本發(fā)明涉及一種用于以高產(chǎn)率生產(chǎn)氯法拉濱(clofarabine)且不形成不期望的α-N9立體異構(gòu)體的方法。

背景技術(shù)：

氯法拉濱(系統(tǒng)IUPAC名稱：5-(6-氨基-2-氯-嘌呤-9-基)-4-氟-2-(羥基-甲基)氧雜環(huán)戊烷-3-醇)為一種嘌呤核苷酸抗代謝物，其用于治療各種類型的白血病，特別是急性成淋巴細胞性白血病(acute lymphoblasticleukemia)。

目前，在本領(lǐng)域中確立了幾種用于生產(chǎn)氯法拉濱的方法。合成路線典型地基于嘌呤衍生物與阿拉伯呋喃糖基(arabinofuranosyl)片段之間的偶聯(lián)反應(yīng)。根據(jù)氟原子引入的方法，可以將這些合成方案分為兩組：(i)將氟原子包含在呋喃核糖片段中，并在偶聯(lián)步驟引入至分子中的方法；(ii)在偶聯(lián)步驟后，通過前面獲得的核苷的化學(xué)轉(zhuǎn)化將氟原子引入的方法。

美國專利5,034,518公開了由Montgomery和同事開發(fā)的用于生產(chǎn)氯法拉濱的原始合成方案。在圖1中闡明了合成路線。簡而言之，將1-溴-2-氟-糖1與2,6-二氯嘌呤2偶聯(lián)，然后進行胺化和脫保護步驟。該偶聯(lián)步驟導(dǎo)致產(chǎn)物3的α-和β-異頭物的混合物的形成。在色譜分離后，僅能夠以32％的產(chǎn)率分離期望的β-異頭物。事實上，該方法的主要缺點為期望產(chǎn)物的低總產(chǎn)率(overall yield)(基于1為13％)、起始溴化物1的低穩(wěn)定性和由于α-異構(gòu)體的存在偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物3的具有挑戰(zhàn)性的純化。

美國專利6,949,640公開了以上合成路線的改進，其涉及(i)使用通過用強堿(如NaH)處理2-氯-6-取代嘌呤形成的鹽代替NH-形式的嘌呤，以及(ii)使用2-脫氧-2-氟-3,5-二-O-苯甲酰基-α-D-阿拉伯呋喃糖基溴化物4代替O-乙?；苌?(在圖2中闡明了合成路徑)。這些改進能夠使氯法拉濱基于化合物4的總產(chǎn)率(total yield)增加至約40％。然而，合成方案受到溴化物4(其難以生產(chǎn))的低穩(wěn)定性和在偶聯(lián)階段異頭物的混合物的形成(需要具有挑戰(zhàn)性的柱色譜法以分離期望的產(chǎn)物)的阻礙。

在美國專利6,680,382中公開了Montgomery和同事的方法的進一步的改進，在圖3中進一步闡明了所述改進。該改進涉及使用通過用t-BuOK處理2-氯腺嘌呤獲得的2-氯腺嘌呤的鉀鹽5代替2,6-二氯嘌呤的鈉鹽，使用三元溶劑混合物(例如叔戊醇、CH₂Cl₂、CH₃CN)和加入CaH₂以徹底去除溶劑中的水。低極性溶劑在偶聯(lián)步驟中的使用能夠?qū)崿F(xiàn)反應(yīng)的立體選擇性進行(異頭物β與α的比例高達15:1)。此外，在起始材料2-氯腺嘌呤中氨基的存在能夠避開偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的胺化步驟。因此，純化的氯法拉濱基于氟化糖4的總產(chǎn)率為約32％。然而，氟化糖4(由1-O-乙?；?2,3,5-三-O-苯甲酰基-β-D-呋喃核糖以四步獲得)難以生產(chǎn)且穩(wěn)定性低，是該方法仍然存在的兩個缺點。

在美國專利公布2012/0010397中公開的方法涉及上面引述的用于制備氯法拉濱的第二組方法。其在圖4中被闡明。在第一步中，通過將糖6和TMS保護的2-氯腺嘌呤7偶聯(lián)獲得2',3',5'-三-O-苯甲?；?2-氯腺苷8。用水合肼的進一步的脫苯甲?；瘜?dǎo)致3',5'-和2',5'’-二-O-苯甲?；苌锏幕旌衔锏男纬?。在將2',5'-二-O-苯甲酰基衍生物異構(gòu)化為3',5'-衍生物9后，通過用三氟甲磺酸酐處理化合物9獲得三氟甲磺酸酯10。在三氟甲磺酸酯10的氟化和脫保護后，其產(chǎn)生終產(chǎn)物氯法拉濱。然而，該方法的缺點為在6和7的偶聯(lián)步驟中形成大量的異構(gòu)體(其難以分離)(β-N9、α-N7、β-N7異構(gòu)體)，使用高毒性的水合肼，純化的氯法拉濱的總產(chǎn)率僅為15％。

因此，仍然不斷需要用于合成氯法拉濱的改進的方法，其克服已確立的合成方案的限制。特別地，需要合成方案，其導(dǎo)致產(chǎn)物的高產(chǎn)率，并且不涉及不期望的立體異構(gòu)體的形成。

因此，本發(fā)明的目的在于提供這種用于生產(chǎn)氯法拉濱的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在一個方面，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)氯法拉濱的方法，其包括：

(a)通過2-氯腺嘌呤與式1的化合物之間的酶法轉(zhuǎn)糖基化制備2-氯腺苷，

其中，R¹分別為式2的嘌呤堿或式3的嘧啶堿，

其中R²和R³獨立地選自-H、-NH₂、-OH和-CH₃；以及R⁴選自-H和-CH₃；

(b)部分地(partially)保護2-氯腺苷的羥基，以獲得式4的化合物和式5的化合物的混合物，

其中R⁵獨立地為羥基保護基；

(c)將式4的化合物異構(gòu)化為式5的化合物；

(d)由式5的化合物制備式6的化合物，

其中OR⁶為離去基；

(e)將式6的化合物氟化為式7的化合物；以及

(f)將式7的化合物脫保護以獲得氯法拉濱。

在優(yōu)選的實施方案中，通過使用嘌呤核苷磷酸化酶或嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的組合進行步驟(a)中的轉(zhuǎn)糖基化。

在另一優(yōu)選的實施方案中，通過使用氟化劑進行步驟(e)中的氟化。優(yōu)選地，氟化劑選自氫氟酸以及氫氟酸和有機路易斯堿的混合物。特別優(yōu)選地，有機路易斯堿(與氫氟酸混合使用)為胺。

在進一步優(yōu)選的實施方案中，取代基R¹為代表尿苷的嘧啶堿；和/或取代基R⁵為代表苯甲?；牧u基保護基；和/或取代基OR⁶為代表三氟甲磺酸酯的離去基。

附圖說明

圖1闡明如在美國專利5,034,518中所公開的用于生產(chǎn)氯法拉濱的合成方案。

圖2闡明如在美國專利6,949,640中所公開的用于生產(chǎn)氯法拉濱的合成方案。

圖3闡明如在美國專利6,680,382中所公開的用于生產(chǎn)氯法拉濱的合成方案。

圖4闡明如在美國專利公布2012/0010397中所公開的用于生產(chǎn)氯法拉濱的合成方案。

圖5闡明根據(jù)本發(fā)明的用于生產(chǎn)氯法拉濱的合成方案。

具體實施方式

本發(fā)明基于出人意料的發(fā)現(xiàn)，即當由2-氯腺苷起始時，包含酶法轉(zhuǎn)糖基化、苯甲?；?、異構(gòu)化、磺酸酯形成(即磺?；?、氟化和脫保護步驟的級聯(lián)反應(yīng)的進行導(dǎo)致氯法拉濱的高產(chǎn)率生產(chǎn)，而沒有不期望的立體異構(gòu)體的伴隨形成，因此避免了已確立的方法的主要缺點，并提供了一種事半功倍的合成方案。

下面將根據(jù)特別的實施方案并參照一些附圖描述本發(fā)明，但應(yīng)理解本發(fā)明并不被限定于此，而是僅由所附權(quán)利要求限定。所描述的附圖僅是圖解的和有代表性的，且均被認為是非限制性的。

在本說明書和權(quán)利要求中使用術(shù)語“包括”的情況下，其不排除其他元素或步驟。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“由……組成”被認為是術(shù)語“包括”的優(yōu)選的實施方案。在下文中，如果一個組被定義為包括至少某一數(shù)量的實施方案，這也被理解為公開一個組，所述組優(yōu)選僅由這些實施方案組成。

在提及單數(shù)名詞時用到不定冠詞或定冠詞例如“一(a)”、“一個(an)”或“該(the)”的情況下，除非另有具體說明，這包括所述名詞的復(fù)數(shù)。

如果在本發(fā)明的文本中指出數(shù)值，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在精確度的區(qū)間內(nèi)確保所討論的技術(shù)特征的技術(shù)效果，所述區(qū)間通常涵蓋給定數(shù)值的±10％，優(yōu)選±5％的偏差。

此外，本說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等被用于相似的元素之間的區(qū)分，且不一定用于描述順序次序或時間次序。應(yīng)理解的是，如此使用的術(shù)語在適當?shù)那闆r下是可以互換的，并且本文中描述的本發(fā)明的實施方案可以以不同于本文所述或闡明的順序的其他順序操作。

術(shù)語的另外的定義將在以下使用所述術(shù)語的文本中給出。以下術(shù)語或定義僅用于輔助理解本發(fā)明。這些定義不應(yīng)被解釋為具有小于本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的范圍。

在一個方面，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)氯法拉濱的方法，其包括：

(a)通過2-氯腺嘌呤與式1的化合物之間的酶法轉(zhuǎn)糖基化制備2-氯腺苷，

其中，R¹分別為式2的嘌呤堿或式3的嘧啶堿，

其中R²和R³獨立地選自-H、-NH₂、-OH和-CH₃；以及R⁴選自-H和-CH₃；

(b)部分地保護2-氯腺苷的羥基，以獲得式4的化合物和式5的化合物的混合物，

其中R⁵獨立地為羥基保護基；

(c)將式4的化合物異構(gòu)化為式5的化合物；

(d)由式5的化合物制備式6的化合物，

其中OR⁶為離去基；

(e)將式6的化合物氟化為式7的化合物；以及

(f)將式7的化合物脫保護以獲得氯法拉濱。

圖5圖示地總結(jié)了根據(jù)本發(fā)明的方法。在下文中，化合物的編號對應(yīng)于圖5中使用的名稱。

使用酶通過2-氯腺嘌呤(II)與任何含有核糖的核苷之間的酶法轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)獲得2-氯腺苷(III)，所述核苷優(yōu)選尿苷(I)(因為其容易溶解且容易獲得)，所述酶優(yōu)選如嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和尿苷磷酸化酶(UP)。該反應(yīng)是可逆的。為了使平衡向產(chǎn)物(III)方向移動，使用1.5至5當量，優(yōu)選3.3當量的過量的尿苷?？梢栽?0至70℃的溫度，優(yōu)選在58至61℃的溫度進行反應(yīng)。

由于酶法轉(zhuǎn)糖基化的立體專一性，糖基化的唯一產(chǎn)物為β-異頭物(III)。可以例如通過使用低壓制備色譜從起始試劑(I)、(II)和尿嘧啶(副產(chǎn)物)中純化2-氯腺苷。典型地，選擇允許2-氯腺苷被吸附劑保留的條件，而絕大部分雜質(zhì)未被保留在柱子上。其僅包括“上樣(application)”和“洗脫”步驟，能夠簡化純化過程。

然后，優(yōu)選在吡啶的存在下，用苯甲酰氯將獲得的2-氯腺苷苯甲?；?。在該反應(yīng)中，基于式(III)的三醇化合物，可以使用1.8至2.5當量，優(yōu)選2.3當量的苯甲酰氯?？梢栽?10至20℃的溫度，優(yōu)選在0至5℃的溫度進行反應(yīng)。

作為一種副產(chǎn)物，可能形成高達35％的2',3',5'-三-O-苯甲?；?2-氯腺苷(IV)。不過，該副產(chǎn)物的存在并不干擾隨后的異構(gòu)化步驟，并且還可以在3',5'-二-O-苯甲?；苌锏慕Y(jié)晶期間被容易地分離。因此，幾乎全部量的起始化合物2-氯腺苷最終導(dǎo)致了3',5'-二-O-苯甲?；苌锏男纬?。

隨后，將2',5'-二-O-苯甲酰基異構(gòu)體(V)異構(gòu)化為3',5'-二-O-苯甲?；悩?gòu)體(VI)。在核苷中將優(yōu)選的苯甲?；?'位向3'位的遷移已在本領(lǐng)域中確立(參見，特別是Maruyama,T.等人(1999)Chem.Pharm.Bull.47,966-970)。優(yōu)選地，在劇烈攪拌下通過在甲醇中煮沸40-45小時進行異構(gòu)化反應(yīng)。反應(yīng)混合物熱過濾后所獲得的結(jié)晶具有>98％的純度(HPLC)，而幾乎所有雜質(zhì)都留在母液中，再加工(reworking)后可以從母液中分離2-氯腺苷。

使用吡啶作為堿，通過用Tf₂O處理進行隨后的式VI的化合物的磺?；Ｔ谠摲磻?yīng)中，基于式(VI)的化合物，可以使用1.3至2.0當量，優(yōu)選1.6當量的三氟甲磺酸酐。溶劑可以為有機溶劑，如乙腈、四氫呋喃、二氯甲烷、氯仿，優(yōu)選為二氯甲烷。可以在-20至30℃的溫度，優(yōu)選在-10至0℃的溫度進行反應(yīng)。

在下一步中，可以例如通過使用二異丙基乙胺作為堿，通過用氟化劑(如NEt₃*3HF、TBAF或TBAF*(t-BuOH)₄，優(yōu)選NEt₃*3HF)處理三氟甲磺酸酯(VII)來獲得氟衍生物(VIII)。溶劑可以為例如乙酸乙酯、四氯化碳、甲苯、乙腈，優(yōu)選為甲苯?？梢栽?至100℃的溫度，優(yōu)選在35至40℃的溫度進行反應(yīng)?？梢詮囊宜嵋阴ズ图状嫉幕旌衔镏薪Y(jié)晶所獲得的受保護的氯法拉濱。在以上條件中，結(jié)晶后反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)率約為60％。

最后，在溫和條件下將受保護的氯法拉濱脫保護。這些溫和條件(30min，在30℃)能夠進行反應(yīng)而沒有副反應(yīng)。通過用二氯甲烷萃取來分離形成的苯甲酸甲酯，使用低壓制備色譜然后通過結(jié)晶來純化水相中含有的氯法拉濱。獲得的氯法拉濱具有高純度，沒有可檢測的量的雜質(zhì)。氯法拉濱的總產(chǎn)率約為30-40％。

通過附圖和以下實施例進一步描述本發(fā)明，其僅用于闡明本發(fā)明的具體實施方案，而不應(yīng)被解釋為以任何形式限制所要求保護的主題。

實施例

實施例1a：由2-氯腺嘌呤和尿苷制備2-氯腺苷(III)

在58-61℃，在攪拌下將400g尿苷和150g KH₂PO₄溶解于水(52L)和DMSO(1.8L)的混合物中。向所得的溶液中加入第一批(0.75L)由2-氯腺嘌呤(85g)、水(7L)和KOH(120g)制備的溶液。用KOH水溶液將所得的混合物的pH調(diào)節(jié)至7.1-7.2。在58-61℃，在攪拌下加入尿苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的溶液。在58-61℃，在攪拌下，在3小時的時間中將余下的第二批2-氯腺嘌呤溶液依次加入至反應(yīng)混合物中，用HCl水溶液使pH保持在7.1-7.2的范圍內(nèi)。然后，在58-61℃將反應(yīng)混合物攪拌1小時，并加入NaOH以調(diào)節(jié)pH至11。

利用制備色譜純化含有2-氯腺苷的所得的溶液，然后分離產(chǎn)物(涉及在水中結(jié)晶)，獲得120g標題化合物。2-氯腺苷的典型純度為>99％，基于2-氯腺嘌呤的產(chǎn)率為>85％。

實施例1b：由2-氯腺嘌呤和鳥嘌呤制備2-氯腺苷(III)

在58-61℃，在攪拌下將229g鳥嘌呤和75g KH₂PO₄溶解于水(52L)和DMSO(1.8L)的混合物中。向所得的溶液中加入第一批(0.75L)由2-氯腺嘌呤(42g)、水(7L)和KOH(60g)制備的溶液。用KOH水溶液將所得的混合物的pH調(diào)節(jié)至7.1-7.2。在58-61℃，在攪拌下將嘌呤核苷磷酸化酶的溶液加入至反應(yīng)混合物中。在58-61℃，在攪拌下，在3小時的時間中將余下的第二批2-氯腺嘌呤溶液依次加入至反應(yīng)混合物中，用HCl水溶液使pH保持在7.1-7.2的范圍內(nèi)。然后，在58-61℃將反應(yīng)混合物攪拌1小時，并加入NaOH以調(diào)節(jié)pH至11。

利用低壓反相柱色譜純化含有2-氯腺苷的所得的溶液，然后分離產(chǎn)物(涉及在水中結(jié)晶)，獲得53g標題化合物。2-氯腺苷的典型純度為>99％，基于2-氯腺嘌呤的產(chǎn)率為>70％。

實施例2：2-氯腺苷的苯甲?；?/p>

將2-氯腺苷(750g)的吡啶(7.5L)溶液冷卻至-5-0℃。然后，在攪拌和冷卻下將苯甲酰氯(720g)的乙腈(1440mL)溶液緩慢加入至反應(yīng)混合物中。因此，反應(yīng)混合物的內(nèi)部溫度應(yīng)當不高于5℃。在相同條件下將混合物溫育30min。此后，在60℃的溫度減壓蒸發(fā)溶劑。將殘余物溶解于CH₂Cl₂中，并依次用1M H₂SO₄水溶液、飽和NaHCO₃水溶液和水洗滌。減壓蒸發(fā)有機相，以獲得2-氯-9-(2',5'-二-O-苯甲?；?β-D-核糖呋喃糖基(ribofuranosyl))-腺嘌呤和2-氯-9-(3',5'-二-O-苯甲?；?β-D-核糖呋喃糖基)-腺嘌呤的混合物(二者一起總計約65％，經(jīng)HPLC)，以及2',3',5'-三-O-苯甲?；?2-氯腺苷(約30％，經(jīng)HPLC)。

實施例3：將2-氯-9-(2',5'-二-O-苯甲?；?β-D-核糖呋喃糖基)-腺嘌呤(V)異構(gòu)化為2-氯-9-(3',5'-二-O-苯甲?；?β-D-核糖呋喃糖基)-腺嘌呤(VI)

將如實施例2中制備的2-氯-9-(2',5'-二-O-苯甲酰基-β-D-核糖呋喃糖基)-腺嘌呤和2',3',5'-三-O-苯甲?；?2-氯腺苷的混合物加入至25LMeOH中。在劇烈攪拌下將所得的混合物回流40-45小時。此后，將混合物真空熱過濾，并用MeOH洗滌濾餅。將含有2',3',5'-三-O-苯甲?；?2-氯腺苷和2-氯-9-(2',5'-二-O-苯甲?；?β-D-核糖呋喃糖基)-腺嘌呤的濾液進行再加工，以通過水解獲得2-氯腺苷。將固體在50℃真空干燥，以獲得880g 2-氯-9-(3',5'-二-O-苯甲?；?β-D-核糖呋喃糖基)-腺嘌呤，其具有>98％的HPLC純度。

實施例4：2-氯-9-(3',5'-二-O-苯甲?；?2'-O-三氟甲基磺?；?β-D-核糖呋喃糖基)-腺嘌呤(VII)的制備

將2-氯-9-(3',5'-二-O-苯甲?；?β-D-核糖呋喃糖基)-腺嘌呤(880g)懸浮于吡啶(0.8L)和CH₂Cl₂(8L)的混合物中。在N₂氣氛中，在攪拌和冷卻(-10-0℃)下將三氟甲磺酸酐(455mL)的CH₂Cl₂(1500mL)溶液緩慢加入至反應(yīng)混合物中。在相同條件下將反應(yīng)混合物溫育30min。然后，在攪拌下加入飽和NaHCO₃水溶液，直至所得的混合物的pH被調(diào)節(jié)至7。將有機相分離，用水洗滌并減壓蒸發(fā)，以獲得1000g標題產(chǎn)物(產(chǎn)率95％)，其具有>95％的HPLC純度。

實施例5：2-氯-9-(3',5'-二-O-苯甲?；?2'-脫氧-2'-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-腺嘌呤(VIII)的制備

將如實施例4中制備的2-氯-9-(3',5'-二-O-苯甲?；?2'-O-三氟甲基磺?；?β-D-核糖呋喃糖基)-腺嘌呤懸浮于5L甲苯中。在攪拌下依次加入N,N-二異丙基乙胺(350mL)和三乙胺三氫氟酸鹽(1.2L)。將反應(yīng)混合物在35-40℃攪拌48小時，并減壓蒸發(fā)。用乙酸乙酯處理殘余物并過濾。在攪拌下將飽和NaHCO₃水溶液加入至濾液中，直至所得的混合物的pH被調(diào)節(jié)至7。將有機相分離，用水洗滌并減壓蒸發(fā)。在60℃在攪拌下將殘余物溶解于甲醇(1.5L)中。將獲得的溶液保持在2-6℃持續(xù)2-3小時，直至充分沉淀。將形成的沉淀物過濾，用甲醇洗滌并干燥，以獲得540g標題產(chǎn)物(產(chǎn)率60％)，其具有>95％的HPLC純度。

實施例6：2-氯-9-(2'-脫氧-2'-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-腺嘌呤(即，氯法拉濱)的制備

將如實施例5中制備的2-氯-9-(3',5'-二-O-苯甲酰基-2'-脫氧-2'-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-腺嘌呤懸浮于1.5L甲醇中。加入30mL 10％MeONa甲醇溶液，將反應(yīng)混合物在30℃攪拌30min。此后，將水(1.5L)和CH₂Cl₂(1.5L)加入至反應(yīng)混合物中。在攪拌10min后，將水相分離，并減壓蒸發(fā)至約1.5L的體積。利用低壓制備柱色譜純化含有氯法拉濱的所得的溶液，然后分離產(chǎn)物(涉及在水/丙酮混合物中結(jié)晶)，獲得260g標題化合物。氯法拉濱的典型純度為>99.9％，總產(chǎn)率(6步后)為32％。

本文說明性描述的本發(fā)明可以在缺少任一個或數(shù)個元素、任一個或數(shù)個限制下適當?shù)貙嵤?，本文并沒有具體地公開。因此，例如，術(shù)語“包括(comprising)”、“包含(including)”、“含有(containing)”等應(yīng)該被廣泛解讀且沒有限制。此外，本文采用的術(shù)語和表述已經(jīng)被用作說明書術(shù)語且沒有限制，并且使用這些術(shù)語和表述無意排除任何所顯示和所描述特征的等價體或其部分，但認為在本發(fā)明要求保護的范圍內(nèi)各種的修飾是可能的。因此，應(yīng)該理解，盡管已經(jīng)通過實施方案和任選的特征具體公開了本發(fā)明，但本文具體表達的本發(fā)明的修飾和變化可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員采用，并且這些修飾和變化被認為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

本文已廣泛而一般性地描述了本發(fā)明。落在一般性公開中的每個更窄的種類和亞類組群也形成本發(fā)明的部分。這包含了本發(fā)明的一般性描述，具有從種屬中去除任何主體的附帶的或否定的限制，無論去除的材料是否在本文具體地列舉。

其他實施方案在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。此外，在本發(fā)明的特征或方面依照馬庫什組描述的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到本發(fā)明因此也能依照馬庫什組成員的任何獨立成員或亞組來描述。