包括白蛋白結(jié)合部分的腺病毒的制作方法

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本發(fā)明涉及疾病治療的領(lǐng)域，更具體地涉及一種用于基因治療或病毒治療的重組腺病毒，該重組腺病毒包括在腺病毒六鄰體蛋白外表面上的白蛋白結(jié)合部分；尤其涉及一種包括白蛋白結(jié)合部分的溶瘤腺病毒及其在預(yù)防和/或治療癌癥中的用途。所述腺病毒與血流中存在的中和抗體相隔離，因此特別適用于全身給藥。

背景技術(shù)：

腺病毒已經(jīng)廣泛用作基因治療中的基因遞送載體，以及用于癌癥治療的溶瘤劑。腺病毒展示出幾種使其適于上述應(yīng)用的特征。即，已經(jīng)對它們結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性質(zhì)進行了廣泛研究，因此可以很容易地對它們的基因組進行修飾；它們能感染正在復(fù)制的細胞也能感染非復(fù)制的細胞；并且，在臨床使用時能容易地生產(chǎn)高滴度的腺病毒。就安全性而言，腺病毒不會給人帶來致命性疾病，它們的基因組是非整合性的，這可以防止插入誘變。雖然仍需對基于腺病毒的載體功效(尤其當(dāng)病毒進行全身給藥時)進行改進，但使用基于腺病毒的載體的臨床實驗顯示出良好的毒理學(xué)和安全性表現(xiàn)。

在基因治療領(lǐng)域，可能需要進行全身給藥(即注射至靜脈或動脈血流中)，以對多個器官或播散性細胞起作用。例如，在使用腺病毒載體和溶瘤腺病毒治療癌癥時，需要進行全身給藥來治療處于晚期或轉(zhuǎn)移階段的播散性腫瘤。然而，腺病毒在注射到血流中時示出一些重要的局限性，這削弱了療效。在血流中，5型腺病毒(Ad5)遭受多次中和作用，大大降低了病毒的生物可利用度。肝臟隔離代表了治療的主要障礙，因為>90％的注射劑量被留存在該器官中，主要被留存在名為庫普弗(Kupffer)細胞的肝巨噬細胞中，也被留存在肝竇內(nèi)皮細胞(LSEC)和肝實質(zhì)細胞中。與血細胞和蛋白質(zhì)的直接作用也是一個重要障礙。Ad5能與血細胞直接結(jié)合，如通過CAR受體與紅細胞直接結(jié)合以及通過整聯(lián)蛋白與血小板直接結(jié)合?？贵w不僅能直接中和病毒，而且還能通過補體激活及通過使單核細胞和中性粒細胞的Fc受體與病毒顆粒對接來觸發(fā)固有免疫應(yīng)答。此外，載體的再次給藥使抗-Ad的中和抗體(NAb)水平上升，從而中和了病毒。抗體和補體對腺病毒的調(diào)理作用還通過Kupffer細胞增強了清除作用?？傊@些相互作用導(dǎo)致Ad在血液中的半衰期很短，在小鼠或人中的半衰期大約為幾分鐘。

已付出很多努力來避免腺病毒全身給藥時的抗體和免疫細胞的中和作用。

測試了腺病毒衣殼蛋白經(jīng)聚合物(聚乙二醇(PEG)或N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA))的化學(xué)修飾。病毒表面上的聚合物綴合能使病毒逃避抗體和免疫細胞的中和作用，同時能消除CAR、整聯(lián)蛋白及FX結(jié)合。然而綴合至衣殼的聚合物不能傳給病毒后代，增加了用于臨床應(yīng)用的大規(guī)模GMP生產(chǎn)的復(fù)雜性。

WO 2011/129468A9公開了能逃避中和抗體免疫識別的嵌合型腺病毒。通過對血清5型人腺病毒的衣殼進行基因修飾獲得所述腺病毒，其中，編碼六鄰體蛋白的基因被替換成血清19型猴腺病毒的六鄰體基因。所獲得的嵌合型腺病毒的抗腫瘤活性高于沒有進行基因修飾的同樣的腺病毒。

為了獲得由白蛋白保護的腺病毒，已經(jīng)進行了幾次嘗試(見WO 2007/050128A2)。然而，實驗證據(jù)顯示出，具有經(jīng)白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域修飾的衣殼的腺病毒不能免于被中和抗體中和(Hedley S.J.et al.2009.The Open Gene Therapy Journal,2:1-11)。

因此，仍需要進一步對腺病毒進行基因修飾，以使其適于全身給藥并能夠逃避中和抗體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在第一個方面，本發(fā)明涉及一種腺病毒基因組，其特征在于，所述腺病毒基因組包括編碼白蛋白結(jié)合部分的序列，所述編碼白蛋白結(jié)合部分的序列插入在六鄰體蛋白的高變區(qū)1(HVR1)的編碼區(qū)中，從而表達包括六鄰體蛋白和白蛋白結(jié)合部分的融合蛋白，并且其中，當(dāng)所述六鄰體蛋白組裝在腺病毒衣殼中時，所述白蛋白結(jié)合部分位于所述六鄰體蛋白的外表面上。

在第二個方面，本發(fā)明涉及一種重組腺病毒，所述重組腺病毒具有根據(jù)本發(fā)明的腺病毒基因組。

在第三個方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包括治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的重組腺病毒，以及藥學(xué)上可接受的載劑。

在第四個方面，本發(fā)明涉及用于醫(yī)藥的根據(jù)本發(fā)明的重組腺病毒或藥物組合物。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療哺乳動物中的癌癥的根據(jù)本發(fā)明的重組腺病毒或藥物組合物，其中，所述腺病毒是在其基因組中插入了用于癌癥治療的基因的溶瘤腺病毒或腺病毒。

附圖說明

圖1.在ICOVIR15-ABD中插入白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ABD)中的示意圖。源自鏈球菌蛋白G的ABD3(SEQ ID NO：1)的兩側(cè)為兩個GSGS(SEQ ID NO：2)連接子，將其插入至溶瘤腺病毒ICOVIR15的高變區(qū)1(HVR1)的中間，獲得ICOVIR15-ABD。LITR/RITR，左、右末端反向重復(fù)序列；MLP，主要晚期啟動子；E1Ap，經(jīng)修飾的E1A啟動子；E1A-Δ24，E1A蛋白的突變形式，其中缺失了多肽鏈第121～129位氨基酸；L1至L5，晚期基因；纖突RGD，通過在纖突H1環(huán)上插入RGD肽的經(jīng)RGD修飾的纖突。

圖2.包含插入在六鄰體中的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ABD)的腺病毒的圖像。與未修飾的腺病毒ICOVIR15(左圖)相比，經(jīng)ABD修飾的病毒ICOVIR-15-ABD(右圖)包被有血液中存在的白蛋白，使病毒與中和抗體隔離開。

圖3. ICOVIR15-ABD和ICOVIR15的病毒生產(chǎn)動力學(xué)。以800個病毒顆粒(vp)/細胞感染匯合成片的A549細胞。感染4小時(h)后去除病毒，用PBS洗滌細胞三次并用無病毒培養(yǎng)基培養(yǎng)。在感染后4、24、48和72小時收集細胞提取物，并用基于抗六鄰體染色的方法測量滴度。樣品通過一式三份進行評估。繪制了平均值±SD誤差線(雖然由于它們的值太低而難以辨別)。TU/mL，每毫升的轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。*與ICOVIR15組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(p≤0.05)。

圖4.比較了存在或不存在人血清白蛋白(HSA)的情況下，ICOVIR15和ICOVIR15-ABD的體外細胞毒性。使用指定病毒以10000～0.0001個病毒顆粒(vp)/細胞感染A549、Sk-mel28、HEK293和MCF-7細胞。示出了感染后第7天的IC₅₀值(導(dǎo)致細胞培養(yǎng)物存活力降低50％所需的vp/細胞)。對于每一細胞系，對三個不同的重復(fù)進行定量。繪制了平均值±SD誤差線。MOI，感染復(fù)數(shù)。

圖5.用ELISA檢測的ICOVIR15-ABD與人和小鼠白蛋白的結(jié)合。A)用人血清白蛋白或牛血清白蛋白(HSA或BSA，它們分別與ABD結(jié)合或不與ABD結(jié)合)包被孔。測試三種不同量的病毒蛋白，來檢測結(jié)合(0.25ng、2.5ng和25ng)。在與抗六鄰體蛋白的抗體以及經(jīng)過氧化物酶標記的二抗孵育之后，通過比色分析檢測與白蛋白包被的孔結(jié)合的ICOVIR15腺病毒和ICOVIR15-ABD腺病毒。樣品通過一式三份進行評估。繪制了平均值±SD誤差線。OD，光密度。*與其他組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(p≤0.05)。B)用牛血清白蛋白、人血清白蛋白或小鼠血清白蛋白(BSA、HSA或MSA)包被孔。所測試的病毒蛋白的量為25ng。在與抗六鄰體蛋白的抗體以及經(jīng)過氧化物酶標記的二抗孵育之后，使用比色分析檢測與白蛋白包被的孔結(jié)合的腺病毒。包括沒有腺病毒的對照模擬組。樣品通過一式三份進行評估。繪制了平均值±SD誤差線。OD，光密度。*與其他組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(p≤0.05)。

圖6.白蛋白結(jié)合在體外使腺病毒免受中和抗體的中和。將包被有或未包被人血清白蛋白(HSA)的AdGL和AdGL-ABD腺病毒與系列稀釋的中和抗體Ab6982在37℃下孵育1小時。然后加入HEK293細胞，以獲得0.5轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)/細胞的感染復(fù)數(shù)。感染后24小時，通過熒光素酶表達來分析細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。引入不含抗體(Ab)的空白對照組(“無Ab”對照)來獲得100％感染值。樣品通過一式三份進行評估。繪制了平均值±SD誤差線。

圖7.在使用人血清白蛋白(HSA)保護時，ICOVIR15-ABD在中和抗體存在情況下體外細胞毒性增加。存在或不存在人血清白蛋白(HSA)的情況下，將ICOVIR15和ICOVIR15-ABD與系列稀釋的中和抗體Ab6982(Nab，商業(yè)化的抗HAd5的多克隆抗體)孵育1小時。加入A549細胞以獲得600個病毒顆粒(vp)/細胞的感染復(fù)數(shù)。感染后第4天測量存活細胞(孔中的蛋白質(zhì)含量)的百分比。樣品通過一式三份進行評估。繪制了平均值±SD誤差線。

圖8. ABD的插入增加了腺病毒的血漿半衰期。給裸鼠注射比例為1:1的ICOVIR15和ICOVIR15-ABD混合物，總劑量為5×10¹⁰病毒顆粒(vp)/小鼠(n＝5)。給藥后5分鐘、15分鐘、1小時、4小時和24小時，收集血液樣品，并離心收集血清。對腺病毒六鄰體的高變區(qū)1(HVR1)進行PCR擴增并使用電泳對樣品進行分析。ABD的插入使HVR1的大小由299bp增加至361bp。凝膠給出了ICOVIR15-ABD:ICOVIR15基因組的幾種比例(0.2、1、5、10和50)的標準樣，注射前的對照(t0)，PCR的水陰性對照(H₂O)和血清樣本的PCR結(jié)(#1至#5)。

圖9.體內(nèi)全身給藥后，ICOVIR15-ABD的抗腫瘤活性。向帶有黑色素瘤皮下異種移植物的裸鼠(Sk-mel28)注射單次靜脈劑量的磷酸鹽緩沖液(PBS)、ICOVIR15或ICOVIR15-ABD(5×10¹⁰病毒顆粒(vp)/小鼠)。繪制了腫瘤體積±SEM(n＝10～12)。*與PBS組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(p≤0.05)。

圖10腺病毒預(yù)免疫的小鼠中保存的體內(nèi)肝臟和腫瘤，其中肝臟和腫瘤轉(zhuǎn)導(dǎo)有在六鄰體HVR1中經(jīng)白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域修飾的腺病毒載體。帶有黑色素瘤皮下異種移植物的C57BL/6小鼠(B16-CAR)經(jīng)腹膜內(nèi)注射hAd5wt(2×10¹⁰病毒顆粒(vp)/小鼠)或溶媒(vehicle)來免疫，7天后靜脈注射AdGL(GFP-熒光素酶載體)或AdGL-ABD(3×10¹⁰vp/小鼠)。3天后通過生物發(fā)光成像(IVIS)分析肝臟和腫瘤中的熒光素酶活性。繪制了平均值±SEM(肝臟n＝4～6，腫瘤n＝8～12)。sec：秒；sr：球面度。

圖11.在高變區(qū)5中插入ABD不影響病毒的存活。使用pAdZGL-H5-ABD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞以產(chǎn)生AdGL-H5-ABD病毒。一周后，收獲細胞及上清液，并且通過三次凍融循環(huán)進行裂解。通過噬菌斑測定，確定含病毒的細胞提取物在HEK293中的滴度。示出了對應(yīng)于稀釋1E6、1E7和1E8的孔，其中證明病毒增殖的噬菌斑是明顯的。

圖12.與在HVR1中插入白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域相反，在HVR5中插入同樣結(jié)構(gòu)域不能使腺病毒免受中和抗體的中和。在HEK293和Sk-mel28細胞中進行體外中和實驗來比較AdGL、AdGL-H1-ABD和AdGL-H5-ABD。在存在或不存在人血清白蛋白(HSA)的情況下，腺病毒與系列稀釋的中和抗體Ab6982孵育1小時。隨后加入細胞以獲得10病毒顆粒(vp)/細胞(HEK293)的感染復(fù)數(shù)及40vp/細胞(Sk-mel28)的感染復(fù)數(shù)。感染后24小時，通過熒光素酶表達來分析細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。引入不含抗體的對照組(Ab)(“無Ab”對照)來獲得100％感染值。樣品通過一式三份進行評估。繪制了平均值±SD誤差線。

具體實施方式

本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在衣殼外表面上，尤其在腺病毒六鄰體蛋白的外表面上經(jīng)白蛋白結(jié)合部分進行基因修飾的腺病毒能夠獲得白蛋白護罩，使病毒在全身給藥后能夠逃避中和抗體并延長其在血液中的保留時間。這一結(jié)果是出乎意料的，因為在先使用白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域來修飾腺病毒的嘗試，都沒有提高腺病毒免受中和抗體的中和(Hedley S.J.et al.2009.The Open Gene Therapy Journal,2:1-11)。

此外，當(dāng)重組腺病毒為溶瘤腺病毒時，白蛋白結(jié)合部分的插入改善了它抗腫瘤的活性。從這個意義上講，上述基因修飾的腺病毒具有克服全身給藥(尤其是用于癌癥治療)的局限性的潛在價值。

本發(fā)明的實例所提供的結(jié)果清楚地表明，包括編碼鏈球菌蛋白G白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ABD)的序列的選擇復(fù)制型溶瘤腺病毒(ICOVIR15-ABD)在其衣殼上暴露這一結(jié)構(gòu)域，促進了白蛋白結(jié)合，使腺病毒與中和抗體相隔離，延長了它的血漿半衰期并改善了它的抗腫瘤功效；其中該編碼鏈球菌蛋白G白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ABD)的序列插入在六鄰體蛋白編碼序列的高變區(qū)1(HVR1)中。本發(fā)明給出的實驗實例還表明，將鏈球菌蛋白G的ABD插入到復(fù)制缺陷型溶瘤腺病毒(AdGL-ABD)六鄰體蛋白的HVR1中，可使該腺病毒免受中和抗體的中和(圖6)。因此，這些結(jié)果表明腺病毒上的白蛋白包被起到護罩作用，將病毒蛋白隱藏起來，避開了血液中的多種不期望的相互作用(中和抗體、血細胞吸附和肝攝取)，改善了它的藥代動力學(xué)。這在腺病毒載體用于基因治療、疫苗或溶瘤腺病毒再次給藥時是非常重要的。因此，本發(fā)明的經(jīng)基因修飾的腺病毒適用于全身給藥。

本發(fā)明的腺病毒

本發(fā)明獲得的結(jié)果表明，在腺病毒六鄰體蛋白的外表面上包括白蛋白結(jié)合部分的腺病毒能為白蛋白所包覆，從而使自身免受血流中存在的中和抗體的中和。復(fù)制型腺病毒(ICOVIR15-ABD)和非復(fù)制型腺病毒(AdGL-ABD)均能觀察到這一保護效果。

在一個方面，本發(fā)明涉及具有腺病毒基因組的重組腺病毒，其特征在于，所述腺病毒基因組包括編碼白蛋白結(jié)合部分的序列，所述編碼白蛋白結(jié)合部分的序列插入在六鄰體蛋白的高變區(qū)1(HVR1)的編碼區(qū)中，從而表達包括六鄰體蛋白和白蛋白結(jié)合部分的融合蛋白，并且其中，當(dāng)所述六鄰體蛋白組裝在腺病毒衣殼中時，所述白蛋白結(jié)合部分位于所述六鄰體蛋白的外表面上。

如本文所使用的，術(shù)語“腺病毒”是指可被歸類為腺病毒的任意病毒，即，任何屬于腺病毒(Adenoviridae)科的病毒，其特征為含有雙鏈DNA基因組且具有二十面體核衣殼的無包膜病毒。該術(shù)語包括能感染人或動物的任意腺病毒，包括使用CAR作為感染靶細胞的受體的所有群、亞群和血清型。本發(fā)明的腺病毒包括但不限于禽、犬、馬、牛、羊、豬、人或蛙的腺病毒。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的腺病毒是人腺病毒，即，能感染人的腺病毒。根據(jù)本發(fā)明，“血清型”是指每一不同免疫類型的腺病毒。存在至少57種血清型的人腺病毒，這些血清型的人腺病毒被分為幾個亞群(A至G)。本發(fā)明考慮使用現(xiàn)有技術(shù)已知的任意血清型的腺病毒，包括但不限于表1中所限定的任意血清型。

表1.幾種適用于本發(fā)明的腺病毒的亞群和血清型的例子。

在一個優(yōu)選的實施方式中，所述人腺病毒選自由血清1型～血清57型的人腺病毒組成的組。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，所述腺病毒屬于C亞群，更優(yōu)選地，所述腺病毒為血清5型

血清5型人腺病毒(Ad5)與輕度呼吸道感染有關(guān)?？稍贕enBank：AY339865.1(2007年8月13日的版本)中找到血清5型人腺病毒的基因序列。

本發(fā)明的腺病毒為重組腺病毒。如本文所使用的，術(shù)語“重組”是指非天然出現(xiàn)的腺病毒。相對于野生型腺病毒，該重組腺病毒含有一種或多種修飾。所述修飾包括但不限于對包裝在顆粒中的腺病毒基因組進行的修飾，以產(chǎn)生感染性病毒。其他修飾允許通過去除病毒基因組中的復(fù)制關(guān)鍵基因，來獲得復(fù)制缺陷型病毒(即無法增殖的病毒)。示例性修飾包括現(xiàn)有技術(shù)已知的缺失，例如缺失E1a、E1b、E2a、E2b、E3或E4編碼區(qū)中的一個或多個編碼區(qū)。其他示例性修飾包括缺失腺病毒基因組的整個編碼區(qū)。這樣的腺病毒被稱為“無病毒”的腺病毒。還包括由不同血清型的元件組合而成的嵌合型腺病毒。

術(shù)語“重組”還包括條件復(fù)制型腺病毒，該條件復(fù)制型腺病毒是優(yōu)選在特定類型的細胞或組織中復(fù)制，而在其他類型的細胞或組織中復(fù)制較低或根本不復(fù)制。例如在本文所提供的腺病毒中，是在異常增生組織(如實體瘤或其他贅生物)中復(fù)制的腺病毒。這些條件復(fù)制型腺病毒包括美國專利第5,998,205號和美國專利第5,801,029號公開的病毒。這樣的病毒有時被稱為“細胞毒性”或“細胞病變”病毒(或載體)，并且如果它們對贅生性細胞具有這樣的效果時，則被稱為“溶瘤”病毒(或載體)。

在一個實施方式中，所述腺病毒是復(fù)制型腺病毒，尤其是溶瘤腺病毒。

在另一個實施方式中，所述腺病毒是非復(fù)制型腺病毒或復(fù)制缺陷型腺病毒。復(fù)制缺陷型腺病毒或非復(fù)制型腺病毒是指不能在靶細胞中復(fù)制的腺病毒，它在基因治療中用作基因載劑來靶向細胞，因為目的是在細胞內(nèi)表達治療性基因而不裂解細胞。

本發(fā)明的重組腺病毒通過在腺病毒六鄰體蛋白的外表面上插入外源序列來進行修飾。優(yōu)選的，所述外源序列編碼白蛋白結(jié)合部分。

腺病毒顆粒構(gòu)成包裹病毒DNA的衣殼。如本文所使用的，術(shù)語“衣殼”指病毒的蛋白質(zhì)外殼，由被稱作殼粒的亞基形成，殼?？梢允俏暹呅位蛄呅巍Ｏ俨《疽職ぞ哂卸骟w，該二十面體具有20個等邊三角形面。大多數(shù)衣殼由六鄰體蛋白形成，每個頂點具有由五鄰體基底和纖突蛋白形成的復(fù)合物。

如本文所使用的，術(shù)語“腺病毒六鄰體蛋白”或“六鄰體蛋白”(以前稱為“蛋白II”)是指在腺病毒中發(fā)現(xiàn)的主要的結(jié)構(gòu)性衣殼蛋白，六鄰體蛋白自結(jié)合為三聚體，每個都是六邊形。240個六鄰體三聚體組裝成腺病毒衣殼。六鄰體蛋白對病毒衣殼的組裝，衣殼二十面體對稱性的確定和衣殼的完整性來說是必需的。不同血清型的腺病毒共享六鄰體蛋白的主要結(jié)構(gòu)特性，但不同血清型之間的六鄰體蛋白的大小和免疫學(xué)性質(zhì)是不同的。在本發(fā)明中，術(shù)語“六鄰體蛋白”涵蓋任意腺病毒的六鄰體蛋白，包括但不限于：于2014年2月19日提交的UniProt數(shù)據(jù)庫登錄號為P04133的序列所限定的蛋白，該蛋白對應(yīng)于C亞群血清5型人腺病毒的六鄰體蛋白；于2014年2月19日提交的UniProt數(shù)據(jù)庫登錄號為P03277的序列所限定的蛋白，該蛋白對應(yīng)于C亞群血清2型人腺病毒的六鄰體蛋白；于2014年2月19日提交的UniProt數(shù)據(jù)庫登錄號為P42671的序列所限定的蛋白，該蛋白對應(yīng)于禽腺病毒gal1(Phelps株)的六鄰體蛋白；以及，于2014年2月19日提交的UniProt數(shù)據(jù)庫登錄號為P11819的序列所限定的蛋白，該蛋白對應(yīng)F亞群血清40型人腺病毒的六鄰體蛋白。該表述包括六鄰體蛋白在其他亞群或血清型中天然出現(xiàn)的所有天然變體。

在本發(fā)明中，“六鄰體蛋白的外表面”這一表述是指六鄰體蛋白的暴露在衣殼表面上的區(qū)域。為了弄清楚本發(fā)明的白蛋白結(jié)合部分是被引入到腺病毒六鄰體蛋白的內(nèi)部還是外表面，可如本專利申請實驗部分中公開的進行與人血清白蛋白結(jié)合的檢測測定(例如ELISA測定)或體外中和測定。如果人血清白蛋白能與腺病毒結(jié)合，則白蛋白結(jié)合部分已經(jīng)被引入至腺病毒六鄰體蛋白的外表面。

據(jù)報道，六鄰體蛋白的環(huán)1(L1)和環(huán)2(L2)暴露在病毒殼粒結(jié)構(gòu)的外側(cè)。L1含有6個高變區(qū)(HVR)，即HVR1至HVR6，而L2含有第7高變區(qū)(HVR7)。

如本文所使用的，術(shù)語“高變區(qū)”或“HVR”是指長度及序列在各血清型腺病毒之間不同的區(qū)域，形成表面暴露的環(huán)的一部分。對于三聚體的每一亞單位，腺病毒六鄰體有7個高變區(qū)(Biere B and Schweiger B.J Clin Virol 2010；47(4):366-371)。在本發(fā)明的上下文中，HVR所用的命名法公開在Crawford-Miksza和Schnurr中(Crawford-Miksza and Schnurr.1996.Virology,224(2):357-367)。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式中，HVR是HVR1。在HVR區(qū)域中插入特定殘基導(dǎo)致每個腺病毒載體有240次×3或總共720次插入。在一個優(yōu)選的實施方式中，插入編碼白蛋白結(jié)合部分的序列，所得到的融合蛋白在六鄰體蛋白的D150氨基酸(根據(jù)日期為2008年6月14日的GenBank登錄號BAG48782.1的六鄰體蛋白的編號，該六鄰體蛋白對應(yīng)于來源為血清5型人腺病毒的六鄰體蛋白)后含有白蛋白結(jié)合部分。在一個更優(yōu)選的實施方式中，完整的經(jīng)修飾的腺病毒六鄰體的核苷酸序列為SEQ ID NO：3，該腺病毒六鄰體具有插入在HVR1中的ABD(ABD-HVR1)。發(fā)明人已經(jīng)證明在另一個HVR(具體為HVR5)中插入白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生活病毒，但不能使腺病毒免受中和抗體中和。本專利申請的實例顯示，將編碼白蛋白結(jié)合部分的序列插入至HVR5中，所得到的融合蛋白在六鄰體蛋白的A274氨基酸(根據(jù)日期為2008年6月14日的GenBank登錄號BAG48782.1的六鄰體蛋白的編號，該六鄰體蛋白對應(yīng)于來源為血清5型人腺病毒的六鄰體蛋白)后含有白蛋白結(jié)合部分。完整的經(jīng)修飾的腺病毒六鄰體的核苷酸序列為SEQ ID NO：4，該腺病毒六鄰體具有插入在HVR5中的ABD(ABD-HVR5)。圖12顯示出，白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域插入在HVR1中時是有功能的，而插入在HVR5中時是沒有功能的。

白蛋白結(jié)合部分可直接附接在六鄰體蛋白上，即白蛋白結(jié)合部分的N-末端和C-末端直接與六鄰體蛋白相連。然而，白蛋白結(jié)合部分也可以利用連接子序列與六鄰體蛋白相連。因此，在另一個實施方式中，白蛋白結(jié)合部分的N-末端和/或C-末端通過連接子序列與六鄰體蛋白相連。

如本文所使用的，術(shù)語“連接子序列”是指在六鄰體蛋白與白蛋白結(jié)合部分之間作為鉸鏈區(qū)的氨基酸序列，其在兩個元件間提供了空間，保證六鄰體蛋白的二級結(jié)構(gòu)不受ABD部分的存在的影響，反之亦然。連接子可具有允許兩個元件彼此獨立運動，同時保持各元件的三維形式的任意長度。在一個優(yōu)選的實施方式中，連接子序列是長度為31個氨基酸或更少的柔性連接子肽。更優(yōu)選的，連接子序列包括少于10個氨基酸、少于5個氨基酸、少于4個氨基酸或2個氨基酸。在一個實施方式中，連接子序列包括選自由甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸組成的組中的2個或更多個氨基酸。在另一個實施方式中，所述連接子序列是聚甘氨酸鏈接子。示例性且非限制性地，連接子序列的實例包括SGGTSGSTSGTGST(SEQ ID NO：5)、AGSSTGSSTGPGSTT(SEQ ID NO：6)、GGSGGAP(SEQ ID NO：7)和GGGVEGGG(SEQ ID NO：8)。這些序列已用于使設(shè)計的卷曲螺旋與其他蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合(Muller,K.M.et al.Meth.Enzymology,2000,328:261-281)。優(yōu)選的，連接子序列包括序列GSGS(SEQ ID NO：2)。本領(lǐng)域已知的其他連接子也可替代使用(Reddy Chichili,VP.,Kumar,V.,and Sivaraman,J.(2013).Linkers in the structural biology of protein-protein interactions.Protein Science 22(2):153-67)。

因此，本發(fā)明的腺病毒在六鄰體蛋白的外表面上具有白蛋白結(jié)合部分，從而使腺病毒的衣殼包被有白蛋白。

如本文所使用的，術(shù)語“白蛋白”是指白蛋白家族蛋白的成員，白蛋白家族蛋白是水溶性球蛋白，適度溶于濃鹽溶液中并且經(jīng)歷熱變性。白蛋白一般發(fā)現(xiàn)于血漿中。血清白蛋白由肝臟產(chǎn)生，溶解于血漿中，是哺乳動物中最豐富的血蛋白。特別的，術(shù)語“血清白蛋白”是指人體內(nèi)由ALB基因(UniGene Hs.418167)編碼的球蛋白。人血清白蛋白是通過Uniprot數(shù)據(jù)庫登錄號為P02768的序列(日期為2014年3月19日)所定義的球蛋白。

如本文所使用的，術(shù)語“白蛋白結(jié)合部分”是指能結(jié)合白蛋白的任意氨基酸序列，即具有白蛋白結(jié)合親和力的任意氨基酸序列。優(yōu)選的，其能結(jié)合血清白蛋白；更優(yōu)選的，能結(jié)合人血清白蛋白。術(shù)語“白蛋白結(jié)合部分”包括但不限于天然存在的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ABD)(諸如存在于細菌蛋白中的ABD)及來自合成肽的白蛋白結(jié)合序列。在一個優(yōu)選的實施方式中，白蛋白結(jié)合部分選自鏈球菌蛋白G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、大消化鏈球菌(Peptostreptococcus magnus)蛋白PAB的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO：9)的白蛋白結(jié)合肽，和它們的功能等同變體。在一個更優(yōu)選的實施方式中，白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域來自鏈球菌蛋白G。

術(shù)語“白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指天然存在的蛋白中能以足夠的特異性與白蛋白結(jié)合，以確保免受中和抗體中和的任意區(qū)域。

如本文所使用的，術(shù)語“鏈球菌蛋白G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“鏈球菌蛋白G的ABD”是指由能形成三螺旋束的46個氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)域(Kraulis P.J.et al.FEBS Lett,1996；378:190-4)，能以高親和力與人白蛋白和小鼠白蛋白結(jié)合，但不與牛白蛋白結(jié)合(Konig T.and Skerra A.J Immunol Methods,1998；218:73-83)。鏈球菌蛋白G中有多個白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個優(yōu)選的結(jié)構(gòu)域中，白蛋白結(jié)合部分是來自鏈球菌蛋白G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域3。優(yōu)選的，鏈球菌蛋白G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域3的序列為SEQ ID NO：1。

如本文所使用的，術(shù)語“大消化鏈球菌(Peptostreptococcus magnus)蛋白PAB的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指被稱為“GA模塊”的，來源于大芬戈爾德菌(Finegoldia magna)(原名為大消化鏈球菌(Peptostreptococcus magnus))蛋白PAB的，能與白蛋白結(jié)合的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Lejon S et al.2004.J Biol Chem 279:42924-42928)。大芬戈爾德菌(Finegoldia magna)蛋白PAB是通過GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號為CAA54857.1的序列(日期為2004年9月9日)所定義的蛋白。

如本文所使用的，術(shù)語“具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO：9)的白蛋白結(jié)合肽”是指Dennis MS et al.(J Biol Chem.2002.277:35035-35043)中公開的，來源于噬菌體克隆RA和SA的結(jié)合白蛋白的肽。

本發(fā)明還包括上述白蛋白結(jié)合部分的功能等同變體。如本文所使用的，術(shù)語“功能等同變體”是指來源于白蛋白結(jié)合部分，通過插入、缺失或取代一個或多個殘基，并仍基本保持與上述白蛋白相互作用的能力的任意多肽。在一個優(yōu)選的實施方式中，如果多肽與白蛋白的結(jié)合能力是SEQ ID NO：1所示白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域與白蛋白結(jié)合能力的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，則認為該多肽是白蛋白結(jié)合部分的功能等同變體。優(yōu)選的，如果多肽能以SEQ ID NO：1所示白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合白蛋白的效率的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％來結(jié)合白蛋白，則認為該多肽是白蛋白結(jié)合部分的功能等同變體。

適合的功能性變體是指那些與本發(fā)明公開的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或白蛋白結(jié)合序列有至少25％氨基酸序列同一性，例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的功能性變體。兩個多肽間的同一性通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的計算機算法和方法來確定。兩個多肽間的同一性優(yōu)選通過使用BLASTP算法[BLAST Manual,Altschul,S.,et al.,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894,Altschul,S.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]來確定，但也可以使用其他類似的算法。根據(jù)如本文所述的參數(shù)，使用BLAST和BLAST 2.0來確定百分比序列同一性。進行BLAST分析的軟件公開于美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)。

白蛋白結(jié)合部分的功能等同變體可以是白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)和白蛋白結(jié)合序列的衍生物。術(shù)語“衍生物”包括但不限于來源于細菌的，經(jīng)修飾以增加對白蛋白親和力的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如Johansson MU.等(J Biol Chem.2002.277:8114-8120)、Jonsson A.等(Protein Eng Des Sel.2008.21:515-527)和Linhult M.等(Protein Sci.2002.11:206-213)中公開的那些。例如，衍生物可以是Jonsson A.等(Protein Eng Des Sel.2008.21:515-527)中公開的經(jīng)修飾的鏈球菌G ABD ABD035。

重組腺病毒可通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的標準分子生物學(xué)技術(shù)(Chillon and Bosch.Adenovirus.Methods and Protocols.3rd edition.Methods in Molecular Biology,vol.1089.Springer Protocols.Humana Press.(2014))來獲得。

按照如在夏蘭和博氏的腺病毒.方法和步驟.第三版.分子生物學(xué)的方法.第1089卷.Springer實驗室指南.胡曼那出版社(Chillon and Bosch.Adenovirus.Methods and Protocols.3rd edition.Methods in Molecular Biology,vol.1089.Springer Protocols.Humana Press.(2014))，和Alemany R,Zhang W.的溶瘤腺病毒載體.Totowa,NJ.：胡曼那出版社(Alemany R,Zhang W.Oncolytic adenoviral vectors.Totowa,NJ.:Humana Press,1999)所公開的腺病毒載體領(lǐng)域的標準方法，使含有本發(fā)明的白蛋白結(jié)合部分的腺病毒進行增殖和擴增。通常用于基因治療和病毒治療領(lǐng)域的細胞系為HEK-293和A549細胞系。優(yōu)選的增殖方法是感染可復(fù)制腺病毒的細胞系。肺腺癌A549細胞系是這種細胞系的一個例子。增殖例如通過下述方式進行：將A549細胞接種在塑料細胞培養(yǎng)板上，然后每個細胞使用100個病毒顆粒進行感染。兩天后，當(dāng)細胞分離形成“葡萄狀”簇時，細胞病變效應(yīng)證實了病毒的產(chǎn)生。將細胞收獲在管中。1000g離心5分鐘后，將細胞沉淀塊凍融3次來破碎細胞。得到的細胞提取物1000g離心5分鐘，使用氯化銫梯度對含有病毒的上清液分層，35000g離心1小時。收集從梯度中獲得的病毒條帶，并且使用另一氯化銫梯度對其進行分層，35000g離心16小時。收集病毒條帶，并且使用PBS-10％甘油進行透析。分裝透析后的病毒并保存于-80℃。按照標準方案，來定量病毒顆粒和空斑形成單位的數(shù)量。含5％甘油的磷酸鹽緩沖液(PBS)是儲存腺病毒的標準制劑。然而，還描述了改善病毒穩(wěn)定性的其他制劑。

用于預(yù)防或治療癌癥的含白蛋白結(jié)合部分的腺病毒的純化方法，與所描述的用于癌癥的病毒治療或基因治療的其他腺病毒或腺病毒載體的純化方法相同。

腺病毒可用于靶向異常細胞，例如，在體內(nèi)有害的或其他不需要的任何細胞。廣泛例子包括引起自身免疫疾病、再狹窄和瘢痕組織形成的細胞。

本發(fā)明的腺病毒可在體內(nèi)選擇性分布在特定的組織中，而在非靶向或非腫瘤組織中不表達或表達顯著減少。

本發(fā)明的復(fù)制型腺病毒可能在其基因組序列中具有修飾，賦予其在細胞中選擇性復(fù)制的能力。為了引導(dǎo)腺病毒在需要表達的組織中或待治療的腫瘤組織中表達，本發(fā)明的腺病毒可包括組織特異性啟動子或腫瘤特異性啟動子。因此，在一個實施方式中，腺病毒進一步包括組織特異性啟動子或腫瘤特異性啟動子。

在一個優(yōu)選的實施方式中，組織特異性啟動子或腫瘤特異性啟動子是控制選自由E1a、E1b、E2和E4組成的組中的一個或多個基因表達的啟動子序列。優(yōu)選的，啟動子控制E1a的表達。

如本文所使用的，術(shù)語“啟動子”根據(jù)本領(lǐng)域公認的含義使用。這旨于指與RNA聚合酶結(jié)合并且將酶導(dǎo)向正確的轉(zhuǎn)錄起始位點的DNA區(qū)域，通常在基因編碼序列的上游。所述啟動子控制啟動復(fù)制的病毒基因。

術(shù)語“組織特異性”旨于指啟動子在該組織中特異性起發(fā)揮功能，以便在該組織中進行復(fù)制，其中復(fù)制所須基因與該啟動子可操作地連接。這可通過激活啟動子的陽性轉(zhuǎn)錄因子存在于該組織中，而不存在于非靶組織中來發(fā)生。這還可通過缺乏轉(zhuǎn)錄抑制因子來發(fā)生，其中轉(zhuǎn)錄抑制因子正常存在于非靶組織中并且通過啟動子而阻止轉(zhuǎn)錄。因此，當(dāng)發(fā)生轉(zhuǎn)錄時，它進行到復(fù)制所須基因中，從而在靶組織中發(fā)生載體的復(fù)制及伴隨的功能。

對于靶向特定組織類型的異常對應(yīng)部分的同時，避開該組織的正常對應(yīng)部分，或者在避開除異常組織之外的周圍不同類型的組織的同時來治療異常組織，組織特異性是特別有意義的。在一個具體的實施方式中，啟動子是“腫瘤特異性的”，這意味著啟動子特異性地在腫瘤組織中發(fā)揮功能。例如，本發(fā)明的重組腺病毒可用于治療肝轉(zhuǎn)移。一個具體例子是結(jié)腸癌，其經(jīng)常轉(zhuǎn)移至肝臟中。已發(fā)現(xiàn)即使是在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移至肝臟中時，CEA啟動子在轉(zhuǎn)移灶的細胞中是有活性的，而在正常肝臟細胞中是沒有活性的。因此，成年人正常肝臟不支持病毒的復(fù)制，該病毒具有與結(jié)腸癌CEA特異性啟動子相連的復(fù)制所須的病毒基因。復(fù)制會發(fā)生在原發(fā)性癌細胞中。另一個例子是甲胎蛋白啟動子，其僅在肝細胞癌中有活性。又一個例子是酪氨酸酶啟動子，其僅在黑色素瘤中有活性，而在正常皮膚中沒有活性。在每種情況下，僅希望在異常細胞中進行復(fù)制，而不在正常細胞中進行復(fù)制。

組織特異性啟動子的例子是但不限于甲胎蛋白啟動子、DE3啟動子、酪氨酸酶啟動子、癌胚抗原(CEA)啟動子、表面活性蛋白啟動子、E2F啟動子、端粒酶hTERT啟動子、前列腺特異性抗原啟動子、COX-2啟動子、白蛋白基因啟動子、肝炎病毒核心啟動子、與甲狀腺素結(jié)合的球蛋白結(jié)合蛋白的啟動子以及ErbB2啟動子。

在一個優(yōu)選的實施方式中，啟動子選自由E2F啟動子、端粒酶hTERT啟動子、酪氨酸酶啟動子、前列腺特異性抗原啟動子、甲胎蛋白啟動子和COX-2啟動子組成的組。

本發(fā)明的腺病毒尤其可用于治療癌癥。所有腫瘤潛在地能使用本發(fā)明的腺病毒進行治療。腫瘤類型包括但不限于造血系統(tǒng)、胰腺、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、胃腸道、內(nèi)分泌、膽道、竇肺、頭和頸、軟組織肉瘤和癌、皮膚、生殖道等。治療的優(yōu)選腫瘤是那些相對正常組織有著高有絲分裂指數(shù)的腫瘤，優(yōu)選實體瘤。

在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的腺病毒是溶瘤腺病毒。

如本文所使用的，術(shù)語“溶瘤腺病毒”是指在腫瘤細胞中能夠復(fù)制或具備復(fù)制能力的任意腺病毒，甚至沒有選擇性。溶瘤腺病毒的治療作用基于復(fù)制和裂解待消除的腫瘤細胞的能力。腫瘤細胞的死亡可通過現(xiàn)有技術(shù)中的任意方法來檢測，例如確定活細胞數(shù)量、細胞病變效應(yīng)、腫瘤細胞凋亡、腫瘤細胞中的病毒的合成(例如通過代謝標記、病毒蛋白的蛋白印記(Western blot)或使用復(fù)制所需病毒基因的反轉(zhuǎn)錄來進行PCR)或腫瘤尺寸的減小。

實現(xiàn)在腫瘤中的選擇性復(fù)制的另一個策略是缺失正常細胞中復(fù)制所需的，但在腫瘤細胞中不需要的病毒功能。這包括，例如缺失阻斷視網(wǎng)膜母細胞瘤(pRB)通路的早期E1A功能。幾篇現(xiàn)有技術(shù)文獻已經(jīng)證實了這些突變體的選擇性復(fù)制。與pRB直接相互作用的其他病毒基因，如E4和E4orf6/7，是待缺失的候選基因，以在腫瘤細胞中實現(xiàn)選擇性復(fù)制。

另一個在腫瘤中實現(xiàn)選擇性復(fù)制的修飾是缺失編碼病毒相關(guān)RNA(VA-RNA)的腺病毒基因。這些RNA阻斷干擾素的抗病毒活性，而它們的缺失引起腺病毒對干擾素抑制敏感。由于干擾素通路在腫瘤細胞特中特有的截斷，所述腺病毒在腫瘤中正常復(fù)制。

因此，在另一個實施方式中，本發(fā)明的腺病毒進一步包括在選自由E1a、E1b、E4和VA-RNA組成的組的一個或多個基因中的突變，從而實現(xiàn)在腫瘤中的選擇性復(fù)制。優(yōu)選的，突變在E1a中。在一個優(yōu)選的實施方式中，E1a中的突變是缺失E1A蛋白中影響E1A與pRB相互作用的一些氨基酸，優(yōu)選缺失多肽鏈的第121～129位氨基酸(Δ24缺失)。

如本文所使用的，“選擇性復(fù)制”的表述是指腺病毒在腫瘤細胞中的復(fù)制效率高于在正常細胞中的復(fù)制效率(例如比正常細胞中高1000倍)。

如本文所使用的，術(shù)語“復(fù)制”是指在核酸水平或在感染性病毒顆粒水平上發(fā)生的腺病毒載體的加倍。在DNA病毒的情況下，核酸水平的復(fù)制是DNA復(fù)制。然而，復(fù)制還包括感染性DNA病毒顆粒的形成。

可通過熟知技術(shù)來測定腺病毒的復(fù)制。對細胞中腺病毒載體復(fù)制的測定通常涉及檢測多核苷酸、病毒粒子或感染性病毒?？捎糜谶@一目的各種熟知方法涉及確定在給定時段中，摻入細胞多核苷酸中的標記底物的數(shù)量。

當(dāng)復(fù)制涉及DNA多核苷酸時，常用³H-胸腺嘧啶作為標記底物。在這種情況下，通過從大量細胞DNA中分離載體DNA并測量特異性摻入載體DNA的氚量，來確定復(fù)制的量。

還可通過裂解或滲透細胞以釋放多核苷酸，然后分離多核苷酸并直接定量所回收的DNA或RNA，來檢測多核苷酸載體的復(fù)制。還可通過定量PCR來檢測多核苷酸的復(fù)制，其中定量PCR使用特異性針對待測多核苷酸的引物。

可通過以下方式來測定病毒粒子：本領(lǐng)域熟知的電子顯微鏡計數(shù)技術(shù)；分離病毒粒子并確定蛋白和核苷酸量；以及，對病毒基因組多核苷酸或病毒粒子蛋白進行標記，并且根據(jù)多核苷酸或蛋白的量確定病毒粒子的量。

實現(xiàn)腺病毒對腫瘤細胞的選擇性的另一個策略是，修飾感染宿主細胞所牽涉的病毒衣殼蛋白，使腺病毒靶向腫瘤細胞中存在的受體。修飾病毒用來感染細胞的衣殼蛋白也可用于增加腺病毒的感染性(即增加病毒進入細胞中)。還可腺病毒靶向腫瘤也可通過雙官能團配體來實現(xiàn)，其中雙官能團配體的一個末端與病毒結(jié)合，另一末端與腫瘤受體結(jié)合。

因此，在另一個實施方式中，本發(fā)明的腺病毒進一步包括增加其感染性或?qū)⑵浒邢蚰[瘤細胞中存在的受體的衣殼修飾。在一個更優(yōu)選的實施方式中，衣殼修飾是將RGD模體(精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺模體)插入在腺病毒纖突蛋白的H1環(huán)中。該插入使腺病毒能用整合素?？坑诩毎?，而不像野生型腺病毒那樣僅僅內(nèi)化。使用整合素作為病毒的細胞受體增加了感染性和溶瘤的效力。在另一個實施方式中，溶瘤腺病毒具有利用腺病毒纖突中的KKTK(SEQ ID NO：10)硫酸乙酰肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域被替換為結(jié)構(gòu)域RGDK(SEQ ID NO：11)(N.Bayo et al.Human Gene Therapy 2009,20:1214-21)進行修飾的衣殼。另一個增加腺病毒對靶細胞的感染性的策略是纖突的一部分被替換為不同血清型的同源部分。通常，源自血清5型的人腺病毒的纖突軸(shaft)和纖突結(jié)(knob)被替換為源自血清3型或血清35型人腺病毒的纖突軸和纖突結(jié)。具有來自不同血清型的基因組的重組腺病毒在本領(lǐng)域中被稱作嵌合型腺病毒。在另一個實施方式中，本發(fā)明的腺病毒進一步包括源自不同的血清型腺病毒的嵌合型衣殼。在另一個優(yōu)選的實施方式中，對衣殼的修飾是將纖突基因的一部分替換為不同血清型腺病毒的同源部分，從而形成嵌合型腺病毒。

在一個優(yōu)選的實施方式中，溶瘤腺病毒是腫瘤選擇性復(fù)制的腺病毒，其特征是：含有E1A蛋白的突變體，其中缺失了多肽鏈中影響E1a與pRB相互作用的第121～129位氨基酸(Δ24缺失)；在E1a內(nèi)源啟動子中插入了4個E2F結(jié)合位點和一個Sp1結(jié)合位點，以控制E1a的表達；最后，在腺病毒纖突中插入了RGD肽，以增加病毒的感染性。ICOVIR15-ABD是本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式。所述修飾可以單獨存在，或組合地存在于同一腺病毒中。

在一個優(yōu)選的實施方式中，溶瘤腺病毒是腫瘤選擇性復(fù)制的腺病毒，其特征是在E1A蛋白中缺失了影響E1a與pRB相互作用的一些氨基酸，優(yōu)選缺失了多肽鏈的第121～129位氨基酸(Δ24缺失)。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，溶瘤腺病毒是腫瘤選擇性復(fù)制的腺病毒，其特征是在E1a內(nèi)源啟動子中插入了4個E2F結(jié)合位點和一個Sp1結(jié)合位點，以控制E1a的表達。

在另一個優(yōu)選的實施方式中，溶瘤腺病毒是腫瘤選擇性復(fù)制的腺病毒，其特征是在腺病毒纖突中插入了RGD肽，以增加病毒的感染性。

腺病毒的基因組可還含有編碼治療性蛋白的外源基因，以便該外源基因可在感染的細胞內(nèi)表達。如本文所使用的，“治療性蛋白”是指當(dāng)在給定細胞內(nèi)表達時預(yù)期能提供一些治療益處的蛋白。所述外源基因產(chǎn)物可以被包含在復(fù)制或非復(fù)制的腺病毒中。插入的治療性基因可以是基因治療或疫苗接種中使用的任何基因。優(yōu)選的，外源基因用于癌癥的基因治療。在溶瘤腺病毒基因組中插入治療性基因生成“武裝溶瘤腺病毒”，增加了溶瘤腺病毒對腫瘤細胞的細胞毒性。例如，所述外源基因能引起腫瘤細胞的死亡，激活免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤，抑制血管生成，消除細胞外機制，誘導(dǎo)凋亡等。在這些情況下，治療性基因的表達方式和時間對治療方法的最終結(jié)果是至關(guān)重要的。

因此，在一個實施方式中，腺病毒包括插入所述腺病毒基因組中的一個或多個非腺病毒基因。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述基因是用于基因治療或疫苗接種的基因。在一個更優(yōu)選的實施方式中，所述基因是用于癌癥的基因治療的基因。優(yōu)選的，用于癌癥的基因治療的基因是選自由前藥激活基因、腫瘤抑制基因、編碼抗腫瘤干擾RNA的基因和免疫刺激基因組成的組中的至少一種基因。

如本文所使用的，術(shù)語“非腺病毒基因”是指在野生型腺病毒基因組中不存在的外源基因。

如本文所使用的，術(shù)語“用于基因治療的基因”是指可用作藥物的基因，該藥物通過將所述治療性DNA遞送至患者細胞中來預(yù)防或治療遺傳性或獲得性疾病或病癥。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，術(shù)語基因治療涉及使用編碼功能性、治療性基因的DNA來替代突變基因，或使用編碼治療性蛋白的DNA。例如，DNA可編碼具有治療價值的酶、激素、受體或多肽?？捎糜谥委熯m用基因治療的疾病的任何基因都可以插入至本發(fā)明的腺病毒的腺病毒基因組中。用于基因治療的基因可以是但不限于編碼酶、血液衍生物、激素、白介素、干擾素、TNF、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)，或它們前體或合成酶，營養(yǎng)因子(即BDNF、CNTF、NGF、IGF，GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等)的基因；載脂蛋白，即ApoAI、ApoAIV、ApoE等；肌營養(yǎng)不良蛋白或小肌營養(yǎng)不良蛋白；腫瘤抑制基因，即p53、Rb、RaplA、DCC、k-rev；編碼參與凝血的因子(即因子VII、因子VIII、因子IX)的基因；前藥激活基因，即胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶；天然或人工免疫球蛋白(Fab、ScFv等)的全部或一部分。治療基因還可以是反義基因或序列，該反義基因或序列在靶細胞中的表達能使基因表達或細胞mRNA的轉(zhuǎn)錄受到控制。

如本文所使用的，術(shù)語“用于疫苗接種的基因”是指編碼抗原肽的基因，該抗原肽能夠在人或動物中生成免疫應(yīng)答，以生產(chǎn)預(yù)防性或治療性疫苗。所述抗原肽可以是但不限于對人類皰疹病毒(Epstein-Barr virus)、HIV病毒、乙型肝炎病毒、偽狂犬病毒和腫瘤特異性肽具有特異性的那些抗原肽。

如本文所使用的，術(shù)語“前藥激活基因”是指編碼以下產(chǎn)物的基因，該產(chǎn)物作用于無毒性前藥，使該無毒性前藥轉(zhuǎn)化為對靶組織有毒性的形式。優(yōu)選的，毒素具有抗腫瘤活性或消除細胞增殖。

前藥激活基因的例子包括但不限于胸苷激酶的基因。單純皰疹病毒的胸苷激酶使更昔洛韋磷酸化，以產(chǎn)生核苷酸毒素更昔洛韋磷酸鹽。該化合物起到鏈終止子和DNA聚合酶抑制劑的作用，阻止DNA合成，因此是有細胞毒性的。在一個實施方式中，前藥激活基因是胸苷激酶的基因，優(yōu)選是選自由單純皰疹病毒胸苷激酶、巨細胞病毒胸苷激酶和水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶組成的組中的病毒胸苷激酶。當(dāng)使用病毒胸苷激酶時，相互作用劑或化療劑優(yōu)選是核苷類似物，例如選自由更昔洛韋、阿昔洛韋和1-2-脫氧-2-氟-D-阿拉伯呋喃糖基-5-碘尿嘧啶(FIAU)組成的組中的一種。病毒胸苷激酶有效地利用上述相互作用劑作為底物，從而使上述相互作用劑極具威脅地摻入至表達病毒胸苷激酶的腫瘤細胞的DNA中，從而導(dǎo)致靶細胞死亡。在另一個實施方式中，前藥激活基因是胞嘧啶脫氨酶。胞嘧啶脫氨酶將5'-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為具有高細胞毒性的抗癌藥物5'-氟尿嘧啶。因此，表達胞嘧啶脫氨酶基因的靶細胞將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶并被殺死。關(guān)于這種“自殺”基因的討論，參見Blaese,R.M.et al.,Eur.J.Cancer 30A:1190-1193(1994)。

如本文所使用的，術(shù)語“腫瘤抑制基因”是指抗癌基因，或保護細胞免于在通向癌癥之路上的一個步驟的基因。當(dāng)這些基因中的一個發(fā)生突變導(dǎo)致其功能喪失或降低時，細胞會發(fā)展為癌癥，這通常與其他基因變化相結(jié)合。

腫瘤抑制基因的例子是但不限于TP53基因編碼的p53腫瘤抑制蛋白，PTEN、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7和ST14。

如本文所使用的，術(shù)語“編碼抗腫瘤干擾RNA的基因”是指編碼用于治療腫瘤的治療有用性RNA分子的基因，即siRNA(Dorsett and Tuschl(2004)Nature Rev Drug Disc 3:318-329)。在一些情況下，基因可以摻入本發(fā)明的重組腺病毒中，以進一步增強腺病毒根除單核細胞/巨噬細胞系的能力，但對細胞本身沒有任何直接影響。這包括編碼能抑制因子活性的siRNA的基因，其損害MHC I類呈遞、阻斷補體、抑制IFN和IFN誘導(dǎo)的機制、趨化因子和細胞因子、基于NK細胞的殺傷、下調(diào)免疫應(yīng)答(如IL-10、TGF-β)，和能夠分解細胞外基質(zhì)的金屬蛋白酶，并且增強病毒在腫瘤內(nèi)的播散。

如本文所使用的，術(shù)語“免疫刺激基因”是指激活免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤的基因。外源基因或其片段的進一步例子包括編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白，如細胞因子或趨化因子的那些外源基因或其片段。例子包括：白細胞介素2，美國專利號4,738,927或5,641,665；白細胞介素7，美國專利號4,965,195或5,328,988；和白細胞介素12，美國專利號5,457,038；腫瘤壞死因子α，專利號4,677,063或5,773,582；干擾素γ，美國專利號4,727,138或4,762,791；或GM CSF，美國專利號5,393,870或5,391,485，Mackensen et al.(1997)Cytokine Growth Factor Rev.8：119-128)。

腺病毒基因組中的這些修飾不相互排斥。

本發(fā)明的腺病毒基因組

本發(fā)明還涉及腺病毒的基因組。在一方面，本發(fā)明涉及腺病毒基因組，其特征是該腺病毒基因組包括插入在六鄰體蛋白高變區(qū)1(HVR1)編碼區(qū)中的編碼白蛋白結(jié)合部分的序列，這樣得到包括六鄰體蛋白和白蛋白結(jié)合部分的融合蛋白的表達，其中當(dāng)所述六鄰體蛋白組裝在腺病毒衣殼中時，所述白蛋白結(jié)合部分位于所述六鄰體蛋白的外表面上。

如本文所使用的，“腺病毒基因組”的表述是指雙鏈DNA序列，該雙鏈DNA序列在合適的蛋白存在時可以被包裝，以得到完整的腺病毒顆粒。為了發(fā)生這一包裝，所述序列必須符合一些條件，將這些條件總結(jié)如下：

-呈現(xiàn)隔離開的腺病毒ITR，在它的一個端點上一個；

-包括在兩個ITR之間的包裝信號Psi，其位置使得包裝信號Psi的5’末端與最接近的ITR3’末端之間的距離不超過會阻止天然腺病毒包裝的距離；在血清5型人腺病毒情況下為200個堿基對的距離，通過類推，假設(shè)該距離在其他血清型的情況中近似相等，因為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在天然隔開ITR和包裝信號的序列內(nèi)，在它們之間引入序列降低了腺病毒基因組包裝能力，導(dǎo)致獲得的腺病毒顆粒的總數(shù)減少，但它們包裝所需的時間沒有明顯變化；

-兩個ITR末端之間的距離不應(yīng)大于天然存在的腺病毒基因組大小的105％，其中形成衣殼的蛋白質(zhì)屬于該天然存在的腺病毒基因組。

腺病毒基因組優(yōu)選缺少病毒復(fù)制所需的至少一種基因功能，從而得到“復(fù)制缺陷型”腺病毒載體?！皬?fù)制缺陷型”是指腺病毒載體包括缺少至少一種復(fù)制必需的基因功能的腺病毒基因組(即，使得腺病毒載體在典型的宿主細胞中不復(fù)制，尤其是在使用本發(fā)明進行療法期間，可被腺病毒載體感染的人類患者中的那些宿主細胞)。

更優(yōu)選的，復(fù)制缺陷型腺病毒載體包括缺少腺病毒基因組一個或多個區(qū)域的至少一種復(fù)制必需基因功能的腺病毒基因組。在這一方面，腺病毒載體缺少病毒復(fù)制所需的腺病毒基因組E4區(qū)或E1區(qū)的至少一種必需基因功能。除了E1區(qū)中的缺陷外，重組腺病毒在主要晚期啟動子(MLP)中也具有突變。更優(yōu)選的，腺病毒載體缺少E3區(qū)(即E3區(qū)的Xba I缺失)至少一部分和E1區(qū)中的至少一種必需基因功能。關(guān)于E1區(qū)，腺病毒載體可缺少(如缺失)E1a區(qū)的至少一部分和E1b區(qū)的至少一部分。例如，腺病毒載體可包括腺病毒基因組的整個E1區(qū)和部分E3區(qū)的缺失(即，核苷酸第355至3511位和第28593至30470位)。單一缺陷型腺病毒載體可以缺失大約核苷酸第356至3329位和第28594至30469位(基于血清5型腺病毒基因組)?；蛘?，腺病毒載體基因組可以缺失大約核苷酸第356至3510位和第28593至30470位(基于血清5型腺病毒基因組)，從而得到在腺病毒基因組的E1、E3和E4區(qū)中有缺失的腺病毒載體。

如本文所使用的，在基因、基因功能、基因區(qū)域或基因組區(qū)域中的缺陷被定義為，缺失病毒基因組的足以損害或消除基因功能的遺傳物質(zhì)，其中該基因缺失其全部或部分的核苷酸序列。通常不需要缺失整個基因區(qū)域，來在破壞復(fù)制所需的基因功能。然而，為了在腺病毒基因組中提供足夠的空間用于一個或多個轉(zhuǎn)基因，可除去基因區(qū)域的大部分。雖然缺失遺傳物質(zhì)是優(yōu)選的，但通過添加或取代對遺傳物質(zhì)進行突變也適用于破壞基因功能。復(fù)制所需的基因功能是指復(fù)制(如增殖)需要的那些基因功能，由例如腺病毒早期區(qū)域(如E1、E2和E4區(qū))、晚期區(qū)域(如L1～L5區(qū))、參與病毒包裝的基因(如IVa2基因)和病毒相關(guān)RNA(如NA-RNA-1和/或NA-RNA-2)編碼。

除了ITR和包裝序列之外，腺病毒載體也可以基本上除去整個腺病毒基因組。這樣的載體在本領(lǐng)域中稱作無腸(gutless)腺病毒載體或輔助依賴性腺病毒載體。在這種情況下，由輔助腺病毒提供經(jīng)修飾含有白蛋白結(jié)合部分的六鄰體序列。包括ITR和包裝序列的腺病毒基因組的5'區(qū)或3'區(qū)不需要來源于與病毒基因組剩余部分相同的血清型腺病毒。例如，血清5型腺病毒基因組的5'區(qū)(即，基因組的5'到腺病毒E1區(qū)的區(qū)域)可被替換為血清2型腺病毒基因組的相應(yīng)區(qū)域(例如，Ad5基因組的5'區(qū)到腺病毒基因組的E1區(qū)被替代為Ad2基因組的第1～456位核苷酸)。然而，本發(fā)明方法的腺病毒載體的腺病毒基因組的缺陷優(yōu)選限于由腺病毒基因組早期區(qū)域編碼的復(fù)制必需的基因功能。

根據(jù)本發(fā)明，末端反向重復(fù)序列或ITR理解為，在腺病毒的線性基因組的兩側(cè)，對于腺病毒基因組復(fù)制所必需的大約100個堿基對的序列(Stow,N.D.,1982,Nucl.Acid.Res,10:5105-5109)。

根據(jù)本發(fā)明，腺病毒包裝信號ψ理解為約160個堿基對長的序列，在血清2型和5型腺病毒的情況下，該序列在基因組的第190位至第350位之間延伸。去除腺病毒基因組的該序列能阻止在病毒增殖期間產(chǎn)生的DNA分子有效并入最近形成的衣殼中(Hearing,P.et al.,1987,J.Virol.,61:2555-2558)，但它們不能阻止所述基因組在包裝細胞中的復(fù)制，這與消除ITR不同。

在本發(fā)明的腺病毒的上下文中公開的所有實施方式均適用于本發(fā)明的腺病毒基因組。

具體地，在一個實施方式中，腺病毒基因組來自人腺病毒，優(yōu)選選自由血清1型至血清57型人腺病毒組成的組，更優(yōu)選來自血清5型人腺病毒。

在另一個實施方案中，白蛋白結(jié)合部分選自來自鏈球菌蛋白G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、來自大消化鏈球菌(Peptostreptococcus magnus)蛋白PAB的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO：9)的白蛋白結(jié)合肽，及它們的功能等同變體。在一個更優(yōu)選的實施方式中，白蛋白結(jié)合部分是來自鏈球菌蛋白G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域3，優(yōu)選具有序列SEQ ID NO：1。

在另一個實施方式中，插入編碼白蛋白結(jié)合部分的序列，所得到的融合蛋白在六鄰體蛋白的D150氨基酸(根據(jù)GenBank登錄號為BAG48782.1的六鄰體蛋白進行編號)后含有白蛋白結(jié)合部分。在一個優(yōu)選的實施方式中，在HVR中插入ABD的經(jīng)完全修飾的腺病毒六鄰體的核苷酸序列為SEQ ID NO：3。

在另一個實施方式中，白蛋白結(jié)合部分的N-末端和/或C-末端通過連接子序列，優(yōu)選包括序列GSGS(SEQ ID NO：2)的連接子序列與六鄰體蛋白連接。

在另一個實施方式中，腺病毒基因組進一步包括組織特異性啟動子或腫瘤特異性啟動子。在一個優(yōu)選的實施方式中，組織特異性啟動子或腫瘤特異性啟動子是：控制選自由E1a、E1b、E2和E4組成的組中的一個或多個基因表達的啟動子序列；更優(yōu)選選自由E2F啟動子、端粒酶hTERT啟動子、酪氨酸酶啟動子、前列腺特異性抗原啟動子、甲胎蛋白啟動子和COX-2啟動子組成的組中的啟動子。

在另一個實施方式中，腺病毒是溶瘤腺病毒，優(yōu)選是以下的腺病毒，在該腺病毒中的腺病毒基因組在選自由E1a、E1b、E4和VA-RNA組成的組中的一個或多個基因中進一步包括突變，以在腫瘤中實現(xiàn)選擇性復(fù)制。

在另一個實施方式中，腺病毒基因組進一步包括增加腺病毒感染性或?qū)⑵浒邢蚰[瘤細胞中存在的受體的衣殼修飾。優(yōu)選的，衣殼修飾是將RGD模體插入在腺病毒纖突蛋白的H1環(huán)中。在另一個實施方式中，腺病毒基因組是源自一給定血清型的嵌合型腺病毒基因組，其中該給定血清型的片段或部分被替代為來自另一血清型的基因組的同源部分。優(yōu)選的，所述嵌合型腺病毒是血清5型人腺病毒，其中纖突基因的一部分被替代為來自另一血清型(優(yōu)選3型人腺病毒或35型人腺病毒)的同源部分。在一個優(yōu)選的實施方式中，對衣殼的修飾是纖突基因的一部分被取代為不同血清型腺病毒的同源部分，從而形成嵌合型腺病毒。

在另一個實施方式中，腺病毒基因組包括插入所述基因組中的其它基因。在一個實施方式中，這些基因用于基因治療或疫苗接種。優(yōu)選的，這些基因是用于癌癥基因治療的基因，更優(yōu)選地是至少選自由前藥激活基因、腫瘤抑制基因、編碼抗腫瘤干擾RNA的基因和免疫刺激基因組成的組中的基因。

本發(fā)明的組合物

本發(fā)明的重組腺病毒可用于制備藥物組合物。因此，本發(fā)明的另一方面是一種藥物組合物，該藥物組合物包括治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的重組腺病毒及藥學(xué)上可接受的載劑。

當(dāng)用于本發(fā)明時，表述“藥物組合物”是指一種制劑，該制劑適用于向細胞、細胞群、器官、組織或生物體給藥預(yù)定劑量的一種或多種治療有用的試劑。

重組腺病毒以有效量給藥?！爸委熡行Я俊北焕斫鉃槟芴峁┲委熜Ч牧?，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)手段來確定。在保健醫(yī)生的知識和經(jīng)驗內(nèi)，有效量會隨著治療的具體癥狀，接受治療的受試者的年齡和身體狀況，癥狀的嚴重性，治療的持續(xù)時間，同時或組合治療的性質(zhì)(如果有的話)，具體給藥途徑和類似因素而變化。通常優(yōu)選使用最大劑量，即根據(jù)合理的醫(yī)學(xué)判斷得到的最高安全劑量。例如，如果受試者有腫瘤，則有效量可以是減小腫瘤體積或負荷(例如通過對腫瘤成像來確定)的量。有效量還可以通過癌細胞在血液或其他體液或組織中的存在和/或頻率來測定(例如活檢)。如果腫瘤影響組織或器官的正常功能，則可以通過測量組織或器官的正常功能來測定有效量。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，也可以根據(jù)戈德曼和高曼的治療藥理學(xué)基礎(chǔ)，第九版(1996)，附錄II，第1707～1711頁(Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ninth Edition(1996),Appendix II,pp.1707-1711)，和戈德曼和高曼的治療藥理學(xué)基礎(chǔ)，第十版(2001)，附錄II，第475～493頁(Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,Tenth Edition(2001),Appendix II,pp.475-493)的指導(dǎo)來確定用量。

如本文所使用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載劑”是指從藥理學(xué)/毒理學(xué)觀點上患者可接受的，以及從物理/化學(xué)角度上(關(guān)于組成、配方、穩(wěn)定性、患者接受性和生物利用度)制藥化學(xué)家可接受的任意類型的無毒的惰性固體、半固體或液體填充劑，稀釋劑，包封材料或制劑助劑。由熱那洛編輯的雷明頓制藥科學(xué)，麥克出版社，伊斯頓(Remington’s Pharmaceutical Sciences.Ed.by Gennaro,Mack Publishing,Easton,Pa.,1995)公開了用于配制藥物組合物的各種載劑及其制備的已知技術(shù)?？勺鳛樗帉W(xué)上可接受的載劑使用的材料的一些例子包括但不限于：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；黃芪膠粉末；麥芽；明膠；滑石；輔料，如可可脂和栓劑蠟；油，如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；洗滌劑，如TWEEN^TM 80；緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙醇；和磷酸鹽緩沖溶液，以及其它無毒的相容性潤滑劑，如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑，根據(jù)配方調(diào)試員的判斷，防腐劑和抗氧化劑也可存在于組合物中。如果過濾或其他最終滅菌方法不可行，則可在無菌條件下制造制劑。

本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域已知的包括口服和腸胃外途徑的任何手段向患者給藥。根據(jù)這樣的實施方案，本發(fā)明的組合物可以通過注射(例如，靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)、腹膜內(nèi)注射)來給藥。在一個具體實施方式中，對需要全身給藥的受試者給藥本發(fā)明的重組腺病毒，例如，通過靜脈輸液或注射來給藥?？勺⑸渲苿?，例如無菌可注射的水性或油性懸浮液可根據(jù)已知技術(shù)使用合適的分散劑或潤濕劑以及懸浮劑來配制。無菌可注射制劑還可以是在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射的溶液、懸浮液或乳液，例如，作為1,3-丁二醇溶液。在可接受的溶媒(vehicle)和溶劑中，可使用水、林格氏溶液、U.S.P.和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)油常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)。出于該目的，可以使用任何溫和的不揮發(fā)油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸用于制備注射劑。在一個實施方式中，將重組腺病毒懸浮于含1％(w/v)羧甲基纖維素鈉和0.1％(v/v)TWEEN^TM 80的載劑流體中。可注射制劑可以例如通過細菌截留過濾器進行過濾或通過摻入滅菌劑來滅菌，其中滅菌劑為無菌固體組合物的形式并且在使用前可溶解或分散于無菌水或其它無菌可注射介質(zhì)中。

所述組合物可以包括重組腺病毒作為唯一的試劑或與另一種治療劑組合。

在一個優(yōu)選實施方式中，所述組合物包括溶瘤腺病毒，或包括插入腺病毒基因組中的用于癌癥基因治療的一個或多個基因的腺病毒。在該具體情況下，所述組合物可以包括這種腺病毒作為唯一的抗腫瘤劑，或與另一種治療劑(如化療藥物或插入有治療基因的載體)組合。

本發(fā)明的腺病毒的治療用途

在基因治療領(lǐng)域和疫苗接種領(lǐng)域中使用復(fù)制缺陷型腺病毒和可復(fù)制的腺病毒有著廣泛的經(jīng)驗。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的重組腺病毒或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物用于醫(yī)藥用途。本發(fā)明的腺病毒可以設(shè)計用于治療需要將這種腺病毒給藥至血流中的任意種類的疾病。

本發(fā)明人已示出本發(fā)明的腺病毒對癌癥治療是特別有用的。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的重組腺病毒或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物用于預(yù)防和/或治療哺乳動物中的癌癥，其中，所述腺病毒是溶瘤腺病毒，或包括插入在腺病毒基因組中的用于癌癥基因治療的一個或多個基因的腺病毒。

可選的，本發(fā)明涉及本發(fā)明的重組腺病毒或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物在制備用于預(yù)防和/或治療哺乳動物中的癌癥的藥物中的用途，其中所述腺病毒是溶瘤腺病毒，或包括插入在腺病毒基因組中的用于癌癥基因治療的一個或多個基因的腺病毒。

可選的，本發(fā)明涉及預(yù)防和/或治療哺乳動物中的癌癥的方法，該方法包括向所述哺乳動物給藥本發(fā)明的重組腺病毒或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中，所述腺病毒是溶瘤腺病毒，或包括插入在腺病毒基因組中的用于癌癥基因治療的一個或多個基因的腺病毒。

如本文所使用的，術(shù)語“預(yù)防”是指是指：預(yù)防性(prophylactic)或防止性(preventive)方法，其中所述腺病毒在疾病的初始階段或早期階段(即腫瘤的惡化前階段)給藥；或者，也指防止其發(fā)作。

腺病毒載體已經(jīng)被普遍用于制備誘發(fā)針對病原體蛋白質(zhì)的免疫的疫苗。例如，已經(jīng)公開描述了針對HIV、狂犬病病毒、登革熱病毒、埃博拉病毒、皰疹冠狀病毒、人乳頭瘤病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、巨細胞病毒、2型單純皰疹病毒、愛潑斯坦巴爾病毒、流感病毒、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)和惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)，以及針對其他病原體的重組腺病毒疫苗。

在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的重組腺病毒或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物用于預(yù)防哺乳動物中的傳染病。

可選的，本發(fā)明涉及本發(fā)明的重組腺病毒或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物用于制備用于預(yù)防哺乳動物中的傳染病的藥劑，優(yōu)選疫苗。

可選的，本發(fā)明涉及預(yù)防哺乳動物中的傳染病的方法，所述方法包括向所述哺乳動物給藥本發(fā)明的重組腺病毒或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。

本文所用的表述“傳染病”或“感染”是指由于以下物質(zhì)入侵宿主生物體所引起的疾病：感染性或病原性因子，如病毒、類病毒和朊病毒；微生物，如細菌；寄生蟲，如線蟲(包括蛔蟲和蟯蟲)；節(jié)肢動物，如蜱、螨、跳蚤和虱子；真菌和原生動物。

本發(fā)明的重組腺病毒適用于制備用于預(yù)防任何種類的傳染病的疫苗。

在一個優(yōu)選的實施方式中，傳染病由選自由HIV、狂犬病毒、登革熱病毒、埃博拉病毒、皰疹冠狀病毒、人乳頭瘤病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、巨細胞病毒、2型單純皰疹病毒、愛潑斯坦巴爾病毒、流感病毒、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)和惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)組成的組中的病原體引起。

術(shù)語“治療(treat)”或“治療(treatment)”是指治療性治療，其目標是在臨床癥狀出現(xiàn)之前或之后控制疾病的發(fā)展。疾病發(fā)展的控制被理解為有益或期望的臨床結(jié)果，其包括但不限于癥狀的減輕、疾病持續(xù)時間的縮短、病理狀態(tài)的穩(wěn)定(特別是避免額外的損傷)、延緩疾病發(fā)展、改善病理狀態(tài)和緩解(部分和完全)。對疾病發(fā)展的控制還涉及與未施用治療的期望存活相比，存活延長。

例如，在治療癌癥的情況下，可以通過觀察以下效果中的一種或多種來監(jiān)測應(yīng)答：(1)在一定程度上抑制腫瘤生長，包括(i)減緩、(ii)抑制血管生成和(ii)完全生長停滯；(2)腫瘤細胞數(shù)量的減少；(3)維持腫瘤尺寸；(4)腫瘤尺寸減小；(5)抑制，包括腫瘤細胞浸潤到外周器官的(i)減少、(ii)減緩或(iii)完全預(yù)防；(6)抑制，包括轉(zhuǎn)移的(i)減少、(ii)減慢或(iii)完全預(yù)防；(7)抗腫瘤免疫應(yīng)答的增強，其可以導(dǎo)致(i)維持腫瘤尺寸、(ii)減小腫瘤尺寸、(iii)減慢腫瘤的生長、(iv)減少、減慢或預(yù)防入侵，和/或(8)在一定程度上緩解與病癥相關(guān)的一種或多種癥狀的嚴重性或數(shù)量。

術(shù)語“癌癥”是指具有以下特征的疾?。翰皇芸氐募毎至?或存活或細胞凋亡抗性增加)，細胞具有侵入其他相鄰組織的能力(侵入)，或通過淋巴管和血管擴散到身體的細胞正常不位于其中(轉(zhuǎn)移)的其他區(qū)域。如本文所使用的，術(shù)語癌癥包括但不限于以下類型的癌癥：乳腺癌；膽道癌；膀胱癌；腦癌，包括成膠質(zhì)細胞瘤和成神經(jīng)管細胞瘤；宮頸癌；絨毛膜癌；結(jié)腸癌；子宮內(nèi)膜癌；食道癌；胃癌；血液腫瘤，包括急性淋巴細胞性白血病和骨髓性白血?。籘細胞急性淋巴細胞白血病/淋巴瘤；毛細胞白血病；慢性骨髓性白血病，多發(fā)性骨髓瘤；AIDS相關(guān)性白血病和成人T細胞白血病/淋巴瘤；上皮內(nèi)腫瘤，包括博文氏病(Bowen's disease)和佩吉特氏病(Paget's disease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇?zhèn)愂喜?Hodglun's disease)和淋巴細胞性淋巴瘤；神經(jīng)母細胞瘤；口腔癌，包括鱗狀細胞癌；卵巢癌，包括起源于上皮細胞、基質(zhì)細胞、生殖細胞和間充質(zhì)細胞的卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直腸癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤和骨肉瘤；皮膚癌，包括黑色素瘤、梅克爾細胞癌、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、基底細胞癌和鱗狀細胞癌；睪丸癌，包括生殖性腫瘤，如精原細胞瘤，非精原細胞瘤(畸胎瘤、絨毛膜癌)、基質(zhì)瘤和生殖細胞腫瘤；甲狀腺癌，包括甲狀腺腺癌和髓質(zhì)癌；及腎癌，包括腺癌和腎母細胞瘤(Wilms tumour)。在一個實施方式中，癌癥是乳腺癌。在另一個實施方式中，癌癥是黑色素瘤。其它癌癥對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是公知的。

本發(fā)明的腺病毒可以給藥予哺乳動物。如本文所使用的，術(shù)語“哺乳動物”是指任意哺乳動物物種，包括但不限于家畜和耕畜(牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒動物)、靈長類動物和人。優(yōu)選的，哺乳動物是人。在本發(fā)明的上下文中，哺乳動物患有癌癥或有患癌癥的風(fēng)險。

為了治療動物模型或患者的腫瘤，腺病毒可以通過腫瘤內(nèi)或腔內(nèi)注射來局部或區(qū)域給藥來遞送，或者通過注射至血液中進行全身給藥來遞送。病毒也可以給藥至腫瘤的脈管系統(tǒng)中。由于本發(fā)明的重組腺病毒免受血流中存在的中和抗體的中和，因此它們特別適合于全身給藥。因此，在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的腺病毒是全身給藥的。本文所使用的，表述“全身給藥”是指給藥至循環(huán)系統(tǒng)中使得全身受到影響的途徑。優(yōu)選地，給藥是腸胃外給藥(通常是動脈內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，輸液或植入)。

本發(fā)明的腺病毒理論上在結(jié)合血清白蛋白之前給藥，其在所治療的受試者的血液中與白蛋白結(jié)合。然而，為了增加腺病毒在血液中的持久性，從而增加到達彌散性腫瘤淋巴結(jié)的可能性，可在腺病毒給藥之前用白蛋白包覆衣殼。

如之前在溶瘤腺病毒的領(lǐng)域中所述，用本發(fā)明的腺病毒治療腫瘤可以與其它治療方式如化療或放療聯(lián)合使用。

使用本發(fā)明所述的腺病毒治療癌癥的方案與在使用腺病毒進行病毒治療和基因治療的領(lǐng)域中所使用的步驟是相同的。

本發(fā)明還涉及以下：

[1]一種腺病毒基因組，其特征在于，所述腺病毒基因組包括編碼白蛋白結(jié)合部分的序列，所述編碼白蛋白結(jié)合部分的序列插入在六鄰體蛋白的高變區(qū)(HVR)的編碼區(qū)中，從而表達包括六鄰體蛋白和白蛋白結(jié)合部分的融合蛋白，并且其中，當(dāng)所述六鄰體蛋白組裝在腺病毒衣殼中時，所述白蛋白結(jié)合部分位于所述六鄰體蛋白的外表面上。

[2]根據(jù)[1]的腺病毒基因組，其中，所述基因組來自人腺病毒。

[3]根據(jù)[2]的腺病毒基因組，其中，所述人腺病毒選自由血清1～57型人腺病毒組成的組。

[4]根據(jù)[3]的腺病毒基因組，其中，所述人腺病毒為血清5型。

[5]根據(jù)[1]、[2]、[3]或[4]的腺病毒基因組，其中，所述白蛋白結(jié)合部分選自鏈球菌蛋白G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、大消化鏈球菌(Peptostreptococcus magnus)蛋白PAB的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO：9)的白蛋白結(jié)合肽，及它們的功能等同變體。

[6]根據(jù)[5]的腺病毒基因組，其中，所述白蛋白結(jié)合部分為鏈球菌蛋白G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域3。

[7]根據(jù)[6]的腺病毒基因組，其中，所述鏈球菌蛋白G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域3的序列為SEQ ID NO：1。

[8]根據(jù)[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]或[7]的腺病毒基因組，其中，所述六鄰體蛋白的HVR選自由HVR1、HVR2、HVR3、HVR4、HVR5、HVR6和HVR7組成的組。

[9]根據(jù)[8]的腺病毒基因組，其中，所述六鄰體蛋白的HVR為HVR1。

[10]根據(jù)[9]的腺病毒基因組，其中，插入編碼所述白蛋白結(jié)合部分的序列，以便所得到的融合蛋白包括在六鄰體蛋白的D150氨基酸之后的白蛋白結(jié)合部分，所述六鄰體蛋白的D150氨基酸是根據(jù)GenBank登錄號為BAG48782.1的六鄰體蛋白進行編號的。

[11]根據(jù)[8]的腺病毒基因組，其中，所述六鄰體蛋白的HVR為HVR5。

[12]根據(jù)[11]的腺病毒基因組，其中，插入編碼所述白蛋白結(jié)合部分的序列，以便所得到的融合蛋白在六鄰體蛋白的A274氨基酸之后包含白蛋白結(jié)合部分，所述六鄰體蛋白根據(jù)GenBank登錄號為BAG48782.1的六鄰體蛋白進行編號。

[13]根據(jù)[1]至[12]中任一項的腺病毒基因組，其中，所述白蛋結(jié)合部分白的N-末端和/或C-末端通過連接子序列與所述六鄰體蛋白相連。

[14]根據(jù)[13]的腺病毒基因組，其中，所述連接子序列包括序列GSGS(SEQ ID NO：2)。

[15]根據(jù)[1]至[14]中任一項的腺病毒基因組，其中，所述腺病毒基因組進一步包括組織特異性啟動子或腫瘤特異性啟動子。

[16]根據(jù)[15]的腺病毒基因組，其中，所述組織特異性啟動子或腫瘤特異性啟動子是控制選自由E1a、E1b、E2和E4組成的組中的一個或多個基因表達的啟動子序列。

[17]根據(jù)[16]的腺病毒基因組，其中，所述啟動子選自由E2F啟動子、端粒酶hTERT啟動子、酪氨酸酶啟動子、前列腺特異性抗原啟動子、甲胎蛋白啟動子和COX-2啟動子組成的組。

[18]根據(jù)[1]至[17]中任一項的腺病毒基因組，其中，所述腺病毒為溶瘤腺病毒。

[19]根據(jù)[18]的腺病毒基因組，其中，所述腺病毒基因組進一步包括在選自由E1a、E1b、E4和VA-RNA組成的組中的一個或多個基因中的突變，以實現(xiàn)在腫瘤中的選擇性復(fù)制。

[20]根據(jù)[1]至[19]中任一項的腺病毒基因組，其中，所述腺病毒基因組進一步包括衣殼修飾，以增加腺病毒的感染性或?qū)⑾俨《景邢蚰[瘤細胞中存在的受體。

[21]根據(jù)[20]的腺病毒基因組，其中所述衣殼修飾是在腺病毒纖突蛋白的H1環(huán)中插入RGD模體。

[22]根據(jù)[1]至[21]中任一項的腺病毒基因組，其中，所述腺病毒基因組包含插入在所述腺病毒基因組中的一個或多個其他的基因。

[23]根據(jù)[22]的腺病毒基因組，其中，所述其他的基因是用于基因治療或疫苗接種中的一個或多個非腺病毒基因。

[24]根據(jù)[23]的腺病毒基因組，其中，所述基因是用于癌癥基因治療的基因。

[25]根據(jù)[24]的腺病毒基因組，其中，所述用于癌癥基因治療的基因是至少選自由前藥激活基因、腫瘤抑制基因、編碼抗腫瘤干擾RNA的基因和免疫刺激基因組成的組中的基因。

[26]一種重組腺病毒，所述重組腺病毒具有[1]至[25]中任一項的腺病毒基因組。

[27]一種藥物組合物，所述藥物組合物包括治療有效量的根據(jù)[26]的重組腺病毒，以及藥學(xué)上可接受的載劑。

[28]根據(jù)[26]的重組腺病毒或[27]的藥物組合物用于醫(yī)藥中。

[29]根據(jù)[26]的重組腺病毒或[27]的藥物組合物用于預(yù)防和/或治療哺乳動物中的癌癥，其中，所述腺病毒為具有根據(jù)[24]或[25]的腺病毒基因組的溶瘤腺病毒或腺病毒。

[30]根據(jù)[28]或[29]的用于上述用途的重組腺病毒，其中，所述哺乳動物是人。

[31]根據(jù)[28]、[29]或[30]的用于上述用途的重組腺病毒，其中，所述腺病毒是全身給藥的。

以下提供的例子僅僅是說明性的，不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。

實施例

材料和方法

細胞系.HEK293(人胚腎)細胞、A549(人肺腺癌)細胞、Sk-mel28(黑色素瘤)細胞以及MCF7(人乳腺癌)細胞獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。除MCF7之外，所有的腫瘤細胞系在37℃，5％CO₂下，用補充有5％胎牛血清的達爾伯克改良的伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)維持。MCF7細胞用補充有10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基維持。對所有細胞系都常規(guī)測試是否存在支原體。

病毒構(gòu)建.ICOVIR15溶瘤腺病毒之前已進行了描述(Rojas JJ,et al.Minimal RB-responsive E1A promoter modification to attain potency,selectivity,and transgene-arming capacity in oncolytic adenoviruses.Mol Ther 2010；18(11):1960-71)。AdGL是E1缺失的第一代載體，表達來自pEGFPLuc(Clontech)的EGFP-熒光素酶融合蛋白盒。按照源自Stanton等人(Stanton RJ,et al.Re-engineering adenovirus vector systems to enable high-throughput analyses of gene function.Biotechniques 2008；45(6):659-62,664-8)的重組工程方案，基于使用陽性-陰性選擇在細菌中進行的同源重組，來插入用于替換E1區(qū)的CMV啟動子-EGFPLuc-多聚腺苷酸(polyA)盒。使用側(cè)翼有E1同源區(qū)的CMV-GFPLuc盒，來替代pAd5-CV5-E3+的陽性-陰性選擇標記物，其通常用于構(gòu)建E1缺失的腺病毒載體。ICOVIR15在A549細胞中增殖，而復(fù)制缺陷型AdGL在HEK293細胞中增殖。

通過將側(cè)翼有兩個接頭(GSGS)(SEQ ID NO：2)的白蛋白結(jié)合域(ABD)插入腺病毒六鄰體的高變區(qū)1(HVR1)的D150氨基酸之后，來構(gòu)建ICOVIR15-ABD和AdGL-ABD。在HVR1中插入有ABD(ABD-HVR1)的經(jīng)完全修飾的六鄰體的核苷酸序列為SEQ ID NO：3。所有修飾均按照源自Stanton等人(Stanton RJ,et al.Re-engineering adenovirus vector systems to enable high-throughput analyses of gene function.Biotechniques 2008；45(6):659-62,664-8)的重組工程方案，基于利用RpsL-Neo盒的陽性-陰性選擇在細菌中進行的同源重組來進行。

首先，使用HVR1rpsLF 5’-GCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGGCCTGGTGATGATGGC-3’(SEQ ID NO：12)和HVR1rpsLR 5’-GTAATATTTATACCAGAATAAGGCGCCTGCCCAAATACGTGAGTTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3’(SEQ ID NO：13)，通過PCR從pJetRpsLNeo擴增rpsLNeo盒，其中pJetRpsLNeo為含有克隆在pJet1.2/blunt中的rpsLneo陽性-陰性選擇標記物(Genscript,Wheelock House,香港)的質(zhì)粒。將上述基因盒插入質(zhì)粒pAdZICOVIR15和pAdZGL的HVR1中，從而構(gòu)建pAdZICOVIR15-H1-rpsLNeo和pAdZGL-H1-rpsLNeo。其次，使用以下重疊的寡核苷酸，通過PCR產(chǎn)生連接子-ABD-連接子片段：

該片段用于替代兩個質(zhì)粒中的rpsLNeo盒，以創(chuàng)建pAdZICOVIR15-H1-ABD和pAdZGL-H1-ABD。

同樣，將ABD插入在AdGL高變區(qū)5的A274氨基酸之后。具有插入在HVR5中的ABD(ABD-HVR5)的經(jīng)完全修飾的六鄰體的核苷酸序列為SEQ ID NO：4。出于這一目的，通過如下所示的寡核苷酸H5rpsLF和H5rpsLR，通過PCR從pJetRpsLNeo擴增出rpsLNeo盒，

并且插入至pAdZGL質(zhì)粒中，以構(gòu)建pAdZGL-H5-rpsLNeo。在第二個重組步驟中，使用如下寡核苷酸ABDH5F和ABDH5R，通過PCR pAdZICOVIR15-H1-ABD擴增出連接子-ABD-連接子片段。

該片段用于替換pAdZGL-H5-rpsLNeo中的rpsLNeo，從而構(gòu)建pAdZGL-H5-ABD。

另外，上述結(jié)構(gòu)域還可以插入至六鄰體蛋白的任意高變區(qū)。為此，應(yīng)當(dāng)將rpsLNeo插入所需區(qū)域中，然后被替換為ABD片段，以在特定的高變環(huán)中進行重組，其中ABD片段使用同源臂通過PCR來產(chǎn)生。

通過用磷酸鈣標準方法將產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中，產(chǎn)生ICOVIR15-ABD(ABD在HVR1中)、AdGL-ABD(ABD在HVR1中)和AdGL-H5-ABD(ABD在HVR5中)。溶瘤腺病毒ICOVIR15-ABD經(jīng)噬菌斑純化，并在A549細胞中進一步擴增。腺病毒載體AdGL-ABD經(jīng)噬菌斑純化，并在HEK293細胞中進一步擴增。根據(jù)標準技術(shù)，使用雙梯度氯化銫來純化這兩種病毒。

用含有1mg/ml HSA的培養(yǎng)基，使病毒與人血清白蛋白(HSA)孵育在室溫1小時。

病毒生產(chǎn)測定.用每種病毒以每細胞800個病毒顆粒(vp)來感染A549細胞，以獲得80％～100％的感染。感染后4小時用PBS洗滌細胞三次，并用新鮮培養(yǎng)基孵育。在指定的時間點，收集細胞并冷融三次以獲得細胞提取物。通過抗六鄰體染色法獲得HEK293細胞中的病毒滴度(Cascallo M,et al.Systemic toxicity-efficacy profile of ICOVIR-5,a potent and selective oncolytic adenovirus based on the pRB pathway.Mol Ther 2007；15:1607-15)。

體外細胞毒性測定.通過在96孔板中接種10000個HEK293細胞/孔，30000個A549細胞/孔，10000個Sk-mel28細胞/孔和20000個MCF-7細胞/孔，來進行細胞毒性測定。在感染之前，病毒在用培養(yǎng)基或含有1mg/ml人血清白蛋白(HSA)的培養(yǎng)基在室溫孵育1小時。在正常培養(yǎng)基或含白蛋白的培養(yǎng)基中，以10000vp/細胞起始的系列稀釋液(對于HEK293、Sk-mel28和MCF-7細胞為1/3，對于A549細胞為1/5)感染細胞。在感染后第7天，用PBS洗滌板，對總蛋白含量進行染色(二辛可寧酸測定；Pierce Biotechnology，Rockford，IL)，并定量吸光度。使用適應(yīng)性改變的希爾(Hill)方程，通過標準非線性回歸(GraFit；Erithacus Software,Horley,UK)，根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線來確定產(chǎn)生50％生長抑制(IC₅₀)所需的vp/細胞。

檢測與人和小鼠血清白蛋白的結(jié)合.檢測人血清白蛋白(HSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)的結(jié)合是根據(jù)源自Konig和Skerra的ELISA方案進行的(Konig T,Skerra A.Use of an albumin-binding domain for the selective immobilisation of recombinant capture antibody fragments on ELISA plates.J Immunol Methods 1998；218:73-83)來檢測與人血清白蛋白(HSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)的結(jié)合。在室溫下孵育1小時，然后用200μl含有0.1％Tween20的PBS進行三次洗滌步驟，所述PBS也是用于稀釋病毒和抗體的緩沖液。

用200μl稀釋在PBS中的2mg/mL HSA或BSA(Sigma)包被96孔板。用稀釋在含0.5％Tween20的PBS中的2mg/mL BSA封閉塑料表面上的剩余結(jié)合位點。在接著的步驟中，加入50μl體積的純化病毒。測試三種不同量的病毒蛋白，來檢測結(jié)合(25、2.5和0.25ng病毒蛋白)(圖5A)。使用伯樂蛋白(Bio Rad Protein)測定法，對純化的病毒樣品的病毒蛋白濃度進行定量。用來自2Hx-2雜交瘤(HB-8117^TM)上清液(每孔50μl，1/5稀釋)的抗六鄰體的抗體，以及綴合有辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠的多克隆抗體(50μl/孔，1/2000稀釋)，進行病毒檢測。每孔加入100μl新鮮混合的3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶底物溶液，振蕩孵育15分鐘，對孔進行染色。加入100μl 2N的硫酸終止反應(yīng)，并且測量450nm處吸光度。

用200μl稀釋在PBS中的2mg/mL BSA、HSA或MSA(Sigma)包被96孔板，并測試25ng病毒蛋白以檢測結(jié)合，來進行相同的實驗。包括沒有病毒的對照模擬組(圖5B)。

體外抗體介導(dǎo)的中和測定.在感染(使用熒光素酶-GFP報道子腺病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo))和復(fù)制水平(有復(fù)制能力的腺病毒介導(dǎo)的細胞毒性)上分析抗體介導(dǎo)的中和。使用商業(yè)抗體Ab6982(抗-Ad5的兔多克隆抗體，Abcam)作為中和抗體。對于感染性分析，從1/100稀釋抗體儲液開始，在96孔板中的含有不同腺病毒(AdGL或AdGL-ABD)的培養(yǎng)基中進行抗體的1/6系列稀釋。

在室溫孵育1小時后，每孔加入1E5HEK293細胞或3E4Sk-mel28細胞，以獲得所需的感染復(fù)數(shù)(對于HEK293細胞為0.5TU/細胞或10vp/細胞，對于Sk-mel28細胞為40vp/細胞)。感染后24小時，除去培養(yǎng)基，加入50μl細胞裂解試劑(Promega，Madison，WI)裂解細胞并凍融一次。裂解物經(jīng)13000g 4℃離心5分鐘，并在發(fā)光計(Berthold Junior,Berthold GmbH&Co,KG,德國)中使用熒光素酶測定試劑(Promega)測量上清液的熒光素酶活性。

對于復(fù)制的分析，從1/100稀釋抗體儲液開始，進行抗體的1/2系列稀釋。該系列稀釋使用含有ICOVIR15或ICOVIR15-ABD的培養(yǎng)基進行。在室溫與抗體孵育一小時后，每孔加入3E5A549細胞以獲得600vp/細胞的感染復(fù)數(shù)。在感染后第4天，通過如上在材料和方法部分中的“體外細胞毒性測定”里描述的對總蛋白含量進行染色，來分析細胞活力。

體內(nèi)血液清除率.體內(nèi)研究在ICO-IDIBELL院(巴塞羅那，西班牙)AAALAC部門1155進行，并獲得IDIBELL的動物實驗倫理委員會批準。Balb/C nu/nu雌性小鼠靜脈內(nèi)注射ICOVIR15和ICOVIR15-ABD(比例為1：1)的混合物，總劑量為5×10¹⁰vp，體積為PBS中的10ml/kg(n＝5)。在給藥后5分鐘、15分鐘、1小時、4小時和24小時，從尾靜脈中收集血液樣品。將血液樣品在4℃、5000g離心5分鐘，以分離細胞組分并收集血清。用蛋白酶K和SDS在54℃保持45分鐘，然后在90℃保持10分鐘來消化血清樣品，以對衣殼進行蛋白水解并釋放病毒DNA。使用六鄰體HVR1-側(cè)翼寡核苷酸Ad19121F 5'-CTGGACATGGCTTCCACGTA-3'(SEQ ID NO：25)和Ad19300R 5-'GCTCGTCTACTTCGTCTTCG-3'(SEQ ID NO：26)，通過PCR擴增經(jīng)消化的樣品，通過1％瓊脂糖凝膠電泳進行分析。因為ICOVIR15-ABD在HVR1的中間插入了ABD，所以PCR產(chǎn)物的大小較長：預(yù)期來自ICOVIR15-ABD的PCR產(chǎn)物為361bp，而來自ICOVIR15的PCR產(chǎn)物為199bp。

體內(nèi)抗腫瘤功效.通過將1×10⁷Sk-mel28細胞注射到6周齡雌性Balb/C nu/nu小鼠的側(cè)腹中，建立皮下黑色素瘤異種移植腫瘤。當(dāng)腫瘤達到150mm³(實驗第0天)時，將小鼠隨機分組(每組n＝10至12只動物)，以10ml/kg的體積(在PBS中)通過尾靜脈單次靜脈內(nèi)給藥注射PBS或5×10¹⁰vp的ICOVIR15或ICOVIR15-ABD。每周監(jiān)測腫瘤尺寸和小鼠狀態(tài)三次。腫瘤體積用數(shù)字卡尺來測量，并定義為方程V(mm³)＝π/6×W²×L，其中W和L分別是腫瘤的寬度和長度。通過雙尾未配對t檢驗評估治療組之間腫瘤尺寸差異的統(tǒng)計學(xué)顯著性。

體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo).6周齡雌性C57BL6小鼠(每組n＝4～6只動物)的兩側(cè)腹皮下植入1×10⁶個B16-CAR細胞建立黑色素瘤。當(dāng)腫瘤達到100mm³時，向小鼠腹膜內(nèi)注射PBS(空白組)或2×10¹⁰vp hAd5wt(預(yù)免疫組)。免疫后7天，以每只小鼠3×10¹⁰個病毒顆粒的劑量，單次靜脈內(nèi)給藥PBS、AdGL或AdGL-ABD來注射動物。載體注射后三天，小鼠接受腹膜內(nèi)注射250μL D-熒光素(15mg/mL；Biosynth，Staad，瑞士)，并且處死小鼠以收獲肝臟和腫瘤用于生物發(fā)光成像(IVIS)。將器官在IVIS Lumina XR(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)上進行成像，并使用Living Image v4.0軟件對光發(fā)射進行定量。

結(jié)果

ICOVIR15-ABD的產(chǎn)生和表征.為了產(chǎn)生白蛋白結(jié)合的腺病毒，將來自鏈球菌屬細菌的G蛋白的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域3(SEQ ID NO：1)插入ICOVIR15六鄰體的HVR1中，產(chǎn)生溶瘤腺病毒ICOVIR15-ABD(圖1和圖2)。該結(jié)構(gòu)域兩側(cè)通過的兩個連接子(GSGS)(SEQ ID NO：2)插入在HVR1中間的D150氨基酸之后，同時不缺失六鄰體的任何序列(圖1)。

為了分析ABD插入對病毒復(fù)制的影響，我們比較了ICOVIR15和ICOVIR15-ABD在A549細胞中的復(fù)制動力學(xué)。如圖3所示，盡管兩種病毒的生產(chǎn)動力學(xué)相似，但能看出ICOVIR15-ABD的總產(chǎn)量下降。還分析了病毒在體外殺死癌細胞的能力。在存在或不存在HSA的情況下，在HEK293、A549、Sk-mel28和MCF-7細胞中進行了細胞毒性實驗。IC₅₀值表明病毒在測試的四種細胞系的三種細胞系之間沒有顯著差異，而在MCF-7細胞中，ICOVIR15-ABD的IC₅₀比ICOVIR15增加3倍，這表明細胞毒性在這一細胞系中有一定的損失(圖4)。在任何情況下添加HSA都不影響細胞毒性。

進行ELISA實驗，以證明ICOVIR15-ABD與HSA和MSA的結(jié)合。用MSA、HSA或BSA(需注意ABD與MSA和HSA結(jié)合，但不與BSA結(jié)合)包被孔，并分析ICOVIR15或ICOVIR15-ABD兩種病毒的結(jié)合情況。當(dāng)ICOVIR15-ABD添加到HSA包被的孔(圖5A)或MSA包被的孔(圖5B)中時都獲得陽性信號，并且信號強度隨著所用病毒量的增加而增加(圖5A)。當(dāng)使用BSA(而不是使用HSA或MSA)時，不管所加入的病毒量如何都觀察不到信號，這表明病毒可以結(jié)合人白蛋白和鼠白蛋白，但不結(jié)合牛白蛋白。如所預(yù)期的，在任何情況下都沒有檢測到ICOVIR15病毒的結(jié)合。

白蛋白結(jié)合在體外使腺病毒免受中和抗體的中和.在已經(jīng)證明ICOVIR15-ABD與人白蛋白結(jié)合的情況下，發(fā)明人測試了這種結(jié)合是否可以在體外使病毒免于被中和抗體(NAb)的中和。為此，構(gòu)建了表達在六鄰體上經(jīng)ABD修飾的GFP-熒光素酶融合蛋白的腺病毒載體，該腺病毒載體被稱為AdGL-ABD。在存在和不存在HSA的情況下，在與商業(yè)中和抗體Ab6982(抗Ad5的兔多克隆抗體)的系列稀釋液孵育后，研究HEK293細胞中AdGL-ABD的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。如圖6所示，不管是否與白蛋白孵育，非修飾的AdGL載體都有著相似的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。相比之下，HSA保護AdGL-ABD免于被中和。有趣的是，即使在不與白蛋白孵育時，AdGL-ABD相比未修飾的載體AdGL而言中和更少，這表明僅僅用ABD修飾HVR1已經(jīng)排除了一些NAb的結(jié)合。

此外，還分析了在中和抗體存在下病毒殺死癌細胞的能力。為此，在存在和不存在HSA的情況下，用提前與系列稀釋的中和抗體Ab6982孵育的ICOVIR15或ICOVIR15-ABD感染A549細胞，并在感染后4天分析細胞存活。在不存在人白蛋白的情況下，兩種病毒示出相似的殺死腫瘤細胞的能力(圖7)，并且看出ICOVIR15-ABD的細胞毒性僅少量增加，這可能是由于在轉(zhuǎn)導(dǎo)中觀察到的對中和抗體的某種逃避(圖6)。重要的是，當(dāng)將人白蛋白加入到培養(yǎng)基中時，ICOVIR15-ABD的細胞毒性與ICOVIR15的細胞毒性相比顯著增強，其中，ICOVIR15的細胞毒性保持不變。

ICOVIR15-ABD顯示出增加的血漿半衰期.為了研究白蛋白結(jié)合能否降低血液中腺病毒的快速清除，研究了ICOVIR15-ABD在體內(nèi)全身給藥后的藥代動力學(xué)。用ICOVIR15和ICOVIR15-ABD的混合物(比例為1:1)注射小鼠并在不同時間點收集血液樣品，其中每只小鼠的總劑量為5×10¹⁰個病毒顆粒。通過PCR擴增血清樣品中的六鄰體HVR1。由于ABD的插入，用ICOVIR15-ABD獲得361bp的條帶，而用ICOVIR15獲得的條帶大小僅為199bp。因此，通過比較各個時間點條帶的相對強度，可以確定哪種病毒在血流中持續(xù)更久。圖8顯示了所有樣品的PCR反應(yīng)的電泳結(jié)果，這些樣品包括具有若干比率的ICOVIR15-ABD：ICOVIR15(0.2、1、5、10和50)標準樣，注射前的對照，和水陰性對照。注射前的組和注射后5分鐘獲得強度相等的條帶。從那時起，可看出條帶強度的變化，對應(yīng)于ICOVIR15-ABD的條帶變得比ICOVIR15的條帶顏色深。在注射后1小時，兩種病毒的差異留存時間明顯有利于ICOVIR15-ABD。這些數(shù)據(jù)表明，注射5分鐘后，ICOVIR15比ICOVIR15-ABD更快地從血流中清除，證明了ABD-修飾的病毒的藥代動力學(xué)得到改善。

體內(nèi)全身給藥后ICOVIR15-ABD的抗腫瘤活性.在證明了ICOVIR15-ABD的血漿半衰期增加之后，測試這是否反應(yīng)為全身給藥后抗腫瘤功效增加。以5×10¹⁰個病毒顆粒/小鼠的單次靜脈內(nèi)劑量，向攜帶Sk-mel28(黑色素瘤)異種移植物腫瘤的小鼠注射磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、ICOVIR15或ICOVIR15-ABD。在治療后第38天，由于PBS治療的腫瘤尺寸大而處死動物。與PBS相比，兩種病毒都能顯著降低腫瘤生長(圖9)。然而，可看出ICOVIR15-ABD治療從第21天直到治療結(jié)束腫瘤生長都有統(tǒng)計學(xué)上的減小，而ICOVIR15直到第35天才在統(tǒng)計學(xué)上控制腫瘤生長。在第38天處死動物時，ICOVIR15誘導(dǎo)了1.4倍的減小，相比之下，ICOVIR15-ABD誘導(dǎo)了2倍的減小。

白蛋白結(jié)合保護腺病毒在體內(nèi)免受抗HAd5的預(yù)免疫.通過腹膜內(nèi)注射hAd5wt的2×10¹⁰個病毒顆粒或PBS(預(yù)免疫或空白組)，免疫攜帶B16-CAR黑色素瘤的有免疫能力的C57BL6小鼠。7天后，小鼠接受3×10¹⁰個病毒顆粒/小鼠的單次靜脈內(nèi)劑量的PBS、AdGL或AdGL-ABD。載體注射三天后處死小鼠，并且收獲肝臟和腫瘤用于體內(nèi)生物發(fā)光成像(IVIS)。載體在空白動物的肝臟和腫瘤轉(zhuǎn)導(dǎo)之間沒有觀察到顯著差異(圖10)。值得注意的是，當(dāng)動物被預(yù)免疫時，未修飾的AdGL載體被完全中和，因為肝臟和腫瘤的轉(zhuǎn)導(dǎo)完全消除。相反，AdGL-ABD在肝臟和腫瘤中能保持相同的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平，這表明免于抗HAd5的預(yù)免疫。

在高變區(qū)5中插入ABD.為了測試這種插入是否也可以在六鄰體的其他高變區(qū)中進行，我們構(gòu)建了AdGL-H5-ABD載體。用pAdZGL-H5-ABD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞以產(chǎn)生AdGL-H5-ABD病毒。轉(zhuǎn)染后一周，收獲細胞和上清液，并通過三次凍融循環(huán)進行裂解。通過噬菌斑測定，確定含病毒的細胞提取物在HEK293細胞中的滴度。對應(yīng)稀釋1E6、1E7和1E8的孔示于圖11中，其中噬菌斑證明了病毒增殖是明顯的。通過病毒基因組測序證實HVR5中插入了ABD。這證明了ABD可插入其他高變區(qū)中，且不影響病毒存活。

ABD插入高變區(qū)5中不能使腺病毒免受中和抗體的中和.為了檢查插入在高變區(qū)5中的ABD是否也使腺病毒免受中和抗體的中和，我們比較了在存在或不存在HSA的情況下，與Ab6982NAb的系列稀釋物孵育后，HEK293細胞和Sk-mel28細胞中的載體AdGL、AdGL-H1-ABD和AdGL-H5-ABD的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。如圖6中所觀察到的，與HSA的孵育為AdGL-H1-ABD向兩個細胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了明顯優(yōu)勢，而對未修飾的AdGL載體沒有重要的影響(圖12)。令人驚訝的是，添加人白蛋白沒有提高AdGL-H5-ABD的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。這表明ABD在插入HVR1中時是有功能的，而在插入HVR5中時是沒有功能的。

序列表

<110> 貝爾韋什生物醫(yī)學(xué)研究學(xué)會 (IDIBELL)

加泰羅尼亞腫瘤研究所

<120> 包括白蛋白結(jié)合部分的腺病毒

<130> P10559PC00

<150> EP 14382162

<151> 2014-04-30

<160> 26

<170> PatentIn版 3.5

<210> 1

<211> 36

<212> PRT

<213> 鏈球菌

<400> 1

Cys Glu Trp Asp Glu Ala Ala Thr Ala Leu Glu Ile Asn Leu Glu Glu

1 5 10 15

Glu Asp Asp Asp Asn Glu Asp Glu Val Asp Glu Gln Ala Glu Gln Gln

20 25 30

Lys Thr His Val

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 2

Gly Ser Gly Ser

<210> 3

<211> 3021

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有插入在HVR1中的ABD的經(jīng)完全修飾的腺病毒六鄰體

<400> 3

atggctaccc cttcgatgat gccgcagtgg tcttacatgc acatctcggg ccaggacgcc 60

tcggagtacc tgagccccgg gctggtgcag tttgcccgcg ccaccgagac gtacttcagc 120

ctgaataaca agtttagaaa ccccacggtg gcgcctacgc acgacgtgac cacagaccgg 180

tcccagcgtt tgacgctgcg gttcatccct gtggaccgtg aggatactgc gtactcgtac 240

aaggcgcggt tcaccctagc tgtgggtgat aaccgtgtgc tggacatggc ttccacgtac 300

tttgacatcc gcggcgtgct ggacaggggc cctactttta agccctactc tggcactgcc 360

tacaacgccc tggctcccaa gggtgcccca aatccttgcg aatgggatga agctgctact 420

gctcttgaaa taaacctaga agaagaggac ggcagcggat ccctggccga ggctaaggtg 480

cttgcgaacc gggaactaga caaatacggt gtttctgatt attacaagaa tttgattaac 540

aatgccaaaa ccgtcgaggg cgtaaaggct ctgatcgacg aaatacttgc ggccctaccc 600

gggtctggta gcgatgacaa cgaagacgaa gtagacgagc aagctgagca gcaaaaaact 660

cacgtatttg ggcaggcgcc ttattctggt ataaatatta caaaggaggg tattcaaata 720

ggtgtcgaag gtcaaacacc taaatatgcc gataaaacat ttcaacctga acctcaaata 780

ggagaatctc agtggtacga aacagaaatt aatcatgcag ctgggagagt cctaaaaaag 840

actaccccaa tgaaaccatg ttacggttca tatgcaaaac ccacaaatga aaatggaggg 900

caaggcattc ttgtaaagca acaaaatgga aagctagaaa gtcaagtgga aatgcaattt 960

ttctcaacta ctgaggcagc cgcaggcaat ggtgataact tgactcctaa agtggtattg 1020

tacagtgaag atgtagatat agaaacccca gacactcata tttcttacat gcccactatt 1080

aaggaaggta actcacgaga actaatgggc caacaatcta tgcccaacag gcctaattac 1140

attgctttta gggacaattt tattggtcta atgtattaca acagcacggg taatatgggt 1200

gttctggcgg gccaagcatc gcagttgaat gctgttgtag atttgcaaga cagaaacaca 1260

gagctttcat accagctttt gcttgattcc attggtgata gaaccaggta cttttctatg 1320

tggaatcagg ctgttgacag ctatgatcca gatgttagaa ttattgaaaa tcatggaact 1380

gaagatgaac ttccaaatta ctgctttcca ctgggaggtg tgattaatac agagactctt 1440

accaaggtaa aacctaaaac aggtcaggaa aatggatggg aaaaagatgc tacagaattt 1500

tcagataaaa atgaaataag agttggaaat aattttgcca tggaaatcaa tctaaatgcc 1560

aacctgtgga gaaatttcct gtactccaac atagcgctgt atttgcccga caagctaaag 1620

tacagtcctt ccaacgtaaa aatttctgat aacccaaaca cctacgacta catgaacaag 1680

cgagtggtgg ctcccgggct agtggactgc tacattaacc ttggagcacg ctggtccctt 1740

gactatatgg acaacgtcaa cccatttaac caccaccgca atgctggcct gcgctaccgc 1800

tcaatgttgc tgggcaatgg tcgctatgtg cccttccaca tccaggtgcc tcagaagttc 1860

tttgccatta aaaacctcct tctcctgccg ggctcataca cctacgagtg gaacttcagg 1920

aaggatgtta acatggttct gcagagctcc ctaggaaatg acctaagggt tgacggagcc 1980

agcattaagt ttgatagcat ttgcctttac gccaccttct tccccatggc ccacaacacc 2040

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<210> 4

<211> 3021

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有插入在HVR5中的ABD的經(jīng)完全修飾的腺病毒六鄰體

<400> 4

atggctaccc cttcgatgat gccgcagtgg tcttacatgc acatctcggg ccaggacgcc 60

tcggagtacc tgagccccgg gctggtgcag tttgcccgcg ccaccgagac gtacttcagc 120

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tacaacgccc tggctcccaa gggtgcccca aatccttgcg aatgggatga agctgctact 420

gctcttgaaa taaacctaga agaagaggac gatgacaacg aagacgaagt agacgagcaa 480

gctgagcagc aaaaaactca cgtatttggg caggcgcctt attctggtat aaatattaca 540

aaggagggta ttcaaatagg tgtcgaaggt caaacaccta aatatgccga taaaacattt 600

caacctgaac ctcaaatagg agaatctcag tggtacgaaa cagaaattaa tcatgcagct 660

gggagagtcc taaaaaagac taccccaatg aaaccatgtt acggttcata tgcaaaaccc 720

acaaatgaaa atggagggca aggcattctt gtaaagcaac aaaatggaaa gctagaaagt 780

caagtggaaa tgcaattttt ctcaactact gaggcagccg caggcagcgg atccctggcc 840

gaggctaagg tgcttgcgaa ccgggaacta gacaaatacg gtgtttctga ttattacaag 900

aatttgatta acaatgccaa aaccgtcgag ggcgtaaagg ctctgatcga cgaaatactt 960

gcggccctac ccgggtctgg tagcggcaat ggtgataact tgactcctaa agtggtattg 1020