表達用)進行細胞培養(yǎng)，從而取得耐藥性克隆。

EP2受體穩(wěn)定表達細胞的培養(yǎng)及化合物處理：

將穩(wěn)定表達大鼠EP2的CHO-K1細胞以1×10⁴個/100μL接種在96孔平板上，使用添加有10％的FBS的α-MEM培養(yǎng)基在37℃及5％CO₂的條件下進行徹夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)基替換為2μmol/L的吲哚美辛/0.1％BSA/α-MEM培養(yǎng)基，再過60分鐘后，替換為1mmol/L的IBMX/2μmol/L的吲哚美辛/0.1％BSA/α-MEM培養(yǎng)基(產品編號12571063，Invitrogen)。10分鐘后，添加被檢測化合物(最終濃度為0.01、0.1、1及10μmol/L)，再過10分鐘后，以最終濃度成為100nmol/L的方式添加PGE2(最終DMSO濃度為0.1％)。為了計算出基于PGE2添加的cAMP的生成量，設計PGE2未添加組。使細胞在CO₂培養(yǎng)箱(37℃，5％CO₂)中培養(yǎng)并反應。在30分鐘后除去培養(yǎng)基，添加0.2％的TritonX-PBS 100μL/孔從而裂解細胞。試驗一式兩份(duplicate)實施1次。

EP2受體穩(wěn)定表達細胞內的cAMP量的測定及分析：

與試驗例4同樣地，使用cAMP HiRange試劑盒測定細胞裂解液中所含的cAMP量。將最終濃度為100nmol/L的PGE2添加時的cAMP的量設為100％，將PGE2未添加時的cAMP的量設為0％，算出被檢測化合物處理時的cAMP的量的比例。

對于評價的結果，對于大鼠的EP2受體介導的基于PGE2的細胞內cAMP量的增加，化合物A直到10,000nmol/L顯示出了50％以上的抑制作用。

EP1及EP3受體穩(wěn)定表達細胞的培養(yǎng)及化合物處理：

將穩(wěn)定表達大鼠EP1或大鼠EP3的HEK-293細胞以1×10⁴個/100μL接種在96孔平板上，使用添加有10％的FBS的D-MEM培養(yǎng)基在37℃及5％CO₂的條件下進行徹夜培養(yǎng)。按照70:1的比例將Ca3測定試劑盒(モレキュラーデバイス)的熒光試劑染料添加到測定緩沖液(1xHBSS，20mmol/L的HEPES-NaOH(pH7.4)，0.6mg/mL的丙磺舒，0.1％BSA)中。將培養(yǎng)基替換為這種稀釋的染料溶液，孵育3小時。向其添加溶解于DMSO及上述測定緩沖液的化合物(最終濃度為1及10μmol/L)。5分鐘后以最終濃度成為100nmol/L的方式添加PGE2(最終DMSO濃度1％)。對于使用大鼠EP1或大鼠EP3受體穩(wěn)定表達細胞的試驗，分別以一式兩份(duplicate)實施1次。

EP1或EP3受體穩(wěn)定表達細胞內的Ca²⁺濃度的測定及分析：

以染料的熒光強度為指標使用FLIPR tetra(モレキュラーデバイス)測定細胞內的Ca²⁺濃度。為了測定根據(jù)PGE2添加的細胞內的Ca²⁺濃度，設計PGE2未添加組。將最終濃度100nmol/L的PGE2添加時的Ca²⁺濃度設為100％，將PGE2未添加時的Ca²⁺濃度設為0％，從而計算出化合物處理時的Ca²⁺濃度的比例。

對于評價的結果，對于大鼠的EP1或EP3受體介導的基于PGE2的細胞內Ca²⁺濃度的上升，化合物A直到10,000nmol/L顯示出了50％以上的抑制作用。

試驗例10：對于大鼠胃腸功能障礙的評價

使用SD大鼠(雄性，7周齡)。將溶解在PEG400:20％Tween 80:1mol/L的NaHCO₃水溶液＝1:4:5的混合液中的被檢測化合物以3mg/kg經口給藥7天(n＝5，5mL/kg)。再將上述混合液以5mL/kg的給藥劑量經口給藥到被檢測藥非處理組(n＝5)7天。在最終給藥的第二日在徹夜禁食下采集血液學/血液化學的檢查用的血液。血液采集后，立刻解剖通過放血而安樂死的動物，摘除胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、肝臟。將摘除的器官固定在10％中性緩沖福爾馬林溶液中，用于組織病理學評估。

對于評價的結果，沒有確認到化合物A表現(xiàn)出異常。

上述試驗的結果確認了：化合物A具有EP4受體親合性，并表現(xiàn)出優(yōu)異的EP4受體拮抗作用。確認了化合物A抑制了EP4激動劑誘發(fā)的PRA上升(試驗例6)。在對于2型糖尿病db/db小鼠的尿中白蛋白的效果檢驗試驗，以及對于5/6腎臟摘除(5/6Nx)慢性腎功能衰竭大鼠的腎功能的效果檢驗試驗中，確認了化合物A具有改善的效果(試驗例7、8)。

因此，化合物A或其鹽可用于慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的預防或治療等。

從試驗例1的結果可知，相比于專利文獻1的實施例205，化合物A示出了優(yōu)異的EP4受體親和性。從上述試驗例10的結果進一步示出了，化合物A為引發(fā)胃腸道功能障礙的擔憂較小的化合物。

上述試驗的結果確認了化合物A或其鹽具有EP4受體拮抗作用，可用作EP4參與的各種疾病的預防或治療用藥物組合物等的有效成分。作為EP4參與的各種疾病，例如，可列舉出腎病(例如腎硬化、痛風性腎病、多囊腎、腎病綜合征、急性腎炎、復發(fā)性血尿、持續(xù)性血尿、慢性腎炎、急進性腎炎、急性腎功能衰竭、慢性腎功能衰竭、糖尿病腎病、巴特綜合征等)、炎癥性皮膚病(例如曬傷、燒傷、濕疹、皮炎等)、由動脈硬化癥所引起的缺血性心臟病(例如心肌梗塞、心絞痛等)、由動脈硬化癥所引起的腦血管疾病(例如腦中風、包括腔隙性腦梗死的腦中風、腦血栓、腦出血、蛛網膜下腔出血、腦梗塞等)、消化性潰瘍(例如胃潰瘍、十二指腸潰瘍等)、惡性腫瘤及其轉移(例如結腸癌、乳腺癌等)、疼痛(例如術后急性疼痛、外傷性疼痛、拆線后疼痛、頸臂疼痛、肩周炎、變形性關節(jié)炎(OA)、腕管綜合征、慢性類風濕性關節(jié)炎(RA)、術后慢性疼痛、間質性膀胱炎、膀胱疼痛綜合征、非細菌性慢性前列腺炎(CP/CPPS)、脊髓損傷后疼痛、腦梗塞后疼痛、多發(fā)性硬化癥(疼痛)、帕金森氏病的疼痛、糖尿病性神經性疼痛、皰疹后疼痛、HIV神經性疼痛、三叉神經痛、纖維肌痛癥、腰痛癥(包括傷害性、神經性在內的腰痛全體)、腰椎管狹窄癥、脊椎疾病的疼痛(除腰椎管狹窄癥、脊髓損傷以外)、丘腦性疼痛、偏頭痛、頭痛、不安腿(不寧腿)綜合征、癌性疼痛、腸易激綜合征)等，特別是慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病等的腎病。

另外，化合物A或其鹽可用作治療和/或預防以下疾病的藥劑，所述疾病包括：各種的水腫(例如心源性水腫、腦水腫等)、諸如惡性高血壓癥等的高血壓、經前期綜合征、尿路結石、由急性或慢性疾病引起的尿乏癥、高磷血癥等。

進而，化合物A或其鹽可用作治療和/或預防以下疾病的藥劑，所述疾病包括：各種的多尿癥(例如中樞性尿崩癥、腎性尿崩癥、心因性尿崩癥、糖尿病、氯化鈉吸收障礙、煩渴等)。

含有化合物A或其鹽作為有效成分的醫(yī)藥組合物可以使用本領域通常使用的賦形劑(即藥用賦形劑或藥用載體等)并通過通常使用的方法來制備。

給藥可以為利用片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液體制劑等的經口給藥，或者利用關節(jié)內、靜脈內、肌肉內等的注射劑、栓劑、滴眼劑、眼軟膏、經皮用液體制劑、軟膏劑、經皮貼劑、經粘膜液體制劑、經粘膜貼劑、吸入劑等的非經口給藥中的任意一種形式。

作為用于經口給藥的固體組合物，可使用片劑、散劑、顆粒劑等。在這樣的固體組合物中，可將有效成分與至少1種惰性賦形劑混合。組合物可以根據(jù)常規(guī)方法含有惰性添加劑，例如潤滑劑或崩解劑、穩(wěn)定劑、溶解助劑。片劑或丸劑可以根據(jù)需要用糖衣或胃溶性或者腸溶性物質的膜進行包衣。

用于經口給藥的液體組合物含有可藥用的乳濁劑、溶液劑、懸濁劑、糖漿劑或酏劑等，且含有一般所用的惰性稀釋劑，例如純水或乙醇。該液體組合物除惰性稀釋劑以外，也可含有如可溶化劑、濕潤劑、懸濁劑之類的輔助劑、甘味劑、風味劑、芳香劑、防腐劑。

用于非經口給藥的注射劑含有無菌的水性或非水性溶液劑、懸濁劑或乳濁劑。作為水性的溶劑，包含例如注射用蒸餾水或生理食鹽水。作為非水性的溶劑，有例如乙醇之類的醇類。這樣的組合物還可以進一步含有等滲劑、防腐劑、濕潤劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定化劑、或溶解輔助劑。它們(例如)通過細菌保留過濾器來過濾、通過殺菌劑的配合或照射而無菌化。另外，它們也可以制造無菌固體組合物，且于使用前溶解或懸濁于無菌水或無菌的注射用溶劑來使用。

外用劑包含軟膏劑、硬膏劑、霜劑、膠狀劑、糊劑、噴霧劑、洗劑、點眼劑、眼軟膏等。含有一般所用的軟膏基劑、洗劑基劑、水性或非水性的液體制劑、懸濁劑、乳劑等。

吸入劑或經鼻劑等的經黏膜劑可使用固體、液體、或半固體狀，可根據(jù)以往公知的方法來制造。也可以適當添加例如公知的賦形劑、或進一步適當添加pH調整劑、防腐劑、表面活性劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑或增黏劑等。給藥可使用用于適當?shù)奈牖虼邓偷难b置。例如，可使用計量給藥吸入裝置等的公知裝置或噴霧器，將化合物單獨地或作為配方后的混合物的粉末來給藥、或者可以將化合物與可藥用的載體組合后作為溶液或懸浮液來給藥。干燥粉末吸入器等可為單次或多次給藥用吸入器，可利用干燥粉末或含有粉末的膠囊?；蚩蔀榧訅簹馊苣z噴霧等的方式，其使用適當?shù)膾伾鋭?，例如氯氟烷烴或二氧化碳等的適合的氣體。

通常經口給藥時，1天的給藥量按體重約為0.001～100mg/kg，優(yōu)選為0.1～30mg/kg，更優(yōu)選為0.1～10mg/kg，并將該給藥量1次服用或分2次～4次服用。靜脈內給藥時，1天的給藥量按體重約為0.0001～10mg/kg是適當?shù)模⒃摻o藥量每日一次或分為多次給藥。而且，使用經粘膜劑時，按體重約為0.001～100mg/kg，每日一次或分多次給藥。應考慮癥狀、年齡、性別等，根據(jù)每個患者的情況，來適當?shù)貨Q定給藥量。

雖然根據(jù)給藥路徑、劑形、給藥部位、賦形劑或添加劑的種類而不同，但本發(fā)明的醫(yī)藥組合物含有0.01～100重量％、作為某一方式含有0.01～50重量％的有效成分即1種或其以上的化合物A。

化合物A可以與認為化合物A示出有效的那些疾病的各種治療劑或預防劑并用。在并用時，可以同時給藥，或者分別連續(xù)給藥、或按所希望的時間間隔給藥。同時給藥時的制劑可以是配合劑，也可以分別制成制劑。

實施例

以下，基于實施例，對式(1)所示的化合物A或其鹽的制造方法進一步進行詳細的說明?；衔顰或其鹽的制造方法并不只限定于以下所示的具體的實施例的制造方法(步驟)，也可通過本領域技術人員不言自明的方法進行制造。

需要說明的是，通過以下的方法進行DSC分析及粉末X射線衍射。

(1)DSC分析

使用TA Instruments制的Q1000及Q2000進行DSC分析。將約2mg試樣填充到專用的鋁制試樣盤中，在不將試樣盤蓋住的狀態(tài)下在氮氣氣氛(50mL/分鐘)中，以室溫至300℃為測定范圍，在10℃/分鐘的升溫速度下連續(xù)地測定并記錄在試樣和參考樣(空的鋁制試樣盤)之間發(fā)生的熱量變化。需要說明的是，按照各裝置所指示的方法及順序從而操作包含數(shù)據(jù)處理的裝置。

(2)粉末X射線衍射

使用RINT-TTRII，在管球為Cu、管電流為300mA、管電壓為50kV、取樣寬度為0.020°、掃描速度為4°/分鐘、波長為測定衍射角范圍(2θ)為2.5至40°的條件下進行粉末X射線衍射的測定。需要說明的是，按照各裝置所指示的方法及順序從而操作包含數(shù)據(jù)處理的裝置。

另外，在實施例中使用以下縮寫。ESI+：在ESI-MASS中的m/z值；NMR-DMSO-d₆：在DMSO-d₆中的¹HNMR中的峰δ(ppm)。

需要說明的是，為方便起見，濃度mol/L以M來表示。例如，1M氫氧化鈉水溶液的意思是1mol/L的氫氧化鈉水溶液。

實施例1

4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(異喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸(I)的合成。

步驟1.

4-[(1S)-1-{[(4-溴-3-甲基-1H-吡唑-5-基)羰基]氨基}乙基]苯甲酸甲酯(5a)的合成

[化學式13]

將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺(1.2mL)添加到4-溴-3-甲基-1H-吡唑-5-羧酸(3)(1.00g)、DMF(20mL)、4-[(1S)-1-氨基乙基]苯甲酸甲酯鹽酸鹽(1.26g)、HOBT(0.99g)的混合物中，在室溫下徹夜攪拌。向混合物中添加乙酸乙酯，在冰冷下攪拌。向混合物中添加10％檸檬酸水溶液，分離為有機層及水層，采用乙酸乙酯萃取水層。將所得的有機層合并，并依次采用飽和碳酸氫鈉水溶液、水、飽和食鹽水進行洗凈，采用無水硫酸鎂干燥，并過濾。將濾液減壓濃縮，得到4-[(1S)-1-{[(4-溴-3-甲基-1H-吡唑-5-基)羰基]氨基}乙基]苯甲酸甲酯(5a)(1.75g)。

ESI+：366，368

步驟2.

4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(異喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸甲酯(2a)的合成

[化學式14]

將4-[(1S)-1-{[(4-溴-3-甲基-1H-吡唑-5-基)羰基]氨基}乙基]苯甲酸甲酯(5a)(1.72g)和DMF(20.0mL)的混合物在冰冷下攪拌。向混合物中添加叔丁醇鉀(580mg)，攪拌0.5小時。向混合物中添加3-(溴甲基)異喹啉(1.10g)和DMF(14mL)的混合物，升溫至室溫并攪拌10天。將所得的混合物在冰冷下攪拌，添加乙酸乙酯、10％檸檬酸水溶液，過段時間后攪拌，采用乙酸乙酯進行萃取。將所得的有機層依次采用飽和碳酸氫鈉水溶液、水、飽和食鹽水進行洗凈，采用無水硫酸鎂干燥，并過濾。將濾液減壓濃縮，采用硅膠柱色譜法(正己烷:乙酸乙酯＝6:4)精制殘渣，得到4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(異喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸甲酯(2a)(518mg)。

NMR-DMSO-d₆：9.28(1H,d,J＝7.8Hz),9.23(1H,s),8.13(1H,d,J＝7.8Hz),7.89(1H,d,J＝7.8Hz),7.81-7.76(1H,m),7.72-7.64(3H,m),7.50(1H,s),7.38(2H,d,J＝8.3Hz),5.65-5.54(2H,m),5.12-5.04(1H,m),3.83(3H,s),2.17(3H,s),1.37(3H,d,J＝7.0Hz)。

步驟3.

4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(異喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸(I)的合成

[化學式15]

在冰冷下將2M氫氧化鈉水溶液(5.0mL)添加到4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(異喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸甲酯(2a)(486mg)、THF(10.0mL)、甲醇(10.0mL)的混合物中，在室溫下攪拌17小時。在冰冷下將1M鹽酸(10.0mL)添加到混合物中，升溫至室溫，并攪拌2小時。濾取析出的固體，用水洗凈從而得到了作為晶體的4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(異喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸(I)(411mg)。

ESI+：493，495

NMR-DMSO-d₆：12.9-12.7(1H,m),9.30(1H,d,J＝7.8Hz),9.24(1H,s),8.13(1H,d,J＝8.1Hz),7.91(1H,d,J＝8.1Hz),7.81-7.76(1H,m),7.74-7.66(3H,m),7.53(1H,s),7.40(2H,d,J＝8.2Hz),5.60(2H,s),5.14-5.03(1H,m),2.16(3H,s),1.37(3H,d,J＝7.0Hz)。

元素分析：C24H21BrN4O3的計算值：C，58.43；H，4.29；N，11.36；Br，16.20。

實測值：C，58.33；H，4.38；N，11.24；Br，16.07。

采用Cu作為管球對實施例1的步驟3中所得的晶體進行粉末X射線衍射測定，其結果為得到了包含2θ(°)＝5.7、7.9、8.3、8.9、9.2、11.5、12.5、13.1、15.8、16.3、16.7、17.2、17.9、18.5及19.5的峰的衍射圖。

從實施例1的步驟3中所得的晶體的DSC分析的結果可知，吸熱峰的起始溫度為253℃。

實施例2

4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(異喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸甲磺酸鹽(Ia)的合成

[化學式16]

在冰冷下將甲磺酸(140μL)添加到4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(異喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸(I)(1000.0mg)、二噁烷(30mL)的混合物中。將所得的混合物升溫至90℃，攪拌1小時。放置冷卻至室溫后，濾取析出的固體，得到了作為晶體的4-[(1S)-1-({[4-溴-1-(異喹啉-3-基甲基)-3-甲基-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸甲磺酸鹽(Ia)(1030mg)。

ESI+：493，495

NMR-DMSO-d₆：9.32(1H,s),9.27(1H,d,J＝7.7Hz),8.17(1H,d,J＝7.9Hz),7.95(1H,d,J＝7.9Hz),7.90-7.79(1H,m),7.77-7.66(3H,m),7.59(1H,s),7.40(2H,d,J＝7.8Hz),5.71-5.54(2H,m),5.16-5.00(1H,m),2.33(3H,s),2.17(3H,s),1.37(3H,d,J＝7.1Hz)。

元素分析：C24H21BrN4O3.CH4O3S的計算值：C，50.94；H，4.27；N，9.50；S，5.44；Br，13.56。

實測值：C，50.65；H，4.25；N，9.36；S，5.41；Br，13.42。

采用Cu作為管球對實施例2中所得的晶體進行粉末X射線衍射測定，其結果為得到了包含2θ(°)＝4.7、9.5、12.0、13.2、13.7、15.3、18.8、20.3、20.9及22.8的峰的衍射圖。

從實施例2中所得的晶體的DSC分析的結果可知，吸熱峰的起始溫度為192℃。

工業(yè)實用性

化合物A或其鹽具有EP4受體拮抗作用，可以作為預防和/或治療慢性腎功能衰竭和/或糖尿病腎病的藥物組合物的有效成分而使用。