本申請包含一個計算機可讀形式的序列表。該計算機可讀形式通過引用結(jié)合在此。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及來自明礬韓國生工菌的新金屬蛋白酶(E.C 3.4.24)及其在清潔過程(例如餐具洗滌和衣物洗滌)中的用途。本發(fā)明進一步涉及包括金屬蛋白酶的清潔和/或洗滌劑組合物。

發(fā)明背景

超過30年以來，洗滌劑工業(yè)已經(jīng)在洗滌劑配制品中應(yīng)用了不同酶，最常用的酶包括蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶，每種酶適于去除不同類型的污漬。除這些酶之外，洗滌劑組合物典型地包括成分的復(fù)雜組合。例如，多數(shù)清潔產(chǎn)品包括表面活性劑系統(tǒng)，漂白劑或助洗劑。

蛋白酶是所有種類的洗滌劑中的標準成分之一，這些洗滌劑范圍是從用于家用洗衣的那些到用于清潔接觸鏡片或義齒的試劑。在紡織品洗滌時，蛋白酶可以去除蛋白質(zhì)污漬，例如草、血液、雞蛋和人的汗液。這些有機污漬具有頑固地粘附在紡織品纖維上的趨勢。蛋白酶水解污漬中的蛋白質(zhì)并將它們分解成更可溶解的多肽或游離氨基酸。

堿性絲氨酸蛋白酶是最重要的一組蛋白酶，其已經(jīng)在洗滌劑工業(yè)中得到商業(yè)開發(fā)?？莶輻U菌蛋白酶是一個典型組的細菌絲氨酸蛋白酶，由于它們在高溫和堿性條件下的穩(wěn)定性和活性，它們廣泛用于洗滌劑中。廣泛用于洗滌劑工業(yè)中的商業(yè)上重要的枯草桿菌蛋白酶是

特性中的新興趣，例如新洗滌劑組合物的低溫性能和開發(fā)，導(dǎo)致對新蛋白酶和其他類型的洗滌劑酶的復(fù)蘇的興趣。對新蛋白酶的尋找不限于枯草桿菌蛋白酶，而且還針對尋找適合應(yīng)用于洗滌產(chǎn)品的新蛋白酶主鏈。

金屬蛋白酶是一組目前尚未商業(yè)地應(yīng)用于洗滌工業(yè)中的蛋白酶，這主要是由于金屬蛋白酶在洗滌劑組合物中連同在洗滌過程期間的條件下的低穩(wěn)定性。金屬蛋白酶是其活性絕對需要金屬離子的蛋白水解酶。多數(shù)金屬蛋白酶是鋅依存性的，盡管某些使用其它過渡金屬。金屬蛋白酶已經(jīng)被廣泛地用于不同工業(yè)中，像食品和釀造工業(yè)。一組金屬蛋白酶是已經(jīng)用于各種應(yīng)用中的M4家族金屬蛋白酶。例如，來自解淀粉芽孢桿菌的M4金屬蛋白酶，也稱為多年以來已經(jīng)被用作不同食品和飼料產(chǎn)品中的添加劑。金屬蛋白酶也已經(jīng)被描述用于洗滌劑和清潔組合物和清潔過程中，例如在WO 2007/044993中的描述。WO 2009/058518中描述了儲存穩(wěn)定的金屬蛋白酶變體在洗滌劑中的用途及其生產(chǎn)方法。EP 1 288 282描述了金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶的共混物，供在餐具洗滌中使用。WO 2000/60042亦描述了包含金屬蛋白酶的洗滌劑組合物。

然而，已知的金屬蛋白酶在常規(guī)洗滌條件下和在常規(guī)洗滌劑組合物中非常不穩(wěn)定。因此，金屬蛋白酶在洗滌劑中和在洗滌和清潔過程中的用途目前還沒有商業(yè)化。

因此，在洗滌條件下和/或在洗滌劑組合物中，仍對具有增加的穩(wěn)定性的金屬蛋白酶存在需要。本發(fā)明針對提供這樣的酶。

已經(jīng)在鏈霉菌屬中鑒定了編碼預(yù)測的金屬內(nèi)肽酶的核苷酸序列。編碼的蛋白質(zhì)UNIPROT:S2YJW6與本發(fā)明的金屬蛋白酶具有84％的一致性。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽，該分離的多肽選自下組，該組由以下各項組成：

a.一種多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％序列一致性、至少86％序列一致性、至少87％序列一致性、至少88％序列一致性、至少89％序列一致性、至少90％序列一致性、至少91％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性或至少99％序列一致性；

b.由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在中嚴格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或(ii)(i)的全長互補鏈雜交；

c.由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列具有至少85％序列一致性、至少86％序列一致性、至少87％序列一致性、至少88％序列一致性、至少89％序列一致性、至少90％序列一致性、至少91％序列一致性、至少92％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性或至少99％序列一致性；

d.變體，該變體包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的一個或多個(例如，若干個)氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及

e.具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段。

本發(fā)明的分離的多肽是一種屬于M4金屬蛋白酶組的金屬蛋白酶。優(yōu)選地，該分離的多肽來源于韓國生工屬。甚至更優(yōu)選地，該分離的多肽來源于明礬韓國生工菌。

本發(fā)明進一步涉及包括選自下組的具有蛋白酶活性的分離的多肽的組合物，該組由以下各項組成：

a.多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性、至少65％序列一致性、至少70％序列一致性、至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少86％序列一致性、至少87％序列一致性、至少88％序列一致性、至少89％序列一致性、至少90％序列一致性、至少91％序列一致性、至少92％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性或至少99％序列一致性；

b.由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在高嚴格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或(ii)(i)的全長互補鏈雜交；

c.由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60％序列一致性、至少65％序列一致性、至少70％序列一致性、至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少92％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性或至少99％序列一致性；

d.變體，該變體包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的一個或多個(例如，若干個)氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及

e.具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段。

本發(fā)明進一步涉及在具體的洗滌劑組合物中的此類組合物，并且涉及此類組合物在清潔過程，例如洗衣和堅硬表面清潔，像自動化餐具洗滌中的用途。

在一個具體實施例中，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸，包括此類多核苷酸的構(gòu)建體、表達載體和宿主細胞及其用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的用途。

序列表綜述

SEQ ID NO:1：來自明礬韓國生工菌的金屬蛋白酶的DNA序列。

SEQ ID NO:2：是如從SEQ ID NO:1推導(dǎo)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3：是克勞氏芽孢桿菌分泌信號。

SEQ ID NO:4：解淀粉芽孢桿菌金屬蛋白酶Uniprot:P06832

SEQ ID NO:5：克勞氏芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶Uniprot:P29600

發(fā)明詳述

定義

“具有蛋白酶活性的多肽”具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有時還被指定為肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是在其任一端開始水解肽的外切型蛋白酶或在多肽鏈內(nèi)部發(fā)揮作用的內(nèi)切型蛋白酶(內(nèi)肽酶)。內(nèi)肽酶對N-和C-末端被封閉的肽底物顯示出活性，這些底物與所討論的蛋白酶的特異性有關(guān)。

術(shù)語“蛋白酶”在此被定義為水解肽鍵的酶。本發(fā)明提供了具有蛋白酶活性的多肽在洗滌劑組合物中的用途。本發(fā)明還提供了編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明的蛋白酶是MEOPS家族M4的金屬蛋白酶。本發(fā)明的這些多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以及至少100％的蛋白酶活性。

可以使用任何測定來測量蛋白酶活性，其中采用一種底物，該底物包括與所討論的蛋白酶的特異性相關(guān)的肽鍵。pH測定和溫度測定同樣適用于所討論的蛋白酶。pH值測定的實例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。溫度測定的實例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、或95℃。普通蛋白酶底物的實例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血紅蛋白。在經(jīng)典的安森(Anson)和米爾斯基(Mirsky)方法中，將變性的血紅蛋白用作底物并且在用所討論的蛋白酶孵育測定后，確定三氯乙酸可溶的血紅蛋白的量用作蛋白酶活性的量度(安森(Anson)，M.L.和米爾斯基(Mirsky)，A.E.，1932，普通生理學(xué)雜志(J.Gen.Physiol.)16:59以及安森，M.L.，1938，普通生理學(xué)雜志22:79)。

出于本發(fā)明的目的，使用描述于“材料與方法”中的測定確定蛋白酶活性，如Protazyme OL測定。

如在此使用的術(shù)語“金屬蛋白酶”是指在結(jié)合/活性位點中具有一種或多種金屬離子的蛋白酶。

如在此使用的術(shù)語“M4金屬蛋白酶家族”或“M4金屬蛋白酶”或“M4”意指根據(jù)羅林斯(Rawlings)等人，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)，290，205-218(1993)并且如進一步描述于MEROPS-(羅林斯等人，MEROPS：肽酶數(shù)據(jù)庫(MEROPS:the peptidase database)，核酸研究(Nucl Acids Res)，第34期數(shù)據(jù)庫，D270-272，2006)中，落入M4金屬蛋白酶家族的多肽。M4金屬蛋白酶是主要包含內(nèi)肽酶的中性金屬蛋白酶。該家族中的所有肽酶都結(jié)合單個的催化鋅離子。M4金屬蛋白酶家族成員包括常見的HEXXH基序，其中組氨酸殘基充當鋅配體并且谷氨酸是活性位點殘基。M4金屬蛋白酶具有主要位于中性pH處的最優(yōu)pH。M4金屬蛋白酶家族包括例如(被分類為MEROPS亞類M04.014)、嗜熱菌蛋白酶、桿菌溶素(Bacillolysin)、弧菌溶血素、假溶素(pseudolysin)、Msp肽酶、球菌溶素(coccolysin)、短梗霉溶素(aureolysin)、比梅溶素(vimelysin)、λ毒素中性肽酶B、PA肽酶(氣單胞菌屬類型)、格里塞溶素(griselysin)、硬脂溶素(stearolysin)、MprIII(交替單胞菌屬菌株O-7)、pap6肽酶、中性肽酶(熱放線菌屬類型)、ZmpA肽酶(伯克霍爾德菌屬)、zpx肽酶、PrtS肽酶(發(fā)光桿菌)、多變?nèi)芩?protealysin)、ZmpB肽酶(伯克氏菌屬)。多肽的M4金屬蛋白酶家庭已經(jīng)被進一步表征并且根據(jù)MEROPS，目前包括至少二十二個已經(jīng)為其指定獨特MEROPS ID(即，具有式M04.xxx的標識符)的亞類以及非肽酶同系物和未指定的肽酶。

術(shù)語“分離的”意指在自然界中不存在的一種形式或環(huán)境中的一種物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實例包括(1)任何非天然發(fā)生的物質(zhì)，(2)包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子的任何物質(zhì)，該物質(zhì)至少部分地從與其本質(zhì)相關(guān)的一種或多種或所有天然存在的的成分中去除；(3)相對于天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)通過人工修飾的任何物質(zhì)；或(4)通過相對于與其天然相關(guān)聯(lián)的其他組分，增加該物質(zhì)的量而修飾的任何物質(zhì)(例如，編碼該物質(zhì)的基因的多個拷貝；比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)聯(lián)的啟動子更強的啟動子的使用)。分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。來自表達本發(fā)明的多肽的重組宿主細胞的發(fā)酵中的發(fā)酵液將包含分離形式的多肽。

術(shù)語“基本上純的多肽”在此指包含按重量計至多10％，優(yōu)選至多8％，更優(yōu)選至多6％，更優(yōu)選至多5％，更優(yōu)選至多4％，更優(yōu)選至多3％，甚至更優(yōu)選至多2％，最優(yōu)選至多1％，并且甚至最優(yōu)選至多0.5％的該多肽與其天然地或重組地相關(guān)的其他多肽材料的多肽制劑。因此，優(yōu)選的是該基本上純的多肽按存在于該制劑中的所有多肽材料的重量計是至少92％純的，優(yōu)選至少94％純的，更優(yōu)選至少95％純的，更優(yōu)選至少96％純的，更優(yōu)選至少97％純的，更優(yōu)選至少98％純的，甚至更優(yōu)選至少99％純的，最優(yōu)選至少99.5％純的，并且甚至最優(yōu)選100％純的。本發(fā)明的多肽優(yōu)選處于基本上純的形式。其可通過，例如，以公知的重組方法或以經(jīng)典的純化方法制備該變體或多肽而達成。

術(shù)語“成熟多肽”意指在翻譯和任何翻譯后修飾如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。在一個方面中，基于N-末端序列GTGNSMY的確定，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至489。另外，SEQ ID NO:2的氨基酸-191至-172是信號肽?；贜-末端和信號序列的確定，SEQ ID NO 2的氨基酸-171至-1為前肽。質(zhì)譜示出，該多肽的顯著部分是C-末端截短的并且由SEQ ID NO:2的氨基酸1至414組成。本領(lǐng)域中已知的是，一個宿主細胞可以產(chǎn)生由同一多核苷酸表達的兩種或更多種不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。在一個方面中，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至414。

術(shù)語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有蛋白酶活性的成熟多肽的一種多核苷酸。在一個方面中，基于N-末端序列的實驗確定，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO:1的核苷酸574至2040。SEQ ID NO:1的核苷酸1至60編碼信號肽。SEQ ID NO:1的核苷酸61至573編碼前肽。

術(shù)語“非常低嚴格條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

術(shù)語“低嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。對于至少100個核苷酸長度的探針，術(shù)語“中嚴格性條件”意指按照標準DNA印跡程序在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和變性的鮭精DNA和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

術(shù)語“中-高嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并變性的鮭魚精子DNA以及或者35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。

術(shù)語“低嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

術(shù)語“非常高嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。兩個氨基酸序列之間或者兩個核苷酸序列之間的關(guān)聯(lián)度通過參數(shù)“序列一致性”來描述。出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，賴斯(Rice)等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(Trends in Genetics)16:276-277；http://emboss.org)(優(yōu)選3.0.0版或更新版本)的尼德爾(Needle)程序中所實施的尼德爾曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德爾曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48:443-453)來確定兩個氨基酸序列之間的一致性程度。使用的可選參數(shù)為缺口罰分(gap penalty)10，缺口延伸罰分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62取代矩陣(BLOSUM62的EMBOSS版)。尼德爾標注的“最長的一致性”的輸出(使用-非簡化選項獲得)被用作百分比一致性，并且如下計算：

(相同殘基x 100)/(比對的長度-在比對中的空位總數(shù))

出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件，賴斯等人，2000，見上文；http://emboss.org)(優(yōu)選3.0.0版或更新版本)的尼德爾程序中所實施的尼德爾曼-翁施算法(尼德爾曼和翁施，1970，見上文)來確定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的一致性程度。所用的可選參數(shù)為缺口形成罰分10、缺口延伸罰分0.5、和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。尼德爾標注的“最長的一致性”的輸出(使用-非簡化選項獲得)被用作百分比一致性，并且如下計算：

(相同脫氧核糖核苷酸x 100)/(比對的長度-在比對中的空位總數(shù))

術(shù)語“片段”意指從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的多肽；其中該片段具有蛋白酶活性。

術(shù)語“多肽的功能片段”或“其功能片段”用來描述衍生自更長的多肽(例如，成熟多肽)的多肽，以及已經(jīng)在N-末端區(qū)或C-末端區(qū)或兩個區(qū)域中截短以產(chǎn)生親本多肽的片段的多肽。為了成為功能多肽，該片段必須保持全長/成熟多肽的至少20％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％，并且甚至最優(yōu)選至少100％的蛋白酶活性。M4金屬蛋白酶可以被截短，這樣使得某個結(jié)構(gòu)域被去除以產(chǎn)生一個功能片段，該功能片段可以是其中少于200個氨基酸已經(jīng)從成熟M4金屬蛋白酶中去除，優(yōu)選少于150個氨基酸，更優(yōu)選少于120、100、80、60、40、30個氨基酸，甚至更優(yōu)選少于20個氨基酸并且最優(yōu)選少于10個氨基酸，例如9、8、7、6、5、4、3、2或1個氨基酸已經(jīng)從成熟多肽中去除的多肽。

術(shù)語“亞序列”意指從成熟多肽編碼序列的5'和/或3'端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的多核苷酸；其中該子序列編碼具有蛋白酶活性的片段。

術(shù)語“等位基因變體”意指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或更多種可替代形式中的任一種。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在所編碼的多肽中沒有改變)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。

術(shù)語“變體”意指在一個或多個(若干個)位置包含改變(即，一個或多個(若干個)氨基酸殘基取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸置換占據(jù)一個位置的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)一個位置的氨基酸；并且插入意指鄰近占據(jù)某個位置的氨基酸添加1、2或甚至3個氨基酸。

術(shù)語“清潔組合物”和“清潔配制品”是指用于從有待清潔的物品上去除不希望的化合物的組合物，這些物品是例如織物、地毯、餐具(包括玻璃器皿)、接觸鏡、硬表面(例如瓷磚、鋅(zinc)、地板和桌面)、頭發(fā)(香波)、皮膚(肥皂和面霜)、牙齒(漱口劑、牙膏)等。這些術(shù)語涵蓋針對具體類型的所希望的清潔組合物和產(chǎn)品的形式(例如，液體、凝膠、顆粒、粉或噴霧組合物)所選的任何材料/化合物，只要該組合物與蛋白酶以及該組合物中使用的其他一種或多種酶可相容即可。清潔組合物材料的特定選擇可通過考慮待清潔的表面、物品或織物，以及組合物對于使用時的清潔條件合意的形式而容易地作出。這些術(shù)語進一步是指適于清潔、漂白、消毒、和/或滅菌任何物品和/或表面的任何組合物。旨在該術(shù)語包括但不限于洗滌劑組合物(例如液體和/或固體衣物洗滌劑和精紡織物(fine fabric)洗滌劑；硬表面清潔配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金屬臺面以及窗戶；地毯清潔劑；爐灶清潔劑；織物清新劑；織物柔軟劑；和紡織品和衣物預(yù)洗滌劑，連同餐具洗滌劑)。

除非另外指明，術(shù)語“洗滌劑組合物”包括顆粒狀或粉狀的全效或重垢洗滌劑，尤其是清潔洗滌劑；液體、凝膠或糊狀的全效洗滌劑，尤其是所謂的重垢液(HDL)類型；液體細薄織物洗滌劑；手工洗碗劑或輕負荷洗碗劑，尤其是高起泡類型的那些；機器洗碗劑，包括用于供家庭和公共機構(gòu)使用的不同的片劑、顆粒、液體和漂洗助劑類型；液體清潔劑和消毒劑，包括抗菌性手洗型、清潔棒、漱口液、義齒清潔劑、轎車或地毯香波、浴室清潔劑；洗發(fā)香波和洗發(fā)劑；沐浴凝膠、泡沫浴液；金屬清潔劑；以及清潔助劑如漂白添加劑和“去污棒(stain-stick)”、預(yù)處理型添加劑。

就預(yù)期用于弄臟的物體清潔的洗滌介質(zhì)中的混合物而言，使用術(shù)語“洗滌劑組合物”和“洗滌劑配制品”。在一些實施例中，就洗滌織物和/或衣服而言，使用該術(shù)語(例如，“衣物洗滌劑”)。在替代性實施例中，該術(shù)語是指例如用于清潔餐具、刀具等的那些的其他洗滌劑(例如“餐具清洗洗滌劑”)。它并不意圖使本發(fā)明限于任何特定的洗滌劑配制品或組合物。其意圖是，除了根據(jù)本發(fā)明的金屬蛋白酶以外，該術(shù)語涵蓋了包含以下各項的洗滌劑：例如表面活性劑、助洗劑、螯合劑(chelator)或螯合試劑(chelating agent)、漂白系統(tǒng)或漂白組分、聚合物、織物調(diào)理劑、增泡劑、抑泡劑、染料、香料、晦暗抑制劑、光學(xué)增亮劑、殺細菌劑、殺真菌劑、污物懸浮劑、防腐蝕劑、酶抑制劑或穩(wěn)定劑、酶激活劑、一種或多種轉(zhuǎn)移酶、水解酶、氧化還原酶、上藍劑和熒光染料、抗氧化劑、以及增溶劑。

術(shù)語“織物”涵蓋任何紡織材料。因此，其意圖是，該術(shù)語涵蓋衣服，連同織物、紗線、纖維、非織造材料、天然材料、合成材料以及任何其他紡織材料。

術(shù)語“紡織品”是指織造織物，連同適于轉(zhuǎn)化為或用作紗線、織造、針織以及非織造織物的短纖維和長絲。該術(shù)語涵蓋制自天然以及合成(例如，制造的)纖維的紗線。術(shù)語“紡織材料”是纖維、紗線中間體、紗線、織物以及制自纖維的產(chǎn)品(例如，衣服以及其他物品)的通用術(shù)語。

術(shù)語“非織物洗滌劑組合物”包括非紡織品表面洗滌劑組合物，包括但不限于餐具洗滌洗滌劑組合物、口服洗滌劑組合物、義齒洗滌劑組合物以及個人清潔組合物。

術(shù)語“酶的有效量”是指在特定應(yīng)用中，例如在定義的洗滌劑組合物中達到所需的酶活性所必需的酶量。此類有效量可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地確定并且基于多種因素，如使用的具體酶、清潔應(yīng)用、洗滌劑組合物的特定組成以及是否需要液體或干燥(例如，顆粒狀、棒狀)組合物等。術(shù)語金屬蛋白酶的“有效量”是指例如在定義的洗滌劑組合物中達到希望水平的酶活性的在上文描述的金屬蛋白酶量。

術(shù)語酶的“洗滌性能”是指酶對洗滌做出貢獻而提供優(yōu)于未向組合物中添加該酶的洗滌劑的另外的清潔性能。在相關(guān)洗滌條件下比較洗滌性能。通過酶在適當?shù)臏y試條件下去除某些代表性污漬的能力而方便地測量其洗滌性能。在這些測試系統(tǒng)中，可以按這樣一種方式控制其他相關(guān)因素，使得模擬某個細分市場中用于家庭應(yīng)用的典型條件，這些其他相關(guān)因素是例如洗滌劑組成、洗滌劑濃度、水硬度、洗滌力學(xué)、時間、pH和/或溫度。

如在此使用的術(shù)語“水硬度”或“硬度(degree of hardness)”或“dH”或“°dH”是指德國硬度(degree of hardness)。一度被定義為10毫克氧化鈣/升水。

在此使用術(shù)語“相關(guān)洗滌條件”指示在洗滌劑細分市場中實際用于家用的條件，具體是洗滌溫度、時間、洗滌力學(xué)、洗滌劑濃度、洗滌劑類型以及水硬度。

使用術(shù)語“改進的特性”指示與沒有酶情況下進行的相同過程相比，在特性方面獲得更好的最終結(jié)果。在本發(fā)明的過程中優(yōu)選被改進的示例性特性包括洗滌性能、酶穩(wěn)定性、酶活性以及底物特異性。

使用術(shù)語“改進的洗滌性能”指示與沒有酶相比或與參比酶相比，在相關(guān)洗滌條件下在從洗滌的物品(例如，織物或餐具和/或刀具)中去除污漬方面獲得更好的最終結(jié)果，或指示在重量基礎(chǔ)上，相對于沒有酶或相對于參比酶獲得相同的最終結(jié)果需要較少的酶。在此背景下，改進的洗滌性能還可以是例如在更短的洗滌時間內(nèi)獲得相同效果(例如去污效果)，例如該酶在測試條件下更加迅速地提供其效果。

在此將術(shù)語“酶洗滌力”或“洗滌力”或“洗滌效果”定義為針對一種洗滌劑，與不具有酶的同一洗滌劑相比，該酶可以增加的有利效果?？赡苡擅柑峁┑闹匾ノ垡嫣幨俏蹪n去除伴隨在洗滌和/或清潔之后無可見污物或污物非常少、阻止或減少在洗滌過程中釋放的污物再沉積(一種又稱作抗再沉積的作用)、完全或部分地恢復(fù)紡織品的白度(一種又稱作增白的作用)，其中所述紡織品最初是白色的，但是在反復(fù)使用和洗滌后獲得淡灰或淡黃色外觀。不直接與污物的催化污漬去除或其再沉積的預(yù)防相關(guān)的紡織品護理益處對于酶洗滌益處而言也是重要的。這類紡織品護理益處的實例是阻止或減少染料從一種織物轉(zhuǎn)移至另一種織物或相同織物的另一個部分(一種又稱作染料轉(zhuǎn)移抑制或抗回染的作用)、去除來自織物表面的突出或破損纖維以降低起球趨勢或去除已經(jīng)存在的毛球或絨毛(一種又稱作抗起球的作用)、改進織物柔軟度、織物的顏色澄清和去除在織物或服裝的纖維中夾帶的顆粒狀污物。酶漂白是一種另外的酶洗滌益處，其中通常將催化活性用于催化漂白組分(例如過氧化氫或其他過氧化物)的形成。

術(shù)語“抗再沉積”用于本文中描述減少或阻止溶解或懸于洗滌液劑中的污物再沉積于經(jīng)清潔的物體。在一個或多個洗滌循環(huán)后可以看到再沉積(例如，作為灰化、黃化或其他變色)。

術(shù)語“輔料”意指針對希望的具體類型的洗滌劑組合物和產(chǎn)品形式(例如，液體、顆粒、粉、棒狀、糊狀、噴霧、片劑、凝膠或泡沫組合物)選擇的任何液體、固體或氣體材料，這些材料也優(yōu)選地與用于該組合物中的金屬蛋白酶可相容。在一些實施例中，顆粒狀組合物處于“壓縮”形式，而在其他實施例中，液體組合物處于“濃縮”形式。

如在此使用的術(shù)語“去污酶(stain removing enzyme)”描述幫助從織物或硬表面去除污漬或污物的酶。去污酶對特定底物起作用，例如蛋白酶對蛋白質(zhì)起作用、淀粉酶對淀粉起作用、脂肪酶和角質(zhì)酶對脂質(zhì)(脂肪和油)起作用、果膠酶對果膠起作用并且半纖維素酶對半纖維素起作用。污漬通常是具有不同組分的復(fù)雜混合物的沉積物，這導(dǎo)致材料自身局部變色或這在物體上留下粘性表面，該粘性表面可以吸引溶解于洗滌液中的污物從而導(dǎo)致弄臟的區(qū)域變色。當酶對存在于污漬中的其特定底物起作用時，該酶降解或部分降解其底物，從而幫助在洗滌過程中去除與底物相關(guān)的污物和污漬組分。例如，當?shù)鞍酌笇Σ菸蹪n起作用時，它降解草中的蛋白組分并且允許在洗滌過程中釋放綠色/棕色。

在此背景下，術(shù)語“減少的量”意指在其他方面相同的條件下，該組分的量小于將用于參比過程中的量。在一個優(yōu)選實施例中，該量被減少例如至少5％，如至少10％、至少15％、至少20％或如另外在此所述的。

術(shù)語“低洗滌劑濃度”系統(tǒng)包括以下洗滌劑，其中在洗滌水中存在少于約800ppm的洗滌劑組分。亞洲(例如，日本)洗滌劑典型地被認為是低洗滌劑濃度系統(tǒng)。

術(shù)語“中洗滌劑濃度”系統(tǒng)包括以下洗滌劑，其中在洗滌水中存在約800ppm與約2000ppm之間的洗滌劑組分。北美洲洗滌劑通常被認為是中洗滌劑濃度系統(tǒng)。

術(shù)語“高洗滌劑濃度”系統(tǒng)包括以下洗滌劑，其中在洗滌水中存在大于約2000ppm的洗滌劑組分。歐洲洗滌劑通常被認為是高洗滌劑濃度系統(tǒng)。

具有蛋白酶活性的多肽

在一個實施例中，本發(fā)明涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽，該分離的多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽的序列一致性是至少85％序列一致性、至少86％序列一致性、至少87％序列一致性、至少88％序列一致性、至少89％序列一致性、至少90％序列一致性、至少91％序列一致性、至少92％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性、至少99％序列一致性或至少100％序列一致性。在一個方面中，這些多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不超過10個氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個。

在一個具體的實施例中，本發(fā)明涉及多肽，這些多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，并且其中該多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少70％的蛋白酶活性。

在一個具體的實施例中，本發(fā)明涉及多肽，這些多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，并且其中該多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少75％的蛋白酶活性。

在一個具體的實施例中，本發(fā)明涉及多肽，這些多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，并且其中該多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少80％的蛋白酶活性。

在一個具體的實施例中，本發(fā)明涉及多肽，這些多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，并且其中該多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少85％的蛋白酶活性。

在一個具體的實施例中，本發(fā)明涉及多肽，這些多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，并且其中該多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少90％的蛋白酶活性。

在一個具體的實施例中，本發(fā)明涉及多肽，這些多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，并且其中該多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少95％的蛋白酶活性。

在一個具體的實施例中，本發(fā)明涉及多肽，這些多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，并且其中該多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少100％的蛋白酶活性。

在一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽，這些分離的多肽選自下組，該組由以下各項組成：

(a)多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％的序列一致性、至少86％序列一致性、至少87％序列一致性、至少88％序列一致性、至少89％序列一致性、至少90％序列一致性、至少91％序列一致性、至少92％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性、至少99％序列一致性或至少100％序列一致性；

(b)一種由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在中嚴格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或(ii)(i)的全長互補鏈雜交；

(c)由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列具有至少85％序列一致性、至少86％序列一致性、至少87％序列一致性、至少88％序列一致性、至少89％序列一致性、至少90％序列一致性、至少91％序列一致性、至少92％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性、至少99％序列一致性或至少100％序列一致性；

(d)變體，該變體包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的一個或多個(例如，若干個)氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及

(e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段。

本發(fā)明涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽，該分離的多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％序列一致性、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％的序列一致性。在一個方面中，這些多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不超過十個氨基酸，例如相差五個氨基酸、相差四個氨基酸、相差三個氨基酸、相差兩個氨基酸以及相差一個氨基酸。

本發(fā)明的多肽優(yōu)選地包括或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因變體組成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一個方面中，該多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或其等位基因變體或由它們組成；或者是其具有蛋白酶活性的片段。在另一個優(yōu)選方面中，該多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至489或由其組成。在另一個優(yōu)選方面中，該多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至414或由其組成。

本發(fā)明還涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽，這些分離的多肽由以下多核苷酸編碼，這些多核苷酸在非常低嚴格條件、低嚴格條件、中嚴格條件、中-高嚴格條件、高嚴格條件或非常高嚴格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、(ii)編碼SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈雜交(J.薩姆布魯克(Sambrook)、E.F.弗里奇(Fritsch)和T.馬尼亞蒂斯(Maniatis)，1989，分子克隆實驗手冊(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，紐約)。

可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、連同SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段來設(shè)計核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法來鑒定并克隆對來自不同屬或種的菌株的具有蛋白酶活性的多肽進行編碼的DNA。具體地說，這類探針可以用于按照標準DNA印跡程序與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以便鑒定并分離其中的相應(yīng)基因。這類探針可以明顯短于完整序列，但是長度應(yīng)為至少14，例如至少25、至少35、或至少70個核苷酸。優(yōu)選地，核酸探針的長度為至少100個核苷酸，例如長度為至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸或至少900個核苷酸。DNA和RNA探針二者均可使用。典型地將探針進行標記(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以檢測相應(yīng)的基因。本發(fā)明涵蓋此類探針。

可以篩選從此類其他菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫的與上述探針雜交并編碼具有蛋白酶活性的多肽的DNA。來自此類其他菌株的基因組DNA或其他DNA可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其他分離技術(shù)來分離。來自文庫的DNA或分離的DNA可轉(zhuǎn)移到并固定在硝酸纖維素或其他適合的載體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO:1同源的克隆或DNA；或其亞序列；優(yōu)選將所述載體材料用在Southern印跡中。

出于本發(fā)明的目的，雜交指示在非常低至非常高嚴格條件下，多核苷酸與標記的核酸探針雜交，該標記的核酸探針對應(yīng)于SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列；包括SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；其全長互補鏈；或其子序列。在這些條件下，核酸探針雜交的分子可以使用例如X-射線膠片而進行檢測。

在一個方面中，核酸探針是SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列。在另一個方面中，核酸探針是SEQ ID NO:1的核苷酸574至2040。在另一個方面中，該核酸探針是編碼SEQ ID NO:2的多肽或其片段的多核苷酸。在另一個優(yōu)選方面中，核酸探針是SEQ ID NO:1。

對于長度為至少100個核苷酸的長探針而言，非常低至非常高嚴格條件定義為最佳地按照標準DNA印跡程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA中，以及對于非常低和低嚴謹度在25％甲酰胺中，對于中和中-高嚴謹度在35％甲酰胺中，或?qū)τ诟吆头浅８邍乐敹仍?0％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。將載體材料最終使用2X SSC、0.2％SDS在45℃下(非常低嚴格)、在50℃下(低嚴格)、在55℃下(中嚴格)、在60℃下(中-高嚴格)、在65℃下(高嚴格)以及在70℃下(非常高嚴格)洗滌三次，每次15分鐘。

對于長度為約15個核苷酸至約70個核苷酸的短探針而言，嚴格條件定義為最佳地遵循標準DNA印跡程序，在比使用根據(jù)博爾頓(Bolton)和麥卡錫(McCarthy)(1962，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:1390)的計算所計算的T_m低約5℃至約10℃下，在每ml 0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl(pH 7.6)、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈特氏溶液(Denhardt’s solution)、1mM焦磷酸鈉、1mM磷酸二氫鈉、0.1mM ATP、以及0.2mg的酵母RNA中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后，將載體材料在比所計算的T_m低5℃至10℃下，在6X SCC加0.1％SDS中洗滌一次(持續(xù)15分鐘)并且使用6X SSC洗滌兩次(每次15分鐘)。

本發(fā)明涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽,該多肽由多核苷酸編碼,該多核苷酸與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列具有至少85％序列一致性、至少86％序列一致性、至少87％序列一致性、至少88％序列一致性、至少89％序列一致性、至少90％序列一致性、至少91％序列一致性、至少92％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性、至少99％序列一致性或至少100％的序列一致性。

本發(fā)明進一步涉及編碼信號肽的分離的多核苷酸，該信號肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-191到-172或由其組成。

本發(fā)明進一步涉及一種多核苷酸，該多核苷酸包括編碼一種前肽的多核苷酸，該前肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-171至-1或由其組成。

本發(fā)明還涉及以下變體，這些變體包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或其同源序列的一個或多個(或若干個)氨基酸的取代、缺失、和/或插入。優(yōu)選地，該變體與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％的序列一致性、至少86％序列一致性、至少87％序列一致性、至少88％序列一致性、至少89％序列一致性、至少90％序列一致性、至少91％序列一致性、至少92％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性、至少99％序列一致性、但小于100％一致性。

上述序列的基本上同源的多肽被表征為在成熟多肽中具有一個或多個(若干個)氨基酸取代、缺失、和/或插入。優(yōu)選地，氨基酸變化是一種次要性質(zhì)的變化，即并不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地具有一至約九個氨基酸，如一、二、三、四、五、六、七、八、或九個氨基酸，優(yōu)選從一至約15個氨基酸，如10、11、12、13、14或15個氨基酸，并且最優(yōu)選從一至約30個氨基酸，如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個氨基酸的小缺失；小氨基-或羧基-末端延伸，如一種氨基-末端甲硫氨酸殘基；具有多達約五至十個殘基，優(yōu)選從10至15個殘基并且最優(yōu)選從20至25個殘基的一種小連接肽，或通過改變凈電荷促進純化或另一種功能的一種小延伸，如一種聚組氨酸標簽、一種抗原表位、蛋白A、一種碳水化合物結(jié)合模塊或另一種結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

保守取代的實例是在下組的范圍內(nèi)：堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸及組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸)。一般不會改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的并且例如由H.諾伊拉特(Neurath)和R.L.希爾(Hill)，1979，在蛋白質(zhì)(The Proteins)，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，紐約中描述。最常發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改變具有這樣一種性質(zhì)：改變多肽的物理化學(xué)特性。例如，氨基酸改變可以提高多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適pH，等。

親本多肽中的必需氨基酸可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的程序來鑒定，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(坎寧安(Cunningham)和韋爾斯(Wells)，1989，科學(xué)(Science)244:1081-1085)。在后一項技術(shù)中，在該分子中的每個殘基處引入單個丙氨酸突變，并且對所得變體分子的蛋白酶活性進行測試以鑒定對于該分子的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。還參見希爾頓(Hilton)等人，1996，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可結(jié)合假定接觸位點氨基酸的突變，如通過以下技術(shù)例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標記進行確定，對結(jié)構(gòu)進行物理學(xué)分析，從而確定酶的活性位點或其他生物學(xué)相互作用。參見，例如，德沃斯(de Vos)等人，1992，科學(xué)(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)224:899-904；烏樂達維爾(Wlodaver)等人，1992，歐洲生化學(xué)會聯(lián)合會快報(FEBS Lett.)309:59-64。還可以從與親本多肽相關(guān)的多肽的一致性分析推斷必需氨基酸的身份,例如像熟知的金屬蛋白酶嗜熱菌蛋白酶。因此可以通過與已知的M4金屬蛋白酶比對來確定催化殘基，其中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在所有此類蛋白酶中這些催化殘基都是保守的。所有M4金屬蛋白酶都結(jié)合單個的催化鋅離子。

所有M4金屬蛋白酶都結(jié)合單個的催化鋅離子。如同在許多其他金屬蛋白酶家族中，本發(fā)明的金屬蛋白酶包括HEXXH基序，其中HEXXH基序的H134和H138連同E158是鋅配體。HEXXH基序的殘基E135和H230是活性位點殘基(根據(jù)SEQ ID NO 2編號)。

使用已知的誘變、重組和/或改組方法、隨后進行一個相關(guān)的篩選程序可以做出單一或多種氨基酸取代、缺失和/或插入并對其進行測試，這些相關(guān)的篩選程序例如由Reidhaar-Olson(瑞德哈爾-奧爾森)和Sauer(薩奧爾)，1988，科學(xué)241:53-57；鮑伊(Bowie)和薩奧爾，1989，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。可使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化學(xué)(Biochemistry)30:10832-10837；美國專利號5,223,409；WO 92/06204)和區(qū)域定向誘變(德比郡(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；內(nèi)爾(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

可以結(jié)合誘變/改組方法與高通量自動化篩選方法來檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(內(nèi)斯(Ness)等人，1999，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)17:893-896)。編碼活性多肽的誘變的DNA分子可以回收自宿主細胞，并且使用本領(lǐng)域的標準方法對其進行迅速測序。這些方法允許迅速確定多肽中單個氨基酸殘基的重要性。

SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不超過10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9。

除了20個標準氨基酸，非標準氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基?？梢杂糜邢迶?shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸來取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成以后已被修飾，和/或在其一個或多個側(cè)鏈中具有與標準氨基酸不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括2-哌啶酸(pipecolic acid)、口塞口坐烷酸(thiazolidine carboxylic acid)、脫氫月甫氣史、3-和4-甲基脯氨酸，和3,3-二甲基脯氨酸。

該多肽可以是雜合多肽，其中一種多肽的一部分在另一種多肽的一部分的N-末端或C-末端處融合。

該多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽在本發(fā)明多肽的N-末端或C-末端處融合。通過將編碼另一種多肽的多核苷酸與本發(fā)明多核苷酸融合而產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列，這樣使得它們在框內(nèi)并且使得融合多肽的表達處于相同的一個或多個啟動子和終止子的控制下。融合蛋白還可以使用內(nèi)含肽技術(shù)構(gòu)建，其中融合在翻譯后產(chǎn)生(庫珀(Cooper)等人，1993，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會雜志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科學(xué)(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在兩種多肽之間進一步包括切割位點。在融合蛋白分泌之時，該位點被切割，從而釋放出這兩種多肽。切割位點的實例包括但不限于以下各項中披露的位點：馬丁(Martin)等人，2003，工業(yè)微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韋蒂納(Svetina)等人，2000，生物技術(shù)雜志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯馬森(Rasmussen)-威爾遜(Wilson)等人，1997，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；華德(Ward)等人，1995，生物技術(shù)(Biotechnology)13:498-503；以及孔特拉斯(Contreras)等人，1991，生物技術(shù)9:378-381；伊頓(Eaton)等人，1986，生物化學(xué)(Biochemistry)25:505-512；柯林斯(Collins)-萊斯(Racie)等人，1995，生物技術(shù)13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白：結(jié)構(gòu)、功能和遺傳學(xué)(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界藥物發(fā)現(xiàn)(Drug Discovery World)4:35-48。

M4金屬蛋白酶的來源

可用于本發(fā)明的M4金屬蛋白酶可獲得自任何屬的微生物。對本發(fā)明來說，這里所使用的與指定來源相關(guān)的術(shù)語“從...中獲得”意為由核苷酸序列編碼的多肽是由一種天然地具有所述核苷酸序列的來源產(chǎn)生的或者由一種來自于該來源的核苷酸序列已經(jīng)插入其中的菌株產(chǎn)生的。在一個優(yōu)選方面中，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。

本發(fā)明的多肽可以是細菌多肽。例如，該多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽，如具有金屬蛋白酶活性的金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、腸球菌屬(Enterococcus)、土芽孢桿菌屬(Geobacillus)、韓國生工菌(Kribbella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)或鏈霉菌屬(Streptomyces)多肽；或革蘭氏陰性細菌多肽，如彎曲桿菌屬(Campylobacter)、大腸桿菌(E.coli)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)和脲原體屬(Ureaplasma)多肽。

在一個方面中，該多肽是來源于韓國生工屬，優(yōu)選地來源于明礬韓國生工菌的多肽，例如SEQ ID NO 2中的多肽。

這些物種的菌株可以容易地在許多培養(yǎng)物保藏中心為公眾所獲得，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、荷蘭菌種保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心北方地區(qū)研究中心(NRRL)。

此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多膚。用于從自然生境分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。然后可通過類似地篩選這樣一種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得多核苷酸。一旦用這種或這些探針檢測到編碼一種多肽的多核苷酸序列，就可以通過使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)分離或克隆該多核苷酸(參見例如，薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989，見上文)。

本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。融合多肽可通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)產(chǎn)生。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列，這樣使得它們在框內(nèi)并且使得融合多肽的表達處于相同的一個或多個啟動子和終止子的控制下。

多核苷酸

本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的多核苷酸，如在此所述。

用于分離或克隆多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的并且包括從基因組DNA或cDNA，或其組合進行分離?？梢岳缤ㄟ^使用熟知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段，實現(xiàn)從基因組DNA克隆多核苷酸。參見例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和應(yīng)用指南(PCR:A Guide to Methods and Application)，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，紐約。可以使用其他核酸擴增程序例如連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于多核苷酸的擴增(NASBA)。這些多核苷酸可以克隆自韓國生工屬的菌株，像明克隆自礬韓國生工菌的菌株或相關(guān)有機體，并且因此，例如可以是該多核苷酸多肽編碼區(qū)的等位基因變體或物種變體。

修飾編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸對于合成與所述多肽基本上類似的多肽可為必需的。術(shù)語“基本上類似”于該多肽是指該多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以某種工程化方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如在比活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等方面不同的變體。這些變體可以基于以SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列(例如其子序列)形式呈現(xiàn)的多核苷酸，和/或通過引入不會改變該多肽的氨基酸序列，但對應(yīng)于預(yù)定用于產(chǎn)生該酶的宿主有機體的密碼子使用的核苷酸取代，或通過引入可能產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代來構(gòu)建。對于核苷酸取代的一般描述，參見例如福德(Ford)等人，1991，蛋白質(zhì)表達與純化(Protein Expression and Purification)2:95-107。

核酸構(gòu)建體

本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，這些核酸構(gòu)建體包含可操作地連接至一個或多個控制序列的本發(fā)明的多核苷酸，在與控制序列相容的條件下，這些控制序列指導(dǎo)編碼序列在適合的宿主細胞中表達。

可以按多種方式操縱多核苷酸，以提供多肽的表達。取決于表達載體，在其插入載體以前操縱多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。

該控制序列可以是啟動子，即，被宿主細胞識別以對編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸進行表達的多核苷酸。該啟動子包含轉(zhuǎn)錄控制序列，這些序列介導(dǎo)該多肽的表達。該啟動子可以是在宿主細胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括變體、截短型及雜合型啟動子，并且可以由編碼與該宿主細胞同源或異源的細胞外或細胞內(nèi)多肽的基因獲得。

用于在細菌宿主細胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的適合啟動子的實例是從以下基因中獲得的啟動子：解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、蘇云金桿菌cryIIIA基因(阿蓋塞(Agaisse)和勒爾克呂(Lereclus)，1994，分子微生物學(xué)(Molecular Microbiology)13:97-107)、大腸桿菌lac操縱子、大腸桿菌trc啟動子(埃貢(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天藍鏈霉菌瓊脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-內(nèi)酰胺酶基因(維拉-卡馬洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac啟動子(德波爾(DeBoer)等人，1983，美國國家科學(xué)院院刊80:21-25)。其他啟動子描述在吉爾伯特(Gilbert)等人，1980，科學(xué)美國人(Scientific American)242:74-94的“來自重組細菌的有用蛋白質(zhì)(Useful proteins from recombinant bacteria)”；以及在薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989，同上。串聯(lián)啟動子的實例披露在WO 99/43835中。

用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄的適合啟動子的實例是從以下各項的基因獲得的啟動子：構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO 96/00787)、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、鑲片鐮孢Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、鑲片鐮孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(一種修飾的啟動子，其來自曲霉屬中性α-淀粉酶基因，其中未翻譯的前導(dǎo)子由曲霉屬丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的未翻譯的前導(dǎo)子替代；非限制性實例包括來自編碼中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修飾的啟動子，其中已經(jīng)用來自編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的構(gòu)巢曲霉或米曲霉基因的未翻譯的前導(dǎo)子替換未翻譯的前導(dǎo)子)；及其變體、截短型及雜合型啟動子。

在酵母宿主中，有用的啟動子從以下各項的基因獲得：釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)、以及釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。羅馬諾斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主細胞的其他有用的啟動子。

控制序列還可以是由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止子。該終止子可操作地連接到編碼該多肽的多核苷酸的3'-末端。在該宿主細胞中起作用的任何終止子都可以用于本發(fā)明中。

用于細菌宿主細胞的優(yōu)選終止子是從克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(amyL)以及大腸桿菌核糖體RNA(rrnB)的基因獲得。

絲狀真菌宿主細胞的優(yōu)選終止子是從以下各項的基因中獲得的：構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。

用于酵母宿主細胞的優(yōu)選終止子從以下各項的基因獲得：釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)、以及釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。用于酵母宿主細胞的其他有用的終止子由羅馬諾斯(Romanos)等人，1992，見上文描述。

該控制序列還可以是在啟動子下游并且在基因編碼序列上游的mRNA穩(wěn)定子區(qū)，它增加該基因的表達。

適合的mRNA穩(wěn)定子區(qū)的實例是從以下獲得的：蘇云金桿菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢桿菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，細菌學(xué)雜志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。

該控制序列還可以是前導(dǎo)子，一種對宿主細胞翻譯很重要的非翻譯mRNA區(qū)域。該前導(dǎo)子可操作地連接到編碼該多肽的多核苷酸的5'-末端?？梢允褂迷谒拗骷毎衅鹱饔玫娜魏吻皩?dǎo)子。

用于絲狀真菌宿主細胞的優(yōu)選前導(dǎo)子是從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因獲得。

適用于酵母宿主細胞的前導(dǎo)子從以下各項的基因獲得：釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子、以及釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。

控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，一種可操作地連接至該多核苷酸的3’-末端并且當轉(zhuǎn)錄時由宿主細胞識別為將聚腺苷酸殘基添加至所轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號的序列?？梢允褂迷谒拗骷毎衅鹱饔玫娜魏尉巯佘账峄蛄?。

用于絲狀真菌宿主細胞的優(yōu)選聚腺苷酸化序列是從以下各項的基因中獲得的：構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。

對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和謝爾曼(Sherman)，1995，分子細胞生物學(xué)(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。

控制序列也可以是編碼與多肽的N-末端連接并指導(dǎo)多肽進入細胞的分泌通路的信號肽的信號肽編碼區(qū)。多核苷酸的編碼序列的5’-端可以固有地包含在翻譯閱讀框中與編碼多肽的編碼序列的區(qū)段天然地連接的信號肽編碼序列。可替代地，編碼序列的5’-端可以包含對于該編碼序列而言是外源的信號肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信號肽編碼序列的情況下，可能需要外源信號肽編碼序列?？商娲兀庠葱盘栯木幋a序列可簡單地替換天然的信號肽編碼序列以便增強該多肽的分泌。然而，可以使用指導(dǎo)所表達多肽進入宿主細胞的分泌通路的任何信號肽編碼序列。

用于細菌宿主細胞的有效信號肽編碼序列是從以下各項的基因獲得的信號肽編碼序列：芽孢桿菌屬NCIB 11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢桿菌prsA。西蒙納(Simonen)和帕爾瓦(Palva)，1993，微生物學(xué)評論(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信號肽。

用于絲狀真菌宿主細胞的有效信號肽編碼序列是獲得自以下各項的基因的信號肽編碼序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、柔毛腐質(zhì)霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。

對于酵母宿主細胞有用的信號肽獲得自以下項的基因：釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶。羅馬諾斯(Romanos)等人，1992，見上文，描述了其他有用的信號肽編碼序列。

該控制序列還可以是編碼位于多肽的N-末端處的前肽的前肽編碼序列。生成的多肽被稱為前體酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情況下被稱為酶原(zymogen))。多肽原通常是無活性的并且可以通過催化切割或自身催化切割來自多肽原的前肽而轉(zhuǎn)化為活性多肽。前肽編碼序列可以從以下各項的基因獲得：枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及釀酒酵母α-因子。

在信號肽序列和前肽序列二者都存在的情況下，該前肽序列定位成緊鄰多肽的N-末端并且該信號肽序列定位成緊鄰該前肽序列的N-末端。

還可能希望地是添加調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序列相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激而引起基因的表達開啟或關(guān)閉的那些，包括調(diào)節(jié)化合物的存在。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac、以及trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、米曲霉TAKAα-淀粉酶啟動子、以及米曲霉葡糖淀粉酶啟動子。調(diào)節(jié)序列的其他例子是允許基因擴增的那些。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)控序列包括在甲氨蝶呤存在下被擴增的二氫葉酸還原酶基因以及用重金屬擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼該多肽的多核苷酸將與調(diào)控序列可操作地連接。

表達載體

本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達載體。不同的核苷酸和控制序列可以連接在一起以產(chǎn)生重組表達載體，該重組表達載體可以包括一個或多個便利的限制酶切位點以允許在這些位點處插入或取代編碼該多肽的多核苷酸?？商娲?，該多核苷酸可以通過將該多核苷酸或包括該多核苷酸的核酸構(gòu)建體插入用于表達的適當載體中來表達。在產(chǎn)生該表達載體時，該編碼序列位于該載體中，這樣使得該編碼序列與該供表達的適當控制序列可操作地連接。

重組表達載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進行重組DNA程序，并且能夠引起多核苷酸的表達。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載體的宿主細胞的相容性。該載體可以是線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。

該載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體或人工染色體。該載體可以包含任何用以保證自我復(fù)制的要素?？商娲兀撦d體可以是這樣一種載體，當它被引入該宿主細胞中時，被整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個或多個染色體一起復(fù)制。此外，可以使用單一載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多個載體或質(zhì)粒(這些載體或質(zhì)粒共同包含待引入宿主細胞的基因組中的總DNA)或轉(zhuǎn)座子。

該載體優(yōu)選包含允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細胞、轉(zhuǎn)染細胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞等細胞的一個或多個選擇性標記。選擇性標記是這樣一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒抗性、重金屬抗性、營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。

細菌性選擇性標記的實例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因，或賦予抗生素抗性(如氨比西林、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素或四環(huán)素抗性)的標記。用于酵母宿主細胞的適合的標記包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在絲狀真菌宿主細胞中使用的選擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶)、以及trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，連同其等效物。優(yōu)選在曲霉屬細胞中使用的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌bar基因。

載體優(yōu)選包含允許載體整合到宿主細胞的基因組中或載體在細胞中獨立于基因組自主復(fù)制的一個或多個元件。

對于整合到該宿主細胞基因組中，該載體可以依靠編碼該多肽的多核苷酸序列或者用于通過同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件?？商娲?，該載體可以包含用于指導(dǎo)通過同源重組而整合到宿主細胞基因組中的一個或多個染色體中的一個或多個精確位置處的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置整合的可能性，這些整合元件應(yīng)包含足夠數(shù)量的核酸，例如100至10,000個堿基對、400至10,000個堿基對、以及800至10,000個堿基對，這些堿基對與對應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細胞的基因組內(nèi)的靶序列同源的任何序列。此外，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，該載體可以通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。

對于自主復(fù)制，該載體可以進一步包括使該載體能夠在所討論的宿主細胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點。復(fù)制起點可以是在細胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語“復(fù)制起點(origin of replication)”或“質(zhì)粒復(fù)制子(plasmid replicator)”意指使得質(zhì)?；蜉d體可在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。

細菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的復(fù)制起點，以及允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的復(fù)制起點。

用于在酵母宿主細胞中使用的復(fù)制起點的實例是2微米復(fù)制起點ARS1、ARS4、ARS1與CEN3的組合以及ARS4與CEN6的組合。

在絲狀真菌細胞內(nèi)有用的復(fù)制起點的實例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡倫(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分離和包括該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建可以根據(jù)披露于WO 00/24883中的方法完成。

可以將本發(fā)明的多核苷酸的多于一個拷貝插入宿主細胞中以增加多肽的產(chǎn)生。通過將序列的至少一個另外的拷貝整合到宿主細胞基因組中或者通過包含與該多核苷酸一起的可擴增的選擇性標記基因可以獲得多核苷酸的增加的拷貝數(shù)目，其中通過在適當?shù)倪x擇性試劑的存在下培養(yǎng)細胞可以選擇包含選擇性標記基因的經(jīng)擴增的拷貝的細胞、以及由此該多核苷酸的另外的拷貝。

用于連接以上所描述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達載體的程序是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的(參見，例如，薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989，同上)。

宿主細胞

本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，這些宿主細胞包含可操作地連接到一個或多個控制序列的本發(fā)明的多核苷酸，這些控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的產(chǎn)生。將包括多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入宿主細胞中，這樣使得該構(gòu)建體或載體被維持作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如早前所述。術(shù)語“宿主細胞”涵蓋由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。宿主細胞的選擇在很大程度上取決于編碼該多肽的基因及其來源。

該宿主細胞可以是有用于重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的任何細胞，例如原核細胞或真核細胞。

原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、以及鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限于：彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、以及脲原體屬。

細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞，包括但不限于：嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅硬芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及蘇云金桿菌細胞。

細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞，包括但不限于：似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌以及馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。

細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞，包括但不限于：不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍鏈霉菌、灰色鏈霉菌、以及淺青紫鏈霉菌細胞。

將DNA引入芽孢桿菌屬細胞中可通過以下來實現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如，張(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遺傳學(xué)與基因組學(xué)(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化(參見例如，楊格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，細菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大衛(wèi)杜夫-阿貝爾森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、電穿孔(參見例如，茂川(Shigekawa)和道爾(Dower)，1988，生物技術(shù)(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(參見例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，細菌學(xué)雜志169:5271-5278)。將DNA引入大腸桿菌細胞中可通過以下來實現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如，哈納汗(Hanahan)，1983，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或電穿孔(參見例如，道爾(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。將DNA引入鏈霉菌屬細胞中可通過以下來實現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔(參見例如，貢(Gong)等人，2004，葉線形微生物學(xué)(Folia Microbiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(參見例如，馬佐迪耶(Mazodier)等人，1989，細菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見例如，伯克(Burke)等人，2001，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。將DNA引入假單孢菌屬細胞中可通過以下來實現(xiàn)：電穿孔(參見例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物學(xué)方法雜志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(參見例如，皮內(nèi)多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。將DNA引入鏈球菌屬細胞中可通過以下來實現(xiàn)：天然感受態(tài)(參見，例如，佩里(Perry)和藏滿(Kuramitsu)，1981，感染與免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，凱特(Catt)和喬力克(Jollick)，1991，微生物學(xué)(Microbios)68:189-207)、電穿孔(參見，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(參見，例如，克萊威爾(Clewell)，1981，微生物學(xué)評論(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的用于將DNA引入宿主細胞中的任何方法。

宿主細胞還可以是真核細胞，如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細胞。

宿主細胞可以是真菌細胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、以及接合菌門(Zygomycota)、連同卵菌門(Oomycota)和全部有絲分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌詞典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，國際應(yīng)用生物科學(xué)中心(CAB International)，大學(xué)出版社(University Press)，英國劍橋(Cambridge，UK)中進行定義的)。

該真菌宿主細胞可以是酵母細胞。如在此使用的“酵母”包括產(chǎn)子嚢酵母(內(nèi)孢霉目)、產(chǎn)擔子酵母和屬于半知菌類(芽孢綱)的酵母。由于酵母的分類在將來可能有變化，出于本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)如酵母生物學(xué)和活動性(Biology and Activities of Yeast)(斯金納(Skinner)、帕斯莫爾(Passmore)、以及達文波特(Davenport)編輯，應(yīng)用細菌學(xué)學(xué)會討論會(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地進行定義。

酵母宿主細胞可以是假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克魯弗酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、或耶氏酵母屬細胞，如乳酸克魯弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)細胞。

真菌宿主細胞可以是絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，見上文所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、以及其他復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲體壁。營養(yǎng)生長是通過菌絲延伸，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母(如釀酒酵母)的營養(yǎng)生長是通過單細胞菌體的出芽(budding)，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。

絲狀真菌宿主細胞可以是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、線黑粉菌科(Filibasidium)、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬、毀絲霉屬、新美鞭菌屬、鏈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細胞。

例如，絲狀真菌宿主細胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(Bjerkandera adusta)、干擬蠟菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡內(nèi)基擬蠟菌(Ceriporiopsis caregiea)、淺黃擬蠟孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘諾希塔擬蠟菌(Ceriporiopsis pannocinta)、環(huán)帶擬蠟菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微紅擬蠟菌(Ceriporiopsis subrufa)、蟲擬蠟菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狹邊金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角質(zhì)金孢子菌、盧克諾文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、糞狀金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士蘭金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)、毛革蓋菌(Coriolus hirsutus)、桿孢狀鐮孢、谷類鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脈菌(Phlebia radiata)、刺芹側(cè)耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢殼霉、長域毛栓菌(Trametes villosa)、變色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉細胞。

可以通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、以及以本身已知的方式進行細胞壁再生的過程來轉(zhuǎn)化真菌細胞。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的適合程序描述在EP 238023；約爾頓(Yelton)等人，1984，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474；和克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物技術(shù)(Bio/Technology)6:1419-1422中。用于轉(zhuǎn)化鐮刀菌屬物種的適合方法由馬拉迪爾(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述?？梢允褂糜扇缫韵挛墨I描述的程序轉(zhuǎn)化酵母：貝克爾(Becker)和瓜倫特(Guarente)，在阿貝爾森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.編，酵母遺傳學(xué)與分子生物學(xué)指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)，酶學(xué)方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187頁，學(xué)術(shù)出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，紐約；伊藤(Ito)等人，1983，細菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)153:163；以及Hinnen等人，1978，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。

該宿主細胞可以是一種包括本發(fā)明的多核苷酸的植物細胞，以便以可回收的量表達和產(chǎn)生多肽或結(jié)構(gòu)域?？蓮闹参锘蛑参锊糠只厥斩嚯幕蚪Y(jié)構(gòu)域。作為替代方案，包括該多肽或結(jié)構(gòu)域的植物或植物部分可以按原樣用于改進食品或飼料的質(zhì)量，例如改進營養(yǎng)價值、可口性及流變學(xué)特性，或破壞抗營養(yǎng)因素。

轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例是草，如草甸草(藍草，早熟禾屬)；飼草，如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；溫帶草，如翦股穎屬(Agrostis)；以及谷類，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。

雙子葉植物的實例是煙草、豆類(如羽扇豆(lupins)、馬鈴薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及緊密相關(guān)的模式生物擬南芥)。

植物部分的實例是莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子、以及塊莖、以及包括這些部分的獨立組織，例如，表皮、葉肉、薄壁組織(parenchyme)、維管組織、分生組織。特定植物細胞區(qū)室，如葉綠體、質(zhì)外體(apoplast)、線粒體、液泡、過氧化物酶體以及細胞質(zhì)也被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論是何種組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以有助于本發(fā)明的利用的特定組織和細胞也被認為是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和種皮。

同樣包括于本發(fā)明范圍內(nèi)的是此類植物、植物部分以及植物細胞的子代。

可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建表達該多肽或結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞。

生產(chǎn)方法

本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包含(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)細胞，該細胞以其野生型形式產(chǎn)生該多肽；并且(b)回收該多肽。在一個優(yōu)選方面中，該細胞是韓國生工屬細胞。在更優(yōu)選的方面中，該細胞為明礬韓國生工菌細胞。

本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，這些方法包括(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細胞；以及(b)回收該多肽。

一個實施例涉及生產(chǎn)多肽的方法，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％序列一致性、至少86％序列一致性、至少87％序列一致性、至少88％序列一致性、至少89％序列一致性、至少90％序列一致性、至少91％序列一致性、至少92％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性或至少99％序列一致性；包括(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細胞；以及(b)回收該多肽。

這些宿主細胞是在適合于使用本領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生該多肽的一種營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。例如，可以通過搖瓶培養(yǎng)，或者在一種適合的培養(yǎng)基中并在允許該多肽表達和/或分離的條件下在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中進行小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、分批給料發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)該細胞。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在一種適合營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生，該培養(yǎng)基包括碳和氮來源及無機鹽。適合的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。如果多肽分泌到該營養(yǎng)培養(yǎng)基中，那么可直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不被分泌，那么其可從細胞裂解液中進行回收。

使用本領(lǐng)域已知的對具有蛋白酶活性的這些多肽特異的方法可以檢測該多肽。這些檢測方法包括但不限于，特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶測定來確定該多肽的活性。

可以使用本領(lǐng)域已知的方法來回收多肽。例如，該多肽可以通過常規(guī)程序，包括但不限于，收集、離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀，從該營養(yǎng)培養(yǎng)基回收。

可以通過本領(lǐng)域中已知的多種程序來純化該多肽以獲得基本上純的多肽，這些程序包括但不限于：色譜法(例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、色譜聚焦、以及尺寸排阻色譜)、電泳程序(例如，制備型等電點聚焦)、差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或提取(參見例如，蛋白質(zhì)純化(Protein Purification)，詹森(Janson)和賴登(Ryden)編輯，VCH出版社(VCH Publishers)，紐約，1989)。

在替代性方面中，沒有回收該多肽，而是將表達該多肽的本發(fā)明的宿主細胞用作該多肽的來源。

信號肽和前肽

本發(fā)明還涉及一種編碼信號肽的分離的多核苷酸，該信號肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-191至-172或由其組成。本發(fā)明還涉及一種編碼前肽的分離的多核苷酸，該前肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-171至-1或由其組成。本發(fā)明還涉及一種編碼信號肽和前肽的分離的多核苷酸，該信號肽和前肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-191至-1或由其組成。所述多核苷酸可以進一步包括編碼蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)與信號肽和/或前肽可操作地連接。該蛋白質(zhì)優(yōu)選地對于該信號肽和/或前肽來說是外源的。在一個方面中，編碼該信號肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸1至60。在另一個方面中，編碼該前肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸61至573。在另一個方面中，編碼該信號肽和該前肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸1至573。

本發(fā)明亦涉及包含此類多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達載體和重組宿主細胞。

本發(fā)明還涉及產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，該方法包括：(a)對包括這種多核苷酸的重組宿主細胞進行培養(yǎng)；并且(b)回收該蛋白質(zhì)。

該蛋白對于宿主細胞而言可以是天然的或異源的。術(shù)語“蛋白質(zhì)”在此不意圖是指特定長度的編碼產(chǎn)物，并且因此涵蓋肽、寡肽及多肽。術(shù)語“蛋白”還涵蓋組合形成編碼的產(chǎn)物的兩個或更多個多肽。這些蛋白還包括雜合多肽和融合多肽。

優(yōu)選地，該蛋白是一種激素、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報告基因。舉例來說，該蛋白質(zhì)可以是一種水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶或轉(zhuǎn)移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。

基因可以從任何原核、真核或其它來源獲得。

組合物

本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的金屬蛋白酶的組合物。優(yōu)選地，這些組合物富含本發(fā)明的金屬蛋白酶。術(shù)語“富含”指示該組合物的蛋白酶活性已經(jīng)增加。

在一個實施例中，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的金屬蛋白酶以及一種適合的載體和/或賦形劑的組合物，特別是清潔組合物和/或洗滌劑組合物。

本發(fā)明還涉及包括具有蛋白酶活性的分離的多肽的組合物,該多肽選自下組,該組由以下各項組成：a)多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％的序列一致性、至少65％序列一致性、至少70％序列一致性、至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少91％序列一致性、至少92％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性、至少99％序列一致性或甚至100％序列一致性；b)由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸在中嚴格條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或(ii)(i)的全長互補鏈雜交；c)由以下多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60％的序列一致性、至少65％序列一致性、至少70％序列一致性、至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少91％序列一致性、至少92％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性、至少99％序列一致性或甚至100％序列一致性；e)變體，該變體包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的一個或多個(例如若干個)氨基酸的取代、缺失、和/或插入；和f)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)多肽的片段。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少75％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少90％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少91％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少92％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少93％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少94％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少95％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少96％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少97％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少98％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少99％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明的組合物包括具有蛋白酶活性的分離的多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有100％序列一致性。

在一個實施例中，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的金屬蛋白酶以及一種適合的載體和/或賦形劑的組合物，特別是清潔組合物和/或洗滌劑組合物。在一個實施例中，該洗滌劑組合物可以適于具體用途，例如衣物洗滌(特別是家用衣物洗滌)、餐具洗滌或硬表面清潔。

本發(fā)明的洗滌劑組合物可以配制為(例如)手洗或機洗衣物洗滌劑組合物，包括適用于預(yù)處理有污跡的織物的洗衣添加劑組合物，和漂洗添加的織物軟化劑組合物，或配制為用于一般家用硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或配制用于手洗或機洗餐具洗滌操作。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以應(yīng)用于硬表面清潔、自動餐具洗滌應(yīng)用、連同化妝品應(yīng)用，例如義齒、牙齒、頭發(fā)及皮膚中。

在一個實施例中，本發(fā)明涉及組合物，具體地涉及清潔組合物和/或洗滌劑組合物，該組合物包括多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％序列一致性、至少86％序列一致性、至少87％序列一致性、至少88％序列一致性、至少89％序列一致性、至少90％序列一致性、至少91％序列一致性、至少92％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性或至少99％序列一致性，以及適合的洗滌劑組分，例如如下所述的表面活性劑、助洗劑、漂白劑、聚合物。

在一個實施例中，本發(fā)明涉及組合物，具體地涉及清潔組合物和/或洗滌劑組合物，該組合物包括多肽，該多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少85％序列一致性、至少86％序列一致性、至少87％序列一致性、至少88％序列一致性、至少89％序列一致性、至少90％序列一致性、至少91％序列一致性、至少92％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性或至少99％序列一致性，以及另外的酶，例如，如下所述的另外的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶等。

在一個優(yōu)選實施例中，這些洗滌劑組合物包括一種或多種常規(guī)的載體和/或賦形劑，例如下文例示的那些。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以呈任何便利的形式，如棒狀、片劑、粉、顆粒、糊狀或液體。液體洗滌劑可以是水性的，典型地包含至多70％的水和0-30％的有機溶劑，或可以是非水性的。

除非另外指出，在此提供的所有組分或組合物水平參照該組分或組合物的活性水平給出，并且不包括可能存在于可商購來源中的雜質(zhì)，例如殘余溶劑或副產(chǎn)品。

本發(fā)明的金屬蛋白酶正常地以按該組合物的重量計從0.000001％至2％酶蛋白的水平，優(yōu)選以按該組合物的重量計從0.00001％至1％酶蛋白的水平，更優(yōu)選以按該組合物的重量計從0.0001％至0.75％酶蛋白的水平，甚至更優(yōu)選以按該組合物的重量計從0.001％至0.5％酶蛋白的水平摻入進該洗滌劑組合物中。

此外，本發(fā)明的金屬蛋白酶正常地以這樣的量摻入進該洗滌劑組合物中，使得其在洗滌水中的濃度處于從0.0000001％至1％酶蛋白的水平，優(yōu)選處于從0.000005％至0.01％酶蛋白的水平，更優(yōu)選處于從0.000001％至0.005％酶蛋白的水平，甚至更優(yōu)選在洗滌水中處于從0.00001％至0.001％酶蛋白的水平。

如眾所周知的，酶量還將根據(jù)具體應(yīng)用和/或作為被包括在這些組合物中的其他組分的結(jié)果而變化。

用于在自動洗碗機(ADW)中使用的組合物例如可以包括按該組合物的重量計0.001％-50％，例如0.01％-25％，例如0.02％-20％，例如0.1％-15％的酶蛋白。

用于在洗衣造粒(laundry granulation)中使用的組合物例如可以包含按該組合物的重量計0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-15％，例如0.05％-10％的酶蛋白。

用于在洗衣液中使用的組合物例如可以包括按該組合物的重量計0.0001％-10％，例如0.001％-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。

在一些優(yōu)選實施例中，在此提供的這些洗滌劑組合物典型地被這樣配制，使得用于水性清潔操作過程中，洗滌水具有以下pH：從約5.0至約11.5，或在替代實施例中，甚至從約6.0至約10.5，例如從約5至約11、從約5至約10、從約5至約9、從約5至約8、從約5至約7、從約6至約11、從約6至約10、從約6至約9、從約6至約8、從約6至約7、從約7至約11、從約7至約10、從約7至約9或從約7至約8。在一些優(yōu)選實施例中，顆?；蛞后w洗衣產(chǎn)品被這樣配制，使得洗滌水具有從約5.5至約8的pH。用于將pH控制在推薦的使用水平的技術(shù)包括使用緩沖劑、堿、酸等，并且是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的。

如實例4中示出，來自明礬韓國生工菌的本金屬蛋白酶在堿性pH條件下有活性，并且因此可以被應(yīng)用于堿性洗滌劑系統(tǒng)中，例如具有7-11的pH，8-10的pH，例如大約9.5的pH的洗滌劑系統(tǒng)。

酶組分重量基于總蛋白。除非另外指明，所有百分比和比率都是按重量計計算。除非另外指明，所有百分比和比率都是基于總組合物計算。在例示洗滌劑組合物中，通過按總組合物的重量計的純酶表示酶水平并且除非另外說明，按總組合物的重量計表示洗滌劑成分。

本發(fā)明的酶還應(yīng)用于洗滌劑添加劑產(chǎn)品中。當例如，溫度較低，例如溫度為約40℃或更低，pH在6與8之間并且洗滌時間較短，例如低于30min時，包括本發(fā)明的金屬蛋白酶的洗滌劑添加劑產(chǎn)品理想地適于包括在洗滌過程中。

該洗滌劑添加劑產(chǎn)品可以是本發(fā)明的金屬蛋白酶并且優(yōu)選是一種另外的酶。在一個實施例中，該添加劑被包裝于劑型中用于添加至清潔過程中。單一劑量可以包括丸、片劑、囊形片(gelcap)或包括粉和/或液體的其他單一劑量單位。在一些實施例中，包括填充物和/或一種或多種載體材料，適合的填充物或載體材料包括但不限于，硫酸鹽、碳酸鹽和硅酸鹽的各種鹽以及滑石、粘土等。在一些實施例中，用于液體組合物的填充物和/或載體材料包括水和/或低分子量伯醇和仲醇(包括多元醇和二元醇)。此類醇的實例包括但不限于，甲醇、乙醇、丙醇以及異丙醇。

在一個特別優(yōu)選的實施例中，根據(jù)本發(fā)明的金屬蛋白酶被用于顆粒組合物或液體中，該金屬蛋白酶可以呈膠囊化粒子的形式。在一個實施例中，該膠囊化材料選自下組，該組由以下各項組成：碳水化合物、天然或合成膠、甲殼素和殼聚糖、纖維素和纖維素衍生物、硅酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蠟及其組合。

根據(jù)本發(fā)明的組合物典型地包括一種或多種洗滌劑成分。術(shù)語洗滌劑組合物包括物品和清潔及處理組合物。除非另外指明，術(shù)語清潔組合物包括片劑，顆粒狀或粉狀的全效或“重垢”洗滌劑，尤其是衣物洗滌劑；液體、凝膠或糊狀的全效洗滌劑，尤其是所謂的重垢液類型；液體精細織物洗滌劑；手工洗碗劑或輕負荷洗碗劑，尤其是高起泡類型的那些；機器洗碗劑，包括用于供家庭和公共機構(gòu)使用的不同的片劑、顆粒、液體和漂洗助劑類型。該組合物還可以處于單位劑量包裝中，包括本領(lǐng)域已知的那些以及水可溶、水不可溶和/或水可滲透的那些。

在清潔和/或洗滌劑組分可能與本發(fā)明的金屬蛋白酶不相容的實施例中，可以使用適合方法來分離清潔和/或洗滌劑組分與該金屬蛋白酶(即，彼此不互相接觸)，直到組合兩種組分適當時。此類分隔方法包括任何本領(lǐng)域中已知的適合方法(例如，軟膠囊，包囊，片劑，物理分隔，例如通過使用具有一個或多個隔室的水溶性小袋)。

如當本發(fā)明的金屬蛋白酶被用作洗滌劑組合物(例如，衣物洗滌洗滌劑組合物或餐具洗滌洗滌劑組合物)的組分時所提及，它可以例如以非塵顆粒、穩(wěn)定化液體或受保護的酶的形式被包括在該洗滌劑組合物中?？梢岳缦衽队赨S 4,106,991和4,661,452(兩者都屬于諾和工業(yè)公司(Novo Industri A/S))中，產(chǎn)生非塵顆粒并且可以通過本領(lǐng)域已知的方法任選地進行包衣。蠟狀包衣材料的實例為具有1000至20000的平均分子量的聚乙二醇(PEG)產(chǎn)品；具有從16至50個環(huán)氧乙烷單位的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中該醇包含從12至20個碳原子，并且其中具有15至80個環(huán)氧乙烷單位；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油單酯、和甘油二酯、以及甘油三酯。適用于通過流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包衣材料的實例在GB 1483591中給出。

在一些實施例中，在此利用的這些酶由存在于為這些酶提供此類離子的成品組合物中的鋅(II)、鈣(II)和/或鎂(II)離子的水溶性來源，連同其他金屬離子(例如，鋇(II)、鈧(II)、鐵(II)、錳(II)、鋁(III)、錫(II)、鈷(II)、銅(II)、鎳(II)以及氧釩(IV))穩(wěn)定化。本發(fā)明的洗滌劑組合物的酶還可以使用常規(guī)穩(wěn)定劑，如多元醇(例如，丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸來穩(wěn)定化，并且可以如描述于例如WO 92/19709和WO 92/19708中配制該組合物。還可以通過添加可逆的酶抑制劑，例如，蛋白類型(如描述于EP 544 777中)或硼酸類型的可逆的酶抑制劑，來穩(wěn)定本發(fā)明的酶。其他酶穩(wěn)定劑是本領(lǐng)域熟知的，例如肽醛和蛋白質(zhì)水解物，例如可以使用肽醛或酮來穩(wěn)定根據(jù)本發(fā)明的金屬蛋白酶，如描述于WO 2005/105826和WO 2009/118375中。

如以上提及的，可以根據(jù)披露于EP 238 216中的方法制備包含在本發(fā)明的洗滌劑組合物中的受保護的酶。

可以用一種或多種試劑來擴充該組合物，用于預(yù)防生物膜的形成或去除形成的生物膜。這些試劑可以包括但不限于，分散劑、表面活性劑、洗滌劑、其他酶、抗微生物劑以及殺生物劑。

本發(fā)明的組合物可以被應(yīng)用于待用于自動定量裝置中的定量元件中。包括本發(fā)明的組合物的定量原件可以放置進如WO 2007/052004和WO 2007/0833141中所述的遞送筒中。定量元件可以有長形的形狀，并且排成形成遞送筒的陣列，該遞送筒是如在案例WO 2007/051989所述的自動定量分配裝置的替換物。遞送筒被放置在自動定量遞送裝置中，例如WO 2008/053191中所述的裝置。

關(guān)于自動定量裝置的適合的披露內(nèi)容可以見于WO 2007/083139、WO 2007/051989、WO 2007/083141、WO 2007/083142和EP 2361964，

其他酶

在一個實施例中，將本發(fā)明的金屬蛋白酶與一種或多種酶，例如至少兩種酶，更優(yōu)選是至少三種、四種或五種酶組合。優(yōu)選地，這些酶具有不同的底物特異性，例如蛋白質(zhì)分解活性、淀粉分解活性、脂質(zhì)分解活性、溶半纖維活性或溶果膠活性。

洗滌劑添加劑和洗滌劑組合物可以包括一種或多種酶，如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、碳水化合物酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如，漆酶)和/或過氧化物酶。

一般而言，一種或多種所選酶的特性應(yīng)與選定的洗滌劑相容(即，最適pH，與其他酶和非酶成分的相容性，等)，并且該一種或多種酶應(yīng)以有效量存在。

纖維素酶：適合的纖維素酶包括動物、植物或微生物來源的那些。特別適合的纖維素酶包括細菌或真菌來源的那些。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的變體。適合的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬的纖維素酶，例如，從在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中披露的特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢產(chǎn)生的真菌纖維素酶。

尤其適合的纖維素酶是具有顏色護理益處的堿性或中性纖維素酶。此類纖維素酶的實例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纖維素酶。其他實例是例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 1999/01544中的那些纖維素酶變體。

可商購的纖維素酶包括Celluzyme^TM、和Carezyme^TM(諾維信公司(Novozymes A/S))、Clazinase^TM、和Puradax HA^TM(杰能科國際有限公司(Genencor International Inc.))、以及KAC-500(B)^TM(花王株式會社(Kao Corporation))。

蛋白酶：適合的蛋白酶包括細菌、真菌、植物、病毒或動物起源的那些，例如微生物或植物起源。優(yōu)選微生物起源。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的變體。它可以是堿性蛋白酶，例如絲氨酸蛋白酶或另一金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草桿菌蛋白酶)。金屬蛋白酶可以例如是來自例如家族M4的嗜熱菌蛋白酶或其他金屬蛋白酶，例如來自M5、M7或M8家族的那些。

術(shù)語“枯草桿菌酶”是指根據(jù)斯艾森(Siezen)等人，蛋白質(zhì)工程學(xué)(Protein Engng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Science)6(1997)501-523的絲氨酸蛋白酶亞組。絲氨酸蛋白酶是特征為在活性位點具有與底物形成共價加合物的絲氨酸的蛋白酶的一個亞組。枯草桿菌酶可以劃分為6個亞部，即，枯草桿菌蛋白酶家族、嗜熱蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

枯草桿菌酶的實例是來源于芽孢桿菌屬的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的遲緩芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和吉氏芽孢桿菌；和描述于WO 89/06279中的枯草桿菌蛋白酶遲緩(lentus)、枯草桿菌蛋白酶諾和(Novo)、枯草桿菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢桿菌、枯草桿菌蛋白酶BPN’、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和鐮孢屬蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及來源于纖維單胞菌屬(Cellumonas)的糜蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。

進一步優(yōu)選的蛋白酶是來自遲緩芽孢桿菌DSM 5483的堿性蛋白酶(如在例如WO 95/23221中所述)、及其變體(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的)。

金屬蛋白酶的實例是如描述于WO 07/044993(杰能科國際公司(Genencor Int.))中的中性金屬蛋白酶，例如來源于解淀粉芽孢桿菌的那些。

有用的蛋白酶的實例是于以下各項中的變體：WO 92/19729、WO 96/034946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下位置的一個或多個中具有取代的變體：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’編號。更優(yōu)選地，這些蛋白酶變體可以包括以下突變：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’進行編號)。

適合的可商購蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：Duralase^Tm、Durazym^Tm、Ultra、Ultra、BlazeUltra、Ultra、和(諾維信公司)，以下列商品名出售的那些：PurafectPreferenz^Tm、PurafectPurafectPurafectEffectenz^Tm、以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、Axapem^TM(吉斯特布羅卡德斯公司(Gist-Brocases N.V.))、BLAP(序列示于US 5352604的圖29中)及其變體(漢高股份(Henkel AG))以及來自花王株式會社(Kao)的KAP(嗜堿芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶)。

脂肪酶：適合的脂肪酶包括動物、植物或微生物來源的那些。特別適合的脂肪酶包括細菌或真菌來源的那些。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的變體。有用的脂肪酶的實例包括來自腐質(zhì)霉屬(與嗜熱霉屬同義)，例如來自如EP 258 068和EP 305 216中描述的疏棉狀腐質(zhì)霉(細毛嗜熱霉)或來自如WO 96/13580中描述的特異腐質(zhì)霉的脂肪酶；假單胞菌屬脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌或類產(chǎn)堿假單胞菌(EP 218 272)、洋蔥假單胞菌(EP 331376)、施氏假單胞菌(GB 1,372,034)、螢光假單胞菌、假單胞菌屬物種菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假單胞菌(WO 96/12012)；芽孢桿菌屬脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(達圖瓦(Dartois)等人，1993，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(Biochemica et Biophysica Acta)，1131:253-360)，嗜熱脂肪芽抱桿菌(JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(WO 91/16422)。

脂肪酶變體的其他實例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079以及WO 97/07202中描述的那些。

優(yōu)選的可商購脂肪酶包括Lipolase^TM、Lipolase Ultra^TM和Lipex^TM(諾維信公司(Novozymes A/S))。

淀粉酶：可以與本發(fā)明的金屬蛋白酶一起使用的適合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是細菌或真菌來源的。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的變體。淀粉酶包括例如獲得自芽孢桿菌屬的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更詳細描述的地衣芽孢桿菌具體株系的α-淀粉酶。適合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的淀粉酶或其與SEQ ID NO:3具有90％序列一致性的變體。優(yōu)選的變體描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在一個或多個以下位置中具有取代的變體：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。不同的適合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其與SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的變體。SEQ ID NO:6的優(yōu)選變體是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。其他適合的淀粉酶是包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的來源于解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶的殘基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的殘基36-483的雜合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的變體。這一雜合α-淀粉酶的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的來源于解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶的殘基1-33和SEQ ID NO:4的殘基36-483的雜合α-淀粉酶的最優(yōu)選變體是具有以下取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

適合的另外的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其與SEQ ID NO:6具有90％序列一致性的變體。SEQ ID NO:6的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特別優(yōu)選的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有90％序列一致性的變體。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更優(yōu)選的變體是在位置181和182或位置183和184中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最優(yōu)選的淀粉酶變體是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476中的一個或多個中具有取代的那些?？梢允褂玫钠渌矸勖甘蔷哂蠾O 08/153815中的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其與WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列一致性或與WO 01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列一致性的變體。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。另外的適合的淀粉酶是具有WO 09/061380中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其與SEQ ID NO:2具有90％序列一致性的變體。SEQ ID NO:2的優(yōu)選變體是在以下位置中的一個或多個中具有C-末端的截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ ID NO:2的更優(yōu)選變體是在一個或多個以下位置中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQ ID NO:2的最優(yōu)選的淀粉酶變體是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中這些變體是C-末端截短的并且任選地進一步在位置243處包括取代和/或在位置180和/或位置181處包括缺失。其他適合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或與SEQ ID NO:12具有至少90％序列一致性的變體。優(yōu)選的淀粉酶變體是在WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的以下位置中的一個或多個中具有取代、缺失或插入的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特別優(yōu)選的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的變體，以及另外在選自下組的一個或多個位置中具有取代的變體：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最優(yōu)選的是另外在所有這些位置中具有取代的變體。其他實例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO 2013/001087中的那些淀粉酶變體?？缮藤彽牡矸勖甘荄uramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme ^TM、Stainzyme Plus^TM、Natalase^TM、Liquozyme X及BAN^TM(來自諾維信公司)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM/Effectenz^TM、Powerase及Preferenz S100(來自杰能科國際有限公司/杜邦公司(Genencor International Inc./DuPont))。

過氧化物酶/氧化酶：適合的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的那些。包括經(jīng)化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的變體。有用的過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬，例如來自灰蓋鬼傘的過氧化物酶，及其變體，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。

可商購的過氧化物酶包括Guardzyme^TM(諾維信公司)。

該一種或多種洗滌劑酶可以通過添加包括一種或多種酶的單獨添加劑，或通過添加包括所有這些酶的組合添加劑而被包括于洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，即單獨的或組合的添加劑，可以配制成例如顆粒、液體、漿液等，優(yōu)選的洗滌劑添加劑劑型為顆粒，特別是如上所述的無粉塵顆粒；液體，特別是穩(wěn)定化液體；或者漿液。

表面活性劑

典型地，該洗滌劑組合物包括(按該組合物的重量計)一種或多種在以下范圍內(nèi)的表面活性劑：0％至50％，優(yōu)選從2％至40％，更優(yōu)選從5％至35％，更優(yōu)選從7％至30％，最優(yōu)選從10％至25％，甚至最優(yōu)選從15％至20％。在一個優(yōu)選實施例中，該洗滌劑是液體或粉洗滌劑，包括按重量計小于40％，優(yōu)選小于30％，更優(yōu)選小于25％，甚至更優(yōu)選小于20％的表面活性劑。該組合物可以包括從1％至15％，優(yōu)選從2％至12％、3％至10％，最優(yōu)選從4％至8％，甚至最優(yōu)選從4％至6％的一種或多種表面活性劑。優(yōu)選的表面活性劑是陰離子型表面活性劑，非離子型表面活性劑，陽離子型表面活性劑，兩性離子型表面活性劑，兩性表面活性劑或其混合物。優(yōu)選地，該表面活性劑的主要部分是陰離子的。適合的陰離子表面活性劑在本領(lǐng)域是熟知的并且可以包括脂肪酸羧酸酯(肥皂)，支鏈、直鏈和隨機鏈烷基硫酸酯或脂肪醇硫酸酯或伯醇硫酸酯或烷基苯磺酸酯(例如LAS和LAB)或苯基鏈烷磺酸酯(phenylalknesulfonate)或烯基磺酸酯或烯基苯磺酸酯或烷基乙氧基硫酸酯或脂肪醇醚硫酸酯或α-烯烴磺酸酯或十二烯基/十四烯基(tetradecnyl)琥珀酸。陰離子表面活性劑可以被烷氧基化。該洗滌劑組合物還可以包括從1wt％至10wt％的非離子表面活性劑，優(yōu)選從2wt％至8wt％，更優(yōu)選從3wt％至7wt％，甚至更優(yōu)選少于5wt％的非離子表面活性劑。適合的非離子表面活性劑在本領(lǐng)域是熟知的并且可以包括醇乙氧基化物、和/或烷基乙氧基化物、和/或烷基酚乙氧基化物、和/或葡糖酰胺(例如脂肪酸N-葡糖基N-甲基酰胺)、和/或烷基多聚葡糖苷和/或單-或二乙醇酰胺或脂肪酸酰胺。該洗滌劑組合物還可以包括從0wt％至10wt％的陽離子表面活性劑，優(yōu)選從0.1wt％至8wt％，更優(yōu)選從0.5wt％至7wt％，甚至更優(yōu)選少于5wt％的陽離子表面活性劑。適合的陽離子表面活性劑在本領(lǐng)域是熟知的并且可以包括烷基季銨化合物、和/或烷基吡啶鎓化合物和/或烷基季鏻化合物和/或烷基三元硫鎓化合物。該組合物優(yōu)選包括在洗滌過程中于洗滌液中提供從100ppm至5,000ppm表面活性劑的量的表面活性劑。所述組合物當與水接觸后典型地形成洗滌液，該洗滌液包括0.5g/L至10g/L洗滌劑組合物。許多適合的表面活性化合物是可獲得的并且于文獻中充分描述，例如由施瓦茲(Schwartz)、佩里(Perry)和伯謝(Berch)描述于“表面活性劑與洗滌劑(Surface-Active Agents and Detergents)”，第I卷和第11卷中。

助洗劑

助洗劑的主要作用在于從洗滌溶液中螯合二價金屬離子(例如鈣離子和鎂離子)，該洗滌溶液否則將與表面活性劑系統(tǒng)消極地相互作用。助洗劑還可有效從織物表面去除金屬離子和無機污物，從而改進地去除微粒和飲料污漬。助洗劑也是一種堿度來源并且將洗滌水的pH緩沖至9.5至11的水平。緩沖能力也叫做儲備堿度，并且應(yīng)該優(yōu)選大于4。

本發(fā)明的洗滌劑組合物可以包括一種或多種洗滌劑助洗劑或助洗劑系統(tǒng)。許多適合的助洗劑系統(tǒng)描述于文獻中，例如描述于粉狀洗滌劑(Powdered Detergents)，表面活性劑科學(xué)系列(Surfactant science series)，第71卷，馬塞爾·德克爾公司(Marcel Dekker,Inc)中。按主題組合物的重量計，助洗劑可以包括從0％至60％，優(yōu)選從5％至45％，更優(yōu)選從10％至40％，最優(yōu)選從15％至35％，甚至更優(yōu)選從20％至30％助洗劑。按主題組合物的重量計，該組合物可以包括從0％至15％，優(yōu)選從1％至12％、2％至10％，最優(yōu)選從3％至8％，甚至最優(yōu)選從4％至6％的助洗劑。

助洗劑包括但不限于，聚磷酸鹽的堿金屬、銨和鏈烷醇銨鹽(例如，三聚磷酸鹽STPP)，堿金屬硅酸鹽，堿土金屬和堿金屬碳酸鹽，鋁硅酸鹽助洗劑(例如，沸石)以及聚羧酸化合物，醚羥基聚羧酸酯，馬來酸酐與乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物，1,3,5-三羥基苯-2,4,6-三磺酸，和羧基甲氧基琥珀酸，聚乙酸的各種堿金屬、銨和取代的銨鹽(如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸)，連同聚羧酸酯，如苯六甲酸、琥珀酸、檸檬酸、氧代二琥珀酸(oxydisuccinic acid)、聚馬來酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲氧基琥珀酸及其可溶鹽。乙醇胺(MEA、DEA和TEA)也可以有助于液體洗滌劑中的緩沖能力。

漂白劑

本發(fā)明的洗滌劑組合物可以包括一種或多種漂白劑。具體而言，粉狀洗滌劑可以包括一種或多種漂白劑。適合的漂白劑包括其他光漂白劑、預(yù)成型過酸、過氧化氫源、漂白活化劑、過氧化氫、漂白催化劑及其混合物。通常，當使用一種漂白劑時，本發(fā)明的組合物可以包括按主題清潔組合物的重量計從約0.1％至約50％或甚至從約0.1％至約25％的漂白劑。適合的漂白劑的實例包括：

(1)其他光漂白劑，例如維生素K3；

(2)預(yù)成型過酸：適合的預(yù)成型過酸包括但不限于選自下組的化合物，該組由以下各項組成：過氧羧酸及鹽，過碳酸及鹽，過亞氨酸(perimidic acid)及鹽，過氧單硫酸及鹽(例如過硫酸氫鉀(Oxone)及其混合物。適合的過氧羧酸包括具有化學(xué)式R-(C＝O)O-O-M的疏水性和親水性過酸，其中R是烷基(任選是支鏈的)，當該過酸是疏水性的，具有從6至14個碳原子或從8至12個碳原子，并且當該過酸是親水性的，具有少于6個碳原子或甚至少于4個碳原子；并且M是平衡離子，例如鈉、鉀或氫；

(3)過氧化氫源，例如無機過氧化氫合物鹽，包括堿金屬鹽，如過硼酸鹽(通常是一水合物或四水合物)，過碳酸鹽，過硫酸鹽，過磷酸鹽，過硅酸鹽的鈉鹽及其混合物。在本發(fā)明的一個方面中，無機過氧化氫合物鹽選自下組，該組由以下各項組成：過硼酸鹽、過碳酸鹽的鈉鹽及其混合物。當使用時，無機過氧化氫合物鹽典型地以整體組合物的從0.05至40wt％或1至30wt％的量存在并且典型地被摻入進此類組合物中作為可以被包衣的結(jié)晶固體。適合的包衣包括：無機鹽，例如堿金屬硅酸鹽、碳酸鹽或硼酸鹽或其混合物，或有機材料，例如水溶性或水分散性聚合物、蠟、油或脂肪皂。有用的漂白組合物描述于美國專利號5,576,282和6,306,812中；

(4)具有R-(C＝O)-L的漂白活化劑，其中R是烷基(任選是支鏈的)，當該漂白活化劑是疏水性的，具有從6至14個碳原子或從8至12個碳原子，并且當該漂白活化劑是親水性的，具有少于6個碳原子或甚至少于4個碳原子；并且L是離去基團。適合的離去基團的實例是苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸鹽。適合的漂白活性劑包括十二烷?；u苯磺酸鹽(dodecanoyl oxybenzene sulphonate)、癸酰基羥苯磺酸鹽、癸?；u苯甲酸或其鹽、3,5,5-三甲基己?；u苯磺酸鹽、四乙?；叶?TAED)和壬?；u苯磺酸鹽(NOBS)。適合的漂白活性劑還公開于WO 98/17767中。盡管可采用任何適合的漂白活性劑，但在本發(fā)明的一個方面中，本主題清潔組合物可以包括NOBS、TAED或其混合物；及

(5)能夠接受來自過氧酸的氧原子并且將該氧原子轉(zhuǎn)移至可氧化底物的漂白催化劑描述于WO 2008/007319中。適用的漂白催化劑包括但不限于：亞胺鹽陽離子和聚離子；亞胺兩性離子；改性的胺；改性的氧化胺；N-磺酰基亞胺；N-磷?；鶃啺罚籒-?；鶃啺?；噻二唑二氧化物；全氟亞胺；環(huán)狀糖酮及其混合物。該漂白催化劑將典型地以按重量計從0.0005％至0.2％、從0.001％至0.1％或甚至從0.005％至0.05％的水平被包括在該洗滌劑組合物中。

當存在時，基于該組合物，該過酸和/或漂白活化劑通常以從約0.1至約60wt％、從約0.5至約40wt％或甚至從約0.6至約10wt％的量存在于該組合物中。可以將一種或多種疏水性過酸或其前體與一種或多種親水性過酸或其前體組合使用。

可以對過氧化氫源和過酸或漂白活化劑的量進行選擇，以使得可用氧(來自過氧化物源)與過酸的摩爾比是從1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。

輔料

分散劑-本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包含分散劑。具體地說，粉狀洗滌劑可以包括分散劑。適合的水溶性有機材料包括均聚合或共聚合的酸或其鹽，其中聚羧酸包括至少兩個羧基，這兩個羧基被不超過兩個碳原子彼此分開。適合的分散劑例如描述于粉狀洗滌劑，表面活性劑科學(xué)系列，第71卷中，馬塞爾·德克爾公司(Marcel Dekker)。

染料轉(zhuǎn)移抑制劑-本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種染料轉(zhuǎn)移抑制劑。適合的聚合物染料轉(zhuǎn)移抑制劑包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮與N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。當存在于主題組合物中時，染料轉(zhuǎn)移抑制劑可以按組合物重量計的以下水平存在：從約0.0001％至約10％、從約0.01％至約5％或甚至從約0.1％至約3％。

熒光增白劑-本發(fā)明的洗滌劑組合物還將優(yōu)選地包含另外的組分,這些組分可以給正清潔的物品著色，例如熒光增白劑或光增亮劑。在本發(fā)明的組合物中可以使用適合用于在衣物洗滌劑組合物中使用的任何熒光增白劑。最常用的熒光增白劑是屬于以下類別的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-聯(lián)苯乙烯基衍生物。二氨基茋-磺酸衍生物型的熒光增白劑的實例包括以下的鈉鹽：4,4'-雙(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2'-二磺酸鹽；4,4'-雙(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)茋-2.2'-二磺酸鹽；4,4'-雙(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羥基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2'-二磺酸鹽；4,4'-雙(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)茋-2,2'-二磺酸鹽；4,4'-雙(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羥基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2'-二磺酸鹽和2-(茋基-4"-萘并-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸鹽。優(yōu)選的熒光增白劑是可從汽巴-嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞爾，瑞士)獲得的天來寶(Tinopal)DMS和天來寶CBS。天來寶DMS是4,4'-雙-(2-嗎啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸鹽的二鈉鹽。天來寶CBS是2,2'-雙-(苯基-苯乙烯基)二磺酸鹽的二鈉鹽。

還優(yōu)選熒光增白劑，是可商購的Parawhite KX，由派拉蒙礦物與化學(xué)(Paramount Minerals and Chemicals)，孟買，印度供應(yīng)。

適合用于在本發(fā)明中使用的其他熒光劑包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。

適合的熒光增白劑水平包括從約0.01wt％、從0.05wt％、從約0.1wt％或甚至從約0.2wt％的較低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的較高水平。

織物調(diào)色劑-本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括織物調(diào)色劑，例如當配制在洗滌劑組合物中時，可以在織物與包括所述洗滌劑組合物的洗滌液體接觸時沉積在所述織物上從而通過可見光吸收來改變所述織物色彩的染料或色素。熒光增白劑發(fā)射至少一些可見光。相比之下，因為它們吸收至少一部分可見光光譜，所以織物調(diào)色劑改變表面的色彩。適合的織物調(diào)色劑包括染料和染料-粘土軛合物，并且還可以包括色素。適合的染料包括小分子染料和聚合物染料。適合的小分子染料包括選自下組的小分子染料，該組由落入顏色索引(Colour Index)(C.I.)分類的以下染料組成：直接藍、直接紅、直接紫、酸性藍、酸性紅、酸性紫、堿性藍、堿性紫和堿性紅、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276以及EP 1 876 226中。洗滌劑組合物優(yōu)選包括從約0.00003wt％至約0.2wt％、從約0.00008wt％至約0.05wt％、或甚至從約0.0001wt％至約0.04wt％的織物調(diào)色劑。該組合物可以包括從0.0001wt％至0.2wt％的織物調(diào)色劑，當該組合物處于單位劑量袋的形式時，這可以是特別優(yōu)選的。

污物釋放聚合物-本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種污物釋放聚合物，這些污物釋放聚合物幫助從織物，例如棉布和聚酯基織物上去除污物，特別是從聚酯基織物上去除疏水污物。污物釋放聚合物可以例如是非離子型或陰離子型對苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己內(nèi)酰胺和相關(guān)共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，參見例如粉狀洗滌劑，表面活性劑科學(xué)系列第71卷第7章，馬塞爾·德克爾公司(Marcel Dekker,Inc.)。另一種類型的污物釋放聚合物是包括核心結(jié)構(gòu)和連接至該核心結(jié)構(gòu)的多個烷氧基化基團的兩親性烷氧基化油污清潔聚合物。芯結(jié)構(gòu)可以包括如WO 2009/087523中詳細描述的一個聚烯屬烴亞胺結(jié)構(gòu)或一個聚烷醇胺結(jié)構(gòu)。此外，任意接枝共聚物是適合的污物釋放聚合物。適合的接枝共聚物更詳細地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中。其他污物釋放聚合物是取代的多糖結(jié)構(gòu)，尤其是取代的纖維素結(jié)構(gòu)，例如改性纖維素衍生物，例如EP 1 867 808或WO 2003/040279中描述的那些。適合的纖維素聚合物包括纖維素、纖維素醚、纖維素酯、纖維素酰胺及其混合物。適合的纖維素聚合物包括陰離子改性的纖維素、非離子改性的纖維素、陽離子改性的纖維素、兼性離子改性的纖維素及其混合物。適合的纖維素聚合物包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、酯羧甲基纖維素及其混合物。

抗再沉積劑-本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種抗再沉積劑，例如羧甲基纖維素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚環(huán)氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸與馬來酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亞胺。以上在污物釋放聚合物下描述的纖維素基聚合物還可以用作抗再沉積劑。

其他適合的輔料包括但不限于防縮劑、防皺劑、殺菌劑、粘合劑、載體、染料、酶穩(wěn)定劑、織物柔軟劑、填充劑、泡沫調(diào)節(jié)劑、助水溶物、香料、色素、抑泡劑(sodsuppressor)、溶劑、用于液體洗滌劑的結(jié)構(gòu)化劑(structurants)和/或結(jié)構(gòu)彈性劑(elasticizing agent)。

在一個方面中，該洗滌劑是一種壓縮液體衣物洗滌劑組合物，包括：a)按該組合物的重量計，至少約10％，優(yōu)選從20％至80％的表面活性劑，選自陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑、肥皂及其混合物；b)按該組合物的重量計，從約1％至約30％，優(yōu)選從5％至30％的水；c)按該組合物的重量計，從約1％至約15％，優(yōu)選從3％至10％的非氨基官能溶劑；以及d)按該組合物的重量計，從約5％至約20％的性能添加劑，選自螯合劑、污物釋放聚合物、酶及其混合物；其中該壓縮液體衣物洗滌劑組合物包括以下各項中的至少一項：(i)該表面活性劑的陰離子表面活性劑與非離子表面活性劑的重量比為從約1.5:1至約5:1，該表面活性劑包括按該組合物的重量計從約15％至約40％的陰離子表面活性劑并且包括按該組合物的重量計從約5％至約40％的肥皂；(ii)按該組合物的重量計從約0.1％至約10％的促泡劑(suds boosting agent)，選自促泡聚合物、陽離子表面活性劑、兼性離子表面活性劑、氧化胺表面活性劑、兩性表面活性劑及其混合物；以及(ii)(i)和(ii)兩者。所有成分都描述于WO 2007/130562中?？捎糜谶@些洗滌劑配制品中的另外的聚合物描述于WO 2007/149806中。

在另一個方面中，該洗滌劑是一種壓縮顆粒狀(粉狀)洗滌劑，包括a)按該組合物的重量計，至少約10％，優(yōu)選從15％至60％的表面活性劑，選自陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑、肥皂及其混合物；b)按該組合物的重量計，從約10％至80％，優(yōu)選從20％至60％的助洗劑，其中該助洗劑可以是一種選自以下各項的助洗劑的混合物，i)磷酸鹽助洗劑，優(yōu)選少于20％，更優(yōu)選少于10％，甚至更優(yōu)選少于5％的總助洗劑是磷酸鹽助洗劑；ii)沸石助洗劑，優(yōu)選少于20％，更優(yōu)選少于10％，甚至更優(yōu)選少于5％的總助洗劑是沸石助洗劑；iii)檸檬酸鹽，優(yōu)選0至5％的總助洗劑是檸檬酸鹽助洗劑；iv)聚羧酸鹽，優(yōu)選0至5％的總助洗劑是聚羧酸鹽助洗劑；v)碳酸鹽，優(yōu)選0至30％的總助洗劑是碳酸鹽助洗劑以及vi)硅酸鈉，優(yōu)選0至20％的總助洗劑是硅酸鈉助洗劑；c)按該組合物的重量計，從約0％至25％的填充物，例如硫酸鹽，按該組合物的重量計，優(yōu)選從1％至15％，更優(yōu)選從2％至10％，更優(yōu)選從3％至5％的填充物；以及d)按該組合物的重量計，從約0.1％至20％的酶，按該組合物的重量計，優(yōu)選從1％至15％，更優(yōu)選從2％至10％的酶。

M4金屬蛋白酶在洗滌劑中的用途

對于洗滌劑配制者而言重要的污物和污漬由許多不同物質(zhì)構(gòu)成，已經(jīng)開發(fā)具有不同底物特異性的一系列不同的酶用于在涉及衣物和硬表面清潔(例如餐具洗滌)兩者中使用。認為這些酶提供酶洗滌益處，因為與不具有酶的同一過程相比，它們在其應(yīng)用至其中的清潔過程中特異性地改進污漬去除。本領(lǐng)域中已知的去污酶包括以下酶，例如糖酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、角質(zhì)酶以及果膠酶。

在一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的金屬蛋白酶在洗滌劑組合物和清潔過程，例如衣物洗滌和硬表面清潔中的用途。因此，在一個方面中，本發(fā)明展示了本發(fā)明的金屬蛋白酶對不同污漬以及在各種條件下的洗滌效果。在本發(fā)明的一個具體方面中，該洗滌劑組合物及在清潔過程中的用途涉及本發(fā)明的金屬蛋白酶與以上提及的去污酶中的至少一種一起使用，例如另一種蛋白酶，并且特別是絲氨酸蛋白酶。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面中，根據(jù)本發(fā)明有用的本發(fā)明的金屬蛋白酶可以與至少兩種酶組合。這些另外的酶詳細描述于“其他酶”部分中，更優(yōu)選是至少三種、四種或五種酶。優(yōu)選地，這些酶具有不同的底物特異性，例如碳水化合物分解活性(carbolytic activity)、蛋白質(zhì)分解活性、淀粉分解活性、脂質(zhì)分解活性、溶半纖維活性或溶果膠活性。酶組合可以例如是本發(fā)明的金屬蛋白酶與另一種去污酶，例如本發(fā)明的金屬蛋白酶和蛋白酶、本發(fā)明的金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶、本發(fā)明的金屬蛋白酶和另一種金屬蛋白酶、本發(fā)明的金屬蛋白酶和淀粉酶、本發(fā)明的金屬蛋白酶和纖維素酶、本發(fā)明的金屬蛋白酶和半纖維素酶、本發(fā)明的金屬蛋白酶和脂肪酶、本發(fā)明的金屬蛋白酶和角質(zhì)酶、本發(fā)明的金屬蛋白酶和果膠酶或本發(fā)明的金屬蛋白酶和抗再沉積酶。更優(yōu)選地，本發(fā)明的金屬蛋白酶與至少兩種其他去污酶組合，例如本發(fā)明的金屬蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶及淀粉酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶及脂肪酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶及果膠酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶及纖維素酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶及半纖維素酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶及角質(zhì)酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、淀粉酶及果膠酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、淀粉酶及角質(zhì)酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、淀粉酶及半纖維素酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、脂肪酶及果膠酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、脂肪酶及角質(zhì)酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、脂肪酶及纖維素酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、脂肪酶及半纖維素酶。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的金屬蛋白酶可以與至少三種其他去污酶組合，例如本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶、淀粉酶及果膠酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶、淀粉酶及角質(zhì)酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及果膠酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及角質(zhì)酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及纖維素酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及半纖維素酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶、脂肪酶及果膠酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶、脂肪酶及角質(zhì)酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶、脂肪酶及纖維素酶；或本發(fā)明的金屬蛋白酶、蛋白酶、脂肪酶及半纖維素酶；根據(jù)本發(fā)明的金屬蛋白酶可以與任何選自非窮盡性列表的酶組合，該列表包括：碳水化合物酶(例如淀粉酶)、半纖維素酶、果膠酶、纖維素酶、黃原膠酶或支鏈淀粉酶、肽酶、蛋白酶或脂肪酶。

在一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的金屬蛋白酶與絲氨酸蛋白酶組合，例如S8家族蛋白酶，如

在本發(fā)明的另一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明有用的本發(fā)明的金屬蛋白酶可以與一種或多種其他金屬蛋白酶組合，例如另一種M4金屬蛋白酶，包括或嗜熱菌蛋白酶。此類組合可以進一步包括如上概述的其他洗滌劑酶的組合。

清潔過程或者紡織品護理過程可以例如是衣物洗滌過程、餐具洗滌過程或硬表面(如浴室瓷磚、地板、桌面、排水管、水槽以及臉盆)清潔。衣物洗滌過程可以例如是家用洗衣，但是它也可以是工業(yè)洗衣。此外，本發(fā)明涉及一種用于洗滌織物和/或衣服的方法，其中該方法包括用包含一種洗滌劑組合物和至少一種本發(fā)明的金屬蛋白酶的洗滌溶液處理織物。例如，可以在機器洗滌過程中或者在手動洗滌過程中進行清潔過程或紡織品保養(yǎng)過程。洗滌溶液可以例如是包含洗滌劑組合物的水洗溶液。

經(jīng)過洗滌、清潔的織物和/或衣物或者本發(fā)明的紡織品保養(yǎng)過程可以是常規(guī)的可洗滌衣物洗滌，例如家用洗滌。優(yōu)選地，衣物洗滌的主要部分是衣物和織物，包括針織品、編織物、斜紋粗棉布、非編織物、毛氈、紗線、以及毛布巾。這些織物可以是纖維素基的，如天然纖維素，包括棉布、亞麻、亞麻布、黃麻、苧麻、劍麻或椰殼纖維；或者人造纖維素(例如，來源于木漿)，包括纖維膠/人造絲、苧麻、醋酸纖維素纖維(三胞)、萊賽爾纖維(lyocell)或其共混物。這些織物還可以是非纖維素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、駱駝毛、羊絨、馬海毛、兔毛或絲；或者合成聚合物，如尼龍、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯以及斯潘德克斯彈性纖維(spandex)/彈性纖維；或其共混物以及纖維素基和非纖維素基纖維的共混物。共混物的例子是棉和/或人造絲/纖維膠與一種或幾種伴隨材料的共混物，該伴隨材料例如是羊毛、合成纖維(例如聚酰胺纖維、丙烯酸纖維、聚酯纖維、聚乙烯醇纖維、聚氯乙烯纖維、聚亞胺酯纖維、聚脲纖維、芳族聚酰胺纖維)以及含纖維素的纖維(例如人造絲/纖維膠、苧麻、亞麻/亞麻布、黃麻、醋酸纖維素纖維、萊賽爾纖維)。

最近幾年，人們對替換洗滌劑中的組分的興趣逐漸增加，這源于用可再生生物組分如酶和多肽替換石油化學(xué)產(chǎn)品而不損害洗滌性能。當洗滌劑組合物的組分改變新酶活性或者相比于常用洗滌劑酶(如蛋白酶)具有替代和/或改進的特性的新酶時，需要脂肪酶和淀粉酶來實現(xiàn)與傳統(tǒng)洗滌劑組合物相比時類似或改進的洗滌性能。

本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的金屬蛋白酶在去除蛋白質(zhì)污漬過程中的用途。蛋白質(zhì)污漬可能是如食品污漬等污漬，如嬰兒食品、皮脂、可可、雞蛋、血液、牛奶、墨水、草、或其組合。

典型的洗滌劑組合物包括除酶之外的各種組分，這些組分具有不同的作用，一些組分像表面活性劑降低洗滌劑的表面張力，這允許正清潔的污漬被提起和分散并隨后被洗滌出來，其他組分像漂白系統(tǒng)通常通過氧化去除顏色并且許多漂白劑還具有強殺菌特性，并且用于消毒和滅菌。再其他組分像助洗劑和螯合劑例如通過從液體中去除金屬離子來軟化洗滌水。

在一個具體實施例中，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的金屬蛋白酶的一種組合物在衣物或餐具洗滌中的用途，其中所述酶組合物進一步包括以下各項中的至少一種或多種：表面活性劑、助洗劑、螯合劑或螯合試劑、漂白系統(tǒng)或漂白組分。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，表面活性劑、助洗劑、螯合劑或螯合試劑、漂白系統(tǒng)和/或漂白組分的量相比于在未添加本發(fā)明的金屬蛋白酶情況下使用的表面活性劑、助洗劑、螯合劑或螯合試劑、漂白系統(tǒng)和/或漂白組分的量有所減小。優(yōu)選地，作為表面活性劑、助洗劑、螯合劑或螯合試劑、漂白系統(tǒng)和/或漂白組分的該至少一種組分按以下量存在：比在不添加本發(fā)明的金屬蛋白酶的情況下組分在系統(tǒng)中的量(例如，此組分的常規(guī)的量)少1％、如少2％、如少3％、如少4％、如少5％、如少6％、如少7％、如少8％、如少9％、如少10％、如少15％、如少20％、如少25％、如少30％、如少35％、如少40％、如少45％、如少50％。在一個方面中，將本發(fā)明的金屬蛋白酶用于洗滌劑組合物中，其中所述組合物不含至少一種組分，該組分是一種表面活性劑、助洗劑、螯合劑或螯合試劑、漂白系統(tǒng)或漂白組分和/或聚合物。

洗滌方法

本發(fā)明的洗滌劑組合物理想地適用于在洗衣應(yīng)用中使用。因此，本發(fā)明包括一種洗滌織物的方法。該方法包括將有待洗滌的織物與包含根據(jù)本發(fā)明的洗滌劑組合物的清潔洗衣溶液接觸的步驟?？椢锟梢园軌蛟诔Ｒ?guī)消費者使用條件下被洗滌的任何織物。該溶液優(yōu)選具有從約5.5至約8的pH?？梢栽谌芤褐邪匆韵聺舛仁褂眠@些組合物：從約100ppm，優(yōu)選500ppm至約15,000ppm。水溫的范圍典型地是從約5℃至約90℃，包括約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃以及約90℃。水與織物之比典型地是從約1:1至約30:1。

在具體實施例中，在從約5.0至約11.5的pH下進行該洗滌方法，或在替代性實施例中，甚至從約6至約10.5，例如約5至約11、約5至約10、約5至約9、約5至約8、約5至約7、約5.5至約11、約5.5至約10、約5.5至約9、約5.5至約8、約5.5.至約7、約6至約11、約6至約10、約6至約9、約6至約8、約6至約7、約6.5至約11、約6.5至約10、約6.5至約9、約6.5至約8、約6.5至約7、約7至約11、約7至約10、約7至約9或約7至約8，優(yōu)選約5.5至約9，并且更優(yōu)選約6至約8。

如實例4中示出，來自明礬韓國生工菌的金屬蛋白酶在堿性pH條件下有活性。在一個優(yōu)選的實施例中，該金屬蛋白酶被用于洗滌劑組合物中，該洗滌劑組合物用于在7-11的pH、8-10的pH，例如大約9.5的pH下進行的洗滌方法中的應(yīng)用。

在多個具體實施例中，在以下硬度下進行該洗滌方法：從約0°dH至約30°dH，例如約1°dH、約2°dH、約3°dH、約4°dH、約5°dH、約6°dH、約7°dH、約8°dH、約9°dH、約10°dH、約11°dH、約12°dH、約13°dH、約14°dH、約15°dH、約16°dH、約17°dH、約18°dH、約19°dH、約20°dH、約21°dH、約22°dH、約23°dH、約24°dH、約25°dH、約26°dH、約27°dH、約28°dH、約29°dH、約30°dH。在典型歐洲洗滌條件下，硬度是約15°dH，在典型美國洗滌條件下，是約6°dH，并且在典型亞洲洗滌條件下，是約3°dH。

本發(fā)明涉及一種用包括本發(fā)明的金屬蛋白酶的洗滌劑組合物清潔織物、餐具或硬表面的方法。

一個優(yōu)選實施例涉及一種清潔方法，所述方法包括在適合于清潔物體的條件下將所述物體與包括本發(fā)明的金屬蛋白酶的清潔組合物接觸的步驟。在一個優(yōu)選實施例中，該清潔組合物是一種洗滌劑組合物并且該過程是一個衣物洗滌或餐具洗滌過程。

另一個實施例涉及一種用于從織物上去除污漬的方法，該方法包括在適合于清潔所述物體的條件下將所述織物與包括本發(fā)明的金屬蛋白酶的組合物接觸。

在一個優(yōu)選實施例中，用于在以上方法中使用的組合物進一步包括至少一種如以上“其他酶”部分列出的另外的酶，如選自下組的酶，該組由以下各項組成：糖酶、肽酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶，木聚糖酶或角質(zhì)酶或其組合。在又另一個優(yōu)選的實施例中，這些組合物包含減少量的至少一種或多種以下組分：表面活性劑、助洗劑、螯合劑或絡(luò)合劑、漂白系統(tǒng)或漂白組分或聚合物。

低溫用途

本發(fā)明的一個實施例涉及一種進行衣物洗滌、餐具洗滌或工業(yè)清潔的方法，該方法包括使有待清潔的表面與本發(fā)明的一種金屬蛋白酶接觸，并且其中所述衣物洗滌、餐具洗滌、工業(yè)或機構(gòu)清潔在約40℃或以下的溫度下進行。本發(fā)明的一個實施例涉及金屬蛋白酶在衣物洗滌、餐具洗滌或清潔過程中的用途，其中衣物洗滌、餐具洗滌、工業(yè)清潔中的溫度是約40℃或以下。

在另一個實施例中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的金屬蛋白酶在除蛋白過程中的用途，其中除蛋白過程中的溫度是約40℃或以下。

本發(fā)明還涉及與商業(yè)金屬蛋白酶(例如)相比具有至少一種改進特性的金屬蛋白酶在衣物洗滌、餐具洗滌或工業(yè)清潔過程中的用途并且其中衣物洗滌、餐具洗滌或清潔過程中的溫度在約40℃或以下的溫度下進行。

在以上確定的方法和用途的每一者中，洗滌溫度是約40℃或以下，例如約39℃或以下、例如約38℃或以下、例如約37℃或以下、例如約36℃或以下、例如約35℃或以下、例如約34℃或以下、例如約33℃或以下、例如約32℃或以下、例如約31℃或以下、例如約30℃或以下、例如約29℃或以下、例如約28℃或以下、例如約27℃或以下、例如約26℃或以下、例如約25℃或以下、例如約24℃或以下、例如約23℃或以下、例如約22℃或以下、例如約21℃或以下、例如約20℃或以下、例如約19℃或以下、例如約18℃或以下、例如約17℃或以下、例如約16℃或以下、例如約15℃或以下、例如約14℃或以下、例如約13℃或以下、例如約12℃或以下、例如約11℃或以下、例如約10℃或以下、例如約9℃或以下、例如約8℃或以下、例如約7℃或以下、例如約6℃或以下、例如約5℃或以下、例如約4℃或以下、例如約3℃或以下、例如約2℃或以下、例如約1℃或以下。

在另一個優(yōu)選實施例中，洗滌溫度在約5℃-40℃的范圍內(nèi)，例如約5℃-30℃、約5℃-20℃、約5℃-10℃、約10℃-40℃、約10℃-30℃、約10℃-20℃、約15℃-40℃、約15℃-30℃、約15℃-20℃、約20℃-40℃、約20℃-30℃、約25℃-40℃、約25℃-30℃或約30℃-40℃。在特別優(yōu)選的實施例中，洗滌溫度是約20℃、約30℃、或約40℃。

在具體實施例中，在從約5.0至約11.5的pH下進行該低溫洗滌方法，或在替代性實施例中，甚至從約6至約10.5，例如約5至約11、約5至約10、約5至約9、約5至約8、約5至約7、約5.5至約11、約5.5至約10、約5.5至約9、約5.5至約8、約5.5.至約7、約6至約11、約6至約10、約6至約9、約6至約8、約6至約7、約6.5至約11、約6.5至約10、約6.5至約9、約6.5至約8、約6.5至約7、約7至約11、約7至約10、約7至約9或約7至約8，優(yōu)選約6至約8.5，并且更優(yōu)選約6至約8。

在具體實施例中，在以下硬度下進行該低溫洗滌方法：從約0°dH至約30°dH，例如約1°dH、約2°dH、約3°dH、約4°dH、約5°dH、約6°dH、約7°dH、約8°dH、約9°dH、約10°dH、約11°dH、約12°dH、約13°dH、約14°dH、約15°dH、約16°dH、約17°dH、約18°dH、約19°dH、約20°dH、約21°dH、約22°dH、約23°dH、約24°dH、約25°dH、約26°dH、約27°dH、約28°dH、約29°dH、約30°dH。在典型歐洲洗滌條件下，硬度是約15°dH，在典型美國洗滌條件下，是約6°dH，并且在典型亞洲洗滌條件下，是約3°dH。

在去除雞蛋污漬中的用途

本發(fā)明的另一個具體實施例涉及雞蛋污漬的去除。這些類型的污漬通常非常難于完全去除。雞蛋污漬在硬表面清潔中是特別有問題的，例如餐具洗滌，其中污漬在洗滌后通常留在盤和刀具上。本發(fā)明的金屬蛋白酶特別適于去除雞蛋污漬。

因此，本發(fā)明進一步涉及用于從紡織品、織物和/或硬表面(像餐具和刀具)，特別是從織物和紡織品去除雞蛋污漬的方法。本發(fā)明的一個優(yōu)選方面涉及一種從紡織品和/或織物去除雞蛋污漬的方法，該方法包括使需要去除雞蛋污漬的表面與本發(fā)明的金屬蛋白酶接觸。在一個實施例中，本發(fā)明包括一種從紡織品和/或織物去除雞蛋污漬的方法，該方法包括使需要去除雞蛋污漬的表面與包括本發(fā)明的金屬蛋白酶的洗滌劑組合物接觸。本發(fā)明還涉及一種去除雞蛋污漬的方法，該方法包括向待洗衣物和/或在洗滌過程中添加本發(fā)明的金屬蛋白酶，其中所述紡織品和/或織物包括不同雞蛋污漬。

本發(fā)明的一個實施例涉及一種用于從硬表面或從待洗衣物去除雞蛋污漬的方法，該方法包括將含雞蛋污漬的硬表面或含雞蛋污漬的衣物與包含本發(fā)明的金屬蛋白酶的清潔或洗滌劑組合物，優(yōu)選衣物洗滌或餐具洗滌組合物接觸。

另一個實施例涉及一種用于從織物或紡織品去除雞蛋污漬的方法，該方法包括使該織物或紡織品與包括本發(fā)明的金屬蛋白酶的清潔或洗滌劑組合物，優(yōu)選衣物洗滌或餐具洗滌組合物接觸。

一個仍另外的實施例涉及一種用于從織物或紡織品去除雞蛋污漬的方法，該方法包括使所述織物或紡織品與包括本發(fā)明的金屬蛋白酶的組合物接觸，其中所述組合物進一步包括至少一種如以上“其他酶”部分列出的另外的酶，例如一種選自下組的酶，該組由以下各項組成：碳水化合物酶、肽酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、木聚糖酶、角質(zhì)酶或其組合。

在具體實施例中，在從約5.0至約11.5的pH下進行該除雞蛋方法，或在替代性實施例中，甚至從約6至約10.5，例如約5至約11、約5至約10、約5至約9、約5至約8、約5至約7、約5.5至約11、約5.5至約10、約5.5至約9、約5.5至約8、約5.5至約7、約6至約11、約6至約10、約6至約9、約6至約8、約6至約7、約6.5至約11、約6.5至約10、約6.5至約9、約6.5至約8、約6.5至約7、約7至約11、約7至約10、約7至約9或約7至約8、約5.5至約9，優(yōu)選約6至約8.5，并且更優(yōu)選約6至約8。

在具體實施例中，在以下硬度下進行該除雞蛋方法：從約0°dH至約30°dH，例如約1°dH、約2°dH、約3°dH、約4°dH、約5°dH、約6°dH、約7°dH、約8°dH、約9°dH、約10°dH、約11°dH、約12°dH、約13°dH、約14°dH、約15°dH、約16°dH、約17°dH、約18°dH、約19°dH、約20°dH、約21°dH、約22°dH、約23°dH、約24°dH、約25°dH、約26°dH、約27°dH、約28°dH、約29°dH、約30°dH。在典型歐洲洗滌條件下，硬度是約15°dH，在典型美國洗滌條件下，是約6°dH，并且在典型亞洲洗滌條件下，是約3°dH。

在此引用的所有文獻均通過引用以其全文結(jié)合在此。

通過以下實例進一步描述本發(fā)明，這些實例不應(yīng)當解釋為限制本發(fā)明的范圍。

實例

材料與方法

用于洗滌測定的測試材料

草污漬小塊布樣062KC是從沃里克伊奎斯特公司(Warwick Equest Ltd)(55單元，康塞特商業(yè)園(Consett Business Park)，康塞特，達勒姆郡，DH8 6BN，英國)獲得的，

剩下的小塊布樣獲得自測試材料BV中心(Center For Testmaterials BV)(郵政信箱120，3133KT弗拉爾丁恩，荷蘭)。

標準洗滌劑

使用了標準洗滌劑B、J、M和Y。標準洗滌劑B類似于歐洲類型液體洗滌劑組合物。標準洗滌劑J類似于美國類型液體洗滌劑組合物。標準洗滌劑M類似于中國類型粉狀洗滌劑組合物。標準洗滌劑Y類似于發(fā)展中和新興(D&E)亞洲太平洋市場類型粉狀洗滌劑組合物。

洗滌測定

用于衣物洗滌的自動機械應(yīng)力測定(AMSA)

為了評定在衣物中的洗滌性能，使用自動機械應(yīng)力測定(AMSA)進行洗滌實驗。使用AMSA，可以檢査大量小體積酶洗滌劑溶液的洗滌性能。AMSA平板具有許多用于測試溶液的縫和蓋子，蓋子針對所有縫開口強力擠壓洗滌樣品(有待洗滌的紡織品)。在洗滌時間期間，板、測試溶液、紡織品和蓋子劇烈振動從而使測試溶液與紡織品接觸并以規(guī)則、周期性擺動方式施加機械應(yīng)力。關(guān)于進一步描述，參見WO 02/42740，尤其是第23-24頁的“特定方法實施例(Special method embodiments)”段落。

將洗滌性能作為所洗滌紡織品顏色的亮度進行測量。亮度也可以表達為當用白光照亮?xí)r從樣品反射的光的強度。當樣品受到污染時，反射光的強度低于干凈樣品的反射光的強度。因此，反射光的強度可以用于測量洗滌性能。

使用專業(yè)平板掃描儀(Kodak iQsmart(柯達(Kodak))，Midtager 29，DK-2605(丹麥)進行顏色測量，該掃描儀用于捕獲所洗滌紡織品的圖像。

為了從掃描的圖像中提取光強度值，將來自圖像的24-位像素值轉(zhuǎn)化為紅、綠以及藍(RGB)的值。通過將RGB值作為向量相加在一起并然后考慮所得向量的長度可以計算強度值(Int)：

AMSA洗滌性能實驗在以下詳細說明的實驗條件下進行：

小洗滌測定(mini wash assay)

在衣物洗滌實驗中使用微量洗滌測定來評定洗滌性能，所述用微量洗滌測定是一種測試方法，其中將弄臟的紡織品在測試溶液中連續(xù)地提起并放下并且隨后漂洗。

在以下指定的實驗條件下進行洗滌實驗：

隨后將洗滌過的紡織品風(fēng)干并且將洗滌性能測量為這些紡織品的顏色的亮度。還可以將亮度表示為反射比(R)，反射比是當用白光照射時，從測試材料反射或發(fā)射的光的量度。使用Zeiss MCS 521VIS分光光度計在460nm處測量紡織品的反射比(R)。根據(jù)制造商的方案進行測量。

通過如下計算相對性能，在2.5nM、5nM、10nM、30nM、或60nM蛋白酶濃度處比較新酶的性能與照酶的性能：

RP＝(R_酶-R_空白)/(R_參考-R_空白)

如果酶在至少一種洗滌劑組合物中的表現(xiàn)優(yōu)于參考(RP>1)，則認為該酶展示出改進的洗滌性能。

Terg-O-tometer(TOM)洗滌測定

Tergo-O-tometer(TOM)是一種中等規(guī)模標準洗滌系統(tǒng)，它可以用于同時測試16種不同的洗滌條件。TOM基本上是大型的具有多達16個開放金屬燒杯淹沒至其中的溫度受控的水浴。每個燒杯構(gòu)成一個小的頂部加載型洗滌機器并且在實驗期間，它們中的每一者將包含特定洗滌劑/酶系統(tǒng)的溶液并且對弄臟的和未弄臟的織物測試其性能。通過旋轉(zhuǎn)攪拌臂獲得機械應(yīng)力，該旋轉(zhuǎn)攪拌臂攪拌在每個燒杯內(nèi)的液體。每個燒杯中有-500或1200mL洗滌劑溶液。因為TOM杯子不含蓋子，所以有可能在TOM實驗期間收回樣品并且在洗滌期間在線分析信息。

在一個TOM實驗中，如壓載物與污物的比率和織物與洗滌液的比率的因素可以變化。因此，TOM提供了在小規(guī)模實驗(如AMSA和微型洗滌)與在全規(guī)模洗滌機中的更費時的全規(guī)模實驗之間的聯(lián)系。

在以下指定的實驗條件下進行TOM洗滌實驗：

蛋白質(zhì)測定

Protazyme AK純化活性測定：

底物：Protazyme AK片劑(AZCL-酪蛋白，麥格酶(Megazyme)T-PRAK 1000)。

溫度：37℃

測定緩沖液：50mM HEPES/NaOH，pH 7.0。

通過溫和攪拌，將Protazyme AK片劑懸浮于2.0ml 0.01％Triton X-100中。將500μl的這種懸液和500μl的測定緩沖液分散在艾本德管中并置于冰上。向冰冷管中添加20μl蛋白酶樣品(稀釋在0.01％Triton X-100中)。通過將艾本德管轉(zhuǎn)移至設(shè)定為測定溫度的艾本德恒溫混勻儀來啟動測定。將管在艾本德恒溫混勻儀上在最高振搖速率(1400rpm)下孵育15分鐘。通過將管轉(zhuǎn)移回冰浴中終止孵育。隨后將管在冰冷的離心機中離心數(shù)分鐘并將200μl上清液轉(zhuǎn)移至微量滴定板。讀取OD₆₅₀作為蛋白酶活性的量度。在測定法中包含空白緩沖液(代替酶)。

表征活性測定：

Protazyme OL表征測定：

底物：Protazyme OL片劑(AZCL-膠原，麥格酶T-PROL 1000)。

溫度：受控的(測定溫度)。

測定緩沖液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂、150mM KCl、0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0以及11.0。

通過溫和攪拌，將Protazyme OL片劑懸浮于2.0ml 0.01％Triton X-100中。將500μl的這種懸液和500μl的測定緩沖液分散在艾本德管中并置于冰上。向冰冷管中添加20μl蛋白酶樣品(稀釋在0.01％Triton X-100中)。通過將艾本德管轉(zhuǎn)移至設(shè)定為測定溫度的艾本德恒溫混勻儀來啟動測定。將管在艾本德恒溫混勻儀上在最高振搖速率(1400rpm)下孵育15分鐘。通過將管轉(zhuǎn)移回冰浴中終止孵育。隨后將管在冰冷的離心機中離心數(shù)分鐘并將200μl上清液轉(zhuǎn)移至微量滴定板。讀取OD₆₅₀作為蛋白酶活性的量度。在測定法中包含空白緩沖液(代替酶)。

實例1.來自明礬韓國生工菌的M4金屬蛋白酶的克隆和表達

該金屬蛋白酶來自明礬韓國生工菌菌株，該菌株是從2009年從中國收集的土壤樣本中分離。

來自純的培養(yǎng)物中的染色體DNA經(jīng)過純化并且經(jīng)過使用Illumina技術(shù)進行全基因組測序。組裝的基因組序列和隨后的16S核糖體亞基基因序列分析指示正確的分類學(xué)上的鑒定是作為明礬韓國生工菌的一個物種。

通過使用BLAST程序進行搜索，與來自枯草芽孢桿菌168(Uniprot P68736)的M4蛋白酶NprE比較，針對來自MEROPS家族M4的金屬蛋白酶分析基因組序列。該分析鑒定了編碼推定的M4金屬蛋白酶的基因，該基因具SEQ ID:1中給出的核苷酸序列。

編碼M4金屬蛋白酶的基因通過PCR擴增，并且與調(diào)節(jié)元件和同源區(qū)域融合，用于重組進枯草芽孢桿菌基因組。

線性整合構(gòu)建體是SOE-PCR融合產(chǎn)物(霍頓(Horton)，R.M.，亨特(Hunt)，H.D.，胡(Ho)，S.N.，皮倫(Pullen)，J.K.以及皮斯(Pease)，L.R.(1989)，不使用限制酶，通過重疊延伸的基因剪接的工程化雜種基因(Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes,gene splicing by overlap extension)基因(Gene)77:61-68))，該融合產(chǎn)物由兩個枯草芽孢桿菌染色體區(qū)域之間的基因連同強啟動子與氯霉素抗性標記的融合制備。SOE PCR方法也描述于專利申請WO 2003095658中。

在三聯(lián)啟動子系統(tǒng)(如WO 99/43835中所述)的控制下表達該基因，該啟動子系統(tǒng)由包含穩(wěn)定化序列的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)啟動子、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)啟動子和蘇云金桿菌cryIIIA啟動子組成。

用克勞氏芽孢桿菌分泌信號(編碼以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA)代替天然的分泌信號來表達該基因。

該SOE-PCR產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化進枯草芽孢桿菌中并且在染色體上通過同源重組將其整合到果膠酸裂解酶位點中。隨后將包含該整合表達構(gòu)建體的重組枯草芽孢桿菌克隆在液體培養(yǎng)基中進行生長。將培養(yǎng)液進行離心(20000x g，20min)，并且將上清液小心地與沉淀物傾析分開并且通過耐潔(Nalgene)0.2um過濾裝置進行過濾，從而去除剩下的芽孢桿菌宿主細胞。通過超濾在賽多利10kDa截留膜上濃縮0.2μm濾液至最小容積并且在G25葡聚糖凝膠柱(來自GE醫(yī)療公司)上將濃縮物轉(zhuǎn)移至20mM MES/NaOH，1mM CaCl₂，pH 6.0中。將G25轉(zhuǎn)移的蛋白酶溶液施加到在20mM MES、1mM CaCl₂、pH 6.0中平衡的桿菌肽瓊脂糖柱(來自Upfront層析公司(Upfront chromatography))上。在用平衡緩沖液充分地洗滌該柱之后，將蛋白酶用具有25％(v/v)2-丙醇的100mM H₃BO₃、10mM MES、2mM CaCl₂、1M NaCl(pH 6.0)洗脫。將洗脫峰(包含蛋白酶活性)轉(zhuǎn)移至在G25葡聚糖凝膠柱(來自GE醫(yī)療公司)上的20mM MES、2mM CaCl₂(pH 6.0)。經(jīng)G25轉(zhuǎn)移的峰是純化的制劑，并且將其用于進一步實驗。

實例2. SDS-PAGE和N-末端測序

當純化的蛋白酶制劑通過SDS-PAGE來分析并且將該凝膠用考馬斯染色時，看到了約55kDa、47kDa和8kDa的三個條帶。埃德曼降解、完整的MS和凝膠內(nèi)肽圖分析示出所有三個條帶源自M4蛋白酶，表明條帶47kDa和8kDa表示帶切口的分子，其中全長的M4蛋白酶在環(huán)上切割一次并且兩個肽鏈仍然與彼此結(jié)合并且給出完全活性的分子。條帶47kDa和8kDa的相對強度表明這兩個條帶之間的1:1摩爾比，支持了這一假設(shè)。

進行純化的蛋白質(zhì)的N-末端測序并且發(fā)現(xiàn)成熟的酶在GTGNSMY啟動，確認了該酶的身份和N-末端前肽的存在。通過質(zhì)譜進行純化的蛋白質(zhì)的完整分子量分析。該分析指示對于在對應(yīng)于多肽GTGNSMY-----LTAS(SEQ ID NO:2的氨基酸1至489)和GTGNSMY----TAET(SEQ ID NO:2的氨基酸1至414)的不同C-末端結(jié)束的純化的蛋白質(zhì)，50.8kDa和42.7kDa的兩個主要分子量形式。

實例3.明礬韓國生工菌蛋白酶在洗滌劑中的穩(wěn)定性

材料：

SpectraMax M2熒光/UV-VIS平板讀數(shù)儀

96孔nunc-平板(熒光Maxi Sorp)

PST 100HL搖床(Biosan)

酶和化學(xué)品

緩沖液：10mM MES、0.01％TritonX、1mM CaCl₂、pH 6

洗滌劑：標準B型洗滌劑

洗滌劑溶液：50％和90％(w/w)標準B型洗滌劑在milli Q水中。90％標準B型洗滌劑，具有2mM CaCl₂和2mM ZnCl₂。10％標準B型在15°dH水中。

底物溶液：一種安瓿EnzCheck-紅底物與20ml 0.3％標準B型洗滌劑在15°dH水中混合。

蛋白酶：明礬韓國生工菌0.30mg/ml在緩沖液中

0.8L產(chǎn)物，緩沖液交換至10mM MES、0.01％TritonX、1mM CaCl₂。

在標準B型洗滌劑中的蛋白酶的儲存穩(wěn)定性

基于如上文概述的標準B型洗滌劑，在不同的洗滌劑溶液中測量明礬韓國生工菌金屬蛋白酶和Neutrase的儲存穩(wěn)定性。儲存穩(wěn)定性被測量為殘余活性(參見下文)。

孵育方案：

將20μl酶溶液(如上所定義)與180μl洗滌劑溶液混合，并且在25℃下，在96孔板蓋中孵育30分鐘。作為參照，將20μl酶溶液與180μl緩沖液(在用2mM CaCl2和2mM ZnCl2的實驗的情況下，這些鹽還要被添加至對照實驗的緩沖液中)混合，并且隨后立即測量活性(測定方案參見下文)。在洗滌劑溶液中孵育后，將20μl樣品與180μl緩沖液混合，隨后將各樣品進行7次2倍稀釋。這導(dǎo)致對于各酶樣品，范圍從10X至1280X稀釋的8個濃度。這一高跨度的濃度的原因是為了確保在大約線性的測定范圍內(nèi)獲得數(shù)據(jù)。稀釋之后，將20μl樣品與80μl緩沖液和100μl底物混合并且如下文在“活性測定”下所述，進行測定。

活性測定：

來自英杰公司的可商購的EnzCheck測定試劑盒(紅色熒光)被用于量化蛋白酶殘余活性。簡言之，如上所述，將酶樣品與底物溶液在96孔微量滴定板中混合并且在25℃下測量熒光10分鐘。將激發(fā)設(shè)置為589nm并將發(fā)射設(shè)置為617nm。10分鐘以后的熒光值被用作活性測量。

從孵育后的活性(A_Inc)與對照活性(未孵育)(A_Ref)的比率計算殘余活性。

殘余活性＝(A_Inc/A_Ref)*100

結(jié)果示于下面的表中。

在測試的洗滌劑組合物中，與對照金屬蛋白酶Neutrase相比，明礬韓國生工菌蛋白酶遠遠更加穩(wěn)定。

實例4.來自明礬韓國生工菌的M4蛋白酶的AMSA洗滌性能

使用自動機械應(yīng)力測定，使用不同的液體洗滌劑，并且在不同洗滌溫度下，在不同技術(shù)污漬上，測試來自明礬韓國生工菌的M4蛋白酶的洗滌性能。

如上在AMSA中針對衣物洗滌方法所描述的，使用單循環(huán)洗滌程序，用下表中所指定洗滌劑和小塊布樣及實驗條件進行實驗。

在PC-03小塊樣布(在棉布/聚酯上的巧克力/牛奶/煙灰)上，來自明礬韓國生工菌的M4蛋白酶的性能超越了并與齊平。當將水硬度調(diào)節(jié)至30°dH時，明礬韓國生工菌蛋白酶在PC-03小塊樣布上的表現(xiàn)超越至一個甚至更大的程度，展示出了是在這些條件下(表7)的兩倍以上的性能。

在血液污漬方面，在PC-05(棉布/聚酯上的血液/牛奶/墨水)和C-05(棉布上的血液/牛奶/煙灰)上，對于這兩種血液污漬，明礬韓國生工菌金屬蛋白酶的洗滌性能，在20℃下超越了并且在40℃下示出與和類似的洗滌性能。在PC-05小塊布樣上，在兩種測試的溫度下(表7)，來自明礬韓國生工菌的M4蛋白酶的性能超越了

在雞蛋污漬方面，在CS-37(在棉布上的全蛋/色素)和CS-38(在棉布上的加熱的蛋黃/色素)上，明礬韓國生工菌金屬蛋白酶在測試的兩種溫度下均比展示出了更高的洗滌性能，并且展示了與相差不遠的洗滌性能(表8)。

在美國類型液體衣物洗滌劑中，在30℃下，來自明礬韓國生工菌的M4蛋白酶齊平或超越了在全部三種測試的污漬類型上的洗滌性能：巧克力污漬(PC-03)，血液污漬(PC-05)和雞蛋污漬(CS-37)(表9)。

出人意料地，在粉狀衣物洗滌劑中，來自明礬韓國生工菌的M4蛋白酶的洗滌性能超越了多達七倍以上。這示出其具有應(yīng)用于堿性洗滌系統(tǒng)的潛力，連同應(yīng)用于粉源洗滌劑系統(tǒng)的潛力(表10)。令人驚訝地，盡管中國的粉狀洗滌劑的洗液的堿性為堿性pH大約10.0，但是明礬韓國生工菌金屬蛋白酶仍然在PC-05(棉布/聚酯上的血液/牛奶/墨水)上給出了超過26個Δ強度單位，這比所給出的多22個Δ強度單位。

在發(fā)展中和新興(D&E)市場類型粉狀衣物洗滌劑中，在PC-05(棉布/聚酯上的血液/牛奶/墨水)上，明礬韓國生工菌金屬蛋白酶在所有測試的濃度下的洗滌性能超越了Neutrase至少17倍(表11)。明礬韓國生工菌金屬蛋白酶在以粉狀洗滌劑源洗滌溶液中的卓越洗滌性能是非常出人意料的。

在標準B型洗滌劑的標準pH(大約pH 7.5)下，在EMPA117EH(棉布/聚酯上的血液/牛奶/墨水，額外加熱)小塊布樣上，明礬韓國生工菌金屬蛋白酶展示出的洗滌性能與和的那些性能相差不遠。然而當將pH調(diào)節(jié)到9.5時，幾乎失去了全部洗滌性能而明礬韓國生工菌金屬蛋白酶的洗滌性能卻出人意料地增加了(表12)。這指示其有應(yīng)用于堿性洗滌劑系統(tǒng)中的潛力。

實例5.來自明礬韓國生工菌的M4蛋白酶的微量洗滌測定性能

使用如上所述的微量洗滌測定來評定衣物洗滌實驗中的洗滌性能。

結(jié)果示出，在C-05小塊布樣(棉布上的血液/牛奶/墨水)上，在測試的條件(表13)下，明礬韓國生工菌金屬蛋白酶超越了的性能并且具有幾乎與相同的性能。

實例6.來自明礬韓國生工菌的M4蛋白酶的TOM洗滌性能

使用如上所述的TOM洗滌測定來評定衣物洗滌實驗中的洗滌性能。

結(jié)果示出，明礬韓國生工菌金屬蛋白酶在四種污漬類型：巧克力(PC-03)、血液(C-05)、雞蛋(CS-37)和草(062KC)上的洗滌性能超越了在PC-03(在棉布/聚酯上的巧克力/牛奶/煙灰)和C-05(棉花上的血液/牛奶/墨水)的污漬上，來自明礬韓國生工菌的M4蛋白酶示出了與類似的洗滌性能。在草污漬(062KC)上，明礬韓國生工菌金屬蛋白酶展示了幾乎是兩倍的洗滌性能(表14)。

序列表

<110> 諾維信公司（Novozymes A/S）

<120> 來自明礬韓國生工菌的金屬蛋白酶和包括金屬蛋白酶的洗滌劑組合物

<130> 12917-WO-PCT

<160> 5

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 2043

<212> DNA

<213> 明礬韓國生工菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2040)

<220>

<221> 尚未歸類的特征

<222> (1)..(3)

<223> 第一個氨基酸應(yīng)該是Met，不是Val。當?shù)谝粋€密碼子

是gtg時，插入Met，盡管gtg正常編碼Val。

<220>

<221> 信號肽

<222> (1)..(60)

<220>

<221> 前肽

<222> (61)..(573)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (574)..(2040)

<400> 1

gtg gcc gtc gtc gcg gca gcg ggt ctt gcg acg act ttc acc gcc 45

Val Ala Val Val Ala Ala Ala Gly Leu Ala Thr Thr Phe Thr Ala

-190 -185 -180

tcg acc gcg ggc gcc gcc gac cgg acg gct ccg ctc cca ggc ttc 90

Ser Thr Ala Gly Ala Ala Asp Arg Thr Ala Pro Leu Pro Gly Phe

-175 -170 -165

aac cag ccg gcc gcc gtc cag gcc gag cag gcg ctg acc gcg cgg 135

Asn Gln Pro Ala Ala Val Gln Ala Glu Gln Ala Leu Thr Ala Arg

-160 -155 -150

acg gcc gcg gct ctc ggt ctc ggc acc ggc gag cag ctc aag gtc 180

Thr Ala Ala Ala Leu Gly Leu Gly Thr Gly Glu Gln Leu Lys Val

-145 -140 -135

cgc gac gtg gtg aag gac ccg gac ggc acg gag tac gtc cgc tac 225

Arg Asp Val Val Lys Asp Pro Asp Gly Thr Glu Tyr Val Arg Tyr

-130 -125 -120

gac cgc acc ttc aac ggc ctc aag gtc gtc gga ggt gac ctg atc 270

Asp Arg Thr Phe Asn Gly Leu Lys Val Val Gly Gly Asp Leu Ile

-115 -110 -105

gtc aag cgc aag ggc gag tcg atc ggc cag gtc acg tac aac cgc ggc 318

Val Lys Arg Lys Gly Glu Ser Ile Gly Gln Val Thr Tyr Asn Arg Gly

-100 -95 -90 -85

gcc aag gcc gtc gcc gtc gcc acc aag ccg acg ctg tcc cag tcg gcg 366

Ala Lys Ala Val Ala Val Ala Thr Lys Pro Thr Leu Ser Gln Ser Ala

-80 -75 -70

gcg ctc gcg aag ggt gcg caa gcc gcg gag ttc aag gcc acc ggc aac 414

Ala Leu Ala Lys Gly Ala Gln Ala Ala Glu Phe Lys Ala Thr Gly Asn

-65 -60 -55

aag ggc gag ttg gtc gtc ttc gtg acg ccg acc aag cct gtc ctg gcg 462

Lys Gly Glu Leu Val Val Phe Val Thr Pro Thr Lys Pro Val Leu Ala

-50 -45 -40

tac gag gtc gtg acc acc ggt gtg aag gct gac cag acc cct tcg gtg 510

Tyr Glu Val Val Thr Thr Gly Val Lys Ala Asp Gln Thr Pro Ser Val

-35 -30 -25

ctg cac tcg ttc atc gac gcc aag acc ggc gcc gtg ctc gac cag gac 558

Leu His Ser Phe Ile Asp Ala Lys Thr Gly Ala Val Leu Asp Gln Asp

-20 -15 -10 -5

gac gag gtc aag acc ggt acc ggc aac tcg atg tac tcc gga acc gtc 606

Asp Glu Val Lys Thr Gly Thr Gly Asn Ser Met Tyr Ser Gly Thr Val

-1 1 5 10

agc atc ggt acg tcg ggg agc tac acg atg agc gac ccg acc cgc ggc 654

Ser Ile Gly Thr Ser Gly Ser Tyr Thr Met Ser Asp Pro Thr Arg Gly

15 20 25

ggc aac tac acc acg gac ctc aac ggc tcc acc tcc ggc agc ggt acg 702

Gly Asn Tyr Thr Thr Asp Leu Asn Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Thr

30 35 40

acg ttc acc gac cct gac gac acc tgg ggc aac ggc tcg acg tcc agc 750

Thr Phe Thr Asp Pro Asp Asp Thr Trp Gly Asn Gly Ser Thr Ser Ser

45 50 55

cgc cag acc gcc ggt gtg gac gcg cat tac ggc gcc cag ctg acc tgg 798

Arg Gln Thr Ala Gly Val Asp Ala His Tyr Gly Ala Gln Leu Thr Trp

60 65 70

gac tac tac aag aac gtc cac ggc cgg aac ggc atc ttc aac aac ggc 846

Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Gly Arg Asn Gly Ile Phe Asn Asn Gly

75 80 85 90

cag ggc gcg cgg tcc cgc gtg cac tac ggc aac gcg tac gtc aac gcg 894

Gln Gly Ala Arg Ser Arg Val His Tyr Gly Asn Ala Tyr Val Asn Ala

95 100 105

ttc tgg gac ggc acc cag atg acg tac ggc gac ggc gcg agc aac gcc 942

Phe Trp Asp Gly Thr Gln Met Thr Tyr Gly Asp Gly Ala Ser Asn Ala

110 115 120

cgt ccg ctg acc tcg atc gac gtc gcc ggc cac gag atg agc cac ggc 990

Arg Pro Leu Thr Ser Ile Asp Val Ala Gly His Glu Met Ser His Gly

125 130 135

gtc acc gag gcg acc gcg aac ctc aac tac tcc ggt gat gcg ggc ggc 1038

Val Thr Glu Ala Thr Ala Asn Leu Asn Tyr Ser Gly Asp Ala Gly Gly

140 145 150

ctg aac gag gcg acc tcg gac atc ttc ggt acg gcg gtg gag ttc tcc 1086

Leu Asn Glu Ala Thr Ser Asp Ile Phe Gly Thr Ala Val Glu Phe Ser

155 160 165 170

gcg aac aac tcg tcc gac ccg ggt gac tac ctg atc ggc gag aag atc 1134

Ala Asn Asn Ser Ser Asp Pro Gly Asp Tyr Leu Ile Gly Glu Lys Ile

175 180 185

aac atc aac ggc aac ggc acg ccg ctg cgc tac atg gac aag ccg tcg 1182

Asn Ile Asn Gly Asn Gly Thr Pro Leu Arg Tyr Met Asp Lys Pro Ser

190 195 200

aag gac ggc cgc agc gtg gac tgc tgg tcg acc agc acc ggc ggc ctg 1230

Lys Asp Gly Arg Ser Val Asp Cys Trp Ser Thr Ser Thr Gly Gly Leu

205 210 215

gac ccg cac tac tcg tcc ggc ccg ctg aac cac tgg ttc tac ctg gcc 1278

Asp Pro His Tyr Ser Ser Gly Pro Leu Asn His Trp Phe Tyr Leu Ala

220 225 230

tcc gag ggc acc ggc agc aag gtc atc ggc ggc gtc acg cac agc agc 1326

Ser Glu Gly Thr Gly Ser Lys Val Ile Gly Gly Val Thr His Ser Ser

235 240 245 250

acc gcc tgc aac ggc gcg acc atc acc ggt gtc ggc cgc gac gtg gcc 1374

Thr Ala Cys Asn Gly Ala Thr Ile Thr Gly Val Gly Arg Asp Val Ala

255 260 265

gcc aag gtc tgg tac cgc acg ctc agc acc aag ctg agc tcg ggc agc 1422

Ala Lys Val Trp Tyr Arg Thr Leu Ser Thr Lys Leu Ser Ser Gly Ser

270 275 280

acc tac aag gac gcc cgc gag ggt gcg atc aac tcc gcg aag gag ctg 1470

Thr Tyr Lys Asp Ala Arg Glu Gly Ala Ile Asn Ser Ala Lys Glu Leu

285 290 295

tac ggc gcg gac tcg gcg cag tgc aag ggc atc gag gcc gcg ttc aac 1518

Tyr Gly Ala Asp Ser Ala Gln Cys Lys Gly Ile Glu Ala Ala Phe Asn

300 305 310

ggc atc tcg gtc ccg gct ggt gcg gcc gcc tgt ggt ggc ggg acc gac 1566

Gly Ile Ser Val Pro Ala Gly Ala Ala Ala Cys Gly Gly Gly Thr Asp

315 320 325 330

ccg gag ccg ccg acg ggt ggc aac ctg ctg aag aac ccg ggt ttc gag 1614

Pro Glu Pro Pro Thr Gly Gly Asn Leu Leu Lys Asn Pro Gly Phe Glu

335 340 345

tcc ggc gcg gtg gac tgg acc ggc acc gcc ggc ccg atc acc aac gac 1662

Ser Gly Ala Val Asp Trp Thr Gly Thr Ala Gly Pro Ile Thr Asn Asp

350 355 360

tcg ggc cgc ccg gcc cgg acc ggc act tgg aag ctc tgg ctc gga ggg 1710

Ser Gly Arg Pro Ala Arg Thr Gly Thr Trp Lys Leu Trp Leu Gly Gly

365 370 375

aac ggc cgc acc gtc acc gag aac gtc gga cag tcg gtc gcg atc ccg 1758

Asn Gly Arg Thr Val Thr Glu Asn Val Gly Gln Ser Val Ala Ile Pro

380 385 390

gcg tcg gcg acc agc gcg acc ctg tcg ttc tgg atc cgg atc gac acc 1806

Ala Ser Ala Thr Ser Ala Thr Leu Ser Phe Trp Ile Arg Ile Asp Thr

395 400 405 410

gcg gag acc acc tct tcg acg gtg tac gac cgg gcg ttg gtg cag atc 1854

Ala Glu Thr Thr Ser Ser Thr Val Tyr Asp Arg Ala Leu Val Gln Ile

415 420 425

gtc gac ggg tcg acc acg acc acg ctg gcg acg tac tcg aac ctg aac 1902

Val Asp Gly Ser Thr Thr Thr Thr Leu Ala Thr Tyr Ser Asn Leu Asn

430 435 440

aag aac acg tcg tac atc cag aag acg ctg aac gtg acg gcg tac aag 1950

Lys Asn Thr Ser Tyr Ile Gln Lys Thr Leu Asn Val Thr Ala Tyr Lys

445 450 455

gga aag acc gtg acg gtg aag ttc gtc ggc cag gag gac tcc tcg ctg 1998

Gly Lys Thr Val Thr Val Lys Phe Val Gly Gln Glu Asp Ser Ser Leu

460 465 470

cag acc agc ttc gtc atc gac gac acc tcc ctg acc gcg agc tga 2043

Gln Thr Ser Phe Val Ile Asp Asp Thr Ser Leu Thr Ala Ser

475 480 485

<210> 2

<211> 680

<212> PRT

<213> 明礬韓國生工菌

<400> 2

Val Ala Val Val Ala Ala Ala Gly Leu Ala Thr Thr Phe Thr Ala

-190 -185 -180

Ser Thr Ala Gly Ala Ala Asp Arg Thr Ala Pro Leu Pro Gly Phe

-175 -170 -165

Asn Gln Pro Ala Ala Val Gln Ala Glu Gln Ala Leu Thr Ala Arg

-160 -155 -150

Thr Ala Ala Ala Leu Gly Leu Gly Thr Gly Glu Gln Leu Lys Val

-145 -140 -135

Arg Asp Val Val Lys Asp Pro Asp Gly Thr Glu Tyr Val Arg Tyr

-130 -125 -120

Asp Arg Thr Phe Asn Gly Leu Lys Val Val Gly Gly Asp Leu Ile

-115 -110 -105

Val Lys Arg Lys Gly Glu Ser Ile Gly Gln Val Thr Tyr Asn Arg Gly

-100 -95 -90 -85

Ala Lys Ala Val Ala Val Ala Thr Lys Pro Thr Leu Ser Gln Ser Ala

-80 -75 -70

Ala Leu Ala Lys Gly Ala Gln Ala Ala Glu Phe Lys Ala Thr Gly Asn

-65 -60 -55

Lys Gly Glu Leu Val Val Phe Val Thr Pro Thr Lys Pro Val Leu Ala

-50 -45 -40

Tyr Glu Val Val Thr Thr Gly Val Lys Ala Asp Gln Thr Pro Ser Val

-35 -30 -25

Leu His Ser Phe Ile Asp Ala Lys Thr Gly Ala Val Leu Asp Gln Asp

-20 -15 -10 -5

Asp Glu Val Lys Thr Gly Thr Gly Asn Ser Met Tyr Ser Gly Thr Val

-1 1 5 10

Ser Ile Gly Thr Ser Gly Ser Tyr Thr Met Ser Asp Pro Thr Arg Gly

15 20 25

Gly Asn Tyr Thr Thr Asp Leu Asn Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Thr

30 35 40

Thr Phe Thr Asp Pro Asp Asp Thr Trp Gly Asn Gly Ser Thr Ser Ser

45 50 55

Arg Gln Thr Ala Gly Val Asp Ala His Tyr Gly Ala Gln Leu Thr Trp

60 65 70

Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Gly Arg Asn Gly Ile Phe Asn Asn Gly

75 80 85 90

Gln Gly Ala Arg Ser Arg Val His Tyr Gly Asn Ala Tyr Val Asn Ala

95 100 105

Phe Trp Asp Gly Thr Gln Met Thr Tyr Gly Asp Gly Ala Ser Asn Ala

110 115 120

Arg Pro Leu Thr Ser Ile Asp Val Ala Gly His Glu Met Ser His Gly

125 130 135

Val Thr Glu Ala Thr Ala Asn Leu Asn Tyr Ser Gly Asp Ala Gly Gly

140 145 150

Leu Asn Glu Ala Thr Ser Asp Ile Phe Gly Thr Ala Val Glu Phe Ser

155 160 165 170

Ala Asn Asn Ser Ser Asp Pro Gly Asp Tyr Leu Ile Gly Glu Lys Ile

175 180 185

Asn Ile Asn Gly Asn Gly Thr Pro Leu Arg Tyr Met Asp Lys Pro Ser

190 195 200

Lys Asp Gly Arg Ser Val Asp Cys Trp Ser Thr Ser Thr Gly Gly Leu

205 210 215

Asp Pro His Tyr Ser Ser Gly Pro Leu Asn His Trp Phe Tyr Leu Ala

220 225 230

Ser Glu Gly Thr Gly Ser Lys Val Ile Gly Gly Val Thr His Ser Ser

235 240 245 250

Thr Ala Cys Asn Gly Ala Thr Ile Thr Gly Val Gly Arg Asp Val Ala

255 260 265

Ala Lys Val Trp Tyr Arg Thr Leu Ser Thr Lys Leu Ser Ser Gly Ser

270 275 280

Thr Tyr Lys Asp Ala Arg Glu Gly Ala Ile Asn Ser Ala Lys Glu Leu

285 290 295

Tyr Gly Ala Asp Ser Ala Gln Cys Lys Gly Ile Glu Ala Ala Phe Asn

300 305 310

Gly Ile Ser Val Pro Ala Gly Ala Ala Ala Cys Gly Gly Gly Thr Asp

315 320 325 330

Pro Glu Pro Pro Thr Gly Gly Asn Leu Leu Lys Asn Pro Gly Phe Glu

335 340 345

Ser Gly Ala Val Asp Trp Thr Gly Thr Ala Gly Pro Ile Thr Asn Asp

350 355 360

Ser Gly Arg Pro Ala Arg Thr Gly Thr Trp Lys Leu Trp Leu Gly Gly

365 370 375

Asn Gly Arg Thr Val Thr Glu Asn Val Gly Gln Ser Val Ala Ile Pro

380 385 390

Ala Ser Ala Thr Ser Ala Thr Leu Ser Phe Trp Ile Arg Ile Asp Thr

395 400 405 410

Ala Glu Thr Thr Ser Ser Thr Val Tyr Asp Arg Ala Leu Val Gln Ile

415 420 425

Val Asp Gly Ser Thr Thr Thr Thr Leu Ala Thr Tyr Ser Asn Leu Asn

430 435 440

Lys Asn Thr Ser Tyr Ile Gln Lys Thr Leu Asn Val Thr Ala Tyr Lys

445 450 455

Gly Lys Thr Val Thr Val Lys Phe Val Gly Gln Glu Asp Ser Ser Leu

460 465 470

Gln Thr Ser Phe Val Ile Asp Asp Thr Ser Leu Thr Ala Ser

475 480 485

<210> 3

<211> 27

<212> PRT

<213> 克勞氏芽孢桿菌

<400> 3

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

1 5 10 15

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala

20 25

<210> 4

<211> 300

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢桿菌

<400> 4

Ala Ala Thr Thr Gly Thr Gly Thr Thr Leu Lys Gly Lys Thr Val Ser

1 5 10 15

Leu Asn Ile Ser Ser Glu Ser Gly Lys Tyr Val Leu Arg Asp Leu Ser

20 25 30

Lys Pro Thr Gly Thr Gln Ile Ile Thr Tyr Asp Leu Gln Asn Arg Glu

35 40 45

Tyr Asn Leu Pro Gly Thr Leu Val Ser Ser Thr Thr Asn Gln Phe Thr

50 55 60

Thr Ser Ser Gln Arg Ala Ala Val Asp Ala His Tyr Asn Leu Gly Lys

65 70 75 80

Val Tyr Asp Tyr Phe Tyr Gln Lys Phe Asn Arg Asn Ser Tyr Asp Asn

85 90 95

Lys Gly Gly Lys Ile Val Ser Ser Val His Tyr Gly Ser Arg Tyr Asn

100 105 110

Asn Ala Ala Trp Ile Gly Asp Gln Met Ile Tyr Gly Asp Gly Asp Gly

115 120 125

Ser Phe Phe Ser Pro Leu Ser Gly Ser Met Asp Val Thr Ala His Glu

130 135 140

Met Thr His Gly Val Thr Gln Glu Thr Ala Asn Leu Asn Tyr Glu Asn

145 150 155 160

Gln Pro Gly Ala Leu Asn Glu Ser Phe Ser Asp Val Phe Gly Tyr Phe

165 170 175

Asn Asp Thr Glu Asp Trp Asp Ile Gly Glu Asp Ile Thr Val Ser Gln

180 185 190

Pro Ala Leu Arg Ser Leu Ser Asn Pro Thr Lys Tyr Gly Gln Pro Asp

195 200 205

Asn Phe Lys Asn Tyr Lys Asn Leu Pro Asn Thr Asp Ala Gly Asp Tyr

210 215 220

Gly Gly Val His Thr Asn Ser Gly Ile Pro Asn Lys Ala Ala Tyr Asn

225 230 235 240

Thr Ile Thr Lys Ile Gly Val Asn Lys Ala Glu Gln Ile Tyr Tyr Arg

245 250 255

Ala Leu Thr Val Tyr Leu Thr Pro Ser Ser Thr Phe Lys Asp Ala Lys

260 265 270

Ala Ala Leu Ile Gln Ser Ala Arg Asp Leu Tyr Gly Ser Gln Asp Ala

275 280 285

Ala Ser Val Glu Ala Ala Trp Asn Ala Val Gly Leu

290 295 300

<210> 5

<211> 269

<212> PRT

<213> 克勞氏芽孢桿菌

<400> 5

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265