本發(fā)明涉及一種通過發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸的方法。
背景技術(shù)：
：有機(jī)化合物，如具有6個(gè)或更少碳的小的二羧酸類化合物，是商業(yè)上重要的化學(xué)品，具有許多用途。例如，小的二酸包括1,4-二酸，如琥珀酸、蘋果酸和酒石酸，以及5-碳分子衣康酸。其他二酸包括兩個(gè)碳的草酸、三個(gè)碳的丙二酸、五個(gè)碳的戊二酸和6個(gè)碳的己二酸，并且還存在這些二酸的許多衍生物?？偟膩碚f，小的二酸具有一些化學(xué)相似性，其在聚合物生產(chǎn)中的使用可以給樹脂提供專門的特性。這樣的多用性使其能夠容易地融入下游化學(xué)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)市場(chǎng)。例如，1,4-二酸分子可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模化學(xué)品馬來酸酐的許多用途，其可以被轉(zhuǎn)化成各種工業(yè)化學(xué)品(四氫呋喃、丁內(nèi)酯、1,4-丁二醇、2-吡咯烷酮)和琥珀酸衍生物琥珀酰胺、琥珀腈、丁二胺和琥珀酸酯。酒石酸在食品、皮革、金屬和印刷工業(yè)中具有許多用途。衣康酸形成用于3-甲基吡咯烷酮、甲基-BDO、甲基-THF等生產(chǎn)的起始材料。特別地，琥珀酸或琥珀酸鹽——這些術(shù)語(yǔ)在本文中可互換使用——已經(jīng)引起了相當(dāng)大的興趣，因?yàn)槠湟呀?jīng)用作食品、化學(xué)和藥物工業(yè)中許多工業(yè)上重要化學(xué)品的前體。實(shí)際上，來自美國(guó)能源部的報(bào)道稱，琥珀酸是從生物質(zhì)制造的前12個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)單元之一。因此，在細(xì)菌中制備二酸的能力將具有顯著的商業(yè)重要性。WO-A-2009/024294公開了琥珀酸生產(chǎn)細(xì)菌菌株，其是巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的成員，最初從瘤胃分離，并且能夠利用甘油作為碳源，WO-A-2009/024294還公開了從其衍生的保留了所述能力的變體和突變菌株，特別是，保藏在DSMZ(德國(guó)微生物保藏中心，DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,因霍夫街，7B,D-38124布勞恩斯切魏格，德國(guó))、具有保藏號(hào)DSM18541(ID06-614)、具有生產(chǎn)琥珀酸能力的命名為DD1的細(xì)菌菌株。如Kuhnert等，2010分類的，DD1-菌株屬于產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌(Basfiasucciniciproducens)種和巴斯德氏菌科。WO-A-2010/092155中公開了這些菌株的突變體，其中l(wèi)dhA-基因和/或pflD-或pflA-基因已經(jīng)被破壞，這些突變株的特征在于，與WO-A-2009/024294中公開的DD1-野生型相比，在厭氧條件下，從碳源(如甘油或甘油和碳水化合物(如麥芽糖)的混合物)產(chǎn)生顯著提高的琥珀酸產(chǎn)量。然而，在例如WO-A-2009/024294和WO-A-2010/092155中公開的生產(chǎn)有機(jī)酸的方法中，使用甘油作為唯一碳源時(shí)，時(shí)空產(chǎn)率仍然是可提高的。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。特別地，本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸(如琥珀酸)的方法，所述方法與現(xiàn)有技術(shù)的已知方法相比，允許在使用甘油作為主要碳源時(shí)以較高的時(shí)空產(chǎn)率生產(chǎn)這些有機(jī)酸。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：通過發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸的如下方法，促進(jìn)了上述目的的實(shí)現(xiàn)，所述方法包括方法步驟：I)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中向培養(yǎng)基中進(jìn)料(feed)甘油和其他含碳化合物作為可同化碳源，以允許微生物產(chǎn)生有機(jī)酸，由此獲得包含有機(jī)酸的發(fā)酵液；II)從方法步驟I)獲得的發(fā)酵液，回收有機(jī)酸或其鹽；其中，所述其他含碳化合物的消耗速率(CRc.c.；以g/升/小時(shí)計(jì))低于該其他含碳化合物的最大理論消耗速率(CRc.c.max；以g/升/小時(shí)計(jì))。本申請(qǐng)的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在甘油用作主要碳源的發(fā)酵方法中生產(chǎn)有機(jī)酸(如琥珀酸)時(shí)，如果以限制的方式加入其他含碳化合物，如蔗糖或D-葡萄糖，有機(jī)酸(如琥珀酸)的時(shí)空產(chǎn)率可以顯著提高。通過以限制的方式加入其他含碳化合物，其他含碳化合物的消耗速率低于該其他含碳化合物的最大理論消耗速率。在根據(jù)本發(fā)明方法的方法步驟I)中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中向培養(yǎng)基中進(jìn)料甘油和其他含碳化合物作為可同化碳源，以允許微生物產(chǎn)生有機(jī)酸，由此獲得包含有機(jī)酸的發(fā)酵液。根據(jù)本發(fā)明的合適微生物可以是酵母、真菌或細(xì)菌。合適的細(xì)菌、酵母或真菌特別是已經(jīng)作為細(xì)菌、酵母或真菌菌株保藏在德國(guó)微生物保藏中心DeutscheSammlungvonMikroorganismenandZellkulturenGmbH(DSMZ)，Brunswick(德國(guó))的那些細(xì)菌、酵母或真菌。根據(jù)本發(fā)明合適的細(xì)菌屬于在http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm下詳述的屬，根據(jù)本發(fā)明合適的酵母屬于在http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm下詳述的那些屬，根據(jù)本發(fā)明合適的真菌屬于在http://www.dsmz.de/species/fungi.htm下詳述的那些真菌。優(yōu)選，方法步驟I)中使用的微生物是細(xì)菌細(xì)胞。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)菌細(xì)胞”是指原核生物，即，細(xì)菌。細(xì)菌可以基于其生化和微生物學(xué)特性及其形態(tài)來分類。這些分類標(biāo)準(zhǔn)是本領(lǐng)域熟知的。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，微生物屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、巴斯德氏菌科、芽孢桿菌科(Bacillaceae)或棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)?！澳c桿菌科”是一個(gè)大的細(xì)菌科，包括許多較熟悉的細(xì)菌，如沙門氏菌(Salmonella)和大腸桿菌(Escherichiacoli)。它們屬于變形菌綱(Proteobacteria)，被給予了它們自己的目(腸桿菌目(Enterobacteriales))。腸桿菌科的成員是桿狀的。與其他變形菌綱細(xì)菌一樣，它們具有革蘭氏陰性株，并且它們是兼性厭氧菌，發(fā)酵糖以產(chǎn)生乳酸和各種其他終產(chǎn)物，如琥珀酸。大部分還可以將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。與大部分相似的細(xì)菌不同，腸桿菌科通常缺乏細(xì)胞色素C氧化酶。大部分具有許多鞭毛用于游動(dòng)，但少數(shù)屬是不動(dòng)的。它們不形成孢子，并且大多是過氧化氫酶陽(yáng)性的。這個(gè)科的許多成員是人和其他動(dòng)物腸道中發(fā)現(xiàn)的腸道菌群的正常部分，而其他在水或土壤中被發(fā)現(xiàn)，或是各種不同動(dòng)物和植物上的寄生物。Escherichiacoli(大腸桿菌)，更多稱為E.coli，是最重要的模式生物之一，并且其遺傳學(xué)和生物化學(xué)已經(jīng)得到詳細(xì)研究。腸桿菌科的大部分成員具有有緣毛的I型菌毛，參與將該細(xì)菌細(xì)胞粘附到其宿主上。腸桿菌科的實(shí)例為大腸桿菌(E.coli)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)?！鞍退沟率暇啤卑ǜ锾m氏陰性變形菌綱的一個(gè)大家族，成員從細(xì)菌(如流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae))至動(dòng)物和人粘膜的共生菌。大部分成員作為共生菌生活在鳥類和哺乳動(dòng)物的粘膜表面上，尤其是在上呼吸道中。巴斯德氏菌科通常是桿狀的，是顯著的兼性厭氧菌組。它們可以通過氧化酶的存在而與相關(guān)的腸桿菌科區(qū)分開來，并且通過不存在鞭毛而與其他相似的細(xì)菌區(qū)分開來。巴斯德氏菌科中的細(xì)菌已經(jīng)基于代謝特性及其16SRNA和23SRNA的序列，歸類至各個(gè)屬中。巴斯德氏菌科中的許多細(xì)菌含有丙酮酸-甲酸-裂解酶基因并且能夠厭氧地將碳源發(fā)酵成有機(jī)酸?！把挎邨U菌科”是可以產(chǎn)生內(nèi)生孢子的革蘭氏陽(yáng)性、異養(yǎng)、桿狀細(xì)菌家族。這個(gè)科的能動(dòng)型成員的特征在于有緣毛的鞭毛。一些芽孢桿菌科是需氧的，而其他是兼性或嚴(yán)格厭氧菌。大部分是非致病的，但已知芽孢桿菌屬(Bacillus)種引起人的疾病。這個(gè)科還包括桿菌類(Bacilli)，其包括兩個(gè)目，芽孢桿菌目(Bacillales)和乳桿菌目(Lactobacillales)。芽孢桿菌屬種是可以在37℃需氧條件下生長(zhǎng)的、大的圓柱狀細(xì)菌。它們通常是非致病的。芽孢桿菌目包括脂環(huán)酸芽孢桿菌科(Alicyclobacillaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、顯核菌科(Caryophanaceae)、李斯特氏菌科(Listeriaceae)、類芽孢桿菌科(Paenibacillaceae)、游動(dòng)球菌科(Planococcaceae)、芽孢乳桿菌科(Sporolactobacillaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae)、蘇黎士桿菌科(Turicibacteraceae)。桿菌類中的許多含有丙酮酸-甲酸-裂解酶基因并且能夠厭氧地將碳源發(fā)酵成有機(jī)酸?！鞍魻顥U菌科”是由真桿菌目(Eubacteriales)的大部分為革蘭氏陽(yáng)性的需氧不動(dòng)桿狀細(xì)菌組成的一個(gè)大家族。這個(gè)科還包括棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，其是革蘭氏陽(yáng)性、桿狀細(xì)菌屬。棒狀桿菌在自然界廣泛分布并且大部分是無(wú)害的。一些在工業(yè)情況中是有用的，如谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)。特別優(yōu)選，方法步驟I)中使用的微生物是修飾的微生物。術(shù)語(yǔ)“修飾的微生物”包括已經(jīng)在遺傳上被改變、修飾或工程化(例如，遺傳工程化)的微生物，由此其與產(chǎn)生其的天然野生型微生物相比呈現(xiàn)出改變、修飾的或不同的基因型和/或表型(例如，當(dāng)遺傳修飾影響微生物的編碼核酸序列時(shí))。根據(jù)本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的實(shí)施方案，方法步驟I)中使用的修飾微生物是重組微生物，這表示所述微生物是使用重組DNA獲得的。如本文中使用的表述“重組DNA”是指，使用實(shí)驗(yàn)室方法(分子克隆)將來自多個(gè)來源的遺傳物質(zhì)結(jié)合在一起形成生物學(xué)有機(jī)體中原本不存在的序列而獲得的DNA序列。這樣的重組DNA的一個(gè)實(shí)例是其中已經(jīng)插入了異源DNA序列的質(zhì)粒。優(yōu)選，方法步驟I)中所使用的微生物，特別是修飾的微生物，源自屬于巴斯德氏菌科的野生型。在這點(diǎn)上，更優(yōu)選修飾微生物源自屬于巴斯夫菌屬(Basfia)的野生型，特別優(yōu)選修飾微生物源自屬于物種產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌(Basfiasucciniciproducens)的野生型。最優(yōu)選，方法步驟I)中使用的修飾微生物所源自的野生型微生物是，依據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在德國(guó)DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，GmbH)具有保藏號(hào)DSM18541的產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌DD1株。該菌株最初從德國(guó)來源的奶牛的瘤胃分離?？梢詮膭?dòng)物并優(yōu)選哺乳動(dòng)物的胃腸道分離巴斯德氏菌屬(Pasteurella)細(xì)菌。特別地，細(xì)菌菌株DD1可以從牛瘤胃分離并且能夠利用甘油(包括粗制甘油)作為碳源。可以用于制備根據(jù)本發(fā)明的修飾微生物的其它巴斯夫菌屬菌株有，已經(jīng)保藏在DSZM具有保藏號(hào)DSM22022的巴斯夫菌屬菌株、或已經(jīng)保藏在瑞典哥德堡大學(xué)保藏中心(CultureCollectionoftheUniversityof)(CCUG)具有保藏號(hào)CCUG57335、CCUG57762、CCUG57763、CCUG57764、CCUG57765或CCUG57766的巴斯夫菌屬菌株。所述菌株最初從德國(guó)或瑞士來源的奶牛的瘤胃分離。在這點(diǎn)上，特別優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明方法的方法步驟I)中使用的修飾微生物來源于如下野生型微生物，所述野生型微生物具有SEQIDNO:1的16SrDNA、或顯示出與SEQIDNO:1至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或至少99.9％序列同源性的序列的16SrDNA。還優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的修飾微生物所源自的野生型具有SEQIDNO:2的23SrDNA、或顯示出與SEQIDNO:2至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或至少99.9％序列同源性的序列的23SrDNA。就用于本發(fā)明修飾微生物的各種多肽或多核苷酸提及的同一性百分?jǐn)?shù)值，優(yōu)選按照在比對(duì)序列的全長(zhǎng)上的殘基同一性來計(jì)算，例如，使用來自生物信息學(xué)軟件包EMBOSS(版本5.0.0，http://emboss.source-forge.net/what/)的程序針、使用缺省參數(shù)計(jì)算的同一性(對(duì)于相當(dāng)相似的序列)，所述參數(shù)為空位開放(開放空位的罰分)：10.0，空位延伸(延伸空位的罰分)：0.5，和數(shù)據(jù)文件(數(shù)據(jù)包中包括的評(píng)分矩陣文件)：EDNAFUL。應(yīng)當(dāng)注意，根據(jù)本發(fā)明方法的方法步驟I)中使用的修飾微生物不僅可以源自上述野生型微生物，尤其源自產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌株DD1，也可以源自這些菌株的變體。在這點(diǎn)上，表述“菌株的變體”包括與野生型菌株具有相同或基本上相同特征的每個(gè)菌株。在這點(diǎn)上，特別優(yōu)選，變體的16SrDNA與該變體所源自的野生型具有至少90％，優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少99％，更優(yōu)選至少99.5％，更優(yōu)選至少99.6％，更優(yōu)選至少99.7％，更優(yōu)選至少99.8％和最優(yōu)選至少99.9％的同一性。還特別優(yōu)選，變體的23SrDNA與該變體所源自的野生型具有至少90％，優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少99％，更優(yōu)選至少99.5％，更優(yōu)選至少99.6％，更優(yōu)選至少99.7％，更優(yōu)選至少99.8％和最優(yōu)選至少99.9％的同一性。在該定義下的菌株的變體，例如，可以通過用誘變化學(xué)劑、X-射線或UV光處理野生型菌株，或通過重組方法缺失、超表達(dá)基因或?qū)愒椿蛞爰?xì)胞中來獲得。根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案，方法步驟I)中使用的修飾微生物是與其野生型相比，具有以下活性的微生物：i)降低的丙酮酸甲酸裂解酶活性，ii)降低的乳酸脫氫酶活性，或iii)降低的丙酮酸甲酸裂解酶活性和降低的乳酸脫氫酶活性。在表述“與其野生型相比，修飾微生物具有降低的由x-基因編碼的酶的活性”中，其中x-基因是ldhA-基因、pflA-基因和/或pflD-基因，術(shù)語(yǔ)“野生型”是指由x-基因編碼的酶的活性尚沒有降低的微生物，即，該微生物的基因組以引入x-基因(特別是ldhA-基因、pflA-基因和/或pflD-基因)的遺傳修飾之前的狀態(tài)存在。優(yōu)選，表述“野生型”指，微生物的基因組，特別是其x-基因，以作為進(jìn)化結(jié)果而天然形成的狀態(tài)存在。該術(shù)語(yǔ)可以用于整個(gè)微生物，但優(yōu)選用于單個(gè)基因，例如，ldhA-基因、pflA-基因和/或pflD-基因。如本文中使用的，與野生型中的相應(yīng)酶的活性相比，術(shù)語(yǔ)“降低的酶活性”優(yōu)選對(duì)應(yīng)于相應(yīng)酶的活性的至少50％，優(yōu)選至少75％和更優(yōu)選至少95％的降低。術(shù)語(yǔ)“降低的酶活性”包括，例如，所述遺傳修飾(例如，遺傳工程化)的微生物的酶表達(dá)水平低于所述微生物的野生型的酶表達(dá)水平。用于降低酶表達(dá)的遺傳操縱可以包括，但不限于，缺失編碼所述酶的基因或其部分，改變或修飾與編碼酶的基因的表達(dá)相關(guān)的調(diào)控序列或位點(diǎn)(例如，通過除去強(qiáng)啟動(dòng)子或阻抑型啟動(dòng)子)，修飾參與酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄和/或基因產(chǎn)物翻譯的蛋白(例如，調(diào)控蛋白、阻遏物、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活物等)，或本領(lǐng)域常規(guī)的降低特定基因表達(dá)的任何其他常規(guī)方式(包括，但不限于，使用反義核酸分子或iRNA或其他方法來敲除或阻斷靶標(biāo)蛋白的表達(dá))。此外，可以將去穩(wěn)定化元件引入mRNA中或引入遺傳修飾導(dǎo)致RNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)劣化。還可以以使翻譯效率和速度降低的方式來改變基因的密碼子使用。還可以通過引入一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)致降低的酶活性的基因突變來獲得降低的酶活性。此外，酶活性的降低還可以包括激活酶的失活(或降低的表達(dá))，所述激活酶是激活其活性待降低的酶所必需的。通過后一種方法，其活性待降低的酶優(yōu)選保持在失活狀態(tài)。具有乳酸脫氫酶缺陷和/或丙酮酸甲酸裂解酶活性缺陷的修飾微生物公開于WO-A-2010/092155、US2010/0159543和WO-A-2005/052135中，其公開中關(guān)于降低微生物，優(yōu)選是巴斯德氏菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，特別優(yōu)選產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌株DD1中乳酸脫氫酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶的活性的不同方法，按引用并入本文中。測(cè)定丙酮酸甲酸裂解酶活性的方法例如公開于AsanumaN.和HinoT.，“EffectsofpHandEnergySupplyonActivityandAmountofPyruvate-Formate-LyaseinStreptococcusbovis”(pH和能量供應(yīng)對(duì)牛鏈球菌中的丙酮酸甲酸裂解酶的活性和含量的影響)，Appl.Environ.Microbiol.(2000)，Vol.66，第3773-3777頁(yè)；測(cè)定乳酸脫氫酶活性的方法例如公開于Bergmeyer,H.U.,BergmeyerJ.和Grassl,M.(1983-1986)，“MethodsofEnzymaticAnalysis”(酶分析方法)，第3版，第III卷，第126-133頁(yè)，VerlagChemie,Weinheim。在這點(diǎn)上，優(yōu)選，通過失活ldhA-基因(其編碼乳酸脫氫酶LdhA；EC1.1.1.27或EC1.1.1.28)來實(shí)現(xiàn)乳酸脫氫酶活性的降低，通過失活pflA-基因(其編碼丙酮酸甲酸裂解酶的激活物PflA；EC1.97.1.4)或pflD-基因(其編碼丙酮酸甲酸裂解酶PflD；EC2.3.1.54)來實(shí)現(xiàn)丙酮酸甲酸裂解酶的降低，其中優(yōu)選通過缺失這些基因或其部分，通過缺失這些基因的調(diào)控元件或其至少一部分，或通過將至少一個(gè)突變引入這些基因中來實(shí)現(xiàn)這些基因(即，ldhA、pflA和pflD)的失活，其中優(yōu)選通過如上所述的“坎貝爾重組”(Campbellrecombination)來進(jìn)行這些修飾。其活性在修飾微生物中降低的ldhA-基因優(yōu)選包括選自以下的核酸：α1)具有SEQIDNO:3的核苷酸序列的核酸；α2)編碼SEQIDNO:4的氨基酸序列的核酸；α3)與α1)或α2)的核酸具有至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，至少99.6％，至少99.7％，至少99.8％或至少99.9％，最優(yōu)選100％同一性的核酸，所述同一性是在α1)或α2)的核酸的整個(gè)長(zhǎng)度上的同一性；和α4)編碼與α1)或α2)的核酸編碼的氨基酸序列具有至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，至少99.6％，至少99.7％，至少99.8％或至少99.9％，最優(yōu)選100％同一性的氨基酸序列的核酸，所述同一性是在α1)或α2)的核酸編碼的氨基酸序列的整個(gè)長(zhǎng)度上的同一性。其活性在修飾微生物中降低的pflA-基因優(yōu)選包括選自以下的核酸：β1)具有SEQIDNO:5的核苷酸序列的核酸；β2)編碼SEQIDNO:6的氨基酸序列的核酸；β3)與β1)或β2)的核酸具有至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，至少99.6％，至少99.7％，至少99.8％或至少99.9％，最優(yōu)選100％同一性的核酸，所述同一性是在β1)或β2)的核酸的整個(gè)長(zhǎng)度上的同一性；和β4)編碼與β1)或β2)的核酸編碼的氨基酸序列具有至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，至少99.6％，至少99.7％，至少99.8％或至少99.9％，最優(yōu)選100％同一性的氨基酸序列的核酸，所述同一性是在β1)或β2)的核酸編碼的氨基酸序列的整個(gè)長(zhǎng)度上的同一性。其活性在修飾微生物中降低的pflD-基因優(yōu)選包括選自以下的核酸：γ1)具有SEQIDNO:7的核苷酸序列的核酸；γ2)編碼SEQIDNO:8的氨基酸序列的核酸；γ3)與γ1)或γ2)的核酸具有至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，至少99.6％，至少99.7％，至少99.8％或至少99.9％，最優(yōu)選100％同一性的核酸，所述同一性是在γ1)或γ2)的核酸的整個(gè)長(zhǎng)度上的同一性；和γ4)編碼與γ1)或γ2)的核酸編碼的氨基酸序列具有至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，至少99.6％，至少99.7％，至少99.8％或至少99.9％，最優(yōu)選100％同一性的氨基酸序列的核酸，所述同一性是在γ1)或γ2)的核酸編碼的氨基酸序列的整個(gè)長(zhǎng)度上的同一性。在這點(diǎn)上，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明方法的方法步驟I)中使用的修飾微生物包括：A)ldhA-基因或其至少一部分的缺失，ldhA-基因的調(diào)控元件或其至少一部分的缺失，或ldhA-基因中至少一個(gè)突變的引入；B)pflD-基因或其至少一部分的缺失，pflD-基因的調(diào)控元件或其至少一部分的缺失，或pflD-基因中至少一個(gè)突變的引入；C)pflA-基因或其至少一部分的缺失，pflA-基因的調(diào)控元件或其至少一部分的缺失，或pflA-基因中至少一個(gè)突變的引入；D)ldhA-基因或其至少一部分的缺失，ldhA-基因的調(diào)控元件或其至少一部分的缺失，或ldhA-基因中至少一個(gè)突變的引入和pflD-基因或其至少一部分的缺失，pflD-基因的調(diào)控元件或其至少一部分的缺失，或pflD-基因中至少一個(gè)突變的引入；或E)ldhA-基因或其至少一部分的缺失，ldhA-基因的調(diào)控元件或其至少一部分的缺失，或ldhA-基因中至少一個(gè)突變的引入和pflA-基因或其至少一部分的缺失，pflA-基因的調(diào)控元件或其至少一部分的缺失，或pflA-基因中至少一個(gè)突變的引入。優(yōu)選，在本發(fā)明方法的方法步驟I)中由微生物產(chǎn)生的有機(jī)酸包括羧酸，如甲酸、乳酸、丙酸、2-羥基丙酸、3-羥基丙酸、3-羥基丁酸、丙烯酸、丙酮酸或這些羧酸的鹽，二羧酸，如丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、戊二酸、衣康酸、己二酸或其鹽，或三羧酸，如檸檬酸或其鹽。根據(jù)本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的實(shí)施方案，有機(jī)酸是琥珀酸。在本發(fā)明的內(nèi)容中使用的術(shù)語(yǔ)“琥珀酸”必須以其最寬的含義來理解，還包括其鹽(即，琥珀酸鹽)，例如，堿金屬鹽，如Na+和K+-鹽，或堿土金屬鹽，如Mg2+和Ca2+鹽，或銨鹽或琥珀酸酐。優(yōu)選在約10至60℃或20至50℃或30至45℃的溫度下在2.5至9.0或3.5至8.0或4.5至7.0的pH下在培養(yǎng)基中孵育微生物。優(yōu)選，有機(jī)酸，尤其是琥珀酸，在厭氧條件下產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^常規(guī)技術(shù)建立厭氧條件，例如，通過將反應(yīng)介質(zhì)的組分脫氣并通過以例如0.1至1或0.2至0.5vvm的流速引入二氧化碳或氮?dú)饣蚱浠旌衔锖腿芜x地氫氣來維持厭氧條件?？梢酝ㄟ^常規(guī)技術(shù)，例如通過以例如0.1至1或0.2至0.5vvm的流速引入空氣或氧氣，來建立需氧條件。如果合適，在過程中可以使用0.1至1.5巴的輕微超壓力。根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于，其他含碳化合物的消耗速率(CRc.c.；以g/升/小時(shí)計(jì))低于該其他含碳化合物的最大理論消耗速率(CRc.c.max；以g/升/小時(shí)計(jì))。如果其他含碳化合物的量(即，進(jìn)料至培養(yǎng)基中的量和可能已經(jīng)包含在培養(yǎng)基中且尚未消耗的量)低于細(xì)胞理論上可以消耗的其他含碳化合物的最大量，則其他含碳化合物的消耗速率低于其他含碳化合物的最大理論消耗速率。由此，其他含碳化合物的量是受到限制的。在本發(fā)明的方法中，例如，可以通過其他含碳化合物的進(jìn)料速率來控制其他含碳化合物的消耗速率(條件是，培養(yǎng)基中可能已經(jīng)存在且尚未消耗的其他含碳化合物的量足夠低)。在這點(diǎn)上，優(yōu)選其他含碳化合物的進(jìn)料速率不高于其他含碳化合物的最大消耗速率的50％，更優(yōu)選不高于25％，更優(yōu)選不高于10％和最優(yōu)選不高于5％。當(dāng)培養(yǎng)基基本上不含任何(尚未消耗的)其他含碳化合物，或當(dāng)其他含碳化合物的量低于0.5g/l，優(yōu)選低于0.05g/l，最優(yōu)選低于檢測(cè)限，則尤其可以通過其他含碳化合物的進(jìn)料速率來控制其他含碳化合物的消耗速率。在優(yōu)選實(shí)施方案中，進(jìn)料至培養(yǎng)基中的其他含碳化合物被細(xì)胞立即且完全消耗。在這樣的條件下，以限制方式進(jìn)料其他含碳化合物。此外，優(yōu)選在本發(fā)明的方法中，維持如下條件特定長(zhǎng)度的一段時(shí)間，其中在所述條件下其他含碳化合物的消耗速率低于其他含碳化合物的最大理論消耗速率，優(yōu)選維持所述條件至少30分鐘，優(yōu)選至少1小時(shí)，更優(yōu)選至少6小時(shí)，甚至更優(yōu)選至少12小時(shí)和最優(yōu)選至少20小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。通常，在總培養(yǎng)時(shí)間的至少25％，優(yōu)選至少50％和最優(yōu)選至少70％中，實(shí)現(xiàn)其他含碳化合物限制進(jìn)料的條件。優(yōu)選，其他含碳化合物的消耗速率(CRc.c.；以g/升/小時(shí)計(jì))不高于其他含碳化合物的最大理論消耗速率(CRc.c.max；以g/升/小時(shí)計(jì))的50％，更優(yōu)選不高于25％，更優(yōu)選不高于10％和最優(yōu)選不高于5％。如果其他含碳化合物的最大消耗速率為例如1g/L/h，則所述消耗速率不高于0.5g/L/h(50％)，優(yōu)選不高于0.25g/L/h(25％)，更優(yōu)選不高于0.1g/L/h(10％)和最優(yōu)選不高于0.05g/L/h(5％)。在這點(diǎn)上，此外優(yōu)選，同時(shí)(即，在其他含碳化合物的消耗速率低于其他含碳化合物的最大理論消耗速率的相同時(shí)間段內(nèi))，甘油的量不受限制，而是優(yōu)選過量存在(這表示，優(yōu)選甘油以如下的量添加和/或甘油以如下的量存在于培養(yǎng)基中，所述量使得細(xì)胞消耗甘油的速度不快于甘油加入細(xì)胞培養(yǎng)物中的速度和/或使得細(xì)胞消耗甘油的量不超過其在培養(yǎng)基中的存在量)。在這點(diǎn)上，優(yōu)選甘油的消耗速率(CRg；以g/升/小時(shí)計(jì))為甘油的最大理論消耗速率(CRg.max；以g/升/小時(shí)計(jì))的25％以上，優(yōu)選50％以上，更優(yōu)選75％以上，甚至更優(yōu)選90％以上和最優(yōu)選95％以上。如果甘油的最大消耗速率為例如1g/L/h，則消耗速率為0.5g/L/h(50％)以上，優(yōu)選0.75g/L/h(75％)以上，更優(yōu)選0.9g/L/h(90％)以上和最優(yōu)選0.95g/L/h(95％)以上。根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案，在至少30分鐘，優(yōu)選至少1小時(shí)，更優(yōu)選至少6小時(shí)，甚至更優(yōu)選至少12小時(shí)和最優(yōu)選至少20小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間中，-其他含碳化合物的消耗速率(CRc.c.；以g/升/小時(shí)計(jì))不高于其他含碳化合物的最大理論消耗速率(CRc.c.max；以g/升/小時(shí)計(jì))的50％，更優(yōu)選不高于25％，更優(yōu)選不高于10％和最優(yōu)選不高于5％和，同時(shí)，-甘油的消耗速率(CRg；以g/升/小時(shí)計(jì))為甘油的最大理論消耗速率(CRg.max；以g/升/小時(shí)計(jì))的25％以上，優(yōu)選50％以上，更優(yōu)選75％以上，甚至更優(yōu)選90％以上和最優(yōu)選95％以上。為了確定其他含碳化合物的最大理論消耗速率CRc.c.max和甘油最大理論消耗速率CRg.max，可以分別在過量的其他含碳化合物和甘油的存在下孵育細(xì)胞。如果在至少特定的一段時(shí)間中可以在培養(yǎng)基中檢測(cè)到特定最小量的尚未消耗的底物(即，其他含碳化合物或甘油)，優(yōu)選至少1g/L的量，更優(yōu)選至少2.5g/L，則存在過量的其他含碳化合物和甘油。為了測(cè)定其他含碳化合物的最大理論消耗速率CRc.c.max，可以在用于測(cè)定CRc.c(即，在含碳化合物以限制量存在時(shí)，含碳化合物的實(shí)際消耗速率的測(cè)定)的完全相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)細(xì)胞一小時(shí)，但其中使用至少5g/升的含碳化合物的初始量、并且以使培養(yǎng)基中尚未消耗的含碳化合物的濃度總是在1g/L以上的量連續(xù)添加含碳化合物。此外，在本文中，在CRc.c.max測(cè)定的上下文中，表述“在完全相同的培養(yǎng)條件下”表示，在與CRc.c測(cè)定時(shí)相比存在相同量的甘油但具有過量的含碳化合物的情況下，進(jìn)行CRc.c.max的測(cè)定。為了測(cè)定甘油的最大理論消耗速率CRg.max，也在用于測(cè)定CRg(即，甘油的實(shí)際消耗速率)的完全相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)細(xì)胞一小時(shí)，但其中作為唯一碳源的甘油的初始量為至少5g/升，且進(jìn)一步連續(xù)添加甘油，添加量使得培養(yǎng)基中尚未消耗的甘油的濃度總是在1g/L以上。如本文中使用的，在CRg.max測(cè)定的上下文中，表述“在完全相同的培養(yǎng)條件下”表示，在與測(cè)定CRg時(shí)相比存在相同量的其他含碳化合物但具有過量甘油的情況下，進(jìn)行CRg.max的測(cè)定。可以在培養(yǎng)開始時(shí)立刻將碳源(即，甘油和其他含碳化合物)加入培養(yǎng)物中，或可以周期性地或連續(xù)地添加碳源。當(dāng)然，還可以例如在培養(yǎng)開始時(shí)立刻加入一種碳源(例如，甘油)，而周期性地或連續(xù)地加入其他碳源(例如，其他含碳化合物)。不管碳源加入發(fā)酵培養(yǎng)基中的方式如何，優(yōu)選，將用于其他含碳化合物的限制進(jìn)料和甘油的優(yōu)選非限制進(jìn)料的上述條件，維持至少30分鐘，優(yōu)選至少1小時(shí)，更優(yōu)選至少6小時(shí)，甚至更優(yōu)選至少12小時(shí)和最優(yōu)選至少24小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。優(yōu)選，以至少5:1，更優(yōu)選至少7.5:1和最優(yōu)選至少10:1的甘油:其他含碳化合物的總重量比，向培養(yǎng)基中進(jìn)料甘油和其他含碳化合物。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“總重量比”定義方法步驟I)中添加的其他含碳化合物總量與甘油總量的比。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案，向發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)料其他含碳化合物，其中進(jìn)料量使得發(fā)酵培養(yǎng)基中其他含碳化合物的濃度增加低于0.1g/l/h，優(yōu)選低于0.01g/l/h。最優(yōu)選，發(fā)酵培養(yǎng)基中其他含碳化合物的濃度完全沒有提高(因?yàn)樘砑拥暮蓟衔锪⒓幢幌?。在這點(diǎn)上，還優(yōu)選，培養(yǎng)基中的其他含碳化合物的濃度為0至1g/L，優(yōu)選0.6g/L以下，更優(yōu)選0.3g/L以下，甚至更優(yōu)選0.1g/L以下，其中最優(yōu)選地，由于其他含碳化合物被微生物快速消耗，如使用合適的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(優(yōu)選通過HPLC，如本文實(shí)驗(yàn)部分中的描述)測(cè)量的，例如，作為培養(yǎng)基中的殘留濃度測(cè)定的，培養(yǎng)基中的其他含碳化合物的濃度低于檢測(cè)限。其他含碳化合物優(yōu)選是除了甘油以外的碳水化合物，更優(yōu)選選自蔗糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖及其混合物的碳水化合物或含有至少一種所述化合物的組合物。最優(yōu)選，其他含碳化合物選自蔗糖和D-葡萄糖，最優(yōu)選蔗糖、D-葡萄糖及其混合物。用作可同化碳源的甘油可以以純甘油的形式或以未經(jīng)之前純化的粗制甘油的形式來使用，所述粗制甘油例如獲自生物柴油或生物乙醇生產(chǎn)。可同化碳源的初始濃度(即，甘油和至少一種其他含碳化合物的總和)優(yōu)選被調(diào)節(jié)至0至100g/l，優(yōu)選0至75g/l，更優(yōu)選0至50g/l，甚至更優(yōu)選0至25g/l范圍中的值，并且在培養(yǎng)過程中維持在所述范圍中(如果其他含碳化合物的消耗速度快于其進(jìn)料至細(xì)胞培養(yǎng)物中的速度，可同化碳源的初始濃度可以為0g/l)。反應(yīng)培養(yǎng)基的pH可以通過加入合適的堿來控制，例如，氣態(tài)氨、NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、Mg(HCO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N和/或其混合物。如果在發(fā)酵過程中形成的有機(jī)酸是羧酸或二羧酸，這些堿中和劑尤為需要。在琥珀酸作為有機(jī)酸的情況中，Mg(OH)2和MgCO3是特別優(yōu)選的堿。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵步驟I)可以例如在攪拌式發(fā)酵罐、泡罩塔和環(huán)管反應(yīng)器中進(jìn)行。有關(guān)可能的方法類型(包括攪拌器類型和幾何設(shè)計(jì))的綜述可以見于Chmiel:“Bioprozesstechnik:EinführungindieBioverfahrenstechnik”，第1卷。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，可用的典型變量是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或例如在Chmiel,Hammes和Bailey:“BiochemicalEngineering”中解釋的以下變量：如分批、補(bǔ)料-分批、重復(fù)的補(bǔ)料-分批或者連續(xù)發(fā)酵，使用和不用生物質(zhì)的再循環(huán)。根據(jù)生產(chǎn)菌株，為了獲得良好的產(chǎn)量(YP/S)，可以噴射空氣、氧氣、二氧化碳、氫氣、氮?dú)饣蚝线m的氣體混合物。方法步驟I)中用于生產(chǎn)有機(jī)酸(尤其是琥珀酸)的特別優(yōu)選的條件為：進(jìn)一步優(yōu)選，方法步驟I)中，可同化碳源(即，甘油和其他含碳化合物)轉(zhuǎn)化成有機(jī)酸，優(yōu)選轉(zhuǎn)化成琥珀酸，碳產(chǎn)率YP/S(有機(jī)酸/碳，優(yōu)選琥珀酸/碳)為至少0.75g/g，優(yōu)選至少0.85g/g和最優(yōu)選至少1.0g/g。進(jìn)一步優(yōu)選，方法步驟I)中，可同化碳源(即，甘油和其他含碳化合物)轉(zhuǎn)化成有機(jī)酸，優(yōu)選轉(zhuǎn)化成琥珀酸，比生產(chǎn)產(chǎn)率為至少0.6ggDCW-1h-1有機(jī)酸，優(yōu)選琥珀酸，或至少0.65ggDCW-1h-1，至少0.7ggDCW-1h-1，至少0.75ggDCW-1h-1或至少0.77ggDCW-1h-1有機(jī)酸，優(yōu)選琥珀酸。進(jìn)一步優(yōu)選，方法步驟I)中，可同化碳源(即，甘油和其他含碳化合物)轉(zhuǎn)化成有機(jī)酸，優(yōu)選轉(zhuǎn)化成琥珀酸，其中有機(jī)酸，優(yōu)選琥珀酸，的時(shí)空產(chǎn)率為至少2.2g/(L×h)或至少2.5g/(L×h)，至少2.75g/(L×h)，至少3g/(L×h)，至少3.25g/(L×h)，至少3.5g/(L×h)，至少3.7g/(L×h)，至少4.0g/(L×h)，至少4.5g/(L×h)或至少5.0g/(L×h)有機(jī)酸，優(yōu)選琥珀酸。根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，在方法步驟I)中，微生物將至少20g/L，更優(yōu)選至少25g/L和甚至更優(yōu)選至少30g/L的可同化碳源(即，甘油和至少一種其他含碳化合物的總和)轉(zhuǎn)化成至少20g/l，更優(yōu)選至少25g/l和甚至更優(yōu)選至少30g/l的有機(jī)酸，優(yōu)選琥珀酸。如本文中描述的不同產(chǎn)率參數(shù)(“碳產(chǎn)率”或“YP/S”；“比生產(chǎn)產(chǎn)率”；或“時(shí)空產(chǎn)率(STY)”)是本領(lǐng)域公知的，并且可以按照例如Song和Lee，2006中所述來測(cè)定?！疤籍a(chǎn)率”和“YP/S”(均以產(chǎn)生的有機(jī)酸質(zhì)量/消耗的可同化碳源的質(zhì)量來表示)在本文中按照同義詞來使用。比生產(chǎn)產(chǎn)率描述每g干生物質(zhì)每h每L發(fā)酵液產(chǎn)生的產(chǎn)物(如琥珀酸)的量。表示為“DCW”的干細(xì)胞重量描述生物化學(xué)反應(yīng)中生物活性微生物的量。該值以每h每gDCW的g產(chǎn)物來給出(即，ggDCW-1h-1)。時(shí)空產(chǎn)率(STY)定義為，在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間中考慮，發(fā)酵過程中形成的有機(jī)酸的總量與培養(yǎng)物體積的比。時(shí)空產(chǎn)率也稱為“容積生產(chǎn)力”(volumetricproductivity)。在方法步驟II)中，從方法步驟I)中獲得的發(fā)酵液回收有機(jī)酸，優(yōu)選琥珀酸，或其鹽。通常，回收過程包括從發(fā)酵液分離微生物(稱為“生物質(zhì)”)的步驟。用于移出生物質(zhì)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括過濾、沉淀、浮選或其組合。因此，例如，可以使用離心機(jī)、分離器、傾析器、濾器或在浮選裝置中，移出生物質(zhì)。為了有價(jià)值產(chǎn)物的最大回收，常常建議洗滌生物質(zhì)，例如，以滲濾(diafiltration)的形式來洗滌。方法的選擇取決于發(fā)酵液中生物質(zhì)的含量和生物質(zhì)的性質(zhì)、以及生物質(zhì)與有機(jī)酸(即，有價(jià)值的產(chǎn)物)的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將發(fā)酵液滅菌或巴氏殺菌。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將發(fā)酵液濃縮。根據(jù)需要，這種濃縮可以分批或連續(xù)進(jìn)行。應(yīng)當(dāng)選擇壓力和溫度范圍，使得首先沒有產(chǎn)物損失，并且其次需要最少使用裝置和能量。對(duì)于多階段蒸發(fā)的壓力和溫度水平的熟練選擇特別能夠節(jié)約能量?；厥者^程可以進(jìn)一步包括其他純化步驟，其中將有機(jī)酸，優(yōu)選琥珀酸，進(jìn)一步純化。然而，如果有機(jī)酸通過以下所述的化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化成次級(jí)有機(jī)產(chǎn)物，則取決于反應(yīng)的種類和反應(yīng)條件，有機(jī)酸的進(jìn)一步純化不一定是必需的。對(duì)于方法步驟II)中獲得的有機(jī)酸的純化，優(yōu)選針對(duì)琥珀酸的純化，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如結(jié)晶、過濾、電滲析和色譜。在琥珀酸作為有機(jī)酸的情況中，例如，可以通過使用氫氧化鈣、氧化鈣、碳酸鈣或碳酸氫鈣中和，將琥珀酸沉淀為琥珀酸鈣產(chǎn)物，并過濾沉淀物，以分離琥珀酸。通過用硫酸酸化，接著過濾除去沉淀的硫酸鈣(石膏)，可以從沉淀的琥珀酸鈣回收琥珀酸。可以通過離子交換色譜進(jìn)一步純化所得到的溶液，以除去不合需要的殘留離子?；蛘?，如果已經(jīng)使用氫氧化鎂、碳酸鎂或其混合物來中和發(fā)酵液，則可以將方法步驟I)中獲得的發(fā)酵液酸化，以將培養(yǎng)基中所含的琥珀酸鎂轉(zhuǎn)化成酸形式(即，琥珀酸)，隨后可以通過將酸化的培養(yǎng)基冷卻而結(jié)晶琥珀酸。更多合適的純化方法的實(shí)例公開于EP-A-1005562、WO-A-2008/010373、WO-A-2011/082378、WO-A-2011/043443、WO-A-2005/030973、WO-A-2011/123268和WO-A-2011/064151和EP-A-2360137。根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案，所述方法進(jìn)一步包括方法步驟：I)通過至少一個(gè)化學(xué)反應(yīng)，將方法步驟I)中獲得的包含在發(fā)酵液中的有機(jī)酸、或?qū)⒎椒ú襟EII)中獲得的回收的有機(jī)酸，轉(zhuǎn)化成不同于所述有機(jī)酸的次級(jí)有機(jī)產(chǎn)物。在琥珀酸作為有機(jī)酸的情況中，優(yōu)選的次級(jí)有機(jī)產(chǎn)物選自琥珀酸酯及其聚合物、四氫呋喃(THF)、1,4-丁二醇(BDO)、γ-丁內(nèi)酯(GBL)和吡咯烷酮。根據(jù)用于生產(chǎn)THF、BDO和/或GBL的優(yōu)選實(shí)施方案，該方法包括：b1)將方法步驟I)或II)中獲得的琥珀酸直接催化氫化成THF和/或BDO和/或GBL，或b2)將方法步驟I)或II)中獲得的琥珀酸和/或琥珀酸鹽化學(xué)酯化成其相應(yīng)的二-低級(jí)烷基酯，和將所述酯隨后催化氫化成THF和/或BDO和/或GBL。根據(jù)用于生產(chǎn)吡咯烷酮的優(yōu)選實(shí)施方案，該方法包括：b)將方法步驟I)或II)中獲得的琥珀酸銨鹽以本身已知的方式化學(xué)轉(zhuǎn)化成吡咯烷酮。對(duì)于制備這些化合物的詳細(xì)內(nèi)容，可以參考US-A-2010/0159543和WO-A-2010/092155?，F(xiàn)在借助附圖和非限制性實(shí)施例來更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了質(zhì)粒pSacB(SEQIDNO:9)的示意圖。圖2顯示了質(zhì)粒pSacBΔldhA(SEQIDNO:10)的示意圖。圖3顯示了質(zhì)粒pSacBΔpflA(SEQIDNO:11)的示意圖。圖4顯示了質(zhì)粒pSacBΔpflD(SEQIDNO:12)的示意圖。實(shí)施例實(shí)施例1：用于產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌轉(zhuǎn)化的一般方法表1：本實(shí)施例涉及的DD1-野生型和突變株的命名菌株野生型DD1(保藏號(hào)DSM18541)DD1ΔldhAΔpflADD1ΔldhAΔpflD使用以下實(shí)驗(yàn)方案，通過電穿孔，用DNA轉(zhuǎn)化產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌DD1(野生型)。為了制備預(yù)培養(yǎng)物，自冷凍儲(chǔ)備物，接種DD1于100ml搖瓶中的40mlBHI(腦心浸液；Becton，DickinsonandCompany)中。在37℃；200rpm，孵育過夜。為了制備主培養(yǎng)物，將100mlBHI放入250ml搖瓶中并用預(yù)培養(yǎng)物接種至0.2的終OD(600nm)。孵育在37℃；200rpm進(jìn)行。在大約0.5、0.6和0.7的OD，收集細(xì)胞，用4℃的10％冷甘油洗滌沉淀物一次并重懸浮于2ml10％甘油(4℃)中。將100μl感受態(tài)細(xì)胞與2-8μg質(zhì)粒-DNA混合并在具有0.2cm寬度的電穿孔杯中在冰上保持2min。在以下條件下進(jìn)行電穿孔：400Ω；25μF；2.5kV(GenePulser，Bio-Rad)。在電穿孔后立即加入1ml的冷卻BHI并且在37℃孵育大約2h。將細(xì)胞鋪在含有5mg/L氯霉素的BHI上，并且在37℃孵育2-5d，直至轉(zhuǎn)化體的菌落可見。分離克隆并且在5mg/L氯霉素的BHI上重新劃線培養(yǎng)，直至獲得克隆的純度。實(shí)施例2：缺失/突變構(gòu)建體的產(chǎn)生缺失構(gòu)建體的產(chǎn)生：基于載體pSacB(SEQIDNO:9)構(gòu)建了缺失質(zhì)粒。圖1顯示了質(zhì)粒pSacB的示意圖。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過PCR從產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌的染色體DNA擴(kuò)增了應(yīng)當(dāng)缺失的染色體片段的5’-和3’-側(cè)翼區(qū)(各自大約1500bp)，并引入所述載體中。通常，對(duì)于缺失，靶向至少80％的ORF。以這樣的方式，構(gòu)建了用于乳酸脫氫酶ldhA的缺失質(zhì)粒pSacB_delta_ldhA(SEQIDNO:10)、用于丙酮酸甲酸裂解酶激活酶pflA的缺失質(zhì)粒，pSacB_delta_pflA(SEQIDNO:11)、和用于丙酮酸甲酸裂解酶pflD的缺失質(zhì)粒pSacB_delta_pflD(SEQIDNO:12)。圖2、3和4分別顯示了質(zhì)粒pSacB_delta_ldhA、pSacB_delta_pflA和pSacB_delta_pflD的示意圖。在pSacB的質(zhì)粒序列(SEQIDNO:9)中，堿基2380-3801包含sacB基因。堿基3802-4264包含sacB啟動(dòng)子。堿基526-984包含氯霉素基因。堿基1477-2337包含大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)(oriEC)(參見圖1)。在pSacB_delta_ldhA的質(zhì)粒序列(SEQIDNO:10)中，堿基1519-2850包含與產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌基因組同源的ldhA基因的5’側(cè)翼區(qū)，而堿基62-1518包含與產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌基因組同源的ldhA基因的3’側(cè)翼區(qū)。堿基5169-6590包含sacB基因。堿基6591-7053包含sacB啟動(dòng)子。堿基3315-3773包含氯霉素基因。堿基4266-5126包含大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)(oriEC)(參見圖2)。在pSacB_delta_pflA的質(zhì)粒序列(SEQIDNO:11)中，堿基1506-3005包含與產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌基因組同源的pflA基因的5’側(cè)翼區(qū)，而堿基6-1505包含與產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌基因組同源的pflA基因的3’側(cè)翼區(qū)。堿基5278-6699包含sacB基因。堿基6700-7162包含sacB啟動(dòng)子。堿基3424-3882包含氯霉素基因。堿基4375-5235包含大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)(oriEC)(參見圖3)。在pSacB_delta_pflD的質(zhì)粒序列(SEQIDNO:12)中，堿基1533-2955包含與產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌基因組同源的pflD基因的5’側(cè)翼區(qū)，而堿基62-1532包含與產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌基因組同源的pflD基因的3’側(cè)翼區(qū)。堿基5256-6677包含sacB基因。堿基6678-7140包含sacB啟動(dòng)子。堿基3402-3860包含氯霉素基因。堿基4353-5213包含大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)(oriEC)(參見圖4)。實(shí)施例3：產(chǎn)生改良的琥珀酸生產(chǎn)菌株缺失突變體的產(chǎn)生：a)按照以上所述的，用pSacB_delta_ldhA轉(zhuǎn)化產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌DD1，并“Campbelledin”，產(chǎn)生“Campbellin”菌株。通過PCR產(chǎn)生針對(duì)質(zhì)粒整合至產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌基因組中事件的條帶，證實(shí)了轉(zhuǎn)化和整合至產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌的基因組中。然后使用含有蔗糖的瓊脂平板作為反向選擇培養(yǎng)基，將“Campbelledin”菌株“Campbelledout”，選擇sacB-基因的(功能)的丟失。因此，將“Campbelledin”菌株在25-35ml非選擇性培養(yǎng)基(不含抗生素的BHI)中，在37℃，220rpm孵育過夜。然后將過夜培養(yǎng)物在新鮮制備的含有蔗糖的BHI平板(10％，無(wú)抗生素)上劃線培養(yǎng)并且在37℃下孵育過夜(“第一次蔗糖轉(zhuǎn)移”)。將從第一次轉(zhuǎn)移獲得的單菌落再次在新鮮制備的含有蔗糖的BHI平板(10％)上劃線培養(yǎng)并且在37℃下孵育過夜(“第二次蔗糖轉(zhuǎn)移”)。重復(fù)該程序，直至最少完成蔗糖中的五次轉(zhuǎn)移(“第三次、第四次、第五次蔗糖轉(zhuǎn)移”)。術(shù)語(yǔ)“第一次至第五次蔗糖轉(zhuǎn)移”是指，在含有sacB-果聚糖-蔗糖酶基因的載體染色體整合后菌株在含有蔗糖和生長(zhǎng)培養(yǎng)基的平板上轉(zhuǎn)移，用于選擇失去sacB-基因和周圍質(zhì)粒序列的菌株。將來自第五次轉(zhuǎn)移平板的單菌落接種至非選擇性培養(yǎng)基(不含抗生素的BHI)上并且在37℃，220rpm下孵育過夜。將過夜培養(yǎng)物連續(xù)稀釋并且涂布在BHI平板上以獲得分離的單菌落。通過氯霉素敏感性，證實(shí)了含有l(wèi)dhA-基因座的野生型或ldhA-基因的突變/缺失的“Campbelledout”菌株。通過PCR分析鑒定并證實(shí)了這些菌株中的突變/缺失突變株。這導(dǎo)致了ldhA-缺失突變株產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhA。b)按照以上所述的用pSacB_delta_pflA轉(zhuǎn)化產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhA并且“Campbelledin”，產(chǎn)生“Campbellin”菌株。通過PCR證實(shí)了轉(zhuǎn)化和整合。然后按照之前所述的，將“Campbellin”菌株“Campbelledout”。通過PCR分析鑒定并證實(shí)了這些菌株中的缺失突變株。這導(dǎo)致了ldhApflD-雙缺失突變株產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhAΔpflA。c)按照以上所述的用pSacB_delta_pflD轉(zhuǎn)化產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌ΔldhA并且“Campbelledin”，產(chǎn)生“Campbellin”菌株。通過PCR證實(shí)了轉(zhuǎn)化和整合。然后按照之前所述的，將“Campbellin”菌株“Campbelledout”。通過PCR分析鑒定并證實(shí)了這些菌株中的缺失突變株。這導(dǎo)致了ldhApflD-雙缺失突變株產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhAΔpflD。實(shí)施例4：DD1ΔldhAΔpflA的葡萄糖或甘油消耗速率的測(cè)定1.培養(yǎng)基制備用于種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組成描述于表1中。對(duì)于主培養(yǎng)物發(fā)酵，使用的培養(yǎng)基描述于表2中。表1：用于種子培養(yǎng)物培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成化合物濃度[g/L]酵母提取物(BioSpringer)12.5(NH4)2SO40.05琥珀酸2.5Na2CO32KH2PO41MgCO350葡萄糖50表2：用于主培養(yǎng)物培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成化合物濃度[g/L]酵母提取物(BioSpringer)12.5(NH4)2SO40.05甜菜堿0.23Na2CO32KH2PO41聚丙二醇(消泡)50葡萄糖502.培養(yǎng)和分析一個(gè)種子培養(yǎng)步驟后，接種主培養(yǎng)物。對(duì)于種子培養(yǎng)，在2L瓶中高壓滅菌水、MgCO3和Na2CO3，制備表1中所述的培養(yǎng)基。準(zhǔn)備其他組分并分開滅菌，此后以無(wú)菌方式加入瓶中。將1％低溫儲(chǔ)備物接種至含有1800mL上述液體培養(yǎng)基的2L瓶中。在瓶中施加CO2氣氛。由于MgCO3和CO2氣氛的存在，培養(yǎng)基的起始pH在7.5至8.0的范圍中。孵育在37℃，170rpm(振蕩直徑：2.5cm)在厭氧條件下進(jìn)行12小時(shí)。培養(yǎng)物達(dá)到了21的OD600nm。將總共5％的上述種子培養(yǎng)物用于接種主培養(yǎng)物。主培養(yǎng)在含有初始體積500mL的表2所述液體培養(yǎng)基的1L-發(fā)酵罐中進(jìn)行。通過在發(fā)酵罐中高壓滅菌水、Na2CO3和消泡劑來制備培養(yǎng)基。其他組分分開制成溶液并在此后以無(wú)菌方式加入發(fā)酵罐中。葡萄糖用作這些發(fā)酵的碳源，以測(cè)定琥珀酸生產(chǎn)菌株對(duì)其的消耗速率。按分批方式(batch)在培養(yǎng)基中加入45g/L葡萄糖，并且在發(fā)酵中還通過2g/L/h的速率補(bǔ)料來提供葡萄糖。發(fā)酵開始后4h，開始補(bǔ)料。整個(gè)發(fā)酵時(shí)間過程中，葡萄糖是過量的，并且按照下一部分所述的通過HPLC來測(cè)量(通過發(fā)酵中可檢測(cè)葡萄糖濃度總是高于1g/L，證實(shí)了葡萄糖的過量)。在發(fā)酵過程中保持恒定的pH6.5，并且通過添加15wt.％氫氧化鎂來控制。在發(fā)酵罐中以0.1vvm流速施加CO2，并且轉(zhuǎn)向速度為500rpm。種子培養(yǎng)物和主培養(yǎng)物的分析描述于下一部分中。3.分析通過HPLC來定量羧酸的產(chǎn)生。關(guān)于所用的HPLC方法的詳細(xì)內(nèi)容描述于表3和4中。通過使用分光光度計(jì)(Ultrospec3000，AmershamBiosciences，UppsalaSweden)測(cè)量600nm的吸光度(OD600nm)來測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)。表3：用于甘油、葡萄糖和琥珀酸分析的HPLC方法(ZX-THF50)4.結(jié)果為了計(jì)算葡萄糖消耗速率，進(jìn)行了葡萄糖分批發(fā)酵(fermentationwithbatchedglucose)。在該發(fā)酵中，葡萄糖是過量的，以允許隨著時(shí)間計(jì)算葡萄糖消耗速率。在發(fā)酵過程中通過HPLC離線檢查葡萄糖的濃度，在培養(yǎng)基中總是檢測(cè)到葡萄糖。測(cè)量結(jié)果證實(shí)了葡萄糖在培養(yǎng)基中總是過量的。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，以分批模式加入了45g/L葡萄糖，并且在4小時(shí)后應(yīng)用2g/L/h的補(bǔ)料速率。表5：使用上述的巴斯夫菌屬DD1ΔldhAΔpflD，針對(duì)琥珀酸發(fā)酵的不同時(shí)間間隔的葡萄糖消耗速率。時(shí)間間隔[h]0-99-1515-2323-40葡萄糖消耗速率[g/L/h]2.763.872.221.61為了計(jì)算消耗速率，測(cè)定了特定時(shí)間間隔中消耗的葡萄糖量。實(shí)施例5：使用甘油結(jié)合限制的或非限制的葡萄糖，比較DD1ΔldhAΔpflD的發(fā)酵5.培養(yǎng)基制備用于種子培養(yǎng)和用于主培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組成描述于之前的部分中(實(shí)施例4)。6.培養(yǎng)和分析從由一個(gè)種子培養(yǎng)組成的種子罐(seedtrain)，接種主培養(yǎng)物。對(duì)于種子培養(yǎng)，將1％低溫儲(chǔ)備物接種于含有1800mL表1所述液體培養(yǎng)基的2L瓶中，并使用CO2氣氛。由于MgCO3和CO2氣氛的存在，培養(yǎng)基的起始pH在7.5至8.0的范圍中。在37℃和170rpm(振蕩直徑：2.5cm)在厭氧條件下過夜孵育12小時(shí)(21的OD600nm)。將總共5％的種子培養(yǎng)物用于接種含有500mL初始體積的表2所述液體培養(yǎng)基的1L-發(fā)酵罐中的主培養(yǎng)物。甘油和葡萄糖是碳源。在發(fā)酵開始前，以分批模式提供了54g/L甘油和8g/L葡萄糖。甘油在整個(gè)發(fā)酵過程中保持過量，并且以給細(xì)胞提供限制量的或非限制量的葡萄糖的速率補(bǔ)料葡萄糖。當(dāng)補(bǔ)料速率低于之前測(cè)定的葡萄糖的消耗速率時(shí)，認(rèn)為補(bǔ)料是限制性的。在發(fā)酵4小時(shí)后開始補(bǔ)料，并且葡萄糖的補(bǔ)料速率為2.5g/L/h(非限制的)或0.25g/L/h(限制的)。利用的堿是15wt.％氫氧化鎂。在發(fā)酵罐中以0.1vvm流速施加CO2，并且轉(zhuǎn)向速度為500rpm。按照之前部分(表3)中所述的，進(jìn)行了種子培養(yǎng)物和主培養(yǎng)物的分析。在發(fā)酵過程中通過HPLC離線檢測(cè)葡萄糖的濃度，以2.5g/L/h補(bǔ)料時(shí)培養(yǎng)基中總是檢測(cè)到葡萄糖。當(dāng)使用限制的葡萄糖補(bǔ)料(0.25g/L/h)時(shí)，在特定時(shí)間間隔中在培養(yǎng)物上清液中沒有檢測(cè)到該糖。7.結(jié)果7a.葡萄糖消耗速率的測(cè)定在本實(shí)驗(yàn)中，在發(fā)酵開始前，以分批模式加入了8g/L葡萄糖和54g/L甘油，并且在發(fā)酵4小時(shí)后使用2.5g/L/h的葡萄糖補(bǔ)料速率。按照實(shí)施例4中所述的計(jì)算葡萄糖消耗速率，針對(duì)此具體實(shí)驗(yàn)設(shè)定，每個(gè)時(shí)間間隔的結(jié)果描述于表6中。在此實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵中可檢測(cè)的葡萄糖濃度總是高于1g/L。表6中給出的葡萄糖消耗速率因此是在給定培養(yǎng)條件下“其他含碳化合物的最大理論消耗速率CRcc.max”。表6：使用產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhAΔpflD，針對(duì)琥珀酸發(fā)酵的不同時(shí)間間隔的葡萄糖消耗速率7b.比較在限制的和非限制的葡萄糖補(bǔ)料下產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhAΔpflD發(fā)酵的琥珀酸滴度和時(shí)空產(chǎn)率在測(cè)定以上所述的葡萄糖消耗速率后，在發(fā)酵中使用限制的或非限制的葡萄糖補(bǔ)料。表7顯示了提供限制的和非限制的葡萄糖濃度的不同補(bǔ)料速率。琥珀酸滴度和時(shí)空產(chǎn)率也顯示于表7中。表7：比較琥珀酸生產(chǎn)中限制的和非限制的葡萄糖補(bǔ)料以0.25g/L/h的速率補(bǔ)加葡萄糖(限制性補(bǔ)料)時(shí)，發(fā)酵中的葡萄糖濃度總是低于檢測(cè)限。結(jié)果表明，以限制性方式添加葡萄糖時(shí)，所產(chǎn)生的琥珀酸滴度的增加以及更高的時(shí)空產(chǎn)率。實(shí)施例6：在產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhAΔpflD發(fā)酵中比較不同的葡萄糖限制補(bǔ)料8.培養(yǎng)基制備用于種子培養(yǎng)和主培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組成描述于部分1中(實(shí)施例4)。9.培養(yǎng)和分析從由一個(gè)種子培養(yǎng)組成的種子罐，接種主培養(yǎng)物。對(duì)于種子培養(yǎng)，將1％低溫儲(chǔ)備物接種于含有1800mL表1所述液體培養(yǎng)基的2L瓶中，并使用CO2氣氛。由于MgCO3和CO2氣氛的存在，培養(yǎng)基的起始pH在7.5至8.0的范圍中。在37℃和170rpm(振蕩直徑：2.5cm)在厭氧條件下過夜孵育12小時(shí)(21的OD600nm)。將總共5％的種子培養(yǎng)物用于接種含有500mL初始體積的表2所述液體培養(yǎng)基的1L-發(fā)酵罐中的主培養(yǎng)物。甘油和葡萄糖是碳源。在發(fā)酵開始前，以分批模式提供了50g/L甘油和8g/L葡萄糖。甘油在整個(gè)發(fā)酵過程中保持過量，并且以給細(xì)胞提供限制量葡萄糖的速率補(bǔ)加葡萄糖。當(dāng)補(bǔ)料速率低于之前測(cè)定的葡萄糖消耗速率時(shí)，認(rèn)為補(bǔ)料是限制的。在發(fā)酵4小時(shí)后開始補(bǔ)料，并且葡萄糖的補(bǔ)料速率描述于表8中。利用的堿是15wt.％氫氧化鎂。在發(fā)酵罐中以0.1vvm流速施加CO2，并且轉(zhuǎn)向速度為500rpm。按照之前部分(表3)中所述，進(jìn)行了種子培養(yǎng)物和主培養(yǎng)物的分析。在發(fā)酵過程中通過HPLC離線檢測(cè)葡萄糖的濃度，在特定時(shí)間間隔過程中在培養(yǎng)物上清液中沒有檢測(cè)到葡萄糖。10.結(jié)果按照實(shí)施例1中所述的計(jì)算葡萄糖消耗速率后，進(jìn)行了葡萄糖的補(bǔ)料速率低于消耗速率(限制補(bǔ)料)的發(fā)酵。甘油在發(fā)酵中過量。琥珀酸滴度和時(shí)空產(chǎn)率受到補(bǔ)入發(fā)酵罐中的葡萄糖量的直接影響(表8)。表8中觀察到的結(jié)果證實(shí)，在甘油是主要碳源的發(fā)酵中，使用限制量的葡萄糖，可以提高琥珀酸的量和時(shí)空產(chǎn)率。葡萄糖的補(bǔ)料速率越低，琥珀酸滴度和時(shí)空產(chǎn)率越高。表8：限制性葡萄糖補(bǔ)料速率結(jié)合過量的甘油對(duì)通過產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌DD1ΔldhAΔpflD的琥珀酸發(fā)酵的滴度和時(shí)空產(chǎn)率的影響。這些實(shí)施例顯示，使用甘油作為琥珀酸發(fā)酵的主碳源時(shí)，限制的葡萄糖量是有益的。序列表SEQIDNO：1(菌株DD1的16SrDNA的核苷酸序列)tttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgaacggtagcgggaggaaagcttgctttctttgccgacgagtggcggacgggtgagtaatgcttggggatctggcttatggagggggataacgacgggaaactgtcgctaataccgcgtaatatcttcggattaaagggtgggactttcgggccacccgccataagatgagcccaagtgggattaggtagttggtggggtaaaggcctaccaagccgacgatctctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggttgtaaagttctttcggtgacgaggaaggtgtttgttttaataggacaagcaattgacgttaatcacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaataactgggcgtaaagggcatgcaggcggacttttaagtgagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaattgcatttcagactgggagtctagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccgaaggcgaaggcagccccttgggaagatactgacgctcatatgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgcggtaaacgctgtcgatttggggattgggctttaggcctggtgctcgtagctaacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatcctgtagagatacgggagtgccttcgggagctctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcatgtaaagatgggaactcaaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggtgcatacagagggcggcgataccgcgaggtagagcgaatctcagaaagtgcatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgtaccagaagtagatagcttaaccttcggggggggcgtttaccacggtatgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggSEQIDNO：2(菌株DD1的23SrDNA的核苷酸序列)agtaataacgaacgacacaggtataagaatacttgaggttgtatggttaagtgactaagcgtacaaggtggatgccttggcaatcagaggcgaagaaggacgtgctaatctgcgaaaagcttgggtgagttgataagaagcgtctaacccaagatatccgaatggggcaacccagtagatgaagaatctactatcaataaccgaatccataggttattgaggcaaaccgggagaactgaaacatctaagtaccccgaggaaaagaaatcaaccgagattacgtcagtagcggcgagcgaaagcgtaagagccggcaagtgatagcatgaggattagaggaatcggctgggaagccgggcggcacagggtgatagccccgtacttgaaaatcattgtgtggtactgagcttgcgagaagtagggcgggacacgagaaatcctgtttgaagaaggggggaccatcctccaaggctaaatactcctgattgaccgatagtgaaccagtactgtgaaggaaaggcgaaaagaaccccggtgaggggagtgaaatagaacctgaaaccttgtacgtacaagcagtgggagcccgcgagggtgactgcgtaccttttgtataatgggtcagcgacttatattatgtagcgaggttaaccgaataggggagccgaagggaaaccgagtcttaactgggcgtcgagttgcatgatatagacccgaaacccggtgatctagccatgggcaggttgaaggttgggtaacactaactggaggaccgaaccgactaatgttgaaaaattagcggatgacctgtggctgggggtgaaaggccaatcaaaccgggagatagctggttctccccgaaatctatttaggtagagccttatgtgaataccttcgggggtagagcactgtttcggctagggggccatcccggcttaccaacccgatgcaaactgcgaataccgaagagtaatgcataggagacacacggcgggtgctaacgttcgtcgtggagagggaaacaacccagaccgccagctaaggtcccaaagtttatattaagtgggaaacgaagtgggaaggcttagacagctaggatgttggcttagaagcagccatcatttaaagaaagcgtaatagctcactagtcgagtcggcctgcgcggaagatgtaacggggctcaaatatagcaccgaagctgcggcatcaggcgtaagcctgttgggtaggggagcgtcgtgtaagcggaagaaggtggttcgagagggctgctggacgtatcacgagtgcgaatgctgacataagtaacgataaaacgggtgaaaaacccgttcgccggaagaccaagggttcctgtccaacgttaatcggggcagggtgagtcggcccctaaggcgaggctgaagagcgtagtcgatgggaaacgggttaatattcccgtacttgttataattgcgatgtggggacggagtaggttaggttatcgacctgttggaaaaggtcgtttaagttggtaggtggagcgtttaggcaaatccggacgcttatcaacaccgagagatgatgacgaggcgctaaggtgccgaagtaaccgataccacacttccaggaaaagccactaagcgtcagattataataaaccgtactataaaccgacacaggtggtcaggtagagaatactcaggcgcttgagagaactcgggtgaaggaactaggcaaaatagcaccgtaacttcgggagaaggtgcgccggcgtagattgtagaggtatacccttgaaggttgaaccggtcgaagtgacccgctggctgcaactgtttattaaaaacacagcactctgcaaacacgaaagtggacgtatagggtgtgatgcctgcccggtgctggaaggttaattgatggcgttatcgcaagagaagcgcctgatcgaagccccagtaaacggcggccgtaactataacggtcctaaggtagcgaaattccttgtcgggtaagttccgacctgcacgaatggcataatgatggccaggctgtctccacccgagactcagtgaaattgaaatcgccgtgaagatgcggtgtacccgcggctagacggaaagaccccgtgaacctttactatagcttgacactgaaccttgaattttgatgtgtaggataggtgggaggctttgaagcggtaacgccagttatcgtggagccatccttgaaataccaccctttaacgtttgatgttctaacgaagtgcccggaacgggtactcggacagtgtctggtgggtagtttgactggggcggtctcctcccaaagagtaacggaggagcacgaaggtttgctaatgacggtcggacatcgtcaggttagtgcaatggtataagcaagcttaactgcgagacggacaagtcgagcaggtgcgaaagcaggtcatagtgatccggtggttctgaatggaagggccatcgctcaacggataaaaggtactccggggataacaggctgataccgcccaagagttcatatcgacggcggtgtttggcacctcgatgtcggctcatcacatcctggggctgaagtaggtcccaagggtatggctgttcgccatttaaagtggtacgcgagctgggtttaaaacgtcgtgagacagtttggtccctatctgccgtgggcgttggagaattgagaggggctgctcctagtacgagaggaccggagtggacgcatcactggtgttccggttgtgtcgccagacgcattgccgggtagctacatgcggaagagataagtgctgaaagcatctaagcacgaaacttgcctcgagatgagttctcccagtatttaatactgtaagggttgttggagacgacgacgtagataggccgggtgtgtaagcgttgcgagacgttgagctaaccggtactaattgcccgagaggcttagccatacaacgctcaagtgtttttggtagtgaaagttattacggaataagtaagtagtcagggaatcggctSEQIDNO：3(來自菌株DD1的1dhA-基因的核苷酸序列)ttgacaaaatcagtatgtttaaataaggagctaactatgaaagttgccgtttacagtactaaaaattatgatcgcaaacatctggatttggcgaataaaaaatttaattttgagcttcatttctttgattttttacttgatgaacaaaccgcgaaaatggcggagggcgccgatgccgtctgtattttcgtcaatgatgatgcgagccgcccggtgttaacaaagttggcgcaaatcggagtgaaaattatcgctttacgttgtgccggttttaataatgtggatttggaggcggcaaaagagctgggattaaaagtcgtacgggtgcctgcgtattcgccggaagccgttgccgagcatgcgatcggattaatgctgactttaaaccgccgtatccataaggcttatcagcgtacccgcgatgcgaatttttctctggaaggattggtcggttttaatatgttcggcaaaaccgccggagtgattggtacgggaaaaatcggcttggcggctattcgcattttaaaaggcttcggtatggacgttctggcgtttgatccttttaaaaatccggcggcggaagcgttgggcgcaaaatatgtcggtttagacgagctttatgcaaaatcccatgttatcactttgcattgcccggctacggcggataattatcatttattaaatgaagcggcttttaataaaatgcgcgacggtgtaatgattattaataccagccgcggcgttttaattgacagccgggcggcaatcgaagcgttaaaacggcagaaaatcggcgctctcggtatggatgtttatgaaaatgaacgggatttgtttttcgaggataaatctaacgatgttattacggatgatgtattccgtcgcctttcttcctgtcataatgtgctttttaccggtcatcaggcgtttttaacggaagaagcgctgaataatatcgccgatgtgactttatcgaatattcaggcggtttccaaaaatgcaacgtgcgaaaatagcgttgaaggctaaSEQIDNO：4(來自菌株DD1的LdhA的氨基酸序列)MTKSVCLNKELTMKVAVYSTKNYDRKHLDLANKKFNFELHFFDFLLDEQTAKMAEGADAVCIFVNDDASRPVLTKLAQIGVKIIALRCAGFNNVDLEAAKELGLKVVRVPAYSPEAVAEHAIGLMLTLNRRIHKAYQRTRDANFSLEGLVGFNMFGKTAGVIGTGKIGLAAIRILKGFGMDVLAFDPFKNPAAEALGAKYVGLDELYAKSHVITLHCPATADNYHLLNEAAFNKMRDGVMIINTSRGVLIDSRAAIEALKRQKIGALGMDVYENERDLFFEDKSNDVITDDVFRRLSSCHNVLFTGHQAFLTEEALNNIADVTLSNIQAVSKNATCENSVEGSEQIDNO：5(來自菌株DD1的pf1A-基因的核苷酸序列)atgtcggttttaggacgaattcattcatttgaaacctgcgggacagttgacgggccgggaatccgctttattttatttttacaaggctgcttaatgcgttgtaaatactgccataatagagacacctgggatttgcacggcggtaaagaaatttccgttgaagaattaatgaaagaagtggtgacctatcgccattttatgaacgcctcgggcggcggagttaccgcttccggcggtgaagctattttacaggcggaatttgtacgggactggttcagagcctgccataaagaaggaattaatacttgcttggataccaacggtttcgtccgtcatcatgatcatattattgatgaattgattgatgacacggatcttgtgttgcttgacctgaaagaaatgaatgaacgggttcacgaaagcctgattggcgtgccgaataaaagagtgctcgaattcgcaaaatatttagcggatcgaaatcagcgtacctggatccgccatgtt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