本申請涉及核酸提取領域。更具體地，本申請涉及用于從諸如細菌、病毒和真菌等微生物中最大化或改善核酸提取的方法和系統(tǒng)。

背景

提高核酸從堅韌的微生物和病毒中的釋放的組合物/方法。

微生物(包括細菌、藻類和真菌)都是非常多種多樣的，并且生活在生物圈中的所有部分。一些微生物對營養(yǎng)循環(huán)是關鍵的并且與較大的生物體具有親密的、互惠互利的關系，而其他的是致病的，感染且有時殺害宿主，即人類、其他動物和植物。微生物、病毒和朊病毒引起疾病，例如鼠疫、炭疽、結核病、麻風病、瘧疾、霍亂、傷寒、昏睡病、破傷風、弓形蟲病(toxoplamosis)、組織胞漿菌病、肉毒桿菌、白喉、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、流感、脊髓灰質炎、麻疹、腮腺炎、風疹、甲型和乙型肝炎、1型和2型皰疹、黃熱病、登革熱、狂犬病、乳頭狀瘤/癌(由人類乳頭狀瘤病毒引起)、腺病毒介導的呼吸道感染、和傳染性海綿狀腦病(例如，克羅伊茨費爾特-雅各布(Creutzfeldt-Jakob)疾病)。

醫(yī)療相關的感染(HAI)或醫(yī)院感染是病人在接受針對其他病癥的醫(yī)療保健治療過程中獲得的感染或者在醫(yī)院工作人員之間發(fā)展出的一種感染。醫(yī)療環(huán)境可以被能夠長時間生存的醫(yī)院病原體變成高污染的環(huán)境。這些可預防的感染可以是毀滅性的和全世界發(fā)病率和死亡率的顯著起因。

現(xiàn)代醫(yī)療采用許多類型的侵入設備和程序來治療患者。HAI的三分之二與在醫(yī)學程序中使用的設備有關，例如中心導管相關血流感染、導尿管相關的尿路感染、和呼吸機相關性肺炎。HAI也可能在手術部位及開放性創(chuàng)傷處發(fā)生。此外，受難辨梭菌(Clostridium difficile)細菌和孢子污染的表面可引起胃腸道感染和嚴重的疾病。引起HAI的微生物的其他實例包括不動桿菌(Acinetobacter)、洋蔥伯克霍爾德桿菌(Burkholderia cepacia)、白色念珠菌(Candida albicans)、索氏梭菌(Clostridium Sordellii)、腸桿菌科(Enterobacteriasceae)、大腸桿菌、A-C型肝炎、人類免疫缺陷病毒(HIV)、流感、克雷伯菌屬(Klebsiella)、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)、膿腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)、諾羅病毒(Norovirus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、萬古霉素(Vancomycin)中間體和萬古霉素抗性金黃色葡萄球菌、和嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。由這些微生物引起的感染通過延長患者在醫(yī)院停留占據(jù)稀缺的衛(wèi)生部門資源。

HAI是發(fā)達國家中重要的公共健康問題。在美國，疾病控制和預防中心(CDC)估計來自所有類型的微生物(包括細菌)加在一起大約170萬HAI每年引起或促成99,000人死亡。根據(jù)CDC，在美國每天每20名住院患者中約1名具有通過接受醫(yī)學治療引起的感染。僅在美國，對于醫(yī)院的HAI的整體年度直接醫(yī)療費用(包括住院病人服務)大約是$450億(基于由CDC分析的2007年數(shù)據(jù)；RD·斯科特II(RD Scott II)，2009)。

醫(yī)院有關于制服、器械消毒、清洗和其他預防措施的消毒試驗方案。所有醫(yī)務人員在與每位患者接觸前后徹底洗手和/或使用酒精涂擦是與一些HAI戰(zhàn)斗的最有效的方法之一。在器械和表面上的微生物可以通過暴露于化學品、電離輻射、干熱或在壓力下的蒸汽被殺死或進行滅菌。然而，頑強的微生物(例如葡萄球菌、MRSA和萬古霉素抗性腸球菌)已知在“接觸”表面(如床欄、電話、呼叫按鈕、地板、床頭窗簾、坐便器、椅子、門把手、電燈開關、靜脈內磁極、計數(shù)器、聽診器、TV遙控器、和桌面)連同在空氣和灰塵中生存，持續(xù)延長的時間段。

這些表面的消毒經(jīng)常被忽視、然而還打破醫(yī)療環(huán)境中的感染周期的關鍵組成部分。現(xiàn)代消毒方法，例如在二氧化碳中的不可燃酒精蒸氣(NAV-CO₂)系統(tǒng)已經(jīng)針對腸胃炎、MRSA、流感劑稍微有效。而且，過氧化氫蒸氣降低感染率，針對內生孢子形成的細菌(例如難辨梭菌)尤其有效，其中酒精已被證明是無效的。因此，為了避免和戰(zhàn)勝HAI兩者，在醫(yī)院、醫(yī)療機構、療養(yǎng)院和長期護理設施中極度需要安全和有效的抗菌藥劑來常規(guī)地消毒常見的接觸表面、可重復使用的醫(yī)療設備、和醫(yī)療/牙科器械。

研究人員和感染控制專家正在提倡更為嚴格的清洗試驗方案和程序，以及針對不同的傳染性病原體定制的材料。福利(Fawley)和同事(2001)發(fā)現(xiàn)一些通用的、基于清潔劑(離子和非離子表面活性劑)的消毒劑(沒有充足的消毒)實際上可能增加對環(huán)境的污染。而且，一項美國的研究(馬丁內斯(Martinez)等人，2003)推斷日常的20-30分鐘清洗(使用酚消毒劑)不足以消滅在患者的房間中的萬古霉素抗性腸球菌(VRE)。它采取了更徹底的4小時清洗試驗方案以從內科重癥監(jiān)護病房(ICU)清除VRE。今天，存在對安全、快速、有效、廉價且對環(huán)境無害的消毒器械、工具和接觸表面的方式的需求，而不需要使用有毒或腐蝕性化學品。理想的消毒劑應當具有寬的抗菌譜，引起快速的殺滅，無毒，無味，應當在處理的表面上留下經(jīng)濟的、可溶于水的、穩(wěn)定的抗微生物膜，并且不應當破壞環(huán)境。

在醫(yī)療設施中使用的大多數(shù)醫(yī)療和手術設備是由熱穩(wěn)定的材料制成，并且因此經(jīng)受熱(主要是蒸汽)滅菌。然而，自1950年以來，由需要低溫滅菌的材料制成的醫(yī)療設備和儀器不斷增加。在過去的15年中，許多新的低溫滅菌系統(tǒng)(例如，環(huán)氧乙烷(ETO)、過氧化氫氣體等離子、過乙酸浸泡、臭氧)已經(jīng)被開發(fā)且被用來消毒醫(yī)療設備(例如，外科手術儀器、移植物、血液培養(yǎng)管、皮下注射器、活檢鉗)和牙科儀器，以及用來凈化微生物廢物。正在開發(fā)用于在醫(yī)療設施中使用而沒有被FDA明確的技術包括汽化的過氧化氫、汽相過乙酸、氣態(tài)二氧化氯、電離輻射、或脈沖光。為了保護患者免受感染，同時對工作人員最小化風險并保留正在被再處理的物品的價值，還需要另外的新的低溫環(huán)境友好的滅菌技術，該滅菌技術具有對于活性微生物和孢子出色的殺微生物活性。

結核病(TB)是由“結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)復合體”的成員所造成的人類主要的傳染病，該“結核分枝桿菌復合體”包括，例如，結核分枝桿菌、牛分枝桿菌(M.bovis)、非洲分枝桿菌(M.africanum)、田鼠分枝桿菌(M.microti)、卡內堤分枝桿菌(M.cannetti)、山羊分枝桿菌(M.caprae)和鰭腳目分枝桿菌(M.pinnipedi)物種的致病性菌株。結核分枝桿菌(MT)感染約三分之一的世界人口，其中的90％在感染后幾年能夠保持無癥狀。TB在>50％的感染人群中是致命的，多重耐藥(MDR)菌株的出現(xiàn)使得結核病的診斷和治療在發(fā)展中的非洲人群中高度優(yōu)先。MT生長緩慢，其意味著這種生物體和其他臨床上重要的分枝桿菌的分離、鑒定、和藥敏試驗非常困難并且可能需要數(shù)周或數(shù)月。如果生物安全3級實驗室在這樣的遠程位置不可用，測試的難度被使樣品在處理和分子測試之前不感染以減少傳遞和發(fā)病率的需求所混淆。然而，MT感染的早期和準確診斷對隔離患者，從而減少對密切接觸者的疾病傳播，并確保適當和有效治療的開始很關鍵?？股丿煼ǖ脑缙诮o予顯著降低了疾病的嚴重性，增加了緩解率，并且旨在避免MDR TB的發(fā)展。目前的方法具有從懷疑感染MT的患者中安全地收集、運輸、穩(wěn)定和/或提取“好的”/代表性的樣本(如痰標本)的困難相關的缺點。

目前使用痰來診斷MT感染的方法涉及將痰收集到空容器中，將可能感染的痰樣品遞送到實驗，在那里將容器打開并用氫氧化鈉(NaOH)和N-乙?；?L-半胱氨酸(NALC)來處理樣品。NaOH/NALC被廣泛用于液化痰并減少其他微生物的背景，同時保持MT的生存能力。MT是如此頑強以至于大多數(shù)在這種嚴酷的處理下生存，允許這種微生物的選擇性培養(yǎng)。然而，MT在體外生長非常緩慢，其延長了檢測和診斷的時間。在NaOH/NALC處理之后，包含MT的沉積物在進一步的處理之前可以進行濃縮，該進一步的處理包括a)抗酸染色法，以鑒定在涂片上的“耐酸”細菌，b)常規(guī)的微生物培養(yǎng)方法，以及c)基于分子的測定用于物種鑒定和抗生素抗性分析。

在原則上，分子診斷方法的使用避免了培養(yǎng)MT的需要，因此，避免了將原始樣品中的細菌維持在存活狀態(tài)的需要。此外，全世界存在對結核病實施比用于MT的常規(guī)的實驗室測試更靈敏和快速的分子診斷測試(使用DNA和/或RNA)的需要，以使患者的分離和有效治療的更早開始成為可能。可商購的、FDA批準的用于MT的分子檢測的測定(例如，來自羅氏診斷系統(tǒng)(Roche Diagnostic Systems)(巴塞爾，瑞士)的Amplicor結核分枝桿菌檢測(Amplicor Mycobacterium Tuberculosis Test)和來自Gen-Probe公司(圣地亞哥，加利福尼亞州，美國)的“增強擴增結核分枝桿菌直接(E-MTD)測試(Enhanced Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct(E-MTD)Test)”)具有被標準化和可再現(xiàn)的優(yōu)點，并在涂片陽性樣品中表現(xiàn)出高靈敏度(>95％)和特異性。然而，所有新的肺TB病例的一半在初步診斷時是涂片陰性的。不幸的是，F(xiàn)DA批準的分子測定法還顯示了在涂片陰性和非呼吸樣本中的低靈敏度(40.0-92.9％，MTD測試；40.0-73.1％，Amplicor測試)。此外，高器械和測試成本限制了它們在遙遠的、低資源配置的發(fā)展中國家的實施(“針對用于診斷結核病的核酸擴增的使用的專家咨詢報告(Report of an Expert Consultation on the Uses of Nucleic Acid Amplification Tests for the Diagnosis of Tuberculosis)”，疾病控制和預防中心；“用于對來自臨床標本的分枝桿菌進行診斷和抗生素抗性檢測的分子遺傳學方法(Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistance detection of mycobacteria from clinical specimens)”，APMIS(2004)112：728-752)。一種增加MT檢測的靈敏度并因此分子診斷測試的準確性的手段是增加從給定的樣品中提取核酸(特別是從臨床樣品中病原菌中提取DNA和RNA)的有效性。來自具有活動和/或休眠感染的患者的樣本，特別是具有HIV/TB共同感染的個體，可能只包含少數(shù)嵌入厚的(往往是‘實的’)粘液中的分枝桿菌。高效的提取方法可以通過增加檢測MT的敏感性，從而允許早期干預來徹底改變結核病的診斷和治療。

分枝桿菌的蠟狀細胞壁中含有霉菌酸，使其難以破壞并且大大減少了大多數(shù)化學或酶提取過程的核酸提取效率。強壯的細菌細胞壁阻礙了細胞裂解和DNA的有效提取兩者(卡瑟(Kaser)等人，2009)。目前，臨床市場缺乏從處于適合PCR和其他復雜的分子分析(例如微陣列)的形式的大量樣品中提取/分離核酸的有效的方法。用于微生物/細胞破碎的物理方法包括機械細胞分裂(珠粒打漿、破碎和研磨、濕磨、超聲波、液壓剪、凍結壓力)、液體或流體剪切(弗細胞壓碎器(French press)、Chaikoff壓碎器、均質器、濕磨碎機、振動磨碎機、過濾器、超聲波分解)和固體剪切(研磨、休斯壓碎器(Hughes press))。例如，在E-MTD測試中，超聲被用于從靶細胞中釋放分枝桿菌的rRNA。細菌和其他微生物(如真菌)的機械破碎產(chǎn)生高度可變的DNA釋放，很大程度上取決于使用的具體技術。

相比于機械手段(如珠粒打漿)，一些類型的臨床樣品中頑強的細菌/孢子的化學/酶裂解會更容易和更安全地集成到現(xiàn)有的高通量、自動化的樣品處理系統(tǒng)和工作流程中。微生物/細胞分解的化學方法都旨在修改細胞壁，所以由于膨壓的影響細胞變成有漏洞的或爆裂。方法包括反滲透、干燥和提取、自溶、細胞壁合成的抑制、酶對細胞壁、噬菌體和其他裂解因素的攻擊、和電離輻射。

典型地，使用瓊脂和液體培養(yǎng)方法測定MT的耐藥性，其分別需要6至8周和4至5周提供結果。對來自MT陽性標本的RNA的可靠檢測預期徹底改變TB(特別是和多重耐藥和廣泛耐藥的結核病(MDR/XDR TB))的診斷和治療。利用分子生物學方法的耐藥性快速檢測需要一到兩天，其能夠使有效治療的早期開始成為可能，從而減少MDR TB病例的傳染性的時期多達6周和全面地改善患者的結果；這兩者都可能對努力控制MDR TB具有很大的影響(參考文獻：“關于在美國檢測耐藥結核病的迅速分子測試的專家咨詢報告(Report of Expert Consultations on Rapid Molecular Testing to Detect Drug-Resistant Tuberculosis in the United States)”，疾病控制和預防中心)。

在TB陽性患者標本中的MT DNA水平的定量測定在大多數(shù)患者中不是用于成功治療的可靠標志，因為MT DNA可在治療完成后在TB患者的痰中繼續(xù)存在長達一年。相比之下，原核mRNA具有短的半衰期，因此將被預測僅僅在活生物體中找到。相比mRNA，核糖體RNA(rRNA)是相對穩(wěn)定的RNA靶標，比mRNA具有基本上更長的半衰期和比mRNA更豐富，具有mRNA的總池的100倍的評估水平。因此，RNA穩(wěn)定化、提取和分析對于診斷和治療以前錯過的涂片陰性的、TB陽性的樣品和快速測量新的用藥方案或當前的抗TB治療的治療優(yōu)勢或有效性將是特別有價值的。MT mRNA從TB陽性患者的痰中迅速消失表明，它是微生物的生存能力的良好指標和對治療響應的快速評估的有用標記(LE·加鼎(LE Desjardin)等人，“痰結核分枝桿菌信使RNA作為替代物對化療響應的測定(Measurement of sputum Mycobacterium tuberculosis messenger RNA as a surrogate for response to chemotherapy)”(1999)美國呼吸和重癥監(jiān)護醫(yī)學雜志(Am J Respir Crit Care Med)160：203-210)。

對于DNA提取目前可用的‘非機械’的方法包括‘快速提取’(將樣品與包括Tris、EDTA和Triton X-100的裂解緩沖液混合，煮沸15分鐘，用異丙醇沉淀DNA)、‘有機提取’(將樣品與苯酚-氯仿-異戊醇混合，DNA從水層中沉淀)、‘基于二氧化硅的提取’(將樣品與包括硫氰酸胍、EDTA和Triton X-100的裂解緩沖液混合，與二氧化硅一起孵育、洗滌、從二氧化硅中洗脫DNA)以及磁性粒子，例如‘MagaZorb^TM’(將樣品與蛋白酶K和裂解緩沖液混合，孵育，添加結合緩沖液和磁性顆粒，洗滌，從顆粒中洗脫DNA)。目前，RNA可以通過僅物理或機械破碎(如珠粒打漿)從MT中釋放，并且它通常被降解。

提供此背景信息是出于介紹本申請人認為與本發(fā)明可能相關的已知信息的目的。目的不是必須承認，也不應被理解為任何前述信息構成針對本發(fā)明的現(xiàn)有技術。

概述

本發(fā)明的目的是提供使用高碘酸鹽用于從微生物中釋放DNA和RNA的方法和系統(tǒng)。依照本發(fā)明的一個方面，提供了包含氧化劑和緩沖劑的組合物，其中該氧化劑是高碘酸、高碘酸鹽或過硫酸鹽。

依照本發(fā)明的另一個方面，提供了用于從微生物中提取核酸的方法，該方法包括將懷疑包含該微生物的樣品與氧化劑混合并加熱所得的混合物，其中該氧化劑是高碘酸、高碘酸鹽或過硫酸鹽。

依照本發(fā)明的另一個方面，提供了用于核酸提取的試劑盒，其中該試劑盒包括(i)提取組合物，該提取組合物包含濃度從約5mM至約300mM的高碘酸鹽或過硫酸鹽和pH從約7至約13的緩沖液；和(ii)使用的說明。

依照本發(fā)明的另一個方面，提供了定量在樣品中的總核酸的方法，該方法包括(i)用酸處理樣品并加熱該酸化樣品；(ii)中和該酸化樣品；和(iii)用反相柱使該中和的樣品經(jīng)過HPLC并且通過UV光譜法監(jiān)測洗脫液以鑒定對應于腺嘌呤的峰；(iv)計算該腺嘌呤峰的曲線下的面積作為樣品中的總核酸的測量。

附圖簡要說明

為了更好地理解本發(fā)明以及其他方面和其進一步的特征，可參考下面的描述，該描述是與附圖結合使用的，其中：

圖1圖解地描述了從酸處理至從純的DNA釋放腺嘌呤的結果；

圖2圖解地描述了從存在于完整的枯草桿菌細胞的懸浮液中的DNA釋放的腺嘌呤作為酸濃度的函數(shù)的結果；

圖3圖解地描述了通過酸提取方法和通過珠粒打漿方法檢測的總DNA的比較的結果；

圖4是顯示使用本申請的組合物從釀酒酵母(S.cerevisiae)釋放核酸的瓊脂糖凝膠的照片；

圖5是顯示從使用高碘酸鹽和加熱從枯草桿菌(Bacillus subtilis)釋放DNA和RNA的瓊脂糖凝膠的照片。

圖6是顯示從使用高碘酸鹽和加熱從恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)釋放DNA和RNA的瓊脂糖凝膠的照片。

圖7圖解地描述了相對于商購的分離試劑盒(羅氏公司(Roche))，使用高碘酸鹽提取的來自孢子的肉毒桿菌(C.Botulinum)特定的-DNA的檢測。

圖8圖解地描述了相對于商購的分離試劑盒(羅氏公司(Roche))，使用高碘酸鹽提取的來自孢子的梭狀芽孢桿菌(C.difficile)特定的-DNA的檢測。

圖9圖解地描述了rtPCR的“高碘酸鹽”方法和“護理標準”方法靈敏度的比較。

圖10圖解地描述了低、中、高TB負荷的痰樣品的rtPCR分析。

圖11圖解地描述了使用不同的提取方法從痰樣品中回收的aMTB DNA的百分比。

圖12是用高碘酸鹽處理的純的胰核糖核酸酶A的SDS-PAGE的照片。

圖13是用高碘酸鹽處理的恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)的SDS-PAGE的照片。

圖14是顯示通過用高碘酸鹽預處理的RNA酶A的抑制的瓊脂糖凝膠電泳的照片。

圖15圖解地描述了標準凈化和用高碘酸鹽處理后炭疽桿菌(B.Anthracis)孢子生存能力。

圖16圖解地描述了標準凈化和用高碘酸鹽處理后肉毒桿菌(C.botulinum)孢子生存能力。

圖17圖解地描述了標準凈化和用高碘酸鹽處理后難辨梭菌(C.difficile)孢子生存能力。

詳細說明

除非另外定義，否則在此所使用的全部技術與科學術語具有如本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。

如說明書和權利要求書中使用，單數(shù)形式“一個/種(a/an)”和“該/所述(the)”包括復數(shù)指代物，除非上下文另有清楚規(guī)定。

如在此所使用的術語“包括”將被理解為意指以下的列表是非詳盡的并且在適當情況下可以包括或可以不包括任何其它附加的合適項目，例如一個或多個另外的特征、成分和/或要素。

如在此所使用的術語“樣品”將被理解為意指可能含有感興趣的物質的任何樣品，其任選地是核酸、蛋白質或其它感興趣的生物分子。術語“樣品”可涵蓋溶液(如水性溶液)、細胞、組織、活組織檢查、粉末、或其一個或更多的群體。該樣品可以是生物樣品，如唾液、痰、頰拭子樣品、血清、血漿、血液、血沉棕黃層、咽、鼻腔/鼻咽或竇拭樣或分泌物、咽拭樣或刮屑、尿、黏液、糞便、直腸拭樣、病灶拭樣、食糜、嘔吐物、胃液、胰液、胃腸液、精液/精子、尿道拭樣和分泌物、腦脊髓液、乳產(chǎn)品或月經(jīng)、蛋黃、羊水、房水、玻璃狀液、宮頸分泌物或拭樣、陰道液/分泌物/拭樣或刮屑、骨髓樣本和抽出物、胸膜液體和胸腔積液、汗液、膿、淚、淋巴液、支氣管或肺灌洗液或抽出物、腹膜積液、細胞培養(yǎng)物和細胞懸液、結締組織、上皮細胞、上皮拭子和涂片、粘膜、肌肉組織、胎盤組織、活組織檢查、滲出液、器官組織、神經(jīng)組織、毛發(fā)、皮膚、指甲、植物、植物提取物、藻類、土壤樣品、污水、廢水、食品、肉類加工設備拭樣等。樣品也可以是穩(wěn)定化的或保藏的樣品，其中包含原始核酸的樣本已經(jīng)與存儲溶液混合或以其他方式被存儲溶液處理，例如在試劑盒中發(fā)現(xiàn)的存儲溶液，例如但不限于，·DNA收集試劑盒、·RNA收集試劑盒、·發(fā)現(xiàn)感染的疾病收集試劑盒、Performagene^TM·牲畜(LIVESTOCK)DNA收集試劑盒、和·動物DNA收集試劑盒、或組合物，例如描述于美國專利號7,482,116、8,158,357和美國專利公開號2010/0099149，其各自通過引用結合在此。優(yōu)選地，將在這樣的穩(wěn)定化樣品中的核酸保持基本上完整和非降解持續(xù)延長的時間段，例如，從樣品收集、運輸?shù)牡攸c到測試實驗室，以及本發(fā)明的處理。

如在此所使用的術語“微生物”將被理解為意指任何微觀生物體和孢子，包括所有的原核生物，即真細菌和古細菌，以及各種形式的真核生物，包括原生動物、真菌(如酵母)、藻類和動物(如輪蟲和真渦蟲)。

如在此所使用的術語“螯合劑”將被理解為意指將與某些金屬離子一起形成可溶的穩(wěn)定的復合體，螯合這些離子以至于它們不能正常與其它組分進行反應的化學品。螯合劑可以是，例如，乙二醇四乙酸(EGTA)、(2-羥乙基)乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺三乙酸(EDTA)、環(huán)己烷二胺四乙酸(CDTA)，N,N-雙(羧基甲基)甘氨酸、無水檸檬酸、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、二檸檬酸銨、檸檬酸、檸檬酸二銨、檸檬酸鐵銨、檸檬酸鋰、或它們的任意組合。

如在此所使用的術語“變性劑”將被理解為意指可以引起蛋白質失去它們的天然二級和/或三級結構的任何化學品。變性劑可以是，例如，陰離子洗滌劑(例如，十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基硫酸鋰、或月桂硫酸鈉(SLS))、陽離子洗滌劑(例如，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，其可以適用于一些核酸應用；十六烷基溴化吡啶或烷基芐二甲基氯化銨)、或非離子型洗滌劑(例如，吐溫(Tween)、Triton X、或布里杰(Brij))。

本申請?zhí)峁┝擞糜趶奈⑸镏刑崛『怂岬姆椒ā⒔M合物和系統(tǒng)。本發(fā)明的方法、組合物和系統(tǒng)能夠從抵抗一般標準核酸提取技術的微生物和孢子中釋放核酸，例如，分枝桿菌屬的一個或多個物種，結核分枝桿菌復合體的一個或多個物種、結核分枝桿菌的MDR菌株、梭菌屬的一個或多個物種、芽孢桿菌的一個或多個物種、以及具有頑強的細胞壁的其他微生物。

本提取方法、組合物和系統(tǒng)具有超出結核病市場的應用。該方法、組合物和系統(tǒng)在人類和動物的醫(yī)學診斷和研究中是有用的(例如，研究微生物進化、毒性、耐藥性、和流行病學的群體基因組學)。另外，許多市場/行業(yè)正在尋找有效的方法來破開堅韌的小蟲和孢子，包括食品安全(食品/肉類加工廠)、土壤和水樣采集(環(huán)境測試)、生物安全或生物防御(炭疽孢子和其他生物武器)、動物飼料測試、農業(yè)/植物科學/工業(yè)、酒精生產(chǎn)等。

新的和迅速擴大的研究焦點是腸道菌群或腸道微生物組和在健康和患病的人類糞便中的微生物分析。出于研究和經(jīng)濟上的原因，對在許多家畜(尤其是為了乳制品和肉被飼養(yǎng)的那些動物)的瘤胃中的數(shù)千種不同的微生物的分析也有巨大的興趣。

本發(fā)明人已意外地發(fā)現(xiàn)，常見的實驗室化學品高碘酸鹽在弱堿性pH和升高的溫度下使用，可以用來從在生長和休眠(例如，內生孢子和孢子)兩種狀態(tài)中的微生物中快速和有效地釋放核酸。核酸的驚人釋放似乎是高碘酸鹽特異性的并且在較小的程度上是過硫酸鹽特異性的。相關的化合物(如碘酸鹽)不會顯著地提高核酸從細菌或真菌中的釋放。

本化學組合物和方法具有簡化和加快用于檢測微生物的樣品制備或加工的潛力，而不需要冷鏈或昂貴且費時的樣品凈化和乳化。本發(fā)明可以用于具有高通量系統(tǒng)的中心實驗室或具有最少的實驗基礎設施和設備的農村或流動診所。這種用途有利于流行病學和疫情監(jiān)測，從田間樣本在收集現(xiàn)場的流行性疾病和傳染病跟蹤，以及用于快速評估和監(jiān)測患者對治療的反應。

分枝桿菌頑強的細胞壁由厚的、蠟質的、疏水的、霉菌酸酯層和肽聚糖層通過多糖結合在一起組成。為了確定細胞壁的蠟質組分是否可以剝去，對各種溶劑(例如，瓦索爾(Varsol)、DMSO和Hemo-)進行了嘗試，但沒有觀察到DNA的釋放增加。同樣地，各種洗滌劑(如SDS)、甲酸、和硼酸鹽在升高的溫度下進行了測試。這些化合物沒有一種甚至在100℃下被發(fā)現(xiàn)從分枝桿菌中釋放10％以上的DNA。

除了從微生物釋放非常高級分的DNA/RNA，本非機械提取組合物和方法可具有使該樣品不被感染的另外的優(yōu)點，這將對實驗室工作人員的安全是有利的。驚奇地，在基本上全部DNA被釋放的條件下，本發(fā)明的組合物和方法仍然可以允許分枝桿菌的抗酸染色和顯微鏡觀察。與此相反，本發(fā)明人觀察到酵母在使用本發(fā)明的組合物和方法處理時即快速分解以至于它們不能夠通過染色或顯微鏡進行進一步的分析。

本申請的方法和系統(tǒng)在從細菌和孢子釋放DNA/RNA方面是有用的。該細菌可以是，例如，結核分枝桿菌、結核分枝桿菌復合體的物種、恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、卡內蒂分枝桿菌、山羊分枝桿菌、鰭腳目分枝桿菌、海魚分枝桿菌(Mycobacterium marinum)、麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、彌漫型麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium Lepromatosis)、鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)，鳥細胞內分枝桿菌(Mycobacterium avium-intra-cellulare)、鳥類結核分枝桿菌(Mycobacterium avium paratuberculosis)、潰瘍分枝桿菌(Mycobacterium ulcerans)、戈登分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)、芽孢桿菌屬物種、枯草桿菌、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)、鏈球菌屬物種、葡萄球菌屬物種、脆雙核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)和其他物種、梭狀芽胞桿菌物種、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、沙門氏菌物種、彎曲桿菌物種、厚壁菌門(Firmicutes)細菌，巴爾通氏體屬(Bartonella)物種，立克次氏體(Rickettsia)物種、耶爾森菌屬(Yersinia)物種、弗朗西絲菌屬(Francisella)物種、布魯桿菌屬(Brucella)物種、博德特菌屬(Bordetella)物種、伯霍爾德桿菌屬(Burkholderia)物種、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種、志賀菌屬(Shigella)物種、衣原體屬(Chlamydophila)物種、軍團菌屬(Legionella)物種，李斯特菌屬(Listeria)物種、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)物種、腸球菌(Enterococcus)物種、埃希氏菌屬(Escherichia)物種、嗜血桿菌屬(Haemophilus)物種、螺桿菌屬(Helicobacter)物種、鉤端螺旋體屬(Leptospira)物種、支原體(Mycoplasma)物種、奈瑟球菌屬(Neisseria)物種、密螺旋體屬(Treponema)物種、或弧菌屬(Vibrio)物種。

本申請的方法和系統(tǒng)在從真菌中釋放DNA/RNA是有用的。真菌可以是(例如)酵母菌屬、念珠菌屬、曲霉屬、組織胞漿菌屬、肺囊蟲屬、葡萄穗霉屬或隱球菌屬。

高碘酸鹽提取組合物

高碘酸鹽可以許多形式存在，這些形式包括，間-和鄰-高碘酸鹽(分別是IO₄^-和IO₆^-5)，其是從碘和氧形成的陰離子并且通常作為具有鉀(如KIO₄)或鈉(如NaIO₄)的鹽被發(fā)現(xiàn)。至少四個系列的高碘酸鹽已知處于水溶液中，即鄰高碘酸(H₅IO₆)、高碘酸(HIO₄)、偏高碘酸鹽(H₃IO₅)、和三高碘酸(H₇I₃O₁₄)[N.N.·格林伍德(N.N.Greenwood)和A.·恩肖(A.Earnshaw)，元素的化學(Chemistry of the Elements)，第2版，巴特沃思海涅曼公司(Butterworth Heinemann)，牛津，第17章，第872-875頁(1998)]。在溶液中，高碘酸鹽可以是氧化劑并且被應用于分子生物化學用于打開糖環(huán)和標記的RNA的目的。高碘酸鹽切割在合成的聚合物和天然的多糖和單糖中具有羥基基團(順式乙二醇)的相鄰的碳原子之間的鍵，從而生成兩個醛基基團。這些醛可以被用于與伯胺或酰肼活化的標記/標簽、固定支撐和交聯(lián)試劑進行的兩種類型的偶聯(lián)反應。高碘酸也被用于組織學染色(高碘酸-希夫(PAS))，用于檢測組織中的糖原和其他多糖的一種染色方法。然而，據(jù)本發(fā)明人所知，高碘酸鹽以前從未被用于從微生物中提取DNA和/或RNA。

高碘酸鹽提取組合物是高碘酸鹽的水性溶液，當與樣品混合時，該水性溶液包括從約0.1mM至約100mM，優(yōu)選地5mM至約30mM的高碘酸鹽，該高碘酸鹽可以是間-高碘酸鹽、鄰-高碘酸鹽或其任意組合。具有在弱堿性pH下濃度低至5M高碘酸鹽的高碘酸鹽的組合物，在加熱條件下，從頑強的細菌和孢子中釋放大量的DNA，這些細菌和孢子包括但不限于分枝桿菌屬、梭菌屬和芽孢桿菌屬物種。樣品中高達25-30mM的高碘酸鹽的濃度也成功地從所述樣品中的微生物中有效地釋放DNA。甚至更高濃度的高碘酸鹽可能是成功的，但可能會發(fā)生不希望的副反應。高碘酸鈉的最大實際溶解度為約400mM，使得可能難以產(chǎn)生高度濃縮的組合物或儲備溶液用于制造的目的。

為了規(guī)避高濃度的高碘酸鹽的溶解度問題，它們可以高碘酸的形式被添加到組合物中，該高碘酸可以用堿(如NaOH)中和?？商娲?，高碘酸鹽是以高碘酸鹽的形式引入，如高碘酸鈉(在此也稱為NPI)、高碘酸鉀或高碘酸鋰。因為其較高的溶解度，高碘酸鹽的鈉鹽(NaIO₄)的使用比鉀鹽和鋰鹽優(yōu)選?？商娲兀^硫酸鈉(Na₂S₂O₈)、過硫酸鉀和過硫酸銨可用于從微生物和孢子中釋放核酸。

雖然高碘酸鈉在水中并與樣品混合的簡單溶液確實從微生物中提取核酸，但是高碘酸鹽的作用是pH依賴性的。在pH從約5至約11，觀察到DNA和RNA提取，其中在接近中性的pH值時RNA完整性更好地被保留。在某些實施例中，將本申請的提取組合物緩沖至pH為從約6.5至約11、或從約8.0至約10.5、或約9.5至約10.5。在一個實施例中，為了確定最佳的pH范圍，提取組合物是使用緩沖劑的組合來緩沖的。例如，該組合物可使用磷酸(pKa為2.15、7.20、12.38)、乙酸(pKa 4.76)和硼酸的組合(pKa 9.24)進行緩沖。

任選地，高碘酸鹽提取組合物可包含附加組分，包括鋰鹽，洗滌劑和/或螯合劑。在一個具體的實施例中，高碘酸鹽提取組合物另外包括LiCl、SDS和/或CDTA。任選地，該組合物另外包括甘氨酸或硼酸作為緩沖劑。有利的是，這些附加組分有助于確保核酸從微生物中提取過程中和生物樣品的處理過程中保持完整用于隨后的下游分子測試(例如，PCR、微陣列)。這些附加組分也可協(xié)助液化樣品和在處理過程中賦予穩(wěn)定性。如果該樣品被立即收集到具有這些附加組分的高碘酸鹽組合物中，核酸將最佳地得以保存免受收集點、樣品的運輸和儲存過程中的傷害，允許樣品的處理以提取核酸，并且以感興趣的測試結束。

任選地，不含高碘酸鹽，含有LiCl、SDS和/或CDTA和/或甘氨酸或硼酸作為緩沖劑的提取組合物可以被用于保存樣品中的核酸免受采集點、運輸和儲存過程的傷害，直到需要核酸提取。在那時，可加入高碘酸鹽并且進行樣品的處理來提取核酸，最終進行感興趣的測試。

核酸提取的方法

本申請進一步提供了從含有微生物的樣品中提取核酸的方法。該方法包括使含有微生物的樣品與包含高碘酸鹽的組合物接觸和加熱所得的混合物。

依據(jù)具體的實施例中，該方法包括以下步驟：

-準備微生物的懸浮液：在一個實例中，例如，當微生物是細菌的肉湯培養(yǎng)物時，將細胞通過離心收集并洗滌(例如，用鹽水洗兩次)以去除可能會存在于復雜培養(yǎng)基中的干擾污染物。洗滌的細胞(約5-20×10⁸)應該被很好地懸浮于水(如約200μL)。

-添加高碘酸鹽提取組合物：典型地將等體積的提取組合物與等體積的細胞懸浮液混合(如，200μL的提取試劑與200μL的細胞懸浮液混合)。

-加熱該懸浮液：該加熱步驟通常用來自前一步驟的懸浮液在封閉管中進行。典型地，該加熱步驟是在45℃或更高的溫度下或在從約50℃至約100℃的溫度下，并在從約15分鐘至約60分鐘的時間中進行。較長的時間和較高的溫度可以在釋放DNA中更有效，但釋放的DNA可能被部分降解。在80℃下加熱約20分鐘時，幾乎100％DNA從高碘酸鹽處理的恥垢分枝桿菌中釋放，具有最小的DNA降解。

在一個具體的實施例中，在添加高碘酸鹽提取組合物之前，樣品首先用穩(wěn)定或預處理組合物處理。在這種方法的一個實例中，可以執(zhí)行以下步驟：

1)在穩(wěn)定試劑(例如或)中收集樣品，例如痰樣品，(例如，在遠程設置中)，該穩(wěn)定試劑在環(huán)境條件下穩(wěn)定核酸；

2)運送穩(wěn)定的樣品到實驗室，不需要冷鏈(如，無制冷)；

3)添加高碘酸鹽組合物至穩(wěn)定化的樣品并且加熱以從頑強的微生物(例如，結核分枝桿菌)和孢子中迅速和有效地釋放基本上所有核酸并且使樣本不被感染；

4)快速地、成本有效地加工處理過的樣品以分離在步驟3中釋放的核酸；并且任選地

5)使用釋放的核酸進行一個或多個診斷測試。

作為與現(xiàn)有的技術相比的核酸釋放的改進的結果，本發(fā)明的高碘酸鹽處理可導致增加的診斷測試的敏感性和更準確的診斷或對治療方案的有效性的確定。

本申請進一步提供了用于DNA提取的試劑盒。該試劑盒包括提取組合物，該組合物包括濃度為從約5mM至約30mM的高碘酸鹽和pH為約7至約13的緩沖液。如上所述，該提取組合物可包括附加組分，包括鋰鹽、變性劑和/或螯合劑。該試劑盒可以另外包括用于執(zhí)行上述的提取方法的說明、一個或多個試劑容器和/或樣品接收容器。

用于凈化/消毒的方法

本申請進一步提供了用于(例如)設備、儀器或結構的表面的凈化或消毒的方法。該方法包括使表面與包含高碘酸鹽的組合物接觸和加熱該表面。

如在此已經(jīng)證明的，用包括高碘酸鹽的組合物和加熱來處理微生物方法導致DNA從微生物中的釋放。DNA的這種釋放的后果是微生物不再是有生活力的。以下實例12證明了本發(fā)明的高碘酸鹽組合物加上加熱使三種頑強的細菌無生活力的能力。

典型地，在凈化或消毒的方法中的加熱步驟是在45℃或更高的溫度下或在從約50℃至約100℃的溫度下，并在從約15分鐘至約60分鐘的時間中進行。較長的時間和較高的溫度也可以在本方法中使用，因為它們在釋放DNA和凈化或消毒表面中可以更加有效。加熱可以使用各種手段(例如，但不限于，加熱燈、輻射加熱系統(tǒng)和烘箱)應用于表面。

在微生物懸浮液中定量總DNA的方法

本申請?zhí)峁┯糜诙繕悠分械目侱NA的方法，該樣品包括微生物的樣品。這種方法被用于建立樣品中的DNA的總量，以被用作參考來計算通過在此所述組合物釋放DNA的效率。

眾所周知，暴露于相對溫和的酸性條件可以引起DNA降解(骨架斷裂)。降解在兩個步驟中發(fā)生。首先，酸催化DNA的脫嘌呤，即釋放嘌呤核堿基(腺嘌呤和鳥嘌呤)，但不釋放嘧啶核堿基(胸腺嘧啶和胞嘧啶)。其結果是一種稱為無嘌呤酸的相當穩(wěn)定的結構。最終，骨架在嘌呤位點通過β-消除斷裂，釋放脫氧核糖和磷酸鹽；這個過程通過用堿或某些催化劑處理被加速[例如，K.·伯頓(K.Burton)、M.R.·倫特(M.R.Lunt)、G.B.·彼得森(G.B.Petersen)、J.C.Siebke，對脫氧核糖核酸中的核苷酸序列的研究(Studies of Nucleotide Sequences in Deoxyribonucleic Acid)，冷泉港定量生物學研討會(Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology)，第28卷，第28-34頁(1963)]。

與此相反，通過溫和酸處理的RNA的脫嘌呤以前沒有在任何細節(jié)方面被研究過。人們普遍理解的是RNA的嘌呤比DNA的更穩(wěn)定，但是尚未作出并排比較。相反，已知RNA很容易通過用溫和的堿處理降解，而DNA的骨架在這些條件下是非常穩(wěn)定的[(例如，G.·施密特(G.Schmidt)和S.J.·坦豪澤(S.J.Thannhauser)，用于在動物組織中確定脫氧核糖核酸、核糖核酸和磷蛋白的一種方法(A method for the determination of deoxyribonucleic acid,ribonucleic acid,and phosphoproteins in animal tissues)，生物化學雜志(Journal of Biological Chemistry)第161卷，第83-89頁(1945)]。堿催化的RNA骨架的分解在兩個步驟中發(fā)生。首先，將一個核苷酸的核糖3’-羥基連接到鄰近核苷酸的5’-羥基的磷酸二酯鍵被轉移(未斷開)到該第一個核苷酸的2’-羥基。這導致斷鏈而未水解裂解磷酸酯鍵。所得的2’、3’-環(huán)狀磷酸二酯是相對穩(wěn)定的，但它在進一步的堿處理中可以以大約相同的頻率緩慢的裂解為2’-磷酸單酯或3’-磷酸單酯。在這些條件下，DNA骨架是很穩(wěn)定的，因為它的糖(脫氧核糖)缺少相鄰3’-羥基的2’-羥基，所以容易的第一步驟，形成2’、3’-環(huán)磷酸二酯，是不可能的。

雖然科學文獻包含有關上述反應的一般背景信息，產(chǎn)生DNA的鄰近定量脫嘌呤同時引起很少或沒有RNA的脫嘌呤的詳細的、具體的酸處理條件以前還沒有被描述。

具有腺嘌呤和鳥嘌呤定量地從DNA釋放但不能從RNA釋放的良好定義的條件具有很大的實用性。它允許對在復雜生物樣品和微生物中的DNA的靈敏和可再現(xiàn)的定量(目前這是困難的)，在檢測之前無擴增步驟。例如，在測定方法(例如UV吸收或熒光DNA結合染色)可以應用之前，樣品制備和DNA純化是必要的第一步驟?；诙桨坊駾ABA(氨基苯甲酸)的化學方法受到生物樣品中的化合物(包括復雜的多糖)的干擾[G.M.·理查茲(G.M.Richards)，二苯胺反應的改進在DNA的評估中產(chǎn)生增加的靈敏度和簡便性(Modifications of the diphenylamine reaction giving increased sensitivity and simplicity in the estimation of DNA)，分析生物化學(Analyt.Biochem.)57，369-376(1974)；J.M.Kissane、E.·羅賓斯(E.Robins)，動物組織特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的脫氧核糖核酸的熒光測量(The fluorometric measurement of deoxyribonucleic acid in animal tissues with special reference to the central nervous system)，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)233，184-188(1958)]。意外地，目前沒有簡單的、精確的方法確定存在于完整的、未處理的微生物的懸浮液中的DNA(或RNA)的量。具有這樣的信息對確定任何現(xiàn)有或新的方法或組合物實際上從微生物的懸浮液中釋放DNA的效率是至關重要的。提取的效率(E)被定義為通過處理提取的DNA的量(DNAe)除以最初存在于未處理的樣品中的DNA的總量(DNAt)。

$E=\frac{DNAe}{DNAt}$

建立了目前描述的酸提取/HPLC方法以允許這樣的測定。

因此，本申請?zhí)峁┯糜诖_定在樣品中的總DNA的方法。該方法在以下實例1中詳細描述。通常，該方法包括使用HCl(“酸水解”步驟)或另一種酸(例如，濃的甲酸)加熱含有核酸的樣品的步驟，隨后在使用反相HPLC柱(如，Gemini-NX柱)進行HPLC分析之前中和該樣品。流動相可基于所使用的柱從各種溶劑或溶劑的混合物等選擇，選擇適當?shù)牧鲃酉鄬⑹窃诒绢I域的技術工人的標準能力范圍內。在一個實施例中，流動相為2％甲醇、1mM CDTA、30mM乙酸銨，用單磷酸酸鈉調整到pH 6.3。任選地，該方法另外包括允許RNA的定量的步驟。為了確定樣品中的RNA的量在用HCl加熱樣品的步驟之后，添加NaOH至相對所添加的HCl的量0.1N過量，并在100℃下孵育15分鐘。

對應于腺嘌呤(代表DNA)和對應于2’或3’單磷酸腺苷(2’-和3’-AMP)(代表RNA)的HPLC峰的曲線下面積(“AUC”)使用TotalChrom Navigator軟件(珀金埃爾默公司(Perkin Elmer))來計算。標準曲線可以利用這些純分析物(來自阿法埃莎公司(Alfa Aesar)的腺嘌呤；來自西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)的2’-3’-AMP(混合物))的已知濃度來生成。

為了更好地理解在此所描述的本發(fā)明，列出以下實例。應當理解的是，這些實例僅用于說明的目的。因此，它們不應該以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實例

實例1：用于測量樣品中總DNA的酸提取HPLC方法

表1概括了由本發(fā)明人發(fā)展的酸提取/HPLC方法以精確地測量在未加工的或未處理的微生物/樣品中的核酸的總量，以及由本發(fā)明的處理引起的從這樣的微生物/樣品中釋放的核酸的詳情。

表1.用于使用本發(fā)明描述的提取方法從頑強的微生物中釋放核酸和用于測量在完整的和處理的微生物中的DNA和RNA的典型試驗方案

實例1A：純的DNA。用于從DNA完全釋放腺嘌呤的最佳的酸提取條件

在這個實例中，測量了在不同時間段通過酸處理從純的基因組中釋放的腺嘌呤的量。在60℃下，將460納克純的犬齒DNA(Novagen公司)經(jīng)受酸提取方法持續(xù)指示的時間。結果顯示于圖1中。誤差棒表示一式三份樣品的SEM。

該結果表明在60℃下孵育60分鐘時間足以從DNA釋放最大量的腺嘌呤。極大多數(shù)的腺嘌呤是在40分鐘時釋放的，在處理的80分鐘時不再釋放腺嘌呤，表明在60分鐘時腺嘌呤的完全脫嘌呤。

實例1B：用于從完整的細菌細胞中釋放腺嘌呤的最佳酸濃度

如圖2所示，將枯草桿菌細胞在60℃下與不同濃度(標準)的HCl一起孵育60分鐘。誤差棒，一式兩份的平均值和范圍；在沒有顯示誤差棒的地方，范圍的值是在符號范圍內。

這些結果表明腺嘌呤從完整的枯草桿菌的最大釋放發(fā)生在約0.20–0.25N的HCl濃度的范圍內。

實例1C：與酸提取HPLC方法相比估計DNA含量的CFU方法

這項實驗被設計來比較通過計數(shù)細菌細胞的數(shù)量(如通過菌落形成單位(CFU)估計的)存在于細菌培養(yǎng)物中的DNA的量與使用酸提取HPLC方法從對腺嘌呤的AUC計算的DNA的量。

CFU方法是用于估計樣品中有生活力的細菌細胞的數(shù)量的經(jīng)典方法。然而，它很費時并且具有理論局限性。典型地，細菌在小團塊中生長。因此，被評分為細菌的有生活力的“菌落”實際上可以從單個細胞或從2個或多個細胞的團塊產(chǎn)生。而且，在培養(yǎng)物中的任何無生活力的細胞將包括DNA但不會形成菌落。這兩個因素趨于低估懸浮液中細菌細胞的實際數(shù)量。從對細胞的估計和每個細胞中DNA的“文獻”知識，可以計算在細胞懸浮液中的DNA的總量。

相反，酸提取HPLC方法是估計細胞懸浮液中的DNA的總量的直接的化學的方法。本發(fā)明人建立這個方法主要證明本發(fā)明對于從頑強的微生物和孢子中釋放核酸的有效性。該方法(如上詳細概括的)是基于腺嘌呤從DNA的釋放和腺嘌呤從細胞的提取，以及然后使用HPLC對腺嘌呤的檢測和定量。已知量的腺嘌呤可以從DNA的堿基組成被轉換為已知量的DNA。例如，對于具有48％的GC含量的DNA，從腺嘌呤至DNA的轉換因子是10。

這項實驗對于CFU和酸提取HPLC方法測量在枯草桿菌的懸浮液中DNA的能力進行了比較。為了估計CFU，將對數(shù)期細菌(生長于胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基(TSB))的懸浮液用冷的25mM Tris、150mM NaCl(pH 7.6)的溶液洗滌并且分成2部分。將一個部分在TSB中系列稀釋(一式三份)，并且涂抹于胰蛋白酶大豆瓊脂板上。在37℃下生長18小時后，計算有生活力的菌落的數(shù)量。將另一部分分到3只管中并離心。將沉淀溶解在200μL的0.2N HCl中，在60℃下孵育60分鐘，用ADA中和并通過HPLC進行分析。

從公布的基因組序列數(shù)據(jù)，采取枯草桿菌的基因組大小為4880ng/10⁹個細胞。

表2：標準的CFU方法

表3：酸提取HPLC方法

*AUC，曲線下的面積；**ade，腺嘌呤

CFU和酸提取HPLC方法提供了在枯草桿菌的純培養(yǎng)物中的細菌計數(shù)的非常相似的估計。酸水解HPLC方法提供的估計高出約20％，該估計與通過如上討論的CFU方法的細胞數(shù)的預期低估一致。這個實例支持了酸提取HPLC方法有效地從細胞內的DNA釋放腺嘌呤，允許用HPLC檢測它的見解。

實例1D：與酸提取HPLC方法相比估計DNA含量的溶菌酶/洗滌劑方法

這項實驗被設計來比較通過酶裂解方法從革蘭氏陽性(即，溶菌酶敏感)枯草桿菌釋放的DNA量與使用酸提取HPLC方法在完整的細胞中測量的DNA量。革蘭氏陽性生物體(例如枯草桿菌)已知對通過用溶菌酶處理接著用SDS處理的細胞溶解非常敏感(例如，B.M.·沙西(B.M.Chassy)，用于口腔鏈球菌的細胞溶解的溫和方法(A gentle method for the lysis of oral streptococci)，生物化學生物物理學研究通訊(Biochem Biophys Res Commun)68：603-608(1976))。溶菌酶是通過攻擊在細菌(尤其是革蘭氏陽性細菌)的細胞壁中發(fā)現(xiàn)的肽聚糖而起作用的糖苷水解酶。如果酸提取HPLC方法的確有效，通過全細胞的酸處理釋放并通過HPLC檢測的腺嘌呤的量應該與通過用溶菌酶加SDS溶解細胞釋放的量相似。

溶菌酶試驗方案：

-將枯草桿菌在1mL LB液體培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期并通過離心收獲。

-將細胞在冰冷的TE緩沖液(10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0)中洗滌。將沉淀溶解在1mL TE緩沖液中，分為四個等分試樣并用TE再洗滌一次。

-將沉淀中的兩份重懸于950μL的溶菌酶(1mg/mL于TE中)中，并在37℃下孵育45分鐘。

-將50μL的10％SDS添加到0.5％的終濃度。

-通過添加KCl(終濃度0.1M)除去SDS，在0℃下孵育5分鐘并且離心5分鐘。將上清液轉移至新的管；丟棄沉淀。

-使樣品經(jīng)受酸提取HPLC方法。

-將剩下的兩份未處理的沉淀溶解在500μL H₂O中并且經(jīng)受酸提取HPLC方法。

表4：酸提取HPLC方法檢測到在完整的枯草桿菌細胞中當溶菌酶/SDS處理相同的細胞后被釋放的相同的量的DNA

*重復樣品

通過酸處理從完整的枯草桿菌釋放的腺嘌呤的量與通過溶菌酶/SDS處理(預計通過細胞的100％溶解釋放100％的DNA的過程)釋放的腺嘌呤的量基本上相同。這提供了強有力的證據(jù)表明，酸提取HPLC方法是用于確定在完整的、革蘭氏陽性細菌細胞中的DNA的量的非常有效的工具。

實例1E：與酸提取HPLC方法相比估計來自枯草桿菌的DNA含量的珠粒打漿方法

進行這項研究是為了比較在完整的細菌細胞中DNA的初始量(通過酸提取HPLC法估計)與使用‘珠粒打漿’方法從相同的細菌釋放的DNA的量。用于酸提取HPLC的程序如上所描述。用于珠粒打漿方法的程序總結如下：

-將多個2mL等分試樣的枯草桿菌穩(wěn)定期培養(yǎng)物通過離心收集并在25mM Tris、150mM NaCl、pH 7.6(TBS)的冷溶液中通過離心洗滌兩次。

-根據(jù)制造商的說明在一個微型珠粒打漿機-16(Mini-BeadBeater-16)(BioSpec公司)進行珠粒打漿。簡而言之，將洗滌的細菌沉淀懸浮于500μL的TBS中并轉移至含有約100μL的100μm的玻璃珠粒(Polyscience公司)的螺旋蓋聚丙烯微型管。

-將管固定到儀器，并且在3,450振動/分鐘以兩個1分鐘周期進行劇烈攪拌。在周期之間將樣品在冰上冷卻1分鐘。

-將懸浮液轉移至1.5mL微型離心管中，并且在微型離心機中在14,000rpm下通過離心5分鐘除去未破裂的細胞和殘骸。

-除去上清液，并且添加HCl至0.2N的終濃度。在60℃下孵育樣品60分鐘。

-為了比較在完整的細胞中的DNA量與通過珠粒打漿產(chǎn)生的細胞裂解物，將完整的枯草桿菌細胞的等分試樣在0.2N HCl中在60℃下孵育60分鐘(酸提取法)。

-在14,000rpm下將所有樣品離心4分鐘以除去殘骸，并且將40μL的小部分應用于反相Gemini-NX柱(菲羅門公司(Phenomenex))且通過HPLC進行分析。

在圖3中提供了這項研究的結果。誤差棒代表一式兩份分析的范圍。

盡管人們普遍假定“珠粒打漿”在破壞細菌細胞和釋放DNA方面是高效的，這并不一定如此。這項實驗提供了另外的證據(jù)表明，酸提取HPLC方法比珠粒打漿提供了在初始細胞懸浮液中的DNA的實際量的更真實和更一致的表現(xiàn)。在其他實驗中，通過珠粒打漿釋放的DNA的量已經(jīng)達到100％，即，處于與酸提取方法相等的量。因為它提供了不同的結果，該珠粒打漿方法不是估計存在于完整的細菌細胞的懸浮液中的DNA的量的可靠方法。

實例2：對高碘酸鹽與其他過鹵化和氧化化合物進行比較

在這項實例中，評估了一系列過全鹵化和氧化化合物在從細菌細胞中釋放核酸的有效性。(間)高碘酸鈉、過硼酸鈉四水合物、高氯酸鈉、過硫酸鈉(各為15mM)被用來處理枯草桿菌營養(yǎng)細胞(即不是孢子)的懸浮液的等分試樣。在70℃下孵育20分鐘后，有或沒有測試化合物的情況下，將每個懸浮液的上清液級分(以及未經(jīng)處理的細菌細胞)經(jīng)受酸水解HPLC方法，并且計算了通過每種處理從細菌中釋放的DNA的百分比。

實驗方法和材料

-制備的BD緩沖液(2％SDS、5mM Li-CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸、pH 10.5)。

-對以下各項測試化合物在蒸餾水中新鮮制備300mM的儲備溶液：(間)高碘酸鈉(西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)，目錄號S-1878)、過硼酸鈉四水合物(西格瑪-奧德里奇公司，目錄號71840)、高氯酸鈉(西格瑪-奧德里奇公司，目錄號410241)、和過硫酸鈉(西格瑪-奧德里奇公司，目錄號216232)。

-通過將100μL(或對于陰性對照100μL的水)轉移到含有0.8mL的BD緩沖器的五個管來制得來自上述步驟的各個儲備溶液的10倍稀釋液。

-工作測試溶液。將水(100μL)添加到每個管使各儲備溶液的終濃度在80％BD緩沖液中達到30mM的終濃度。

-從等體積的穩(wěn)定期的枯草桿菌懸浮液中制備洗滌的沉淀。

-將每份沉淀懸浮在300μL的水中。

-將等體積(300μL)的每種工作測試溶液(即，在80％BD緩沖液或水(陰性對照)中的30mM(間)高碘酸鈉、過硼酸鈉四水合物、高氯酸鈉、或過硫酸鈉)添加到每個細菌懸浮液并混勻。

-將混合物在70℃下加熱20分鐘。

-加熱后，每個混合物在14,000rpm下離心4分鐘。保留上清液。丟棄不溶性物質的沉淀。

-將鹽酸添加到上清液級分至0.2N的終濃度。

-將混合物在60℃下加熱60分鐘。

-將每個樣品的150μL等分試樣用100μL的ADA緩沖液(pH 8.0)中和。

-然后每個樣品通過HPLC進行分析來確定腺嘌呤的AUC。使未經(jīng)處理的細胞(步驟5)的三份洗滌的沉淀直接經(jīng)受酸水解HPLC方法以確定在每份細菌沉淀中的DNA(腺嘌呤)的總量。

結果

結果總結在如下表5中：

表5.比較由過全鹵化和氧化化合物從枯草桿菌釋放的DNA。

結論

在單一濃度(15mM)的測試的4種化合物中，只有(間)高碘酸鈉和過硫酸鈉釋放了比對照更多的DNA：分別從枯草桿菌釋放了44％和15％的總DNA。相反，其他過全鹵化/氧化化合物沒有釋放比對照更多的DNA(6.7％)。

這項實例證明，過硫酸鹽也可以類似于高碘酸鹽的方式起到增加核酸釋放的作用。

實例3：pH在高碘酸鹽提取中的作用

在跨越一系列pH值測試NPI((間)高碘酸鈉)的有效性和劑量依賴性中，有必要考慮各種因素，包括(i)NPI與緩沖液本身的可能反應(ⅱ)在不同的pH值可能存在NPI的不同形式(例如，偏高碘酸鹽、鄰高碘酸鹽)和(iii)NPI在升高的pH值下具有降低的溶解度。

對于這些研究，使用了一個緩沖液系統(tǒng)，該緩沖液系統(tǒng)包括3個不同的覆蓋一系列pKa值的緩沖弱酸并用單堿調節(jié)到所需的pH。酸(pKa值)是磷酸(2.15、7.20、12.38)、醋酸(4.76)和硼酸(9.24)。結合酸的初始溶液(各為20mM)具有pH 1.9(表6)(在此被稱為“PAB”緩沖溶液)。PAB緩沖溶液用5N NaOH調節(jié)以達到所需的pH值用于實驗(表7)。

在pH 3.7、5.5、7.4和9.4的PAB緩沖溶液單獨測試和與在三種不同的濃度(最終6、12和18mM)的NPI聯(lián)合測試。將有或沒有NPI的緩沖液添加至洗滌的恥垢分枝桿菌的沉淀。對三種不同濃度的NPI進行了測試以確定在這個濃度范圍內對于從細菌細胞中釋放DNA是否存在劑量反應。因此，恥垢分枝桿菌細胞用含有不同濃度的NPI的在一定范圍的pH值內的PAB緩沖溶液加熱以測量使用在此所述的酸提取HPLC方法釋放的DNA的量。

PAB緩沖溶液

混合在表6中列出的成分，并且將所得的混合物攪拌過夜以允許硼酸完全溶解。初始pH測量為1.9。

表6.PAB緩沖體系的組成

表7.PAB緩沖系統(tǒng)溶液的最終pH值

制備后，該PAB緩沖溶液儲存在4℃。

實驗方法

新鮮工作溶液(PAB緩沖溶液±NPI)的制備是通過(分別)添加0、20、40或60μL的300mM NPI儲備(在水中)至1,000、980、960或940μL的每個PAB緩沖溶液。工作溶液在制備的3小時內使用。

洗滌的沉淀從恥垢分枝桿菌的均勻分布的、洗滌的懸浮液中制備(其中，水用于最后一次洗滌)。

將每份沉淀懸浮在200μL的PAB緩沖溶液±NPI(最終6、12和18mM)中，一式三份。將所得的混合物在70℃下加熱20分鐘。

將該混合物在14,000rpm下離心4分鐘。保留上清液并丟棄不溶性物質的沉淀。

將HCl添加到上清液級分至0.2N的最終濃度，在60℃下，將酸化級分加熱60分鐘。

每150μL樣品用100μL的ADA緩沖液(N-(2-乙酰氨基)亞氨基二乙酸)(pH 8.0)中和。然后樣品通過HPLC進行分析。

結果

將結果總結于下面的表8和表9中。

表8.在來自用NPI處理的恥垢分枝桿菌的上清液中的作為pH的函數(shù)的DNA釋放*

*在分析使用在此所述的酸提取HPLC方法釋放的DNA之前，用和不用6、12和18mM NPI(最終)在指示的pH和加熱下用PAB緩沖溶液處理細菌。顯示了每個重復分析的結果。

**對于腺嘌呤的AUC(曲線下面積)是在指定的pH下通過所指示的處理釋放的并通過HPLC測量的DNA的量的量度。

***釋放的DNA的百分比是從對于在每個pH條件和NPI的濃度下釋放到上清液中的腺嘌呤的平均的AUC，除以從未處理的細菌中酸提取的腺嘌呤的平均量計算出的(表9)。

表9.在表8的實驗中使用的3個重復的恥垢分枝桿菌細胞的沉淀中的DNA的量。

**對于腺嘌呤的AUC(曲線下面積)，在未處理的細胞的沉淀存在的DNA的量的量度。

結論

使用3組分緩沖系統(tǒng)來證明對NPI介導的從恥垢分枝桿菌釋放DNA的pH依賴效應。在沒有NPI的情況下，在70℃下在20分鐘的孵育過程中從恥垢分枝桿菌釋放了2.1-11.5％的DNA。與此相反，向緩沖溶液中添加甚至很低濃度的NPI(6mM)以pH依賴性的方式顯著地增加從相同的微生物釋放的總DNA約9倍至37.4-59.4％。驚奇地，NPI的濃度從6mM增加至12mM甚至18mM僅導致DNA從細菌適度額外的釋放；這僅在中性和堿性pH值下觀察到。

實例4：使用高碘酸鹽從孢子的核酸釋放

枯草桿菌是革蘭氏陽性細菌，可從生長的營養(yǎng)狀態(tài)改變到非常頑強的非分裂孢子，允許生物體在極端的環(huán)境條件下生存。通常，孢子非常耐熱(能夠在100℃下存活幾個小時)、干燥、UV輻射和氧化劑。孢子形成基本上是由營養(yǎng)素的缺乏引起的。細菌以不對稱的方式分裂導致單個內生孢子的形成，該內生孢子包含由一個非常頑強的外壁包圍的細菌的基因組DNA。在這種狀態(tài)下，細菌可以處于休眠、但有生活力的狀態(tài)下持續(xù)延長的時間，甚至上百年。在有利的環(huán)境條件下，內生孢子可以重新被激活并恢復到生長的(營養(yǎng)的)狀態(tài)。

細菌孢子被認為是在最難破開的細胞類型之中。破壞營養(yǎng)細胞的一般抗菌劑，例如家庭消毒劑(如乙醇、洗滌劑、季銨化合物)不殺死內生孢子。孢子外殼對溶菌酶不敏感。在這個實例中，證明了(間)高碘酸鈉對于從枯草桿菌孢子中釋放核酸的效力。

孢子的制備

枯草桿菌的單個菌落在軌道平臺搖床上以200rpm于37℃下在2mL盧里亞(Luria)液體培養(yǎng)基(LB)中生長過夜。通過以11000rpm離心3分鐘收獲細菌(1mL)；丟棄上清液。細菌通過在1mL冷的無菌H₂O中離心洗滌兩次以除去殘留的LB。

為了將營養(yǎng)細胞轉換為孢子，將細菌懸浮于200μL H₂O中并添加到100mL的含有0.1mM氯化錳的哥倫比亞液體培養(yǎng)基中[J.A.·莫雷洛(J.A.Morello)和P.D.·艾爾納(P.D.Ellner)，1969，用于血液培養(yǎng)的新培養(yǎng)基(New medium for blood cultures)，應用微生物學(Appl.Microbiol.)17：68-07]。

將混合物在軌道平臺上以160rpm在37℃下振蕩72小時以產(chǎn)生大約每毫升10⁸個孢子。孢子通過離心收獲并懸浮于15％乙醇的水中。

在使用之前，每個孢子樣品用冰冷的水洗滌三次。

為了消除任何剩余的營養(yǎng)細菌，將沉淀物懸浮在1mL冷水中。添加溶菌酶溶液(在Tris(10mM)、EDTA(1mM)中的400μL的5mg/mL儲備溶液)，并且將所得混合物在37℃下孵育1小時。孢子通過離心收集，并且丟棄上清液。

將孢子沉淀懸浮于1mL的0.1％SDS中并且在室溫下孵育5分鐘。孢子沉淀通過以9000rpm離心4分鐘收集；丟棄上清液。

為了除去制備中的任何殘留的無細胞DNA，將孢子懸浮于含有10μg胰DNA酶的1mL的1X DNA酶緩沖液(10mM Tris-HCl、4mM MgCl₂、1mM CaCl₂)，并在37℃下孵育30分鐘。

將孢子懸浮液在9,000rpm離心4分鐘并且棄去上清液。將沉淀用水洗滌一次。將高度純化的孢子沉淀再懸浮于1.2mL H₂O中。這種制備(800μL)的大多數(shù)被用于在下面的實驗方法的步驟2中；其他三個100μL的等分試樣用酸提取HPLC方法(步驟5-8，以下)直接進行處理以估計孢子的總DNA含量；孢子懸浮液的剩余100μL的等分試樣用溶菌酶和SDS進行第二次處理(步驟9和10，以上)以確認從孢子釋放的DNA不是由于轉化成營養(yǎng)狀態(tài)的細胞。然后進行酸提取/HPLC分析。

DNA提取

用和不用(間)高碘酸鈉來制備試劑BA、BB、BC和BD(表10)。

懸浮的枯草桿菌孢子(來自以上步驟)的等分試樣(100μL)與等體積的具有或不具有(間)高碘酸鈉的BA、BB、BC或BD混合。將該混合物在70℃下加熱20分鐘，然后在14,000rpm下離心4分鐘。保留上清液并丟棄不溶性物質的沉淀。

將鹽酸添加到上清液級分至0.2N的終濃度，然后將級分在60℃下加熱60分鐘。每個樣品(150μL)的一小部分用100μL的ADA緩沖液(pH 8.0)中和。該樣品通過HPLC進行分析以確定對于腺嘌呤的AUC。

表10.使用的試劑組成

表11.在不同試劑中的高碘酸鹽對從在70℃下處理20分鐘的孢子的DNA釋放的有效性，如使用酸提取HPLC方法測量的*

*在分析使用在此所描述的酸提取HPLC方法釋放的DNA之前，用和不用15mM(間)高碘酸鈉(終濃度)在指示的pH和加熱(70℃，20分鐘)下用試劑(表10)處理枯草桿菌孢子。顯示了一式三份分析的結果。

**對于腺嘌呤的AUC(曲線下面積)是通過所指示的處理從孢子釋放到上清液中并通過HPLC測量的DNA的量。

***從孢子釋放的DNA的百分比是從在每個處理條件下釋放到上清液中的腺嘌呤的平均AUC，除以從未處理的孢子中酸提取的腺嘌呤的平均量計算出的。

結論

驚奇地，于BAP和BDP試劑中存在低濃度的(間)高碘酸鈉連同適度的加熱處理(70℃，20分鐘)能分別從孢子(最頑強的生物體)釋放多達10％和8.3％的DNA。較高的溫度和較長的處理時間預計將釋放更多的DNA。在沒有釋(間)高碘酸鈉的情況下，不能檢測到DNA的釋放。

實例5：使用高碘酸鹽從真菌的核酸釋放

酵母是單細胞真核微生物，歸類于真菌界。酵母的一個物種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)已被廣泛使用了數(shù)千年并用于眾多應用中。在發(fā)酵過程中，釀酒酵母能將簡單碳水化合物代謝為CO₂(二氧化碳)和酒精(乙醇)。CO₂被用作烘焙中的發(fā)酵劑并且乙醇被用作酒精飲料的主要成分。最近，生物技術行業(yè)利用酵母將糖轉化為乙醇，用作生物燃料。一些酵母菌株已經(jīng)被用于生物降解的領域。釀酒酵母是研究最徹底的真核微生物之一，并且它仍然是遺傳和細胞生物學研究中的重要有機體。

盡管細菌通常具有由肽聚糖組成的細胞壁，真菌具有包含葡糖胺聚合物、幾丁質的細胞壁。大多數(shù)真正的真菌具有細胞壁，該細胞壁由三層組成：幾丁質、其他多糖(酵母聚糖)和甘露糖蛋白。(http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_wall-cite_note-11)在這個實例中，釀酒酵母為發(fā)明者擔任來自真菌界的模式微生物，以測試NPI((間)高碘酸鈉)對于核酸(DNA和RNA兩者)的釋放的功效。

實驗方法

用和不用(間)高碘酸鈉來制備試劑BA、BB、BC和BD(參見表10)。

釀酒酵母(弗萊希曼(Fleischmann’s)的面包酵母)的培養(yǎng)物通過在37℃下用具有50mM的葡萄糖胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基生長過夜來制備。細胞從6mL培養(yǎng)物通過在8,000rpm離心3分鐘來收集。細胞沉淀用冷PBS通過離心洗滌一次，懸浮于冷的PBS中，分配到10只管中，離心并將得到的沉淀用冷水再次洗滌。

將每份洗滌的沉淀再懸浮于200μL水中，并與等體積的具有或不具有NPI(最終15mM)的BA、BB、BC和BD試劑混合。將該懸浮液在70℃下加熱20分鐘，并且然后冷卻至室溫。將懸浮液在14,000rpm離心4分鐘；將澄清的上清液轉移至新的管并且丟棄沉淀。

將每種上清液的10μL的一個部分在0.8％瓊脂糖凝膠上進行電泳，并且用溴化乙錠染色以可視化DNA和RNA。

向上清液級分的剩余部分添加HCl至0.2N的終濃度。將樣品在60℃下加熱60分鐘。然后將150μL的每個樣品用100μL的ADA緩沖液(pH 8.0)中和。

中和的樣品(40μL)通過HPLC進行分析并且確定腺嘌呤的AUC。

結果與討論

通過具有或不具有高碘酸鹽的不同組合物處理從釀酒酵母釋放的DNA

下表12所示的結果證明了本發(fā)明的幾個特征。

釀酒酵母，一種頑強的單細胞微生物，出乎意料地對通過(間)高碘酸鈉的DNA釋放敏感。相比在水(BC)中相同的熱處理，單獨在水中接近中性pH的(間)高碘酸鈉(BCP)在70℃下處理20分鐘后釋放了4倍以上的DNA(表12)。

添加高濃度的SDS(1-2％終濃度)和/或LiCl(125mM)和/或較高pH和/或螯合劑CDTA(2.5-25mM)增加了更多釋放的DNA的量(表12)。有趣的是，在相同的條件下在沒有(間)高碘酸鈉的情況下釋放的DNA的量并不受新型試劑的這些次級組份的影響(表12)。

如從文獻報導所預期的，相比DNA，酵母含有大量的RNA，其可以通過瓊脂糖凝膠電泳看出(圖4)。清楚的強烈的核糖體RNA(rRNA)帶可以在使用試劑BA和BD沒有(間)高碘酸鈉處理的樣本中可以看出；當添加(間)高碘酸鈉時更多的RNA似乎被釋放(BAP、BDP)，但RNA被部分降解。在這些實驗中沒有嘗試通過處理條件穩(wěn)定從釀酒酵母釋放的RNA。

采用硼酸鹽緩沖的BB以及BBP釋放大量的RNA，但在兩種情況下RNA明顯被降低(圖4)。在所有情況下，相比RNA的量，在凝膠上只看到少量的高分子量DNA(圖4)。

表12.使用酸提取/HPLC方法來測量腺嘌呤的AUC時含有高碘酸鹽的試劑對DNA從釀酒酵母中釋放的影響*

*在表10中提供了組合物的詳細信息。

結論

這項研究表明，相對于不具有高碘酸鹽的相同試劑，DNA和RNA兩者從釀酒酵母(具有堅固細胞壁的原始真核微生物)的釋放可以通過用含有高碘酸鈉的試劑處理來大大增強。在一些含有高碘酸鹽的試劑中，提取了高分子量的DNA和RNA，如使用瓊脂糖凝膠電泳查看從釀酒酵母釋放的DNA和RNA所示。

實例6：在各種試劑正高碘酸鹽和加熱處理對核酸從枯草桿菌和恥垢分枝桿菌中釋放的影響

在這個實例中，溫度(室溫、50℃、70℃、80℃和100℃)和在幾個組合物中的(間)高碘酸鈉(15mM終濃度)(表10)的影響，使用兩種不同的靶標微生物(枯草桿菌和恥垢分枝桿菌)來進行評估。核酸從這些微生物的釋放，使用酸提取HPLC方法、實時PCR和瓊脂糖凝膠電泳來進行評估。

枯草桿菌是通常在土壤和植被中發(fā)現(xiàn)的一種頑強的細菌；它被廣泛用于研究實驗室研究。細胞是革蘭氏陽性的桿狀，并具有由肽聚糖(胞壁質)、糖和氨基酸的聚合物構成的剛性細胞壁。在不利的環(huán)境條件下，它可以形成堅韌的、保護性孢子，其能夠存活于極端條件。

分枝桿菌是可由染色技術鑒定為抗酸的桿狀細菌。在土壤中發(fā)現(xiàn)的一些物種被認為是良性的。其他種類對于人類和其他哺乳動物是嚴重的病原體和肺結核(TB)的致病物，肺結核是在世界的許多地方的毀滅性的疾病。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，2010年TB感染的發(fā)病率在一些非洲國家高達1000/10萬人口。TB和HIV的雙重感染是特別致命的組合。越來越多的關注的原因是TB的廣泛耐藥(XDR)菌株，這些菌株構成了重要的人類健康問題。

分枝桿菌物種共享特有的堅韌細胞壁，該細胞壁包含稱為霉菌酸的蠟狀材料，該材料使得微生物非常疏水。細胞壁由霉菌酸層、肽聚糖層和多糖(阿拉伯半乳聚糖)構成?？顾崛旧男再|是由于霉菌酸層。盡管革蘭氏陽性細菌通常對溶菌酶是敏感的，并不知攻擊分枝桿菌的細胞壁的這樣的酶。從這個物種有效地釋放DNA的所有目前的方法都需要某種形式的機械破壞。

目前描述的方法，完全避免了復雜的機械破碎的步驟，對其從這些種類的微生物釋放DNA的能力進行了評估。

實驗方法

將枯草桿菌在胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基中于37℃下生長過夜。過夜培養(yǎng)物的等分試樣(100μL)用于接種40mL的胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基，并在37℃的搖動平臺生長直到對數(shù)期。恥垢分枝桿菌在胰蛋白酶大豆瓊脂上于37℃下生長3天并且通過刮擦收獲至冷的H₂O中。

枯草桿菌和恥垢分枝桿菌各自通過在2,700g離心15分鐘來收集；丟棄上清液。細菌沉淀用冷的H₂O通過在2,700g離心15分鐘洗滌2次并且丟棄上清液。將洗滌的細菌沉淀重懸浮于15mL冷的H₂O中。

每個細菌懸浮液的3個等分試樣(每個300μL)直接用酸提取HPLC方法進行處理以確定在這些細胞中的總核酸含量。

將各細菌懸浮液的剩余部分分成1.5mL樣品等分試樣，然后與等體積的BA、BB、BC或BD試劑(表10)之一，其中具有和不具有(間)高碘酸鈉(在試劑中為30mM，最終為15mM)，混合。

每個3mL等分試樣均等地(600μL)分到5只微型離心管，并且在室溫、50℃、70℃、80℃或100℃孵育20分鐘。將管在14,000rpm下離心5分鐘。將澄清的上清液轉移到新的管并且丟棄沉淀。將每個上清液的等分試樣(190μL)除去用于通過酸提取HPLC方法如下一式三份直接進行分析(表13和表14)：

將鹽酸添加到上清液級分至0.2N的終濃度，將級分在60℃下加熱60分鐘。將每個級分的等分試樣(150μL)用100μL的ADA緩沖液(pH 8.0)中和。所得的樣品通過HPLC進行分析并且確定腺嘌呤的AUC。

將來自每個剩余的上清液級分的350μL樣品除去，并且在50℃下與蛋白酶K(160μg)一起孵育1小時。

將10μL各處理的上清液級分在1.0％瓊脂糖凝膠上在100V下電泳40分鐘，用1Kb⁺DNA梯度作為標記；將凝膠用溴化乙錠(1μg/μL)染色10分鐘，并且將DNA和RNA在UV透照下可視化/拍照(圖5和6)。

將氯化鈉(0.1M終濃度)添加到具有BC和BCP化學品的管。將兩體積的95％冷乙醇添加到所有的管，然后在-20℃下孵育30分鐘以沉淀核酸。將管在13,000rpm下離心，并且將沉淀小心地用冷的70％乙醇沖洗一次。

將沉淀風干并溶解于90μL減小的TE(10mM Tris、0.1mM EDTA，pH 8.0)中。將各個溶解的沉淀的2μL部分與‘通用的’細菌16S核糖體DNA引物(BacrRNA173-F5’ATTACCGCGGCTGCTGG3’和BacrRNA173-R5’CCTACGGGAGGCAGCAG3’)一起添加到25μL的PCR反應，以通過定量實時PCR(qPCR)來估計對于每個測試條件的從枯草桿菌和恥垢分枝桿菌釋放的DNA的量(表15和16)。每個PCR反應包括2.5μL的1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)、2.5μL的10x PCR緩沖液、1.25μL的50mM MgCl₂、0.5μL的10mMdNTPs、0.5μL的10pMol正向引物、0.5μL的10pMol反向引物、0.5μL的0.5μM Syto9、0.2μL的5U/μL Taq聚合酶、12.3μL的水。來自枯草桿菌和恥垢分枝桿菌的高度純化的DNA充當PCR分析的參考。陰性對照包括在其中沒有添加模板DNA的反應。Ct值是指在擴增曲線穿過檢測的閾值的點的部分循環(huán)數(shù)。轉子基因(Rotorgene)儀器軟件設定閾值線，并且計算各樣品的Ct值。Ct值與樣品中的DNA的量成反比；一個Ct值的減小對應于檢測出的DNA的量加倍。

結果與討論

結果顯示于表13、14、15和16中，和圖5和6中。

表13.在不同試劑中的高碘酸鹽對從在增加的溫度下處理20分鐘的枯草桿菌的DNA釋放的影響，如使用酸提取HPLC方法測量的

*從營養(yǎng)的枯草桿菌釋放的DNA的百分比是從在每個處理條件下釋放到上清液中的腺嘌呤的平均AUC，除以從未處理的細菌中酸提取的腺嘌呤的平均量計算出的。

**超過100％的值表明參考樣品(從未經(jīng)處理的細菌沉淀中經(jīng)酸提取的腺嘌呤的平均量)稍微低估了存在的DNA的總量。

表14.在不同試劑中的高碘酸鹽對從在增加的溫度下處理20分鐘的恥垢分枝桿菌的DNA釋放的影響，如使用酸提取HPLC方法測量的

*從營養(yǎng)的恥垢分枝桿菌釋放的DNA的百分比是從在每個處理條件下釋放到上清液中的腺嘌呤的平均AUC，除以從未處理的細菌中酸提取的腺嘌呤的平均量計算出的。

關于圖5，其顯示通過高碘酸鹽和80℃(A)或70℃(B)的加熱步驟DNA和RNA從枯草桿菌釋放到上清液中，高分子量(>23kb)DNA帶的強度在所有情況下因為高碘酸鹽的存在顯著地增加了，除了一種情況，BBP在80℃下(小圖A)。后者可能是由于導致DNA在其從細胞釋放后在一些點丟失了的誤差，因為在70℃下處理的相同樣品表現(xiàn)出強烈的DNA帶(小圖B)。在所有條件下處理后存在完整的或基本完整的核糖體RNA，除了BB和BBP。

參見圖6，其顯示通過高碘酸鹽和70℃的加熱步驟DNA和RNA從恥垢分枝桿菌釋放到上清液中，高分子量(>23kb)DNA帶的強度在所有情況下因為高碘酸鹽的存在顯著地增加了。相比枯草桿菌，釋放的RNA的量較少并且它更廣泛地被降解。

表15.使用qPCR定量通過高碘酸鹽和增加的溫度從枯草桿菌釋放到上清液中的DNA

表16.使用實時PCR定量通過高碘酸鹽和增加的溫度從恥垢分枝桿菌釋放到上清液中的DNA

在表15和16中給出的結果顯示高碘酸鹽降低了Ct值(即，提取更多的DNA)，從用BA、BB、和BD試劑處理的，但不是BC試劑(水)處理的，并在50℃、70℃和80℃下孵育20分鐘的營養(yǎng)的枯草桿菌和恥垢分枝桿菌兩者。重要的是，用高碘酸鹽和加熱處理釋放的DNA的質量是適合于隨后通過實時PCR分析進行的擴增和鑒定。使用在100℃加熱重復該研究并證明了成功的DNA提取；然而，qPCR結果被DNA在100℃下變性且不可被熒光染料定量的事實復雜化。

一些樣品在高碘酸鹽處理后沒能顯示更低的Ct值，很可能是由于可變的或較差效率的乙醇沉淀步驟。在這些實驗中，在qPCR可以進行之前需要該步驟來除去抑制劑。當用乙醇沉淀之前相同的樣品通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析時(圖5和6)，在每種情況下可以看到從用高碘酸鹽處理的樣品釋放的DNA的量明顯增加。

結論

三種不同的方法(酸提取HPLC、瓊脂糖凝膠電泳和qPCR)已經(jīng)被用于證明由本發(fā)明的化學方法從微生物釋放核酸的有效性，該微生物包括已知抵抗標準的核酸提取方法的那些。本發(fā)明的方法是特別有價值的，因為它不要求樣品的機械破碎或沸騰。高碘酸鹽以溫度依賴的方式明顯增加從枯草桿菌和恥垢分枝桿菌中釋放的DNA和RNA的量。

實例7：在各種試劑正高碘酸鹽和加熱處理對核酸從摻入恥垢分枝桿菌的唾液樣品中釋放的影響

在這個實例中，溫度(70℃)和添加至幾個組合物(表10)正(偏)高碘酸鈉(15mM終濃度)的影響，用被摻入人唾液中的‘活的’恥垢分枝桿菌的已知量來進行評估，以模擬復雜的生物標本的條件。從在復雜的樣品中的這個微生物的核酸釋放，使用酸提取HPLC方法和采用恥垢分枝桿菌特異性引物的實時PCR來進行評估。

前面的實例處理了純的培養(yǎng)物并洗滌了細菌和真菌的沉淀。然而，大多數(shù)的生物標本或樣品的組合物是高度復雜的，并且包含大量的樣品特有的、潛在的干擾物質以及宿主細胞和微生物物種。例如，除了大量的水，唾液(和痰)包含許多其他物質，例如，電解質、粘液、許多酶、抗菌化合物和細胞(人類和微生物起源的)。特別地，唾液包含大量的粘蛋白，該蛋白是具有多糖側鏈的蛋白質。鑒于高碘酸鹽主要攻擊和打開糖環(huán)，本發(fā)明人關注到高碘酸鹽(尤其是在發(fā)現(xiàn)可有效地從洗滌的微生物沉淀中釋放DNA的較低濃度下)，可能通過與存在于唾液中過剩的多糖反應而被消耗，而不是可用來攻擊樣品中感興趣的細菌/真菌的細胞壁。這個實例被設計來證明高碘酸鹽在從復雜的生物樣品中的微生物中釋放核酸的有效性。還有，在人DNA和口腔細菌DNA的存在下，對摻入的生物體(恥垢分枝桿菌)的特異性檢測進行了評估。

實驗方法和材料

-通過交替向15只管子中吐痰來收集六個1mL唾液樣品。緊接其后，如下向每只管添加三種不同的緩沖液(1mL)中的一種：2只管包含BA試劑，2只管包含BB試劑，并且其余2只管包含BD試劑(表10)。

-大約10⁹個恥垢分枝桿菌的懸浮液通過離心在1mL冷的PBS(pH 7.4)中洗滌兩次，然后懸浮于0.5mL PBS中。

-將100μL的各個細菌懸浮液添加到一組含有BA、BB或BD試劑的管；將100μL的PBS添加到第二組管。樣品通過渦旋簡單混合。使另一個100μL的細菌懸浮液(一式兩份)經(jīng)受酸提取HPLC方法以準確地定量在具有三種緩沖液中的一種的每個唾液等分試樣中摻入的恥垢分枝桿菌DNA的量。使用已知濃度的腺嘌呤標準和已知67.5％GC含量的恥垢分枝桿菌DNA來將腺嘌呤的量轉換成DNA的量，已確定100μL的細菌懸浮液含有2366ng的恥垢分枝桿菌DNA。沒有預期100％的DNA產(chǎn)率，因為提取步驟隨后是純化步驟，例如，乙醇沉淀(下文描述)，其不是100％有效的。

-將10μL的蛋白酶K(89μg/mL終濃度)添加到每個管并將這些管在50℃下孵育過夜。

-從每個管將一個200μL等分試樣轉移到新的管，并與10μL的300mM(間)高碘酸鈉混合。

-來自每個管的第二個200μL的等分試樣轉移至新管。

-所有等分試樣在70℃下孵育20分鐘，然后在室溫下冷卻3分鐘。

-將Tris-HCl(1M，pH 7.1)添加至每個等分試樣至100mM的終濃度，并且在室溫下孵育15分鐘。

-將醋酸鉀(3M，pH 5.5)添加至每個等分試樣至150mM的終濃度，并且在冰上孵育10分鐘。

-將等分試樣在14,000rpm離心3.5分鐘。將上清液取出并轉移到新管；丟棄沉淀。

-將兩體積的室溫95％乙醇添加至每個等分試樣，并在室溫下孵育15分鐘。

-將等分試樣在14,000rpm離心3.5分鐘。

-小心地從每個等分試樣除去乙醇并且將DNA沉淀溶解于50μL的TE(pH7.5)。將一部分再溶解的沉淀稀釋5倍，并且將5μL稀釋的等分試樣作為模板添加至含有恥垢分枝桿菌基因特異的DNA引物的25μL的qPCR反應[HP-正向：TGCCATCATCAGCGAAGTAG；HP-反向：GCGGCTACAGATTACGAAGC]。預期的產(chǎn)物是編碼恥垢分枝桿菌菌株MC2155的‘假定蛋白MSMEI_2098’的基因的250bp的區(qū)域。這個引物被用來通過定量PCR(qPCR)評估在將這個微生物摻入唾液樣品后從這個微生物釋放的DNA的量。具體的條件在表17中列出。qPCR反應也包括2.5μL的1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)、2.5μL的10x PCR緩沖液、1.0μL的50mM MgCl₂、0.5μL的10mM dNTPs以及0.5μL的10pMol正向引物、0.5μL的10pMol如上所述的反向引物、0.5μL的0.5μM Syto 9、0.2μL的5U/μL Taq聚合酶、11.85μL的水。來自恥垢分枝桿菌的高度純化的DNA充當PCR分析的參考。陰性對照包括在其中沒有添加模板DNA的反應。Ct值是指在擴增曲線穿過軟件產(chǎn)生的檢測閾值的點的部分循環(huán)數(shù)。轉子基因(Rotorgene)軟件設定閾值線，并且計算各個樣品的Ct值。Ct值與樣品中的DNA的量成反比；一個Ct值的減小對應于檢測出的DNA的量加倍。

結果與討論

結果總結在如下表17中：

表17.使用qPCR定量通過高碘酸鹽和增加的溫度從摻入恥垢分枝桿菌的人唾液釋放的DNA

表17的結果顯示高碘酸鹽顯著地增加從細胞中釋放的恥垢分枝桿菌DNA，該細胞最初被“摻入”唾液中并且隨后用含有高碘酸鹽的BB和BD試劑在70℃下處理20分鐘。較低的Ct值是恥垢分枝桿菌DNA更大的量的反映。使用含有高碘酸鹽的BA試劑觀察到提取效率相似但不那么顯著的增加。在最驚人的情況下，相比BD加高碘酸鹽，在包含單獨的BD試劑的樣品中DNA的估計量增加了約100倍，每個反應從150pg增加至16,230pg。對于含有BB的樣品，添加高碘酸鹽也增加了DNA 100倍，每個反應從70pg增加至6,430pg。對于含有BA的樣品，添加高碘酸鹽也增加了檢測的DNA，每個反應從不可檢測增加至1,090pg。這些實驗證明，從恥垢分枝桿菌釋放的DNA的量適合于通過qPCR分析進行的PCR擴增和微生物特異的鑒定，該恥垢分枝桿菌與含有高碘酸鹽和其他試劑的唾液混合并且隨后被加熱，該PCR分析使用恥垢分枝桿菌特異的引物。

結論

這個實例證明了本發(fā)明的從恥垢分枝桿菌釋放核酸的化學組合物和方法的有效性，即使該恥垢分枝桿菌被摻入復雜的生物樣品。盡管在唾液中發(fā)現(xiàn)蛋白質連接的多糖和其他潛在的干擾物質的存在，很小濃度的高碘酸鹽在從這個非常頑強的微生物中釋放很大比例的核酸非常有效。這證明了通過高碘酸鹽實現(xiàn)的DNA從恥垢分枝桿菌釋放和檢測的100倍的增加，可能增加涂片陰性、MT-陽性樣品的檢測的敏感性，允許的有效治療方案早期開始從而減少MDR TB病例的傳染性的周期。

實例8：如通過實時PCR確定的，比較通過高碘酸鹽和MagNA純的純化方法從肉毒梭菌和難辨梭菌孢子釋放的DNA量

梭菌屬(Clostridium)是由大約100中革蘭氏陽性細菌物種組成的屬，屬于厚壁菌門(Firmicutes)，其在脅迫下產(chǎn)生頑強的孢子。這些桿狀細胞在自然界中普遍存在，并且在土壤中尤其普遍。梭狀芽胞桿菌是能動的專性厭氧菌，是引起人類疾病的重要病原體。有五個引起人類疾病的主要物種，即，肉毒梭菌、難辨梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風梭菌和索氏梭菌。

由肉毒梭菌產(chǎn)生的孢子是橢圓形的近頂端內生孢子，通常發(fā)現(xiàn)于土壤中，并且很難殺死。在海平面，肉毒梭菌孢子可以于沸水溫度存活，因此許多食品罐頭都是用加壓煮沸，該加壓煮沸達到甚至更高的溫度，足以殺滅孢子。肉毒梭菌在食品和傷口中產(chǎn)生肉毒毒素，其導致肉毒中毒。來自這種細菌的孢子可在蜂蜜中發(fā)現(xiàn)，并且在十二個月和更小的孩子中導致嬰兒型肉毒中毒?！叭舛緱U菌毒素”是一種神經(jīng)毒素，在美容上用于麻痹面部肌肉減少老化的跡象，以及用于許多治療應用中。

大約每20位住院患者中有1位將感染醫(yī)院獲得性感染(HAI)。雖然大多數(shù)類型的HAI正在下降，由難辨梭菌(一種腸道共生菌)導致的暴發(fā)是困擾住院患者和長期的醫(yī)療設施的一個日益嚴重的問題，在這些住院患者和長期的醫(yī)療設施中抗生素治療是常見的。難辨梭菌感染(CDI)通過糞-口途徑傳播，并且被認為是從胃腸失調(即，正常腸道微生物或菌群的破壞)造成的?？股刂委煔⑺涝谖改c道中大多數(shù)細菌，這些細菌通常保持難辨梭菌在控制之下。在這種改變的環(huán)境中，難辨梭菌復制并產(chǎn)生攻擊腸道襯里的毒素，引起從腹瀉到威脅生命的炎癥和結腸內表的出血的癥狀。根據(jù)疾病控制與預防中心(CDC)，難辨梭菌與美國每年14000人的死亡有關。

在醫(yī)療環(huán)境中，難辨梭菌通過糞-口途徑人對人傳播，并且當人類意外從共同的‘接觸’表面(如床欄、門把手、坐便器、水槽)吸入孢子時發(fā)生疫情。難辨梭菌孢子抵抗熱和最常規(guī)的表面清洗方法，包括基于酒精的手清潔劑，并且可以在環(huán)境中存活數(shù)月至數(shù)年。針對經(jīng)常發(fā)生的難辨梭菌感染的有效治療不能普遍獲得。矛盾的是，今天，對于難辨梭菌感染的主要治療是給予更多的抗生素，約20％的患者在一個月內具有復發(fā)，而且他們中的許多都反復發(fā)作。

許多市場和行業(yè)都在尋找有效的方法來消滅有害孢子(和細菌)，包括食品安全(食品/肉類加工廠)、醫(yī)療保健、土壤和水樣采集(環(huán)境測試)、生物安全或生物防御、動物飼料檢驗、農業(yè)/植物科學/工業(yè)等。對細菌和/或孢子的致病菌株的檢測和特性感興趣的臨床實踐和流行病學研究，需要具有優(yōu)良的敏感性和特異性以及重測信度的更快的替代方法。如今，“黃金標準”測試仍然涉及大便培養(yǎng)，這是一個敏感的檢測，但具有很長的周轉時間，是資源密集型的，并且需要具有組織培養(yǎng)設施的有經(jīng)驗的實驗室。相反，PCR試驗測試廉價，具有快速的周轉時間、優(yōu)良的敏感性、特異性和預測值，只要從存在于所收集的生物樣品中感興趣的細菌/孢子提取出足夠量的DNA。

本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)，常見的實驗室化學品高碘酸鹽在弱堿性pH和升高的溫度下使用，可以用來從在活躍和休眠兩種狀態(tài)中的微生物中快速和有效地釋放核酸。在這個實例中，從肉毒梭菌和難辨梭菌的培養(yǎng)物中制備孢子，并且對兩種不同的DNA分離方法的功效進行了比較：1)本發(fā)明的高碘酸鹽方法和2)可商購的MagNA^TM純的純化方法。通過這些方法提取的DNA使用CLIA/CLEP批準的實時PCR(rtPCR)試驗來進行定量，該rtPCR對于每個生物體是特異的。

實驗方法

[肉毒梭菌和難辨梭菌孢子制備，DNA提取和rtPCR試驗是與沃茲沃斯中心生物防御實驗室(Wadsworth Center Biodefense Laboratory)(紐約州衛(wèi)生部門，奧爾巴尼，紐約州，美國)合作進行的。]

肉毒梭菌和難辨梭菌孢子制備

肉毒梭菌B型和難辨梭菌的冷凍儲備培養(yǎng)物在具有5％綿羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上培養(yǎng)，并在35℃下厭氧孵育24至48小時。初始孵育后，將這些培養(yǎng)物轉移到多個(最少10個)腦心浸液瓊脂板(Brain Heart Infusion Agar plates)，并在35℃下厭氧孵育長達2周。每3至4天進行孔雀綠孢子染色以監(jiān)測體外細菌的孢子形成。當孔雀綠染色顯示生物體的形成孢子幾乎完成時，將孢子收獲至5.0mL的PBS(pH 7.4)中，并在室溫下保存直到使用。

孢子濃度的確定

將肉毒梭菌和難辨梭菌的每個孢子儲備懸浮液在PBS中稀釋至10^-2。將這些最終稀釋液中的每一個的等分試樣(10μL)裝入2室的血細胞計數(shù)器載玻片的每個清潔的孔中。在40x放大無油下觀察血細胞計數(shù)器室來進行孢子計數(shù)。在血細胞計數(shù)器的光場網(wǎng)格上孢子可視化為圓形或橢圓形的黑細胞。肉毒梭菌，檢測的極限(LOD)＝30個孢子/反應；難辨梭菌，LOD＝20個孢子/反應。

使用高碘酸鹽方法從孢子提取DNA

1.向肉毒梭菌和難辨梭菌的350μL孢子儲備懸浮液(上文)添加350μL BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)。

2.渦旋混合。

3.取出100μL用于培養(yǎng)。

4.添加50μL的300mM(間)高碘酸鈉或NPI儲備(終濃度30mM)，渦旋混合。

5.在70℃水浴中孵育20分鐘。

6.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

7.取出100μL用于培養(yǎng)。

8.添加20μL的1M Tris pH 7緩沖液(終濃度50mM)。

9.在室溫下孵育10分鐘。

10.添加20μL的3M醋酸鉀(pH 5.5)(終濃度150mM)。

11.在冰上孵育10分鐘。

12.以13000rpm離心5分鐘。

13.將上清轉移到干凈的標記的管。丟棄沉淀。

14.加入800μL室溫的95％乙醇。

15.反轉20次混合。

16.在室溫下孵育樣品15分鐘以沉淀DNA。

17.以15,000rpm離心2分鐘以沉淀DNA。

18.輕輕取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀。

19.將沉淀溶于100μL TE。

20.短暫渦旋以充分重懸DNA。

21.運行CLIA/CLEP批準的對每個生物體特異的rtPCR試驗。

使用羅氏公司(Roche)的MagNA^TM純的DNA分離試劑盒從孢子中提取DNA

1.準備10個在每個希望的濃度200μL的肉毒梭菌的和難辨梭菌孢子懸浮液的等分試樣(總共30只管)。

2.通過合并38μL蛋白酶K與262μL細菌裂解緩沖液對每個樣品制備裂解緩沖液，該262μL細菌裂解緩沖液是來自MagNA純的LC DNA分離試劑盒III(細菌、真菌)(目錄號03264785001，羅氏公司(Roche))。

3.將300μL的裂解緩沖液添加到每個200μL孢子懸浮液。

4.渦旋。

5.在65℃下孵育20分鐘。

6.在95℃下孵育10分鐘。

7.允許樣品在室溫下冷卻。

8.當冷卻時，短暫離心以去除氣溶膠。

9.轉移500μL每個樣品到羅氏MagNA純的緊湊型樣品管。

10.將樣品管放置在羅氏MagNA純的緊湊型儀器上。

11.遵循篩選說明使用DNA血液外部裂解試驗方案：樣品體積：500μL；流出體積：100μL。

用于肉毒梭菌B型和難辨梭菌的實時PCR

所有rtPCR試驗在ABI7500儀器上進行。使用CLIA/CLEP批準的對每個生物體特異的rtPCR試驗法(弗羅布萊夫斯基(Wroblewski)等人，2009)單份地分析從每個提取分離的DNA。

結果與討論

雖然生物樣品或細菌/孢子的培養(yǎng)物的機械珠粒打漿可以相當有效地破開微生物，但是它的確會產(chǎn)生氣溶膠，該氣溶膠增加了傳播傳染劑的機會并且把實驗室人員的健康處于危險之中。因此，非常需要開發(fā)非機械的化學方法從頑強的微生物及其孢子中釋放總核酸。這個實例證明本發(fā)明的“高碘酸鹽”方法是快速的、廉價的、簡單的化學處理，在肉毒梭菌孢子(圖7)和難辨梭菌孢子兩者中分離DNA方面，比可商購的來自羅氏公司(Roche)的DNA分離試劑盒(“合作者”的方法)和非常昂貴的自動化系統(tǒng)顯著地更加有效(DNA增加8倍)。MagNA^TM純的試劑盒(“合作者(Collaborator)”，圖7和8)利用裂解緩沖液加磁性玻璃顆粒，而本發(fā)明的高碘酸鹽方法(“高碘酸鹽”，圖1A和1B)不需要磁珠或具有磁處理能力的復雜的自動化系統(tǒng)甚至從頑強的孢子中分離DNA。

CLIA/CLEP批準的rtPCR試驗表明，相比“合作者”的方法，使用“高碘酸鹽”方法增加了檢測來自肉毒梭菌和難辨梭菌芽孢的DNA的敏感性(Δ3C_t值)，即，高碘酸鹽處理的樣品導致在rtPCR中在每個LOD始終較低的Ct值。使用高碘酸鹽方法對微生物DNA的提取的改善應當解釋為用其他CLIA/CLEP批準的從rtPCR試驗評估生物樣品中的檢測敏感性增強。

實例9：如通過對結核分枝桿菌特異的實時PCR確定的，比較通過高碘酸鹽方法與傳統(tǒng)的珠粒打漿從結核病陽性的臨床痰樣品釋放的DNA的量。

這個實例提供了通過兩種方法純化的TB陽性痰樣品(由FIND惠贈，參見下文)的臨床評價的并排比較。具體地，對1)“治療標準”和2)“高碘酸鹽方法”兩種不同的DNA提取方法的影響在CLIA/CLEP批準的rtPCR試驗的敏感性上進行了比較，該rtPCR試驗靶向RD4結核分枝桿菌復合體(MTBC)差異區(qū)域(RD)(哈爾斯(Halse)等人，2011)。

與“高碘酸鹽方法”相反，“治療標準”方法包括珠粒打漿、機械方法以破開痰樣品中的細菌。雖然機械珠粒打漿可以有效地破開生物體，但是它在實驗室的確產(chǎn)生危險的氣溶膠。因此，非常希望開發(fā)一種有效的、非機械的、化學的方法以安全地從結核分枝桿菌釋放DNA，而不會對診斷測試的臨床敏感性產(chǎn)生負面影響。

實驗方法

結核分枝桿菌陽性痰樣品的生活力的確認

樣品

對于本實例，來自TB陽性患者的未加工的痰樣品由創(chuàng)新診斷基金會(Foundation for Innovative Diagnostics，F(xiàn)IND)結核病標本庫惠贈。一式兩份的0.5mL的等分試樣從30位患者樣品提供并且冷凍儲存。利用培養(yǎng)和涂片分析，F(xiàn)IND將這30個樣品分類為‘涂片+、培養(yǎng)+(高)’，‘涂片+、培養(yǎng)+(中)’或‘涂片-、培養(yǎng)+(低)’TB陽性。

將等分試樣冷凍運到沃茲沃斯中心分枝桿菌學實驗室(Wadsworth Center Mycobacteriology Laboratory)(紐約州衛(wèi)生部門，奧爾巴尼，紐約州，美國)以進行進一步的分析，該實驗室是CLIA/CLEP批準的臨床實驗室。

在抵達沃茲沃斯之后，將來自30個捐贈者的等分試樣在冰上解凍，并且在這些10個‘高’，10個‘中’和10個‘低’的TB等分試樣中的分枝桿菌的生存能力用培養(yǎng)和涂片鏡檢來確認。

使用高碘酸鹽方法從TB陽性痰中提取DNA

1.將0.5mL BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)添加到每個0.5mL痰等分試樣；渦旋混合。

2.添加蛋白酶K(400μg)，并在50℃水浴中孵育2小時。

3.轉移0.4mL至新的管并添加NPI(終濃度30mM)，渦旋混合。

4.在70℃水浴中孵育20分鐘。

5.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

6.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度。

7.在室溫下孵育10分鐘。

8.添加3M醋酸鉀(pH 5.5)至150mM的終濃度。

9.在冰上孵育10分鐘。

10.以13000rpm離心5分鐘。

11.將上清轉移到干凈的標記的管。丟棄沉淀。

12.添加2體積的室溫的95％乙醇。

13.反轉20次混合。

14.在室溫下孵育樣品10分鐘以沉淀DNA。

15.以15,000rpm離心2分鐘以沉淀DNA。

16.輕輕取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀。

17.將沉淀溶于200μL TE。

18.短暫渦旋以充分重懸DNA。

使用“治療標準”從TB陽性痰中提取DNA

1.將0.5mL 3.5％NaOH添加到每個0.5mL痰等分試樣；渦旋混合。

2.在室溫下孵育15分鐘。

3.添加無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)使體積至10mL。

4.以5,000rpm離心20分鐘以沉淀細菌。丟棄上層清液。

5.在0.5mL無菌PBS中重懸沉淀。

6.預留300μL重懸的細菌用于培養(yǎng)。

7.向剩余200μL重懸的細菌中，加入200mg的105-150微米的玻璃珠粒。

8.珠粒打漿2個周期，每個周期1分鐘，隨后使用微型珠粒打漿機(BioSpec產(chǎn)品)在冰上進行1分鐘。

對結核分枝桿菌進行實時PCR和抗生素抗性焦磷酸測序

使用CLIA/CLEP批準的rtPCR試驗，來自每個純化的痰樣品的5μL‘純的’DNA和5μL稀釋的(1:10)DNA的重復反應在ABI7500實時PCR儀上擴增，該rtPCR試驗靶向RD4結核分枝桿菌復合體(MTBC)差異區(qū)域(RD)(哈爾斯(Halse)等人，2011)。小于37的閾值循環(huán)(C_t)值報道為陽性，并且值大于37的樣品被重測；如果結果是相同的，結果被報告為陽性，并且如果它們不同，它們被報告為不確定的。

結果與討論

相比于傳統(tǒng)的珠粒打漿方法(“治療標準”)，本發(fā)明的化學“高碘酸鹽法”明確導致結核分枝桿菌特異性檢測的增加的敏感性，特別是對于通過培養(yǎng)和涂片鏡檢歸類為‘低’和‘中’TB陽性的痰樣品。在這個實例中，直到使用“治療標準”方法提取的DNA被稀釋10倍才可以檢測到在‘中’和‘高’TB陽性痰樣品中的結核分枝桿菌(表18)；然而利用“高碘酸鹽方法”分離DNA后87％‘低’TB負荷的痰樣品被檢測為陽性(表18)。

表18.使用2種不同的方法提取DNA后被檢測為TB陽性的痰樣品的百分比

*2個數(shù)據(jù)從低TB樣品中排除-任何提取方法或培養(yǎng)后未檢測

圖9表明相比“治療標準”或SOC，使用“高碘酸鹽方法”提取的所有TB陽性痰樣品中結核分枝桿菌的檢測極限的顯著的改善。例如，‘低’TB陽性痰的C_t值的范圍對于“高碘酸鹽方法”為31.4-45.0，相比之下對于SOC為38.5-45.0；‘中’TB陽性痰的C_t值的范圍對于“高碘酸鹽方法”為20.9-32.3，相比之下對于SOC為26.8-45.0；‘高’TB陽性痰的C^t值的范圍對于“高碘酸鹽方法”為19.8-28.3，相比之下對于SOC為27-2-39.3；圖10顯示通過DNA提取方法安排的圖9的數(shù)據(jù)。當使用本發(fā)明的高碘酸鹽方法來提取DNA時，對于所有TB負荷水平C_t值始終較低。這個由改善的DNA提取提供的較低的檢測極限，幫助確保對來自患者痰樣品的結核分枝桿菌的精確診斷。

實例10：基于高碘酸鹽方法比凱杰公司(Qiagen)純化釋放顯著更多的結核分枝桿菌DNA

自1980年以來結核病在發(fā)達以及發(fā)展中國家的復蘇與HIV傳染病、耐藥菌株的出現(xiàn)、和從疾病流行率很高地區(qū)的移民增加相關(科比特(Corbett)等人，2003)。結核病是發(fā)病率的最常見的原因之一和在欠發(fā)達國家生活的HIV陽性成年人總死亡的最常見的原因，但它是可以預防和治療的疾病。由于從人到人傳播的高風險，結核分枝桿菌的快速檢測對疾病管理至關重要。美國疾病控制與預防中心(CDC)建議收到的臨床樣品同時通過培養(yǎng)、抗酸桿菌(AFB)染色、核酸擴增(NAA)試驗方案進行分析(結核病在成人和兒童中的診斷標準與分類(Diagnostic Standards and Classifications of Tuberculosis in Adults and Children)；美國胸科學會(American Thoracic Society)和CDC，2000)。雖然培養(yǎng)仍然是最后確定的“黃金標準”，它可能需要長達2至8周。AFB染色是快速的，但具有低敏感性和低特異性，因為它不區(qū)分來自結核分枝桿菌復合體(MTBC)的成員與非結核分枝桿菌(NTM)。因此，快速鑒定，對結核病的傳播至關重要，越來越多地依賴于核酸提取和分子診斷測試。

MTBC成員在毒力屬性、耐藥模式和宿主偏好方面不同。這些物種的快速區(qū)分以確定動物傳染的或人類起源的結核疾病或指導治療可以有益于公眾健康和病人管理。哈爾斯(Halse)等人(2010；2011)開發(fā)了實時PCR試驗用于區(qū)分密切相關的生物體，結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、牛BCG分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、和卡內蒂分枝桿菌。MTBC成員的基因組之間的差別區(qū)域(RD)的存在或不存在允許設計一種廉價從、快速、單管、五叢的實時PCR(rtPCR)試驗以區(qū)分臨床樣品中的這些物種。

在這樣的rtPCR的上游；然而，至關重要的是臨床標本以這樣的方式處理以便盡可能地回收最大量的DNA。在歷史上，定量研究已經(jīng)顯示必須有5000至10000個桿菌/毫升標本以允許在染色涂片中的細菌檢測(霍比(Hobby)等人，1973)。相反，需要10至100個生物體用于陽性培養(yǎng)(耶格爾(Yeager)等人，1967)。在含有少至10個桿菌的整體標本中的分枝桿菌的分子檢測對診斷測定表現(xiàn)出真正的挑戰(zhàn)，尤其是當測試輸入量為總標本的一小部分時。與培養(yǎng)和染色涂片相反，分子方法檢測來自接受治療的患者標本中的活的和死亡或瀕臨死亡的桿菌的DNA，允許治療前和治療過程中對MTBC生物體的鑒定。

明顯存在對開發(fā)優(yōu)越的提取方法的需求，該提取方法有助于從患者標本中的堅韌的微生物中快速恢復全部或大部分DNA。從復雜樣品(像痰)的DNA提取的改善，直接轉化為對結核病和其他疾病的基于診斷性(Dx)/DNA測定的增加的敏感性，并且最終用適當?shù)乃幬镏委焷砀斓刂委熁颊摺＿@一需求被在多個國家中的多重耐藥結核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結核病(XDR-TB)的出現(xiàn)以及近期在南非的迅速致命的HIV相關的結核病的流行進一步加劇(甘地(Ghandi)等人，2006；拉維格里昂(Raviglione)，2006)。由于差的控制措施，一些國家現(xiàn)在正面臨的TB控制的可能最壞的情形之一：HIV感染和高度耐藥TB的致命組合(拉維格里昂(Raviglione)，2006)。

實驗方法

摻入結核分枝桿菌的生物樣品的制備

為了模擬結核病陽性痰，將減毒結核分枝桿菌(aMTB)以5×10⁶菌落形成單位/毫升(cfu/mL)摻入健康人的唾液樣品。

使用高碘酸鹽方法從結核分枝桿菌陽性唾液中提取DNA[“DNA Genotek最優(yōu)方法”或“選項1”]

1.將等體積的摻入aMTB的唾液與BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)混合。

2.在室溫下孵育15分鐘。

3.以5,000rpm離心20分鐘。丟棄上層清液。

4.將沉淀重懸浮于50％BD2緩沖液中。

5.添加NPI至30mM的終濃度，渦旋混合。

6.在70℃水浴中孵育20分鐘。

7.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

8.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度。

9.在室溫下孵育10分鐘。

10.添加3M醋酸鉀(pH 5.5)至150mM的終濃度。

11.在冰上孵育10分鐘。

12.以13000rpm離心5分鐘。

13.將上清轉移到干凈的標記的管。丟棄沉淀。

14.加入800μL室溫的95％乙醇。

15.反轉20次混合。

16.在室溫下孵育樣品15分鐘以沉淀DNA。

17.以15,000rpm離心2分鐘以沉淀DNA。

18.輕輕取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀。

19.將沉淀溶于100μL TE。

20.短暫渦旋以充分重懸DNA。

使用高碘酸鹽方法從結核分枝桿菌陽性唾液中提取DNA隨后是凱杰公司(Qiagen)純化[“選項2”]

1.將等體積的摻入aMTB的唾液與BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)混合。

2.在室溫下孵育15分鐘。

3.以5,000rpm離心20分鐘。丟棄上層清液。

4.將沉淀重懸浮于50％BD2緩沖液中。

5.添加NPI至30mM的終濃度，渦旋混合。

6.在70℃水浴中孵育20分鐘。

7.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

8.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度。

9.在室溫下孵育10分鐘。

10.添加等體積的凱杰(Qiagen)AL緩沖液。

11.對于凱杰公司(Qiagen)QIAamp DNA微型試劑盒(目錄號51304)遵循凱杰QIAMP程序。

使用BD2緩沖液和凱杰(Qiagen)純化從結核分枝桿菌陽性唾液中提取DNA[“選項3”]

1.將等體積的摻入aMTB的唾液與BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)混合。

2.在室溫下孵育15分鐘。

3.以5,000rpm離心20分鐘。丟棄上層清液。

4.將沉淀重懸浮于50％BD2緩沖液中。

5.添加等體積的凱杰(Qiagen)AL緩沖液。

6.對于凱杰公司(Qiagen)QIAamp DNA微型試劑盒(目錄號51304)遵循凱杰QIAMP程序。

用標準的氫氧化鈉/NALC方法和凱杰(Qiagen)純化從結核分枝桿菌陽性唾液中提取DNA[“標準的凱杰方法”或“選項4”]

1.新鮮制備和高壓滅菌4％氫氧化鈉(NaOH)溶液。

2.新鮮制備和高壓滅菌2.9％檸檬酸鈉溶液。

3.在使用前，混合等體積的NaOH和檸檬酸鈉溶液。

4.添加N-乙?；?L-半胱氨酸(NALC)粉末以達到0.5％的終濃度。充分混合并在同一天使用。

5.混合等體積的摻入aMTB的唾液和NaOH/NALC/檸檬酸溶液。

6.在室溫下孵育15分鐘。

7.添加無菌PBS以使總體積為50mL。

8.以5,000rpm離心20分鐘。丟棄上清液。

9.將沉淀重懸于PBS中。

10.添加等體積的凱杰(Qiagen)AL緩沖液。

11.對于凱杰公司(Qiagen)QIAamp DNA微型試劑盒(目錄號51304)遵循凱杰QIAMP程序。

rtPCR條件

在這個實例中，使從摻入aMTB的唾液樣品中分離的DNA(選項1-4，上文)經(jīng)受特異于分枝桿菌的rtPCR試驗，RD4Taqman實時PCR測定。RD4的引物如下：RD4-正向5’-CCA CGA CTA TGA CTA GGA CAG CAA-3’和RD4-反向5’-AAG AAC TAT CAA TCG GGC AAG ATC-3’(哈爾斯(Halse)等人(2011))。

圖11闡明了通過分子檢測基于計算出的基因組當量(GE)回收的aMTB DNA的百分比(回收GE/輸入GE*100)。

結果與結論

最近開發(fā)的分子測定提供在培養(yǎng)材料的結果可用之前幫助疑似結核病患者的初期管理的可靠結果，并提供在從臨床標本收集的短短1-2天內預測結核分枝桿菌陽性標本的抗生素耐藥性的能力。然而，結核病診斷和一般基于PCR的系統(tǒng)需要DNA的有效分離和純化程序，其被痰的物理特點和缺乏同質性以及被分枝桿菌細胞壁的高脂質含量進一步復雜化。因此，所有對分枝桿菌的DNA提取可用的技術需要操縱步驟，該步驟導致起始材料不可預測的損失，其可導致假陰性診斷。

本實例比較了針對生物標本的多種DNA分離和處理方法。具體地，結核病陽性痰通過在健康捐贈者的唾液樣品中摻入aMTB來模擬。標本的常規(guī)NaOH/NALC凈化，接著用可商購的凱杰QIAamp DNA微型試劑盒進行DNA提取(選項4)，導致在僅2.2％的aMTB DNA的回收率。相比之下，本發(fā)明的高碘酸鹽方法(選項1)導致71.3％aMTB DNA的顯著回收率；比選項4回收率增加了70％。選項3證明標本與BD2緩沖液的初始孵育不是選項1的顯著結果的原因，因為BD2緩沖液接著凱杰提取回收了aMTB原摻入量的1.6％。當高碘酸鹽處理的標本用凱杰的試劑盒進行提取(選項2)時，只有26.4％的aMTB DNA被回收；相比傳統(tǒng)的NaOH/NACL/凱杰試劑盒(選項4)，相當于DNA回收率增加24％。

高碘酸鹽方法有效地從結核分枝桿菌摻入標本中分離出大多數(shù)的DNA，并因此可用于顯著增加診斷/分子測定已知的好處，即，高水平的特異性和敏感性，短的周轉時間和成本效益。這些改善使醫(yī)療保健系統(tǒng)節(jié)省多達8周的時間來通過培養(yǎng)區(qū)分MTBC的物種，提供信息以實現(xiàn)適當?shù)摹⒖焖俚乃幬镏委?，具有最小的副作用，以及早期洞察TB傳播。

實例11：通過高碘酸鹽的蛋白選擇性降解

高碘酸鹽通常用于溶液中打開連二醇之間的糖環(huán)，允許RNA的3’-末端的選擇性標記。出人意料的是，本發(fā)明人已經(jīng)確定高碘酸鹽在“殺死”或中和特定的酶(如胰核糖核酸酶A(RNA酶A))的活性方面也是非常有效的，并且高碘酸鹽也降解某些其他的蛋白質。

在這個實例中，RNA酶A，切割單鏈RNA的胰核糖核酸酶，被證明是高碘酸鹽的靶標。RNA酶的酶活性通過監(jiān)測其降解RNA底物(從HeLa細胞純化的RNA)的能力進行評估。如果RNA酶的酶活性被高碘酸鹽負面地影響，則HeLa細胞核糖體RNA基本上不會被降解，如通過瓊脂糖凝膠電泳所評估。

實驗方法和材料

用高碘酸鹽處理純的胰核糖核酸酶A

1.將純的胰核糖核酸酶A(西格瑪公司(Sigma))(0.1-0.2μg/μL)添加到有或沒有15mM高碘酸鹽的緩沖液(1％SDS、25mM Li-CDTA、125mM LiCl、25mM甘氨酸，pH 10.5)。

2.將混合物在70℃下加熱15分鐘。

3.將10μL混合物裝載到10％SDS-PAGE凝膠上，并在160伏特運行60分鐘。

4.SDS-PAGE凝膠用熱的考馬斯藍染色30分鐘，然后在室溫下脫色2小時，并在可見光下拍照(圖12)。

用高碘酸鹽處理恥垢分枝桿菌裂解物

1.從平板生長的恥垢分枝桿菌的懸浮液制備洗滌的沉淀。

2.根據(jù)制造商的說明在一個微型珠粒打漿機-16(Mini-BeadBeater-16)(BioSpec公司)進行珠粒打漿。簡而言之，將洗滌的細菌沉淀物懸浮于1000μL的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，并轉移到含有約100μL的100μm的玻璃珠粒(Polyscience公司)的螺旋蓋聚丙烯離心管中。

3.將管固定到儀器，并以兩個1分鐘的周期(3,450振動/分鐘)進行劇烈攪拌。在周期之間將樣品在冰上冷卻1分鐘。

4.將懸浮液轉移到1.5mL微型離心管中，并且通過在微型離心機中在14,000rpm下離心5分鐘除去完整的細胞和殘骸。

5.將上清液取出并且均等地分到兩個1.5mL微型離心管中。將一個級分用等體積的PBS稀釋(對照，參見圖13)。將第二級分與等體積的緩沖液(1％SDS、25mM Li-CDTA、125mM LiCl、25mM甘氨酸，pH 10.5)混合，分成3份，加入高碘酸鹽至0、7.5mM或15mM的終濃度。

6.將管在70℃下加熱15分鐘。對照樣品不加熱。

7.將7.5μL或15μL混合物裝載到10％SDS-PAGE凝膠上，并在160伏特運行60分鐘。

8.SDS-PAGE凝膠用熱的考馬斯藍染色30分鐘，然后在室溫下脫色2小時，并拍照(圖13)。

用胰核糖核酸酶A和高碘酸鹽處理純化的HeLa核酸

1.在50mM甘氨酸(pH 10.5)中制備10μg/mL的純的胰核糖核酸酶A(西格瑪公司)(RNA酶A)溶液。

2.將該溶液在兩只管中平分，并且一個等分試樣用15mM高碘酸鹽處理。

3.兩只管在70℃下加熱15分鐘。

4.處理過的RNA酶A管在50mM ADA緩沖液(pH 6.5)中稀釋200-1000倍。

5.將稀釋的RNA酶A與HeLa核酸(DNA和RNA)一起在50℃下孵育20分鐘。

6.添加SDS至0.5％‘停止’該反應。

7.用1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析處理的HeLa RNA的完整性(圖14)。

結果與結論

圖12顯示了令人驚奇的結果：全長純化的RNA酶蛋白質的質量在與高碘酸鹽短暫孵育之后降低了；在凝膠中未觀察到降解產(chǎn)物(更小的蛋白質片段)。而且，仔細檢查圖13顯示在與高碘酸鹽孵育之后在恥垢分枝桿菌的無細胞的裂解液中某些(未知)蛋白質條帶的選擇性丟失。在增加的濃度的高碘酸鹽(7.5mM和15mM)的存在下，一些蛋白質條帶選擇性地降解或從凝膠完全消失，表明高碘酸鹽具有多個蛋白質靶標。

如在圖14中所示的數(shù)據(jù)所證明，如果RNA酶A與RNA接觸前與高碘酸鹽預孵育一小段時間，核糖體RNA不再被RNA酶A降解。需要添加較大量的RNA酶A(50ng)來檢測少量的未能被高碘酸鹽滅活的殘留活性的RNA酶。因此，除了其對總細胞蛋白的影響，高碘酸鹽可以靶向并抑制特定降解酶的酶促作用。

實例12：高碘酸鹽處理消除炭疽桿菌、肉毒桿菌和難辨梭菌孢子的生存能力

炭疽熱是一種急性的、通常致命的、由棒狀革蘭氏陽性好氧性細菌炭疽桿菌引起的疾病，該炭疽桿菌通常以內生孢子形式安置在土壤中。像肉毒梭菌和難辨梭菌，炭疽桿菌能形成休眠的內生孢子，其很難根除，在惡劣條件下生存幾十年甚至幾百年。當孢子被吸入、攝入、或接觸到宿主的皮膚損傷時，他們可能成為再活化的并迅速繁殖。炭疽孢子的頑強性以及它們在體外易于生產(chǎn)，使得它們非常適合于用作(以粉末和氣溶膠形式)生物武器。

盡管前面的實例證明了高碘酸鹽方法相比標準方法對于從孢子釋放核酸的有效性，重要的是也理解使用高碘酸鹽處理后任何活孢子是否殘留。

實驗方法

炭疽桿菌、肉毒梭菌、和難辨梭菌孢子的制備

肉毒梭菌B型和難辨梭菌的冷凍儲備培養(yǎng)物在具有5％綿羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上培養(yǎng)，并在35℃下厭氧孵育24至48小時。初始孵育后，將這些培養(yǎng)物轉移到多個(最少10個)腦心浸液瓊脂板(Brain Heart Infusion Agar plates)，并在35℃下厭氧孵育長達2周。

炭疽桿菌斯特恩(Sterne)菌株的冷凍儲備培養(yǎng)物在具有5％綿羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上培養(yǎng)，并在35℃、5％CO₂下孵育24小時。初始孵育后，將這些培養(yǎng)物轉移到多個(最少10個)桿菌孢子形成瓊脂板(Bacillus Sporulation Agar plates)，并在35℃、CO₂下厭氧孵育長達2周。

每3至4天進行孔雀綠孢子染色以監(jiān)測體外細菌的孢子形成。當制備的孔雀綠染色顯示生物體的形成孢子幾乎完成時，將孢子收獲至5.0mL的PBS(pH 7.4)中，并在室溫下保存直到使用。

孢子濃度的確定

將肉毒梭菌和難辨梭菌的每個孢子儲備懸浮液在PBS中稀釋至10^-2。將炭疽桿菌斯特恩(Sterne)菌株在PBS中稀釋至10^-3。將這些最終稀釋液中的每一個的等分試樣(10μL)裝入2室的血細胞計數(shù)器載玻片的每個清潔的孔中。在40x放大無油下觀察血細胞計數(shù)器室來進行孢子計數(shù)。在血細胞計數(shù)器的光場網(wǎng)格上孢子可視化為圓形或橢圓形的黑細胞。炭疽桿菌，檢測極限(LOD)＝53個孢子/反應；肉毒梭菌，LOD＝30個孢子/反應；難辨梭菌，LOD＝20個孢子/反應。

使用標準和高碘酸鹽方法處理孢子

1.為每種生物體以要求的濃度制備700μL的孢子儲備懸浮液。

2.將每個樣品分成2x 350μL體積。

3. 350μL用于WC BDL標準方法(“合作者”)：

a.取出50μL等分試樣以通過涂抹于具有5％綿羊血胰蛋白酶大豆瓊脂上確認孢子是有生活力的(參見下文)。

4. 350μL用于高碘酸鹽方法：

a.將350μL BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5添加至炭疽桿菌、肉毒梭菌、難辨梭菌的350μL孢子儲備懸浮液。

b.渦旋混合。

c.取出100μL用于培養(yǎng)(“高碘酸鹽前”)。

d.添加50μL的300mM(間)高碘酸鈉或NPI儲備(終濃度30mM)，渦旋混合。

e.在70℃水浴中孵育20分鐘。

f.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

g.取出100μL用于培養(yǎng)(“高碘酸鹽后”)。

培養(yǎng)孢子以確定生存能力

炭疽桿菌：將等分試樣直接涂抹于具有5％綿羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上，并在35℃、5％CO₂下孵育24小時。

肉毒梭菌和難辨梭菌：將等分試樣直接涂抹于具有5％綿羊血的胰蛋白酶大豆瓊脂上，并在35℃下厭氧孵育24至48小時。

結果與討論

這個實例證明本發(fā)明的“高碘酸鹽”方法是在降低來自炭疽桿菌(圖15)、肉毒梭菌(圖16)、和難辨梭菌(圖17)的頑強的孢子的生存能力方面非常有效。高碘酸鹽處理(高碘酸鹽后)顯著地降低了炭疽桿菌孢子的生存能力，但使用一次處理并沒有根除存在的所有孢子。相比之下，高碘酸鹽處理后通過培養(yǎng)沒有肉毒梭菌和難辨梭菌是有生活力的。有趣的是，單獨的BD2緩沖液(高碘酸鹽前)對肉毒梭菌和難辨梭菌(但不是炭疽桿菌)孢子生存能力具有顯著的影響，表明這些微生物比炭疽桿菌更容易溶解。

實例13：使用本發(fā)明來檢測在唾液和口腔清洗標本中的分枝桿菌

根據(jù)世界衛(wèi)生組織，在2012年，130萬人死于TB，860萬人患上了結核病，并且估計在全世界有53萬<15歲的兒童患上這種傳染病。TB是通過細小的呼吸飛沫從被感染的人傳播的空中疾病。患有TB的病人是最有可能傳播給與他們有密切和長時間接觸的人，如家庭成員、朋友和同事。

小兒TB的診斷受獲得兒童痰標本的困難和他們的往往需要侵入性操作(如胃抽吸或支氣管鏡檢)的疾病的少菌性質所阻礙。如果TB可以從唾液或口腔樣品進行診斷，收集可以很容易在野外或診所進行。然而，使用傳統(tǒng)的DNA提取方法，在TB感染的個體的唾液中豐富的MTB被認為太低的唾液而不被認為是用于活性肺TB的診斷的可靠樣本類型。

如今，診斷實驗室主要依靠痰標本來進行肺TB的診斷。然而，許多患者(包括嬰兒和兒童)都不能咳出痰液，使用于TB診斷性研究的替代的非侵入性樣品很有價值。幾個研究已經(jīng)評估了使用口腔清洗標本(戴維斯·JL(Davis Jl)等人，2009)和唾液樣本(亞森·G(Yassen G)等人，2012)用于活性TB的檢測。在不能產(chǎn)生痰的患者中，相比誘導痰，唾液樣品和/或口腔清洗標本可能更容易和更安全地獲得，誘導痰對于低氧性患者可能是不舒服的和危險的并且對于工作人員可能是費時和有害的。對于口腔清洗標本的收集，受試者被指示大力咳嗽5次，然后用10mL的無菌鹽水漱口60秒。相比咳出痰，使用口腔清洗標本和唾液樣本產(chǎn)生較少的感染性氣溶膠。

眾所周知，PCR診斷疾病的敏感性可以通過優(yōu)化DNA提取技術來改善。實例9(上文)表明，本發(fā)明的高碘酸鹽方法比使用珠粒打漿的治療標準方法從MTB釋放顯著更多的DNA。此外，實例10表明，基于高碘酸鹽方法比凱杰DNA提取方法釋放顯著更多的MTB DNA在唾液中。因此，可以預料，通過利用本發(fā)明來提取MTB DNA獲得的增加的檢測敏感性將第一次使廣泛采用唾液和/或口腔清洗標本在有癥狀的個體(特別是兒童)中作為肺TB的初步診斷標本成為可能。盡管在活躍感染個體的唾液中MTB的數(shù)量很低，預期通過基于高碘酸鹽方法獲得的檢測敏感性的提高將使得使用這種容易收集的樣品類型的MTB的更可靠的分子檢測成為可能。唾液和/或口腔清洗標本可以很容易地從有癥狀的個體中收集以快速篩選TB并在較早階段開始治療，這反過來將減少與這種感染性疾病相關的傳播和發(fā)病率。

同樣地，可以預期本發(fā)明的組合物也可以與支氣管肺泡灌洗樣品、尿液、糞便和胃抽出物一起用來從MTB提取DNA，導致在分子診斷測試中TB檢測的敏感性增加和鑒定的TB病例數(shù)增加。

實例14：使用高碘酸鹽從廣泛的微生物中釋放核酸

在這個實例中，用高碘酸鹽處理了一組不同的微生物，包括革蘭氏陽性細菌(蘇云金芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、恥垢分枝桿菌)、革蘭氏陰性細菌(卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、小腸結腸炎耶爾森菌、蜃樓弗朗西斯氏菌)和酵母(白色念珠菌)。使用2種不同的方法評估了核酸從這些微生物的釋放，即在酸提取HPLC方法和實時PCR(qPCR)。

實驗方法

使細菌和酵母在如下推薦的生長培養(yǎng)基中和推薦的溫度下生長：YEPD液體培養(yǎng)基(白色念珠菌)、具有0.1％半胱氨酸的胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基(蜃樓弗朗西斯氏菌)、腦心浸液液體培養(yǎng)基(小腸結腸炎耶爾森菌、卡他莫拉菌)或胰蛋白酶大豆液體培養(yǎng)基(蘇云金芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、恥垢分枝桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌)。小腸結腸炎耶爾森菌和白色念珠菌在30℃下生長，而其他微生物在35℃下生長。

過夜后，生長的細胞通過在7,500g離心8分鐘來收集；丟棄上清液。細菌沉淀用冷的磷酸鹽緩沖鹽水通過在7,500g離心6分鐘洗滌一次，并且丟棄上清液。洗滌的細菌沉淀重懸浮于1.5mL冷水中。

將180μL的細胞懸浮液與200μL的BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)混合，并且將20μL的300mM高碘酸鹽或無RNA酶/DNA酶的水(對照)加入到未接收高碘酸鹽的樣品。將樣品在35℃，70℃或80℃下孵育20分鐘。將樣品在14,000rpm離心5分鐘。將上清液轉移到新的管并且丟棄沉淀。

將所有樣品均通過添加16μL TK緩沖液(500mM Tris、1.5M醋酸鉀，pH 5.5)純化，首先在室溫下孵育5分鐘，然后在冰上孵育15分鐘，接著在14,000rpm離心5分鐘。每個樣品的一半體積用2X體積的冷的95％乙醇在-20℃下沉淀1小時；另一半通過添加鹽酸至0.2N的終濃度來進行酸水解，并在60℃下孵育60分鐘。向所有酸水解的樣品中添加NaOH至過量0.1N，接著在100℃下孵育10分鐘。為了中和樣品用于反相HPLC，將300μL的500mM ADA pH 6.5添加到樣品，并且樣品持續(xù)3分鐘在14,000rpm下離心5分鐘。上清液通過HPLC分析，而且丟棄任何不溶的物質。

將乙醇中的樣品在14,000rpm下離心3分鐘，除去上清液，并將沉淀溶解在50μL冷的無RNA酶/DNA酶水中。適用1μL純化的物質在重復的25μL PCR反應中作為模板。參見實例6使用通用細菌引物的實時PCR的條件。

通用的真菌引物是F:5’-gcatcgatgaagaacgcagc-3’和R:5’-tcctccgcttattgatatgc-3’。每個25μL PCR反應含有2.0mM MgCl₂、0.2mM dNTPs、1.0μM Syto 9、4.0pmole通用真菌引物F、4.0pmole通用真菌引物R、2.0μg牛血清白蛋白(BSA)、1U FastStart Taq DNA聚合酶(羅氏公司(Roche))和1×FastStart PCR預混液。通用真菌引物的循環(huán)條件如下：95℃持續(xù)2分鐘x 1，(95℃持續(xù)20秒，56.5℃持續(xù)30秒，72℃持續(xù)25秒)x 38。

結果與討論

顯然，在高碘酸鹽的存在下比沒有它從廣泛的微生物中釋放顯著更多的DNA，如通過實時PCR(表19-21)和酸提取HPLC方法(表22-30)所示。高碘酸鹽的這種效果似乎是溫度依賴的，最佳核酸釋放發(fā)生在70-80℃。高碘酸鹽從革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌、以及真菌中釋放核酸。有趣的是，高碘酸鹽從金黃色葡萄球菌釋放較少量的核酸，如通過HPLC方法(但不是實時PCR)檢測的。

表19：使用通用細菌引物的實時PCR的C_t值。

表20：使用通用細菌引物或通用真菌引物的實時PCR的C_t值。

表21：使用通用細菌引物的實時PCR的C_t值。

表22：如通過酸提取HPLC方法確定的從蜃樓弗朗西斯氏菌中釋放的DNA(％)

表23：如通過酸提取HPLC方法確定的從金黃色葡萄球菌中釋放的DNA(％)

表24：如通過酸提取HPLC方法確定的從恥垢分枝桿菌中釋放的DNA(％)

表25：如通過酸提取HPLC方法確定的從蘇云金芽孢桿菌中釋放的DNA(％)

表26：如通過酸提取HPLC方法確定的從小腸結腸炎耶爾森菌中釋放的DNA(％)

表27：如通過酸提取HPLC方法確定的從白色念珠菌中釋放的DNA(％)

表28：如通過酸提取HPLC方法確定的從卡他莫拉菌中釋放的DNA(％)

表29：如通過酸提取HPLC方法確定的從肺炎克雷佰菌中釋放的DNA(％)

表30：如通過酸提取HPLC方法確定的從銅綠假單胞菌中釋放的DNA(％)

實例15：使用高碘酸鹽用于從存在于不同生物樣品類型中的結核分枝桿菌釋放DNA

可能在各種天然的環(huán)境中找到微生物，宿主生物體和生物樣品。這個實例顯示，DNA提取的本發(fā)明的化學“高碘酸鹽方法”是適合于檢測頑強的生物體，例如，來自不同復雜程度的生物樣品的結核分枝桿菌。具體地，結核分枝桿菌DNA是從人類尿液和糞便樣品中回收。

實驗方法

摻入結核分枝桿菌的生物樣品的制備

為了模擬結核陽性樣品，將來自健康供體的1mL的尿液或糞便(從收集到2mL糞便勻漿緩沖液中的約400mg糞便的制備(美國系列號61/949,692))樣品摻入減毒結核分枝桿菌(aMTB)至大約3×10⁶cfu/mL的終濃度。

使用“高碘酸鹽方法”從結核分枝桿菌陽性尿液和糞便中提取DNA

1.將200μL的摻入aMTB的尿液或糞便和等體積的BD2緩沖液混合

2.添加40μL NPI(終濃度30mM)，渦旋混合，并在70℃下孵育20分鐘

3.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

4.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度

5.在室溫下孵育10分鐘

6.添加3M醋酸鉀(pH 5.5)至150mM的終濃度

7.在冰上孵育10分鐘

8.在15,000x g下離心5分鐘

9.將上清轉移到新的管，并丟棄沉淀

10.添加800μL室溫95％乙醇并反轉20次混合

11.在室溫下孵育樣品15分鐘以沉淀DNA

12.在15,000x g下離心2分鐘以沉淀DNA

13.小心取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀

14.添加100μL TE以再水化沉淀。

實時PCR

將從摻有aMTB的尿或糞便中分離的DNA用于在實例9和10中所描述的RD4Taqman實時PCR試驗。在試驗之前對糞便的DNA稀釋1:100，并且在每種情況下使用5μL。

結果與結論

在這個實例中，在100％測試的情況下使用“高碘酸鹽方法”提取的DNA被檢測為TB陽性(表31)，表明本發(fā)明在釋放從低復雜性(主要是水性的、均質的、pH值中性溶液)到更高復雜性(半固體、不均勻的、pH值可變的復合材料)范圍的樣品釋放功能性DNA是有效的。

表31：使用“高碘酸鹽方法”提取DNA后，檢測出TB陽性的尿液和糞便樣品的百分比。

實例16：使用高碘酸鹽用于傳染病樣品的生物安全性。

持續(xù)上升的全世界TB感染需要涉及檢測、治療和預防的健康的醫(yī)學響應。這種框架取決于積極參與具有高度傳染性樣品的處理的實驗室以及相關的科研人員的大型網(wǎng)絡。鑒于TB很容易傳播，需要復雜的、高級別生物安全柜(BSC)來處理。而且，這些工人處于感染的潛在較高風險中。具有迅速使這些樣本“生物安全”(即，不再有生活力)并且因此搬遷至更加基礎的實驗室用于下游分析的能力的組合物是在這一領域中明顯的優(yōu)勢。

在這個實例中，在用和不用高碘酸鹽的處理試驗方案之后獲得的細菌沉淀從生物安全性的視角來進行評估，以確保材料可以安全地從BSL-3(生物安全3級)搬遷至BSL-2實驗室的生物套房用于分析。

實驗方法

摻入結核分枝桿菌的生物樣品的制備

為了模擬結核病陽性痰，將具有如下大概儲備濃度的減毒結核分枝桿菌(aMTB)摻入來自健康捐贈者的唾液樣品。

1. 7.5x 10⁹cfu/mL(高負載)

2. 7.5x 10⁷cfu/mL(中負載)

根據(jù)以下組來制備摻入的唾液樣品，并且使用高負載儲備濃度或中負載儲備濃度來制備每個組：

A.1.0mL唾液+1.0mL BD2緩沖液+100μL aMTB儲備液：無NPI處理

B.2.0mL唾液+100μL aMTB儲備液：無NPI處理

C.2.0mL唾液+100μL aMTB儲備液：NPI處理

D.1.0mL唾液+1.0mL BD2緩沖液+100μL aMTB儲備液：NPI處理

在各組中aMTB的終濃度為約3.75×10⁸cfu/mL(高負載樣品)或約3.75×10⁶cfu/mL(中負載樣品)。每只管短暫地渦旋混合，并且將樣品處理如下：

用于組A和組B樣品的試驗方案

1.將每個樣品等分至3只新的1.5mL離心管，每管500μL

2.將管在3500x g下離心20分鐘

3.取出并丟棄懸浮液

4.將沉淀重懸浮于50μL的無菌PBS中

5.仔細地將PBS沉淀混合物應用到Lowenstein-Jansen培養(yǎng)基管(LJ斜面)的頂邊，并輕輕左右搖擺來分配樣品。

6.在35℃下孵育42天并對生長進行評分

用于組C和組D樣品的試驗方案

1.將每個樣品等分至3只新的1.5mL離心管，每管500μL

2.將管在3500x g下離心20分鐘

3.取出并丟棄懸浮液

4.將沉淀重懸浮于500μL的50％BD2緩沖液中

5.添加50μL NPI(終濃度30mM)，渦旋混合，并在70℃下孵育20分鐘

6.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

7.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度

8.將管在3500x g下離心20分鐘

9.取出并丟棄懸浮液

10.在500μL的無菌PBS中洗滌沉淀

11.將管在3500x g下離心20分鐘

12.取出并丟棄懸浮液

13.將沉淀重懸浮于50μL的無菌PBS中

14.仔細地將PBS沉淀混合物應用到Lowenstein-Jansen培養(yǎng)基管(LJ傾斜)的頂邊，并輕輕左右搖擺來分配樣品。

15.在35℃下孵育42天并對生長進行評分

結果與結論

表32：在NPI存在或不存在下在LJ斜面上的aMTB生長的總結

*缺乏初始裂解緩沖液(BD2)以消除背景菌群造成這些污染微生物的快速生長

表32說明了在NPI存在下TB生存能力的阻止。在不存在NPI的A和B組中，8-10天后TB菌落開始出現(xiàn)(A組)，并污染的背景菌群在一天內淹沒了LJ培養(yǎng)基(B組)。相反，在添加了NPI的C和D組中，甚至在孵育42天后(其是用于確定TB陰性狀態(tài)的目前的培養(yǎng)標準)，沒有觀察到任何微生物的生長。這表明TB生存能力的阻止需要NPI。即使用于去除背景菌群的初始裂解緩沖液不存在(BD2；C組)，這種效果也可見，表明單獨的NPI足以阻止TB生存能力。這對本領域的當前狀態(tài)是明顯的改善，因為它允許個別操作的TB陽性樣品迅速和有效地提供樣品生物安全性。從而降低對個體的風險，并且這些NPI處理的樣品可以從限制性BSL3環(huán)境遷至BSL2實驗室用于進一步分析，包括DNA提取和實時PCR(參見實例9)。

實例17：在NaOH-NALC痰樣品中直接測試ML的活性

NaOH/NALC被廣泛用于液化痰。這個實例證明高碘酸鹽仍然有效，即，從用NaOH/NALC處理的痰樣品中的MTB釋放核酸。

實驗方法

摻入結核分枝桿菌的痰樣品的制備

為了模擬結核病陽性痰，將痰樣品(購買自組織溶液有限公司(Tissue Solutions Ltd.)，格拉斯哥，蘇格蘭)摻入約9x106CFU/mL減毒結核分枝桿菌H37Ra(aMTB)，并且分成兩個部分。一個部分用等體積的NaOH/NALC在室溫下處理15分鐘，而第二部分與等體積BD2緩沖液(50mM甘氨酸、250mM LiCl、12.5mM Li-CDTA、2％SDS，pH 10.5)混合。將BD緩沖器處理的痰在5,000rpm下離心20分鐘，并且將沉淀再懸浮于1mL PBS中，向該PBS中添加1mL BD2緩沖液。

使用最佳的高碘酸鹽方法從在NaOH/NALC或BD緩沖液中的aMTB陽性痰提取DNA

1.將三個200μL等分試樣的NaOH/NALC處理的痰或BD2緩沖液處理的痰(上文)用NPI處理至30mM的終濃度，渦旋混合。

2.在70℃水浴中孵育20分鐘。

3.將等分試樣在室溫下冷卻2分鐘。

4.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度。

5.添加3M醋酸鉀(pH 5.5)至150mM的終濃度。

6.在冰上孵育10分鐘。

7.以13,200rpm離心5分鐘。

8.將上清轉移到干凈的管。丟棄沉淀。

9.添加400μL室溫的95％乙醇。反轉20次混合。

10.在室溫下孵育樣品15分鐘以沉淀DNA。

11.以15,000rpm離心2分鐘以沉淀DNA。

12.輕輕取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀。

13.將沉淀溶于200μL TE。短暫渦旋以充分重懸DNA。

使用縮短的高碘酸鹽方法從在NaOH/NALC中的aMTB陽性痰提取DNA

1.將三個200μL等分試樣的NaOH/NALC處理的痰(上文)用NPI處理至30mM的終濃度，渦旋混合。

2.在70℃水浴中孵育20分鐘。

3.將等分試樣在室溫下冷卻2分鐘。

4.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度。

5.在室溫下孵育10分鐘。

6.添加2體積的室溫的95％乙醇。反轉20次混合。

7.在室溫下孵育樣品15分鐘以沉淀DNA。

8.以15,000rpm離心2分鐘以沉淀DNA。

9.輕輕取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀。

10.將沉淀溶于200μL TE。短暫渦旋以充分重懸DNA。

rtPCR條件

在這個實例中，使從摻有aMTB的痰樣品(上文)中分離的DNA經(jīng)受特異于分枝桿菌的rtPCR試驗，RD4Taqman實時PCR測定(參見實例10)。

結果與結論

如上文概述的，用于NaOH/NALC處理的痰的提取試驗方案可以通過去除從BD2緩沖液處理的樣品沉淀SDS需要的醋酸鉀和離心步驟來縮短。本實例使用對結核分枝桿菌特異的實時PCR試驗來證明高碘酸鹽能夠在用NaOH/NALC處理后從痰中的aMTB釋放核酸(表33)。相比本發(fā)明的方法，BD2緩沖液處理接著用高碘酸鹽提取DNA，當在使用高碘酸鹽進行DNA提取之間用NaOH/NALC處理痰時Ct值僅高出2個循環(huán)。

表33：對從摻有aMTB的痰中釋放的DNA的定量

實例18：高碘酸鹽方法與治療標準相比用于結核分枝桿菌的分子檢測

CDC建議臨床標本同時通過培養(yǎng)、抗酸桿菌(AFB)染色、和核酸擴增試驗方案來進行分析(匿名，2009)。培養(yǎng)是TB陽性的最終確定的“黃金標準”，但它是緩慢的并可能需要長達8周。AFB染色是快速的，但具有低敏感性和低特異性，因為它不區(qū)分來自結核分枝桿菌復合體(MTBC)的成員與非結核分枝桿菌(NTM)。因此，對控制疾病的傳播至關重要的快速鑒定依賴于核酸擴增試驗方案，例如實時PCR(qPCR)和測序。

在結核分枝桿菌感染的患者中抗生素耐藥性的評估是對患者管理和控制疾病的傳播至關重要的。結核分枝桿菌的藥物敏感試驗(DST)的標準方法可能需要幾周到幾個月來提供結果。由于多重耐藥結核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結核病(XDR-TB)的出現(xiàn)，已經(jīng)發(fā)展出快速的分子辦法。rpoB基因內突變與利福平(RIF)耐藥性相關，而katG基因和inhA基因的突變與異煙肼耐藥性相關。哈爾斯(Halse)等人(2010)開發(fā)了兩步分子方法，該方法直接用對結核分枝桿菌復合體(MTBC)陽性的臨床標本通過實時PCR利用抗生素抗性基因焦磷酸測序分析。

在這個實例中，對通過兩種不同的方法處理的TB陽性痰樣品(由創(chuàng)新診斷基金會(FIND)結核標本庫惠贈)的臨床評估進行了并排比較。具體地，1)“治療標準”方法，包括氫氧化鈉處理，接著是珠粒打漿，和2)本發(fā)明在CLIA/CLEP批準的qPCR試驗(靶向RD4MTBC差異區(qū)域(RD))(哈爾斯(Halse)等人，2011)和抗生素抗性基因焦磷酸測序試驗(哈爾斯(Halse)等人，2010)的敏感性方面進行了比較。在本發(fā)明的方法中，在DNA的分離和試驗檢測之前，TB陽性痰樣品用BD2緩沖液和高碘酸鹽進行處理以促進標本中的細胞的化學細胞溶解。

與本發(fā)明相反，“治療標準”方法包括珠粒打漿、機械方法以破開痰樣品中的細菌。雖然機械珠粒打漿可以有效地破開生物體，但是它在實驗室的確產(chǎn)生危險的氣溶膠。因此，非常希望開發(fā)一種有效的、非機械的、化學的方法以安全地從結核分枝桿菌釋放DNA，而不會對診斷測試的臨床敏感性產(chǎn)生負面影響。

實驗方法

結核分枝桿菌陽性痰樣品

對于本實例，來自確認的TB陽性患者的未加工的痰樣品由創(chuàng)新診斷基金會(FIND)結核病標本庫惠贈。使用涂片和培養(yǎng)分析，F(xiàn)IND將這些樣品歸類為‘低’、‘中’和‘高’TB陽性標本。一式兩份的0.5mL的等分試樣從30位患者樣品提供并且冷凍儲存。將等分試樣冷凍運到沃茲沃斯中心分枝桿菌學實驗室(Wadsworth Center Mycobacteriology Laboratory)(紐約州衛(wèi)生部門，奧爾巴尼，紐約州，美國)以進行進一步的分析，該實驗室是CLIA/CLEP批準的臨床實驗室。

將來自30為供體的一式兩份的等分試樣在冰上解凍；在DNA的分離之前，一組等分試樣使用“治療標準”方法(合作者)來處理并且第二組用BD2緩沖液和高碘酸鹽來處理。

使用“治療標準”方法處理TB陽性痰

1.將0.5mL 3.5％NaOH添加到每個0.5mL痰等分試樣(n＝6)；渦旋混合。

2.在室溫下孵育15分鐘。

3.用無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)升至10mL。

4.以5,000rpm離心20分鐘以沉淀細菌。丟棄上層清液。

5.在0.5mL無菌PBS中重懸沉淀。

6.預留300μL的重懸浮的細菌用于培養(yǎng)以確認結核分枝桿菌的生存能力。

7.通過將200mg的105-150微米的玻璃珠添加至剩余的200μL的再懸浮細菌來裂解細菌。

8.珠粒打漿2個周期，每個周期1分鐘，隨后使用微型珠粒打漿機(BioSpec產(chǎn)品)在冰上進行1分鐘。

使用碘酸試驗方法處理TB-陽性痰

1.將0.5mL BD2緩沖液(2％SDS、12.5mM CDTA、250mM LiCl、50mM甘氨酸，pH 10.5)添加到每個0.5mL痰等分試樣(n＝6)；渦旋混合。

2.添加蛋白酶K(400μg)，并在50℃水浴中孵育2小時。

3.添加NPI至30mM的終濃度，渦旋混合。

4.在70℃水浴中孵育20分鐘。

5.在室溫下冷卻樣品2分鐘。

6.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度。

7.在室溫下孵育10分鐘。

8.添加3M醋酸鉀(pH 5.5)至150mM的終濃度。

9.在冰上孵育10分鐘。

10.以13,000rpm離心5分鐘。

11.將上清轉移到干凈的標記的管。丟棄沉淀。

12.添加2體積的室溫的95％乙醇；反轉20次以混合。

13.在室溫下孵育樣品15分鐘以沉淀DNA。

14.以15,000rpm離心2分鐘以沉淀DNA。

15.輕輕取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀。

16.將沉淀溶于200μL TE。

17.短暫地渦旋以充分重懸DNA并且在室溫下靜置至少30分鐘。

對結核分枝桿菌進行實時PCR和抗生素抗性焦磷酸測序

使用CLIA/CLEP批準的qPCR試驗，來自每個純化的痰樣品(上文)的5μL‘純的’DNA和5μL稀釋的(1:10)DNA的重復反應在ABI7500實時PCR儀上擴增，該qPCR試驗靶向RD4MTBC差異區(qū)域(RD)(哈爾斯(Halse)等人，2011)。小于37的閾值循環(huán)(C_t)值報道為陽性，并且值大于37的樣品被重測；如果結果是相同的，結果被報告為陽性，并且如果它們不同，它們被報告為不確定的。

對于利福平耐藥性用先前公布的焦磷酸測序法(rpoB)(哈爾斯(Halse)等人，2010)和對于異煙肼耐藥性用另外的靶標(inhA和katG)來進行抗生素耐藥性分析。從兩種方法獲得的DNA被用于單獨的PCR反應以擴增rpoB、inhA和katG基因的特異性區(qū)域。在這些區(qū)域中的突變表明對利福平和/或異煙肼抗生素的可能的耐藥性。

結果與討論

現(xiàn)在，治療標準方法涉及用氫氧化鈉(或NaOH/NALC)液化痰，接著是使用機械珠粒打漿從細菌分離DNA。本發(fā)明的方法與那樣一種簡單的化學處理不同，包括高碘酸鹽，有效地裂解細菌。重要的是，如果本發(fā)明的組合物和方法在引起對結核分枝桿菌特異的DNA和抗生素抗性標記的后續(xù)檢測方面不是更加有效，本發(fā)明的組合物和方法似乎也與治療標準方法一樣有效。

表34：在結核分枝桿菌中對三種抗生素抗性標記的焦磷酸測序結果。

相比傳統(tǒng)的方法(“合作者”，表34)，本發(fā)明的化學方法(“高碘酸鹽法”，表34)通過qPCR在由培養(yǎng)和涂片鏡檢歸類為‘低’和‘中’TB陽性的痰樣品中導致結核分枝桿菌特異性檢測的臨床敏感性增加。在這個實例中，直到使用“治療標準”方法提取的DNA被稀釋10倍才通過qPCR檢測到在‘中’和‘高’TB陽性痰樣品中的結核分枝桿菌(表34)。對于所有TB負載的水平，表1闡明了相比治療標準方法(合作者)，使用本發(fā)明的方法(高碘酸鹽法)處理的所有TB陽性痰樣品中結核分枝桿菌的顯著改善的檢測極限(通過qPCR的較低的C_t值)。這個較低的檢測極限，幫助確保對來自患者痰樣品的結核分枝桿菌的精確診斷。

類似地，本發(fā)明的組合物和方法是與工業(yè)標準測試兼容來預測在結核分枝桿菌陽性標本中的抗生素抗性。對于測試的6個臨床的TB陽性痰標本，用治療標準方法和高碘酸鹽方法獲得的焦磷酸測序法結果是100％一致的。重要的是，從這6個患者痰樣品中，本發(fā)明的高碘酸鹽方法，但不是治療標準方法，檢測到2名患者(FIND 01 012072和FIND 01 01 2137)具有抗生素抗性標記(inhA和ropB基因)(表34)。甚至黃金標準培養(yǎng)測試在體外52天后沒能顯示這2個患者的樣品中的分枝桿菌的生長。

在測試時分枝桿菌DNA的回收率增加帶來的影響最好使用焦磷酸測序數(shù)據(jù)高亮顯示。用高碘酸鹽處理的樣品具有足夠數(shù)量可用的DNA以在測試的第0天對抗生素抗性標記進行測試。相比之下，治療標準方法在焦磷酸測序前需要平均14天用于MGIT培養(yǎng)來變成陽性，該方法可以在第0天被PCR測試為陰性樣品上重復?；颊叩目股靥卣髑€對病例管理至關重要，并且使用適當?shù)目股刂委煹妮^早期干預將減少傳播率和增加恢復的幾率。因此，本發(fā)明對通過實時PCR的MTBC的快速的當天的鑒定有價值，并且足夠靈敏以檢測用于結核分枝桿菌的抗生素抗性標記，無需等待通過培養(yǎng)來檢測分枝桿菌。

實例19：從痰拭子樣品中檢測MTB

對于結核病的最優(yōu)控制，早期診斷是至關重要的。若干研究人員已經(jīng)開發(fā)出實時PCR試驗，該實時PCR試驗提供對患者樣品中結核分枝桿菌復合體(MTBC)的各種靶序列和藥物抗性基因的快速檢測。這些試驗檢測臨床樣品中的MTBC的能力取決于所選的靶序列和DNA提取程序的效率。前面的實例已經(jīng)證明，本發(fā)明大幅改善了從微生物(如MTB)的核酸提取，增加了在人類痰中結核分枝桿菌檢測的敏感性。

代替處理全部痰標本，通過直接從處于未加工的或未處理的狀態(tài)(即，用氫氧化鈉和/或NALC凈化之前)的每個標本的一小部分提取核酸可以獲得進一步的效率。這個實例證明可商購的拭子可以用來成功地捕獲和轉移未處理的痰的小等分試樣(每個拭子大約100-200微升)。結合用本發(fā)明所獲得的提取效率，處理全部樣品的一小部分可以極大地改善標本在實驗室中的處理，以及診斷的時間。

材料與方法

將一個3mL冷凍的、未處理的痰樣品(組織溶液有限公司(Tissue Solutions Ltd.))解凍，并被摻入9x10⁷CFU/mL減毒的MTB H37Ra(aMTB)。一次一個地將8個FLOQ(科潘診斷公司(Copan Diagnostics Inc.)；目錄號502CS01)和8個Hydra Flock(清教徒醫(yī)療產(chǎn)品有限公司(Puritan Medical Products Co.,LLC)；目錄號25-3406-H)拭子浸入摻有aMTB的痰中，盤繞10秒，然后轉移到含有500μL的BD2緩沖液(50mM甘氨酸、250mM LiCl、12.5mM Li-CDTA、2％SDS，pH 10.5)的管中。在室溫下放置2小時后，將拭子取出，將管在3,500rpm下離心20分鐘，并將沉淀再懸浮于100μL PBS中。將每個拭子兩個重懸樣品涂抹到M7H10瓊脂平板上，并且在35℃下孵育21天以確認aMTB的生存能力；將每個拭子6個再懸浮樣品在用和不用高碘酸鹽提取核酸之前與100μL BD2緩沖液混合(參見下文)。

使用高碘酸鹽方法從aMTB陽性痰中提取DNA

1.將五個200μL的等分試樣(拭子1-5；上文)用NPI處理至30mM的終濃度，渦旋混合；一個200μL的等分試樣(拭子6)不用NPI處理。

2.在70℃水浴中孵育20分鐘。

3.將等分試樣在室溫下冷卻2分鐘。

4.添加1M Tris緩沖液(pH 7)至50mM的終濃度。

5.添加3M醋酸鉀(pH 5.5)至150mM的終濃度。

6.在冰上孵育10分鐘。

7.以13,200rpm離心5分鐘。

8.將上清轉移到干凈的管。丟棄沉淀。

9.添加400μL室溫的95％乙醇。反轉20次混合。

10.在室溫下孵育樣品15分鐘以沉淀DNA。

11.以15,000rpm離心2分鐘以沉淀DNA。

12.輕輕取出并丟棄上清液，小心不要打亂沉淀。

13.將沉淀溶于200μL TE。短暫渦旋以充分重懸DNA。

rtPCR條件

在這個實例中，使從摻有aMTB的痰樣品(上文)中分離的DNA經(jīng)受特異于分枝桿菌的rtPCR試驗，RD4Taqman實時PCR測定(參見實例10)。

結果與結論

用拭子收集的摻有aMTB的痰在培養(yǎng)基中是有生活力的。在培養(yǎng)基中21天后，從科潘(Copan)拭子分離出的aMTB產(chǎn)生了一菌苔的細菌，而從清教徒(Puritan)拭子回收的aMTB產(chǎn)生了大約200個菌落/平板。

使用MTB特異的rtPCR很容易地檢測從單個科潘或清教徒拭子收集的aMTB DNA的量(拭子6；參見表35)。當高碘酸鹽包含在DNA提取試驗方案中時(拭子1-5；表35)，C_t值下降超過3個周期，對于科潘拭子從27.75下降到24.02，對于清教徒拭子從27.62下降到23.69，相當于在每個拭子回收的aMTB特異DNA的量超過10倍的增加。此外，使用純的對比稀釋的DNA(1:10)的rtPCR證明了預期的3個循環(huán)的差異，表明提取的DNA包含很少或幾乎沒有PCR抑制劑。

因此，將拭子浸入未處理的痰標本可以提供足夠的樣本(100-200μL)來迅速診斷在中至高陽性標本終的結核分枝桿菌的存在。重要的是，在DNA提取試驗方案中包含高碘酸鹽增加了這項檢測的敏感性至少10倍，其對于低至中陽性標本具有重要的影響。

表35：使用拭子和高碘酸鹽從痰中分離的DNA的實時PCR分析。

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