洗滌劑組合物的制作方法

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本申請包括計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及包括脫氧核糖核酸酶(DNA酶)的洗滌劑和藥物組合物，其中該DNA酶獲得自真菌來源。本發(fā)明進(jìn)一步涉及洗滌方法和DNA酶的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有DNA酶活性的多肽、連同生產(chǎn)這些多肽的方法。

發(fā)明背景

在許多自然、工業(yè)和醫(yī)療環(huán)境中，微生物一般附著于表面而生存，由包括生物聚合物和高分子的細(xì)胞外物質(zhì)進(jìn)行囊化。經(jīng)粘液囊化的微生物所產(chǎn)生的層被稱為生物膜。生物膜是細(xì)菌在自然環(huán)境中生長的主要模式，并且在生物膜中生長的細(xì)菌表現(xiàn)出獨(dú)特的生理性質(zhì)。與其浮游生長的對應(yīng)物相比，生物膜中的細(xì)菌更耐受抗生素、紫外光照射、洗滌劑和宿主免疫應(yīng)答。

生物膜可以包括一種或多種微生物，包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌、藻類、原生動物、和/或酵母或絲狀真菌和病毒和/或噬菌體。有問題的生物膜的實(shí)例是牙菌斑，醫(yī)學(xué)植入物的上的感染，還有船體上的初始污染。生物膜歸因于人類許多感染的發(fā)病機(jī)理，并且就暴露面的生物污著而論在工業(yè)中是一個(gè)顯著問題，其中生物膜定植可以形成能夠破壞并且干擾工業(yè)方法和組分的局部生態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ)組分。

當(dāng)使用衣物(像T恤或運(yùn)動衣)時(shí)，它們暴露于來自使用者的身體和來自它們使用的環(huán)境的其余部分的細(xì)菌。這些細(xì)菌中的一些能夠粘附于衣物物品并且在該物品上形成生物膜。細(xì)菌的存在意味著，衣物物品變得粘稠，并且因此污垢粘附在粘稠區(qū)域上。這種污垢已經(jīng)顯示出難以通過可商購的洗滌劑組合物來去除。此外，當(dāng)非常臟的衣物物品與不太臟的衣物物品一起洗滌時(shí)，洗滌液中存在的污物傾向于附著于生物膜上。其結(jié)果是，該衣物物品在洗滌后比洗滌前更“臟”。此外，這些細(xì)菌是難聞的氣味的來源，在對衣物物品使用后產(chǎn)生難聞的氣味。難聞的氣味難以去除，并且即使在洗滌后仍可存在。這種難聞的氣味的原因是細(xì)菌粘附到紡織品表面。由于粘附到紡織品上，即使洗滌后細(xì)菌仍可存在，并且繼續(xù)成為難聞的氣味的來源。

國際專利申請WO 2011/098579涉及細(xì)菌脫氧核糖核酸酶化合物以及用于破壞和預(yù)防生物膜的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及包括脫氧核糖核酸酶(DNA酶)和洗滌劑佐劑成分的洗滌劑組合物，其中該DNA酶獲得自真菌來源。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于清潔或洗滌物品的清潔或洗滌方法，該方法包括以下步驟：

a.將一種物品暴露于一種洗滌液，該洗滌液包括真菌DNA酶或包括真菌DNA酶的洗滌劑組合物；

b.完成至少一個(gè)洗滌循環(huán)；以及

c.任選地沖洗該物品，

其中該物品是一種紡織品。

此外，要求保護(hù)的是DNA酶用于防止、減少或去除物品的生物膜的用途。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有DNA酶活性的多肽以及生產(chǎn)該多肽的方法。

本發(fā)明還涉及包括DNA酶和醫(yī)療裝置的藥物組合物。

定義

等位基因變體：術(shù)語“等位基因變體”意指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或更多種可替代形式中的任一種。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在所編碼的多肽中沒有改變)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。

生物膜：生物膜是在表面上，例如紡織品、餐具或硬表面上，細(xì)胞彼此粘附在一起的任何群組的微生物。這些粘附細(xì)胞經(jīng)常包埋在胞外高聚物(EPS)的自身產(chǎn)生的基質(zhì)內(nèi)。生物膜EPS是一般由細(xì)胞外的DNA、蛋白、和多糖組成的聚合物團(tuán)塊。生物膜可以形成在活的或非活的表面上。在生物膜中生長的微生物細(xì)胞與同一有機(jī)體的浮游細(xì)胞(相比之下，浮游細(xì)胞是可以在液體培養(yǎng)基中漂浮或浮游的單個(gè)細(xì)胞)是在生理上不同的。

生活在生物膜中的細(xì)菌通常具有與同一物種的自由漂浮細(xì)菌顯著不同的特性，因?yàn)楸荒さ拿芗⑶沂鼙Ｗo(hù)的環(huán)境允許它們以不同方式協(xié)作和相互作用。這一環(huán)境的一個(gè)益處是增加對洗滌劑和抗生素的抗性，因?yàn)椋芗募?xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞的外層保護(hù)群落的內(nèi)部。

在衣物上，會發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生生物膜的細(xì)菌是在以下物種中：不動桿菌屬物種、氣微菌屬物種、短波單胞菌屬物種、微桿菌屬物種、滕黃微球菌、假單胞菌屬物種、表皮葡萄球菌、和寡養(yǎng)單胞菌屬物種。

cDNA：術(shù)語“cDNA”意指可以通過從得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mRNA分子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。早先的初始RNA轉(zhuǎn)錄本是mRNA的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mRNA之前要經(jīng)一系列的步驟進(jìn)行加工，包括剪接。

編碼序列：術(shù)語“編碼序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般由一個(gè)開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從一個(gè)起始密碼子(如ATG、GTG或TTG)開始并且以一個(gè)終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。

色差(L值)：Lab色彩空間是針對明度具有尺寸L的色彩對立的空間。L值，L*代表在L*＝0下的最暗的黑色，并且為在L*＝100下的最亮的白色。在本發(fā)明的上下文中，L值還稱為色差。

控制序列：術(shù)語“控制序列”意指對于表達(dá)編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。各個(gè)控制序列可以相對于編碼多肽的多核苷酸是天然的(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或相對于彼此是天然的或外源的。此類控制序列包括但不限于前導(dǎo)子、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼多肽的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，這些控制序列可以提供有多個(gè)接頭。

關(guān)于術(shù)語“深度清潔”意指生物膜或生物膜的組分，例如多糖、蛋白、DNA、污垢或生物膜中存在的其他組分的破壞或除去。

洗滌劑佐劑成分：洗滌劑佐劑成分不同于本發(fā)明的DNA酶。這些額外佐劑組分的精確性質(zhì)、其摻入水平將取決于組合物的物理形式和將在其中使用組合物的操作的性質(zhì)。適合的佐劑材料包括，但不限于：以下描述的組分，如表面活性劑、助洗劑、絮凝助劑、螯合劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、酶、酶穩(wěn)定劑、酶抑制劑、催化材料、漂白活化劑、過氧化氫、過氧化氫源、預(yù)形成的過酸、聚合的分散劑、粘土去污劑/抗再沉淀劑、增白劑、抑泡劑、染料、香料、結(jié)構(gòu)彈力劑、織物柔軟劑、載體、助水溶物、助洗劑和共助洗劑、織物調(diào)色劑、防沫劑、分散劑、加工助劑、和/或顏料。

洗滌劑組合物：術(shù)語“洗滌劑組合物”是指用于從有待清潔的物品(例如紡織品)除去不希望的化合物的組合物。該洗滌劑組合物可以用于例如清潔紡織品，用于家用清潔劑和工業(yè)清潔二者。這些術(shù)語涵蓋選擇用于希望的具體類型的清潔組合物和產(chǎn)品的形式(例如，液體、凝膠、粉末、顆粒、糊狀、或噴霧組合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗滌劑組合物(例如，液體和/或固體衣物洗滌劑和精細(xì)織物洗滌劑；織物清新劑；織物柔軟劑；以及紡織品和衣物預(yù)去污劑/預(yù)處理)。除了包含本發(fā)明的酶之外，該洗滌劑配制品還可以包含一種或多種另外的酶(例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果膠酶、果膠裂解酶、黃原膠酶、過氧化物酶、鹵代過氧合酶、過氧化氫酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物)，和/或組分，例如表面活性劑、助洗劑、螯合劑(chelator)或螯合試劑(chelating agent)、漂白系統(tǒng)或漂白組分、聚合物、織物調(diào)理劑、增泡劑、抑泡劑、染料、香料、晦暗抑制劑、光學(xué)增亮劑、殺細(xì)菌劑、殺真菌劑、污垢懸浮劑、防蝕劑、酶抑制劑或穩(wěn)定劑、酶激活劑、一種或多種轉(zhuǎn)移酶、水解酶、氧化還原酶、上藍(lán)劑和熒光染料、抗氧化劑以及增溶劑。

DNA酶：術(shù)語“DNA酶”意指具有DNA酶活性的多肽，該多肽催化DNA主鏈中的磷酸二酯鍵的水解斷裂，從而降解DNA。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)測定I中所描述的程序確定DNA酶活性。在一方面，本發(fā)明的這些多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的DNA酶活性。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽具有改進(jìn)的DNA酶活性，例如，這樣使得該多肽的DNA酶活性是關(guān)于SEQ ID NO:2的成熟多肽的DNA酶活性的至少105％，例如，至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少160％、至少170％、至少180％、或至少200％。

酶洗滌益處：在此將術(shù)語“酶洗滌益處”定義為將一種酶添加至洗滌劑中與不具有該酶的同一洗滌劑相比的有利效果?？梢杂擅柑峁┑闹匾南礈煲嫣幨窃谙礈旌?或清潔之后沒有或有非常少的可見污垢的污漬去除，預(yù)防或減少在洗滌過程中釋放的污垢的再沉積(一種也被稱作抗再沉積的效果)，完全或部分恢復(fù)紡織品的白度(一種也被稱作增白的效果)，這些紡織品初始是白色的但是在重復(fù)使用和洗滌后獲得淺灰色或淺黃色的外觀。不直接與污垢的催化去污或其再沉積的預(yù)防相關(guān)的紡織品護(hù)理益處對于酶洗滌益處而言也是重要的。此類紡織品護(hù)理益處的實(shí)例是預(yù)防或減少染料從一織物轉(zhuǎn)移至另一織物或同一織物的另一部分(一種也被稱作染料轉(zhuǎn)移抑制或抗返染的效果)，從織物表面去除突出或斷裂的纖維以減少起球傾向或去除已經(jīng)存在的絨球或絨毛(一種也被稱作抗起球的效果)，改善織物柔軟性，織物的顏色澄清以及去除陷在織物或服裝的纖維中的微粒狀污垢。酶漂白是一種另外的酶洗滌益處，其中通常將催化活性用于催化漂白組分(例如過氧化氫或其他過氧化物)的形成。

表達(dá)：術(shù)語“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。

表達(dá)載體：術(shù)語“表達(dá)載體”意指線性或環(huán)狀DNA分子，該分子包含編碼多肽的多核苷酸并且該多核苷酸可操作地與提供用于其表達(dá)的控制序列相連接。

片段：術(shù)語“片段”意指具有從成熟多肽或結(jié)構(gòu)域的氨基和/或羧基端缺失的一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))氨基酸的多肽；其中片段具有DNA酶活性。在一方面，片段包含至少139個(gè)氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸50至188)、或至少188個(gè)氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至188)。

真菌的：在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“真菌的”相對于多肽(如酶，例如，DNA酶)是指由真菌基因組編碼并且因此直接從真菌基因組衍生的多肽，其中這種真菌未經(jīng)過遺傳修飾來編碼所述多肽，例如，通過重組DNA技術(shù)將編碼序列引入基因組中。因此，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“真菌DNA酶”或“獲得自真菌來源的具有DNA酶活性的多肽”是指由真菌基因組編碼并且因此直接從真菌基因組衍生的DNA酶，其中該真菌物種未經(jīng)受通過引入編碼所述DNA酶的重組DNA進(jìn)行的遺傳修飾。因此，編碼具有DNA酶活性的真菌多肽的核苷酸序列是真菌物種遺傳背景中的天然序列。由這種序列編碼的具有DNA酶活性的真菌多肽還可以是指野生型DNA酶(或親本DNA酶)。在另一方面，本發(fā)明提供了具有DNA酶活性的多肽，其中所述多肽與真菌DNA酶基本上同源。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“基本上同源”表示一種具有DNA酶活性的多肽，該多肽與所選擇的真菌DNA酶的氨基酸序列具有至少80％，優(yōu)選地至少85％，更優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％，甚至更優(yōu)選地至少96％、97％、98％，以及最優(yōu)選地至少99％的一致性。與真菌DNA酶基本上同源的多肽可以被包括于本發(fā)明的洗滌劑中，和/或在本發(fā)明的方法中使用。

宿主細(xì)胞：術(shù)語“宿主細(xì)胞”意指易于用包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。

改進(jìn)的洗滌性能：術(shù)語“改進(jìn)的洗滌性能”在此定義為相對于沒有酶的相同洗滌劑組合物的洗滌性能，展示出洗滌劑組合物中增加的洗滌性能的酶，例如，通過增加去污或較少的再沉積。術(shù)語“改進(jìn)的洗滌性能”包括在衣物中的洗滌性能。

分離的：術(shù)語“分離的”是指處于非天然發(fā)生的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括(1)任何非天然存在的物質(zhì)，(2)包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白、肽或輔因子的任何物質(zhì)，該物質(zhì)至少部分地從與其本質(zhì)相關(guān)的一種或多種或所有天然存在的成分中去除；(3)相對于天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)通過人工修飾的任何物質(zhì)；或(4)通過相對于與其天然相關(guān)的其他組分，增加物質(zhì)的量而修飾的任何物質(zhì)(例如，宿主細(xì)胞中的重組產(chǎn)生；編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；以及比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)聯(lián)的啟動子更強(qiáng)的啟動子的使用)而修飾的任何物質(zhì)。分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中，例如，可以將宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾來表達(dá)本發(fā)明多肽。來自宿主細(xì)胞的發(fā)酵液將包括分離的多肽。

洗衣：術(shù)語“洗衣”涉及家用洗衣和工業(yè)洗衣兩者并且意指用包含本發(fā)明的清潔或洗滌劑組合物的溶液處理紡織品的過程。洗衣過程可以例如使用例如家用或工業(yè)洗衣機(jī)進(jìn)行或可以手動進(jìn)行。

關(guān)于術(shù)語“惡臭”意指在清潔物品上不希望的氣味。清潔的物品應(yīng)氣味清新并且干凈，而沒有附著在該物品上的惡臭。惡臭的一個(gè)實(shí)例是具有使人不愉快的氣味的化合物，這些化合物可以是微生物產(chǎn)生的。另一實(shí)例是令人不愉悅的氣味可以是附著至已經(jīng)與人類或動物接觸的物品的汗水或體味。惡臭的另一實(shí)例可以是來自香料的氣味，其粘附于物品，例如氣味強(qiáng)烈的咖喱或其他異國香料。測量物品附著惡臭的能力的一個(gè)方式是通過使用在此披露的測定II。

成熟多肽：術(shù)語“成熟多肽”意指在翻譯和任何翻譯后修飾如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至188，并且SEQ ID NO:2的氨基酸-17至-1是信號肽。在本領(lǐng)域中已知的是，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同成熟多肽(即，具有一個(gè)不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本領(lǐng)域還已知，不同的宿主細(xì)胞不同地加工多肽，并且因此一個(gè)表達(dá)一種多核苷酸的宿主細(xì)胞當(dāng)與另一個(gè)表達(dá)相同多核苷酸的宿主細(xì)胞相比時(shí)可以產(chǎn)生一種不同的成熟多肽(例如，具有一個(gè)不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。在一方面，成熟多肽包含高達(dá)139個(gè)氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸50至188)、高達(dá)188個(gè)氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至188)。

成熟多肽編碼序列：術(shù)語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有DNA酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO:1的核苷酸52至864。在SEQ ID NO:1的序列：76-164、289-362和520-615中預(yù)測出三個(gè)內(nèi)含子。分泌信號在位置1-51處。

核酸構(gòu)建體：術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指單鏈或雙鏈的核酸分子，該核酸分子是從天然存在的基因中分離的，或以本來不存在于自然界中的方式被修飾成含有核酸的區(qū)段，或是合成的，該核酸分子包括一個(gè)或多個(gè)控制序列。

可操作地連接：術(shù)語“可操作地連接”意指如下的構(gòu)造，其中，控制序列相對于多核苷酸的編碼序列安置在適當(dāng)位置處，從而使得該控制序列指導(dǎo)該編碼序列的表達(dá)。

藥物佐劑成分意指適用于配制藥物化合物的任何藥物賦形劑。

此類賦形劑、載體、運(yùn)載體等對本領(lǐng)域中技術(shù)人員是熟知的，并且描述于如雷明頓藥學(xué)大全，Mack出版公司，伊斯頓，賓夕法尼亞州，1985的教科書中。

適用于片劑配制品中的藥學(xué)上可接受的賦形劑包括例如惰性稀釋劑如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；制粒劑或崩解劑，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；以及潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。片劑可以是未包衣的，或者它們可以通過已知的技術(shù)來包衣以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，并且由此在一個(gè)更長時(shí)期提供持久的作用。例如，可以采用延時(shí)材料，例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

針對硬膠囊配制品，可以將活性成分與惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土混合。針對軟膠囊劑配制品，可以將活性成分與水或油介質(zhì)，例如，花生油、液體石蠟或橄欖油混合。

適用于制造水性懸浮液的賦形劑包括助懸劑，例如，羧甲纖維素鈉，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，藻酸鈉，聚乙烯基吡咯烷酮，黃蓍膠和阿拉伯膠；分散或潤濕劑可以是天然磷脂，例如卵磷脂，或烯烴氧化物與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或環(huán)氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物，例如，十七亞乙基氧基鯨蠟醇，或環(huán)氧乙烷與獲得自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物，比如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與獲得自脂肪酸和己糖醇脫水物的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚乙烯脫水山梨醇單油酸酯。

水性混懸劑還可包含一或多種防腐劑，例如苯甲酸鹽，如對羥基苯甲酸乙酯或?qū)αu基苯甲酸正丙酯；一或多種著色劑；一或多種調(diào)味劑；以及一或多種甜味劑，例如蔗糖或糖精。

含油懸浮液可以這樣配制：將活性成分懸浮于植物油，例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油中，或于礦物質(zhì)油比如液狀石蠟中。所述油懸浮液可以含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或十六烷醇。可以添加甜味劑和調(diào)味劑。這些組合物可以通過加入抗氧化劑，如抗壞血酸維生素C來保存。

序列一致性：用參數(shù)“序列一致性”來描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件，賴斯(Rice)等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(Trends Genet.)16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德爾程序中所實(shí)施的尼德爾曼-翁施算法(尼德爾曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48:443-453)來確定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性。使用的參數(shù)為空位開放罰分(gap open penalty)10，缺口延伸罰分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的“最長的一致性”的輸出(使用-非簡化選項(xiàng)獲得)被用作百分比一致性，并且計(jì)算如下：

(一致的殘基x 100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))

出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件，賴斯(Rice)等人，2000，見上文)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德爾程序中所實(shí)施的尼德爾曼-翁施算法(尼德爾曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，見上文)來確定兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10，空位延伸罰分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的“最長的一致性”的輸出(使用-非簡化選項(xiàng)獲得)被用作百分比一致性，并且計(jì)算如下：

(同樣的脫氧核糖核苷酸×100)/(比對長度－比對中缺口的總數(shù))

嚴(yán)格條件：術(shù)語“非常低嚴(yán)格條件”意指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

術(shù)語“低嚴(yán)格條件”意指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針來說，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并變性的鮭魚精子DNA和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。最后在50℃使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

術(shù)語“中嚴(yán)格條件”意指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針來說，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并變性的鮭魚精子DNA和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

術(shù)語“中-高嚴(yán)格條件”意指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針來說，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并變性的鮭魚精子DNA和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。最后在60℃使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

術(shù)語“高嚴(yán)格條件”意指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針來說，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并變性的鮭魚精子DNA和50％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

術(shù)語“非常高嚴(yán)格條件”意指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針來說，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并變性的鮭魚精子DNA和50％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

子序列：術(shù)語“子序列”意指使一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))核苷酸從成熟多肽編碼序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中該子序列編碼具有DNA酶活性的片段。在一方面，子序列包含至少587個(gè)核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸278至864)，至少650個(gè)核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸215至864)，或至少816個(gè)核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸52至864)。

紡織品：術(shù)語“紡織品”意指包括紗線、紗線中間體、纖維、非機(jī)織物材料、天然材料、合成材料、以及任何其他紡織品材料的任何紡織品材料，這些材料制造的織物和由這些織物制成的產(chǎn)品(例如服裝和其他物品)。該紡織品或織物可以處于針織品、機(jī)織物、牛仔布、非機(jī)織物、氈、紗線、以及毛巾布的形式。這些紡織品可以是纖維素基的，如天然纖維素，包括棉、亞麻/亞麻布、黃麻、苧麻、劍麻或椰殼纖維或者人造纖維素(例如，來源于木漿)，包括纖維膠/人造絲、醋酸纖維素纖維(三胞)、萊賽爾纖維(lyocell)或其共混物。紡織品或織物也可以不基于纖維素，如天然聚酰胺，包括羊毛、駝毛、羊絨、馬海毛、兔毛和蠶絲或合成聚合物如尼龍、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨綸/彈性纖維(spandex/elastane)、或其共混物其以及基于纖維素和不基于纖維素的纖維的共混物。共混物的實(shí)例是棉布和/或人造絲/纖維膠與一種或幾種伴隨材料的共混物，該伴隨材料例如是羊毛、合成纖維(例如聚酰胺纖維、丙烯酸纖維、聚酯纖維、聚氯乙烯纖維、聚氨酯纖維、聚脲纖維、芳族聚酰胺纖維)和/或含纖維素的纖維(例如人造絲/纖維膠、苧麻、亞麻/亞麻布、黃麻、醋酸纖維素纖維、萊賽爾纖維)?？椢锟梢允浅Ｒ?guī)的可洗滌衣物，例如玷污的家居衣物。當(dāng)使用術(shù)語織物或服裝時(shí)，旨在也包括廣義術(shù)語紡織品。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“紡織品”還包括織物。

變體：術(shù)語“變體”意指在一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))位置處包括改變(即，取代、插入和/或缺失)的具有DNA酶活性的一個(gè)多肽。取代意指占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸替換不同的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸；并且插入意指在鄰接并且緊隨占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸之后添加一個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的上下文中，所鑒別的DNA酶的變體具有親本的酶活性，即，催化DNA主鏈中的磷酸二酯鍵水解斷裂的能力(脫氧核糖核酸酶活性)。在一個(gè)實(shí)施例中，變體的脫氧核糖核酸酶活性關(guān)于親本DNA酶是增加的，例如，SEQ ID NO:2的成熟多肽。

洗滌周期：在此將術(shù)語“洗滌周期”定義為一個(gè)洗滌操作，其中將紡織品浸泡在洗液中，將某種機(jī)械作用施加至該紡織品，以釋放污物，并且協(xié)助洗液流進(jìn)和流出該紡織品，并且最終去除多余的洗液。在一個(gè)或多個(gè)洗滌周期后，總體上對該紡織品進(jìn)行沖洗和干燥。

洗液：在此將術(shù)語“洗液”定義為任選地包括本發(fā)明的酶的水和洗滌劑組合物的溶液或混合物。

白度：在此將術(shù)語“白度”定義為在不同領(lǐng)域并且針對不同顧客具有不同含義的廣義術(shù)語。白度的損失可以例如歸因于灰化、黃化、或光學(xué)增亮劑/調(diào)色劑的去除?；一忘S化可歸因于污垢再沉積、身體污垢、來自例如鐵和銅離子或染料轉(zhuǎn)移的著色。白度可包括來自以下列表的一個(gè)或若干個(gè)問題：著色劑或染料作用；不完全污物去除(例如身體污垢、皮脂等)；再沉積(物體的灰化、黃化或其他變色)(去除的污垢與紡織品的其他部分(弄臟的或未弄臟的)再關(guān)聯(lián))；在應(yīng)用過程中紡織品的化學(xué)變化；以及顏色的澄清或淡色化。

本發(fā)明詳細(xì)說明

諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，具有脫氧核糖核酸酶(DNA酶)活性并且獲得自真菌來源的多肽可以用于防止或去除物品如紡織品和/或織物上的生物膜。當(dāng)物品上存在微生物并且在物品上粘在一起時(shí)，生物膜會在紡織品上發(fā)展。一些微生物傾向于粘附至物品(例如紡織品)的表面上。一些微生物粘附在此類表面上并且在表面上形成生物膜。生物膜可以是粘性的并且粘附的微生物和/或生物膜是難以除去的。此外，由于生物膜的粘性性質(zhì)，生物膜粘附污垢。市場上可獲得的商業(yè)衣物洗滌劑組合物并不除去此類粘附的微生物或生物膜。

本發(fā)明涉及具有DNA酶活性的多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜的用途，其中具有DNA酶活性的多肽獲得自真菌來源并且其中該物品是紡織品。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，具有DNA酶活性的多肽用于防止、減少或除去物品的粘性?？梢詫⒕哂蠨NA酶活性的多肽進(jìn)一步用于預(yù)處理紡織品或織物上的污漬，如具有附著于紡織品的明顯量的生物膜的紡織品或織物。

此外，本發(fā)明涉及具有DNA酶活性的多肽在洗滌循環(huán)過程中用于防止、減少或去除污垢再沉積的用途。當(dāng)將該多肽用于例如紡織品或織物的洗滌中時(shí)，該多肽阻止洗滌液中存在的污垢沉積在紡織品或織物上。

此外，本發(fā)明涉及具有DNA酶活性的多肽用于防止、減少或去除污垢在物品上的附著。在一個(gè)實(shí)施例中，該物品是紡織品或織物。當(dāng)該污垢沒有附著于該物品時(shí)，該物品顯得更干凈。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有DNA酶活性的多肽用于維持或改進(jìn)該物品白度的用途。

當(dāng)使用物品(像T恤或運(yùn)動衣)時(shí)，它們暴露于來自使用者的身體和來自它們使用的環(huán)境的其余部分的細(xì)菌。這能夠引起物品上的惡臭，即使在洗滌該物品后。因此，本發(fā)明還涉及紡織品或織物上的惡臭的去除或減少。該惡臭可能由產(chǎn)生具有令人不愉快氣味的化合物的細(xì)菌引起。此類具有令人不愉快氣味的化合物的一個(gè)實(shí)例是E-2-壬烯醛。該惡臭可以存在于新洗的仍是濕的紡織品或織物上。或者該惡臭可以存在于新洗的基本上已經(jīng)干了的紡織品或織物上。該惡臭還可以存在于紡織品或織物上，該紡織品在洗滌后儲存了一段時(shí)間。本發(fā)明涉及從濕的或干的紡織品或織物減少或去除惡臭如E-2-壬烯醛。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括具有DNA酶活性的多肽和洗滌劑佐劑成分的洗滌劑組合物，其中該DNA酶獲得自真菌來源。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以用于從物品上防止、減少或去除生物膜，用于防止、減少或去除物品的粘性，用于預(yù)處理物品上的污漬，用于在洗滌循環(huán)過程中防止、用于減少或去除污垢在物品上的附著，用于維持或改進(jìn)物品的白度并且用于防止、減少或去除物品的惡臭。本發(fā)明的洗滌劑組合物克服了現(xiàn)有技術(shù)的問題。

諸位發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用其他洗滌劑酶進(jìn)行配制時(shí)，獲得自真菌來源的具有DNA酶活性的多肽比具有DNA酶活性的細(xì)菌多肽更穩(wěn)定。尤其，諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在包括蛋白酶的組合物中配制獲得自真菌來源的DNA酶時(shí)，真菌DNA酶比獲得自細(xì)菌來源的細(xì)菌DNA酶更穩(wěn)定。具有DNA酶活性的多肽可以獲得自木霉屬，例如，哈茨木霉。獲得自哈茨木霉的具有DNA酶活性的多肽已經(jīng)顯示出當(dāng)與蛋白酶一起配制時(shí)，比細(xì)菌DNA酶和蛋白酶的組合更穩(wěn)定。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該洗滌劑組合物包括如在此要求保護(hù)的具有DNA酶活性的多肽。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該洗滌劑佐劑成分選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：表面活性劑、助洗劑、絮凝助劑、螯合劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、酶、酶穩(wěn)定劑、酶抑制劑、催化材料、漂白活化劑、過氧化氫、過氧化氫源、預(yù)形成的過酸、聚合的分散劑、粘土去污劑/抗再沉淀劑、增白劑、抑泡劑、染料、香料、結(jié)構(gòu)彈力劑、織物柔軟劑、載體、助水溶物、助洗劑和共助洗劑、織物調(diào)色劑、防沫劑、分散劑、加工助劑、和/或顏料。

該洗滌劑佐劑成分可以是表面活性劑。在包括真菌DNA酶的洗滌劑組合物中包括表面活性劑的一個(gè)優(yōu)勢是洗滌性能得以改進(jìn)。

在一個(gè)實(shí)施例中，該洗滌劑佐劑成分是助洗劑或粘土去污劑/抗再沉淀劑。

在一個(gè)實(shí)施例中，洗滌劑佐劑成分是酶。該洗滌劑組合物可以包括一種或多種酶。該一種或多種酶可以選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和氧化酶。

諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與其他酶一起配制時(shí)，獲得自真菌來源的DNA酶顯示出良好的穩(wěn)定性。當(dāng)將細(xì)菌DNA酶與其他酶如蛋白酶一起配制時(shí)，獲得自細(xì)菌來源的DNA酶已經(jīng)顯示出具有不良的穩(wěn)定性。諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與獲得自細(xì)菌來源的DNA酶相比，獲得自真菌來源的DNA酶具有增加的穩(wěn)定性。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將本發(fā)明的洗滌劑組合物與一種蛋白酶一起配制，該蛋白酶是動物、植物或微生物來源的。將該蛋白酶進(jìn)行化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選是堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：芽胞桿菌屬，例如，枯草桿菌蛋白酶諾和(Novo)、枯草桿菌蛋白酶嘉士伯、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶168、牛源胰蛋白酶、豬源的胰蛋白酶和鐮孢屬蛋白酶。該蛋白酶可以與SEQ ID NO:7具有至少90％，如至少95％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該蛋白酶與SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％一致性、或在以下位置中的一個(gè)或多個(gè)具有取代的其變體：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、和274，優(yōu)選地，該變體是與SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％一致性的堿性蛋白酶，其具有以下取代：M222S或取代N76D+G195E。

在一個(gè)實(shí)施例中，該洗滌劑組合物能夠減少選自下組的細(xì)菌的附著至表面，該組由以下各項(xiàng)組成：不動桿菌屬、氣微菌屬、短波單胞菌屬、微桿菌屬、滕黃微球菌、假單胞菌屬、表皮葡萄球菌以及寡養(yǎng)單胞菌屬，或能夠使細(xì)菌從它們粘附至其上的表面釋放。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該表面是紡織品表面。該紡織品可以由棉、棉/聚酯、聚酯、聚酰胺、聚丙烯和/或絲綢制成。

該洗滌劑組合物可以被配制為條、均勻的片劑、具有兩個(gè)或更多個(gè)層的片劑、具有一個(gè)或多個(gè)室的袋、規(guī)則的或壓縮的粉末、顆粒、膏、凝膠、或規(guī)則的、壓縮的或濃縮的液體。該洗滌劑組合物可以是液體洗滌劑、粉狀洗滌劑或顆粒洗滌劑。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種液體洗滌劑組合物，包括總濃度按重量計(jì)是至少3％的表面活性劑和洗滌劑助洗劑，和含洗滌劑酶的微囊，其中該微囊的膜是通過具有高于1kDa分子量的多支化的多胺的交聯(lián)而產(chǎn)生。諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將酶包封在本發(fā)明具有半透膜的微囊中，并且在這些囊(在添加至該液體洗滌劑之前)中具有高于該液體洗滌劑中的水活度時(shí)，當(dāng)被添加到該洗滌劑(水正溢出)中時(shí)這些囊將經(jīng)歷(部分地)崩潰，因此在這些囊中留下更為濃縮的并且更粘的含酶內(nèi)部。該膜的崩潰還可導(dǎo)致可透性的降低。這可以通過添加穩(wěn)定劑/聚合物進(jìn)一步使用，尤其是不會通過該膜可透的那些。該崩潰和所得黏度增加將降低/妨礙敵對組分(例如，表面活性劑或螯合劑)擴(kuò)散進(jìn)入這些囊中，并且因此增加液體洗滌劑中酶的儲存穩(wěn)定性。該液體洗滌劑中的對該酶敏感的組分(例如，充當(dāng)該酶底物的組分)還被保護(hù)免于受該酶的降解。在洗滌過程中，該液體洗滌劑被水稀釋，因此增加了水活度。水現(xiàn)在將擴(kuò)散進(jìn)這些囊(滲透作用)中。這些囊將溶脹并且該膜將變得對該酶可透過由此它們可以離開這些囊，或簡單地脹裂并且以此方式釋放該酶。該概念在穩(wěn)定這些酶對抗液體洗滌劑中的敵對組分方面非常有效，反之亦然還保護(hù)該液體洗滌劑中酶敏感的組分不受酶的影響。

對酶敏感并且可以被酶降解的洗滌劑組分的實(shí)例包括(括號中的相關(guān)酶)：黃原膠(黃原膠酶)、具有酯鍵的聚合物(脂肪酶)、氫化蓖麻油(脂肪酶)、香料(脂肪酶)、甲酯磺酸鹽表面活性劑(脂肪酶)、纖維素和纖維素衍生物(例如，CMC)(纖維素酶)、和糊精和環(huán)糊精(淀粉酶)。

敏感的洗滌劑成分還可以被囊化，并且由此被穩(wěn)定化在本發(fā)明的微囊中。敏感的洗滌劑成分在儲存期間易于降解。這類洗滌劑成分包括漂白化合物、漂白活化劑、香料、聚合物、助洗劑、表面活性劑等。

通常，本發(fā)明的微囊可以被用于分離洗滌劑中不相容的組分/化合物。

將這些微囊添加到洗滌劑中可以被用于影響該洗滌劑產(chǎn)品的可視外觀，例如不透光效應(yīng)(小型微囊)或明顯可見的顆粒(大型微囊)的效應(yīng)。這些微囊也可以是著色的。

這些微囊可以被用于在處理和加工酶產(chǎn)品期間降低酶塵埃水平。

除非另外指明，貫穿本申請所有的百分比指示為重量百分比(％w/w)。

微囊：典型地，這些微囊通過將水滴形成不可與水混溶的連續(xù)體而產(chǎn)生-即典型地通過制備一種油包水乳劑-并且隨后通過界面聚合經(jīng)由添加一種交聯(lián)劑形成該膜。在最終固化之后，可以收獲這些囊并進(jìn)行進(jìn)一步清洗并通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行配制。隨后將該囊配制品加入該洗滌劑中。

有效負(fù)載、有待囊化的主膜成分和最終另外的組分是在水相中發(fā)現(xiàn)的。在該連續(xù)體中發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定化這些水滴趨向凝聚的組分(乳化劑、乳化穩(wěn)定劑、表面活性劑等)，并且還通過該連續(xù)體添加該交聯(lián)劑。

可以通過本領(lǐng)域中任何方法來制備該乳劑，例如，通過機(jī)械攪動、滴注方法、膜乳化、微流體技術(shù)、超聲處理等。在一些情況下，這些相的簡單混合將自動導(dǎo)致一種乳劑，通常被稱為自乳化。使用方法導(dǎo)致一個(gè)窄的粒度分布是有利的。

隨后典型地將該或這些交聯(lián)劑加入該乳劑中，這是直接或更典型地通過制備交聯(lián)劑在一種溶劑中的溶液，該溶劑在連續(xù)相中是可溶的。該乳劑和交聯(lián)劑或其溶液可以通過本領(lǐng)域中常規(guī)使用的方法來混合，例如，通過簡單混合或通過仔細(xì)地控制該乳劑以及該交聯(lián)劑溶液流動通過一個(gè)串聯(lián)混合器。

在一些情況下，需要固化這些囊來完成膜的形成。固化經(jīng)常是簡單的攪拌這些囊一段時(shí)間以允許界面聚合反應(yīng)結(jié)束。在其他情況下，該膜的形成可以通過添加反應(yīng)淬滅劑來終止。

這些囊可以被后修飾，例如通過使組分反應(yīng)到該膜上以阻礙或減少這些顆粒在如在WO 99/01534中所述的洗滌劑中的絮凝。

可以通過本領(lǐng)域中已知的方法分離或濃縮這些產(chǎn)生的囊，例如，通過過濾、離心、蒸餾或傾析該囊分散體。

這些所得囊可以被進(jìn)一步配制，例如，通過添加表面活性劑以賦予產(chǎn)物對于存儲、運(yùn)輸和稍后處理以及添加至洗滌劑的所需性質(zhì)。其他微囊配制劑包括流變改性劑、殺生物劑(例如，Proxel)、用于pH調(diào)節(jié)的酸/堿(其也將在這些微囊內(nèi)調(diào)節(jié))、以及用于調(diào)節(jié)水活度的水。

該囊形成方法可以包括以下步驟：

-制備初始的一個(gè)或多個(gè)水相和油相，

-形成油包水乳劑，

-通過界面聚合形成膜，

-任選的后修飾，

-任選的分離和/或配制，

-添加至洗滌劑。

該方法可以是一個(gè)分批法或是一個(gè)連續(xù)或半連續(xù)方法。

根據(jù)本發(fā)明的微囊是小型的水性球體，其周圍有一個(gè)均勻的膜。該微囊內(nèi)部的材料被稱為核心、內(nèi)相、或填充物，而該膜有時(shí)被稱為殼、包衣、或壁。本發(fā)明的這些微囊具有在0.5μm和2毫米之間的直徑。優(yōu)選地，這些微囊的平均直徑是在1μm至1000μm的范圍中，更優(yōu)選地在5μm至500μm的范圍中，甚至更優(yōu)選地在10μm至500μm的范圍中，甚至更優(yōu)選地在50μm至500μm的范圍中，并且最優(yōu)選地在50μm至200μm的范圍中。可替代地，這些微囊的直徑是在0.5μm至30μm的范圍中；或在1μm至25μm的范圍中。該微囊的直徑是當(dāng)聚合作用完成之后在油相中測定的。該囊的直徑可以根據(jù)周圍化學(xué)環(huán)境的水活度改變。

酶的微囊化(如本發(fā)明中所用的)可以通過界面聚合來進(jìn)行，其中聚合反應(yīng)中的這兩種反應(yīng)物在一個(gè)界面處相遇并且快速反應(yīng)。這一方法的基礎(chǔ)是多胺與酸衍生物的反應(yīng)，通常是酸性鹵化物，充當(dāng)一種交聯(lián)劑。該多胺優(yōu)選地是基本上水溶性的(當(dāng)處于游離堿形式時(shí))。在正確的條件下，柔性薄膜在該界面處快速形成。進(jìn)行該聚合作用的一種方式是使用該酶和多胺的一種水性溶液，其與一種非水溶劑(以及一種乳化劑)進(jìn)行乳化，并添加包含該酸衍生物的溶液。該酶溶液中可以存在堿劑以中和在該反應(yīng)過程中形成的酸。聚合物(聚酰胺)膜在這些乳滴的界面處立即形成。該微囊的聚合物膜典型地具有陽離子性質(zhì)，并且因此與具有陰離子性質(zhì)的化合物結(jié)合/絡(luò)合。

這些微囊的直徑是通過這些乳滴的大小而確定的，乳滴的大小通過例如攪拌速率來控制。

乳劑：乳劑是一個(gè)液相在第二液相內(nèi)暫時(shí)或永久的分散體。該第二液相通常被稱為連續(xù)相。表面活性劑通常用于幫助乳劑的形成和穩(wěn)定。不是所有的表面活性劑都能同樣地穩(wěn)定乳劑。需要針對最優(yōu)乳劑效用選擇表面活性劑的類型和數(shù)量，尤其是對于該乳劑的制備和物理穩(wěn)定性，以及在稀釋或進(jìn)一步加工過程中的穩(wěn)定性。物理穩(wěn)定性是指將乳劑以分散體形式進(jìn)行維持。例如凝聚、聚合、吸附至容器壁、沉降和乳油化的過程是物理不穩(wěn)定性的多種形式，并且應(yīng)被避免。合適的表面活性劑的實(shí)例描述于WO 97/24177，第19-21頁；以及WO 99/01534中。

可以將乳劑進(jìn)一步分類為簡單的乳劑，其中該分散的液相是一種簡單的均質(zhì)液體，或一種更復(fù)雜的乳劑，其中該分散的液相是液相或固相的非均質(zhì)組合，例如雙重乳劑或復(fù)合型乳劑。例如，可以形成一種油包水雙重乳劑或復(fù)合型乳劑，其中該水相本身進(jìn)一步含有乳化的油相；這種類型的乳劑可以被指定為一種油包水包油(o/w/o)乳劑?？商娲?，可以形成油包水乳劑，其中該水相含有分散的固相，通常被稱為一種懸浮液-乳劑?？梢悦枋銎渌鼜?fù)雜的乳劑。因?yàn)樵诿枋鲞@類系統(tǒng)方面固有的困難，術(shù)語乳劑用于描述簡單和更復(fù)雜的乳劑兩者，不必要限制乳劑的形式或存在的相類型和相數(shù)。

多胺：膜的剛性/柔性和可透性主要受多胺選擇的影響。根據(jù)本發(fā)明的多胺是一種多支化的多胺。每個(gè)分支(優(yōu)選地以一個(gè)伯氨基團(tuán)結(jié)束)充當(dāng)膜網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)系拴點(diǎn)，從而產(chǎn)生本發(fā)明的有利性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的多支化的多胺是一種具有多于兩個(gè)分支點(diǎn)和多于兩個(gè)反應(yīng)性氨基的多胺(能夠與交聯(lián)劑反應(yīng)，即，伯氨基團(tuán)和仲氨基團(tuán))。當(dāng)制備該乳劑時(shí)，該多支化的多胺被用作起始材料–它不是從其他起始材料原位形成的。為了得到本發(fā)明引人注目的特性，該多胺的多支化結(jié)構(gòu)必須作為起始材料存在。

分支點(diǎn)數(shù)目和伯胺數(shù)目之間存在密切的關(guān)系，由于伯胺將總是位于分支的末端：一個(gè)線性胺只能包含兩個(gè)伯胺。對于假設(shè)地引入這樣一種線性二胺的每個(gè)分支點(diǎn)將允許一個(gè)或多個(gè)伯胺引入到該或這些被引入的分支的末端。在本文中，我們將該伯氨基團(tuán)理解為該分支的一部分，即該分支的端點(diǎn)。例如，我們認(rèn)為三(2-氨乙基)胺或1,2,3-丙烷三胺都是具有一個(gè)分支點(diǎn)的分子。對于本發(fā)明，該多胺具有至少四個(gè)伯胺?？梢詮闹咀鍩N鏈(如在之前所述實(shí)例中)或從不飽和的碳鍵(例如在，例如3,3’-二氨基聯(lián)苯胺中)、或從叔氨基團(tuán)(例如在N,N,N’,N’-四-(2-氨乙基)乙二胺)中引入多個(gè)分支點(diǎn)。

除了分支點(diǎn)的數(shù)目之外，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)性氨基團(tuán)的緊密度非常重要。例如，N,N,N’,N’-四-(12-氨十二基)乙二胺的物質(zhì)是不適合的。肽或蛋白(例如一種酶)都不適合用于膜形成。因此，該多支化的多胺不是肽或蛋白。

在一個(gè)實(shí)施例中，這些反應(yīng)性氨基團(tuán)構(gòu)成該多支化的多胺至少15％的分子量，例如超過20％，或超過25％。優(yōu)選地，該多支化的多胺的分子量是至少為1kDa；更優(yōu)選地，該多支化的多胺的分子量是至少為1.3kDa。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該多支化的多胺是聚乙烯亞胺(PEI)，及其修飾體，具有多于兩個(gè)分支點(diǎn)和多于兩個(gè)反應(yīng)性氨基，其中這些反應(yīng)性氨基構(gòu)成該P(yáng)EI至少15％的分子量，例如超過20％，或超過25％。優(yōu)選地，該P(yáng)EI的分子量是至少為1kDa。

不同的多支化的多胺的組合可以用于制備根據(jù)本發(fā)明的微囊。

可以通過添加一種或多種具有小于1kDa分子量的小胺來改進(jìn)本發(fā)明的微囊的有利特性(例如，酶儲存穩(wěn)定性、降低的酶滲出、降低的洗滌劑成分的入通量)。該小胺優(yōu)選地是基本上水溶性的(當(dāng)處于游離堿形式時(shí))并且可以是一種例如乙二胺、六亞甲基二胺、己二胺、二亞乙基四胺、乙四胺、苯二胺、哌嗪、四亞甲基五胺或、優(yōu)選地二亞乙基三胺(DETA)的物質(zhì)。在制備本發(fā)明的微囊時(shí)，可以按小胺和多支化的多胺的總含量重量計(jì)高達(dá)50％、優(yōu)選地高達(dá)40％、高達(dá)30％、高達(dá)20％、高達(dá)10％、高達(dá)5％的量添加這些小胺。

交聯(lián)劑：如在本發(fā)明中所使用的交聯(lián)劑是一種具有至少兩個(gè)能夠與胺類反應(yīng)形成共價(jià)鍵的基團(tuán)/位點(diǎn)的分子。

該交聯(lián)劑優(yōu)選地是油可溶性的并且可以呈酸酐或酸性鹵化物的形式，優(yōu)選地為?；?。例如，它可以是己二酰氯、癸二酰氯、十二烷基二酰氯、鄰苯二甲酰氯、對苯二甲酰氯、間苯二甲酰氯、或均苯三甲酰氯，但優(yōu)選地，該交聯(lián)劑是對苯二甲酰氯或均苯三甲酰氯。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于洗滌物品的方法，該方法包括以下步驟：

a.將物品暴露于洗滌液，該洗滌液包括具有DNA酶活性的本發(fā)明的多肽或或包括該多肽的洗滌劑組合物；

b.完成至少一個(gè)洗滌循環(huán)；以及

c.任選地沖洗該物品，

其中該物品是一種紡織品。

該洗滌液的pH在7到10的范圍內(nèi)，如在7到9的范圍內(nèi)，在7到8的范圍內(nèi)或在7到7.5的范圍內(nèi)。

該洗滌液可以具有在5℃到95℃范圍內(nèi)，或在10℃到80℃范圍內(nèi)，在10℃到70℃范圍內(nèi)，在10℃到60℃范圍內(nèi)，在10℃到50℃范圍內(nèi)，在15℃到40℃范圍內(nèi)或在20℃到30℃范圍內(nèi)的溫度。在一個(gè)實(shí)施例中，該洗滌液的溫度是30℃。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用于洗滌物品的方法進(jìn)一步包括在完成洗滌循環(huán)后排掉洗滌液或部分洗滌液。然后可以將洗滌液在后續(xù)洗滌循環(huán)中或在后續(xù)沖洗循環(huán)中重復(fù)使用。在第一個(gè)和任選地第二個(gè)或第三個(gè)洗滌循環(huán)過程中，可以將該物品暴露于洗滌液。在一個(gè)實(shí)施例中，在暴露于洗滌液后，沖洗該物品?？梢詫⒃撐锲酚盟蛴冒ㄕ{(diào)節(jié)劑的水進(jìn)行沖洗。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明方法洗滌的物品。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括具有DNA酶活性的多肽和藥物佐劑成分的藥物組合物，其中該具有DNA酶活性的多肽獲得自真菌來源?？梢詫⒃摻M合物用于釋放或去除生物膜，或者防止生物膜形成。

抗寄生蟲化合物可以是以下各項(xiàng)中的一種或多種：苯并吡咯，如阿苯達(dá)唑、甲苯達(dá)唑和噻苯達(dá)唑；唑，如甲硝唑和替硝唑；大環(huán)，如兩性霉素B、利福平和伊維菌素；雙羥萘酸噻嘧啶；乙胺嗪；氯硝柳胺；吡喹酮；米拉索普(melarsopro)；和依氟鳥氨酸。

該抗病毒化合物可以是以下各項(xiàng)中的一種或多種：核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑中，如阿昔洛韋、地達(dá)諾新、司他夫定、疊氮胸苷、拉米夫定、阿巴卡韋、恩曲他濱和恩替卡韋；未包衣的抑制劑，如金剛胺、金剛乙胺和普拉康納利；蛋白酶抑制劑，如沙奎那韋、利托那韋、茚地那韋、奈非那韋和氨普那韋；扎那米韋；奧塞米韋；和利福平?？辜?xì)菌化合物可以是以下各項(xiàng)中的一種或多種：氨基糖苷，如慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素；β-內(nèi)酰胺，如青霉素、氨比西林和亞胺培南；頭孢菌素，如頭孢他啶、喹啉酮如環(huán)丙沙星；大環(huán)內(nèi)酯，如阿奇毒素、克拉霉素、地紅霉素、紅霉素、羅紅霉素和泰利霉素；噁唑烷酮，如利奈唑胺；袢霉素，如利福霉素；磺酰胺；四環(huán)素，如多西環(huán)素；糖肽，如萬古霉素；磺胺異噁唑、三甲氧芐二氨嘧啶、新生霉素、達(dá)托霉素和利奈唑胺。

抗真菌化合物可以是以下各項(xiàng)中的一種或多種：唑，如咪可納唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、奧莫康唑、聯(lián)苯芐唑、布康唑、芬替康唑、異康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、氟康唑、伊曲康唑、艾沙康唑、雷夫康唑、泊沙康唑、伏立康唑、特康唑和阿巴芬凈；大環(huán)，如納他霉素、龜裂殺菌素、非律平、制霉菌素、兩性霉素B、坎底辛、哈霉素；烯丙基胺，如特比萘芬、萘替芬和布替萘芬；棘球白素，如阿尼芬凈、卡泊芬凈和米卡芬凈；或其他如水蓼二醛、環(huán)吡酮、托萘酯、苯甲酸、十一烯酸、氟胞嘧啶和灰黃霉素。

本發(fā)明還涉及內(nèi)留置醫(yī)療裝置，其特征在于將所述裝置的病人可接觸表面的至少一部分用藥物組合物進(jìn)行涂覆。

該裝置可以是導(dǎo)管如中央靜脈導(dǎo)管、血管內(nèi)導(dǎo)管、導(dǎo)尿管、?？寺鼘?dǎo)管、腹膜透析管、氣管導(dǎo)管、或其中該裝置是機(jī)械心臟瓣膜、心臟起搏器、動靜脈分流、鞏膜扣、人工關(guān)節(jié)、鼓膜造孔插管、氣管造口管、聲音假體、陰莖假體、人工尿道括約肌、合成的恥骨陰道吊帶、手術(shù)用縫線、骨錨、骨螺釘、人工晶狀體、接觸鏡、宮內(nèi)節(jié)育器、主動脈股動脈移植物、血管移植物、針、Luer-Lok連接器、無針連接器或外科器械。

該藥物組合物可以被配制為液體、洗液、霜劑、噴霧劑、凝膠或軟膏。

該藥物組合物可以用于向動物患者給予。動物患者可以是哺乳動物患者。該哺乳動物患者可以是人類。

具有DNA酶活性的多肽可以獲得自木霉屬，例如，哈茨木霉。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，具有DNA酶活性的多肽是要求保護(hù)的多肽。

本發(fā)明的一方面涉及與SEQ ID NO:2成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的分離的多肽，這些分離的多肽具有DNA酶活性。在一方面，這些多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有多達(dá)10個(gè)(例如1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、或10個(gè))氨基酸的差異。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的具有DNA酶活性的分離多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少90％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少91％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少92％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少93％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少94％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少95％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少96％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少97％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少98％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少99％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有100％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽，并且將該多肽用于從物品上防止、減少或除去生物膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。本發(fā)明的多肽優(yōu)選地包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因變體或由其組成；或?yàn)槠渚哂蠨NA酶活性的片段。在另一方面，該多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其組成。在另一方面，該多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至188或由其組成。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種具有DNA酶活性的分離的多肽，該分離的多肽是由在低嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全長補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸所編碼(薩姆布魯克等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，紐約冷泉港)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種具有DNA酶活性的分離的多肽，該分離的多肽是由在低-中嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全長補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸所編碼。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種具有DNA酶活性的分離的多肽，該分離的多肽是由在中嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全長補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸所編碼。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種具有DNA酶活性的分離的多肽，該分離的多肽是由在中-高嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全長補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸所編碼。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種具有DNA酶活性的分離的多肽，該分離的多肽是由在高嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全長補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸所編碼。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種具有DNA酶活性的分離的多肽，該分離的多肽是由在非常高嚴(yán)格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全長補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸所編碼。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。

可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、連同SEQ ID NO:2的多肽或其片段來設(shè)計(jì)核酸探針，以便根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法鑒定和克隆編碼來自不同屬或種的菌株的具有DNA酶活性的多肽的DNA。具體地，可以遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，使用此類探針與感興趣的細(xì)胞的基因組DNA或cDNA雜交，以便鑒定和分離其中的對應(yīng)基因。這樣的探針可以大大短于整個(gè)序列，但是長度應(yīng)該為至少15個(gè)，例如至少25個(gè)、至少35個(gè)或至少70個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，核酸探針的長度為至少100個(gè)核苷酸，例如長度為至少200個(gè)核苷酸、至少300個(gè)核苷酸、至少400個(gè)核苷酸、至少500個(gè)核苷酸、至少600個(gè)核苷酸、至少700個(gè)核苷酸、至少800個(gè)核苷酸、或至少900個(gè)核苷酸。DNA和RNA探針二者均可使用。典型地將探針進(jìn)行標(biāo)記，用于檢測相應(yīng)的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白)。本發(fā)明涵蓋此類探針。

可以篩選從此類其他菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫的與上述探針雜交并編碼具有DNA酶活性的多肽的DNA。來自此類其他菌株的基因組DNA或其他DNA可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、或其他分離技術(shù)來分離。來自文庫的DNA或分離的DNA可轉(zhuǎn)移到并固定在硝酸纖維素或其他適合的載體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO:1或其子序列雜交的克隆或DNA，將載體材料用于DNA印跡中。

出于本發(fā)明的目的，雜交表示多核苷酸與對應(yīng)于以下項(xiàng)的標(biāo)記的核酸探針雜交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO：1的成熟多肽編碼序列；(iii)其cDNA序列，(iv)其全長互補(bǔ)體；或(v)其子序列；在非常低、低嚴(yán)格條件、低-中嚴(yán)格條件、中嚴(yán)格條件、中-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件至非常高嚴(yán)格條件下進(jìn)行。在這些條件下與該核酸探針雜交的分子可以使用例如X射線薄膜或本領(lǐng)域中已知的任何其他檢測手段進(jìn)行檢測。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種由以下多核苷酸編碼的具有DNA酶活性的多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少60％,，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。在另外的實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及在一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))位置處包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的變體。在一個(gè)實(shí)施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目多達(dá)10個(gè)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)。這些氨基酸變化可以具有微小性質(zhì)，即，不會顯著地影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基末端的或羧基末端的延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；高達(dá)20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或另一功能有利于純化的小的延伸，例如聚組氨酸段、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

保守取代的實(shí)例是在下組的范圍內(nèi)：堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸及組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸)。一般不會改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的并且例如由H.諾伊拉特(Neurath)和R.L.希爾(Hill)，1979，在蛋白質(zhì)(The Proteins)，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，紐約中描述。常見取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)：改變多肽的物理化學(xué)特性。例如，氨基酸改變可以改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適pH等。

可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的程序，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(坎寧漢(Cunningham)和威爾斯(Wells)，1989，科學(xué)(Science)244:1081-1085)來鑒定多肽中的必需氨基酸。在后一項(xiàng)技術(shù)中，在該分子中的每個(gè)殘基處引入單個(gè)丙氨酸突變，并且對所得突變體分子的DNA酶活性進(jìn)行測試以鑒定對于該分子的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。還參見希爾頓(Hilton)等人，1996，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可結(jié)合假定接觸位點(diǎn)氨基酸的突變，如通過以下技術(shù)例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記進(jìn)行確定，對結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理學(xué)分析，從而確定酶的活性位點(diǎn)或其他生物學(xué)相互作用。參見例如德沃斯(de Vos)等人，1992，科學(xué)(Science)255:306-312；史密斯等人，1992，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)224:899-904；沃德弗(Wlodaver)等人，1992，歐洲生物化學(xué)學(xué)會聯(lián)盟簡訊(FEBS Lett.)309:59-64。還可以從與相關(guān)多肽的比對推斷鑒別必需氨基酸。

可以做出單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用誘變、重組和/或改組的已知方法進(jìn)行測試，隨后進(jìn)行相關(guān)篩選程序，如由里德哈爾-奧爾森(Reidhaar-Olson)和薩奧爾(Sauer)，1988，科學(xué)(Science)241:53-57；博維(Bowie)和薩奧爾，1989，美國科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些?？梢允褂玫钠渌椒òㄒ族e(cuò)PCR、噬菌體展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化學(xué)(Biochemistry)30:10832-10837；美國專利號5,223,409；WO 92/06204)以及區(qū)域定向誘變(德比什爾(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；內(nèi)爾(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

可以結(jié)合誘變/改組方法與高通量自動化篩選方法來檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(內(nèi)斯(Ness)等人，1999，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)17:893-896)。編碼活性多肽的誘變的DNA分子可以回收自宿主細(xì)胞，并且使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法對其進(jìn)行迅速測序。這些方法允許迅速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。

多肽可以是雜合多肽，其中一個(gè)多肽的區(qū)域融合在另一多肽的區(qū)域的N-末端或C-末端。

多肽還可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在本發(fā)明的多肽的N-末端或C-末端。通過將編碼另一多肽的多核苷酸融合到本發(fā)明的多核苷酸而產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并且包括連接編碼多肽的編碼序列，這樣使得它們在框內(nèi)并且使得融合多肽的表達(dá)處于相同的一個(gè)或多個(gè)啟動子和終止子的控制下。融合多肽還可以使用內(nèi)含肽技術(shù)來構(gòu)建，其中融合多肽在翻譯后產(chǎn)生(庫珀(Cooper)等人，1993，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會雜志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科學(xué)(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在兩種多肽之間進(jìn)一步包括切割位點(diǎn)。在融合蛋白分泌之時(shí)，該位點(diǎn)被切割，從而釋放出這兩種多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于在以下文獻(xiàn)中披露的位點(diǎn)：馬丁(Martin)等人，2003，工業(yè)微生物與生物技術(shù)雜志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯維特娜(Svetina)等人，2000，生物技術(shù)雜志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威爾遜(Rasmussen-Wilson)等人，1997，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技術(shù)(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技術(shù)9:378-381；伊頓(Eaton)等人，1986，生物化學(xué)(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技術(shù)13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白質(zhì)：結(jié)構(gòu)、功能以及遺傳學(xué)(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，藥物發(fā)現(xiàn)世界(Drug Discovery World)4:35-48。

多核苷酸

本發(fā)明還涉及編碼如在此描述的多肽的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸已經(jīng)被分離。在另一個(gè)實(shí)施例中，編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸包括SEQ ID NO:8中所闡釋的多核苷酸序列，或由其組成。

用于分離或克隆多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的并且包括從基因組DNA或cDNA、或其組合進(jìn)行分離?？梢岳缤ㄟ^使用熟知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或表達(dá)文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段，實(shí)現(xiàn)從基因組DNA克隆多核苷酸。參見例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和應(yīng)用指南(PCR:A Guide to Methods and Application)，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，紐約?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增程序例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于多核苷酸的擴(kuò)增(NASBA)。這些多核苷酸可以由木霉屬菌株或相關(guān)生物體克隆，并且因此，例如可以是該多核苷酸的多肽編碼區(qū)的等位基因或種類變體。

編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的修飾對于合成基本上類似于該多肽的多肽可以是必需的。術(shù)語“基本上類似”于該多肽是指該多肽的非天然存在的形式。這些多肽在一些工程化方式方面可以不同于從其天然來源分離的多肽，例如具體活性、熱穩(wěn)定性、pH最佳值等方面不同的變體。這些變體可以基于以SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、或其cDNA序列(例如其子序列)形式呈現(xiàn)的多核苷酸，和/或通過引入不會改變該多肽的氨基酸序列，但對應(yīng)于預(yù)定用于產(chǎn)生該酶的宿主有機(jī)體的密碼子用法的核苷酸取代，或通過引入可以產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代來構(gòu)建。對于核苷酸取代的一般描述，參見例如，福德(Ford)等，1991，蛋白質(zhì)表達(dá)與純化(Protein Expression and Purification)2:95-107。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，該多核苷酸包括SEQ ID NO:8中所闡釋的多核苷酸序列，或由其組成，其中這些密碼子通過核苷酸取代進(jìn)行修飾，來對應(yīng)于預(yù)定用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的宿主有機(jī)體的密碼子用法。

核酸構(gòu)建體

本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，這些核酸構(gòu)建體包含可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制序列的本發(fā)明的多核苷酸，在與控制序列相容的條件下，這些控制序列指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。

可以用許多方式操作所述多核苷酸以便于多肽的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在多核苷酸插入載體之前對其進(jìn)行操縱可以是令人希望的或必需的。用于利用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。

該控制序列可以是一個(gè)啟動子，即，被宿主細(xì)胞識別以對編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸進(jìn)行表達(dá)的一種多核苷酸。該啟動子包含轉(zhuǎn)錄控制序列，這些序列介導(dǎo)該多肽的表達(dá)。該啟動子可以是在宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變型、截短型及雜合型啟動子，并且可以由編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。

在細(xì)菌宿主細(xì)胞中，適合指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的啟動子的實(shí)例是獲得自以下各項(xiàng)的啟動子：解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、蘇云金芽孢桿菌cryIIIA基因(阿蓋斯(Agaisse)和里瑞克拉斯(Lereclus)，1994，分子微生物學(xué)(Molecular Microbiology)13:97-107)、大腸桿菌lac操縱子、大腸桿菌trc啟動子(埃貢(Egon)等人，1988，基因)69:301-315)，天藍(lán)鏈霉菌瓊脂酶基因(dagA)、和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(維拉-卡瑪諾夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美國國家科學(xué)院院刊75:3727-3731)、連同tac啟動子(德波爾(DeBoer)等人，1983，美國國家科學(xué)院院刊80:21-25)。另外的啟動子描述于“來自重組細(xì)菌的有用蛋白(Useful proteins from recombinant bacteria)”，吉爾伯特(Gilbert)等人，1980，科學(xué)美國人(Scientific American)，242:74-94；以及薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989，同上。串聯(lián)啟動子的實(shí)例披露在WO 99/43835中。

用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例是從以下各項(xiàng)的基因獲得的啟動子：構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣蛋白酶(WO 96/00787)、鑲片鐮孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、鑲片鐮孢菌Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、鑲片鐮孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，和里氏木霉翻譯延伸因子，連同NA2tpi啟動子(修飾的啟動子，其來自曲霉屬中性α-淀粉酶基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由曲霉屬丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的未翻譯的前導(dǎo)序列替代；非限制性實(shí)例包括修飾的啟動子，其來自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由構(gòu)巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的未翻譯的前導(dǎo)序列替代)；以及其突變型啟動子、截短型啟動子、以及雜合型啟動子。其他啟動子在美國專利號6,011,147中描述。

在酵母宿主中，有用的啟動子獲得自以下各項(xiàng)的基因：釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇去氫酶/甘油醛-3-磷酸去氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)、以及釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。羅馬諾斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主細(xì)胞的其他有用的啟動子。

控制序列還可以是由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止子。該終止子可操作地連接到編碼該多肽的多核苷酸的3'末端。在該宿主細(xì)胞中起作用的任何終止子都可以用于本發(fā)明中。

用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(amyL)以及大腸桿菌核糖體RNA(rrnB)的基因獲得。

用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從以下各項(xiàng)的基因獲得：構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻譯延長因子。

用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)、以及釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因獲得。羅馬諾斯(Romanos)等人，1992，同上，描述了酵母宿主細(xì)胞的其他有用的終止子。

該控制序列還可以是在啟動子下游并且在基因編碼序列上游的mRNA穩(wěn)定子區(qū)域，它增加該基因的表達(dá)。

適合的mRNA穩(wěn)定子區(qū)的實(shí)例是從以下獲得的：蘇云金芽孢桿菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢桿菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，細(xì)菌學(xué)雜志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。

該控制序列還可以是前導(dǎo)序列，一種對宿主細(xì)胞翻譯很重要的非翻譯mRNA區(qū)域。該前導(dǎo)子可操作地連接到編碼該多肽的多核苷酸的5'-末端。在宿主細(xì)胞中起作用的任何前導(dǎo)子都可以使用。

用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列是從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因獲得。

酵母宿主細(xì)胞的適合的前導(dǎo)子是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的：釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子、和釀酒酵母醇去氫酶/甘油醛-3-磷酸去氫酶(ADH2/GAP)。

控制序列還可以是一種多腺苷酸化序列，可操作地連接至該多核苷酸的3’-末端并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)由宿主細(xì)胞識別為將聚腺苷酸殘基添加至所轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號的序列?？梢允褂迷谒拗骷?xì)胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。

絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選多腺苷酸化序列是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的：構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣蛋白酶。

對于酵母宿主細(xì)胞有用的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和謝爾曼(Sherman)，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。

控制序列還可以是編碼連接至多肽的N-末端的信號肽并指導(dǎo)該多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑的信號肽編碼區(qū)域。多核苷酸的編碼序列的5’-端本身可包含在翻譯閱讀框中天然與編碼多肽的編碼序列區(qū)段相連接的信號肽編碼序列?？商娲?，該編碼序列的5’-末端可以包含對于該編碼序列來說是外來的信號肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信號肽編碼序列的情況下，可能需要外源信號肽編碼序列?？商娲兀庠葱盘栯木幋a序列可簡單地替換天然的信號肽編碼序列以便增強(qiáng)該多肽的分泌。然而，可以使用指導(dǎo)所表達(dá)多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌通路的任何信號肽編碼序列。

用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼序列是從以下各項(xiàng)的基因獲得的信號肽編碼序列：芽孢桿菌屬NCIB 11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢桿菌prsA。西蒙納(Simonen)和帕爾瓦(Palva)，1993，微生物學(xué)評論(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信號肽。

用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼序列是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的信號肽編碼序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、柔毛腐質(zhì)霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。

對于酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽獲得自以下項(xiàng)的基因：釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶。羅馬諾斯(Romanos)等人，1992，同上，描述了其他有用的信號肽編碼序列。

控制序列還可以是編碼位于多肽的N-末端的前肽的前肽編碼序列。生成的多肽被稱為前體酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情況下被稱為酶原(zymogen))。多肽原通常是無活性的并且可以通過從該多肽原上催化切割或自動催化切割前肽而被轉(zhuǎn)化成活性多肽。前肽編碼序列可以從以下各項(xiàng)的基因獲得：枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及釀酒酵母α-因子。

當(dāng)信號肽和前肽序列同時(shí)存在時(shí)，前肽序列的位置緊鄰于多肽的N-末端，且信號肽序列的位置緊鄰于前肽序列的N-末端。

還可以希望添加調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序列相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例是使得基因的表達(dá)響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)節(jié)化合物的存在)而開啟或關(guān)閉的那些序列。在原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)序列包括lac、tac、以及trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、米曲霉TAKAα-淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子、里氏木霉纖維二糖水解酶I啟動子以及里氏木霉纖維二糖水解酶II啟動子。調(diào)控序列的其他實(shí)例是允許基因擴(kuò)增的那些。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)控序列包括在甲氨蝶呤存在下被擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因以及用重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)控序列可操作地連接。

表達(dá)載體

本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達(dá)載體。不同的核苷酸和控制序列可以連接在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制酶切位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)處插入或取代編碼該多肽的多核苷酸?？商娲兀摱嗪塑账峥梢酝ㄟ^將該多核苷酸或包括該多核苷酸的核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中來表達(dá)。在產(chǎn)生該表達(dá)載體時(shí)，該編碼序列位于該載體中，這樣使得該編碼序列與該供表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。在一個(gè)實(shí)施例中，該表達(dá)載體包括SEQ ID NO:8中所闡釋的多核苷酸序列，該多核苷酸序列可操作地鏈接至適當(dāng)?shù)目刂菩蛄杏糜诒磉_(dá)。在另一個(gè)實(shí)施例中，已經(jīng)通過核苷酸取代對多核苷酸序列密碼子進(jìn)行修飾，以對應(yīng)于旨在用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的宿主有機(jī)體的密碼子使用。

重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒)，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA程序，并且能夠引起多核苷酸的表達(dá)。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。

載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體、或人工染色體。該載體可包含任何用以保證自我復(fù)制的要素。可替代地，該載體可以是這樣載體，當(dāng)它被引入該宿主細(xì)胞中時(shí)，被整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個(gè)或多個(gè)染色體一起復(fù)制。此外，可以使用單一載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒(這些載體或質(zhì)粒共同含有待引入到宿主細(xì)胞的基因組中的總DNA)或轉(zhuǎn)座子。

該載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞等細(xì)胞的選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是這樣一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒抗性、重金屬抗性、營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。

細(xì)菌性選擇性標(biāo)記的實(shí)例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因，或賦予抗生素抗性(例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素或四環(huán)素抗性)的標(biāo)記。用于酵母宿主細(xì)胞的適合的標(biāo)記包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的選擇性標(biāo)記包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶)、以及trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)、連同其等效物。優(yōu)選在曲霉屬細(xì)胞中使用的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌bar基因。優(yōu)選在木霉細(xì)胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph、和pyrG基因。

選擇性標(biāo)記可以是在WO 2010/039889中描述的雙選擇性標(biāo)記系統(tǒng)。在一方面，雙選擇性標(biāo)記是hph-tk雙選擇性標(biāo)記系統(tǒng)。

載體優(yōu)選地包含允許該載體整合到宿主細(xì)胞的基因組或允許該載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組而自主復(fù)制的一個(gè)或多個(gè)元件。

對于整合到該宿主細(xì)胞基因組中，該載體可以依靠編碼該多肽的多核苷酸序列或者用于通過同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件。可替代地，該載體可以包含用于指導(dǎo)通過同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中的一個(gè)或多個(gè)染色體中的一個(gè)或多個(gè)精確位置處的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置整合的可能性，這些整合元件應(yīng)包含足夠數(shù)量的核酸，例如100至10,000個(gè)堿基對、400至10,000個(gè)堿基對、以及800至10,000個(gè)堿基對，這些堿基對與對應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的靶序列同源的任何序列。此外，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，該載體可以通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。

對于自主復(fù)制，該載體可以進(jìn)一步包括使該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語“復(fù)制起點(diǎn)(origin of replication)”或“質(zhì)粒復(fù)制子(plasmid replicator)”意指使得質(zhì)?；蜉d體可在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。

細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允許在芽孢桿菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的復(fù)制起點(diǎn)。

用于在酵母宿主細(xì)胞中使用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)ARS1、ARS4、ARS1與CEN3的組合、以及ARS4與CEN6的組合。

在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡倫(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分離和包括該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建可以根據(jù)披露于WO 00/24883中的方法完成。

可以將本發(fā)明的多核苷酸的多于一個(gè)拷貝插入宿主細(xì)胞中以增加多肽的產(chǎn)生。通過將序列的至少一個(gè)另外的拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中或者通過包含與該多核苷酸一起的可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因可以獲得多核苷酸的增加的拷貝數(shù)目，其中通過在適當(dāng)?shù)倪x擇性試劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞可以選擇包含選擇性標(biāo)記基因的經(jīng)擴(kuò)增的拷貝的細(xì)胞、以及由此該多核苷酸的另外的拷貝。

用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的程序?qū)τ诒绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是熟知的(參見，例如薩拉布魯克(Sambrook)等人，1989，同上)。

宿主細(xì)胞

本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，這些重組宿主細(xì)胞包括本發(fā)明的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制序列，該一個(gè)或多個(gè)控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的產(chǎn)生。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入到宿主細(xì)胞中，這樣使得該構(gòu)建體或載體被維持作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如早前所描述。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上取決于編碼該多肽的基因及其來源。

該宿主細(xì)胞可以是有用于重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的任何細(xì)胞，例如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。

原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括，但不限于芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、大洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括，但不限于彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟球菌屬、假單胞菌屬、沙門菌屬和脲原體屬。

細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌細(xì)胞，包括但不限于：嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)硬芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。

細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞，包括但不限于：似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌以及馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。

細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌細(xì)胞，包括但不局限于不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌以及淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。

將DNA引入芽孢桿菌細(xì)胞中可以通過以下方式實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參看例如，常(Chang)和柯汗(Cohen)，1979，分子和普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(參看例如，楊(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，細(xì)菌學(xué)雜志81:823-829，或杜布諾(Dubnau)和達(dá)維多夫-阿博森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物學(xué)雜志56:209-221)、電穿孔(參看例如，茂川(Shigekawa)和道維(Dower)，1988，生物技術(shù)6:742-751)或結(jié)合法(參看例如，科勒(Koehler)和斯奧姆(Thome)，1987，細(xì)菌學(xué)雜志169:5271-5278)。將DNA引入大腸桿菌細(xì)胞中可通過以下來實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，哈納汗(Hanahan)，1983，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或電穿孔(參見，例如，道爾(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。將DNA引入鏈霉菌屬細(xì)胞中可通過以下來實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔(參見例如，貢(Gong)等人，2004，葉線形微生物學(xué)(Folia Microbiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(參見例如，馬佐迪耶(Mazodier)等人，1989，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見例如，伯克(Burke)等人，2001，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。將DNA引入假單孢菌屬細(xì)胞中可通過以下來實(shí)現(xiàn)：電穿孔(參見，例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物學(xué)方法雜志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(參見，例如，皮內(nèi)多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。將DNA引入鏈球菌屬細(xì)胞中可通過以下來實(shí)現(xiàn)：天然感受態(tài)(參見，例如，佩里(Perry)和藏滿(Kuramitsu)，1981，感染與免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，凱特(Catt)和喬力克(Jollick)，1991，微生物學(xué)(Microbios)68:189-207)、電穿孔(參見，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(參見，例如，克萊威爾(Clewell)，1981，微生物學(xué)評論(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的用于將DNA引入宿主細(xì)胞中的任何方法。

宿主細(xì)胞還可以是真核細(xì)胞，如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細(xì)胞。

宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、以及接合菌門(Zygomycota)、連同卵菌門(Oomycota)和全部有絲分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌詞典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，國際應(yīng)用生物科學(xué)中心(CAB International)，大學(xué)出版社(University Press)，英國劍橋(Cambridge，UK)中進(jìn)行定義的)。

該真菌宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞。如在此使用的“酵母”包括產(chǎn)子嚢酵母(內(nèi)孢霉目)、產(chǎn)擔(dān)子酵母和屬于半知菌類(芽孢綱)的酵母。由于酵母的分類在將來可能有變化，出于本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)如酵母生物學(xué)和活動性(Biology and Activities of Yeast)(斯金納(Skinner)、帕斯莫爾(Passmore)、以及達(dá)文波特(Davenport)編輯，應(yīng)用細(xì)菌學(xué)學(xué)會討論會(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地進(jìn)行定義。

酵母宿主細(xì)胞可以是假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克魯弗酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、或耶氏酵母屬細(xì)胞，如乳酸克魯弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)細(xì)胞。

真菌宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，見上文所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、以及其他復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲體壁。營養(yǎng)生長是通過菌絲延伸，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母(如釀酒酵母)的營養(yǎng)生長是通過單細(xì)胞菌體的出芽(budding)，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。

絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、線黑粉菌科(Filibasidium)、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新美鞭菌屬、鏈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞。

例如，絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(Bjerkandera adusta)、干擬蠟菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡內(nèi)基擬蠟菌(Ceriporiopsis caregiea)、淺黃擬蠟孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘諾希塔擬蠟菌(Ceriporiopsis pannocinta)、環(huán)帶擬蠟菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微紅擬蠟菌(Ceriporiopsis subrufa)、蟲擬蠟菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狹邊金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角質(zhì)金孢子菌、盧克諾文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、糞狀金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士蘭金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)、毛革蓋菌(Coriolus hirsutus)、桿孢狀鐮孢、谷類鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脈菌(Phlebia radiata)、刺芹側(cè)耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢殼霉、長域毛栓菌(Trametes villosa)、變色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉細(xì)胞。

可以將真菌細(xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、以及細(xì)胞壁再生的方法以本身已知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的適合程序描述于EP 238023和約爾頓(Yelton)等人，1984，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474和克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技術(shù)(Bio/Technology)6:1419-1422中。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬物種的適合方法由馬拉迪爾(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述?？梢允褂糜扇缫韵挛墨I(xiàn)描述的程序轉(zhuǎn)化酵母：貝克爾(Becker)和瓜倫特(Guarente)，在阿貝爾森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.編，酵母遺傳學(xué)與分子生物學(xué)指南，酶學(xué)方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187頁，學(xué)術(shù)出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，紐約；伊藤(Ito)等人，1983，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。

生產(chǎn)方法

本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包含(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生該多肽；并且可任選地(b)回收該多肽。在一方面，該細(xì)胞是一種木霉屬細(xì)胞。在另一方面，該細(xì)胞是一種哈茨木霉細(xì)胞。

本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，該方法包括：(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞；并且可任選地，(b)回收該多肽。

這些宿主細(xì)胞是在適合于使用本領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生該多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。例如，可以通過在適合的培養(yǎng)基中和在允許表達(dá)和/或分離該多肽的條件下，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，或者在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)，分批，分批補(bǔ)料，或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在適合的營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生，該培養(yǎng)基包含碳源和氮源及無機(jī)鹽。適合的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。如果多肽分泌到該營養(yǎng)培養(yǎng)基中，那么可直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不被分泌，那么其可從細(xì)胞裂解液中進(jìn)行回收。

可以使用特異性針對這些多肽的本領(lǐng)域已知的方法來檢測該多肽。這些檢測方法包括但不限于，特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶測定來確定該多肽的活性。

可以使用本領(lǐng)域已知的方法來回收多肽。例如，該多肽可以通過常規(guī)程序，包括但不限于，收集、離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀，從該營養(yǎng)培養(yǎng)基回收。在一方面，回收包含該多肽的發(fā)酵液。

可以通過本領(lǐng)域中已知的多種程序來純化該多肽以獲得基本上純的多肽，這些程序包括但不限于：色譜法(例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、色譜聚焦、以及尺寸排阻色譜)、電泳程序(例如，制備型等電點(diǎn)聚焦)、差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或提取(參見例如，蛋白純化(Protein Purification)，詹森(Janson)和賴登(Ryden)編輯，VCH出版社(VCH Publishers)，紐約，1989)。

在一個(gè)替代性方面中，該多肽未被回收，而是使用表達(dá)該多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞作為該多肽來源。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明進(jìn)一步包括通過培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)該多肽，進(jìn)一步包括編碼感興趣的第二多肽的多核苷酸；優(yōu)選地感興趣的酶；更優(yōu)選地感興趣的分泌的酶，甚至更優(yōu)選地水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶；并且最優(yōu)選地該分泌的酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、綠色熒光蛋白、葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

在一個(gè)實(shí)施例中，該感興趣的第二多肽是與宿主細(xì)胞異源的或同源的。

在一個(gè)實(shí)施例中，重組宿主細(xì)胞是真菌宿主細(xì)胞；優(yōu)選地絲狀真菌宿主細(xì)胞；更優(yōu)選地枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、線黑粉菌科(Filibasidium)、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新美鞭菌屬、鏈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞；最優(yōu)選地泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(Bjerkandera adusta)、干擬蠟菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡內(nèi)基擬蠟菌(Ceriporiopsis caregiea)、淺黃擬蠟孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘諾希塔擬蠟菌(Ceriporiopsis pannocinta)、環(huán)帶擬蠟菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微紅擬蠟菌(Ceriporiopsis subrufa)、蟲擬蠟菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狹邊金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角質(zhì)金孢子菌、盧克諾文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、糞狀金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士蘭金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)、毛革蓋菌(Coriolus hirsutus)、桿孢狀鐮孢、谷類鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脈菌(Phlebia radiata)、刺芹側(cè)耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢殼霉、長域毛栓菌(Trametes villosa)、變色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施例中，重組宿主細(xì)胞是細(xì)菌宿主細(xì)胞；優(yōu)選地原核生物宿主細(xì)胞；更優(yōu)選地革蘭氏陽性宿主細(xì)胞；甚至更優(yōu)選地芽胞桿菌屬、梭狀芽孢桿菌、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、或鏈霉菌屬宿主細(xì)胞；和最優(yōu)選地嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)宿主細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施例中，用于生產(chǎn)感興趣的第二多肽的方法包括在有益于產(chǎn)生該感興趣的第二多肽的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括回收該感興趣的第二多肽。

發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物

本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物。發(fā)酵液產(chǎn)物進(jìn)一步包括在發(fā)酵過程中使用的另外的成分，例如像，細(xì)胞(包括含有編碼本發(fā)明的多肽的基因的宿主細(xì)胞，這些宿主細(xì)胞被用于產(chǎn)生感興趣的多肽)、細(xì)胞碎片、生物質(zhì)、發(fā)酵介質(zhì)和/或發(fā)酵產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，該組合物是含有一種或多種有機(jī)酸、殺滅的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片以及培養(yǎng)基的細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液。

如在此使用的術(shù)語“發(fā)酵液”是指由細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生、不經(jīng)歷或經(jīng)歷最低限的回收和/或純化的制劑。例如，當(dāng)微生物培養(yǎng)株在允許蛋白質(zhì)合成(例如，由宿主細(xì)胞的酶表達(dá))并且將蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的碳受限的條件下孵育生長到飽和時(shí)，產(chǎn)生發(fā)酵液。發(fā)酵液可以包含在發(fā)酵結(jié)束時(shí)得到的發(fā)酵材料的未分級的或分級的內(nèi)容物。典型地，發(fā)酵液是未分級的并且包括在例如通過離心除去微生物細(xì)胞(例如，絲狀真菌細(xì)胞)后存在的耗盡的培養(yǎng)基和細(xì)胞碎片。在一些實(shí)施例中，發(fā)酵液包含用過的細(xì)胞培養(yǎng)基、胞外酶、以及有活力的和/或無活力的微生物細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施例中，該發(fā)酵液配制品和細(xì)胞組合物包括第一有機(jī)酸組分(包括至少一種1-5碳的有機(jī)酸和/或其鹽)以及第二有機(jī)酸組分(包括至少一種6碳或更多碳的有機(jī)酸和/或其鹽)。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該第一有機(jī)酸組分是乙酸、甲酸、丙酸、其鹽、或兩種或更多種前述酸的混合物并且該第二有機(jī)酸組分是苯甲酸、環(huán)己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其鹽、或兩種或更多種前述酸的混合物。

在一方面，該組合物包含一種或多種有機(jī)酸，并且任選地進(jìn)一步包含殺死的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片。在一個(gè)實(shí)施例中，從細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液中去除這些殺死的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片，以提供不含這些組分的組合物。

這些發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物可以進(jìn)一步包含一種防腐劑和/或抗微生物(例如抑菌)劑，包括但不限于山梨醇、氯化鈉、山梨酸鉀、以及本領(lǐng)域中已知的其他試劑。

該細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液或組合物可以包含在發(fā)酵結(jié)束時(shí)得到的發(fā)酵材料的未分級的內(nèi)容物。典型地，該細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液或組合物包含用過的培養(yǎng)基以及在微生物細(xì)胞(例如，絲狀真菌細(xì)胞)生長至飽和、在碳限制條件下孵育以允許蛋白合成之后存在的細(xì)胞碎片。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液或組合物含有用過的細(xì)胞培養(yǎng)基、胞外酶和殺滅的絲狀真菌細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，可以使用本領(lǐng)域已知的方法來使細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液或組合物中存在的微生物細(xì)胞透性化和/或裂解。

如在此描述的全培養(yǎng)液或細(xì)胞組合物典型地是液體，但是可以含有不溶性組分，例如殺滅的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基組分和/或一種或多種不溶性酶。在一些實(shí)施例中，可以除去不溶性組分以提供澄清的液體組合物。

可以通過WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法產(chǎn)生本發(fā)明的全培養(yǎng)液配制品和細(xì)胞組合物。

信號肽

本發(fā)明還涉及一種編碼信號肽的多核苷酸，該信號肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-17到-1或由其組成。本發(fā)明還涉及一種編碼信號肽的多核苷酸，該信號肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-17到-1或由其組成。這些多核苷酸可以進(jìn)一步包含一個(gè)編碼蛋白的基因，該蛋白可操作地連接到該信號肽。該蛋白優(yōu)選地對于該信號肽來說是外源的。在一方面，編碼該信號肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸1至51。

本發(fā)明還涉及包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體及重組宿主細(xì)胞。

本發(fā)明還涉及產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，該方法包括：(a)對包括這種多核苷酸的重組宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；并且(b)回收該蛋白質(zhì)。

該蛋白對于宿主細(xì)胞而言可以是天然的或異源的。術(shù)語“蛋白質(zhì)”在此不意圖是指特定長度的編碼產(chǎn)物，并且因此涵蓋肽、寡肽及多肽。術(shù)語“蛋白”還涵蓋組合形成編碼的產(chǎn)物的兩個(gè)或更多個(gè)多肽。這些蛋白還包含雜合多肽和融合多肽。

優(yōu)選地，該蛋白是一種激素、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報(bào)告基因。例如，該蛋白質(zhì)可以是一種水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶，例如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

該基因可以從任何原核、真核或其他來源獲得。

本發(fā)明的酶-脫氧核糖核酸酶(DNA酶)

具有DNA酶活性的多肽或脫氧核糖核酸酶(DNA酶)是催化DNA骨架中的磷酸二酯鍵的水解切割從而降解DNA的任何酶。可互換地使用兩個(gè)術(shù)語，具有DNA酶活性的多肽和DNA酶。

根據(jù)本發(fā)明，該DNA酶可獲得自細(xì)菌；具體地而言優(yōu)選的是可獲得自木霉屬的DNA酶；具體地而言優(yōu)選的是可獲得自哈茨木霉的DNA酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，具有脫氧核糖核酸酶活性的多肽不是來自米曲霉的S1核酸酶。

具有DNA酶活性的多肽可以獲得自木霉屬，例如，哈茨木霉。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，具有DNA酶活性的多肽是要求保護(hù)的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的具有DNA酶活性的分離的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少90％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少91％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少92％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少93％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少94％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少95％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少96％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少97％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少98％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少99％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有100％序列一致性的具有DNA酶活性的多肽。

SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列，連同SEQ ID NO:2的多肽或其片段可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法用于設(shè)計(jì)核酸探針以鑒定和克隆來自不同屬或種的株系的、編碼具有DNA酶活性的多肽的DNA。具體地，可以遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，使用此類探針與感興趣的細(xì)胞的基因組DNA或cDNA雜交，以便鑒定和分離其中的對應(yīng)基因。這樣的探針可以大大短于整個(gè)序列，但是長度應(yīng)該為至少15個(gè)，例如至少25個(gè)、至少35個(gè)或至少70個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，核酸探針的長度為至少100個(gè)核苷酸，例如長度為至少200個(gè)核苷酸、至少300個(gè)核苷酸、至少400個(gè)核苷酸、至少500個(gè)核苷酸、至少600個(gè)核苷酸、至少700個(gè)核苷酸、至少800個(gè)核苷酸、或至少900個(gè)核苷酸。DNA和RNA探針二者均可使用。典型地將探針進(jìn)行標(biāo)記，用于檢測相應(yīng)的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白)。本發(fā)明涵蓋此類探針。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種由以下多核苷酸編碼的具有DNA酶活性的多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。在另外的實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。

該DNA酶可以包括SEQ ID NO:2的氨基酸-37至206所示的氨基酸序列或具有DNA酶的其片段，如成熟多肽，或由其組成?；蛘咴揇NA酶可以包括SEQ ID NO:2的氨基酸-37至206的片段或SEQ ID NO:2的氨基酸1至188，或由其組成，針對該片段從SEQ ID NO:2的氨基和/或羧基末端刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸。

本發(fā)明還提供了基本上與以上多肽同源的DNA酶多肽及其種類同系物(旁系同源物或直系同源物)。在此使用術(shù)語“基本上同源”表示與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少80％、優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％、甚至更優(yōu)選至少97％相同，并且最優(yōu)選至少99％或更多相同的多肽、或其具有DNA酶活性的片段、或其直系同源物或旁系同源物。

出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件，賴斯(Rice)等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(Trends Genet.)16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德爾程序中所實(shí)施的尼德爾曼-翁施算法(尼德爾曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48:443-453)來確定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性。使用的參數(shù)為空位開放罰分(gap open penalty)10，缺口延伸罰分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的“最長的一致性”的輸出(使用-非簡化選項(xiàng)獲得)被用作百分比一致性，并且計(jì)算如下：

(一致的殘基x 100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))

在另一個(gè)實(shí)施例中，SEQ ID NO:2的DNA酶在一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))位置處包括取代、缺失和/或插入。在一個(gè)實(shí)施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目不超過10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、或9。這些氨基酸變化可以具有微小性質(zhì)，即，不會顯著地影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基末端的或羧基末端的延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；高達(dá)20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或另一功能有利于純化的小的延伸，例如聚組氨酸段、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

可以做出單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用誘變、重組和/或改組的已知方法進(jìn)行測試，隨后進(jìn)行相關(guān)篩選程序，如由里德哈爾-奧爾森(Reidhaar-Olson)和薩奧爾(Sauer)，1988，科學(xué)(Science)241:53-57；博維(Bowie)和薩奧爾，1989，美國科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些?？梢允褂玫钠渌椒òㄒ族e(cuò)PCR、噬菌體展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化學(xué)(Biochemistry)30:10832-10837；美國專利號5,223,409；WO92/06204)以及區(qū)域定向誘變(德比什爾(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；內(nèi)爾(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

該多肽可以是一種雜交多肽，其中一個(gè)多肽的一個(gè)區(qū)域融合在另一個(gè)多肽的一個(gè)區(qū)域的N-末端或C-末端。

該多肽可以是一種融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一個(gè)多肽是在本發(fā)明多肽的N-末端或C-末端處融合。通過將編碼另一多肽的多核苷酸融合至本發(fā)明的多核苷酸而產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并且包括連接編碼多肽的編碼序列，這樣使得它們在框內(nèi)并且使得融合多肽的表達(dá)處于相同的一個(gè)或多個(gè)啟動子和終止子的控制下。融合多肽還可以使用內(nèi)含肽技術(shù)來構(gòu)建，其中融合多肽在翻譯后產(chǎn)生(庫珀(Cooper)等人，1993，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會雜志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科學(xué)(Science)266:776-779)。

洗滌液中DNA酶的濃度典型地在以下范圍內(nèi)：0.0004-100ppm酶蛋白，0.001-100ppm酶蛋白，0.01-100ppm酶蛋白，優(yōu)選0.05-50ppm酶蛋白，更優(yōu)選0.1-50ppm酶蛋白，更優(yōu)選0.1-30ppm酶蛋白，更優(yōu)選0.5-20ppm酶蛋白，并且最優(yōu)選0.5-10ppm酶蛋白。

可以將本發(fā)明的DNA酶以對應(yīng)于以下各項(xiàng)的量添加至洗滌劑組合物中：每升洗滌液至少1mg的DNA酶蛋白，例如至少5mg的蛋白、優(yōu)選至少10mg的蛋白、更優(yōu)選至少15mg的蛋白、甚至更優(yōu)選至少20mg的蛋白、最優(yōu)選至少30mg的蛋白,并且甚至最優(yōu)選至少40mg的蛋白。因此，該洗滌劑組合物可以包括至少0.1％DNA酶蛋白，優(yōu)選至少0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.5％或2.0％的DNA酶蛋白。

在一個(gè)實(shí)施例中，DNA酶的濃度典型地在以下范圍內(nèi)：1-40ppm酶蛋白，優(yōu)選1-20ppm酶蛋白，更優(yōu)選1-10ppm酶蛋白。

可以使用常規(guī)穩(wěn)定劑穩(wěn)定本發(fā)明的清潔劑組合物的DNA酶，這些常規(guī)穩(wěn)定劑例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配置該組合物。

本發(fā)明的多肽還可以結(jié)合到WO 97/07202中所披露的洗滌劑配制品中，通過引用將其結(jié)合在此。

洗滌劑組合物

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明針對洗滌劑組合物，該洗滌劑組合物包含結(jié)合一種或多種額外的清潔組合物組分的本發(fā)明的酶。在一個(gè)實(shí)施例中，該洗滌劑組合物包括多肽，該多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列，或由其組成。在一個(gè)實(shí)施例中，該洗滌劑組合物處于固體形式。在另一個(gè)實(shí)施例中，該洗滌劑組合物處于液體形式。另外的組分的選擇在普通技術(shù)人員技術(shù)內(nèi)并且包括常規(guī)成分，包括以下列出的示例性、非限制性組分。

液體洗滌劑組合物

該液體洗滌劑組合物可以包括本發(fā)明的微囊，并且由此形成處于任何形式的任何洗滌劑組合物的一部分，如液體和粉狀洗滌劑，以及皂和洗滌劑條。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明針對液體洗滌劑組合物，這些組合物包含微囊(如上所述)與一種或多種另外的清潔組合物組分組合。

該微囊(如上所述)可以按對應(yīng)于從0.0001％至5％(w/w)活性酶蛋白(AEP)的量被添加至該液體洗滌劑組合物；優(yōu)選地從0.001％至5％，更優(yōu)選地從0.005％至5％，更優(yōu)選地從0.005％至4％，更優(yōu)選地從0.005％至3％，更優(yōu)選地從0.005％至2％，甚至更優(yōu)選地從0.01％至2％，并且最優(yōu)選地從0.01％至1％(w/w)活性酶蛋白。

該液體洗滌劑組合物具有一種物理形式，它不是固體(或氣體)。它可以是可傾流的液體，糊劑，可傾流的凝膠或不可傾流的凝膠。它可以是各向同性的亦或或結(jié)構(gòu)化的，優(yōu)選是各向同性的。它可以是一種配制品，用于在自動洗衣機(jī)中洗滌或用于手洗。它還可以是個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品，例如個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品洗發(fā)水、牙膏、或洗手皂。

該液體洗滌劑組合物可以是水性的，典型地包含按重量計(jì)至少20％并且高達(dá)95％的水，例如高達(dá)70％的水、高達(dá)50％的水、高達(dá)40％的水、高達(dá)30％的水、或高達(dá)20％的水。包括但不限于鏈烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他類型的液體可以被包括在水性液體洗滌劑中。水性液體洗滌劑可以包含從0％-30％的有機(jī)溶劑。液體洗滌劑甚至可以是非水性的，其中水含量低于10％，優(yōu)選低于5％。

洗滌劑成分可以通過水可溶性小袋中的區(qū)室彼此物理性地分開。由此可以避免組分之間的負(fù)面的儲存相互作用。在洗滌溶液中，每個(gè)室的不同溶解曲線還可以引起選擇的組分的延遲溶解。

該洗滌劑組分可以采用一種單位劑量產(chǎn)物的形式。單位劑量產(chǎn)品是不可重復(fù)使用的容器中的單一劑量的包裝。它被越來越多的應(yīng)用在針對衣物洗滌劑中。洗滌劑單位劑量產(chǎn)品是用于單次洗滌的洗滌劑的量的包裝(例如，在由水溶性膜制成的袋中)。

袋可以具有適合保存該組合物的任何形式、形狀和材料，例如在與水接觸之前，不允許該組合物從袋中釋放出來。袋由封裝內(nèi)體積的水溶性膜制成?？梢詫⑺鰞?nèi)體積分為具有袋的室。優(yōu)選的膜是形成膜或片的聚合材料，優(yōu)選是聚合物。優(yōu)選的聚合物、共聚物或其衍生物選自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纖維素、羧甲基纖維素、糊精鈉、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、麥芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最優(yōu)選地是聚乙烯醇共聚物以及羥丙基甲基纖維素(HPMC)。優(yōu)選地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少約60％。優(yōu)選的平均分子量將典型地是約20,000至約150,000。薄膜還可以是一種混合組合物，包括可通過水解可降解的以及水溶性的聚合物混合物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在貿(mào)易參考(Trade reference)M8630下，由Chris Craft In.Prod.Of Gary，Ind.，US銷售)，以及增塑劑，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。這些袋可以包括固體衣物清潔組合物或部分組分和/或液體清潔組合物或由水溶性膜分開的部分組分。組合物中，液體組分的區(qū)室可以與含有固體的區(qū)室不同(見例如US2009/0011970)。

洗滌劑組分的選擇可以包括(用于紡織品保養(yǎng))有待清潔的紡織品的類型、污物的類型和/或程度、進(jìn)行清潔時(shí)的溫度、以及洗滌劑產(chǎn)品的配制的考慮。盡管根據(jù)一種具體的功能性對以下提及的組分由通用標(biāo)題進(jìn)行分類，但是這并不被解釋為限制，因?yàn)槿鐚⒈黄胀夹g(shù)人員所理解，一種組分可以包括另外的功能性。

另外的組分的選擇在普通技術(shù)人員技術(shù)內(nèi)并且包括常規(guī)成分，包括以下列出的示例性、非限制性組分。

表面活性劑

洗滌劑組合物可以包括一種或多種表面活性劑，它們可以是陰離子的和/或陽離子的和/或非離子的和/或半極性的和/或兼性離子的或其混合物。在一個(gè)具體實(shí)施例中，洗滌劑組合物包括一種或多種非離子型表面活性劑和一種或多種陰離子表面活性劑的混合物。這種或這些表面活性劑典型地以按重量計(jì)從約0.1％至60％的水平存在，例如約1％至約40％、或約3％至約20％、或約3％至約10％?；谒Ｍ那鍧崙?yīng)用來選擇這種或這些表面活性劑，并且這種或這些表面活性劑包括本領(lǐng)域中已知的任何一種或多種常規(guī)表面活性劑。

當(dāng)包含在其中時(shí)，該洗滌劑通常將會含有按重量計(jì)約1％至約40％的陰離子表面活性劑，如約5％至約30％，包括從約5％至約15％，或從約15％至約20％，或從約20％至約25％的陰離子型表面活性劑。陰離子表面活性劑的非限制性實(shí)例包括硫酸鹽和磺酸鹽，具體地說是直鏈烷基苯磺酸鹽(LAS)、LAS的異構(gòu)體、支鏈烷基苯磺酸鹽(BABS)、苯基鏈烷磺酸鹽、α-烯烴磺酸鹽(AOS)、烯烴磺酸鹽、鏈烯烴磺酸鹽、鏈烷-2,3-二基雙(硫酸鹽)、羥基鏈烷磺酸鹽以及二磺酸鹽、烷基硫酸鹽(AS)(如十二烷基硫酸鈉(SDS))、脂肪醇硫酸鹽(FAS)、伯醇硫酸鹽(PAS)、醇醚硫酸鹽(AES或AEOS或FES，也被稱為醇乙氧基硫酸鹽或脂肪醇醚硫酸鹽)、仲鏈烷磺酸鹽(SAS)、石蠟烴磺酸鹽(PS)、酯磺酸鹽、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸鹽(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或脂肪酸鹽(皂)的二酯和單酯及其組合。

當(dāng)被包括在其中時(shí)，該洗滌劑將通常包含按重量計(jì)從約1％至約40％的陽離子表面活性劑，例如從約0.5％至約30％，特別是從約1％至約20％、從約3％至約10％，如從約3％至約5％、從約8％至約12％或從約10％至約12％。陽離子表面活性劑的非限制性實(shí)例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化銨(DSDMAC)、以及烷基芐基二甲基銨、烷基季銨化合物、烷氧基化季銨(AQA)化合物、酯季銨及其組合。

當(dāng)被包括在其中時(shí)，該洗滌劑將通常包含按重量計(jì)從約0.2％至約40％的非離子表面活性劑，例如從約0.5％至約30％，特別是從約1％至約20％、從約3％至約10％，如從約3％至約5％、從約8％至約12％或從約10％至約12％。非離子型表面活性劑的非限制性實(shí)例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸單乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(PFAM)，多羥基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，連同在SPAN和TWEEN商品名下可獲得的產(chǎn)品，及其組合。

當(dāng)被包括在其中時(shí)，洗滌劑將通常包含按重量計(jì)從約0％至約40％的半極性表面活性劑。半極化表面活性劑的非限制性實(shí)例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基)-N,N-雙(2-羥乙基)胺氧化物，及其組合。

當(dāng)被包括在其中時(shí)，洗滌劑將通常包含按重量計(jì)從約0％至約40％的兼性離子表面活性劑。兼性離子表面活性劑的非限制性實(shí)例包括甜菜堿，如烷基二甲基甜菜堿、磺基甜菜堿及其組合。

助水溶劑

助水溶劑是如下化合物，該化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非極性環(huán)境中的極性物質(zhì))。一般地，助水溶物具有親水和疏水兩種特征(如由表面活性劑已知的所謂的兩親性質(zhì))；然而，助水溶物的分子結(jié)構(gòu)一般不利于自發(fā)性自聚集，參見例如通過霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)(2007)，膠體&界面科學(xué)新見(Current Opinion in Colloid&Interface Science)12:121-128的綜述。助水溶劑并不顯示臨界濃度，高于該濃度就會發(fā)生如對表面活性劑而言所發(fā)現(xiàn)的自聚集以及脂質(zhì)形成膠束、薄層或其他很好地定義的中間相。很多助水溶劑反而示出連續(xù)型聚集過程，其中聚集體的大小隨著濃度增加而增長。然而，很多助水溶劑改變了包括極性和非極性特征的物質(zhì)的系統(tǒng)(包括水、油、表面活性劑、和聚合物的混合物)的相行為、穩(wěn)定性、和膠體特性。經(jīng)典地從制藥、個(gè)人護(hù)理、食品跨行業(yè)至技術(shù)應(yīng)用使用助水溶劑。助水溶劑在洗滌劑組合物中的使用允許例如更濃的表面活性劑配制品(如在通過除去水而壓縮液體洗滌劑的過程中)而不引起不希望的現(xiàn)象，例如相分離或高粘度。

洗滌劑可以包含按重量計(jì)0-10％，例如按重量計(jì)0-5％，例如約0.5％至約5％、或約3％至約5％的助水溶劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何助水溶劑。助水溶劑的非限制性實(shí)例包括苯磺酸鈉、對甲苯磺酸鈉(STS)、二甲苯磺酸鈉(SXS)、枯烯磺酸鈉(SCS)、傘花烴磺酸鈉、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羥基萘甲酸鈉、羥基萘磺酸鈉、乙基己基磺酸鈉及其組合。

助洗劑和共助洗劑

洗滌劑組合物可以包含按重量計(jì)約0-65％，例如約5％至約50％的洗滌劑助洗劑或共助洗劑或其混合物。助洗劑和/或共助洗劑可以具體是形成具有Ca和Mg的水溶性復(fù)合物的螫合劑?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知用于在洗滌劑中使用的任何助洗劑和/或共助洗劑。助洗劑的非限制性實(shí)例包括沸石、二磷酸鹽(焦磷酸鹽)、三磷酸鹽例如三磷酸鈉(STP或STPP)、碳酸鹽例如碳酸鈉、可溶性硅酸鹽例如硅酸鈉、層狀硅酸鹽(例如，來自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也稱為2,2’-亞氨基二乙-1-醇)、三乙醇胺(TEA，也稱為2,2’,2”-次氮基三乙-1-醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其組合。

該洗滌劑組合物還可以包含按重量計(jì)0-50％，例如約5％至約30％的洗滌劑共助洗劑。洗滌劑組合物可以單獨(dú)地包括一種共助洗劑，或與一種助洗劑，例如沸石助洗劑組合。共助洗劑的非限制性實(shí)例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/馬來酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性實(shí)例包括檸檬酸鹽，螯合劑，例如氨基羧酸鹽、氨基多羧酸鹽和膦酸鹽，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具體實(shí)例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、亞氨基二丁二酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羥基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四(亞甲基膦酸)(EDTMPA)、二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA)、N-(2-羥乙基)亞氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-單乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-單丙酸(ASMP)、亞氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亞氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、絲氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、異絲氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、鄰氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、?；撬?N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羥乙基)-亞乙基二胺-N,N’,N”-三乙酸鹽(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亞甲基膦酸)(ATMP)、及其組合和鹽。其他示例性助洗劑和/或共助洗劑描述于例如WO 09/102854、US 5977053中

漂白系統(tǒng)

該洗滌劑可以包含按重量計(jì)0-30％，例如約1％至約20％的漂白系統(tǒng)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知用于洗滌劑中的任何漂白系統(tǒng)。適合的漂白系統(tǒng)組分包括漂白催化劑、光漂白劑、漂白活化劑、過氧化氫源如過碳酸鈉、過硼酸鈉和過氧化氫-尿素(1:1)、預(yù)成型過酸及其混合物。適合的預(yù)成型過酸包括但不限于過氧羧酸及鹽、二過氧二羧酸、過亞氨酸(perimidic acid)及鹽、過氧單硫酸及鹽(例如過硫酸氫鉀(Oxone(R))及其混合物。漂白體系的非限制性例子包括與過酸形成漂白活化劑組合的基于過氧化物的漂白體系，其可以包含例如無機(jī)鹽，包括堿金屬鹽例如過硼酸鹽的鈉鹽(通常為單或四水合物)、過碳酸鹽、過硫酸鹽、過磷酸鹽、過硅酸鹽。術(shù)語漂白活化劑在此意指一種與過氧化氫反應(yīng)以經(jīng)由過水解反應(yīng)形成過酸的化合物。以此方式形成的過酸構(gòu)成活化的漂白劑。有待在此使用的適合漂白活化劑包括屬于酯、酰胺、酰亞胺或酸酐類別的那些。適合的實(shí)例是四乙?；叶?TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己?；?氧基]苯-1-磺酸鈉(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸鹽(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸鹽、4-(癸?；趸?苯甲酸鹽(DOBS或DOBA)、4-(壬?；趸?苯-1-磺酸鹽(NOBS)和/或披露于WO 98/17767中的那些。感興趣的漂白活化劑的具體家族披露于EP 624154中并且在那個(gè)家族中特別優(yōu)選的是乙酰檸檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短鏈甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下優(yōu)點(diǎn)，它是環(huán)境友好的。此外，乙酰檸檬酸三乙酯和三醋汀在存儲時(shí)在產(chǎn)品中具有良好的水解穩(wěn)定性，并且是一種有效的漂白活化劑。最后，ATC是多功能的，因?yàn)樵谶^水解反應(yīng)中釋放的檸檬酸鹽可以作為助洗劑起作用?？商娲?，漂白系統(tǒng)可以包括例如酰胺、酰亞胺、或砜型的過氧酸。漂白系統(tǒng)還可以包括過酸，例如6-(鄰苯二甲酰亞胺基)過氧己酸(PAP)。漂白系統(tǒng)還可以包括一種漂白催化劑。在一些實(shí)施例中，漂白組分可以是選自下組的有機(jī)催化劑，該組由以下各項(xiàng)組成：具有下式的有機(jī)催化劑：

(iii)及其混合物；

其中每個(gè)R¹獨(dú)立地是含有從9到24個(gè)碳的支鏈烷基或含有從11到24個(gè)碳的直鏈烷基，優(yōu)選地每個(gè)R¹獨(dú)立地是含有從9到18個(gè)碳的支鏈烷基或含有從11到18個(gè)碳的直鏈烷基，更優(yōu)選地每個(gè)R¹獨(dú)立地選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、異壬基、異癸基、異十三烷基以及異十五烷基。其他示例性漂白系統(tǒng)描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259、EP 1867708(維生素K)以及WO 2007/087242中。適合的光漂白劑可以例如是磺化的酞菁鋅或酞菁鋁。

優(yōu)選地，除了漂白催化劑、特別是有機(jī)漂白催化劑以外，漂白組分還包括過酸源。過酸源可以選自(a)預(yù)形成的過酸；(b)過碳酸鹽、過硼酸鹽或過硫酸鹽(過氧化氫源)，優(yōu)選與一種漂白活化劑組合；和(c)過水解酶以及酯，用于在紡織品或硬表面處理步驟中在水的存在下原位形成過酸。

聚合物

洗滌劑可以包含按重量計(jì)0％-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何聚合物。聚合物可以作為如以上提到的共助洗劑起作用，或可以提供抗再沉積、纖維保護(hù)、污垢釋放、染料轉(zhuǎn)移抑制、油污清潔和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一種的以上提到的特性和/或多于一種的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纖維素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(環(huán)氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亞乙基亞胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性CMC(HM-CMC)和硅酮、對苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(對苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯對苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季銨鹽。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考慮了以上提到的聚合物的鹽。

織物調(diào)色劑

本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括織物調(diào)色劑，例如染料或色素，當(dāng)配制在洗滌劑組合物中時(shí)，當(dāng)所述織物與一種洗滌液接觸時(shí)織物調(diào)色劑可以沉積在織物上，該洗滌液包括所述洗滌劑組合物，并且因此通過可見光的吸收/反射改變所述織物的色彩。熒光增白劑發(fā)射至少一些可見光。相比之下，因?yàn)樗鼈兾罩辽僖徊糠挚梢姽夤庾V，所以織物調(diào)色劑改變表面的色彩。適合的織物調(diào)色劑包括染料和染料-粘土軛合物，并且還可以包括色素。適合的染料包括小分子染料和聚合物染料。適合的小分子染料包括選自下組的小分子染料，該組由落入顏色索引(Colour Index)(C.I.)分類的以下染料組成：直接藍(lán)、直接紅、直接紫、酸性藍(lán)、酸性紅、酸性紫、堿性藍(lán)、堿性紫和堿性紅、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP 1876226中(將其通過引用而特此結(jié)合)。洗滌劑組合物優(yōu)選包括從約0.00003wt％至約0.2wt％、從約0.00008wt％至約0.05wt％、或甚至從約0.0001wt％至約0.04wt％的織物調(diào)色劑。該組合物可以包括從0.0001wt％至0.2wt％的織物調(diào)色劑，當(dāng)該組合物處于單位劑量袋的形式時(shí)，這可以是特別優(yōu)選的。適合的調(diào)色劑還披露于例如WO 2007/087257和WO 2007/087243中。

酶

洗滌劑添加劑連同洗滌劑組合物可以包括一種或多種額外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或過氧化物酶。

一般而言，一種或多種所選酶的特性應(yīng)與選定的洗滌劑相容(即，最適pH，與其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且該一種或多種酶應(yīng)以有效量存在。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該洗滌劑添加劑或該洗滌劑組合物包括蛋白酶。

纖維素酶

適合的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程處理的突變體。適合的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢屬的纖維素酶，例如，從在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中披露的特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)和尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)產(chǎn)生的真菌纖維素酶。

特別適合的纖維素酶是具有顏色護(hù)理益處的堿性或中性纖維素酶。此類纖維素酶的實(shí)例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纖維素酶。其他實(shí)例是例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中的那些纖維素酶變體。

其他纖維素酶是具有一種序列的內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶，該序列與WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性，或一種家族44木葡聚糖酶，該木葡聚糖酶具有一種序列，該序列與WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％一致性。

可商購的纖維素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(諾維信公司(Novozymes A/S))、Carezyme Premium^TM(諾維信公司)、Celluclean^TM(諾維信公司)、Celluclean Classic^TM(諾維信公司)、Cellusoft^TM(諾維信公司)、Whitezyme^TM(諾維信公司)、Clazinase^TM和Puradax HA^TM(杰能科國際公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)^TM(花王株式會社(Kao Corporation))。

蛋白酶

適合的蛋白酶包括細(xì)菌、真菌、植物、病毒或動物來源的那些，例如植物或微生物來源。優(yōu)選微生物來源。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程處理的突變體。它可以是堿性蛋白酶，例如絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草桿菌蛋白酶)。金屬蛋白酶可以例如是來自例如家族M4的嗜熱菌蛋白酶或其他金屬蛋白酶，例如來自M5、M7或M8家族的那些。

術(shù)語“枯草桿菌酶”是指根據(jù)斯艾森(Siezen)等人，蛋白質(zhì)工程學(xué)(Protein Engng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Science)6(1997)501-523的絲氨酸蛋白酶亞組。絲氨酸蛋白酶是特征為在活性位點(diǎn)具有與底物形成共價(jià)加合物的絲氨酸的蛋白酶的一個(gè)亞組?？莶輻U菌酶可以劃分為6個(gè)亞部，即，枯草桿菌蛋白酶家族、嗜熱蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

枯草桿菌酶的實(shí)例是獲得自芽孢桿菌屬的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的遲緩芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和吉氏芽孢桿菌；和描述于WO 89/06279中的枯草桿菌蛋白酶遲緩(lentus)、枯草桿菌蛋白酶諾和(Novo)、枯草桿菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢桿菌、枯草桿菌蛋白酶BPN’、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶樣蛋白酶的實(shí)例是胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和鐮孢菌蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及獲得自纖維單胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。

進(jìn)一步優(yōu)選的蛋白酶是來自遲緩芽孢桿菌DSM 5483的堿性蛋白酶(如在例如WO 95/23221中所述)、及其變體(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。

金屬蛋白酶的實(shí)例是如描述于WO 07/044993(杰能科國際公司(Genencor Int.))中的中性金屬蛋白酶，例如獲得自解淀粉芽孢桿菌的那些。

有用的蛋白酶的實(shí)例是于以下各項(xiàng)中的變體：WO 92/19729、WO 96/034946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置的一個(gè)或多個(gè)中具有取代的變體：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’編號。更優(yōu)選地，這些枯草桿菌酶變體可以包含以下突變：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’進(jìn)行編號)。

適合的可商購蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：Duralase^Tm、Durazym^Tm、Ultra、Ultra、Ultra、Ultra、和(諾維信公司)，以下列商品名出售的那些：PurafectPreferenz^Tm、PurafectPurafectPurafectEffectenz^Tm、以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、Axapem^Tm(吉斯特布羅卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的圖29中)及其變體(漢高股份(Henkel AG))以及來自花王株式會社(Kao)的KAP(嗜堿芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶)。

脂肪酶和角質(zhì)酶

適合的脂肪酶和角質(zhì)酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白工程化的突變體酶。實(shí)例包括來自嗜熱真菌屬的脂肪酶，例如如描述于EP 258068和EP 305216中的來自疏綿狀嗜熱絲孢菌(早先命名為疏棉狀腐質(zhì)霉)；來自腐質(zhì)霉屬的角質(zhì)酶，例如特異腐質(zhì)霉(WO 96/13580)；來自假單胞菌屬的菌株的脂肪酶(這些中的一些現(xiàn)在改名為伯克霍爾氏菌屬)，例如產(chǎn)堿假單胞菌或類產(chǎn)堿假單胞菌(EP 218272)、洋蔥假單胞菌(EP 331376)、假單胞菌屬菌株SD705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假單胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；GDSL-型鏈霉菌屬脂肪酶(WO 10/065455)；來自稻瘟病菌的角質(zhì)酶(WO 10/107560)；來自門多薩假單胞菌的角質(zhì)酶(US 5,389,536)；來自褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜熱脂肪土芽孢桿菌脂肪酶(WO 11/084417)；來自枯草芽孢桿菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及來自灰色鏈霉菌(WO 11/150157)和始旋鏈霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO 12/137147)。

其他實(shí)例是脂肪酶變體，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。

優(yōu)選的商業(yè)化脂肪酶產(chǎn)品包括Lipolase^TM、Lipex^TM；Lipolex^TM和Lipoclean^TM(諾維信公司)，Lumafast(最初來自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(最初來自吉斯特-博克德斯公司(Gist-Brocades))。

再其他實(shí)例是有時(shí)稱為?；D(zhuǎn)移酶或過水解酶的脂肪酶，例如與南極假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的?；D(zhuǎn)移酶(WO 10/111143)、來自恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)的?；D(zhuǎn)移酶(WO 05/56782)、來自CE 7家族的過水解酶(WO 09/67279)以及恥垢分枝桿菌過水解酶的變體(特別是來自亨斯邁紡織品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商業(yè)產(chǎn)品Gentle Power Bleach中所用的S54V變體)(WO 10/100028)。

淀粉酶

可以與本發(fā)明的酶一起使用的適合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有細(xì)菌或真菌起源。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程處理的突變體。淀粉酶包括例如獲得自芽孢桿菌屬的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更詳細(xì)描述的地衣芽孢桿菌具體株系的α-淀粉酶。

適合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其與SEQ ID NO:3具有90％序列一致性的變體。優(yōu)選的變體描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在一個(gè)或多個(gè)以下位置中具有取代的變體：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

不同的適合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其與SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的變體。SEQ ID NO:6的優(yōu)選變體是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

其他適合的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的獲得自解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶的殘基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的殘基36-483的雜合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的變體。這一雜合α-淀粉酶的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個(gè)或多個(gè)中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的獲得自解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶的殘基1-33和SEQ ID NO:4的殘基36-483的雜合α-淀粉酶的最優(yōu)選變體是具有以下取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

適合的另外的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其與SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的變體。SEQ ID NO:6的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個(gè)或多個(gè)中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特別優(yōu)選的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。

可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有90％序列一致性的變體。使用WO 96/023873的SEQ ID 2用于編號，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個(gè)或多個(gè)中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更優(yōu)選的變體是在選自181、182、183和184的兩個(gè)位置，例如181和182、182和183、或位置183和184具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最優(yōu)選的淀粉酶變體是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476的一個(gè)或多個(gè)中具有取代的那些。

可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其與WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或與WO 01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的變體。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個(gè)或多個(gè)中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。

另外的適合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其與SEQ ID NO:2具有90％序列一致性的變體。SEQ ID NO:2的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個(gè)或多個(gè)中具有C末端的截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更優(yōu)選變體是在一個(gè)或多個(gè)以下位置中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQ ID NO:2的最優(yōu)選的淀粉酶變體是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中這些變體是C-末端截短的并且任選地進(jìn)一步在位置243處包括取代和/或在位置180和/或位置181處包括缺失。

其他適合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或與SEQ ID NO:12具有至少90％序列一致性的變體。優(yōu)選的淀粉酶變體是在WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的以下位置中的一個(gè)或多個(gè)中具有取代、缺失或插入的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特別優(yōu)選的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的變體，以及另外在選自下組的一個(gè)或多個(gè)位置中具有取代的變體：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最優(yōu)選的是另外在所有這些位置中具有取代的變體。

其他實(shí)例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO 2013/001087中的那些淀粉酶變體。

可商購的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme ^TM、Stainzyme Plus^TM、Natalase^TM、Liquozyme X及BAN^TM(來自諾維信公司)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM/Effectenz^TM、Powerase及Preferenz S100(來自杰能科國際有限公司/杜邦公司(Genencor International Inc./DuPont))。

過氧化物酶/氧化酶

根據(jù)本發(fā)明的過氧化物酶是由如由國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會命名委員會(IUBMB)陳述的酶分類EC 1.11.1.7包括的過氧化物酶，或獲得自其中的展示出過氧化物酶活性的任何片段。

適合的過氧化物酶包括植物、細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程處理的突變體。有用的過氧化物酶的實(shí)例包括來自擬鬼傘屬，例如來自灰蓋擬鬼傘(C.cinerea)的過氧化物酶(EP 179,486)，及其變體，如在WO 93/24618、WO 95/10602以及WO 98/15257中描述的那些。

根據(jù)本發(fā)明的過氧化物酶還包括鹵代過氧化物酶，例如氯過氧化物酶、溴過氧化物酶以及展示出氯過氧化物酶或溴過氧化物酶活性的化合物。根據(jù)其對鹵素離子的特異性將鹵代過氧化物酶加以分類。氯過氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化從氯根離子形成次氯酸鹽。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的鹵代過氧化物酶是氯過氧化物酶。優(yōu)選地，該鹵代過氧化物酶是釩鹵代過氧化物酶，即含釩酸鹽的鹵代過氧化物酶。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法中，將含釩酸鹽的鹵代過氧化物酶與氯根離子來源組合。

已經(jīng)從許多不同真菌，特別是從暗色絲孢菌(dematiaceous hyphomycete)真菌組中分離出了鹵代過氧化物酶，比如卡爾黑霉屬(Caldariomyces)(例如煤卡爾黑霉(C.fumago))、鏈格孢屬、彎孢屬(例如疣枝彎孢(C.verruculosa)和不等彎孢(C.inaequalis))、內(nèi)臍蠕孢屬、細(xì)基格孢屬以及葡萄孢屬。

還已經(jīng)從細(xì)菌，如假單胞菌屬(例如，吡咯假單胞菌(P.pyrrocinia))和鏈霉菌屬(例如，金色鏈霉菌(S.aureofaciens))中分離出了鹵代過氧化物酶。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該鹵代過氧化物酶可源自彎孢屬，特別是疣枝彎孢(Curvularia verruculosa)或不等彎孢，如如描述于WO 95/27046中的不等彎孢CBS 102.42或描述于WO 97/04102中的疣枝彎孢CBS 147.63或疣枝彎孢CBS 444.70；或可源自如描述于WO 01/79459中的Drechslera hartlebii，如描述于WO 01/79458中的鹽沼小樹狀霉(Dendryphiella salina)、如描述于WO 01/79461中的Phaeotrichoconis crotalarie或如描述于WO 01/79460中的Geniculosporium屬。

根據(jù)本發(fā)明的氧化酶具體包括由酶分類EC 1.10.3.2囊括的任何漆酶或獲得自其中的展示出漆酶活性的片段、或展示出類似活性的化合物，例如兒茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)、鄰氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或膽紅素氧化酶(EC 1.3.3.5)。

優(yōu)選的漆酶是微生物來源的酶。這些酶可以獲得自植物、細(xì)菌或真菌(包括絲狀真菌和酵母)。

來自真菌適合的實(shí)例包括源自以下項(xiàng)的菌株的漆酶：曲霉屬(Aspergillus)，脈孢菌屬(Neurospora)，例如粗糙脈孢菌(N.crassa)，柄孢殼屬(Podospora)，葡萄孢屬(Botrytis)，金錢菌屬(Collybia)，層孔菌屬(Fomes)，香菇屬(Lentinus)，側(cè)耳屬(Pleurotus)，栓菌屬(Trametes)，例如，長絨毛栓菌和變色栓菌，絲核菌屬(Rhizoctonia)，例如，立枯絲核菌(R.solani)，鬼傘屬(Coprinus)，例如，灰蓋鬼傘(C.cinereus)、毛頭鬼傘(C.comatus)、費(fèi)賴斯鬼傘(C.friesii)、和褶紋鬼傘(C.plicatilis)，小脆柄菇屬(Psathyrella),例如，P.condelleana，斑褶菇屬(Panaeolus)，例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus)，毀絲霉屬(Myceliophthora)，例如，嗜熱毀絲霉(M.thermophila)，柱頂孢屬(Schytalidium)，例如，S.thermophilum，多孔菌屬(Polyporus)，例如，匹斯特斯多孔菌(P.pinsitus)，射脈菌屬(Phlebia)，例如，射脈菌(P.radita)(WO 92/01046)，或擬革蓋菌屬(Coriolus)，例如，毛革蓋菌(C.hirsutus)(JP 2238885)。

來自細(xì)菌的適合實(shí)例包括可源自芽孢桿菌屬的菌株的漆酶。

優(yōu)選的是獲得自擬鬼傘屬或毀絲霉屬的漆酶；特別是獲得自灰蓋擬鬼傘的漆酶，如披露于WO 97/08325中；或來自嗜熱毀絲霉，如披露于WO 95/33836中。

該一種或多種洗滌劑酶可以通過添加包含一種或多種酶的單獨(dú)的添加劑，或通過添加包括所有這些酶的組合添加劑而被包括于洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，即獨(dú)立添加劑或組合添加劑，可以被配制為，例如顆粒、液體、漿料等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑配制品是顆粒，尤其是非塵顆粒；液體，尤其是穩(wěn)定化的液體；或漿料。

非塵顆?？梢岳缛缭赨S 4,106,991和4,661,452中所披露而產(chǎn)生，并且可以任選地通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行涂層。蠟狀包衣材料的實(shí)例是平均分子量為1000至20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG)；具有16到50個(gè)環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚(ethoxylatednonylphenol)；具有15至80個(gè)環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化脂肪族醇，其中醇含有12至20個(gè)碳原子；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的單-和雙-和三甘油酯。適用于通過流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包衣材料的實(shí)例在GB 1483591中給出。液體酶制劑可以例如通過根據(jù)已確立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而穩(wěn)定化。受保護(hù)的酶可以根據(jù)EP 238,216中披露的方法制備。

其他材料

還可以使用本領(lǐng)域中已知用于洗滌劑中的任何洗滌劑組分。其他任選的洗滌劑組分包括防腐劑、防縮劑、抗污垢再沉積劑、抗皺劑、殺細(xì)菌劑、粘合劑、腐蝕抑制劑、崩解劑(disintegrant)/崩解試劑(disintegration agent)、染料、酶穩(wěn)定劑(包括硼酸、硼酸鹽、CMC和/或多元醇如丙二醇)、織物整理劑(包括粘土)、填充劑/加工助劑、熒光增白劑/光學(xué)增亮劑、增泡劑、泡沫(泡)調(diào)節(jié)劑、香料、污垢助懸劑、軟化劑、抑泡劑、晦暗抑制劑以及芯吸劑，單獨(dú)或組合使用?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知用于洗滌劑中的任何成分。此類成分的選擇完全在普通技術(shù)人員的技術(shù)內(nèi)。

分散劑

本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以含有分散劑。具體地說，粉狀洗滌劑可以包括分散劑。適合的水溶性有機(jī)材料包括均聚合或共聚合的酸或其鹽，其中聚羧酸包括至少兩個(gè)羧基，這兩個(gè)羧基被不超過兩個(gè)碳原子彼此分開。適合的分散劑例如描述于粉狀洗滌劑，表面活性劑科學(xué)系列，第71卷中，馬塞爾·德克爾公司(Marcel Dekker)。

染料轉(zhuǎn)移抑制劑

本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種染料轉(zhuǎn)移抑制劑。合適的聚合物染料轉(zhuǎn)移抑制劑包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮與N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。當(dāng)存在于主題組合物中時(shí)，染料轉(zhuǎn)移抑制劑可以按組合物重量計(jì)的以下水平存在：從約0.0001％至約10％、從約0.01％至約5％或甚至從約0.1％至約3％。

熒光增白劑

本發(fā)明的洗滌劑組合物將優(yōu)選地還包含另外的組分，這些組分可以給正在清潔的物品著色，例如熒光增白劑或光學(xué)增亮劑。其中增亮劑優(yōu)選以約0.01％至約0.5％的水平存在。在本發(fā)明的組合物中可以使用適合用于在衣物洗滌劑組合物中使用的任何熒光增白劑。最常用的熒光增白劑是屬于以下類別的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-聯(lián)苯乙烯基衍生物。二氨基芪-磺酸衍生物類型的熒光增白劑的實(shí)例包括以下的鈉鹽：4,4'-雙-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-均-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽、4,4'-雙-(2,4-二苯胺基-均-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸鹽、4,4'-雙-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羥基-乙基氨基)-均-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽、4,4'-雙-(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸鹽以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸鈉。優(yōu)選的熒光增白劑是可從汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞爾，瑞士)獲得的天來寶(Tinopal)DMS和天來寶CBS。天來寶DMS是4,4'-雙-(2-嗎啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽的二鈉鹽。天來寶CBS是2,2'-雙-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸鹽的二鈉鹽。還優(yōu)選熒光增白劑，是可商購的Parawhite KX，由派拉蒙礦物與化學(xué)(Paramount Minerals and Chemicals)，孟買，印度供應(yīng)。適合用于在本發(fā)明中使用的其他熒光劑包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。

適合的熒光增亮劑水平包括從約0.01wt％、從0.05wt％、從約0.1wt％或甚至從約0.2wt％的較低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的較高水平。

污物釋放聚合物

本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種污物釋放聚合物，這些聚合物幫助從織物(如棉和基于聚酯的織物)移除污物，特別是從基于聚酯的織物移除疏水性污物。污物釋放聚合物可以例如是非離子型或陰離子型對苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己內(nèi)酰胺和相關(guān)共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，參見例如粉狀洗滌劑，表面活性劑科學(xué)系列第71卷第7章，馬塞爾·德克爾公司(Marcel Dekker，Inc.)。另一種類型的污物釋放聚合物是包括一個(gè)芯結(jié)構(gòu)和連接至該芯結(jié)構(gòu)的多個(gè)烷氧基化基團(tuán)的兩親性烷氧基化油污清潔聚合物。核心結(jié)構(gòu)可以包括聚烷基亞胺結(jié)構(gòu)或聚烷醇胺結(jié)構(gòu)，如WO 2009/087523中詳細(xì)描述的(將其通過引用而特此結(jié)合)。此外，隨機(jī)接枝共聚物是適合的污物釋放聚合物。適合的接枝共聚物更詳細(xì)地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314中(將其通過引用而特此結(jié)合)。其他污物釋放聚合物是取代的多糖結(jié)構(gòu)，尤其是取代的纖維素結(jié)構(gòu)，例如改性纖維素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(將二者都通過引用而特此結(jié)合)。適合的纖維素聚合物包括纖維素、纖維素醚、纖維素酯、纖維素酰胺及其混合物。適合的纖維素聚合物包括陰離子改性的纖維素、非離子改性的纖維素、陽離子改性的纖維素、兼性離子改性的纖維素及其混合物。適合的纖維素聚合物包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、酯羧甲基纖維素及其混合物。

抗再沉淀劑

本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種抗再沉積劑，例如羧甲基纖維素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和馬來酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亞胺。以上在污物釋放聚合物下描述的纖維素基聚合物還可以用作抗再沉積劑。

流變改性劑

本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種流變改性劑、結(jié)構(gòu)劑或增稠劑，不同于降粘劑。流變改性劑選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：非聚合物結(jié)晶、羥基功能材料、聚合物流變改性劑，它們?yōu)橐后w洗滌劑組合物的水性液相基質(zhì)賦予剪切稀化特征?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法修飾和調(diào)整洗滌劑的流變學(xué)和粘度，例如如在EP 2169040中所示。

其他適合的輔料包括但不限于防縮劑、抗皺劑、殺細(xì)菌劑、粘合劑、載體、染料、酶穩(wěn)定劑、織物軟化劑、填充劑、泡沫調(diào)節(jié)劑、助水溶劑、香料、色素、抑泡劑、溶劑以及用于液體洗滌劑的結(jié)構(gòu)劑和/或結(jié)構(gòu)彈性劑。

洗滌劑產(chǎn)品的配制品

本發(fā)明的洗滌劑組合物可以處于任何常規(guī)形式，例如條、均勻的片劑、具有兩個(gè)或更多個(gè)層的片劑、具有一個(gè)或多個(gè)室的袋、規(guī)則的或壓縮的粉末、顆粒、膏、凝膠、或規(guī)則的、壓縮的或濃縮的液體。

袋可以被配置為單個(gè)或多個(gè)的室。它可以具有適合容持該組合物的任何形式、形狀和材料，例如在與水接觸之前，不允許該組合物從袋中釋放出來。袋由封裝內(nèi)體積的水溶性膜制成?？梢詫⑺鰞?nèi)體積分為具有袋的室。優(yōu)選的膜是形成膜或片的聚合材料，優(yōu)選是聚合物。優(yōu)選的聚合物、共聚物或其衍生物選自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纖維素、羧甲基纖維素、糊精鈉、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、麥芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最優(yōu)選地是聚乙烯醇共聚物以及羥丙基甲基纖維素(HPMC)。優(yōu)選地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少約60％。優(yōu)選的平均分子量將典型地是約20,000至約150,000。膜還可以是共混組合物，該共混組合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在貿(mào)易參考M8630下，如由美國印第安納州的MonoSol LLC公司銷售)加增塑劑，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。這些袋可以包括固體衣物清潔組合物或部分組分和/或液體清潔組合物或由水溶性膜分開的部分組分。用于液體組分的室在組成上可以與包括固體的室不同：US 2009/0011970 A1。

可以由水可溶的袋中或片劑的不同層中的室來將洗滌劑成分物理地彼此分開。由此可以避免組分之間的負(fù)面的存儲相互作用。在洗滌溶液中，每個(gè)室的不同溶解曲線還可以引起選擇的組分的延遲溶解。

非單位劑量的液體或凝膠洗滌劑可以是水性的，典型地包含按重量計(jì)至少20％并且高達(dá)95％的水，例如高達(dá)約70％的水、高達(dá)約65％的水、高達(dá)約55％的水、高達(dá)約45％的水、高達(dá)約35％的水。包括但不限于鏈烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他類型的液體可以被包括在水性液體或凝膠中。含水液體或凝膠洗滌劑可以含有從0-30％的有機(jī)溶劑。

液體或凝膠洗滌劑可以是非水性的。

洗衣皂?xiàng)l

本發(fā)明的DNA酶可以被添加至洗衣皂?xiàng)l中并且用于手洗洗衣、織物和/或紡織品。術(shù)語洗衣皂?xiàng)l包括洗衣條、皂?xiàng)l、組合條(combo bar)、合成洗滌劑條以及洗滌劑條。條的類型通常區(qū)別在于它們包含的表面活性劑的類型，并且術(shù)語洗衣皂?xiàng)l包括含有來自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂?xiàng)l具有在室溫下為固體而非液體、凝膠或粉末的物理形式。術(shù)語固體被定義為不隨時(shí)間推移顯著改變的實(shí)體形式，即如果將一個(gè)固體物件(例如洗衣皂?xiàng)l)放置在一種容器內(nèi)，那么該固體物件不會改變以填充放置該固體物件的容器。該條是典型地呈條形式但是可以呈其他固體形狀、如圓形或卵形的一種固體。

洗衣皂?xiàng)l可以包含一種或多種另外的酶，蛋白酶抑制劑例如肽醛類(或次硫酸鹽加合物或半縮醛加合物)，硼酸，硼酸鹽，硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰苯基硼酸，一種或多種肥皂或合成表面活性劑，多元醇例如甘油，pH控制化合物例如脂肪酸、檸檬酸、乙酸和/或甲酸，和/或一價(jià)陽離子和有機(jī)陰離子的鹽，其中該一價(jià)陽離子可以是例如Na⁺、K⁺或NH₄⁺并且該有機(jī)陰離子可以是例如甲酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽或乳酸鹽，這樣使得一價(jià)陽離子和有機(jī)陰離子的鹽可以是例如甲酸鈉。

洗衣皂?xiàng)l還可以包含絡(luò)合劑像EDTA和HEDP，香料和/或不同類型的填充劑，表面活性劑例如陰離子型合成表面活性劑，助洗劑，聚合的污垢釋放劑，洗滌劑螯合劑，穩(wěn)定劑，填充劑，染料，著色劑，染料轉(zhuǎn)移抑制劑，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡劑，結(jié)構(gòu)劑，粘合劑，浸出劑，漂白活化劑，粘土去污劑，抗再沉積劑，聚合分散劑，增白劑，織物柔軟劑，香料和/或本領(lǐng)域已知的其他化合物。

洗衣皂?xiàng)l可以在常規(guī)的洗衣皂?xiàng)l制造設(shè)備中進(jìn)行加工，例如但不限制于：混合器、壓條機(jī)例如雙級真空壓條機(jī)、擠出機(jī)、切割機(jī)、標(biāo)識壓模機(jī)(logo-stamper)、冷卻隧道以及包裝機(jī)。本發(fā)明不局限于通過任何單一方法制備洗衣皂?xiàng)l。可以在過程的不同階段向肥皂中添加本發(fā)明的預(yù)混料。例如，可以制備包含肥皂、DNA酶、任選地一種或多種另外的酶、蛋白酶抑制劑以及一價(jià)陽離子和有機(jī)陰離子的鹽的預(yù)混料并且然后將該混合物壓條?？梢酝瑫r(shí)添加作為例如處于液態(tài)的蛋白酶抑制劑的DNA酶以及任選的另外的酶。除了混合步驟和壓條步驟以外，該工藝還可以進(jìn)一步包括研磨、擠出、切割、壓模、冷卻和/或包裝的步驟。

共顆粒中酶的配制品

該DNA酶可以被配制為顆粒，例如，配制為結(jié)合一種或多種酶的共顆粒。然后，每種酶將存在于多種顆粒中，這些顆粒確保酶在洗滌劑中的分布更均勻。這還減少了由于不同的粒度，不同酶的物理隔離。用于生產(chǎn)針對洗滌劑工業(yè)的多酶共顆粒的方法披露于IP.com公開內(nèi)容IPCOM000200739D中。

通過使用共顆粒的酶的配制品的另一個(gè)實(shí)例披露于WO 2013/188331中，其涉及包括以下各項(xiàng)的洗滌劑組合物：(a)多酶共顆粒；(b)少于10wt沸石(無水基底)；和(c)少于10wt磷酸鹽(無水基底)，其中所述酶共顆粒包括從10wt％至98wt％的水分匯組分，并且該組合物另外還包括從20wt％至80wt％的洗滌劑水分匯組分。WO 2013/188331還涉及處理和/或清潔表面的方法，優(yōu)選織物表面，該方法包括以下步驟：(i)將所述表面與在含水洗滌液中如在此要求保護(hù)的并且描述的洗滌劑組合物接觸，(ii)沖洗和/或干燥該表面。

該多酶共顆?？梢园―NA酶和(a)選自下組的一種或多種酶，該組由以下各項(xiàng)組成：首次洗滌脂肪酶、清潔纖維素酶、木葡聚糖酶、過水解酶、過氧化酶、脂氧合酶、漆酶及其混合物；和(b)選自下組的一種或多種酶，該組由以下各項(xiàng)組成：半纖維素酶、蛋白酶、護(hù)理纖維素酶、纖維二糖脫氫酶、木聚糖酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、甘露聚糖酶、果膠酸裂解酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質(zhì)酶、普魯蘭酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、地衣聚糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、玻璃酸酶、軟骨素酶、淀粉酶、及其混合物。

在以下各段中進(jìn)一步概述本發(fā)明：

1.一種具有DNA酶活性的多肽用于從物品上防止、減少或去除生物膜的用途，其中該多肽獲得自真菌來源并且該物品是紡織品。

2.根據(jù)段落1所述的用途，用于防止、減少或去除物品的粘性。

3.根據(jù)段落1或2中任一項(xiàng)所述的用途，用于預(yù)處理物品上的污漬。

4.根據(jù)段落1-3中任一項(xiàng)所述的用途，用于防止、減少或去除洗滌循環(huán)過程中污垢的再沉積。

5.根據(jù)段落1-4中任一項(xiàng)所述的用途，用于防止、減少或去除污垢在物品上的附著。

6.根據(jù)以上段落中任一項(xiàng)所述的用途，用于維持或改進(jìn)該物品的白度。

7.根據(jù)以上段落中任一項(xiàng)所述的用途，其中該多肽是如段落47-54所述的多肽。

8.根據(jù)以上段落中任一項(xiàng)所述的用途，其中從該物品減少或去除惡臭。

9.根據(jù)以上段落中任一項(xiàng)所述的用途，其中該惡臭是由E-2-壬烯醛引起的。

10.根據(jù)以上段落中任一項(xiàng)所述的用途，其中減少或去除在濕紡織品上存在的E-2-壬烯醛的量。

11.根據(jù)以上段落中任一項(xiàng)所述的用途，其中減少或去除在干紡織品上存在的E-2-壬烯醛的量。

12.一種洗滌劑組合物，該洗滌劑組合物包括具有脫氧核糖核酸酶(DNA酶)活性的多肽和洗滌劑佐劑成分，其中該多肽獲得自真菌來源。

13.根據(jù)段落12所述的洗滌劑組合物，其中該多肽獲得自木霉屬。

14.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該多肽獲得自哈茨木霉。

15.根據(jù)以上段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該多肽是如段落47-54所述的多肽。

16.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該洗滌劑佐劑成分選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：表面活性劑、助洗劑、絮凝助劑、螯合劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、酶、酶穩(wěn)定劑、酶抑制劑、催化材料、漂白活化劑、過氧化氫、過氧化氫源、預(yù)形成的過酸、聚合的分散劑、粘土去污劑/抗再沉淀劑、增白劑、抑泡劑、染料、香料、結(jié)構(gòu)彈力劑、織物柔軟劑、載體、助水溶物、助洗劑和共助洗劑、織物調(diào)色劑、防沫劑、分散劑、加工助劑、和/或顏料。

17.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該組合物進(jìn)一步包括選自下組的一種或多種酶，該組由以下各項(xiàng)組成：蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和氧化酶。

18.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該酶是動物、植物或微生物來源的蛋白酶。

19.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該蛋白酶是化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程的。

20.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中蛋白酶是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。

21.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該蛋白酶選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：芽胞桿菌屬，例如，枯草桿菌蛋白酶諾和、枯草桿菌蛋白酶嘉士伯、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶168、牛源胰蛋白酶、豬源的胰蛋白酶和鐮孢屬蛋白酶。

22.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該蛋白酶與SEQ ID NO:7具有至少90％，如至少95％序列一致性。

23.根據(jù)以上段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該蛋白酶與SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％一致性、或在以下位置中的一個(gè)或多個(gè)具有取代的其變體：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、和274，優(yōu)選地，該變體是與SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％一致性的堿性蛋白酶，其具有以下取代：M222S或取代N76D+G195E。

24.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中洗滌劑組合物能夠減少選自下組的細(xì)菌的附著至表面，該組由以下各項(xiàng)組成：不動桿菌屬物種、氣微菌屬物種、短波單胞菌屬物種、微桿菌屬物種、滕黃微球菌、假單胞菌屬物種、表皮葡萄球菌以及寡養(yǎng)單胞菌屬物種，或能夠使細(xì)菌從它們粘附至其上的表面釋放。

25.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該表面是紡織品表面。

26.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該紡織品由棉、棉/聚酯、聚酯、聚酰胺、聚丙烯和/或絲綢制成。

27.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該組合物是棒、均勻的片劑、具有兩個(gè)或更多個(gè)層的片劑、具有一個(gè)或多個(gè)室的袋、規(guī)則的或壓縮的粉末、顆粒、膏、凝膠、或規(guī)則的、壓縮的或濃縮的液體。

28.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該組合物是液體洗滌劑、粉狀洗滌劑或顆粒洗滌劑。

29.一種用于洗滌物品的洗滌方法，該方法包括以下步驟：

a.將一種物品暴露于一種洗滌液，該洗滌液包括如段落47-54所述的多肽或根據(jù)段落12-28中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物；

b.完成至少一個(gè)洗滌循環(huán)；以及

c.任選地沖洗該物品，

其中該物品是一種紡織品。

30.根據(jù)段落29所述的方法，其中該洗滌液的pH在7至10的范圍內(nèi)。

31.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中該洗滌液的pH在7至9的范圍內(nèi)，在7至8的范圍內(nèi)或在7至7.5的范圍內(nèi)。

32.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中該洗滌液的溫度在5℃至95℃的范圍內(nèi)、或在10℃至80℃的范圍內(nèi)、在10℃至70℃的范圍內(nèi)、在10℃至60℃的范圍內(nèi)、在10℃至50℃的范圍內(nèi)、在15℃至40℃的范圍內(nèi)、或在20℃至30℃的范圍內(nèi)。

33.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中該洗滌液的溫度是30℃。

34.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括在完成洗滌循環(huán)后排掉洗滌液或部分洗滌液。

35.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中在第一個(gè)并且任選地第二個(gè)或第三個(gè)洗滌循環(huán)過程中，將該物品暴露于該洗滌液。

36.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中在暴露于該洗滌液后，沖洗該物品。

37.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中將該物品用水或用包括調(diào)節(jié)劑的水進(jìn)行沖洗。

38.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中該物品的粘性被減少。

39.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中將物品上存在的污漬用如段落47-54所述的多肽或根據(jù)段落12-28中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物進(jìn)行預(yù)處理。

40.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中污垢的再沉積被減少。

41.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中污垢在物品上的附著被減少或去除。

42.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中該物品的白度被維持或改善。

43.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中從該物品減少或去除惡臭。

44.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中該惡臭是由E-2-壬烯醛引起的。

45.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中在濕紡織品上存在的E-2-壬烯醛的量被減少或去除。

46.根據(jù)以上方法段落中任一項(xiàng)所述的方法，其中在干紡織品上存在的E-2-壬烯醛的量被減少或去除。

47.一種具有DNA酶活性的多肽，該多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：

a.與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性的多肽；

b.由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸在低嚴(yán)格條件下與以下各項(xiàng)雜交

i.SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列，

ii.其cDNA序列，或

iii.(i)或(ii)的全長互補(bǔ)體；

c.一種由與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸編碼的多肽；

d.SEQ ID NO:2的成熟多肽的一種變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)位置處包含取代、缺失、和/或插入；和

e.(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，該片段具有DNA酶活性。

48.如段落47所述的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。

49.根據(jù)段落47或48所述的多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸在低嚴(yán)格條件、低-中嚴(yán)格條件、中嚴(yán)格條件、中-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下各項(xiàng)雜交

i.SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列，

ii.其cDNA序列，或

iii.(i)或(ii)的全長互補(bǔ)體。

50.根據(jù)段落47-49中任一項(xiàng)所述的多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。

51.根據(jù)段落47-50中任一項(xiàng)所述的多肽，該多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽或者由其組成。

52.根據(jù)段落51所述的多肽，其中該成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至188。

53.根據(jù)段落47-52中任一項(xiàng)所述的多肽，該多肽是SEQ ID NO:2的成熟多肽的變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)位置處包括取代、缺失和/或插入。

54.根據(jù)段落53所述的多肽，該多肽是SEQ ID NO:2的片段，其中該片段具有DNA酶活性。

55.一種編碼根據(jù)段落47-54中任一項(xiàng)所述的多肽的多核苷酸。

56.一種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，該核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體包括如段落55所述的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至指導(dǎo)多肽在表達(dá)宿主內(nèi)產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)控制序列。

57.一種重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞包括如段落47-54所述的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至指導(dǎo)多肽的產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)控制序列。

58.一種產(chǎn)生如段落47-54中任一項(xiàng)所述的多肽的方法，該方法包括：在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)一種細(xì)胞，該細(xì)胞處于其野生型形式時(shí)產(chǎn)生該多肽。

59.如段落58所述的方法，該方法進(jìn)一步包括回收該多肽。

60.一種產(chǎn)生具有DNA酶活性的多肽的方法，該方法包括：在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)如段落57所述的宿主細(xì)胞。

61.如段落60所述的方法，該方法進(jìn)一步包括回收該多肽。

62.一種編碼信號肽的多核苷酸，該信號肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-17至-1或由其組成。

63.一種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，該核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體包括編碼蛋白質(zhì)的可操作地連接至如段落62所述的多核苷酸的基因，其中該基因?qū)τ诰幋a該信號肽的多核苷酸而言是外源的。

64.一種重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞包括編碼蛋白質(zhì)的可操作地連接至如段落62所述的多核苷酸的基因，其中該基因?qū)τ诰幋a該信號肽的多核苷酸而言是外源的。

65.一種產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，該方法包括：在有益于產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞包括編碼蛋白質(zhì)的可操作地連接至如段落62所述的多核苷酸上的基因，其中該基因?qū)τ诰幋a該信號肽的多核苷酸而言是外源的。

66.如段落65所述的方法，該方法進(jìn)一步包括回收該蛋白質(zhì)。

67.一種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，該核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體包括一個(gè)編碼蛋白質(zhì)的可操作地連接至如段落62所述的多核苷酸的基因，其中該基因?qū)τ诰幋a該前肽的多核苷酸來說是外源的。

68.一種重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞包括一個(gè)編碼蛋白質(zhì)的可操作地連接至如段落62所述的多核苷酸的基因，其中該基因?qū)τ诰幋a該前肽的多核苷酸來說是外源的。

69.一種產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，該方法包括：在有益于產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)該重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞包括編碼可操作地連接至如段落62所述的多核苷酸上的蛋白質(zhì)的基因，其中該基因?qū)τ诰幋a該多肽的多核苷酸來說是異源的。

70.如段落69所述的方法，該方法進(jìn)一步包括回收該蛋白質(zhì)。

71.一種包括如段落47-54中任一項(xiàng)所述的多肽的全培養(yǎng)液配制品或細(xì)胞培養(yǎng)組合物。

72.根據(jù)段落29-46中任一項(xiàng)所述的方法洗滌的物品。

73.一種藥物組合物，該藥物組合物包括具有DNA酶活性的多肽和藥物佐劑成分，其中該多肽獲得自真菌來源。

74.根據(jù)段落73所述的藥物組合物，其中具有DNA酶活性的多肽獲得自木霉屬。

75.根據(jù)段落73-74中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中具有DNA酶活性的多肽獲得自哈茨木霉。

76.根據(jù)段落73-75中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中該多肽是如段落47-54所述的多肽。

77.根據(jù)段落73-76中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中將該組合物配制為牙膏、液體牙膏、漱口劑、含片或牙齦按摩軟膏劑。

78.根據(jù)段落73-77中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，該藥物組合物進(jìn)一步包括一種或多種抗微生物化合物，如抗細(xì)菌化合物、抗寄生蟲化合物、抗真菌化合物和抗病毒化合物。

79.一種內(nèi)留置醫(yī)療裝置，其特征在于將所述裝置的病人可接觸表面的至少一部分用如段落73-78中任一項(xiàng)所述藥物組合物進(jìn)行涂覆。

80.根據(jù)段落79所述的裝置，其中所述裝置是導(dǎo)管如中央靜脈導(dǎo)管、血管內(nèi)導(dǎo)管、導(dǎo)尿管、?？寺鼘?dǎo)管、腹膜透析管、氣管導(dǎo)管、或其中該裝置是機(jī)械心臟瓣膜、心臟起搏器、動靜脈分流、鞏膜扣、人工關(guān)節(jié)、鼓膜造孔插管、氣管造口管、聲音假體、陰莖假體、人工尿道括約肌、合成的恥骨陰道吊帶、手術(shù)用縫線、骨錨、骨螺釘、人工晶狀體、接觸鏡、宮內(nèi)節(jié)育器、主動脈股動脈移植物、血管移植物、針、Luer-Lok連接器、無針連接器或外科器械。

81.一種產(chǎn)生如段落47-54中任一項(xiàng)所述的多肽的方法，該方法包括：在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)如段落57所述的宿主細(xì)胞。

82.如段落81所述的方法，該方法進(jìn)一步包括回收該多肽。

83.如段落57所述的重組宿主細(xì)胞，進(jìn)一步包括編碼感興趣的第二多肽的多核苷酸；優(yōu)選感興趣的酶；更優(yōu)選感興趣的分泌的酶，甚至更優(yōu)選水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶；并且最優(yōu)選該分泌的酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、綠色熒光蛋白、葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

84.如段落83的重組宿主細(xì)胞，其中該感興趣的第二多肽是與宿主細(xì)胞異源的或同源的。

85.如段落83或84所述的重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞是真菌宿主細(xì)胞；優(yōu)選絲狀真菌宿主細(xì)胞；更優(yōu)選枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管菌屬、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘菌屬、革蓋菌屬、隱球菌屬、線黑粉酵母屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新美鞭菌屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉菌屬、平革菌屬、白腐菌屬、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬、或木霉屬的細(xì)胞；最優(yōu)選泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(Bjerkandera adusta)、干擬蠟菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡內(nèi)基擬蠟菌(Ceriporiopsis caregiea)、淺黃擬蠟孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘諾希塔擬蠟菌(Ceriporiopsis pannocinta)、環(huán)帶擬蠟菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微紅擬蠟菌(Ceriporiopsis subrufa)、蟲擬蠟菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狹邊金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角質(zhì)金孢子菌、盧克諾文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、糞狀金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士蘭金孢子菌、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)、毛革蓋菌(Coriolus hirsutus)、桿孢狀鐮孢、谷類鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢菌、產(chǎn)紫青霉菌、黃孢原毛平革菌、射脈菌(Phlebia radiata)、刺芹側(cè)耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢殼、長域毛栓菌(Trametes villosa)、變色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞。

86.如段落83或84所述的重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞是細(xì)菌宿主細(xì)胞；優(yōu)選原核生物宿主細(xì)胞；更優(yōu)選革蘭氏陽性宿主細(xì)胞；甚至更優(yōu)選芽胞桿菌屬、梭狀芽孢桿菌、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、或鏈霉菌屬宿主細(xì)胞；并且最優(yōu)選嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、和蘇云金芽孢桿菌宿主細(xì)胞。

87.一種產(chǎn)生如段落83-84中任一項(xiàng)所定義的感興趣的第二多肽的方法，該方法包括：在有益于產(chǎn)生該感興趣的第二多肽的條件下培養(yǎng)如段落83-86中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞。

88.如段落87所述的方法，該方法進(jìn)一步包括回收該感興趣的第二多肽。

89.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該洗滌劑佐劑成分是表面活性劑。

90.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該洗滌劑佐劑成分是助洗劑。

91.根據(jù)以上組合物段落中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該洗滌劑佐劑成分是粘土去污劑/抗再沉淀劑。

92.根據(jù)段落28所述的洗滌劑組合物，其中該組合物是一種液體洗滌劑組合物，包括總濃度按重量計(jì)是至少3％的表面活性劑和洗滌劑助洗劑，和含洗滌劑酶的微囊，其中該微囊的膜是通過具有高于1kDa分子量的多支化的多胺的交聯(lián)而產(chǎn)生。

93.根據(jù)段落92所述的洗滌劑組合物，其中該多支化的多胺的這些反應(yīng)性氨基構(gòu)成該分子量的至少15％。

94.根據(jù)段落92-93中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中通過使用?；茸鳛榻宦?lián)劑生成該微囊。

95.根據(jù)段落92-94中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該微囊的直徑是至少50微米，或大于50微米。

96.根據(jù)段落92-95中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該微囊包含按重量計(jì)至少1％的活性酶。

97.根據(jù)段落92-96中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，該洗滌劑組合物進(jìn)一步包括醇，例如多元醇。

98.根據(jù)段落92-97中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該表面活性劑是陰離子表面活性劑。

99.根據(jù)段落92-98中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，該洗滌劑組合物是液體洗衣組合物。

100.根據(jù)段落92-99中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，該洗滌劑組合物包含按重量計(jì)少于90％的水。

101.根據(jù)段落92-100中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該洗滌劑酶是具有DNA酶活性的多肽、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶、或氧化還原酶。

102.根據(jù)段落92-101中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該蛋白酶是金屬蛋白酶或堿性絲氨酸蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶。

103.根據(jù)段落92-101中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中具有DNA酶活性的多肽是根據(jù)段落47-54中任一項(xiàng)所述的多肽。

104.根據(jù)段落92-103中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中使用酰基氯作為交聯(lián)劑通過界面聚合來生成該微囊。

105.根據(jù)段落92-104中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該多支化的多胺是聚乙亞胺。

106.根據(jù)段落92-105中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中該微囊包括Mg2+、Ca2+、或Zn2+離子的來源，如Mg2+、Ca2+、或Zn2+的難溶鹽。

測定和洗滌劑組合物

洗滌劑組合物

可以將以下提及的洗滌劑組合物結(jié)合本發(fā)明的酶一起使用。

Biotex黑(液體)

5％-15％的陰離子表面活性劑、<5％非離子表面活性劑、香料、酶、DMDM和乙內(nèi)酰脲。

碧浪靈敏性白色與彩色衣物洗滌劑組合物、液體洗滌劑組合物

水、酒精乙氧基硫酸鹽、醇乙氧基化物、氨基氧化物、檸檬酸、C12-18拔頂棕櫚仁脂肪酸、蛋白酶、糖苷酶、淀粉酶、乙醇、1,2丙二醇、甲酸鈉、氯化鈣、氫氧化鈉、有機(jī)硅乳液、跨硫酸EHDQ(這些成分以遞減次序列出)。

WFK IEC-A標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑的組合物(粉狀)

成分：直鏈烷基苯磺酸鈉8.8％、乙氧基化的脂肪醇C12-18(7EO)4.7％、鈉皂3.2％、消泡劑DC2-4248S 3.9％、硅酸鋁鈉沸石4A 28.3％、碳酸鈉11.6％、丙烯酸和馬來酸的共聚物的鈉鹽(Sokalan CP5)2.4％、硅酸鈉3.0％、羧甲基纖維素1.2％、Dequest 2066 2.8％，光學(xué)增白劑0.2％、硫酸鈉6.5％、蛋白酶0.4％。

標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑A組合物(液體)

成分：12％LAS、11％AEO Biosoft N25-7(NI)、7％AEOS(SLES)、6％MPG(丙二醇)、3％乙醇、3％TEA、2.75％可可皂、2.75％大豆皂、2％甘油、2％氫氧化鈉、2％檸檬酸鈉、1％甲酸鈉、0.2％DTMPA和0.2％PCA(所有的百分?jǐn)?shù)都是w/w)

碧浪Actilift組合物(液體)

成分：5％-15％陰離子表面活性劑；<5％非離子型表面活性劑、磷酸鹽、肥皂；酶、光學(xué)增亮劑、苯并異噻唑啉酮、甲基異噻唑啉酮、香料、α-異甲基紫羅蘭酮、香茅醇、香葉醇、芳樟醇。

碧浪Actilift彩色&風(fēng)格組合物(液體)

成分：5％-15％陰離子表面活性劑；<5％非離子型表面活性劑、磷酸鹽、肥皂；酶、香料、苯并異噻唑啉酮、甲基異噻唑啉酮、α-異甲基紫羅蘭酮、丁苯基甲基丙醛、香茅醇、香葉醇、芳樟醇。

寶瑩小&強(qiáng)大洗滌劑組合物(液體)

成分：15％-30％陰離子表面活性劑、非離子型表面活性劑、5％-15％皂、<5％聚羧酸酯、香料、磷酸鹽、光學(xué)增亮劑

寶瑩2合1與舒適西番蓮粉末

硫酸鈉、碳酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、膨潤土、碳酸鈉過氧化物、硅酸鈉、沸石、水、檸檬酸、TAED、C12-15Pareth-7、硬脂酸、香精、丙烯酸鈉/MA共聚物、纖維素膠、所修飾的玉米淀粉、氯化鈉、羥乙磷酸四鈉、EDTMP鈣鈉、苯胺嗎啉三嗪基-氨基苯磺酸二鈉、碳酸氫鈉、苯丙基乙基聚甲基硅氧烷、丁苯基甲基丙醛、甘油硬脂酸酯、碳酸鈣、聚丙烯酸鈉、α-異甲基紫羅蘭酮、二苯乙烯基聯(lián)苯基二磺酸二鈉、纖維素、蛋白酶、檸檬烯、PEG-75、二氧化鈦、糊精、蔗糖、聚芳基磺酸鈉、CI 12490、CI 45100、CI 42090、硫代硫酸鈉、CI 61585。

寶瑩生物粉末

蔗糖、山梨醇、硅酸鋁、聚甲醛三聚氰胺、聚芳基磺酸鈉、CI 61585、CI 45100、脂肪酶、淀粉酶、黃胞膠、羥丙基甲基纖維素、CI 12490、二苯乙烯基聯(lián)苯基二磺酸二鈉、硫代硫酸鈉、CI 42090、甘露聚糖酶、CI 11680、羥乙磷酸、EDTA四鈉。

寶瑩生物片劑

碳酸鈉、碳酸鈉過氧化物、碳酸氫鈉、沸石、水、硅酸鈉、月桂基硫酸鈉、纖維素、TAED、十二烷基苯磺酸鈉、半纖維素、木質(zhì)素、月桂基葡糖苷、丙烯酸鈉/MA共聚物、膨潤土、氯化鈉、香精、羥乙磷酸四鈉、硫酸鈉、聚丙烯酸鈉、二甲硅油、苯胺基嗎啉代三嗪基氨基芪磺酸二鈉鹽、十二烷基苯磺酸、三甲基硅氧基硅酸鹽、碳酸鈣、纖維素、PEG-75、二氧化鈦、糊精、蛋白酶、所修飾的玉米淀粉、蔗糖、CI 12490、聚芳基磺酸鈉、硫代硫酸鈉、淀粉酶、高嶺土。

寶瑩色彩護(hù)理生物粉末

枯草桿菌蛋白酶、咪唑啉酮、己基肉桂醛、蔗糖、山梨醇、硅酸鋁、聚甲醛三聚氰胺、CI 61585、CI 45100、脂肪酶、淀粉酶、黃胞膠、羥丙基甲基纖維素、CI 12490、二苯乙烯基聯(lián)苯基二磺酸二鈉、硫代硫酸鈉、CI 42090、甘露聚糖酶、CI 11680、羥乙磷酸、EDTA四鈉。

寶瑩色彩護(hù)理生物片劑

碳酸氫鈉、碳酸鈉、沸石、水、硅酸鈉、十二烷基硫酸鈉、纖維素膠、十二烷基苯磺酸鈉、月桂基葡糖苷、氯化鈉、丙烯酸鈉/MA共聚物、香精、硫代乙酸鈉、PVP、硫酸鈉、羥乙磷酸四鈉、聚丙烯酸鈉、二甲硅油、膨潤土、十二烷基苯磺酸、三甲基硅氧基硅酸鹽、碳酸鈣、纖維素、PEG-75、二氧化鈦、糊精、蛋白酶、所修飾的玉米淀粉、蔗糖、硫代硫酸鈉、淀粉酶、CI 74160、高嶺土。

寶瑩雙效膠囊生物制品

MEA-十二烷基苯磺酸、MEA-氫化椰油酸、C12-15 Pareth-7、二丙二醇、水、羥乙磷酸四鈉、聚乙烯醇、甘油、氮丙啶、乙氧基化的均聚物、丙二醇、香精、二亞乙基三胺五亞甲基磷酸鈉、山梨醇、MEA-硫酸、乙醇胺、枯草桿菌蛋白酶、乙二醇、丁苯基甲基丙醛、硼酸、(4-甲酰苯基)、己基肉桂醛、檸檬烯、芳樟醇、二苯乙烯基聯(lián)苯基二磺酸二鈉、α-異甲基紫羅蘭酮、香葉醇、淀粉酶、聚合的藍(lán)色著色劑、聚合的黃色著色劑、滑石粉、氯化鈉、苯并異噻唑啉酮、甘露聚糖酶、苯酸芐銨酰胺。

寶瑩2合1與舒適晴天粉末

硫酸鈉、碳酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、膨潤土、碳酸鈉過氧化物、硅酸鈉、沸石、水、檸檬酸、TAED、C12-15Pareth-7、香精、硬脂酸、丙烯酸鈉/MA共聚物、纖維素膠、所修飾的玉米淀粉、氯化鈉、羥乙磷酸四鈉、EDTMP鈣鈉、苯胺嗎啉三嗪基-氨基苯磺酸二鈉、碳酸氫鈉、苯丙基乙基聚甲基硅氧烷、丁苯基甲基丙醛、甘油硬脂酸酯、碳酸鈣、聚丙烯酸鈉、香葉醇、二苯乙烯基聯(lián)苯基二磺酸二鈉、纖維素、蛋白酶、PEG-75、二氧化鈦、糊精、蔗糖、聚芳基磺酸鈉、CI 12490、CI 45100、CI 42090、硫代硫酸鈉、CI 61585。

寶瑩小&強(qiáng)大2合1余舒適晴天

水、C12-15 Pareth-7、十二烷基苯磺酸鈉、丙二醇、氫化椰油酸鈉、三乙醇胺、甘油、TEA-氫化椰油酸酯、香精、氯化鈉、聚季銨鹽-10、PVP、聚合的粉色著色劑、硫酸鈉、二苯乙烯基聯(lián)苯基二磺酸二鈉、丁苯基甲基丙醛、苯乙烯/丙烯酸酯共聚物、己基肉桂醛、香茅醇、丁子香酚、聚乙烯醇、乙酸鈉、異丙醇、聚合的黃色著色劑、十二烷基硫酸鈉。

寶瑩小&強(qiáng)大生物制品

水、MEA-十二烷基苯磺酸、丙二醇、月桂醇醚硫酸鈉、C12-15 Pareth-7、TEA-氫化椰油酸酯、MEA-檸檬酸、氮丙啶、乙氧基化的均聚物、MEA-羥乙磷酸、三乙醇胺、香精、丙烯酸酯共聚物、山梨醇、MEA-硫酸、亞硫酸鈉、二苯乙烯基聯(lián)苯基二磺酸二鈉、丁苯基甲基丙醛、苯乙烯/丙烯酸酯共聚物、香茅醇、硫酸鈉、肽、鹽、來自發(fā)酵(工藝)的糖、枯草桿菌蛋白酶、甘油、硼酸、(4-甲酰苯基)、香葉醇、果膠裂解酶、淀粉酶、十二烷基硫酸鈉、甘露聚糖酶、CI 42051。

寶瑩小&強(qiáng)大膠囊生物制品

MEA-十二烷基苯磺酸、MEA-氫化椰油酸、C12-15 Pareth-7、二丙二醇、水、甘油、聚乙烯醇、香精、氮丙啶、乙氧基化的均聚物、二亞乙基三胺五亞甲基磷酸鈉、丙二醇、山梨醇、MEA-硫酸、乙醇胺、枯草桿菌蛋白酶、乙二醇、丁苯基甲基丙醛、己基肉桂醛、淀粉、硼酸、(4-甲酰苯基)、檸檬烯、芳樟醇、二苯乙烯基聯(lián)苯基二磺酸二鈉、α-異甲基紫羅蘭酮、香葉醇、淀粉酶、滑石粉、聚合的藍(lán)色著色劑、氯化鈉、苯并異噻唑啉酮、苯酸芐銨酰胺、聚合的黃色著色劑、甘露聚糖酶。

寶瑩小&強(qiáng)大膠囊色彩護(hù)理

MEA-十二烷基苯磺酸、MEA-氫化椰油酸、C12-15 Pareth-7、二丙二醇、水、甘油、聚乙烯醇、香精、氮丙啶、乙氧基化的均聚物、二亞乙基三胺五亞甲基磷酸鈉、丙二醇、MEA-硫酸、乙醇胺、PVP、山梨醇、丁苯基甲基丙醛、枯草桿菌蛋白酶、己基肉桂醛、淀粉、檸檬烯、芳樟醇、硼酸、(4-甲酰苯基)、α-異甲基紫羅蘭酮、香葉醇、滑石粉、聚合的藍(lán)色著色劑、苯酸芐銨酰胺、聚合的黃色著色劑。

寶瑩小&強(qiáng)大色彩護(hù)理

水、MEA-十二烷基苯磺酸、丙二醇、月桂醇醚硫酸鈉、C12-15 Pareth-7、TEA-氫化椰油酸酯、MEA-檸檬酸、氮丙啶、乙氧基化的均聚物、MEA-羥乙磷酸、三乙醇胺、香精、丙烯酸酯共聚物、山梨醇、MEA-硫酸、亞硫酸鈉、甘油、丁苯基甲基丙醛、香茅醇、硫酸鈉、肽、鹽、來自發(fā)酵(工藝)的糖,苯乙烯/丙烯酸酯共聚物、枯草桿菌蛋白酶、硼酸、(4-甲酰苯基)、香葉醇、果膠裂解酶、淀粉酶、十二烷基硫酸鈉、甘露聚糖酶、CI 61585、CI 45100。

Fairy非生物制品組合物(液體)

成分：15％-30％陰離子表面活性劑、5％-15％非離子表面活性劑、肥皂、苯并異噻唑啉酮、甲基異噻唑啉酮、香料

標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑T組合物(粉末)

成分：11％LAS、2％AS/AEOS、2％肥皂、3％AEO、15.15％碳酸鈉、3％硅酸鈉、18.75％沸石、0.15％螯合劑、2％檸檬酸鈉、1.65％AA/MA共聚物、2.5％CMC和0.5％SRP(所有的百分?jǐn)?shù)都是w/w)。

標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑X組合物(粉末)

成分：16.5％LAS、15％沸石、12％二硅酸鈉、20％碳酸鈉、1％sokalan、35.5％硫酸鈉(所有的百分?jǐn)?shù)都是w/w)。

碧浪Actilift彩色&風(fēng)格組合物(粉末)

成分：15％-30％陰離子表面活性劑、<5％非離子表面活性劑、磷酸鹽、聚羧酸鹽、沸石；酶、香料、己基肉桂醛。

碧浪Actilif組合物(粉末)

成分：5％-15％陰離子表面活性劑、基于氧的漂白劑、<5％非離子表面活性劑、磷酸鹽、聚羧酸鹽、沸石、光學(xué)增亮劑、酶、香料、丁苯基甲基丙醛、香豆素、己基肉桂醛

寶瑩Megaperls組合物(粉末)

成分：以下的15％-30％：陰離子表面活性劑、基于氧的漂白劑和沸石，以下的少于5％：非離子表面活性劑、磷酸鹽、聚羧酸鹽、肥皂、另外成分：香料、己基肉桂醛、水楊酸芐酯、芳樟醇、光學(xué)增亮劑、酶和香茅醇。

汰漬液體，原版：線形烷基苯磺酸酯、丙二醇、檸檬酸、氫氧化鈉、硼砂、乙醇胺、乙醇、醇硫酸鹽、聚乙烯亞胺乙氧基化物、脂肪酸鈉、乙氧基硫酸二季銨鹽、蛋白酶、二乙二醇、月桂醇聚醚-9、烷基二甲胺氧化物、香味、淀粉酶、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、DTPA、甲酸鈉、甲酸鈣、聚乙二醇4000、甘露聚糖酶、Liquitint^TM藍(lán)、二甲硅油。

液體汰漬，自由和溫和型：水、醇乙氧基硫酸鈉、丙二醇、硼砂、乙醇、線形烷基苯磺酸鈉、鹽、聚乙烯亞胺乙氧基化物、二乙二醇、反式硫酸化和乙氧基化的六亞甲基二胺、醇乙氧化物、線形烷基苯磺酸酯、MEA鹽、甲酸鈉、烷基硫酸鈉、DTPA、氧化胺、甲酸鈣、二氨基二苯乙烯二鈉、二磺酸鹽、淀粉酶、蛋白酶、二甲硅油、苯并異噻唑啉酮

汰漬冷水液體，清香型：水、醇乙氧基硫酸酯、線形烷基苯磺酸酯、二乙二醇、丙二醇、乙醇胺、檸檬酸、硼砂、醇硫酸鹽、氫氧化鈉、聚乙烯亞胺、乙氧基化物、脂肪酸鈉、乙醇、蛋白酶、月桂醇聚醚-9、乙氧基硫酸二季銨鹽、月桂基胺氧化物、異丙苯鈉、磺酸鹽、香味、DTPA、淀粉酶、二鈉、二氨基二苯乙烯、二磺酸鹽、甲酸鈉、二苯乙烯基聯(lián)苯基二磺酸二鈉、甲酸鈣、聚乙二醇4000、甘露聚糖酶、果膠酶、Liquitint^TM藍(lán)、二甲硅油

汰漬TOTALCARE^TM液體，冷棉：水、醇乙氧基硫酸酯、丙二醇、脂肪酸鈉、月桂基三甲基氯化銨、乙醇、氫氧化鈉、異丙基苯磺酸鈉、檸檬酸、乙醇胺、二甘醇、聚醚硅氧烷、硼砂、香味、聚乙烯亞胺、乙氧基化物、蛋白酶、月桂醇聚醚-9、DTPA、聚丙烯酰胺季銨鹽氯化物、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、甲酸鈉、Liquitint^TM橙、二丙基乙四胺、二甲硅油、纖維素。

液體汰漬加漂白劑Alternative^TM，生動白和鮮艷、最初以及清潔微風(fēng)：水、醇乙氧基硫酸鈉、烷基硫酸鈉、MEA檸檬酸、線形烷基苯磺酸酯、MEA鹽、丙二醇、二乙二醇、聚乙烯亞胺乙氧基化物、乙醇、脂肪酸鈉、乙醇胺、月桂基胺氧化物、硼砂、月桂醇聚醚-9、DTPA、枯烯磺酸鈉、甲酸鈉、甲酸鈣、線形烷基苯磺酸酯、鈉鹽、醇硫酸鹽、氫氧化鈉、乙氧基硫酸二季銨鹽、香味、淀粉酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果膠酶、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、苯并異噻唑啉酮、Liquitint^TM藍(lán)、二甲硅油、二丙基乙四胺。

液體汰漬HE，原味：水、醇乙氧基硫酸鈉、MEA檸檬酸、烷基硫酸鈉、醇乙氧化物、線形烷基苯磺酸酯、MEA鹽、脂肪酸鈉、聚乙烯亞胺乙氧基化物、二乙二醇、丙二醇、乙氧基硫酸二季銨鹽、硼砂、聚乙烯亞胺、乙氧基化物丙氧基化物、乙醇、枯烯磺酸鈉、香味、DTPA、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、甘露聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、甲酸鈉、甲酸鈣、月桂基胺氧化物、Liquitint^TM藍(lán)、二甲硅油/聚二甲基硅酮。

汰漬TOTALCARE HE液體，新生雨潤(renewing Rain)：水、醇乙氧基硫酸酯、線形烷基苯磺酸酯、醇乙氧化物、檸檬酸、乙醇胺、脂肪酸鈉、二乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、硼砂、聚乙烯亞胺乙氧基化物、聚醚硅氧烷、乙醇、蛋白酶、枯烯磺酸鈉、乙氧基硫酸二季銨鹽、月桂醇聚醚-9、香味、淀粉酶、DTPA、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、二苯乙烯基聯(lián)苯基二磺酸二鈉、甲酸鈉、甲酸鈣、甘露聚糖酶、Liquitint^TM橙、二甲硅油、聚丙烯酰胺季銨鹽氯化物、纖維素酶、二丙基乙四胺。

汰漬液體HE自由：水、醇乙氧基硫酸酯、二乙二醇、單乙醇胺檸檬酸、甲酸鈉、丙二醇、線形烷基苯磺酸酯、乙醇胺、乙醇、聚乙烯亞胺乙氧基化物、淀粉酶、苯并異噻唑啉、硼砂、甲酸鈣、檸檬酸、乙二烯三胺五乙酸鈉、二甲硅油、乙氧基硫酸二季銨鹽、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、月桂醇聚醚-9、甘露聚糖酶、蛋白酶、枯烯磺酸鈉、脂肪酸鈉。

汰漬冷水HE液體，清香型：水、醇乙氧基硫酸酯、MEA檸檬酸、醇硫酸鹽、醇乙氧化物、線形烷基苯磺酸酯MEA、脂肪酸鈉、聚乙烯亞胺乙氧基化物、二乙二醇、丙二醇、乙氧基硫酸二季銨鹽、硼砂、聚乙烯亞胺乙氧基化物丙氧基化物、乙醇、枯烯磺酸鈉、香味、DTPA、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、蛋白酶、甘露聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、甲酸鈉、甲酸鈣、月桂基胺氧化物、Liquitint^TM藍(lán)、二甲硅油。

汰漬冷水HE自由液體：水、醇乙氧基硫酸鈉、MEA檸檬酸、線形烷基苯磺酸酯：鈉鹽、醇乙氧化物、線形烷基苯磺酸酯：MEA鹽、脂肪酸鈉、聚乙烯亞胺乙氧基化物、二乙二醇、丙二醇、乙氧基硫酸二季銨鹽、硼砂、蛋白酶、聚乙烯亞胺乙氧基化物丙氧基化物、乙醇、枯烯磺酸鈉、淀粉酶、檸檬酸、DTPA、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、甲酸鈉、甲酸鈣、二甲硅油。

汰漬簡單潔凈與清新：水、醇乙氧化物硫酸鹽、線形烷基苯磺酸鈉/Mea鹽、丙二醇、二乙二醇、甲酸鈉、乙醇、硼砂、脂肪酸鈉、香味、月桂基胺氧化物、DTPA、聚乙烯胺乙氧基化物、甲酸鈣、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、二甲硅油、四胺、Liquitint^TM藍(lán)。

汰漬艙，海霧，神秘森林，春天牧場：線形烷基苯磺酸酯、C12-16Pareth-9、丙二醇、醇乙氧基硫酸酯、水、聚乙烯亞胺乙氧基化物、甘油、脂肪酸鹽、PEG-136聚乙酸乙烯酯、乙二胺琥珀酸鹽、單乙醇胺檸檬酸、亞硫酸氫鈉、乙二烯三胺五乙酸鈉、二苯乙烯基聯(lián)苯基二磺酸二鈉、甲酸鈣、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、甲酸鈉、氫化蓖麻油、natalase、染料、termamyl、枯草桿菌蛋白酶、苯并異噻唑啉、香料。

汰漬去污筆(Tide to Go)：去離子水、二丙二醇丁基醚、烷基硫酸鈉、過氧化氫、乙醇、硫酸鎂、烷基二甲基氧化胺、檸檬酸、氫氧化鈉、三甲氧基苯甲酸、香味。

汰漬污漬釋放液體：水、烷基乙氧基化物、直鏈烷基苯磺酸鹽、過氧化氫、乙氧基硫酸二季銨鹽、乙醇胺、二苯乙烯基聯(lián)苯基二磺酸二鈉、四丁基乙叉基雙酚、F&DC黃3、香味。

汰漬污漬釋放粉末：過碳酸鈉、硫酸鈉、碳酸鈉、鋁硅酸鈉、壬酰氧基苯磺酸鹽、聚丙烯酸鈉、水、烷基苯磺酸鈉、DTPA、聚乙二醇、棕櫚酸鈉、淀粉酶、蛋白酶、修飾的淀粉、FD&C藍(lán)1、香味。

汰漬污漬釋放，預(yù)處理器噴霧：水、烷基乙氧基化物、MEA硼酸鹽、直鏈烷基苯磺酸鹽、丙二醇、乙氧基硫酸二季銨鹽、氯化鈣酶、蛋白酶、乙醇胺、苯并異噻唑啉酮、淀粉酶、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、香味。

汰漬去污漬橡皮擦：水、烷基氧化胺、二丙二醇苯基醚、過氧化氫、檸檬酸、乙二胺二琥珀酸鈉鹽、烷基硫酸鈉、香味。

汰漬氧化加強(qiáng)：碳酸氫鈉、碳酸鈉、過碳酸鈉、醇乙氧化物、氯化鈉、馬來酸/丙烯酸共聚物、壬酰氧基苯磺酸鹽、硫酸鈉、著色劑、乙二烯三胺五乙酸鈉鹽、水合硅鋁酸鹽(沸石)、聚乙二醇、烷基苯磺酸鈉、棕櫚酸鈉、淀粉、水、香味。

汰漬污漬釋放加強(qiáng)雙重Pac：聚乙烯醇袋膜，其中有被包裝的液體部分和粉末部分。

液體成分：二丙二醇、乙氧基硫酸二季銨鹽、水、甘油、LiquitintTM橙、粉末成分：過碳酸鈉、壬酰氧基苯磺酸鹽、碳酸鈉、硫酸鈉、鋁硅酸鈉、聚丙烯酸鈉、烷基苯磺酸鈉、馬來酸/丙烯酸共聚物、水、淀粉酶、聚乙二醇、棕櫚酸鈉、修飾的淀粉、蛋白酶、甘油、DTPA、香味。

汰漬超級污漬釋放：水、醇乙氧基硫酸鈉、直鏈烷基苯磺酸鹽、鈉/MEA鹽、MEA檸檬酸、丙二醇、聚乙烯亞胺乙氧基化物、乙醇、二乙二醇、聚乙烯亞胺丙氧基乙氧基化物、脂肪酸鈉、蛋白酶、硼砂、枯烯磺酸鈉、DTPA、香味、淀粉酶、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、甲酸鈣、甲酸鈉、葡聚糖酶、二甲硅油、Liquitint^TM藍(lán)、甘露聚糖酶。

具有少許粉狀洗滌劑的超級汰漬，四月清新/清潔微風(fēng)/四月精華：碳酸鈉、鋁硅酸鈉、硫酸鈉、線形烷基苯磺酸酯、膨潤土、水、過碳酸鈉、聚丙烯酸鈉、硅酸鹽、烷基硫酸鹽、壬酰氧基苯酚酯磺酸、DTPA、聚乙二醇4000、硅膠、乙氧基化物、香味、聚氧化乙烯、棕櫚酸、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、蛋白酶、Liquitint^TM紅、FD&C藍(lán)1、纖維素酶。

具有少許Downy清潔微風(fēng)的超級汰漬：水、醇乙氧基硫酸鈉、MEA檸檬酸、直鏈烷基苯磺酸鹽：鈉/MEA鹽s、丙二醇、聚乙烯亞胺乙氧基化物、乙醇、二乙二醇、聚乙烯亞胺、丙氧基乙氧基化物、乙氧基硫酸二季銨鹽、醇硫酸鹽、二甲硅油、香味、硼砂、脂肪酸鈉、DTPA、蛋白酶、亞硫酸氫鈉、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、淀粉酶、葡聚糖酶、蓖麻油、甲酸鈣、MEA、苯乙烯丙烯酯共聚物、甲酸鈉、Liquitint^TM藍(lán)。

具有Downy陽花的超級汰漬：水、醇乙氧基硫酸鈉、MEA檸檬酸、直鏈烷基苯磺酸鹽：鈉/MEA鹽、丙二醇、乙醇、二乙二醇、聚乙烯亞胺丙氧基乙氧基化物、聚乙烯亞胺乙氧基化物、醇硫酸鹽、二甲硅油、香味、硼砂、脂肪酸鈉、DTPA、蛋白酶、亞硫酸氫鈉、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、淀粉酶、蓖麻油、甲酸鈣、MEA、苯乙烯丙烯酯共聚物、丙銨丙酰胺、葡聚糖酶、甲酸鈉、Liquitint^TM藍(lán)。

具有Downy四月清新/甜蜜夢境的超級汰漬：水、醇乙氧基硫酸鈉、MEA檸檬酸、直鏈烷基苯磺酸鹽：鈉/MEA鹽、丙二醇、聚乙烯亞胺乙氧基化物、乙醇、二乙二醇、聚亞乙基亞胺丙氧基乙氧基化物、乙氧基硫酸二季銨鹽、醇硫酸鹽、二甲硅油、香味、硼砂、脂肪酸鈉、DTPA、蛋白酶、亞硫酸氫鈉、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、淀粉酶、葡聚糖酶、蓖麻油、甲酸鈣、MEA、苯乙烯丙烯酯共聚物、丙銨丙酰胺、甲酸鈉、Liquitint^TM藍(lán)。

超級汰漬自由粉狀洗滌劑：碳酸鈉、鋁硅酸鈉、烷基硫酸鹽、硫酸鈉、線形烷基苯磺酸酯、水、聚丙烯酸鈉、硅酸鹽、乙氧基化物、過碳酸鈉、聚乙二醇4000、蛋白酶、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、硅膠、纖維素酶。

超級汰漬粉狀洗滌劑，清潔微風(fēng)/春日薰衣草/森林泉：碳酸鈉、鋁硅酸鈉、硫酸鈉、線形烷基苯磺酸酯、烷基硫酸鹽、過碳酸鈉、水、聚丙烯酸鈉、硅酸鹽、壬酰氧基苯酚酯磺酸、乙氧基化物、聚乙二醇4000、香味、DTPA、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、棕櫚酸、蛋白酶、硅膠、纖維素酶。

超級汰漬HE(高效率)粉狀洗滌劑，清潔微風(fēng)：碳酸鈉、鋁硅酸鈉、硫酸鈉、線形烷基苯磺酸酯、水、壬酰氧基苯酚酯磺酸、烷基硫酸鹽、聚丙烯酸鈉、硅酸鹽、過碳酸鈉、乙氧基化物、聚乙二醇4000、香味、DTPA、棕櫚酸、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、蛋白酶、硅膠、纖維素酶。

超級汰漬冷水粉狀洗滌劑，清香型：碳酸鈉、鋁硅酸鈉、硫酸鈉、過碳酸鈉、烷基硫酸鹽、線形烷基苯磺酸酯、水、壬酰氧基苯酚酯磺酸、聚丙烯酸鈉、硅酸鹽、乙氧基化物、聚乙二醇4000、DTPA、香味、Natalase、棕櫚酸、蛋白酶、二鈉、二氨基二苯乙烯二磺酸鹽、FD&C藍(lán)1、硅膠、纖維素酶、烷基醚硫酸鹽。

具有漂白劑粉狀洗滌劑的超級汰漬，清潔微風(fēng)：碳酸鈉、鋁硅酸鈉、硫酸鈉、線形烷基苯磺酸酯、過碳酸鈉、壬酰氧基苯酚酯磺酸、烷基硫酸鹽、水、硅酸鹽、聚丙烯酸鈉乙氧基化物、聚乙二醇4000、香味、DTPA、棕櫚酸、蛋白酶、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、硅膠、FD&C藍(lán)1、纖維素酶、烷基醚硫酸鹽。

具有Febreeze Freshness^TM粉狀洗滌劑的超級汰漬，春日新生：

碳酸鈉、鋁硅酸鈉、硫酸鈉、線形烷基苯磺酸酯、過碳酸鈉、烷基硫酸鹽、水、聚丙烯酸鈉、硅酸鹽、壬酰氧基苯酚酯磺酸、乙氧基化物、聚乙二醇4000、DTPA、香味、纖維素酶、蛋白酶、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、硅膠、FD&C藍(lán)1。

具有Febreeze Freshness的液體汰漬加–運(yùn)動HE活躍新鮮：

水、醇乙氧基硫酸鈉、MEA檸檬酸、線形烷基苯磺酸酯、鈉鹽、線形烷基苯磺酸酯：MEA鹽、醇乙氧化物、脂肪酸鈉、丙二醇、二乙二醇、聚乙烯亞胺乙氧基化物丙氧基化物、乙氧基硫酸二季銨鹽、乙醇、枯烯磺酸鈉、硼砂、香味、DTPA、硫酸氫鈉、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、甘露聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、甲酸鈉、甲酸鈣、月桂基胺氧化物、Liquitint^TM藍(lán)、二甲硅油/聚二甲基硅酮。

汰漬加Febreeze Freshness春日新生：

水、醇乙氧基硫酸鈉、直鏈烷基苯磺酸鹽：鈉/MEA鹽、MEA檸檬酸、丙二醇、聚乙烯亞胺乙氧基化物、香味、乙醇、二乙二醇、聚乙烯亞胺丙氧基乙氧基化物、蛋白酶、醇硫酸鹽、硼砂、脂肪酸鈉、DTPA、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、MEA、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、甲酸鈉、二甲硅油、Liquitint^TM藍(lán)、四胺。

具有Febreeze Freshness的液體汰漬加，運(yùn)動HE勝利新鮮：水、醇乙氧基硫酸鈉、MEA檸檬酸、線形烷基苯磺酸酯、鈉鹽、線形烷基苯磺酸酯：MEA鹽、醇乙氧化物、脂肪酸鈉、丙二醇、二乙二醇、聚乙烯亞胺乙氧基化物丙氧基化物、乙氧基硫酸二季銨鹽、乙醇、枯烯磺酸鈉、硼砂、香味、DTPA、硫酸氫鈉、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、甘露聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、甲酸鈉、甲酸鈣、月桂基胺氧化物、Liquitint^TM藍(lán)、二甲硅油/聚二甲基硅酮。

汰漬生動白+鮮艷，原版：

碳酸鈉、鋁硅酸鈉、硫酸鈉、線形烷基苯磺酸酯、過碳酸鈉、壬酰氧基苯酚酯磺酸、烷基硫酸鹽、水、硅酸鹽、聚丙烯酸鈉乙氧基化物、聚乙二醇4000、香味、DTPA、棕櫚酸、蛋白酶、二氨基二苯乙烯二磺酸鈉、硅膠、FD&C藍(lán)1、纖維素酶、烷基醚硫酸鹽。

所有酶水平表達(dá)為rug活性酶蛋白/100g洗滌劑組合物。表面活性劑成分獲得自巴斯夫公司(BASF)、路德維希港、德國(Lutensol(R))；殼牌化學(xué)公司(Shell Chemicals)，倫敦，英國；斯泰潘公司(Stepan)，諾思菲爾德，III，美國；亨斯曼公司(Huntsman)，鹽湖城，猶他州，美國；科萊恩公司(Clariant)，蘇爾茨巴赫市，德國(Praepagen(R))。

三聚磷酸鈉可以獲得自羅地亞公司(Rhodia)、巴黎、法國。沸石可以獲得自工業(yè)沸石(英國)有限公司，格雷士，艾塞克斯，英國。檸檬酸和檸檬酸鈉可以獲得自永本茲勞爾公司(Jungbunzlauer)，巴塞爾，瑞士。NOBS是壬酰基羥苯磺酸鈉，由伊士曼公司(Eastman)，貝茨維爾，阿肯色州，美國。TAED是四乙酰乙二胺，在科萊恩有限公司(Clariant GmbH)，祖爾茨巴赫，德國的Peractive(R)品牌下提供。

碳酸鈉和碳酸氫鈉可以獲得自索爾維公司(Solvay)，布魯塞爾，比利時(shí)。

聚丙烯酸酯、聚丙烯酸酯/馬來酸酯共聚物可以獲得自巴斯夫公司、路德維希港、德國。

Repel-O-Tex(R)可以獲得自羅地亞公司(Rhodia)、巴黎、法國。Texcare(R)可以獲得自科萊恩公司，祖爾茨巴赫，德國。過碳酸鈉和碳酸鈉可以獲得自索爾維公司，休斯頓，德克薩斯州，美國。

乙二胺-N,N’-二琥珀酸的Na鹽，(S,S)異構(gòu)體(EDDS)是通過聯(lián)合奧泰公司(Octel)，埃爾斯米爾港，英國提供。

羥基乙醇二磷酸鹽(HEDP)是由美國陶氏化學(xué)公司(Dow Chemical)，米德蘭，密歇根州，美國提供。

酶Savinase(R)、Savinase(R)Ultra、Stainzyme(R)Plus、Lipex(R)、Lipolex(R)、Lipoclean(R)、Celluclean(R)、Carezyme(R)、Natalase(R)、Stainzyme(R)、Stainzyme(R)Plus、Termamyl(R)、Termamyl(R)ultra、和Mannaway(R)可以獲得自諾維信公司(Novozymes)，巴格斯瓦德，丹麥。

酶Purafect(R)、FN3、FN4和Optisize可以獲得自杰能科國際公司(Genencor International Inc.)帕洛阿爾托，加利福尼亞州，美國。

直接紫9和99可以獲得自巴斯夫公司、路德維希港、德國。溶劑紫13可以獲得自寧波立興化工有限公司(Ningbo Lixing Chemical Co.,Ltd.)，寧波，浙江，中國。增亮劑可以獲得自汽巴精化有限公司，巴塞爾，瑞士。除非另外指明，所有百分比和比率都是按重量計(jì)計(jì)算。除非另外指明，所有百分比和比率都是基于總組合物計(jì)算。

應(yīng)當(dāng)理解的是貫穿本說明書給出的每一最大數(shù)值限度包括每一較低的數(shù)值限度，如同此類較低數(shù)值限度在此被明確寫出。貫穿本說明書給出的每一最小數(shù)值限度將包括每一較高的數(shù)值限度，如同此類較高數(shù)值限度在此被明確寫出。本說明書中所給出的每個(gè)數(shù)值范圍將包括落入在這樣更寬泛數(shù)值范圍內(nèi)的每一狹小的范圍，好像這樣狹小的數(shù)值范圍都在這里被書面表達(dá)了。

洗滌測定

Launder-O-Meter(LOM)模式洗滌系統(tǒng)

Launder-O-Meter(LOM)是中等規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)洗滌系統(tǒng)，它可以應(yīng)用于同時(shí)測試多達(dá)20種不同洗滌條件。LOM基本上是大型的具有20個(gè)封閉金屬燒杯在其中旋轉(zhuǎn)的溫度受控的水浴。每個(gè)燒杯構(gòu)成一個(gè)小的洗衣機(jī)并且在一次實(shí)驗(yàn)過程中，每個(gè)試管將包含一種具有特定的有待測試的洗滌劑/酶系統(tǒng)連同在關(guān)于其進(jìn)行測試的弄臟的和未弄臟的織物。機(jī)械壓力由在水浴中旋轉(zhuǎn)的燒杯并且由包括在燒杯中的金屬球?qū)崿F(xiàn)。

LOM標(biāo)準(zhǔn)洗滌系統(tǒng)主要用于清潔劑和酶的中等規(guī)模測試，在例如歐洲洗滌條件下。在一個(gè)LOM實(shí)驗(yàn)中，如壓載物與污物的比率和織物與洗滌液的比率的因素可以變化。因此，LOM提供了在小規(guī)模實(shí)驗(yàn)(如AMSA和微型洗滌)與在前面加載型洗滌機(jī)中的更費(fèi)時(shí)的全規(guī)模實(shí)驗(yàn)之間的聯(lián)系。

迷你Launder-O-Meter(迷你LOM)模式洗滌系統(tǒng)

迷你LOM是Launder-O-Meter(LOM)的修飾的迷你洗滌系統(tǒng)，其是中等規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)洗滌系統(tǒng)，它可以應(yīng)用于同時(shí)測試多達(dá)20種不同洗滌條件。LOM基本上是大型的具有20個(gè)封閉金屬燒杯在其中旋轉(zhuǎn)的溫度受控的水浴。每個(gè)燒杯構(gòu)成一個(gè)小的洗衣機(jī)并且在一次實(shí)驗(yàn)過程中，每個(gè)試管將包含一種具有特定的有待測試的洗滌劑/酶系統(tǒng)連同在關(guān)于其進(jìn)行測試的弄臟的和未弄臟的織物。機(jī)械壓力由在水浴中旋轉(zhuǎn)的燒杯并且由包括在燒杯中的金屬球?qū)崿F(xiàn)。

在迷你LOM中，洗滌是在置于斯圖爾特(Stuart)旋轉(zhuǎn)器中的50ml試管中進(jìn)行的。

酶測定

測定I：DNA酶活性測試

在具有甲基綠(BD公司，富蘭克林湖，新澤西州，美國)的DNA酶測試瓊脂上確定DNA酶活性。簡言之，將21g瓊脂溶于500ml水中，并且然后在121℃下高壓滅菌15分鐘。將高壓蒸汽處理的瓊脂在水浴中溫和至48℃，并且將20ml的瓊脂倒入培養(yǎng)皿并且允許在室溫下通過孵育來固化。在固化的瓊脂平板上，添加5μl的酶溶液，并且DNA酶活性被觀察為斑點(diǎn)酶溶液周圍的無色區(qū)域。

測定II

使用電子鼻分析紡織品上的E-2-壬烯醛

測試紡織品上的惡臭的存在的一種方式是通過使用作為惡臭的標(biāo)志物的E-2-壬烯醛，因?yàn)榇嘶衔镆鹨挛锷系膼撼簟?/p>

將E-2-壬烯醛的溶液添加至5cm x 5cm紡織品小塊布樣上并且將該小塊布樣放入20mL玻璃小瓶中用于GC分析并且蓋住該小瓶。在40℃下孵育20分鐘后，在來自法國阿爾法M.O.S.(Alpha M.O.S.)的Heracles II電子鼻中分析來自加帽小瓶的5mL頂部空間(具有2個(gè)FID的雙柱氣相色譜儀，柱1：MXT5并且柱2：MXT1701)。

實(shí)例

方法

PCR、克隆、連接核苷酸等的一般方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的并且可以例如發(fā)現(xiàn)于“分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(Molecular cloning:A laboratory manual)”，薩拉布魯克(Sambrook)等人(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor lab.)，冷泉港，紐約；奧蘇貝爾(Ausubel)，F(xiàn)·M等人(編輯)；“分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(Current protocols in Molecular Biology)”，約翰威立父子公司(John Wiley and Sons)，(1995)；哈伍德(Harwood)，C·R和卡廷(Cutting)，S·M(編輯)；“DNA克?。簩?shí)用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)，I和II卷”，D.N.格洛弗(Glover)編輯(1985)；“寡核苷酸合成”(Oligonucleotide Synthesis)，M.J.蓋特(Gait)編輯(1984)；“核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)”，B.D.黑姆斯(Hames)&S.J.希金斯(Higgins)編輯(1985)；“分子克隆實(shí)用指南(A Practical Guide To Molecular Cloning)”，B.帕柏爾(Perbal)(1984)。

菌株

哈茨木霉O4是已知生產(chǎn)許多分泌酶的菌株。將分離物用作DUF1524多肽的來源(http://pfam.sanger.ac.uk/)。將在編號CBS223.93下保藏的哈茨木霉在PDA板上，在20℃下進(jìn)行繁殖。

培養(yǎng)基和溶液

YP+2％葡萄糖培養(yǎng)基由1％酵母提取物、2％蛋白胨以及2％葡萄糖構(gòu)成。

LB培養(yǎng)基由10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的氯化鈉、以及加至1升的去離子水構(gòu)成。

LB瓊脂板由LB培養(yǎng)基和每升15g的細(xì)菌用瓊脂構(gòu)成。

PDA板由馬鈴薯浸出液組成，該馬鈴薯浸出液是通過將300g切片的馬鈴薯(洗滌但未削皮)在水中煮沸30分鐘，并且然后將該培養(yǎng)液傾析或?yàn)V過粗濾布而制成。然后添加蒸餾水，直到懸浮液的總體積為一升，隨后添加20g(w/v)的右旋糖和20g(w/v)的瓊脂粉。該培養(yǎng)基通過在15psi下高壓殺菌15分鐘來進(jìn)行滅菌(細(xì)菌學(xué)分析手冊(Bacteriological Analytical Manual)，第8版，修訂A，1998)。

Dap-4C介質(zhì)由以下構(gòu)成：20g右旋糖、10g麥芽糖、11g MgSO4.7H2O、1g KH2PO4、2g檸檬酸、5.2g K3PO4.H2O、0.5g酵母提取物(Difco)、1ml Dowfax 63N10(陶氏化學(xué)公司(Dow Chemical Company))、0.5ml KU6痕量金屬溶液、2.5g CaCO3、以及補(bǔ)足到1升的去離子水。該培養(yǎng)基通過在15psi下高壓殺菌15分鐘來進(jìn)行滅菌(細(xì)菌學(xué)分析手冊(Bacteriological Analytical Manual)，第8版，修訂A，1998)。使用之前，Dap-4C培養(yǎng)基中添加3.5ml無菌的50％(NH4)2HPO4和5ml無菌的20％乳酸/150ml培養(yǎng)基。

KU6痕量金屬溶液由以下各項(xiàng)構(gòu)成：0.13g NiCl2、2.5g CuSO4.5H2O、13.9g FeSO4.7H2O、8.45g MnSO4.H2O、6.8g ZnCl2、3g檸檬酸、以及去離子水補(bǔ)足至1升。

COVE蔗糖選擇板由以下構(gòu)成：342g的蔗糖、20g的瓊脂粉、20ml的COVE鹽溶液及補(bǔ)足至1升的去離子水。該培養(yǎng)基通過在15psi下高壓殺菌15分鐘來進(jìn)行滅菌(細(xì)菌學(xué)分析手冊(Bacteriological Analytical Manual)，第8版，修訂A，1998)。將該培養(yǎng)基冷卻至60℃并且然后添加10mM、以及X-100(50μl/500ml)。

COVE頂層瓊脂糖：342.3g/L蔗糖、20ml/L COVE鹽溶液、10mM乙酰胺、15mM CsCl、6g/L GTG瓊脂糖(目錄號50070，SeaKem，美國)

用于分離的COVE-2：30g/L蔗糖、20ml/L COVE鹽溶液、10mM乙酰胺、30g/L諾布爾瓊脂

COVE鹽溶液由26g的MgSO₄·7H₂O、26g的KCl、26g的KH₂PO₄、50ml的COVE痕量金屬溶液及補(bǔ)足到1升的去離子水組成。

COVE痕量金屬溶液由0.04g的Na₂B₄O₇·10H₂O、0.4g的CuSO₄·5H₂O、1.2g的FeSO₄·7H₂O、0.7g的MnSO₄·H₂O、0.8g的Na₂MoO₄·2H₂O、10g的ZnSO₄·7H₂O及補(bǔ)足到1升的去離子水組成。

PEG：60％是由以下各項(xiàng)組成：60％(W/V)PEG 4000(BDH)、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl pH 7.5。將該溶液對0,22uM PES膜進(jìn)行過濾用于滅菌(PES膜(HPWP14250，密理博公司(Millipore Corp.)))。在過濾滅菌后，可以將該P(yáng)EG 60％以等分試樣在-20℃下儲存直至需要。

實(shí)例1

從哈茨木霉O4克隆P34A9E DUF1524多肽編碼序列

通過PCR，從哈茨木霉O4DNA克隆P34A9E DUF1524多肽編碼序列。

在20℃下，在1000ml錐形搖瓶中的100ml的YP+2％葡萄糖介質(zhì)中培養(yǎng)哈茨木霉O4 5天。通過由襯有(EMD密理博，比勒利卡，MA，USA)的布氏真空漏斗對培養(yǎng)基進(jìn)行過濾從這些瓶中收獲菌絲。將菌絲冷凍于液氮中并在-80℃儲存直至進(jìn)一步使用。根據(jù)制造商的說明書，使用植物大提試劑盒(Plant Maxi Kit)(凱杰公司(QIAGEN GMBH)，希爾登，德國)分離基因組DNA。

通過Illumina MySeq(Illumina公司，圣迭哥，加利福尼亞州)生產(chǎn)基因組序列信息。根據(jù)制造商說明書，將5μg的分離的哈茨木霉基因組DNA用于文庫制備和分析。采用300bp配對端策略，文庫插入尺寸為200-500bp。針對總計(jì)4,300,311,407 300bp的所獲得的原始讀數(shù)，使用一個(gè)HiSeq運(yùn)行的一半。隨后將該讀數(shù)分級為25％，隨后修正(提取最長的、具有10或更多Phred-得分的子序列)。

使用Idba版本0.18集合這些讀數(shù)。丟棄短于200bp的疊連群，得到39,391,155bp，N-50為167,714。使用GeneMark.hmm ES版本2.3c調(diào)用基因，并且使用由Pfam提供的“DUF1524“隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Model)進(jìn)行該催化結(jié)構(gòu)域的鑒別。使用以下描述的引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)通過PCR，從哈茨木霉O4基因組DNA，克隆整個(gè)編碼區(qū)的多肽編碼序列。

5’-ACACAACTGGGGATCCACCG-3’(SEQ ID NO:3)

5’-AGATCTCGAGAAGCTT-3’(SEQ ID NO:4)

粗體字母表示哈茨木霉酶編碼序列。限制位點(diǎn)是已加下劃線的。這些限制位點(diǎn)左方的序列與pDau109的插入位點(diǎn)是同源的(WO 2005/042735)。

In-Fusion^TMTM優(yōu)越PCR克隆試劑盒目錄號639620

根據(jù)制造商說明書(賽墨科技公司)用以下終濃度進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(50μl)

1X Phusion HC緩沖液

200uM dNTP

2.0mM MgCl2

0.5uM的每種引物(KKSC0370-F和KKSC0370-R)

10ng的哈茨木霉O4基因組DNA

將PCR反應(yīng)在Dual-Block熱循環(huán)儀(Dual-Block Thermal Cycler)(伯樂公司(BioRad)，美國)中進(jìn)行孵育，編程為98℃持續(xù)2分鐘，1個(gè)循環(huán)；98℃持續(xù)10秒鐘和72℃持續(xù)2分鐘，30個(gè)循環(huán)；以及72℃持續(xù)6分鐘，1個(gè)循環(huán)。在去除之前將樣品冷卻至10℃并且進(jìn)一步處理。

使用40mM Tris堿、20mM乙酸鈉、1mM EDTA二鈉(TAE)緩沖液，通過1％瓊脂糖凝膠電泳分析5μl的PCR反應(yīng)。觀察到一個(gè)約1.1bp的主帶。根據(jù)制造商說明書，直接使用ILLUSTRA^TM GFX^TM PCR DNA和凝膠帶純化試劑盒(ILLUSTRA^TM GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit)(GE醫(yī)療公司，皮斯卡塔韋(Piscataway)，新澤西州，美國)純化剩余的PCR反應(yīng)。

將2μg的質(zhì)粒pDau109用Bam HI和Hind III進(jìn)行消化，并且在1％瓊脂糖凝膠上使用50mM Tris堿-50mM硼酸-1mM EDTA二鈉(TBE)緩沖液運(yùn)行該消化的質(zhì)粒，以從該限制質(zhì)粒去除填充片段。通過添加安全DNA凝膠染液(Safe DNA gel stain)(生命技術(shù)公司(Life Technologies Corporation)，格蘭德島(Grand Island)，新澤西州，美國)并且使用470nm波長透照儀將條帶可視化。將對應(yīng)于該限制質(zhì)粒的條帶切下，并且使用ILLUSTRA^TMGFX^TM PCR DNA和凝膠條帶純化試劑盒進(jìn)行純化。將該質(zhì)粒洗脫到10mM Tris pH 8.0中，并將其濃度調(diào)節(jié)至20ng/μl。使用PCR克隆試劑盒(克羅泰克實(shí)驗(yàn)室有限公司(Clontech Laboratories,Inc.)，山景城(Mountain View)，加利福尼亞州，美國)以將該1170bp PCR片段克隆到用Bam HI和Hind III(20ng)消化的pDau109中。該總反應(yīng)體積是10μl。該總反應(yīng)體積是10μl。根據(jù)制造商的方案，將該IN-反應(yīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)FUSION-BLUE^TM大腸桿菌細(xì)胞(克羅泰克實(shí)驗(yàn)室有限公司，山景城，加利福尼亞州，美國)中，并且將其鋪板在補(bǔ)充有50μg的氨比西林/ml的LB瓊脂板上。在37℃下孵育過夜之后，觀察到轉(zhuǎn)化菌落在這些補(bǔ)充有50μg氨比西林/ml的LB板上在選擇下生長。

選擇若干菌落用于通過菌落PCR使用以下所述的pDau222載體引物進(jìn)行分析。用黃色的接種針(能肯公司(Nunc)A/S，丹麥)從該補(bǔ)充有50μg的氨比西林/ml的LB板上將四個(gè)菌落轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有50μg的氨比西林/ml的新的LB板上，并在37℃孵育過夜。

引物8653：5’-GCAAGGGATGCCATGCTTGG-3’(SEQ ID NO:5)

引物8654：5’-CATATAACCAATTGCCCTC-3’(SEQ ID NO:6)

將這三個(gè)菌落中的每個(gè)直接轉(zhuǎn)移到200μl PCR管中，該P(yáng)CR管中由5μl的2X賽墨科技公司Dream Taq^TM PCR Master Mix(賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)，羅克福德(Rockford)，伊利諾伊州，美國)、0.5μl的引物8653(10pm/μl)、0.5μl的引物8654(10pm/μl)、以及4μl的去離子水構(gòu)成。每個(gè)菌落PCR在Dual-Block熱循環(huán)儀中進(jìn)行孵育，編程為：在94℃下持續(xù)60秒鐘，1個(gè)循環(huán)；在95℃下持續(xù)30秒鐘，60℃持續(xù)45秒鐘，72℃持續(xù)60秒鐘，68℃持續(xù)10分鐘，和10℃持續(xù)10分鐘，30個(gè)循環(huán)。

將4μl的每個(gè)完成的PCR反應(yīng)使用TAE緩沖液提交到1％瓊脂糖凝膠電泳。四個(gè)大腸桿菌轉(zhuǎn)化體都顯示900bp的PCR條帶。使用QIAprep質(zhì)粒小提試劑盒(Spin Miniprep Kit)(凱杰公司，希爾登，德國)從這四個(gè)菌落的每個(gè)中分離質(zhì)粒DNA。將所得質(zhì)粒DNA使用一種應(yīng)用生物系統(tǒng)模型3730自動DNA測序儀使用3.1版BIG-DYE^TM終止子化學(xué)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems，Inc.)，福斯特市(Foster City)，加利福尼亞州，美國)，用引物8653和8654進(jìn)行測序。一個(gè)命名為pKKSC0370-1的質(zhì)粒

選擇質(zhì)粒pKKSC0370-1，用于轉(zhuǎn)化米曲霉MT3568。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破壞的基因衍生物(WO 2002/40694)，其中通過鈍化米曲霉amdS基因來修復(fù)pyrG營養(yǎng)缺陷型。根據(jù)歐洲專利EP0238023，第14-15頁中所描述的方法制備米曲霉MT3568原生質(zhì)體。

根據(jù)制造商說明書(Genomed)，使包含pKKSC0370-1的大腸桿菌3701生長過夜，并且根據(jù)制造商說明書使用質(zhì)粒Midi試劑盒(Genomed JETquick試劑盒，目錄號400250，Genomed有限公司，德國)分離pKKSC0370-1的質(zhì)粒DNA。將純化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)米曲霉MT3568中。根據(jù)克里斯滕森等人，1988，生物/技術(shù)(Bio/Technology)6:1419-1422中所描述的方法制備米曲霉MT3568原生質(zhì)體。選擇版由以下各項(xiàng)組成：COVE蔗糖與+10mM乙酰胺+15mM CsCl+X-100(50μl/500ml)。在37℃下孵育這些平板。簡而言之，將代表3μg的DNA的8μl的質(zhì)粒DNA添加到100μl的MT3568原生質(zhì)體中。添加250ul的60％PEG溶液，并且將這些管輕輕地混合，并且在37℃下孵育30分鐘。將混合物添加到10ml的預(yù)熔化的Cove頂層瓊脂糖中(該頂層瓊脂糖融化并且然后在被添加到原生質(zhì)體混合物之前在熱水浴中溫度平衡至40℃)。然后將合并的混合物涂布于具有10mM乙酰胺的兩個(gè)Cove-蔗糖選擇皮氏平板上。在37℃下孵育這些平板4天。

通過在作為碳源的選擇乙酰胺上生長來鑒別單個(gè)曲霉屬轉(zhuǎn)化菌落。將四種米曲霉轉(zhuǎn)化體中的每個(gè)接種到96深孔板中補(bǔ)充有2％葡萄糖的750μl的YP培養(yǎng)基和補(bǔ)充有2％麥芽糊精的750μl的YP培養(yǎng)基和補(bǔ)充有DAP4C的750μl的YP培養(yǎng)基中，并在37℃靜止孵育4天。同時(shí)，將四種轉(zhuǎn)化體再劃痕到COVE-2蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上。

然后根據(jù)制造商，使用10％Bis-Tris SDS凝膠(英杰公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國)通過SDS-PAGE，針對P34A9E DUF1524多肽的產(chǎn)生，對來自米曲霉轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)液進(jìn)行分析。對于這些米曲霉轉(zhuǎn)化體中每個(gè)，在大約30kDa觀察到一個(gè)條帶。將產(chǎn)生P34A9E多肽的一個(gè)米曲霉轉(zhuǎn)化體指定為米曲霉EXP09484。

將米曲霉EXP09484在26℃下在包含100ml的DAP4C培養(yǎng)基的1000ml錐形搖瓶中在85rpm攪拌下培養(yǎng)4天。

實(shí)例2

來自哈茨木霉O4的P34A9E DUF1524多肽編碼序列的表征

哈茨木霉O4P34A9E DUF1524多肽基因組編碼序列的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列分別在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中示出。該編碼序列是867bp，包括終止密碼子，并且分別在位置76-154、289-362和521-615處觀察到了三個(gè)內(nèi)含子。編碼的預(yù)測的蛋白為205個(gè)氨基酸。使用SignalP程序(尼爾森等人，1997，同上)預(yù)測出17個(gè)殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白包含188個(gè)氨基酸，具有20kDa的預(yù)測分子量和5.9的預(yù)測等電點(diǎn)。在預(yù)測的分子量和由SDS凝膠分析(30kDa)預(yù)測的分子量之間的差異最有可能是肽糖基化的結(jié)果。

使用尼德曼和翁施算法(尼德曼和翁施，1970，同上)確定氨基酸序列的比較性成對地總體比對，使用空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5以及EBLOSUM62矩陣。比對顯示，哈茨木霉O4P34A9E DUF1524多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自綠色木霉菌SWISSPROT_G9MNM6的DUF1524多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列具有96.1％一致性(排除空位)。

實(shí)例3

在液體和粉末標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑中哈茨木霉DNA酶的深層清潔性能

分離衣物特定細(xì)菌菌株

在本實(shí)例中使用一種分離自衣物的短波單胞菌屬的菌株。在30℃下，使短波單胞菌屬物種在胰胨豆胨瓊脂(TSA)(pH 7.3)(CM0131；Oxoid有限公司，貝辛斯托克，英國)上預(yù)生長2-5天。將來自單菌落的滿環(huán)物(loop-full)轉(zhuǎn)移至10mL的TSB中并且伴隨振蕩(240rpm)于30℃下孵育16小時(shí)。繁殖后，通過離心(西格瑪實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)(Sigma Laboratory Centrifuge)6K15)(3000g，在21℃下，7min)沉淀短波單胞菌屬并且將其重懸于10mL用milliQ水稀釋兩次的TSB中。使用分光計(jì)(POLARstar Omega(BMG萊伯泰科(BMG Labtech)，奧滕貝格(Ortenberg)，德國))測量600nm處的光密度(OD)。將用milliQ水稀釋兩次的新鮮TSB接種至0.03的OD_600nm，并且將1.6mL添加到12孔的聚苯乙烯平底微板的各孔(3512；康寧公司(Corning Incorporated)，康寧(Corning)，紐約州(NY)，美國)，在該微板中放置無菌聚酯WFK30A的圓形小塊布樣(直徑2cm)。伴隨振蕩(100rpm)在15℃下孵育24h后，將小塊布樣用0.9％(w/v)NaCl沖洗兩次。

為了檢測深層作用，將具有短波單胞菌屬的五個(gè)沖洗的小塊布樣與五個(gè)無菌的聚酯WFK30A小塊布樣在50mL試管中混合并添加10mL的洗滌劑洗滌溶液，該洗滌溶液包含0.7g/L污垢(Pigmentschmutz，09V，wfk，克雷費(fèi)爾德(Krefeld)，德國)和哈茨木霉DNA酶(0.04ppm)(SEQ ID NO:2)。在30℃下，將試管放入斯圖爾特(Stuart)旋轉(zhuǎn)器中，持續(xù)1小時(shí)。將小塊布樣用自來水沖洗兩次并且在濾紙上干燥過夜。作為對照，平行進(jìn)行不添加哈茨木霉DNA酶的洗滌。使用Color Eye(Macbeth Color Eye 7000反射分光光度計(jì))測量色差(L值)。在入射光中沒有UV的情況下進(jìn)行測量并且從CIE Lab色空間中提取L值。數(shù)據(jù)表示為ΔL值，意指用DNA酶洗滌的小塊布樣的L值減去不用DNA酶洗滌的小塊布樣的L值。在一個(gè)液體標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑(標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑A)中以及在一個(gè)粉末標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑(標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑T)中調(diào)研哈茨木霉DNA酶的深層清潔作用。通過添加3.3g到1L硬度15°dH的水(Ca:Mg:NaHCO₃ 4:1:1.5)中來制備標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑A的洗滌溶液。通過添加5.3g到1L硬度15°dH的水(Ca:Mg:NaHCO₃ 4:1:1.5)中來制備標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑T的洗滌溶液。

本實(shí)例示出，哈茨木霉DNA酶防止污垢沉積(抗再沉積)到與細(xì)菌預(yù)生長的聚酯小塊布樣，并且改進(jìn)了與細(xì)菌預(yù)生長的聚酯小塊布樣的白度。在pH 8.0液體洗滌劑中，還在pH 10的粉狀洗滌中都觀察到了污垢沉積的預(yù)防，盡管在液體洗滌劑中觀察到了最顯著的深層清潔效果。

表1.哈茨木霉DNA酶(SEQ ID NO:2)的深層清潔作用。

實(shí)例4

在米曲霉中表達(dá)的核酸酶哈茨木霉(SEQ ID NO:2)的純化

通過具有0.22μm截留的Fast PES Bottle top過濾器過濾具有半乳聚糖酶的發(fā)酵上清液。將100ml過濾的上清液用400ml MQ水進(jìn)行稀釋并且將該pH用1M HCl調(diào)整到4.5。

在預(yù)處理后，通過在XK26柱中的大約30ml的S-瓊脂糖(S-Sepharose)上的陽離子交換色譜法純化該500ml包核酸酶的溶液，使用50mM乙酸鈉(pH 4.5)作為緩沖液A并且使用50mM乙酸鈉+1M NaCl(pH 4.5)作為緩沖液B?；谏V圖(在280nm和254nm處的吸收)和SDS-PAGE分析將來自該柱的部分進(jìn)行池化。

如從SDS-PAGE中估算的分子量大約為30kDa并且純度>95％。通過凝膠內(nèi)消化隨后將產(chǎn)生的肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，該純化的核酸酶的氨基酸序列證實(shí)為SEQ ID NO:2。

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該技術(shù)已申請專利。僅供學(xué)習(xí)研究，如用于商業(yè)用途，請聯(lián)系技術(shù)所有人。
技術(shù)研發(fā)人員：L.E.T.巴爾特森;K.戈里;M.阿萊森-霍爾姆;K.M.施諾爾;
技術(shù)所有人：諾維信公司;
我是此專利的發(fā)明人

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