本申請要求2014年5月6日提交的“賦予鞘翅目和半翅目害蟲抗性的SEC23核酸分子”的美國臨時專利申請系列號61/989,170的申請日的利益。本公開的領(lǐng)域本發(fā)明一般性地涉及由鞘翅目和半翅目害蟲引起的植物損害的遺傳控制。在特定的實施方案中，本發(fā)明涉及目標編碼和非編碼序列的鑒定、及其重組DNA技術(shù)在鞘翅目或半翅目害蟲細胞中轉(zhuǎn)錄后阻遏或抑制目標編碼序列和非編碼序列表達從而提供植保作用的用途。背景西方玉米根蟲(WCR)(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte，玉米根螢葉甲)是北美的一種破壞性最大的玉米根蟲物種，在美國中西部玉米種植區(qū)受到特別關(guān)注。北方玉米根蟲(NCR)(巴氏根螢葉甲)是與WCR共棲大致相同范圍的近緣物種。有幾種葉甲屬的其他相關(guān)亞種是北美洲的嚴重害蟲：墨西哥玉米根蟲(MCR)[墨西哥玉米根螢葉甲(D.virgiferazeaeKrysanandSmith)]；南方玉米根蟲(SCR)(十一星根螢葉甲)；黃瓜條根螢葉甲(D.balteataLeConte)；D.undecimpunctatatenella；和D.u.undecimpunctataMannerheim。美國農(nóng)業(yè)部目前估計玉米根蟲每年造成10億美元收入損失，包括8億美元產(chǎn)量損失和2億美元處理成本。WCR卵和NCR卵兩者都在夏季期間沉積在土壤中。這些昆蟲在整個冬季都停留在卵階段。卵是橢圓的、白色、且長度小于0.004英寸(0.010cm)。幼蟲在5月下旬或6月上旬孵出，卵孵化的精確時間由于溫度差異和位置而在各年間有所變化。新孵出的幼蟲是白色的蠕蟲，長度小于0.125英寸(0.3175cm)。一旦孵出，幼蟲便開始以玉米根為食。玉米根蟲經(jīng)歷三個幼蟲齡。在進食幾周后，幼蟲蛻皮，進入蛹階段。它們在土壤中化蛹，然后它們在7月和8月中以成蟲從土壤出現(xiàn)。成體根蟲長度約0.25英寸(0.635cm)。玉米根蟲幼蟲在玉米和幾種其他禾本科物種上完成發(fā)育。在黃色狗尾草上飼養(yǎng)的幼蟲較晚出現(xiàn)，并且作為成蟲比玉米上飼養(yǎng)的幼蟲具有更小的頭殼尺寸。Ellsbury等人，(2005)Environ.Entomol.34:627-634。WCR成蟲以玉米穗絲、花粉、和暴露的穗尖上的籽粒為食。如果WCR成蟲在存在玉米生殖組織之前出現(xiàn)，則它們可以以葉組織為食，由此減緩植物生長，且偶而殺死宿主植物。然而，當優(yōu)選的穗絲和花粉變得可得到時，成蟲會快速向其移動。NCR成蟲也以玉米植物的生殖組織為食，但相比之下很少以玉米葉為食。玉米中的大部分根蟲損傷由幼蟲進食引起。新孵出的根蟲最初以細的玉米根毛為食，并鉆入根尖中。隨著幼蟲長得更大，它們以初生根為食并鉆入其中。在有大量玉米根蟲時，幼蟲進食經(jīng)常導(dǎo)致修剪根，一直到玉米桿基部。嚴重的根損傷干擾根將水和養(yǎng)分轉(zhuǎn)運到植物中的能力，降低植物生長，并導(dǎo)致籽粒產(chǎn)生減少，由此經(jīng)常急劇降低總產(chǎn)量。嚴重的根損傷還經(jīng)常導(dǎo)致玉米植物的倒伏，其使收獲變得更難，并進一步降低產(chǎn)量。此外，成蟲以玉米生殖組織為食可以導(dǎo)致穗尖的穗絲修剪。如果這種“穗絲剪切”在花粉脫落期間足夠嚴重，則傳粉可能受到破壞?？梢酝ㄟ^作物輪作、化學(xué)殺蟲劑、生物殺蟲劑(例如，孢子形成革蘭氏陽性細菌蘇云金芽孢桿菌)、或這些手段的組合來嘗試控制玉米根蟲。作物輪作的重大缺陷是過度限制了農(nóng)田的用途。此外，一些根蟲物種可以在大豆田間產(chǎn)卵，因此會降低用玉米和大豆實施的作物輪作的效率?；瘜W(xué)殺蟲劑是最為人們所倚重的實現(xiàn)玉米根蟲控制的手段。然而，使用化學(xué)殺蟲劑并不是完美的玉米根蟲控制策略；如果把化學(xué)殺蟲劑的成本與使用殺蟲劑后仍可能發(fā)生的根蟲害所致的損失相加，則美國每年由于玉米根蟲可能損失超過10億美元。大的幼蟲群體、大雨、和不適當?shù)臍⑾x劑應(yīng)用均可導(dǎo)致玉米根蟲控制不充分。此外，殺蟲劑的連續(xù)使用可能選擇殺蟲劑抗性根蟲品系，并且由于殺蟲劑中許多對非靶物種有毒性，有嚴重的影響環(huán)境之虞。椿象(半翅目；蝽科)構(gòu)成了另一大類重要的農(nóng)業(yè)害蟲。已知全世界有超過50個椿象的近緣物種引起作物損害。McPherson&McPherson,R.M.(2000)StinkbugsofeconomicimportanceinAmericanorthofMexicoCRCPress。這些昆蟲孳生于許多重要作物，包括玉米、大豆、水果、蔬菜、和谷物。新熱帶區(qū)布朗椿象(英雄美洲蝽)、紅帶椿象(蓋德擬壁蝽)；棕翅蝽(茶翅蝽)、和南部綠色蝽(稻綠蝽)是特別受到關(guān)注的。椿象在達到成體期之前要經(jīng)歷多個蛹期。蛹和成體均以來自軟組織的汁液為食，它們還將消化酶注入到軟組織中，引起口外組織的消化和壞死。然后攝入消化的植物材料和養(yǎng)分。植物維管系統(tǒng)水分和養(yǎng)分的耗竭導(dǎo)致植物組織破壞。對于籽粒和種子發(fā)育的損害最為顯著，因為產(chǎn)量和萌發(fā)顯著減少。從卵發(fā)育到成體的時間為約30-40天。在溫暖的氣候下會出現(xiàn)多個世代，導(dǎo)致顯著的蟲害壓力。當前的椿象管理依賴于單塊田的殺蟲劑處理。因此，迫切需要替代的管理策略，以將正在發(fā)生的作物損失降低到最低限度。RNA干擾(RNAi)是一種利用內(nèi)源細胞途徑的方法，由此對足夠大小的整個或任何部分靶基因序列特異性的干擾RNA(iRNA)分子(例如，雙鏈RNA(dsRNA)分子)導(dǎo)致由其編碼的mRNA的降解。在最近幾年，在許多物種和實驗系統(tǒng)，例如線蟲秀麗隱桿線蟲、植物、昆蟲胚胎、和組織培養(yǎng)物中的細胞中，已經(jīng)使用RNAi進行基因“敲低”。參見，例如Fire等人，(1998)Nature391:806-811；Martinez等人，(2002)Cell110:563-574；McManus和Sharp(2002)NatureRev.Genetics3:737-747。RNAi通過包括切丁酶(DICER)蛋白質(zhì)復(fù)合物的內(nèi)源途徑完成mRNA的降解。切丁酶將長的dsRNA分子切割成約20個核苷酸的短片段，稱作小干擾RNA(siRNA)。siRNA解旋成兩個單鏈RNA：乘客鏈(passengerstrand)和引導(dǎo)鏈(guidestrand)。乘客鏈被降解，引導(dǎo)鏈則被整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中。微小核糖核酸(miRNA)分子可以類似地整合到RISC中。轉(zhuǎn)錄后基因沉默發(fā)生在引導(dǎo)鏈特異性結(jié)合mRNA分子的互補序列并且誘導(dǎo)Argonaute(RISC復(fù)合物的催化組分)切割時。盡管在一些真核生物，諸如植物、線蟲類和一些昆蟲中，siRNA和/或miRNA的初始濃度有限，但已知此過程系統(tǒng)性地遍布于整個生物體。僅與siRNA和/或miRNA互補的轉(zhuǎn)錄物被切割和降解，因此mRNA表達的敲低是序列特異性的。在植物中，存在切丁酶基因的幾個功能組。RNAi的基因沉默效應(yīng)持續(xù)數(shù)天，并且在實驗條件下，可以導(dǎo)致靶向轉(zhuǎn)錄物的豐度下降90％或更多，隨之發(fā)生相應(yīng)蛋白質(zhì)的水平降低。美國專利No.7,612,194和美國專利公開文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545披露了自玉米根螢葉甲蛹分離的9112種表達序列標簽(EST)序列的文庫。在美國專利No.7,612,194和美國專利公開號2007/0050860中提出將與其中披露的玉米根螢葉甲液泡型H+-ATP酶(V-ATP酶)的幾個特定部分序列之一互補的核酸分子與啟動子可操作連接，以在植物細胞中表達反義RNA。美國專利公開文本No.2010/0192265提出將啟動子與核酸分子可操作連接以在植物細胞中表達反義RNA，所述核酸分子與具有未知且未公開的功能的玉米根螢葉甲基因的特定部分序列互補(該部分序列據(jù)稱與秀麗隱桿線蟲中的C56C10.3基因產(chǎn)物58％相同)。美國專利公開文本No.2011/0154545提出將啟動子與核酸分子可操作連接以在植物細胞中表達反義RNA，所述核酸分子與玉米根螢葉甲外被體(coatomer)β亞基基因的兩個特定部分序列互補。此外，美國專利No.7,943,819公開了自玉米根螢葉甲幼蟲、蛹、和切開的中腸分離的906種表達序列標簽(EST)序列的文庫，并且提出了將啟動子與核酸分子可操作連接以在植物細胞中表達雙鏈RNA，所述核酸分子與玉米根螢葉帶電的多泡體蛋白4b基因的特定部分序列互補。除了V-ATP酶的幾個特定部分序列和未知功能的基因的特定部分序列之外，在美國專利No.7,612,194和美國專利公開文本2007/0050860、2010/0192265和2011/0154545中沒有進一步提出使用其中列出的超過9000個序列中的任何特定序列進行RNA干擾。此外，美國專利No.7,612,194、以及美國專利公開文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545都沒有教示提供的超過9000個序列中哪些其他序列在用作dsRNA或siRNA時在玉米根蟲物種中會是致命的、甚至沒有教示其有任何其他方面的用處。除了帶電多泡體蛋白4b基因的特定部分序列之外，美國專利No.7,943,819沒有提出使用其文中的超過900個序列的任何特定序列進行RNA干擾。此外，美國專利No.7,943,819沒有教示其提供的超過900個序列中哪些其他序列在用作dsRNA或siRNA時在玉米根蟲物種中會是致命的、甚至沒有教示其有任何其他方面的用處。美國專利申請公開文本U.S.2013/040173和PCT申請公開文本W(wǎng)O2013/169923描述了源自玉米根螢葉甲Snf7基因的序列在玉米中進行RNA干擾的用途。(還公開于Bolognesi等人，(2012)PLosONE7(10):e47534.doi:10.1371/journal.pone.0047534)。與玉米根蟲DNA互補的絕大多數(shù)序列(如上述)用作dsRNA或siRNA時在玉米根蟲物種中不是致命的。例如，Baum等人(2007,NatureBiotechnology25:1322-1326)描述了RNAi對幾個WCR基因靶的抑制作用。這些作者報告，在超過520ng/cm2的極高iRNA(例如，dsRNA)濃度下，他們測試的26個靶基因中有8個不能提供實驗上顯著的鞘翅目害蟲死亡率。公開本文中公開了用于控制鞘翅目害蟲和半翅目害蟲的核酸分子(例如，靶基因、DNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)及其使用方法，所述鞘翅目害蟲包括，例如，玉米根螢葉甲(D.virgiferaLeConte)(西方玉米根蟲，“WCR”)；巴氏根螢葉甲(D.barberiSmithandLawrence,北方玉米根蟲，“NCR”)；十一星根螢葉甲(D.u.howardiBarber；南方玉米根蟲，“SCR”)；墨西哥玉米根螢葉甲(D.v.zeaeKrysanandSmith,墨西哥玉米根蟲，“MCR”)；黃瓜條根螢葉甲(D.balteataLeConte)；D.u.tenella；和D.u.undecimpunctataMannerheim；和半翅目害蟲，包括，例如，英雄美洲蝽(Euschistusheros(Fabr.))(新熱帶區(qū)布朗椿象，“BSB”)、稻綠蝽(Nezaraviridula(L.)(南部綠色蝽)、蓋德擬壁蝽(Piezodorusguildinii(Westwood))(紅帶椿象)、和茶翅蝽(Halyomorphahylys)(棕翅蝽)。在具體的實例中，公開了示例性核酸分子，其與鞘翅目和/或半翅目害蟲的一個或多個天然核酸序列的至少一部分可以同源。在這些和進一步的實例中，天然核酸序列可以是靶基因，其產(chǎn)物可以，例如但不限于：涉及代謝過程；涉及生殖過程；或者涉及幼蟲發(fā)育。在一些實例中，借助于包含與靶基因同源的序列的核酸分子，靶基因表達的翻譯后抑制在鞘翅目和/或半翅目害蟲中可以是致命的，或?qū)е律L和/或生殖降低。在具體的實例中，在具體實例中，可選擇以下的至少一種基因：玉米根螢葉甲Sec23(例如，SEQIDNO:1)；玉米根螢葉甲Sec23reg1(例如，SEQIDNO:3)；玉米根螢葉甲Sec23ver1(例如，SEQIDNO:4)；玉米根螢葉甲Sec23ver2(例如，SEQIDNO:5)；BSB_Sec23(例如，SEQIDNO:81)；BSB_Sec23-1(例如，SEQIDNO:82)；和BSB_Sec23-2(SEQIDNO:83)作為轉(zhuǎn)錄后沉默的靶基因。在具體實例中，用于轉(zhuǎn)錄后抑制的靶基因是本文稱為Sec23的基因。包含全長Sec23多核苷酸(例如SEQIDNO:1和81)的全長Sec23多核苷酸的互補序列的分離的核酸分子；和任何前述的片段。還公開了包含編碼與靶基因產(chǎn)物內(nèi)的氨基酸序列(例如選自下面列表的的基因的產(chǎn)物：玉米根螢葉甲Sec23；玉米根螢葉甲Sec23reg1；玉米根螢葉甲Sec23ver1；玉米根螢葉甲Sec23ver2；BSB_Sec23；BSB_Sec23-1；和BSB_Sec23-2)至少85％相同的多肽的核苷酸序列的核酸分子。例如，核酸分子可以包含編碼與包含在SEC23多肽(例如SEQIDNO:2和91)中的氨基酸序列至少85％相同的多肽的核苷酸序列。在特定的實例中，核酸分子包含編碼與Sec23的產(chǎn)物內(nèi)的氨基酸序列至少85％相同的多肽的核苷酸序列。進一步公開了包含編碼這樣的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列是編碼與靶基因產(chǎn)物內(nèi)的氨基酸序列至少85％相同的多肽的核苷酸序列的反向互補序列。還公開了用于產(chǎn)生iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)分子的cDNA序列，所述iRNA與鞘翅目和/或半翅目害蟲靶基因(例如,玉米根螢葉甲Sec23；玉米根螢葉甲Sec23reg1；玉米根螢葉甲Sec23ver1；玉米根螢葉甲Sec23ver2；BSB_Sec23；BSB_Sec23-1；和BSB_Sec23-2)的全部或部分互補。在特定的實施方案中，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和/或hpRNA可以在體外產(chǎn)生，或由遺傳修飾的生物(如植物或細菌)在體內(nèi)產(chǎn)生。在特定的實例中，公開了可用于產(chǎn)生與Sec23(例如，SEQIDNO:1和SEQIDNO:81)的全部或部分互補的iRNA分子的cDNA分子。進一步公開了抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中必需基因的表達的手段、以及向植物提供鞘翅目和/或半翅目害蟲抗性的手段。用于抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中的必需基因表達的手段是由SEQIDNO:3-5、82和83中的任一者或其互補序列組成的單鏈或雙鏈RNA分子。用于抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中的必需基因表達的手段的功能等同物包括與來自鞘翅目和/或半翅目害蟲的Sec23基因的全部或部分基本上同源的單鏈或雙鏈RNA分子。對植物提供鞘翅目和/或半翅目害蟲抗性的手段是這樣的DNA分子，其包含與啟動子可操作連接的、編碼抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中的必需基因的表達的手段的核酸序列，其中所述DNA分子能夠整合到植物(例如玉米)的基因組中。公開了控制鞘翅目和/或半翅目害蟲群體的方法，所述方法包括向鞘翅目和/或半翅目害蟲提供iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和hpRNA)分子，所述iRNA分子在被鞘翅目和/或半翅目害蟲攝取之后發(fā)揮作用而抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲體內(nèi)的生物功能，其中所述iRNA分子包含選自以下的核苷酸序列的全部或部分:SEQIDNO:1；SEQIDNO:1的互補序列；SEQIDNO:3；SEQIDNO:3的互補序列；SEQIDNO:4，SEQIDNO:4的互補序列；SEQIDNO:5；SEQIDNO:5的互補序列；SEQIDNO:81；SEQIDNO:81的互補序列；SEQIDNO:82；SEQIDNO:82的互補序列；SEQIDNO:83；SEQIDNO:83的互補序列；包含SEQIDNO:1，3-5和81-83中任一者的全部或部分的鞘翅目或半翅目生物(例如，WCR和BSB)的天然編碼序列；包含SEQIDNO:1，3-5和81-83中任一者的全部或部分的鞘翅目或半翅目生物的天然編碼序列的互補序列；被轉(zhuǎn)錄為包含SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的全部或部分的天然RNA分子的鞘翅目或半翅目生物天然非編碼序列；和轉(zhuǎn)錄為包含SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的全部或部分的天然RNA分子的鞘翅目或半翅目生物天然非編碼序列的互補序列。在具體實例中，公開了用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲群體的方法，包括向鞘翅目和/或半翅目害蟲提供iRNA(例如dsRNA，siRNA，miRNA，shRNA和hpRNA)，所述iRNA分子在被鞘翅目和/或半翅目害蟲攝取后發(fā)揮功能以抑制該翅目和/或半翅目害蟲中的生物活性，其中所述iRNA分子包含選自以下的核苷酸序列：SEQIDNO:1的全部或部分；SEQIDNO:1的全部或部分的互補序列；SEQIDNO:81的全部或部分；SEQIDNO:81的全部或部分的互補序列；包含SEQIDNO:1的鞘翅目或半翅目生物(例如，WCR和BSB)天然編碼序列的全部或部分；包含SEQIDNO:1的鞘翅目或半翅目生物天然編碼序列的互補序列的全部或部分；轉(zhuǎn)錄為包含SEQIDNO:1的天然RNA分子的鞘翅目或半翅目生物天然非編碼序列的全部或部分；轉(zhuǎn)錄為包含SEQIDNO:1的天然RNA分子的鞘翅目或半翅目生物天然非編碼序列的互補序列的全部或部分；包含SEQIDNO:81的鞘翅目或半翅目生物天然編碼序列的全部或部分；包含SEQIDNO:81的鞘翅目或半翅目生物天然編碼序列的互補序列的全部或部分；轉(zhuǎn)錄為包含SEQIDNO:81的天然RNA分子的鞘翅目或半翅目生物天然非編碼序列的全部或部分；以及轉(zhuǎn)錄為包含SEQIDNO:81的天然RNA分子的鞘翅目或半翅目生物天然非編碼序列的互補序列的全部或部分。本文中還公開了方法，其中可將dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和/或hpRNA在基于食料的測定中(diet-basedassay)提供給鞘翅目和/或半翅目害蟲，或提供在表達dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和/或hpRNA的遺傳修飾的植物細胞中。在這些和另外的實例中，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA可被鞘翅目和/或半翅目害蟲的幼蟲和/或成蟲攝入。然后，本發(fā)明的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、和/或hpRNA的攝入可在幼蟲和/或成蟲中導(dǎo)致RNAi，進而可導(dǎo)致對于鞘翅目和/或半翅目害蟲的生存力必需的基因的沉默，并最終導(dǎo)致害蟲死亡。因此，公開了這樣的方法，其中將包含示例性核酸序列的用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子提供給鞘翅目和/或半翅目害蟲。在特定的實例中，通過使用本發(fā)明的核酸分子控制的鞘翅目和/或半翅目害蟲可以是WCR、NCR、英雄美洲蝽(Euchistusheros)、蓋德擬壁蝽(Piezodorusguildinii)、茶翅蝽(Halyomorphahalys)、稻綠蝽(Nezaraviridula)、擬綠蝽(Acrosternumhilare)、和褐臭蝽(Euschistusservus)。參考下文結(jié)合附圖進行的對若干實施方案的詳細說明，前述的特征以及其他特征將會更加自明。附圖簡述圖1包括用單一一對引物從單個轉(zhuǎn)錄模板生成dsRNA的策略的描述。圖2是來自兩個轉(zhuǎn)錄模板的dsRNA的生成策略的描述。序列表中的序列的簡述使用如37C.F.R.§1.822規(guī)定的核苷酸堿基的標準字母縮寫，示出了所附序列表中列出的核酸序列。對于每個核酸序列僅顯示了一條鏈，僅顯示每個核酸序列的一條鏈，任何對所展示的鏈的提述應(yīng)理解為包括對互補鏈。由于一級核酸序列的互補序列和反向互補序列必然被該一級序列所公開，所以對核酸序列的任何提述也包括核酸序列的互補序列和反向互補序列，但另有明確說明或者從該序列出現(xiàn)的上下文可以明確看出并非如此的除外。在所附序列表中：SEQIDNO:1顯示了一條示例性的Sec23多核苷酸，在本文中稱為玉米根螢葉甲Sec23：AAATTCTGTAAACAATTAGGTTGGTAAGAGTCAGATGTCAGACACGACATCGAATGACGTGGAAGTTCAAATTCTGAAACAATTAGGTGTAATTTTTAGGAGCTCAATAATAGTGTTATTTACATGATAGAATCCTAATAATATATATTGAGGAATTTCCTTAGGGAATTCCGACTTGTAATCTTCAAAAATGAGCACATATGAAGAGTATATACAACAAAATGAAGATCGAGATGGGATTAGATTTACCTGGAATGTATGGCCTTCAAGCAGAATTGAAGCTACCCGTCTCGTAGTACCCTTAGCTTGTCTGTACCAGCCTATAAAGGAACGTCTGGATCTTCCACCAATACAATATGACCCTGTTTTATGTACTAGAAATACTTGTAGAGCAATATTAAACCCACTGTGTCAGGTAGATTATCGAGCAAAACTCTGGGTATGCAACTTTTGTTTCCAGAGAAATCCATTTCCACCTCAATATGCTGCTATTTCAGAACAACATCAACCAGCGGAATTGATGCCTATGTTTTCCACCATTGAATACACAATAACTAGAGCTCAATGTTTACCACCAATATTTTTGTATGTTGTTGACACCTGCATGGATGATGAAGAACTGGGTTCCCTGAAAGACTCATTGCAAATGTCCCTTAGTTTGTTGCCACCTAATGCGTTAATAGGACTAATAACATTTGGGAAAATGGTTCAAGTTCATGAACTTGGCACTGAAGGTTGTAGTAAGTCATATGTGTTCAGAGGTACAAAAGATCTTAGTGCTAAACAGGTTCAAGAAATGCTGGGAATAGGCAAAGTGGCTTTAGGTCAGCAAGCCCCTCAACAGCCAGGGCAGCCTCTAAGACCTGGGCAAATGCAACCTACTGTTGTTGCACCAGGAAGCAGGTTTCTACAACCTGTATCCAAATGCGATATGAATCTAACAGACCTAATAGGAGAACAACAGAAAGATCCTTGGCCTGTTCATCAGGGTAAAAGGTATTTAAGATCTACAGGTGTAGCTTTATCGATTGCCATTGGTTTGTTAGAATGTACATATTCCAATACTGGCGCCCGAGTTATGCTATTTGTTGGAGGACCTTGCTCACAAGGACCTGGTCAGGTAGTTAATGATGATTTAAAACAGCCTATTAGATCACATCATGATATTCAGAAAGATAATGCAAAATATATGAAGAAAGGTATTAAACATTATGATGCGTTAGCAATGAGAGCCGCAACTAATGGTCACTCTGTTGATATTTATTCTTGTGCTTTGGATCAGACAGGTCTGATGGAAATGAAGCAATGCTGTAATTCTACTGGGGGACACATGGTAATGGGGGATTCATTTAATTCTTCCTTGTTTAAGCAAACTTTCCAACGTGTGTTTACCAGAGATCAAAAAAGTGATCTGAAAATGGCATTTAACGGTACTTTGGAAGTGAAGTGTTCCCGAGAATTAAAAGTTCAAGGAGGTATCGGTTCGTGTGTATCACTTAACGTGAAGAGCCCCTTGGTTTCCGACACAGAAATAGGAATGGGTAATACTGTGCAATGGAAAATGTGTACTTTAACGCCAAGTACTACCATGTCTTTATTCTTTGAGGTCGTAAATCAACATTCTGCTCCCATACCTCAAGGTGGTAGAGGTTGTATACAATTTATTACGCAGTACCAGCATTCAAGTGGTCAAAGAAAAATCAGAGTAACAACAGTGGCTCGAAATTGGGCTGACGCAACTGCTAATATACACCATATCAGTGCCGGATTCGATCAAGAAGCTGCTGCTGTAATAATGGCTAGGATGGCCGTTTATAGGGCAGAATCTGATGATAGTCCAGATGTTCTTAGATGGGTTGACAGAATGCTGATTAGATTGTGTCAAAAATTCGGAGAATACAATAAGGACGACCCCAATTCATTCAGACTTGGTCAAAACTTCAGTCTTTACCCACAGTTCATGTATCACTTAAGAAGATCTCAATTTCTTCAAGTATTCAATAATTCTCCGGACGAGACTTCATTCTACAGACACATGTTGATGAGGGAAGATCTTACTCAATCTTTGATAATGATTCAACCTATTTTGTATAGTTATAGTTTCAATGGTCCACCAGAGCCTGTATTACTAGATACTAGCTCCATTCAACCTGACAGAATATTACTTATGGATACTTTCTTCCAAATATTAATTTTCCATGGAGAGACTATCGCCCAATGGCGTAGTTTAAAATATCAAGACATGCCAGAATATGAAAACTTTAGACAGCTACTACAGGCTCCAGTAGATGATGCACAAGAAATTTTGCAAACTAGGTTCCCAATGCCGAGATATATTGATACCGAACAAGGCGGATCCCAAGCCAGATTTTTGTTGTCGAAAGTAAATCCAAGTCAAACTCATAACAACATGTATTCCTACGGAGGTGATTCTGGAGCTCCAGTTTTGACAGATGATGTATCCCTTCAAGTATTCATGGACCATCTAAAGAAATTGGCAGTTTCGTCCACAGCATAATACCTATATATTACAATTAGATACATTTGACATAATACAGTTTTTGAATTTATTCAATATATTATATTTTAAGCTTAATTTTTTGTATATTTATTTCATAGATAGTTTATATATTTGGTAATGTGATACAATAAATTTTTGTTTTCCAGACCTTGCAATTGTAAAAGAATAAATTATAATACCTGTATTAACTAASEQIDNO:2顯示了由示例性的玉米根螢葉甲Sec23多核苷酸編碼的SEC23多肽的氨基酸序列：MSTYEEYIQQNEDRDGIRFTWNVWPSSRIEATRLVVPLACLYQPIKERLDLPPIQYDPVLCTRNTCRAILNPLCQVDYRAKLWVCNFCFQRNPFPPQYAAISEQHQPAELMPMFSTIEYTITRAQCLPPIFLYVVDTCMDDEELGSLKDSLQMSLSLLPPNALIGLITFGKMVQVHELGTEGCSKSYVFRGTKDLSAKQVQEMLGIGKVALGQQAPQQPGQPLRPGQMQPTVVAPGSRFLQPVSKCDMNLTDLIGEQQKDPWPVHQGKRYLRSTGVALSIAIGLLECTYSNTGARVMLFVGGPCSQGPGQVVNDDLKQPIRSHHDIQKDNAKYMKKGIKHYDALAMRAATNGHSVDIYSCALDQTGLMEMKQCCNSTGGHMVMGDSFNSSLFKQTFQRVFTRDQKSDLKMAFNGTLEVKCSRELKVQGGIGSCVSLNVKSPLVSDTEIGMGNTVQWKMCTLTPSTTMSLFFEVVNQHSAPIPQGGRGCIQFITQYQHSSGQRKIRVTTVARNWADATANIHHISAGFDQEAAAVIMARMAVYRAESDDSPDVLRWVDRMLIRLCQKFGEYNKDDPNSFRLGQNFSLYPQFMYHLRRSQFLQVFNNSPDETSFYRHMLMREDLTQSLIMIQPILYSYSFNGPPEPVLLDTSSIQPDRILLMDTFFQILIFHGETIAQWRSLKYQDMPEYENFRQLLQAPVDDAQEILQTRFPMPRYIDTEQGGSQARFLLSKVNPSQTHNNMYSYGGDSGAPVLTDDVSLQVFMDHLKKLAVSSTASEQIDNO:3顯示了一條示例性的Sec23多核苷酸，在某些地方稱為玉米根螢葉甲Sec23reg1(區(qū)域1)：AGGACGACCCCAATTCATTCAGACTTGGTCAAAACTTCAGTCTTTACCCACAGTTCATGTATCACTTAAGAAGATCTCAATTTCTTCAAGTATTCAATAATTCTCCGGACGAGACTTCATTCTACAGACACATGTTGATGAGGGAAGATCTTACTCAATCTTTGATAATGATTCAACCTATTTTGTATAGTTATAGTTTCAATGGTCCACCAGAGCCTGTATTACTAGATACTAGCTCCATTCAACCTGACAGAATATTACTTATGGATACTTTCTTCCAAATATTAATTTTCCATGGAGAGACTATCGCCCAATGGCGTAGTTTAAAATATCAAGACATGCCAGAATATGAAAACTTTAGACAGCTACTACAGGCTCCAGTASEQIDNO:4顯示了一條示例性的Sec23多核苷酸，在某些地方稱為玉米根螢葉甲Sec23ver1(版本1)：AGGTTCCCAATGCCGAGATATATTGATACCGAACAAGGCGGATCCCAAGCCAGATTTTTGTTGTCGAAAGTAAATCCAAGTCAAACTCATAACAACATGTATTCCTACGGAGGTGATTCTGGAGCTCCAGTTTTGACAGATGATGTATCCCTTCAAGTATTCATGGACCATCTAAAGAAATTGGCAGTTTCGTCCACAGCATAASEQIDNO:5顯示了一條示例性的Sec23多核苷酸，在某些地方稱為玉米根螢葉甲Sec23ver2(版本2)：ATTCCTACGGAGGTGATTCTGGAGCTCCAGTTTTGACAGATGATGTATCCCTTCAAGTATTCATGGACCATCTAAAGAAATTGGCAGTTTCGTCCACAGCATAASEQIDNO:6顯示了T7噬菌體啟動子多核苷酸的序列。SEQIDNO:7顯示了用于體外dsRNA合成YFP編碼區(qū)區(qū)段的DNA序列(未顯示在5’和3’端的T7啟動子序列)。SEQIDNO:8顯示了GFP多核苷酸。SEQIDNO:9-14顯示了用于PCR擴增來自玉米根螢葉甲的示例性Sec23多核苷酸靶的編碼區(qū)的若干部分的引物序列。SEQIDNO:15顯示了含有ST-LS1內(nèi)含子(下劃線)的形成玉米根螢葉甲Sec23v1hpRNA的多核苷酸：AGGTTCCCAATGCCGAGATATATTGATACCGAACAAGGCGGATCCCAAGCCAGATTTTTGTTGTCGAAAGTAAATCCAAGTCAAACTCATAACAACATGTATTCCTACGGAGGTGATTCTGGAGCTCCAGTTTTGACAGATGATGTATCCCTTCAAGTATTCATGGACCATCTAAAGAAATTGGCAGTTTCGTCCACAGCATAAGACTAGTACCGGTTGGGAAAGGTATGTTTCTGCTTCTACCTTTGATATATATATAATAATTATCACTAATTAGTAGTAATATAGTATTTCAAGTATTTTTTTCAAAATAAAAGAATGTAGTATATAGCTATTGCTTTTCTGTAGTTTATAAGTGTGTATATTTTAATTTATAACTTTTCTAATATATGACCAAAACATGGTGATGTGCAGGTTGATCCGCGGTTATTATGCTGTGGACGAAACTGCCAATTTCTTTAGATGGTCCATGAATACTTGAAGGGATACATCATCTGTCAAAACTGGAGCTCCAGAATCACCTCCGTAGGAATACATGTTGTTATGAGTTTGACTTGGATTTACTTTCGACAACAAAAATCTGGCTTGGGATCCGCCTTGTTCGGTATCAATATATCTCGGCATTGGGAACCTSEQIDNO:16顯示了含有ST-LS1內(nèi)含子(下劃線)的形成玉米根螢葉甲Sec23v2hpRNA的多核苷酸：ATTCCTACGGAGGTGATTCTGCAGCTCCAGTTTTGACAGATGATGTATCCCTTCAAGTATTCATGGACCATCTAAAGAAATTGGCAGTTTCGTCCACAGCATAAGACTAGTACCGGTTGGGAAAGGTATGTTTCTGCTTCTACCTTTGATATATATATAATAATTATCACTAATTAGTAGTAATATAGTATTTCAAGTATTTTTTTCAAAATAAAAGAATGTAGTATATAGCTATTGCTTTTCTGTAGTTTATAAGTGTGTATATTTTAATTTATAACTTTTCTAATATATGACCAAAACATGGTGATGTGCAGGTTGATCCGCGGTTATTATGCTGTGGACGAAACTGCCAATTTCTTTAGATGGTCCATGAATACTTGAAGGGATACATCATCTGTCAAAACTGGAGCTGCAGAATCACCTCCGTAGGAATSEQIDNO:17顯示了含有ST-LS1內(nèi)含子(下劃線)的YFPv2hpRNA形成性多核苷酸：ATGTCATCTGGAGCACTTCTCTTTCATGGGAAGATTCCTTACGTTGTGGAGATGGAAGGGAATGTTGATGGCCACACCTTTAGCATACGTGGGAAAGGCTACGGAGATGCCTCAGTGGGAAAGGACTAGTACCGGTTGGGAAAGGTATGTTTCTGCTTCTACCTTTGATATATATATAATAATTATCACTAATTAGTAGTAATATAGTATTTCAAGTATTTTTTTCAAAATAAAAGAATGTAGTATATAGCTATTGCTTTTCTGTAGTTTATAAGTGTGTATATTTTAATTTATAACTTTTCTAATATATGACCAAAACATGGTGATGTGCAGGTTGATCCGCGGTTACTTTCCCACTGAGGCATCTCCGTAGCCTTTCCCACGTATGCTAAAGGTGTGGCCATCAACATTCCCTTCCATCTCCACAACGTAAGGAATCTTCCCATGAAAGAGAAGTGCTCCAGATGACATSEQIDNO:18顯示示例性的ST-L1內(nèi)含子多核苷酸。SEQIDNO:19顯示YFP多核苷酸。SEQIDNO:20顯示膜聯(lián)蛋白區(qū)1多核苷酸。SEQIDNO:21顯示膜聯(lián)蛋白區(qū)2多核苷酸。SEQIDNO:22顯示Beta血影蛋白2區(qū)1多核苷酸。SEQIDNO:23顯示Beta血影蛋白2區(qū)2多核苷酸。SEQIDNO:24顯示mtRP-L4區(qū)1多核苷酸。SEQIDNO:25顯示mtRP-L4區(qū)2多核苷酸。SEQIDNO:26-55顯示了用于擴增dsRNA合成的GFP，YFP，膜聯(lián)蛋白，β分布蛋白2和mtRP-L4的基因區(qū)域的引物。SEQIDNO:56顯示編碼玉米TIP41樣蛋白的多核苷酸。SEQIDNO:57顯示寡核苷酸T20NV。SEQIDNO:58-62顯示了用于轉(zhuǎn)基因玉米中轉(zhuǎn)錄物水平的分子分析的引物和探針的序列。SEQIDNO:63顯示用于二元載體主鏈檢測的SpecR編碼區(qū)的一部分。SEQIDNO:64顯示用于基因組拷貝數(shù)分析的AAD1編碼區(qū)的一部分。SEQIDNO:65顯示了玉米轉(zhuǎn)化酶基因。SEQIDNO:66-74顯示用于基因拷貝數(shù)分析的引物和探針。SEQIDNO:75-77顯示用于玉米表達分析的引物和探針。SEQIDNO:78顯示了肌動蛋白多核苷酸。SEQIDNO:79和80顯示了用于擴增用于dsRNA合成的肌動蛋白的基因區(qū)域的引物。SEQIDNO:81顯示了示例性Sec23多核苷酸，本文稱為英雄美洲蝽(Euschistusheros)Sec23或BSB_Sec23：TACACAATTCAAATAAAATAAAAATACAAGAATACATTTAACATTTTATATAAGTTTTAATGATGCGAACAAATCAGACTAAATGTACGTAATAATAAAATAATTTGTATGTACATATACAAGCCTTGTTAAAGTTCTAACCATTCCATAAGAAAAGTAAATACATAATTAAATTTTATAAAACATATCGATTATGCTATAAATTGGTCATTTAAGAAAATAATACATACCAATTATGAACATCAAATTTATAGTTTGGTAAAGTAATTCTTTTAAGCTGTAGAAGATACAGCTAATTTTTTCAAGTGATCCATGAAAGTCTGAAGACTTACATCATCGGTGAGAACAGGTGCCCCAGATTCACCACCATAAGCATACATGTTATTGTGGGTTTGTGAAGGGTTTACTTTTGACAATAGGAACCTGGCCTGAGAACCTCCCTGTTCGGTATCAATGTATCTCGGCATCGGGAATCTTGTATGAAGTATGTCCTTAGCATCATCTACAGGAGCTTGTAAAAGCTGCTTGAAGTTTTCATACTCAGGCATATCTTGATACCTCTGAGCTCTCCACTGTGCTATCGTTTCTCCGTGGAATATCAAAATTTGGAAGAATGTGTCCATAAGTAGAATTCTGTCCGGTTGAATACTAGACGTATCCAAGAGAACTGGTTCAGGTGGTCCATTGAAGCTGTAACTATATAAAATAGGCTGAATCATAATCAAACTTTGAGAAAGATCTTCTCTCATTAAAATATGCCTATAATAAGAAGTCTCATCGGGACTGTTATTGAAAACTTGTAAAAATTGTGATCTTCTCAGATGATACATGAATTGAGGATAAAGTGAAAAGTTCTCTGGCAAACGGAAGCTGTTGGGGTCATCTTTATTGTATTCTCCAAATTTCTGGCAAAGTCTAATTAGCATTCTATCAGCCCAACGCATAACATCTGGGCCGTCATCAGACTCGGCACGATGTACAACCATTCTTGCCATTAGAACAGCAGCAGCTTCCTGATCGAACCCAGCACTTATATGATGCAGGTTAGTAGTAGCATCAGCCCAATTTCTAGCTATAGTGGTTACTCTAATGCGCCTTTGTCCCGTTGCATGCTGGTACTGAGTGATAAACTGAATACATCCCCTGCCACCTTGTGGAATTGGTGCACCATGTTGATTGATTACTTCAAAGAAAAATGCACAAGTCATACTAGGAGTTAGAGAGCAGAATTTCCACTGGGATGTACCTCCCAAACCTATATCACTATCACTTACACAAGGGCCTTTAACATTCAACGATACACAAGACCCTATAGCACCCATAACTTTAAGTTCTCGTGAAGCTTTCACTTCAAGGACCCCATTAAATGCCATTTTAAAATCACCAACTTGATCACGAGAGAGTACTCTCTGAAAAGACTGTTTGAACAGTGAAGAATTAAATGAATCTCCCATTACCATATGACCACCTGTAGAGTTGCAGCATGATTTCATTTCATGTAGCCCAGTTTGATCTAAGGCGCAAGAATAAATATCAATACTATGCCCATTAGTAGCAGCCCTAATTGCTAAACTTTCATAATGCTTGATGGCTTTTTTCATGTATCTGGCATTATCTTTGTGAATATCATGATGAGAACGAATAGGTTCCCGAAGATCATCATTTACAACAAGACCAGGCCCTTGTGAGCACGGTCCTCCAACAAAAAGCATTATTCTAGCACCAGTATTAGGGTATGAACATTCCAGTAAGCCAACTGCGATAGCAAGGGCTGCACCAGTAGATCTTAATGGTCTTTTACCAGTACTTACAGGCCAAGGATCCCGTTGCATTTCTCCGAGTAGATCAGTAAGACTCATATCACAAGACTGAACAGGTTGAATAAAACGATTAGCAGGCAAAGGCTGTTGGCCTGGGGGTTGCCCAGGAACAGCAGGATTGAACGTTGCAGCACTTGGAACTTTCCCAATACCTAACATATCTTGAACTTGCTTAGCTGTTAATTCTTTAGTACCTCTAAAAACAAAGCTTCTAGAGCAACCTTCTGTTGACAGTTCATGAACCTGAACCATTCTTCCAAATGTAATTAACCCAATTAAAGCATTGGGAGGAAGTAATGATAAAGAAGTTTGCAATGAATCTTTCAACGCTCCAAGTTCTTCATCATCTAAACATGTATCAACCACTAGGAGAAAAATAGGAGGTAAAAACTGAGCTCTTGTTATCGTGTATTCTATTGTCGAAAAAGATGGTATAAGTTCAGCAGGCTGGTGTTGTTCAGATATACCAGCATATTGAGGTGGGAAAGGGTTTCGCTGAAAACAAAAATTACATACCCACAGCTTAGCACGATAGTCAACCTGGCAGAGAGGGTTTAAAATTGCTCTGCATGTATTTCTTGTGCACTGAACAGGATCATATTGAATTGGTGGTAAATCTACTCGCTCTCTCAAAGGTTGGAAGAGACATCCTACAGGAACGACAAGTTTTGTAGCTTCCAGACGGCTTGATGGCCAAACATTCCAAGTAAATCTAATCCCGTCCCTCTCCTCACTCTGTTGAATGAATTCTTCATAAGTTGTCATTGTCACAATTCACTAATAAACAACGTTCATTGAAAATTTCGTCTCCAGAGATTAGTCAAACTTTTCTTGAAAATTGTAACAGATAACAACTATGTTCGGTCTTCAAAGCATTATTAGGACTATCAGAAAATCGAAGACGATAAACTGAGTTCAAAAAGTAAAACCCTAAATTACAATAACATTAACAATACAGCCACAAATACTTTTCGAAAATCATCAGGGCAAATTAACCTACCCGACCGACACGTAGGTTCTAGATAAGGTACACGTAGACATGTCAGAGGGAGTGAACTGGCGAAGGTGCTGCTCCTAGCGGAGCGAAGTATCACTTCTGCATATCCTAGCTGTTTTGTTTTGAAAGTGTCCCAATTTAATCTGTTTTTATGAAATAATAATACTTSEQIDNO:82顯示示例性Sec23多核苷酸，本文稱為BSBSec23-1：TCCGAGTAGATCAGTAAGACTCATATCACAAGACTGAACAGGTTGAATAAAACGATTAGCAGGCAAAGGCTGTTGGCCTGGGGGTTGCCCAGGAACAGCAGGATTGAACGTTGCAGCACTTGGAACTTTCCCAATACCTAACATATCTTGAACTTGCTTAGCTGTTAATTCTTTAGTACCTCTAAAAACAAAGCTTCTAGAGCAACCTTCTGTTGACAGTTCATGAACCTGAACCATTCTTCCAAATGTAATTAACCCAATTAAAGCATTGGGAGGAAGTAATGATAAAGAAGTTTGCAATGAATCTTTCAACGCTCCAAGTTCTTCATCATCTAAACATGTATCAACCACTAGGAGAAAAATAGGAGGTAAAAACTGAGCTCTTGTTATCGTGTATTCTATTGTCGAAAAAGATGGTATAAGTTCAGCAGGCTGGTGTTGTTCAGATATACCAGCATATTGAGGTGGGAAAGGGTTTCGCTGAAAACSEQIDNO:83顯示示例性Sec23多核苷酸，本文稱為BSBSec23-2：CTGGTTCAGGTGGTCCATTGAAGCTGTAACTATATAAAATAGGCTGAATCATAATCAAACTTTGAGAAAGATCTTCTCTCATTAAAATATGCCTATAATAAGAAGTCTCATCGGGACTGTTATTGAAAACTTGTAAAAATTGTGATCTTCTCAGATGATACATGAATTGAGGATAAAGTGAAAAGTTCTCTGGCAAACGGAAGCTGTTGGGGTCATCTTTATTGTATTCTCCAAATTTCTGGCAAAGTCTAATTAGCATTCTATCAGCCCAACGCATAACATCTGGGCCGTCATCAGACTCGGCACGATGTACAACCATTCTTGCCATTAGAACAGCAGCAGCTTCCTGATCGAACCCAGCACTTATATGATGCAGGTTAGTAGTAGCATCAGCCCAATTTCTAGCTATAGTGGTTACTCTAATGCGCCTTTGTCCCGTTGCATGCTGGTACTGAGTGATAAACTGAATACATCCCCTGCCACCTTGTGGAATTGGTGCSEQIDNO:84-87顯示了用于擴增來自英雄美洲蝽的示例性Sec23多核苷酸靶標的編碼區(qū)的部分的引物序列。SEQIDNO:88顯示示例性dsRNA靶向YFP的有義鏈，本文稱為YFPv2。SEQIDNO:89和90顯示了用于擴增YFPv2部分的引物。SEQIDNO:91顯示由示例性英雄美洲蝽Sec23多核苷酸編碼的SEC23多肽的氨基酸序列：MTTYEEFIQQSEERDGIRFTWNVWPSSRLEATKLVVPVGCLFQPLRERVDLPPIQYDPVQCTRNTCRAILNPLCQVDYRAKLWVCNFCFQRNPFPPQYAGISEQHQPAELIPSFSTIEYTITRAQFLPPIFLLVVDTCLDDEELGALKDSLQTSLSLLPPNALIGLITFGRMVQVHELSTEGCSRSFVFRGTKELTAKQVQDMLGIGKVPSAATFNPAVPGQPPGQQPLPANRFIQPVQSCDMSLTDLLGEMQRDPWPVSTGKRPLRSTGAALAIAVGLLECSYPNTGARIMLFVGGPCSQGPGLVVNDDLREPIRSHHDIHKDNARYMKKAIKHYESLAIRAATNGHSIDIYSCALDQTGLHEMKSCCNSTGGHMVMGDSFNSSLFKQSFQRVLSRDQVGDFKMAFNGVLEVKASRELKVMGAIGSCVSLNVKGPCVSDSDIGLGGTSQWKFCSLTPSMTCAFFFEVINQHGAPIPQGGRGCIQFITQYQHATGQRRIRVTTIARNWADATTNLHHISAGFDQEAAAVLMARMVVHRAESDDGPDVMRWADRMLIRLCQKFGEYNKDDPNSFRLPENFSLYPQFMYHLRRSQFLQVFNNSPDETSYYRHILMREDLSQSLIMIQPILYSYSFNGPPEPVLLDTSSIQPDRILLMDTFFQILIFHGETIAQWRAQRYQDMPEYENFKQLLQAPVDDAKDILHTRFPMPRYIDTEQGGSQARFLLSKVNPSQTHNNMYAYGGESGAPVLTDDVSLQTFMDHLKKLAVSSTASEQIDNO:92顯示了含有RTM1內(nèi)含子(加下劃線)的形成YFPhpRNA的多核苷酸(YFPv2-1)：ATGTCATCTGGAGCACTTCTCTTTCATGGGAAGATTCCTTACGTTGTGGAGATGGAAGGGAATGTTGATGGCCACACCTTTAGCATACGTGGGAAAGGCTACGGAGATGCCTCAGTGGGAAAGTCCGGCAACATGTTTGACGTTTGTTTGACGTTGTAAGTCTGATTTTTGACTCTTCTTTTTTCTCCGTCACAATTTCTACTTCCAACTAAAATGCTAAGAACATGGTTATAACTTTTTTTTTATAACTTAATATGTGATTTGGACCCAGCAGATAGAGCTCATTACTTTCCCACTGAGGCATCTCCGTAGCCTTTCCCACGTATGCTAAAGGTGTGGCCATCAACATTCCCTTCCATCTCCACAACGTAAGGAATCTTCCCATGAAAGAGAAGTGCTCCAGATGACAT實施本發(fā)明的模式I.若干實施方案的概覽本文中公開了用于遺傳控制鞘翅目或半翅目害蟲侵染的方法和組合物。還提供了用于鑒定對于鞘翅目和/或半翅目害蟲的生命周期必需的一個或多個基因，作為靶基因用于RNAi介導(dǎo)的鞘翅目和/或半翅目害蟲群體控制的方法?？稍O(shè)計編碼一個或多個dsRNA分子的DNA質(zhì)粒載體來抑制生長、存活、發(fā)育、和/或生殖所必需的靶基因。在一些實施方案中，提供了通過與鞘翅目和/或半翅目害蟲中靶基因的編碼或非編碼序列互補的核酸分子來轉(zhuǎn)錄后阻抑靶基因表達或抑制靶基因的方法。在這些和另外的實施方案中，鞘翅目和/或半翅目害蟲可以攝取一種或多種從與靶基因的編碼或非編碼序列互補的核酸分子的全部或部分轉(zhuǎn)錄的dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和/或hpRNA分子，由此提供植物保護效果。因此，一些實施方案涉及使用與靶基因的編碼和/或非編碼序列互補的dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和/或hpRNA對靶基因產(chǎn)物的表達進行序列特異性抑制，以實現(xiàn)對鞘翅目和/或半翅目害蟲的至少部分控制。公開了一組分離純化的核酸分子，其包含，例如，如SEQIDNO:1，3-5，15，16，和81-83任一者中列出的核苷酸序列及其片段。在一些實施方案中，可以從這些序列、其片段、或包含這些序列之一的基因表達穩(wěn)定化的dsRNA分子，用于靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默或抑制。一些實施方案涉及在其基因組中具有編碼至少一種iRNA(例如，dsRNA)分子的至少一種重組DNA序列的重組宿主細胞(例如，植物細胞)。在特定的實施方案中，dsRNA分子可以在被鞘翅目和/或半翅目害蟲攝取時產(chǎn)生，使鞘翅目和/或半翅目害蟲中的靶基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄后沉默或抑制其表達。重組DNA序列可以包含，例如，下述的任何一種或多種：SEQIDNO:1、3-5、15、16和81-83；SEQIDNO:1、3-5、15、16和81-83中任一個的片段；或包含SEQIDNO:1、3-5、15、16和81-83中的一個或多個的基因的部分序列；或其互補序列。在一些實施方案中，在其基因組中具有編碼至少一種dsRNA分子的至少一種重組DNA序列的重組宿主細胞可以是轉(zhuǎn)化的植物細胞。一些實施方案涉及包含這樣的轉(zhuǎn)化的植物細胞的轉(zhuǎn)基因植物。除了這樣的轉(zhuǎn)基因植物之外，還提供了任何轉(zhuǎn)基因植物世代的后代植物、轉(zhuǎn)基因種子、和轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品，它們均包含重組DNA序列。在特定的實施方案中，可以在轉(zhuǎn)基因植物細胞中表達本發(fā)明的dsRNA分子。因此，在這些和其他實施方案中，可以從轉(zhuǎn)基因植物細胞分離本發(fā)明的dsRNA分子。在特定的實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物是選自下組的植物，包括：玉米(玉蜀黍(Zeamays))、大豆(Glycinemax)、和禾本科(Poaceae)的植物。一些實施方案涉及用于調(diào)控鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中靶基因表達的方法。在這些和其他實施方案中，可以提供核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼dsRNA分子的核苷酸序列。在特定的實施方案中，編碼dsRNA分子的核苷酸序列可與啟動子可操作連接，并且還可與轉(zhuǎn)錄終止序列可操作連接。在特定的實施方案中，用于調(diào)控鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中靶基因表達的方法可包括：(a)用包含編碼dsRNA分子的核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化植物細胞；(b)在足以容許形成包含多個轉(zhuǎn)化的植物細胞的植物細胞培養(yǎng)物的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的植物細胞；(c)選擇已將載體整合到其基因組中的轉(zhuǎn)化的植物細胞；和(d)確定選擇的轉(zhuǎn)化的植物細胞包含由載體的核苷酸序列編碼的dsRNA分子?？梢詮幕蚪M中整合有載體、且包含由載體的核苷酸序列編碼的dsRNA分子的植物細胞再生植物。因此，還公開了在其基因組中整合有載體的轉(zhuǎn)基因植物，所述載體具有編碼dsRNA分子的核苷酸序列，其中轉(zhuǎn)基因植物包含由所述載體的核苷酸序列編碼的dsRNA分子。在特定的實施方案中，植物中dsRNA分子的表達足以調(diào)控接觸所述轉(zhuǎn)化的植物或植物細胞(例如通過以轉(zhuǎn)化的植物、植物的一部分(例如，根)或植物細胞為食)的鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中靶基因的表達。本文中公開的轉(zhuǎn)基因植物可以展現(xiàn)出對鞘翅目和/或半翅目害蟲侵染的抗性和/或增強的耐受性。特定的轉(zhuǎn)基因植物可以展現(xiàn)出對一種或多種選自下組的鞘翅目和/或半翅目害蟲的抗性和/或增強的耐受性：WCR、NCR、SCR、MCR、玉米根螢葉甲、D.u.tenella、D.u.undecimpunctataMannerheim、英雄美洲蝽、蓋德擬壁蝽、茶翅蝽、稻綠蝽、擬綠蝽和褐臭蝽。本文中還公開了用于將控制劑(如iRNA分子等)投送給鞘翅目和/或半翅目害蟲的方法。這樣的控制劑可以直接或間接地阻礙鞘翅目和/或半翅目害蟲進食、生長或以其他方式致害宿主的能力。在一些實施方案中，提供了這樣的方法，包括將穩(wěn)定化的dsRNA分子遞送至鞘翅目和/或半翅目害蟲以抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中的至少一種靶基因，從而減少或消除鞘翅目和/或半翅目害蟲對植物的損害。在一些實施方案中，抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中靶基因表達的方法可以導(dǎo)致鞘翅目和/或半翅目害蟲生長、發(fā)育、生殖和/或進食的停止。在一些實施方案中，所述方法最終可導(dǎo)致鞘翅目和/或半翅目害蟲死亡。在一些實施方案中，提供了包含本發(fā)明的iRNA(例如，dsRNA)分子的組合物(例如，局部用組合物)，供在植物、動物、和/或植物或動物的環(huán)境中使用以消除或降低鞘翅目和/或半翅目害蟲的侵染。在特定的實施方案中，組合物可以是要喂給鞘翅目和/或半翅目害蟲的營養(yǎng)組合物或食物來源。一些實施方案包括使鞘翅目和/或半翅目害蟲可得到所述營養(yǎng)組合物或食物來源。包含iRNA分子的組合物的攝入可導(dǎo)致一個或多個鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞攝取所述分子，進而可導(dǎo)致鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中至少一種靶基因表達的抑制。通過在鞘翅目和/或半翅目害蟲的宿主中提供一種或多種包含本發(fā)明的iRNA分子的組合物，可以在任何存在鞘翅目和/或半翅目害蟲的宿主組織或環(huán)境之中或之上限制或消除鞘翅目和/或半翅目害蟲對植物或植物細胞的攝入或損傷。在具體實施方案中，包含本發(fā)明的iRNA分子的組合物是RNAi誘餌(bait)。RNAi誘餌包含iRNA分子和使誘餌對鞘翅目和/或半翅目可口的一種或多種另外的物質(zhì)(例如葫蘆素)害蟲。在一些實例中，當iRNA(例如，dsRNA)與食物或引誘劑或兩者混合時形成RNAi誘餌。當害蟲吃誘餌時，它也消耗iRNA。在具體實施方案中，RNAi誘餌可以是，例如但不限于：顆粒，凝膠，粉末(例如，可流動粉末)，液體和/或固體。在具體的實例中，如本文所述的Sec23iRNA分子可以摻入誘餌制劑中，例如在美國專利8,530,440中描述的那些，其通過引用整體并入本文。在一些實施方案中，RNAi誘餌放置在鞘翅目和/或半翅目害蟲(例如，WCR)的環(huán)境中或周圍，由此害蟲與誘餌接觸和/或被誘餌吸引。本文中公開的組合物和方法可與用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲所致?lián)p害的其他方法和組合物組合一起使用。例如，本文中所描述的用于針對鞘翅目和/或半翅目害蟲保護植物的iRNA分子可以在這樣的方法中使用，所述方法包括另外使用一種或多種針對鞘翅目和/或半翅目害蟲有效的化學(xué)劑、針對鞘翅目和/或半翅目害蟲有效的生物殺蟲劑、作物輪作、或展現(xiàn)出與本發(fā)明的RNAi介導(dǎo)的方法和RNAi組合物的特征不同的特征(例如，在植物中重組產(chǎn)生對于鞘翅目和/或半翅目害蟲有害的蛋白質(zhì)(例如，Bt毒素))的重組遺傳技術(shù)。II.縮寫B(tài)SB新熱帶區(qū)布朗椿象(英雄美洲蝽，EuschistusherosFabricius)dsRNA雙鏈核糖核酸GI生長抑制NCBI美國國家生物技術(shù)信息中心gDNA基因組DNAiRNA抑制性核糖核酸ORF開放閱讀框RNAi核糖核酸干擾miRNA微小抑制性核糖核酸siRNA小抑制性核糖核酸shRNA小發(fā)夾核糖核酸hpRNA發(fā)夾核糖核酸UTR非翻譯區(qū)WCR西方玉米根蟲(玉米根螢葉甲)NCR北方玉米根蟲(巴氏根螢葉甲)MCR墨西哥玉米根蟲(墨西哥玉米根螢葉甲)PCR聚合酶鏈式反應(yīng)RISCRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物SCR南方玉米根蟲(十一星根螢葉甲)III.術(shù)語在以下描述和表中，使用了許多術(shù)語。為了提供對說明書和權(quán)利要求書的清楚且一致的理解，包括要賦予此類術(shù)語的范圍，提供了以下定義：鞘翅目害蟲：如本文中使用的，術(shù)語“鞘翅目害蟲”指以玉米和其它真正的禾本科為食的葉甲屬昆蟲。在具體的例子中，鞘翅目害蟲選自下列清單，包括：玉米根螢葉甲(WCR)；巴氏根螢葉甲(NCR)；十一星根螢葉甲(SCR)；墨西哥玉米根螢葉甲(MCR)；黃瓜條根螢葉甲；D.u.tenella；和D.u.undecimpunctataMannerheim。半翅目害蟲：如本文中使用的，術(shù)語“半翅目害蟲”指蝽科昆蟲，其以廣泛的宿主植物為食并具有刺吸式口器。在特定的實例中，半翅目害蟲選自下列清單，包括：英雄美洲蝽(新熱帶區(qū)布朗椿象)、稻綠蝽(南部綠色蝽)、蓋德擬壁蝽(紅帶椿象)、茶翅蝽(棕翅蝽)、擬綠蝽(綠色蝽)、和褐臭蝽(褐蝽)。(與生物)接觸：如本文中使用的，與生物(例如，鞘翅目害蟲和/或半翅目害蟲)“接觸”或被生物“攝取”等術(shù)語，就核酸分子而言，包括核酸分子內(nèi)化到生物中，例如但不限于：生物攝取分子(例如，通過進食)；使生物與包含核酸分子的組合物接觸；以及用包含核酸分子的溶液浸泡生物。玉米植物：如本文中使用的，術(shù)語“玉米植物”指物種玉蜀黍(玉米)的植物。編碼dsRNA：如本文中使用的，修飾語“編碼dsRNA”包括這樣的DNA多核苷酸，其RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能夠形成分子內(nèi)dsRNA結(jié)構(gòu)(例如，發(fā)夾)或分子間dsRNA結(jié)構(gòu)(例如，通過與靶RNA分子雜交)。表達：如本文中使用的，編碼序列(例如，基因或轉(zhuǎn)基因)的“表達”是指這樣的過程，通過該過程，核酸轉(zhuǎn)錄單元(包括，例如基因組DNA或cDNA)的編碼信息被轉(zhuǎn)化為細胞的操作部分、非操作部分、或結(jié)構(gòu)部分(常常包括蛋白質(zhì)的合成)?；虮磉_可能受到外部信號的影響，例如細胞、組織、或生物暴露于增加或降低基因表達的物質(zhì)?；虮磉_也可以在從DNA到RNA再到蛋白質(zhì)的途徑中的任何位置受到調(diào)節(jié)。例如，通過控制對轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA運輸和加工、中間分子比如mRNA的降解的作用，或通過在特異性蛋白分子已經(jīng)產(chǎn)生之后的活化、失活、區(qū)室化、或降解，或它們的組合，由此發(fā)生基因表達的調(diào)節(jié)。通過本領(lǐng)域已知的任何方法，包括但不限于，Northern(RNA)印跡、RT-PCR、Western(免疫)印跡，或體外、原位或體內(nèi)蛋白活性測定，可以在RNA水平或蛋白質(zhì)水平測量基因表達。遺傳物質(zhì)：如本文中使用的，術(shù)語“遺傳物質(zhì)”包括所有基因和核酸分子，諸如DNA和RNA。抑制：如本文中使用的，術(shù)語“抑制”在用于描述對編碼序列(例如基因)的影響時是指從編碼序列轉(zhuǎn)錄的mRNA和/或編碼序列的肽、多肽、或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的細胞水平的可測量的降低。在一些實例中，抑制編碼序列的表達可以使得表達大致消失?！疤禺愋砸种啤笔侵冈趯崿F(xiàn)特異性抑制的細胞中對靶編碼序列的抑制不對其他編碼序列(例如，基因)的表達產(chǎn)生影響。分離的：“分離的”生物學(xué)組分(諸如核酸、肽或蛋白質(zhì))是已經(jīng)從該組分所天然存在的生物細胞中的其他生物學(xué)組分(即，其他染色體和染色體外的DNA和RNA、和蛋白質(zhì))實質(zhì)性分開、分開產(chǎn)生、或純化出來，同時實現(xiàn)組分中的化學(xué)或功能變化(例如，核酸可以通過斷開將核酸連接到染色體中的其余DNA的化學(xué)鍵而從染色體分離)。已經(jīng)“分離的”核酸分子和蛋白質(zhì)包括通過標準純化方法純化的核酸分子和蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括通過在宿主細胞內(nèi)重組表達制備的核酸分子和蛋白質(zhì)，以及化學(xué)合成的核酸分子、蛋白質(zhì)和肽。核酸分子：如本文中使用的，術(shù)語“核酸分子”可以是指核苷酸的聚合物形式，可包括RNA、cDNA、基因組DNA的有義和反義鏈，以及上述情形的合成形式和混合聚合物。核苷酸或核堿基可以是指核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、或這兩種類型核苷酸的任一者的修飾形式。如本文中使用的“核酸分子”與“核酸”和“多核苷酸”是同義詞。除非另外指明，核酸分子通常在長度上具有至少10個堿基。根據(jù)慣例，核酸分子的核苷酸序列從分子的5’至3’端閱讀。核苷酸序列的“互補序列”是指與核苷酸序列的核堿基形成堿基對(即，A-T/U，和G-C)的核堿基的序列。一些實施方案包括包含轉(zhuǎn)錄為RNA分子的模板DNA的核酸，所述RNA分子是mRNA分子的互補序列。在這些實施方案中，轉(zhuǎn)錄為mRNA分子的核苷酸序列的互補序列以5'至3'方向存在，使得RNA聚合酶(其以5'至3'方向轉(zhuǎn)錄DNA)將從互補序列轉(zhuǎn)錄出可以與mRNA分子雜交的核酸。因此，除非另有明確說明或者從上下文中可以清楚地看出另有所指，術(shù)語“互補序列”是指可以與特定核苷酸序列的核堿基形成堿基對的從5'至3'的核堿基序列。類似地，除非另有明確說明或者從上下文中可以清楚地看出另有所指，核酸序列的“反向互補序列”是指互補序列以相反取向的序列。前述內(nèi)容在以下圖示中示出：ATGATGATG核苷酸序列TACTACTAC核苷酸序列的“互補序列”CATCATCAT核苷酸序列的“反向互補序列”本發(fā)明的一些實施方案可以包括形成發(fā)夾RNA的RNAi分子。在這些RNAi分子中，RNA干擾的靶核苷酸序列的互補序列和該序列的反向互補序列可以出現(xiàn)在同一分子中，使得單鏈RNA分子可以“折疊”并與自身雜交其包含互補和反向互補序列?！昂怂岱肿印卑―NA的單鏈和雙鏈形式；RNA的單鏈形式；和RNA的雙鏈形式(dsRNA)。術(shù)語“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作為個別單鏈或在雙鏈體中的核酸有義和反義鏈兩者。術(shù)語“核糖核酸”(RNA)包括iRNA(抑制性RNA)、dsRNA(雙鏈RNA)、siRNA(小干擾RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微小RNA)、shRNA(小發(fā)夾RNA)、hpRNA(發(fā)夾RNA)、tRNA(轉(zhuǎn)運RNA)(無論是裝載還是卸下相應(yīng)的?；被?、和cRNA(互補RNA)。術(shù)語“脫氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA、基因組DNA、和DNA-RNA雜交體。術(shù)語“核酸區(qū)段”和“核苷酸序列區(qū)段”，或更一般而言的“區(qū)段”，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解它們是功能性的術(shù)語，其包括基因組序列、核糖體RNA序列、轉(zhuǎn)運RNA序列、信使RNA序列、操縱子序列、和較小的工程化核苷酸序列，其編碼或可適用于編碼肽、多肽、或蛋白質(zhì)。寡核苷酸：寡核苷酸是短的核酸聚合物。寡核苷酸可通過切割較長核酸區(qū)段、或通過使單獨的核苷酸前體聚合而形成。自動合成儀能夠合成長度多達幾百個堿基的寡核苷酸。由于寡核苷酸可與互補的核苷酸序列結(jié)合，因此它們可用作檢測DNA或RNA的探針。由DNA(寡脫氧核糖核苷酸)組成的寡核苷酸可以用于PCR，PCR是一種用于擴增DNA和RNA(逆轉(zhuǎn)錄成cDNA)序列的技術(shù)。在PCR中，寡核苷酸一般被稱為“引物”，其允許DNA聚合酶延伸寡核苷酸并復(fù)制互補鏈。核酸分子可以包括天然存在的核苷酸和/或修飾核苷酸，它們通過天然存在和/或非天然存在的核苷酸連接而連接在一起。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解，核酸分子可被化學(xué)修飾或生物化學(xué)修飾，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸堿基。這些修飾包括，例如，標記物、甲基化、用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾(例如，如不帶電連接(unchargedlinkage)的修飾：例如甲基膦酸鹽、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；帶電連接(chargedlinkage)的修飾：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；懸垂部分的修飾：例如肽類；嵌入劑修飾：例如吖啶、補骨脂素等；螯合劑修飾；烷化劑(alkylator)修飾；和修飾的連接：例如α異頭核酸等)。術(shù)語“核酸分子”還包括任何拓撲結(jié)構(gòu)，包括單鏈的、雙鏈的、部分雙鏈體的、三鏈體的、發(fā)夾形的(hairpinned)、圓形的、掛鎖形的結(jié)構(gòu)。如本文中使用的，就DNA而言，術(shù)語“編碼序列”、“結(jié)構(gòu)核苷酸序列”、或“結(jié)構(gòu)核酸分子”是指這樣的核苷酸序列，當被置于適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列控制下時，其通過轉(zhuǎn)錄和mRNA最終翻譯成多肽。就RNA而言，術(shù)語“編碼序列”指翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的核苷酸序列。編碼序列的邊界由5’端的翻譯起始密碼子和3’端的翻譯終止密碼子所界定。編碼序列包括但不限于：基因組DNA；cDNA；EST；和重組核苷酸序列。基因組：如本文中所使用的，術(shù)語“基因組”是指存在于細胞核內(nèi)的染色體DNA，并且也指存在于細胞的亞細胞組成部分內(nèi)的細胞器DNA。在本發(fā)明的一些實施方案中，可以將DNA分子導(dǎo)入植物細胞中，使得DNA分子整合到植物細胞的基因組中。在這些和另外的實施方案中，DNA分子可以整合到植物細胞的核DNA中，或整合到植物細胞的葉綠體或線粒體的DNA中。術(shù)語“基因組”在其應(yīng)用于細菌時，指細菌細胞內(nèi)的染色體和質(zhì)粒兩者。在本發(fā)明的一些實施方案中，可以將DNA分子導(dǎo)入細菌中，使得DNA分子整合到細菌的基因組中。在這些和另外的實施方案中，DNA分子可以整合于染色體，或者作為穩(wěn)定的質(zhì)粒定位或位于穩(wěn)定的質(zhì)粒中。序列同一性：如本文中使用的術(shù)語“序列同一性”或“同一性”，在兩個核酸或多肽序列的情況下，是指在指定比較窗口上以最大對應(yīng)性比對時，這兩個序列中相同的殘基。如本文中使用的，術(shù)語“序列同一性百分比”可以是指通過在比較窗口上比較兩個最優(yōu)比對序列(例如，核酸序列或多肽序列)確定的值，其中為了實現(xiàn)這兩個序列的最優(yōu)比對，該比較窗口中的序列部分相比于參考序列(其不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即，空位)。通過確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核苷酸或氨基酸殘基的位置的數(shù)目而產(chǎn)生匹配位置數(shù)，用該匹配位置數(shù)除以比較窗口中位置的總數(shù)，將結(jié)果乘以100而產(chǎn)生序列同一性的百分比，從而計算出該百分比。每個位置與參考序列相比均相同的序列被認為是與參考序列是100％相同的，反之亦然。用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。各種程序和比對算法例如描述于Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene73:237-244；Higgins和Sharp(1989)CABIOS5:151-153；Corpet等人，(1988)NucleicAcidsRes.16:10881-10890；Huang等人，(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-165；Pearson等人，(1994)MethodsMol.Biol.24:307-331；Tatiana等人(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-250。序列比對方法和同源性計算的詳細考慮事項可見于例如，Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)基本局部比對搜索工具(BLASTTM；Altschul等人(1990))可在幾個來源訪問，包括美國國家生物技術(shù)信息中心(Bethesda,MD)、以及在互聯(lián)網(wǎng)上，其與幾種序列分析程序結(jié)合使用。怎樣使用該程序確定序列同一性的描述可在互聯(lián)網(wǎng)上BLAST的“幫助”部分獲得。為了比較核酸序列，可以采用利用默認參數(shù)的默認BLOSUM62矩陣集的BLAST(Blastn)程序的“Blast2序列”函數(shù)。在用這種方法評估時，與參考序列具有較大相似性的核酸序列將顯示出同一性百分比的增加?？商禺愋噪s交/特異性互補：如本文中使用的，術(shù)語“可特異性雜交”和“特異性互補”是表明互補性的足夠程度的術(shù)語，該互補性足以使得在核酸分子與靶核酸分子之間發(fā)生穩(wěn)定且特異的結(jié)合。在兩個核酸分子之間的雜交兩種涉及核酸分子的核酸序列之間的反平行比對的形成。然后，兩個分子能夠與相反鏈上的相應(yīng)堿基形成氫鍵以形成雙鏈體分子，如果該雙鏈體分子足夠穩(wěn)定，則可使用本領(lǐng)域中熟知的方法檢出。核酸分子與其可特異性雜交的靶序列不一定是100％互補的。然而，對于特異性雜交必須存在的序列互補性量依賴所使用的雜交條件而變化。導(dǎo)致特定嚴格程度的雜交條件會根據(jù)選擇的雜交方法的性質(zhì)和雜交的核酸序列的組成和長度而變化。通常，雜交的溫度和雜交緩沖液的離子強度(尤其是Na+和/或Mg++濃度)是雜交嚴格性的決定因素。關(guān)于獲得特定嚴格性程度所需要的雜交條件的計算是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，并且論述于例如Sambrook等人(編輯)MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,vol.1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989,chapters9and11,andupdates；以及Hames和Higgins(編輯)NucleicAcidHybridization,IRLPress,Oxford,1985。關(guān)于核酸雜交的進一步詳細說明和指導(dǎo)例如可見于Tijssen,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,"inLaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,PartI,Chapter2,Elsevier,NY,1993；以及Ausubel等人編輯，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Chapter2,GreenePublishingandWiley-Interscience,NY,1995,andupdates。如本文中使用的，“嚴格條件”涵蓋僅在雜交分子與靶核酸分子內(nèi)的同源序列之間存在大于80％序列同一性時才發(fā)生雜交的條件?！皣栏駰l件”包括另外的特定嚴格性水平。因此，如本文中使用的，“中等嚴格性”條件為具有80％以上序列同一性的分子將會雜交的條件(即，具有小于20％的錯配)；“高嚴格性”條件為具有90％以上同一性的序列將會雜交的條件(即，具有小于10％的錯配)；并且“極高嚴格性”條件為具有95％以上同一性的序列將會雜交的條件(即，具有小于5％的錯配)。以下是代表性的非限制性雜交條件：高嚴格性條件(檢測出共享至少90％序列同一性的序列)：在5XSSC緩沖液中在65℃雜交16小時；在2XSSC緩沖液中在室溫下洗滌兩次，每次15分鐘；并且在0.5XSSC緩沖液中在65℃洗滌兩次，每次20分鐘。中等嚴格性條件(檢測出共享至少80％序列同一性的序列)：在5X到6XSSC緩沖液中在65--70℃雜交16-20小時；在2XSSC緩沖液中在室溫下洗滌兩次，每次5-20分鐘；并且在1XSSC緩沖液中在55-70℃洗滌兩次，每次30分鐘。非嚴格對照條件(共享至少50％序列同一性的序列會雜交)：在6XSSC緩沖液中在室溫到55℃雜交16-20小時；在2X到3XSSC緩沖液中在室溫到55℃洗滌至少兩次，每次20-30分鐘。如本文中使用的，術(shù)語“基本上同源”或“實質(zhì)性同源性”就連續(xù)核酸序列而言是指由這樣的核酸分子產(chǎn)生的連續(xù)核苷酸序列，所述核酸分子在嚴格條件下與具有參考核酸序列的核酸分子雜交。例如，包含與SEQIDNO:1-5和81-83中任一個的參考核酸序列基本上同源的序列的核酸分子是如下的那些核酸分子，所述核酸分子在嚴格條件(例如，所提出的中等嚴格性條件，見上文)下與具有SEQIDNO:1-5和81-83中任一個的參考核酸序列的核酸分子雜交?；旧贤吹男蛄锌梢跃哂兄辽?0％序列同一性。例如，基本上同源的序列可以具有約80％到100％序列同一性，諸如約81％；約82％；約83％；約84％；約85％；約86％；約87％；約88％；約89％；約90％；約91％；約92％；約93％；約94％；約95％；約96％；約97％；約98％；約98.5％；約99％；約99.5％；和約100％。實質(zhì)性同源性的特性與特異性雜交緊密相關(guān)。例如，當存在足夠的互補程度時，核酸分子可特異性地雜交，以便避免核酸在特異性結(jié)合是期望的情況下(例如，在嚴格雜交條件下)與非靶序列的非特異性結(jié)合。如本文中使用的，術(shù)語“直系同源物”是指兩種或更多種物種中已經(jīng)從共同的祖先核苷酸序列進化并且可以在所述兩種或更多種物種中保留相同功能的基因。如本文中使用的，當以5’至3’方向閱讀的序列的每個核苷酸與當以3’至5’方向閱讀時的另一序列的每個核苷酸序列互補時，兩個核酸序列分子被認為展現(xiàn)出“完全互補性”。與參考核苷酸序列互補的核苷酸序列將展現(xiàn)出與參考核苷酸序列的反向互補序列相同的序列。這些術(shù)語和描述是本領(lǐng)域中定義明確的，并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易理解的?？刹僮鬟B接：當?shù)谝缓怂嵝蛄信c第二核酸序列處于功能性關(guān)系中時，則第一核酸序列與第二核酸序列是可操作連接的。當以重組方式產(chǎn)生時，可操作連接的核酸序列通常是毗連的，并且在必要時可以將兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)連接在同一個閱讀框內(nèi)(例如，在翻譯融合的ORF中)。然而，可操作連接的核酸不一定是毗連的。在有關(guān)調(diào)節(jié)序列和編碼序列的情況下使用時，術(shù)語“可操作連接”意味著該調(diào)節(jié)序列影響該連接的編碼序列的表達。“調(diào)節(jié)序列”或“控制元件”是指影響轉(zhuǎn)錄的周期和水平/量、RNA加工或穩(wěn)定性、或相關(guān)編碼序列的翻譯的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列可以包括啟動子；翻譯前導(dǎo)序列；內(nèi)含子；增強子；莖環(huán)結(jié)構(gòu)；阻抑物結(jié)合序列；終止序列；和多腺苷酸化識別序列等。特定的調(diào)節(jié)序列可位于與其可操作連接的編碼序列的上游和/或下游。并且，與編碼序列可操作連接的特定調(diào)節(jié)序列可位于雙鏈核酸分子的相關(guān)互補鏈上。啟動子：如本文中使用的，術(shù)語“啟動子”是指可以在轉(zhuǎn)錄起始上游的、且可能涉及RNA聚合酶與其他蛋白質(zhì)的識別和結(jié)合而啟動轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。啟動子可與用于在細胞中表達的編碼序列可操作連接，或者啟動子可與編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接，所述核苷酸序列可與用于在細胞中表達的編碼序列可操作連接?！爸参飭幼印笨梢允悄軌騿又参锛毎D(zhuǎn)錄的啟動子。在發(fā)育控制下的啟動子的實例包括優(yōu)先啟動某些組織中的轉(zhuǎn)錄的啟動子，所述組織例如葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞、或厚壁組織。這樣的啟動子稱為“組織優(yōu)先”啟動子。僅啟動某些組織中的轉(zhuǎn)錄的啟動子被稱為“組織特異性”啟動子?！凹毎愋吞禺愋浴眴幼又饕?qū)動一個或多個器官中某些細胞類型(例如，根或葉中的維管細胞)中的表達?！罢T導(dǎo)型”啟動子可以是可以在環(huán)境控制之下的啟動子?？赏ㄟ^誘導(dǎo)型啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實例包括厭氧條件和光的存在。組織特異性啟動子、組織優(yōu)先啟動子、細胞類型特異性啟動子、和誘導(dǎo)型啟動子構(gòu)成“非組成型”啟動子類別?！敖M成型”啟動子是可在大多數(shù)環(huán)境條件下或在大多數(shù)組織或細胞類型中有活性的啟動子。在本發(fā)明的一些實施方案中可以使用任何誘導(dǎo)型啟動子。參見Ward等人，(1993)PlantMol.Biol.22:361-366。利用誘導(dǎo)型啟動子，轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)于誘導(dǎo)劑而增加。誘導(dǎo)型啟動子的實例包括但不限于：來自響應(yīng)于銅的ACEI系統(tǒng)的啟動子；響應(yīng)于苯磺酰胺除草劑安全劑的來自玉米的In2基因啟動子；來自Tn10的Tet阻抑物；和來自類固醇激素基因的誘導(dǎo)型啟動子，其轉(zhuǎn)錄活性可通過糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)(Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10421-10425)。示例性的組成型啟動子包括，但不限于：來自植物病毒的啟動子，例如來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子；來自水稻肌動蛋白基因的啟動子；泛素啟動子；pEMU；MAS；玉米H3組蛋白啟動子；和ALS啟動子，歐洲油菜ALS3結(jié)構(gòu)基因5'的Xba1/NcoI片段(或與所述Xba1/NcoI片段相似的核苷酸序列)(美國專利No.5,659,026)。另外，在本發(fā)明的一些實施方案中可以利用任何組織特異性或組織優(yōu)先啟動子。用包含與組織特異性啟動子可操作連接的編碼序列的核酸分子轉(zhuǎn)化的植物可唯一地或優(yōu)先地在特異性組織中產(chǎn)生所述編碼序列的產(chǎn)物。示例性的組織特異性或組織優(yōu)先啟動子包括但不限于：種子特異性啟動子，如來自菜豆蛋白基因的啟動子；葉特異性和光誘導(dǎo)型啟動子，如來自cab或rubisco的啟動子；花藥特異性啟動子，如來自LAT52的啟動子；花粉特異性啟動子，如來自Zm13的啟動子；以及小孢子優(yōu)先啟動子，如來自apg的啟動子。大豆植物：如本文中使用的，術(shù)語“大豆植物”是指物種大豆屬的植物，包括大豆(Glycinemax)。轉(zhuǎn)化：如本文中使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”是指將一個或多個核酸分子轉(zhuǎn)移到細胞中。當核酸分子通過核酸分子并入細胞基因組中、或通過附加型復(fù)制而由該細胞穩(wěn)定復(fù)制時，細胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)到該細胞中的核酸分子“轉(zhuǎn)化”。如本文中使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”涵蓋可將核酸分子導(dǎo)入這種細胞中的所有技術(shù)。實例包括但不限于：用病毒載體轉(zhuǎn)染；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化；電穿孔(Fromm等人，(1986)Nature319:791-793)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Felgner等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7417)；顯微注射(Mueller等人，(1978)Cell15:579-585)；土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(Fraley等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803-4807)；直接DNA攝取；和微粒轟擊(Klein等人，(1987)Nature327:70)。轉(zhuǎn)基因：外源核酸序列。在一些實例中，轉(zhuǎn)基因可以是編碼dsRNA分子的一條或兩條鏈的序列，所述dsRNA分子包含與存在于鞘翅目和/或半翅目害蟲中的核酸分子互補的核苷酸序列。在另外的實例中，轉(zhuǎn)基因為反義核酸序列，其中所述反義核酸序列的表達抑制靶核酸序列的表達。在又另外的實例中，轉(zhuǎn)基因可以是基因序列(例如，除草劑抗性基因)、編碼工業(yè)或藥學(xué)上有用的化合物的基因、或編碼期望的農(nóng)業(yè)性狀的基因。在這些和其他實例子中，轉(zhuǎn)基因可以含有與轉(zhuǎn)基因的編碼序列可操作連接的調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子)。載體：引入到細胞中，例如產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細胞的核酸分子。載體可以包含允許其在宿主細胞中復(fù)制的核酸序列，諸如復(fù)制起點。載體的實例包括但不限于：質(zhì)粒；粘粒；噬菌體；和攜帶外源DNA或RNA進入細胞中的病毒。載體還可包括一種或多種基因、反義序列、和/或選擇標志物基因和本領(lǐng)域已知的其他遺傳元件。載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或感染細胞，由此引起細胞表達核酸分子和/或由該載體編碼的蛋白質(zhì)。任選地，載體包括輔助核酸分子實現(xiàn)進入細胞中的物質(zhì)(例如脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)包衣等)。產(chǎn)量：相對于在相同生長位置在相同時間且在相同條件下生長的檢驗品種的產(chǎn)量，約100％或更大的穩(wěn)定化產(chǎn)量。在特定的實施方案中，“提高的產(chǎn)量”或“提高產(chǎn)量”意指相對于在含有相當大密度的對該作物有害的鞘翅目和/或半翅目害蟲的相同生長位置在相同時間且在相同條件下生長的檢驗品種的產(chǎn)量，具有105％至115％或更大的穩(wěn)定化產(chǎn)量的栽培種。除非特別指明或暗示，如本文中使用的術(shù)語“一個”、“一種”和“該”表示“至少一個/種”。除非另外特別地解釋，本文中使用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與屬于本公開的領(lǐng)域之內(nèi)的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義?？梢栽谝韵鲁霭嫖镏姓业椒肿由飳W(xué)中常見術(shù)語的定義：例如，Lewin’sGenesX,Jones&BartlettPublishers,2009(ISBN100763766321)；Krebs等人(編輯)，TheEncyclopediaofMolecularBiology,BlackwellScienceLtd.,1994(ISBN0-632-02182-9)；和MeyersR.A.(編輯)，MolecularBiologyandBiotechnology:AComprehensiveDeskReference,VCHPublishers,Inc.,1995(ISBN1-56081-569-8)。除非另有說明，所有百分比均以重量計，所有溶劑混合物比例以體積計。所有溫度以攝氏度計。IV.第一組實施方案A.概述本文中描述了可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子。描述的核酸分子包括靶序列(例如，天然基因、和非編碼序列)、dsRNA、siRNA、hpRNA、shRNA、和miRNA。例如，在一些實施方案中描述了dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和/或hpRNA分子，其可與鞘翅目和/或半翅目害蟲中的一種或多種天然核酸序列的全部或部分特異性地互補。在這些和另外的實施方案中，天然核酸序列可以是一種或多種靶基因，其產(chǎn)物可以例如但不限于：涉及代謝過程；涉及生殖過程；或者涉及幼蟲發(fā)育。本文中描述的核酸分子在導(dǎo)入包含至少一種與該核酸分子特異性互補的天然核酸序列的細胞中時，可以在細胞中啟動RNAi，隨后降低或消除該天然核酸序列的表達。在一些實例中，借助于包含與靶基因特異性互補的序列的核酸分子，靶基因表達的表達的降低或消除在鞘翅目和/或半翅目害蟲中可以是致命的，或?qū)е律L和/或生殖降低。在一些實施方案中，可以選擇鞘翅目和/或半翅目害蟲中的至少一種靶基因，其中靶基因為Sec23基因(例如SEQIDNO:1和SEQIDNO:81)。在具體的實例中，鞘翅目和/或半翅目害蟲中的靶基因包含選自以下的核苷酸序列：玉米根螢葉甲Sec23(SEQIDNO:1)；玉米根螢葉甲Sec23reg1(SEQIDNO:3)；玉米根螢葉甲Sec23ver1(SEQIDNO:4)；玉米根螢葉甲Sec23ver2(SEQIDNO:5)；BSB_Sec23(SEQIDNO:81)；BSB_Sec23-1(SEQIDNO:82)；andBSB_Sec23-2(SEQIDNO:83)。在一些實施方案中，靶基因可以是包含編碼多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述多肽包含與Sec23基因(例如SEQIDNO:1和SEQIDNO:81)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列至少85％相同(例如，約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、或100％相同)的連續(xù)氨基酸序列。靶基因可以是鞘翅目和/或半翅目害蟲中任何這樣的核酸序列，對該序列的轉(zhuǎn)錄后抑制會對鞘翅目和/或半翅目害蟲造成有害影響，或為植物提供針對鞘翅目和/或半翅目害蟲的保護益處。在具體的實例中，靶基因是包含編碼多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述多肽包含與選自玉米根螢葉甲Sec23(SEQIDNO:1)；玉米根螢葉甲Sec23reg1(SEQIDNO:3)；玉米根螢葉甲Sec23ver1(SEQIDNO:4)玉米根螢葉甲Sec23ver2(SEQIDNO:5)；BSB_Sec23(SEQIDNO:81)；BSB_Sec23-1(SEQIDNO:82)；和BSB_Sec23-2(SEQIDNO:83)。的核苷酸序列的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列至少85％相同、約90％相同、約95％相同、約96％相同、約97％相同、約98％相同、約99％相同、約100％相同、或100％相同的連續(xù)氨基酸序列。依照本發(fā)明提供了核苷酸序列，其表達生成包含核苷酸序列的RNA分子，所述核苷酸序列與由鞘翅目和/或半翅目害蟲中的編碼序列編碼的天然RNA分子的全部或部分特異性地互補。在一些實施方案中，在鞘翅目和/或半翅目害蟲攝入表達的RNA分子后，可以獲得鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中編碼序列的下調(diào)。在特定的實施方案中，鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中編碼序列的下調(diào)可以對鞘翅目和/或半翅目害蟲的生長、生存力、增殖、和/或生殖產(chǎn)生有害影響。在一些實施方案中，靶序列包括轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA序列，諸如5’UTR；3’UTR；剪接前導(dǎo)序列；內(nèi)含子序列；末端內(nèi)含子(outron)序列(例如，隨后在反式剪接中修飾的5'UTRRNA)；donatron序列(例如，提供反式剪接的供體序列需要的非編碼RNA)；和鞘翅目和/或半翅目害蟲靶基因的其他非編碼轉(zhuǎn)錄RNA。這樣的序列可以衍生自單順反子和多順反子基因兩者。因此，本文中結(jié)合一些實施方案還描述了包含至少一種核苷酸序列的iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)，所述核苷酸序列與鞘翅目和/或半翅目害蟲中的靶序列的全部或部分特異性地互補。在一些實施方案中，iRNA分子可以包含與多個靶序列，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多個靶序列的全部或部分互補的核苷酸序列。在特定的實施方案中，iRNA分子可以在體外產(chǎn)生，或通過遺傳修飾的生物(如植物或細菌)在體內(nèi)產(chǎn)生。還公開了cDNA序列，其可以用于產(chǎn)生與鞘翅目和/或半翅目害蟲中的靶序列的全部或部分特異性地互補的dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子、和/或hpRNA分子。進一步描述了在實現(xiàn)特定宿主靶標的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化中使用的重組DNA構(gòu)建體。轉(zhuǎn)化的宿主靶標可以從重組DNA構(gòu)建體表達有效水平的dsRNA、siRNA、miRNA分子、shRNA分子、和/或hpRNA分子。因此，還描述了植物轉(zhuǎn)化載體，其包含與在植物細胞中功能性的異源啟動子可操作連接的至少一個核苷酸序列，其中核苷酸序列的表達生成包含與鞘翅目和/或半翅目害蟲中的靶序列的全部或部分特異性地可雜交(例如互補)的核苷酸序列的RNA分子。在一些實施方案中，可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子可以包括：從鞘翅目或半翅目生物分離的天然Sec23核酸序列的全部或部分，其包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:81中例如15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200或更多個連續(xù)核苷酸的多核苷酸(例如SEQIDNO:1,3-5和81-83中的任一者)；在表達時生成這樣的RNA分子的核苷酸序列，所述RNA分子包含與由Sec23基因(例如，SEQIDNO:1和SEQIDNO:81)編碼的天然RNA分子的全部或部分特異性地互補的核苷酸序列；iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)，所述iRNA分子包含與Sec23基因的全部或部分特異性地互補的至少一個核苷酸序列；可用于產(chǎn)生dsRNA分子、siRNA分子、miRNA、shRNA和/或hpRNA分子的cDNA序列，所述分子與Sec23基因的全部或部分特異性地互補；以及用于在實現(xiàn)特定宿主靶標的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化中使用的重組DNA構(gòu)建體，其中轉(zhuǎn)化的宿主靶標包含前述核酸分子的一種或多種。B.核酸分子本發(fā)明提供了，除其他事項外，抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲的細胞、組織、或器官中的靶基因表達的iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)分子；和能夠在細胞或微生物中表達為iRNA分子以抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲的細胞、組織、或器官中的靶基因表達的DNA分子。本發(fā)明的一些實施方案提供了分離的核酸分子，其包含至少一個(例如，一個、兩個、三個、或更多個)選自下組的核苷酸序列：SEQIDNO:1；SEQIDNO:1的互補序列；SEQIDNO:3；SEQIDNO:3的互補序列；SEQIDNO:4，SEQIDNO:4的互補序列；SEQIDNO:5；SEQIDNO:5的互補序列；SEQIDNO:81；SEQIDNO:81的互補序列；SEQIDNO:82；SEQIDNO:82的互補序列；SEQIDNO:83；SEQIDNO:83的互補序列；SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一個的至少15個連續(xù)核苷酸(例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個連續(xù)核苷酸)的片段；SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補序列；包含SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的全部或部分的鞘翅目或半翅目生物(例如，WCR和BSB)的天然編碼序列；包含SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的全部或部分的鞘翅目或半翅目生物的天然編碼序列的互補序列；被轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的全部或部分的天然RNA分子的鞘翅目或半翅目生物體的天然非編碼序列；被轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的全部或部分的天然RNA分子的鞘翅目或半翅目生物體的天然非編碼序列的互補序列；被轉(zhuǎn)錄為包含SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的全部或部分的天然RNA分子的鞘翅目或半翅目生物體的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段，以及被轉(zhuǎn)錄為包含SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的全部或部分的天然RNA分子的鞘翅目或半翅目生物體的天然非編碼序列的互補序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段。在特定的實施方案中，分離的核酸序列與鞘翅目和/或半翅目害蟲的接觸或被其攝取可抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲的生長、發(fā)育、生殖和/或進食。在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可以包含至少一個(例如，一個、兩個、三個、或更多個)DNA序列，其能夠在細胞或微生物中表達為iRNA分子以抑制鞘翅目害蟲的細胞、組織、或器官中的靶基因表達。這樣的DNA序列可以與在包含該DNA分子的細胞中具備功能的啟動子序列可操作連接，以啟動或增強編碼的能夠形成dsRNA分子的RNA的轉(zhuǎn)錄。在一個實施方案中，至少一個(例如，一個、兩個、三個、或更多個)DNA序列可衍生自SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者。SEQIDNO:1、3-5和81-83的衍生物包括SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的片段。在一些實施方案中，這樣的片段可包含例如SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的至少約15個連續(xù)核苷酸、或其互補序列。因此，這樣的片段可包含，例如，SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個連續(xù)核苷酸，或其互補序列。一些實施方案包括將部分或完全穩(wěn)定化的dsRNA分子導(dǎo)入鞘翅目和/或半翅目害蟲中以抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲的細胞、組織或器官中靶基因的表達。當表達為iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)并被鞘翅目和/或半翅目害蟲攝取時，包含SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的一個或多個片段的核酸序列可以引起下列一項或多項：鞘翅目和/或半翅目害蟲的死亡、生長抑制、性別比變化、產(chǎn)卵量(broodsize)減少、感染停止、和/或進食停止。例如，在一些實施方案中，提供了dsRNA分子，其包含含有與鞘翅目和/或半翅目害蟲靶基因序列基本上同源的約15到約300個(例如約19到約25個)核苷酸的核苷酸序列，且包含含有SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的核苷酸序列的一個或多個片段。這樣的dsRNA分子的表達可以例如導(dǎo)致攝取dsRNA分子的鞘翅目和/或半翅目害蟲的死亡和/或生長抑制。在某些實例中，本發(fā)明提供的dsRNA分子包含與Sec23靶基因或Sec23靶基因的片段(例如，包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:81的靶基因或者SEQIDNO:1或SEQIDNO:81的片段)互補的核苷酸序列，在鞘翅目和/或半翅目害蟲中抑制所述靶基因?qū)е聦τ谇食崮亢?或半翅目害蟲的生長、發(fā)育、或其他生物學(xué)功能必需的蛋白質(zhì)或核苷酸序列物質(zhì)的減少或消除。選擇的核苷酸序列可以與下列各項展現(xiàn)出約80％到約100％序列同一性：SEQIDNO:1或SEQIDNO:81；在SEQIDNO:1或SEQIDNO:81中所示的核苷酸序列的連續(xù)片段；或前述項任一者的互補序列。例如，選定的核苷酸序列可以與下列各項展現(xiàn)出約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約98.5％、約99％、約99.5％、或約100％的序列同一性：SEQIDNO:1或SEQIDNO:81；在SEQIDNO:1或SEQIDNO:81中所示的核苷酸序列的連續(xù)片段；或前述項任一者的互補序列。在一些實施方案中，能夠在細胞或微生物中表達為iRNA分子以抑制靶基因表達的DNA分子可以包含與存在于一個或多個鞘翅目和/或半翅目害蟲物種中的天然核酸序列的全部或部分特異性地互補的單個核苷酸序列，或者DNA分子可以是從多個這樣的特異性互補序列構(gòu)建而成的嵌合體。在一些實施方案中，核酸分子可以包含以“間隔物序列”分開的第一和第二核苷酸序列。間隔物序列可以是任何包含促進第一和第二核苷酸序列之間的二級結(jié)構(gòu)形成(在期望的情況下)的核苷酸序列的區(qū)域。在一個實施方案中，間隔物序列是mRNA的有義或反義編碼序列的一部分?；蛘撸g隔物序列可以包含能夠與核酸分子可操作連接的核苷酸或其同源物的任何組合。例如，在一些實施方案中，DNA分子可以包含編碼一種或多種不同RNA分子的核苷酸序列，其中每種不同RNA分子分別包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，其中第一和第二核苷酸序列彼此互補。第一和第二核苷酸序列在RNA分子內(nèi)可以通過間隔物序列連接。間隔物序列可以構(gòu)成第一核苷酸序列或第二核苷酸序列的一部分。包含第一和第二核苷酸序列的RNA分子的表達可以通過第一和第二核苷酸序列的特異性堿基配對而導(dǎo)致本發(fā)明的dsRNA分子的形成。第一核苷酸序列或第二核苷酸序列可以與對于鞘翅目和/或半翅目害蟲而言天然的核酸序列(例如，靶基因、或轉(zhuǎn)錄的非編碼序列)、其衍生物、或其互補序列基本上相同。dsRNA核酸分子包含聚合核糖核苷酸序列的雙鏈，并且可以包含對磷酸-糖主鏈或核苷的修飾。可以適宜調(diào)整RNA結(jié)構(gòu)的修飾以使得特異性抑制能夠發(fā)生。在一個實施方案中，可以通過普遍存在的酶促過程來修飾dsRNA分子，以便能夠生成siRNA分子。此酶促過程可以利用體外或體內(nèi)的RNA酶III酶，如真核生物中的切丁酶。參見Elbashir等人，(2001)Nature411:494-498；以及Hamilton和Baulcombe(1999)Science286(5441):950-952。切丁酶或功能等效的RNA酶III酶將較大的dsRNA鏈和/或hpRNA分子切割成較小的寡核苷酸(例如，siRNA)，每個所述寡核苷酸長度為約19-25個核苷酸。由這些酶生成的siRNA分子具有2到3個核苷酸3’突出物、和5’磷酸和3’羥基末端。由RNA酶III酶生成的siRNA分子在細胞中解旋，并分成單鏈RNA。然后，siRNA分子與從靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA序列特異性地雜交，并且這兩種RNA分子隨后通過固有的細胞RNA降解機制而被降解。這個過程可以導(dǎo)致由靶生物中的靶基因編碼的RNA序列的有效降解或消除。結(jié)果導(dǎo)致靶向基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。在一些實施方案中，通過內(nèi)源RNA酶III酶從異源核酸分子產(chǎn)生的siRNA分子可以有效介導(dǎo)鞘翅目和/或半翅目害蟲中靶基因的下調(diào)。在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可以包括至少一種可被轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA分子的非天然存在的核苷酸序列，所述單鏈RNA分子能夠在體內(nèi)通過分子間雜交形成dsRNA分子。這樣的dsRNA序列常常進行自組裝，并且可以在鞘翅目和/或半翅目害蟲的營養(yǎng)來源中提供，以實現(xiàn)靶基因的轉(zhuǎn)錄后抑制。在這些和另外的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可以包含兩種不同的非天然存在的核苷酸序列，其中每種序列與鞘翅目和/或半翅目害蟲中的不同靶基因特異性地互補。當向鞘翅目和/或半翅目害蟲以dsRNA分子的形式提供這樣的核酸分子時，dsRNA分子抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中至少兩種不同靶基因的表達。C.獲得核酸分子可以使用鞘翅目和/或半翅目害蟲中的多種天然序列作為靶序列來設(shè)計本發(fā)明的核酸分子，如iRNA和編碼iRNA的DNA分子。然而，天然序列的選擇并非是直截了當?shù)倪^程。鞘翅目和/或半翅目害蟲的天然序列中僅有少數(shù)會是有效的靶標。例如，無法肯定地預(yù)測特定的天然序列是否可以被本發(fā)明的核酸分子有效下調(diào)，或者特定的天然序列的下調(diào)是否會對鞘翅目和/或半翅目害蟲的生長、生存力、增殖和/或生殖具有有害影響。絕大多數(shù)的鞘翅目和/或半翅目害蟲天然序列，如自其分離的EST(例如，如美國專利7,612,194和美國專利7,943,819中所列出的)，對鞘翅目和/或半翅目害蟲，如WCR、NCR、英雄美洲蝽、稻綠蝽、蓋德擬壁蝽、茶翅蝽、擬綠蝽、和褐臭蝽的生長、生存力、增殖和/或生殖沒有有害影響。同樣無法預(yù)測，在可以對鞘翅目和/或半翅目害蟲具有有害影響的天然序列中，哪些能夠在重組技術(shù)中使用，從而在宿主植物中表達與這樣的天然序列互補的核酸分子，并且在進食后對害蟲造成有害影響，同時不對宿主植物引起損害。在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子(例如，要在鞘翅目和/或半翅目害蟲的宿主植物中提供的dsRNA分子)被選擇為靶向這樣的cDNA序列，其編碼對于鞘翅目和/或半翅目害蟲存活必需的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分(如涉及代謝或分解代謝生物化學(xué)途徑、細胞分裂、生殖、能量代謝、消化、宿主植物識別等的氨基酸序列)。如本文中描述的，靶生物攝入含有一種或多種dsRNA——所述dsRNA的至少一個區(qū)段與靶害蟲生物細胞中產(chǎn)生的RNA的至少一個基本上相同的區(qū)段特異地互補——的組合物，可以導(dǎo)致靶生物的死亡或其他抑制?？梢允褂脧那食崮亢?或半翅目害蟲衍生的核苷酸序列(DNA或RNA)來構(gòu)建對鞘翅目和/或半翅目害蟲侵染有抗性的植物細胞。例如，可以轉(zhuǎn)化鞘翅目和/或半翅目害蟲的宿主植物(例如，玉蜀黍或大豆)，使其含有從鞘翅目和/或半翅目害蟲衍生的如本文中提供的一種或多種核苷酸序列。轉(zhuǎn)化到宿主中的核苷酸序列可以編碼一種或多種RNA，其在轉(zhuǎn)化的宿主內(nèi)的細胞或生物學(xué)流體中形成dsRNA序列，因此，如果/當鞘翅目和/或半翅目害蟲與轉(zhuǎn)基因宿主形成營養(yǎng)關(guān)系時，使得dsRNA可用。這可以導(dǎo)致鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中一種或多種基因表達的阻抑，最終導(dǎo)致死亡或其生長或發(fā)育的抑制。因此，在一些實施方案中，靶向?qū)嵸|(zhì)參與鞘翅目和/或半翅目害蟲的生長、發(fā)育和生殖的基因。本發(fā)明中使用的其他靶基因可以包括例如那些在鞘翅目和/或半翅目害蟲的生存力、運動、遷移、生長、發(fā)育、感染性、進食位置的建立和生殖中發(fā)揮重要作用的靶基因。因此，靶基因可以是管家基因或轉(zhuǎn)錄因子。另外，本發(fā)明中使用的天然鞘翅目和/或半翅目害蟲核苷酸序列也可以從植物、病毒、細菌或昆蟲基因的同源物(例如，直系同源物)衍生，所述同源物的功能對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，且其核苷酸序列與鞘翅目和/或半翅目害蟲的基因組中的靶基因可特異性地雜交。通過雜交鑒定已知核苷酸序列的基因同源物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于獲得包含用于產(chǎn)生iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)分子的核苷酸序列的核酸分子的方法。一種這樣的實施方案包括：(a)對一種或多種靶基因分析其在鞘翅目和/或半翅目害蟲中在dsRNA介導(dǎo)的基因阻抑后的表達、功能和表型；(b)用探針探查cDNA或gDNA文庫，所述探針包含來自靶向的鞘翅目和/或半翅目害蟲的核苷酸序列的全部或部分或其同源物，所述靶向的鞘翅目和/或半翅目害蟲在dsRNA介導(dǎo)的阻抑分析中展現(xiàn)出改變的(例如，降低的)生長或發(fā)育表型；(c)鑒定與探針特異性雜交的DNA克隆；(d)分離步驟(b)中鑒定的DNA克??；(e)對包含步驟(d)中分離的克隆的cDNA或gDNA片段測序，其中測序的核酸分子包含RNA序列的全部或大部分或其同源物；和(f)化學(xué)合成基因序列的全部或大部分、或siRNA、或miRNA、或shRNA、或hpRNA或mRNA或dsRNA。在另外的實施方案中，用于獲得包含用于產(chǎn)生大部分的iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)分子的核苷酸序列的核酸片段的方法包括：(a)合成第一和第二寡核苷酸引物，其與來自靶向的鞘翅目和/或半翅目害蟲的天然核苷酸序列的一部分特異性地互補；和(b)使用步驟(a)的第一和第二寡核苷酸引物擴增克隆載體中存在的cDNA或gDNA插入物，其中擴增的核酸分子包含siRNA或miRNA或shRNA或hpRNA或mRNA或dsRNA分子的大部分。本發(fā)明的核酸可以通過多種途徑分離、擴增、或產(chǎn)生。例如，可以通過PCR擴增從gDNA或cDNA文庫衍生的靶核酸序列(例如，靶基因或靶轉(zhuǎn)錄的非編碼序列)、或其部分而獲得iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)分子?？梢詮陌猩锾崛NA或RNA，并且可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法從其制備核酸文庫?？墒褂米园猩锷傻膅DNA或cDNA文庫進行靶基因的PCR擴增和測序。可以使用確認的PCR產(chǎn)物作為體外轉(zhuǎn)錄的模板以在最低限度的啟動子的情況下生成有義和反義RNA?；蛘?，可以使用標準化學(xué)，如亞磷酰胺化學(xué)，通過許多技術(shù)(參見，例如Ozaki等人，(1992)NucleicAcidsResearch,20:5205-5214；和Agrawal等人，(1990)NucleicAcidsResearch,18:5419-5423)，包括使用自動化DNA合成儀(例如，P.E.Biosystems,Inc.(FosterCity,Calif.)392或394型DNA/RNA合成儀)的任一者來合成核酸分子。參見，例如，Beaucage等人，(1992)Tetrahedron,48:2223-2311；美國專利4,415,732、4,458,066、4,725,677、4,973,679、和4,980,460。也可以采用備選化學(xué)，其生成非天然主鏈基團，如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯，等等。本發(fā)明的RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、或hpRNA分子可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過手動或自動反應(yīng)以化學(xué)或酶促方式產(chǎn)生，或者在包含含有編碼RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、或hpRNA分子的序列的核酸分子的細胞中體內(nèi)產(chǎn)生。還可以通過部分或完全有機合成產(chǎn)生RNA，可以通過體外酶促或有機合成引入任何經(jīng)修飾的核糖核苷酸?？梢酝ㄟ^細胞RNA聚合酶或噬菌體RNA聚合酶(例如，T3RNA聚合酶、T7RNA聚合酶、和SP6RNA聚合酶)合成RNA分子。可用于克隆和表達核苷酸序列的表達構(gòu)建體是本領(lǐng)域中已知的。參見，例如，美國專利5,593,874、5,693,512、5,698,425、5,712,135、5,789,214、和5,804,693?？梢栽趯?dǎo)入細胞中之前純化化學(xué)合成或通過體外酶促合成合成的RNA分子。例如，可以通過用溶劑或樹脂提取、沉淀、電泳、色譜法、或其組合從混合物純化RNA分子。或者，可以在不純化或最小程度純化的情況下使用化學(xué)合成或通過體外酶促合成而合成的RNA分子，例如，以避免由于樣品加工所致的損失?？梢詫NA分子干燥貯存或溶解在水溶液中。溶液可以含有緩沖劑或鹽以促進dsRNA分子雙鏈體鏈的退火和/或穩(wěn)定化。在實施方案中，可以通過單一自身互補的RNA鏈或者從兩條互補RNA鏈形成dsRNA分子。dsRNA分子可以在體內(nèi)或在體外合成。細胞的內(nèi)源RNA聚合酶可以在體內(nèi)介導(dǎo)一條或兩條RNA鏈的轉(zhuǎn)錄，或者可以使用克隆的RNA聚合酶在體內(nèi)或在體外介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。通過宿主器官、組織、或細胞類型中的特異性轉(zhuǎn)錄(例如，通過使用組織特異性啟動子進行)；刺激宿主中的環(huán)境條件(例如，通過使用響應(yīng)于感染、脅迫、溫度、和/或化學(xué)誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)型啟動子)；和/或在宿主的某個發(fā)育階段或年齡人工造成轉(zhuǎn)錄(例如，通過使用發(fā)育階段特異性啟動子)，在鞘翅目和/或半翅目害蟲中靶基因的轉(zhuǎn)錄后抑制可以是宿主靶向的。形成dsRNA分子的RNA鏈(不論是體外還是體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的)可以也可以不是多聚腺苷酸化的，并且可以能夠也可以不能被細胞翻譯機制翻譯成多肽。D.重組載體和宿主細胞轉(zhuǎn)化在一些實施方案中，本發(fā)明還提供了用于導(dǎo)入細胞(例如，細菌細胞、酵母細胞、或植物細胞)中的DNA分子，其中DNA分子包含這樣的核苷酸序列，該核苷酸序列在表達為RNA并被鞘翅目和/或半翅目害蟲攝取后，可實現(xiàn)對鞘翅目和/或半翅目害蟲的細胞、組織或器官中靶基因的阻抑。因此，一些實施方案提供了重組核酸分子，其包含能夠在植物細胞中表達為iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)分子以抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中靶基因表達的核酸序列。為了啟動或增強表達，這樣的重組核酸分子可以包含一種或多種調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列可以與能夠表達為iRNA的核酸序列可操作連接。在植物中表達基因阻抑分子的方法是已知的，并且可以用于表達本發(fā)明的核苷酸序列。參見，例如，國際PCT公開號WO06/073727；和美國專利公開號2006/0200878Al)。在具體的實施方案中，本發(fā)明的重組DNA分子可以包含編碼可形成dsRNA分子的RNA的核酸序列。這樣的重組DNA分子可以編碼這樣的dsRNA分子，它們在被攝取后能夠抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中內(nèi)源靶基因的表達。在許多實施方案中，轉(zhuǎn)錄的RNA可以形成dsRNA分子，所述dsRNA分子可以以穩(wěn)定化形式提供；例如，以發(fā)夾和莖和環(huán)結(jié)構(gòu)的形式提供。在某些實施方案中，dsRNA分子的一條鏈可以通過從與選自下組的核苷酸序列基本上同源的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄而形成：SEQIDNO:1；SEQIDNO:1的互補序列；SEQIDNO:1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；SEQIDNO:1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補序列；包含SEQIDNO:1的葉甲屬生物(例如，WCR)的天然編碼序列；包含SEQIDNO:1的葉甲屬生物的天然編碼序列的互補序列；轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:1的天然RNA分子的葉甲屬生物的天然非編碼序列；轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:1的天然RNA分子的葉甲屬生物的天然非編碼序列的互補序列；包含SEQIDNO:1的葉甲屬生物(例如，WCR)的天然編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；包含SEQIDNO:1的葉甲屬生物的天然編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補序列；轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:1的天然RNA分子的葉甲屬生物的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；和轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:1的天然RNA分子的葉甲屬生物的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補序列。在其他實施方案中，dsRNA分子的一條鏈可以通過從與選自下組的核苷酸序列基本上同源的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄而形成：SEQIDNO:81；SEQIDNO:81的互補序列；SEQIDNO:81的至少19個連續(xù)核苷酸的片段；SEQIDNO:81的至少19個連續(xù)核苷酸的片段的互補序列；包含SEQIDNO:81的半翅目生物的天然編碼序列；包含SEQIDNO:81的半翅目生物的天然編碼序列的互補序列；轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:81的天然RNA分子的半翅目生物的天然非編碼序列；轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:81的天然RNA分子的半翅目生物的天然非編碼序列的互補序列；包含SEQIDNO:81的半翅目生物的天然編碼序列的至少19個連續(xù)核苷酸的片段；包含SEQIDNO:81的半翅目生物的天然編碼序列的至少19個連續(xù)核苷酸的片段的互補序列；轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:81的天然RNA分子的半翅目生物的天然非編碼序列的至少19個連續(xù)核苷酸的片段；和轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:81的天然RNA分子的半翅目生物的天然非編碼序列的至少19個連續(xù)核苷酸的片段的互補序列。在特定的實施方案中，編碼dsRNA分子的重組DNA分子可以在一個轉(zhuǎn)錄序列內(nèi)包含至少兩個核苷酸序列區(qū)段，這樣的序列如此排列，使得該轉(zhuǎn)錄序列包含處于有義取向的第一核苷酸序列區(qū)段、和處于反義取向的第二核苷酸序列區(qū)段(即，所述第一核苷酸序列區(qū)段的反向互補序列)，其中有義核苷酸序列區(qū)段和反義核苷酸序列區(qū)段由約五(約5)到約一千(約1000)個核苷酸的間隔物序列區(qū)段連接或相連。間隔物序列區(qū)段可以在有義和反義序列區(qū)段之間形成環(huán)。有義核苷酸序列或反義核苷酸序列區(qū)段可以與靶基因(例如，包含SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的基因)或其片段的核苷酸序列基本上同源。然而，在一些實施方案中，重組DNA分子可以編碼沒有間隔物序列的dsRNA分子。在實施方案中，有義編碼序列和反義編碼序列可具有不同長度。通過在本發(fā)明的重組核酸分子中創(chuàng)建適當?shù)谋磉_盒，可以容易地將鑒定為對鞘翅目和/或半翅目害蟲具有有害影響或者針對鞘翅目和/或半翅目害蟲的植物保護效果的序列摻入表達的dsRNA分子中。例如，可以通過如下步驟將這樣的序列表達為具有莖和環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾：采用對應(yīng)于靶基因序列(例如，SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者，及其片段)的第一區(qū)段；將此序列與第二區(qū)段間隔物區(qū)連接，所述第二區(qū)段間隔物區(qū)與第一區(qū)段不是同源或互補的；并將這與第三區(qū)段連接，其中第三區(qū)段的至少一部分與第一區(qū)段基本上互補。這樣的構(gòu)建體通過第一區(qū)段與第三區(qū)段的分子內(nèi)堿基配對而形成莖和環(huán)結(jié)構(gòu)，其中環(huán)結(jié)構(gòu)形式包含第二區(qū)段。參見，例如，美國專利公開文本2002/0048814和2003/0018993；以及國際PCT公開文本W(wǎng)O94/01550和WO98/05770?？梢岳缫噪p鏈結(jié)構(gòu)諸如莖環(huán)結(jié)構(gòu)(例如，發(fā)夾)形式生成dsRNA分子，由此通過共表達靶基因的片段(例如在另外的植物表達盒上的靶基因的片段)增強靶向天然鞘翅目和/或半翅目害蟲序列的siRNA的產(chǎn)生，這可導(dǎo)致siRNA產(chǎn)生增強，或者降低甲基化以防止dsRNA發(fā)夾啟動子的轉(zhuǎn)錄基因沉默。本發(fā)明的實施方案包括將本發(fā)明的重組核酸分子導(dǎo)入植物中(即，轉(zhuǎn)化)以實現(xiàn)一種或多種iRNA分子的鞘翅目和/或半翅目害蟲抑制水平的表達。重組DNA分子可以例如是載體，如線性或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體系統(tǒng)可以是單一載體或質(zhì)粒，或者共同含有要導(dǎo)入宿主基因組中的總DNA的兩個或更多個載體或質(zhì)粒。另外，載體可以是表達載體?？梢岳鐚⒈景l(fā)明的核酸序列適當?shù)夭迦胼d體中，在一種或多種宿主中發(fā)揮功能以驅(qū)動連接的編碼序列或其他DNA序列表達的合適啟動子控制下。許多載體可用于此目的，適當載體的選擇主要將取決于要插入載體中的核酸的大小和要用載體轉(zhuǎn)化的特定宿主細胞。根據(jù)其功能(例如，DNA擴增或DNA表達)及與其相容的特定宿主細胞，每種載體含有不同的組分。為了對轉(zhuǎn)基因植物賦予鞘翅目和/或半翅目害蟲抗性，例如可以在重組植物的組織或流體內(nèi)將重組DNA轉(zhuǎn)錄成iRNA分子(例如，形成dsRNA分子的RNA分子)。iRNA分子可包含與可引起宿主植物物種損害的鞘翅目和/或半翅目害蟲內(nèi)的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄核苷酸序列基本上同源且可特異性雜交的核苷酸序列。例如，鞘翅目和/或半翅目害蟲可以通過攝取包含iRNA分子的轉(zhuǎn)基因宿主植物的細胞或流體而接觸在轉(zhuǎn)基因宿主植物細胞中轉(zhuǎn)錄的iRNA分子。因此，靶基因的表達在侵染轉(zhuǎn)基因宿主植物的鞘翅目和/或半翅目害蟲內(nèi)受到iRNA分子阻抑。在一些實施方案中，對靶鞘翅目和/或半翅目害蟲中靶基因表達的阻抑可以生成對害蟲侵染有抗性的植物。為了使iRNA分子能夠被投送給與已經(jīng)用本發(fā)明的重組核酸分子轉(zhuǎn)化的植物細胞處于營養(yǎng)關(guān)系的鞘翅目和/或半翅目害蟲，需要在植物細胞中表達(即，轉(zhuǎn)錄)iRNA分子。因此，重組核酸分子可以包含與一種或多種調(diào)節(jié)序列(諸如在宿主細胞中發(fā)揮功能的異源啟動子序列)可操作連接的本發(fā)明的核苷酸序列，所述宿主細胞諸如其中要擴增核酸分子的細菌細胞，或其中要表達核酸分子的植物細胞。適合于用于本發(fā)明的核酸分子的啟動子包括誘導(dǎo)型、病毒的、合成的、或組成型的那些啟動子，它們都是本領(lǐng)域中熟知的。描述這樣的啟動子的非限制性實例包括美國專利6,437,217(玉米RS81啟動子)；5,641,876(水稻肌動蛋白啟動子)；6,426,446(玉米RS324啟動子)；6,429,362(玉米PR-1啟動子)；6,232,526(玉米A3啟動子)；6,177,611(組成型玉米啟動子)；5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196(CaMV35S啟動子)；6,433,252(玉米L3油質(zhì)蛋白啟動子)；6,429,357(水稻肌動蛋白2啟動子和稻肌動蛋白2內(nèi)含子)；6,294,714(光誘導(dǎo)型啟動子)；6,140,078(鹽誘導(dǎo)型啟動子)；6,252,138(病原體誘導(dǎo)型啟動子)；6,175,060(磷缺乏誘導(dǎo)型啟動子)；6,388,170(雙向啟動子)；6,635,806(γ薏苡辛(coixin)啟動子)；及美國專利公開號2009/757,089(玉米葉綠體醛縮酶啟動子)。其他啟動子包括膽脂堿合酶(NOS)啟動子(Ebert等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(16):5745-5749)和章魚堿合酶(OCS)啟動子(兩者都在根癌土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上攜帶)；花椰菜花葉病毒組(caulimovirus)啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動子(Lawton等人，(1987)PlantMol.Biol.9:315-324)；CaMV35S啟動子(Odell等人，(1985)Nature313:810-812；玄參花葉病毒35S啟動子(Walker等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(19):6624-6628)；蔗糖合酶啟動子(Yang和Russell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:4144-4148)；R基因復(fù)合物啟動子(Chandler等人，(1989)PlantCell1:1175-1183)；葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動子；CaMV35S(美國專利5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196)；FMV35S(美國專利5,378,619和6,051,753)；PClSV啟動子(美國專利No.5,850,019)；SCP1啟動子(美國專利No.6,677,503)；和AGRtu.nos啟動子(登錄號V00087；Depicker等人，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-573；Bevan等人，(1983)Nature304:184-187)。在特定的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含組織特異性啟動子，如根特異性啟動子。根特異性啟動子驅(qū)動專門或優(yōu)先在根組織中表達可操作連接的編碼序列。根特異性啟動子的實例是本領(lǐng)域中已知的。參見，例如，美國專利5,110,732；5,459,252和5,837,848；Opperman等人，(1994)Science263:221-3；和Hirel等人，(1992)PlantMol.Biol.20:207-18。在一些實施方案中，可以在兩個根特異性啟動子之間克隆依照本發(fā)明的用于鞘翅目和/或半翅目害蟲控制的核苷酸序列或片段，所述根特異性啟動子相對于所述核苷酸序列或片段以相反的轉(zhuǎn)錄方向排布，在轉(zhuǎn)基因植物細胞中可操作，并且在轉(zhuǎn)基因植物細胞中表達以在轉(zhuǎn)基因植物細胞中產(chǎn)生RNA分子，RNA分子隨后可形成dsRNA分子，如上文所述。鞘翅目和/或半翅目害蟲可以攝取植物組織中表達的iRNA分子，從而實現(xiàn)對靶基因表達的阻抑?？扇芜x地與感興趣的核酸分子可操作連接的其他調(diào)節(jié)序列包括5'UTR，5'UTR作為位于啟動子序列和編碼序列之間的翻譯前導(dǎo)序列發(fā)揮功能。翻譯前導(dǎo)序列存在于完全加工的mRNA中，并且其可以影響初級轉(zhuǎn)錄物的加工和/或RNA的穩(wěn)定性。翻譯前導(dǎo)序列的例子包括玉米和矮牽牛熱休克蛋白前導(dǎo)物(美國專利No.5,362,865)、植物病毒外殼蛋白前導(dǎo)序列、植物rubisco前導(dǎo)序列等。參見，例如，Turner和Foster(1995)MolecularBiotech.3(3):225-36。5'UTR的非限制性實例包括GmHsp(美國專利No.5,659,122)；PhDnaK(美國專利No.5,362,865)；AtAnt1；TEV(Carrington和Freed(1990)J.Virol.64:1590-7)；和AGRtunos(GENBANKTM登錄號V00087；和Bevan等人，(1983)Nature304:184-7)。其他與感興趣的核酸分子可操作連接的調(diào)節(jié)序列還包括3'非翻譯序列、3'轉(zhuǎn)錄終止區(qū)、或多腺苷酸化區(qū)。這些是位于核苷酸序列下游的遺傳元件，并且包括提供多腺苷酸化信號的多核苷酸、和/或能夠影響轉(zhuǎn)錄或mRNA加工的其他調(diào)節(jié)信號。多腺苷酸化信號在植物中發(fā)揮功能以引起多腺苷酸化核苷酸添加至mRNA前體的3'端。多腺苷酸化序列可以源自多種植物基因或T-DNA基因。3'轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的一個非限制性實例是膽脂堿合酶3'區(qū)(nos3'；Fraley等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803-7)。在Ingelbrecht等人，(1989)PlantCell1:671-80中提供了使用不同3'非翻譯區(qū)的實例。多腺苷酸化信號的非限制性實例包括來自豌豆RbcS2基因的信號(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi等人，(1984)EMBOJ.3:1671-9)和AGRtu.nos(GENBANKTM登錄號E01312)。一些實施方案可以包括植物轉(zhuǎn)化載體，該植物轉(zhuǎn)化載體包含分離純化的DNA分子，該DNA分子包含與本發(fā)明的一種或多種核苷酸序列可操作連接的至少一種上文描述的調(diào)節(jié)序列。在表達時，一種或多種核苷酸序列生成一種或多種包含核苷酸序列的RNA分子，所述核苷酸序列與鞘翅目和/或半翅目害蟲中的天然RNA分子的全部或部分特異性地互補。因此，核苷酸序列可以包含編碼靶向的鞘翅目和/或半翅目害蟲RNA轉(zhuǎn)錄物內(nèi)存在的核糖核苷酸序列的全部或部分的區(qū)段，并且可以包含靶向的鞘翅目和/或半翅目害蟲轉(zhuǎn)錄物的全部或部分的反向重復(fù)。植物轉(zhuǎn)化載體可以含有與超過一種靶序列特異性互補的序列，由此容許產(chǎn)生超過一種dsRNA以抑制靶鞘翅目和/或半翅目害蟲的一個或多個群體或物種的細胞中兩種或更多種基因的表達?？梢詫⑴c不同基因中存在的核苷酸序列特異性互補的核苷酸序列區(qū)段組合成單一復(fù)合核酸分子，以便在轉(zhuǎn)基因植物中表達。這樣的區(qū)段可以是連續(xù)的或者由間隔物序列分開。在一些實施方案中，可以通過在同一質(zhì)粒中依次插入另外的核苷酸序列來修飾已經(jīng)含有本發(fā)明的至少一個核苷酸序列的本發(fā)明質(zhì)粒，其中所述另外的核苷酸序列與原有的至少一個核苷酸序列可操作連接于相同的調(diào)節(jié)元件。在一些實施方案中，核酸分子可以設(shè)計為抑制多種靶基因。在一些實施方案中，要抑制的多種基因可以獲自相同的鞘翅目和/或半翅目害蟲物種，這樣做可以增強核酸分子的有效性。在其他實施方案中，基因可以來自不同的鞘翅目和/或半翅目害蟲，這樣可以拓寬藥劑有效的鞘翅目和/或半翅目害蟲的范圍。當靶向多種基因以實現(xiàn)阻抑、或表達和阻抑的組合時，可以制造多順反子DNA元件。本發(fā)明的重組核酸分子或載體可以包含賦予轉(zhuǎn)化的細胞，諸如植物細胞可選擇表型的選擇標志物。也可以使用選擇標志物來選擇包含本發(fā)明的重組核酸分子的植物或植物細胞。標志物可以編碼殺生物劑抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、遺傳霉素(G418)、博來霉素、潮霉素，等等)、或除草劑抗性(例如，草甘膦等)。選擇標志物的實例包括但不限于編碼卡那霉素抗性并且可以使用卡那霉素、G418等選擇的neo基因；編碼雙丙氨磷抗性的bar基因；編碼草甘膦抗性的突變體EPSP合酶基因；賦予對溴苯腈的抗性的腈水解酶基因；賦予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突變體乙酰乳酸合酶基因(ALS)；和甲氨蝶呤抗性DHFR基因?？捎枚喾N選擇標志物，其賦予對氨芐青霉素、博來霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、膦絲菌素、嘌呤霉素、大觀霉素、利福平、鏈霉素和四環(huán)素等的抗性。這樣的選擇標志物的實例展示于，例如美國專利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047。本發(fā)明的重組核酸分子或載體還可以包含可篩選標志物?？梢允褂每珊Y選標志物來監(jiān)測表達。示例性篩選標志物包括β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，其編碼已知的多種生色底物的酶(Jefferson等人，(1987)PlantMol.Biol.Rep.5:387-405)；R基因座基因，其編碼調(diào)節(jié)植物組織中花色素苷色素(紅色)產(chǎn)生的產(chǎn)物(Dellaporta等人，(1988)"MolecularcloningofthemaizeR-njallelebytransposontaggingwithAc."收錄于18thStadlerGeneticsSymposium,P.Gustafson和R.Appels編輯，(NewYork:Plenum),pp.263-82)；β-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffe等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:3737-41)；編碼已知多種生色底物的酶(例如，PADAC，一種生色頭孢菌素)的基因；螢光素酶基因(Ow等人，(1986)Science234:856-9)；xylE基因,其編碼能轉(zhuǎn)化生色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶(Zukowski等人，(1983)Gene46(2-3):247-55)；淀粉酶基因(Ikatu等人，(1990)Bio/Technol.8:241-2)；酪氨酸酶基因，其編碼能夠?qū)⒗野彼嵫趸癁镈OPA和多巴醌(dopaquinone)(其繼而縮合成黑色素)的酶(Katz等人，(1983)J.Gen.Microbiol.129:2703-14))；和α-半乳糖苷酶。在一些實施方案中，在用于創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因植物和在植物中表達異源核酸的方法中，可以使用如上文所描述的重組核酸分子來制備表現(xiàn)出對鞘翅目和/或半翅目害蟲的易感性降低的轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以通過將編碼iRNA分子的核酸分子插入植物轉(zhuǎn)化載體中，并將這些導(dǎo)入植物中來制備植物轉(zhuǎn)化載體。用于宿主細胞轉(zhuǎn)化的適合方法包括任何能將DNA導(dǎo)入細胞中的方法，如通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，美國專利No.5,508,184)，通過干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝取(參見，例如，Potrykus等人.(1985)Mol.Gen.Genet.199:183-8)，通過電穿孔(參見，例如，美國專利No.5,384,253)，通過用碳化硅纖維攪拌(參見，例如，美國專利5,302,523和5,464,765)，通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(參見，例如，美國專利5,563,055；5,591,616；5,693,512；5,824,877；5,981,840；和6,384,301)，以及通過加速DNA包被的顆粒(參見，例如，美國專利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861、和6,403,865)，等。特別可用于轉(zhuǎn)化玉米的技術(shù)描述于例如美國專利5,591,616、7,060,876和7,939,3281中。通過應(yīng)用諸如此類的這些技術(shù)，幾乎任何物種的細胞都可被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化DNA被整合到宿主細胞的基因組中。在多細胞物種的情況下，轉(zhuǎn)基因細胞可再生為轉(zhuǎn)基因生物?？梢允褂萌魏芜@些技術(shù)來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，例如在轉(zhuǎn)基因植物的基因組中包含編碼一種或多種iRNA分子的一種或多種核酸序列。用于將表達載體導(dǎo)入植物中的廣泛使用的方法是基于各種土壤桿菌物種的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌是將植物細胞遺傳轉(zhuǎn)化的植物致病性土壤細菌。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌的Ti和Ri質(zhì)粒分別攜帶負責植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因。Ti(誘導(dǎo)腫瘤)-質(zhì)粒含有被稱為T-DNA的大片段，其被轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化的植物中。Ti質(zhì)粒的另一個片段，Vir區(qū)，負責T-DNA的轉(zhuǎn)移。T-DNA區(qū)的邊界為末端重復(fù)序列。在修飾的二元載體中，腫瘤誘導(dǎo)基因已缺失，Vir區(qū)的功能用于轉(zhuǎn)移以T-DNA邊界序列為界的外來DNA。T區(qū)還可含有用于轉(zhuǎn)基因細胞和植物有效恢復(fù)的選擇標志物、以及插入用于轉(zhuǎn)移諸如編碼核酸的dsRNA之類序列的多克隆位點。因此，在一些實施方案中，植物轉(zhuǎn)化載體來源于根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒(參見，例如，美國專利4,536,475、4,693,977、4,886,937、和5,501,967；以及歐洲專利No.EP0122791)或發(fā)根土壤桿菌的Ri質(zhì)粒。其他的植物轉(zhuǎn)化載體包括，例如但不限于，由Herrera-Estrella等人，(1983)Nature303:209-13；Bevan等人，(1983)Nature304:184-7；Klee等人，(1985)Bio/Technol.3:637-42；以及在歐洲專利No.EP0120516中所描述的那些載體，以及從任何前述文獻來源的那些載體。可以修飾天然地與植物相互作用的其他細菌，如中華根瘤菌屬、根瘤菌屬、和中慢生根瘤菌屬，以介導(dǎo)到許多各種各樣的植物中的基因轉(zhuǎn)移。通過獲取卸甲Ti質(zhì)粒和適合的二元載體，可以使這些植物相關(guān)的共生細菌能夠勝任基因轉(zhuǎn)移。在提供外源DNA到受體細胞的遞送之后，通常鑒定出轉(zhuǎn)化的細胞用于進一步培養(yǎng)和植物再生。為了提高鑒定轉(zhuǎn)化細胞的能力，人們可能期望采用如前提出的選擇或篩選標志物基因，其中轉(zhuǎn)化載體用來再生轉(zhuǎn)化體。在采用選擇標志物的情況下，通過使細胞暴露于選擇劑或藥劑，鑒定出在潛在轉(zhuǎn)化的細胞群中的轉(zhuǎn)化細胞。在采用篩選標志物的情況下，可針對期望的標志物基因性狀來篩選細胞。暴露于選擇劑后存活的細胞、或者在篩選測定中已被評分為陽性的細胞，可以在支持植物再生的介質(zhì)中進行培養(yǎng)。在一些實施方案中，可通過包含其他物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)劑來改良任何適合的植物組織培養(yǎng)基(例如，MS和N6培養(yǎng)基)?？蓪⒔M織維持在具有生長調(diào)節(jié)劑的基本培養(yǎng)基上，直到可得到足夠的組織用于啟動植物再生工作時為止，或者在重復(fù)多輪的手動選擇之后，直到組織形態(tài)適合于再生時為止(例如，約2周)，然后轉(zhuǎn)移到有助于芽形成的介質(zhì)中。定期轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物，直到已經(jīng)出現(xiàn)充分的芽形成時為止。一旦形成芽，將它們轉(zhuǎn)移到有助于根形成的介質(zhì)中。一旦形成足夠的根，可將植物轉(zhuǎn)移到土壤中，以便進一步生長和成熟。為了證實再生植物中感興趣核酸分子(例如，編碼一種或多種iRNA分子的DNA序列，所述iRNA分子抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中的靶基因表達)的存在，可以進行多種測定法。這樣的測定法例如包括：分子生物學(xué)測定，如Southern和northern印跡、PCR、和核酸測序；生物化學(xué)測定，如檢測蛋白質(zhì)產(chǎn)物的存在，例如通過免疫學(xué)手段(ELISA和/或免疫印跡)或借助于酶功能；植物部分測定，如葉或根測定；和再生的全植物的表型分析?？衫缤ㄟ^使用對感興趣核酸分子特異的寡核苷酸引物進行PCR擴增來分析整合事件。PCR基因分型應(yīng)當理解為包括但不限于，來源于分離的宿主植物愈傷組織的基因組DNA的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增，所述愈傷組織預(yù)期含有整合到基因組中的感興趣核酸分子，然后進行標準克隆和PCR擴增產(chǎn)物的序列分析。PCR基因分型方法已被很好地描述(例如Rios,G等人，(2002)PlantJ.32:243-53)，并可應(yīng)用于來源于任何植物物種(例如，玉米或大豆)或組織類型(包括細胞培養(yǎng)物)的基因組DNA。采用依賴于土壤桿菌的轉(zhuǎn)化方法形成的轉(zhuǎn)基因植物一般含有插入一個染色體中的單個重組DNA序列。該單個重組DNA序列被稱為“轉(zhuǎn)基因事件”或“整合事件”。這樣的轉(zhuǎn)基因植物對于插入的外源序列而言是半合的。在一些實施方案中，通過含有單個外源基因序列的獨立分離的轉(zhuǎn)基因植物與自身(例如T0植物)有性交配(自交)以產(chǎn)生Tl種子，可獲得相對于轉(zhuǎn)基因為純合的轉(zhuǎn)基因植物。所產(chǎn)生的Tl種子的四分之一相對于所述轉(zhuǎn)基因是純合的。萌發(fā)Tl種子產(chǎn)生的植物可用于測試雜合性，所述測試一般使用SNP測定或熱擴增測定，使得允許在雜合子和純合子之間進行區(qū)分(即，接合型測定)。在特定的實施方案中，在植物細胞中產(chǎn)生具有鞘翅目和/或半翅目害蟲-抑制效果的至少2、3、4、5、6、7、8、9種或10種或更多種不同iRNA分子?？梢詮囊氩煌D(zhuǎn)化事件中的多種核酸序列、或從引入單一轉(zhuǎn)化事件中的單一核酸序列表達iRNA分子(例如，dsRNA分子)。在一些實施方案中，在單一啟動子的控制下表達多個iRNA分子。在其他實施方案中，在多個啟動子的控制下表達多個iRNA分子?？梢员磉_包含多個核酸序列的單一iRNA分子，所述核酸序列各自與在相同鞘翅目和/或半翅目害蟲物種的不同群體中或在不同的鞘翅目和/或半翅目害蟲物種中的一個或多個鞘翅目和/或半翅目害蟲內(nèi)的不同基因座同源。除了用重組核酸分子直接轉(zhuǎn)化植物之外，可通過使具有至少一個轉(zhuǎn)基因事件的第一植物與缺乏這種事件的第二植物雜交來制造轉(zhuǎn)基因植物。例如，可將包含編碼iRNA分子的核苷酸序列的重組核酸分子導(dǎo)入易于轉(zhuǎn)化的第一植物品系中而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物可與第二植物品系雜交而使編碼iRNA分子的核苷酸序列滲入到第二植物品系中。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的一種或多種序列的商業(yè)產(chǎn)品。特定的實施方案包括從含有本發(fā)明的一種或多種核苷酸序列的重組植物或種子生產(chǎn)的商業(yè)產(chǎn)品。含有本發(fā)明的一種或多種序列的商業(yè)產(chǎn)品預(yù)期包括但不限于：植物的粗粉、油類、碾碎的或完整的籽?；蚍N子，或包含含有本發(fā)明的一種或多種序列的重組植物或種子的任何粗粉、油、或碾碎的或完整的籽粒的任何食物或動物飼料產(chǎn)品。本文中考慮的一種或多種商品或商業(yè)產(chǎn)品中的本發(fā)明的一種或多種序列的檢測實際上證明，商品或商業(yè)產(chǎn)品是從為了使用dsRNA介導(dǎo)的基因阻抑方法控制鞘翅目和/或半翅目植物害蟲的目的，設(shè)計為表達本發(fā)明的一種或多種核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物所生產(chǎn)的。在一些方面，包括由自轉(zhuǎn)化的植物細胞衍生的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子和商業(yè)產(chǎn)品，其中種子或商業(yè)產(chǎn)品包含可檢出量的本發(fā)明的核酸序列。在一些實施方案中，例如，可以通過獲得轉(zhuǎn)基因植物并從它們制備食物或飼料來生產(chǎn)這樣的商業(yè)產(chǎn)品。包含本發(fā)明的一種或多種核酸序列的商業(yè)產(chǎn)品包括例如但不限于：植物的粗粉、油類、碾碎的或完整的籽?；蚍N子，和包含含有本發(fā)明的一種或多種序列的重組植物或種子的任何粗粉、油、或碾碎的或完整的籽粒的任何食物產(chǎn)品。在一種或多種商品或商業(yè)產(chǎn)品中的檢出本發(fā)明的一種或多種序列，實際上證明該商品或商業(yè)產(chǎn)品是由為了控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的目的，設(shè)計為表達本發(fā)明的一種或多種iRNA分子的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的。在一些實施方案中，包含本發(fā)明的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物或種子也可在其基因組中包含至少一個其他的轉(zhuǎn)基因事件，包括但不限于：自其轉(zhuǎn)錄靶向鞘翅目和/或半翅目害蟲中與由Sec23基因座不同的基因座的iRNA分子的轉(zhuǎn)基因事件，所述不同的基因座例如像，選自下組的一個或多個基因座：Caf1-180(美國專利申請公開號2012/0174258)、VatpaseC(美國專利申請公開號2012/0174259)、Rho1(美國專利申請公開號2012/0174260)、VatpaseH(美國專利申請公開號2012/0198586)、PPI-87B(美國專利申請公開號2013/0091600)、RPA70(美國專利申請公開號2013/0091601)、和RPS6(美國專利申請公開號2013/0097730)；自其轉(zhuǎn)錄靶向與鞘翅目和/或半翅目害蟲不同的生物(例如，植物寄生性線蟲)中的基因的iRNA分子的轉(zhuǎn)基因事件；編碼殺蟲蛋白(例如，蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白)的基因，例如，Cry34Ab1(美國專利6,127,180、6,340,593、和6,624,145)、Cry35Ab1(美國專利6,083,499、6,340,593、和6,548,291)、在單一事件中的“Cry34/35Ab1”組合(例如，玉米事件DAS-59122-7；美國專利No.7,323,556)、Cry3A(例如，美國專利No.7,230,167)、Cry3B(例如，美國專利No.8,101,826)、Cry6A(例如，美國專利No.6,831,062)、及其組合(例如，美國專利申請2013/0167268、2013/0167269、和2013/0180016)；耐除草劑基因(例如，提供草甘膦、草丁膦、麥草畏或2,4--D耐受性的基因(例如，美國專利No.7,838,733))；以及促成轉(zhuǎn)基因植物中的期望表型的基因，所述期望表型例如產(chǎn)量增加、脂肪酸代謝改變、或細胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)。在特定的實施方案中，可以在植物中將編碼本發(fā)明iRNA分子的序列與其他昆蟲控制或抗病性性狀組合以實現(xiàn)增強的昆蟲損害和植物疾病控制的期望性狀。例如，由于對所述性狀的抗性的概率在田間將發(fā)生降低，組合采用獨特作用模式的昆蟲控制性狀可以對受保護的轉(zhuǎn)基因植物提供優(yōu)越的持久性，該持久性優(yōu)于含有單一控制性狀的植物。V.鞘翅目和/或半翅目害蟲中的靶基因阻抑A.概述在本發(fā)明的一些實施方案中，可以對鞘翅目和/或半翅目害蟲提供至少一種可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子，其中所述核酸分子在鞘翅目和/或半翅目害蟲中導(dǎo)致RNAi介導(dǎo)的基因沉默。在特定的實施方案中，可以對鞘翅目和/或半翅目害蟲提供iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)。在一些實施方案中，可以通過使核酸分子與鞘翅目和/或半翅目害蟲接觸對鞘翅目和/或半翅目害蟲提供可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子。在這些和另外的實施方案中，可以在鞘翅目和/或半翅目害蟲的進食基質(zhì)，例如營養(yǎng)組合物中提供可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子。在這些和另外的實施方案中，可以通過攝取被鞘翅目和/或半翅目害蟲攝取的包含核酸分子的植物材料來提供可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子。在某些實施方案中，核酸分子通過表達導(dǎo)入植物材料中的重組核酸序列而存在于植物材料中，所述導(dǎo)入例如通過用包含重組核酸序列的載體轉(zhuǎn)化植物細胞，并從轉(zhuǎn)化的植物細胞再生植物材料或全植物來進行。B.RNA介導(dǎo)的靶基因阻抑在實施方案中，本發(fā)明提供了iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA、和hpRNA)，可以設(shè)計此類分子使之靶向鞘翅目和/或半翅目害蟲(例如，WCR、NCR、英雄美洲蝽、稻綠蝽、蓋德擬壁蝽、茶翅蝽、擬綠蝽、和褐臭蝽)的轉(zhuǎn)錄組中的必需天然核苷酸序列(例如，必需基因)，例如設(shè)計有至少一條鏈包含與靶序列特異性互補的核苷酸序列的iRNA分子。如此設(shè)計的iRNA分子的序列可以與靶序列相同，或者可以含有不會阻止iRNA分子與其靶序列之間的特異性雜交的錯配。本發(fā)明的iRNA分子可以在用于鞘翅目和/或半翅目害蟲中基因阻抑的方法中使用，由此降低由害蟲對植物(例如，包含iRNA分子的受保護的轉(zhuǎn)化植物)引起的損害水平或發(fā)生率。如本文中使用的，術(shù)語“基因阻抑”是指用于降低由于基因轉(zhuǎn)錄成mRNA及隨后mRNA翻譯而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水平，包括降低基因或編碼序列的蛋白質(zhì)表達，包括任何公知的轉(zhuǎn)錄后抑制表達和轉(zhuǎn)錄阻抑表達的方法。通過從靶向阻抑的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的全部或部分與用于阻抑的相應(yīng)iRNA分子之間的特異性同源性而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后抑制。另外，轉(zhuǎn)錄后抑制是指通過核糖體結(jié)合的細胞中可用的mRNA量的實質(zhì)性和可測量降低。在其中RNAi分子是dsRNA分子的實施方案中，酶切丁酶可以將dsRNA分子切割成短siRNA分子(大約20個核苷酸長度)。借助于切丁酶對dsRNA分子的活性而生成的雙鏈siRNA分子可以分成兩個單鏈siRNA：“乘客鏈”和“引導(dǎo)鏈”。乘客鏈可以被降解，而引導(dǎo)鏈可以摻入RISC中。通過引導(dǎo)鏈與mRNA分子的特異性互補序列的特異性雜交，隨后通過酶Argonaute(RISC復(fù)合物的催化組分)切割而發(fā)生轉(zhuǎn)錄后抑制。在本發(fā)明的實施方案中，可以使用任何形式的iRNA分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解的是，在制備過程中及在對細胞提供iRNA分子的步驟過程中，dsRNA分子一般比單鏈RNA分子更穩(wěn)定，并且一般在細胞中也是更穩(wěn)定的。因此，例如，雖然在一些實施方案中siRNA和miRNA分子可能是同等有效的，但是dsRNA分子可以由于其穩(wěn)定性而被選用。在特定的實施方案中，提供了包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列可以在體外表達以產(chǎn)生iRNA分子，所述iRNA分子與由鞘翅目和/或半翅目害蟲基因組內(nèi)的核苷酸序列編碼的核酸分子基本上同源。在某些實施方案中，體外轉(zhuǎn)錄的iRNA分子可以是包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化的dsRNA分子。在鞘翅目和/或半翅目害蟲接觸體外轉(zhuǎn)錄的iRNA分子后，可以發(fā)生對鞘翅目和/或半翅目害蟲中靶基因(例如，必需基因)的轉(zhuǎn)錄后抑制。在一些實施方案中，在用于對鞘翅目害蟲中靶基因的轉(zhuǎn)錄后抑制的方法中可利用至少一種包含核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸的核酸分子的表達，其中所述核苷酸序列選自下組：SEQIDNO:1；SEQIDNO:1的互補序列；SEQIDNO:3；SEQIDNO:3的互補序列；SEQIDNO:4；SEQIDNO:4的互補序列；SEQIDNO:5；SEQIDNO:5的互補序列；SEQIDNO:81；SEQIDNO:81的互補序列；SEQIDNO:82；SEQIDNO:82的互補序列；SEQIDNO:83；SEQIDNO:83的互補序列；SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補序列；包含SEQIDNO:1、3-5和81-83中任一者的鞘翅目和/或半翅目害蟲的天然編碼序列；包含SEQIDNO:1、3-5和81-83的鞘翅目和/或半翅目害蟲的天然編碼序列的互補序列；轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:1、3-5和81-83的天然RNA分子的鞘翅目和/或半翅目害蟲的天然非編碼序列；轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:1、3-5和81-83的天然RNA分子的鞘翅目和/或半翅目害蟲的天然非編碼序列的互補序列；轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:1、3-5和81-83的天然RNA分子的鞘翅目和/或半翅目害蟲的天然非編碼序列的互補序列；包含SEQIDNO:1、3-5和81-83的鞘翅目和/或半翅目害蟲的天然編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；包含SEQIDNO:1、3-5和81-83的鞘翅目和/或半翅目害蟲的天然編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補序列；轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:1、3-5和81-83的天然RNA分子的鞘翅目和/或半翅目害蟲的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；和轉(zhuǎn)錄成包含SEQIDNO:1、3-5和81-83的天然RNA分子的鞘翅目和/或半翅目害蟲的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補序列。在某些實施方案中，可以使用與前述任一項至少80％相同(例如，80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、和100％)的核酸分子的表達。在這些和另外的實施方案中，可以表達與存在于至少一個鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中的RNA分子特異性雜交的核酸分子。在特定的實例中，這樣的核酸分子可包含含有選自SEQIDNO:3-5、82和/或83的核苷酸序列。本發(fā)明的一些實施方案的重要特征在于，RNAi轉(zhuǎn)錄后抑制系統(tǒng)能夠容忍靶基因中預(yù)期由于遺傳突變、株系多態(tài)性、或進化趨異而可能發(fā)生的序列變異。導(dǎo)入的核酸分子可以不必與靶基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或完全加工的mRNA絕對同源，只要導(dǎo)入的核酸分子與靶基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或完全加工的mRNA可特異性雜交即可。而且，相對于靶基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或完全加工的mRNA，導(dǎo)入的核酸分子可以不必是全長的。使用本發(fā)明的iRNA技術(shù)抑制靶基因是序列特異性的；即，靶向與iRNA分子基本上同源的核苷酸序列進行遺傳抑制。在一些實施方案中，可以使用包含與靶基因序列的一部分相同的核苷酸序列的RNA分子進行抑制。在這些和另外的實施方案中，可以使用包含相對于靶基因序列具有一個或多個插入、缺失和/或點突變的核苷酸序列的RNA分子。在特定的實施方案中，iRNA分子和靶基因的一部分可以共享例如至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％、至少約100％、和100％的序列同一性?；蛘?，dsRNA分子的雙鏈體區(qū)可以與靶基因轉(zhuǎn)錄物的一部分可特異性地雜交。在可特異性雜交的分子中，展現(xiàn)出較大同源性的小于全長的序列可補償較長的、同源性較低的序列。dsRNA分子的雙鏈體區(qū)中與靶基因轉(zhuǎn)錄物的一部分相同的核苷酸序列的長度可以是至少約15、25、50、100、200、300、400、500個、或至少約1000個堿基。在一些實施方案中，可以使用大于20個到100個核苷酸的序列。在特定的實施方案中，可以使用大于約200個到300個核苷酸的序列。在特定的實施方案中，根據(jù)靶基因的大小，可以使用大于約500個到1000個核苷酸的序列。在某些實施方案中，可以將鞘翅目和/或半翅目害蟲中靶基因的表達在鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞內(nèi)抑制至少10％；至少33％；至少50％；或至少80％，使得發(fā)生顯著抑制。顯著抑制是指高于閾值的抑制，所述抑制導(dǎo)致可檢出的表型(例如，生長停止、進食停止、發(fā)育停止、和誘導(dǎo)性死亡，等等)，或與所抑制的靶基因?qū)?yīng)的RNA和/或基因產(chǎn)物的可檢出降低。雖然在本發(fā)明的某些實施方案中，在鞘翅目和/或半翅目害蟲的基本上所有細胞中均發(fā)生抑制，但在其他實施方案中，僅在表達靶基因的細胞子集中發(fā)生抑制。在一些實施方案中，細胞中的轉(zhuǎn)錄阻抑由展現(xiàn)出與啟動子DNA序列或其互補序列的實質(zhì)性序列同一性的dsRNA分子的存在所介導(dǎo)，從而產(chǎn)生所謂的“啟動子反式阻抑”?；蜃枰挚梢栽诳梢詳z取或接觸此類dsRNA分子的鞘翅目和/或半翅目害蟲中針對靶基因發(fā)揮效果，例如通過害蟲攝取或接觸含有dsRNA分子的植物材料。在啟動子反式阻抑中使用的dsRNA分子可以特異性地設(shè)計為抑制或阻抑鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中一種或多種同源或互補序列的表達。美國專利5,107,065、5,231,020、5,283,184、和5,759,829中公開了通過反義或有義取向的RNA進行轉(zhuǎn)錄后基因阻抑以調(diào)節(jié)植物細胞中的基因表達。C.對鞘翅目和/或半翅目害蟲提供的iRNA分子的表達可以許多體外或體內(nèi)形式的任一種進行表達用于在鞘翅目和/或半翅目害蟲中RNAi介導(dǎo)的基因抑制的iRNA分子。然后，可以對鞘翅目和/或半翅目害蟲提供iRNA分子，例如通過使iRNA分子與害蟲接觸，或通過引起害蟲攝取或以別的方式內(nèi)在化iRNA分子。本發(fā)明的一些實施方案包括鞘翅目和/或半翅目害蟲的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主植物、經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞、和經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的后代。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞和經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物可以工程化改造為例如在異源啟動子控制下表達一種或多種iRNA分子，以提供害蟲保護效果。因此，當在鞘翅目和/或半翅目害蟲在進食期間食用轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞時，害蟲可以攝取轉(zhuǎn)基因植物或細胞中表達的iRNA分子。也可以將本發(fā)明的核苷酸序列導(dǎo)入廣泛而多樣的原核和真核微生物宿主中以產(chǎn)生iRNA分子。術(shù)語“微生物”包括原核和真核物種，如細菌和真菌。基因表達的調(diào)控可以包括對此類表達的部分或完全阻抑。在另一個實施方案中，用于阻抑鞘翅目和/或半翅目害蟲中基因表達的方法包括在害蟲宿主的組織中提供基因阻抑量的至少一種如本文中所描述的核苷酸序列在轉(zhuǎn)錄后形成的dsRNA分子，其至少一個區(qū)段與鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞內(nèi)的mRNA序列互補。根據(jù)本發(fā)明的鞘翅目和或半翅目害蟲所攝取的dsRNA分子，包括其修飾的形式，如siRNA、miRNA、shRNA、或hpRNA分子，可以與從包含選自下列核苷酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)錄的RNA分子至少約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、或100％相同，所述核苷酸序列包括SEQIDNO:1、3-5、和81-83中任一者。因此，提供了用于制備本發(fā)明的dsRNA分子的分離的且基本上純化的核酸分子，包括但不限于非天然存在的核苷酸序列和重組DNA構(gòu)建體，其在導(dǎo)入鞘翅目和/或半翅目害蟲時阻抑或抑制其中的內(nèi)源編碼序列或靶編碼序列的表達。特定的實施方案提供了用于遞送iRNA分子以轉(zhuǎn)錄后抑制鞘翅目和/或半翅目植物害蟲中的一種或多種靶基因并控制鞘翅目和/或半翅目植物害蟲群體的遞送系統(tǒng)。在一些實施方案中，所述遞送系統(tǒng)涉及包括對宿主轉(zhuǎn)基因植物細胞或包含在宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的RNA分子的宿主細胞內(nèi)容物的攝取。在這些和另外的實施方案中，創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因植物細胞或轉(zhuǎn)基因植物，其含有可提供本發(fā)明的穩(wěn)定化dsRNA分子的重組DNA構(gòu)建體。包含編碼特定iRNA分子的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物細胞和轉(zhuǎn)基因植物可以如下產(chǎn)生：采用重組DNA技術(shù)(這些基礎(chǔ)技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知的)構(gòu)建包含編碼本發(fā)明的iRNA分子(例如，穩(wěn)定化的dsRNA分子)的核苷酸序列的植物轉(zhuǎn)化載體；以此轉(zhuǎn)化植物細胞或植物；并以此生成含有轉(zhuǎn)錄的iRNA分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞或轉(zhuǎn)基因植物。為了對轉(zhuǎn)基因植物賦予鞘翅目和/或半翅目害蟲抗性，可以例如將重組DNA分子轉(zhuǎn)錄成iRNA分子，如dsRNA分子、siRNA分子、shRNA分子、miRNA分子、或hpRNA分子。在一些實施方案中，從重組DNA分子轉(zhuǎn)錄的RNA分子可以在重組植物的組織或流體內(nèi)形成dsRNA分子。這樣的dsRNA分子可以包含在核苷酸序列的一部分中，所述核苷酸序列與可侵染宿主植物的類型的鞘翅目和/或半翅目害蟲內(nèi)的DNA序列轉(zhuǎn)錄的相應(yīng)核苷酸序列相同。鞘翅目和/或半翅目害蟲內(nèi)靶基因的表達被所述攝入的dsRNA分子所阻抑，并且鞘翅目和/或半翅目害蟲中靶基因表達的阻抑導(dǎo)致，例如，鞘翅目和/或半翅目害蟲的進食停止，最終結(jié)果是例如，轉(zhuǎn)基因植物被保護免于受到該鞘翅目和/或半翅目害蟲的進一步損害。已經(jīng)顯示dsRNA分子的調(diào)控作用可適用于害蟲中表達的多種基因，包括例如負責細胞代謝或細胞轉(zhuǎn)化的內(nèi)源基因，包括管家基因；轉(zhuǎn)錄因子；蛻皮相關(guān)基因；和編碼涉及細胞代謝或正常生長和發(fā)育的多肽的其他基因。為了從體內(nèi)轉(zhuǎn)基因或表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，可以在一些實施方案中使用調(diào)節(jié)區(qū)(例如，啟動子、增強子、沉默子、和多聚腺苷酸化信號)以轉(zhuǎn)錄一條或多條RNA鏈。因此，在一些實施方案中，如上文提出的，在產(chǎn)生iRNA分子中使用的核苷酸序列可以與在植物宿主細胞中有功能的一種或多種啟動子序列可操作連接。啟動子可以是通常駐留于宿主基因組中的內(nèi)源啟動子。在可操作連接的啟動子序列控制下的本發(fā)明的核苷酸序列可以進一步被其他有利地影響其轉(zhuǎn)錄和/或所得轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性的序列所側(cè)翼。這樣的序列可以位于可操作連接啟動子的上游、表達構(gòu)建體3'端的下游、并且可以同時存在于啟動子的上游和表達構(gòu)建體3'端的下游。一些實施方案提供了用于降低由以植物為食的鞘翅目和/或半翅目害蟲引起的對宿主植物(例如，玉米植物)的損害的方法，其中所述方法包括在宿主植物中提供表達本發(fā)明的至少一種核酸分子的轉(zhuǎn)化植物細胞，其中所述核酸分子在被鞘翅目和/或半翅目害蟲攝取后發(fā)揮功能以抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲內(nèi)靶序列的表達，該表達抑制導(dǎo)致鞘翅目和/或半翅目害蟲的死亡、生長降低、和/或生殖降低，由此降低由鞘翅目和/或半翅目害蟲引起的對宿主植物的損害。在一些實施方案中，核酸分子包含dsRNA分子。在這些和另外的實施方案中，核酸分子包含dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超過一種與鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交的核苷酸序列。在一些實施方案中，核酸分子由一種核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交。在一些實施方案中，提供了用于提高玉米作物產(chǎn)量的方法，其中所述方法包括將本發(fā)明的至少一種核酸分子導(dǎo)入玉米植物中；栽培玉米植物以容許表達包含核酸序列的iRNA分子，其中包含所述核酸序列的iRNA分子的表達可抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲生長和/或鞘翅目和/或半翅目害蟲損害，由此降低或消除由于鞘翅目和/或半翅目害蟲侵染所致的產(chǎn)量損失。在一些實施方案中，iRNA分子是dsRNA分子。在這些和另外的實施方案中，核酸分子包含dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超過一種與鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交的核苷酸序列。在一些實施方案中，核酸分子由一種核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交。在一些實施方案中，提供了用于調(diào)控鞘翅目和/或半翅目害蟲中靶基因表達的方法，所述方法包括：用包含編碼本發(fā)明的至少一種核酸分子的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化植物細胞，其中所述核苷酸序列與啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列可操作連接；在足以容許形成包含多個轉(zhuǎn)化植物細胞的植物細胞培養(yǎng)物的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞；選擇已經(jīng)將核酸分子整合到其基因組中的轉(zhuǎn)化植物細胞；對轉(zhuǎn)化植物細胞篩選由整合的核酸分子編碼的iRNA分子的表達；選擇表達iRNA分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞；并且用選擇的轉(zhuǎn)基因植物細胞喂養(yǎng)鞘翅目和/或半翅目害蟲。也可以從表達由整合的核酸分子編碼的iRNA分子的轉(zhuǎn)化植物細胞再生植物。在一些實施方案中，iRNA分子是dsRNA分子。在這些和另外的實施方案中，核酸分子包含dsRNA分子，所述dsRNA分子各自包含超過一種與鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交的核苷酸序列。在一些實施方案中，核酸分子由一種核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交?？梢詫⒈景l(fā)明的iRNA分子作為來自摻入植物細胞基因組中的重組基因的表達產(chǎn)物、或者摻入應(yīng)用于種植前種子的包衣或種子處理中而摻入植物物種(例如，玉米)的種子之內(nèi)。包含重組基因的植物細胞被視為轉(zhuǎn)基因事件。本發(fā)明的實施方案中還包括用于將iRNA分子投送給鞘翅目和/或半翅目害蟲的遞送系統(tǒng)。例如，可以將本發(fā)明的iRNA分子直接導(dǎo)入鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中。用于導(dǎo)入的方法可以包括將iRNA與來自鞘翅目和/或半翅目害蟲宿主的植物組織直接混合，以及對宿主植物組織應(yīng)用包含本發(fā)明的iRNA分子的組合物。例如，可將iRNA分子噴霧到植物表面上?；蛘?，可以通過微生物表達iRNA分子，并且可以將微生物應(yīng)用到植物表面上，或通過物理手段諸如注射導(dǎo)入根或莖中。如上文論述的，也可以對轉(zhuǎn)基因植物進行遺傳工程改造，使其以足以殺死已知侵染植物的鞘翅目和/或半翅目害蟲的量表達至少一種iRNA分子。通過化學(xué)或酶促合成產(chǎn)生的iRNA分子也可以以符合常見農(nóng)業(yè)實踐的方式配制，并且作為噴霧產(chǎn)品使用以控制鞘翅目和/或半翅目害蟲所致的植物損害。配制劑可以包含有效的葉覆蓋需要的適當粘著劑(sticker)和濕潤劑，以及保護iRNA分子(例如，dsRNA分子)免于UV損傷的UV保護劑。這樣的添加劑通常在生物殺蟲劑產(chǎn)業(yè)中使用，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這樣的應(yīng)用可以與其他噴霧殺蟲劑應(yīng)用(基于生物學(xué)的或其他方面)組合以增強針對鞘翅目和/或半翅目害蟲的植物保護。本文中所討論的所有參考文獻，包括本文引用的出版物，專利和專利申請，均通過引用并入本文，只要與本公開的明確細節(jié)不沖突，如同單獨地和具體地明示將每篇參考文獻通過引用并入本文一樣。本文所討論的參考文獻僅為其在本申請的申請日之前的公開內(nèi)容而提供。本文中任何內(nèi)容不應(yīng)被解釋為承認發(fā)明人無權(quán)憑借在先發(fā)明而先于這些公開。提供以下實施例以展示某些具體特征和/或?qū)嵤┓桨?。這些實施例不應(yīng)被理解為將本公開限于本文中例示的具體特征或?qū)嵤┓桨浮嵤├龑嵤├?：昆蟲食料生物測定合成了若干dsRNA分子(包括對應(yīng)于Sec23reg1(SEQIDNO:3)，Sec23ver1(SEQIDNO:4)，Sec23ver2(SEQIDNO:5)，BSB_Sec23-1(SEQIDNO:82)，和BSB_Sec23-2(SEQIDNO:83)者)，并使用RNAi試劑盒純化。將純化的dsRNA分子準備在TE緩沖液中，并且所有生物測定均包含由該緩沖液組成的對照處理，用作WCR(玉米根螢葉甲)的死亡率或生長抑制的背景檢查。使用NANODROPTM8000分光光度計(THERMOSCIENTIFIC，Wilmington，DE)測量生物測定緩沖液中dsRNA分子的濃度。在使用飼喂人工昆蟲食料的成年昆蟲的生物測定中測試樣品的昆蟲活性。WCR卵獲自CROPCHARACTERISTICS，INC(Farmington，MN)。生物測定在特別為昆蟲生物測定設(shè)計的128孔塑料托盤(C-DINTERNATIONAL，Pitman，NJ)中進行。每個孔含有約1.0mL設(shè)計用于鞘翅目昆蟲生長的人工食料。通過移液管將60μL等份的dsRNA樣品遞送到每個孔的食料的表面(40μL/cm2)。dsRNA樣品濃度作為孔中每平方厘米(ng/cm2)表面積(1.5cm2)的dsRNA量來計算。將處理的托盤保持在通風(fēng)櫥中，直到食料表面上的液體蒸發(fā)或吸收到食料中。在破殼后的幾個小時內(nèi)，用濕潤的駱駝毛刷拾取幼蟲個體，并且將其放置在處理的食料(每孔一個或兩個幼蟲)上。然后用透明塑料粘合片密封128孔塑料托盤上帶蟲的孔，并通氣以允許氣體交換。將生物測定盤在受控環(huán)境條件(28℃，～40％相對濕度，16:8(光照:黑暗))下保持9天，而后記錄暴露于每個樣品的昆蟲總數(shù)、死亡的昆蟲數(shù)、和存活昆蟲的重量。計算每個處理的平均百分比死亡率和平均生長抑制。生長抑制(GI)計算如下:GI＝[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]，其中TWIT是處理中活昆蟲的總重量；TNIT是處理中的昆蟲總數(shù)；TWIBC是背景檢查中的活昆蟲的總重量(緩沖液對照)；和TNIBC是背景檢查中的昆蟲總數(shù)(緩沖液對照)。使用JMPTM軟件(SAS，Cary，NC)進行統(tǒng)計學(xué)分析。LC50(致死濃度)定義為50％的測試昆蟲被殺死時的劑量。GI50(生長抑制)定義為試驗昆蟲的平均生長(例如活體重)為在背景檢查樣品中觀察到的平均值的50％時的劑量。重復(fù)的生物測定證明，特定樣品被攝取后導(dǎo)致了玉米根蟲幼蟲和成蟲的令人驚訝且意想不到的死亡率。實施例2候選靶基因的鑒定選擇多個WCR(玉米根螢葉甲)發(fā)育期進行匯集的轉(zhuǎn)錄組分析，以提供通過RNAi轉(zhuǎn)基因植物抗蟲技術(shù)控制的候選靶基因序列。在一個范例中，從約0.9g的完整第一齡WCR幼蟲(孵化后4到5天；保持在16℃)分離總RNA，并使用下述基于苯酚/TRI-的方法(MOLECULARRESEARCHCENTER,Cincinnati,OH)進行純化：將幼蟲于室溫在具有10mL的15mL勻漿器中均質(zhì)化，直到獲得均勻的懸浮液時為止。在室溫溫育5分鐘后，將勻漿分配到1.5mL微量離心管中(每管1mL)，添加200μL氯仿，并將混合物強力振搖15秒。在室溫提取10分鐘之后，通過在4℃以12,000xg離心分離各個相。將上層相(包含約0.6mL)小心轉(zhuǎn)移到另一個無菌的1.5mL管中，并添加等體積的室溫異丙醇。在室溫溫育5到10分鐘之后，將混合物在12,000xg(4℃或25℃)離心8分鐘。將上清液小心取出并棄去，并將RNA離心沉淀通過用75％乙醇渦旋振蕩洗滌兩次，在每次洗滌后通過在7,500xg(4℃或25℃)離心5分鐘回收。小心去除乙醇，讓離心沉淀風(fēng)干3至5分鐘，然后溶解在無核酸酶的無菌水中。通過在260nm和280nm測量吸光度(A)測定RNA濃度。從約0.9g幼蟲的典型提取產(chǎn)生超過1mg的總RNA，其中A260/A280比為1.9。如此提取的RNA在80℃貯存，直到進一步加工。通過使等份跑1％瓊脂糖凝膠確定RNA質(zhì)量。在經(jīng)高溫滅菌的容器中，使用經(jīng)DEPC(焦碳酸二乙酯)處理的水稀釋的高溫滅菌的10XTAE緩沖液(Tris乙酸鹽EDTA；1X濃度為0.04MTris乙酸鹽，1mMEDTA(乙二胺四乙酸鈉鹽，pH8.0)制成瓊脂糖凝膠溶液。使用1XTAE作為運行緩沖液。在使用前，用(INVITROGENINC.,Carlsbad,CA)清潔電泳槽和造孔梳。將2μLRNA樣品與8μLTE緩沖液(10mMTrisHClpH7.0；1mMEDTA)和10μLRNA樣品緩沖液(目錄號70606；EMD4Bioscience,Gibbstown,NJ)混合。將樣品于70℃加熱3分鐘，冷卻至室溫，每孔上樣5μL(含有1μg到2μgRNA)。將市售的RNA分子量標記物在分離的孔中同時運行以進行分子大小比較。在60伏特下跑膠2小時。由服務(wù)提供商(EUROFINSMWGOperon,Huntsville,AL)利用隨機引發(fā)從幼蟲總RNA制備標準化的cDNA文庫。在EUROFINSMWGOperon通過GSFLX454TitaniumTM系列化學(xué)以1/2板的規(guī)模對標準化的幼蟲cDNA文庫進行測序，其產(chǎn)生具有平均讀段長度348bp的超過600,000個讀段。將350,000個讀段裝配成超過50,000個重疊群。使用公眾可訪問的程序F0RMATDB(可在NCBI訪問)將未裝配的讀段和重疊群兩者都轉(zhuǎn)換成可BLAST的數(shù)據(jù)庫。類似地從其他WCR發(fā)育期收獲的材料制備了總RNA和標準化的cDNA文庫。合并代表各個發(fā)育期的cDNA文庫成員，構(gòu)建了用于靶基因篩選的匯集的轉(zhuǎn)錄組文庫。使用關(guān)于特定基因在其他昆蟲(諸如果蠅、擬谷盜屬、和半翅目)中的致死RNAi效應(yīng)的信息，選擇用于RNAi靶向的候選基因。假設(shè)這些基因?qū)τ谇食崮亢?或半翅目昆蟲的存活和生長是必需的。對于選定的靶基因，在轉(zhuǎn)錄物組序列數(shù)據(jù)庫中鑒定其同源物，如下文所述。通過PCR擴增靶基因的全長或部分序列來制備用于產(chǎn)生雙鏈RNA(dsRNA)的模板。使用候選蛋白質(zhì)編碼序列針對含有未裝配的葉甲屬序列讀段或已裝配的重疊群的可BLAST數(shù)據(jù)庫進行TBLASTN搜索。對于與葉甲屬序列的顯著命中(定義為：對于重疊群同源性，好于e-20；對于未裝配的序列讀段同源性，好于e-10)，使用BLASTX針對NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫加以確認。此BLASTX搜索的結(jié)果確認，在TBLASTN搜索中鑒定的葉甲屬同源物候選基因序列確實包含葉甲屬基因，或者是針對葉甲屬序列中存在的非葉甲屬候選基因序列的最佳命中。在大多數(shù)情況下，被注釋為編碼蛋白質(zhì)的半翅目候選基因呈現(xiàn)出明確的與葉甲屬轉(zhuǎn)錄物組序列中的一種或多種序列的序列同源性。在少數(shù)情況下可明顯看出，某些基于與非葉甲屬候選基因的同源性選擇的葉甲屬重疊群或未裝配的序列讀段有重疊，而且重疊群的裝配未能連接起這些重疊。在這些情況下，使用SEQUENCHERTMv4.9(GENECODESCORPORATION,AnnArbor,MI)將序列裝配成更長的重疊群。一個編碼葉甲屬Sec23的候選靶基因(SEQIDNO:1)被鑒定為可以導(dǎo)致鞘翅目害蟲死亡、WCR中生長抑制、發(fā)育抑制、或生殖抑制的基因。與WCRSec23同源的基因Sec23是外殼蛋白復(fù)合物II(COPII)的組分，其促進從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)形成運輸囊泡。外殼有兩個主要功能，即ER膜物理變形成囊泡和貨物分子的選擇。其他也含有這個結(jié)構(gòu)域的玉米根螢葉甲蛋白可能共享結(jié)構(gòu)和/或功能性質(zhì)，因此編碼這些蛋白質(zhì)之一的基因可能包括可導(dǎo)致鞘翅目害蟲死亡、WCR中生長抑制、發(fā)育抑制、生殖抑制、或死亡的候選靶基因。SEQIDNO:1的序列是新的。該序列未提供在公共數(shù)據(jù)庫中，并且沒有在WO/2011/025860；美國專利申請?zhí)?0070124836；美國專利申請?zhí)?0090306189；美國專利申請?zhí)朥S20070050860；美國專利申請No.20100192265；或美國專利No.7,612,194中公開。葉甲屬Sec23序列(SEQIDNO:1)在某種程度上與來自熊蜂(Bombusimpatiens)(GenBank登錄號XM_003484381.1)的Sec23A樣基因的片段相關(guān)。葉甲屬Sec23氨基酸序列(SEQIDNO:2)的最接近的同系物是具有GENBANK登錄號XP_971475.1的金龜子(Triboliumcasetanum)蛋白(95％相似；在同源區(qū)域上92％相同)。英雄美洲蝽Sec23序列(SEQIDNO:81)與來自人虱(Pediculushumanus)的Sec23A樣基因的片段(GENBANK登錄號XM_002431130.1)有些相關(guān)。英雄美洲蝽SEC23氨基酸序列(SEQIDNO:91)的最接近的同系物是具有GENBANK登錄號BAN20484.1的點蜂緣蝽(Riptortuspedestris)蛋白(97％相似；在同源區(qū)域上96％相同)。Sec23dsRNA轉(zhuǎn)基因可與其他dsRNA分子組合以提供冗余的RNAi靶向和協(xié)同的RNAi效應(yīng)。表達靶向Sec23的dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米事件用于防止玉米根蟲引起的噬根性損害(rootfeedingdamage)。Sec23dsRNA轉(zhuǎn)基因提供了新的作用模式，可以用來與蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白技術(shù)在昆蟲抗性管理基因疊加(InsectResistanceManagementgenepyramid)中組合，以減緩根蟲群體對這兩種根蟲控制技術(shù)中的任一者發(fā)展抗性。利用葉甲屬候選基因，本文中稱為Sec23，的序列的全長或部分克隆來生成用于dsRNA合成的PCR擴增子。實施例3：擴增靶基因產(chǎn)生dsRNA設(shè)計引物通過PCR擴增每個靶基因的編碼區(qū)部分。參見表1。在適當?shù)那闆r下，將T7噬菌體啟動子序列(TTAATACGACTCACTATAGGGAGA；SEQIDNO:6)引入擴增的有義或反義鏈的5'端。參見表1。從WCR提取總DNA，并使用相對的引物，使用第一鏈cDNA作為模板進行PCR反應(yīng)，引物的位置可擴增天然靶基因序列的全部或部分。還從包含黃色熒光蛋白(YFP)(SEQIDNO:7；Shagin等人，(2004)Mol.Biol.Evol.21(5):841-50)編碼區(qū)的DNA克隆擴增了dsRNA。表1.用于擴增示例性Sec23靶基因和YFP陰性對照基因的編碼區(qū)部分的引物和引物對實施例4：RNAi構(gòu)建體通過PCR制備模板和dsRNA合成。圖1中顯示了一種提供特異性模板用于產(chǎn)生Sec23和GFPdsRNA的策略。使用表1中的引物對、以及從分離自WCR第一齡幼蟲的總RNA制備的第一鏈cDNA(作為PCR模板)，制備了準備在Sec23dsRNA合成中使用的模板DNA。對于每個選定的Sec23和GFP靶基因區(qū)，PCR擴增在擴增的有義和反義鏈的5'端導(dǎo)入了一個T7啟動子序列(YFP區(qū)段擴增自YFP編碼區(qū)的DNA克隆)。使用在給定基因的每個區(qū)域的有義鏈和反義鏈的5'端具有T7啟動子序列的PCR產(chǎn)物用于dsRNA產(chǎn)生。參見圖1。被特定引物對擴增的dsRNA模板序列是:SEQIDNO:3(Sec23reg1)、SEQIDNO:4(Sec23ver1)、SEQIDNO:5(Sec23ver2)、GFP(SEQID:8)、和YFP(SEQIDNO:7)。合成用于昆蟲生物測定的雙鏈RNA，并使用RNAi試劑盒遵循制造商的說明書(INVITROGEN)進行純化。使用NANODROPTM8000分光光度計(THERMOSCIENTIFIC,Wilmington,DE)測量dsRNA的濃度。植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建使用化學(xué)合成的片段(DNA2.0,MenloPark,CA)的組合以及標準分子克隆方法，組裝了包含具有Sec23(SEQIDNO:1)的區(qū)段的用于發(fā)夾形成的靶基因構(gòu)建體的入門載體((pDAB115765))。通過(在單一轉(zhuǎn)錄單位內(nèi))安排兩個拷貝的靶基因區(qū)段彼此相反取向來易化RNA初級轉(zhuǎn)錄物形成分子內(nèi)發(fā)夾，其中兩個區(qū)段相隔一個ST-LS1內(nèi)含子序列(SEQIDNO:18；Vancanneyt等人，(1990)Mol.Gen.Genet.220(2):245-50)。因此，初級mRNA轉(zhuǎn)錄物含有被內(nèi)含子序列分開的兩個Sec23基因區(qū)段，其中兩個區(qū)段互為大的反向重復(fù)序列。用玉米泛素1啟動子的拷貝(美國專利No.5,510,474)來驅(qū)動初級mRNA發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生，并用包含來自玉米過氧化物酶5基因的3'非翻譯區(qū)(ZmPer53'UTRv2；美國專利No.6,699,984)的片段來終止表達發(fā)夾RNA的基因的轉(zhuǎn)錄。入門載體pDAB117240包含Sec23發(fā)夾v1RNA構(gòu)建體(SEQIDNO:15)，其含有Sec23(SEQIDNO:1)的一個區(qū)段。入門載體pDAB117242包含Sec23發(fā)夾v2-RNA構(gòu)建體(SEQIDNO:16)，其含有不同于pDAB117240中所見的Sec23(SEQIDNO:1)區(qū)段。使用上述入門載體pDAB117240和pDAB117242與典型的二元目標載體(pDAB115765)進行標準重組反應(yīng)，分別產(chǎn)生了用于土壤桿菌介導(dǎo)的玉米胚轉(zhuǎn)化的Sec23發(fā)夾RNA表達轉(zhuǎn)化載體(pDAB117241和pDAB117243)。通過典型的二元目標載體(pDAB109805)與入門載體pDAB101670的標準重組反應(yīng)，構(gòu)建了包含表達YFP發(fā)夾dsRNA的基因的陰性對照二元載體pDAB110853。入門載體pDAB101670包含處于玉米泛素1啟動子(如上文)的表達控制之下的YFP發(fā)夾序列(SEQIDNO:17)和包含來自玉米過氧化物酶5基因(如上文)的3'非翻譯區(qū)的片段。二元目標載體pDAB109805包含處于甘蔗桿狀DNA病毒(ScBV)啟動子(Schenk等人，(1999)PlantMolec.Biol.39:1221-30)的調(diào)節(jié)之下的除草劑抗性基因(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶；AAD-1v3)(美國專利7838733(B2)，和Wright等人，(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:20240-5)。一個人工5'UTR序列定位在SCBV啟動子區(qū)段的3'端與AAD-1編碼區(qū)的起始密碼子之間，該5'UTR序列由來自玉米線條病毒(MSV)外殼蛋白基因5'UTR和來自玉米醇脫氫酶1(ADH1)基因的內(nèi)含子6的序列組成。利用一個包含玉米脂肪酶基因的3'非翻譯區(qū)(ZmLip3'UTR；美國專利No.7,179,902)的片段來終止AAD-1mRNA的轉(zhuǎn)錄。通過典型的二元目標載體(pDAB9989)與入門載體pDAB100287的標準重組反應(yīng)，構(gòu)建了另一個包含表達YFP蛋白的基因的陰性對照二元載體pDAB110556。二元目標載體pDAB9989包含處于玉米泛素1啟動子(如上文)的表達調(diào)節(jié)之下的除草劑抗性基因(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶；AAD-1v3)(如上文)和一個包含來自玉米脂肪酶基因的3'非翻譯區(qū)(ZmLip3'UTR；如上文)的片段。入門載體pDAB100287包含處于玉米泛素1啟動子(如上文)的表達控制之下的YFP編碼區(qū)(SEQIDNO:19)和一個包含來自玉米過氧化物酶5基因(如上文)的3'非翻譯區(qū)的片段。實施例5:候選靶基因的篩選在基于食料的測定中，當將設(shè)計為抑制實施例2中鑒定的靶基因序列的合成dsRNA給予至WCR時，引起了死亡和生長抑制。在這個測定中觀察到，Sec23reg1、Sec23ver1、和Sec23ver2表現(xiàn)出的效力相比于其他篩選的dsRNA大幅增加。重復(fù)的生物測定證明，對分別來源于Sec23reg1、Sec23ver1、和Sec23ver2的dsRNA制備物的攝取導(dǎo)致西方玉米根蟲幼蟲的死亡和/或生長抑制。表2和表3顯示了在WCR幼蟲暴露于這些dsRNA9天之后的基于食料的飼喂生物測定的結(jié)果，以及從黃色熒光蛋白(YFP)編碼區(qū)(SEQIDNO:7)制備的dsRNA的陰性對照樣品獲得的結(jié)果。表2.利用西方玉米根蟲幼蟲進食9天之后獲得的Sec23dsRNA食料進食測定的結(jié)果。ANOVA分析發(fā)現(xiàn)在平均百分比死亡率(％Mort.)和平均生長抑制(GI)上的顯著差異。使用Tukey--Kramer檢驗分離平均值。誤差為平均標準誤差。刮弧中的字母指明統(tǒng)計水平。不是由相同字母連接的水平是顯著不同的(P<0.05)。靶基因劑量(ng/cm2)行數(shù)平均％Mort.平均GISec23reg1500653.00±12.75(A)0.56±0.27(A)Sec23ver1500666.14±4.77(A)0.85±0.03(A)Sec23ver2500665.69±10.00(A)0.84±0.04(A)TE*01210.42±3.34(B)-0.04±0.05(B)水0128.39±2.45(B)0.08±0.03(B)YFP**500129.63±2.51(B)0.10±0.05(B)**TE＝TrisHCl(1mM)加EDTA(1mM)緩沖液，pH8。***YFP＝黃色熒光蛋白表3.Sec23dsRNA對WCR幼蟲的口服效力(ng/cm2)的總結(jié)。靶基因LC50范圍GI50范圍Sec23ver153.5633.77-88.032.541.31-4.92Sec23ver236.0622.49–58.685.772.93-11.63以前有人提出，某些葉甲屬物種基因可以用于RNAi介導(dǎo)的昆蟲控制。參見美國專利公開號2007/0124836，其公開了906個序列，以及美國專利7,612,194，其公開了9,112個序列。然而確定了，許多被提示對RNAi介導(dǎo)的昆蟲控制基因?qū)刂迫~甲屬無效。還確定了，與表明其他對于RNAi介導(dǎo)的昆蟲控制有用的基因相比，序列Sec23reg1、Sec23ver1、和Sec23ver2各自提供了令人驚奇和出乎意料的優(yōu)越的葉甲屬控制。例如，美國專利7,612,194提出，膜聯(lián)蛋白、β血影蛋白2和mtRP-L4都在RNAi介導(dǎo)的昆蟲控制中有效。SEQIDNO:20為膜聯(lián)蛋白區(qū)1(Reg1)的DNA序列，SEQIDNO:21為膜聯(lián)蛋白區(qū)2(Reg2)的DNA序列。SEQIDNO:22為β血影蛋白2區(qū)1(Reg1)的DNA序列，SEQIDNO:23為β血影蛋白2區(qū)2(Reg2)的DNA序列。SEQIDNO:24為mtRP-L4區(qū)1(Reg1)的DNA序列，并且SEQIDNO:25為mtRP-L4區(qū)2(Reg2)的DNA序列。還使用了YFP序列(SEQIDNO:7)產(chǎn)生用作陰性對照的dsRNA。分別利用上述序列通過實施例3中的方法來產(chǎn)生dsRNA。提供用于產(chǎn)生dsRNA的特異性模板的策略顯示在圖2中。使用表4中的引物對和從分離自WCR第一齡幼蟲的總RNA制備的第一鏈cDNA(作為PCR模板)，制備了準備了在dsRNA合成中使用的模板DNA。(YFP從DNA克隆擴增。)對于每個選擇的靶基因區(qū)，進行兩個單獨的PCR擴增。第一個PCR擴增在擴增的有義鏈的5'端引入T7啟動子序列。第二個反應(yīng)在反義鏈的5'端引入T7啟動子序列。然后將每個靶基因區(qū)的兩個PCR擴增片段以大致相等的量混合，并將混合物用作dsRNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄模板。參見圖2。合成雙鏈RNA，并使用RNAi試劑盒遵循制造商的說明書(INVITROGEN)進行純化。使用NANODROPTM8000分光光度計(THERMOSCIENTIFIC,Wilmington,DE)測量dsRNA的濃度。并通過上述相同的基于食料的生物測定方法測試每一種dsRNA。表4列出了用來產(chǎn)生膜聯(lián)蛋白Reg1、膜聯(lián)蛋白Reg2、β血影蛋白2Reg1、β血影蛋白2Reg2、mtRP-L4Reg1、和mtRP-L4Reg2dsRNA分子的引物的序列。在圖2描繪的方法中使用的YFP引物序列也在表4中列出。用于圖1中描述的方法的GFP引物序列也在表4中列出。表5呈現(xiàn)了WCR幼蟲在暴露于這些dsRNA分子9天之后的基于食料的飼喂生物測定的結(jié)果。重復(fù)的生物測定證明，在以上西方玉米根蟲幼蟲中，攝取這些dsRNA沒有導(dǎo)致超過TE緩沖液、水、或YFP蛋白等對照樣品中所見的死亡或生長抑制。表4.用來擴增建議的候選靶基因編碼區(qū)的多個部分的引物和引物對。表5.利用西方玉米根蟲幼蟲9天之后獲得的食料進食測定的結(jié)果。*TE＝TrisHCl(10mM)加EDTA(1mM)緩沖液，pH8。**YFP＝黃色熒光蛋白實施例6：樣品制備和用于成蟲測定的生物測定法通過將對應(yīng)于Sec23靶基因序列片段的dsRNA供給成蟲，進行西方玉米根蟲中的RNA干擾(RNAi)。試驗昆蟲是24-48小時大的成蟲。昆蟲獲自CropCharacteristics，Inc.(Farmington，MN)。成蟲在23±1℃，相對濕度>75％飼養(yǎng)，所有生物測定的光照：黑暗期為8小時:16小時。昆蟲飼養(yǎng)食料借鑒Branson和Jackson(1988，J.KansasEntomol.Soc.61：353-35)。將干成分(48g/100mL)加入到包含具有2.9％瓊脂和7mL甘油的雙蒸水的溶液中。此外，每100mL的食料中加入0.5mL的包含47％丙酸和6％磷酸溶液的混合物，用于抑制微生物生長。對于所有成蟲dsRNA進食測定，對食料加以調(diào)整以提供切取食料小段所必需的稠度。干成分以60g/100mL加入，并將瓊脂增加至3.6％。將瓊脂溶于沸水中，加入干成分、甘油和丙酸/磷酸溶液，充分混合，傾倒至約2mm的深度。用1號軟木鉆孔器從食料切下固化的食料小段(直徑約4mm，高度2mm；25.12mm3)，并用dsRNA或水處理。相對轉(zhuǎn)錄本豐度用以Sec23reg1(SEQIDNO:3)基因特異性dsRNA(500ng/食料小段；約20ng/mm3)處理過的人工食料表面小段飼養(yǎng)成蟲。對照處理為暴露于用相同濃度的GFP(綠色熒光蛋白)dsRNA(SEQIDNO:8)或相同體積的水處理的食料的成蟲。GFPdsRNA如上所述產(chǎn)生，使用在其5'端具有T7啟動子序列的相對引物(SEQIDNO:26和27)。在整個實驗過程中，每隔一天提供用dsRNA處理過的新鮮人工食料。1μg總RNA用于第一鏈cDNA合成。對Sec23reg1(SEQIDNO:9和10)和肌動蛋白引物對(SEQIDNO:79和80)進行引物效率測試，以確定qPCR分析的適合性。qPCR使用APPLIEDBIOSYSTEMS7500快速實時PCR系統(tǒng)，SYBRGreen主預(yù)混物(APPLIEDBIOSYSTEMS，GrandIsland，NY)。用WCR肌動蛋白基因作為參考基因以計算相對轉(zhuǎn)錄本豐度。三個重復(fù)(重復(fù)1，重復(fù)2和重復(fù)3)，每個重復(fù)包含三至六條成蟲，在不同日運行。在第1天和第3天提供新鮮處理的人工食料。表6顯示了在處理的人工食料攝入5天后，Sec23或GFPdsRNA或水對WCR成蟲轉(zhuǎn)錄物水平的影響。LC50測定將成蟲甲暴露于濃度為0、0.1、1、10、100或1000ng/食料小段的Sec23reg1(SEQIDNO:3)或GFP(SEQIDNO:8；Shagin等人，(2004)MolBiol.Evol.21(5)：841-50)以測定LC50值。單獨的水建立了對照死亡率。如上所述的新鮮人工食料用dsRNA處理，并且每隔一天提供直到第10天。在第10天后，用未處理的人工食料喂養(yǎng)成蟲，每隔一天提供新鮮的食料。每天記錄死亡率歷時15天。LC50使用PoloPlus軟件(LeOraSoftware，Berkeley，CA)計算。表7顯示了用于計算Sec23reg1的LC50的10倍劑量(0.1-1000ng)的百分比死亡率曲線。使用第6天的數(shù)據(jù)，LC50為44.2ng/食料小段。暴露時間使成蟲暴露于50ng/食料小段的Sec23reg1(SEQIDNO:3)或GFP(SEQIDNO:8)dsRNA，或等體積的水，歷時3、6或48小時，然后移至未處理的人工食料，以確定達到顯著死亡率的最小暴露時間。每天記錄死亡率，歷時15天。表8呈現(xiàn)了WCR成體的基于食料的進食生物測定在暴露于50ng/食料小段的Sec23reg1dsRNA、GFPdsRNA或水3、6、48小時之后的結(jié)果。表6.Sec23reg1或GFPdsRNA或水對WCR成蟲對暴露于經(jīng)處理的人工食料5天后轉(zhuǎn)錄物水平的影響。用WCR肌動蛋白基因作為參考基因以計算相對轉(zhuǎn)錄本豐度。數(shù)據(jù)是平均值加/減標準誤差。時間(小時)Sec23GFP水60.8098±0.03240.8522±0.01720.8156±0.0768240.1748±0.01230.7726±0.04930.8954±0.0993720.0530±0.00950.8781±0.07640.7611±0.02571200.0564±0.01440.7477±0.07720.7774±0.0650表7.用于計算Sec23reg1的LC50的10倍劑量(0.1-1000ng)的死亡率百分比曲線。使用第6天的數(shù)據(jù)，LC50為44.2ng/食料小段。數(shù)據(jù)是平均值的平均值加/減標準誤差。劑量第1日第2日第3日第4日第5日第6日第7日第8日00±00±00±00±00±00±00±00±00.10±00±00±00±00±00±00±00±010±00±00±00±00±00±00±00±0100±00±00±00±00±03.3±3.313.3±8.833.3±16.71000±00±00±00±00±00±036.7±1273.3±3.310000±00±00±00±010±1056.7±23.383.3±16.796.7±3.3劑量第9日第10日第11日第12日第13日第14日第15日00±00±00±00±00±00±00±00.10±00±00±00±03.3±3.33.3±3.33.3±3.310±03.3±3.36.7±6.76.7±6.76.7±6.76.7±6.76.7±6.71036.7±18.640±2043.3±16.746.7±13.346.7±13.346.7±13.346.7±13.310090±5.893.3±6.793.3±6.793.3±6.793.3±6.793.3±6.793.3±6.71000100±0100±0100±0100±0100±0100±0100±0表8.在食料喂養(yǎng)測定中暴露于50ng/食料小段的Sec23reg1或綠色熒光蛋白(GFP)dsRNA分子或水3、6或48小時后，西方玉米根蟲成蟲的平均百分死亡率。數(shù)據(jù)是平均值加/減標準誤差。日3小時6小時48小時水GFP10.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.0023.33±3.333.33±2.116.67±3.333.33±2.364.44±2.4233.33±3.333.33±2.1113.33±6.674.44±2.944.44±2.4246.67±4.225.00±3.4220.00±11.554.44±2.944.44±2.42511.67±7.4910.00±5.1623.33±8.825.56±2.947.78±4.34623.33±10.5433.33±12.8263.33±3.338.89±3.8910.00±5.53750.00±11.2563.33±12.5693.33±3.338.89±3.8911.11±5.64856.67±13.5868.33±11.6793.33±3.338.89±3.8911.11±5.64960.00±13.6675.00±11.4793.33±3.3310.00±3.7311.11±5.641063.33±12.8275.00±11.4793.33±3.3310.00±3.7311.11±5.641163.33±12.8275.00±11.4796.67±3.3310.00±3.7313.33±6.451263.33±12.8275.00±11.4796.67±3.3310.00±3.7314.44±7.091366.67±10.8575.00±11.4796.67±3.3310.00±3.7314.44±7.091466.67±10.8575.00±11.4796.67±3.3310.00±3.7315.56±7.091566.67±10.8575.00±11.4796.67±3.3310.00±3.7317.78±8.62實施例7：包含殺蟲發(fā)夾dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米組織的產(chǎn)生土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化之后，制成了通過表達穩(wěn)定地整合到植物基因組中的嵌合基因而產(chǎn)生一種或多種殺蟲dsRNA分子(例如，至少一種靶向Sec23基因的dsRNA分子)的轉(zhuǎn)基因玉米細胞、組織、和植物。采用超二元或二元轉(zhuǎn)化載體的玉米轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域中已知的，正如例如美國專利8,304,604中(在此通過提述并入其全部內(nèi)容)所描述。通過轉(zhuǎn)化的組織在含吡氟氯禾靈的培養(yǎng)基上生長的能力選擇它們，并視情況適宜篩選其dsRNA產(chǎn)生?？梢詫⒁徊糠诌@樣的轉(zhuǎn)化的組織培養(yǎng)物提供給新生玉米根蟲幼蟲以進行生物測定，基本上如實施例1中所描述。土壤桿菌培養(yǎng)啟動將包含上述(實施例4)二元轉(zhuǎn)化載體pDAB114515、pDAB115770、pDAB110853或pDAB110556的土壤桿菌菌株DAt13192細胞(WO2012/016222A2)的甘油儲劃線接種在含有適當抗生素的AB基本培養(yǎng)基平板(Watson等人，(1975)J.Bacteriol.123:255-264)上，并在20℃培養(yǎng)3天。然后將培養(yǎng)物劃線接種在含有相同抗生素的YEP平板(g/L:酵母提取物10；蛋白胨10；NaCl5)上，并在20℃溫育1天。土壤桿菌培養(yǎng)在實驗當天，以適合于實驗中的構(gòu)建體數(shù)目的體積制備接種培養(yǎng)基和乙酰丁香酮的儲液，并將其移液到無菌的一次性250mL燒瓶中。接種培養(yǎng)基(Frame等人，(2011)GeneticTransformationUsingMaizeImmatureZygoticEmbryos.收錄于PlantEmbryoCultureMethodsandProtocols:MethodsinMolecularBiology.T.A.ThorpeandE.C.Yeung,(Eds),SpringerScienceandBusinessMedia,LLC.pp327-341)含有:2.2g/LMS鹽；1XISU改良的MS維生素(Frame等人，ibid.)；68.4g/L蔗糖；36g/L葡萄糖；115mg/L脯氨酸；和100mg/L肌醇；pH為5.4)。將乙酰丁香酮以200μM的終濃度(從100％二甲亞砜中的1M儲液)添加到含有接種培養(yǎng)基的燒瓶中，并充分混合溶液。對于每種構(gòu)建體，來自YEP平板的1或2個滿接種環(huán)的土壤桿菌懸浮在一次性50mL無菌離心管內(nèi)15mL的接種培養(yǎng)基/乙酰丁香酮儲液中，在分光光度計中在550nm(OD550)處測量溶液的光密度。然后使用另外的接種培養(yǎng)基/乙酰丁香酮混合物將懸液稀釋到0.3到0.4的OD550。然后將土壤桿菌懸液的管水平放置在設(shè)置為在室溫下約75rpm的平臺搖床上，并在進行胚切開的同時振搖1到4小時。穗消毒和胚分離未成熟玉米胚從玉米近交系B104(Hallauer等人，(1997)CropScience37:1405-1406)植物獲得，所述植物在溫室中培養(yǎng)，并進行自花授粉或近親授粉以產(chǎn)生穗。在授粉后大約10到12天收獲穗。在實驗當天，將穗脫殼，并通過浸沒在20％市售漂白劑(ULTRAGermicidalBleach，6.15％次氯酸鈉；加兩滴吐溫TM20)的溶液中并振搖20到30分鐘進行表面消毒，隨后在層流罩內(nèi)在無菌去離子水中沖洗三次。從每個穗無菌切下未成熟合子胚(1.8到2.2mm長)并隨機分配到微量離心管中，每根微量離心管含有2.0mL的液體接種培養(yǎng)基中的適當土壤桿菌細胞的懸液，其中含200μM乙酰丁香酮，并添加了2μL的10％S233表面活性劑(EVONIKINDUSTRIES；Essen,Germany)。對于一套給定的實驗，每次轉(zhuǎn)化均使用來自匯集的穗的胚。土壤桿菌共培養(yǎng)在分離之后，將胚在搖動平臺上放置5分鐘。然后將管的內(nèi)容物傾倒到共培養(yǎng)基的平板上，所述培養(yǎng)基含有4.33g/LMS鹽；1XISU改良的MS維生素；30g/L蔗糖；700mg/LL--脯氨酸；在KOH中的3.3mg/L的麥草畏(3,6-二氯-o-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100mg/L肌醇(myo-inositol)；100mg/L酪蛋白酶水解物；15mg/LAgNO3；200μM溶于DMSO中的乙酰丁香酮；和3gm/LGELZANTM，pH為5.8。用無菌一次性移液管移除液態(tài)土壤桿菌懸液。然后借助于顯微鏡，使用無菌鑷子使胚定向為盾片面向朝上。蓋上平板，用3MTMMICROPORETM醫(yī)用膠帶密封，并放置在具有大約60μmolm-2s-1的光合有效輻射(PAR)的連續(xù)光照的25℃培養(yǎng)箱中。愈傷組織選擇和轉(zhuǎn)基因事件的再生在共培養(yǎng)期之后，將胚轉(zhuǎn)移到靜息培養(yǎng)基上，靜息培養(yǎng)基的組成為:4.33g/LMS鹽；1XISU改良的MS維生素；30g/L蔗糖；700mg/LL-脯氨酸；溶于KOH中的3.3mg/L的麥草畏；100mg/L肌醇；100mg/L酪蛋白酶水解物；15mg/LAgNO3；0.5g/LMES(2-(N-嗎啉代)乙磺酸一水合物；PHYTOTECHNOLOGIESLABR.；Lenexa,KS)；250mg/L羧芐青霉素；和2.3g/LGELZANTM；pH為5.8。將不超過36個胚移到每個平板上。將平板放置在透明的塑料盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1PAR的連續(xù)光照下溫育7到10天。然后將愈傷的胚轉(zhuǎn)移(<18個/板)到選擇培養(yǎng)基I上，所述培養(yǎng)基由具有100nM吡氟氯禾靈酸(R-Haloxyfopacid)(0.0362mg/L；用于選擇包含AAD-1基因的愈傷組織)的靜息培養(yǎng)基(上文)構(gòu)成。將平板返回到透明盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1PAR的連續(xù)光照下溫育7天。然后將愈傷的胚轉(zhuǎn)移(<12個/板)到選擇培養(yǎng)基II上，所述培養(yǎng)基由具有500nM吡氟氯禾靈酸(R-Haloxyfopacid)(0.181mg/L)的靜息培養(yǎng)基組成。將平板返回到透明盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1PAR的連續(xù)光照下溫育14天。這一選擇步驟允許轉(zhuǎn)基因愈傷組織進一步增殖和分化。將增殖中的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到(<9個/板)預(yù)再生培養(yǎng)基上。預(yù)再生培養(yǎng)基含有4.33g/LMS鹽；1XISU改良的MS維生素；45g/L蔗糖；350mg/LL-脯氨酸；100mg/L肌醇；50mg/L酪蛋白酶水解物；1.0mg/LAgNO3；0.25g/LMES；溶于NaOH中的0.5mg/L萘乙酸；溶于乙醇中的2.5mg/L脫落酸；1mg/L6-芐氨基嘌呤；250mg/L羧芐青霉素；2.5g/LGELZANTM；和0.181mg/L吡氟氯禾靈酸；pH為5.8。將平板保存在透明盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1PAR的連續(xù)光照下溫育7天。然后將再生中的愈傷組織轉(zhuǎn)移到(<6個/板)PHYTATRAYSTM(SIGMA-ALDRICH)中的再生培養(yǎng)基上，在28℃以每天16小時光照/8小時黑暗(以大約160μmolm-2s-1PAR)溫育14天，直到發(fā)出芽和根為止。再生培養(yǎng)基含有4.33g/LMS鹽；1XISU改良的MS維生素；60g/L蔗糖；100mg/L肌醇；125mg/L羧芐青霉素；3g/LGELLANTM膠；和0.181mg/L吡氟氯禾靈酸(R-Haloxyfopacid)；pH為5.8。然后分離具有主根的小芽，并不經(jīng)選擇直接轉(zhuǎn)移到伸長培養(yǎng)基上。伸長培養(yǎng)基含有4.33g/LMS鹽；1XISU改良的MS維生素；30g/L蔗糖；和3.5g/LGELRITETM:pH為5.8。通過它們在含有吡氟氯禾靈的培養(yǎng)基上生長的能力而選擇出轉(zhuǎn)化植物芽，將所述芽從PHYTATRAYSTM移栽到填充有生長培養(yǎng)基(PROMIXBX；PREMIERTECHHORTICULTURE)的小盆中，小盆用杯子或HUMI-DOMES(ARCOPLASTICS)覆蓋，然后在CONVIRON生長室中煉苗(27℃白天/24℃夜晚，16小時光周期，50-70％RH，200μmolm-2s-1PAR)。在一些情況下，分析推定的轉(zhuǎn)基因小植物的轉(zhuǎn)基因相對拷貝數(shù)，這使用設(shè)計用于檢測整合到玉米基因組中的AAD1除草劑耐受基因的引物通過定量實時PCR測定來完成。此外，利用RNAqPCR測定來檢測在推定的轉(zhuǎn)化體表達的dsRNA中ST-LS1內(nèi)含子序列的存在。然后將選定的轉(zhuǎn)化小植物移動到溫室中，以便進一步生長和測試。轉(zhuǎn)移T0植物和在溫室中定植以進行生物測定和產(chǎn)生種子當植物達到V3-V4期時，將其移栽到IECUSTOMBLEND(PROFILE/METROMIX160)土壤混合物中，在溫室中(光曝露類型:光或同化作用；高光限值:1200PAR；16-小時晝長；27℃白天/24℃夜晚)培植至開花。將要用于昆蟲生物測定的植物從小盆移栽到TINUSTM350-4(SPENCER-LEMAIREINDUSTRIES,Acheson,Alberta,Canada)(每每事件一個植物)。在移栽到約四天后，侵染植物以進行生物測定。通過對T0轉(zhuǎn)基因植物的穗絲授粉，其中花粉從非轉(zhuǎn)基因良種近交系B104或其他適當?shù)幕ǚ酃w采集而來，并種植所得的種子而獲得T1代植物。在可能時進行互交。實施例8:轉(zhuǎn)基因玉米組織的分子分析對在評估噬根損害的同日從溫室培植的植物采集的葉和根的樣品進行了玉米組織的分子分析(例如，RNAqPCR)。用對Per53'UTR的RNAqPCR測定結(jié)果來驗證發(fā)夾轉(zhuǎn)基因的表達。(在非轉(zhuǎn)化的玉米植物中預(yù)期會檢出低水平的Per53'UTR，因為在玉米組織中通常存在內(nèi)源Per5基因表達)。用針對表達的RNA中ST-LS1內(nèi)含子序列(為形成dsRNA發(fā)夾分子所必需)的RNAqPCR測定結(jié)果來驗證發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物的存在。測量了相對于內(nèi)源玉米基因的RNA水平的轉(zhuǎn)基因RNA表達水平。通過DNAqPCR分析檢測基因組DNA中AAD1編碼區(qū)的一部分，用來估計轉(zhuǎn)基因插入拷貝數(shù)。從培植在環(huán)境室中的植物采集樣品用于這些分析。將結(jié)果與旨在檢測單拷貝天然基因的一部分的測定法的DNAqPCR結(jié)果進行比較，并將簡單事件(具有一個或兩個轉(zhuǎn)基因拷貝)推進到溫室中的進一步研究。將結(jié)果與設(shè)計用于檢測單拷貝天然基因之一部分的測定法的DNAqPCR結(jié)果進行比較，并且將簡單事件(一個或兩個拷貝的轉(zhuǎn)基因)推進到進一步研究。另外，用旨在檢測大觀霉素抗性基因(SpecR；包含在T-DNA外部的二元載體質(zhì)粒上)的一部分的qPCR測定法來確定轉(zhuǎn)基因植物是否含有無關(guān)的整合的質(zhì)粒骨架序列。發(fā)夾RNA轉(zhuǎn)錄物表達水平:Per53'UTRqPCR通過Per53'UTR序列的實時定量PCR(qPCR)來分析愈傷組織細胞事件或轉(zhuǎn)基因植物，以確定全長發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物的相對表達水平，與內(nèi)部玉米基因(SEQIDNO:56；GENBANK登錄號BT069734)的轉(zhuǎn)錄物水平比較，所述內(nèi)部玉米基因編碼TIP41-樣蛋白(即，GENBANK登錄號AT4G34270的玉米同源物；具有74％同一性的tBLASTX得分)。使用RNAEASYTM96試劑盒(QIAGEN,Valencia,CA)分離RNA。洗脫后，根據(jù)試劑盒建議的方案進行總RNA的DNAse1處理。然后在NANODROPTM8000分光光度計(THERMOSCIENTIFIC)上將RNA定量，并將濃度歸一化為25ng/μL。大體上按照制造商推薦的方案，使用高容量cDNA合成試劑盒(INVITROGEN)制備第一鏈cDNA，反應(yīng)體積10μL，含有5μL變性RNA。略微改變該方案以包括將10μL的100μMT20VN寡核苷酸(IDT)(SEQIDNO:57；TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN，其中V是A、C、或G，N是A、C、G、或T/U)添加到隨機引物儲備預(yù)混物的1mL管中，以制備隨機引物和寡dT混合的工作儲備液。在cDNA合成后，以無核酸酶的水將樣品以1:3稀釋，并儲存在-20℃直到用于測定時為止。在LIGHTCYCLERTM480(ROCHEDIAGNOSTICS,Indianapolis,IN)上以10μL的反應(yīng)體積分別進行Per53'UTR和TIP41樣轉(zhuǎn)錄物的實時PCR測定。對于Per53'UTR測定，利用引物P5U76S(F)(SEQIDNO:58)和P5U76A(R)(SEQIDNO:59)、以及ROCHEUNIVERSALPROBETM(UPL76；目錄號4889960001；用FAM標記)進行反應(yīng)。對于TIP41-樣參考基因測定，使用引物TIPmxF(SEQIDNO:60)和TIPmxR(SEQIDNO:61)、以及標記有HEX(六氯熒光素)的探針HXTIP(SEQIDNO:62)。所有測定都包括沒有模板的陰性對照(僅有預(yù)混物)。為制備標準曲線，在源板中還包括空白(源孔中加水)，以檢查樣品交叉污染。在表9中列出了引物和探針序列。用于檢測各種轉(zhuǎn)錄物的反應(yīng)成分配方在表10中公開，PCR反應(yīng)條件概述于表11中。在465nm處激發(fā)FAM(6-羧基熒光素亞磷酰胺)熒光部分，并測量在510nm處的熒光；HEX(六氯熒光素)熒光部分的對應(yīng)值為533nm和580nm。表9.用于轉(zhuǎn)基因玉米中轉(zhuǎn)錄物水平的分子分析的多核苷酸序列。*TIP41-樣蛋白。**NAv序列無法從供應(yīng)商獲得表7.用于轉(zhuǎn)錄物檢測的PCR反應(yīng)體系。表11.用于RNAqPCR的熱循環(huán)儀條件。使用LIGHTCYCLERTM軟件v1.5，根據(jù)供應(yīng)商的推薦利用二階導(dǎo)數(shù)最大算法計算Cq值，通過相對定量分析數(shù)據(jù)。對于表達分析，使用ΔΔCt方法(即，2-(CqTARGET–CqREF))計算表達值，所述方法依賴于比較兩個靶之間的Cq值的差異，其中假定對于優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件，每個循環(huán)產(chǎn)物都加倍，基值選擇為2。發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物大小和完整性:Northern印跡測定在一些情況下，利用Northern印跡(RNA印跡)分析來確定在表達Sec23發(fā)夾dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物中Sec23發(fā)夾RNA的分子大小，從而獲得轉(zhuǎn)基因植物的另外的分子表征。所有的材料和設(shè)備在使用之前用RNAZAP(AMBION/INVITROGEN)處理。將組織樣品(100mg到500mg)采集到2mLSAFELOCKEPPENDORF管中，用配備三個鎢珠的KLECKOTM組織粉碎器(GARCIAMANUFACTURING,Visalia,CA)在1mLTRIZOL(INVITROGEN)中破碎5分鐘，然后在室溫(RT)下溫育10分鐘。任選地，將樣品在4℃在11,000rpm下離心10分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移到新鮮的2mLSAFELOCKEPPENDORF管中。在將200μL的氯仿添加到勻漿中之后，通過翻轉(zhuǎn)該管2到5分鐘進行混合，在RT下溫育10分鐘，并在4℃在12,000xg下離心15分鐘。將上層相轉(zhuǎn)移到無菌的1.5mLEPPENDORF管中，添加600μL的100％異丙醇，在RT溫育10分鐘到2小時之后，然后在4°到25℃在12,000xg下離心10分鐘。棄去上清液，用1mL的70％乙醇將RNA離心沉淀物洗滌兩次，在兩次洗滌之間，在4°到25℃在7,500xg下離心10分鐘。棄去乙醇，將離心沉淀物快速風(fēng)干3到5分鐘，然后重懸在50μL無核酸酶的水中。使用8000(THERMO-FISHER)對總RNA定量，并將樣品歸一化為5μg/10μL。然后向每個樣品中加入10μL的乙二醛(AMBION/INVITROGEN)。將5到14ng的DIGRNA標準標志物預(yù)混物(ROCHEAPPLIEDSCIENCE,Indianapolis,IN)分配并添加到等體積的乙二醛中。在50℃使樣品和標志物RNA變性45分鐘，并保存在冰上，直到上樣到在NORTHERNMAXTM10X乙二醛運行緩沖液(AMBION/INVITROGEN)中的1.25％SEAKEMGOLDTM瓊脂糖(LONZA,Allendale,NJ)凝膠上為止，通過在65伏特/30mA下電泳2小時15分鐘分離RNA。電泳之后，在2XSSC沖洗凝膠5分鐘，在凝膠DOC工作站(BIORAD,Hercules,CA)上成像，然后在RT過夜使RNA被動轉(zhuǎn)移到尼龍膜(MILLIPORE)上，其中使用10XSSC作為轉(zhuǎn)移緩沖液(由3M氯化鈉和300mM檸檬酸三鈉組成的20XSSC，pH7.0)。轉(zhuǎn)膜后，在2XSSC中沖洗膜5分鐘，通過UV使RNA與該膜交聯(lián)(AGILENT/STRATAGENE)，并使該膜在RT下干燥2天。使膜在ULTRAHYBTM緩沖液(AMBION/INVITROGEN)中預(yù)雜交1到2小時。探針由含有感興趣序列(例如，SEQIDNO:15或SEQIDNO:16的反義序列部分，視情況適宜)的PCR擴增產(chǎn)物組成，其通過ROCHEAPPLIEDSCIENCEDIG程序用地高辛配基標記。在雜交管中推薦的緩沖液中60℃的溫度下雜交過夜。雜交后，對印跡進行DIG洗滌，包裝，暴露于膠片1到30分鐘，然后將膠片顯影，所有這些都通過DIG試劑盒的供應(yīng)商推薦的方法來進行。轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)確定將大約等同于2個葉沖孔塊的玉米葉片收集在96孔的收集平板(QIAGEN)中。用配備一個不銹鋼珠的KLECKOTM組織粉碎器(GARCIAMANUFACTURING,Visalia,CA)在BIOSPRINT96TMAP1溶解緩沖液(與BIOSPRINT96TMPLANTKIT一起提供；QIAGEN)中進行組織破碎。組織浸軟之后，使用BIOSPRINT96TMPLANTKIT和BIOSPRINT96TM提取機器人以高通量形式分離基因組DNA(gDNA)。在設(shè)立qPCR反應(yīng)之前，以2:3的DNA:水稀釋基因組DNA。qPCR分析通過使用480系統(tǒng)的實時PCR，借助水解探針測定來進行轉(zhuǎn)基因檢測。使用PROBEDESIGNSOFTWARE2.0設(shè)計了要在水解探針測定中用于檢測ST-LS1內(nèi)含子序列(SEQIDNO:18)、或檢測SpecR基因(即，負載在二元載體質(zhì)粒上的大觀霉素抗性基因；SEQIDNO:74；在表12中的SPC1寡核苷酸)的一部分的寡核苷酸。此外，使用PRIMEREXPRESS軟件(APPLIEDBIOSYSTEMS)設(shè)計了要在水解探針測定中用于檢測AAD-1耐除草劑基因(SEQIDNO:68；在表12中的GAAD1寡核苷酸)的區(qū)段的寡核苷酸。表12顯示了引物和探針序列。測定用內(nèi)源玉米染色體基因(轉(zhuǎn)化酶(SEQIDNO:71；GENBANK登錄號U16123；在本文中稱為IVR1)的試劑多重化，所述基因用作內(nèi)部參考序列以確保在每個測定中都存在gDNA。為了擴增，制備了在10μL體積的多重反應(yīng)物中的1X終濃度的480PROBES母液混合物(ROCHEAPPLIEDSCIENCE)，其含有每種引物各0.4μM，以及每種探針各0.2μM(表13)。如表14中概述進行兩步擴增反應(yīng)。FAM-和HEX-標記探針的熒光團活化和發(fā)射如上文所述；花青-5(CY5)偶聯(lián)物在650nm處最大激發(fā)，并且在670nm處發(fā)最大熒光。使用擬合點算法(軟件發(fā)行版本1.5)和相對定量模塊(基于ΔΔCt方法)，根據(jù)實時PCR數(shù)據(jù)確定Cp得分(熒光信號與背景閾值雜交的點)。如前所述處理數(shù)據(jù)(上文；RNAqPCR)。表12.用于基因拷貝數(shù)確定和二元載體質(zhì)粒骨架檢測的引物和探針(具有熒光偶聯(lián)物)的序列。表13.用于基因拷貝數(shù)分析和質(zhì)粒骨架檢測的反應(yīng)成分表14.用于基因組拷貝數(shù)分析DNAqPCR的熱循環(huán)儀條件實施例9.轉(zhuǎn)基因玉米的生物測定體外昆蟲生物測定通過生物測定方法來證實在植物細胞中產(chǎn)生的本主題發(fā)明的dsRNA的生物活性。參見，例如，Baum等人，(2007)Nat.Biotechnol.25(11):1322-1326。人們能夠例如通過在受控的飼喂環(huán)境下給靶昆蟲喂食來源于產(chǎn)生殺蟲dsRNA的植物的各種植物組織或組織片來證實效力?；蛘?，從來源于產(chǎn)生殺蟲dsRNA的植物的各種植物組織制備提取物，并將提取的核酸分配在用于如以前在本文中描述的生物測定的人工食料上面。將這樣的飼喂測定的結(jié)果與類似方式進行的采用來自不產(chǎn)生殺蟲dsRNA的宿主植物的適當對照組織、或其他對照樣品的生物測定進行比較。關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米事件的昆蟲生物測定選擇從經(jīng)洗滌的卵孵化的兩條西方玉米根蟲幼蟲(1到3日齡)并將其置于生物測定托盤的每個孔中。然后將這些孔用“拉-揭”(PULLN’PEEL)護蓋(BIO-CV-16,BIO-SERV)覆蓋，并置于具有18小時/6小時光照/黑暗周期的28℃培養(yǎng)箱中。在初始侵染9日之后，評估幼蟲死亡率，其按照死亡昆蟲占的每次處理中昆蟲總數(shù)的百分比來計算。將昆蟲樣品在-20℃冷凍兩天，然后匯集來自每個處理的昆蟲幼蟲并稱重。生長抑制百分比按照實驗處理的平均重量除以兩個對照孔處理的平均重量的均值來計算。數(shù)據(jù)表示為(陰性對照的)生長抑制百分比。將超過對照平均重量的平均重量歸一化為零。溫室中的昆蟲生物測定從CROPCHARACTERISTICS(Farmington,MN)收到帶有西方玉米根蟲(WCR，玉米根螢葉甲)卵的土壤。在28℃溫育WCR卵10到11天。洗掉卵上的土壤，將卵置于0.15％瓊脂溶液中，濃度調(diào)節(jié)至每0.25mL等份大約75個到100個卵。將一份卵懸浮液加入培養(yǎng)皿中以設(shè)置孵化平板，用于監(jiān)測孵化速率。用150到200個WCR卵侵染中生長的玉米植物周圍的土壤。允許昆蟲攝食2周，在這段時間之后，對每個植物給出“根評級”。利用一個節(jié)損傷量表進行分級，大體上如Oleson等人，(2005,J.Econ.Entomol.98:1-8)所述。將通過了這個生物測定的植物移栽到5加侖的盆中供產(chǎn)生種子。用殺蟲劑處理移植物以防止進一步根蟲損害和昆蟲釋放到溫室中。將植物人工授粉以產(chǎn)生種子。保存由這些植物產(chǎn)生的種子以評估植物的T1和后續(xù)世代。溫室生物測定包括兩種陰性對照植物。轉(zhuǎn)基因陰性對照植物通過用包含設(shè)計為產(chǎn)生黃色熒光蛋白(YFP)的基因或YFP發(fā)夾dsRNA的載體轉(zhuǎn)化而生成(參見實施例4)。非轉(zhuǎn)化的陰性對照植物從品系7sh382或B104的種子培植而來。在兩個不同的日期進行生物測定，其中每一組植物材料中均包括陰性對照。表15顯示了Sec23-發(fā)夾植物的分子分析和生物測定的結(jié)果匯總?？疾炜偨Y(jié)在表15中的生物測定結(jié)果揭示了一項令人驚奇和出乎意料的觀察結(jié)果，即，大多數(shù)包含表達含有SEQIDNO:1區(qū)段(例如，如在SEQIDNO:15和SEQIDNO:16中例示的)的Sec23發(fā)夾dsRNA的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因玉米植物受到保護而免于通過喂養(yǎng)西方玉米根蟲幼蟲招致的根損害。37個被分級的事件中的二十二個具有0.5或更低的根評級。表16顯示了陰性對照植物的分子分析和生物測定的合并結(jié)果。大多數(shù)植物不具有針對WCR幼蟲喂養(yǎng)的保護，盡管34個被分級的植物中有五個具有0.75或更低的根評級。在陰性對照植物組中有時觀察到一些具有低的根評級的植物的存在，這反映出在溫室環(huán)境中進行這種類型的生物測定的可變性和困難。表15.表達Sec23-發(fā)夾的玉米植物的溫室生物測定和分子分析結(jié)果。*RTL＝針對TIP4-樣基因轉(zhuǎn)錄物水平測量的相對轉(zhuǎn)錄物水平。**NG＝由于植物尺寸小而未評級。***ND＝未進行。表16.包含轉(zhuǎn)基因的陰性對照植物和非轉(zhuǎn)化玉米植物的溫室生物測定和分子分析結(jié)果。*RTL＝針對TIP4-樣基因轉(zhuǎn)錄物水平測量的相對轉(zhuǎn)錄物水平。**NG＝由于植物尺寸小未予分級***ND＝未進行。實施例10.包含鞘翅目害蟲序列的轉(zhuǎn)基因玉米如實施例6中所述生成10個到20個轉(zhuǎn)基因T0玉米植物。獲得另外的10--20個表達針對RNAi構(gòu)建體的發(fā)夾dsRNA的T1玉米獨立品系用于玉米根蟲攻擊。發(fā)夾dsRNA按照SEQIDNO:15、SEQIDNO:16中所列出而衍生，或包含來自SEQIDNO:1的連續(xù)核苷酸。更多的發(fā)夾dsRNA衍生自例如鞘翅目害蟲序列，例如像Caf1-180(美國專利申請公開號2012/0174258)、VatpaseC(美國專利申請公開號2012/0174259)、Rho1(美國專利申請公開號2012/0174260)、VatpaseH(美國專利申請公開號2012/0198586)、PPI-87B(美國專利申請公開號2013/0091600)、RPA70(美國專利申請公開號2013/0091601)、或RPS6(美國專利申請公開號2013/0097730)。這些通過RT-PCR或其他分子分析方法得以證實。來自選定的獨立T1系的總RNA制備物在某些情況下用于RT--PCR，其中引物被設(shè)計為在每個RNAi構(gòu)建體中的發(fā)夾表達盒的ST-LS1內(nèi)含子中結(jié)合。另外，用于RNAi構(gòu)建體中每個靶基因的特異性引物在某些情況下用于擴增在植物內(nèi)siRNA產(chǎn)生所需要的預(yù)加工mRNA，并用于確認所述預(yù)加工mRNA的產(chǎn)生。對于每個靶基因的期望條帶的擴增可確認每個轉(zhuǎn)基因玉米植物中發(fā)夾RNA的表達。隨后在某些情況下利用RNA印跡雜交在獨立轉(zhuǎn)基因系中確認靶基因的dsRNA發(fā)夾加工成siRNA。而且，與靶基因具有80％以上序列同一性、具有錯配序列的RNAi分子對玉米根蟲的影響類似于與靶基因具有100％序列同一性的RNAi分子。錯配序列與天然序列的配對在同一個RNAi構(gòu)建體中形成發(fā)夾dsRNA，由此產(chǎn)生出能夠影響攝食中的鞘翅目害蟲的生長、發(fā)育和生存力的植物加工的siRNA。對應(yīng)于靶基因的dsRNA、siRNA、或miRNA的植物內(nèi)遞送以及被鞘翅目害蟲進食后的攝取，導(dǎo)致鞘翅目害蟲中的靶基因由于RNA介導(dǎo)的基因沉默而下調(diào)。當靶基因在發(fā)育的一個或多個階段發(fā)揮重要作用的時候，鞘翅目害蟲的生長、發(fā)育和生殖受到影響，而且在WCR、NCR、SCR、MCR、玉米根螢葉甲、D.u.tenella、和D.u.undecimpunctataMannerheim的至少一者的情況下，會導(dǎo)致鞘翅目害蟲無法成功侵染、攝食、發(fā)育、和/或生殖，或?qū)е缕渌劳觥Ｈ缓笸ㄟ^靶基因的選擇和RNAi的成功應(yīng)用來控制鞘翅目害蟲。轉(zhuǎn)基因RNAi品系和非轉(zhuǎn)化玉米的表型比較選用于創(chuàng)建發(fā)夾dsRNA的靶鞘翅目害蟲基因或序列與任何已知的植物基因序列都沒有相似性。因此不期望靶向這些鞘翅目害蟲基因或序列的構(gòu)建體的(系統(tǒng)性)RNAi的產(chǎn)生或活化對轉(zhuǎn)基因植物會有任何有害影響。然而，將轉(zhuǎn)基因系的發(fā)育和形態(tài)特征與非轉(zhuǎn)化植物、以及用沒有發(fā)夾表達基因的“無效”(null)載體轉(zhuǎn)化的那些轉(zhuǎn)基因系進行比較。比較了植物根、芽、葉和生殖特征。轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)化植物在根長和生長模式上沒有可觀察到的差異。植物地上部特征，諸如高度、葉數(shù)和大小、開花時間、花大小和外觀之類，是相似的?？偟膩碚f，在體外以及在溫室土壤中培養(yǎng)時，在轉(zhuǎn)基因系和沒有表達靶iRNA分子的那些品系之間沒有可觀察的形態(tài)差異。實施例11.包含鞘翅目害蟲序列和另外的RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因玉蜀黍轉(zhuǎn)基因玉米植物在其基因組中包含異源編碼序列，所述異源編碼序列被轉(zhuǎn)錄成靶向鞘翅目害蟲之外的生物的iRNA分子，對這樣的轉(zhuǎn)基因植物通過土壤桿菌或WHISKERSTM方法(參見Petolino和Arnold(2009)MethodsMol.Biol.526:59-67)進行二次轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生一種或多種殺蟲dsRNA分子(例如，至少一種dsRNA分子，包括靶向Sec23基因，例如包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:81的Sec23基因的dsRNA分子)?；旧先鐚嵤├?中所述制備植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體，經(jīng)由土壤桿菌或WHISKERSTM-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法遞送到獲自轉(zhuǎn)基因HiII或B104玉米植物的玉米懸浮細胞或未成熟玉米胚中，所述玉米植物在其基因組中包含異源編碼序列，所述異源編碼序列被轉(zhuǎn)錄成靶向鞘翅目害蟲之外的生物的iRNA分子。實施例12.包含RNAi構(gòu)建體和另外的鞘翅目害蟲控制序列的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)基因玉米植物在其基因組中包含被轉(zhuǎn)錄成靶向鞘翅目害蟲生物的iRNA分子的異源編碼序列(例如，至少一種dsRNA分子，包括靶向Sec23基因，例如包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:81的Sec23基因的dsRNA分子)，對于這樣的轉(zhuǎn)基因玉米植物，通過土壤桿菌或WHISKERSTM方法(參見Petolino和Arnold(2009)MethodsMol.Biol.526:59-67)進行二次轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生一種或多種殺蟲蛋白分子，例如，Cry3、Cry34和Cry35殺蟲蛋白。基本上如實施例4中所述制備植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體，經(jīng)由土壤桿菌或WHISKERSTM-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法遞送到獲自轉(zhuǎn)基因B104玉米植物的玉米懸浮細胞或未成熟玉米胚中，所述玉米植物在其基因組中包含被轉(zhuǎn)錄成靶向鞘翅目害蟲生物的iRNA分子的異源編碼序列。獲得產(chǎn)生用于控制鞘翅目害蟲的iRNA分子和殺蟲蛋白的雙重轉(zhuǎn)化植物。實施例13.在Sec23RNAi注射之后的新熱帶區(qū)布朗椿象(英雄美洲蝽)的死亡率昆蟲飼養(yǎng)用如下制備的BSB人工食料(在制備好的兩周內(nèi)使用)飼養(yǎng)新熱帶區(qū)布朗椿象(BSB；英雄美洲蝽)。在MAGIC混合器中將凍干綠豆混合成細粉，同時在另一臺MAGIC混合器中將生(有機)花生混合。在大的MAGIC混合器中合并混合的干成分(重量百分比:綠豆35％；花生35％；蔗糖5％；維生素復(fù)合物(例如用于昆蟲的Vanderzant維生素混合物，SIGMA-ALDRICH,目錄號V1007)0.9％)，加蓋并充分振搖以將這些成分混合。然后將混合的干成分添加到混合碗。在另一容器中，將水和苯菌靈抗真菌劑(50ppm；25μL20,000ppm溶液/50mL食料液)充分混合，然后添加到干成分混合物中。人工混合所有成分，直到溶液完全混合時為止。將食料成形為期望的大小，松散地包裝在鋁箔中，在60℃加熱4小時，然后冷卻，在室溫儲存。熱帶區(qū)布朗椿象(BSB；英雄美洲蝽)集落BSB在27℃的培養(yǎng)箱中，在65％相對濕度，16:8小時光照:黑暗循環(huán)下飼；養(yǎng)。將經(jīng)歷2-3天收集的1克卵接種在底部具有濾紙盤的5L容器中；用#18目網(wǎng)覆蓋容器以便通風(fēng)。每個飼養(yǎng)容器產(chǎn)生約300-400條BSB成蟲。在所有階段，昆蟲每周喂食新鮮青豆三次，每周更換一次裝有向日葵種子、大豆和花生(重量比3:1:1)的種子混合物的小袋。在小瓶中補充水，用棉塞作為捻子。在最初的兩周后，每周一次將昆蟲轉(zhuǎn)移到新的容器中。RNAi靶選擇選擇六個BSB發(fā)育期用于mRNA文庫制備。從冷凍在-70℃的昆蟲提取總RNA，并將其在-24設(shè)備(MPBIOMEDICALS)上的溶解MATRIXA2mL管(MPBIOMEDICALS,SantaAna,CA)中的10倍體積的溶解/結(jié)合緩沖液中均質(zhì)化。使用mirVanaTMmiRNA分離試劑盒(AMBION；INVITROGEN)根據(jù)制造商的方案提取總mRNA。使用HiSeqTM系統(tǒng)(SanDiego,CA)的RNA測序提供了用于在RNAi昆蟲控制技術(shù)中使用的候選靶基因序列。HiSeqTM生成針對六個樣品的總共約3.78億個讀段。使用TRINITY匯編程序軟件(Grabherr等人，(2011)NatureBiotech.29:644-652)針對每個樣品將讀段逐一匯編。合并匯編的轉(zhuǎn)錄物以生成匯集的轉(zhuǎn)錄組。這個BSB匯集的轉(zhuǎn)錄組含有378,457個序列。BSBSec23直系同源物鑒定使用查詢序列果蠅屬SEC23直向同源物(釀酒酵母)蛋白Sec23-PE(GENBANK登錄號NP_001246932)進行BSB匯集的轉(zhuǎn)錄組的tBLASTn搜索。BSBSec23(SEQIDNO:81)被鑒定為英雄美洲蝽候選靶基因。模板制備和dsRNA合成使用試劑(LIFETECHNOLOGIES)，從提取自單一年輕成蟲(約90mg)的總BSBRNA制備cDNA。使用微量管研磨棒(pelletpestle)(FISHERBRAND目錄號12-141-363)和研磨棒混合器(PestleMotorMixer)(COLEPARMER,VernonHills,IL)，在裝有200μL的的1.5mL微量離心管中將昆蟲均質(zhì)化。均質(zhì)化之后，再添加800μL的使勻漿渦旋，然后在室溫下溫育五分鐘。通過離心去除細胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移到新的管中。按照制造商推薦的提取方案，將RNA離心沉淀在室溫下干燥，并重懸于來自GFXPCRDNAANDGELEXTRACTIONKIT(IllustraTM；GEHEALTHCARELIFESCIENCES)的200μLTris緩沖液中，使用洗脫緩沖液類型4(即10mMTris-HCl，pH8.0)。使用NANODROPTM8000分光光度計(THERMOSCIENTIFIC，Wilmington，DE)測定RNA濃度。添加200μL的氯仿，將混合物渦旋15秒。在室溫下讓提取物靜置2-3分鐘之后，通過在4℃以12,000xg離心15分鐘分離各個相。將上層水相小心轉(zhuǎn)移到另一個無核酸酶的1.5mL微量離心管中，并用500μL的室溫異丙醇使RNA沉淀。在室溫下溫育十分鐘之后，如上文所述將混合物離心10分鐘。RNA離心沉淀用1mL的室溫的75％乙醇沖洗，如上文所述另外離心10分鐘。將RNA離心沉淀在室溫下干燥，并使用洗脫緩沖液4型(即，10mMTris-HCl，pH8.0)重懸在來自GFXPCRDNAANDGELEXTRACTIONKIT(IllustraTM；GEHEALTHCARELIFESCIENCES)的200μL的Tris緩沖液中。使用NANODROPTM8000分光光度計(THERMOSCIENTIFIC,Wilmington,DE)確定RNA濃度。使用針對RT-PCR的SUPERSCRIPTIIIFIRST-STRANDSYNTHESISSYSTEMTM(INVITROGEN)，根據(jù)供應(yīng)商的推薦方案，從5μg的BSB總RNA模板和寡dT引物反向轉(zhuǎn)錄而成cDNA。用無核酸酶的水將轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的終體積調(diào)節(jié)為100μL。使用引物BSB_Sec23-1-For(SEQIDNO:84)和BSB_Sec23-1-Rev(SEQIDNO:85)以擴增BSB_Sec23-1(SEQIDNO:82)模板；使用引物BSB_Sec23-2-For(SEQIDNO:86)和BSB_Sec23-2-Rev(SEQIDNO:87)以擴增BSB_Sec23-2(SEQIDNO:83)模板，進行觸地(touch-down)PCR(退火溫度從60溫降至50溫，以10溫循環(huán)降低)，用1μ用降低從)(上文)作為模板。在35個循環(huán)的PCR中還產(chǎn)生了包含Sec23的488bp和498bp區(qū)段的片段，分別為：BSB_Sec23區(qū)域1(也稱為BSB_Sec23-1(SEQIDNO:82))，和BSB_Sec23區(qū)域2(也稱為BSB_Sec23-2(SEQIDNO:83))。上述程序也被用于使用YFPv2-F(SEQIDNO:89)和YFPv2-R(SEQIDNO:90)引物擴增301bp陰性對照模板YFPv2(SEQIDNO:88)。BSB_Sec23和YFPv2引物在其5'端含有T7噬菌體啟動子序列(SEQIDNO:6)，因此使得YFPv2、BSB_Sec23-1和BSB_Sec23-2DNA片段能夠用于dsRNA轉(zhuǎn)錄。利用MEGAscriptTMRNAi試劑盒(AMBION)，根據(jù)制造商的說明，使用2μL的PCR產(chǎn)物(上文)作為模板合成dsRNA。(參見圖1)。在8000分光光度計上將dsRNA定量并在無核酸酶的0.1XTE緩沖液(1mMTrisHCL，0.1mMEDTA，pH7.4)中稀釋到500ng/μL。dsRNA注射到BSB血腔中在27℃培養(yǎng)箱中，在65％相對濕度和16:8小時的光:暗光周期下，用人工食料(上文)喂養(yǎng)BSB。用小刷子輕輕操作第二齡若蟲(每只重1到1.5mg)以防損傷，并將它們置于冰上培養(yǎng)皿中，以使昆蟲預(yù)冷和固定。給每只昆蟲注射55.2nL的500ng/μLdsRNA溶液(即，27.6ngdsRNA；18.4到27.6μg/g體重的劑量)。注射使用配備有從Drummond3.5英寸#3-000＝203-G/X玻璃毛細管拉制而成的注射針的NANOJECTTMII注入器(DRUMMONDSCIENTIFIC,Broomhall,PA)。將針尖打破，用輕礦油裝填毛細管，然后充填2到3μL的dsRNA。將dsRNA注射到若蟲的腹部(每次試驗每dsRNA注射10個昆蟲)，在不同的三天重復(fù)試驗。經(jīng)過注射的昆蟲(每孔5個)被轉(zhuǎn)移到含有一團人工BSB食料并覆蓋有Pull-N-PeelTM蓋片(BIO-CV-4；BIO-SERV)的32孔托盤(Bio-RT-32RearingTray；BIO-SERV,Frenchtown,NJ)中。借助于帶有棉花芯的裝有1.25mL水的1.5mL微量離心管提供水分。將這些托盤在26.5℃、60％濕度和16:8光:暗光周期下溫育。在注射之后7天，獲取生存力計數(shù)和重量。注射鑒定的BSBSec23作為致死性dsRNA靶與YFP編碼區(qū)，YFPv2(如實施例2中制備)同源的dsRNA用作BSB注射實驗中的陰性對照。如表17中總結(jié)的，將27.6ng的BSB_Sec23reg1或BSB_Sec23-2dsRNA注射到第二齡BSB若蟲的血腔中，在七天內(nèi)產(chǎn)生了高死亡率。由BSB_Sec23reg1和BSB_Sec23-2二者的dsRNA引起的死亡率與用相同量的注射的YFPv2dsRNA(陰性對照)所見到的相比均顯著不同，p值分別＝0.0003127和0.0005874(Student'st-檢驗)。表17.BSB_Sec23reg1或BSB_Sec23reg1dsRNA注射到第二齡布朗椿象若蟲的血腔中注射七天之后的結(jié)果。*每種dsRNA每次試驗注射10只昆蟲實施例14.包含半翅目害蟲序列的轉(zhuǎn)基因玉米如實施例7中所述，生成10到20個包含表達載體的轉(zhuǎn)基因T0玉米植物，所述表達載體含有SEQIDNO:81、SEQIDNO:82和/或SEQIDNO83的核酸。獲得另外的10-20個T1玉米獨立系，其表達針對RNAi構(gòu)建體的發(fā)夾dsRNA，用于BSB攻擊。獲得的發(fā)夾dsRNA如SEQIDNO:82和/或SEQIDNO:83中所示，或者進一步包含Sec23基因的連續(xù)核苷酸，例如SEQIDNO:81。這些通過RT--PCR或其他分子分析方法得以證實。在某些情況下用選定的獨立T1系的總RNA制備物進行RT-PCR，其中引物設(shè)計為結(jié)合每個RNAi構(gòu)建體中的發(fā)夾表達盒的ST-LS1內(nèi)含子中。另外，在某些情況下用針對RNAi構(gòu)建體中每個靶基因的特異性引物進行擴增，并且在植物體內(nèi)確認產(chǎn)生siRNA所需要的預(yù)加工mRNA的產(chǎn)生。每個靶基因的各期望條帶的擴增可確認每個轉(zhuǎn)基因玉米植物中發(fā)夾RNA的表達。在某些情況下隨后在獨立轉(zhuǎn)基因系中利用RNA印跡雜交來確認靶基因的dsRNA發(fā)夾加工成siRNA。而且，與靶基因具有80％以上序列同一性的具有錯配序列的RNAi分子以類似于與靶基因具有100％序列同一性的RNAi分子所見的方式影響玉米根蟲。錯配序列與天然序列的配對在同一個RNAi構(gòu)建體中形成發(fā)夾dsRNA，從而投放出能夠影響攝食的半翅目害蟲的生長、發(fā)育和生存力的植物加工的siRNA。在植物內(nèi)投放對應(yīng)于靶基因的dsRNA、siRNA、shRNA、或miRNA，隨后被半翅目害蟲通過攝食而攝取，結(jié)果導(dǎo)致半翅目害蟲中的靶基因由于RNA介導(dǎo)基因沉默作用而下調(diào)。當靶基因在所影響的半翅目害蟲的發(fā)育、生長、發(fā)育和生殖的一個或多個階段中發(fā)揮重要功能時，并且在英雄美洲蝽、蓋德擬壁蝽、茶翅蝽、稻綠蝽、擬綠蝽、和褐臭蝽中至少一者的情況下，可導(dǎo)致半翅目害蟲無法成功侵染、進食、發(fā)育、和/或生殖，或?qū)е缕渌劳?。然后選定的靶基因的和RNAi的成功應(yīng)用可用來控制半翅目害蟲。轉(zhuǎn)基因RNAi系和非轉(zhuǎn)化玉米的表型比較選用于創(chuàng)建發(fā)夾dsRNA的靶半翅目害蟲基因或序列與任何已知的植物基因序列都沒有相似性。因此可以預(yù)期，靶向這些半翅目害蟲基因或序列的構(gòu)建體的(系統(tǒng)性)RNAi的產(chǎn)生或者激活不會對轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生任何有害影響。盡管如此，將轉(zhuǎn)基因系的發(fā)育和形態(tài)特征與非轉(zhuǎn)化植物、以及用沒有發(fā)夾表達基因的“空”載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因系進行比較。比較植物根、芽、葉和生殖特征。轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)化植物在根長和生長模式上沒有可觀察到的差異。諸如高度、葉數(shù)和大小、開花時間、花大小和外觀之類的植物地上部特征是相似的?？偟膩碚f，在體外以及在溫室土壤中培養(yǎng)時，在轉(zhuǎn)基因品系和沒有表達靶iRNA分子的品系之間沒有可觀察到的形態(tài)差異。實施例15包含半翅目害蟲序列的轉(zhuǎn)基因大豆生成10到20個包含表達載體的轉(zhuǎn)基因T0大豆植物，所述表達載體含有SEQIDNO:81、SEQIDNO:82和/或SEQIDNO:83的核酸，所述植物按照本領(lǐng)域已知的方式生成，例如通過如下所述的土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。用氯氣將成熟大豆(Glycinemax)種子消毒十六小時過夜。用氯氣消毒之后，將種子置于LAMINARTM層流罩內(nèi)的開放容器中以驅(qū)散氯氣。接著，使用黑盒，在黑暗中24℃下使消毒過的種子吸收無菌H2O十六小時。分割種子大豆的制備.包含部分胚軸的大豆種子分割方案需要制備縱向切開的大豆種子材料，縱向切開使用固定在解剖刀上的10號刀片，沿著種子的種臍分離并去除種皮，并將種子分開為兩個子葉部分。小心地移除部分胚軸，其中約1/2-1/3的胚軸仍然附著在子葉的節(jié)端。接種然后將包含部分胚軸的分割大豆種子在根癌土壤桿菌(例如，菌株EHA101或EHA105)溶液中浸沒約30分鐘，根癌土壤桿菌攜帶包含SEQIDNO:81、SEQIDNO:82和/或SEQIDNO:83的二元質(zhì)粒。在浸入帶胚軸的子葉之前，將根癌土壤桿菌溶液稀釋到λ＝0.6OD650的終濃度。共培養(yǎng)接種后，將分割的大豆種子與根癌土壤桿菌菌株在共培養(yǎng)基(Wang,Kan.AgrobacteriumProtocols.2.1.NewJersey:HumanaPress,2006.Print.)上共培養(yǎng)5天，共培養(yǎng)基置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿用一片濾紙覆蓋。芽誘導(dǎo)在共培養(yǎng)5天之后，將分割的大豆種子在含有B5鹽、B5維生素、28mg/L二價鐵、38mg/LNa2EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/LMES、1.11mg/LBAP、100mg/LTIMENTINTM、200mg/L頭孢噻肟、和50mg/L萬古霉素的液體芽誘導(dǎo)(SI)(pH5.7)培養(yǎng)基中洗滌。然后將分割的大豆種子在含有B5鹽、B5維生素、7g/LNoble瓊脂、28mg/L二價鐵、38mg/LNa2EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/LMES、1.11mg/LBAP、50mg/LTIMENTINTM、200mg/L頭孢噻肟、50mg/L萬古霉素的芽誘導(dǎo)I(SII)培養(yǎng)基(pH5.7)上培養(yǎng)，其中子葉的平坦一側(cè)向上，而子葉的節(jié)端埋入培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)2周之后，將來自轉(zhuǎn)化的分割大豆種子的外植體轉(zhuǎn)移到芽誘導(dǎo)II(SIII)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有補充了6mg/L草丁膦的SII培養(yǎng)基。芽伸長在SIII培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周之后，將子葉從外植體移除，通過在子葉的基部做切口切下含有胚軸的齊平的(flush)芽墊。將分離自子葉的芽墊轉(zhuǎn)移到芽伸長(SE)培養(yǎng)基上。該SE培養(yǎng)基含有MS鹽、28mg/L二價鐵、38mg/LNa2EDTA、30g/L蔗糖和0.6g/LMES、50mg/L天冬酰胺、100mg/LL--焦谷氨酸、0.1mg/LIAA、0.5mg/LGA3、1mg/L玉米素核苷、50mg/LTIMENTINTM、200mg/L頭孢噻肟、50mg/L萬古霉素、6mg/L草丁膦、7g/LNoble瓊脂，(pH5.7)。每2周將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮的SE培養(yǎng)基上。培養(yǎng)物在CONVIRONTM生長室中在24℃下培養(yǎng)，使用18h光周期，光強為80-90μmol/m2sec。生根對于從子葉芽墊發(fā)出的伸長芽，通過在子葉芽墊基部切割伸長芽加以分離，并將伸長芽浸入1mg/LIBA(吲哚-3-丁酸)中1-3分鐘促進生根。接著，將伸長芽轉(zhuǎn)移到Phyta托盤中的生根培養(yǎng)基(MS鹽、B5維生素、28mg/L二價鐵、38mg/LNa2EDTA、20g/L蔗糖和0.59g/LMES、50mg/L天冬酰胺、100mg/LL-焦谷氨酸、7g/LNoble瓊脂，pH5.6)中。栽培在CONVIRONTM生長室24℃、18h光周期培養(yǎng)1-2周之后，將已經(jīng)生根的芽轉(zhuǎn)移到帶蓋的圣代杯內(nèi)的土壤混合物中，放到CONVIRONTM生長室(型號CMP4030和CMP3244,ControlledEnvironmentsLimited,Winnipeg,Manitoba,Canada)內(nèi)，置于長的白晝條件下(16小時光照/8小時黑暗)，光強度為120-150μmol/m2sec，溫度(22℃)和濕度(40-50％)恒定，以馴化小植物。生根的小植物在圣代杯中馴化數(shù)周之后，轉(zhuǎn)移到溫室中進行進一步的馴化并定植強健的轉(zhuǎn)基因大豆植物。獲得另外的10-20個表達針對RNAi構(gòu)建體的發(fā)夾dsRNA的T1大豆獨立系用于BSB攻擊。衍生的發(fā)夾dsRNA可以如SEQIDNO:82、SEQIDNO:83所示，或者可包含來自Sec23基因的連續(xù)核苷酸，例如SEQIDNO:81。這些通過RT-PCR或其他分子分析方法加以確認。在某些情況下用來自選擇的獨立T1系的總RNA制備物進行RT-PCR，其中引物設(shè)計為結(jié)合每個RNAi構(gòu)建體中的發(fā)夾表達盒中的ST-LS1內(nèi)含子。另外，在某些情況下用針對RNAi構(gòu)建體中每個靶基因的特異性引物進行擴增，并且在植物體內(nèi)確認產(chǎn)生siRNA所需要的預(yù)加工mRNA的產(chǎn)生。每個靶基因的各期望條帶的擴增可確認每個轉(zhuǎn)基因玉米植物中發(fā)夾RNA的表達。在某些情況下隨后在獨立轉(zhuǎn)基因系中利用RNA印跡雜交來確認靶基因的dsRNA發(fā)夾加工成siRNA。而且，與靶基因具有80％以上序列同一性的具有錯配序列的RNAi分子以類似于與靶基因具有100％序列同一性的RNAi分子所見的方式影響玉米根蟲。錯配序列與天然序列的配對在同一個RNAi構(gòu)建體中形成發(fā)夾dsRNA，從而投放出能夠影響攝食的半翅目害蟲的生長、發(fā)育和生存力的植物加工的siRNA。在植物內(nèi)投放對應(yīng)于靶基因的dsRNA、siRNA、shRNA、或miRNA，隨后被半翅目害蟲通過攝食而攝取，結(jié)果導(dǎo)致半翅目害蟲中的靶基因由于RNA介導(dǎo)基因沉默作用而下調(diào)。當靶基因在所影響的半翅目害蟲的發(fā)育、生長、發(fā)育和生殖的一個或多個階段中發(fā)揮重要功能時，并且在英雄美洲蝽、蓋德擬壁蝽、茶翅蝽、稻綠蝽、擬綠蝽、和褐臭蝽中至少一者的情況下，可導(dǎo)致半翅目害蟲無法成功侵染、進食、發(fā)育、和/或生殖，或?qū)е缕渌劳?。然后選定的靶基因的和RNAi的成功應(yīng)用可用來控制半翅目害蟲。轉(zhuǎn)基因RNAi系和非轉(zhuǎn)化玉米的表型比較選用于創(chuàng)建發(fā)夾dsRNA的靶半翅目害蟲基因或序列與任何已知的植物基因序列都沒有相似性。因此可以預(yù)期，靶向這些半翅目害蟲基因或序列的構(gòu)建體的(系統(tǒng)性)RNAi的產(chǎn)生或者激活不會對轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生任何有害影響。盡管如此，將轉(zhuǎn)基因系的發(fā)育和形態(tài)特征與非轉(zhuǎn)化植物、以及用沒有發(fā)夾表達基因的“空”載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因系進行比較。比較植物根、芽、葉和生殖特征。轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)化植物在根長和生長模式上沒有可觀察到的差異。諸如高度、葉數(shù)和大小、開花時間、花大小和外觀之類的植物地上部特征是相似的。總的來說，在體外以及在溫室土壤中培養(yǎng)時，在轉(zhuǎn)基因品系和沒有表達靶iRNA分子的品系之間沒有可觀察到的形態(tài)差異。實施例16.人工飲食的英雄美洲蝽生物測定在使用人工食料的dsRNA飼喂測定中，與注射實驗(實施例13)相同，設(shè)置具有一顆約18mg的人工飼料小丸和水的32孔托盤。將濃度為200ng/μL的dsRNA加入到食物小丸和水樣品中，向兩個孔中的每一個加入100μL。向每個孔中加入5只第2齡的英雄美洲蝽若蟲。以水樣品和靶向YFP轉(zhuǎn)錄物的dsRNA作為陰性對照。在三個不同的日期重復(fù)實驗。稱重存活的昆蟲，并在處理8天后測定死亡率。實施例17.包含半翅目害蟲序列的轉(zhuǎn)基因擬南芥使用與實施例4相似的標準分子方法產(chǎn)生包含用于發(fā)夾形成的靶基因構(gòu)建體的擬南芥轉(zhuǎn)化載體，所述構(gòu)建體包含Sec23(SEQIDNO:81)的區(qū)段。使用標準的基于土壤桿菌的方法進行擬南芥轉(zhuǎn)化。用草銨膦耐受性選擇標志物選擇T1種子。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因T1擬南芥植物，并產(chǎn)生純合的單拷貝T2轉(zhuǎn)基因植物用于昆蟲研究。對具有花序的生長中的擬南芥植物進行生物測定。將五至十只昆蟲放置在每株植物上，并在14天內(nèi)監(jiān)測存活。擬南芥轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建使用化學(xué)合成的片段(DNA2.0，MenloPark，CA)的組合，以及標準的分子克隆方法，組裝基于入門載體pDAB3916的入門克隆，這些入門克隆包含用于發(fā)夾形成的靶基因構(gòu)建體，靶基因構(gòu)建體包含Sec23的區(qū)段(例如，SEQIDNO:81)。通過將靶基因區(qū)段的兩個拷貝以相反方向排列(在單個轉(zhuǎn)錄單元內(nèi))，兩個區(qū)段被ST-LS1內(nèi)含子序列(SEQIDNO:18)(Vancanneytetal.(1990)Mol.Gen.Genet.220(2)：245-50)所分隔，可以易化RNA初級轉(zhuǎn)錄物的分子內(nèi)發(fā)夾形成。因此，初級mRNA轉(zhuǎn)錄物包含兩個Sec23基因區(qū)段序列，它們彼此作為對方的大反向重復(fù)序列，由內(nèi)含子序列分隔開。使用一個擬南芥泛素10啟動子的拷貝(Callisetal.(1990)J.BiologicalChem.265：12486-12493)來驅(qū)動初級mRNA發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生，并且使用包含來自根癌土壤桿菌的開放閱讀框23(AtuORF233'UTRv1；美國專利號5,428,147)的3'非翻譯區(qū)的片段來終止表達發(fā)夾RNA的基因的轉(zhuǎn)錄。將上述入門載體pDAB3916內(nèi)的發(fā)夾克隆用于標準重組反應(yīng)，使用典型的二元目的載體pDAB101836，以產(chǎn)生用于土壤桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化的發(fā)夾RNA表達轉(zhuǎn)化載體。二元目的載體pDAB101836包含在木薯葉脈花葉病毒啟動子(CsVMVPromoterv2，美國專利號US7601885；Verdaguer等人)控制下的除草劑耐受基因DSM-2v2(美國專利公開號2011/0107455)(1996)PlantMol.Biol.31：1129-1139)。使用包含來自根癌土壤桿菌開放閱讀框1的3'非翻譯區(qū)(AtuORF13'UTRv6；Huang等人(1990)J.Bacteriol，172：1814-1822)的片段來終止DSM2v2mRNA的轉(zhuǎn)錄。通過標準重組反應(yīng)用典型的二元目的載體(pDAB101836)和入門載體pDAB3916構(gòu)建包含表達YFP發(fā)夾RNA的基因的陰性對照二元構(gòu)建體pDAB114507。入門構(gòu)建體pDAB112644包含在擬南芥泛素10啟動子(如上)的表達控制下的YFP發(fā)夾序列(hpYFPv2-1，SEQIDNO:92)和包含來自根癌土壤桿菌的ORF233'非翻譯區(qū)的片段(如上所述)。包含殺蟲發(fā)夾RNA的轉(zhuǎn)基因擬南芥的產(chǎn)生：土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將含有發(fā)夾序列的二元質(zhì)粒電穿孔到土壤桿菌菌株GV3101(pMP90RK)中。通過重組土壤桿菌菌落的質(zhì)粒制備物的限制性分析確認重組土壤桿菌克隆。使用QIAGENPlasmidMaxKit(QIAGEN，Cat#12162)根據(jù)制造商推薦的方案從土壤桿菌培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒。擬南芥轉(zhuǎn)化和T1選擇將12至15株擬南芥植物(Columbia栽培種)在溫室中的4”盆中生長，光強度為250μ50長，m2，250和18:6小時光照:黑暗條件。轉(zhuǎn)化前一周修剪主花莖。通過將10μL重組土壤桿菌甘油儲在28土、225rpm振蕩下在100mLLB肉湯(SigmaL3022)+100mg/L壯觀霉素+50mg/L卡那霉素中溫育72小時來制備土壤桿菌接種物。收獲土壤桿菌細胞，并將其懸浮于5％蔗糖+0.04％Silwet-L77(LehleSeedsCat#VIS-02)+10-02L苯甲氨基嘌呤(BA)溶液中至OD6000.8～1.0，然后浸花。將植株的地上部分浸入土壤桿菌溶液5-10分鐘，輕柔攪動，然后將植株轉(zhuǎn)移到溫室中進行正常生長，并定期澆水和施肥，直到種子定植。實施例18.轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長和生物測定選擇用發(fā)夾RNAi構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的T1擬南芥將來自每次轉(zhuǎn)化的至多達200mg的T1種子在0.1％瓊脂糖溶液中分層。將種子種植在裝有5號陽光培養(yǎng)基(sunshinemedia)的發(fā)芽盤(10.5”×0.”×0”；T.O.PlasticsInc.，Clearwater，MN)中。在種植后6天和9天，選擇對280g/ha的(草銨膦)具有耐受性的轉(zhuǎn)化體。將選出的事件移植到4”直徑的盆中。在移植的一周內(nèi)進行插入拷貝分析，插入拷貝分析使用RocheLightCycler480TM的水解定量實時PCR(qPCR)。使用LightCyclerTMProbeDesignSoftware2.0(Roche)，針對DSM2v2選擇標記設(shè)計PCR引物和水解探針。將植物維持在24℃，在強度為100-150mE/m2s的熒光和白熾燈下以16:8小時光:暗光周期。英雄美洲蝽植物飼養(yǎng)生物測定為每個構(gòu)建體選擇至少四個低拷貝事件(1-2個插入)、四個中拷貝事件(2-3個插入)和四個高拷貝(≥4個插入)事件。使植物生長至開花期(植物有花和長角果)。土壤表面覆蓋有～50mL體積的白色沙子，便于鑒別昆蟲。將五到十二齡的英雄美洲蝽若蟲引入每株植物。植物用直徑3”，高16”，壁厚0.03”的塑料管(產(chǎn)品號484485，VisipackFentonMO)覆蓋；用尼龍網(wǎng)蓋住管子以隔離昆蟲。在Conviron培養(yǎng)箱中將植物保持在正常溫度、光照和澆水條件下。在14天中，收集昆蟲并稱重，計算死亡率百分比以及生長抑制(1-處理重量/對照重量)。用表達YFP發(fā)夾的植物作為對照。T2擬南芥種子生成和T2生物測定對于每個構(gòu)建體，從選定的低拷貝(1-2個插入)事件產(chǎn)生T2種子。如上所述，對植物(純合的和/或雜合的)進行英雄美洲蝽飼養(yǎng)生物測定。從純合子收獲T3種子并儲存用于將來分析。序列表<110>美國陶氏益農(nóng)公司內(nèi)布拉斯加大學(xué)K·E·納爾瓦K·阿羅拉S·E·沃登M·蘭加薩米H·李B·齊格弗里德C·卡朱里亞E·菲什里維奇<120>賦予鞘翅目和半翅目害蟲抗性的SEC23核酸分子<130>2971-P12239US(75324)<160>92<170>PatentInversion3.5<210>1<211>2713<212>DNA<213>玉米根螢葉甲(Diabroticavirgifera)<400>1aaattctgtaaacaattaggttggtaagagtcagatgtcagacacgacatcgaatgacgt60ggaagttcaaattctgaaacaattaggtgtaatttttaggagctcaataatagtgttatt120tacatgatagaatcctaataatatatattgaggaatttccttagggaattccgacttgta180atcttcaaaaatgagcacatatgaagagtatatacaacaaaatgaagatcgagatgggat240tagatttacctggaatgtatggccttcaagcagaattgaagctacccgtctcgtagtacc300cttagcttgtctgtaccagcctataaaggaacgtctggatcttccaccaatacaatatga360ccctgttttatgtactagaaatacttgtagagcaatattaaacccactgtgtcaggtaga420ttatcgagcaaaactctgggtatgcaacttttgtttccagagaaatccatttccacctca480atatgctgctatttcagaacaacatcaaccagcggaattgatgcctatgttttccaccat540tgaatacacaataactagagctcaatgtttaccaccaatatttttgtatgttgttgacac600ctgcatggatgatgaagaactgggttccctgaaagactcattgcaaatgtcccttagttt660gttgccacctaatgcgttaataggactaataacatttgggaaaatggttcaagttcatga720acttggcactgaaggttgtagtaagtcatatgtgttcagaggtacaaaagatcttagtgc780taaacaggttcaagaaatgctgggaataggcaaagtggctttaggtcagcaagcccctca840acagccagggcagcctctaagacctgggcaaatgcaacctactgttgttgcaccaggaag900caggtttctacaacctgtatccaaatgcgatatgaatctaacagacctaataggagaaca960acagaaagatccttggcctgttcatcagggtaaaaggtatttaagatctacaggtgtagc1020tttatcgattgccattggtttgttagaatgtacatattccaatactggcgcccgagttat1080gctatttgttggaggaccttgctcacaaggacctggtcaggtagttaatgatgatttaaa1140acagcctattagatcacatcatgatattcagaaagataatgcaaaatatatgaagaaagg1200tattaaacattatgatgcgttagcaatgagagccgcaactaatggtcactctgttgatat1260ttattcttgtgctttggatcagacaggtctgatggaaatgaagcaatgctgtaattctac1320tgggggacacatggtaatgggggattcatttaattcttccttgtttaagcaaactttcca1380acgtgtgtttaccagagatcaaaaaagtgatctgaaaatggcatttaacggtactttgga1440agtgaagtgttcccgagaattaaaagttcaaggaggtatcggttcgtgtgtatcacttaa1500cgtgaagagccccttggtttccgacacagaaataggaatgggtaatactgtgcaatggaa1560aatgtgtactttaacgccaagtactaccatgtctttattctttgaggtcgtaaatcaaca1620ttctgctcccatacctcaaggtggtagaggttgtatacaatttattacgcagtaccagca1680ttcaagtggtcaaagaaaaatcagagtaacaacagtggctcgaaattgggctgacgcaac1740tgctaatatacaccatatcagtgccggattcgatcaagaagctgctgctgtaataatggc1800taggatggccgtttatagggcagaatctgatgatagtccagatgttcttagatgggttga1860cagaatgctgattagattgtgtcaaaaattcggagaatacaataaggacgaccccaattc1920attcagacttggtcaaaacttcagtctttacccacagttcatgtatcacttaagaagatc1980tcaatttcttcaagtattcaataattctccggacgagacttcattctacagacacatgtt2040gatgagggaagatcttactcaatctttgataatgattcaacctattttgtatagttatag2100tttcaatggtccaccagagcctgtattactagatactagctccattcaacctgacagaat2160attacttatggatactttcttccaaatattaattttccatggagagactatcgcccaatg2220gcgtagtttaaaatatcaagacatgccagaatatgaaaactttagacagctactacaggc2280tccagtagatgatgcacaagaaattttgcaaactaggttcccaatgccgagatatattga2340taccgaacaaggcggatcccaagccagatttttgttgtcgaaagtaaatccaagtcaaac2400tcataacaacatgtattcctacggaggtgattctggagctccagttttgacagatgatgt2460atcccttcaagtattcatggaccatctaaagaaattggcagtttcgtccacagcataata2520cctatatattacaattagatacatttgacataatacagtttttgaatttattcaatatat2580tatattttaagcttaattttttgtatatttatttcatagatagtttatatatttggtaat2640gtgatacaataaatttttgttttccagaccttgcaattgtaaaagaataaattataatac2700ctgtattaactaa2713<210>2<211>775<212>PRT<213>玉米根螢葉甲(Diabroticavirgifera)<400>2MetSerThrTyrGluGluTyrIleGlnGlnAsnGluAspArgAspGly151015IleArgPheThrTrpAsnValTrpProSerSerArgIleGluAlaThr202530ArgLeuValValProLeuAlaCysLeuTyrGlnProIleLysGluArg354045LeuAspLeuProProIleGlnTyrAspProValLeuCysThrArgAsn505560ThrCysArgAlaIleLeuAsnProLeuCysGlnValAspTyrArgAla65707580LysLeuTrpValCysAsnPheCysPheGlnArgAsnProPheProPro859095GlnTyrAlaAlaIleSerGluGlnHisGlnProAlaGluLeuMetPro100105110MetPheSerThrIleGluTyrThrIleThrArgAlaGlnCysLeuPro115120125ProIlePheLeuTyrValValAspThrCysMetAspAspGluGluLeu130135140GlySerLeuLysAspSerLeuGlnMetSerLeuSerLeuLeuProPro145150155160AsnAlaLeuIleGlyLeuIleThrPheGlyLysMetValGlnValHis165170175GluLeuGlyThrGluGlyCysSerLysSerTyrValPheArgGlyThr180185190LysAspLeuSerAlaLysGlnValGlnGluMetLeuGlyIleGlyLys195200205ValAlaLeuGlyGlnGlnAlaProGlnGlnProGlyGlnProLeuArg210215220ProGlyGlnMetGlnProThrValValAlaProGlySerArgPheLeu225230235240GlnProValSerLysCysAspMetAsnLeuThrAspLeuIleGlyGlu245250255GlnGlnLysAspProTrpProValHisGlnGlyLysArgTyrLeuArg260265270SerThrGlyValAlaLeuSerIleAlaIleGlyLeuLeuGluCysThr275280285TyrSerAsnThrGlyAlaArgValMetLeuPheValGlyGlyProCys290295300SerGlnGlyProGlyGlnValValAsnAspAspLeuLysGlnProIle305310315320ArgSerHisHisAspIleGlnLysAspAsnAlaLysTyrMetLys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