本發(fā)明關(guān)于人參皂苷M1用于抑制腎纖維化之新穎用途，特別是抑制間質(zhì)性纖維化

背景技術(shù)：

腎纖維化是腎臟疾病的最終階段。造成腎纖維化的原因包括輸尿管阻塞(ureteral obstruction)。

輸尿管阻塞是泌尿科醫(yī)師最常遇到的問(wèn)題。輸尿管阻塞會(huì)造成在輸尿管中尿液流動(dòng)的阻抗。最常見的阻塞發(fā)生在輸尿管腎盂接合處。較廣義的“阻塞性尿路病變”乙詞可用來(lái)表示任何發(fā)生在腎盂與尿道之間的尿液流動(dòng)阻塞，其導(dǎo)致逐漸形成腎盂積水以及相關(guān)的腎損傷。尿道狹窄與良性前列腺肥大是這方面的例子。據(jù)報(bào)告，單側(cè)輸尿管阻塞(UUO)的發(fā)生率在成人中為1/1,000。輸尿管結(jié)石為最常見的原因，且急性阻塞通常伴隨明顯的腎絞痛為主要的癥狀。參見，例如，Docherty等人，抑制腎小管細(xì)胞凋亡保護(hù)對(duì)抗輸尿管阻塞后之腎損傷及纖維化發(fā)展的證據(jù)，Am J Physiol Renal Physiol.2006Jan；290(1):F4-13。

在發(fā)生單側(cè)輸尿管阻塞(UUO)初期，間質(zhì)組織由單核細(xì)胞所滲入，其典型地受到活化(classically activated)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，而釋放細(xì)胞激素，如TGF-β1與腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。接著，TGFβ1促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的表現(xiàn)型反應(yīng)，而進(jìn)入細(xì)胞凋亡(造成腎小管萎縮)，或進(jìn)入上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，而變成纖維母細(xì)胞，其可遷移至間質(zhì)組織。血管收縮素II(Angiotensin II，ANG II)，由單核細(xì)胞的活化所產(chǎn)生，可刺激核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的產(chǎn)生，其引致更多巨噬細(xì)胞的聚集，以及產(chǎn)生活性含氧物(reactive oxygen species，ROS)，其加重了腎小管的損傷。相反地，替代性活化(alternatively activated)的巨噬細(xì)胞則增加腎小管細(xì)胞的存活與增殖。內(nèi)皮細(xì)胞可以進(jìn)行內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換作用(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)或細(xì)胞凋亡，其造成毛細(xì)管損失與續(xù)發(fā)性腎缺血與缺氧。周邊細(xì)胞與浸潤(rùn)性造血干細(xì)胞亦可分化為纖維母細(xì)胞。在細(xì)胞激素的刺激下，例如由巨噬細(xì)胞或其它細(xì)胞產(chǎn)生的TGF-β1，纖維母細(xì)胞合成壓力纖維，且進(jìn)一步分化而變成肌纖維母細(xì)胞。該肌纖維母細(xì)胞可收縮且增加胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的沈積，導(dǎo)致惡化型間質(zhì)纖維化。此過(guò)程最終導(dǎo)致惡化型腎纖維化以及不可逆的腎功能衰竭。參見，例如，Chevalier等人，以輸尿管阻塞作為腎間質(zhì)纖維化與阻塞性腎病變的模型，Kidney Int.2009Jun；75(11):1145-52。

人參皂苷是人參之主要成分，已知具有多種藥理學(xué)活性，例如，抗腫瘤、抗糖尿病、抗疲勞、抗過(guò)敏及抗氧化活性。人參皂苷類具有相同的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，其系由具17個(gè)碳原子排成四個(gè)環(huán)的性脂烷類固醇(gonane steroid nucleus)核心組成。人參皂苷會(huì)在體內(nèi)代謝，近來(lái)許多研究指出，在體內(nèi)易吸收而作為活性成分的是人參皂苷代謝物而非天然存在之人參皂苷。其中，人參皂苷M1已知為原人參二醇型(protopanaxadiol-type)人參皂苷代謝物之一，其系經(jīng)由人體腸道細(xì)菌之絞股藍(lán)皂苷(gypenoside)途徑生成。迄今，尚未有前案報(bào)導(dǎo)人參皂苷M1于狼瘡性腎炎的治療功效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明中，不可預(yù)期地發(fā)現(xiàn)人參皂苷M1可有效抑制腎纖維化。因此，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防個(gè)體之腎纖維化的新穎方法。

具體而言，本發(fā)明提供一種在有需要的個(gè)體抑制腎纖維化的方法，包含對(duì)該個(gè)體投予治療有效量的人參皂苷M1。

在部分具體實(shí)施例中，該個(gè)體是具有阻塞性腎病變的病患。

在部分具體實(shí)施例中，本發(fā)明的方法能有效降低或緩解一或多種病征或癥狀，包括但不限于，單核白血球發(fā)炎、腎小管擴(kuò)張、腎小管萎縮、腎小管上皮細(xì)胞的增殖、纖維母細(xì)胞或肌纖維母細(xì)胞的活化，以及膠原蛋白(例如第III型或第IV型)的沈積，具體而言是在該個(gè)體的腎小管間質(zhì)腔室中。

在部分具體實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可有效降低或緩解在個(gè)體的腎間質(zhì)中的單核血球發(fā)炎或纖維化。

在部分具體實(shí)施例中，該人參皂苷M1由非經(jīng)腸道或腸道內(nèi)途徑投予。

在部分具體實(shí)施例中，該人參皂苷M1于腎纖維化發(fā)生之前或發(fā)生時(shí)投予。

在部分具體實(shí)施例中，該人參皂苷M1于腎纖維化發(fā)生之后投予。

本發(fā)明提供人參皂苷M1用于制造供治療腎纖維化之藥物的用途

本發(fā)明之一或多個(gè)具體實(shí)施例之詳述系列于下方之說(shuō)明中。本發(fā)明之其他特征或優(yōu)勢(shì)可由下列數(shù)個(gè)具體實(shí)施例之詳細(xì)說(shuō)明及所附之主張而更臻清楚。

附圖說(shuō)明

欲說(shuō)明本發(fā)明，圖式具體實(shí)施例如下。然而，應(yīng)理解到，本發(fā)明未局限于所示之較佳具體實(shí)施例。在圖式中：

圖1顯示UUO動(dòng)物模式的建立，包括(A)實(shí)驗(yàn)流程、(B)UUO動(dòng)物模式的手術(shù)流程，其中左邊是輸尿管結(jié)扎后的疾病腎臟，以及右邊是無(wú)輸尿管結(jié)扎的正常腎臟。

圖2顯示以蘇木精及伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色進(jìn)行之腎臟組織病理學(xué)評(píng)估，其中箭頭指示處為擴(kuò)張的腎小管。(A)腎臟組織病理學(xué)評(píng)估的H&E染色。#表示擴(kuò)張的腎小管，星狀表示單核細(xì)胞，以及＊表示萎縮的腎小管。病理學(xué)的原始放大倍數(shù)為400倍。(B)半定量顯示腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分(tubulointerstitialscore,TIS)。白色、黑色及灰色柱狀分別代表正常對(duì)照組小鼠、疾病對(duì)照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。***表示p<0.005。

圖3顯示腎細(xì)胞凋亡與增殖的評(píng)估，包括(A)以免疫組織化學(xué)染色偵測(cè)PCNA，其中箭頭指示處為陽(yáng)性染色細(xì)胞，以及(B)半定量結(jié)果。原始放大倍數(shù)為400倍。白色、黑色與灰色柱狀分別代表正常對(duì)照組小鼠、疾病對(duì)照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。***表示p<0.005。

圖4顯示纖維化表現(xiàn)評(píng)估，包括(A)以Masson氏毛狀體染色分析在腎組織中纖維化的膠原蛋白的表現(xiàn)，(B)以免疫組織化學(xué)染色分析在腎組織中平滑肌α肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表現(xiàn)，(C)以免疫組織化學(xué)染色分析在腎組織中平滑膠原蛋白第III型的表現(xiàn)，(D)以免疫組織化學(xué)染色分析在腎組織中平滑膠原蛋白第IV型的表現(xiàn)，其中箭頭指示處為陽(yáng)性染色細(xì)胞，以及(E)半定量結(jié)果。原始放大倍數(shù)為400倍。白色、黑色與灰色柱狀分別代表正常對(duì)照組小鼠、疾病對(duì)照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.005。

圖5顯示(A)以免疫組織化學(xué)染色分析在腎組織中NF-κB的表現(xiàn)，其中箭頭指示處為陽(yáng)性染色細(xì)胞，以及(B)半定量結(jié)果。原始放大倍數(shù)為400倍。白色、黑色與灰色柱狀分別代表正常對(duì)照組小鼠、疾病對(duì)照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。***表示p<0.005。

圖6顯示在腎組織中單核白血球浸潤(rùn)，包括以免疫組織化學(xué)染色偵測(cè)(A)F4/80⁺單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞以及(B)CD3⁺T細(xì)胞，其中箭頭指示處為陽(yáng)性染色細(xì)胞，以及(C)半定量結(jié)果。原始放大倍數(shù)為400倍。白色、黑色與灰色柱狀分別代表正常對(duì)照組小鼠、疾病對(duì)照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。***表示p<0.005。

圖7顯示LCHK168抑制腎盂尿中的MCP-1、TNF-α及IL-1β的表現(xiàn)水平。(A)MCP-1、(B)TNF-α及(C)IL-1β以ELISA偵測(cè)尿液樣本。白色、黑色與灰色柱狀分別代表正常對(duì)照組小鼠、疾病對(duì)照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.005。

圖8顯示細(xì)胞免疫力的活化評(píng)估，包括以流式細(xì)胞儀偵測(cè)(A)CD3⁺CD69⁺T細(xì)胞以及(B)CD19⁺CD69⁺T細(xì)胞。白色、黑色與灰色柱狀分別代表正常對(duì)照組小鼠、疾病對(duì)照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。

圖9顯示造血干細(xì)胞的活化評(píng)估，包括以流式細(xì)胞儀偵測(cè)(A)CD34⁺干細(xì)胞以及(B)Sca-1⁺造血干細(xì)胞。白色、黑色與灰色柱狀分別代表正常對(duì)照組小鼠、疾病對(duì)照組小鼠，以及LCHK168+UUO小鼠。

具體實(shí)施方式

除非另有定義，本文所使用的技術(shù)性及科學(xué)性術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明領(lǐng)域之技術(shù)人員所能常規(guī)理解的意義。除非另有指明，本文所使用的下列術(shù)語(yǔ)具有賦予其之涵義。

本文所使用的冠詞“一”與“一者”是指一個(gè)或多于一個(gè)(亦即，至少一者)之該冠詞語(yǔ)法對(duì)象。舉例而言，“一組件”是指一個(gè)組件或多于一個(gè)之組件。

在本發(fā)明中，意外地發(fā)現(xiàn)人參皂苷M1可有效抑制腎纖維化。特別是，發(fā)現(xiàn)在小鼠UUO模型中，腎損傷/發(fā)炎降低，且腎纖維化的惡化受到抑制或減輕。

對(duì)嚙齒科動(dòng)物進(jìn)行手術(shù)干預(yù)的UUO模型數(shù)十年來(lái)已被用來(lái)作為UO的高通量實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。此模型不?huì)并發(fā)高血壓、蛋白尿或高血脂癥，且不涉及任何明顯的免疫或毒性腎衰竭。取決于阻塞時(shí)間的長(zhǎng)短，UUO可以模擬不同階段的阻塞性腎病變，其最終導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化。該動(dòng)物的壽命不會(huì)受到損害，因?yàn)閷?duì)側(cè)的腎臟仍具有功能，或甚至因?yàn)檠a(bǔ)償功能與解剖肥大之故而增加功能。此模型的其它優(yōu)點(diǎn)包括，腎纖維化的進(jìn)展為高度可預(yù)期且可重復(fù)，并在相對(duì)短的期間(7-14天)內(nèi)導(dǎo)致顯著纖維化及腎元損失。參見，例如，Eddy等人，研究小鼠模型中慢性腎臟疾病的機(jī)制，Pediatr Nephrol.2012Aug；27(8):1233-47；以及Grande MT與López-Novoa JM，在阻塞性腎病變中的纖維母細(xì)胞的活化與肌纖維母細(xì)胞的產(chǎn)生，Nat Rev Nephrol.2009Jun；5(6):319-28。

以下的實(shí)施例與數(shù)據(jù)顯示出人參皂苷M1的不可預(yù)期效果，包括(1)在腎間質(zhì)組織中降低細(xì)胞凋亡與腎小管損傷，(2)在腎間質(zhì)組織中預(yù)防纖維化與膠原蛋白沈積，(3)降低NF-κB的活化，(4)預(yù)防腎臟巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞之浸潤(rùn)，以及(5)維持造血干細(xì)胞的正常功能與全身性細(xì)胞免疫力。

因此，本發(fā)明提供一種在有需要的個(gè)體治療或預(yù)防腎纖維化的方法，包含對(duì)該個(gè)體投予治療有效量的人參皂苷M1。

人參皂苷M1，即20-β-D-吡喃葡萄糖基原人參二醇(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol)，為本領(lǐng)域習(xí)知之皂素代謝物之一。人參皂苷M1之化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

人參皂苷M1已知為原人參二醇型人參皂苷之代謝物之一，其系經(jīng)由人體腸道細(xì)菌之絞股藍(lán)皂苷途徑產(chǎn)生。人體服用人參后，可于血液或尿液中發(fā)現(xiàn)人參皂苷M1。人參皂苷M1可制備自人參植物，其系以本領(lǐng)域習(xí)知方法如真菌發(fā)酵方式進(jìn)行，例如，中國(guó)臺(tái)灣發(fā)明專利申請(qǐng)案第094116005號(hào)(I280982)及美國(guó)專利第7,932,057號(hào)，其全部?jī)?nèi)容在此列入本案以作為參考數(shù)據(jù)。在部分具體實(shí)施例中，用于制備人參皂苷M1的人參植物包括五加科(Araliaceae)、人參屬(Panax genus)，如人參(P.ginseng)及假人參(P.pseudo-ginseng)(亦稱作三七)。一般而言，人參皂苷M1之制備方法包括步驟：(a)提供人參植物材料(如葉或莖)的粉末；(b)提供真菌，以進(jìn)行人參植物材料之發(fā)酵，其中發(fā)酵溫度范圍為20至50℃、發(fā)酵濕度范圍為70至100％、pH值范圍為4.0至6.0、及發(fā)酵時(shí)間范圍為5至15天；(c)萃取及收集發(fā)酵產(chǎn)物；以及(d)自發(fā)酵產(chǎn)物分離20-β-D-吡喃葡萄糖基原人參二醇。

在本發(fā)明中，當(dāng)以“分離”或“純化”描述人參皂苷M1時(shí)，其應(yīng)理解為非絕對(duì)的分離或純化，而是相對(duì)的分離或純化。舉例而言，純化的人參皂苷M1是指相較于其天然存在形式而言，純度更高。在一具體實(shí)施例中，含有純化的人參皂苷M1的制劑可包含的人參皂苷M1之含量為總制劑的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％(w/w)。應(yīng)理解的是，當(dāng)以某數(shù)字顯示比例或劑量時(shí)，該數(shù)字通常包括其10％上下之范圍，或更特別地，包括其5％上下之范圍。

本發(fā)明提供一種抑制腎纖維化之方法，包括將有效量之人參皂苷M1投用于有需要此治療的個(gè)體。亦提供的是人參皂苷M1用于制造藥物之用途，其系供于有需要的個(gè)體抑制腎纖維化。本發(fā)明的藥物有效于降低或緩解個(gè)體的一或多種癥狀或病況，包括但不限于，單核白血球發(fā)炎、腎小管擴(kuò)張、腎小管萎縮、腎小管上皮細(xì)胞的增殖、纖維母細(xì)胞或肌纖維母細(xì)胞的活化以及膠原蛋白(第III型或第IV型)的沈積，特別是在腎小管間質(zhì)腔室。特定而言，本發(fā)明的藥物有效于降低或緩解在個(gè)體的腎間質(zhì)中的單核白血球發(fā)炎或纖維化。

本文所使用的“個(gè)人”或“個(gè)體”等詞包括人類或非人類動(dòng)物，例如陪伴動(dòng)物(如狗、貓等)、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(如牛、綿羊、豬、馬等)、或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物(如大鼠、小鼠、天竺鼠等)。

本文所使用的“治療”乙詞是指施加或投予包括一或多種活性藥劑的組合物至具有疾病、疾病之癥狀或病況、或疾病惡化之個(gè)體，其目的在于治療、治愈、緩解、減輕、改變、補(bǔ)救、改善、改進(jìn)、或影響疾病、疾病之癥狀或病況、疾病引發(fā)之失能、或疾病惡化。如本文所使用，“預(yù)防”乙詞意指施用或投予包括一或多種活性劑的組合物至易感受或傾向于疾病或其癥狀或病癥的個(gè)體內(nèi)，而因此涉及預(yù)防該疾病或其癥狀或病癥或其病因的發(fā)生。

本文所使用的“有效量”乙詞是指于接受處理之個(gè)體產(chǎn)生想要的醫(yī)療功效之活性成分的量。例如，用于治療或預(yù)防腎纖維化的有效量為可以抑制、改善、緩解、降低或預(yù)防一或多種癥狀或病況，例如，單核白血球發(fā)炎、腎小管擴(kuò)張、腎小管萎縮、腎小管上皮細(xì)胞的增殖、纖維母細(xì)胞或肌纖維母細(xì)胞的活化以及膠原蛋白(第III型或第IV型)的沈積，特別是在腎小管間質(zhì)腔室。該癥狀可使用本領(lǐng)域習(xí)知方法基于不同疾病進(jìn)展相關(guān)指數(shù)予以決定與評(píng)估，例如，藉由透過(guò)染色分析腎切片。該有效量可根據(jù)不同理由而改變，例如，投予途徑與頻率、接受該藥物的個(gè)體的體重與物種，以及投予的目的。本領(lǐng)域技藝者基于本文所揭露者、已建立的方法，以及其經(jīng)驗(yàn)來(lái)決定在個(gè)案中的劑量。例如，在部分具體實(shí)施例中，本發(fā)明所使用的人參皂苷M1口服劑量為每日10至1,000mg/kg。在部分實(shí)例中，本發(fā)明所使用的人參皂苷M1口服劑量為每日100至300mg/kg、每日50至150mg/kg、每日25至100mg/kg、每日10至50mg/kg、或每日5至30mg/kg。此外，在本發(fā)明之部分具體實(shí)施例中，人參皂苷M1系周期性投予一段時(shí)間，例如，每日投予達(dá)至少15天、一個(gè)月或二個(gè)月或更久。

依據(jù)本發(fā)明，人參皂苷M1可作為活性成分，以治療或預(yù)防腎纖維化。在一具體實(shí)施例中，針對(duì)輸送及吸收目的，有效量之活性成分可與醫(yī)藥上可接受載體配制成適當(dāng)形式之醫(yī)藥組合物。依據(jù)投予模式，本發(fā)明之醫(yī)藥組合物較佳為包含約0.1％重至約100％重之活性成分，其中百分比重系以組合物之總重量為基準(zhǔn)計(jì)算。

本文所使用的“醫(yī)藥上可接受”乙詞是指載體與組合物之活性成分兼容，且較佳為可穩(wěn)定該活性成分且對(duì)于接受治療之個(gè)體具安全性。該載體可為活性成分之稀釋劑、載劑、賦形劑、或介質(zhì)。適用之賦形劑的一些實(shí)例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無(wú)菌水、糖漿、及甲基纖維素。本組合物可額外包含潤(rùn)滑劑如滑石、硬脂酸鎂、及礦物油；潤(rùn)濕劑；乳化劑及懸浮劑；防腐劑如甲基及丙基羥基苯甲酸酯；增甜劑；以及調(diào)味劑。在投予至病患后，本發(fā)明之組合物可提供活性成分快速、持續(xù)、或緩慢釋放之效果。

依據(jù)本發(fā)明，該組合物之形式可為片劑、丸劑、粉劑、錠劑、囊劑、扁囊劑、酏劑、懸劑、乳液、溶液、糖漿、軟與硬明膠膠囊、栓劑、無(wú)菌注射液、及包裝粉劑。

本發(fā)明之組合物可經(jīng)由任何生理上可接受途徑輸送，例如，口服、非口服(如肌內(nèi)、靜脈、皮下、及腹腔)、經(jīng)皮、栓劑、及鼻內(nèi)方法。關(guān)于非口服投予，較佳為使用無(wú)菌水溶液，其可包含其他物質(zhì)，如足以使溶液與血液等張的鹽類或葡萄糖。水溶液可視需求適當(dāng)?shù)亟?jīng)緩沖(較佳為具pH值3至9)。本領(lǐng)域之技術(shù)人員可由習(xí)知之標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)技術(shù)于無(wú)菌條件下制備適合的非口服組合物。

依據(jù)本發(fā)明，含有以人參皂苷M1作為活性成分的人參皂苷M1或組合物可用于治療或預(yù)防罹患腎纖維化之個(gè)體。特定而言，含有以人參皂苷M1作為活性成分的人參皂苷M1或組合物可投予至罹患腎纖維化之個(gè)體或具有罹患腎纖維化風(fēng)險(xiǎn)之個(gè)體，以預(yù)防疾病發(fā)生或改善癥狀或推遲癥狀惡化。特定而言，人參皂苷M1可在發(fā)生腎纖維化時(shí)或之前投用，或在發(fā)生腎纖維化之后投用。

此外，依據(jù)本發(fā)明，含有以人參皂苷M1作為活性成分的人參皂苷M1或組合物可用于結(jié)合現(xiàn)有的療法或藥劑，如醫(yī)藥治療，包括但不限于，皮質(zhì)類固醇(如腎上腺皮質(zhì)酮)、非類固醇消炎藥物(NSAIDs)、細(xì)胞毒性藥物(如環(huán)磷酰胺、氯芥苯丁酸、及硫唑嘌呤)、免疫抑制劑(如環(huán)孢素及霉酚酸酯)、及血管擴(kuò)張劑(如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACE抑制劑)。在一具體實(shí)施例中，用于結(jié)合之藥劑或療法可同時(shí)(并行)或依序使用。當(dāng)結(jié)合藥劑使用時(shí)，可將藥劑混入相同配方或分別使用不同配方，如個(gè)別的膠囊、丸劑、片劑、及注射劑。

本發(fā)明系進(jìn)一步以下列實(shí)例說(shuō)明，其目的旨在闡述而非局限。

實(shí)施例

1.材料及方法

1.1動(dòng)物模型與實(shí)驗(yàn)方法

UUO(單側(cè)輸尿管阻塞(Unilateral ureteral obstruction，UUO)動(dòng)物模型

雄性8周齡C57BL/6小鼠系購(gòu)自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖及研究中心(中國(guó)臺(tái)灣，臺(tái)北)，且飼養(yǎng)于NDMC的動(dòng)物中心(中國(guó)臺(tái)灣，臺(tái)北)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行皆獲得中國(guó)臺(tái)灣NDMC的IACUC的核準(zhǔn)，且符合NIH實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照護(hù)及使用指南。

小鼠首先以戊巴比妥鈉(50mg/kg，腹腔注射)麻醉。在小鼠左側(cè)切開一開口，暴露出左側(cè)輸尿管，以6-0絲縫線捆綁于二個(gè)點(diǎn)上，并切斷二個(gè)捆綁點(diǎn)之間的輸尿管。最后，縫合圍腸膜與皮膚。依照所有UUO程序的步驟，除了捆綁與切除輸尿管的步驟之外，以進(jìn)行假手術(shù)作為對(duì)照組(Xiao等人，腺苷A2A受體：在阻塞性腎病變中調(diào)節(jié)腎間質(zhì)纖維化的目標(biāo)，PLoS One.2013Apr 9；8(4):e60173)。

簡(jiǎn)言之，所有小鼠均接受術(shù)前止痛(皮下注射50mg/kg丁基原啡因(Temgesic，Shering-Plough))，右側(cè)輸尿管隨后在2.0％異氟醚誘導(dǎo)麻醉下，透過(guò)一個(gè)小的腹部切口以6.0絲捆綁。腹部以二層縫合關(guān)閉，且小鼠于28℃下于通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行術(shù)后恢復(fù)12小時(shí)。小鼠在術(shù)后7或14天進(jìn)行犧牲(Pulskens等人，Nlrp3預(yù)防早期腎間質(zhì)水腫以及在單側(cè)輸尿管阻塞中的血管通透性，PLoS One.2014Jan 15；9(1):e85775)。

1.2人參皂苷M1與投予

人參皂苷M1，即20-β-D-吡喃葡萄糖基原人參二醇(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol，以下稱為L(zhǎng)CHK168)，系以本領(lǐng)域習(xí)知之方法制備，如中國(guó)臺(tái)灣專利申請(qǐng)案第094116005號(hào)(I280982)及美國(guó)專利第7,932,057號(hào)所揭示者。LCHK168系溶解于3％cremophore中(Sigma-Aldrich公司)。在UUO手術(shù)前一天開始，以腹腔注射方式每天給予小鼠日劑量的LCHK168(30mg/kg)直到犧牲為止。

1.3腎組織病理學(xué)

石蠟包埋的腎臟組織進(jìn)行切片，并使用標(biāo)準(zhǔn)程序以Masson氏三色染劑以及蘇木精及伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色。針對(duì)組織病理學(xué)，該組織以10％緩沖的甲醛固定，并包埋于石蠟中，然后制備切片(厚度3μm)并以蘇木精及伊紅(H&E)染色。

所有的切片在固定后檢視。半定量方法是根據(jù)腎小管間質(zhì)上的發(fā)炎及纖維化的程度進(jìn)行，隨機(jī)選擇20個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分。0表示正常形態(tài)學(xué)，1表示有影響的區(qū)域少于10％，2表示有影響的區(qū)域約10至30％，3表示有影響的區(qū)域約30至50％，以及4表示有影響的區(qū)域大于50％，

1.4免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)與細(xì)胞凋亡的偵測(cè)

針對(duì)IHC，甲醛固定且石蠟包埋的組織切片于4℃下以抗PCNA抗體(Santa Cruz生物科技公司，Santa Cruz，加州，美國(guó))、CD3抗體(DAKO公司，Glostrup，丹麥)、α-SMA抗體(Thermo Fisher Scietific公司，Waltham，麻州，美國(guó))、膠原蛋白第III型抗體、膠原蛋白第IV型抗體(兩者皆來(lái)自SouthernBiotech公司，Birmingham，亞拉巴馬州，美國(guó))、F4/80抗體(單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞；Serotec公司，Raleigh，北卡羅訥州，美國(guó))、磷酸化-NF-κB p65抗體(pNF-κB p65；Cell Signaling Technology公司，Beverly，麻州，美國(guó))，稀釋于DAKO抗體稀釋緩沖液中(DAKO公司，Glostrup，丹麥)處理整夜，然后在室溫下以在相同緩沖液的共軛連接辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的二級(jí)抗體(DAKO公司)或是抗-兔聚合物-HRP抗體(BioGenex公司，F(xiàn)remont，加州，美國(guó))處理1小時(shí)；然后加入DAB(BioGenex公司)。蘇木精系用于復(fù)染細(xì)胞核。針對(duì)細(xì)胞凋亡的偵測(cè)，使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶-調(diào)節(jié)的dUTP缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)。使用凋亡標(biāo)記加上過(guò)氧化酶原位細(xì)胞凋亡偵測(cè)套組(ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis detection kit，Chemicon公司，Temecula，加州，美國(guó))根據(jù)制造商的指示對(duì)甲醛固定的組織切片染色。大量的α-SMA、膠原蛋白第III型、膠原蛋白第IV型，或磷酸化NF-κB p65⁺、PCNA⁺、F4/80⁺、CD3⁺以及細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的數(shù)量，在隨機(jī)選擇的皮質(zhì)區(qū)腎小管間質(zhì)腔室的視野中(放大倍率400倍)，以Pax-It量化圖像分析軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)(Paxcam)。

1.5流式細(xì)胞儀

來(lái)自小鼠的脾細(xì)胞以Tris緩沖的氯化銨處理，以去除紅血球，清洗后，再懸浮于補(bǔ)充有10％胎牛血清、Hepes緩沖液、L-麩酰胺酸，以及青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中(皆來(lái)自Invitrogen/Life Technologies公司，Grand Island，紐約州，美國(guó))。接著細(xì)胞以T或B細(xì)胞的表面標(biāo)記染色，使用FITC共軛結(jié)合的抗-小鼠CD3抗體(17A2)偵測(cè)T細(xì)胞，以抗小鼠CD19抗體(1D3)偵測(cè)B細(xì)胞，以及藻紅蛋白-共軛結(jié)合的抗-小鼠CD69抗體(H1.2F3；所有抗體皆來(lái)自BD Biosciences公司)。針對(duì)骨髓細(xì)胞分析，來(lái)自小鼠的骨髓依照描述分離(Takeshita S等人，2014年)，且以抗小鼠Sca-1抗體(BD Biosciences公司)或CD34抗體(eBioscience公司，San Diego，加州，美國(guó))染色。使用FACSCalibur儀器(BD Biosciences公司)進(jìn)行流式細(xì)胞分析。

1.6梅生三色染色(Masson's Trichrome Staining)

將3μm的腎切片培養(yǎng)在75℃達(dá)15分鐘。將玻片移轉(zhuǎn)上方至二甲苯及梯度酒精。在蘇木紫染色1分鐘后，將媒染劑固定于玻片上。在以0.75％橘G溶液、梅生染色溶液B、2.5％磷鎢酸溶液及苯胺藍(lán)染色溶液染色之后，以1％醋酸清洗兩次并以阿拉伯膠固定。風(fēng)干數(shù)分鐘，在光學(xué)顯微鏡上觀察染色的切片。

1.7酵素免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

藉由29G胰島素注射針筒從腎大盞及腎盂收集尿液。在正常對(duì)照組，則由代謝籠收及尿液。依據(jù)制造商(eBioscience and R&D)的說(shuō)明書，藉由ELISA偵測(cè)MCP-1、TNF-α及IL-1β。簡(jiǎn)言之，將捕獲抗體涂布在96孔盤上經(jīng)過(guò)隔夜。以PBST清洗后，將阻斷緩沖液、樣本、偵測(cè)抗體及親合素-HRP依序加入。在TMB基質(zhì)步驟后發(fā)展顏色，然后加入2N H₂SO₄停止反應(yīng)。最后，測(cè)量O.D.450nm。

1.8統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)值是平均值±SD。以Student’s t檢定進(jìn)行二組別間之比較。p值<0.05視為具有顯著差異。

2.結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)UUO模型的建立

實(shí)驗(yàn)系以8-10周齡的C57BL/6小鼠進(jìn)行。小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組、疾病對(duì)照組與LCHK168治療組，且在UUO之后7或14天進(jìn)行犧牲。在UUO腎臟的腎盂中觀察到尿液滯留，顯示UUO模型建立成功。參見圖1A及圖1B。

2.2腎組織病理學(xué)評(píng)估

收集腎組織、固定并且進(jìn)行H&E染色。如圖2所示，在UUO第7天，疾病對(duì)照組小鼠在間質(zhì)區(qū)域顯現(xiàn)出顯著的單核白血球浸潤(rùn)及腎小管擴(kuò)張，這些組織病理學(xué)特征在投予LCHK168后受到抑制。在UUO第14天，觀察到纖維化與腎小管萎縮，這些在投予LCHK168之后也顯著受到抑制。

2.3腎細(xì)胞凋亡與增殖的評(píng)估

在UUO腎臟中，尿液滯留而造成機(jī)械應(yīng)力，而由腎細(xì)胞釋放出細(xì)胞激素與ROS響應(yīng)該應(yīng)力，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷，其導(dǎo)致細(xì)胞自我更新或凋亡反應(yīng)。腎切片進(jìn)行TUNNEL染色以分析凋亡的細(xì)胞，結(jié)果顯示UUO腎間質(zhì)區(qū)域的染色在投予LCHK168后下降。參見圖3A。

以增殖的細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，進(jìn)行腎切片免疫組織化學(xué)染色，其系一種不只針對(duì)腎小管上皮細(xì)胞增殖狀態(tài)也針對(duì)活化的肌纖維母細(xì)胞與發(fā)炎細(xì)胞的標(biāo)記，結(jié)果顯示在UUO之后PCNA顯現(xiàn)出顯著地增加，特別是在擴(kuò)張的腎小管中。然而，在投予LCHK168之后，PCNA的表現(xiàn)下降。這些結(jié)果顯示，LCHK168可能減弱細(xì)胞凋亡與損傷。見圖3B。

2.4纖維化表現(xiàn)評(píng)估

在UUO腎臟中，纖維化是一種對(duì)腎組織損傷的不良反應(yīng)，且若阻塞持續(xù)存在，則將會(huì)發(fā)展為不可逆的腎功能不全。以梅生三色染色進(jìn)行腎切片的組織化學(xué)染色顯示，相較于假手術(shù)對(duì)照組，在UUO間質(zhì)區(qū)域內(nèi)纖維化組織顯著地增加，而在投予LCHK168后減少。參見圖4A。進(jìn)一步對(duì)腎切片進(jìn)行α-SMA、膠原蛋白第III型以及膠原蛋白第IV型的免疫組織化學(xué)染色分析，結(jié)果顯示這些指針都在UUO間質(zhì)區(qū)域中強(qiáng)烈地表現(xiàn)，且在投予LCHK168后表現(xiàn)下降。參見圖4B-圖4E。這些數(shù)據(jù)顯示，LCHK168可能減緩肌纖維母細(xì)胞的活化以及在腎間質(zhì)中的腎纖維化。

2.5NF-κB調(diào)節(jié)的發(fā)炎反應(yīng)

2.5.1NF-κB在腎組織中的表現(xiàn)

NF-κB是一種針對(duì)其細(xì)胞激素與細(xì)胞黏附分子的刺激之發(fā)炎相關(guān)因子的調(diào)節(jié)所必需的核轉(zhuǎn)錄因子。先前的研究顯示，在各種發(fā)炎性疾病中，包括腎臟疾病，NF-κB的表現(xiàn)水平提升。針對(duì)NF-κB的腎切片免疫組織化學(xué)染色顯示NF-κB表現(xiàn)的增加，且在投予LCHK168后被抑制。參見圖5。這數(shù)據(jù)顯示，LCHK168可抑制在UUO腎臟內(nèi)的NF-κB。

2.5.2單核白血球浸潤(rùn)

先前的研究顯示，發(fā)炎細(xì)胞在UUO的發(fā)病機(jī)制中扮演重要的角色。單核白血球的浸潤(rùn)可在UUO的早期階段中被觀察到，特別是巨噬細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞。隨著阻塞的持續(xù)，活化的發(fā)炎細(xì)胞刺激腎小管上皮細(xì)胞或其他發(fā)炎細(xì)胞釋放各種細(xì)胞激素與趨化激素，引致更多的發(fā)炎細(xì)胞聚集至腎間質(zhì)區(qū)域，以及誘發(fā)的腎發(fā)炎與纖維化。單核白血球浸潤(rùn)的評(píng)估以腎切片的F4/80與CD3+免疫組織化學(xué)染色來(lái)進(jìn)行，其為巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞的標(biāo)記。在UUO之后F4/80與CD3+的表現(xiàn)增加，且在投予LCHK168后減少。參見圖6A、圖6B。這些數(shù)據(jù)顯示，LCHK168可預(yù)防腎間質(zhì)的巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.5.3尿液中MCP-1、TNF-α及IL-1β的表現(xiàn)評(píng)估

在初始階段，細(xì)胞激素及趨化激素集中釋放在腎并可聚集免疫細(xì)胞。被聚集的免疫細(xì)胞接著釋放越來(lái)越多的發(fā)炎因子。偵測(cè)腎盂中的MCP-1、TNF-α及IL-1β。UUO及UUO+LCHK組均表現(xiàn)較高的MCP-1、TNF-α及IL-1β，相較于第7天的正常對(duì)照組而言。雖然這些細(xì)胞激素及趨化激素在第14天，在UUO+LCHK組顯著下降，相較于UUO組而言。圖式顯示LCHK168可顯著降低尿液的MCP-1、TNF-α及IL-1β水平。

2.6細(xì)胞免疫力的活化與造血干細(xì)胞活化

2.6.1B與T淋巴細(xì)胞的活化

為了檢驗(yàn)LCHK168是否透過(guò)抑制全身性細(xì)胞免疫力來(lái)預(yù)防局部發(fā)炎反應(yīng)與纖維化，我們以流式細(xì)胞儀檢驗(yàn)了在脾細(xì)胞中的B細(xì)胞與T細(xì)胞的活化。如圖8A與圖8B所示，在這三個(gè)族群中CD3⁺CD69⁺(活化的泛B細(xì)胞)與CD4⁺CD69⁺(活化的泛T細(xì)胞)的百分比皆無(wú)顯著的改變。這些數(shù)據(jù)顯示，由UUO造成的腎病變可能對(duì)全身性細(xì)胞免疫力的影響不大，且LCHK168可能并非透過(guò)抑制全身性細(xì)胞免疫力來(lái)預(yù)防局部發(fā)炎反應(yīng)與纖維化。

2.6.2造血干細(xì)胞的活化

為了檢驗(yàn)LCHK168是否透過(guò)抑制造血干細(xì)胞的活化而預(yù)防局部發(fā)炎反應(yīng)與纖維化，我們以流式細(xì)胞儀檢驗(yàn)了在骨髓細(xì)胞中的干細(xì)胞與造血干細(xì)胞的活化。如圖9A與圖9B所示，在這三個(gè)族群中，干細(xì)胞抗原-1-陽(yáng)性細(xì)胞(造血干細(xì)胞)與CD34⁺(干細(xì)胞)的百分比皆無(wú)顯著的改變。該獲得的數(shù)據(jù)顯示，由UUO造成的腎病變可能對(duì)造血干細(xì)胞活化的影響不大，且LCHK168可能并非透過(guò)抑制造血干細(xì)胞的活化來(lái)預(yù)防局部發(fā)炎反應(yīng)與纖維化。

總而言之，我們的研究顯示，人參皂苷M1在UUO模型中能有效預(yù)防腎纖維化的發(fā)展。特別是，研究結(jié)果顯示人參皂苷M1(1)降低腎間質(zhì)組織的細(xì)胞凋亡與腎小管損傷，(2)預(yù)防腎間質(zhì)組織的纖維化與膠原蛋白沈積，(3)降低NF-κB的活化，(4)預(yù)防腎臟的巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞浸潤(rùn)，以及(5)造血干細(xì)胞的正常功能與全身性細(xì)胞免疫力。所有的發(fā)現(xiàn)暗示了人參皂苷M1可以進(jìn)一步被發(fā)展為治療或預(yù)防腎纖維化的候選新藥。

相信熟習(xí)本發(fā)明領(lǐng)域普通知識(shí)之技術(shù)人員可基于本文之闡述最大限度利用本發(fā)明，而毋須進(jìn)一步說(shuō)明。因此，應(yīng)理解到，所提供之說(shuō)明及主張僅用于示例之目的，而非以任何方式局限本發(fā)明之范疇。