本申請要求于2014年3月11日提交的美國臨時申請?zhí)?1/951,051的權益和優(yōu)先權，其內容據此通過引用并入本文中。

技術領域

本發(fā)明涉及從獲得自血液樣本的造血細胞誘導多能干細胞的方法。

背景技術：

誘導性多能干細胞(iPSC)是替代胚胎干細胞用于治療疾病、發(fā)育階段的研究和檢測疾病機制的干細胞的重要來源。由于涉及使用人胚胎的倫理問題，當研究人細胞和疾病機制和治療時是尤其重要的。

最初通過在真皮成纖維細胞中過表達數個轉錄因子生成人iPSC(hiPSC)(Takahashi等人，2007；Yu等人，2007，Park等人，2008)。如同人胚胎干細胞(hESC)，hiPSC能夠分化為功能性細胞譜系，因此對于疾病模型、藥物篩選和未來的治療醫(yī)學具有巨大的潛力(Kondo等人，2013；Park等人，2008)。

近期的研究使用人尿液樣本用于上皮樣細胞的衍生，所述上皮樣細胞能夠重建(reprogrammed)多能性(Zhou等人，2011)。這種方法提供了能夠方便且無創(chuàng)收集的無限制的細胞來源。盡管如此，這種方法需要收集大體積的尿液樣本，導致下游存儲和運輸的物流困難(Xue等人，2013)。

血液由于它的豐富性(abundance)和可及性(accessibility)被認為是用于重建的細胞的理想來源。來自動員(mobilized)、骨髓和臍帶血液的血液祖細胞非常適合于重建(Loh等人，2009；Ye等人，2009；Giorgetti等人，2009；Haase等人，2009)。然而，細胞因子誘導的動員可以導致副作用(Sohn等人，2002)，收集骨髓是有創(chuàng)的，且臍帶血液限于在出生時存儲了樣本的個體。

相比之下，外周血T細胞很容易從供體獲得并高效率重建(Loh等人，2010；Seki等人，2010；Staerk等人，2010)。然而，T細胞衍生的hiPSC在T細胞受體(TCR)基因座上攜帶已存在的V(D)J重排，且尚不清楚這些hiPSC是否能正常地分化或是否這種細胞證實了發(fā)展為T細胞淋巴瘤的趨勢(Serwold等人，2007)。

近期研究報告了在外周血中的非T細胞群的重建。在這些研究中重建效率通常較低，迫使在重建規(guī)程中添加更多的因子(在一些情況中5至7種因子，包括SV40LT、TP53shRNA)(Chou等人，2011；Mack等人，2011；Okita等人，2013)。

技術實現要素：

本發(fā)明涉及從小體積的外周血獲得iPSC的方法。

由于典型用于使血液樣本分離成不同的成分的多糖制劑的排除，所述方法僅需要小的血液體積，例如僅僅10μl的血液。

因此，血液樣本可以通過手指刺破(finger-prick)獲得。手指刺破樣本很容易地且方便地收集，包括通過受試者在家中或在其它非實驗室環(huán)境，不需要經訓練的抽血者。

使用仙臺病毒將多能性蛋白因子轉染CD71+細胞能夠提供iPSC，所述iPSC無轉基因且不含有基因組重排。

所述方法可以在擴增的手指刺破血液細胞群中提供誘導多能性的有效比率。例如使用該方法，手指刺破衍生的hiPSC從人外周血以極高的效率生成(100至600克隆/mL的血液)。

易于獲得血液樣本和誘導多能性的有效比率可以允許開發(fā)來自大群供體的國際hiPSC庫。

在一個方面，提供了一種在造血細胞中誘導多能性的方法，所述方法包括：在不存在任何用于分離血液成分的多糖制劑時，提供收集自受試者的血液樣本；在不存在任何用于分離血液成分的多糖制劑時，使用低滲的紅細胞裂解緩沖液處理樣本，耗盡樣本的紅細胞，以獲得剩余細胞群；在造血擴增介質中擴增在樣本中的剩余細胞群，以獲得含有CD71+細胞的擴增細胞群；以及在人胚胎干細胞介質中，在存在Oct4、Sox2和Klf4以及任選地c-MYC時，培養(yǎng)擴增細胞群，以誘導多能性。

樣本在所述方法中使用前，在約3℃至約5℃的溫度或在冰上可以存儲長達約48小時。

血液樣本的體積可以是約250μl或更少的，包括例如從約10μl至約20μl。

在另一個方面，提供了一種在造血細胞中誘導多能性的方法，所述方法包括：在不存在任何用于分離血液成分的多糖制劑時，提供收集自受試者的血液樣本；所述血液樣本具有從約10μl至約20μl的體積，且在成為樣本之前在非實驗室環(huán)境中，由受試者通過手指刺破收集，所述樣本在約3℃至約5℃的溫度或在冰上存儲可長達約48小時；在不存在任何用于分離血液成分的多糖制劑時，使用低滲的紅細胞裂解緩沖液處理樣本，耗盡樣本的紅細胞，以獲得剩余細胞群；在造血擴增介質中擴增在樣本的中剩余細胞群，以獲得含有CD71+細胞的擴增細胞群；以及在人胚胎干細胞介質中，在存在Oct4、Sox2和Klf4以及任選地c-MYC時，培養(yǎng)擴增細胞群，以誘導多能性。

如在本文中描述的，造血細胞可以是非人造血細胞，或者可以是人造血細胞。

所述低滲裂解緩沖液可以包含氯化銨。

擴增在樣本中的剩余細胞群可以在無血清造血擴增介質中進行。同樣地，擴增可以在約12至約16天的時間發(fā)生。

在培養(yǎng)以便誘導多能性之前，產生的擴增的細胞群可以包含約20 000個或更多的細胞。在培養(yǎng)以便誘導多能性之前，擴增的細胞群包含約50％或更多的CD71+細胞。

可以在存在或不存在飼養(yǎng)細胞時進行培養(yǎng)以便誘導多能性。在一些實施方案中，在培養(yǎng)期間，Oct4、Sox2和Klf4以及任選地c-MYC可以包括在人胚胎干細胞介質中。在一些實施方案中，在培養(yǎng)期間，擴增細胞群可以使用一種或多種編碼Oct4、Sox2和Klf4以及任選地c-MYC的核酸載體轉染或轉導。例如，一種或多種核酸載體可以是病毒載體、附加體載體、微環(huán)載體或合成的mRNA?？梢允褂玫牟《据d體包括腺病毒載體、桿狀病毒載體或仙臺病毒載體。在一些實施方案中，使用仙臺病毒載體轉導擴增的細胞群，以及例如可以將擴增的細胞群暴露于一種或多種仙臺病毒載體超過約24小時的時間，包括例如針對一種或多種仙臺病毒的每種，按照約10的MOI。

一旦獲得，產生的誘導性多能細胞可以存儲在細胞庫或文庫。

此外，在耗盡前，可以保留起初收集的血液樣本的一部分用于表征，例如DNA測序和/或血液血清分型。

在另一個方面，提供了一種試劑盒，其用于收集在造血細胞中誘導多能性中使用的手指刺破血液樣本，所述試劑盒包含手指刺破裝置、收集管、保溫箱(thermo-box)和收集血液樣本的說明。試劑盒還可以包含運輸箱或包裝用于收集后遞送樣本，和/或一種或多種血液分析試驗。

結合所附附圖，在綜述本發(fā)明的具體實施方案的下列描述后，對于本領域普通技術人員來說，本發(fā)明的其它方面和特征將變得明顯。

附圖說明

在附圖中只通過示例說明本發(fā)明的實施方案，附圖如下：

圖1.從手指刺破血液樣本衍生hiPSC。(A)重建人手指刺破血液所使用的策略的示意圖。(B)表達多能性標記物TRA-1-60、SSEA4和OCT4的FPiPSC克隆的免疫熒光染色。(C)對在FPiPSC和它們的親本細胞中的OCT4和NANOG的啟動子進行亞硫酸氫鹽DNA甲基化分析。(D)顯示hESC、hiPSC和親本血液細胞的全表達譜的無監(jiān)督層次聚類的系統(tǒng)樹圖(上部)。hESC、hiPSC和親本血液細胞多能性和造血特異性標記物基因的表達的熱圖分析(下部)。(E)與親本細胞(左側)和H7人ESC(右側)比較的FPiPSC全基因表達譜的散點圖。(F)qRT-PCR分析在FPiPSC、H7ESC和親本細胞中，ESC標記物基因OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、DNMT3B、REX1、KLF4和c-MYC的表達。

圖2.FPiPSC分化成三種胚層的衍生物。(A)FPiPSC在體外分化后，分化標記物的免疫熒光染色。(B)hiPSC衍生的心肌細胞(cardiomyocyctes)中的α輔肌動蛋白、β肌球蛋白重鏈(β-MHC)和肌聯蛋白的免疫熒光染色。(C)hiPSC衍生的心肌細胞膜片鉗分析。(D)衍生自注射有FPiPSC的免疫缺陷小鼠的畸胎瘤的蘇木精和伊紅染色。

圖3.FPiPSC的表征。(A)衍生的FPiPSC系的轉基因表達分析。(B)FPiPSC的細胞遺傳學分析。(C)FPiPSC克隆的IgH重排分析。(D)FPiPSC克隆的TCRB重排分析。(E)FPiPSC克隆的TCRG重排分析。(F)對在該V(D)J重排分析中使用的樣本進行基因組DNA擴增對照實驗。

圖4.FPiPSC生成的自己動手的(DIY)概念。(A)細胞培養(yǎng)前12小時、24小時和48小時收集的FP血液樣本。(B)衍生自供體1的DIY FP血液(12小時和24小時)的hiPSC克隆對多能性標記物TRA-1-60染色呈陽性。(C)衍生自供體5的DIY FP血液(24小時和48小時)的hiPSC克隆對多能性標記物TRA-1-60染色呈陽性。(D)qRT-PCR分析在FP(DIY)iPSC、H1ESC和親本細胞中的ESC標記物基因OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、DNMT3B、REX1和c-MYC的表達。(E)DNA指紋分析確認FPiPS細胞系衍生自它們的親本系。(F)衍生自供體的hiPSC的總結。

圖5.手指刺破樣本的血液定型和DNA基因型。(A)從手指刺破樣本進行供體的血液分型。(B)手指刺破血液和衍生的hiPSC的供體血型的基因分型。(C)手指刺破樣本和衍生的hiPSC的恒河猴D抗原基因分型。(D)來自DIY手指刺破血液衍生的hiPSC的供體血型的基因分型。(E)DIY手指刺破樣本衍生的hiPSC的恒河猴D抗原基因分型。(F)ALDH2基因座上的SNP。(G)對供體的乙醇膜片試驗。(H)在體內乙醇降解的代謝通路和ALDH2相關的基因型/表型。

圖6.靜脈穿刺(VP)血液衍生的hiPSC。(A)VP血液重建的時間軸的示意圖。(B)在VPiPSC上多能性標記物的免疫熒光染色。(C)VPiPSC上的多能性基因表達分析。檢測的多能性基因列于附圖的上側。(D)在4次傳代后VPiPSC系的轉基因表達分析。

圖7.VPiPSC的表征。(A)在VPiPSC中OCT4和NANOG的啟動子的DNA甲基化分析。白色和黑色圓圈分別代表在啟動子區(qū)域未甲基化和甲基化的CpG島。(B)在體外分化的VPiPSC的中胚層標記物、肌間線蛋白和SMA的免疫熒光染色。(C)在體外分化VPiPSC后分化標記物的免疫熒光染色。由GFAP抗體染色外胚層。

圖8.FP血液細胞的分選和擴增。(A)FP血液的收集。以順序方式(I至IV)顯示附圖。(B)FP血液的RBC耗盡。(C)來自5至12天的純化的FP血液細胞的圖片。所有圖片使用20x物鏡獲得。(D)在培養(yǎng)的具體的天(第0、8、15天)通過流式細胞術分析細胞以確定細胞表面的免疫表型。具有細胞表面免疫表型CD3(+)、CD19(+)、CD34(+)或CD71(+)的細胞的百分比總結并展示在表中。

圖9.衍生的VPiPSC的V(D)J重排。(A)、(B)和(C)顯示對衍生的VPiPSC進行的IgH、TCRB和TCRG重排分析。(D)分析中所使用的VPiPSC基因組DNA的擴增對照。在所有附圖中，期望的PCR產物范圍在凝膠圖片的左側示出，靶標區(qū)域在凝膠圖片的下部示出。

圖10.衍生的FP(DIY)iPSC的V(D)J重排。(A)、(B)和(C)顯示對衍生的FP(DIY)iPSC進行的IgH、TCRB和TCRG重排分析。(D)在該分析中使用的FP(DIY)iPSC基因組DNA的擴增對照。

圖11.DIY手指刺破血液和衍生的iPSC的血液定型和DNA基因分型。(A)從DIY手指刺破樣本進行供體5血型的基因分型。(B)供體5DIY手指刺破樣本的恒河猴D抗原基因分型。(C)在分析前24小時和48小時獲得的供體1DIY手指刺破樣本的血液分型。(D)來自DIY手指刺破血液衍生的hiPSC的供體血型的基因分型。

圖12.衍生的hiPSC上ALDH2、ADH2和ADH3的基因分型。(A)和(B)顯示供體1和供體2的FP血液(A)以及它們各自的hiPSC(B)的ALDH2測序比對結果。(C)供體1上的乙醇膜片試驗。將咖啡因、70％乙醇、水和空白膜片應用到供體1的皮膚(0分鐘)。在10分鐘后，如白色箭頭指示的，應用70％乙醇的區(qū)域顯示泛紅反應。(D)FPiPSC上ADH2、ADH3和ALDH2基因分型的總結。

圖13.含有表1：iPSC克隆的指紋分析數據。

圖14.含有表2：對iPSC克隆進行的表征的總結。

圖15.hiPSC庫的整合策略示意描述。使用本發(fā)明衍生hiPSC的方法的hiPSC庫的整合策略的圖示。

具體實施方式

在本文中所描述的方法涉及收集含有非T細胞并能夠重建成多能細胞的外周血細胞的血液樣本。所述樣本在無多糖添加劑或制劑比如親水性多糖的條件下收集，典型地，所述親水性多糖被添加至收集的血液樣本中以幫助在樣本中血液成分的離心分離。使用低滲紅細胞裂解緩沖液處理樣本，以去除紅細胞，之后擴增細胞以及重建以獲得iPSC。由于在收集條件下不存在多糖制劑，以及由于使用紅細胞裂解緩沖液，可以使用很小體積的血液來重建，包括僅僅約10μl的血液體積。

在開發(fā)本文中描述的方法之前，以前的研究報告了在外周血中的非T細胞群的重建。然而在這些研究中重建效率通常較低，迫使在重建規(guī)程中添加更多的因子(在一些情況中5至7種因子，包括SV40LT、TP53shRNA)(Chou等人，2011；Mack等人，2011；Okita等人，2013)。

至今，所有描述的用于外周血細胞重建的研究需要大量的起始材料(約10mL)，這由有經驗的抽血者通過進行靜脈穿刺獲得。這種需求使得樣本收集、運輸和存儲不方便。此外，如果待收集的樣本用于納入hiPSC庫中，將需要樣本的大規(guī)模收集，且以前描述的收集和重建方法限制招募大批潛在的供體。兩項研究描述了從相對小的體積的外周血生成hiPSC；然而，在這些研究中，仍需要2mL至6mL的外周血，以便純化足夠的CD34+細胞用于重建(Merling等人，2013；Ye等人，2013)。

因此，在一個方面，提供了一種在造血細胞中誘導多能性的方法。在體外對以本文中描述的方式從患者收集的外周血液樣本獲得的細胞進行該方法。

在造血細胞中誘導多能性指使非多能的造血細胞改變成多能細胞。如本文中所使用的，iPSC是從非多能起源細胞經誘導成多能狀態(tài)的多能干細胞，例如部分或者完全分化的細胞，通過暴露于合適的條件和轉錄因子或者其它在多能細胞中調節(jié)基因的表達譜的蛋白因子，從而能夠被誘導成為多能。因此，iPSC是一種多能細胞，其衍生自非多能起源細胞，并且不是一種胚胎干細胞。

因此，iPSC是完全未分化的細胞，且可能分化成任何細胞類型，例如來自三個胚層(中胚層、內胚層和外胚層)之一的細胞，還例如任何特定譜系的部分分化或完全分化的細胞，例如骨細胞、神經細胞、皮膚細胞、肌肉細胞或任何部分分化的這些細胞類型的前體細胞。iPSC可以通過其多能性標記物的表達來鑒定，例如OCT4、TRA-1-60、SSEA-4、SOX2、KLF4、c-MYC、REX1、NANOG、LIN28和DNMT3B的一種或多種的表達。

收集的血液樣本是外周血樣本，意思是收集自循環(huán)血液，且含有循環(huán)血液細胞，包括紅細胞、白細胞和血小板，以及循環(huán)造血細胞。如本文中所使用的，提及的造血細胞是指血液前體細胞，其能夠分化成為多種類型的紅細胞，且典型地表達CD71細胞表面標記物。

除非另有說明，在上下文允許時，如本文中所使用的術語“細胞”指且包括單細胞、多細胞或細胞群。相似地，除非另有說明，在上下文允許時，提及的細胞還包括提及的單細胞。

造血細胞或細胞可以是在從受試者提取前的體內環(huán)境中，或者可以是在體外環(huán)境中，包括例如包含在提取的樣本中，或者可以包含在培養(yǎng)物中，包括分批培養(yǎng)或在組織培養(yǎng)板中，以及可以在懸浮液中或者可以附著在培養(yǎng)支持物表面。

相似地，一旦誘導成為多能，iPSC可以在體外以及可以包含在培養(yǎng)物中，包括分批培養(yǎng)或在組織培養(yǎng)板中，以及可以在懸浮液中或者可以附著在培養(yǎng)支持物表面。

待收集血液的受試者可以是任何動物，包括任何哺乳動物，包括非人哺乳動物或人。在一些實施方案中，受試者是人受試者。

所述方法包括在不存在任何比如當在實驗室環(huán)境中收集血液時典型使用的多糖制劑時，使用收集自受試者的血液樣本。

因此，在該方法中使用的血液樣本以無多糖制劑的方式收集，典型地所述多糖制劑包括在收集的血液樣本中以幫助分離血液成分。當收集血液樣本時，典型的實驗室實踐是提取數毫升的血液，例如約10至20ml，在已經含有多糖制劑的管中收集提取的血液，或者在收集之后隨后添加多糖制劑至管中，接著梯度離心以將不同的血液成分分離成層。血液收集和分離典型使用的多糖制劑是市售獲得的。這種多糖制劑趨向含有親水性多糖，例如肝素或分支多糖FICOLL^TM。

因此，如本文中所使用的，提及的無多糖制劑的血液樣本，或者在不存在多糖制劑時收集的血液樣本，是指已經被收集的血液樣本，從而無多糖制劑存在于收集容器中，以及沒有多糖制劑被隨后添加到收集的樣本中，以幫助分離或分選血液成分。

在該方法中使用的血液樣本的體積是小的，且因此收集的樣本是小的，例如少于約250μl，或者從約10μl至約250μl的體積，或者落在該范圍的任何體積。在該方法中可以使用僅僅10μl來生成iPSC，且因此在一些實施方案中，收集的樣本可以從約10μl至約20μl的體積，例如典型的血滴的體積。

盡管在不存在任何多糖制劑時收集血液，但可以在存在抗凝劑比如EDTA時收集血液?？鼓齽┛梢砸呀洿嬖谟谔砑友旱娜萜骰蚬苤?，或者可以在添加了血液之后不久隨后添加到容器中。

如果使用抗凝劑，應基于待收集的血液樣本的體積添加足夠的抗凝劑，以便防止血液在該方法中使用前凝結，但是不能太多以至于導致細胞裂解或致使任何造血細胞不存活。

因為收集小體積的血液，不需要由經訓練的抽血者通過注射器抽取血液。因此，樣本可以通過刺破受試者的手指肚(pad)或拇指收集，或者任何手或足的下側(underside)的其它位置，因為這種刺破疼痛相對較低，且血液容易捕獲在管中或其它收集容器中。因為注射器抽取不是必需的，樣本不需要在實驗室環(huán)境中收集，并且在一些實施方案中，可以由受試者方便地收集。

一旦收集，血液樣本可以直接在該方法中使用?？蛇x擇地，在該方法中使用前，血液樣本可以存儲在冰上、或者可以在約3℃至約5℃或約4℃的溫度冷藏。因此，樣本可以存儲在冰上不超過約8小時、不超過約12小時、不超過約16小時、不超過約20小時、不超過約24小時、不超過約28小時、不超過約32小時、不超過約36小時、不超過約40小時、不超過約44小時或不超過約48小時。如果樣本將存儲超過48小時，則該樣本使用液氮冷凍并保存用于將來使用。

使用低滲紅細胞裂解緩沖液處理收集的無任何多糖制劑的血液樣本，以耗盡樣本的紅細胞。這種裂解緩沖液是已知的，并且可以含有例如低滲裂解緩沖液可以含有氯化銨。

例如，血液樣本可以與約10至約20份(parts)的低滲紅細胞裂解緩沖液混合。然后離心經處理的樣本以便從裂解的紅細胞去除細胞碎片。

使用低滲紅細胞裂解緩沖液處理也在不存在任何多糖制劑時進行。因此，產生的經處理的樣本仍然無任何多糖制劑，且已經耗盡了紅細胞，留下包括造血細胞的剩余細胞群。

然后擴增含有造血細胞的剩余細胞群，以增加總的造血細胞群。如前所述，造血細胞可以包括CD71+細胞，因此擴增剩余細胞群以獲得含有CD71+細胞的擴增的細胞群。

使用造血擴增介質進行在剩余細胞群中的造血細胞的細胞擴增。這種技術是已知的，且擴增介質是市售可獲得的。例如，可以使用StemSpan^TM(Stemcell Technologies)。

擴增介質可以含有擴增包含在樣本的剩余細胞群中的剩余細胞群(優(yōu)選無進一步分化的細胞群)所必需的其它因子和補充劑。例如，擴增介質可以補充有氨基酸、抗氧化劑或生長因子。同樣地，介質可以補充有抗生素或其它防止微生物污染的成分。

在一些實施方案中，擴增介質可以是無血清的，且因此剩余細胞群的擴增可以在不存在血清包括人或非人血清時完成。

例如，在一些實施方案中，使用的造血擴增介質可以是StemSpan^TM無血清擴增介質(09650,Stemcell Technologies)，其補充有1X青霉素/鏈霉素(Gibco)、1X L-谷氨酰胺(Gibco)、1X NEAA(Gibco)、50μg/mL L-抗壞血酸(Sigma)、50ng/mL干細胞因子(Peprotech)、10ng/mL白介素-3(Peprotech)、40ng/mL胰島素樣生長因子-1(Peprotech)、2U/mL紅細胞生成素(R&D Systems)、1μM地塞米松(Sigma)、含有或不含有10ng/mL的白介素-6(Peprotech)。

剩余細胞群可以經歷擴增以獲得足夠的細胞數量，以允許有效的誘導多能性。例如，可以擴增含有包括CD71+細胞的造血細胞的剩余細胞群，以獲得約20 000個或更多的細胞、約20 000至約30 000個細胞的總細胞群。

取決于使用的生長條件和使用的擴增介質，以及用作受試者的動物類型，擴增剩余細胞群的時間長度可以變化。在一些實施方案中，剩余細胞群可以經歷不超過16天的時間的擴增，例如從約12天至約16天。

在擴增時期結束時，獲得擴增的細胞群。存在于擴增的細胞群中的CD71+細胞的比例可以是至少一半，以提高誘導多能性的效率。例如在擴增時期完成時，擴增的細胞群可以含有約50％或更多的CD71+細胞，約75％或更多的CD71+細胞、約80％或更多的CD71+細胞、約85％或更多的CD71+細胞、約90％或更多的CD71+細胞、約95％或更多的CD71+細胞或約98％或更多的CD71+細胞。

然后將含有CD71+細胞的擴增細胞群誘導成多能。

誘導多能性的方法是已知的，例如在Takahashi和Yamanaka(2006)Cell126:663-676中描述的。

通過在胚胎細胞介質中，在適合生長和促進胚胎干細胞生長的條件下，在存在多能性蛋白因子Sox2、Oct4、Klf4以及任選地c-Myc時培養(yǎng)擴增的細胞群，擴增的細胞群可以被誘導成多能的。如本文中所使用的，提及的多能性蛋白因子是指Sox2、Oct4、Klf4以及任選地c-Myc。

在存在多能性蛋白因子時培養(yǎng)擴增的細胞群包括使細胞與多種多能性蛋白因子接觸從而多能性蛋白因子被細胞攝取，以及使用編碼多種多能性蛋白因子的核酸轉染或轉導細胞，并共表達多能性蛋白因子。

可以通過在擴增時期結束時在造血擴增介質中包括多能性蛋白因子來實現使擴增的細胞群與多能性蛋白因子接觸。介質可以更換成胚胎干細胞介質，其可以來自多能性蛋白因子。

可選擇地，可以使用一種或多種編碼多能性蛋白因子的核酸分子轉染或轉化擴增的細胞群。

例如，一種或多種編碼多能性蛋白因子的核酸分子可以是病毒載體、附加體載體、微環(huán)載體或合成的mRNA?？梢允褂玫牟《据d體包括腺病毒載體、桿狀病毒載體、慢病毒載體或仙臺病毒載體。

在一些實施方案中，一種或多種核酸分子是一種或多種編碼多能性蛋白因子的仙臺病毒。這種病毒是市售的，例如作為CytoTune-iPS Reprogramming Kit^TM(Life Technologies)的一部分。擴增的細胞群可以通過以每種病毒約10MOI的合適的仙臺病毒添加到擴增介質中而轉導。轉導之后，介質可以更換為胚胎干細胞介質。

將認識到，多能性蛋白因子的共表達包括從合適的啟動子表達，所述啟動子可操作地連接至特定的多能性蛋白因子的編碼區(qū)域。當序列被置于功能性關系中時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作連接。例如，如果啟動子激活編碼序列的轉錄，編碼序列可操作連接至啟動子。

一旦細胞已經與多能性蛋白因子接觸，或者一旦細胞已經轉染或轉導有編碼每種多能性蛋白因子的核酸分子，以及細胞已經暴露于共表達的條件，細胞可以在適合胚胎干細胞生長的條件下培養(yǎng)。

胚胎干細胞介質是已知的并且是市售的。例如，這種介質包括DMEM/F12(Gibco)或mTeSR1(Stemcell Technologies)，其還可以補充有任何必需的因子或成分。例如，干細胞介質可以補充有血清、氨基酸、抗氧化劑或生長因子。同樣地，介質還可以補充有抗生素或其它成分以防止微生物污染。一般地，mTeSR1是確定的介質，其可以用于hESC和iPSC的無飼養(yǎng)培養(yǎng)。在一些實施方案中，mTeSR1含有牛血清白蛋白、rh bFGF、rh TGFβ、氯化鋰、哌可酸和GABA。盡管mTeSR1確定介質可以是市售的，但這種介質是已知的且規(guī)程是可獲得的，這允許技術人員使用常規(guī)實驗室方法很容易制備mTeSR1。

在一些情況中，使用飼養(yǎng)細胞以促進在培養(yǎng)中的干細胞生長是可取的，這與標準的胚胎干細胞培養(yǎng)技術相一致，例如鼠胚胎成纖維細胞。

若優(yōu)選的話，按照標準的細胞培養(yǎng)技術，可以選擇誘導性多能細胞的個體克隆，然后擴增以獲得誘導性多能細胞的克隆群。

如本文中描述的方法可以以高效率誘導iPSC。與Merling和同事的工作描述的由1mL的人外周血起始分離20個hiPSC克隆相比(Merling等人，2013)，在使用通過手指刺破獲得血液樣本的本方法中每毫升100至600克隆的重建產量，這是顯著提高的。

雖然該方法提供了在偏遠地區(qū)由受試者進行的收集小體積的DIY手指刺破樣本的可能性，但是這不能排除在醫(yī)院或實驗室環(huán)境中收集樣本的益處。即，當在醫(yī)療環(huán)境中獲得，可能獲得更完整的和/或準確的患者醫(yī)療和診斷信息。

同樣地，因為僅需要小體積的血液來進行該方法以從血液樣本獲得iPSC，來自樣本的剩余血液(包括單滴血液)可以被用于其它類型的分析。例如，未用于該方法的剩余體積的血液樣本能夠用于試驗疾病基因型，或者經歷深度基因組測序以發(fā)現遺傳變異的廣泛目錄、SNP和單倍型。血液的分析提供了供體健康和表型的綜合評價，因為機構能夠進行血清分型、測量血球計數和多種代謝產物的水平。

因此，由于該方法需要小體積的血液，能夠使用單滴手指刺破血液樣本進行細胞重建、DNA測序和血型定型/生物化學的平行實驗。

使用手指刺破樣本能夠幫助從地理、遺傳和種族多樣的群體招募供體，這可以幫助建立多樣iPSC庫。這種獲得iPSC的方法可以與基因編輯的新進展(Cong等人，2013)以及iPSC衍生技術的自動化和微型化(Geti等人，2012)相結合使用。因此，這種方法可以提高操作大規(guī)模國際iPSC庫的功能性、通量和可行性。

在該方法中獲得的iPSC能夠被用于干細胞庫、疾病模型、藥物篩選、毒理學試驗和細胞命運工程。該方法顯示建立具有基因型(DNA測序)、表型(血清學和DIY試驗)和臨床信息(血液生物化學和健康問卷)相關完整注釋的hiPSC庫的機會。

目前世界各地建立了很多hiPSC庫項目(Rao等人，2013；Turner等人，2013)。這種干細胞資源庫的潛能只能夠在它們可以利用廣泛多樣的種族、基因型和疾病的供體/患者時才能實現。從小體積的手指刺破樣本重建的能力提供了用于利用大群供體的hiPSC庫的策略。

使用目前的方法，hiPSC機構能夠為供體提供由DIY手指刺破收集試劑盒、運輸保溫箱、知情同意書、健康問卷和DIY試驗試劑盒組成的套裝(package)。尤其是由于物流、財務或身體條件(例如，臥床不起的、年邁的、殘疾的和嬰幼兒)有旅行困難的供體，將從這個策略中受益。它還使從偏遠地區(qū)招募患有罕見疾病表型的供體成為可能。

因此，還涉及試劑盒或商業(yè)套裝。所述試劑盒可以含有手指刺破裝置、收集管、保溫箱、說明書和任選地樣本收集后用于遞送的運輸箱或包裝。所述試劑盒還包括知情同意書、和/或健康問卷、和/或多種血液分析試驗試劑盒，以允許DIY分析比如糖水平、血型定型等。

收到DIY試劑盒后，供體能夠進行手指刺破以將血液樣本收集在含有抗凝劑的管中，并且將它存儲在約4℃左右。健康問卷可以幫助詳述供體的臨床狀態(tài)和病史。最后供體能夠進行具體的DIY血液試驗，比如糖水平的測量。這些試驗根據研究或機構旨在解決的具體問題而定制。完整的文件、同意書和手指刺破樣本能夠簡單地通過全球快遞服務返回至hiPSC庫。

通過以下非限定性的實施例進一步例示本文中描述的方法、細胞群、試劑盒和用途。

實施例

實施例1

描述了來自人手指刺破血液無轉基因的hiPSC的有效衍生。發(fā)現單滴體積的手指刺破樣本足夠平行進行細胞重建、DNA測序和血液血清分型。

材料和方法

手指刺破和靜脈血液樣本。在無菌的實驗室環(huán)境中，收集10μL的指尖毛細管血液。將樣本在2mL的1x RBC裂解緩沖液(00-4300-54，eBioscience)中裂解10分鐘，之后以250g旋轉(spinning)5分鐘。在離心之后立即吸出(aspirated)裂解緩沖液。使用500μL的細胞擴增介質重懸純化的細胞，并接種至24孔組織培養(yǎng)板(3536，Corning)的一孔中。對于DIY實驗，要求供體自己進行手指刺破并將血液收集到含有抗凝劑的Microtainer管中((422)365974,Becton Dickinson)。該管可以通過火焰或在UV照射下預滅菌。DIY血液樣本存儲在冰上，并且在12、24或48小時之后進行RBC裂解。FP血液細胞擴增介質(Chou等人，2011；van den Akker等人，2010)含有StemSpan^TM無血清擴增介質(09650，Stemcell Technologies)，補充有1X青霉素/鏈霉素(Gibco)、1X L-谷氨酰胺(Gibco)、1X NEAA(Gibco)、50μg/mL L-抗壞血酸(Sigma)、50ng/mL干細胞因子(Peprotech)、10ng/mL白介素-3(Peprotech)、40ng/mL胰島素樣生長因子-1(Peprotech)、2U/mL紅細胞生成素(R&D Systems)、1μM地塞米松(Sigma)、含有或不含有10ng/mL的白介素-6(Peprotech)。通過小心吸出介質的一半并以新鮮的介質替代來每天更換介質。12至16天之后，當細胞群達到20至30K的數量時，使用仙臺病毒轉導它們。對于VPiPSC衍生物，通過靜脈穿刺收集250μL或500μL的外周血。根據制造商的說明，使用Ficoll-Paque PLUS(ρ＝1.077±0.001g/mL)(17-1440-03，GE Healthcare)純化PBMC。然后如對手指刺破樣本描述的培養(yǎng)細胞。手指刺破血液樣本的使用經新加坡國立大學的倫理委員會批準。從所有供體獲得書面知情同意書。

細胞重建。通過OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC仙臺病毒轉導20至30K的細胞(CytoTune^TM-iPS重建試劑盒，Life Technologies)，每種因子MOI＝10(每種因子約5μL)(Yang等人，2012)。在24小時后，通過使用新鮮的細胞擴增介質替代來終止轉導。在第3天，將細胞轉移到4或5孔的在6孔組織培養(yǎng)板中(3516，Corning)經輻照的CF1-MEF(以200K每孔的密度接種)中，使用1：1比例的擴增和hESC介質(DMEM/F12(Gibco)，補充有20％的Knockout Serum Replacement(Gibco、100μM MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)、100μMβ-巰基乙醇(Gibco)、1X青霉素-鏈霉素(Gibco)、1X L-谷氨酰胺(Gibco)和10ng/mL bFGF(Gibco))培養(yǎng)。兩天后，將介質更換為hESC介質，每天更換介質。從第14天，使用MEF條件的1:1比例的hESC介質和mTeSR1(Stemcell Technologies)繼續(xù)重建。用于6孔培養(yǎng)的介質的體積是每孔2mL。一旦hiPSC克隆在形態(tài)上出現類似于hESC，則機械地挑選克隆，并再接種至MEF用于擴增。

基因表達分析。進行對貼壁細胞或細胞沉淀直接應用PureZol(Bio-rad)，用于RNA分選。使用QIAGEN RNeasy試劑盒進行RNA純化。使用iScript cDNA合成試劑盒(Bio-Rad)進行第一鏈cDNA合成。使用CXF384實時系統(tǒng)(Bio-Rad)和KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)(KK4602)進行定量PCR分析。

免疫組織化學染色。將細胞在4％的多聚甲醛中固定15分鐘。對于非表面標記物染色，使用0.1％Triton X-100對細胞透化30分鐘，并在含有8％FBS的PBS中封閉30分鐘。在4℃使用一抗孵育細胞過夜，洗滌，使用Alexa Fluor(Invitrogen)二抗孵育2小時，或者使用熒光團綴合的抗體孵育1小時。在成像之前通過Hoechst33342將細胞染色30分鐘。SSEA-4Alexa 647(560219)和TRA-1-60Alexa 647(560173)抗體從Becton Dickinson Biosciences獲得。OCT3/4抗體從Abcam(ab19857)獲得。針對GFAP的抗體從Sigma(G9269)獲得；抗β3微管蛋白從Covance(MMS-435P)；抗GATA4從Santa Cruz Biotechnology(Sc-25310)；抗SMA從Pierce(MA1-06110)以及抗肌間線蛋白從Cell Signalling(5332S)。對于活染色，根據制造商的規(guī)程，使用StainAlive^TM TRA-1-60抗體(DyLight^TM 488)(09-0068，Stemgent)。

亞硫酸氫鹽基因組測序。根據制造商的規(guī)程，使用CpGenome DNA修飾試劑盒(Chemicon)實施基因組DNA(gDNA)的亞硫酸氫鹽處理。簡要地，如以前報道的(Freberg等人，2007)，通過PCR OCT4引物組3擴增轉化的(converted)gDNA。凝膠純化PCR產物，使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆入pCR2.1-TOPO中。對于每個樣本的所有個體克隆，非CpG胞嘧啶的亞硫酸氫鹽轉化效率在80％至99％的范圍。通過使用M13引物測序來證實每個樣本的每個克隆。

流式細胞術。在制造商的建議下，在4℃使用一組稀釋在PBS中的抗體將血液細胞染色20分鐘。這組包括來自BD Bioscience的APC-CD3、PE-CD34和APC-CD19和來自Miltenyi Biotech的APC-CD71。使用碘化丙啶(Sigma)用于活的/死的區(qū)分，除了使用PE-CD34染色的樣本。在FACS Canto II機器上(BDScience)進行流式細胞術，使用FACS Diva軟件分析數據。

DNA指紋和核型分析。對親本血液細胞和它們的衍生hiPS細胞系進行DNA指紋的分析。根據制造商的規(guī)程，使用DNeasy血液和組織試劑盒(Qiagen)提取DNA，并送至健康科學管理局(Health Sciences Authority，HSA，新加坡)用于STR分析?？蛇x擇地，如以前描述的，PCR使用特異于含有高度數目可變串聯重復序列(VNTR)的基因組間隔的引物，用于指紋分析(Prigione等人，2010)。簡要地，使用KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)(KK4602)，在10μL的反應中1ng基因組DNA和0.4μM的引物進行PCR。PCR條件被設置為95℃ 3分鐘，之后40個循環(huán)的95℃ 3秒和58℃ 30秒，在72℃最終延伸10分鐘。在2.5％的瓊脂糖凝膠上，在1X TAE緩沖液中，應用3V/cm的電壓60分鐘，分析PCR產物。使用溴化乙錠染色的凝膠在UV透照儀下可視化。對于核型分析，活的hiPSC系送至新加坡基因組研究院(Genome Institute of Singapore)用于分析。

擬胚體形成。為形成擬胚體，將匯合的未分化的hiPS細胞機械地刮成條狀，并轉移至6孔低附著的的板中，在由補充有10％胎牛血清(PAN Biotech)、1X非必需氨基酸(Gibco)、1X L-谷氨酰胺(Gibco)以及1X青霉素/鏈霉素(Gibco)的DMEM組成的分化介質中。

畸胎瘤形成的測定。對于畸胎瘤形成，通過膠原酶處理收集在MEF上生長的hiPSC，重懸在基質膠(Matrigel)中，并注射至6周齡SCID小鼠的后肢肌肉中。使用70％匯合的在6孔板中1孔的hiPSC用于每只小鼠。每種hiPSC克隆注射三只小鼠。對于所有的組織學測定，在6-10周后，切下畸胎瘤，并在福爾馬林中固定，嵌入石蠟中，并經受蘇木精和伊紅染色。

T/B細胞重排測定。按照制造商的說明，使用DNeasy血液和組織試劑盒(Qiagen)從hiPSC和對照細胞系中分離DNA。對于TCRβ、γ和IgH重排進行PCR測定，在以前的研究中描述了使用的引物(van Dongen等人，2003)。使用1至2個單位的Taq DNA聚合酶(Qiagen)，在25μL的反應中，使用50ng的基因組DNA，10pmol的每種引物和200μM dNTP，在1X PCR緩沖液中進行PCR(35個循環(huán)的94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒)。所有PCR以預變性(在95℃3分鐘)開始，且以最終延伸(72℃10分鐘)結尾，之后保持在4℃?？蛇x擇地，使用KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)(KK4602)，使用1ng基因組DNA和0.2μM的引物，在10μL的反應中進行PCR。除了PCR的退火溫度設置為65℃以外，PCR和凝膠工作條件與在DNA指紋和核型分析中描述的相同。

ABO/Rh群分型。在載玻片上，1μL的手指刺破血液與1μL的抗體溶液(來自DIAGAST的抗A、抗B、抗A、B或抗D)混合。孵育反應物30秒，然后將溶液展開(spread)并允許干燥。掃描載玻片并記錄結果。分別如Muro等人，2012和Simsek等人，1995描述的，實施ABO和恒河猴(Rhesus)因子基因分型。除了PCR的退火溫度設置為63.5℃以及循環(huán)數減少至35個循環(huán)以外，PCR反應和凝膠工作條件與DNA指紋和核型分析中描述的相同。

ADH和ALDH基因分型。除了每個反應使用5-10ng的gDNA，和使用KAPAHiFi HotStart(KK2601)或KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)(KK4602)用于擴增以外，在ADH2、ADH3和ALDH2的PCR中使用的引物和條件與Chen等人，1997描述的那些相似。隨后通過使用TA TOPO克隆試劑盒(Invitrogen)將PCR產物克隆入pcDNA3.3。至少挑選10個克隆并測序。

心分化。通過使用Accutase(Sigma-Aldrich)在37℃孵育5分鐘，將人iPSC分解成單細胞，然后以100,000細胞/cm²接種在包被基質膠的細胞培養(yǎng)皿上，在補充有5μM ROCK抑制劑(Y-27632，Stemgent)和10μM CHIR99021(Stemgent)的mTeSR1介質中24小時。然后將細胞在補充有B27無胰島素的RPMI1640介質中培養(yǎng)兩天。然后將介質替換成補充有5μM IWP-2(Stemgent)的RPMI/B27-胰島素再維持2天，然后更換為RPMI/B27-胰島素再維持兩天，這之后，將細胞維持在含B27的RPMI1640介質中，每三天更換介質(Lian等人，2012)。使用針對α輔肌動蛋白(Sigma，A7811)、β肌球蛋白重鏈(b-MHC)(Alexis，F36)和肌聯蛋白(Millipore，MAB1553)的鼠單克隆抗體進行心肌細胞標記物的染色。

膜片鉗分析。使用Axon 200B膜片鉗放大器(Axon instrument，USA)且在2至5kHz低通濾波下進行整體細胞膜片鉗記錄。使用Digidata 1440A實現數據采集。通過水平拉具(puller)(Model P-97，Sutter Instrument，USA)牽引硼硅酸鹽玻璃電極(1.5mm OD)，當填充有內液時，火拋光(fired-polished)至2-3MΩ的最終阻力。在正常的Tyrode溶液中記錄來自hiPSC-CM的自發(fā)AP，所述Tyrode溶液中含有(以mM計)：NaCl 140、KCl 5.4、CaCl₂ 1.8、MgCl₂ 1、葡萄糖10、HEPES 10，使用NaOH調整pH值至7.40。溶液含有(以mM計)：KCl 130、NaCl 5、MgCl₂ 1、MgATP 3、EGTA 10和HEPES 10，使用KOH調整pH值至7.20。在記錄期間，通過TC-324B單通道加熱控制器(Warner Instruments)將細胞維持在35-37℃。

乙醇膜片試驗。將約1滴70％乙醇添加至固定在膠條上的10×10mm棉絨墊上。膜片附著在上臂的內側表面7分鐘后去除。去除后10至15分鐘顯示紅斑的膜片區(qū)域判斷為陽性的。對照包括棉絨墊(無任何液體)、含水的棉絨墊以及含咖啡因的棉絨墊(Muramatsu等人，1989)。

DNA微陣列。使用Cy3標記來自PBMC、hES細胞或來自PBMC的hiPS細胞的總RNA。根據制造商的規(guī)程，將樣本雜交于HumanHT-12v4Beadchip(Illumina)。使用Beadchip Reader(Illumina)掃描陣列。使用在BioConductor lumi程序包中應用的Quantile歸一化算法計算數據歸一化。在R程序包中進行聚類分析并生成散點圖。原始數據以登錄號GSE53485儲存在GEO。

附圖說明

圖1.從手指刺破血液樣本衍生hiPSC。(A)在這個研究中的重建人手指刺破血液所使用的策略的示意圖。圖片顯示收集手指刺破血液、在培養(yǎng)中擴增細胞和附著克隆。最初的hESC樣克隆通常在第18天至20天出現，在第21天后挑選。衍生的FPiPSC能夠穩(wěn)定傳代以長期培養(yǎng)。(B)表達多能性標記物TRA-1-60、SSEA4和OCT4的FPiPSC克隆的免疫熒光染色。Hoechst染色指示每個區(qū)域總的細胞含量。(C)對在FPiPSC和它們的親本細胞中OCT4和NANOG的啟動子進行亞硫酸氫鹽DNA甲基化分析。白色和黑色的圓圈分別代表在啟動子區(qū)域中未甲基化和甲基化的CpG島。(D)顯示hESC、hiPSC和親本血液細胞的全表達譜的無監(jiān)督層次聚類的系統(tǒng)樹圖(上部)。hESC、hiPSC和親本血液細胞多能性和造血特異性標記物基因的表達的熱圖分析(下部)。紅色代表上調，黑色代表下調。(E)與親本細胞(左側)和H7人ESC(右側)比較的FPiPSC全基因表達譜的散點圖。黑線指示在配對的細胞類型間基因表達水平的線性等價和2倍變化。在散點圖中指示在多能性基因OCT4、SOX2、NANOG和LIN28的位置。(F)qRT-PCR分析在FPiPSC、H7ESC和親本細胞中，ESC標記物基因OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、DNMT3B、REX1、KLF4和c-MYC的表達。個體PCR反應以H7ESC歸一化，且β-肌動蛋白作為內部對照。所有檢測的FPiPSC細胞系顯示與H7ESC相似的ESC標記物基因的表達。

圖2.FPiPSC分化成三種胚層的衍生物。(A)FPiPSC在體外分化后，分化標記物的免疫熒光染色。外胚層由GFAP和β3微管蛋白抗體染色，然而內胚層由抗GATA4抗體染色。在上側的所有圖片使用10x物鏡(objectives)獲得，除了GATA4染色圖片，其使用4x物鏡獲得。下側的圖片以更高的放大倍數顯示。Hoechst染色指示核。(B)hiPSC衍生的心肌細胞中的α輔肌動蛋白、β肌球蛋白重鏈(β-MHC)和肌聯蛋白的免疫熒光染色。Hoechst染色指示核。(C)hiPSC衍生的心肌細胞膜片鉗分析。(D)衍生自注射有FPiPSC的免疫缺陷小鼠的畸胎瘤的蘇木精和伊紅染色，顯示代表所有三種胚胎胚層的組織，包括腸樣上皮細胞(內胚層)、軟骨(中胚層)和神經組織(外胚層)。

圖3.FPiPSC的表征。(A)衍生的FPiPSC系的轉基因表達分析。通過qRT-PCR測量SeV(仙臺病毒)骨架和SeV OCT4表達值，并且以SeV感染的親本細胞歸一化，β-肌動蛋白作為內部對照。在從這些hiPSC系中收集的總RNA中檢測無SeV轉基因。(B)FPiPSC的細胞遺傳學分析。FPiPSC顯示含46條染色體的正常人核型。(C)FPiPSC克隆的IgH重排分析。LTR-228(B細胞系)用作陽性對照。在我們的FPiPSC中觀察到沒有IgH重組。(D)FPiPSC克隆的TCRB重排分析。Jurkat(T細胞系)或CD3+T細胞用作這個分析的陽性對照。(E)FPiPSC克隆的TCRG重排分析。Jurkat(T細胞系)或CD3+T細胞用作這個分析的陽性對照。所有V(D)J重排PCR的陰性結果指示衍生的FPiPSC不起源自B或T淋巴細胞。在(C)、(D)和(E)中的所有圖中，期望的PCR產物范圍在凝膠圖片的左側示出，靶標區(qū)域在凝膠圖片的下部示出。在收集前，在這個測定中使用的FP血液已經在細胞擴增介質中培養(yǎng)至少15天。在PCR分析中始終包括水樣本作為陰性對照。(F)對在這些V(D)J重排分析中使用的所有樣本進行基因組DNA擴增對照實驗。

圖4.FPiPSC生成的DIY概念。(A)細胞培養(yǎng)前12小時、24小時和48小時收集的FP血液樣本。細胞在第0天進行RBC裂解(左側)，并且在介質中擴增12天。所有圖片使用20x物鏡獲得。(B)衍生自供體1DIY FP血液(12小時和24小時)的hiPSC克隆對多能性標記物TRA-1-60染色呈陽性。上側的圖片使用20x物鏡獲得，然而下側的圖片使用4x物鏡獲得。(C)衍生自供體5DIYFP血液(24小時和48小時)的hiPSC克隆對多能性標記物TRA-1-60染色呈陽性。所有圖片使用10x物鏡獲得。(D)qRT-PCR分析在FP(DIY)iPSC、H1ESC和親本細胞中的ESC標記物基因OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、DNMT3B、REX1和c-MYC的表達。個體PCR反應以H1ESC歸一化，β-肌動蛋白作為內部對照。所有檢測的FP(DIY)iPSC系顯示與H1ESC相似的ESC標記物基因的表達。(E)DNA指紋分析確認FPiPS細胞系衍生自它們的親本系。使用PCR引物組D10S1214、D17S1290、D7S796和D21S2055檢測可變串聯重復。(F)衍生自供體的hiPSC的總結。所示的VP和FP分別是靜脈穿刺血液和手指刺破的血液?；谟^察到的TRA-1-60克隆并以1mL的血液歸一化計算重建產量。

圖5.手指刺破樣本的血液定型和DNA基因型。(A)從手指刺破樣本進行供體的血液分型。上側顯示使用的抗體。如果供體的紅細胞攜帶對應的抗原，將發(fā)生凝集，并且可以確定供體的血型。供體1和供體2的表型血型是B+型，而供體5是O-。(B)手指刺破血液和衍生的hiPSC的供體血型的基因分型。使用特異性引物用于ABO等位基因檢測。上側顯示引物擴增的特異性等位基因。設計引物6O、6AB、7AO和7B以分別靶向O等位基因外顯子6、A或B等位基因外顯子6、A或O等位基因外顯子7和B等位基因外顯子7。清晰的DNA條帶(～100bp)指示陽性的PCR結果，顯示供體攜帶這些等位基因。供體1的FP血液和FPiPSC顯示BB基因型(上側)，然而供體2的FP血液和FPiPSC顯示BO基因型(下側)。包括靶向參照基因36B4的引物，作為基因組DNA擴增的陽性對照。(C)手指刺破樣本和衍生的hiPSC的恒河猴D抗原基因分型。設計引物以靶向Rh CcEe和Rh D區(qū)域。從Rh CcEe等位基因擴增1200bp的條帶，以及來自Rh D等位基因的600bp。對于Rh D陽性樣本，能夠觀察到清晰的600bp的條帶和1200bp的條帶；否則僅能檢測到1200bp的條帶。供體1和2以及它們的hiPSC顯示Rh D陽性基因型。(D)來自DIY手指刺破血液衍生的hiPSC的供體的血型的基因分型。供體5FP(DIY)iPSC顯示OO基因型。(E)DIY手指刺破樣本衍生的hiPSC的恒河猴D抗原基因分型。供體1FP(DIY)iPSC顯示Rh D陽性的基因型，然而供體5FP(DIY)iPSC是Rh D陰性的。(F)ALDH2基因座上的SNP。ALDH2負責將乙醛轉化成乙酸。ALDH2*2等位基因由谷氨酸至賴氨酸突變(1510G→A)組成，并且編碼缺陷的ALDH2。(G)對供體的乙醇膜片試驗。當應用在供體的皮膚時，供體1顯示對乙醇的泛紅反應，然而供體2和5顯示對乙醇無作用。(H)上側顯示在體內乙醇降解的代謝通路。首先，通過乙醇脫氫酶使乙醇氧化成有毒的乙醛，隨后通過ALDH氧化成乙酸。在我們的研究中，供體1具有ALDH2*2等位基因且因此證明對乙醇不耐受。

圖6.靜脈穿刺(VP)血液衍生的hiPSC。(A)VP血液重建的時間軸的示意圖。收集小體積的VP血液(250μl和500μl)，擴增細胞12天。在SeV轉導18天后觀察到克隆。衍生的VPiPSC是長期培養(yǎng)穩(wěn)定的。(B)在VPiPSC上多能性標記物的免疫熒光染色。所有VPiPSC的OCT4、TRA-1-60和SSEA4染色呈陽性。對應的Hoechst 33342染色指示在該區(qū)域中總細胞含量。(C)VPiPSC上的多能性基因表達分析。檢測的多能性基因列于附圖的上側。個體PCR反應以H7ESC歸一化，β-肌動蛋白作為內部對照。所有檢測的FPiPSC系顯示與H7ESC相似的ESC標記物基因的表達。(D)在4次傳代后VPiPSC系的轉基因表達分析。通過qRT-PCR測量SeV骨架表達值，并以SeV感染的親本細胞歸一化，β-肌動蛋白作為內部對照。從這些iPSC系收集的總RNA未檢測到SeV骨架。

圖7.VPiPSC的表征。(A)在VPiPSC中OCT4和NANOG的啟動子的DNA甲基化分析。白色和黑色圓圈分別代表在啟動子區(qū)域未甲基化和甲基化的CpG島。(B)在體外分化的VPiPSC的中胚層標記物、肌間線蛋白和SMA的免疫熒光染色。(C)在體外分化VPiPSC后分化標記物的免疫熒光染色。由GFAP抗體染色外胚層。

圖8.FP血液細胞的分離和擴增。(A)FP血液的收集。以順序方式(I至IV)顯示附圖。對供體指尖應用手指刺破(I)，隨后將血液收集在Microtainer(II至IV)中。(B)FP血液的RBC耗盡。在RBC裂解緩沖液中裂解10μl的FP血液(從I至IV)。(C)來自5至12天的純化的FP血液細胞的圖片。所有圖片使用20x物鏡獲得。(D)在培養(yǎng)的具體的天(第0、8、15天)通過流式細胞術分析細胞以確定細胞表面的免疫表型。具有細胞表面免疫表型CD3(+)、CD19(+)、CD34(+)或CD71(+)的細胞的百分比總結并展示在表中。除了CD34樣本，通過碘化丙啶染色排除死細胞。

圖9.衍生的VPiPSC的V(D)J重排。(A)、(B)和(C)顯示對衍生的VPiPSC進行的IgH、TCRB和TCRG重排分析。LTR-288用作IgH重排分析的陽性對照，然而Jurkat和CD3+T細胞用作TCRB和TCRG重排分析的陽性對照。來自所有V(D)J重排PCR的陰性結果指示衍生的VPiPSC不起源自B或T淋巴細胞。(D)分析中所使用的VPiPSC基因組DNA的擴增對照。所有樣本顯示5條條帶，指示使用的基因組DNA質量良好。在所有附圖中，期望的PCR產物范圍在凝膠圖片的左側示出，靶標區(qū)域在凝膠圖片的下部示出。同樣，在PCR試驗中始終包括水樣本作為陰性對照。

圖10.衍生的FP(DIY)iPSC的V(D)J重排。(A)、(B)和(C)顯示對衍生的FP(DIY)iPSC進行的IgH、TCRB和TCRG重排分析。結果指示衍生的FP(DIY)iPSC不起源自B或T淋巴細胞。(D)在該分析中使用FP(DIY)iPSC基因組DNA的擴增對照。所有樣本顯示5條條帶，指示使用的基因組DNA質量良好。

圖11.DIY手指刺破血液和衍生的iPSC的血液定型和DNA基因分型。(A)從DIY手指刺破樣本進行供體5血型的基因分型。結果顯示期望的OO基因型。(B)供體5DIY手指刺破樣本的恒河猴D抗原基因分型。結果顯示期望的恒河猴陰性基因型。(C)在分析前24小時和48小時獲得的供體1DIY手指刺破樣本的血液分型。供體1顯示期望的B+表型。(D)來自DIY手指刺破血液衍生的hiPSC的供體血型的基因分型。供體1FP(DIY)iPSC顯示期望的BB基因型。

圖12.衍生的hiPSC上ALDH2、ADH2和ADH3的基因分型。(A)和(B)顯示供體1和供體2的FP血液(A)以及它們各自的hiPSC(B)的ALDH2測序比對結果。在供體1的測序結果中發(fā)現正常的和突變的ALDH2等位基因，指示供體1是ALDH2雜合的。另一方面供體2僅攜帶正常等位基因。(C)供體1上的乙醇膜片試驗。將咖啡因、70％乙醇、水和空白膜片應用到供體1的皮膚(0分鐘)。在10分鐘后，如白色箭頭指示的，應用70％乙醇的區(qū)域顯示泛紅反應。(D)FPiPSC上ADH2、ADH3和ALDH2基因分型的總結。供體1的hiPSC的所有3種基因顯示雜合型，然而供體2和3的hiPSC顯示ADH2的純合體突變等位基因，但ADH3和ALDH2上是純合體正常的等位基因。供體5的hiPSC顯示ADH3的雜合型，但ADH2和ALDH2的正常等位基因。

圖13.含有表1：iPSC克隆的指紋分析數據。

圖14.含有表2：對iPSC克隆進行的表征的總結。

圖15.hiPSC庫的整合策略示意描述。hiPSC庫的整合策略的圖示。使用FP血液重建、hiPSC機構能夠招募世界范圍的不同群體的供體。hiPSC機構向供體提供試劑盒，其含有無菌的手指刺破和貯血器。供體將完成知情同意書和健康問卷，并將它們連同他們的FP血液返回至機構。機構能夠從單滴的FP血液樣本進行一系列的DNA測序、血清學測定以及hiPSC衍生。

結果

從亞毫升(sub-milliliter)的人外周血生成hiPSC。使用2mL的人外周血單個核細胞(PBMC)，成功地從兩個個體重建T細胞和非T細胞(數據未顯示)。這與之前的研究具有良好的一致性，之前的研究以相似體積的血液樣本起始用于重建(Merling等人，2013；Ye等人，2013)。

檢測了以少于1mL體積的血液樣本，相同的Ficoll純化規(guī)程是否將產出足夠的細胞。血液的起始體積逐漸減少，并且確認了使用僅僅250μL至500μL的靜脈血能夠實現重建(圖6A)。使用免疫熒光，靜脈穿刺衍生的iPSC(VPiPSC)的OCT4、TRA-1-60和SSEA-4染色呈陽性(圖6B)。qRT-PCR結果顯示多能性標記物的再活化(圖6C)。尤其是，在培養(yǎng)4次傳代后，在VPiPSC中未檢測到仙臺病毒轉基因(圖6D)。與它們的hESC樣形態(tài)相一致，VPiPSC顯示在OCT4和NANOG啟動子處的CpG二核苷酸的脫甲基(圖7A)，并且在體外能夠分化成不同的譜系(圖7B和7C)。DNA指紋分析證實了這些細胞確實衍生自親本血液細胞(在圖13中的表1)。

然而，當對起始血液體積低于250μL的樣本使用靜脈穿刺之后Ficoll-Paque離心的這個方法時，沒有獲得用于重建的足夠的PBMC。這個結果的一種可能性是有關分離白膜層(buffy coat)的技術困難，導致單個核細胞的損失。

從手指刺破血液樣本衍生hiPSC。為研究是否能夠從微量的血液樣本生成hiPSC，純化過程改變?yōu)榕懦褂脗鹘y(tǒng)的Ficoll純化。從不同的個體收集手指刺破樣本(圖8A)，并使細胞經受低滲裂解溶液以耗盡紅細胞(圖8B)。引人注目地，發(fā)現來自10μL血液的RBC裂解的手指刺破細胞能夠在介質培養(yǎng)中擴增，以生產足夠的分裂細胞用于重建(圖8C)。

總計，招募了5位供體(19至36歲)，其中的4位供體實現成功地重建產生hiPSC。作為供體的年齡的函數，觀察到重建效率沒有顯著減少。一個供體(年齡29歲)在培養(yǎng)中沒有產生足夠的細胞，且因此沒有對這個供體的樣本進行用于重建的病毒感染。

與以前的報告(Chou等人，2011；Yang等人，2012)相一致，在15天的培養(yǎng)擴增后的細胞大部分是CD71+髓系祖細胞(圖8D)。使用這個方法，在使用仙臺病毒轉導后20天觀察到出現hESC樣克隆(圖1A)。所有的手指刺破衍生的iPSC(FPiPSC)克隆繁殖至少20代，且在培養(yǎng)中保持穩(wěn)定。

使用免疫染色檢測在FPiPSC系中的多能性標記物的表達。與hESC樣形態(tài)相符，檢測到OCT4、TRA-1-60和SSEA-4的表達(圖1B)。與多能性相關基因的活化相一致，手指刺破血液細胞的重建伴隨著OCT4和NANOG啟動子處的CpG二核苷酸的脫甲基(圖1C)。

與hESC和親本體細胞相比較，進行FPiPSC的全基因表達分析。聚類的系統(tǒng)樹圖在重建的hiPSC間顯示高度的相似性，所述重建的hiPSC與H1、H7和H9ESC聚集一起，且遠離親本體細胞(圖1D，上側)。熱圖分析指示多能性基因的再活化，以及在hiPSC系中造血基因的抑制(圖1D)。相似地，散點圖分析顯示在重建的FPiPSC與人ESC(H7ESC)之間更嚴格的相關性，而不是與親本血細胞(圖1E)。定量PCR分析證實了內源多能性標記物包括OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、REX1、NANOG、LIN28和DNMT3B的表達(圖1F)。尤其是，這些基因在FPiPSC中恢復至與在H7hESC中觀察到的相似的水平(圖1F)。

FPiPSC分化成三種胚層的衍生物。通過在體外擬胚體(EB)分化評估FPiPSC系的發(fā)育潛能。通過誘導hiPSC很容易形成EB，能夠分化成中胚層(肌間線蛋白和SMA)、神經(β3微管蛋白、GFAP)以及內胚層(GATA4)譜系(圖2A)。

特定的體外分化之后，FiPSC產生有節(jié)奏的跳動的心肌細胞。α輔肌動蛋白、β-MHC和肌聯蛋白的陽性染色證實了它們的心肌細胞身份(圖2B)。使用膜片鉗分析，表征個體心肌細胞，發(fā)現已經發(fā)育成不同的心室、心房和結點動作電位(圖2C)。

人iPSC的多能性的最嚴格的試驗是在免疫缺陷小鼠宿主中形成畸胎瘤(Lensch等人，2007)。通過注射入SCID小鼠的后肢肌肉，FPiPSC系生成分化良好的囊性畸胎瘤，其包含衍生自三種胚胎胚層的架構和組織。這些包括腸樣上皮細胞、軟骨和神經組織(圖2D)。

FPiPSC無轉基因和V(D)J重排。有效的轉基因沉默是多能hiPSC系的衍生所必需的(Park等人，2008)。使用仙臺病毒載體骨架和外源性仙臺OCT4重建因子特異性引物的qRT-PCR證實FPiPSC不攜帶任何仙臺轉基因(圖3A)。檢測的FPiPSC系顯示正常的核型(圖3B)。DNA指紋分析證實這些細胞確實衍生自親本血細胞，不是存在hESC或hiPSC系的污染的結果(圖13中表1)。

在循環(huán)血液中，B細胞和T細胞是豐富的，后者可以很容易被重建(Loh等人，2010；Seki等人，2010；Staerk等人，2010)。因此使用基于PCR的檢測來試驗FPiPSC克隆的TCR和IgH重排。雖然克隆對照(Jurkat和LTR-228)和CD3+T細胞顯示指示重排的條帶，檢測的所有FPiPSC和VPiPSC克隆在TCRβ、γ和IgH基因座處不具有任何重排(圖3C、3D、3E、3F和9)。因此，這些結果證實了FPiPSC不起源自淋巴T和B細胞。

從DIY手指刺破樣本重建。有別于僅能由經訓練的抽血者進行的靜脈穿刺，手指刺破血液可以由供體自己按合適的說明收集。為了試驗這個想法，在正常房間環(huán)境中，指導供體刺破他們自己的手指，將單滴血液樣本收集在EDTA管中。將管置于冰上，遞送至實驗室用于重建。12、24或48小時之后，使用RBC裂解緩沖液處理細胞，并且在顯微鏡下觀察活力和污染的跡象(圖4A)。有趣的是，在介質中12天的擴增之后，細胞顯示健康且活躍的分裂(圖4A)。

為開始重建，使用仙臺病毒轉導分離自手指刺破樣本的細胞。在感染后約20天觀察到hESC樣克隆?？傆?，在4個獨立實驗中從兩位供體獲得了8個TRA-1-60+克隆(圖4B)。

V(D)J重排PCR證實FP(DIY)iPSC不起源自淋巴T和B細胞(圖10)。定量PCR分析表明，內源性多能性標記物基因的表達達到與H1ESC可比的水平(圖4D)。尤其是，FP(DIY)iPSC衍生自各供體FP細胞，且不是由于存在hESC或hiPSC污染(圖4E)。每毫升100至300個克隆的效率與來自在控制的和清潔的實驗室環(huán)境下采集的新鮮樣本的重建結果相似。有趣的是，新鮮收集的樣本和DIY手指刺破樣本間，觀察到重建效率未顯著減少(圖4F)。

總之，從亞毫升體積的靜脈穿刺和單滴體積的手指刺破樣本成功地衍生無轉基因和無V(D)J重排的hiPSC(圖4F和圖14中表2)，具有每毫升血液100至600個克隆的高重建產量(圖4F)。

hiPSC庫的整合策略。因為單滴血液是約20μL，且僅需要10μL用于重建，然后評估剩余量的供體血液是否能夠用作其它分析。多能干細胞可以潛在地成為細胞治療的無限資源，但是在移植期間可以引起免疫排斥問題。除了人白細胞抗原(HLA)(Taylor等人，2012)，近期的研究發(fā)現，在體外hESC分化的肝細胞和心肌細胞表達ABO抗原(Molne等人，2008)。

對3位供體，使用4μL的手指刺破血液進行A、B和Rh抗原群的血清學分析(圖5A)。然后從手指刺破樣本收集gDNA；2μL的血液產生約150ng的PCR級的gDNA用于分子研究。使用基于PCR的技術還可以確定ABO/Rh分型。此外，PCR分析能夠解釋ABO群的準確的基因型。該結果證實了盡管供體1和2具有B+的表型，供體1具有BB+的基因型，然而供體2是BO+(圖5B、5C)。在另一方面，供體5的ABO和Rh抗原是隱性的，如由O-表型所顯示的(圖5A)。供體5的手指刺破血液的基因型分析證實了血清學結果(圖11A、11B)。有趣的是，DIY手指刺破血液樣本沒有顯示降解的跡象(樣本收集后24和48小時)，因為供體的血清學ABO/Rh血型仍能夠準確的確定(圖11C)。預期地，衍生自各供體的FPiPSC和FP(DIY)iPSC顯示與親本血細胞相同的ABO和Rh基因型(圖5B、5C、5D、5E和11D)。

細胞培養(yǎng)前72小時收集擴增的DIY手指刺破樣本，觀察到高度的細胞死亡。

為進一步評估是否分離自小量的手指刺破血液樣本的gDNA能夠被用于檢測單核苷酸突變，對涉及酒精代謝的乙醛脫氫酶(ALDH)和乙醇脫氫酶(ADH)基因進行測序分析。有趣的是，ALDH2的測序結果指示供體1攜帶突變的ALDH2*2等位基因(1510G>A突變)(圖4F)。在血液樣本和衍生的hiPSC中觀察到突變(圖12A和12B)。多種報告表明在ALDH2上的單核苷酸多態(tài)性(SNP)能夠導致蛋白功能障礙，所述蛋白功能障礙導致在體內有毒的乙醛的積累，并顯現為皮膚上的泛紅(Rao等人，2007；Xiao等人，1995)。

當收集手指刺破樣本時，接著要求供體進行簡單的試驗。與ALDH2基因型一致，由供體1進行乙醇膜片試驗導致皮膚發(fā)紅，然而攜帶純合體正常的ALDH2*1等位基因的供體2和5不顯示任何泛紅癥狀(圖5G和圖12C)。

總之，使用DNA測序和DIY乙醇試驗的組合，描述了供體1、2和5的酒精耐受的水平(圖5H和12D)。重要的是，產生的hiPSC如實地概括突變基因型，并且將是將來研究酒精代謝的良好資源(圖12D)。

由供體收集手指刺破血液的系統(tǒng)的模型以及整合入分析和hiPSC庫在圖15中顯示。

在本說明書中提及的所有出版物和專利申請都在此引用作為參考，就如同每一篇出版物或專利申請被具體地且單獨地指出以被引用作為參考那樣。任何出版物的引用為在申請日前公開的內容，并且不應將其解釋為由于先于本發(fā)明而承認本發(fā)明不早于這些公開。

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在本說明書和所附權利要求書中，所用術語“包括”、“包含”、“含有”和這些術語的其它形式意指非限定的包含含義，換言之，在沒有排除其它任何元素或成分的情況下，包括具體所述元素或成分。

如在本說明書和所附權利要求書中所用的所有給定的范圍或列舉旨在包含其含有的任何中間值或范圍或任何子集。

除非另外定義，本文所用全部技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同含義。

雖然通過用于清楚理解目的的說明和實施例已經在一定程度上詳細描述了前述發(fā)明，對本領域普通技術人員來說，顯而易見的是，鑒于本發(fā)明的教導，在沒有脫離所附權利要求的實質或范圍的情況下，可以另外進行一些變化和修改。

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