本發(fā)明涉及生物合成蝦紅素(astaxanthin)。更具體來說，本發(fā)明涉及以生物方法合成蝦紅素或其前驅(qū)物或衍生物。

背景技術(shù)：

類胡蘿卜素(carotenoids)是一種捕光色素(light harvesting pigments)，可用以保護光合系統(tǒng)，避免過量光照所引起的光氧化傷害。在人體中，類胡蘿卜素是可作為抗氧化劑的維生素A前驅(qū)物，已知可刺激免疫系統(tǒng)，保護個體抵抗諸如癌癥等各式疾病。自然界存在著多種類胡蘿卜素，包含蝦紅素、茄紅素(lycopene)、β-胡蘿卜素(β-carotene)、海膽酮(echinenone)、斑螯黃質(zhì)(又名角黃素，canthaxanthin)和玉米黃質(zhì)(zeaxanthin)。相較于其它種類的類胡蘿卜素而言，蝦紅素具有更顯著的抗氧化功效；因此，蝦紅素更具經(jīng)濟價值。可廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、醫(yī)療保健產(chǎn)品、化妝品和食品工業(yè)等不同領(lǐng)域。

蝦紅素(又名蝦青素，3,3'-二羥基-β-胡蘿卜素-4,4'-二酮，3,3'-dihydroxy-β-carotene-4,4'-dione，圖1)是一種類胡蘿卜色素，賦予某些鳥類、甲殼類動物和鮭魚獨特的顯色。蝦紅素的抗氧化力是維生素E的500倍以上，且是其它類胡蘿卜素的10倍以上。已知氧化壓力會導(dǎo)致風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、帕金森氏癥、阿茲海默癥、癌癥和中風(fēng)。許多研究指出，蝦紅素具有促進(jìn)保健功效，不僅可用于預(yù)防且可治療各式疾病，例如癌癥、慢性發(fā)炎疾病、代謝癥候群、糖尿病、糖尿病腎病變、心血管疾病、胃腸道疾病、肝臟疾病、神經(jīng)退化性疾病、眼部疾病、皮膚疾病、運動性疲勞、雄性不孕癥和氯化汞引發(fā)的急性腎衰竭，增強免疫力并減少罹患動脈粥狀硬化的風(fēng)險。

在各式類胡蘿卜素產(chǎn)品中，蝦紅素是價格最高的產(chǎn)品。巿售蝦紅素多由化學(xué)方法合成(亦即，石化合成法)，其商業(yè)用途主要是作為養(yǎng)殖鮭魚和鱒魚用的飼料添加劑?；瘜W(xué)合成和天然合成的蝦紅素，雖具有大致相同的化學(xué)式，但二者的分子特性卻截然不同；該不同之處賦予了天然蝦紅素較佳的安全性及抗氧化功效。此外，化學(xué)合成的蝦紅素在醫(yī)藥巿場上接受度很低，原因如下：

第一，幾何異構(gòu)物的形式會影響合成蝦紅素的吸收。化學(xué)合成的蝦紅素具有Z形式的構(gòu)型(順式異構(gòu)型，cis-isomeric)，該結(jié)構(gòu)的蝦紅素?zé)o法被動物體吸收，因此，美國食品藥物管理局(U.S.Food and Drug Administration,FDA)已禁止其販賣使用(表1)。相較之下，98％的天然蝦紅素系為E形式的構(gòu)型(反式異構(gòu)型，trans-isomer)(表1)。

表1.不同來源的蝦紅素的幾何異構(gòu)物和立體異構(gòu)物

GEM:遺傳工程微生物

第二，蝦紅素具有三種構(gòu)型異構(gòu)體，其構(gòu)型是利用分子結(jié)構(gòu)中的二個氫氧基來區(qū)分，包含二種鏡像異構(gòu)物(enantiomer，即3R,3’R及3S,3’S)和一種內(nèi)消旋型異構(gòu)物(mesoform，即3R,3’S，圖1)，各異構(gòu)物皆具有位于C-3和C-3’的二個手性中心。相較于3R,3’R立體異構(gòu)物，3S,3’S立體異構(gòu)物的抗氧化功效更為顯著；3R,3’S內(nèi)消旋型異構(gòu)物則不具有任何抗氧化功效。化學(xué)合成蝦紅素通常是一種同時包含3S,3’S、3R,3’S及3R,3’R的混合物(比例約為1:2:1)；相較之下，源自藻類的天然蝦紅素則主要為3S,3’S形式的立體異構(gòu)物(表1)。

第三，游離形式(或稱自由形式，free form)的合成蝦紅素非常容易進(jìn)行氧化反應(yīng)。天然蝦紅素常與蛋白質(zhì)接合，或與一或二種脂肪酸產(chǎn)生酯化反應(yīng)而形成單酯體(monoester)或雙酯體(diester)；酯化蝦紅素相較于游離形式更易被人體吸收。此外，源自藻類(例如雨生紅球藻，Haematococcus pluvialis)的天然蝦紅素較于合成蝦紅素更適于作為自由基清除劑(free radical scavenger)和抗氧化劑。

蝦紅素為具有應(yīng)用潛力的功能性食物和醫(yī)藥成分，并可做為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的食用色素添加劑等。由于天然蝦紅素(特別是3S,3’S型的酯化蝦紅素)無法由化學(xué)合成所取代，科學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域亟欲發(fā)展生物合成法，在一適當(dāng)?shù)纳锓磻?yīng)器內(nèi)建立一套類胡蘿卜素的生合成方法，據(jù)以生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品。本發(fā)明即是利用已知的類胡蘿卜素生物合成路徑(圖2a及2b)來建立一可生產(chǎn)高價值蝦紅素(例如3S,3’S型的酯化蝦紅素)的生物細(xì)胞工廠。已知多種包含鮭魚、蝦、藻類、植物、紅發(fā)夫酵母(Phaffia rhodozyma；Xanthophyllomyces dendrorhous)和基因工程微生物，皆可用以制備不同形式的蝦紅素及其衍生物。然而，該些生物工廠往往受限于宿主本身的生產(chǎn)條件，例如飼養(yǎng)于冷水的魚和蝦僅能產(chǎn)生低濃度的蝦紅素、植物系統(tǒng)則會進(jìn)行非預(yù)期的酮化反應(yīng)(ketolation)、紅發(fā)夫酵母生產(chǎn)的最終產(chǎn)物抗氧化活性過低，以及飼養(yǎng)藻類時需要大土地面積和很長時間。

有鑒于此，相關(guān)領(lǐng)域亟需一種可用以穩(wěn)定生物合成蝦紅素的新穎方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明內(nèi)容旨在提供本公開內(nèi)容的簡化摘要，以使閱讀者對本公開內(nèi)容具備基本的理解。此發(fā)明內(nèi)容并非本公開內(nèi)容的完整概述，且其用意并非在指出本發(fā)明實施例的重要/關(guān)鍵組件或界定本發(fā)明的范圍。

本公開內(nèi)容旨在提供一用以生物合成蝦紅素、蝦紅素前驅(qū)物或蝦紅素衍生物的重組多核苷酸序列、載體、宿主細(xì)胞及方法。基于蝦紅素和/或其前驅(qū)物或衍生物的抗氧化功效，本公開內(nèi)容亦提供一種用以改善宿主細(xì)胞對壓力的耐受性的方法，以及一種用以增加宿主細(xì)胞制備乙醇或漿果赤霉素III(baccatin III)的產(chǎn)量的方法。

本公開內(nèi)容的第一方面是關(guān)于一種用以在宿主細(xì)胞中，制備蝦紅素或其前驅(qū)物或衍生物的重組多核苷酸序列。該重組多核苷酸序列包含四組基因組：(1)第一基因組，其系包含第一啟動子及可操作式地連結(jié)至該第一啟動子的第一核酸序列，其中該第一核酸序列系用以編碼一焦磷酸香葉香葉酯合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPP synthase)；(2)第二基因組，其系包含第二啟動子及可操作式地連結(jié)至該第二啟動子的第二核酸序列，其中該第二核酸序列系用以編碼3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl–coenzyme A reductase，HMG-CoA reductase，以下簡稱HMG-CoA還原酶)；(3)第三基因組，其系包含第三啟動子及可操作式地連結(jié)至該第三啟動子的第三核酸序列，其中該第三核酸序列系用以編碼八氫茄紅素去飽合酶(phytoene desaturase)；以及(4)第四基因組，其系包含第四啟動子及可操作式地連結(jié)至該第四啟動子的第四核酸序列，其中該第四核酸序列系用以編碼具有八氫茄紅素合成酶(phytoene synthase)和茄紅素環(huán)化酶(lycopene cyclase)個別功能的雙功能酶。所述重組多核苷酸序列中各基因組的3’端序列與位于其下游的下一組基因組的5’端序列彼此為相互同源序列，其順序皆可調(diào)動。

依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，第一核酸序列為一包含序列編號：1的序列的crtE基因，第二核酸序列為包含序列編號：2的序列的HMG1基因，第三核酸序列為包含序列編號：3的序列的crtI基因，而第四核酸序列則為包含序列編號：4的序列的crtYB基因。

依據(jù)本公開內(nèi)容某些實施方式，生物制成的蝦紅素是3S,3S’-蝦紅素。依據(jù)本公開內(nèi)容其它實施方式，生物制成的蝦紅素是3R,3R’-蝦紅素。

依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，蝦紅素的前驅(qū)物可以是焦磷酸香葉香葉酯(geranylgeranyl-pyrophosphate,GGPP)、尼基葉黃素(phenicoxanthin)、茄紅素(lycopene)、海膽酮(echinenone)、斑螯黃質(zhì)(又名角黃素，canthaxanthin)、八氫西紅柿紅素(phytoene)、玉米黃質(zhì)(zeaxanthin)、β-隱黃素(β-cryptoxanthin)或β-胡蘿卜素(β-carotene)。依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施方式，蝦紅素的衍生物可以是蝦紅素單酯體(monoester)或蝦紅素雙酯體(diester)。

在本公開內(nèi)容某些實施方式中，重組多核苷酸序列進(jìn)一步包含第五基因組和第六基因組。第五基因組包含第五啟動子及可操作式地連結(jié)至該第五啟動子的第五核酸序列，其中該第五核酸序列系用以編碼β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotene hydroxylase)。第六基因組則包含第六啟動子及一可操作式地連結(jié)至該第六啟動子的第六核酸序列，其中該第六核酸序列系用以編碼β-胡蘿卜素酮醇酶(β-carotene ketolase)。

依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，第五核酸序列為包含序列編號：5、6或7的序列的chYb基因；而第六核酸序列則為包含序列編號：8的序列的bkt基因。

依據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式，第一至第六啟動子系分別選自由ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子所組成的群組。較佳情況是，第一至第六啟動子系為不同的啟動子，其順序皆可調(diào)動。

在本公開內(nèi)容其它實施方式中，除了第一、第二、第三和第四基因組外，重組多核苷酸序列進(jìn)一步包含第七基因組和第八基因組。第七基因組包含第七啟動子及可操作式地連結(jié)至該第七啟動子的第七核酸序列，其中該第七核酸序列系用以編碼P450還原酶(P450reductase)。第八基因組包含第八啟動子及可操作式地連結(jié)至該第八啟動子的第八核酸序列，其中該第八核酸序列系用以編碼β-胡蘿卜素氧化酶(β-carotene oxygenase)。

依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，第七核酸序列為包含序列編號：9的序列的crtR基因；而第八核酸序列則為包含序列編號：10的序列的crtS基因。

依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施方式，第一、第二、第三、第四、第七和第八啟動子系分別選自由ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子所組成的群組。較佳的情況是，第一、第二、第三、第四、第七和第八啟動子系為不同的啟動子，其順序皆可調(diào)動。

在本公開內(nèi)容某些實施方式中，重組多核苷酸序列進(jìn)一步包含一篩選標(biāo)記基因組，其系包含篩選標(biāo)記啟動子及可操作式地連結(jié)至該篩選標(biāo)記啟動子的篩選標(biāo)記基因。

本公開內(nèi)容的第二方面是關(guān)于一種用以在宿主細(xì)胞中，制備蝦紅素或其前驅(qū)物或衍生物的重組載體。該重組載體包含上述任一種重組多核苷酸序列，以及可操作式地連結(jié)至該重組多核苷酸序列的控制序列(control sequence)，據(jù)以表達(dá)本發(fā)明重組多核苷酸序列。

本公開內(nèi)容的第三方面是關(guān)于一種用以制備蝦紅素或其前驅(qū)物或衍生物的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞包含本公開內(nèi)容所述的任一種重組多核苷酸序列或重組載體。因應(yīng)不同的重組多核苷酸序列或重組載體，生物制成的蝦紅素可以是3S,3S’-蝦紅素或3R,3R’-蝦紅素。蝦紅素的前驅(qū)物可以是焦磷酸香葉香葉酯、尼基葉黃素、茄紅素、海膽酮、斑螯黃質(zhì)、八氫西紅柿紅素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃素或β-胡蘿卜素。蝦紅素的衍生物可以是蝦紅素單酯體或蝦紅素雙酯體。

在任選的實施方式中，宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。

本公開內(nèi)容的第四方面是關(guān)于一種用以制備蝦紅素或其前驅(qū)物或衍生物的方法。依據(jù)更多的實施方式，本發(fā)明方法包含將上述宿主細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)液中，其中該培養(yǎng)液包含一種選自由葡萄糖、半乳糖、甘油和脂肪酸所組成的群組的成分，藉以制備蝦紅素或其前驅(qū)物或衍生物。在一特定實施方式中，該培養(yǎng)液包含0.5-40％甘油(glycerol)。在另一特定實施方式中，該培養(yǎng)液包含0.001-5％脂肪酸，例如辛酸(octanoic acid)。

本公開內(nèi)容的第五方面是關(guān)于一種用以改善宿主細(xì)胞對壓力的耐受性的方法。該方法包含將本公開內(nèi)容的重組多核苷酸序列和/或重組載體引入宿主細(xì)胞中。依據(jù)一實施方式，壓力可以是來自于宿主細(xì)胞被暴露在乙醇、異丁醇(butanol)、紫外光照射、糠醛(furfural)或藥物前驅(qū)物下所造成。依據(jù)一實施方式，該藥物前驅(qū)物可以是10-去乙酰漿果赤霉素III(10-deacetyl baccatin III,10DB)。

本公開內(nèi)容的第六方面則是關(guān)于一種用以增加宿主細(xì)胞制備乙醇或漿果赤霉素III的產(chǎn)量的方法。該方法包含將本公開內(nèi)容的重組多核苷酸序列和/或重組載體引入宿主細(xì)胞中。

在參閱下文實施方式后，本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者當(dāng)可輕易了解本發(fā)明的基本精神和其它發(fā)明目的，以及本發(fā)明所采用的技術(shù)手段與實施方式。

附圖說明

為讓本發(fā)明的上述與其它目的、特征、優(yōu)點與實施例能更明顯易懂，所附圖說明如下：

圖1是分別用以繪示3S,3’S-蝦紅素(上圖)、3R,3’R-蝦紅素(中圖)及3R,3’S-蝦紅素(下圖)的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2a和2b是用以繪示類胡蘿卜素生物合成路徑的示意圖；

圖3是關(guān)于本發(fā)明用以生物合成3S,3’S-蝦紅素的示意圖；

圖4a是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的序列比對數(shù)據(jù)，其系關(guān)于HMG-CoA還原酶(HMG-CoA reductase)的保留性區(qū)域(conserved region)，并以底線標(biāo)注其催化域(catalytic domain)1-6；其中，在圖中7208代表由馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)分離的HMG-CoA還原酶，P12683代表由啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)分離的HMG-CoA還原酶，ACN40476代表由史特卡云杉(Picea sitchensis)分離的HMG-CoA還原酶，XP_001211323代表由土曲霉(Aspergillus terreus)分離的HMG-CoA還原酶，而ABY84848則代表由靈芝(Ganoderma lucidum)分離的HMG-CoA還原酶；

圖4b是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于HMG-CoA還原酶的催化域1-6中的保留性殘基，并以底線標(biāo)注該些保留性殘基；

圖5a是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的序列比對數(shù)據(jù)，其系關(guān)于焦磷酸香葉香葉酯合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPP synthase)的保留性區(qū)域，并以底線標(biāo)注其催化域1-3；其中，AAY33921代表由紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)分離的焦磷酸香葉香葉酯合成酶，NP_624521代表由天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)分離的焦磷酸香葉香葉酯合成酶，BAB99565代表由谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)分離的焦磷酸香葉香葉酯合成酶，ZP_00056752代表由嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)分離的焦磷酸香葉香葉酯合成酶，而NP_696587則代表由雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)分離的焦磷酸香葉香葉酯合成酶；

圖5b是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于焦磷酸香葉香葉酯合成酶的催化域1-2中的保留性殘基，并以底線標(biāo)注該些保留性殘基；

圖6是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于包含本發(fā)明重組多核苷酸序列的基因工程菌株Xd3.0，其中該重組多核苷酸序列包含3組基因組(即crtE-Kan-tHMG1)；

圖7a是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的序列比對數(shù)據(jù)，其系關(guān)于茄紅素環(huán)化酶(lycopene cyclase)的保留性區(qū)域，并以底線標(biāo)注其催化域1-2；其中，CAB51949代表由紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)分離的茄紅素環(huán)化酶，XP_762434代表由玉米黑穗菌521(Ustilago maydis 521)分離的茄紅素環(huán)化酶，NP_344223代表由硫化葉菌P2(Sulfolobus solfataricus P2)分離的茄紅素環(huán)化酶，而YP_024312則代表由嗜苦古菌(Picrophilus torridus)分離的茄紅素環(huán)化酶；

圖7b是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于茄紅素環(huán)化酶的催化域1-2中的保留性殘基，并以底線標(biāo)注該些保留性殘基；

圖7c是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的序列比對數(shù)據(jù)，其系關(guān)于反-異戊烯焦磷酸合成酶合成酶(trans-isoprenyl diphosphate synthase)的保留性區(qū)域，并以底線標(biāo)注其催化域1-2；其中，CAB51949代表由紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)分離的反-異戊烯焦磷酸合成酶合成酶，NP_279693代表由嗜鹽菌NRC-1(Halobacterium sp.NRC-1)分離的反-異戊烯焦磷酸合成酶合成酶，NP_681887代表由嗜熱藻BP-1(Thermosynechococcus elongatus BP-1)分離的反-異戊烯焦磷酸合成酶合成酶，而ZP_00089878則代表由棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)分離的反-異戊烯焦磷酸合成酶合成酶；

圖7d是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于反-異戊烯焦磷酸合成酶合成酶的催化域1-2中的保留性殘基，并以底線標(biāo)注該些保留性殘基；

圖8a是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的序列比對數(shù)據(jù)，其系關(guān)于八氫茄紅素去飽合酶(phytoene desaturase)的保留性區(qū)域，并以底線標(biāo)注其NAD(P)-結(jié)合羅斯曼相似區(qū)域(NAD(P)-binding Rossmann-like domain)；其中，AAO53257代表由紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)分離的八氫茄紅素去飽合酶，CAE07416代表由聚球藻WH 8102(Synechococcus sp.WH 8102)分離的八氫茄紅素去飽合酶，BAA10798代表由集胞藻PCC 6803(Synechocystis sp.PCC 6803)分離的八氫茄紅素去飽合酶，BAB73763代表由念珠藻PCC 7120(Nostoc sp.PCC 7120)分離的八氫茄紅素去飽合酶，而AAL91366則代表由西紅柿(Solanum lycopersicum)分離的八氫茄紅素去飽合酶；

圖8b是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于八氫茄紅素去飽合酶的NAD(P)-結(jié)合羅斯曼相似區(qū)域中的保留性殘基，并以底線標(biāo)注該些保留性殘基；

圖9是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于包含本發(fā)明重組多核苷酸序列的基因工程菌株Xd5.0，其中該重組多核苷酸序列包含5組基因組(即crtI-crtE-Kan-crtYB-tHMG1)；

圖10a和10b是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的序列比對數(shù)據(jù)，其系關(guān)于β-胡蘿卜素加氧酶(β-carotene oxygenase)的保留性區(qū)域，并以底線標(biāo)注其催化域1-3；其中，AAY33921代表由紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)分離的β-胡蘿卜素加氧酶，Q08477代表由智人(Homo sapiens)分離的β-胡蘿卜素加氧酶，P33274代表由褐家鼠(Rattus norvegicus)分離的β-胡蘿卜素加氧酶，P11707代表由家兔(Oryctolagus cuniculus)分離的β-胡蘿卜素加氧酶，而P33270則代表由果蠅(Drosophila melanogaster)分離的β-胡蘿卜素加氧酶；

圖10c是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于β-胡蘿卜素加氧酶的催化域1-3中的保留性殘基，并以底線標(biāo)注該些保留性殘基；

圖11a和11b是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的序列比對數(shù)據(jù)，其系關(guān)于P450還原酶(P450reductase)的保留性區(qū)域，并以底線分別標(biāo)注其黃素氧化還原蛋白域(flavodoxin domain)和NADPH細(xì)胞色素p450還原酶域(NADPH cytochrome p450reductase domain)；其中，ACI43097代表由紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)分離的P450還原酶，Q00141代表由黑曲菌(Aspergillus niger)分離的P450還原酶，NP_596046代表由粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)分離的P450還原酶，XP_001731494代表由球形馬拉色菌CBS 7966(Malassezia globosa CBS 7966)分離的P450還原酶，而XP_762420則代表由玉米黑穗菌521(Ustilago maydis 521)分離的P450還原酶；

圖11c是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于P450還原酶的黃素氧化還原蛋白區(qū)域1-4中的保留性殘基，并以底線標(biāo)注該些保留性殘基；

圖11d依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于NADPH細(xì)胞色素p450還原酶域1-5中的保留性殘基，并以底線標(biāo)注該些保留性殘基；

圖12是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于包含本發(fā)明重組多核苷酸序列的基因工程菌株Xd7-3，其中該重組多核苷酸序列包含 7組基因組(即crtI-crtR-crtE-Kan-crtS-crtYB-tHMG1)；

圖13a是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例的照片，其系關(guān)于特定菌株于瓊脂培養(yǎng)基(agar plate)培養(yǎng)10代后的表型(phenotype)；

圖13b是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的用以建構(gòu)重組多核苷酸序列的示意圖；

圖13c是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例的凝膠電泳(gel electrophoresis)照片，其該凝膠電泳中的DNA片段是由特定菌株萃出后，利用菌落聚合酶連鎖反應(yīng)(colony polymerase chain reaction,colony PCR)擴增(amplify)后的DNA產(chǎn)物；

圖14a是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的序列比對數(shù)據(jù)，其系關(guān)于β-胡蘿卜素酮醇酶(β-carotene ketolase)的保留性區(qū)域，并以底線標(biāo)注其催化域1-4；其中，XP_001698699代表由萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)分離的β-胡蘿卜素酮醇酶，BAB74888代表由珠藻PCC 7120(Nostoc sp.PCC 7120)分離的β-胡蘿卜素酮醇酶，NP_924674代表由無類囊體藍(lán)藻PCC 7421(Gloeobacter violaceus PCC 7421)分離的β-胡蘿卜素酮醇酶，ABB25938代表由聚球藻CC9902(Synechococcus sp.CC9902)分離的β-胡蘿卜素酮醇酶，而CAE07883則代表由聚球藻WH 8102(Synechococcus sp.WH 8102)分離的β-胡蘿卜素酮醇酶；

圖14b是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于β-胡蘿卜素酮醇酶的催化域1-4中的保留性殘基，并以底線標(biāo)注該些保留性殘基；

圖15a是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的序列比對數(shù)據(jù)，其系關(guān)于β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotene hydroxylase)的保留性區(qū)域，并以底線標(biāo)注其催化域1-2；其中，XP_001698698代表由萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)分離的β-胡蘿卜素羥化酶，ABS50237代表由小球藻(Chromochloris zofingiensis)分離的β-胡蘿卜素羥化酶，而Q9SPK6則代表由雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)分離的β-胡蘿卜素羥化酶；

圖15b是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于β-胡蘿卜素羥化酶的催化域1-2中的保留性殘基，并以底線標(biāo)注該些保留性殘基；

圖16a是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于包含本發(fā)明重組多核苷酸序列的基因工程菌株Cr1，其中該重組多核苷酸序列包含 7組基因組(即crtI-crtE-CrChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1)；

圖16b是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于包含本發(fā)明重組多核苷酸序列的基因工程菌株Hp9，其中該重組多核苷酸序列包含 7組基因組(即crtI-crtE-HpChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1)；

圖16c是依據(jù)本公開內(nèi)容再另一實施例所繪示的示意圖，其系關(guān)于包含本發(fā)明重組多核苷酸序列的基因工程菌株Cz5，其中該重組多核苷酸序列包含 7組基因組(即crtI-crtE-CzChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1)；

圖17a是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所提供的包含特定菌株的培養(yǎng)液照片；

圖17b是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所提供的包含特定菌株的培養(yǎng)液照片；

圖17c是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的特定菌株的生長曲線圖；

圖17d是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的曲線圖，其系利用光譜分析試驗來測量類胡蘿卜素的紫外光/可見光(UV/V)全光譜；

圖18a和18b是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)結(jié)果，該結(jié)果是利用HPLC光譜分析試驗、于UV450納米波段來測量特定菌株；其中1代表游離形式的斑螯黃質(zhì)，6代表游離形式的β-胡蘿卜素，而2、3、4、5、7和8則代表未知高峰；

圖19a是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所提供的特定菌株的照片；

圖19b是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所提供的在不同溫度下培養(yǎng)特定菌株的培養(yǎng)液照片；

圖19c是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的基因表達(dá)柱狀圖；

圖20a和20b是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的特定菌株于UV450納米波段的HPLC結(jié)果；

圖21a是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所提供的包含特定菌株和成分的培養(yǎng)液照片；

圖21b是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所提供的包含CA6-ITS菌株和成分的培養(yǎng)液照片；

圖22是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的液相層析法－質(zhì)譜法(liquid chromatography–mass spectrometry,LC/MS)分析結(jié)果，其系將化合物皂化(saponification)后，利用LC/MS于UV460納米波段來進(jìn)行分析；

圖23a是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的柱狀圖，其系關(guān)于特定菌株的自由基清除比例，其中該比例是利用抗氧化能力試驗，并以2,2'-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid),ABTS)作為受質(zhì)來定量；

圖23b是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的柱狀圖，其系關(guān)于水溶性維生素E相似物等量抗氧化能力(Trolox equivalent antioxidant capacity,TEAC)試驗結(jié)果；

圖24a是依據(jù)本公開另一實施例所繪示的包含8組基因組的重組多核苷酸序列示意圖；

圖24b是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的CA6-ITS菌株的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)示意圖，其中該CA6-ITS菌株包含7組基因組；

圖24c是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的相對基因表達(dá)柱狀圖，其中萃取特定菌株的各基因的RNA，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)放大分析；

圖24d是依據(jù)本公開另一實施例所繪示的載體RS426示意圖，其中該RS426載體為多拷貝數(shù)(high copy number)載體，且包含本發(fā)明重組多核苷酸序列；

圖24e是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所提供的電泳圖照片；

圖24f是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的利用HPLC分析由CA6-ITS菌株制備的蝦紅素的分析結(jié)果；

圖25a和25b是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所提供的包含特定菌株和成分的培養(yǎng)液照片；

圖26a是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的利用液相層析法－質(zhì)譜法于UV460納米波段所分析的超高效液相層析(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC)結(jié)果；

圖26b是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的利用液相層析法－質(zhì)譜法于UV460納米波段所分析的質(zhì)譜分析結(jié)果；

圖27是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所提供的野生型或Cz30菌株的照片，其中該些菌株是分別以(a)紫外光照射，(b)糠醛，(c)乙醇和(d)丁醇進(jìn)行處理；

圖28a是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的野生型和Cz30菌株的細(xì)胞密度柱狀圖，其中該些菌株是分別以不同濃度的乙醇進(jìn)行處理；

圖28b是依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施例所繪示的野生型和Cz30菌株的細(xì)胞密度及乙醇產(chǎn)量圖，其中該些菌株是分別培養(yǎng)于包含20％半乳糖的YPG培養(yǎng)液中；左側(cè)y軸代表細(xì)胞密度，右側(cè)y軸代表乙醇產(chǎn)量，x軸則代表時間；

圖29a是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所提供的野生型或Cz30菌株的照片，其中該些菌株是分別以溶于特定濃度的乙醇的10-去乙酰漿果赤霉素III來進(jìn)行處理；

圖29b是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的野生型或Cz30菌株的細(xì)胞密度柱狀圖，其中該些菌株是分別以溶于特定濃度的乙醇的10-去乙酰漿果赤霉素III來進(jìn)行處理；

圖30是依據(jù)本公開內(nèi)容一實施例所繪示的野生型或Cz30菌株的生長曲線圖，其中該些菌株是分別以(a)0.8mM的溶于4％乙醇的10-去乙酰漿果赤霉素III，和(b)1.2mM的溶于6％乙醇的10-去乙酰漿果赤霉素III進(jìn)行處理；以及

圖31是關(guān)于漿果赤霉素III于特定菌株中的生物轉(zhuǎn)換(bio-conversion)。

根據(jù)慣常的作業(yè)方式，圖中各種特征與組件并未依比例繪制，其繪制方式是為了以最佳的方式呈現(xiàn)與本發(fā)明相關(guān)的具體特征與組件。

實施方式

為了使本公開內(nèi)容的敘述更加詳盡與完備，下文針對本發(fā)明的實施方式與具體實施例提出說明性的描述；但這并非實施或運用本發(fā)明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特征以及用以建構(gòu)與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其它具體實施例來達(dá)成相同或均等的功能與步驟順序。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學(xué)與技術(shù)詞匯的含義與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

在不和上下文沖突的情形下，本說明書所用的單數(shù)名詞涵蓋該名詞的復(fù)數(shù)型；而所用的復(fù)數(shù)名詞時亦涵蓋該名詞的單數(shù)型。

雖然用以界定本發(fā)明較廣范圍的數(shù)值范圍與參數(shù)皆是約略的數(shù)值，此處已盡可能精確地呈現(xiàn)具體實施例中的相關(guān)數(shù)值。然而，任何數(shù)值本質(zhì)上不可避免地含有因個別測試方法所致的標(biāo)準(zhǔn)偏差。在此處，「約」通常系指實際數(shù)值在一特定數(shù)值或范圍的正負(fù)10％、5％、1％或0.5％之內(nèi)?；蛘呤?，「約」一詞代表實際數(shù)值落在平均值的可接受標(biāo)準(zhǔn)誤差之內(nèi)，視本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者的考慮而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當(dāng)可理解此處所用的所有范圍、數(shù)量、數(shù)值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數(shù)量比例和其它相似者)均經(jīng)過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利范圍所公開的數(shù)值參數(shù)皆為約略的數(shù)值，且可視需求而更動。至少應(yīng)將這些數(shù)值參數(shù)理解為所指出的有效位數(shù)與套用一般進(jìn)位法所得到的數(shù)值。在此處，將數(shù)值范圍表示成由一端點至另一段點或介于二端點之間；除非另有說明，此處所述的數(shù)值范圍皆包含端點。

在本說明書中，「控制序列」(control sequence)一詞系指可調(diào)控編碼序列(coding sequence)的多核苷酸序列，其中該編碼序列系可操作式地連接至該控制序列?？刂菩蛄械奶匦詴浪拗魃矬w的差異而有所不同。在原核生物體中，控制序列通常包含啟動子(promoter)、核醣體結(jié)合位置(ribosomal binding site)和終止子(terminator)。在真核生物體中，控制序列通常包含啟動子、終止子和促進(jìn)子(enhancer)或緘默子(silencer)?！缚刂菩蛄小?control sequence)一詞包含最少量的可調(diào)控編碼序列表達(dá)的所有組件，亦包含其它可增加或控制特定基因的表達(dá)時間、表達(dá)量和表達(dá)位置的附加組件。在某些實施方式中，「控制序列」(control sequence)包含特定啟動子以外的調(diào)控組件。

「啟動子」(promoter)一詞在本說明書系指一合成或融合的分子或其衍生物，可據(jù)以活化或增加細(xì)胞、組織或器官的核酸序列的表達(dá)。

「核酸序列」(nucleic acid sequence)、「多核苷酸」(polynucleotide)或「核酸」(nucleic acid)在本說明書中可交替使用，可指雙股脫氧核糖核酸(deoxyribonuclic acid,DNA)、單股DNA或所述DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如核糖核酸分子，ribonucleic acid，RNA)。需知本公開內(nèi)容無關(guān)乎自然界或自然狀態(tài)下的基因多核苷酸序列。能用以分離或純化(或部份純化)本發(fā)明的核酸、多核苷酸或核苷酸序列的方法包含，但不限于離子交換色層分析(ion-exchange chromatography)、分子篩選色層分析(molecular size exclusion chromatography)或是可用于基因工程技術(shù)諸如擴增(amplification)、扣除雜交法(subtractive hybridization)、克隆(cloning)、亞克隆(sub-cloning)、化學(xué)合成(chemical synthesis)或其組合等基因工程技術(shù)。

「序列相同性」(sequence identity)一詞在此是指二條或多條序列或次序列在進(jìn)行比較或比對時的最大對應(yīng)值，其中該些序列或次序列系相同或具有一特定比例的相同的氨基酸殘基或核苷酸。為取得相同百分比，該些序列是以最佳化的比對方式進(jìn)行比對(例如，可在第一氨基酸序列中插入或刪去間隙，使其與第二氨基酸序列比對時可達(dá)最大序列相同性)。再比對位于對應(yīng)位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢门c第二序列中相對應(yīng)的位置具有相同的氨基酸殘基或核苷酸時，則該位置的二個分子系為相同。二條序列的相同百分比是序列間相同位置的數(shù)量函數(shù)(即，相同百分比＝相同位置的數(shù)量/位置的總數(shù)量(例如，兩兩排列的位置數(shù)量)×100)。在某些實施方式中，二條序列具有相同的長度。用來比對序列的方法是相關(guān)領(lǐng)域人士所熟知的，例如GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。

如上所述，目前以生物方式合成蝦紅素仍有諸多限制，利用生物合成蝦紅素的成本明顯高出化學(xué)合成許多。然而，化學(xué)合成往往會導(dǎo)致環(huán)境污染，且合成產(chǎn)物不易保存，亦不易被人體所吸收。有鑒于此，本發(fā)明旨在提供一種策略(圖3)，能有效且大量地于宿主細(xì)胞中制備蝦紅素或其前驅(qū)物或衍生物。相較于傳統(tǒng)方法(例如基因工程微生物)或化學(xué)合成，本發(fā)明策略具有4項優(yōu)勢：(1)可合成較高量的前驅(qū)物，(2)較短的代謝路徑，(3)最終產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)具有生物活性，以及(4)酯化形式易于吸收。

具體來說，本公開內(nèi)容提供重組多核苷酸序列，其系用以編碼數(shù)種調(diào)控生物合成蝦紅素的多條勝肽；包含本發(fā)明重組多核苷酸序列的載體；包含本發(fā)明重組多核苷酸序列和/或載體的宿主細(xì)胞；以及一種利用本發(fā)明宿主細(xì)胞來生物合成蝦紅素或其前驅(qū)物或衍生物的方法?；谖r紅素和/或其前驅(qū)物或衍生物的抗氧化功效，本公開內(nèi)容亦提供一種用以改善宿主細(xì)胞對壓力的耐受度的方法，以及一種用以增加宿主細(xì)胞制備乙醇或漿果赤霉素III的產(chǎn)量的方法。

本發(fā)明制備出的蝦紅素可以是3S,3S’-蝦紅素或3R,3R’-蝦紅素。蝦紅素的前驅(qū)物可以是焦磷酸香葉香葉酯(geranylgeranyl-pyrophosphate)、尼基葉黃素(phenicoxanthin)、茄紅素(lycopene)、海膽酮(echinenone)、斑螯黃質(zhì)(canthaxanthin)、八氫西紅柿紅素(phytoene)、玉米黃質(zhì)(zeaxanthin)、β-隱黃素(β-cryptoxanthin)或β-胡蘿卜素(β-carotene)。蝦紅素的衍生物可以是蝦紅素單酯體(monoester)或蝦紅素雙酯體(diester)。

1.重組多核苷酸序列

本公開內(nèi)容的第一方面是關(guān)于一重組多核苷酸序列，其中重組多核苷酸序列是依據(jù)以啟動子為基礎(chǔ)的基因組合及同步表達(dá)(Promoter-based Gene Assembly and Simultaneous Overexpression,PGASO)方法(Chang et al.,2012)來建構(gòu)完成。PGASO方法是一種利用具有重迭區(qū)域的多核苷酸序列來重組帶有不同啟動子的基因組的克隆方法；利用該方法可將多個基因組依特定順序插入宿主細(xì)胞的基因體(genome)中。簡單來說，各基因組包含二部份：(1)一段連接于啟動子的5’端的基因序列，以及(2)一段位于基因組的3’端且與其鄰近基因組的5’端相同的基因序列。第一基因組啟動子的5’端序列與第二基因組的3’端序列系與宿主基因體的特定位置相互同源的基因序列，故可利用同源重組(homologous recombination)的機制將二基因組插入宿主基因體的特定位置。各基因組中啟動子的序列應(yīng)為不同的序列。而基因組的3’端序列則應(yīng)與鄰近下游基因組的部份啟動子序列相互同源。當(dāng)將各基因組克隆至宿主細(xì)胞內(nèi)后，各基因組會藉由啟動子與對應(yīng)序列間的重迭序列進(jìn)行同源重組，重組后的重組多核苷酸序列會再利用第一基因組中的啟動子序列與基因體中預(yù)設(shè)的同源序列和最后一組基因組中的3’端序列與基因體中預(yù)設(shè)的同源序列，以預(yù)先設(shè)定的順序插入宿主細(xì)胞的基因體中。

以下所有重組多核苷酸序列皆是利用PGASO的技術(shù)建構(gòu)而成。

1.1包含二基因組的重組多核苷酸序列

依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，本發(fā)明重組多核苷酸序列包含二組基因組。第一基因組包含以第一啟動子驅(qū)動的第一核酸序列，其中該第一核酸序列系用以編碼焦磷酸香葉香葉酯合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPP synthase)；已知焦磷酸香葉香葉酯合成酶可催化焦磷酸香葉(geranyl pyrophosphate,FPP)形成焦磷酸香葉香葉酯(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)。第二基因組包含由第二啟動子驅(qū)動的第二核酸序列，其中該第二核酸序列系用以編碼3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl–coenzyme A reductase，HMG-CoA reductase，以下簡稱HMG-CoA還原酶)；已知HMG-CoA還原酶可催化甲基二羥戊酸(mevalonic acid)形成乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)?；赑GASO的建構(gòu)策略，一基因組的3’端會與位于該基因組下游的另一基因組的5’端相互同源。據(jù)此，當(dāng)二基因組同時克隆至宿主細(xì)胞后，其會進(jìn)行同源重組形成重組多核苷酸序列。

舉例來說，依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，第一基因組的3’端序列系與第二啟動子的部份序列相互同源。經(jīng)同源重組后，重組多核苷酸序列會包含二基因組；其由5’端至3’端分別為第一基因組和第二基因組。

可選擇性地，本發(fā)明重組多核苷酸序列可更包含標(biāo)記基因組，該標(biāo)記基因組包含標(biāo)記啟動子及可操作式地連結(jié)至該標(biāo)記啟動子的標(biāo)記基因。依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施方式，第一基因組的3’端序列與標(biāo)記啟動子的部份序列相互同源，而標(biāo)記基因組的3’端序列則與第二啟動子的部份序列相互同源。據(jù)此，經(jīng)同源重組后，標(biāo)記基因組會位于第一和第二基因組之間。

為制備焦磷酸香葉香葉酯合成酶，第一核酸序列為一crtE基因或其片段；其中該crtE基因或其片段可以源自紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)或雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)的crtE基因。在一特定實施方式中，第一核酸序列系源自紅發(fā)夫酵母的crtE基因的催化域，且包含序列編號：1的序列。

為制備HMG-CoA還原酶，第二核酸序列為HMG1基因或其片段，其中該HMG1基因或其片段可以源自馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、史特卡云杉(Picea sitchensis)、土曲霉(Aspergillus terreus)或靈芝(Ganoderma lucidum)的HMG1基因。在一實施方式中，第二核酸序列系源自馬克斯克魯維酵母的HMG1基因的催化域。已知截斷型HMG-CoA還原酶(truncated HMG-CoA reductase,tHMG1)會減少反饋抑制(feedback inhibition)，進(jìn)而增加焦磷酸香葉香葉酯的產(chǎn)量。據(jù)此，在一特定實施方式中，第二核酸序列為tHMG1基因，且包含序列編號：2的序列。

標(biāo)記基因可以是熒光基因、β-葡萄醣醛酸酶(β-glucuronidase)基因和LacZ基因等篩分(screening)標(biāo)記基因，亦可以是抗生素抗藥性基因等篩選(selection)標(biāo)記基因。依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，本發(fā)明標(biāo)記基因是一種抗生素抗藥性基因，例如可對康霉素(Kanamycin)/建那霉素(geneticin,G418)/新霉素(neomycin)產(chǎn)生抗性的KanMX標(biāo)記基因，或是可對金黃擔(dān)子素A(aureobasidin A,AbA)產(chǎn)生抗性的AUR1-C基因。

適用于驅(qū)動第一、第二及標(biāo)記核酸序列/基因表達(dá)的啟動子包含，但不限于，ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子。較佳的情況是，利用不同的啟動子來驅(qū)動重組多核苷酸序列中各核酸序列或基因組的表達(dá)。在一實施方式中，第一啟動子是KlLac4啟動子，第二啟動子是ScADHI啟動子，而標(biāo)記啟動子則為KlGapDH啟動子。

1.2包含四基因組的重組多核苷酸序列

依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施方式，本發(fā)明重組多核苷酸序列包含四組基因組。具體來說，除了本公開內(nèi)容1.1所述的用以編碼焦磷酸香葉香葉酯合成酶和HMG-CoA還原酶的第一及第二基因組外，本發(fā)明重組多核苷酸序列進(jìn)一步包含第三和第四基因組。第三基因組包含以第三啟動子驅(qū)動的第三核酸序列，其中該第三核酸序列系用以編碼八氫茄紅素去飽合酶(phytoene desaturase)；已知八氫茄紅素去飽合酶可催化順-八氫茄紅素(cis-phytoene)形成茄紅素(lycopene)。第四基因組包含以第四啟動子驅(qū)動的第四核酸序列，其中該第四核酸序列系用以編碼一具有八氫茄紅素合成酶(phytoene synthase)和茄紅素環(huán)化酶(lycopene cyclase)個別功能的雙功能酶(以下簡稱八氫茄紅素合成酶/茄紅素環(huán)化酶)；已知八氫茄紅素合成酶和茄紅素環(huán)化酶皆可催化茄紅素形成β-胡蘿卜素(β-carotene)。

利用PGASO的建構(gòu)策略來重組該四組基因組。亦即，各基因組的3’端會與位于其下游的下一基因組的5’端相互同源。舉例來說，在本公開內(nèi)容一實施方式中，第三基因組的3’端序列系與第一啟動子的部份序列相互同源；第一基因組的3’端序列系與第四啟動子的部份序列相互同源；而第四基因組的3’端序列系與第二啟動子的部份序列相互同源。據(jù)此，該四組基因組將會于活體內(nèi)自發(fā)性地重組形成重組多核苷酸序列，其由5’端至3’端依序包含第三基因組、第一基因組、第四基因組和第二基因組。

可選擇性地，本發(fā)明重組多核苷酸序列可包含標(biāo)記基因組，該標(biāo)記基因組包含標(biāo)記啟動子和可操作式地連結(jié)至該標(biāo)記啟動子的標(biāo)記基因。包含標(biāo)記基因組的重組多核苷酸序列系利用PGASO方法建構(gòu)而成；因此，為簡潔起見在此省略其詳細(xì)描述。依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，標(biāo)記基因組是位于第一和第四基因組之間。

為制備八氫茄紅素去飽合酶，第三核酸序列為crtI基因或其片段；其中該crtI基因或其片段可以源自紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、聚球藻WH 8102(Synechococcus sp.WH 8102)、集胞藻PCC 6803(Synechocystis sp.PCC 6803)、念珠藻PCC 7120(Nostoc sp.PCC 7120)或西紅柿(Solanum lycopersicum)的crtI基因。在一特定實施方式中，第三核酸序列系源自紅發(fā)夫酵母的crtI基因的催化域，且包含序列編號：3的序列。

為制備具有八氫茄紅素合成酶和茄紅素環(huán)化酶個別功能的雙功能酶，第四核酸序列包含crtYB基因或其片段；其中該crtYB基因或其片段可以源自紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、玉米黑穗菌521(Ustilago maydis 521)、硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)或嗜苦古菌(Picrophilus torridus)的crtYB基因。在一特定實施方式中，第四核酸序列系源自紅發(fā)夫酵母的crtYB基因的催化域，且包含序列編號：4的序列。

標(biāo)記基因可以是篩分標(biāo)記基因或篩選標(biāo)記基因。依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，標(biāo)記基因為抗生素抗藥性基因KanMX。

適用于驅(qū)動第一、第二、第三、第四及標(biāo)記核酸序列/基因表達(dá)的啟動子包含，但不限于，ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子。較佳的情況是，利用不同的啟動子來驅(qū)動重組多核苷酸序列中各核酸序列或基因組的表達(dá)。在一實施方式中，第一啟動子是ScPGK啟動子，第二啟動子是ScADHI啟動子，第三啟動子是KlLac4啟動子，第四啟動子是KlADHI啟動子，而標(biāo)記啟動子則是KlGapDH啟動子。

1.3用以表達(dá)3S,3S’-蝦紅素的包含六基因組的重組多核苷酸序列

依據(jù)本公開內(nèi)容另一實施方式，本發(fā)明重組多核苷酸序列包含用以制備3S,3S’-蝦紅素的六組基因組。具體來說，除了本公開內(nèi)容1.2所述的用以編碼焦磷酸香葉香葉酯合成酶、HMG-CoA還原酶、八氫茄紅素去飽合酶和八氫茄紅素合成酶/茄紅素環(huán)化酶的第一至第四基因組外，本發(fā)明重組多核苷酸序列進(jìn)一步包含二基因組，其系分別用以表達(dá)β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotene hydroxylase)和β-胡蘿卜素酮醇酶(β-carotene ketolase)；已知β-胡蘿卜素羥化酶和β-胡蘿卜素酮醇酶系為將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)換為3S,3S’-蝦紅素的必要性酶。更具體來說，第五基因組包含以第五啟動子驅(qū)動的第五核酸序列，其中該第五核酸序列系用以編碼β-胡蘿卜素羥化酶。第六基因組包含以第六啟動子驅(qū)動的第六核酸序列，其中該第六核酸序列系用以編碼β-胡蘿卜素酮醇酶。

相似地，包含六組基因組的重組多核苷酸序列亦是利用PGASO的建構(gòu)策略重組而成；其中，各基因組的3’端會與位于其下游的下一基因組的5’端相互同源。舉例來說，在一特定實施例中，第三基因組的3’端序列系與第一啟動子的部份序列相互同源，第一基因組的3’端序列系與第五啟動子的部份序列相互同源，第五基因組的3’端序列系與第六啟動子的部份序列相互同源，第六基因組的3’端序列系與第四啟動子的部份序列相互同源，而第四基因組的3’端序列則系與第二啟動子的部份序列相互同源。一旦克隆至宿主細(xì)胞內(nèi)后，該六組基因組會自發(fā)性地重組形成一重組多核苷酸序列，其由5’端至3’端依序包含第三基因組、第一基因組、第五基因組、第六基因紅、第四基因組和第二組基因。

可選擇性地，本發(fā)明重組多核苷酸序列可包含一標(biāo)記基因組，該標(biāo)記基因組包含一標(biāo)記啟動子及一可操作式地連結(jié)至該標(biāo)記啟動子的標(biāo)記基因。在一實施例中，建構(gòu)的標(biāo)記基因組是位于第五和第六基因組之間。

為制備β-胡蘿卜素羥化酶，第五核酸序列包含一ChYb基因或其片段，其中該ChYb基因或其片段可以源自萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小球藻(Chlorella zofingiensis)或雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)的ChYb基因。在一實施方式中，第五核酸序列是源自萊茵衣藻的ChYb基因的催化域，且包含序列編號：5的序列。在另一實施方式中，第五核酸序列是源自小球藻的ChYb基因的催化域，且包含序列編號：6的序列。在再另一實施方式中，第五核酸序列是源自雨生紅球藻的ChYb基因的催化域，且包含序列編號：7的序列。

為制備β-胡蘿卜素酮醇酶，第六核酸序列包含一bkt基因或其片段，其中該bkt基因或其片段可以源自萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、念珠藻PCC 7120(Nostoc sp.PCC 7120)、無類囊體藍(lán)藻PCC 7421(Gloeobacter violaceus PCC 7421)、聚球藻CC9902(Synechococcus sp.CC9902)或聚球藻WH 8102(Synechococcus sp.WH 8102)的bkt基因。在一特定實施方式中，第六核酸序列系源自萊茵衣藻的bkt基因的催化域，且包含序列編號：8的序列。

標(biāo)記基因可以是篩分標(biāo)記基因或篩選標(biāo)記基因。依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，標(biāo)記基因為抗生素抗藥性基因KanMX。

適用于驅(qū)動第一至第六核酸序列及標(biāo)記基因表達(dá)的啟動子包含，但不限于，ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子。較佳情況是，利用不同的啟動子來驅(qū)動重組多核苷酸序列中各核酸序列或基因組的表達(dá)。在一實施方式中，第一啟動子是ScGapDH啟動子，第二啟動子是ScADHI啟動子，第三啟動子是KlLac4啟動子，第四啟動子是KlADHI啟動子，第五啟動子是ScPGK啟動子，第六啟動子是KlPGK啟動子，而標(biāo)記啟動子則是KlGapDH啟動子。

1.4用以表達(dá)3R,3R’-蝦紅素的包含六基因組的重組多核苷酸序列

本公開內(nèi)容亦提供一用以于宿主細(xì)胞中制備3R,3R’-蝦紅素的重組多核苷酸序列。依據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式，本發(fā)明用以制備3R,3R’-蝦紅素的重組多核苷酸序列包含六組基因組，其中前四組基因組為本公開內(nèi)容1.2所述的基因組，其系分別用以表達(dá)焦磷酸香葉香葉酯合成酶、HMG-CoA還原酶、八氫茄紅素去飽合酶和八氫茄紅素合成酶/茄紅素環(huán)化酶；另外二組基因組(即第七基因組和第八基因組)則分別用以表達(dá)P450還原酶(P450reductase)和β-胡蘿卜素加氧酶(β-carotene oxygenase)；已知P450還原酶和β-胡蘿卜素加氧酶在催化β-胡蘿卜素形成3R,3R’-蝦紅素的生物合成路徑中扮演著重要的角色。具體來說，第七基因組包含以第七啟動子驅(qū)動的第七核酸序列，其中該第七核酸序列系用以編碼P450還原酶。第八基因組包含以第八啟動子驅(qū)動的第八核酸序列，其中該第八核酸序列系用以編碼β-胡蘿卜素加氧酶。

同樣地，用以制備3R,3R’-蝦紅素的重組多核苷酸序列也是利用PGASO策略建構(gòu)而成，其中，各基因組的3’端會與位于其下游的下一基因組的5’端相互同源。舉例來說，依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，第三基因組的3’端序列系與第七啟動子的部份序列相互同源；第七基因組的3’端序列系與第一啟動子的部份序列相互同源；第一基因組的3’端序列系與第八啟動子的部份序列相互同源；第八基因組的3’端序列系與第四啟動子的部份序列相互同源；而第四基因組的3’端序列則系與第二啟動子的部份序列相互同源。利用基因組間的同源序列，該七組基因組可于活體內(nèi)進(jìn)行同源重組，以形成一重組多核苷酸序列，其由5’端至3’端依序包含第三基因組、第七基因組、第一基因組、第八基因組、第四基因組和第二基因組。

可選擇性地，本發(fā)明用以制備3R,3R’-蝦紅素的重組多核苷酸序列可進(jìn)一步包含一標(biāo)記基因組，該標(biāo)記基因組包含一由標(biāo)記啟動子驅(qū)動的標(biāo)記基因。在一較佳的實施方式中，標(biāo)記基因組是位于第一和第八基因組之間。

為制備P450還原酶，第七核酸序列包含一crtR基因或其片段，其中該crtR基因或其片段可以源自紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、黑曲菌(Aspergillus niger)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、形馬拉色菌CBS 7966(Malassezia globosa CBS 7966)或玉米黑穗菌521(Ustilago maydis 521)的crtR基因。在一特定實施方式中，第七核酸序列系源自紅發(fā)夫酵母的crtR基因，且包含序列編號：9的序列。

為制備β-胡蘿卜素加氧酶，第八核酸序列包含一crtS基因或其片段，其中該crtS基因或其片段可以源自紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、智人(Homo sapiens)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、家兔(Oryctolagus cuniculus)或果蠅(Drosophila melanogaster)的crtS基因。在一實施方式中，第八核酸序列系源自紅發(fā)夫酵母的crtS基因，且包含序列編號：10的序列。

標(biāo)記基因可以是篩分標(biāo)記基因或篩選標(biāo)記基因。依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，所述標(biāo)記基因為一抗生素抗藥性基因KanMX。

適用于驅(qū)動第一、第二、第三、第四、第七、第八和標(biāo)記核酸序列/基因表達(dá)的啟動子包含，但不限于，ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子。較佳的情況是，利用不同的啟動子來驅(qū)動重組多核苷酸序列中各核酸序列或基因組的表達(dá)。在一實施方式中，第一啟動子是ScPGK啟動子，第二啟動子是ScADHI啟動子，第三啟動子是KlLac4啟動子，第四啟動子是KlADHI啟動子，第七啟動子是ScGapDH啟動子，第八啟動子是KlPGK啟動子，而標(biāo)記啟動子則是KlGapDH啟動子。所有上述啟動子皆為酵母菌組成型啟動子(constitutive promoter)，不論在何種環(huán)境下皆具有活性且可有效驅(qū)動酵母菌細(xì)胞中基因的表達(dá)。

依據(jù)某些實施方式，本公開內(nèi)容1.1至1.4所述的各啟動子(即第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和標(biāo)記啟動子)包含特定的核苷酸序列。在一特定實施方式中，KlLac4啟動子包含序列編號：63的核苷酸序列；ScGapDH啟動子包含序列編號：64的核苷酸序列；ScPGK啟動子包含序列編號：65的核苷酸序列；KlGapDH啟動子包含序列編號：66的核苷酸序列；KlPGK啟動子包含序列編號：67的核苷酸序列；KlADHI啟動子包含序列編號：68的核苷酸序列；而ScADHI啟動子則包含序列編號：69的核苷酸序列。

當(dāng)可想見，也可以以其它組成型啟動子來取代本公開內(nèi)容1.1至1.4所述的各啟動子(即第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和標(biāo)記啟動子)，其中該些組成型啟動子可在酵母菌以外的物種中驅(qū)動下游基因的表達(dá)；據(jù)此，本發(fā)明基因組可于原核宿主細(xì)胞(例如細(xì)菌宿主細(xì)胞)或其它真核宿主細(xì)胞(例如真菌、植物、哺乳動物細(xì)胞)中有效進(jìn)行表達(dá)。適用于在原核宿主細(xì)胞中驅(qū)動基因表達(dá)的啟動子包含，但不限于，T3啟動子、T5啟動子、T7啟動子、trp啟動子、lac啟動子、tac啟動子(為trp和lac啟動子的雜合體)、lac衍生的啟動子、araBAD啟動子、recA啟動子、proU啟動子、cst-1啟動子、tatA啟動子、cadA啟動子、nar啟動子、cspA啟動子、SP6啟動子、Rhamnose啟動子和phoA啟動子。適用于在哺乳動物細(xì)胞中驅(qū)動基因表達(dá)的啟動子可選擇自，但不限于，由SV40早期啟動子(SV40early promoter)、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter)、腺病毒主要晚期啟動子(adenovirus major late promoter)、人類巨細(xì)胞病毒實時早期啟動子(human cytomegalovirus(CMV)immediate early promoter)、小鼠干細(xì)胞病毒啟動子(murine stem cell virus(MSCV)promoter)、病毒內(nèi)部啟動子(virus's internal promoter)、泛素啟動子(Ubiquitin C(UbC)promoter)、延長因子－1α啟動子(elongation factor-1α(EF-1α)promoter)、磷酸甘油酸激酶啟動子(phosphoglycerate kinase(PGK)promoter)或CMV早期啟動子(CMV early enhancer)/雞只β肌動蛋白啟動子(chickenβactin(CAG)promoter)所組成的群組。

除了PGASO建構(gòu)方法外，亦可采用所屬領(lǐng)域具有通常知識者所熟知的任何方法，來重組建構(gòu)本公開內(nèi)容1.1至1.4所述的基因組(即第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和標(biāo)記基因組)，例如適當(dāng)?shù)南拗泼负涂寺∠到y(tǒng)，前提是只要能制備出欲求的特定產(chǎn)物(3S,3S’-蝦紅素或3R,3R’-蝦紅素)即可。

當(dāng)使用不同方法來建構(gòu)本發(fā)明基因組時，本公開內(nèi)容1.1至1.4所述的基因組(即第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和標(biāo)記基因組)可能會以不同的順序進(jìn)行重組。舉例來說，在使用不同的重迭/同源序列時，所建構(gòu)重組的產(chǎn)物可能會與本發(fā)明重組多核苷酸序列具有不同的基因組排列順序?；蛘呤?，可依據(jù)特定的排列順序來使用不同的限制酶，藉以產(chǎn)生不一樣的基因產(chǎn)物。因此，包含本發(fā)明基因組且具有不同排列順序的重組多核苷酸序列亦屬本公開內(nèi)容的范疇。

可利用任何實驗室或臨床研究常用的方法來確認(rèn)及分析重組多核苷酸序列的組成順序。舉例來說，可藉由基因定序、限制酶酶切或長聚合酶連鎖反應(yīng)(long-PCR)試驗來進(jìn)行分析。依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，是利用長聚合酶連鎖反應(yīng)來分析重組多核苷酸序列的組成順序。一般來說，長聚合酶連鎖反應(yīng)是一種用以放大極長PCR產(chǎn)物(長達(dá)40kb DNA)的技術(shù)，可由巿售的商業(yè)套組，并參閱其所附的操作手冊來進(jìn)行試驗。

2.包含本發(fā)明重組多核苷酸序列的載體

本公開內(nèi)容的第二方面是關(guān)于一包含本發(fā)明重組多核苷酸序列和控制序列的載體，其中該控制序列是可操作式地連結(jié)至該重組多核苷酸序列。

控制序列是用以輔助重組多核苷酸序列于不同類型的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。因此，控制序列可包含不同的成分(例如啟動子、核醣體結(jié)合位置、促進(jìn)子/緘默子及終止子)。舉例來說，于酵母菌中表達(dá)的控制序列通常包含一自主復(fù)制序列(autonomously replicating sequence,ARS)，其系包含酵母菌基因體中的復(fù)制起始序列(replication origin,ori)；自主復(fù)制序列通常包含四個區(qū)域(A、B 1、B2及B3)，其系以于質(zhì)體表達(dá)的穩(wěn)定度來依序命名。A區(qū)域為高度保留性區(qū)域，任何的突變皆會使復(fù)制起始序列的功能喪失。相較的下，B 1、B2和B3區(qū)域的突變則僅會影響、而不會抑制復(fù)制起始序列的功能。一般來說，為了起始載體于酵母菌的復(fù)制，控制序列中的復(fù)制起始序列是由一可與復(fù)制蛋白結(jié)合的必要性DNA序列(即ARS保守序列，ARS consensus sequence，ACS)所組成。

在原核宿主細(xì)胞表達(dá)的控制序列可包含一復(fù)制起始序列和一操縱子(operon)。一般而言，復(fù)制起始序列可以是一源自大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)基因體的oriC，或是一源自pBR322(一種大腸桿菌的質(zhì)體)且包含二突變的pUC。操縱子通?？捎靡哉{(diào)控啟動子的表達(dá)；適用的操縱子包含，但不限于lac操縱子、trp操縱子或源自Tn10的抗四環(huán)素操縱子(Tn10-derived tetracycline resistance(Tet)operon)。

在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的控制序列則可包含復(fù)制起始序列及促進(jìn)子/緘默子。用以起始載體于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的復(fù)制起始序列可以是源自SV40病毒基因體的SV40起始序列，或是一源自哺乳動物細(xì)胞基因體的oriC。促進(jìn)子為位于調(diào)控基因上游或下游的短片段DNA(50-1500bp)，通常為順式作用(cis-acting)，可與蛋白質(zhì)(活化子)結(jié)合來活化基因的轉(zhuǎn)錄；緘默子則為位于調(diào)控基因上游或下游的DNA序列，可與轉(zhuǎn)錄因子(抑制子)結(jié)合來抑制基因的轉(zhuǎn)錄。

可利用習(xí)知技藝人士所熟知的任一方法，將本發(fā)明重組多核苷酸序列以可操作方式連結(jié)至控制序列。舉例來說，可利用適當(dāng)?shù)南拗泼?、克隆系統(tǒng)或同源重組進(jìn)行分子克隆。依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，系以同源重組的方式將本發(fā)明重組多核苷酸序列可操作式地連結(jié)至控制序列。具體來說，本發(fā)明重組多核苷酸序列是與控制序列共轉(zhuǎn)化至酵母菌中，其中重組多核苷酸序列的5’端和3’端是分別與控制序列中的標(biāo)記基因的3’端和5’端相互同源。據(jù)此，包含于重組多核苷酸序列的基因組可于活體內(nèi)自發(fā)性地與控制序列進(jìn)行重組。在一特定實施方式中，控制序列是質(zhì)體pRS426，而標(biāo)記基因為URA3基因。

依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，控制序列是高拷貝數(shù)(high-copy-number)質(zhì)體。因此，在進(jìn)行同源重組后，本發(fā)明重組多核苷酸序列可于酵母菌中高度表達(dá)。

3.用以表達(dá)本發(fā)明重組多核苷酸列的宿主細(xì)胞

本公開內(nèi)容的第三方面是關(guān)于一種用以制備蝦紅素、蝦紅素前驅(qū)物及/或蝦紅素衍生物的宿主細(xì)胞。在某些實施方式中，是將本公開內(nèi)容2所述的包含1.1、1.2、1.3或1.4的重組多核苷酸序列的載體克隆至宿主細(xì)胞中。

所制備而成的蝦紅素可以是3S,3S’-蝦紅素或3R,3R’-蝦紅素。蝦紅素的前驅(qū)物可以是焦磷酸香葉香葉酯、尼基葉黃素、茄紅素、海膽酮、斑螯黃質(zhì)、八氫西紅柿紅素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃素或β-胡蘿卜素。蝦紅素的衍生物可以是蝦紅素單酯體或蝦紅素雙酯體。

可利用任何習(xí)知技藝人士所熟知的方法將本發(fā)明重組多核苷酸序列及/或載體克隆至宿主細(xì)胞中。具體來說，用以將外源性DNA及/或載體克隆至原核宿主細(xì)胞(例如細(xì)菌宿主細(xì)胞)的方法包含化學(xué)處理(例如將宿主細(xì)胞培養(yǎng)于包含二價陽離子的溶液中，再以熱進(jìn)行處理)，以及電穿孔(electroporation，例如以電場刺激宿主細(xì)胞，使其于細(xì)胞膜上產(chǎn)生孔洞)。

用以將外源性DNA及/或載體克隆至一酵母菌的方法包含，但不限于，酶處理(以酶降解酵母菌的細(xì)胞壁)、化學(xué)處理(以堿性陽離子處理酵母菌)、電穿孔及玻璃珠攪拌。依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，是利用電穿孔將本發(fā)明重組多核苷酸序列及/或載體克隆至酵母菌細(xì)胞中。

用以將外源性DNA及/或載體克隆至一真核宿主細(xì)胞(例如哺乳動物細(xì)胞)的方法包含以化學(xué)(例如磷酸鈣、高分支有機化合物/樹枝狀聚合物(dendrimer)、脂質(zhì)體及陽離子聚合物)處理宿主細(xì)胞、電穿孔、細(xì)胞擠壓(cell squeezing，輕壓細(xì)胞膜)、超音波穿孔(sonoporation，包含利用高強度超音波于細(xì)胞膜形成孔洞)、光轉(zhuǎn)染(optical transfection，利用高聚焦電射于細(xì)胞膜制造一微小孔洞)、基因交付(impalefection，將DNA連接至一可穿透細(xì)胞的納米纖維的表面)、基因槍(gene gun，將DNA連接至一納米粒子后，直接注入標(biāo)的細(xì)胞核內(nèi))、磁轉(zhuǎn)染(magnetofection)/磁輔助轉(zhuǎn)染(magnet assisted transfection，利用磁力將DNA送至標(biāo)的細(xì)胞內(nèi))，以及病毒法/病毒轉(zhuǎn)染(利用病毒作為轉(zhuǎn)體，將DNA送至標(biāo)的細(xì)胞內(nèi))。

因此，適用以表達(dá)蝦紅素、蝦紅素前驅(qū)物及/或蝦紅素衍生物的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞)或真核細(xì)胞(例如酵母菌細(xì)胞及哺乳動物細(xì)胞)。依據(jù)本公開內(nèi)容一較佳實施方式，適用的宿主細(xì)胞為一酵母菌細(xì)胞。

依據(jù)某些實施方式，宿主細(xì)胞可以是馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)、畢赤酵母(Pichia pastoris)、漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母(Klyveromyces lactis)、耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、蠟蚧輪枝菌屬(Lecanicillium)、覆膜酵母屬(Galactomyces)、地絲菌屬(Geotrichum)、帚樣霉菌屬(Scopulariopsis)、鐮孢菌屬(Fusarium)、德巴利酵母(Debaryomyces,Dekkera)、孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、瑟氏哈薩克酵母屬(Kazachstania)、郎香菌屬(Lachancea)、美極梅奇酵母(Metschnikowia)、畢赤酵母屬(Pichia)、圓酵母屬(Torulopsis)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)、斯塔摩酵母屬(Starmerella)、三角酵母屬(Trigonopsis)、威克漢遜酵母屬(Wickerhamomyces)、結(jié)合酵母屬(Zygosaccharomyces)、接合囊孢菌(Zygotorulaspora)、孢圓酵母屬(Torulaspora)、紅霉菌屬(Neurospora)、曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、絲胞菌屬(Sporendonema)、隱球酵母屬(Cystofilobasidium)、耐冷酵母屬(Guehomyces)、白霉菌屬(Mucor)、黑霉菌屬(Rhizopus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、庫克菌屬(Kocuria)、細(xì)球菌屬(Micrococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、四聯(lián)球菌屬(TetrAgenococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、小球菌屬(Pediococcus)、白念珠球菌屬(Leuconostoc)、酒酒球菌屬(Oenococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、大型球菌屬(Macrococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、乳酸球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、醋酸菌屬(Acetobacter)、葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter)、哈夫尼亞菌屬(Hafnia)、鹽單胞菌屬(Halomonas)或發(fā)酵單孢菌屬(Zymomonas)細(xì)胞。在一特定實施方式中，宿主細(xì)胞為馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)。

依據(jù)一實施方式，宿主細(xì)胞可以包含一或多拷貝數(shù)的本公開內(nèi)容1和2所述的本發(fā)明基因組/重組多核苷酸序列/載體，藉以有效率地制備蝦紅素、蝦紅素前驅(qū)物及/或蝦紅素衍生物。

有鑒于發(fā)酵過程中，常伴隨產(chǎn)生對宿主細(xì)胞具有毒性的中間產(chǎn)物，或是需利用該些中間產(chǎn)物來大量制備最終產(chǎn)物；利用本發(fā)明重組多核苷酸序列/載體所產(chǎn)生的蝦紅素/蝦紅素前驅(qū)物/蝦紅素衍生物可保護宿主細(xì)胞，避免在發(fā)酵過程中受到毒性中間產(chǎn)物的傷害。

依據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式，產(chǎn)生的蝦紅素/蝦紅素前驅(qū)物/蝦紅素衍生物具備抗氧化功效，可改善宿主細(xì)胞對壓力的耐受性。壓力可以來自乙醇、異丁醇、紫外光照射、糠醛及/或抗癌藥物的前驅(qū)物。在一特定實施例中，宿主細(xì)胞系對用以制備抗癌藥物紫杉醇(paclitaxel)的前驅(qū)物10-去乙酰漿果赤霉素III(10-deacetyl baccatin III,10DB)具有耐受性。可依實驗需求使用不同的方法來測量宿主細(xì)胞對各式壓力的耐受度。舉例來說，可藉由測量菌落數(shù)、細(xì)胞生長、細(xì)胞密度或基因表達(dá)來了解耐受性。

4.用以制備蝦紅素、蝦紅素前驅(qū)物或蝦紅素衍生物的方法

本公開內(nèi)容的第四方面是關(guān)于一種用以制備蝦紅素、蝦紅素前趨物及/或蝦紅素衍生物的方法。該方法包含將本公開內(nèi)容3所述的宿主細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)液(例如，酵母菌萃取物-蛋白胨-甘油培養(yǎng)液，yeast extract-peptone-glycerol medium,YPG medium)中，其中該培養(yǎng)液包含一種選自由葡萄糖、半乳糖、甘油、脂肪酸和/或其組合所組成的群組的成分。在一實施方式中，培養(yǎng)液包含甘油。在另一實施方式中，培養(yǎng)液包含葡萄糖。在另一實施方式中，培養(yǎng)液包含半乳糖。在再另一實施方式中，培養(yǎng)液包含脂肪酸，例如辛酸。

足以誘發(fā)本發(fā)明宿主細(xì)胞表達(dá)各基因組的葡萄糖、半乳糖或甘油濃度約為0.5-40％(重量濃度，重量/重量)；亦即，濃度可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％或40％；而足以誘發(fā)本發(fā)明宿主細(xì)胞表達(dá)各基因組的脂肪酸濃度則為0.001％-5％(重量濃度，重量/重量)；亦即，濃度可以是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％或5％。

較佳的情況是，用以誘發(fā)本發(fā)明宿主細(xì)胞表達(dá)各基因組的葡萄糖、半乳糖或甘油濃度約為5-30％；而用以誘發(fā)本發(fā)明宿主細(xì)胞表達(dá)各基因組的脂肪酸濃度則為0.005-0.5％。

依據(jù)本公開內(nèi)容某些實施方式，培養(yǎng)液包含一種選自由葡萄糖、半乳糖、甘油、脂肪酸及/或其組合所組成的群組的成分。在一實施方式中，培養(yǎng)液包含20％葡萄糖。在另一實施方式中，培養(yǎng)液包含20％半乳糖。在再另一實施方式中，培養(yǎng)液包含0.01-0.1％脂肪酸。在一較佳的實施方式中，培養(yǎng)液包含10-20％甘油。

當(dāng)可想見，培養(yǎng)液可包含至少二種選自由葡萄糖、半乳糖、甘油、脂肪酸及/或其組合所組成的群組的成分，藉以更有效地誘發(fā)宿主細(xì)胞表達(dá)各基因組。

依據(jù)本公開內(nèi)容其它實施方式，適用于培養(yǎng)本發(fā)明宿主細(xì)胞生產(chǎn)蝦紅素的溫度約為18℃-42℃；舉例來說，溫度可以是18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃。在一實施方式中，溫度為30℃。在另一實施方式中，溫度為37℃。依據(jù)一較佳的實施方式，溫度為25℃。

可利用任何本所屬領(lǐng)域習(xí)知技藝人士所熟知的方法來測量本發(fā)明重組多核苷酸序列/載體的表達(dá)。舉例來說，可直接目測及/或照像記錄菌落及/或培養(yǎng)液的顏色變化。或是，藉由測量細(xì)胞生長、細(xì)胞濃度、基因表達(dá)、高效液相色譜分析或液相層析法－質(zhì)譜法來分析序列/載體的表達(dá)。

依據(jù)本公開內(nèi)容某些實施方式，本發(fā)明方法進(jìn)一步可包含將制備的蝦紅素、蝦紅素前驅(qū)物及/或蝦紅素衍生物自宿主細(xì)胞或培養(yǎng)液中分離的步驟。在一實施方式中，是直接將蝦紅素由酵母菌中萃取出來；萃取方法包含，但不限于，自溶作用(autolysis，將酵母菌與甲苯/氫氧化銨均勻混合后，靜置于室溫24-48小時)、均質(zhì)化(homogenization，使用均質(zhì)機或法式壓碎機)、玻璃珠振蕩(利用玻璃珠攪拌來破壞酵母菌細(xì)胞)、酶水解(以消解酶(zymolase)或酶解酶(lyticase)來分解細(xì)胞壁)、冷凍及研磨(以液態(tài)氮冷凍細(xì)胞后，利用研缽和研杵來研磨冷凍的細(xì)胞)、超臨界萃取，以及化學(xué)處理(例如以SDS及/或丙酮處理宿主細(xì)胞)。依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，是利用丙酮將蝦紅素由酵母菌中萃取出來。依據(jù)另一實施方式，是利用冷凍干燥法及甲醇處理將蝦紅素由酵母菌中萃取出來。

依據(jù)本公開內(nèi)容某些實施方式，制備出的蝦紅素可以是3S、3S’-蝦紅素或3R、3R’-蝦紅素。

依據(jù)一實施方式，本發(fā)明方法所制備的產(chǎn)物是一蝦紅素前驅(qū)物，其可以是焦磷酸香葉香葉酯、尼基葉黃素、茄紅素、海膽酮、斑螯黃質(zhì)、八氫西紅柿紅素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃素或β-胡蘿卜素。

依據(jù)其它實施方式，本發(fā)明方法所制備的產(chǎn)物是一蝦紅素衍生物，其可以是蝦紅素單酯體或蝦紅素雙酯體。

依據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式，本發(fā)明方法制備的蝦紅素及/或其前驅(qū)物或衍生物具有抗氧化功效，可作為一種抗氧化劑?？衫昧?xí)知技藝人士所熟知的任何活體外及/或活體內(nèi)方法來測量其抗氧化功效。舉例來說，活體外的測量方法可以是1、1-二苯基-2-苦基苯肼(1、1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，又稱α,α-二苯基-β-苦基苯肼，α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl，DPPH)清除活性試驗、過氧化氫清除活性試驗、一氧化氮清除活性試驗、過氧化亞硝酸鹽自由基(peroxynitrite radical)清除活性試驗、水溶性維生素E相似物等量抗氧化能力(Trolox equivalent antioxidant capacity、TEAC)試驗/ABTS自由基陽離子脫色(ABST radical cation decolorization)試驗、總自由基捕獲抗氧化參數(shù)(total radical-trapping antioxidant parameter、TRAP)試驗、鐵離子減少抗氧化力(ferric reducing-antioxidant power、FRAP)試驗、超氧化物自由基清除活性(superoxide radical scavenging activity、SOD)試驗、羥基自由基清除活性(hydroxyl radical scavenging activity)試驗、羥基自由基趨避能力(hydroxyl radical averting capacity、HORAC)試驗、氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity、ORAC)試驗、還原力(reducing power、RP)試驗、磷鉬(phosphomolybdenum)試驗、硫氰酸鐵(ferric thiocyanate、FTC)試驗、硫巴比妥酸(thiobarbituric acid、TBA)試驗、N,N-二甲基-對苯二胺二鹽酸鹽(N,N-dimethyl-p-phenylene diamine dihydrochloride、DMPD)試驗、β-胡蘿卜素亞油酸(β-carotene linoleic acid)試驗/共軛二烯(conjugated diene)試驗、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)試驗、銅離子減少抗氧化能力(cupric ion reducing antioxidant capacity、CUPRAC)試驗，或是金屬螫合活性(metal chelating activity)試驗?；铙w內(nèi)測量抗氧化活性的方法則包含，但不限于，血漿鐵還原能力(ferric reducing ability of plasma)、評估還原型麩胺基硫(reduced glutathione(GSH)estimation)、評估麩胺基硫過氧化酶(glutathione peroxidase(GSHPx)estimation)、麩胺基硫轉(zhuǎn)移脢(glutathione-S-transferase、GST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase、SOD)試驗、過氧化氫酶(catalase、CAT)、γ-谷氨酸轉(zhuǎn)勝肽酶(γ-glutamyl transpeptidase、GGT)活化試驗、麩胺基硫還元酶(glutathione reductase、GR)試驗、脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation、LPO)試驗及低密度脂蛋白(low-density lipoprotein、LDL)試驗。依據(jù)本公開內(nèi)容一實施方式，是利用水溶性維生素E相似物等量抗氧化能力試驗/ABTS自由基陽離子脫色試驗來測量蝦紅素或其前驅(qū)物或衍生物的抗氧化活性。

下文舉出多種實施例來闡明本發(fā)明的部分方面，以使本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者能藉以實踐本發(fā)明。因此不應(yīng)將這些實施例視為對本發(fā)明范圍的限制。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者基于此處列舉的說明，當(dāng)可在不需過度推衍的情形下運用本發(fā)明。此處提及的所有文獻(xiàn)，皆視為已完全引用而成為本說明書的一部份。

實施例

材料及方法

基因合成

分別以基因合成(GENEART，德國)來合成萊茵衣藻的bkt基因、萊茵衣藻的ChYb基因(即Crchyb基因)、小球藻(Chromochloris zofingiensis)的ChYb基因(即Czchyb基因)和雨生紅球藻的ChYb基因(即Hpchyb基因)。所有的合成基因序列皆基于宿主紅發(fā)夫酵母的蛋白質(zhì)編碼，利用處理，取得最佳化的多參數(shù)基因。

合成的bkt基因具有序列編號：8的氨基酸序列；合成的Crchyb基因具有序列編號：5的氨基酸序列；合成的Czchyb基因具有序列編號：6的氨基酸序列；而合成的Hpchyb基因具有序列編號：7的氨基酸序列。

基因克隆(gene cloning)

利用PCR分別將crtE基因、截斷型HMG1基因(即tHMG1基因)、crtI基因、crtYB基因、crtR基因及crtS基因由紅發(fā)夫酵母和馬克斯克魯維酵母擴增。表2總結(jié)用以擴增各基因的引物和其序列編號。

表2用以克隆的引物及其序列編號

利用序列編號：70、71、72及73的引物以PCR來擴增KlLac4啟動子，擴增后的KlLac4啟動子具有序列編號：63的核苷酸序列。利用序列編號：74、75、76及77的引物以PCR來擴增ScGapDH啟動子，擴增后的ScGapDH啟動子具有序列編號：64的核苷酸序列。利用序列編號：82、83、84及85的引物以PCR來擴增ScPGK啟動子，擴增后的ScPGK啟動子具有序列編號：65的核苷酸序列。利用序列編號：86、87、88及89的引物以PCR來擴增KlGapDH啟動子，擴增后的KlGapDH啟動子具有序列編號：66的核苷酸序列。利用序列編號：90、91、92及93的引物以PCR來擴增KlPGK啟動子，擴增后的KlPGK啟動子具有序列編號：67的核苷酸序列。利用序列編號：94、95、96及97的引物以PCR來擴增KlADHI啟動子，擴增后的KlADHI啟動子具有序列編號：68的核苷酸序列。利用序列編號：78、79、80及81的引物以PCR來擴增ScADHI啟動子，擴增后的ScADHI啟動子具有序列編號：69的核苷酸序列。

之后，利用限制酶SalI和EcoRI分別將擴增后的啟動子克隆至質(zhì)體pUC18，以方便后續(xù)建構(gòu)重組多核苷酸序列。

基因組重組

利用各基因組中的重迭序列來重組各基因組。以TaKaRa Ex Taq系統(tǒng)進(jìn)行融合PCR(fusion PCR)以重組各基因組。反應(yīng)混合液包含0.2mM的特定引物、0.25mM的三磷酸脫氧核苷酸(deoxynucleoside triphosphate)、含有2mM MgCl₂的1倍PCR緩沖液、2微升的DNA和2.5U的Ex Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)時間及溫度為94℃(1分鐘)、由58℃至53℃的黏著溫度1分鐘，以及72℃(最適時間)；循環(huán)上述步驟10次。

培養(yǎng)酵母菌的最佳條件

為了解用以制備類胡蘿卜素的最佳條件，將酵母菌工程株培養(yǎng)于包含1％酵母菌萃取物(Yeast Extract)、2％蛋白胨(Peptone)及2％D(+)-葡萄糖的YPG培養(yǎng)液中，并置于25℃、30℃或37℃的環(huán)境中培養(yǎng)3天。為測試細(xì)胞生長時碳源的利用，將酵母菌工程株培養(yǎng)于包含20％葡萄糖、20％半乳糖或20％甘油的YPG培養(yǎng)液中。

酵母菌轉(zhuǎn)化(transformation)及菌株篩選

將酵母菌培養(yǎng)于包含1％酵母菌萃取物、2％蛋白胨及2％D(+)-葡萄糖的5毫升的YPG培養(yǎng)液中，并置于30℃、以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)16小時。將各基因組以乳酸克魯維酵母蛋白表達(dá)套組(K.lactis Protein Expression Kit,New England Biolabs)共轉(zhuǎn)化至乳酸克魯維酵母中，以表達(dá)各外源性基因。以高保真(high fidelity)的酶(PrimeSTAR MAX DNA聚合酶，TaKaRa)進(jìn)行聚合酶連鎖反應(yīng)(即HiFi-PCR)來擴增各基因組；再將各基因組共同引入酵母菌中，藉由各序列中的重迭序列來進(jìn)行同源重組，使各基因組以預(yù)先設(shè)計的順序排列重組。之后，利用第一基因組的啟動子序列和最后一組基因組的3’端序列可將所得重組產(chǎn)物同源重組至宿主細(xì)胞的基因體中。以對抗生素G418具有抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neomycin phosphotransferase gene,Kan MX)作為標(biāo)記基因，進(jìn)行特定菌株的篩選。將10微升(μg)的標(biāo)的DNA片段以等莫耳比例共轉(zhuǎn)化至40微升的勝任細(xì)胞(competent cell)中。以BioRad系統(tǒng)(gene PluserXcellTM,Bio-Rad,Hercules,CA)在2毫米鋁制比色管中進(jìn)行電穿孔(1.0kV，400Ω及25μF電容)。之后，將細(xì)胞涂布于包含1％酵母菌萃取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖及每毫升200微克(mg)的含有抗生素G418的YPG培養(yǎng)基上。

為確認(rèn)各片段的位置，以QucikExtract^TM DNA萃取溶液(EPICENTRE,Madison,Wisconsin)分解酵母菌細(xì)胞壁。之后，以長-PCR法(Long-PCR method,EmeraldAmp MAX PCR Master Mix,TaKaRa)，輔以特定引物(序列編號：23-36)及自動電泳分析系統(tǒng)(automatic electrophoresis analysis system,Fragment AnalyzerTM Automated CE System,Advanced Analytical Technologies)來確認(rèn)各基因組順序的正確性。

反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction、RT-PCR)試驗

利用DNA分離套組III(DNA Isolation Kit III,Roche)將基因體DNA由酵母菌中萃取純化出來。以RNeasy微套組(QiAgen,Chatsworth,CA)將模板mRNA由酵母菌中純化出來后，藉由反轉(zhuǎn)錄套組(SuperScript^TM II kit,Invitrogen)合成cDNA。以實時qPCR(real-time qPCR)來分析確認(rèn)菌株中各啟動子及其于不同培養(yǎng)溫度下的驅(qū)動表達(dá)能力。利用通用探針數(shù)據(jù)庫(Universal Probe Library Set,UPLS,LightCyclerW 480Probes Master,Roche)，輔以特定引物對(擴增產(chǎn)物長度約為100至150bp)，于LightCycler儀器(LightCycler 480,Roche)來定量各基因的相對表達(dá)量。表3總結(jié)用以分析各基因表達(dá)所使用的引物。

表3.反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)所使用的引物

抗氧化功效試驗

在食品工業(yè)及農(nóng)業(yè)相關(guān)研究中，常利用2,2'-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)、ABTS)來測量食品的抗氧化功效。該試驗系藉由添加過硫酸鈉使ABTS轉(zhuǎn)換為自由基陽離子后，測量自由基陽離子(藍(lán)色)于吸收波長734納米時的吸收光譜。ABTS自由基陽離子會與多種抗氧化劑反應(yīng)。在反應(yīng)中，藍(lán)色的ABTS自由基陽離子會轉(zhuǎn)換回?zé)o色的中性形式?？衫梅止夤舛扔媮頊y量反應(yīng)。由于此試驗是以相對于水溶性維生素E相似物(Trolox)的抗氧化反應(yīng)來計算表示，故亦稱為水溶性維生素E相似物等量抗氧化能力(Trolox equivalent antioxidant capacity,TEAC)試驗。操作時系先將ABTS受質(zhì)加入細(xì)胞，再將細(xì)胞培養(yǎng)于YPG培養(yǎng)液，并置于25℃培養(yǎng)72小時；之后，冷凍干燥細(xì)胞，利用甲醇萃取色素以進(jìn)行后續(xù)分析。

高效液相色譜(high performance liquid chromatography、HPLC)試驗

收集培養(yǎng)3天的細(xì)胞，并以去離子水洗滌的。將細(xì)胞沉淀物置于冷凍干燥機中冷凍干燥。利用丙酮萃取干燥細(xì)胞中的類胡蘿卜素，進(jìn)行反相高效液相色譜試驗。本發(fā)明是利用包含一PU-2089四元泵(PU-2089Quaternary Pump)及一870-UV智能型紫外光/可見光偵測器(870-UV intelligent UV-VIS detector)的佳世客(Jasco)HPLC儀器來進(jìn)行相關(guān)分析。在操作時，是以野村化學(xué)(Nomura Chemical)制備的Develosil C30-UG管柱(3微米，ID 4.6毫米x L 250毫米－UG17346250W)，輔以甲醇/甲基第三丁基醚(methyl tert-butyl ether,MTBE)/水(比例為81：15：4)及甲醇/甲基第三丁基醚/水(比例為7：90：3)作為移動相，來進(jìn)行HPLC分離及定量。將流速設(shè)定為每分鐘1毫升，并記錄吸收波長460納米時的色層分析圖。

乙醇產(chǎn)量試驗

本發(fā)明是利用氣相分層分析法(Shimazdu，GC-14，日本)，輔以一火焰游離偵檢器(flame ionization detector,FID)及一不銹鋼管柱(80/120Carbopack B/6.6％Carbowax，2米x 2毫米)，并以氮氣作為移動氣體，來分析乙醇的產(chǎn)量。操作步驟包含將管柱以每分鐘4℃的加熱速度由80℃加熱至150℃，柱入溫度為180℃，偵測溫度則為250℃。各發(fā)酵實驗及分析皆獨立重復(fù)三次。

實施例1建構(gòu)重組多核苷酸序列

1.1 crtE-Kan-tHMG1

在許多生物體中，焦磷酸香葉香葉酯為生物合成諸如類胡蘿卜素、吉貝素(gibberellins)、生育醇(tocopherols)、葉綠素(chlorophylls)、萜烯類(terpenes)及類萜(terpenoids)等醫(yī)藥化合物的重要前驅(qū)物。HMG-CoA還原酶(由HMG1基因所編碼)及焦磷酸香葉香葉酯合成酶(由crtE基因所編碼)則是HMG-CoA還原酶路徑中的重要中間產(chǎn)物。已知截斷型HMG-CoA還原酶(truncated HMG-CoA reductase,tHMG1)會減少反饋抑制，進(jìn)而增加焦磷酸香葉香葉酯于酵母菌中的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明首先建構(gòu)一包含一crtE基因及一HMG1基因的重組多核苷酸序列；并利用對抗生素G418具有抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Kan)作為標(biāo)記基因，以進(jìn)行后續(xù)菌株篩選分析。

利用BLAST來分析源自不同宿主細(xì)胞的HMG-CoA還原酶及焦磷酸香葉香葉酯合成酶的胺基因酸序列(圖4a和5a)?；诠δ軈^(qū)域(functional domain)中預(yù)測的氨基酸序列(圖4b和5b)，將各基因以宿主表達(dá)的最佳化密碼子克隆或合成后，與適當(dāng)?shù)膯幼舆B結(jié)，以建構(gòu)出特定的基因組。

在操作上，利用序列編號：11及12的引物以PCR擴增crtE基因，藉由限制酶AgeI及NcoI將其引入載有KlLac4啟動子的質(zhì)體pUC18中，再利用序列編號：23及24的引物以PCR擴增得到KlLac4-crtE基因組。利用序列編號：94及95的引物以PCR擴增Kan基因，藉由限制酶AgeI和NcoI將其引入載有KlGapDH啟動子的質(zhì)體pUC18中，再利用序列編號：25和26的引物以PCR擴增得到KlGapDH-Kan基因組；其中序列編號：25的核苷酸序列部份互補于序列編號：24的核苷酸序列(即AGTATGGTAACGACCGTACAGGCAA與TTGCCTGTACGGTCGTTACCATACT)；據(jù)此，KlGapDH-Kan基因組的5’端序列系與KlLac4-crtE基因組的3’端序列相互同源。利用序列編號：13及14的引物以PCR擴增tHMG1基因，藉由限制酶AgeI和NcoI將其引入載有ScADHI啟動子的質(zhì)體pUC18中，再利用序列編號：27和28的引物以PCR擴增得到ScADHI-tHMG1基因組；其中序列編號：27的核苷酸序列部份互補于序列編號：26的核苷酸序列(即GTGTACAATATGGACTTCCTCTTTTC與GAAAAGAGGAAGTCCATATTGTACAC)；據(jù)此，ScADHI-tHMG1基因組的5’端序列系與KlGapDH-Kan基因組的3’端序列相同互源。

基于KlLac4-crtE基因組與KlGapDH-Kan基因組間的同源序列，以及KlGapDH-Kan基因組與ScADHI-tHMG1基因組間的同源序列，當(dāng)三組基因組共轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞馬克斯克魯維酵母后，三組基因組會自發(fā)性地重組形成一重組多核苷酸序列crtE-Kan-tHMG1(總結(jié)于圖6及表4)。將包含重組多核苷酸序列crtE-Kan-tHMG1的基因工程菌命名為Xd3.0。

表4 crtE-Kan-tHMG1基因組

1.2 crtI-crtE-Kan-crtYB-tHMG1

β-胡蘿卜素是一種維生素A原類胡蘿卜素(provitamin A carotenoid)，已知可用以治療紅血球生成性原紫質(zhì)病(erythropoietic protoporphyria)等疾病。此外，β-胡蘿卜素亦經(jīng)證實可減少女性更年期后罹患乳癌的機率，以及罹患老年性黃斑部病變(Age-related macular degeneration、AMD)的機率。在制備下游類胡蘿卜素的過程中，β-胡蘿卜素是一項重要的中游前驅(qū)物；而crtY基因(用以編碼八氫茄紅素合成酶)和crtB基因(用以編碼茄紅素環(huán)化酶)則為β-胡蘿卜素生物合成路徑中重要的中間產(chǎn)物。據(jù)此，實施例1.2系關(guān)于建構(gòu)一包含一crtI基因、一crtE基因、一crtYB基因(用以編碼一具備八氫茄紅素合成酶和茄紅素環(huán)化酶活性的雙功能酶)、一tHMG1基因及一Kan標(biāo)記基因的重組多核苷酸序列crtI-crtE-Kan-crtYB-tHMG1。

利用BLAST來分析茄紅素環(huán)化酶域、反-異戊烯焦磷酸合成酶合成酶及NAD(P)-結(jié)合羅斯曼相似區(qū)域的氨基酸序列(圖7a、7c和8a)?；诠δ軈^(qū)域中預(yù)測的氨基酸序列(圖7b、7d和8b)，將各基因以宿主表達(dá)的最佳化密碼子轉(zhuǎn)殖或合成后，與適當(dāng)?shù)膯幼舆B結(jié)，以建構(gòu)出特定的基因組。

藉由與實施例1.1相似的建構(gòu)策略，利用序列編號：15和16的引物以PCR擴增crtI基因，藉由限制酶AgeI和NcoI將其引入載有KlLac4啟動子的質(zhì)體pUC18中，再利用序列編號：23和29的引物以PCR擴增得到KlLac4-crtI基因組。利用序列編號：11及12的引物以PCR擴增crtE基因，藉由限制酶AgeI和NcoI將其引入載有ScPGK啟動子的質(zhì)體pUC18中，再利用序列編號：30和24的引物以PCR擴增得到ScPGK-crtE基因組。利用序列編號：94和95的引物以PCR擴增Kan基因，藉由限制酶AgeI和NcoI將其引入載有KlGapDH啟動子的質(zhì)體pUC18中，再利用序列編號：25及31放大得到KlGapDH-Kan基因組。利用序列編號：17及18的引物以PCR擴增crtYB基因，藉由限制酶AgeI和NcoI將其引入載有KlADHI啟動子的質(zhì)體pUC 18中，再利用序列編號：32和26放大得到KlADHI-crtYB基因組。利用序列編號：13和14的引物以PCR擴增tHMG1基因，藉由限制酶XhoI和NotI將其引入載有ScADHI啟動子的質(zhì)體pUC18中，再利用序列編號：27和28放大得到ScADHI-tHMG1基因組。

藉由各基因組間的同源序列，當(dāng)五組基因組共轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞馬克斯克魯維酵母后，五組基因組會自發(fā)性地重組形成一重組多核苷酸序列crtI-crtE-Kan-crtYB-tHMG1(總結(jié)于圖9及表5)。將包含該重組多核苷酸序列crtI-crtE-Kan-crtYB-tHMG1的基因工程菌株命名為Xd5.0。

表5 crtI-crtE-Kan-crtYB-tHMG1基因組

1.3crtI-crtR-crtE-Kan-crtS-crtYB-tHMG1

為使β-胡蘿卜素有效轉(zhuǎn)換為蝦紅素，將二下游蝦紅素合成基因－crtS基因(用以編碼β-胡蘿卜素加氧酶)和crtR基因(用以編碼p450還原酶)共轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞馬克斯克魯維酵母。在實施例1.3中，本發(fā)明建構(gòu)一包含一crtI基因、一crtR基因、一crtE基因、一crtS基因、一crtYB基因(用以編碼一具備八氫茄紅素合成酶和茄紅素環(huán)化酶活性的雙功能酶)、一tHMG1基因和一Kan標(biāo)記基因的重組多核苷酸序列crtI-crtR-crtE-Kan-crtS-crtYB-tHMG1。

以催化域來分析β-胡蘿卜素加氧酶和p450還原酶的保留區(qū)域(圖10a和11a)。此外，亦分析各保留性區(qū)域中的保留性殘基(圖10b、11b和11c)。依據(jù)分析結(jié)果來建構(gòu)重組多核苷酸序列crtI-crtR-crtE-Kan-crtS-crtYB-tHMG1中的密碼子。藉由相似的PGASO建構(gòu)方法，利用序列編號：15和16的引物以PCR擴增crtI基因，再利用限制酶AgeI和NcoI將其轉(zhuǎn)殖于載有KlLac4啟動子的質(zhì)體pUC18中，之后利用序列編號：23和33的引物以PCR擴增得到KlLac4-crtI基因組。利用序列編號：19和20的引物以PCR擴增crtR基因，再利用限制酶SfiI和NcoI將其轉(zhuǎn)殖于載有ScGapDH啟動子的質(zhì)體pUC18中，之后利用序列編號：34和29的引物以PCR擴增得到ScGapDH-crtRI基因組。利用序列編號：11和12的引物以PCR擴增crtE基因，再利用限制酶AgeI和NcoI將其轉(zhuǎn)殖于載有ScPGK啟動子的質(zhì)體pUC18中，之后利用序列編號：30和24的引物以PCR擴增得到ScPGK-crtE基因組。利用序列編號：98和99的引物以PCR擴增Kan基因，再利用限制酶AgeI和NcoI將其轉(zhuǎn)殖于載有KlGapDH啟動子的質(zhì)體pUC18中，之后利用序列編號：25和35的引物以PCR擴增得到KlGapDH-Kan基因組。利用序列編號：21和22的引物以PCR擴增crtS基因，再利用限制酶AgeI和NcoI將其轉(zhuǎn)殖于載有KlPGK啟動子的質(zhì)體pUC18中，之后利用序列編號：36和31的引物以PCR擴增得到KlPGK-crtS基因組。利用序列編號：17和18的引物以PCR擴增crtYB基因，再利用限制酶AgeI和NotI將其轉(zhuǎn)殖于載有KlADHI啟動子的質(zhì)體pUC18中，之后利用序列編號：32和26的引物以PCR擴增得到KlADHI-crtYB基因組。利用序列編號：13和14的引物以PCR擴增tHMG1基因，再利用限制酶NotI和XhoI將其轉(zhuǎn)殖于載有ScADHI啟動子的質(zhì)體pUC18中，之后利用序列編號：27和28的引物以PCR擴增得到ScADHI-tHMG1基因組。

當(dāng)將七組基因組共轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞馬克斯克魯維酵母后，七組基因組會藉由基因組間的同源序列而自發(fā)性地重組形成一重組多核苷酸序列crtI-crtR-crtE-Kan-crtS-crtYB-tHMG1(總結(jié)于圖12和表6)。將包含該重組多核苷酸序列crtI-crtR-crtE-Kan-crtS-crtYB-tHMG1的基因工程菌株命名為Xd7-3。

表6 crtI-crtR-crtE-Kan-crtS-crtYB-tHMG1基因組

基因工程菌株Xd7-3應(yīng)可用以制備紅色類胡蘿卜素－3R、3’R-蝦紅素立體異構(gòu)物。然而，隨著黃色類胡蘿卜素(β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì))的表達(dá)累積，可發(fā)現(xiàn)Xd7-3會呈現(xiàn)的黃色(圖13a和表7)。推測可能原因為紅發(fā)夫酵母的β-胡蘿卜素加氧酶和P450還原酶的酶功效不佳，或/和ScPGapDH的啟動子強度過低。

表7.基因工程菌株野生型、Xd7-3、Cr1、Cz5和Hp9的類胡蘿卜素濃度

a數(shù)據(jù)為三次獨立實驗的平均值。類胡蘿卜素的增加倍數(shù)系相對于具有最低含量的菌株(該菌株的表達(dá)量設(shè)定為1)。

b－：無法偵測到

1.4crtI-crtE-ChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1

為了制備3S、3’S-蝦紅素立體異構(gòu)物，將二蝦紅素合成基因－bkt基因(用以編碼β-胡蘿卜素酮醇酶)和ChYb基因(用以編碼β-胡蘿卜素羥化酶)共轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞馬克斯克魯維酵母中。

為建構(gòu)重組多核苷酸序列crtI-crtE-ChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1，先分析β-胡蘿卜素酮醇酶的保留性區(qū)域的氨基酸序列(圖14a)；圖14b則為各保留性區(qū)域中的保留性殘基?；诜治鼋Y(jié)果，將各基因以宿主表達(dá)的最佳化密碼子轉(zhuǎn)殖或合成后，與KlPGK啟動子連結(jié)，以建構(gòu)出特定的基因組。

此外，為篩選出其余在蝦紅素生物合成路徑中的重要酶基因，分別由萊茵衣藻、小球藻和雨生紅球藻分離ChYb基因(即Crchyb基因、Czchyb基因和Hpchyb基因)，第15a和15b為該些基因的保留性區(qū)域分析結(jié)果。將該些基因分別以宿主表達(dá)的最佳化密碼子轉(zhuǎn)殖或合成而后，與適當(dāng)?shù)膯幼舆B結(jié)，以建構(gòu)出特定的基因組。。

利用與建構(gòu)crtE-Kan-tHMG1或crtI-crtE-Kan-crtYB-tHMG1相似的方法來建構(gòu)該重組多核苷酸序列crtI-crtE-ChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1，其中ChYb基因可以是Crchyb基因、Czchyb基因或Hpchyb基因。簡單來說，以限制酶AgeI和NcoI將crtI基因引入載有KlLac4啟動子的質(zhì)體pUC18后，利用序列編號：23和33的引物以PCR擴增得到KlLac4-crtI基因組。以限制酶AgeI和NcoI將crtE基因引入載有ScGapDH啟動子的質(zhì)體pUC 18后，利用序列編號：34和29的引物以PCR擴增得到ScGapDH-crtE基因組。以限制酶XhoI和NotI將ChYb基因(即Crchyb基因、Czchyb基因或Hpchyb基因)引入載有ScPGK啟動子的質(zhì)體pUC18后，利用序列編號：30和24的引物以PCR擴增得到ScPGK-ChYb基因組。以限制酶AgeI和NcoI將Kan基因引入載有KlGapDH啟動子的質(zhì)體pUC18后，利用序列編號：25和35的引物以PCR擴增得到KlGapDH-Kan基因組。以限制酶XhoI和NotI將BKT基因引入載有KlPGK啟動子的質(zhì)體pUC18后，利用序列編號：36和31的引物以PCR擴增得到KlPGK-BKT基因組。以限制酶AgeI和NotI將crtYB基因引入載有KlADHI啟動子的質(zhì)體pUC18后，利用序列編號：32和26的引物以PCR擴增得到KlADHI-crtYB基因組。以限制酶XhoI和NotI將tHMG1基因引入載有ScADHI啟動子的質(zhì)體pUC18后，利用序列編號：27和28的引物以PCR擴增得到ScADHI-tHMG1基因組。

藉由相似的建構(gòu)概念，各基因組間的同源序列可使七組基因組在宿主細(xì)胞馬克斯克魯維酵母中進(jìn)行同源重組，進(jìn)而形成一重組多核苷酸序列crtI-crtE-ChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1，其中該ChYb基因可以是Crchyb基因、Czchyb基因或Hpchyb基因(總結(jié)于圖16和表8)。

表8 crtI-crtE-ChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1基因組

接著，將建構(gòu)的重組多核苷酸序列(即crtI-crtE-Crchyb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1、crtI-crtE-Hpchyb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1和crtI-crtE-Czchyb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1)分別引入宿主細(xì)胞馬克斯克魯維酵母的基因體中(圖16)。將包含重組多核苷酸序列crtI-crtE-Hpchyb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1的基因工程菌株命名為Hp9；將包含重組多核苷酸序列crtI-crtE-Crchyb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1的基因工程菌株命名為Cr1；而將包含重組多核苷酸序列crtI-crtE-Czchyb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1的基因工程菌株命名為Cz5。

實施例2分析包含實施例1.4所述的重組多核苷酸序列的基因工程菌株

實施例2將進(jìn)一步分析實施例1.4所建構(gòu)的基因工程菌株－Cr1、Cz5和Hp9。其中，先于實施例2.1中確認(rèn)各基因組和類胡蘿卜素的表達(dá)后，再于實施例2.2來決定宿主表達(dá)類胡蘿卜素的最佳條件。

2.1實施例1.4的重組多核苷酸序列的表達(dá)

經(jīng)過10次繼代培養(yǎng)后，篩選出穩(wěn)定表達(dá)菌株Cr1、Cz5和Hp9。如第13a和表7所示，相較于Crchyb和Czchyb，Hpchyb具有較強的β-胡蘿卜素羥化酶活性。利用長-PCR方法(EmeraldAmp MAX PCR Master Mix，TaKaRa)進(jìn)一步檢驗各菌株的基因組的排列順序，可發(fā)現(xiàn)各穩(wěn)定表達(dá)的菌株皆具有原始設(shè)計的基因組排列順序(圖13b和13c)。

接著，利用50毫升的發(fā)酵培養(yǎng)液來比較各基因工程菌株的表達(dá)。經(jīng)過3天培養(yǎng)后，觀察細(xì)胞生長曲線可知，相較于野生型、Cr1和Xd7-3菌株，Hp9和Cz5菌株生長較為快速(圖17c)。該些菌株(特別是Hp9)培養(yǎng)液的顏色皆會明顯地由對照組的乳白色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t或深橘色(圖17a和17b)。

利用丙酮萃取各酵母菌中的表達(dá)色素，據(jù)以評估類胡蘿卜素于各菌株中的表達(dá)量。以全光譜紫外光/可見光分光光度計來測量類胡蘿卜素和游離形式的類胡蘿卜素化合物(包含β-胡蘿卜素、蝦紅素、斑螯黃質(zhì)和玉米黃質(zhì))的總量。所有類胡蘿卜素化合物的吸收光譜皆介于400納米到530納米之間(結(jié)果未顯示)。除了野生型，由基因工程菌株(即Xd7-3、Cr1、Cz5和Hp9)萃取出的類胡蘿卜素的吸收光譜亦介于400納米至530納米之間(圖17d)。

為分析類胡蘿卜素的成分，利用HPLC來檢驗類胡蘿卜素的成分；藉由沖提時間差可分離游離形式的類胡蘿卜素化合物，例如蝦紅素的沖提時間為7.8分鐘，玉米黃質(zhì)的沖提時間為9.7分鐘，斑螯黃質(zhì)的沖提時間為12.8分鐘，而β-胡蘿卜素的沖提時間則為32分鐘。以標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測各基因工程菌株中β-胡蘿卜素表達(dá)量；結(jié)果顯示，Xd7-3菌株的表達(dá)量為每公克244.7微克，Cr1菌株的表達(dá)量為每公克59.6微克，Cz5菌株的表達(dá)量為每公克93.9微克，而Hp9菌株的表達(dá)量則為每公克224.4微克；亦即，Hp9菌株的產(chǎn)量是Cr1菌株產(chǎn)量的3.8倍。此外，除了野生型和Xd7-3菌株，所有具有藻類bkt和ChYb基因的基因工程菌株皆可于菌株中表達(dá)累積斑螯黃質(zhì)；其中，Cr1菌株的斑螯黃質(zhì)表達(dá)累積量為每公克18.4微克，Cz5菌株的斑螯黃質(zhì)表達(dá)累積量為每公克12.8微克，而Hp9菌株的斑螯黃質(zhì)表達(dá)累積量為每公克39.8微克(表7)；亦即，Hp9菌株生產(chǎn)斑螯黃質(zhì)的速率是Cz5菌株的3.1倍。

將由萊茵衣藻萃取的藻類β-胡蘿卜素羥化酶基因Crchyb，由小球藻萃取的Czchyb基因，或由雨生紅球藻萃取的Hpchyb基因和其它6種參與合成類胡蘿卜素的基因共轉(zhuǎn)化至一酵母菌宿主的基因體中。相較于由紅發(fā)夫酵母萃取的真菌基因，三種藻類基因(即Crchyb、Czchyb和Hpchyb)皆可有效地將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)換為下游的類胡蘿卜素。此外，相較于表達(dá)Crchyb和Czchyb的菌株，表達(dá)Hpchyb的菌株可生產(chǎn)較高量的類胡蘿卜素；亦即，Hpchyb較Crchyb和Czchyb更具合成/轉(zhuǎn)換功效。該些結(jié)果指出，β-胡蘿卜素羥化酶在類胡蘿卜素的生物合成過程中扮演著重要的角色。

由HPLC于UV450納米的光譜測定結(jié)果(圖18a和18b)可知，基因工程菌株會表達(dá)游離形式的斑螯黃質(zhì)(高峰1)、游離形式的β-胡蘿卜素(高峰6)和某些未知的代謝產(chǎn)物(高峰2、3、4、5、7和8)。據(jù)此，基因工程菌株可用以制備類胡蘿卜素及其衍生物，例如玉米黃質(zhì)、3S、3’S-蝦紅素和/或其酯化衍生物。

2.2實施例1.4的重組多核苷酸序列的最佳表達(dá)條件

在本實施例中，將測定用以表達(dá)類胡蘿卜素及其衍生物的最佳條件；其中，實施例2.2.1為評估表達(dá)的最佳溫度，而實施例2.2.2則為確認(rèn)表達(dá)的最佳培養(yǎng)溶液。

2.2.1最佳溫度

為增加本發(fā)明載體的類胡蘿卜素產(chǎn)量，將一或多拷貝數(shù)的本發(fā)明載體整合至Cz5菌株；所得的基因工程菌株為Cz30菌株。相較于Cz5菌株，Cz30菌株更具一明顯的紅色轉(zhuǎn)變(圖19a)。

為評估用以制備類胡蘿卜素的最佳條件，分別將Cz5和Cz30培養(yǎng)于YPG培養(yǎng)液中，并置于25℃、30℃和37℃環(huán)境中培養(yǎng)3天。之后，可觀察到培養(yǎng)于25℃和30℃中的培養(yǎng)液(包含Cz5或Cz30)皆會轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，而培養(yǎng)于37℃中的培養(yǎng)液(包含Cz5或Cz30)則依然為乳白色(圖19b)。此外，在培養(yǎng)2天后，僅有培養(yǎng)于25℃的Cz30會轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。結(jié)果顯示，25℃為用以制備類胡蘿卜素的最佳溫度，且Cz30的產(chǎn)量高于Cz5的產(chǎn)量。

進(jìn)一步分析Cz5和Cz30菌株于不同培養(yǎng)溫度下的基因表達(dá)。將二菌株培養(yǎng)于25℃、30℃或37℃的環(huán)境中；48小時后，萃取各菌株的mRNA。如圖19c所示，不論在何種培養(yǎng)溫度下，Cz30菌株中的轉(zhuǎn)殖基因表達(dá)量皆高于Cz5菌株中的轉(zhuǎn)殖基因表達(dá)量；此結(jié)果與Cz30可產(chǎn)生高量的類胡蘿卜素，并顯著轉(zhuǎn)換為紅色的結(jié)果相符。此外，轉(zhuǎn)殖基因于30℃的表達(dá)量明顯高于25℃和37℃時的表達(dá)量。基于菌株培養(yǎng)于25℃時的顏色轉(zhuǎn)變最為明顯，25℃系為酶反應(yīng)的最佳條件(圖19c)。

基于八氫茄紅素去飽合酶(由crtI基因所編碼)和β-胡蘿卜素酮醇酶(由BKT基因所編碼)在3S、3’S-蝦紅素的生物合成過程中扮演著極為重要的角色，分別利用二個較強的啟動子－pLac4和pKlPGK來驅(qū)動該些基因的表達(dá)。據(jù)此，CrtI和CrBKT為各基因組中表達(dá)量最高的二基因(圖19c)。

HPLC光譜分析更進(jìn)一步確認(rèn)，Cz30基因工程菌株會累積較高量的β-胡蘿卜素、斑螯黃質(zhì)和酯化蝦紅素衍生物(即蝦紅素單酯體和蝦紅素雙酯體，圖20a和20b)。

上述結(jié)果顯示，相較于Cz5菌株，Cz30可產(chǎn)生較高量的類胡蘿卜素；此外，結(jié)果亦指出，25℃為生產(chǎn)胡蘿卜素的最佳溫度。

2.2.2最佳培養(yǎng)液

為確認(rèn)菌株生長時所使用的碳源，分別將野生型馬克斯克魯維酵母和基因工程菌株培養(yǎng)于包含20％葡萄糖、20％半乳糖和20％甘油的YPG培養(yǎng)液中。于25℃培養(yǎng)2天后，野生型菌株的培養(yǎng)液依舊呈現(xiàn)乳白色，而Cz30的培養(yǎng)液則會呈現(xiàn)黃色(葡萄糖)、橘色(半乳糖)或紅色(甘油)(圖21a)。結(jié)果指出，依據(jù)不同的添加物(即葡萄糖、半乳糖或甘油)，Cz30可產(chǎn)生并累積不同成分的類胡蘿卜素。不同碳源間顏色的差異有可能是因累積不同濃度的類胡蘿卜素所導(dǎo)致。亦或是，因生成不同類型的類胡蘿卜素所導(dǎo)致，例如黃色類胡蘿卜素(β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì))和粉紅色到紅色的類胡蘿卜素(斑螯黃質(zhì)、蝦紅素和其它酯化蝦紅素衍生物)(圖21a)。然而，培養(yǎng)5天后，僅培養(yǎng)于包含20％甘油的培養(yǎng)液的菌株會持續(xù)呈現(xiàn)紅色，其余培養(yǎng)于包含葡萄糖或半乳糖的培養(yǎng)液的菌株則皆會轉(zhuǎn)回乳白色。

于包含甘油的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48和72小時后，收集基因工程菌株Cz5和Cz30的檢體，并利用實時PCR試驗來分析各菌株的mRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示，不論是于25℃、30℃或37℃的環(huán)境中，48小時后，CzBKT基因的表達(dá)量皆會高于HpchyB基因的表達(dá)量(表9)。此外，培養(yǎng)72小時后，HpchyB基因的表達(dá)量則會高于CzBKT基因的表達(dá)量，據(jù)以將斑螯黃質(zhì)轉(zhuǎn)換為蝦紅素(表9)。

表9培養(yǎng)于包含20％甘油的YPG培養(yǎng)液中，基因工程菌株的基因表達(dá)量

(1)RNA表達(dá)量倍數(shù)系相對于具有最低表達(dá)量的菌株(該菌株的表達(dá)量設(shè)定為1)。

(2)-：無法偵測到

基于LC的光譜分析結(jié)果，相較于包含20％半乳糖的培養(yǎng)液，將Cz30培養(yǎng)于含有20％甘油的培養(yǎng)液中，可累積較高量的β-胡蘿卜素和斑螯黃質(zhì)(表10)。經(jīng)皂化(saponification)處理后，利用LC/MS來分析確認(rèn)所得化合物，結(jié)果顯示Cz30生產(chǎn)的類胡蘿卜素包含β-胡蘿卜素、斑螯黃質(zhì)和游離形式的蝦紅素(圖22)。

表10.野生型、Cz5和Cz30菌株所生產(chǎn)的類胡蘿卜素濃度

a—：無法偵測到

有趣的是，相較于包含其它碳源的培養(yǎng)液，培養(yǎng)于包含甘油的培養(yǎng)液的Cz30所產(chǎn)生的紅色轉(zhuǎn)變最為顯著；此結(jié)果代表Cz30將可用以發(fā)展綠色工業(yè)。此外，將Cz30培養(yǎng)于包含甘油的培養(yǎng)液5天后，其培養(yǎng)液仍持續(xù)呈現(xiàn)紅色。

接著，分別萃取類胡蘿卜素自野生型和Cz30菌株，并利用ABTS受質(zhì)反應(yīng)來分析其抗氧化功效。將菌株培養(yǎng)于25℃的YPG培養(yǎng)液72小時后，冷凍干燥菌株，再利用甲醇將色素萃出。相較于野生型(52.3％)，Cz30具有較高的自由基清除功效(72.1％)(圖23a)。有鑒于野生型菌株亦具有抗氧化能力，推估在水溶性維生素E相似物等量抗氧化能力(Trolox equivalent antioxidant capacity、TEAC)的試驗中，約有20％的去自由基能力是源自于Cz30所產(chǎn)生的類胡蘿卜素，而1克菌株(干重)的去自由基能力約等于1.95毫克的水溶性維生素E相似物(Trolox)的去自由基能力(第23b圖)。

上述結(jié)果指出，包含20％甘油的培養(yǎng)液為制備本發(fā)明類胡蘿卜素的最佳培養(yǎng)環(huán)境，而制備出的類胡蘿卜素具有抗氧化功效。

實施例3改善蝦紅素的產(chǎn)量

基于β-胡蘿卜素酮醇酶和β-胡蘿卜素羥化酶在蝦紅素的生物合成過程中極為重要，進(jìn)一步將蝦紅素合成基因組(即crtI-crtE-Hpchyb-Kan-Hpchyb-CrBKT-crtYB-tHMG1)與一額外的ChYb基因組共轉(zhuǎn)化至宿主基因體中，藉以制備基因工程菌株CA6(圖24a)。轉(zhuǎn)殖后的菌株培養(yǎng)液會呈現(xiàn)紅色。

為增加制備蝦紅素時重要酶的表達(dá)量，將蝦紅素合成酶基因－bkt(用以編碼β-胡蘿卜素酮醇酶)和ChYb(用以編碼β-胡蘿卜素羥化酶)整合至CA6菌株的rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer、ITS)；制得的基因工程菌株稱為CA6-ITS。該基因組包含aur-Hpchyb-CrBKT及一啟動子(圖24b)。Hpchyb和CrBKT的基因表達(dá)量會隨著主要酶拷貝數(shù)的增加而增加(圖24c)。

為了解細(xì)胞生長所使用的碳源，將基因工程菌株CA6-ITS培養(yǎng)于包含或不包含10％甘油的YPG培養(yǎng)液中。于25℃培養(yǎng)2天后，相較于培養(yǎng)在不包含甘油的YPG培養(yǎng)液的菌株，培養(yǎng)于包含10％甘油的YPG培養(yǎng)液的菌株會產(chǎn)生較為顯著的紅色變化(圖21b)。表11進(jìn)一步指出，10％甘油即可有效引發(fā)CA6-ITS菌株制造蝦紅素。

表11.CA6-ITS菌株所生產(chǎn)的類胡蘿卜素濃度

此外，亦將蝦紅素合成基因組與一高拷貝數(shù)表達(dá)載體RS426共轉(zhuǎn)化至宿主基因組中，以制得CA6－質(zhì)體菌株(圖24d)?；蚪M將會于宿主內(nèi)自動與質(zhì)體進(jìn)行重組；轉(zhuǎn)殖株則會呈現(xiàn)橘到紅的顏色。該高拷貝數(shù)表達(dá)載體可大量表達(dá)本發(fā)明酶，進(jìn)而更有效率地將前驅(qū)物轉(zhuǎn)換為蝦紅素。

基于HPLC的光譜分析結(jié)果，基因工程菌株CA6-ITS可生產(chǎn)游離形式的蝦紅素、玉米黃質(zhì)、斑螯黃質(zhì)和β-胡蘿卜素，其沖提時間分別為7.76、9.9、12.25和31.40分(圖24e)。蝦紅素、玉米黃質(zhì)、斑螯黃質(zhì)、和β-胡蘿卜素的產(chǎn)量則分別為每公克19.48、21.7、4.40和501.57微克(表12)。該些結(jié)果顯示，增加用以編碼β-胡蘿卜素羥化酶的ChYb的基因拷貝數(shù)/表達(dá)量可改善類胡蘿卜素的產(chǎn)量。

表12.基因工程菌株的類胡蘿卜素濃度

a—：無法偵測到

因此，本實施例提供了二種能有效將蝦紅素前驅(qū)物轉(zhuǎn)換為蝦紅素的基因工程菌株－CA6和CA6-ITS。結(jié)果亦顯示，相關(guān)基因的高拷貝數(shù)對于蝦紅素的制備極為重要。

實施例4制備單酯或雙酯形式的天然類胡蘿卜素組合物

相較于非極性的類胡蘿卜素，游離形式的蝦紅素的極性端(polar end)雖較易被生物體所吸收，然亦極易被氧化。自然界中的蝦紅素多以脂肪酸－酯類的形式存在；例如綠色藻類即具有一或二個脂肪酸，以形成較于穩(wěn)定的單酯或雙酯形式。酯化蝦紅素經(jīng)膽固醇酯酶(cholesterol esterase)水解后，可包覆于微胞(micelle)中，藉由小腸細(xì)胞的吸收作用進(jìn)入生物體內(nèi)。

本實施例將分析基因工程菌株中的類胡蘿卜素酯類及其幾何異構(gòu)物。由于克萊布特里陰性酵母菌(Crabtree negative yeast)－馬克斯克魯維酵母具有高生長率和高產(chǎn)量，且可有效將羥基團轉(zhuǎn)換形成諸如辛酸乙酯(octanoic acid-ethyl ester)、乙酸-2-苯基乙基酯(acetic acid-2-phenylethyl ester)和癸酸－乙基酯(decanoic acid-ethyl ester)等具有不同長度碳鏈的脂肪酸的單酯或雙酯結(jié)構(gòu)，因此本實施例系以該酵母菌作為宿主細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)試驗。

由藻類分離的天然蝦紅素的羥基通常會與脂肪酸鍵結(jié)，藉以形成酯化蝦紅素。相較于合成或由細(xì)菌所產(chǎn)生的非酯化蝦紅素(即游離/自由形式的蝦紅素)，酯化蝦紅素具有較高的穩(wěn)定性及較佳的生物功效。為制備單酯或雙酯形式的蝦紅素，在加入半乳糖至CA6-ITS菌株的同時或之后，加入脂肪酸(0.01％或0.1％的辛酸)。由圖25a及25b可知，相較于對照組，加入辛酸會使菌株的顏色轉(zhuǎn)換為較深的紅色。

利用質(zhì)譜分析儀(LC-MS/MS)來分析雙酯類中飽和脂肪酸的組合。結(jié)果指出，制備出的類胡蘿卜素包含非尼基葉黃素、斑螯黃質(zhì)、海膽酮、β-隱黃素、酯化金盞花紅素(esterified adonixanthin)、茄紅素、八氫西紅柿紅素、β-胡蘿卜素和酯化蝦紅素(圖26a及26b)。

實施例5分析包含本發(fā)明重組多核苷酸序列的基因工程菌株

類胡蘿卜素化合物可基于其分別位于或靠近化合物兩端的二環(huán)結(jié)構(gòu)來中和細(xì)胞內(nèi)或外的單態(tài)和三態(tài)氧分子。此外，類胡蘿卜素化合物亦可輔助Cz30減少因紫外光照射、溶劑壓力和氧化自由基(reactive oxygen species、ROS)所造成的傷害。Cz30可藉由減降生長細(xì)胞中脂質(zhì)的過度氧化來抵抗環(huán)境壓力。據(jù)此，本公開內(nèi)容的基因工程菌株可用以制備具有附加價值的代謝產(chǎn)物，并改善產(chǎn)量。

5.1增加宿主細(xì)胞對抗壓力的耐受性

圖23指出，相較于野生型，Cz30的菌株萃取物具有抗氧化功效。在本實施例中，該分別利用紫外光照、糠醛、乙醇和異丁醇處理來檢測Cz30的抗壓功效。

分別以紫外光照射野生型和Cz30菌株5、10或20分鐘；接著，連續(xù)稀釋該些菌株，并將其涂覆培養(yǎng)于YPG培養(yǎng)基。48小時后，僅少數(shù)經(jīng)紫外光照射20分鐘的Cz30可生長于YPG培養(yǎng)基(圖27a)。該結(jié)果顯示，Cz30所表達(dá)的類胡蘿卜素可有效減少紫外光的傷害，使其相較于野生型菌株具有較快的生長速度。

在生物煉制的應(yīng)用領(lǐng)域中，植物生質(zhì)(plant biomass)是地球上最豐富的可再生資源的一，且被視為發(fā)展永續(xù)經(jīng)營使用的重要基石。植物的可再生資源可轉(zhuǎn)換為生物產(chǎn)物，例如生物燃料、生物化學(xué)品、生物潤滑劑及生物可降解材料等。舉例來說，相關(guān)業(yè)界常使用諸如酸水解(acid hydrolysis)、蒸汽爆裂(steam explosion)、氨纖維膨脹(ammonia fiber expansion)、有機溶劑法(organosolv)、亞硫酸鹽預(yù)處理(sulfite pretreatment)、堿性濕氧化(alkaline wet oxidation)、臭氧預(yù)處理(ozone pretreatment)和酶處理等各式處理技術(shù)來破壞木質(zhì)纖維素(lignocellulose)，以取得植物生質(zhì)中的糖類。然而，在利用酸和蒸氣來處理木質(zhì)纖維素的過程中，往往會產(chǎn)生大量的毒性物質(zhì)，例如由半纖維素和纖維素所釋放的糠醛，由木質(zhì)素(lignin)所釋放的乙醇和醛類，以及由生物反應(yīng)劑所釋放的重金屬。因此，本實施例亦檢測Cz30菌株對糠醛的抗壓功效。如圖27b的結(jié)果所示，Cz30菌株可容忍濃度為100mM的糠醛，相較的下，野生型菌株僅能忍受約80mM的糠醛。

接著，進(jìn)一步檢測野生型和Cz30菌株對乙醇及異丁醇的耐受性。分別將菌株置于包含0、4、8或12％乙醇的環(huán)境中24小時，或是包含0、0.5、1或2％異丁醇的環(huán)境中24小時；之后，連續(xù)稀釋該些菌株，并將其涂覆培養(yǎng)于YPG培養(yǎng)基48小時。結(jié)果顯示，經(jīng)12％乙醇(圖27c)和2％異丁醇(圖27d)處理24小時后，僅少量的Cz30可維持生長。據(jù)此，類胡蘿卜素可使Cz30具備抗氧化功效，進(jìn)而有效提升對乙醇及異丁醇的抗性。

上述結(jié)果指出，類胡蘿卜素的抗氧化活性可保護宿主細(xì)胞(即Cz30)，有效抵抗紫外光照射、糠醛、乙醇和異丁醇等各式環(huán)境壓力所造成的傷害。

5.2增加宿主細(xì)胞于發(fā)酵過程中對乙醇的耐受性和產(chǎn)量

在發(fā)酵過程中，諸如乙醇等產(chǎn)物的累積往往會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性傷害，進(jìn)而限制影響整體的生產(chǎn)制備。細(xì)胞會產(chǎn)生氧化自由基來因應(yīng)外來壓力，該些自由基通常會進(jìn)一步使脂質(zhì)過氧化來攻擊細(xì)胞膜。細(xì)胞膜是生物體對外的第一道防線，可調(diào)控細(xì)胞對外來壓力的反應(yīng)，也極易受到外界有機溶液的影響。

為測試野生型和基因工程菌株Cz30對乙醇的耐受性，分別將二種菌株培養(yǎng)于包含不同濃度的乙醇的YPG培養(yǎng)液中(圖28a)。在不含乙醇的情況下，野生型和Cz30菌株具有相似的生長速度。在含有2、4或6％乙醇的培養(yǎng)環(huán)境中，可發(fā)現(xiàn)野生型菌株的生長會明顯地受到乙醇的抑制；相較的下，Cz30僅會受到輕微的影響。亦即，相較于野生型菌株，Cz30菌株在經(jīng)過24小時的乙醇培養(yǎng)后，具有較高的細(xì)胞密度(圖28a)。此結(jié)果顯示，Cz30所表達(dá)的類胡蘿卜素可減少溶劑對菌株所造成的傷害，因而相較于野生型菌株，Cz30具有較快的生長速度。

為測試乙醇的產(chǎn)量，分別將野生型和Cz30菌株培養(yǎng)于包含20％半乳糖的YPG培養(yǎng)液中。72小時后，可觀察到相較于野生型(2.5％)，Cz30會產(chǎn)生更高量的乙醇(3.5％)(圖28b)。因此，Cz30所表達(dá)的類胡蘿卜素明顯具備抗氧化功效。

上述結(jié)果指出，類胡蘿卜素可保護宿主細(xì)胞，減少發(fā)酵過程中乙醇所造成的傷害，進(jìn)而改善整體的產(chǎn)量。

5.3改善宿主細(xì)胞對毒素的耐受性和產(chǎn)量

自然界中，次級代謝物的產(chǎn)量通常會少于其前驅(qū)物。為了能得到足量的化合物，半合成(semi-synthesis)提供了一種將中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)換為最終產(chǎn)物或相似物的化學(xué)方法。然而，化學(xué)反應(yīng)往往需要大量的人力，且會造成有機污染。一般來說，次級代謝物和其前驅(qū)物皆會對宿主細(xì)胞造成毒性傷害，影響整體的合成制造。

在紫杉醇的半合成醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中，漿果赤霉素III(Baccatin III)是一極為重要的前驅(qū)物。漿果赤霉素III的前趨化合物－10-去乙酰漿果赤霉素III(10-deacetyl baccatin III,10DB)，可由觀賞植物紅豆杉(Taxus baccata)中大量萃取，是一種較為廉價且較具經(jīng)濟價值的前驅(qū)物。在處理該些前驅(qū)物和最終產(chǎn)物時，常使用乙醇作為溶劑來進(jìn)行溶解及萃取。

在本實施例中，是利用預(yù)先溶于乙醇的10-去乙酰漿果赤霉素III來分析Cz30的抗毒性功效。分別將野生型和Cz30菌株培養(yǎng)于包含0、0.8、1.6或3.2mM的10-去乙酰漿果赤霉素III的培養(yǎng)液中。24小時后，連續(xù)稀釋該些菌株，并涂覆培養(yǎng)于YPG培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時。如圖29a所示，在經(jīng)過溶于12％乙醇的3.2mM的10-去乙酰漿果赤霉素III處理后，相較于野生型，Cz30菌株具有較佳的生長狀態(tài)。此外，亦將菌株培養(yǎng)于包含不同濃度的10-去乙酰漿果赤霉素III和乙醇的YPG培養(yǎng)液中，藉以測試菌株對10-去乙酰漿果赤霉素III的耐受性(圖29b)。結(jié)果指出，在經(jīng)過0.4-1.2mM的10-去乙酰漿果赤霉素III處理后，相較于野生型，Cz30菌株具有較佳的生長狀態(tài)。相較于包含4％乙醇或6％乙醇的培養(yǎng)液，包含0.8mM的10-去乙酰漿果赤霉素III和4％乙醇的培養(yǎng)液，或是包含1.2mM的10-去乙酰漿果赤霉素III和6％乙醇的培養(yǎng)液，會對菌株產(chǎn)生更大的毒性傷害(圖29b)。進(jìn)一步利用生長曲線試驗來證實該結(jié)果，其系分別將菌株培養(yǎng)于包含0.8mM的10-去乙酰漿果赤霉素III和4％乙醇的培養(yǎng)液(圖30a)，或是包含1.2mM的10-去乙酰漿果赤霉素III和6％乙醇的培養(yǎng)液(圖30b)。

上述結(jié)果指出，類胡蘿卜素可保護宿主細(xì)胞，減少生醫(yī)藥物的前驅(qū)物(例如10-去乙酰漿果赤霉素III)對細(xì)胞造成的毒性傷害。此外，亦利用基因工程菌株來測試10-去乙酰漿果赤霉素III與漿果赤霉素III(baccatin III)之間的生物轉(zhuǎn)換(圖31)。結(jié)果指出，相較于其它菌株，包含較高濃度的類胡蘿卜素的YD8菌株，可將10-去乙酰漿果赤霉素III轉(zhuǎn)換為更多的漿果赤霉素III(表13)。結(jié)果指出，包含類胡蘿卜素的菌株可改善其生物轉(zhuǎn)換能力。

表13.基因工程菌株的漿果赤霉素III生物轉(zhuǎn)換

-無法偵測

總結(jié)上述，本公開內(nèi)容提供了不同的重組多核苷酸序列，該些重組多核苷酸序列皆可用于活體中制備類胡蘿卜素?；诒景l(fā)明重組多核苷酸序列具備高產(chǎn)量的特性，本公開內(nèi)容建立數(shù)株分別包含不同重組多核苷酸序列的基因工程菌株。此外，本公開內(nèi)容亦確認(rèn)用以表達(dá)本發(fā)明重組多核苷酸序列/基因工程菌株的最佳條件；該表達(dá)條件可大幅提升產(chǎn)量，進(jìn)而提供科學(xué)或產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域一種生物合成蝦紅素的新方法。利用本發(fā)明重組多核苷酸序列所制備的產(chǎn)物可保護基因轉(zhuǎn)殖細(xì)胞，避免受到環(huán)境壓力、發(fā)酵產(chǎn)物或生醫(yī)藥物的前驅(qū)物所造成的傷害；藉以提升基因轉(zhuǎn)殖細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用性。

雖然上文實施方式中揭露了本發(fā)明的具體實施例，然其并非用以限定本發(fā)明，本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者，在不悖離本發(fā)明的原理與精神的情形下，當(dāng)可對其進(jìn)行各種更動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍當(dāng)以附隨申請專利范圍所界定者為準(zhǔn)。

序列表

<110> 中央研究院

李文雄

<120> 用以制備蝦紅素的重組多核苷酸序列及其應(yīng)用

<130> 5454/0147PWO2

<160> 99

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1128

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crtE 基因

<400> 1

atggactacg ccaacatcct caccgccatc cccctcgagt tcacccccca ggacgacatc 60

gtcctcctcg agccctacca ctacctcggc aagaaccccg gcaaggagat ccgctcccag 120

ctcatcgagg ccttcaacta ctggctcgac gtcaagaagg aggacctcga ggtcatccag 180

aacgtcgtcg gcatgctcca caccgcctcc ctcctcatgg acgacgtcga ggactcctcc 240

gtcctccgcc gcggctcccc cgtcgcccac ctcatctacg gcatccccca gaccatcaac 300

accgccaact acgtctactt cctcgcctac caggagatct tcaagctccg ccccaccccc 360

atccccatgc ccgtcatccc cccctcctcc gcctccctcc agtcctccgt ctcctccgcc 420

tcctcctcct cctccgcctc ctccgagaac ggcggcacct ccacccccaa ctcccagatc 480

cccttctcca aggacaccta cctcgacaag gtcatcaccg acgagatgct ctccctccac 540

cgcggccagg gcctcgagct cttctggcgc gactccctca cctgcccctc cgaggaggag 600

tacgtcaaga tggtcctcgg caagaccggc ggcctcttcc gcatcgccgt ccgcctcatg 660

atggccaagt ccgagtgcga catcgacttc gtccagctcg tcaacctcat ctccatctac 720

ttccagatcc gcgacgacta catgaacctc cagtcctccg agtacgccca caacaagaac 780

ttcgccgagg acctcaccga gggcaagttc tccttcccca ccatccactc catccacgcc 840

aacccctcct cccgcctcgt catcaacacc ctccagaaga agtccacctc ccccgagatc 900

ctccaccact gcgtcaacta catgcgcacc gagacccact ccttcgagta cacccaggag 960

gtcctcaaca ccctctccgg cgccctcgag cgcgagctcg gccgcctcca gggcgagttc 1020

gccgaggcca actccaagat cgacctcggc gacgtcgagt ccgagggccg caccggcaag 1080

aacgtcaagc tcgaggccat cctcaagaag ctcgccgaca tccccctc 1128

<210> 2

<211> 1638

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HMG1 基因

<400> 2

atggagctca ccgccaacga catccagaag aagcgcgccg ccaagctcgt ccccaagccc 60

tactccaacc acaacgagaa gcagtccccc tcctcctccg cctccaacga gaccaaggtc 120

gagaccatca ccgagcgcat gcccgtcgtc gcctccatcc agcacgagat cgacaccgag 180

tccgactccg acaacggccc ctccgaggtc cgccccgtcg aggagctcgt cgaggtcctc 240

aagggcggcg acgtcaagtc cctctccaac cgcgaggtcg tctccctcgt cgtcgccaac 300

aagctccccc tctacgccct cgagaagcag ctcggcgaca ccacccgcgc cgtcgtcgtc 360

cgccgcaagg ccctcgccat cctcgccgac gcccccgtcc tcaccaccga gcgcctcccc 420

tacaagaact acgactacaa ccgcgtcttc ggcgcctgct gcgagaacgt catcggctac 480

atgcccctcc ccgtcggcgt catcggcccc ctcatgatcg acggcgtcta ctaccacatc 540

cccatggcca ccaccgaggg ctgcctcgtc gcctccgcca tgcgcggctg caaggccatc 600

aactccggcg gcggcgtcac caccgtcctc accaaggacg gcatgacccg cggcccctgc 660

gtccgcttcc cctccctcaa gcgcgccggc gcctgcaaga tctggctcga ctccgaggag 720

ggccagaaca agatcaagaa ggccttcaac tccacctccc gcttcgcccg cctccagcac 780

gtccagaccg ccctcgccgg cgacctcctc ttcatccgct tccgcaccac caccggcgac 840

gccatgggca tgaacatgat ctccaagggc gtcgagttct ccctccacca gatggtcgag 900

gagtacggct ggaaggacat ggagatcgtc tccgtctccg gcaactactg catggacaag 960

aagcccgccg ccatcaactg gatcgagggc cgcggcaagt ccgtcgtcgc cgaggccaac 1020

atccccggcg acgtcgtccg caaggtcctc aagtccgacg tcaaggccct cgtcgacctc 1080

aacatctcca agaacctcat cggctccgcc atggccggct ccatcggcgg cttcaacgcc 1140

cacgcctcca acctcgtcac cgccgtctac ctcgccctcg gccaggaccc cgcccagaac 1200

gtcgagtcct ccaactgcat gaccctcatg aaggaggtcg acggcgacct ccgcatctcc 1260

gtctccatgc cctccatcga ggtcggcacc atcggcggcg gcaccatcct cgagccccag 1320

tccgccatgc tcgacctcct cggcgtccgc ggcccccacc ccaccgagcc cggcaagaac 1380

gcccgccagc tcgccaagat cgtcgcctcc gccgtcatgg ccggcgagct ctccctctgc 1440

tccgccctcg ccgccggcca cctcgtccag tcccacatgg tccacaaccg cgccaagcag 1500

cccgtcgcca ccggcgccgg cgcccccgtc tccggccccg gccccgtctc cacccccgcc 1560

atggccacca acggcaagga gctctccgcc gagcagctca agaccctcaa ggagggctcc 1620

gtcatctgca tcaagtcc 1638

<210> 3

<211> 1746

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crtI 基因

<400> 3

atgggcaagg agcaggacca ggacaagccc accgccatca tcgtcggctg cggcatcggc 60

ggcatcgcca ccgccgcccg cctcgccaag gagggcttcc aggtcaccgt cttcgagaag 120

aacgactact ccggcggccg ctgctccctc atcgagcgcg acggctaccg cttcgaccag 180

ggcccctccc tcctcctcct ccccgacctc ttcaagcaga ccttcgagga cctcggcgag 240

aagatggagg actgggtcga cctcatcaag tgcgagccca actacgtctg ccacttccac 300

gacgaggaga ccttcaccct ctccaccgac atggccctcc tcaagcgcga ggtcgagcgc 360

ttcgagggca aggacggctt cgaccgcttc ctctccttca tccaggaggc ccaccgccac 420

tacgagctcg ccgtcgtcca cgtcctccag aagaacttcc ccggcttcgc cgccttcctc 480

cgcctccagt tcatcggcca gatcctcgcc ctccacccct tcgagtccat ctggacccgc 540

gtctgccgct acttcaagac cgaccgcctc cgccgcgtct tctccttcgc cgtcatgtac 600

atgggccagt ccccctactc cgcccccggc acctactccc tcctccagta caccgagctc 660

accgagggca tctggtaccc ccgcggcggc ttctggcagg tccccaacac cctcctccag 720

atcgtcaagc gcaacaaccc ctccgccaag ttcaacttca acgcccccgt ctcccaggtc 780

ctcctctccc ccgccaagga ccgcgccacc ggcgtccgcc tcgagtccgg cgaggagcac 840

cacgccgacg tcgtcatcgt caacgccgac ctcgtctacg cctccgagca cctcatcccc 900

gacgacgccc gcaacaagat cggccagctc ggcgaggtca agcgctcctg gtgggccgac 960

ctcgtcggcg gcaagaagct caagggctcc tgctcctccc tctccttcta ctggtccatg 1020

gaccgcatcg tcgacggcct cggcggccac aacatcttcc tcgccgagga cttcaagggc 1080

tccttcgaca ccatcttcga ggagctcggc ctccccgccg acccctcctt ctacgtcaac 1140

gtcccctccc gcatcgaccc ctccgccgcc cccgagggca aggacgccat cgtcatcctc 1200

gtcccctgcg gccacatcga cgcctccaac ccccaggact acaacaagct cgtcgcccgc 1260

gcccgcaagt tcgtcatcca caccctctcc gccaagctcg gcctccccga cttcgagaag 1320

atgatcgtcg ccgagaaggt ccacgacgcc ccctcctggg agaaggagtt caacctcaag 1380

gacggctcca tcctcggcct cgcccacaac ttcatgcagg tcctcggctt ccgcccctcc 1440

acccgccacc ccaagtacga caagctcttc ttcgtcggcg cctccaccca ccccggcacc 1500

ggcgtcccca tcgtcctcgc cggcgccaag ctcaccgcca accaggtcct cgagtccttc 1560

gaccgctccc ccgcccccga ccccaacatg tccctctccg tcccctacgg caagcccctc 1620

aagtccaacg gcaccggcat cgactcccag gtccagctca agttcatgga cctcgagcgc 1680

tgggtctacc tcctcgtcct cctcatcggc gccgtcatcg cccgctccgt cggcgtcctc 1740

gccttc 1746

<210> 4

<211> 2019

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crtYB 基因

<400> 4

atgaccgccc tcgcctacta ccagatccac ctcatctaca ccctccccat cctcggcctc 60

ctcggcctcc tcacctcccc catcctcacc aagttcgaca tctacaagat ctccatcctc 120

gtcttcatcg ccttctccgc caccaccccc tgggactcct ggatcatccg caacggcgcc 180

tggacctacc cctccgccga gtccggccag ggcgtcttcg gcaccttcct cgacgtcccc 240

tacgaggagt acgccttctt cgtcatccag accgtcatca ccggcctcgt ctacgtcctc 300

gccacccgcc acctcctccc ctccctcgcc ctccccaaga cccgctcctc cgccctctcc 360

ctcgccctca aggccctcat ccccctcccc atcatctacc tcttcaccgc ccacccctcc 420

ccctcccccg accccctcgt caccgaccac tacttctaca tgcgcgccct ctccctcctc 480

atcacccccc ccaccatgct cctcgccgcc ctctccggcg agtacgcctt cgactggaag 540

tccggccgcg ccaagtccac catcgccgcc atcatgatcc ccaccgtcta cctcatctgg 600

gtcgactacg tcgccgtcgg ccaggactcc tggtccatca acgacgagaa gatcgtcggc 660

tggcgcctcg gcggcgtcct ccccatcgag gaggccatgt tcttcctcct caccaacctc 720

atgatcgtcc tcggcctctc cgcctgcgac cacacccagg ccctctacct cctccacggc 780

cgcaccatct acggcaacaa gaagatgccc tcctccttcc ccctcatcac cccccccgtc 840

ctctccctct tcttctcctc ccgcccctac tcctcccagc ccaagcgcga cctcgagctc 900

gccgtcaagc tcctcgagaa gaagtcccgc tccttcttcg tcgcctccgc cggcttcccc 960

tccgaggtcc gcgagcgcct cgtcggcctc tacgccttct gccgcgtcac cgacgacctc 1020

atcgactccc ccgaggtctc ctccaacccc cacgccacca tcgacatggt ctccgacttc 1080

ctcaccctcc tcttcggccc ccccctccac ccctcccagc ccgacaagat cctctcctcc 1140

cccctcctcc ccccctccca cccctcccgc cccaccggca tgtaccccct cccccccccc 1200

ccctccctct cccccgccga gctcgtccag ttcctcaccg agcgcgtccc cgtccagtac 1260

cacttcgcct tccgcctcct cgccaagctc cagggcctca tcccccgcta ccccctcgac 1320

gagctcctcc gcggctacac caccgacctc atcttccccc tctccaccga ggccgtccag 1380

gcccgcaaga cccccatcga gaccaccgcc gacctcctcg actacggcct ctgcgtcgcc 1440

ggctccgtcg ccgagctcct cgtctacgtc tcctgggcct ccgccccctc ccaggtcccc 1500

gccaccatcg aggagcgcga ggccgtcctc gtcgcctccc gcgagatggg caccgccctc 1560

cagctcgtca acatcgcccg cgacatcaag ggcgacgcca ccgagggccg cttctacctc 1620

cccctctcct tcttcggcct ccgcgacgag tccaagctcg ccatccccac cgactggacc 1680

gagccccgcc cccaggactt cgacaagctc ctctccctct ccccctcctc caccctcccc 1740

tcctccaacg cctccgagtc cttccgcttc gagtggaaga cctactccct ccccctcgtc 1800

gcctacgccg aggacctcgc caagcactcc tacaagggca tcgaccgcct ccccaccgag 1860

gtccaggccg gcatgcgcgc cgcctgcgcc tcctacctcc tcatcggccg cgagatcaag 1920

gtcgtctgga agggcgacgt cggcgagcgc cgcaccgtcg ccggctggcg ccgcgtccgc 1980

aaggtcctct ccgtcgtcat gtccggctgg gagggccag 2019

<210> 5

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CrChYb 基因

<400> 5

atgatgctcg cctcccgccc cgccgtcgcc ctcggcgccc gcgcccagcc ccaggtcctc 60

cgccccaccc tcgtcccccg ccccggcatg gtctccaacc tccgcctcca gcccgtcaag 120

gtcgccgacc ccatcgtcgc ctccgagacc tcccaggtca tggaggcccc ccaggagaag 180

aagctctccg agttcgagct caagcgcctc gagcgcaagc agcagcgcgc ccaggaggcc 240

gccacctaca agttctccgc catcgccgcc accgtcctcg tcctctccat cgccgtcgtc 300

gccacctact accgcttcgc ctggcacttc gccgaggacg gcgacctccc cgtcgacgag 360

atggccgcca ccctcctcct cgtcttcggc ggcatgttcg gcatggagat gtacgcccgc 420

ttcgcccaca aggtcctctg gcacgacttc gagcccggct gggccctcca caagtcccac 480

cacgagcccc gcaccggccc cttcgagctc aacgacatct acgccgtcgc caacgccctc 540

cccgccatgg ccctctgcgc ctacggcttc ttcacccccc acgtcatcgg cggcgtctgc 600

ttcggcgccg gcctcggcat caccctcttc ggcatcgcct acatgttctt ccacgacggc 660

ctcgtccacc gccgcttccc cgtcggcccc atcgccaacc tcccctacat gaagcgcatc 720

atggtcgccc accagatcca ccacaccaac aagttcggcg gcgtcccctt cggcatgttc 780

ctcggcgtcc aggagctcga ggccgtcccc ggcggcaagg aggagctcga caagctcatg 840

gccgacctcg aggcccgcga ggccgccgcc gccaaggccg ccggctcctc c 891

<210> 6

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CzChYb 基因

<400> 6

atgcagaccg tcttccagcc ctcctccgtc tggcacctcc gcaaccgcca cgtcctcggc 60

gaccgcacct gcgtcccctg ccgcacctcc ctctccacct gccgccacgc cgtccgcctc 120

gtccgcgcca acgtcgccga gacccaggcc acccccacca cctcccagat gctcgaggag 180

gtccacgacg agtcccacgc cgcctccgcc tcctcccaga tcttcgagct cgccgtcaag 240

acctccatca agcgccagca gcgcaaccgc cagcagctca cctaccaggg ctccgccatc 300

gccgcctccc tcggcgtcgg cgccctcgcc gtcgccgcca cccactacaa gttctcctac 360

cacatgccct ccgagtcccc cttcccctgg ctcgacatgg ccggcaccct cgccctcgtc 420

atcggcggcg tcttcggcat ggagatgtgg gcccgctacg cccacaaggc cctctggcac 480

gacttccagc ccggctgggc cctccacaag tcccaccacg agccccgcat cggccccttc 540

gaggccaacg acatcttcgc cgtcatcaac gccgtccccg ccttctccct ctgcctctac 600

ggcttcctca cccccaacct cgtcggctcc ctctgcttcg gcgccggcct cggcatcacc 660

ctcttcggca tcatgtacat gttcatccac gacggcctcg tccacaagcg cttccccgtc 720

ggccccatcg cccagatgcc cgccatgaag cgcgtcgcca tcgcccacaa gctccaccac 780

tccgagaagt acggcggcgt cccctggggc atgttcttcg gcccccagga gctcgaggcc 840

atcggcgccg gccccgagct cgaccgcctc tgcgccgagc tcgactccaa gtcctcc 897

<210> 7

<211> 879

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HpChYb 基因

<400> 7

atgctctcca agctccagtc catctccgtc aaggcccgcc gcgtcgagct cgcccgcgac 60

atcacccgcc ccaaggtctg cctccacgcc cagcgctgct ccctcgtccg cctccgcgtc 120

gccgcccccc agaccgagga ggccctcggc accgtccagg ccgccggcgc cggcgacgag 180

cactccgccg acgtcgccct ccagcagctc gaccgcgcca tcgccgagcg ccgcgcccgc 240

cgcaagcgcg agcagctctc ctaccaggcc gccgccatcg ccgcctccat cggcgtctcc 300

ggcatcgcca tcttcgccac ctacctccgc ttcgccatgc acatgaccgt cggcggcgcc 360

gtcccctggg gcgaggtcgc cggcaccctc ctcctcgtcg tcggcggcgc cctcggcatg 420

gagatgtacg cccgctacgc ccacaaggcc atctggcacg agtcccccct cggctggctc 480

ctccacaagt cccaccacac cccccgcacc ggccccttcg aggccaacga cctcttcgcc 540

atcatcaacg gcctccccgc catgctcctc tgcaccttcg gcttctggct ccccaacgtc 600

ctcggcgccg cctgcttcgg cgccggcctc ggcatcaccc tctacggcat ggcctacatg 660

ttcgtccacg acggcctcgt ccaccgccgc ttccccaccg gccccatcgc cggcctcccc 720

tacatgaagc gcctcaccgt cgcccaccag ctccaccact ccggcaagta cggcggcgcc 780

ccctggggca tgttcctcgg cccccaggag ctccagcaca tccccggcgc cgccgaggag 840

gtcgagcgcc tcgtcctcga gctcgactgg tccaagcgc 879

<210> 8

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> bkt 基因

<400> 8

atgggccccg gcatccagcc cacctccgcc cgcccctgct cccgcaccaa gcactcccgc 60

ttcgccctcc tcgccgccgc cctcaccgcc cgccgcgtca agcagttcac caagcagttc 120

cgctcccgcc gcatggccga ggacatcctc aagctctggc agcgccagta ccacctcccc 180

cgcgaggact ccgacaagcg caccctccgc gagcgcgtcc acctctaccg ccccccccgc 240

tccgacctcg gcggcatcgc cgtcgccgtc accgtcatcg ccctctgggc caccctcttc 300

gtctacggcc tctggttcgt caagctcccc tgggccctca aggtcggcga gaccgccacc 360

tcctgggcca ccatcgccgc cgtcttcttc tccctcgagt tcctctacac cggcctcttc 420

atcaccaccc acgacgccat gcacggcacc atcgccctcc gcaaccgccg cctcaacgac 480

ttcctcggcc agctcgccat ctccctctac gcctggttcg actactccgt cctccaccgc 540

aagcactggg agcaccacaa ccacaccggc gagccccgcg tcgaccccga cttccaccgc 600

ggcaacccca acctcgccgt ctggttcgcc cagttcatgg tctcctacat gaccctctcc 660

cagttcctca agatcgccgt ctggtccaac ctcctcctcc tcgccggcgc ccccctcgcc 720

aaccagctcc tcttcatgac cgccgccccc atcctctccg ccttccgcct cttctactac 780

ggcacctacg tcccccacca ccccgagaag ggccacaccg gcgccatgcc ctggcaggtc 840

tcccgcacct cctccgcctc ccgcctccag tccttcctca cctgctacca cttcgacctc 900

cactgggagc accaccgctg gccctacgcc ccctggtggg agctccccaa gtgccgccag 960

atcgcccgcg gcgccgccct cgcccccggc cccctccccg tccccgccgc cgccgccgcc 1020

accgccgcca ccgccgccgc cgccgccgcc gccaccggct cccccgcccc cgcctcccgc 1080

gccggctccg cctcctccgc ctccgccgcc gcctccggct tcggctccgg ccactccggc 1140

tccgtcgccg cccagcccct ctcctccctc cccctcctct ccgagggcgt caagggcctc 1200

gtcgagggcg ccatggagct cgtcgccggc ggctcctcct ccggcggcgg cggcgagggc 1260

ggcaagcccg gcgccggcga gcacggcctc ctccagcgcc agcgccagct cgcccccgtc 1320

ggcgtcatgg cc 1332

<210> 9

<211> 2238

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crtR 基因

<400> 9

atggccaccc tctccgacct cgtcatcctc ctcctcggcg ccctcctcgc cctcggcttc 60

tacaacaagg accgcctcct cggctcctcc tcctcctccg cctccaccac ctccggctcc 120

tccgccgcca ccgccaacgg ctccaagccc acctactcca acggcaacgg caacgccttc 180

aagggcgacc cccgcgactt cgtcgcccgc atgaaggacc agaagaagcg cctcgccgtc 240

ttctacggct cccagaccgg caccgccgag gagtacgcca cccgcatcgc caaggaggcc 300

aagtcccgct tcggcgtctc ctccctcgtc tgcgacatcg aggagtacga cttcgagaag 360

ctcgaccagg tccccgagga ctgcgccatc gtcttctgca tggccaccta cggcgagggc 420

gagcccaccg acaacgccgt ccagttcatc gagatgatct cccaggacga ccccgagttc 480

tccgagggct ccaccctcga cggcctcaag tacgtcgtct tcggcctcgg caacaagacc 540

tacgagcagt acaacgtcgt cggccgccag ctcgacgccc gcctcaccgc cctcggcgcc 600

acccgcgtcg gcgagcgcgg cgagggcgac gacgacaagt ccatggagga ggactacctc 660

gcctggaagg acgacatgtt cgccgccctc gccaccaccc tctccttcga ggagggcgcc 720

tccggcgaga cccccgactt cgtcgtcacc gaggtcccca accaccccat cgagaaggtc 780

ttccagggcg agctctcctc ccgcgccctc ctcggctcca agggcgtcca cgacgccaag 840

aacccctacg cctcccccgt cctcgcctgc cgcgagctct tcaccggcgg cgaccgcaac 900

tgcatccacc tcgagttcga catcaccggc tccggcatca cctaccagac cggcgaccac 960

gtcgccgtct ggccctccaa ccccgacgtc gaggtcgagc gcctcctcgc cgtcctcggc 1020

ctcacctccc ccgagaagcg ccgcatgatc atccaggtcg tctccctcga ccccaccctc 1080

gccaaggtcc ccttccccac ccccaccacc tacgacgccg tcttccgcca ctacctcgac 1140

atctccgccg tcgcctcccg ccagaccctc gccgtcctcg ccaagtacgc cccctccgag 1200

caggccgccg agttcctcac ccgcctcggc accgacaagc aggcctacca caccgaggtc 1260

gtcggcggcc acctccgcct cgccgaggtc ctccagctcg ccgccggcaa cgacatcacc 1320

gtcatgccca ccgccgagaa caccaccgtc tggaacatcc ccttcgacca cgtcgtctcc 1380

gacgtctccc gcctccagcc ccgcttctac tccatctcct cctcccccaa gctccacccc 1440

aactccatcc acgtcaccgc cgtcatcctc aagtacgagt cccaggccac cgaccgccac 1500

cccgcccgct gggtcttcgg cctcggcacc aactacctcc tcaacgtcaa gcaggccgcc 1560

aacaacgaga ccacccccat gatctccgac ggccaggacg acgtccccga gcacgtctcc 1620

gcccccaagt acaccctcga gggcccccgc ggctcctaca agcacgacga ccagctcttc 1680

aaggtcccca tccacgtccg ccgctccacc ttccgcctcc ccacctcccc caagatcccc 1740

gtcatcatga tcggccccgg caccggcgtc gcccccttcc gcggcttcat ccaggagcgc 1800

atcgccctcg cccgccgctc catcgccaag aacggccccg acgccctcgc cgactgggcc 1860

cccatctacc tcttctacgg ctcccgcgac gagcaggact tcctctacgc cgaggagtgg 1920

cccgcctacg aggccgagct ccagggcaag ttcaagatcc acgtcgcctt ctcccgctcc 1980

ggcccccgca agcccgacgg ctccaagatc tacgtccagg acctcctctg ggaccagaag 2040

gaggtcatca agtccgccat cgtcgagaag cgcgcctccg tctacatctg cggcgacggc 2100

cgcaacatgt ccaaggacgt cgagcagaag ctcgccgcca tgctcgccga gtccaagaac 2160

ggctccgccg ccgtcgaggg cgccgccgag gtcaagtccc tcaaggagcg ctcccgcctc 2220

ctcatggacg tctggtcc 2238

<210> 10

<211> 1671

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> crtS 基因

<400> 10

atgttcatcc tcgtcctcct caccggcgcc ctcggcctcg ccgccttctc ctgggcctcc 60

atcgccttct tctccctcta cctcgccccc cgccgctcct ccctctacaa cctccagggc 120

cccaaccaca ccaactactt caccggcaac ttcctcgaca tcctctccgc ccgcaccggc 180

gaggagcacg ccaagtaccg cgagaagtac ggctccaccc tccgcttcgc cggcatcgcc 240

ggcgcccccg tcctcaactc caccgacccc aaggtcttca accacgtcat gaaggaggcc 300

tacgactacc ccaagcccgg catggccgcc cgcgtcctcc gcatcgccac cggcgacggc 360

gtcgtcaccg ccgagggcga ggcccacaag cgccaccgcc gcatcatgat cccctccctc 420

tccgcccagg ccgtcaagtc catggtcccc atcttcctcg agaagggcat ggagctcgtc 480

gacaagatga tggaggacgc cgccgagaag gacatggccg tcggcgagtc cgccggcgag 540

aagaaggcca cccgcctcga gaccgagggc gtcgacgtca aggactgggt cggccgcgcc 600

accctcgacg tcatggccct cgccggcttc gactacaagt ccgactccct ccagaacaag 660

accaacgagc tctacgtcgc cttcgtcggc ctcaccgacg gcttcgcccc caccctcgac 720

tccttcaagg ccatcatgtg ggacttcgtc ccctacttcc gcaccatgaa gcgccgccac 780

gagatccccc tcacccaggg cctcgccgtc tcccgccgcg tcggcatcga gctcatggag 840

cagaagaagc aggccgtcct cggctccgcc tccgaccagg ccgtcgacaa gaaggacgtc 900

cagggccgcg acatcctctc cctcctcgtc cgcgccaaca tcgccgccaa cctccccgag 960

tcccagaagc tctccgacga ggaggtcctc gcccagatct ccaacctcct cttcgccggc 1020

tacgagacct cctccaccgt cctcacctgg atgttccacc gcctctccga ggacaaggcc 1080

gtccaggaca agctccgcga ggagatctgc cagatcgaca ccgacatgcc caccctcgac 1140

gagctcaacg ccctccccta cctcgaggcc ttcgtcaagg agtccctccg cctcgacccc 1200

ccctccccct acgccaaccg cgagtgcctc aaggacgagg acttcatccc cctcgccgag 1260

cccgtcatcg gccgcgacgg ctccgtcatc aacgaggtcc gcatcaccaa gggcaccatg 1320

gtcatgctcc ccctcttcaa catcaaccgc tccaagttca tctacggcga ggacgccgag 1380

gagttccgcc ccgagcgctg gctcgaggac gtcaccgact ccctcaactc catcgaggcc 1440

ccctacggcc accaggcctc cttcatctcc ggcccccgcg cctgcttcgg ctggcgcttc 1500

gccgtcgccg agatgaaggc cttcctcttc gtcaccctcc gccgcgtcca gttcgagccc 1560

atcatctccc accccgagta cgagcacatc accctcatca tctcccgccc ccgcatcgtc 1620

ggccgcgaga aggagggcta ccagatgcgc ctccaggtca agcccgtcga g 1671

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物_crtE 基因_AgeI

<400> 11

accggtatgg attacgcgaa catcct 26

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物_crtE 基因_NcoI

<400> 12

ccatggtcac agagggatat cggcta 26

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物_HMG1 基因_NotI

<400> 13

gcggccgcat ggaactaact gctaatga 28

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物_HMG1 基因_XhoI

<400> 14

ctcgagtcac gatttgatgc aaatca 26

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物_crtI 基因_AgeI

<400> 15

accggtatgg gaaaagaaca agatca 26

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物_crtI 基因_NcoI

<400> 16

ccatggtcag aaagcaagaa caccaa 26

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物_crtYB 基因_AgeI

<400> 17

accggtatga cggctctcgc atatta 26

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物_crtYB 基因_NotI

<400> 18

gcggccgctt actgcccttc ccatccgc 28

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物_crtR 基因_NcoI

<400> 19

ccatggatgg ccacactctc cgatct 26

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物_crtR 基因_SfiI

<400> 20

ggcccaacag gccctacgac cagacgtcca tca 33

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物_crtS 基因_AgeI

<400> 21

accggtatgt tcatcttggt cttgct 26

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物_crtS 基因_NcoI

<400> 22

ccatggtcat tcgaccggct tgacct 26

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-KlPLac4

<400> 23

ccgcggggat cgactcataa aatag 25

<210> 24

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-ScTTPGK_KlPGapDH

<400> 24

ggactccagc ttttccattt gccttcgcgc ttgcctgtac ggtcgttacc atactaagct 60

ttttcgaaac gcagaatttt cg 82

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-KlPGapDH

<400> 25

agtatggtaa cgaccgtaca ggcaa 25

<210> 26

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-ScTTGap_ScPADHI

<400> 26

ggaatcccga tgtatgggtt tggttgccag aaaagaggaa gtccatattg tacactggcg 60

gaaaaaattc atttgtaa 78

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-ScPADHI

<400> 27

gtgtacaata tggacttcct cttttc 26

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-ScTTADHI_KlPLac4

<400> 28

gaaatttagg aattttaaac ttg 23

<210> 29

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-ScTTGap_ScPGK

<400> 29

ggactccagc ttttccattt gccttcgcgc ttgcctgtac ggtcgttacc atacttggcg 60

gaaaaaattc atttgtaa 78

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-ScPGK

<400> 30

actgtaattg cttttagttg tgtat 25

<210> 31

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-ScTTPGK_KlPADHI

<400> 31

aggtaagtat ggtaacgacc gtacaggcaa gcgcgaaggc aaatggaaaa gctggaagct 60

ttttcgaaac gcagaatttt 80

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-KlPADHI

<400> 32

ccagcttttc catttgcctt cgcgcttgcc 30

<210> 33

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-KlTTLac4_ScPGapDH

<400> 33

ctactattaa ttatttacgt attctttgaa atggcagtat tgataatgat aaacttatac 60

aacatcgaag aagagtct 78

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-ScPGapDH

<400> 34

agtttatcat tatcaatact gccat 25

<210> 35

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-ScTTGap_KlPGK

<400> 35

catatacctt tgataccata aaaacaagca aatattctta cttcaaacac acccgtggcg 60

gaaaaaattc atttgtaaac t 81

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-KlPGK

<400> 36

cgggtgtgtt tgaagtaaga atatt 25

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-crtE-UPL#1-F

<400> 37

cgagatgctt tccctccata 20

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-crtE-UPL#1-R

<400> 38

ttcgctagga cacgtcagac t 21

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-crtI-UPL#155-F

<400> 39

ccgatccttc cttttacgtg 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-crtI-UPL#155-R

<400> 40

cggcacaaga atgacgatag 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-crtR-UPL#41-F

<400> 41

acgtcgtctc tgacgtttcc 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-crtR-UPL#41-R

<400> 42

ttgggtgaag tttcggagaa 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-crtS-UPL#149-F

<400> 43

ggatgttcaa ggtcgggata 20

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-crtS-UPL#149-R

<400> 44

cggacagctt ttgagattca g 21

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-crtYB-UPL#34-F

<400> 45

cactgatctt atctttccct tatcg 25

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-crtYB-UPL#34-R

<400> 46

gtggtctcga taggcgtctt 20

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-tHMG-UPL#119-F

<400> 47

ttctgctatg gcgggttc 18

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-tHMG-UPL#119-R

<400> 48

gctgtaacca aattcgaagc a 21

<210> 49

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-CrBKT-UPL#159-F

<400> 49

gctgctgcaa ctggttcac 19

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-CrBKT-UPL#159-R

<400> 50

gcactagcgg aactagcaga a 21

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-CrChYb-UPL#48-F

<400> 51

ttctttcacg atggattggt c 21

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-CrChYb-UPL#48-R

<400> 52

tgtatggtaa gttggcgata gg 22

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-CZChYb-UPL#157-F

<400> 53

cgcccacaaa ttacaccatt 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-CZChYb-UPL#157-R

<400> 54

tccgaaaaac ataccccaag 20

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-HpChYb#139-F

<400> 55

aacgacttgt tcgcaatcat ta 22

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-HpChYb#139-R

<400> 56

cccaacacgt ttggcaac 18

<210> 57

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-Kan-UPL#144-F

<400> 57

agactaaact ggctgacgga at 22

<210> 58

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-Kan-UPL#144-R

<400> 58

catcaggagt acggataaaa tgc 23

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-Actin-UPL #9-F

<400> 59

gcgtagattg gaacaacgtg 20

<210> 60

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-Actin-UPL #9-R

<400> 60

agaactaccg gtattgtgtt gga 23

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-alg9-UPL #132-F

<400> 61

caatcaatgg cccgtatcat 20

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物-alg9-UPL #132-R

<400> 62

tgtctcagaa gcacagtttg g 21

<210> 63

<211> 2292

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KlLac4 啟動子

<400> 63

ccgcggggat cgactcataa aatagtaacc ttctaatgcg tatctattga ctaccaacca 60

ttagtgtggt tgcagaaggc ggaattttcc cttcttcgaa tttagcttgc tttttcattt 120

tttattttcc atttttcagt ttttgtttgt gtcgaattta gccagttgct tctccaagat 180

gaaaaaaacc cctgcgcagt ttctgtgctg caagatccta atcgactttt ccacccccca 240

caaaagtaaa tgttcttttg ttacattcgc gtgggtagct agctccccga atcttcaaag 300

gacttaggga ctgcactaca tcagagtgtg ttcacctggt ttgctgcctg gtttgaaaga 360

aaagagcagg gaactcgcgg gttcccggcg aataatcatg cgatagtcct ttggccttcc 420

aagtcgcatg tagagtagac aacagacagg gagggcagga aggatctttc actgagatcc 480

tgtatcttgt tgggtaagtc ggatgaaagg ggaatcgtat gagattggag aggatgcgga 540

agaggtaacg ccttttgtta acttgtttaa ttattatggg gcaggcgaga gggggaggaa 600

tgtatgtgtg tgaggcgggc gagacggagc catccaggcc aggtagaaat agagaaagcc 660

gaatgttaga caatatggca gcgtagtaga gtaggtaggt aggcaagtac tgctagcaaa 720

gaggagaagg gtaagctcac tcttcgcatt ccacaccgtt agtgtgtcag tttgaacaaa 780

aaaacaatca tcataccaat tgatggactg tggactggct tttggaacgg cttttcggac 840

tgcgattatt cgtgaggaat caaggtagga atttggtcat atttacggac aacagtgggt 900

gattcccata tcgagtagga aaacgagatc atggtatcct cagatatgtt gcggaaatct 960

gttcaccgca aagttcaggg tgctctggtg ggtttcggtt ggtctttgct ttgcttctcc 1020

cttgtcttgc atgttaataa tagcctagcc tgtgagccga aacttagggt aggcttagtg 1080

ttggaacgta catatctatc acgttgactt ggtttaacca ggcgacctgg tagccagcca 1140

tacccacaca cgttttttgt atcttcagta tagttgtgaa aagtgtagcg gaaatttgtg 1200

gtccgagcaa cagcgtcttt ttctagtagt gcggtcggtt acttggttga cattggtatt 1260

tggactttgt tgctacacca ttcactactt gaagtcgagt gtgaagggta tgatttctag 1320

tggtgaacac ctttagttac gtaatgtttt cattgctgtt ttacttgaga tttcgattga 1380

gaaaaaggta tttaatagct cgaatcaatg tgagaacaga gagaagatgt tcttccctaa 1440

ctcgaaaggt atatgaggct tgtgtttctt aggagaatta ttattctttt gttatgttgc 1500

gcttgtagtt ggaaaaggtg aagagacaaa agctggaatt gtgagcggat aacaagctca 1560

acacttgaaa tttaggaaag agcagaattt ggcaaaaaaa ataaaaaaaa aataaacaca 1620

catactcatc gagaccggtg gcgcgcccct aggggccggc cacgcgtcca tgggcggccg 1680

cttaattaag gcctgttggg ccctcgagat ttatacttag ataagtatgt acttacaggt 1740

atatttctat gagatactga tgtatacatg catgataata tttaaacggt tattagtgcc 1800

gattgtcttg tgcgataatg acgttcctat caaagcaata cacttaccac ctattacatg 1860

ggccaagaaa atattttcga acttgtttag aatattagca cagagtatat gatgttatcc 1920

gttagattat gcatgattca ttcctacaac tttttcgtag cataaggatt aattacttgg 1980

atgccaataa aaaaaaaaaa catcgagaaa atttcagcat gctcagaaac aattgcagtg 2040

tatcaaagta aaaaaaagat tttcactaca tgttcctttt gaagaaagaa aatcatggaa 2100

cattagattt acaaaaattt aaccaccgct gattaacgat tagaccgtta agcgcacaac 2160

aggttattag tacagagaaa gcattctgtg gtgttgcccc ggactttctt ttgcgacata 2220

ggtaaatcga ataccatcat actatctttt ccaatgactc cctaaagaaa gactcttctt 2280

cgatgttgta ta 2292

<210> 64

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScGapDH 啟動子

<400> 64

agtttatcat tatcaatact gccatttcaa agaatacgta aataattaat agtagtgatt 60

ttcctaactt tatttagtca aaaaattagc cttttaattc tgctgtaacc cgtacatgcc 120

caaaataggg ggcgggttac acagaatata taacatcgta ggtgtctggg tgaacagttt 180

attcctggca tccactaaat ataatggagc ccgcttttta agctggcatc cagaaaaaaa 240

aagaatccca gcaccaaaat attgttttct tcaccaacca tcagttcata ggtccattct 300

cttagcgcaa ctacagagaa caggggcaca aacaggcaaa aaacgggcac aacctcaatg 360

gagtgatgca acctgcctgg agtaaatgat gacacaaggc aattgaccca cgcatgtatc 420

tatctcattt tcttacacct tctattacct tctgctctct ctgatttgga aaaagctgaa 480

aaaaaaggtt gaaaccagtt ccctgaaatt attcccctac ttgactaata agtatataaa 540

gacggtaggt attgattgta attctgtaaa tctatttctt aaacttctta aattctactt 600

ttatagttag tctttttttt agttttaaaa caccaagaac ttagtttcga ataaacacac 660

ataaacaaac aaaaaaaccg gtggcgcgcc cctaggggcc ggccacgcgt ccatgggcgg 720

ccgcttaatt aaggcctgtt gggccctcga ggtgaattta ctttaaatct tgcatttaaa 780

taaattttct ttttatagct ttatgactta gtttcaattt atatactatt ttaatgacat 840

tttcgattca ttgattgaaa gctttgtgtt ttttcttgat gcgctattgc attgttcttg 900

tctttttcgc cacatgtaat atctgtagta gatacctgat acattgtgga tgctgagtga 960

aattttagtt aataatggag gcgctcttaa taattttggg gatattggct ttttttttta 1020

aagtttacaa atgaattttt tccgcca 1047

<210> 65

<211> 1239

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScPGK 啟動子

<400> 65

actgtaattg cttttagttg tgtattttta gtgtgcaagt ttctgtaaat cgattaattt 60

ttttttcttt cctcttttta ttaaccttaa tttttatttt agattcctga cttcaactca 120

agacgcacag atattataac atctgcataa taggcatttg caagaattac tcgtgagtaa 180

ggaaagagtg aggaactatc gcatacctgc atttaaagat gccgatttgg gcgcgaatcc 240

tttattttgg cttcaccctc atactattat cagggccaga aaaaggaagt gtttccctcc 300

ttcttgaatt gatgttaccc tcataaagca cgtggcctct tatcgagaaa gaaattaccg 360

tcgctcgtga tttgtttgca aaaagaacaa aactgaaaaa acccagacac gctcgacttc 420

ctgtcttcct attgattgca gcttccaatt tcgtcacaca acaaggtcct agcgacggct 480

cacaggtttt gtaacaagca atcgaaggtt ctggaatggc gggaaagggt ttagtaccac 540

atgctatgat gcccactgtg atctccagag caaagttcgt tcgatcgtac tgttactctc 600

tctctttcaa acagaattgt ccgaatcgtg tgacaacaac agcctgttct cacacactct 660

tttcttctaa ccaagggggt ggtttagttt agtagaacct cgtgaaactt acatttacat 720

atatataaac ttgcataaat tggtcaatgc aagaaataca tatttggtct tttctaattc 780

gtagtttttc aagttcttag atgctttctt tttctctttt ttacagatca tcaaggaagt 840

aattatctac tttttacaac aaatataaaa caaaaaaaac cggtggcgcg cccctagggg 900

ccggccacgc gtccatgggc ggccgcttaa ttaaggcctg ttgggccctc gagattgaat 960

tgaattgaaa tcgatagatc aatttttttc ttttctcttt ccccatcctt tacgctaaaa 1020

taatagttta ttttattttt tgaatatttt ttatttatat acgtatatat agactattat 1080

ttacttttaa tagattatta agatttttat taaaaaaaaa ttcgtccctc tttttaatgc 1140

cttttatgca gttttttttt cccattcgat atttctatgt tcgggtttca gcgtatttta 1200

agtttaataa ctcgaaaatt ctgcgtttcg aaaaagctt 1239

<210> 66

<211> 1090

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KlGapDH 啟動子

<400> 66

agtatggtaa cgaccgtaca ggcaagcgcg aaggcaaatg gaaaagctgg agtccggaag 60

ataatcattt catcttcttt tgttagaaca gaacagtgga tgtccctcat ctcggtaacg 120

tattgtccat gccctagaac tctctgtccc taaaaagagg acaaaaaccc aatggtttcc 180

ccagcttcca gtggagccac cgatcccact ggaaaccact ggacaggaag agaaaatcac 240

ggacttcctc tattgaagga taattcaaca ctttcaccag atcccaaatg tcccgcccct 300

attcccgtgt tccatcacgt accataactt accatttcat cacgttctct atggcacact 360

ggtactgctt cgactgcttt gcttcatctt ctctatgggc caatgagcta atgagcacaa 420

tgtgctgcga aataaaggga tatctaattt atattattac attataatat gtactagtgt 480

ggttattggt aattgtactt aattttgata tataaagggt ggatcttttt cattttgaat 540

cagaattgga attgcaactt gtctcttgtc actattactt aatagtaatt atatttctta 600

ttaacctttt ttttaagtca aaacaccaag gacaagaact actcttcaaa ggtatttcaa 660

gttatcatac gtctcacaca cgcttcacag tttcaagtaa aaaaaaagaa tattacacaa 720

ccggtggcgc gcccctaggg gccggccacg cgtccatggg cggccgctta attaaggcct 780

gttgggccct cgaggtgaat ttactttaaa tcttgcattt aaataaattt tctttttata 840

gctttatgac ttagtttcaa tttatatact attttaatga cattttcgat tcattgattg 900

aaagctttgt gttttttctt gatgcgctat tgcattgttc ttgtcttttt cgccacatgt 960

aatatctgta gtagatacct gatacattgt ggatgctgag tgaaatttta gttaataatg 1020

gaggcgctct taataatttt ggggatattg gctttttttt ttaaagttta caaatgaatt 1080

ttttccgcca 1090

<210> 67

<211> 1236

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KlPGK 啟動子

<400> 67

cgggtgtgtt tgaagtaaga atatttgctt gtttttatgg tatcaaaggt atatgttgta 60

gaagacaatt tccggtaatc caattgtctg tctgctcagt ttagcacatg tatagtacgt 120

tgcacatagt ctacaatatt cagcattcag cattcagtat acagcatatg gctaaatgat 180

cacaaatgtg attgatgatt tgacacgact agaaaagaga acgaaaaagg gaaattccat 240

gtcacgtgcg ttggcacgtg acatggaata tcgaagaaag aaaaaaaaaa cgatctcgtc 300

ctagtggaag cccagagtct ggtccccccg gagtcttccc aaaacaagaa gctgacacat 360

gttgacacag aacaccccac agcaaatgca ccacgctacg tagatcagga agcttaactc 420

tagcgacctg tcgctcgccc cacagaacct cacccgagaa ccacacatta cacgccgcca 480

gctcccacta tactcatctt gcttccctta agcgttctca cgattcgttc gctgcccttc 540

ttcaagagtc ttctgattct aattctcatt cgaaatcctc tacagttaat gaattgcttg 600

acatgacatt cattgtctca tggttttggc tttttggctt ttgtctttta aagctatatc 660

aactttacat ataaatatac gtcaaaaggg gattcattaa ttagaaaatt ctctttttca 720

atagttgcta ttcattatca atctattcaa ctcaattggt tattattttc atctttttgt 780

catcctaaac catcaacaat atttaaatat atctgttgct acattaagag ttacttcaga 840

aataacaaaa aaatcgatca agaattaata aaaaaaccgg tggcgcgccc ctaggggccg 900

gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag attgaattga 960

attgaaatcg atagatcaat ttttttcttt tctctttccc catcctttac gctaaaataa 1020

tagtttattt tattttttga atatttttta tttatatacg tatatataga ctattattta 1080

cttttaatag attattaaga tttttattaa aaaaaaattc gtccctcttt ttaatgcctt 1140

ttatgcagtt tttttttccc attcgatatt tctatgttcg ggtttcagcg tattttaagt 1200

ttaataactc gaaaattctg cgtttcgaaa aagctt 1236

<210> 68

<211> 1246

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KlADHI 啟動子

<400> 68

ccagcttttc catttgcctt cgcgcttgcc tgtacggtcg ttaccatact tacctttctt 60

gcttcttctc aaaatggaat ccaggttttt agcttcgtgt ttcttttttt tttttaccat 120

ttttcaaatt tcagtcttcc attttcagct tcttgttttt tttttttttt ttttttttca 180

tttcagtttt tacagcttcc agtctccctc tttccttcga tttccatctt cttgtttctg 240

tagccatctt cctatcacgt gcaagggaag aaagtggggg cccagcacct tcttttttgt 300

tctttggtgg gggctcgttt tagtttttac gtgcgtaatt gggaatcttc cgaggtagta 360

tgacatgtcc ggtggtgacc tgatactttc tgtttctccg agtaggacag aagaggaaaa 420

aaaaatagcg tgtgatgttc ttctattcta gtagtgtatt gatctattca caatcagatc 480

acaatcatat gagcagatga tgtattttgg gttgcttttc accaacccaa gtattcgatt 540

gatctttata tactgcggtt atttctaggt cttaaacggt taacacctgt tgcagggtgg 600

tatgtatttt tctcaaagtg tgctattttc acaccagcta gaaatcagct gtcttacttg 660

tatacaatta gaccagccat ttggtcttct ggaatatgta tataaacacc cggtcgattc 720

tgacaatcca tccacttttg tagtaggtct ctctatatcc atttgtacaa tgttgtttct 780

gttttgccct acatcatcat caagcaaaaa caatagtttc aattgaaaca taaacaagct 840

ttaaacacac aaactctata ctaaaaaaag ataaaaccgg tggcgcgccc ctaggggccg 900

gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag gtgaatttac 960

tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatgacttag tttcaattta 1020

tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag ctttgtgttt tttcttgatg 1080

cgctattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata tctgtagtag atacctgata 1140

cattgtggat gctgagtgaa attttagtta ataatggagg cgctcttaat aattttgggg 1200

atattggctt ttttttttaa agtttacaaa tgaatttttt ccgcca 1246

<210> 69

<211> 2068

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScADHI 啟動子

<400> 69

gtgtacaata tggacttcct cttttctggc aaccaaaccc atacatcggg attcctataa 60

taccttcgtt ggtctcccta acatgtaggt ggcggagggg agatatacaa tagaacagat 120

accagacaag acataatggg ctaaacaaga ctacaccaat tacactgcct cattgatggt 180

ggtacataac gaactaatac tgtagcccta gacttgatag ccatcatcat atcgaagttt 240

cactaccctt tttccatttg ccatctattg aagtaataat aggcgcatgc aacttctttt 300

cttttttttt cttttctctc tcccccgttg ttgtctcacc atatccgcaa tgacaaaaaa 360

atgatggaag acactaaagg aaaaaattaa cgacaaagac agcaccaaca gatgtcgttg 420

ttccagagct gatgaggggt atctcgaagc acacgaaact ttttccttcc ttcattcacg 480

cacactactc tctaatgagc aacggtatac ggccttcctt ccagttactt gaatttgaaa 540

taaaaaaaag tttgctgtct tgctatcaag tataaataga cctgcaatta ttaatctttt 600

gtttcctcgt cattgttctc gttccctttc ttccttgttt ctttttctgc acaatatttc 660

aagctatacc aagcatacaa tcaagcaatt ccagatctaa aaaaaccggt ggcgcgcccc 720

taggggccgg ccacgcgtcc atgggcggcc gcttaattaa ggcctgttgg gccctcgagc 780

ccgggggggg ctcgatcccc tcgcgagttg gttcagctgc tgcctgaggc tggacgacct 840

cgcggagttc taccggcagt gcaaatccgt cggcatccag gaaaccagca gcggctatcc 900

gcgcatccat gcccccgaac tgcaggagtg gggaggcacg atggccgctt tggtcgatct 960

agattacgtg gaagaaaggt agtaaaagta gtagtataag tagtaaaaag aggtaaaaag 1020

agaaaaccgg ctacatacta gagaagcacg tacacaaaaa ctcataggca cttcatcata 1080

cgacagtttc ttgatgcatt ataatagtgt attagatatt ttcagaaata tgcatagaac 1140

ctcctcttgc ctttactttt tatacataga acattggcag atttacttac actactttgt 1200

ttctacgcca tttcttttgt tttcaacact tagacaagtt gttgagaacc ggactactaa 1260

aaagcaatgt tcccactgaa aatcatgtac ctgcagcata ataaccccct aattctgcat 1320

cgatccagta tgtttttttt tctctactca tttttacctg aagatagagc ttctaaaaca 1380

aaaaaaatca gtgattacat gcatattgtg tgttctagta accaaaggaa aggaacagat 1440

agataaaatt ccgagactgt caaattaggt ttttttcttt ttttttggcg ggagtcagtg 1500

ggccgaaata tgttcttggc ctagaactta atctggtttg atcatgccaa tacttgcctg 1560

agtgcccgac tttttgccca ccctcttgcc ttctgtcatc cttcaaaacc cacctgtttt 1620

ccagccgtat cttcgctcgc atctacacat actgtgccat atcttgtgtg tagccggacg 1680

tgactatgac caaaaacaaa caaggagaac tgttcgccga tttgtaacac tcctgcatcc 1740

atccaagtgg gtatgcgcta tgcaatgtta agctaggtca ggtcagacca ggtccaagga 1800

cagcaacttg actgtatgca acctttacca tctttgcaca gaacatactt gtagctagct 1860

agttacactt atggaccgaa aaggcacccc accatgtctg tccggcttta gagtacggcc 1920

gcagaccgct gatttgcctt gccaagcagt agtcacaatg catcgcatga gcacacgggc 1980

acgggcacgg gcacaggaac cattggcaaa aataccagat acactatacc gacgtatatc 2040

aagcccaagt ttaaaattcc taaatttc 2068

<210> 70

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KlPLac4-3’_SalI-F

<400> 70

taggtcgacc cgcggggatc gactcata 28

<210> 71

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KlPLac4-3’-R

<400> 71

aagcggccgc ccatggacgc gtggccggcc cctaggggcg cgccaccggt ctcgatgagt 60

atgtgtgttt attttttttt tatttttttt gc 92

<210> 72

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KlTTLac4-F

<400> 72

gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag atttatactt 60

agataagtat gtacttacag gtatatttct atg 93

<210> 73

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KlTTLac4_EcoRI-R

<400> 73

taggaattcc tactattaat tatttacgta ttctttgaaa tggcag 46

<210> 74

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScPGapDH_SalI-F

<400> 74

taggtcgaca gtttatcatt atcaatactg ccatttcaaa gaatac 46

<210> 75

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScPGapDH-R

<400> 75

aagcggccgc ccatggacgc gtggccggcc cctaggggcg cgccaccggt ttttttgttt 60

gtttatgtgt gtttattcga aactaagttc 90

<210> 76

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScTTGap-F

<400> 76

gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag gtgaatttac 60

tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatg 104

<210> 77

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScTTGap_EcoRI-R

<400> 77

taggaattcg gactccagct tttccatttg 30

<210> 78

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScPADHI_SalI-F

<400> 78

taggtcgacg tgtacaatat ggacttcctc ttttc 35

<210> 79

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScPADHI -R

<400> 79

aagcggccgc ccatggacgc gtggccggcc cctaggggcg cgccaccggt ttttttagat 60

ctggaattgc ttgattgtat gc 82

<210> 80

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScTTADHI_KlPLac4 -5'端-F

<400> 80

gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag cccggggggg 60

gctcgatccc ctcgc 75

<210> 81

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScTTADHI_KlPLac4-5'端_EcoRI-R

<400> 81

taggaattcg aaatttagga attttaaact tgggcttgat atac 44

<210> 82

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScPGK_SalI-F

<400> 82

taggtcgaca ctgtaattgc ttttagttgt gtatttttag tgtg 44

<210> 83

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScPGK-R

<400> 83

aagcggccgc ccatggacgc gtggccggcc cctaggggcg cgccaccggt tttttttgtt 60

ttatatttgt tgtaaaaagt agataattac ttccttgatg 100

<210> 84

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScTTPGK-F

<400> 84

gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag attgaattga 60

attgaaatcg atagatcaat ttttttcttt tctc 94

<210> 85

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScTTPGK_EcoRI-R

<400> 85

taggaattcc atataccttt gataccataa aaacaagcaa atattc 46

<210> 86

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KlPGapDH_SalI-F

<400> 86

taggtcgaca gtatggtaac gaccgtacag 30

<210> 87

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KlPGapDH-R

<400> 87

aagcggccgc ccatggacgc gtggccggcc cctaggggcg cgccaccggt tgtgtaatat 60

tctttttttt tacttgaaac tgtgaagc 88

<210> 88

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScTTGap-F

<400> 88

gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag gtgaatttac 60

tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatg 104

<210> 89

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScTTGap_EcoRI-R

<400> 89

taggaattct ggcggaaaaa attcatttgt aaactttaaa aaaaaaagc 49

<210> 90

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KlPGK_SalI-F

<400> 90

taggtcgacc gggtgtgttt gaagtaagaa tatttg 36

<210> 91

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KlPGK -R

<400> 91

aagcggccgc ccatggacgc gtggccggcc cctaggggcg cgccaccggt ttttttatta 60

attcttgatc gatttttttg ttatttctga agtaactc 98

<210> 92

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScTTPGK -F

<400> 92

gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag attgaattga 60

attgaaatcg atagatcaat ttttttcttt tctc 94

<210> 93

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScTTPGK_EcoRI-R

<400> 93

taggaattca agctttttcg aaacgcagaa ttttcg 36

<210> 94

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KlPADHI_SalI-F

<400> 94

taggtcgacc cagcttttcc atttgccttc 30

<210> 95

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KlPADHI -R

<400> 95

aagcggccgc ccatggacgc gtggccggcc cctaggggcg cgccaccggt tttatctttt 60

tttagtatag agtttgtgtg tttaaagctt g 91

<210> 96

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScTTGap-F

<400> 96

gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag gtgaatttac 60

tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatg 104

<210> 97

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScTTGap_EcoRI-R

<400> 97

taggaattcg gaatcccgat gtatgggt 28

<210> 98

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物_kan 基因_AgeI

<400> 98

accggtatgg gtaaggaaaa gactca 26

<210> 99

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物_kan 基因_NcoI

<400> 99

ccatggttag aaaaactcat cgagca 26