諸如具有6個(gè)碳或6個(gè)以下碳的小的二羧酸的有機(jī)化合物是商業(yè)上重要的具有許多用途的化學(xué)品。例如，小的二酸包括1,4-二酸，如琥珀酸、蘋果酸和酒石酸，及5碳分子衣康酸。其他二酸包括二碳草酸、三碳丙二酸、五碳戊二酸和6碳己二酸，也存在這類二酸的許多衍生物。作為一個(gè)組，小的二酸具有一些化學(xué)相似性，它們?cè)诰酆衔锷a(chǎn)中的使用可以為樹(shù)脂提供特化性質(zhì)。這種通用性使得它們能夠容易地契合下游化學(xué)基礎(chǔ)市場(chǎng)。例如，1,4-二酸分子滿足大規(guī)?；瘜W(xué)品馬來(lái)酐的許多用途，因?yàn)樗鼈冝D(zhuǎn)化為多種工業(yè)化學(xué)品(四氫呋喃、丁內(nèi)酯、1,4-丁二醇、2-吡咯烷酮)及琥珀酸衍生物琥珀酰胺、琥珀腈、二氨基丁烷和琥珀酸酯。酒石酸在食品、皮革、金屬和印刷工業(yè)中具有許多用途。衣康酸形成用于產(chǎn)生3-甲基吡咯烷酮、甲基-BDO和甲基-THF等的原材料。尤其是，琥珀酸或丁二酸(這些術(shù)語(yǔ)在本文中可互換使用)引起了相當(dāng)大的興趣，因?yàn)樗言谑称?、化學(xué)和藥物工業(yè)中用作許多工業(yè)上重要的化學(xué)品的前體。事實(shí)上，來(lái)自美國(guó)能源部的報(bào)告報(bào)道，琥珀酸是從生物量制造的前12種化學(xué)構(gòu)件之一。因此，在細(xì)菌中產(chǎn)生二酸的能力將具有顯著的商業(yè)重要性。WO-A-2009/024294公開(kāi)了產(chǎn)琥珀酸細(xì)菌菌株，該菌株是巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)成員，最初分離自瘤胃，能夠利用甘油作為碳源，從其衍生的變體和突變菌株保留該能力，尤其是保藏于DSMZ(德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH),Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,德國(guó))的命名為DD1的細(xì)菌菌株，其具有保藏號(hào)DSM18541(ID06-614)，且具有產(chǎn)生琥珀酸的能力。如Kuhnert等,2010所分類，DD1菌株屬于物種Basfiasucciniciproducens和巴斯德氏菌科。這些菌株的突變(其中破壞了ldhA基因和/或pflD或pflA基因)公開(kāi)于WO-A-2010/092155中，這些突變菌株的特征在于，與WO-A-2009/024294中公開(kāi)的DD1野生型相比，在厭氧條件下，從諸如甘油或甘油和糖類(如麥芽糖)的碳源產(chǎn)生的琥珀酸顯著增加。但是，在用諸如WO-A-2009/024294或WO-A-2010/092155中公開(kāi)的那些的細(xì)菌菌株來(lái)產(chǎn)生諸如琥珀酸的有機(jī)化合物時(shí)，將碳源轉(zhuǎn)化為希望得到的有機(jī)化合物的選擇性以及希望得到的有機(jī)化合物的產(chǎn)率仍可以改進(jìn)。此外，已觀察到，在使用現(xiàn)有技術(shù)的細(xì)菌菌株時(shí)，有時(shí)難以在發(fā)酵過(guò)程結(jié)束時(shí)從發(fā)酵液分離生物質(zhì)。通常，發(fā)酵產(chǎn)生諸如琥珀酸的有機(jī)化合物包括以下步驟：在適宜的培養(yǎng)條件下在包含至少一種可同化碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，以允許該微生物產(chǎn)生希望得到的有機(jī)化合物，隨后從發(fā)酵液回收該有機(jī)化合物，其中在回收過(guò)程的第一個(gè)步驟中，通常通過(guò)例如沉降或離心來(lái)將微生物(即生物質(zhì))從培養(yǎng)基分離。在使用現(xiàn)有技術(shù)的微生物時(shí)，不能容易地從發(fā)酵液分離生物量，其(因?yàn)椴糠职l(fā)酵液以某種方式包封在生物質(zhì)中)有時(shí)導(dǎo)致某個(gè)量的發(fā)酵液的損失(從而也導(dǎo)致某個(gè)量的希望得到的有機(jī)化合物的損失)。因此本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的劣勢(shì)。具體而言，本發(fā)明的目的是提供微生物，該微生物可以用于發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)化合物(如琥珀酸)，且不僅從可同化的碳源(如甘油、葡萄糖、蔗糖、木糖、乳糖、果糖或麥芽糖)大量(優(yōu)選僅有少量副產(chǎn)物)產(chǎn)生希望得到的有機(jī)產(chǎn)物(如琥珀酸)，還可以在隨后回收有機(jī)化合物的過(guò)程中容易地從發(fā)酵液分離，僅少量發(fā)酵液包封在生物質(zhì)中。通過(guò)修飾微生物來(lái)為達(dá)到上述目的提供貢獻(xiàn)，與其野生型相比，該修飾微生物具有降低的wcaJ基因編碼的酶的活性。尤其通過(guò)其中已缺失wcaJ基因或其部分，或其中已缺失wcaJ基因的調(diào)節(jié)元件或至少其部分，或其中已在wcaJ基因中引入至少一個(gè)突變的修飾微生物來(lái)提供促成達(dá)到上述目的。令人驚奇地，已發(fā)現(xiàn)，例如通過(guò)缺失wcaJ基因或其部分來(lái)降低wcaJ基因編碼的酶(此酶可能是葡萄糖轉(zhuǎn)移酶)的活性，產(chǎn)生了這樣的微生物，與其中此酶活性未降低的相應(yīng)微生物相比，該微生物可以于在合適的培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生諸如琥珀酸的有機(jī)化合物之后，更容易地作為生物質(zhì)從培養(yǎng)基分離。在使用本發(fā)明的修飾微生物時(shí)，更少的發(fā)酵液包封在純化過(guò)程中分離的生物質(zhì)中，這意味著用于發(fā)酵過(guò)程的每克生物質(zhì)可以獲得更高量的發(fā)酵液(從而獲得更高量的希望得到的有機(jī)化合物，如琥珀酸)，從該發(fā)酵液分離有機(jī)化合物。在表述“與其野生型相比具有降低的x基因編碼的酶的活性的修飾微生物”(其中x基因是fruA基因，及可選地，后文所述的ldhA基因、pflA基因和/或pflD基因)的背景中，術(shù)語(yǔ)“野生型”指其中x基因編碼的酶的活性未降低的微生物，即指其基因組以引入x基因的遺傳修飾之前的狀態(tài)存在的微生物。優(yōu)選地，表述“野生型”指其基因組尤其是其x基因以由于進(jìn)化而天然產(chǎn)生的狀態(tài)存在的微生物(例如細(xì)菌、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞等)。該術(shù)語(yǔ)用于整個(gè)微生物和單個(gè)基因二者。因此，術(shù)語(yǔ)“野生型”優(yōu)選尤其不涵蓋已借助重組方法至少部分人為修飾其基因序列的那些微生物或那些基因。因此術(shù)語(yǔ)“修飾微生物”包括這樣的微生物，該微生物已進(jìn)行遺傳改變、修飾或改造(例如遺傳改造)，使得它與它所衍生自的天然存在的野生型微生物相比顯示改變的、修飾的或不同的基因型和/或表型(例如，在遺傳修飾影響微生物的編碼核酸序列時(shí))。根據(jù)本發(fā)明的修飾微生物的具體的優(yōu)選實(shí)施方案，修飾微生物是重組微生物，其是指用重組DNA獲得的微生物。本文所用的表述“重組DNA”指源自用實(shí)驗(yàn)室方法(分子克隆)使來(lái)自多種來(lái)源的遺傳物質(zhì)結(jié)合在一起產(chǎn)生否則將不見(jiàn)于生物中的序列的DNA序列。衍生本發(fā)明的微生物的野生型可以是酵母、真菌或細(xì)菌。適宜的細(xì)菌、酵母或真菌尤其是作為細(xì)菌、酵母或真菌菌株保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ),Brunswick,德國(guó)的那些細(xì)菌、酵母或真菌。本文所用的表述“衍生自野生型的修飾微生物”指通過(guò)受控的遺傳修飾(例如基因工程)、通過(guò)不受控(隨機(jī))的遺傳修飾(例如用誘變化學(xué)劑、X射線、紫外線等處理)或通過(guò)這些方法的組合從野生型獲得的微生物。下文提供制備本發(fā)明的修飾微生物的其他細(xì)節(jié)。適于本發(fā)明的細(xì)菌屬于http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm下詳述的屬；適于本發(fā)明的酵母屬于http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm下詳述的那些屬；適于本發(fā)明的真菌是http://www.dsmz.de/species/fungi.htm下詳述的那些。優(yōu)選地，衍生本發(fā)明的修飾微生物的野生型是細(xì)菌細(xì)胞。本文所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)菌細(xì)胞”指原核生物，即細(xì)菌。細(xì)菌可根據(jù)其生物化學(xué)和微生物學(xué)特性以及其形態(tài)學(xué)來(lái)分類。這些分類標(biāo)準(zhǔn)為本領(lǐng)域公知。根據(jù)本發(fā)明的修飾微生物的優(yōu)選實(shí)施方案，衍生修飾微生物的野生型屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、巴斯德氏菌科、芽孢桿菌科(Bacillaceae)或棒桿菌科(Corynebacteriaceae)?！澳c桿菌科”代表一個(gè)細(xì)菌大家族，包括許多更熟悉的細(xì)菌，如沙門氏菌屬(Salmonella)和大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)。它們屬于朊細(xì)菌(Proteobacteria)，且它們被賦予它們自己的目Enterobacteriales。腸桿菌科的成員為桿狀。與其他朊細(xì)菌一樣，它們具有革蘭氏陰性菌株，且它們是兼性厭氧菌，發(fā)酵糖來(lái)產(chǎn)生乳酸和多種其他終產(chǎn)物，如琥珀酸。大多數(shù)還將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。與大多數(shù)相似的細(xì)菌不同，腸桿菌科通常缺乏細(xì)胞色素C氧化酶。大多數(shù)具有許多用于移動(dòng)的鞭毛，但少數(shù)屬不能移動(dòng)。它們是無(wú)芽孢細(xì)菌，且大多數(shù)情況下它們?yōu)檫^(guò)氧化氫酶陽(yáng)性。此家族的許多成員是見(jiàn)于人類和其他動(dòng)物腸中的腸道菌群的正常部分，而其他成員見(jiàn)于水和土壤中，或寄生在多種不同的動(dòng)物和植物上。大腸埃希氏菌(作為大腸桿菌(E.coli)更為出名)是最重要的模式生物之一，且其遺傳學(xué)和生物化學(xué)已得到仔細(xì)研究。腸桿菌科的大多數(shù)成員具有涉及細(xì)菌細(xì)胞黏附于其宿主的周毛I(xiàn)型菌毛。腸桿菌科的實(shí)例是大腸桿菌、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)。巴斯德氏菌科包含革蘭氏陰性朊細(xì)菌的大家族，成員從細(xì)菌(如流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae))至動(dòng)物和人類黏膜的共生體。大部分成員作為鳥(niǎo)類和哺乳類黏膜表面(尤其是在上呼吸道中)上的共生體生活。巴斯德氏菌科通常為桿狀，是值得注意的一組兼性厭氧菌。它們可以通過(guò)氧化酶的存在而與相關(guān)的腸桿菌科區(qū)分開(kāi)，并通過(guò)鞭毛的缺乏而與大多數(shù)其他相似的細(xì)菌區(qū)分開(kāi)。巴斯德氏菌科中的細(xì)菌已根據(jù)代謝特性及其16SRNA和23SRNA序列分類為許多屬。巴斯德氏菌科的許多成員包含丙酮酸甲酸裂合酶基因，能夠厭氧發(fā)酵碳源為有機(jī)酸?！把挎邨U菌科”是可以產(chǎn)生內(nèi)生孢子的革蘭氏陽(yáng)性、異養(yǎng)、圓形細(xì)菌家族。此家族的可移動(dòng)成員表征為周毛鞭毛。一些芽孢桿菌為需氧細(xì)菌，而其他芽孢桿菌為兼性厭氧菌或?qū)Ｐ詤捬蹙?。大多?shù)為非致病菌，但已知芽孢桿菌屬(Bacillus)物種在人類中引起疾病。此家族還包括芽孢桿菌，其包括芽孢桿菌目(Bacillales)和乳桿菌目(Lactobacillales)兩個(gè)目。芽孢桿菌屬物種代表可以在37℃有氧條件下生長(zhǎng)的大的圓柱形細(xì)菌。它們通常為非致病菌。芽孢桿菌目包括Alicyclobacillaceae、芽孢桿菌科、顯核菌科(Caryophanaceae)、利斯特氏菌科(Listeriaceae)、Paenibacillaceae、動(dòng)性球菌科(Planococcaceae)、芽孢乳桿菌科(Sporolactobacillaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae)、Turicibacteraceae物種。許多芽孢桿菌包含丙酮酸甲酸裂合酶基因，能夠厭氧發(fā)酵碳源為有機(jī)酸?！鞍魲U菌科”是Eubacteriales目的大多數(shù)情況下為革蘭氏陽(yáng)性、需氧和非移動(dòng)的桿狀細(xì)菌的大家族。此家族還包括棒桿菌屬(Corynebacterium)，棒桿菌屬是革蘭氏陽(yáng)性、桿狀細(xì)菌的屬。棒桿菌廣泛分布于自然界中，大多數(shù)情況下無(wú)害。一些棒桿菌用于工業(yè)背景中，如谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)。根據(jù)本發(fā)明的修飾微生物的具體的優(yōu)選實(shí)施方案，衍生修飾微生物的野生型屬于巴斯德氏菌科。在此背景中，進(jìn)一步優(yōu)選衍生本發(fā)明的修飾微生物的野生型屬于Basfia屬，尤其優(yōu)選衍生修飾微生物的野生型屬于Basfiasucciniciproducens物種。最優(yōu)選地，衍生本發(fā)明的修飾微生物的野生型是在布達(dá)佩斯條約下保藏于德國(guó)DSMZ(德意志微生物保藏中心)的保藏號(hào)DSM18541的Basfiasucciniciproducens菌株DD1。此菌株最初分離自德國(guó)來(lái)源的牛的瘤胃，巴斯德氏菌屬(Pasteurella)細(xì)菌可從動(dòng)物優(yōu)選哺乳動(dòng)物的胃腸道分離。細(xì)菌菌株DD1尤其可從牛瘤胃分離，且能夠利用甘油(包括粗甘油)作為碳源?？梢杂糜谥苽浔景l(fā)明的修飾微生物的其他Basfia屬菌株是在保藏號(hào)DSM22022下保藏的Basfia屬菌株，或保藏于瑞典哥德堡大學(xué)培養(yǎng)物保藏所(CultureCollectionoftheUniversityofCCUG)的具有保藏號(hào)CCUG57335、CCUG57762、CCUG57763、CCUG57764、CCUG57765或CCUG57766的Basfia屬菌株。該菌株最初分離自德國(guó)或瑞士來(lái)源的牛的瘤胃。在此背景中，尤其優(yōu)選衍生本發(fā)明的修飾微生物的野生型具有SEQIDNO:1或與SEQIDNO:1顯示至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％序列同源性的序列的16SrDNA。還優(yōu)選衍生本發(fā)明的修飾微生物的野生型具有SEQIDNO:2或與SEQIDNO:2顯示至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％序列同源性的序列的23SrDNA。與待用于本發(fā)明的修飾微生物的多種多肽或多核苷酸一并提到的以百分比值表示的同一性優(yōu)選計(jì)算為所比對(duì)的序列全長(zhǎng)內(nèi)殘基的同一性，例如，借助來(lái)自生物信息學(xué)軟件包EMBOSS(5.0.0版,http://emboss.source-forge.net/what/)的程序，以默認(rèn)參數(shù)計(jì)算的同一性(對(duì)于非常相似的序列)，該默認(rèn)參數(shù)即為缺口開(kāi)放(開(kāi)放一個(gè)缺口的罰分)：10.0；缺口延伸(延伸一個(gè)缺口的罰分)：0.5；數(shù)據(jù)文件(包括在軟件包中的評(píng)分矩陣文件)：EDNAFUL。應(yīng)指出，本發(fā)明的重組微生物不僅可以衍生自上述野生型微生物，尤其是衍生自Basfiasucciniciproducens菌株DD1，還可以衍生自這些菌株的變體。在此背景中，表述“菌株的變體”包含具有與野生型菌株相同或基本相同的特征的每種菌株。在此背景中，尤其優(yōu)選變體的16SrDNA與衍生變體的野生型具有至少90％、優(yōu)選至少95％、更優(yōu)選至少99％、更優(yōu)選至少99.5％、更優(yōu)選至少99.6％、更優(yōu)選至少99.7％、更優(yōu)選至少99.8％和最優(yōu)選至少99.9％同一性。還尤其優(yōu)選變體的23SrDNA與衍生變體的野生型具有至少90％、優(yōu)選至少95％、更優(yōu)選至少99％、更優(yōu)選至少99.5％、更優(yōu)選至少99.6％、更優(yōu)選至少99.7％、更優(yōu)選至少99.8％和最優(yōu)選至少99.9％同一性。此定義意義上的菌株的變體可以例如通過(guò)用誘變化學(xué)劑、X射線或紫外線處理野生型菌株來(lái)獲得。本發(fā)明的修飾微生物的特征在于，與其野生型相比，wcaJ基因編碼的酶的活性降低。酶活性的降低(Δ活性)定義如下：其中，在測(cè)定Δ活性時(shí)，在完全相同的條件下測(cè)定野生型中的活性和修飾微生物中的活性。用于檢測(cè)和測(cè)定wcaJ基因編碼的酶的活性的方法可見(jiàn)于例如Nothaft等:“InvivoanalysisofHPrrevealsafructose-specificphosphotransferasesystemthatconfershigh-affinityuptakeinStreptomycescoelicolor”,Journalofbacteriology,185(3)卷,929-937頁(yè)中。降低的本文公開(kāi)的酶的活性，尤其是降低的wcaJ基因編碼的酶、乳酸脫氫酶和/或丙酮酸甲酸裂合酶的活性可以是，與野生型微生物中該酶的活性相比，酶活性降低至少50％，或酶活性降低至少90％，或更優(yōu)選酶活性降低至少95％，或更優(yōu)選酶活性降低至少98％，或甚至更優(yōu)選酶活性降低至少99％，或甚至更優(yōu)選酶活性降低至少99.9％。術(shù)語(yǔ)“降低的wcaJ基因編碼的酶的活性”或下文所述的“降低的乳酸脫氫酶活性”或“降低的丙酮酸甲酸裂合酶活性”也涵蓋沒(méi)有可檢測(cè)到的這些酶活性的修飾微生物。術(shù)語(yǔ)“降低的酶活性”包括，例如，該遺傳操作(例如遺傳改造)微生物以比該微生物的野生型的表達(dá)水平低的水平表達(dá)該酶。用于降低酶的表達(dá)的遺傳操作可以包括但不限于缺失編碼該酶的基因或其部分、改變或修飾與編碼該酶的基因的表達(dá)相關(guān)的調(diào)節(jié)序列或位點(diǎn)(例如通過(guò)去除強(qiáng)啟動(dòng)子或阻抑型啟動(dòng)子)、修飾涉及編碼該酶的基因的轉(zhuǎn)錄和/或基因產(chǎn)物的翻譯的蛋白質(zhì)(例如調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、抑制因子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活因子等)、或本領(lǐng)域例行的任何其他降低特定基因表達(dá)的常規(guī)手段(包括但不限于使用反義核酸分子或iRNA或其他方法來(lái)敲除或阻斷靶蛋白的表達(dá))。此外，可以在mRNA中引入去穩(wěn)定化元件或引入導(dǎo)致RNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)退化的遺傳修飾。還可能以這樣的方式改變基因的密碼子選擇，使得翻譯效率和速度降低。降低的酶活性也可以通過(guò)引入一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)致酶活性降低的基因突變來(lái)獲得。此外，酶活性降低還可以包括使激活待降低其活性的酶所必需的激活酶失活(或降低表達(dá))。通過(guò)后一種方法，待降低其活性的酶優(yōu)選保持處于失活狀態(tài)。具有降低的wcaJ基因編碼的酶的活性的微生物可以天然存在，即由于自發(fā)突變?？梢酝ㄟ^(guò)多種技術(shù)(如化學(xué)處理或輻射)來(lái)將微生物修飾為缺乏或具有顯著降低的wcaJ基因編碼的酶的活性。為此，將通過(guò)例如誘變化學(xué)劑、X射線或紫外線來(lái)處理微生物。在隨后的步驟中，將選擇具有降低的wcaJ基因編碼的酶的活性的那些微生物。修飾微生物也可通過(guò)同源重組技術(shù)獲得，該同源重組技術(shù)旨在突變、破壞或切除微生物基因組中的wcaJ基因，或用相應(yīng)基因取代該基因，該相應(yīng)基因編碼與野生型基因編碼的酶相比具有降低的活性的酶。根據(jù)本發(fā)明的修飾微生物的優(yōu)選實(shí)施方案，通過(guò)修飾wcaJ基因來(lái)達(dá)到降低wcaJ基因編碼的酶的活性，其中優(yōu)選通過(guò)缺失wcaJ基因或至少其部分，缺失wcaJ基因的調(diào)節(jié)元件或至少其部分(如啟動(dòng)子序列)、或通過(guò)在wcaJ基因中引入至少一個(gè)突變來(lái)實(shí)現(xiàn)此基因修飾。在wcaJ基因中引入至少一個(gè)突變的背景中，尤其優(yōu)選該至少一個(gè)突變導(dǎo)致表達(dá)截短的由wcaJ基因編碼的酶。此外優(yōu)選在截短的酶中，從C端缺失了wcaJ基因編碼的野生型酶的至少100個(gè)氨基酸、優(yōu)選至少125個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少150個(gè)氨基酸和最優(yōu)選至少160個(gè)氨基酸。wcaJ基因編碼的這種截短的酶可以例如通過(guò)在wcaJ基因內(nèi)適當(dāng)位置插入或缺失導(dǎo)致移碼突變的核苷酸來(lái)獲得，其中借助此移碼突變引入終止密碼子。例如，如SEQIDNO:16中所示，在81位胸腺嘧啶和82位腺嘌呤之間在編碼賴氨酸的密碼子中插入核苷酸導(dǎo)致移碼突變，借助該移碼突變引入終止密碼子。wcaJ基因的這類突變可以例如通過(guò)定位或隨機(jī)誘變來(lái)引入，然后通過(guò)重組來(lái)將修飾基因引入微生物的基因組中?？梢酝ㄟ^(guò)借助PCR突變wcaJ基因序列SEQIDNO:3來(lái)產(chǎn)生wcaJ基因的變體?？梢杂谩癚uickchange定位誘變?cè)噭┖小?Stratagene)來(lái)進(jìn)行定位誘變?？梢越柚癎eneMorphII隨機(jī)誘變?cè)噭┖小?Stratagene)來(lái)進(jìn)行SEQIDNO:3的整個(gè)編碼序列或僅其部分的隨機(jī)誘變。在下文中，描述適合用于重組、尤其是用于引入突變或用于刪除序列的技術(shù)。此技術(shù)在本位中有時(shí)也稱為“Campbell重組”(Leenhouts等,ApplEnvMicrobiol.(1989),55卷,394-400頁(yè))。本文所用的“Campbell入(Campbellin)”指原宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體，其中整個(gè)環(huán)狀雙鏈DNA分子(例如質(zhì)粒)通過(guò)單個(gè)同源重組事件(交叉入(crossin)事件)整合入染色體，并有效導(dǎo)致該環(huán)狀DNA分子的線性化形式插入與該環(huán)狀DNA分子的第一DNA序列同源的染色體的第一DNA序列?！耙袰ampbell入(Campbelledin)”指已整合入“Campbell入”轉(zhuǎn)化體的染色體中的線性化DNA序列?！癈ampbell入”包含雙份第一同源DNA序列，其中每個(gè)拷貝包含和圍繞同源重組交叉點(diǎn)的拷貝。本文所用的“Campbell出(Campbellout)”指源自“Campbell入”轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞，其中在包含在“已Campbell入”DNA的線性化插入DNA上的第二DNA序列和與該線性化插入片段的第二DNA序列同源的染色體來(lái)源的第二DNA序列之間發(fā)生了第二同源重組事件(交叉出(crossout)事件)，該第二重組事件導(dǎo)致一部分整合DNA序列的缺失(拋棄)，但更重要的是，還導(dǎo)致一部分(這可以少至單個(gè)堿基)整合的已Campbell入DNA保留在染色體中，使得與原宿主細(xì)胞相比，“Campbell出”細(xì)胞在染色體中包含一個(gè)或多個(gè)有意改變(例如，單個(gè)堿基取代、多個(gè)堿基取代、插入異源基因或DNA序列、插入同源基因或修飾同源基因的一個(gè)或多個(gè)額外拷貝、或插入包含一個(gè)以上上文所列的這些前述實(shí)例的DNA序列)。優(yōu)選通過(guò)針對(duì)包含在“已Campbell入”DNA序列的一部分(希望拋棄的部分)中的基因的逆選擇來(lái)獲得“Campbell出”細(xì)胞，該基因例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)sacB基因，其在約5％至10％蔗糖存在下培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)致死。在有或無(wú)逆選擇的情況下，可以通過(guò)用任何可篩選表型篩選希望得到的細(xì)胞來(lái)獲得或鑒定希望得到的“Campbell出”細(xì)胞，該可篩選表型例如但不限于菌落形態(tài)、菌落顏色、存在或缺乏抗生素抗性、聚合酶鏈反應(yīng)確定給定DNA序列的存在或缺乏、存在或缺乏輔源營(yíng)養(yǎng)、存在或缺乏酶、菌落核酸雜交、抗體篩選等。術(shù)語(yǔ)“Campbell入”和“Campbell出”也可以以多種時(shí)態(tài)用作動(dòng)詞來(lái)指上述方法或過(guò)程。應(yīng)理解，導(dǎo)致“Campbell入”或“Campbell出”的同源重組事件可以在同源DNA序列內(nèi)的DNA堿基的一個(gè)范圍內(nèi)發(fā)生，由于同源序列將在此范圍的至少一部分內(nèi)彼此相同，通常不可能確切地指出在什么地方發(fā)生交叉事件。換言之，不可能精確指出那個(gè)序列最初來(lái)自插入的DNA，哪個(gè)序列最初來(lái)自染色體DNA。此外，第一同源DNA序列和第二同源DNA序列通常由部分非同源的區(qū)域分隔開(kāi)，正是此非同源區(qū)域保留在“Campbell出”細(xì)胞的染色體中。優(yōu)選地，第一和第二同源DNA序列長(zhǎng)度為至少約200個(gè)堿基對(duì)，且長(zhǎng)度可以為至多幾千個(gè)堿基對(duì)。但是，可使該方法對(duì)更短或更長(zhǎng)的序列有效。例如，第一和第二同源序列的長(zhǎng)度可以在約500個(gè)堿基至2000個(gè)堿基的范圍內(nèi)，通過(guò)安排第一和第二同源序列為大致相同的長(zhǎng)度，優(yōu)選差異小于200個(gè)堿基對(duì)，最優(yōu)選二者中較短的序列是較長(zhǎng)的序列的堿基對(duì)長(zhǎng)度的至少70％，來(lái)便于從“Campbell入”獲得“Campbell出”。其活性在本發(fā)明的修飾微生物中降低的wcaJ基因優(yōu)選包含選自以下的核酸：a)具有核苷酸序列SEQIDNO:3的核酸；b)編碼氨基酸序列序列SEQIDNO:4的核酸；c)與a)或b)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優(yōu)選100％同一的核酸，該同一性是a)或b)的核酸全長(zhǎng)內(nèi)的同一性；d)編碼與a)或b)的核酸所編碼的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優(yōu)選100％同一的氨基酸序列的核酸，該同一性是a)或b)的核酸所編碼的氨基酸序列全長(zhǎng)內(nèi)的同一性；e)能夠在嚴(yán)格條件下與a)或b)的任意核酸的互補(bǔ)序列雜交的核酸；和f)編碼與a)或b)的任意核酸相同的蛋白質(zhì)，但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于以上a)或b)的核酸的核酸。本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜交”包括“核酸分子的鏈通過(guò)堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈結(jié)合的任何過(guò)程”(J.Coombs(1994)DictionaryofBiotechnology,StocktonPress,紐約)。雜交和雜交的強(qiáng)度(即核酸分子間結(jié)合的強(qiáng)度)受諸多因素影響，如核酸分子間的互補(bǔ)程度、所涉及條件的嚴(yán)格性、所形成雜合鏈的Tm、核酸分子內(nèi)的G:C比。本文所用的術(shù)語(yǔ)“Tm”用來(lái)指“解鏈溫度”。解鏈溫度是雙鏈核酸分子群體的一半解離為單鏈的溫度。用于計(jì)算核酸分子Tm的方程為本領(lǐng)域公知。如標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)所示，可以通過(guò)方程Tm＝81.5+0.41(％G+C)來(lái)計(jì)算核酸分子處于1MNaCl水溶液中時(shí)的Tm值的簡(jiǎn)單估計(jì)值(參見(jiàn)例如Anderson和Young,QuantitativeFilterHybridization,inNucleicAcidHybridization(1985))。其他參考文獻(xiàn)包括更復(fù)雜的計(jì)算，其將結(jié)構(gòu)以及序列特征考慮在Tm的計(jì)算中。嚴(yán)格條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，且可見(jiàn)于CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。具體而言，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”指這樣的條件，其中作為互補(bǔ)核苷酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)的片段或與互補(bǔ)核苷酸分子同一的100個(gè)相鄰核苷酸或更多核苷酸、150個(gè)相鄰核苷酸或更多核苷酸、200個(gè)相鄰核苷酸或更多核苷酸、或250個(gè)相鄰核苷酸或更多核苷酸，在等同于在50℃下在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中雜交，并在50℃或65℃下、優(yōu)選65℃下在2×SSC、0.1％SDS中洗滌的條件下，與特定核酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)雜交。優(yōu)選地，該雜交條件等同于在50℃下在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中雜交，并在50℃或65℃、優(yōu)選65℃下在1×SSC、0.1％SDS中洗滌，更優(yōu)選地，該雜交條件等同于在50℃下在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中雜交，并在50℃或65℃、優(yōu)選65℃下在0.1×SSC、0.1％SDS中洗滌。優(yōu)選地，該互補(bǔ)核苷酸與wcaJ核酸片段或整個(gè)wcaJ核酸雜交。備選地，優(yōu)選的雜交條件包括在65℃下在1×SSC中或在42℃下在1×SSC和50％甲酰胺中雜交，然后在65℃下在0.3×SSC中洗滌，或在50℃下在4×SSC中或在40℃下在6×SSC和50％甲酰胺中雜交，然后在50℃下在2×SSC中洗滌。其他優(yōu)選的雜交條件是0.1％SDS、0.1SSD和65℃?？梢酝ㄟ^(guò)上述“Campbell重組”來(lái)刪除或通過(guò)上述“Campbell重組”在其中引入至少一個(gè)突變的wcaJ基因或其部分優(yōu)選包含上文定義的核酸。具有核苷酸序列SEQIDNO:3的核酸對(duì)應(yīng)于Basfiasucciniciproducens菌株DD1的wcaJ基因。根據(jù)本發(fā)明的修飾微生物的優(yōu)選實(shí)施方案，與野生型相比，此微生物不僅表征為降低的wcaJ基因編碼的酶的活性，還表征為：i)降低的丙酮酸甲酸裂合酶活性；ii)降低的乳酸脫氫酶活性；或iii)降低的丙酮酸甲酸裂合酶活性和降低的乳酸脫氫酶活性。WO-A-2010/092155、US2010/0159543和WO-A-2005/052135中公開(kāi)了乳酸脫氫酶缺陷和/或丙酮酸甲酸裂合酶活性缺陷的修飾微生物，其關(guān)于降低微生物中、優(yōu)選巴斯德氏菌屬細(xì)菌細(xì)胞中、尤其優(yōu)選Basfiasucciniciproducens菌株DD1中乳酸脫氫酶和/或丙酮酸甲酸裂合酶活性的不同方法的公開(kāi)內(nèi)容，在此引入作為參考。用于測(cè)定丙酮酸甲酸裂合酶活性的方法例如由AsanumaN.和HinoT.公開(kāi)于“EffectsofpHandEnergySupplyonActivityandAmountofPyruvate-Formate-LyaseinStreptococcusbovis”,Appl.Environ.Microbiol.(2000),66卷,3773-3777頁(yè)中，用于測(cè)定乳酸脫氫酶活性的方法例如由Bergmeyer,H.U.,BergmeyerJ.和Grassl,M.(1983-1986)公開(kāi)于“MethodsofEnzymaticAnalysis”,第3版,III卷,126-133頁(yè),VerlagChemie,Weinheim中。在此背景中，優(yōu)選通過(guò)失活ldhA基因(其編碼乳酸脫氫酶LdhA；EC1.1.1.27或EC1.1.1.28)來(lái)達(dá)到降低乳酸脫氫酶活性，通過(guò)失活pflA基因(其編丙酮酸甲酸裂合酶激活物PflA；EC1.97.1.4)或pflD基因(其編丙酮酸甲酸裂合酶PflD；EC2.3.1.54)來(lái)達(dá)到降低丙酮酸甲酸裂合酶活性，其中優(yōu)選通過(guò)缺失這些基因或其部分、通過(guò)缺失這些基因的調(diào)節(jié)元件或至少其部分，或通過(guò)在這些基因中引入至少一個(gè)突變來(lái)達(dá)到失活這些基因(即ldhA、pflA和pflD)，尤其優(yōu)選借助上文所述的“Campbell重組”。其活性在本發(fā)明的修飾微生物中降低的ldhA基因優(yōu)選包含選自以下的核酸：α1)具有核苷酸序列SEQIDNO:10的核酸；α2)編碼氨基酸序列序列SEQIDNO:11的核酸；α3)與α1)或α2)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優(yōu)選100％同一的核酸，該同一性是α1)或α2)的核酸全長(zhǎng)內(nèi)的同一性；α4)編碼與α1)或α2)的核酸所編碼的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優(yōu)選100％同一的氨基酸序列的核酸，該同一性是α1)或α2)的核酸所編碼的氨基酸序列全長(zhǎng)內(nèi)的同一性；α5)能夠在嚴(yán)格條件下與α1)或α2)的任意核酸的互補(bǔ)序列雜交的核酸；和α6)編碼與α1)或α2)的任意核酸相同的蛋白質(zhì)，但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于以上α1)或α2)的核酸的核酸。其活性在本發(fā)明的修飾微生物中降低的pflA基因優(yōu)選包含選自以下的核酸：β1)具有核苷酸序列SEQIDNO:12的核酸；β2)編碼氨基酸序列序列SEQIDNO:13的核酸；β3)與β1)或β2)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優(yōu)選100％同一的核酸，該同一性是β1)或β2)的核酸全長(zhǎng)內(nèi)的同一性；β4)編碼與β1)或β2)的核酸所編碼的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優(yōu)選100％同一的氨基酸序列的核酸，該同一性是β1)或β2)的核酸所編碼的氨基酸序列全長(zhǎng)內(nèi)的同一性；β5)能夠在嚴(yán)格條件下與β1)或β2)的任意核酸的互補(bǔ)序列雜交的核酸；和β6)編碼與β1)或β2)的任意核酸相同的蛋白質(zhì)，但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于以上β1)或β2)的核酸的核酸。其活性在本發(fā)明的修飾微生物中降低的pflD基因優(yōu)選包含選自以下的核酸：γ1)具有核苷酸序列SEQIDNO:14的核酸；γ2)編碼氨基酸序列序列SEQIDNO:15的核酸；γ3)與γ1)或γ2)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優(yōu)選100％同一的核酸，該同一性是γ1)或γ2)的核酸全長(zhǎng)內(nèi)的同一性；γ4)編碼與γ1)或γ2)的核酸所編碼的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最優(yōu)選100％同一的氨基酸序列的核酸，該同一性是γ1)或γ2)的核酸所編碼的氨基酸序列全長(zhǎng)內(nèi)的同一性；γ5)能夠在嚴(yán)格條件下與γ1)或γ2)的任意核酸的互補(bǔ)序列雜交的核酸；和γ6)編碼與γ1)或γ2)的任意核酸相同的蛋白質(zhì)，但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于以上γ1)或γ2)的核酸的核酸。在此背景中，優(yōu)選本發(fā)明的修飾微生物進(jìn)一步包含：A)ldhA基因或至少其部分的缺失，ldhA基因的調(diào)節(jié)元件或至少其部分的缺失，或ldhA基因中至少一個(gè)突變的引入；B)pflD基因或至少其部分的缺失，pflD基因的調(diào)節(jié)元件或至少其部分的缺失，或pflD基因中至少一個(gè)突變的引入；C)pflA基因或至少其部分的缺失，pflA基因的調(diào)節(jié)元件或至少其部分的缺失，或pflA基因中至少一個(gè)突變的引入；D)ldhA基因或至少其部分的缺失，ldhA基因的調(diào)節(jié)元件或至少其部分的缺失，或ldhA基因中至少一個(gè)突變的引入；和pflD基因或至少其部分的缺失，pflD基因的調(diào)節(jié)元件或至少其部分的缺失，或pflD基因中至少一個(gè)突變的引入；或E)ldhA基因或至少其部分的缺失，ldhA基因的調(diào)節(jié)元件或至少其部分的缺失，或ldhA基因中至少一個(gè)突變的引入；和pflA基因或至少其部分的缺失，pflA基因的調(diào)節(jié)元件或至少其部分的缺失，或pflA基因中至少一個(gè)突變的引入。本發(fā)明的修飾微生物的尤其優(yōu)選的實(shí)施方案是：-巴斯德氏菌科、尤其優(yōu)選Basfia屬、甚至更優(yōu)選Basfiasucciniciproducens物種的修飾細(xì)菌細(xì)胞，其中缺失了wcaJ基因或至少其部分，或在wcaJ基因中引入了至少一個(gè)突變，其中該至少一個(gè)突變的引入優(yōu)選導(dǎo)致表達(dá)這樣的酶，該酶從C端缺失了wcaJ基因編碼的野生型酶的至少100個(gè)氨基酸、優(yōu)選至少125個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少150個(gè)氨基酸和最優(yōu)選至少160個(gè)氨基酸；-巴斯德氏菌科、尤其優(yōu)選Basfia屬、甚至更優(yōu)選Basfiasucciniciproducens物種的修飾細(xì)菌細(xì)胞，其中缺失了wcaJ基因或至少其部分，或在wcaJ基因中引入了至少一個(gè)突變，其中該至少一個(gè)突變的引入優(yōu)選導(dǎo)致表達(dá)這樣的酶，該酶從C端缺失了wcaJ基因編碼的野生型酶的至少100個(gè)氨基酸、優(yōu)選至少125個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少150個(gè)氨基酸和最優(yōu)選至少160個(gè)氨基酸，且其中與野生型相比，優(yōu)選通過(guò)修飾ldhA基因，尤其是通過(guò)修飾具有SEQIDNO:10的核酸序列且編碼具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的LdhA的ldhA基因，來(lái)降低乳酸脫氫酶的活性；-巴斯德氏菌科、尤其優(yōu)選Basfia屬、甚至更優(yōu)選Basfiasucciniciproducens物種的修飾細(xì)菌細(xì)胞，其中缺失了wcaJ基因或至少其部分，或在wcaJ基因中引入了至少一個(gè)突變，其中該至少一個(gè)突變的引入優(yōu)選導(dǎo)致表達(dá)這樣的酶，該酶從C端缺失了wcaJ基因編碼的野生型酶的至少100個(gè)氨基酸、優(yōu)選至少125個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少150個(gè)氨基酸和最優(yōu)選至少160個(gè)氨基酸，且其中與野生型相比，優(yōu)選通過(guò)修飾pflA基因或pflD基因，尤其是通過(guò)修飾具有SEQIDNO:12的核酸序列且編碼具有SEQIDNO:13的氨基酸序列的PflA的pflA基因，或通過(guò)修飾具有SEQIDNO:14的核酸序列且編碼具有SEQIDNO:15的氨基酸序列的PflD的pflD基因，來(lái)降低丙酮酸甲酸裂合酶的活性；-巴斯德氏菌科、尤其優(yōu)選Basfia屬、甚至更優(yōu)選Basfiasucciniciproducens物種的修飾細(xì)菌細(xì)胞，其中缺失了wcaJ基因或至少其部分，或在wcaJ基因中引入了至少一個(gè)突變，其中該至少一個(gè)突變的引入優(yōu)選導(dǎo)致表達(dá)這樣的酶，該酶從C端缺失了wcaJ基因編碼的野生型酶的至少100個(gè)氨基酸、優(yōu)選至少125個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少150個(gè)氨基酸和最優(yōu)選至少160個(gè)氨基酸，且其中與野生型相比，優(yōu)選通過(guò)修飾ldhA基因和pflA基因，尤其是通過(guò)修飾具有SEQIDNO:10的核酸序列且編碼具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的LdhA的ldhA基因，或通過(guò)修飾具有SEQIDNO:12的核酸序列且編碼具有SEQIDNO:13的氨基酸序列的PflA的pflA基因，或通過(guò)修飾ldhA基因和pflD基因，尤其是通過(guò)修飾具有SEQIDNO:10的核酸序列且編碼具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的LdhA的ldhA基因，或通過(guò)修飾具有SEQIDNO:14的核酸序列且編碼具有SEQIDNO:15的氨基酸序列的PflD的pflD基因，來(lái)降低乳酸脫氫酶和丙酮酸甲酸裂合酶的活性。此外，通過(guò)產(chǎn)生有機(jī)化合物的方法來(lái)為解決一開(kāi)始提到的問(wèn)題提供貢獻(xiàn)，該方法包括：I)在包含至少一種可同化的碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的修飾微生物，以允許修飾微生物產(chǎn)生有機(jī)化合物，從而獲得包含有機(jī)化合物的發(fā)酵液；II)從方法步驟I)中獲得的發(fā)酵液回收有機(jī)化合物。在方法步驟I)中，在包含至少一種可同化的碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的修飾微生物，以允許修飾微生物產(chǎn)生有機(jī)化合物，從而獲得包含有機(jī)化合物的發(fā)酵液?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的優(yōu)選的有機(jī)化合物包括：羧酸，如甲酸、乳酸、丙酸、2-羥基丙酸、3-羥基丙酸、3-羥基丁酸、丙烯酸、丙酮酸或這些羧酸的鹽；二羧酸，如丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、戊二酸、衣康酸、己二酸或其鹽；三羧酸，如檸檬酸或其鹽；醇，如甲醇或乙醇；氨基酸，如L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-精氨酸、L-異亮氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-絲氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸等。根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案，該有機(jī)化合物是琥珀酸。在本發(fā)明背景中使用的術(shù)語(yǔ)“琥珀酸”必須以其最廣泛的含義理解，且還涵蓋其鹽(即琥珀酸鹽)，例如，堿金屬鹽，如Na+和K+鹽，或堿土金屬鹽，如Mg2+和Ca2+鹽，或銨鹽，或琥珀酸酐。優(yōu)選在約10℃至60℃，或20℃至50℃，或30℃至45℃范圍內(nèi)的溫度下，在5.0至9.0，或5.5至8.0，或6.0至7.0的pH下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的修飾微生物。優(yōu)選地，在厭氧條件下產(chǎn)生有機(jī)化合物，尤其是琥珀酸。厭氧條件可以借助常規(guī)技術(shù)來(lái)建立，例如，通過(guò)對(duì)反應(yīng)介質(zhì)的組分脫氣，并通過(guò)按例如0.1至1，或0.2至0.5vvm的流速引入二氧化碳或氮?dú)饣蚱浠旌衔锖涂蛇x地引入氫氣來(lái)維持厭氧條件。需氧條件可以借助常規(guī)技術(shù)來(lái)建立，例如，通過(guò)按例如0.1至1，或0.2至0.5vvm的流速引入空氣或氧氣。根據(jù)需要，可以在方法中應(yīng)用0.1至1.5bar的輕微超壓?？赏奶荚磧?yōu)選選自蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖、甘油及其混合物、或包含該化合物中的至少一種的組合物，或選自淀粉、纖維素、半纖維素和/或木素纖維素的分解產(chǎn)物。優(yōu)選地，可同化的碳源包含D-葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘油或這些化合物中的至少兩種的混合物，其中尤其優(yōu)選甘油和D-葡萄糖、甘油和蔗糖、甘油和D-木糖、甘油和麥芽糖，及D-葡萄糖和果糖的混合物?？赏奶荚吹某跏紳舛葍?yōu)選調(diào)節(jié)至5至100g/l、優(yōu)選5至75g/l和更優(yōu)選5至50g/l范圍內(nèi)的值，且可以在培養(yǎng)期間維持在該范圍內(nèi)。反應(yīng)介質(zhì)的pH可以通過(guò)加入適宜的堿來(lái)控制，例如氣態(tài)氨、NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、Mg(HCO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N和/或其混合物。如果發(fā)酵方法過(guò)程中形成的有機(jī)化合物是羧酸或二羧酸，則尤其需要這些堿性中和劑。在琥珀酸作為有機(jī)化合物的情況下，Mg(OH)2和MgCO3是尤其優(yōu)選的堿。本發(fā)明的發(fā)酵步驟I)可以例如在攪拌式發(fā)酵罐、泡罩塔和環(huán)式反應(yīng)器中進(jìn)行?？赡艿姆椒愋?包括攪拌器類型和幾何設(shè)計(jì))的綜合概述可見(jiàn)于Chmiel:“Bioprozesstechnik:EinführungindieBioverfahrenstechnik”,1卷中。在本發(fā)明的方法中，在本發(fā)明的方法中，可用的典型變通形式是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或例如Chmiel,HammesandBailey:“BiochemicalEngineering”中解釋的以下變通形式：如批次、補(bǔ)料分批、反復(fù)補(bǔ)料分批或其他具有生物質(zhì)再循環(huán)的連續(xù)發(fā)酵。取決于生產(chǎn)菌株，可以用空氣、氧氣、二氧化碳、氫氣、氮?dú)饣蜻m當(dāng)?shù)臍怏w混合物進(jìn)行通氣，以達(dá)到良好的產(chǎn)率(YP/S)。用于在方法步驟I)中產(chǎn)生有機(jī)酸尤其是琥珀酸的尤其優(yōu)選的條件是：可同化的碳源：甘油、蔗糖、D-葡萄糖、麥芽糖、甘油+D-葡萄糖、甘油+蔗糖、甘油+麥芽糖、甘油+D-木糖、D-葡萄糖+果糖溫度：30至45℃pH：5.5至7.0所提供的氣體：CO2此外，優(yōu)選在方法步驟I)中，可同化的碳源轉(zhuǎn)化為有機(jī)化合物(優(yōu)選琥珀酸)，碳產(chǎn)率YP/S為至少0.5g/g至約1.28g/g，例如，碳產(chǎn)率YP/S為至少0.6g/g、至少0.7g/g、至少0.75g/g、至少0.8g/g、至少0.85g/g、至少0.9g/g、至少0.95g/g、至少1.0g/g、至少1.05g/g、至少1.1g/g、至少1.15g/g、至少1.20g/g、至少1.22g/g或至少1.24g/g(有機(jī)化合物/碳，優(yōu)選琥珀酸/碳)。此外，優(yōu)選在方法步驟I)中，可同化的碳源轉(zhuǎn)化為有機(jī)化合物(優(yōu)選琥珀酸)，單位生產(chǎn)率(specificproductivityyield)為至少0.6ggDCW-1h-1有機(jī)化合物(優(yōu)選琥珀酸)、或至少0.65ggDCW-1h-1、或至少0.7ggDCW-1h-1、或至少0.75ggDCW-1h-1或至少0.77ggDCW-1h-1有機(jī)化合物(優(yōu)選琥珀酸)。此外，優(yōu)選在方法步驟I)中，可同化的碳源轉(zhuǎn)化為有機(jī)化合物(優(yōu)選琥珀酸)，有機(jī)化合物(優(yōu)選琥珀酸)的時(shí)空產(chǎn)率為至少2.2g/(L×h)、或至少2.5g/(L×h)、至少2.75g/(L×h)、至少3g/(L×h)、至少3.25g/(L×h)、至少3.5g/(L×h)、至少3.7g/(L×h)、至少4.0g/(L×h)、至少4.5g/(L×h)、或至少5.0g/(L×h)有機(jī)化合物(優(yōu)選琥珀酸)。根據(jù)本發(fā)明的方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案，在方法步驟I)中，修飾微生物將至少20g/l、更優(yōu)選至少25g/l和甚至更優(yōu)選至少30g/l的可同化碳源(優(yōu)選選自蔗糖、麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的可同化碳源)轉(zhuǎn)化為至少20g/l、更優(yōu)選至少25g/l和甚至更優(yōu)選至少30g/l的有機(jī)化合物(優(yōu)選琥珀酸)。本文所述的不同產(chǎn)率參數(shù)(“碳產(chǎn)率”或“YP/S”、“單位生產(chǎn)率”或“時(shí)空產(chǎn)率(STY)”)為本領(lǐng)域公知，并按例如Song和Lee,2006所述測(cè)定。“碳產(chǎn)率”和“YP/S”(各以所產(chǎn)生的有機(jī)化合物的質(zhì)量/所消耗的可同化碳源的質(zhì)量表示)在本文中作為同義詞使用。單位生產(chǎn)率描述每克干生物質(zhì)每小時(shí)和每升發(fā)酵液產(chǎn)生的產(chǎn)物(如琥珀酸)的量。表示為“DCW”的干細(xì)胞重的量描述生物化學(xué)反應(yīng)中生物活性微生物的量。值作為克產(chǎn)物/克DCW/小時(shí)(即ggDCW-1h-1)給出。時(shí)空產(chǎn)率(STY)定義為發(fā)酵過(guò)程中形成的有機(jī)化合物的總量與培養(yǎng)物體積的比值，在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)考慮。時(shí)空產(chǎn)率也稱為“體積生產(chǎn)力(volumetricproductivity)”。在方法步驟II)中，從方法步驟I)中獲得的發(fā)酵液回收有機(jī)化合物，優(yōu)選琥珀酸。通常，回收方法包括將重組微生物作為所謂的“生物質(zhì)”從發(fā)酵液分離的步驟。用于去除生物質(zhì)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，且包括過(guò)濾、沉降、漂浮或其組合。因此，可以用例如離心機(jī)、分離器、傾析器、濾器或在漂浮設(shè)備中去除生物質(zhì)。為了有價(jià)值的產(chǎn)物的最大回收，通常可以例如以滲濾的形式洗滌生物質(zhì)。方法的選擇取決于發(fā)酵液中的生物質(zhì)含量和生物質(zhì)的特性，以及生物質(zhì)與有機(jī)化合物(即有價(jià)值的產(chǎn)物)的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，可對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行滅菌或巴氏滅菌。在另一實(shí)施方案中，濃縮發(fā)酵液。取決于需要，此濃縮可以分批或連續(xù)進(jìn)行。壓力和溫度范圍應(yīng)這樣選擇，使得首先不發(fā)生產(chǎn)物損傷，其次僅有必要最小程度地使用設(shè)備和能量。為多級(jí)蒸發(fā)巧妙地選擇壓力和溫度水平尤其使得能夠節(jié)約能量?；厥辗椒梢赃M(jìn)一步包括附加的純化步驟，其中進(jìn)一步純化有機(jī)化合物，優(yōu)選琥珀酸。但是，如果通過(guò)下文所述的化學(xué)反應(yīng)將該有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化為次級(jí)有機(jī)產(chǎn)物，則取決于反應(yīng)類型和反應(yīng)條件，并非必然需要進(jìn)一步純化該有機(jī)化合物。為了純化方法步驟II)中獲得的有機(jī)化合物，優(yōu)選為了純化琥珀酸，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如結(jié)晶、過(guò)濾、電透析和層析。在琥珀酸作為有機(jī)化合物的情況下，例如，可以通過(guò)用氫氧化鈣、氧化鈣、碳酸鈣或碳酸氫鈣中和并過(guò)濾沉淀，通過(guò)將琥珀酸沉淀為琥珀酸鈣產(chǎn)物來(lái)分離它。通過(guò)用硫酸酸化，然后過(guò)濾去除沉淀的硫酸鈣(石膏)來(lái)從沉淀的琥珀酸鈣回收琥珀酸。得到的溶液可以借助離子交換層析來(lái)進(jìn)一步純化，以去除不希望得到的殘留離子。備選地，如果用氫氧化鎂、碳酸鎂或其混合物來(lái)中和發(fā)酵液，則可以酸化方法步驟I)中獲得的發(fā)酵液，以將包含在介質(zhì)中的琥珀酸鎂轉(zhuǎn)化為酸形式(即琥珀酸)，隨后可以通過(guò)冷卻酸化的介質(zhì)來(lái)結(jié)晶。其他適宜的純化方法的實(shí)例公開(kāi)于EP-A-1005562、WO-A-2008/010373、WO-A-2011/082378、WO-A-2011/043443、WO-A-2005/030973、WO-A-2011/123268、WO-A-2011/064151和EP-A-2360137中。根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案，該方法進(jìn)一步包括方法步驟：III)通過(guò)至少一步化學(xué)反應(yīng)，使包含在方法步驟I)中獲得的發(fā)酵液中的有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化或使方法步驟II)中獲得的回收的有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化為不同于該有機(jī)化合物次級(jí)有機(jī)產(chǎn)物。在琥珀酸作為有機(jī)化合物的情況下，優(yōu)選的次級(jí)有機(jī)產(chǎn)物選自琥珀酸酯及其聚合物、四氫呋喃(THF)、1,4-丁二醇(BDO)、γ-丁內(nèi)酯(GBL)和吡咯烷酮。根據(jù)用于產(chǎn)生THF、BDO和/或GBL的優(yōu)選實(shí)施方案，此方法包括：b1)直接催化氫化方法步驟I)或II)中獲得的琥珀酸為THF和/或BDO和/或GBL；或b2)化學(xué)酯化方法步驟I)或II)中獲得的琥珀酸和/或琥珀酸鹽為其相應(yīng)的二-低級(jí)烷基酯，隨后催化氫化該酯為THF和/或BDO和/或GBL。根據(jù)用于產(chǎn)生吡咯烷酮的優(yōu)選實(shí)施方案，此方法包括：b)以本身已知的方式化學(xué)轉(zhuǎn)化方法步驟I)或II)中獲得的琥珀酸銨鹽為吡咯烷酮。對(duì)于制備這些化合物的詳情，參考US-A-2010/0159543和WO-A-2010/092155。通過(guò)本發(fā)明的修飾微生物在發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)化合物中的用途來(lái)為解決一開(kāi)始提到的問(wèn)題提供貢獻(xiàn)。優(yōu)選的有機(jī)化合物是已經(jīng)與本發(fā)明的方法一并提到的那些化合物，最優(yōu)選的有機(jī)化合物是琥珀酸。此外，用于發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)化合物(優(yōu)選琥珀酸)的優(yōu)選條件是已經(jīng)與本發(fā)明方法的方法步驟I)一并描述的那些條件?，F(xiàn)在借助附圖和非限制性實(shí)施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。圖1顯示質(zhì)粒pSacB(SEQIDNO:5)的示意圖譜。圖2顯示質(zhì)粒pSacBΔldhA(SEQIDNO:6)的示意圖譜。圖3顯示質(zhì)粒pSacBΔpflA(SEQIDNO:7)的示意圖譜。圖4顯示質(zhì)粒pSacBΔwcaJ(SEQIDNO:8)的示意圖譜。圖5顯示質(zhì)粒pSacBΔpflD(SEQIDNO:9)的示意圖譜。圖6顯示通過(guò)沉降不同培養(yǎng)基獲得的細(xì)胞沉淀。實(shí)施例實(shí)施例1：用于轉(zhuǎn)化Basfiasucciniciproducens的一般方法菌株野生型DD1(保藏號(hào)DSM18541)DD1ΔwcaJDD1ΔldhADD1ΔldhAΔpflDDD1ΔldhAΔpflDΔwcaJDD1ΔldhAΔpflADD1ΔldhAΔpflAΔwcaJ表1：實(shí)施例中提到的DD1野生型和突變體的命名。通過(guò)使用以下流程的電穿孔來(lái)用DNA轉(zhuǎn)化BasfiasucciniciproducensDD1(野生型)：為了制備預(yù)培養(yǎng)物，從凍存物將DD1接種入100ml搖瓶中的40mlBHI(腦心浸液；Becton,DickinsonandCompany)。37℃、200轉(zhuǎn)/分鐘過(guò)夜進(jìn)行孵育。為了制備主培養(yǎng)物，在250ml搖瓶中放入100mlBHI，用預(yù)培養(yǎng)物接種至最終OD(600nm)為0.2。37℃、200轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行孵育。在OD約為0.5、0.6和0.7時(shí)收集細(xì)胞，用4℃的10％冷甘油洗滌沉淀一次，重懸在2ml10％甘油(4℃)中。在寬度為0.2cm的電穿孔杯中將100μl感受態(tài)細(xì)胞與2-8μg質(zhì)粒DNA混合，并在冰上放置2分鐘。在以下條件下電穿孔：400Ω、25μF、2.5kV(GenePulser,Bio-Rad)。電穿孔后立即加入1ml冷BHI，并在37℃進(jìn)行約2小時(shí)孵育。將細(xì)胞接種在含5mg/L氯霉素的BHI上，并在37℃孵育2-5天，直至轉(zhuǎn)化體的菌落可見(jiàn)。分離克隆，并重新劃線接種在含5mg/L氯霉素的BHI上，直至獲得純的克隆。實(shí)施例2：缺失構(gòu)建體的產(chǎn)生突變/缺失質(zhì)?；谳d體pSacB(SEQIDNO:5)構(gòu)建。圖1顯示質(zhì)粒pSacB的示意圖譜。通過(guò)PCR從Basfiasucciniciproducens的染色體DNA擴(kuò)增應(yīng)缺失的染色體片段5’-和3’-側(cè)翼區(qū)(各約1500bp)，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入該載體。通常，靶向至少80％的OFR進(jìn)行缺失。以這種方式，構(gòu)建了用于乳酸脫氫酶ldhA(pSacB_delta_ldhA(SEQIDNO:6))、丙酮酸甲酸裂合酶激活酶pflA(pSacB_delta_pflA(SEQIDNO:7))、假定的果糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白wcaJ(pSacB_delta_wcaJ(SEQIDNO:8))和丙酮酸甲酸裂合酶pflD(pSacB_delta_pflD(SEQIDNO:9))的缺失質(zhì)粒。圖2、3、4和5分別顯示質(zhì)粒pSacB_delta_ldhA、pSacB_delta_pflA、pSacB_delta_wcaJ和pSacB_delta_pflD的示意圖譜。在pSacB的質(zhì)粒序列(SEQIDNO:5)中，從堿基2380至3801包含sacB基因。從堿基3802至4264包含sacB啟動(dòng)子。從堿基526至984包含氯霉素基因。從堿基1477至2337包含用于大腸桿菌(E.coli)的復(fù)制起點(diǎn)(oriEC)(參見(jiàn)圖1)。在pSacB_delta_ldhA的質(zhì)粒序列(SEQIDNO:6)中，從堿基1519至2850包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的ldhA基因5’側(cè)翼區(qū)，而從堿基62至1518包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的ldhA基因3’側(cè)翼區(qū)。從堿基5169至6590包含sacB基因。從堿基6591至7053包含sacB啟動(dòng)子。從堿基3315至3773包含氯霉素基因。從堿基4266至5126包含用于大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)(oriEC)(參見(jiàn)圖2)。在pSacB_delta_pflA的質(zhì)粒序列(SEQIDNO:7)中，從堿基1506至3005包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的pflA基因5’側(cè)翼區(qū)，而從堿基6至1505包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的pflA基因3’側(cè)翼區(qū)。從堿基5278至6699包含sacB基因。從堿基6700至7162包含sacB啟動(dòng)子。從堿基3424至3882包含氯霉素基因。從堿基4375至5235包含用于大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)(oriEC)(參見(jiàn)圖3)。在pSacB_delta_wcaJ的質(zhì)粒序列(SEQIDNO:8)中，從堿基1506至3122包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的wcaJ基因5’側(cè)翼區(qū)，而從堿基6至1505包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的wcaJ基因3’側(cè)翼區(qū)。從堿基5395至6816包含sacB基因。從堿基6817至7279包含sacB啟動(dòng)子。從堿基3541至3999包含氯霉素基因。從堿基4492至5352包含用于大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)(oriEC)(參見(jiàn)圖4)。在pSacB_delta_pflD的質(zhì)粒序列(SEQIDNO:9)中，從堿基1533至2955包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的pflD基因5’側(cè)翼區(qū)，而從堿基62至1532包含與Basfiasucciniciproducens基因組同源的pflD基因3’側(cè)翼區(qū)。從堿基5256至6677包含sacB基因。從堿基6678至7140包含sacB啟動(dòng)子。從堿基3402至3860包含氯霉素基因。從堿基4353至5213包含用于大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)(oriEC)(參見(jiàn)圖5)。實(shí)施例3：改進(jìn)的產(chǎn)琥珀酸菌株的產(chǎn)生a)用pSacB_delta_ldhA按上文所述轉(zhuǎn)化BasfiasucciniciproducensDD1，并“Campbelled入”，以產(chǎn)生“Campbell入”菌株。通過(guò)PCR來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)化和整合入Basfiasucciniciproducens基因組，該P(yáng)CR產(chǎn)生質(zhì)粒整合入Basfiasucciniciproducens基因組的事件的條帶。然后用含有蔗糖的瓊脂平板作為針對(duì)sacB基因(的功能)的喪失進(jìn)行選擇的反選擇培養(yǎng)基“Campbelled出”“Campbell入”菌株。因此，在25-35ml非選擇培養(yǎng)基(不含抗生素的BHI)中37℃、200轉(zhuǎn)/分鐘過(guò)夜孵育“Campbell入”菌株。然后將過(guò)夜培養(yǎng)物劃線培養(yǎng)在現(xiàn)配制的含蔗糖的BHI平板(10％，不含抗生素)上，并在37℃過(guò)夜孵育(“第一次蔗糖轉(zhuǎn)移”)。從第一轉(zhuǎn)移獲得的單菌落再次劃線培養(yǎng)在現(xiàn)配制的含蔗糖的BHI平板(10％)上，并在37℃過(guò)夜孵育(“第二次蔗糖轉(zhuǎn)移”)。重復(fù)此流程，直至在蔗糖中完成最少五次轉(zhuǎn)移(“第三、第四、第五次轉(zhuǎn)移”)。術(shù)語(yǔ)“第一至第五次蔗糖轉(zhuǎn)移”指為了選擇sacB基因和周圍質(zhì)粒序列丟失的菌株的目的而將染色體整合了含有sacB果聚糖蔗糖酶基因的菌株轉(zhuǎn)移至含有蔗糖和生長(zhǎng)培養(yǎng)基的瓊脂平板上。將從第五塊轉(zhuǎn)移平板獲得的單菌落接種在25-35ml非選擇培養(yǎng)基(不含抗生素的BHI)上，并在37℃、220轉(zhuǎn)/分鐘過(guò)夜孵育。將過(guò)夜培養(yǎng)物系列稀釋，并接種在BHI平板上，以獲得分離的單菌落。通過(guò)氯霉素敏感性來(lái)確認(rèn)含有l(wèi)dhA基因的突變/缺失的“Campbelled出”菌株。通過(guò)PCR分析來(lái)鑒定和確認(rèn)這些菌株中的突變/缺失突變體。這產(chǎn)生了ldhA缺失突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhA。b)按上文所述用pSacB_delta_pflD轉(zhuǎn)化BasfiasucciniciproducensΔldhA，并“Campbelled入”，以產(chǎn)生“Campbell入”菌株。通過(guò)PCR來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)化和整合。然后按之前所述“Campbelled出”“Campbell入”菌株。通過(guò)PCR分析來(lái)鑒定和確認(rèn)這些菌株中的缺失突變體。這產(chǎn)生了ldhApflD雙缺失突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflD。c)按上文所述用pSacB_delta_wcaJ轉(zhuǎn)化BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflD，并“Campbelled入”，以產(chǎn)生“Campbell入”菌株。通過(guò)PCR來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)化和整合。然后按之前所述“Campbelled出”“Campbell入”菌株。通過(guò)PCR分析來(lái)鑒定和確認(rèn)這些菌株中的缺失突變體。這產(chǎn)生了ldhApflDwcaJ三重缺失突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflDΔwcaJ。d)按上文所述用pSacB_delta_pflA轉(zhuǎn)化BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhA，并“Campbelled入”，以產(chǎn)生“Campbell入”菌株。通過(guò)PCR來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)化和整合。然后按之前所述“Campbelled出”“Campbell入”菌株。通過(guò)PCR分析來(lái)鑒定和確認(rèn)這些菌株中的缺失突變體。這產(chǎn)生了ldhApflA雙缺失突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflA。e)按上文所述用pSacB_delta_wcaJ轉(zhuǎn)化BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflA，并“Campbelled入”，以產(chǎn)生“Campbell入”菌株。通過(guò)PCR來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)化和整合。然后按之前所述“Campbelled出”“Campbell入”菌株。通過(guò)PCR分析來(lái)鑒定和確認(rèn)這些菌株中的缺失突變體。這產(chǎn)生了ldhApflAwcaJ三重缺失突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflAΔwcaJ。f)按上文所述用pSacB_delta_wcaJ轉(zhuǎn)化BasfiasucciniciproducensDD1，并“Campbelled入”，以產(chǎn)生“Campbell入”菌株。通過(guò)PCR來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)化和整合。然后按之前所述“Campbelled出”“Campbell入”菌株。通過(guò)PCR分析來(lái)鑒定和確認(rèn)這些菌株中的缺失突變體。這產(chǎn)生了wcaJ缺失突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔwcaJ。實(shí)施例4：在葡萄糖和蔗糖上培養(yǎng)多種DD1菌株在存在葡萄糖或蔗糖作為碳源的情況下，將DD1的生產(chǎn)力與突變體菌株DD1ΔwcaJ的生產(chǎn)力相比較。在存在葡萄糖或蔗糖作為碳源的情況下，將DD1ΔldhAΔpflD的生產(chǎn)力與突變體菌株DD1ΔldhAΔpflDΔwcaJ的生產(chǎn)力相比較。在存在葡萄糖或蔗糖作為碳源的情況下，將DD1ΔldhAΔpflA的生產(chǎn)力與突變體菌株DD1ΔldhAΔpflAΔwcaJ的生產(chǎn)力相比較。利用下文所述的培養(yǎng)基和孵育條件分析生產(chǎn)力。1.培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基的組成和配制如以下表2、3、4和5中所述。表2：痕量元素溶液的組成。表3：維生素溶液的組成。表4：用于葡萄糖上培養(yǎng)的LSM培養(yǎng)基的組成。表5：用于蔗糖上培養(yǎng)的LSM培養(yǎng)基的組成。2.培養(yǎng)和分析為了培養(yǎng)主培養(yǎng)物，用來(lái)自新鮮培養(yǎng)的BHI瓊脂平板的細(xì)菌接種具有氣密丁基橡膠塞的100ml血清瓶至OD600＝0.75，該血清瓶包含50ml表2和3中所述液體培養(yǎng)基，具有CO2氣體。37℃和160轉(zhuǎn)/分鐘(搖動(dòng)直徑：2.5cm)孵育血清瓶。24小時(shí)或48小時(shí)后通過(guò)HPLC(HPLC方法在表10和11中描述)定量碳源的消耗和羧酸的產(chǎn)生。通過(guò)用分光光度計(jì)(Ultrospec3000,AmershamBiosciences,Uppsala瑞典)測(cè)量600nm吸光度(OD600)來(lái)測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)。3.結(jié)果表6、7和8中顯示不同DD1菌株的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如從這些結(jié)果可見(jiàn)，ΔwcaJ細(xì)胞編碼的酶的活性的降低導(dǎo)致琥珀酸的產(chǎn)生增加。此外，將孵育24小時(shí)或48小時(shí)后通過(guò)培養(yǎng)DD1ΔldhAΔpflD/DD1ΔldhAΔpflA菌株和DD1ΔldhAΔpflDΔwcaJ/DD1ΔldhAΔpflAΔwcaJ菌株獲得的樣品轉(zhuǎn)入15ml管，以測(cè)量離心后獲得的上清體積。如表9中所示，ΔwcaJ細(xì)胞編碼的酶的活性的降低產(chǎn)生這樣的修飾微生物，該修飾微生物顯示顯著改進(jìn)的沉降行為(離心后獲得更緊密的細(xì)胞沉淀)，因此可以更容易地在隨后的純化過(guò)程中從培養(yǎng)基去除。表6：葡萄糖和蔗糖上的DD1和DD1ΔwcaJ菌株培養(yǎng)。a培養(yǎng)時(shí)間b底物(葡萄糖或蔗糖)的消耗c琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸、丙酸和乙醇的形成gSA產(chǎn)率(每份所消耗的底物的SA定量)h發(fā)現(xiàn)乙酸、乳酸、蘋果酸和甲酸的檢測(cè)限在給定HPLC方法中低于0.01g/l表7：葡萄糖和蔗糖上的DD1ΔldhAΔpflD菌株和DD1ΔldhAΔpflDΔwcaJ菌株培養(yǎng)。a培養(yǎng)時(shí)間b底物(葡萄糖或蔗糖)的消耗c琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸、丙酸和乙醇的形成gSA產(chǎn)率(每份所消耗的底物的SA定量)h發(fā)現(xiàn)乙酸、乳酸、蘋果酸和甲酸的檢測(cè)限在給定HPLC方法中低于0.01g/l表8：葡萄糖和蔗糖上的DD1ΔldhAΔpflA菌株和DD1ΔldhAΔpflAΔwcaJ菌株培養(yǎng)。a培養(yǎng)時(shí)間b底物(葡萄糖或蔗糖)的消耗c琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸、丙酸和乙醇的形成gSA產(chǎn)率(每份所消耗的底物的SA定量)h發(fā)現(xiàn)乙酸、乳酸、蘋果酸和甲酸的檢測(cè)限在給定HPLC方法中低于0.01g/l菌株底物培養(yǎng)時(shí)間上清體積DD1ΔldhAΔpflD葡萄糖24h8,0mLDD1ΔldhAΔpflDΔwcaJ葡萄糖24h8,8mLDD1ΔldhAΔpflA葡萄糖24h8,0mLDD1ΔldhAΔpflAΔwcaJ葡萄糖24h8,4mLDD1ΔldhAΔpflD蔗糖48h8,3mLDD1ΔldhAΔpflDΔwcaJ蔗糖48h9,0mLDD1ΔldhAΔpflA蔗糖48h8,3mLDD1ΔldhAΔpflAΔwcaJ蔗糖48h8,6mL表9：離心(4600轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)10ml細(xì)菌培養(yǎng)物后獲得的上清體積。表10：用于分析葡萄糖、琥珀酸、甲酸、乳酸、乙酸、丙酮酸和乙醇的HPLC方(ZX-THF50)法。表11：用于分析葡萄糖和蔗糖的HPLC方法(Fast-CH)。序列SEQIDNO:1(菌株DD1的16SrDNA的核苷酸序列)SEQIDNO:2(菌株DD1的23SrDNA的核苷酸序列)SEQIDNO:3(來(lái)自菌株DD1的wcaJ基因的核苷酸序列)SEQIDNO:4(以上wcaJ基因編碼的酶的氨基酸序列)SEQIDNO:5(質(zhì)粒pSacB的完整核苷酸序列)SEQIDNO:6(質(zhì)粒pSacB_delta_ldhA的完整核苷酸序列)SEQIDNO:7(質(zhì)粒pSacB_delta_pflA的完整核苷酸序列)SEQIDNO:8(質(zhì)粒pSacB_wcaJ的完整核苷酸序列)SEQIDNO:9(質(zhì)粒pSacB_pflD的完整核苷酸序列)SEQIDNO:10(來(lái)自菌株DD1的ldhA基因的核苷酸序列)SEQIDNO:11(來(lái)自菌株DD1的LdhA的氨基酸序列)SEQIDNO:12(來(lái)自菌株DD1的pflA基因的核苷酸序列)SEQIDNO:13(來(lái)自菌株DD1的PflA的氨基酸序列)SEQIDNO:14(來(lái)自菌株DD1的pflD基因的核苷酸序列)SEQIDNO:15(來(lái)自菌株DD1的PflD的氨基酸)SEQIDNO:16(核苷酸81和82之間插入胞嘧啶的來(lái)自菌株DD1的wcaJ基因的核苷酸序列)打印輸出(電子表格原件)(該頁(yè)不作為國(guó)際申請(qǐng)的一部分并且不作國(guó)際申請(qǐng)頁(yè)計(jì))僅供受理局使用僅供國(guó)際局使用當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3