本發(fā)明涉及一種利用源自人干細(xì)胞的肝細(xì)胞的免疫肝毒性篩選方法及免疫肝毒性篩選試劑盒。

背景技術(shù)：

目前，在新藥開發(fā)方面，因毒性而導(dǎo)致的失敗率在非臨床階段約占20％，且在臨床階段約占13％之高的比例。以新的合成化合物(new chemical entity；NCE)登記后，雖然被淘汰的新藥候選物質(zhì)的毒性機(jī)制和靶器官尚不清楚，但據(jù)百時美施貴寶(Bristol-Myers Squibb)的1993～2006年的資料報(bào)道顯示，在非臨床階段的靶器官中，心臟和肝臟之和約為42％。對1990年之后因毒性問題而市場上被撤回的市售的醫(yī)藥品，按照臨床階段的原因分別進(jìn)行分析的實(shí)際結(jié)果為，13種(約40％)為肝毒性，11件(33％)為因QT時間(QT interval)增加所致的心臟疾病(心律失常)，這兩種原因占全部原因的73％。此外，在2004年以后，每年有1個以上的醫(yī)藥品因肝毒性而從市場被退回，不僅如此，在目前使用的醫(yī)藥品中，被美國食品及藥物管理局(FDA)發(fā)出黑框警告(black box warning，作為最高級別的警告，在醫(yī)藥品的使用方面受到限制)的醫(yī)藥品總共達(dá)515項(xiàng)品種，其中，大部分主要是因肝毒性及心臟毒性的問題而受到警告。

目前使用的醫(yī)藥品中的800種以上會誘發(fā)肝毒性，其占美國全部急性肝功能衰竭(Acute liver failure)的30％以上，占黃疸入院患者的2～20％。源自藥物的肝毒性(drug induced liver injury)是引起臨床前階段中新藥開發(fā)的中斷，臨床階段中臨床試驗(yàn)的中斷，以及市售后市場上被撤回的最主要的原因。誘發(fā)肝毒性的醫(yī)藥品有包括抗生素和抗癌劑在內(nèi)的高血壓治療劑、抗驚厥劑、高脂血癥治療劑、抗精神病醫(yī)藥品、非甾體類抗炎藥、吸入麻醉劑、糖尿病治療劑、生藥制劑等多種，最近，美國FDA及歐洲醫(yī)藥局(European Medicines Agency)也是為了使源自藥物的肝毒性最小化而努力之中。對肝毒性醫(yī)藥品的肝毒性機(jī)制進(jìn)行分析的結(jié)果為，代謝活性化占很大的比重，美國FDA于2008年2月發(fā)行了“用于檢驗(yàn)藥物代謝體的工業(yè)上的安全性的介紹”，并強(qiáng)調(diào)了對于藥物代謝體的研究在新藥開發(fā)中為重要的研究領(lǐng)域。

因肝毒性而被退回的14種藥物中的9種，附有警告書的14種藥物中的10種中報(bào)道有活性代謝體，在通常情況下，藥物所帶來的肝毒性中，與母體藥物(parent drug)引起的肝毒性相比，大部分情況是因源自母體藥物的代謝體而引起的。在誘發(fā)肝毒性的藥物代謝體的物理化學(xué)特性中，介導(dǎo)肝毒性的特征為親電子性。因此，在新藥開發(fā)的初期階段，提出了能夠探索親電子性的毒性代謝體的形成的研究方法。代謝活化會引起問題的化學(xué)結(jié)構(gòu)有，1)聯(lián)氨(hydrazine)及酰肼(hydrazide)，2)芳基乙酸(arylacetic acid)及芳基丙酸(arylpropionic acid)，3)噻吩(thiophene)、呋喃(furan)及吡咯(pyrrole)，4)苯胺(aniline)及酰苯胺(anilide)，5)醌(quinone)及醌亞胺(quinoneimine)，6)中鏈脂肪酸(medium chain fatty acid)，7)鹵代烴(halogenated hydrocarbon)及部分鹵代芳烴(halogenated aromatic)(Br>Cl>F)，8)硝基芳烴(nitroaromatic)，9)α,β-不飽和烯醇-狀結(jié)構(gòu)(α,β-unsaturated enol-like structure)，10)硫醇(thiol)或硫羰基(thiono)[噻唑烷二酮授權(quán)專利10-1334159(thiazolidinedione)及硫脲(thiourea)]及11)氨噻唑(aminothiazole)類等，具有非常多的結(jié)構(gòu)。

目前在新藥開發(fā)方面，存在多種肝毒性評價系統(tǒng)的問題。第一，可以例舉出不存在能夠預(yù)測肝毒性的特定靶標(biāo)。例如，在心臟毒性的情況下，HERG通道分析(channel assay)作為評價心臟毒性的基準(zhǔn)而被公開，并且報(bào)道有關(guān)于活體內(nèi)的效果和相關(guān)性的論文，但存在肝毒性難以以特定靶蛋白質(zhì)構(gòu)建評價系統(tǒng)的問題。

第二，動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的人肝毒性預(yù)測力微弱。例如，在國際生命科學(xué)研究所(international life sciences institute)的1999年研究結(jié)果中，在238種的新藥候選物質(zhì)中，在新藥開發(fā)過程中31個被觀察到具有肝毒性，但在動物實(shí)驗(yàn)中觀察到肝毒性的為58％，因此，在動物實(shí)驗(yàn)中肝毒性的預(yù)測力相對較低。此外，在羅納普朗克(Rhone-Roulenc Rorer)的肝毒性評價分析結(jié)果中，報(bào)道了動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床結(jié)果的差異較大。

第三，在高易感性個體中，確認(rèn)了特異體質(zhì)性肝毒性(idiosyncratic hepatotoxicity)的表達(dá)。市場上被撤回的肝毒性藥物在特征上劑量依賴性和機(jī)制不清楚，在易感性強(qiáng)的特定個體中會誘發(fā)非常嚴(yán)重的毒性(在一萬名或十萬名中約有一名)。因此，會出現(xiàn)到臨床3期為止的臨床試驗(yàn)過程或新藥上市申請(new drug application，NDA)過程中未被發(fā)現(xiàn)的問題。

第四，在經(jīng)典的動物試驗(yàn)中，在新藥開發(fā)中肝毒性的預(yù)測力不符合行業(yè)要求。因種的不同所引起的藥物代謝體樣品的定性及定量的差異會使種間肝毒性存在差異，此外，在經(jīng)典的肝毒性評價的情況下，未能預(yù)測因特異體質(zhì)性肝障礙(idiosyncratic liver injury)而從市場被退回的藥物的肝毒性。

第五，作為細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，將人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞、轉(zhuǎn)化HepG2細(xì)胞[細(xì)胞色素450P(cytochrome P450，CYP)等藥物代謝酶過表達(dá)細(xì)胞株]、永生的人肝細(xì)胞(immortalized human hepatocytes)(SV40 T抗原基因插入等)、原代肝細(xì)胞(primary hepatocytes)(人或大鼠等)等用作肝毒性預(yù)測模型，但是在臨床上的肝毒性預(yù)測方面均具有很大的限制。

對此，本發(fā)明人為了基于源自人干細(xì)胞的肝細(xì)胞而進(jìn)行免疫肝毒性檢查技術(shù)的開發(fā)，經(jīng)過努力研究的結(jié)果為，用乙醇、CCl₄及對乙酰氨基酚對由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞進(jìn)行處理，從而誘發(fā)肝毒性后，構(gòu)建分化肝細(xì)胞的免疫毒性物質(zhì)分析系統(tǒng)，以確認(rèn)所述肝細(xì)胞所分泌的介質(zhì)細(xì)胞因子、趨化因子及脂質(zhì)介質(zhì)，使用所述系統(tǒng)在誘發(fā)肝毒性的所述細(xì)胞中確認(rèn)了免疫毒性物質(zhì)。此外，通過確認(rèn)在不需要動物模型的情況下，利用與本發(fā)明的人肝細(xì)胞類似的細(xì)胞能夠評價候選藥劑等的檢查對象化合物的代謝或肝毒性，從而明確了利用所述源自人干細(xì)胞的肝細(xì)胞，能夠有效地被用作免疫肝毒性篩選方法及用于檢測肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的試劑盒，從而完成了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的問題

本發(fā)明的目的在于，涉及一種利用源自人干細(xì)胞的肝細(xì)胞的免疫肝毒性篩選方法。

本發(fā)明的另一目的在于，涉及一種利用源自人干細(xì)胞的肝細(xì)胞的免疫肝毒性篩選試劑盒。

用于解決問題的手段

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的篩選方法，所述肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的篩選方法包括以下步驟：1)用被檢測物質(zhì)處理由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞；以及2)對所述步驟1)的肝細(xì)胞的凋亡或增殖抑制水平進(jìn)行測定。

此外，本發(fā)明提供一種肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的篩選方法，所述肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的篩選方法包括以下步驟：1)用被檢測物質(zhì)處理由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞；2)收取所述步驟1)的肝細(xì)胞的培養(yǎng)液或上清液；以及3)在所述步驟2)的培養(yǎng)液或上清液中分析細(xì)胞因子、趨化因子或脂質(zhì)介質(zhì)。

此外，本發(fā)明提供一種用于檢測肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的試劑盒，其包含由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞。

此外，本發(fā)明提供一種用于檢測肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的試劑盒，其包含由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及該肝細(xì)胞分化的介質(zhì)檢測試劑。

此外，本發(fā)明提供一種用于檢測肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的試劑盒的用途，所述試劑盒包含由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞。

此外，本發(fā)明提供一種用于檢測肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的試劑盒的用途，所述試劑盒包含由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及該肝細(xì)胞分化的介質(zhì)的檢測試劑。

發(fā)明效果

本發(fā)明涉及一種利用源自人干細(xì)胞的肝細(xì)胞的免疫肝毒性篩選方法，用乙醇、CCl₄及對乙酰氨基酚對由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞進(jìn)行處理，從而誘發(fā)肝毒性后，構(gòu)建分化肝細(xì)胞的免疫毒性物質(zhì)分析系統(tǒng)，以確認(rèn)所述肝細(xì)胞所分泌的介質(zhì)細(xì)胞因子、趨化因子及脂質(zhì)介質(zhì)，由于使用所述系統(tǒng)能夠在誘發(fā)肝毒性的所述細(xì)胞中確認(rèn)免疫毒性物質(zhì)，因此，利用所述源自人干細(xì)胞的肝細(xì)胞能夠有效地被用作免疫肝毒性的篩選方法。

附圖說明

圖1為示出源自人多能胚胎干細(xì)胞的肝細(xì)胞分化的示意圖。

圖2為示出1次及2次肝毒性誘導(dǎo)的示意圖。

圖3為示出構(gòu)建免疫毒性物質(zhì)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)分析系統(tǒng)的圖。

圖4為示出根據(jù)用乙醇處理由人胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞的免疫毒性物質(zhì)ELISA分析的圖。

圖5為示出根據(jù)用CCl₄處理由人胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞的免疫毒性物質(zhì)ELISA分析的圖。

圖6為示出根據(jù)用對乙酰氨基酚處理由人胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞的免疫毒性物質(zhì)ELISA分析的圖。

具體實(shí)施方式

下面，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

本發(fā)明提供一種肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的篩選方法，所述肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的篩選方法包括以下步驟：1)用被檢測物質(zhì)處理由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞；以及2)對所述步驟1)的肝細(xì)胞的凋亡或增殖抑制水平進(jìn)行測定。

在所述方法中，步驟1)的人干細(xì)胞優(yōu)選為人胚胎干細(xì)胞，但并不限定于此。

優(yōu)選地，在所述方法中，步驟1)的分化是通過包含a)培養(yǎng)人干細(xì)胞，從而誘導(dǎo)分化的步驟；以及b)將上述分化的細(xì)胞在添加了肝細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟的方法實(shí)施的，但并不限定于此。

在所述方法中，肝毒性誘發(fā)物質(zhì)優(yōu)選選自乙醇、CCl₄及對乙酰氨基酚中的任意一種，但并不限定于此。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，本發(fā)明人為了確認(rèn)是否能夠由人胚胎干細(xì)胞向內(nèi)胚層等其它分化性系統(tǒng)細(xì)胞進(jìn)行分化，誘導(dǎo)了由人胚胎干細(xì)胞(CHA-hESC4)向作為內(nèi)胚層的肝細(xì)胞(hepatocytes)的分化。此外，為了比較用毒性物質(zhì)對上述細(xì)胞進(jìn)行處理而表現(xiàn)出的免疫毒性，采用如圖1示出的示意圖的方法，誘導(dǎo)了由人多能胚胎干細(xì)胞(CHA-hESC15)向肝細(xì)胞的分化(圖1)。將所述分化的肝細(xì)胞在肝細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，并誘導(dǎo)肝細(xì)胞的成熟，從而獲得成熟的肝細(xì)胞。

此外，肝毒性反應(yīng)由肝細(xì)胞直接與藥物及毒性物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的1次毒性反應(yīng)，以及與藥物反應(yīng)生成的代謝產(chǎn)物(metabolites)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的活化及炎癥反應(yīng)而引起的2次免疫毒性組成。為了分析免疫毒性，由于需要因肝細(xì)胞生成的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、生物活性氣體等代謝物質(zhì)的分析(參照圖2)，因此構(gòu)建了對人IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-α、IFN-β及TGF-β等8種作為炎癥性(pro-inflammatory)細(xì)胞因子系列的免疫毒性物質(zhì)的ELISA檢測。確保對于各個細(xì)胞因子的抗體和各個細(xì)胞因子，從而根據(jù)濃度檢測ELISA反應(yīng)，并確立了最優(yōu)條件(參照圖3)。

此外，為了確認(rèn)根據(jù)對由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞進(jìn)行藥物處理的免疫毒性物質(zhì)的分析，分別用不同濃度的乙醇對所述細(xì)胞進(jìn)行處理時，沒有確認(rèn)到炎癥性(pro-inflammatory)細(xì)胞因子的生成，但是確認(rèn)了在用乙醇對人肝細(xì)胞進(jìn)行處理的情況下，檢測出了一部分細(xì)胞因子。因此，以與一般毒性檢查結(jié)果類似的狀態(tài)，可以推導(dǎo)出在源自干細(xì)胞的肝細(xì)胞的情況下，未顯示出對于乙醇(ethanol)的毒性反應(yīng)(參照圖4)。

此外，為了確認(rèn)根據(jù)對由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞進(jìn)行藥物處理的免疫毒性物質(zhì)的分析，用CCl₄對由人胚胎干細(xì)胞(hESC4)分化的肝細(xì)胞進(jìn)行處理時，在上述細(xì)胞中檢測出了IL-6、IL-10及IFN-α，確認(rèn)了根據(jù)CCl₄處理濃度的不同，一般情況下得到增加。此外，用CCl₄對人肝細(xì)胞(hESC15)進(jìn)行處理時，雖然在上述細(xì)胞中也確認(rèn)了檢測出IL-6、IL-10及IFN-α，但是鑒于在培養(yǎng)上述細(xì)胞時的細(xì)胞數(shù)量低于由干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，因此，確認(rèn)了分泌的細(xì)胞因子的量在人肝細(xì)胞中顯示為高(參照圖5)。

此外，為了確認(rèn)根據(jù)對由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞進(jìn)行藥物處理的免疫毒性物質(zhì)的分析，在用對乙酰氨基酚對由人胚胎干細(xì)胞(hESC4)分化的肝細(xì)胞進(jìn)行處理時，確認(rèn)了在上述細(xì)胞中檢測出IL-6、TNF-α及IFN-β，確認(rèn)了根據(jù)對乙酰氨基酚處理濃度的不同，一般情況下得到增加。此外，在用對乙酰氨基酚對人肝細(xì)胞進(jìn)行處理時，雖然在上述細(xì)胞中也確認(rèn)了檢測出IL-6、TNF-α及IFN-β，但是鑒于在培養(yǎng)上述細(xì)胞時的細(xì)胞數(shù)量低于由干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，因此，確認(rèn)了分泌的IL-6及IFN-β細(xì)胞因子的量在人肝細(xì)胞中顯示為高，確認(rèn)了特異性地在干細(xì)胞分化肝細(xì)胞中檢測到的TNF-α細(xì)胞因子的量非常高(參照圖6)。

因此，用乙醇、CCl₄及對乙酰氨基酚對由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞進(jìn)行處理，從而誘發(fā)肝毒性后，構(gòu)建了分化肝細(xì)胞的免疫毒性物質(zhì)分析系統(tǒng)，以確認(rèn)所述肝細(xì)胞所分泌的介質(zhì)細(xì)胞因子、趨化因子及脂質(zhì)介質(zhì)，由于使用所述系統(tǒng)可以在誘發(fā)了肝毒性的所述細(xì)胞中確認(rèn)免疫毒性物質(zhì)，因此，能夠?qū)?gòu)建的免疫毒性物質(zhì)分析系統(tǒng)有效地用作利用源自人干細(xì)胞的肝細(xì)胞的免疫肝毒性篩選方法。

此外，本發(fā)明提供一種肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的篩選方法，所述肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的篩選方法包括以下步驟：1)用被檢測物質(zhì)處理由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞；2)收取所述步驟1)的肝細(xì)胞的培養(yǎng)液或上清液；以及3)在所述步驟2)的培養(yǎng)液或上清液中分析細(xì)胞因子、趨化因子或脂質(zhì)介質(zhì)。

在所述方法中，步驟1)的干細(xì)胞優(yōu)選為人胚胎干細(xì)胞，但并不限定于此。

在所述方法中，步驟3)的細(xì)胞因子優(yōu)選選自IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-α及IFN-β中的任意一種，但不限定于此。

在所述方法中，步驟3)的趨化因子優(yōu)選選自IL-8、IP-10、RANTES、MIP-1及MCP中的任意一種，但并不限定于此。

在所述方法中，步驟3)的脂質(zhì)介質(zhì)優(yōu)選選自前列腺素(prostaglandin)以及白三烯(leukotriene)中的任意一種，但并不限定于此。

在所述方法中，肝毒性誘發(fā)物質(zhì)優(yōu)選選自乙醇、CCl₄及對乙酰氨基酚中的任意一種，但并不限定于此。

本發(fā)明的免疫肝毒性篩選方法用乙醇、CCl₄及對乙酰氨基酚對由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞進(jìn)行處理，從而誘發(fā)肝毒性后，構(gòu)建分化肝細(xì)胞的免疫毒性物質(zhì)分析系統(tǒng)，以確認(rèn)所述肝細(xì)胞所分泌的介質(zhì)細(xì)胞因子、趨化因子及脂質(zhì)介質(zhì)，由于使用所述系統(tǒng)能夠在誘發(fā)肝毒性的所述細(xì)胞中確認(rèn)免疫毒性物質(zhì)，因此，能夠有效地被用作肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的篩選方法。

此外，本發(fā)明提供一種用于檢測肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的試劑盒，其包含由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞。

此外，本發(fā)明提供一種用于檢測肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的試劑盒，其包含由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及該肝細(xì)胞分化的介質(zhì)的檢測試劑。

此外，本發(fā)明提供一種用于檢測肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的試劑盒的用途，所述試劑盒包含由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞。

此外，本發(fā)明提供一種用于檢測肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的試劑盒的用途，所述試劑盒包含由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及該肝細(xì)胞分化的介質(zhì)的檢測試劑。

在所述方法中，肝毒性誘發(fā)物質(zhì)優(yōu)選選自乙醇、CCl₄及對乙酰氨基酚中的任意一種，但并不限定于此。

在所述方法中，肝分化介質(zhì)優(yōu)選選自細(xì)胞因子、趨化因子及脂質(zhì)介質(zhì)中的任意一種，但并不限定于此。

在所述方法中，介質(zhì)的檢測試劑優(yōu)選選自下述表1中所示的檢測試劑中的任意一種，但并不限定于此。

表1

本發(fā)明的免疫肝毒性篩選方法用乙醇、CCl₄及對乙酰氨基酚對由人干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞進(jìn)行處理，從而誘發(fā)肝毒性后，構(gòu)建分化肝細(xì)胞的免疫毒性物質(zhì)分析系統(tǒng)，以確認(rèn)所述肝細(xì)胞所分泌的介質(zhì)細(xì)胞因子、趨化因子及脂質(zhì)介質(zhì)，由于使用所述系統(tǒng)能夠在誘發(fā)肝毒性的所述細(xì)胞中確認(rèn)免疫毒性物質(zhì)，因此，能夠有效地被用作用于檢測肝毒性誘發(fā)物質(zhì)的試劑盒。

下面，通過實(shí)施例及實(shí)驗(yàn)例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。但是，下述實(shí)施例及實(shí)驗(yàn)例僅例示本發(fā)明而已，本發(fā)明的內(nèi)容并不被下述實(shí)施例及實(shí)驗(yàn)例所限定。

<實(shí)施例1>誘導(dǎo)由人胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化

為了確認(rèn)是否能夠由人胚胎干細(xì)胞向內(nèi)胚層等其它分化性系統(tǒng)細(xì)胞進(jìn)行分化，誘導(dǎo)了由人胚胎干細(xì)胞向內(nèi)胚層的肝細(xì)胞(hepatocytes)的分化(Cai，J.et.al，(2007)Hepatology45(5)：1229-1239.)。

具體地，hESC細(xì)胞株是用CHA-hESC4細(xì)胞株在無支持細(xì)胞的系統(tǒng)(feeder-free system)中，培養(yǎng)3天，以使其充滿(confluent)調(diào)整的培養(yǎng)基(condit ioned medium)中。培養(yǎng)后，將所述hESC細(xì)胞在含有50ng/ml的激活素A(Activin A；派普泰克公司，美國)的RPMI-1640(?？寺?Hyclone)公司，美國)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，從而誘導(dǎo)分化。然后，將所述分化的細(xì)胞在含有30ng/ml的成纖維細(xì)胞生長因子4(fibroblast growth factor4，F(xiàn)GF4；派普泰克公司)及20ng/ml的骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2；派普泰克公司)的肝細(xì)胞培養(yǎng)基(hepatocyte culture medium，HCM；龍沙(Lonza)公司，美國)中培養(yǎng)5天后，在添加了20ng/ml的肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF；派普泰克公司)的肝細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)5天，從而誘導(dǎo)了由hESC向肝細(xì)胞的分化。將所述分化的肝細(xì)胞在添加了10ng/ml的制瘤素M(oncostatin M，OSM；R&D系統(tǒng)公司，美國)及0.1μM的地塞米松(dexamethasone，Dex；西格瑪奧德里奇公司，美國)的肝細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，并誘導(dǎo)肝細(xì)胞的成熟(Maturation)，從而獲得成熟的肝細(xì)胞。

<實(shí)施例2>誘導(dǎo)由人多能胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化

為了誘導(dǎo)源自人多能胚胎干細(xì)胞的肝細(xì)胞的分化，實(shí)施了以下方法。

具體地，采用如圖1中所示的方法，hESC細(xì)胞株為CHA-hESC15細(xì)胞株在無支持細(xì)胞的系統(tǒng)(feeder-free system)中，培養(yǎng)3天，以使其充滿(confluent)調(diào)整的培養(yǎng)基(condit ioned medium)中。培養(yǎng)后，采用與上述<實(shí)施例1>相同的方法進(jìn)行培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞的成熟(Maturation)，從而獲得成熟的肝細(xì)胞(圖1)。

<實(shí)施例3>構(gòu)建分化的肝細(xì)胞的免疫毒性物質(zhì)分析系統(tǒng)

肝毒性反應(yīng)由肝細(xì)胞直接與藥物及毒性物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的1次毒性反應(yīng)，以及與藥物反應(yīng)生成的代謝產(chǎn)物(metabolites)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的活化及炎癥反應(yīng)而引起的2次免疫毒性組成。為了分析免疫毒性，由于需要因肝細(xì)胞生成的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、生物活性氣體等的代謝物質(zhì)的分析(圖2)，因此通過實(shí)施下述方法構(gòu)建了炎癥性(pro-inflammatory)細(xì)胞因子系列的免疫毒性物質(zhì)分析系統(tǒng)。

具體地，將采用上述<實(shí)施例1>中記載的方法制備的由人干細(xì)胞分化第19天的肝細(xì)胞以每孔90％的濃度分株到6-孔板上，然后，使用1000mg/L的DMEM-低葡萄糖(low glucose)培養(yǎng)液(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，制備公司威健(Welgene)第001-11)進(jìn)行替換后，培養(yǎng)2小時。然后，獲得了所述源自干細(xì)胞的肝細(xì)胞培養(yǎng)液。為了去除上述細(xì)胞的副產(chǎn)物，以12000xg、20分鐘及4℃的條件實(shí)施離心分離后，獲得了上清液。然后，將作為捕獲抗體(capture antibody)的2.5μg/ml的抗-IL-1β抗體、2μg/ml的抗-IL-6抗體、2.5μg/ml的抗-IL-10抗體、2μg/ml的抗-IL-12抗體、1μg/ml的抗-TNF-α抗體、2μg/ml的抗-IFN-α抗體、1μg/ml的抗-IFN-β抗體及2μg/ml的抗-TGF-β抗體在37℃下培養(yǎng)2小時，并涂布到96孔ELISA板上，清洗后利用0.2％的I-封阻(I-block)(福斯特城，加利福尼亞州)在37℃下封阻了(blocking)2小時。對上述經(jīng)過封阻的捕獲抗體進(jìn)行清洗后，將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(標(biāo)準(zhǔn)，在未結(jié)合蛋白質(zhì)的柔性板(flexible plate)上從10ng/ml的濃度開始，實(shí)施2倍稀釋(fold serial)至4.88pg/ml，以完成準(zhǔn)備)和上清液分株到ELISA板(格雷內(nèi)爾(Greiner)，克雷姆斯明斯特(Kremsmunster)，奧地利)上，在37℃下培養(yǎng)2小時。培養(yǎng)后，添加生物素化(biotinylation)的檢測抗體(抗-IL-1β抗體：2μg/ml、抗-IL-6抗體：1μg/ml、抗-IL-10抗體：1μg/ml、抗-IL-12抗體：1μg/ml、抗-TNF-α抗體：1μg/ml、抗-IFN-α抗體:4μg/ml、抗-IFN-β抗體：2μg/ml、抗-TGF-β抗體：1μg/ml,最終濃度(final concent rat ion))，在37℃下培養(yǎng)2小時。培養(yǎng)后，在常溫下培養(yǎng)結(jié)合了堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)的鏈霉親和素(streptavidin)30分鐘，添加5mM的硝基苯基磷酸物質(zhì)(nitrophenyl phosphate substrate)，在405nm的波長下利用酶標(biāo)儀進(jìn)行了測定。

其結(jié)果如圖3中所示，構(gòu)建了對于人IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-α/β及TGF-β等8種的作為炎癥性(proinf lammatory)細(xì)胞因子系列的免疫毒性物質(zhì)的ELISA檢查。確保對于各個細(xì)胞因子的抗體和各個細(xì)胞因子，從而根據(jù)濃度檢查了ELISA反應(yīng)，并確立了最優(yōu)條件。此外，為了證明ELISA技術(shù)方法構(gòu)建，分析了各個細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線(standard curve)，并確認(rèn)了所有的R²值均得出為0.9以上(圖3)。

<實(shí)施例4>根據(jù)對分化的肝細(xì)胞進(jìn)行藥物處理的免疫毒性物質(zhì)的分析

<4-1>根據(jù)使用乙醇(ethanol)進(jìn)行處理的免疫毒性物質(zhì)的確認(rèn)

為了通過上述<實(shí)施例1>中記載的方法對由人胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞進(jìn)行了分化誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行藥物處理并分析免疫毒性物質(zhì)，實(shí)施了下述方法。

將采用上述<實(shí)施例1>中記載的方法進(jìn)行培養(yǎng)而分化第19天的肝細(xì)胞以每孔90％的濃度分株到6-孔板上，然后，使用1000mg/L的DMEM-低葡萄糖(low glucose)培養(yǎng)液(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，制備公司威健(Welgene)第001-11)進(jìn)行替換后，培養(yǎng)了2小時。分別用不同濃度的0、100及200mM的乙醇(默克(Merk)，第100983)對上述培養(yǎng)的細(xì)胞處理24小時。為了用乙醇對源自干細(xì)胞的肝細(xì)胞和人肝細(xì)胞進(jìn)行處理，并比較炎癥性(pro-inflammatory)細(xì)胞因子的生成，對采用上述<實(shí)施例2>中記載的方法進(jìn)行培養(yǎng)的人肝細(xì)胞分別用不同濃度的0、100及200mM的乙醇(默克，第100983)處理了24小時。然后，為了提取免疫毒性物質(zhì)，獲得了所述源自干細(xì)胞的肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞培養(yǎng)液。為了去除上述細(xì)胞的副產(chǎn)物，以12000xg、20分鐘及4℃的條件實(shí)施離心分離后，獲得了上清液。利用上述<實(shí)施例3>中記載的方法所構(gòu)建的細(xì)胞因子ELISA分析系統(tǒng)，實(shí)施了根據(jù)乙醇處理的分化肝細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌性能分析。

其結(jié)果如圖4中所示，對由人干細(xì)胞(hESC4)向肝細(xì)胞實(shí)施了分化誘導(dǎo)的細(xì)胞分別用濃度不同的乙醇進(jìn)行處理時，沒有確認(rèn)到炎癥性(pro-inflammatory)細(xì)胞因子的生成，但是確認(rèn)了在用乙醇對利用<實(shí)施例2>中記載的方法培養(yǎng)的人肝細(xì)胞進(jìn)行處理的情況下，檢測出了一部分細(xì)胞因子。因此，以與一般毒性檢查結(jié)果類似的狀態(tài)，可以推導(dǎo)出在源自干細(xì)胞的肝細(xì)胞的情況下，未顯示出對于乙醇(ethanol)的毒性反應(yīng)(圖4)。

<4-2>根據(jù)使用CCl₄進(jìn)行處理的免疫毒性物質(zhì)的確認(rèn)

為了對通過上述<實(shí)施例1>中記載的方法由人胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞進(jìn)行了分化誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，并分析免疫毒性物質(zhì)，實(shí)施了下述方法。

具體地，制備CCl₄(四氯化碳和二甲基亞砜(DMSO)以1:1混合的儲存液(stock)，西格瑪?shù)?19961號)，并分別用不同的濃度的0、5、10及20mM的上述CCl₄對采用上述<實(shí)施例1>中記載的方法由人胚胎干細(xì)胞(hESC4)分化的肝細(xì)胞處理了24小時。為了用CCl₄對源自人胚胎干細(xì)胞的肝細(xì)胞和人肝細(xì)胞進(jìn)行處理，并比較炎癥性(pro-inflammatory)細(xì)胞因子生成，對采用上述<實(shí)施例2>中記載的方法進(jìn)行培養(yǎng)的人肝細(xì)胞分別用不同濃度的0、5、10及20mM的CCl₄(西格瑪，第319961號)處理了24小時。然后，為了提取免疫毒性物質(zhì)，獲得了所述源自干細(xì)胞的肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞培養(yǎng)液。為了去除上述細(xì)胞的副產(chǎn)物，以12000xg、20分鐘及4℃的條件實(shí)施離心分離后，獲得了上清液。利用上述<實(shí)施例3>中記載的方法所構(gòu)建的細(xì)胞因子ELISA分析系統(tǒng)，實(shí)施了根據(jù)乙醇處理的分化肝細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌性能分析。

其結(jié)果如圖5中所示，用CCl₄對由人干細(xì)胞(hESC4)分化的肝細(xì)胞進(jìn)行處理時，在上述細(xì)胞中檢測出了IL-6、IL-10及IFN-α，確認(rèn)了根據(jù)CCl₄處理濃度的不同，一般情況下得到增加。此外，用CCl₄對人肝細(xì)胞(hESC15)進(jìn)行處理時，雖然在上述細(xì)胞中也確認(rèn)了檢測出IL-6、IL-10及IFN-α，但是鑒于在培養(yǎng)上述細(xì)胞時的細(xì)胞數(shù)量低于由干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，因此，確認(rèn)了分泌的細(xì)胞因子的量在人肝細(xì)胞中顯示為高(圖5)。

<4-3>根據(jù)使用對乙酰氨基酚(Acetoaminophen)進(jìn)行處理的免疫毒性物質(zhì)的確認(rèn)

為了對通過上述<實(shí)施例1>中記載的方法由人胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞進(jìn)行了分化誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，并分析免疫毒性物質(zhì)，實(shí)施了下述方法。

具體地，將1.75M的對乙酰氨基酚(Acetoaminophen，西格瑪，第A5000號)溶解到DMSO之后，并以0、10及20mM的濃度對采用上述<實(shí)施例1>中記載的方法由人胚胎干細(xì)胞(hESC4)分化的肝細(xì)胞處理了24小時。為了用對乙酰氨基酚對源自人胚胎干細(xì)胞的肝細(xì)胞和人肝細(xì)胞進(jìn)行處理，并比較炎癥性(pro-inflammatory)細(xì)胞因子生成，對采用上述<實(shí)施例2>中記載的方法進(jìn)行培養(yǎng)的人肝細(xì)胞(hES15)分別用不同濃度的0、10及20mM的對乙酰氨基酚處理了24小時。然后，為了提取免疫毒性物質(zhì)，獲得了所述源自干細(xì)胞的肝細(xì)胞及人肝細(xì)胞培養(yǎng)液。為了去除上述細(xì)胞的副產(chǎn)物，以12000xg、20分鐘及4℃的條件實(shí)施離心分離后，獲得了上清液。利用上述<實(shí)施例3>中記載的方法所構(gòu)建的細(xì)胞因子ELISA分析系統(tǒng)，實(shí)施了根據(jù)乙醇處理的分化肝細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌性能分析。

其結(jié)果如圖6中所示，用對乙酰氨基酚對由人干細(xì)胞(hESC4)分化的肝細(xì)胞進(jìn)行處理時，確認(rèn)了在上述細(xì)胞中檢測出IL-6、TNF-α及IFN-β，確認(rèn)了根據(jù)對乙酰氨基酚處理濃度的不同，一般情況下得到增加。此外，確認(rèn)了用對乙酰氨基酚對人肝細(xì)胞(hES15)進(jìn)行處理時，雖然在上述細(xì)胞中也確認(rèn)了檢測出IL-6、TNF-α及IFN-β，但是鑒于在培養(yǎng)上述細(xì)胞時的細(xì)胞數(shù)量低于由干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，因此，確認(rèn)了分泌的IL-6及IFN-β細(xì)胞因子的量在人肝細(xì)胞中顯示為高，確認(rèn)了特異性地在干細(xì)胞分化肝細(xì)胞中檢測到的TNF-α細(xì)胞因子的量非常高(圖6)。