本發(fā)明涉及特異性結合中東呼吸綜合征–冠狀病毒(MERS-CoV)的刺突蛋白的人抗體和人抗體的抗原結合片段和使用這些抗體的治療和診斷方法。相關技術的陳述中東呼吸綜合征–冠狀病毒(MERS-CoV)是新出現(xiàn)的β冠狀病毒，其引起嚴重的急性呼吸疾病。其首先在沙特阿拉伯于2012年分離(Zaki等2012,NEJM367:1814-1820)且自此傳播至約18個國家，其中大多數(shù)的病例在沙特阿拉伯和阿拉伯聯(lián)合酋長國。截止2014年5月15日，世界衛(wèi)生組織報告了571例MERS，包括171例死亡。最近在美國發(fā)現(xiàn)兩例MERS感染。人中MERS-CoV感染的臨床特征范圍從無感染癥狀到非常嚴重的肺炎，伴隨急性呼吸窘迫綜合征、敗血性休克和導致死亡的多器官功能衰竭的發(fā)展?jié)摿?。MERS-CoV與蝙蝠冠狀病毒HKU4和HKU5分享相似性。病毒使用其刺突蛋白用于與用來進入靶細胞的細胞受體相互作用。Raj等展示了病毒經(jīng)由其刺突蛋白的受體結合域與在人上皮和內皮細胞上的二肽基肽酶4(DPP4)結合(Raj等2013,Nature495:251-256)。Lu等在2013年已顯示MERS-CoV受體結合域由核心和與DPP4相互作用的受體結合亞結構域組成(Lu等2013,Nature500:227-231)。WO2014/045254描述了MERS-CoV的分離和表征、刺突蛋白和針對刺突蛋白的受體結合域的多克隆抗體。通過例如Du等(2014,J.Virol.)、Ying等(2014,J.Virol.)、Tang等(2014,PNAS)和Jiang等(2014,Sci.Transl.Med.Vol.6,234ra59)已公開了刺突蛋白受體結合域的中和單克隆抗體。迄今，并沒有預防或治療MERS感染的疫苗或治療劑。由于其持續(xù)危及人類健康并引起高致死率(超過30％)，對于用于MERS控制的預防和治療性抗病毒療法是急需的。以高親和力特異性結合MERS-CoV刺突蛋白并抑制病毒感染性的全長人抗體對于預防和治療MERS感染可能是重要的。發(fā)明簡述本發(fā)明提供結合MERS-CoV刺突蛋白的抗體及其抗原結合片段。本發(fā)明的抗體可特別用于抑制或中和MERS-CoV刺突蛋白的活性。在一些實施方案中，抗體用于阻斷病毒與其宿主細胞受體二肽基肽酶4(DPP4)的結合并用于預防MERS-冠狀病毒進入宿主細胞。在一些實施方案中，抗體通過抑制病毒細胞至細胞的轉移而發(fā)揮功能。在一些實施方案中，抗體用于預防、治療或緩解受試者中至少一種癥狀。在一些實施方案中，可將抗體預防性或治療性施用于具有MERS-CoV感染或處于具有MERS-CoV感染風險的受試者。本發(fā)明的抗體可以是全長的(例如，IgG1或IgG4抗體)或可以僅包含抗原結合部分(例如，F(xiàn)ab、F(ab’)2或scFv片段)，且可經(jīng)修飾以影響功能性，例如，增加在宿主中的持久性或消除殘留的效應功能(Reddy等，2000,J.Immunol.164:1925-1933)。在一些實施方案中，抗體可以是雙特異性的。第一方面，本發(fā)明提供與MERS-CoV刺突蛋白特異性結合的分離的重組單克隆抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體是全長的人單克隆抗體。本發(fā)明的抗體及其抗原結合片段與在MERS-CoV的刺突蛋白的受體結合域(RBD)內的表位結合。在一些實施方案中，本發(fā)明提供抗體及其抗原結合片段，其與選自GenBank登錄號AFS88936.1(SEQIDNO:457)的氨基酸367-606的氨基酸結合。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體結合MERS-CoV分離株EMC/2012的刺突蛋白結合。在一些實施方案中，抗體與不同的MERS-CoV分離株的刺突蛋白結合。本發(fā)明示例性的抗MERS-CoV-S抗體列于本文的表2和3。表2描述了示例性的抗MERS-CoV-S抗體的重鏈可變區(qū)(HCVR)、輕鏈可變區(qū)(LCVR)、重鏈互補決定區(qū)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和輕鏈互補決定區(qū)(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列標識符。表3描述了示例性的抗MERS-CoV-S抗體的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列標識符。本發(fā)明提供包含HCVR的抗體或其抗原結合片段，所述HCVR含有的氨基酸序列選自列于表2的HCVR氨基酸序列，或與其基本上相似的與其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。本發(fā)明還提供包含LCVR抗體或其抗原結合片段，所述LCVR含有的氨基酸序列選自列于表2的LCVR氨基酸序列，或與其基本上相似的與其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。本發(fā)明還提供包含HCVR和LCVR氨基酸序列對(HCVR/LCVR)的抗體或其抗原結合片段，所述序列對包含列于表2的任何HCVR氨基酸序列與列于表2的任何LCVR氨基酸序列的配對。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明提供包含HCVR/LCVR氨基酸序列對的抗體或其抗原結合片段，所述HCVR/LCVR氨基酸序列對包含在列于表2的任何示例性的抗MERS-CoV-S抗體內。在一些實施方案中，HCVR/LCVR氨基酸序列對選自下組：SEQIDNO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/106、122/106、130/106、138/106、146/106、154/162、170/162、178/162、186/194、202/210、218/226、234/242、250/258、266/274、282/290、298/306、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434和442/450。在一些實施方案中，HCVR/LCVR氨基酸序列對選自下列之一：SEQIDNO:2/10(例如H1H15177P)、18/26(例如H1H15188P)、66/74(例如H1H15211P)、114/106(例如H1H15231P2)、170/162(例如H1H15260P2)或218/226(例如H1H15277N)。本發(fā)明還提供包含重鏈CDR1(HCDR1)的抗體或其抗原結合片段，所述重鏈CDR1(HCDR1)含有的氨基酸序列選自列于表2的任何HCDR1氨基酸序列或與其基本上相似的具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。本發(fā)明還提供包含重鏈CDR2(HCDR2)的抗體或其抗原結合片段，所述重鏈CDR2(HCDR2)含有的氨基酸序列選自列于表2的任何HCDR2氨基酸序列或與其基本上相似的具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。本發(fā)明還提供包含重鏈CDR3(HCDR3)的抗體或其抗原結合片段，所述重鏈CDR3(HCDR3)含有的氨基酸序列選自列于表2的任何HCDR3氨基酸序列或與其基本上相似的具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。本發(fā)明還提供包含輕鏈CDR1(LCDR1)的抗體或其抗原結合片段，所述重鏈CDR1(LCDR1)含有的氨基酸序列選自列于表2的任何LCDR1氨基酸序列或與其基本上相似的具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。本發(fā)明還提供包含輕鏈CDR2(LCDR2)的抗體或其抗原結合片段，所述重鏈CDR2(LCDR2)含有的氨基酸序列選自列于表2的任何LCDR2氨基酸序列或與其基本上相似的具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。本發(fā)明還提供包含輕鏈CDR3(LCDR3)的抗體或其抗原結合片段，所述重鏈CDR3(LCDR3)含有的氨基酸序列選自列于表2的任何LCDR3氨基酸序列或與其基本上相似的具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。本發(fā)明還提供包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列對(HCDR3/LCDR3)的抗體或其抗原結合片段，所述HCDR3/LCDR3含有列于表2的任何HCDR3氨基酸序列與列于表2的任何LCDR3氨基酸序列的配對。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明提供包含HCDR3/LCDR3氨基酸序列對的抗體或其抗原結合片段，所述HCDR3/LCDR3氨基酸序列對包含在列于表2的任何示例性的抗MERS-CoV-S抗體中。在一些實施方案中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列對選自下組：SEQIDNO:8/16(例如H1H15177P)、24/32(例如H1H15188P)、72/80(例如H1H15211P)、120/112(例如H1H15231P2)、176/168(例如H1H15260P2)和224/232(例如H1H15277N)。本發(fā)明還提供包含6個CDR組(即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗體或其抗原結合片段，所述組包含在列于表2的任何示例性的抗MERS-CoV-S抗體中。在一些實施方案中，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列組選自下組：SEQIDNO:4-6-8-12-14-16(例如H1H15177P)、20-22-24-28-30-32(例如H1H15188P)；68-70-72-76-78-80(例如H1H15211P)；116-118-120-108-110-112(例如H1H15231P2)；172-174-176-164-166-168(例如H1H15260P2)和220-222-224-228-230-232(例如H1H15277N)。在相關的實施方案中，本發(fā)明提供6個CDR組(即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗體或其抗原結合片段，所述組包含在通過列于表2的任何示例性的抗MERS-CoV-S抗體定義的HCVR/LCVR氨基酸序列對中。例如，本發(fā)明包括含有HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列組的抗體或其抗原結合片段，所述組包含在選自下組的HCVR/LCVR氨基酸序列對中：SEQIDNO:2/10(例如H1H15177P)、18/26(例如H1H15188P)；66/74(例如H1H15211P)；114/106(例如H1H15231P2)；170/162(例如H1H15260P2)和218/226(例如H1H15277N)。用于鑒定在HCVR和LCVR氨基酸序列內的CDR的方法和技術為本領域已知且可用于鑒定本文公開的指定HCVR和/或LCVR氨基酸序列中的CDR?？捎糜诮缍–DR邊界的示例性的慣例包括例如Kabat定義、Chothia定義和AbM定義。一般而言，Kabat定義基于序列的可變性，Chothia定義基于結構環(huán)區(qū)的位置，且AbM定義在Kabat和Chothia方式間折中。參見例如Kabat,"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,"NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；和Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989)。可獲得公開的數(shù)據(jù)庫用于鑒定在抗體內的CDR序列。本發(fā)明包括具有修飾的糖基化模式的抗MERS-CoV-S抗體。在一些實施方案中，去除不想要的糖基化位點的修飾可以是有用的，或缺乏寡糖鏈上的巖藻糖部分的抗體可增加抗體依賴的細胞毒性(ADCC)功能(參見Shield等(2002)JBC277:26733)。在其他應用中，可進行糖基化修飾以修飾補體依賴的細胞毒性(CDC)。本發(fā)明還提供抗體及其抗原結合片段，其與含有HCVR的CDR和LCVR的CDR的抗體或其抗原結合片段競爭對MERS-CoV-S的特異性結合，其中HCVR和LCVR各具有選自列于表2的HCVR和LCVR序列的氨基酸序列。本發(fā)明還提供抗體及其抗原結合片段，其與含有HCVR的CDR和LCVR的CDR的參照抗體或其抗原結合片段交叉競爭對MERS-CoV-S的結合，其中HCVR和LCVR各具有選自列于表2的HCVR和LCVR序列的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段可以激動劑的方式特異性結合MERS-CoV-S，即，其可增強或刺激MERS-CoV-S結合和/或活性；在其他實施方案中，抗體可以拮抗劑的方式特異性結合MERS-CoV-S，即，其可阻斷MERS-CoV-S與其受體(DPP4)的結合。本發(fā)明還提供分離的抗體及其抗原結合片段，其阻斷MERS-CoV刺突蛋白與DPP4的結合。在一些實施方案中，阻斷MERS-CoV刺突蛋白與DPP4的結合的抗體或其抗原結合片段可結合MERS-CoV刺突蛋白上與DPP4相同的表位或可結合MERS-CoV刺突蛋白上與DPP4不同的表位。在一些實施方案中，本發(fā)明提供抗體或其抗原結合片段，其阻斷MERS-CoV-S與人、駱駝或蝙蝠的DPP4的結合。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結合片是雙特異性的，其包含與MERS-CoV刺突蛋白的受體結合域中的第一表位的第一結合特異性和與MERS-CoV刺突蛋白的受體結合域中的第二表位的第二結合特異性，其中所述第一和第二表位是不同和非重疊的。在一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的抗體或抗原結合片段，其具有一種或多種下列特征：(a)是全長的人單克隆抗體；(b)分離自選自下組的雜交瘤細胞系：HBVX06H05、HBVX11H04、HBVX11D02、HBVZ10E10、HBVY09F08、HBVZ05G02、HBVZ09B06、HBVY01F08、HBVY10G02、HBVY04B06、HBVY07D10、HBVZ08A09、HBVZ05G04、HBVY06C07、HBVY03H06、HBVZ10G06、HBVZ04F10、HBVX11E09、HBVY06H09、HBVZ05B11、HBVY02E05和HBVZ04C07；(c)與MERS-CoV刺突蛋白的受體結合域中的一個或多個氨基酸殘基相互作用，所述氨基酸殘基選自SEQIDNO:457的氨基酸殘基367-606；(d)以小于10-9M的解離常數(shù)(KD)與MERS-CoV刺突蛋白結合，如在表面等離子體共振測定中所測量的；(e)阻斷MERS-CoV刺突蛋白與二肽基肽酶4(DPP4)的大于90％的結合；如在阻斷ELISA測定中所測量的；(f)中和人宿主細胞大于90％的MERS-CoV感染性且具有小于4nM的IC50，如在病毒樣顆粒(VLP)中和測定中所測量的；(g)中和MERS-CoV感染性，其中所述MERS-CoV包含選自下組的病毒的分離株：EMC/2012、Jordan-N3/2012、England-Qatar/2012、Al-Hasa_1_2013、Al-Hasa_2_2013、Al-Hasa_3_2013、Al-Hasa_4_2013、Al-Hasa_12、Al-Hasa_15、Al-Hasa_16、Al-Hasa_17、Al-Hasa_18、Al-Hasa_19、Al-Hasa_21、Al-hasa_25、Bisha_1、Buraidah_1、England1、Hafr-Al-batin_1、Hafr-Al-Batin_2、Hafr-Al-Batin_6、Jeddah_1、KFU-HKU1、KFU-HKU13、Munich、Qatar3、Qatar4、Riyadh_1、Riyadh_2、Riyadh_3、Riyadh_3、Riyadh_4、Riyadh_5、Riyadh_9、Riyadh_14、Taif_1、UAE和Wadi-Ad-Dawasir；且(h)為雙特異性抗體，其包含與MERS-CoV刺突蛋白的受體結合域中第一表位的第一結合特異性和與MERS-CoV刺突蛋白的受體結合域中第二表位的第二結合特異性，其中所述第一和第二表位是不同的和非重疊的。第二方面，本發(fā)明提供編碼抗MERS-CoV-S抗體或其部分的核酸分子。例如本發(fā)明提供編碼任何列于表2的HCVR氨基酸序列的核酸分子；在一些實施方案中，核酸分子包含多核苷酸序列，其選自列于表3的任何HCVR核酸序列或與其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。本發(fā)明還提供編碼任何列于表2的LCVR氨基酸序列的核酸分子，在一些實施方案中，核酸分子包含多核苷酸序列，其選自列于表3的任何LCVR核酸序列或與其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。本發(fā)明還提供編碼任何列于表2的HCDR1氨基酸序列的核酸分子；在一些實施方案中，核酸分子包含多核苷酸序列，其選自列于表3的任何HCDR1核酸序列或與其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。本發(fā)明還提供編碼任何列于表2的HCDR2氨基酸序列的核酸分子；在一些實施方案中，核酸分子包含多核苷酸序列，其選自列于表3的任何HCDR2核酸序列或與其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。本發(fā)明還提供編碼任何列于表2的HCDR3氨基酸序列的核酸分子；在一些實施方案中，核酸分子包含多核苷酸序列，其選自列于表3的任何HCDR3核酸序列或與其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。本發(fā)明還提供編碼任何列于表2的LCDR1氨基酸序列的核酸分子；在一些實施方案中，核酸分子包含多核苷酸序列，其選自列于表3的任何LCDR1核酸序列或與其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。本發(fā)明還提供編碼任何列于表2的LCDR2氨基酸序列的核酸分子；在一些實施方案中，核酸分子包含多核苷酸序列，其選自列于表3的任何LCDR2核酸序列或與其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。本發(fā)明還提供編碼任何列于表2的LCDR3氨基酸序列的核酸分子；在一些實施方案中，核酸分子包含多核苷酸序列，其選自列于表3的任何LCDR3核酸序列或與其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。本發(fā)明還提供編碼HCVR的核酸分子，其中所述HCVR包含三個CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3)的組，其中HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列組如通過任何列于表2的示例性的抗MERS-CoV-S抗體定義。本發(fā)明還提供編碼LCVR的核酸分子，其中所述LCVR包含三個CDR(即LCDR1-LCDR2-LCDR3)的組，其中LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列組如通過任何列于表2的示例性的抗MERS-CoV-S抗體定義。本發(fā)明還提供編碼HCVR和LCVR的核酸分子，其中所述HCVR包含任何列于表2的HCVR氨基酸序列的氨基酸序列，且其中所述LCVR包含任何列于表2的LCVR氨基酸序列的氨基酸序列。在一些實施方案中，核酸分子包含多核苷酸序列，其選自任何列于表3的HCVR核酸序列或與其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列，和多核苷酸序列，其選自任何列于表2的LCVR核酸序列或與其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的該方面，核酸分子編碼HCVR和LCVR，其中所述HCVR和LCVR都源自列于表2的相同抗MERS-CoV-S抗體。本發(fā)明提供編碼任何列于表2的重鏈氨基酸序列的核酸分子。本發(fā)明還提供編碼任何列于表2的輕鏈氨基酸序列的核酸分子。在相關方面，本發(fā)明提供能夠表達含有抗MERS-CoV-S抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的多肽的重組表達載體。例如，本發(fā)明包括重組表達載體，其包含任何上文提及的核酸分子，即編碼任何列于表3的HCVR、LCVR和/或CDR序列的核酸分子。還包括在本發(fā)明的范圍內的是其中已引入所述載體的宿主細胞以及通過在允許抗體或抗體片段產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細胞而生產(chǎn)抗體或其部分，并回收如此產(chǎn)生的抗體和抗體片段的方法。第三方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含治療上有效量的至少一種重組單克隆抗體或其抗原結合片段和藥物上可接受的載體，所述單克隆抗體或其抗原結合片段特異性結合MERS-CoV刺突蛋白。在相關方面，本發(fā)明特征為一種組合物，其為抗MERS-CoV-S抗體和第二治療劑的組合。在一個實施方案中，第二治療劑是有利地與抗MERS-Co-V-S抗體組合的任何作用劑?？捎欣嘏c抗MERS-Co-V-S抗體組合的示例性作用劑包括但不限于結合和/或抑制MERS-CoV活性的其他作用劑(包括其他抗體或其抗原結合片段等)和/或不直接結合MERS-CoV-S但抑制病毒活性包括宿主細胞感染性的作用劑。在一些實施方案中，本發(fā)明提供藥物組合物，所述藥物組合物包含：(a)第一抗MERS-CoV-S抗體或其抗原結合片段；(b)第二抗MERS-CoV-S抗體或其抗原結合片段，其中第一抗體結合MERS-CoV刺突蛋白上的第一表位且第二抗體結合MERS-CoV刺突蛋白上的第二表位，其中第一和第二表位是不同且非重疊的；和(c)藥物上可接受的載劑或稀釋劑。在一些實施方案中，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含：(a)第一抗MERS-CoV-S抗體或其抗原結合片段；(b)第二抗MERS-CoV-S抗體或其抗原結合片段，其中所述第一抗體不與第二抗體交叉競爭與MERS-CoV刺突蛋白的結合；和(c)藥物上可接受的載劑或稀釋劑。涉及本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體的其他組合療法和共配制劑在本文的他處公開。第四方面，本發(fā)明提供用于治療受試者中與MERS-CoV有關的疾病或病癥如病毒感染的治療方法，其使用本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體或抗體的抗原結合部分，其中所述治療方法包括將治療上有效量的含有本發(fā)明的抗體或抗體的抗原結合片段的藥物組合物施用于對其有需要的受試者。治療的病癥是通過抑制MERS-CoV活性改善、緩解、抑制或預防的任何疾病或病況。在一些實施方案中，本發(fā)明提供預防、治療或緩解MERS-CoV感染的至少一種癥狀的方法，所述方法包括將治療上有效量的本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體或其抗原結合片段施用于對其有需要的受試者。在一些實施方案中，本發(fā)明提供通過施用本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體緩解或減少受試者中的MERS感染的至少一種癥狀或適應癥的嚴重性的方法，其中所述至少一種癥狀或適應癥選自下組：肺部炎癥、肺泡損傷、發(fā)熱、咳嗽、呼吸淺短、腹瀉、器官衰竭、肺炎、敗血性休克和死亡。在一些實施方案中，本發(fā)明提供減少受試者中病毒載量的方法，其包括對受試者施用有效量的本發(fā)明的抗體或其片段，所述抗體或其片段結合MERS-CoV-S并阻斷MERS-CoV-S與宿主細胞受體DPP4的結合。在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段可預防性或治療性施用于具有MERS感染或處于具有MERS感染的風險的受試者。處于風險的受試者包括但不限于免疫功能低下的個體、老年人(大于65歲)、小于2歲的兒童、至中東地區(qū)(如沙特阿拉伯、阿拉伯聯(lián)合酋長國、卡塔爾等)的旅行者、醫(yī)護人員、與確認具有或疑似具有MERS感染的人密切接觸的成人或兒童，和具有潛在的醫(yī)療病況(如肺部感染、心臟病或糖尿病)的人。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段與第二治療劑組合施用于對其有需要的受試者。第二治療劑可選自下組：抗炎癥藥物(如皮質類固醇和非甾體抗炎癥藥物)、抗病毒藥物、針對MERS-CoV刺突蛋白的不同的抗體、抗病毒藥物、對于MERS-CoV的疫苗、膳食補充劑如抗氧化劑和本領域已知的任何其他藥物或療法。在一些實施方案中，第二治療劑可為幫助抵消或減少與本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段有關的任何可能的副作用(如果這種副作用會發(fā)生)的作用劑。抗體或其片段可通過皮下、靜脈內、皮內、腹膜內、口服、肌內或顱內施用。在一個實施方案中，抗體可作為單靜脈輸注用于抗體在受試者血清中的最大濃度?？贵w或其片段可以約0.1mg/kg至約100mg/kg受試者體重的劑量施用。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體可以包含50mg-600mg的一個或多個劑量施用。本發(fā)明還包括本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體或其抗原結合片段在制造用于治療將從阻斷MERS-CoV結合和/或活性獲益的疾病或病癥的藥物中的用途。其他實施方案基于隨后的發(fā)明詳述將變得顯而易見。附圖簡述圖1的表列舉了抗體雜交瘤上清(通過其樣品ID在列1中列舉)及其在結合、阻斷和中和測定中的特征。如本文他處所述。圖2的矩陣顯示抗體交叉競爭測定結果，其中將第一抗MERS-CoV-S抗體(mAb-1)應用至MERSRBD涂覆的傳感器尖端，隨后用第二抗MERS-CoV-S抗體(mAb-2)處理。描述了測定的每種抗體組合的結合響應(數(shù)值-0.05至0.64)。具有黑色字體的淺灰色框代表自身競爭的結合響應。不依賴于抗原結合的順序在兩個方向中競爭的抗體以白色字體在黑色框中高亮。指示不同結合區(qū)的無競爭以黑色字體的白色框代表。在結合中顯示大于0.18nm移動的抗體不與另一種交叉競爭。圖3的矩陣顯示抗體交叉競爭測定結果，其中將第一抗MERS-CoV-S抗體(mAb-1)應用至MERSRBD涂覆的傳感器尖端，隨后用第二抗MERS-CoV-S抗體(mAb-2)處理。描述了測定的每種抗體組合的結合響應(數(shù)值-0.01至0.55)。黑色字體的淺灰色框代表自身競爭的結合響應。不依賴于抗原結合的順序在兩個方向中競爭的抗體以白色字體在黑色框中高亮。指示不同結合區(qū)的無競爭以黑色字體的白色框代表。在結合中顯示大于0.14nm移動的抗體不與另一種交叉競爭。圖4顯示在感染后的第2天和第4天在人源化的DPP4小鼠中，MERS-CoV轉錄物(包膜基因-UpE的基因組上游的轉錄mRNA)的定量PCR。圖5顯示在感染后的第2天和第4天在人源化的DPP4小鼠中，MERS-CoV轉錄物(MERS-CoV基因組-先導序列)的定量PCR。圖6顯示在感染后第4天感染的小鼠肺的MERS-CoV病毒滴度的量化。量化小鼠肺MERS-CoV水平并表示為pfu/ml均質化的小鼠肺。圖7顯示來自以MERS-CoV感染前一天，用200μg、20μg或2μg的H1H15211P或H1H15277N抗體或用hIgG同型對照處理的小鼠的肺的MERS-CoV轉錄物(包膜基因-UpE的基因組上游的轉錄mRNA)的定量PCR。全部樣品與設置為100％的hIgG1同型對照進行比較。圖8顯示來自以MERS-CoV感染前一天，用200μg、20μg或2μg的H1H15211P或H1H15277N抗體或用hIgG同型對照處理的小鼠的肺的MERS-CoV轉錄物(MERS-CoV基因組-先導序列)的定量PCR。全部樣品與設置為100％的hIgG1同型對照進行比較。圖9顯示如通過噬斑測定量化的肺中的病毒滴度分析，且報告為pfu/ml(來自以MERS-CoV感染前一天，用200μg、20μg或2μg的H1H15211P或H1H15277N抗體或用hIgG同型對照處理的小鼠的肺)。全部樣品與設置為100％的hIgG1同型對照進行比較。圖10顯示來自以MERS-CoV感染前一天，用200μg、20μg或2μg的H1H15211P或H1H15277N抗體或用hIgG同型對照處理的小鼠的肺的組織學分析的炎癥評分。圖11顯示來自在以MERS-CoV感染后一天用200μg或500μg的H1H15211P或hIgG同型對照或在以MERS-CoV感染前一天用200μg的H1H15211P處理的小鼠的肺的MERS-CoV轉錄物(包膜基因-UpE的基因組上游的轉錄mRNA)的定量PCR。全部樣品與設置為100％的hIgG1同型對照進行比較。圖12顯示來自在MERS-CoV感染后一天用200μg或500μg的H1H15211P或hIgG同型對照或在以MERS-CoV感染前一天用200μg的H1H15211P處理的小鼠的肺的MERS-CoV轉錄物(MERS-CoV基因組-先導序列)的定量PCR。全部樣品與設置為100％的hIgG1同型進行比較。圖13顯示通過噬斑測定量化的肺中的病毒滴度分析，且報告為pfu/ml(來自MERS-CoV感染后一天用200μg或500μg的H1H15211P或hIgG同型對照或在以MERS-CoV感染前一天用200μg的H1H15211P處理的小鼠的肺)。全部樣品與設置為100％的hIgG1同型進行比較。圖14顯示來自以MERS-CoV感染后一天用200μg或500μg的H1H15211P或hIgG同型對照處理的小鼠的肺的組織學分析的炎癥評分。發(fā)明詳述描述本發(fā)明的方法前，應該理解的是本發(fā)明不限于具體的方法和描述的實驗條件，因為這些方法和條件可以變化。還應該理解的是本文使用的術語僅出于描述具體實施方案的目的，且并非意欲為限制性的，而本發(fā)明的范圍將僅受所附的權利要求限制。除非另外限定，本文使用的全部技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員所通常理解的相同的含義。盡管與本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料可用于實踐或測試本發(fā)明，現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。本文提及的全部出版物通過提述以其整體并入本文。定義術語“MERS-CoV”也稱作“MERS冠狀病毒”，指新發(fā)生的中東呼吸綜合征-冠狀病毒，其首先在2012年于阿拉伯半島分離(Zaki等2012,NEJM367:1814-1820)并鑒定為嚴重的急性呼吸疾病的暴發(fā)的原因。其最初稱為人冠狀病毒-EMC(伊拉斯姆斯醫(yī)療中心；hCoV-EMC)。它屬于β冠狀病毒譜系2c且引起嚴重的呼吸疾病，與2002年在中國發(fā)生的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)相似。MERS冠狀病毒已發(fā)現(xiàn)與在蝙蝠和駱駝中發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒密切相關。其經(jīng)由病毒刺突蛋白與人宿主細胞受體二肽基肽酶4(DPP4)結合。MERS-CoV刺突蛋白已發(fā)現(xiàn)與其他物種的DPP4結合，特別是蝙蝠和駱駝(Raj等2013,Nature495:251-254)。術語“MERS-CoV-S”也稱為“S蛋白”，指MERS冠狀病毒的刺突蛋白。MERS-CoV刺突蛋白是1353個氨基酸的I型膜糖蛋白，其裝配成為三體，構成包膜MERS冠狀病毒顆粒的表面上的刺突或垂體。蛋白具有兩種基本功能，宿主受體結合和膜融合，其有助于S蛋白N末端(S1，氨基酸殘基1-751)和C末端(S2，氨基酸殘基752-1353)的兩半。MERS-CoV-S與其同源受體二肽基肽酶4(DPP4)經(jīng)由存在于S1亞基的約230個氨基酸長的受體結合域(RBD)結合。Mou等(2013)已在J.Virology(87卷，第9379-9383頁)中顯示MERS-CoVRBD位于刺突蛋白的殘基358-588內。全長MERS-CoV刺突蛋白的氨基酸序列由GenBank中以登錄號AFS88936.1(SEQIDNO:457)提供的MERS-CoV分離株EMC/2012的刺突蛋白的氨基酸序列示例。術語“MERS-CoV-S”還包括分離自下述不同MERS-CoV分離株的MERS-CoV刺突蛋白的蛋白變體：例如Jordan-N3/2012、England-Qatar/2012、Al-Hasa_1_2013、Al-Hasa_2_2013、Al-Hasa_3_2013、Al-Hasa_4_2013、Al-Hasa_12、Al-Hasa_15、Al-Hasa_16、Al-Hasa_17、Al-Hasa_18、Al-Hasa_19、Al-Hasa_21、Al-Hasa_25、Bisha_1、Buraidah_1、England1、Hafr-Al-Batin_1、Hafr-Al-Batin_2、Hafr-Al-Batin_6、Jeddah_1、KFU-HKU1、KFU-HKU13、Munich、Qatar3、Qatar4、Riyadh_1、Riyadh_2、Riyadh_3、Riyadh_3、Riyadh_4、Riyadh_5、Riyadh_9、Riyadh_14、Taif_1、UAE和Wadi-Ad-Dawasir。術語“MERS-CoV-S”包括重組MERS-CoV刺突蛋白或其片段。術語還涵蓋與下述偶聯(lián)的MERS-CoV刺突蛋白或其片段：例如組氨酸標簽、小鼠或人Fc或信號序列如ROR1。例如，術語包括通過SEQIDNO:458所示序列示例的序列，其在C末端包括與全長MERS-CoV刺突蛋白的氨基酸殘基367-606偶聯(lián)的小鼠Fc(mIgG2a)或人(hIgG1)。術語還包括與全長MERS-CoV刺突蛋白的氨基酸殘基367-606偶聯(lián)的蛋白變體，所述蛋白變體在C末端包含組氨酸標簽。術語“DPP4”指二肽基肽酶4，一種MERS-CoV的受體。DPP4是以二聚體形式在細胞表面上存在的766個氨基酸的II型跨膜糖蛋白。它是切割脯氨酸殘基后來自激素和趨化因子的二肽的外肽酶，由此調節(jié)激素和趨化因子的生物活性。在人中，DPP4主要表達在腎、小腸、肝和前列腺中的上皮細胞上，上和下呼吸道中的纖毛和非纖毛細胞上和免疫細胞上(即CD4+、CD8+、樹突細胞和巨噬細胞)。除非指定為來自非人物種，如本文使用的術語“DPP4”意為人DPP4。如本文使用的也表征為中東呼吸綜合征的術語“MERS感染”或“MERS-CoV感染”指由MERS冠狀病毒引起的嚴重急性呼吸性疾病且最初在2013年于沙特阿拉伯報導。術語包括呼吸道感染，經(jīng)常在下呼吸道。癥狀包括高熱、咳嗽、呼吸淺短、肺炎、胃腸癥狀如腹瀉、器官衰竭(腎衰竭和腎功能不全)、敗血性休克和嚴重情況下的死亡。如本文使用的術語"抗體"意在指由四條多肽鏈組成的免疫球蛋白分子(其中兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)通過二硫鍵相互連接(即"完整的抗體分子"))，以及其多聚體(例如IgM)或其抗原結合片段。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(“HCVR”或“VH”)和重鏈恒定區(qū)(由結構域CH1、CH2和CH3組成)組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(“LCVR或“VL”)和輕鏈恒定區(qū)(CL)組成。VH和VL區(qū)可進一步細分為稱為互補決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，其間插有更保守的區(qū)稱為框架區(qū)(FR)。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，以下列順序從氨基末端至羥基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發(fā)明的一些實施方案中，抗體(或其抗原結合片段)的FR可與人種系序列相同或可經(jīng)天然或人工修飾。氨基酸共有序列可基于兩個或多個CDR并排分析定義。一個或多個CDR殘基的取代或一個或多個CDR的省略也是可能的?？贵w已在科學文獻中進行描述，其中一個或多個CDR可免除用于結合。Padlan等(1995FASEBJ.9:133-139)基于公開的晶體結構分析了抗體和其抗原的接觸區(qū)，并得出結論僅約1/5-1/3的CDR殘基實際上接觸抗原。Padlan還發(fā)現(xiàn)許多抗體其中的一個或兩個CDR沒有氨基酸接觸抗原(還參見Vajdos等2002JMolBiol320:415-428)。不接觸抗原的CDR殘基可基于之前的研究(例如CDRH2中的殘基H60-H65經(jīng)常是不需要的)從位于ChothiaCDR外的KabatCDR的區(qū)通過分子建模和/或經(jīng)驗鑒定。如果CDR或其殘基省略，其通常由在另一人抗體序列或該序列的共有序列中占據(jù)相應位置的氨基酸取代。用于在CDR內取代的位置和待取代的氨基酸也可憑經(jīng)驗選擇。經(jīng)驗取代可以是保守或非保守取代。本文公開的全長的人抗MERS-CoV-S單克隆抗體相比對應的種系序列可在重鏈和輕鏈可變域的在框架區(qū)和/或CDR區(qū)包含一個或多個氨基酸取代、插入和/或缺失。這種突變可通過將本文公開的氨基酸序列與從例如公開的抗體序列數(shù)據(jù)庫獲得的種系序列進行比較而容易地確定。本發(fā)明包括抗體及其抗原結合片段，其源自本文公開的任何氨基酸序列，其中在一個或多個框架區(qū)和/或CDR區(qū)內的一個或多個氨基酸突變?yōu)榭贵w所來源的種系序列的相應殘基，或突變?yōu)榱硪蝗朔N系序列的相應殘基，或突變?yōu)橄鄳N系殘基的保守氨基酸取代(該序列的變化在本文統(tǒng)稱為"種系突變")。本領域的技術人員以本文公開的重鏈和輕鏈可變區(qū)起始可容易地生成眾多抗體和抗原結合片段，其包含一個或多個單獨的種系突變或其組合。在一些實施方案中，在VH和/或VL結構域內的全部框架和/或CDR殘基回復突變?yōu)樵诳贵w所來源的最初種系序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。在其他實施方案中，僅一些殘基回復突變?yōu)樽畛醯姆N系序列，例如僅在FR1的最初8個氨基酸內或FR4的最后8個氨基酸內發(fā)現(xiàn)的突變的殘基，或僅在CDR1、CDR2或CDR3內發(fā)現(xiàn)的突變的殘基。在其他實施方案中，一個或多個框架和/或CDR殘基突變?yōu)椴煌N系序列的相應殘基(即不同于抗體最初來源的種系序列的種系序列)。此外，本發(fā)明的抗體可包含在框架區(qū)和/或CDR區(qū)內的兩個或多個種系突變的任何組合，例如其中一些單獨的殘基突變?yōu)樘囟ǚN系序列的相應殘基而一些不同于最初種系序列的其他殘基保留或突變?yōu)椴煌N系序列的相應殘基。一旦獲得，可容易地對包含一個或多個種系突變的抗體和抗原結合片段的一種或多種合意的特征進行測試，如改善的結合特異性、增加的結合親和力、改善或增強的拮抗或激動生物特性(視情況可定)、減少的免疫原性等。以該一般方式獲得的抗體和抗原結合片段涵蓋在本發(fā)明內。本發(fā)明還包括全長的人抗MERS-CoV-S單克隆抗體，其包含本文公開的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的具有一個或多個保守取代的變體。例如，本發(fā)明包括抗MERS-CoV抗體，其具有的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列相對本文公開的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10個以下、8個以下、6個以下、4個以下等的保守氨基酸取代。如本文使用的術語"人抗體"意在包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人mAb可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如由隨機或體外位點特異性誘變或通過體內體細胞突變引入的突變)，例如在CDR中且特別是在CDR3中。然而，如本文使用的術語"人抗體"并非意在包括其中CDR源自另一哺乳動物物種(例如小鼠)的種系的CDR序列已植入人FR序列上的mAb。術語包括在非人哺乳動物或在非人哺乳動物細胞中重組產(chǎn)生的抗體。術語并非意在包括分離自人受試者或在其中生成的抗體。如本文使用的術語“重組”指本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段，其通過本領域已知的技術或方法生成、表達、分離或獲得，如重組DNA技術(其包括例如DNA剪接和轉基因表達)。術語指表達在非人哺乳動物(包括轉基因非人哺乳動物例如轉基因小鼠)或細胞(例如CHO細胞)表達系統(tǒng)中或分離自重組組合性人抗體文庫的抗體。術語“特異性結合”或“特異性地與…結合”等意為抗體或其抗原結合片段與抗原形成在生理條件下相對穩(wěn)定的復合物。特異性結合可通過至少約1x10-8M或更小的平衡解離常數(shù)表征(例如更小的KD表示更緊密的結合)。用于確定兩分子是否特異性結合的方法為本領域已知且包括例如平衡透析、表面等離子體共振等。如本文所述，抗體已通過表面等離子體共振鑒定，例如BIACORETM，其特異性地與MERS-CoV-S結合。此外，結合MERS-CoV-S中的一個結構域和一種或多種其他抗原的多特異性抗體或結合MERS-CoV-S的兩個不同的區(qū)的雙特異性抗體也認為是如本文所使用的“特異性結合”的抗體。術語“高親和力”抗體指具有與MERS-CoV-S的結合親和力的那些mAb，以至少10-8M，優(yōu)選10-9M；更優(yōu)選10-10M，進一步優(yōu)選10-11M，更優(yōu)選10-12M的KD表示，如通過表面等離子體共振例如BIACORETM或溶液親和力ELISA所測量的。術語“慢速率”、“Koff”或“kd”意為從MERS-CoV解離的抗體，具有1x10-3s-1或更小，優(yōu)選1x10-4s-1或更小的速率常數(shù)，如通過表面等離子體共振例如BIACORETM所確定的。如本文使用的術語抗體的"抗原結合部分"、抗體的"抗原結合片段"等包括任何天然存在的、酶學可獲得的、合成的或基因工程的特異性結合抗原以形成復合物的多肽或糖蛋白。如本文使用的術語抗體的"抗原結合片段"或"抗體片段”指抗體的保持與MERS-CoV刺突蛋白結合的能力的一個或多個片段。在特定的實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段可與如配體的部分或治療性部分(“免疫綴合物”)如抗病毒藥物、第二抗MERS-CoV-S抗體、或可用于治療MERS-CoV引起的感染的任何其他治療部分偶聯(lián)。如本文使用的"分離的抗體"意在指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體(Ab)的抗體(例如特異性結合MERS-CoV-S的分離的抗體或其片段基本上不含特異性結合除MERS-CoV-S外的抗原的Ab)。如本文使用的“阻斷抗體”或"中和抗體"(或"中和MERS-CoV-S活性的抗體"或“拮抗抗體”)意在指其與MERS-CoV-S的結合導致MERS-CoV的至少一種生物活性抑制的抗體。例如本發(fā)明的抗體可防止或阻斷MERS-CoV與DPP4的結合。如本文使用的術語"表面等離子體共振"指通過檢測生物傳感器基質內蛋白濃度的改變允許對實時生物分子相互作用進行分析的光學現(xiàn)象，例如使用BIACORETM系統(tǒng)(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,SwedenandPiscataway,N.J.)。如本文使用的術語“KD”意在指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數(shù)。術語“表位”指與已知為互補位的抗體分子的可變區(qū)中特異性抗原結合位點相互作用的抗原決定區(qū)。單抗原可具有多于一個的表位。因此，不同的抗體可結合抗原上的不同區(qū)域且可具有不同的生物效應。術語“表位”還指在抗原上B和/或T細胞對其響應的位點。其還指由抗體所結合的抗原的區(qū)。表位可由結構或功能定義。功能性表位一般是結構表位的子集且具有直接有助于相互作用親和性的那些殘基。表位還可以是構象性的，即，由非線性氨基酸構成。在一些實施方案中，表位可包括下述分子的化學活性表面組合的決定區(qū)：如氨基酸、糖側鏈、磷酸基或磺酰基，且在一些實施方案中，可具有特定的三維結構特征和/或特定的電荷特征。如本文使用的術語“交叉競爭”意為與抗原結合并抑制或阻斷其與另一抗體或其抗原結合片段結合的抗體或其抗原結合片段。術語還包括兩種抗體間以兩種方向的競爭，即結合并阻斷第二抗體結合的第一抗體，反之亦然。在一些實施方案中，第一抗體和第二抗體可與相同的表位結合?？商鎿Q地，第一和第二抗體可與不同但重疊的表位結合，從而一者的結合抑制或阻斷第二抗體的結合，例如經(jīng)由空間位阻?？贵w間的交叉競爭可通過本領域已知的方法測量，例如，通過實時、無標記生物層干涉測定。兩抗體間的交叉競爭可表示為少于由于自身-自身結合所致的背景信號的第二抗體的結合(其中第一和第二抗體是相同的抗體)。2種抗體間的交叉競爭可表示為例如少于基線自身-自身背景結合的第二抗體的結合％(其中第一和第二抗體是相同的抗體)。當指代核酸或其片段時，術語"基本同一性"或"基本上相同"指示當與另一核酸(或其互補鏈)以適當?shù)暮怂岵迦牖蛉笔Ф罴驯葘r，存在至少約90％，且更優(yōu)選至少約95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸堿基的核苷酸序列同一性，如通過已知的序列同一性算法，如FASTA、BLAST或GAP所測量的，如下文所討論的。與參照核酸具有較大同一性的核酸分子在一些實例中可編碼具有與由參照核酸分子編碼的多肽相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。當應用至多肽時，術語"基本相似性"或“基本上相似”意為當最佳比對時，如通過程序GAP或BESTFIT使用默認缺口權重，兩種肽序列分享至少90％的序列同一性，甚至更優(yōu)選地至少95％、98％或99％的序列同一性。優(yōu)選地，不相同的殘基位置通過保守氨基酸取代區(qū)分。"保守的氨基酸取代"是其中氨基酸殘基通過另一具有側鏈(R基)的氨基酸殘基(擁有相似化學特征(例如電荷或疏水性))取代的一種。一般而言，保守的氨基酸取代將基本上不改變蛋白的功能性特征。在其中兩個或多個氨基酸序列彼此通過保守取代不同的情況中，相似性的百分比或程度可向上調整以對于取代的保守性質進行校正。進行該調整的方式為本領域的技術人員已知。參見例如Pearson(1994)MethodsMol.Biol.24:307-331，其在本文通過提述并入。具有擁有相似化學特征的側鏈的氨基酸組的實例包括1)脂肪族側鏈：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂肪族-羥基側鏈：絲氨酸和蘇氨酸；3)含酰胺側鏈：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族側鏈：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)堿性側鏈：賴氨酸、精氨酸和組氨酸；6)酸性側鏈：天冬氨酸和谷氨酸和7)含硫側鏈：半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代基為：纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺?？商鎿Q地，保守替換是在Gonnet等(1992)Science256:144345公開的PAM250log-可能性矩陣中具有陽性值的任何變化，其在本文通過提述并入。“中度保守”替換是在PAM250log-可能性矩陣中具有陰性值的任何變化。多肽的序列相似性通常使用序列分析軟件測量。蛋白分析軟件使用分配于多種取代、缺失和其他修飾(包括保守的氨基酸取代)的相似性量度匹配相似的序列。例如，GCG軟件包含程序如GAP和BESTFIT，其可以默認的參數(shù)使用以在密切相關的多肽(如來自生物體不同物種的同源多肽或在野生型蛋白和其突變蛋白之間)中確定序列同源性或序列同一性。參見例如GCG版本6.1。多肽序列還可使用FASTA以默認或推薦的參數(shù)比較；GCG版本6.1中的程序。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查詢和搜索序列間最佳重疊的區(qū)的比對和百分比序列同一性(Pearson(2000)同上)。當將本發(fā)明的序列與包含大量來自不同生物體的序列的數(shù)據(jù)庫比較時，另一優(yōu)選的算法是計算機程序BLAST，特別是使用默認參數(shù)的BLASTP或TBLASTN。參見例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402，其每一篇通過提述并入本文。表述“治療上有效的量”意為將其施用以產(chǎn)生合意效果的量。精確的量將取決于治療目的，且將由本領域的技術人員使用已知的技術確認(參見例如，Lloyd(1999)TheArt,ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding)。如本文使用的術語“受試者”指需要緩解、預防和/或治療疾病或病癥如病毒感染的動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。術語包括具有MERS感染或處于具有MERS感染風險的人受試者。如本文使用的術語“治療(treat、treating或treatment)”指由于將治療劑如本發(fā)明的抗體施用于對其有需要的受試者所致的MERS感染的至少一種癥狀或適應癥的嚴重性的減少或緩解。術語包括疾病進展或感染惡化的抑制。術語還包括疾病的陽性預后，即當施用治療劑如本發(fā)明的抗體時，受試者可無感染或可具有減少的病毒滴度或無病毒滴度。治療劑可以治療劑量施用于受試者。術語“預防/防止(prevent、preventing或prevention)”指當施用本發(fā)明的抗體時，MERS感染的表現(xiàn)或MERS感染的任何癥狀或適應癥的抑制。術語包括暴露于病毒或處于具有MERS感染的風險的受試者中感染傳播的預防。如本文使用的術語“抗病毒藥物”指使用以治療、預防或緩解受試者中感染的任何抗感染藥物或療法。術語“抗病毒藥物”包括但不限于利巴韋林、奧司他韋、扎那米韋、干擾素-α2b、鎮(zhèn)痛藥和皮質類固醇。在本發(fā)明的語境中，病毒感染包括由人冠狀病毒(包括但不限于MERS-CoV、HCoV_229E、HCoV_NL63、HCoV-OC43、HCoV_HKU1和SARS-CoV)引起的感染。一般性描述用于預防或治療感染性疾病的被動免疫治療已使用超過一個世紀，經(jīng)常以包含中和抗體的高滴度的恢復期人血清的形式使用(Good等1991；Cancer68:1415-1421)?，F(xiàn)今，多次純化的單克隆抗體作為抗微生物劑使用目前處于臨床前和臨床開發(fā)(Marasco等2007；NatureBiotechnology25:1421-1434)中。發(fā)明人在本文描述了全長的人抗體及其抗原結合片段，其特異性地與MERS-CoV-S結合并調節(jié)MERS-CoV-S與DPP4的相互作用?？筂ERS-CoV-S抗體可以高親和力結合MERS-CoV-S。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體是阻斷抗體，其中所述抗體可與MERS-CoV-S結合且可阻斷MERS-CoV-S與DPP4的相互作用。在一些實施方案中，本發(fā)明的阻斷抗體可阻斷MERS-CoV-S與DPP4的結合和/或抑制或中和宿主細胞的病毒感染性。在一些實施方案中，阻斷抗體可用于治療罹患MERS感染的受試者。在一些實施方案中，不交叉競爭與刺突蛋白的結合的所選抗體作為雞尾酒組合使用以減少病毒響應來自每種組分的選擇性壓力經(jīng)由突變逃脫的能力。當施用于對其有需要的受試者時，抗體可減少被病毒如受試者中的MERS-CoV感染。其可用于減少受試者中的病毒載量。其可單獨使用，或作為輔助療法與用于治療病毒感染的其他治療部分或本領域已知的模態(tài)使用。本文還顯示這些抗體與在S蛋白上的表位結合，所述S蛋白在過去的2年中在病毒天然進化過程中是保守的。此外，用新的轉基因小鼠模型證明了鑒定的抗體可在接種后的治療方案中預防性地保護小鼠免于感染以及緩解之前確立的感染。在實施例7中，顯示感染前1天施用抗MERS-Cov-S抗體能夠將MERS-CoV復制減少至接近活病毒測定中的檢測水平和在病毒RNA測定中減少3log。該抗體證明了劑量依賴性保護，由于在感染前24小時給予的更低劑量的抗體能夠將MERS-CoV阻斷至更少的程度。此外，肺部組織的組織學分析證明了用抗體預處理的小鼠顯示減少的MERS-CoV誘導的支氣管周圍皺縮、肺泡壁增厚和總體炎癥病灶。全長MERS-CoV刺突蛋白的全長氨基酸序列在SEQIDNO:457中顯示。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體獲得自用初級免疫原如全長的MERS-CoV刺突蛋白(SEQIDNO:457)免疫的小鼠，或用重組形式的MERS-CoV-S或修飾的MERS-CoV-S片段(例如SEQIDNO:458)免疫的小鼠，隨后用二級免疫原或用MERS-CoV-S的免疫活性片段免疫。免疫原可以是MERS-CoV-S的生物活性和/或免疫原性片段或編碼其活性片段的DNA。所述片段可源自MERS-CoV-S的N末端或C末端。在本發(fā)明的一些實施方案中，免疫原是SEQIDNO:457的氨基酸殘基367-606的MERS-CoV-S片段?？尚揎楇囊园ㄒ恍埢奶砑踊蛉〈糜跇擞浕虺鲇谂c載劑分子如KLH偶聯(lián)的目的。例如，半胱氨酸可添加在肽的N末端或C末端，或可添加接頭序列以制備用于與例如KLH偶聯(lián)用于免疫的肽。本發(fā)明的一些抗MERS-CoV-S抗體能夠結合MERS-CoV-S以中和其活性，如通過體外或體內測定所確定的。本發(fā)明的抗體結合MERS-CoV-S并中和其活性的能力可使用本領域的技術人員已知的任何標準方法測量，包括本文所述的結合測定或活性測定。用于測量結合和阻斷活性的非限制性、示例性的體外測定在本文的實施例4-5中說明。在實施例4中，針對MERS-CoV-S的抗MERS-CoV-S抗體的結合親和力和解離常數(shù)通過表面等離子體共振測定確定。在實施例5中，使用中和測定以確定包含MERS-CoV刺突蛋白病毒樣顆粒的感染性。特異性針對MERS-CoV-S的抗體可不包含其他標記或部分，或其可包含N末端或C末端的標記或部分。在一個實施方案中，所述標記或部分是生物素。在結合測定中，標記(如果存在的話)的位置可確定肽相對肽所結合的表面的方向。例如，如果表面用抗生物素蛋白涂覆，包含N末端生物素的肽將被定向從而肽的C末端部分將遠離表面。在一個實施方案中，標記可以是放射性核素、熒光染料或MRI可檢測的標記。在一些實施方案中，這種標記的抗體可在診斷測定包括成像測定中使用?？贵w的抗原結合片段除非特別另外指示，本文使用的術語“抗體”將理解為涵蓋包含兩個免疫球蛋白重鏈和兩個免疫球蛋白輕鏈的抗體分子(即“全長的抗體分子”)及其抗原結合片段。本文使用的術語抗體的“抗原結合部分”、抗體的“抗原結合片段”等包括天然存在的、酶學可獲得的、合成的或基因工程的多肽或糖蛋白，其特異性地結合抗原以形成復合物。術語抗體的“抗原結合片段”或“抗體片段”指一種或多種保持特異性與MERS-CoV刺突蛋白結合的能力的抗體片段?？贵w片段可包括Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb片段、包含CDR的片段或分離的CDR。在一些實施方案中，術語“抗原結合片段”指多重特異性抗原結合分子的多肽片段?？贵w的抗原結合片段可使用任何合適的標準技術如蛋白水解消化或重組基因工程技術源自例如全長的抗體分子，所述技術涉及編碼抗體可變和(任選的)恒定域的DNA的操縱和表達。這些DNA為已知的和/或可容易地從例如商業(yè)來源、DNA文庫(包括例如噬菌體-抗體文庫)得到，或可為合成的。DNA可測序并通過使用分子生物技術化學操縱，例如以將一個或多個可變和/或恒定域排列成為合適的配置，或以引入密碼子、生成半胱氨酸殘基、修飾、添加或缺失氨基酸等?？乖Y合片段的非限制性實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段和(vii)由模擬抗體高變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識別單元(例如分離的互補決定區(qū)(CDR)如CDR3肽)或受限的FR3-CDR3-FR4肽。其他工程化的分子如結構域特異性抗體、單結構域抗體、結構域缺失的抗體、嵌合抗體、CDR移植的抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、納米抗體(例如單價納米抗體、二價納米抗體等)、小模塊免疫藥物(SMIP)和鯊魚可變IgNAR結構域(sharkvariableIgNARdomain)也涵蓋在本文使用的表述"抗原結合片段"內?？贵w的抗原結合片段將通常包含至少一個可變域。該可變域可以是任何大小或氨基酸組成且將一般包含至少一個CDR，其與一個或多個框架序列相鄰或在與一個或多個框架序列在框架中。在具有與VL結構域相關的VH結構域的抗原結合片段中，VH和VL結構域可相對彼此以任何適當?shù)呐帕羞M行配置。例如，可變區(qū)可以是二聚化的并包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體?？商鎿Q地，抗體的抗原結合片段可包含單聚VH或VL結構域。在一些實施方案中，抗體的抗原結合片段可包含至少一個可變域，其與至少一個恒定域共價連接?？稍诒景l(fā)明的抗體的抗原結合片段內發(fā)現(xiàn)的可變和恒定域的非限制示例性配置包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可變和恒定域的任何配置中，包括上文列舉的任何示例性配置，可變和恒定域可直接彼此連接或可通過全長或部分鉸鏈或接頭區(qū)連接。鉸鏈區(qū)可由至少2(例如5、10、15、20、40、60或更多)個氨基酸組成，其導致在單個的多肽分子中相鄰的可變和/或恒定域間柔性或半柔性連接基。此外，本發(fā)明的抗體的抗原結合片段可包含任何上文列舉的可變和恒定域構造彼此和/或與一個或多個單聚VH或VL結構域(例如通過二硫鍵)以非共價締合的同二聚體或異二聚體(或其他多聚體)。而對于全長的抗體分子，抗原結合片段可以是單特異性的或多特異性的(例如雙特異性的)。抗體的多特異性抗原結合片段將通常包含至少兩個不同的可變域，其中每個可變域能夠特異性地結合不同的抗原或在相同抗原上的不同表位。本文公開的任何多特異性抗體形式，包括示例性的雙特異性抗體形式可適于在本發(fā)明抗體的抗原結合片段的語境中使用本領域可獲得的常規(guī)技術使用。人抗體的制備用于在轉基因小鼠中生成人抗體的方法為本領域已知。任何這些已知的方法可在本發(fā)明的語境中使用以制備特異性與MERS-CoV刺突蛋白結合的人抗體。包含下述任一項的免疫原可用于生成對MERS-CoV刺突蛋白的抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體從用全長的天然MERS-CoV刺突蛋白，或用編碼其蛋白或片段的DNA獲得免疫的小鼠獲得(參見例如，GenBank登錄號AFS88936.1)(SEQIDNO:457)?？商鎿Q地，刺突蛋白或其片段可使用標準的生化技術產(chǎn)生并修飾和作為免疫原使用。在一個實施方案中，免疫原是MERS-CoV刺突蛋白的受體結合域(S1)。在本發(fā)明的一些實施方案中，免疫原是MERS-CoV刺突蛋白的片段，其范圍為SEQIDNO:457的約氨基酸殘基367-606。在一些實施方案中，免疫原可以是在大腸桿菌中或任何其他真核或哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表達的重組MERS-CoV刺突蛋白受體結合域肽。使用技術(參見例如，US6,596,541,RegeneronPharmaceuticals,)或任何其他已知的用于生成單克隆抗體的方法，初始分離對MERS-CoV-S的高親和力嵌合抗體，其具有人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)。技術涉及轉基因小鼠的生成，所述小鼠基因組包含與內源性小鼠恒定區(qū)基因座可操作連接的人重鏈和輕鏈可變區(qū)，從而小鼠產(chǎn)生對應抗原性刺激包含小鼠可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的抗體。分離編碼抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA并與編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的DNA可操作地連接。隨后在能夠表達全長人抗體的細胞中表達DNA。一般而言，小鼠用感興趣的抗原挑戰(zhàn)，并從表達抗體的小鼠回收淋巴細胞(如B-細胞)。淋巴細胞可與骨髓瘤細胞系融合以制備永生的雜交瘤細胞系，并篩選和選擇該雜交瘤細胞系以鑒定產(chǎn)生特異性針對感興趣抗原的抗體?？煞蛛x編碼重鏈和輕鏈的可變區(qū)的DNA并連接至重鏈和輕鏈的合意的同型恒定區(qū)。這種抗體蛋白可在細胞中產(chǎn)生，如CHO細胞。可替換地，編碼抗原特異性嵌合抗體或輕鏈和重鏈的可變域的DNA可直接從抗原特異性淋巴細胞分離。最初，分離高親和性嵌合抗體，其具有人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)。根據(jù)下文實驗部分，針對合意的特性包括親和力、選擇性、表位等表征并選擇抗體。小鼠恒定區(qū)使用合意的人恒定區(qū)替換以生成本發(fā)明的全長的人抗體，例如野生型或修飾的IgG1或IgG4。由于所選的恒定區(qū)可根據(jù)特定用途發(fā)生變化，高親和力抗原結合和靶特異性特征取決于可變區(qū)。生物等同物本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體和抗體片段涵蓋具有不同于所述抗體的氨基酸序列的蛋白，但其仍保持結合MERS-CoV刺突蛋白的能力。當與親代序列比較時，這種變體抗體和抗體片段包含一個或多個氨基酸添加、缺失或取代，但呈現(xiàn)與所述抗體本質上等同的生物活性。同樣地，當與公開的序列比較時，本發(fā)明編碼抗體的DNA序列涵蓋包含一個或多個核苷酸的添加、缺失或取代的序列，但其編碼與本發(fā)明的抗體或抗體片段本質上生物等同的抗體或抗體片段。如果例如兩種抗原結合蛋白或抗體是藥物等同物或藥物替代物，即當以相同的摩爾濃度(單劑量或多重劑量)在相似的實驗環(huán)境下施用時，其吸收的速率和程度未顯示顯著差異，則將其認作生物等同。一些抗體將認為是等同物或藥物替代物，如果它們在其吸收程度上等同但在其吸收速率上不等同但由于這種在吸收速率上的差異是刻意的且反映在標記上，對例如長期使用的有效機體藥物濃度的達成并非至關重要，則其可認為是生物等同的且認為是對于研究的特定藥物產(chǎn)品在醫(yī)學上非顯著的。在一個實施方案中，如果在其安全性、純度或效力上不存在臨床上有意義的差異時，認為兩種抗原結合蛋白是生物等同的。在一個實施方案中，如果患者可在參照產(chǎn)品間轉化一次或多次，且與無該轉換的持續(xù)療法相比，生物產(chǎn)品無副作用風險的預期增加(包括免疫原性中的臨床顯著性變化或消除的有效性)，則兩種抗原結合蛋白是生物等同的。在一個實施方案中，如果在使用情況下其都通過共同的一種作用機制或多種機制發(fā)揮作用至該機制已知的程度，則兩種抗原結合蛋白是生物等同的。生物等同性可通過體內和/或體外的方法證明。生物等同性的測量包括例如(a)人或其他哺乳動物中的體內測試，其中將在血液、血漿、血清或其他生物體液中測量的抗體或其代謝物的濃度作為時間的函數(shù)；(b)體外測試，其與人體內生物利用度數(shù)據(jù)相關且是對其合理的預測；(c)人或其他哺乳動物中的體內測試，其中抗體(或其靶標)適當?shù)募毙运幚碜饔米鳛闀r間的函數(shù)測量；和(d)在建立安全性、效力或生物利用度或抗體的生物等同性的良好控制的臨床試驗中。本發(fā)明抗體的生物等同變體可通過例如生成殘基或序列的不同取代或對于生活活性不需要的末端或內部殘基或序列的缺失來構建。例如對于生物活性不必須的半胱氨酸殘基可缺失或用其他氨基酸替換以防止復性時不需要的或不正確的分子內二硫橋的形成。其他語境中，生物等同抗體可包括含有氨基酸改變的抗體變體，其修飾抗體的糖基化特性，例如消除或去除糖基化的突變。包含F(xiàn)c變體的抗MERS-CoV-S抗體根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，提供了抗MERS-CoV-S抗體，其包含含有一個或多個增強或消除抗體與FcRn受體結合的突變的Fc結構域(例如相比中性pH在酸性pH)。例如，本發(fā)明包括在Fc結構域的CH2或CH3區(qū)中含有突變的抗MERS-CoV-S抗體，其中所述突變在酸性環(huán)境中增加Fc結構域與FcRn的親和力(例如在內涵體中，其中pH為約5.5至約6.0)。當施用于動物時，這種突變可導致抗體血清半衰期的增加。這種Fc修飾的非限制性實例包括例如在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)，254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)，或在位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如A、W、H、F或Y[N434A、N434W、N434H、N434F或N434Y])的修飾，或在位置250和/或428的修飾；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修飾。在一個實施方案中，所述修飾包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修飾；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾；250Q和428L修飾(例如T250Q和M428L)；和307和/或308修飾(例如308F或308P)。在另一實施方案其中，修飾包含265A(例如D265A)和/或297A(例如N297A)修飾。例如，本發(fā)明包括含有Fc結構域的抗MERS-CoV-S抗體，所述Fc結構域包含一個或多個選自下組的突變對或組：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；257I和311I(例如P257I和Q311I)；257I和434H(例如P257I和N434H)；376V和434H(例如D376V和N434H)；307A、380A和434A(例如T307A,E380A和N434A)；和433K和434F(例如H433K和N434F)。本文公開的抗體可變域內的前述Fc結構域突變和其他突變的全部可能的組合預期在本發(fā)明的保護范圍內。本發(fā)明還包括含有嵌合重鏈恒定區(qū)(CH)的抗MERS-CoV-S抗體，其中所述嵌合CH區(qū)包含源自多于一種免疫球蛋白同型的CH區(qū)的區(qū)段。例如，本發(fā)明的抗體可包含嵌合CH區(qū)，所述嵌合CH區(qū)含有與源自人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的CH3結構域的部分或全部組合的源自人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的部分或全部CH2結構域。根據(jù)一些實施方案，本發(fā)明的抗體包含具有嵌合鉸鏈區(qū)的嵌合CH區(qū)。例如，嵌合鉸鏈可包含與源自人IgG1、人IgG2或人IgG4分子鉸鏈區(qū)的"下鉸鏈"序列(根據(jù)EU編號位置228-236的氨基酸殘基)組合的源自人IgG1、人IgG2或人IgG4分子鉸鏈區(qū)的"上鉸鏈"氨基酸序列(根據(jù)EU編號位置216-227的氨基酸殘基)。根據(jù)一些實施方案，嵌合鉸鏈區(qū)包含源自人IgG1或人IgG4上鉸鏈的氨基酸殘基和源自人IgG2下鉸鏈的氨基酸殘基。在一些實施方案中，包含如本文所述的嵌合CH區(qū)的抗體可呈現(xiàn)修飾的Fc效應器功能而不負面影響抗體的治療或藥理學特性(參見例如2013年2月1日提交的美國臨時申請?zhí)?1/759,578，其公開內容由此通過提述以其整體并入)?？贵w的生物學特性一般而言，本發(fā)明的抗體通過與MERS-CoV刺突蛋白結合發(fā)揮功能。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體以高親和力與在MERS-CoV的刺突蛋白的受體結合域(RBD)中的一個或多個氨基酸結合。例如，本發(fā)明包括以少于20nM的KD結合二聚MERS-CoV刺突蛋白RBD(例如在25℃或在37℃)的抗體和抗體的抗原結合片段，如通過表面等離子體共振所測量的，例如使用如本文實施例4所定義的測定形式。在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段以少于約20nM、少于約10nM、少于約5nM、少于約2nM、少于約1nM、少于約500pM、少于約250pM或少于100pM的KD結合二聚MERS-CoV-S，如通過表面等離子體共振所測量的，例如使用如本文實施例4所定義的測定形式，或基本上相似的測定。本發(fā)明還包括以大于約2.1分鐘的解離半衰期(t1/2)結合MERS-CoV刺突蛋白的抗體及其抗原結合片段，如在25℃通過表面等離子體共振所測量的，例如使用如本文實施例4所定義的測定形式，或基本上相似的測定。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結合片段以大于約5分鐘、大于約10分鐘、大于約30分鐘、大于約50分鐘、大于約100分鐘、大于約150分鐘、大于約200分鐘或大于約250分鐘的t1/2結合MERS-CoV刺突蛋白，如在25℃通過表面等離子體共振所測量的，例如使用如本文實施例4所定義的測定形式(例如mAb-捕獲或抗原捕獲形式)，或基本上相似的測定。本發(fā)明還包括以大于1.5分鐘的解離半衰期(t1/2)結合MERS-CoV刺突蛋白的抗體及其抗原結合片段，如通過在37℃的表面等離子體共振所測量的，例如使用如本文實施例4所定義的測定形式，或基本上相似的測定。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結合片段以大于約2分鐘、大于約5分鐘、大于約10分鐘、大于約25分鐘、大于約50分鐘、大于約100分鐘、大于約150分鐘、大于約200分鐘的t1/2結合MERS-CoV刺突蛋白，如在37℃通過表面等離子體共振所測量的，例如使用如本文實施例4所定義的測定形式(例如mAb-捕獲或抗原捕獲形式)，或基本上相似的測定。本發(fā)明還包括阻斷大于90％的MERS-CoV-S與DPP4的結合的抗體或其抗原結合片段，如使用基于ELISA的免疫測定所確定的，例如在實施例2中所示，或基本上相似的測定。本發(fā)明還包括中和或抑制MERS-CoV對于其宿主細胞的感染性的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體中和MERS-CoV樣假顆粒(MERSpp)的感染性。在一些實施方案中，在優(yōu)化的病毒樣假顆粒(VLP)中和測定中，抗體抑制大于90％的人宿主細胞上的MERS-CoV結合，例如在實施例5中所示，或基本上相似的測定?？贵w以58.9pM至2.93nM的IC50中和MERSpp感染性。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體結合MERS-CoV刺突蛋白的受體結合域或結構域的片段。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體可與多于一個結構域結合(交叉反應性抗體)。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體可結合位于受體結合域中的包含MERS-CoV-S的氨基酸殘基367-606的表位。在一個實施方案中，抗體可結合包含一個或多個選自下組的氨基酸的表位：SEQIDNO:457中所述的氨基酸殘基367-606。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體可通過阻斷或抑制與MERS-CoV刺突蛋白相關的DPP4-結合活性通過與全長蛋白(SEQIDNO:457所述的序列)的任何其他區(qū)或片段結合而發(fā)揮功能。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體可以是雙特異性抗體。本發(fā)明的雙特異性抗體可結合一個結構域中的一個表位且還可結合在MERS-CoV刺突蛋白的相同或不同的結構域中的第二表位。在一些實施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體可結合相同結構域中的兩個不同表位。在一個實施方案中，本發(fā)明提供特異性結合MERS-CoV刺突蛋白的分離的重組抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其片段呈現(xiàn)一種或多種下列特征：(a)為全長的人單克隆抗體；(b)與在MERS-CoV刺突蛋白的受體結合域中的一個或多個氨基酸殘基相互作用，其中所述氨基酸殘基選自SEQIDNO:457的氨基酸殘基367-606；(c)與MERS-CoV刺突蛋白以小于18.5nM的解離常數(shù)(KD)結合，如在表面等離子體共振測定中所測量的；(d)阻斷MERS-CoV刺突蛋白與二肽基肽酶4大于90％的結合，如在阻斷ELISA測定中所測量的；(e)中和人宿主細胞大于90％的MERS-CoV感染性且具有小于4nM的IC50，如在VLP中和測定中所測量的；(f)中和MERS-CoV感染性，其中所述MERS-CoV包含選自下組的病毒的分離株：EMC/2012、Jordan-N3/2012、England-Qatar/2012、Al-Hasa_1_2013、Al-Hasa_2_2013、Al-Hasa_3_2013、Al-Hasa_4_2013、Al-Hasa_12、Al-Hasa_15、Al-Hasa_16、Al-Hasa_17、Al-Hasa_18、Al-Hasa_19、Al-Hasa_21、Al-hasa_25、Bisha_1、Buraidah_1、England1、Hafr-Al-batin_1、Hafr-Al-Batin_2、Hafr-Al-Batin_6、Jeddah_1、KFU-HKU1、KFU-HKU13、Munich、Qatar3、Qatar4、Riyadh_1、Riyadh_2、Riyadh_3、Riyadh_3、Riyadh_4、Riyadh_5、Riyadh_9、Riyadh_14、Taif_1、UAE和Wadi-Ad-Dawasir；(g)在以MERS-CoV感染的受試者中阻斷MERS-CoV體內復制；和(h)為雙特異性抗體，其包含與MERS-CoV刺突蛋白的受體結合域中第一表位的第一結合特異性和與MERS-CoV刺突蛋白的受體結合域中第二表位的第二結合特異性，其中所述第一和第二表位是不同的和非重疊的。本發(fā)明的抗體可具有一種或多種上述生物學特性，或其任何組合。本發(fā)明抗體的其他生物學特性以本文為基礎包括本文的工作實施例對本領域的技術人員將變得顯而易見。表位映射和相關技術本發(fā)明包括抗MERS-CoV-S抗體，其與在MERS-CoV刺突蛋白分子的一個或多個結構域內發(fā)現(xiàn)的一個或多個氨基酸相互作用，所述氨基酸包括N末端S1結構域(氨基酸殘基1-751)和C末端S2結構域(氨基酸殘基752-1353)?？贵w與之結合的表位可由位于任何上述MERS-CoV刺突蛋白分子的結構域內的3個或更多(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)氨基酸的單一連續(xù)序列組成(例如結構域中的線性表位)。可替換地，表位可由位于刺突蛋白分子的上述結構域之一或兩者內的多個非連續(xù)氨基酸(或氨基酸序列)組成(例如構象表位)。本領域的技術人員已知的多種技術可用于確定抗體是否與多肽或蛋白內的“一個或多個氨基酸相互作用”。示例性的技術包括例如，常規(guī)的交叉阻斷測定，如抗體中所述，Harlow和Lane(ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY)。其他方法包括丙氨酸掃描突變分析、肽印跡分析(Reineke(2004)MethodsMol.Biol.248:443-63)、肽裂解分析晶體學研究和NMR分析。此外，可采用方法如抗原的表位切除、表位提取和化學修飾(Tomer(2000)Prot.Sci.9:487-496)?？捎糜阼b定多肽內抗體與之相互作用的氨基酸的另一方法是通過質譜檢測的氫/氘交換。一般而言，氫/氘交換的方法涉及氘標記感興趣的蛋白，隨后使抗體與氘標記的蛋白結合。接下來，將蛋白/抗體復合物轉移至水并通過抗體復合物保護的氨基酸內的可交換質子以低于并非為界面部分的氨基酸內可交換的質子的速率經(jīng)歷氘至氫的回復交換。結果是，形成蛋白/抗體界面部分的氨基酸可保留氘并因此呈現(xiàn)比未包括在界面內的氨基酸更高的質量?？贵w解離后，對靶蛋白進行蛋白酶裂解和質譜分析，由此揭示對應抗體與之相互作用的特定氨基酸的氘標記的殘基。參見例如Ehring(1999)AnalyticalBiochemistry267:252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。術語"表位"指B和/或T細胞對其響應的抗原上的位點。B細胞表位可從通過蛋白的三級折疊并置的非連續(xù)的氨基酸或連續(xù)的氨基酸形成。由連續(xù)的氨基酸形成的表位通常保持對變性溶劑的暴露，而由三級折疊形成的表位通常因變性溶劑的處理而喪失。表位通常在特定的空間構象中包括至少3個或更多，通常至少5個或8-10個氨基酸。修飾輔助的分析(MAP)，也稱為基于抗原結構的抗體分析(ASAP)，是一種根據(jù)每種抗體與化學或酶學修飾的抗原表面結合概貌的相似性對針對相同抗原的大量單克隆抗體(mAb)分類的方法(參見US2004/0101920，其在本文通過提述以其整體具體并入)。每個種類可反映與由另一種類代表的表位完全不同或部分重疊的特定表位。該技術允許基因上相同的抗體的迅速過濾，從而表征可專注于基因上不同的抗體。當應用至雜交瘤篩選時，MAP可促進產(chǎn)生具有合意的特性的mAb的罕見雜交瘤克隆的鑒定。MAP可用于將本發(fā)明的抗體分選入結合不同表位的抗體的組。在一些實施方案中，抗MERS-CoV-S抗體或其抗原結合片段結合在MERS-CoV刺突蛋白(如SEQIDNO:457中所示的天然形式或如SEQIDNO:458中所示的重組產(chǎn)生的)或其片段中所示的任何一個或多個區(qū)內的表位。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體與包含選自MERS-CoV刺突蛋白的氨基酸殘基367-606的一個或多個氨基酸的胞外區(qū)結合。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體與選自下組的至少一個氨基酸序列相互作用：SEQIDNO:457的約位置358至約位置450的氨基酸殘基；或約位置451至約位置606的氨基酸殘基。本發(fā)明包括與相同的表位或表位部分結合的抗MERS-CoV-S抗體，如從圖1列舉的細胞系獲得的任何具體示例性抗體。同樣，本發(fā)明還包括與任何從圖1列舉的雜交瘤獲得的具體的示例性抗體競爭對MERS-CoV刺突蛋白或其片段的結合的抗MERS-CoV-S抗體。例如，本發(fā)明包括與一種或多種從圖1列舉的雜交瘤獲得的抗體交叉競爭對MERS-CoV刺突蛋白的結合的抗MERS-CoV-S抗體。通過使用本領域已知的常規(guī)方法，技術人員可容易地確定抗體是否與參照抗MERS-CoV-S抗體結合相同的表位，或與其競爭對相同表位的結合。例如，為確定測試的抗體是否與本發(fā)明的參照抗MERS-CoV-S抗體結合相同的表位，在飽和條件下，允許參照抗體結合MERS-CoV刺突蛋白或肽。接下來，評估測試的抗體與MERS-CoV刺突蛋白分子結合的能力。如果與參照MERS-CoV-S抗體飽和結合后，測試的抗體能夠與MERS-CoV-S結合，可以得出的結論是測試的抗體與參照抗MERS-CoV-S抗體結合不同的表位。另一方面，如果與參照MERS-CoV刺突蛋白飽和結合后，測試的抗體不能與MERS-CoV刺突蛋白結合，則測試的抗體可結合與本發(fā)明的參照抗MERS-CoV-S抗體所結合的表位相同的表位。為確定抗體是否與參照抗MERS-CoV-S抗體競爭結合，以兩種方向實施上述結合方法：在第一方向，允許參照抗體在飽和條件下與MERS-CoV刺突蛋白結合，隨后評估測試的抗體與MERS-CoV-S分子的結合。在第二方向，允許測試的抗體在飽和條件下與MERS-CoV-S分子結合，隨后評估參照抗體與MERS-CoV-S分子的結合。如果在兩種方向中，僅第一(飽和)抗體能夠與MERS-CoV-S分子結合，則可以得出的結論是測試的抗體與參照抗體競爭對MERS-CoV-S的結合。本領域的技術人員將理解的是，與參照抗體對對結合競爭的抗體可不必須結合與參照抗體相同的表位，但在空間上可通過結合重疊或相鄰的表位阻斷參照抗體的結合。如果每種抗體競爭性地抑制(阻斷)另一種與抗原的結合，則兩種抗體結合相同或重疊的表位。也就是說，如在競爭性結合測定中所測量的，1、5、10、20或100倍過量的一種抗體抑制另一種至少50％但優(yōu)選75％、90％或甚至99％的結合(參見例如Junghans等，CancerRes.199050:1495-1502)?？商鎿Q地，如果抗原中減少或消除一種抗體的結合的基本上全部的氨基酸突變減少或消除另一種的結合，則兩種抗體具有相同的表位。如果減少或消除一種抗體的結合的一些氨基酸突變減少或消除另一種的結合，則兩種抗體具有重疊的表位。可隨后實施其他常規(guī)的實驗(例如肽突變和結合分析)以確認觀察到的測試的抗體結合的缺失是否事實上是由于與參照抗體結合相同的表位或是否是空間阻斷(或另一種現(xiàn)象)對觀察到的結合的進行負責。該分選的實驗可使用ELISA、RIA、表面等離子體共振、流式細胞術或任何其他本領域可獲得的定量或定性的抗體結合測定實施。免疫綴合物本發(fā)明涵蓋與治療部分如類毒素或抗病毒藥物綴合以治療MERS感染的人抗MERS-CoV-S單克隆抗體(“免疫綴合物”)。如本文使用，術語“免疫綴合物”指與放射性作用劑、細胞因子、干擾素、靶或報告物部分、酶、肽或蛋白或治療劑化學或生物連接的抗體?？贵w可沿分子的任何位置連接至放射性作用劑、細胞因子、干擾素、靶或報告物部分、酶、肽或治療劑，只要其能夠結合其靶。免疫綴合物的實例包括抗體藥物綴合物和抗體-毒素融合蛋白。在一個實施方案中，作用劑可以是針對MERS-CoV刺突蛋白的第二種不同的抗體。在一些實施方案中，抗體可與特異于病毒感染的細胞的作用劑綴合?？膳c抗MERS-CoV-S抗體綴合的治療部分的類型應考慮待治療的病況和將實現(xiàn)的理想的治療效果。用于形成免疫綴合物的適當?shù)淖饔脛┑膶嵗秊楸绢I域已知，參見例如WO05/103081。多特異性抗體本發(fā)明的抗體可以是單特異性的、雙特異性的或多特異性的。多特異性抗體可以特異性針對靶多肽的不同表位或可包含特異性針對多于一種的靶多肽的抗原結合域。參見例如Tutt等，1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等，2004,TrendsBiotechnol.22:238-244。本發(fā)明的任何多特異性抗原結合分子或其變體可使用標準的分子生物學技術構建(例如重組DNA和蛋白表達技術)，如本領域的技術人員已知。在一些實施方案中，MERS-CoV-S-特異性抗體以雙特異性的形式生成("雙特異性")，其中與MERS-CoV刺突蛋白的不同結構域結合的可變區(qū)連接在一起以在單結合分子內賦予雙結構域特異性。適當設計的雙特異性抗體可通過增加特異性和結合親合力增強總體的MERS-CoV-刺突蛋白抑制性效力。具有針對單結構域的特異性的可變區(qū)(例如N末端結構域的區(qū)段)，或可與一個結構域內的不同區(qū)結合的可變區(qū)在允許每個區(qū)同時與不同表位結合或允許每個區(qū)與一個結構域內的不同區(qū)結合的結構支架上配對。在雙特異性抗體的一個實例中，來自一個結合的具有針對一個結構域的特異性的重鏈可變區(qū)(VH)與來自系列結合的具有針對第二結構域的輕鏈可變區(qū)(VL)重組以識別可與最初的VH配對而不破壞針對該VH的最初的特異性的非同源VL伴侶。以這種該方式，單VL區(qū)段(例如VL1)可與兩種不同的VH結構域(例如VH1和VH2)組合以生成包含兩個結合"臂"的雙特異性抗體(VH1-VL1和VH2-VL1)。單VL區(qū)段的使用減少系統(tǒng)的復雜性且由此簡化生成雙特異性抗體使用的克隆、表達和純化步驟并增加其效率(參見例如，USSN13/022759和US2010/0331527)?？商鎿Q地，結合多于一個結構域的第二靶如但不限于第二種不同的抗MERS-CoV-S抗體的抗體可使用本文所述的技術或其他本領域的技術人員已知的技術以雙特異性的形式制備。與不同的區(qū)結合的抗體可變區(qū)可與結合例如在MERS-CoV-S的胞外結構域上相關位點的可變區(qū)連接在一起，以在單結合分子內賦予雙抗原特異性。適當設計的該雙特異性性質可作為雙功能發(fā)揮作用。具有針對胞外結構域的特異性的可變區(qū)與具有針對胞外結構域的外側的可變區(qū)組合，且在允許每個可變區(qū)與不同抗原結合的結構支架上配對?？稍诒景l(fā)明的語境中使用的示例性的雙特異性抗體形式涉及第一免疫球蛋白(Ig)CH3結構域和第二IgCH3結構域的使用，其在第一和第二IgCH3結構域通過至少一個氨基酸彼此不同，且其中至少一個氨基酸的差異相比缺乏氨基酸差異的雙特異性抗體減少了雙特異性抗體與蛋白A的結合。在一個實施方案中，第一IgCH3結構域結合蛋白A和第二IgCH3結構域包含減少或阻斷蛋白A結合的突變如H95R修飾(通過IMGT外顯子編號；H435R通過EU編號)。第二CH3可進一步包含Y96F修飾(通過IMGT；通過EU為Y436F)。在IgG1抗體的情況中，可在第二CH3內發(fā)現(xiàn)的其他突變包括：在IgG1抗體的情況中，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(通過IMGT；通過EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗體的情況中，N44S、K52N,和V82I(IMGT；通過EU為N384S、K392N和V422I)；且在IgG4抗體的情況中，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(通過IMGT；通過EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上文所述的雙特異性抗體形式上的變化預期在本發(fā)明的范圍之內?？稍诒景l(fā)明的語境中使用的其他示例性的雙特異性形式包括但不限于例如基于scFv或雙抗體的雙特異性形式、IgG-scFv融合、雙可變域(DVD)-Ig、Quadroma、旋鈕入孔、通用輕鏈(例如具有旋鈕入孔的通用輕鏈等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)體、亮氨酸拉鏈、雙體(Duobody)、IgG1/IgG2、雙作用Fab(DAF)-IgG和Mab2雙特異性形式(參見例如Klein等2012，mAb4:6，1-11和其中引用的文獻，用于上述形式的綜述)。雙特異性抗體還可使用肽/核酸綴合構建，例如其中具有正交化學反應性的非天然的氨基酸用于生成位點特異性抗體-寡核苷酸綴合物，其隨后自我裝配成為具有限定組成、效價和幾何的多聚復合物(參見例如Kazane等，J.Am.Chem.Soc.[Epub:Dec.4,2012])。治療性施用和配制本發(fā)明提供包含本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體或其抗原結合片段的治療組合物。依照本發(fā)明的治療組合物將與適當?shù)妮d劑、賦形劑和其他并入以提供改善的轉移、遞送、耐受等的作用劑共同施用。多種適當?shù)闹苿┛稍谌w藥物化學家已知的處方集中發(fā)現(xiàn)：Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton,PA。這些制劑包括例如粉末、糊劑、軟膏、膠凍、蠟、油、脂質、包含脂質(陽離子或陰離子)的囊泡(如LIPOFECTINTM)、DNA綴合物、無水吸收膏、水包油和油包水乳液、乳液碳蠟(多種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠和含有碳蠟的半固體混合物。還參見Powell等“Compendiumofexcipientsforparenteralformulations”PDA(1998)JPharmSciTechnol52:238-311?？贵w的劑量取決于待施用受試者的年齡和體型、靶向的疾病、病況、施用途徑等可發(fā)生變化。當將本發(fā)明的抗體用于治療成年患者中的疾病或病癥時，或用于預防該疾病時，有利的是以約0.1至約60mg/kg體重，更優(yōu)選約5至約60，約10至約50或約20至約50mg/kg體重的單劑量正常地施用本發(fā)明的抗體。取決于病況的嚴重性，可調整治療的頻率和持續(xù)時間。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段可以至少約0.1mg至約800mg、約1至約500mg、約5至約300mg或約10至約200mg、至約100mg或至約50mg的初始劑量施用。在一些實施方案中，初始劑量后以與初始劑量大致相同或較少的量施用第二或多次后續(xù)劑量的抗體或其抗原結合片段，其中后續(xù)劑量通過至少1天至3天；至少1周、至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；至少14周分隔。已知多種遞送系統(tǒng)且可用于施用本發(fā)明的藥物組合物，例如封裝在脂質體、微粒、微膠囊中，能夠表達突變病毒的重組細胞、受體介導的內吞(參見例如Wu等(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)。導入的方法包括但不限于皮內、透皮、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服途徑。組合物可通過任何方便的途徑施用，例如通過輸液或推注、通過經(jīng)上皮或粘膜皮層的吸收(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)且可與其他生物活性作用劑共同施用。可全身或局部施用。藥物組合物還可在囊泡中遞送，特別是脂質體(參見例如，Langer(1990)Science249:1527-1533)。遞送本發(fā)明抗體的納米顆粒的使用預期也在本文中?？贵w綴合的納米顆粒還可用于治療和診斷應用兩者?？贵w綴合的納米顆粒和制備方法及用途由Arruebo,M.,等2009(“Antibody-conjugatednanoparticlesforbiomedicalapplications”inJ.Nanomat.Volume2009,ArticleID439389,24pages,doi:10.1155/2009/439389)詳細描述，其在本文通過提述并入?？砷_發(fā)納米顆粒并與包含在藥物組合物中的抗體綴合以靶向病毒感染的細胞。用于藥物遞送的納米顆粒已描述于例如US8257740或US8246995，每一篇在本文以其整體并入。在一些情況中，藥物組合物可在受控的釋放系統(tǒng)中遞送。在一個實施方案中，可使用泵。在另一個實施方案中，可使用多聚材料。在另一個實施方案中，受控的釋放系統(tǒng)可置于組合物靶的附近，因此僅需要全身劑量的一部分?？勺⑸涞闹苿┛砂ㄓ糜陟o脈內、皮下、皮內、顱內、腹膜內和肌內注射、滴注等的劑型。這些可注射的制劑可通過公共已知的方法制備。例如，可通過在常規(guī)用于注射的無菌水性介質或油性介質中溶解、懸浮或乳化上述抗體或其鹽制備可注射的制劑。作為用于注射的水性介質，存在例如生理鹽水、含有葡萄糖和其他輔助劑的等滲溶液等，其可與適當?shù)脑鋈軇┤绱?例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面活性劑[例如聚山梨醇酯80、氫化蓖麻油的HCO-50(聚氧乙烯(50mol)加合物)]等組合使用。作為油性介質，存在采用的例如芝麻油、大豆油等，其可與增溶劑如苯甲酸芐酯、芐醇等組合使用。因此制備的注射劑優(yōu)選填充在適當?shù)陌碴持小１景l(fā)明的藥物組合物可使用標準的針和注射器皮下或靜脈內遞送。此外，關于皮下遞送，筆遞送裝置容易地具有在遞送本發(fā)明藥物組合物中的應用。這種筆遞送裝置可重復使用或是一次性的?？芍貜褪褂玫墓P遞送裝置一般利用包含藥物組合物的可替換的盒。一旦在盒內的全部藥物組合物已施用且盒已空，可容易地丟棄空盒并以新的包含藥物組合物的盒替換。可重復使用筆遞送裝置。在一次性的筆遞送裝置中，不存在可替換的盒。而是一次性的筆遞送裝置使用保持在裝置內容器中的藥物組合物預先填充。一旦容器無藥物組合物，則丟棄整個裝置。多種可重復使用的筆和自動注射遞送裝置在本發(fā)明藥物組合物的皮下遞送中具有應用。實例包括但當然不限于，AUTOPENTM(OwenMumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM筆(DisetronicMedicalSystems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOGMIX75/25TM筆、HUMALOGTM筆、HUMALIN70/30TM筆(EliLilly和Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI、II和III(NovoNordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPENJUNIORTM(NovoNordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM筆(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPENPROTM、OPTIPENSTARLETTM和OPTICLIKTM(Sanofi-Aventis,Frankfurt,Germany)，僅舉幾例。在本發(fā)明的藥物組合物的皮下遞送中具有應用的一次性筆遞送裝置的實例包括但當然不限于，SOLOSTARTM筆(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(NovoNordisk)和KWIKPENTM(EliLilly)、SURECLICKTMAutoinjector(Amgen,ThousandOaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM筆(AbbottLabs,AbbottPark,IL)，僅舉幾例。有利的是，用于上述口服或腸胃外使用的藥物組合物制備為適于匹配活性成分劑量的單位劑量中的劑型。這種在單位劑量中的劑型包括例如片劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑等。在單位劑量特別是在注射形式中包含的抗體的量一般為約5至約500mg每劑型；優(yōu)選的是對于其他劑型包含約5至約100mg和以約10至約250mg的抗體?？贵w的治療性用途本發(fā)明的抗體可用于治療和/或預防與MERS冠狀病毒如MERS感染相關的疾病或病癥或病況和/或用于改善與該疾病、病癥或病況相關的至少一種癥狀。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段可以治療劑量施用于具有MERS感染的患者。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體用于治療由MERS冠狀病毒引起的患有嚴重和急性呼吸感染的受試者。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體用于在宿主中減少病毒滴度或減少病毒裝載。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體用于預防或減少具有MERS的受試者的肺中的炎癥。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體用于預防或減少具有MERS的受試者中的間質、外周支氣管或外周血管的炎癥、肺泡損傷和胸膜變化?？墒┯帽景l(fā)明的一種或多種抗體以釋放或預防或減少疾病或病癥的一種或多種癥狀或病況。抗體可用于改善或減少MERS感染的至少一種癥狀的嚴重性，包括但不限于由如下組成：發(fā)熱、咳嗽、呼吸淺短、肺炎、腹瀉、器官衰竭(例如腎衰和腎功能不全)、敗血性休克和死亡。本文還預期預防性地使用一種或多種本發(fā)明的抗體至處于發(fā)展MERS感染的風險的受試者如免疫功能低下的個體、老年人(年齡大于65歲)、年齡小于2歲的兒童、至中東國家的旅行者(例如沙特阿拉伯、阿拉伯聯(lián)合酋長國和卡塔爾)、醫(yī)護人員、與駱駝或蝙蝠具有職業(yè)或娛樂接觸的人、與MERS患者密切接近的家庭成員、與確認或疑似MERS感染的患者接觸的成人或兒童，和具有醫(yī)療史(例如增加的肺部感染、心臟病或糖尿病的風險)的患者。在本發(fā)明進一步的實施方案中，本發(fā)明的抗體用于制備治療患有MERS感染的患者的藥物組合物或藥物。在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明的抗體用作本領域的技術人員已知用于治療或改善MERS感染的任何其他作用劑或任何其他療法的輔助療法。組合療法組合療法可包括本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體和任何其他可有利地的與本發(fā)明的抗體或與本發(fā)明抗體的生物活性片段組合的治療劑。本發(fā)明的抗體可與一種或多種用于治療MERS的藥物或療法協(xié)同組合。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體可與第二治療劑組合以減少具有MERS感染的患者中的病毒裝載，或改善感染的一個或多個癥狀。本發(fā)明的抗體可與下述組合使用：抗炎癥藥物(例如皮質類固醇和非甾體抗炎癥藥物)、抗感染藥物、針對MERS-CoV刺突蛋白的不同的抗體、抗病毒藥物、干擾素-α-2b加肌內利巴韋林、恢復期血漿、主要病毒蛋白酶的抑制劑和靶向MERS-CoV刺突蛋白的進入/融合抑制劑、對于MERS-CoV的疫苗、抗生素、膳食補充劑如抗氧化劑或任何其他治療MERS感染的姑息治療。在一些實施方案中，第二治療劑是MERS-CoV刺突蛋白的另一抗體。本文預期使用具有針對MERS-CoV的廣泛的中和或抑制活性的抗體的組合(“雞尾酒”)。在一些實施方案中，可組合非競爭性抗體并施用于對其有需要的受試者，以減少MERS病毒由于選擇壓力而迅速突變所致逃脫的能力。在一些實施方案中，包含組合的抗體與刺突蛋白上的不同非重疊表位結合。包含組合的抗體可阻斷MERS-CoV與DPP4的結合或可防止/抑制膜融合。包含組合的抗體可抑制一個或多個MERS-CoV分離株的MERS-CoV活性，所述分離株包括但不限于EMC/2012、Jordan-N3/2012、England-Qatar/2012、Al-Hasa_1_2013、Al-Hasa_2_2013、Al-Hasa_3_2013、Al-Hasa_4_2013、Al-Hasa_12、Al-Hasa_15、Al-Hasa_16、Al-Hasa_17、Al-Hasa_18、Al-Hasa_19、Al-Hasa_21、Al-hasa_25、Bisha_1、Buraidah_1、England1、Hafr-Al-batin_1、Hafr-Al-Batin_2、Hafr-Al-Batin_6、Jeddah_1、KFU-HKU1、KFU-HKU13、Munich、Qatar3、Qatar4、Riyadh_1、Riyadh_2、Riyadh_3、Riyadh_3、Riyadh_4、Riyadh_5、Riyadh_9、Riyadh_14、Taif_1、UAE和Wadi-Ad-Dawasir。本文還預期使用本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體的組合，其中所述組合包含一種或多種不交叉競爭的抗體；在一些實施方案中，所述組合包括具有廣泛中和活性的第一抗體與具有針對較窄范圍的分離株且不與第一抗體交叉競爭的第二抗體。如本文使用，術語“與…組合”意為其他治療活性組分可在施用本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體之前、與其同時或之后施用。術語“與…組合”還包括抗MERS-CoV-S抗體和第二治療劑的順序或伴隨施用?？稍谑┯帽景l(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體前將其他治療活性組分施用于受試者。例如，如果第一抗體在第二抗體施用的1周前、72小時前、60小時前、48小時前、36小時前、24小時前、12小時前、6小時前、5小時前、4小時前、3小時前、2小時前、1小時前、30分鐘前、15分鐘前、10分鐘前、5分鐘前或少于1分鐘前施用，則認為第一組分可在第二組分“前”施用。在其他實施方案中，其他治療活性組分可在施用本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體后施用于受試者。例如，如果第一組分在第二組分施用1分鐘后、5分鐘后、10分鐘后、15分鐘后、30分鐘后、1小時后、2小時后、3小時后、4小時后、5小時后、6小時后、12小時后、24小時后、36小時后、48小時后、60小時后、72小時后施用，則認為第一組分在第二組分“后”施用。在其他實施方案中，可將其他治療活性組分在施用本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體同時施用于受試者。就本發(fā)明而言，"同時"施用包括將例如抗MERS-CoV-S抗體和其他治療活性組分在單一劑型中施用于受試者或在分開的劑型中在約30分鐘或彼此更短的時間內施用于受試者。如果以分開的劑型施用，每個劑型可經(jīng)由相同的途徑施用(例如抗MERS-CoV-S抗體和其他治療活性組分兩者可靜脈內施用等)；可替換地，每種劑型可經(jīng)由不同的途徑施用(例如抗MERS-CoV-S抗體可靜脈內施用，而其他治療活性則分可口服施用)。就本發(fā)明而言，在任何事件中，組分在單一劑型中的施用、通過相同途徑的不同劑型中的施用或通過不同途徑以不同劑型施用都認為是"同時施用"。就本發(fā)明而言，抗MERS-CoV-S抗體在其他治療活性組分施用“前”、“同時”或“后”施用認為是抗MERS-CoV-S抗體與其他治療活性組分"組合"施用。本發(fā)明包括藥物組合物，其中本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體與本文他處所述的一種或多種其他的治療活性組分共配制。施用方案根據(jù)一些實施方案，單一劑量的本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體(或包含抗MERS-CoV-S抗體和任何其他本文提及的治療活性作用劑的組合的藥物組合物)可施用于對其有需要的受試者。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，多重劑量的抗MERS-CoV-S抗體(或包含抗MERS-CoV-S抗體和任何其他本文提及的治療活性作用劑的組合的藥物組合物)可經(jīng)過限定的時間過程施用于受試者。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括將本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體的多重劑量順序施用于受試者。如本文使用，“順序施用”意為每劑量的抗MERS-CoV-S抗體在時間上不同的點施用于受試者，例如在通過預先確定的時間間隔(例如小時、日、周或月)分開的不同日。本發(fā)明包括方法，其包括對患者順序施用單一初始劑量的抗MERS-CoV-S抗體，隨后一次或多次第二劑量的抗MERS-CoV-S抗體，且任選地隨后是一次或多次第三劑量的抗MERS-CoV-S抗體。術語“初始劑量”、“第二劑量”和“第三劑量”指施用本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體的時間序列。因此，“初始劑量”是在治療方案的開始施用的劑量(也稱作“基線劑量”)；“第二劑量”是在初始劑量后施用的劑量；且“第三劑量”是在第二劑量后施用的劑量。初始、第二和第三劑量都可包含相同的量的抗MERS-CoV-S抗體，但一般就施用頻率上可彼此不同。然而在一些實施方案中，包含在初始、第二和/或第三劑量中的抗MERS-CoV-S抗體的量在治療過程中彼此不同(例如酌情上調或下調)。在一些實施方案中，在治療方案的開始施用兩個或多個(例如2、3、4或5)個劑量作為“裝載劑量”，隨后是以更少頻率為基礎施用的后續(xù)劑量(例如“維持劑量”)。在一些本發(fā)明示例性的實施方案中，每個第二和/或第三劑量在之前劑量后即刻1-48小時(例如1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更久)施用。如本文使用的短語“之前的劑量后即刻”指在多重施用順序中，在施用順序上無間隔劑量的緊接下來劑量之前施用于患者的抗MERS-CoV-S抗體的劑量。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法可包括對患者施用任何數(shù)目的第二和/或第三劑量的抗MERS-CoV-S抗體。例如，在一些實施方案中，僅對患者施用單次第二劑量。在其他實施方案中，對患者施用兩次或多次(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第二劑量。同樣地，在一些實施方案中，僅對患者施用單次第三劑量。在其他實施方案中，對患者施用兩次或多次(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第三劑量。在本發(fā)明的一些實施方案中，施用于患者的第二和/或第三劑量的頻率可在治療方案的過程中發(fā)生變化。在治療過程中，施用的頻率還可由醫(yī)師根據(jù)個體患者臨床檢查后的需要調整。抗體的診斷用途本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體可用于檢測和/或測量樣品中的MERS-CoV，例如用于診斷目的。一些實施方案預期在測定中使用本發(fā)明的一種或多種抗體以檢測疾病或病癥如病毒感染。用于MERS-CoV的示例性診斷測定包括例如使用本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體接觸從患者獲得的樣品，其中使用可檢測的標記或報告分子標記抗MERS-CoV-S抗體或用作捕獲配體以選擇性地從患者樣品分離MERS-CoV。可替換地，未標記的抗MERS-CoV-S抗體可與本身被可檢測地標記的第二抗體組合在診斷應用中使用?？蓹z測的標記或報告分子可以是放射性同位素、如3H、14C、32P、35S或125I；熒光或化學發(fā)光的部分如熒光素異硫氰酸酯或羅丹明，或酶如堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶或熒光素酶?？捎糜跈z測或測量樣品中MERS-CoV的具體的示例性測定包括酶連接的免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)和熒光活化細胞分選(FACS)。可在根據(jù)本發(fā)明的MERS-CoV診斷測定中使用的樣品包括從患者可獲得的任何組織或液體樣品、，其包含在正?；蛏項l件下可檢測量的MERS-CoV刺突蛋白或其片段。一般而言，將測量從健康患者獲得的特定樣品中的MERS-CoV刺突蛋白水平(例如未受與MERS-CoV相關的疾病所擾的患者)以初始性地建立基線或標準MERS-CoV水平。該MERS-CoV基線水平可隨后與從疑似具有MERS-CoV相關病況或與該病況相關的癥狀的個體獲得的樣品中測量的MERS-CoV水平進行比較。特異性針對MERS-CoV刺突蛋白的抗體可不包含其他標記或部分，或其可包含N-末端或C末端的標記或部分。在一個實施方案中，標記或部分是生物素。在結合測定中，標記(如果存在的話)的位置可確定肽相對肽與之結合的表面的方向。例如，如果表面以抗生物素蛋白涂覆，包含N末端生物素的肽將定向，從而肽的C末端部分將遠離表面。實施例描述下列實施例從而為本領域的技術人員提供如何制備和使用本發(fā)明的組合物和方法的完整公開和描述，且并非意在限制發(fā)明人所認為的其發(fā)明的保護范圍。已作出努力來確保關于使用的數(shù)字的精確性(例如數(shù)量、溫度等)，但一些試驗誤差和偏差應考慮在內。除非另外指示，部分是按體重的部分，分子量是平均分子量，溫度時攝氏度，室溫為約25℃且壓力是處于或接近大氣壓。實施例1：針對MERS-CoV刺突蛋白的人抗體的生成在小鼠中生成MERS-CoV刺突蛋白的人抗體，所述小鼠包含編碼人免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈可變區(qū)的DNA。所述小鼠用編碼全長的MERS-CoV刺突蛋白的DNA構建體免疫，隨后進行包含純化的刺突蛋白片段(GenBank登錄號AFS88936.1(SEQIDNO:457)的氨基酸367-606)的加強免疫。編碼MERS-CoVS蛋白(EMC/2012-GenBankJX869059)的密碼子優(yōu)化的cDNA序列通過GeneArt合成并克隆入標準的表達載體。編碼受體結合域(RBD)中的MERS-CoVS蛋白變體的質粒使用QuikChangeII(AgilentTechnologies)根據(jù)制造商的說明書通過誘變生成?？贵w免疫響應通過MERS-CoV-S特異性免疫測定監(jiān)測。當獲得合意的免疫響應時，收獲脾細胞并與小鼠的骨髓瘤細胞融合以保留其可變性并形成雜交瘤細胞系。篩選并選擇雜交瘤細胞系以鑒定產(chǎn)生MERS-CoV-S特異性抗體的細胞系。對于表達抗原特異性抗體的一共696個雜交瘤，發(fā)現(xiàn)182個阻斷DPP4與刺突蛋白的相互作用且123個阻斷MERSpp進入靶細胞。以該方式生成的示例性的細胞系命名為HBVX06H05、HBVX11H04、HBVX11D02、HBVZ10E10、HBVY09F08、HBVZ05G02、HBVZ09B06、HBVY01F08、HBVY10G02、HBVY04B06、HBVY07D10、HBVZ08A09、HBVZ05G04、HBVY06C07、HBVY03H06、HBVZ10G06、HBVZ04F10、HBVX11E09、HBVY06H09、HBVZ05B11、HBVY02E05和HBVZ04C07。使用細胞系以獲得數(shù)種抗MERS-CoV-S嵌合抗體(即具有人可變域和小鼠恒定域的抗體)；以這種方式生成的示例性的抗體命名為H1M15277N、H2aM15279N、H1M15280N、H2aM15278N、H2aM15271N、H1M15267N、H2bM15292N、H2bM15291N、H1M15290N、H1M15293N、H1M15289N、H1M15269N、H2aM15287N、H1M15288N、H2aM15268N、H2aM15270N、H2aM15281N和H2aM15272N。表1顯示從相應的雜交瘤上清獲得的嵌合抗體表1AbPID#克隆名稱H1M15267NHBVX11H04H1M15269NHBVY07D10H1M15277NHBVX06H05H1M15280NHBVZ09B06H1M15288NHBVY02E05H1M15289NHBVY03H06H1M15290NHBVZ04F10H1M15293NHBVZ10G06H2aM15268NHBVY04B06H2aM15270NHBVY09F08H2aM15271NHBVY10G02H2aM15272NHBVZ05G02H2aM15278NHBVX11D02H2aM15279NHBVY01F08H2aM15281NHBVZ10E10H2aM15287NHBVX11E09H2bM15291NHBVZ05G04H2bM15292NHBVZ08A09抗MERS-CoV-S抗體還直接從不與骨髓瘤細胞雜交的抗原陽性的小鼠B細胞分離，如在美國專利7582298中所述，在本文具體通過提述以其整體并入。使用該方法，獲得了數(shù)種全長的人抗MERS-CoV-S抗體(即具有人可變域和人恒定域的抗體)；以這種方式生成的示例性抗體命名為H4sH15188P、H1H15188P、H1H15211P、H1H15177P、H4sH15211P、H1H15260P2、H1H15259P2、H1H15203P、H4sH15260P2、H4sH15231P2、H1H15237P2、H1H15208P、H1H15228P2、H1H15233P2、H1H15264P2、H1H15231P2、H1H15253P2、H1H15215P和H1H15249P2。依照本實施例的方法生成的示例性抗體的生物學特性詳細描述于下文所述的實施例中。實施例2:雜交瘤上清的表征實施ELISA結合測定以鑒定結合MERS-CoV刺突蛋白的抗體上清(從上文所述的雜交瘤獲得)。與人IgG1分子在C末端的Fc部分一起表達的MERS-CoV-S(氨基酸E367-Y606)的受體結構域所組成的蛋白(MERSRBD-hFc；SEQIDNO:458)以2μg/ml在PBS緩沖液中涂覆在96孔板上于4℃過夜。隨后使用PBS中的0.5％(w/v)BSA溶液阻斷非特異性結合位點。在阻斷緩沖液中1:50稀釋雜交瘤上清并允許與MERSRBD涂覆的平板在室溫結合1小時。洗滌后，結合的抗體使用HRP綴合的a-hFc多克隆抗體(JacksonImmunochemical)檢測。樣品用3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB；BDBiosciences)顯色以產(chǎn)生比色反應且隨后用1M硫酸中和，之后在Victor讀板器(PerkinElmer)上測量450nm處的吸收。結果示于圖1。使用在450nm的信號強度選擇抗體用于進一步表征。在Biacore4000或BiacoreT200儀器上使用實時表面等離子體共振生物傳感器測定確定抗原與雜交瘤上清結合的結合締合和解離速率常數(shù)(分別為ka和kd)，平衡解離常數(shù)和解離半衰期(分別為KD和t1/2)(細節(jié)描述于實施例4)。如圖1所示，22個雜交瘤抗體中的21個與MERS-CoV刺突蛋白以245pM-21.5nM的KD值結合?？筂ERS冠狀病毒刺突蛋白抗體阻斷MERS(MERS-RBD)的受體結合域與同源結合伴侶人二肽基肽酶4(hDPP4)結合的能力使用基于ELISA的免疫測定評估。簡而言之，在C末端具有6x組氨酸標簽的表達的人二肽基肽酶4(hDPP4-6His；R&D目錄#1180-SE)以2μg/mL在PBS緩沖液中涂覆在96孔板上在4℃過夜。非特異性結合位點隨后使用在PBS中的0.5％(w/v)BSA溶液阻斷。在以抗MERS抗體上清的稀釋液預先平衡的MERSRBD-hFc溶液中，將該平板用于測量與人IgG1分子在C末端的Fc部分一起表達的MERS-RBD(氨基酸E367-Y606)(MERSRBD-hFc；SEQIDNO:458)。將300pM恒定濃度的MERSRBD-hFc與10％體積的抗MERS抗體上清預先混合，隨后在室溫進行1小時的溫育以允許抗體-抗原結合來達到平衡。隨后將平衡的樣品溶液轉移至hDPP4-6his涂覆的平板。在RT結合1小時后，洗滌平板并使用HRP綴合的a-hFc多克隆抗體(JacksonImmunochemical)檢測結合的MERSRBD。樣品用TMB溶液顯色(BDBiosciences,#51-2606KC和#51-2607KC)以生成比色反應且隨后用1M硫酸中和，之后在VictorX5讀板器(PerkinElmer)上在450nm測量吸收。將單獨的MERSRBD-hFc恒定濃度測量的吸收定義為0％阻斷且無MERSRBD-hFc添加測量的吸收定義為100％阻斷。阻斷百分比計算為抗體存在觀察到的信號減少的比率，百分比阻斷如下計算：抗體存在下觀察到的信號減少相對于從如前文定義的100％阻斷減去使用單獨的MERSRBD-hFc與背景(信號僅來自HRP偶聯(lián)的a-hFc抗體)間的差異的比率。如圖1所示，源自不同的22種獨立雜交瘤的抗MERS-CoV-S抗體中的17種阻斷大于90％的MERS-CoV刺突蛋白與DPP4的結合。測試了源自不同的獨立雜交瘤的抗MERS-CoV-S抗體對MERS感染性的中和(測定詳情在實施例5中)。如圖1中所示，22種細胞抗MERS-CoV-S雜交瘤抗體中的12種抑制或中和大于90％的MERS感染性且具有68.4pM-3.58nM的IC50。實施例3：重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸和核苷酸序列表2說明了本發(fā)明所選抗MERS-CoV-S抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)和CDR的氨基酸序列標識。表2：氨基酸序列標識相應的核酸序列標識闡述于表3中。表3：核酸序列標識本文所述抗體通常依照下述命名法：Fc字首(例如"H4xH"、"H1M"、"H2M"等)，隨后為數(shù)字標識(例如"15177"、"15228"、"15268"等，如表2中所示)，隨后為"P"、"P2"、"N"或"B"后綴。因此，根據(jù)該命名法，抗體在本文可稱為例如"H1H15177P"、"H1H15228P2"、"H2M15268N"等。本文使用的抗體名稱上的H4sH、H1M和H2M字首指示抗體的特定Fc區(qū)同型。例如，"H4sH"抗體具有如US20100331527中公開的其中2個或多個氨基酸改變的人IgG4Fc，"H1M"抗體具有小鼠IgG1Fc，且"H2M"抗體具有小鼠IgG2Fc(a或b同型)(全部可變區(qū)完全是人，如由抗體命名最初的'H'表示)。本領域的普通技術人員可以理解的是，具有特定Fc同型的抗體可轉化為具有不同F(xiàn)c同型的抗體(例如具有小鼠IgG1Fc的抗體可轉化為具有人IgG4的抗體等)，但在任何事件中，可變域(包括CDR)-其通過表2中所示的數(shù)字標識表示-將保持相同，且與抗原的結合特性預期相同或基本上相似，無論Fc結構域的性質如何。實施例4：通過表面等離子體共振確定的抗體與MERS-CoV-S的結合在Biacore4000或BiacoreT200儀器上使用實時表面等離子體共振生物傳感器測定確定抗原與雜交瘤上清結合的結合締合和解離速率常數(shù)(分別為ka和kd)，平衡解離常數(shù)和解離半衰期(分別為KD和t1/2)。Biacore傳感器表面用多克隆兔抗小鼠抗體(GE,#BR-1008-38)或用單克隆小鼠抗人Fc抗體(GE,#BR-1008-39)衍生化以捕獲約100-900RU的抗MERS-CoV-S單克隆抗體，分別與小鼠Fc或人Fc表達。測試的用于與抗MERS-CoV-S抗體結合的MERS-CoV試劑包括與C末端人IgG1Fc一起表達的重組MERS-CoV-S受體結合域(MERSRBD-hFc；SEQIDNO:458)。將3.7nM-200nM的不同濃度的MERS-CoV試劑以30μL/分鐘的流速在Biacore4000上或以50μL/分鐘在BiacoreT200上注射于抗MERS-CoV-S單克隆抗體捕獲的表面上。在HBST運行緩沖液(0.01MHEPESpH7.4，0.15MNaCl，3mMEDTA，0.05％v/vSurfactantP20)中監(jiān)測3-5分鐘MERS-CoV試劑與捕獲的單克隆抗體的結合，同時監(jiān)測7-10分鐘其從抗體的解離。在25℃實施實驗。動力學結合(ka)和解離(kd)速率常數(shù)通過使用Scrubber2.0c曲線擬合軟件處理數(shù)據(jù)并將其擬合至1:1結合模型而確定。結合解離平衡常數(shù)(KD)和解離半衰期(t1/2)隨后從動力學速率常數(shù)計算為：KD(M)＝kd/ka和t1/2(分鐘)＝[ln2/(60*kd)]。在最初的實驗中，確定了22種雜交瘤上清的結合解離平衡常數(shù)和解離半衰期(描述于實施例2中)。在后續(xù)的實驗中，使用上文所述的表面等離子體共振測定測試了純化的抗體與MERS-CoV刺突蛋白的結合。表4表5如表4和5所示，抗體在25℃以77.5pM-18.5nM的KD值在37℃以127pM-13.2nM的KD值與MERS-CoV刺突蛋白結合?？贵w在25℃顯示2.2-262分鐘的解離半衰期(t1/2)值且在37℃顯示1.8-244分鐘的解離半衰期(t1/2)值。實施例5:MERS感染性的抗體介導的中和材料和方法假顆粒的生成通過使用表達MERS刺突蛋白的質粒構建體、HIVgag-pol和編碼螢火蟲熒光素酶的HIV前病毒載體共轉染293T細胞而生成MERS假顆粒(MERSpp；也稱為病毒樣顆粒-VLP)。在轉染后的72小時收獲包含MERSpp的上清，使用離心澄清，濃縮，等分并在-80℃冷凍。通過用編碼水泡性口炎病毒糖蛋白(VesicularStomatitisVirusGlycoprotein，VSVg)的質粒取代表達MERS-CoV刺突蛋白的質粒而生成對照假顆粒?；贛ERSpp的測定抗體稀釋液與MERSpp在室溫溫育1小時。在完全DMEM介質中的Huh7細胞使用1％EDTA分離，洗滌并與抗體/MERSpp混合物溫育72小時。感染效力通過用熒光素酶測定(Promega,SanLuisObispo,CA,USA)的熒光素酶檢測而量化并在X3讀板器中對光的生成進行讀取。基于病毒的測定實驗前1天，將1x104VeroE6細胞每孔接種于96孔板。MERS-CoVEMC/2012株的500TCID50與所示量的抗體在100ul正常VeroE6生長介質中混合并在室溫溫育30分鐘，且隨后將混合物添加至VeroE6細胞。在感染后第2天，使用螢光細胞活力測定(LuminescentCellViabilityAssay，Promega)根據(jù)制造商的說明評估細胞死亡。在SpectramaxM讀板器(MolecularDevices)上讀取螢光。數(shù)據(jù)表示為模擬感染對照的百分比。結果通過抗MERS-CoV-S抗體中和MERS-CoV在最初的實驗中，測試了源自不同獨立的雜交瘤的抗MERS-CoV-S抗體的MERS感染性的中和。如圖1所示，22種細胞抗MERS-CoV-S雜交瘤抗體中的12種抑制或中和多于90％的MERS感染性且具有68.4pM-3.58nM的IC50。在隨后的實驗中，測試了純化的抗體的MERSpp和活MERS病毒(分離株：EMC/2012)的中和。結果示于表6和7。表6抗體針對MERSpp的IC50(M)針對活病毒(EMC2012)的IC50(M)H1M15277N6.46E-112.87E-10H2aM15279N9.39E-118.25E-10H1M15280N1.11E-107.63E-10H2aM15278N1.42E-106.44E-10H2aM15271N1.27E-101.03E-09H1M15267N9.98E-118.91E-10H2bM15292N1.13E-102.26E-09H2bM15291N1.86E-102.22E-09H1M15290N2.10E-102.55E-09H1M15293N2.58E-102.58E-09H1M15289N2.81E-103.15E-09H1M15269N6.88E-106.80E-09H2aM15287N2.93E-098.92E-09H1M15288N～0.12092.66E-08H2aM15268N5.89E-112.72E-10H2aM15270N1.02E-107.11E-10H2aM15281N7.85E-112.92E-10H2aM15272N7.23E-115.69E-10表7抗體針對MERSpp的IC50(M)針對活病毒(EMC2012)的IC50(M)H1H15211P4.74E-113.69E-10H1H15188P6.20E-115.05E-10H1H15177P4.57E-116.29E-10H1H15203P7.65E-118.26E-10H1H15228P29.75E-118.98E-10H1H15231P21.02E-109.20E-10H1H15237P26.60E-111.01E-09H1H15233P28.73E-111.37E-09H1H15259P27.64E-111.63E-09H1H15264P21.34E-102.39E-09H1H15208P8.27E-112.41E-09H1H15253P21.51E-102.42E-09H1H15215P1.92E-102.67E-09H1H15260P26.43E-116.70E-09H1H15249P22.27E-101.20E-08H4sH15188P2.91E-11NAH4sH15211P6.08E-11NAH4sH15260P26.24E-11NAH4sH15231P27.33E-11NA上述數(shù)據(jù)指示本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體強效地阻斷MERS-CoV進入易感細胞并中和感染性。通過抗MERS-CoV-S抗體中和臨床分離株RNA病毒編碼低保真基因組復制機器，這允許他們迅速適應其宿主環(huán)境(Malpica等2002；Genetics162:1505-1511)。然而，冠狀病毒如MERS-CoV編碼具有3’-5’的核糖核酸外切酶活性的非結構蛋白，這在其復制過程中提供校對功能且大大增加了基因組的編碼能力而不導致突變?yōu)碾y(Cotton等2013；Lancetdoi:10.1016/S0140-6736(13)61887-5)。盡管如此，對MERS-CoV疫情的最初兩年中的多個臨床分離株的測序已揭示病毒的MERS-CoVS蛋白處于進化中(Cotton等2014；MBio5doi:10.1128/mBio.01062-13)。對于本研究，比對了38種NCBI保藏的MERS-CoV臨床分離株的序列并與首次分離的株EMC/2012進行了比較?；诤Y選測定的設計，本發(fā)明的抗體預期在MERS-CoVS蛋白的RBD內結合，因此序列的比較特別聚焦于氨基酸367-606。鑒定了7種不同的氨基酸，其不同于測序的臨床分離株和原型EMC/2012序列，A431P、S457G、S460F、A482V、L506F、D509G和V534A(表8)。表8氨基酸改變分離株A431PRiyadh_9S457GKFU-HKU1；KFU-HKU13S469FQatar3；Qatar4A482VRiyadh_9L506FEngland1；England-Qatar/2012D509GBisha_1；Riyadh_1V534ARiyadh_2為測試抗體與RBD內的保守區(qū)結合并中和2014年7月測序的全部MERS-CoV臨床分離株的能力，使用位點導向誘變生成編碼全部S蛋白變體的質粒構建體。將這些用于生成具有修飾的S蛋白的MERSpp假型并實施中和測定。使用以上述突變生成的MERSpp測試了純化的抗體(描述于實施例1中)MERS感染性的中和。表9和10顯示MERSpp變體的百分比中和。表9表10這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的抗體結合于病毒的天然進化過程中保守的MERS-CoV刺突蛋白的區(qū)。本發(fā)明的抗MERS-CoV-S抗體相比之前分離的抗MERS-CoV抗體是更有效的中和劑將本發(fā)明所選抗體的效力與之前分離的單克隆抗體進行了比較。三組使用了體外抗體分離方法，即噬菌體展示(Tang等2014,PNASdoi:10.1073/pnas.1402074111；和Ying等2014,J.Virol.doi:10.1128/JVI.00912-14)和酵母展示(Jiang等2014,Sci.Transl.Med.doi:10.1126/scitranslmed.3008140)，以選擇與MERS-CoVS蛋白結合并阻斷病毒進入的抗體。對于該研究，選擇了報道為中和MERS-CoV并與不同的表位結合的具有公開的可變域序列的三個抗體的組。將抗體3B12(Tang等2014,PNASdoi:10.1073/pnas.1402074111)、MERS-4和MERS-27(Jiang等2014,Sci.Transl.Med.doi:10.1126/scitranslmed.3008140)的序列克隆至人IgG1恒定域上，隨后與本發(fā)明所選抗體相似地表達并純化。使用以原型EMC/2012序列和全部上述的臨床分離株生成的假顆粒測試了全部抗體的中和效力。針對MERSpp變體的所選抗體的中和IC50示于表11。如在表11中所見，H1H15211P能夠以1.3E-11M至6.5E-11M的IC50值中和全部的分離株。對于H1H15277N觀察到相似的值，V534A變體除外，其呈現(xiàn)對抗體的部分抗性。然而值得注意的是，該氨基酸變化僅在2012年分離的且為MERS-CoV進化樹的死枝部分的單MERS-CoV分離株(Riyadh_2)中觀察到。H1H15211P和H1H277N以比最強效的比較抗體MERS-4低至少1個log的IC50值中和MERSpp。此外，3B12和MERS-27都看起來與MERS-CoVS蛋白上較不保守的位點結合，因為具有多重臨床分離株的假顆粒不能使用這種抗體中和。表11這些數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的抗體相比僅基于體外生化特性分離的數(shù)種抗體能夠以改進的效力中和更廣范圍的MERS-CoV分離株。實施例6：抗MERS-CoV-S抗體間的八位(octet)交叉競爭在RED96生物傳感器(PallForteBioCorp)上使用實時、無標記生物層干涉測定確定了MERS-CoVS抗體間的結合競爭。在25℃HBS-POctet緩沖液(10mMHEPES，150mMNaCl和0.05％v/v表面活性劑吐溫-20，pH7.4，1mg/mLBSA)中以1000rpm的速度振蕩平板實施了完整的實驗。為評估抗體是否能夠彼此競爭與在融合了人Fc標簽的重組表達的MERS刺突蛋白受體結合域(MERSRBD-hFc；SEQID:458)上其對應的表位的結合，在實施結合競爭測定前，采用了預先混合的測定形式且將50nM的MERS-CoV-RBD-mFc與500nM的不同抗MERS單克隆抗體(隨后稱為mAb-2)預溫育至少2小時。非特異性單克隆抗體與作為同種型對照的MERS-RBS.mFc溫育。首先將以抗hFc多克隆抗體(PallForteBioCorp.,目錄#18-5060)涂覆的Octet生物傳感器浸入包含50μg/mL溶液的孔中4分鐘以捕獲約2nm的抗MERS抗體(隨后稱為mAb-1)。捕獲步驟后，空置的抗hFc多克隆抗體隨后通過將Octet生物傳感器浸入包含100μg/mL的非特異性完全人單克隆抗體的孔中而飽和。最終，將生物傳感器浸入包含50nMMERS-RBD-mFc和500nMmAb-2的預先混合樣品的孔中4分鐘。實驗的每個步驟間在HBS-POctet緩沖液中洗滌生物傳感器。在實驗過程中監(jiān)測實時結合響應并在每個步驟結尾測量結合響應。比較了mAb-1與MERS-RBD-mFc和mAb-2的前復合物結合的響應并確定了不同的抗MERS單克隆抗體的競爭/非競爭行為。在該實施例中使用的實驗條件下，觀察到交叉競爭(即在兩個方向的抗體間的競爭)，例如，對于：(a)H2aM15281N、H1M15290N、H1M15293N和H2bM15291N；(b)H2aM15272N；H2bM15292N和H2aM15271N；和(c)H2aM15268N、H1M15267N、H2M15279N、H1M15289N和H1M15277N(圖2)。在另一實驗中，確定了從抗原陽性小鼠B細胞直接分離的所選抗體間的結合競爭(描述在實施例1中)。在該實施例中使用的實驗條件下，觀察到交叉競爭(即在兩個方向的抗體間的競爭)，例如：(a)H1H15215P、H1H15177P、H1H15203P和H1H15211P；(b)H1H15188P、H1H15208P、H1H15228P2、H1H15233P2、H1H15237P2、H1H15253P2和H1H15259P2；和(c)H1H15231P2、H1H15249P2、H1H15260P2和H1H15264P2(圖3)。在另一實驗中，監(jiān)測了兩種抗體H1H15211P和H1H15277N間的結合競爭。表12表12顯示兩種抗體不彼此抑制且一種抗體與MERS-CoVRBD的結合仍允許第二抗體的結合。這些數(shù)據(jù)表明兩種抗體結合于離散、不重疊的表位。作為由一種抗體的選擇壓力的結果的一個表位的突變不會影響另一者的結合。實施例7：抗MERS-CoV-S抗體的體內效力材料和方法人DPP4敲入小鼠的生成由于MERS刺突蛋白不與小鼠DPP4相互作用，使用技術生成MERS-CoV感染的人源化模型(Valenzuela等2003,Nat.Biotechnol.21:652-659)。簡言之，構建了大靶向載體(LTVEC)以包含來自外顯子2至26含有3’UTR的82kb人DPP4基因組DNA來替換79kb的小鼠Dpp4對應物序列。使用Blast鑒定了包含Dpp4基因的人BACRP11-68L22和小鼠BACRP23-362N15，并使用Illumina臺式測序儀MiSeq確認了序列。將LTVEC電穿孔入F1雜合體(129S6SvEvTac/C57BL6NTac)ES細胞。電穿孔后10天挑選G418抵抗克隆并通過等位基因喪失測定來篩選正確的靶向。使用方法(Poueymirou等，2007；NatureBiotechnology25:91-99)，其中將靶向的ES細胞注射入未壓實的8細胞階段SwissWebster胚，以產(chǎn)生攜帶人DPP4基因等位基因的完全的ES細胞衍生的F0代小鼠。嚴格依照NIH的實驗動物護理和使用指導的推薦實施全部動物方法。該規(guī)程由Regeneron制藥機構動物護理和使用委員會(RegeneronPharmaceuticalsInstitutionalAnimalCareAndUseCommittee，IACUC)批準。所述方法詳細描述于2014年9月17日提交的美國專利申請?zhí)?2/051,626，其以整體并入本文。還通過hDPP4基因在小鼠基因組中的隨機插入生成轉基因小鼠。動物實驗取決于實驗，在感染前1天或感染后1天，用所示量的抗體或作為對照的無菌鹽水腹膜內(i.p.)注射6-8周齡的人源化DPP4小鼠。鼻內接種前，使用賽拉嗪(0.38mg/小鼠；Lloydlaboratories)和氯胺酮(1.3mg/小鼠；HenryScheinanimalhealth)的混合物(在PBS中稀釋以生成每小鼠50μl的總體積)通過腹膜內注射麻醉小鼠。一旦麻醉，使用總接種量50μl的PBS或稀釋于PBS中的2x105pfu的MERS-CoV(Jordan)鼻內接種小鼠。在實驗過程中，在感染前和實驗的每天對小鼠稱重以評估MERS-CoV誘導的體重喪失。在感染后第2天和第4天使用致死劑量的異氟烷(ButlerAnimalHealthSupply)使小鼠安樂死。收獲肺用于進一步的MERS-CoV復制和病理分析。MERS-CoVRNA分析根據(jù)制造商的指導使用Magnalyzer(Roche)通過在1ml的(LifeTechnologiesInc)中均質化而從小鼠肺提取RNA。根據(jù)制造商的指導使用從LifeTechnologies獲得的引物雙鏈體(靶向包膜基因(UpE)的基因組上游區(qū))、核衣殼信使RNA的先導序列(先導引物)利用Fast病毒一步主混合物(AppliedBiosystems)評估了MERS-CoVRNA的水平；并與小鼠18SrRNA(內源對照)進行了比較。快速光學反應平板(AppliedBiosystems)中的qPCR反應在7500快速DX實時PCR儀器(AppliedBiosystems)上讀取，并使用δCt方法分析了數(shù)據(jù)，其中未感染的對照設置為1。檢測的百分比MERS-CoVRNA相對于用同種型匹配的對照抗體治療的感染小鼠中檢測的RNA水平表示。MERS-CoV滴度的噬斑測定在6000rpm使用Magnalyzer(Roche)在1ml的PBS中用玻璃珠將小鼠的肺均質化60秒。隨后以10,000rpm離心勻漿10分鐘，并通過在VeroE6細胞上的噬斑測定分析上清以量化處理后殘留的病毒水平。如之前所述實施噬斑測定，只是將平板保留3天用于噬斑的出現(xiàn)。組織學分析從固定、石蠟包埋的組織制備組織學切片，并用蘇木精和曙紅染色。通過光學顯微鏡檢查視野并分析。將間質、周圍支氣管和外周血管的炎癥從0-5進行評分。對于每個實驗組，盲化載玻片并從0-5評分和制表以比較株、時間點和處理/治療。還注意到文本中每組的其他組織學特征如支氣管上皮的存在和肺泡損傷、胸膜變化和纖維支氣管血管炎癥的程度。對于每組平均化每只小鼠的整體炎癥評分并表示為每組和時間點中全部小鼠的平均評分。結果DPP4人源化的小鼠對MERS-CoV感染易感抗病毒分子的體內測試需要對MERS-CoV感染易感的小動物模型。小鼠對MERS-CoV感染并不易感。小鼠和人DPP4序列的序列比較揭示了之前鑒定為MERS-CoVS蛋白和其受體之間的接觸位點的氨基酸在兩物種間不同。此外，人DPP4在小鼠細胞中的表達允許MERSpp進入和MERS-CoV傳播，指示病毒的進入是小鼠細胞感染的限制步驟且小鼠DPP4和MERS-CoV糖蛋白間相互作用的缺乏限定體外物種嗜性。發(fā)明人假設使小鼠表達人DPP4來代替小鼠DPP4將對MERS-CoV易感且允許抗MERS-CoV療法的體內測試。采用技術以用82kb的其人直向同源物替代79kb的小鼠Dpp4基因。獲得的小鼠在小鼠調節(jié)元件控制下表達全長人DPP4，以保持適當?shù)谋磉_調節(jié)和蛋白組織分布。為測試人源化的小鼠和轉基因小鼠是否可支持MERS-CoV感染，在一個初始實驗中，用200μg的抗MERS-CoV-S抗體或同種型對照在第-1天腹膜內處理轉基因小鼠并在第0天用MERS-CoV(～106pfu的EMC2012)鼻內感染。感染后4天，收獲肺并通過RT-PCR測量病毒的RNA水平以檢查抗體對病毒載量的影響。表13顯示病毒基因組RNA和復制RNA的平均水平，其表示為同種型對照的百分比。用H1H15211P的治療導致感染小鼠中病毒RNA的約500倍的減少(減少為約1/500)。表13在另一實驗中，用MERS-CoV鼻內接種6-8周齡的人源化DPP4(huDPP4)小鼠。盡管直至第4天都未觀察到死亡或疾病的臨床征兆，但在接種后的第2天和第4天，使小鼠安樂死并對其肺進行解剖。為獲得病毒RNA水平，在中均質化肺并通過實時PCR使用特異性針對MERS-CoV的引物進行分析(圖4和5)。為獲得病毒滴度，在PBS中均質化肺，通過離心澄清并在VeroE6細胞上滴定(圖6)。肺中穩(wěn)固的MERS-CoV復制在感染后的第2和4天明顯。使用經(jīng)設計僅擴增復制的MERS-CoV的對于MERS-CoV先導序列特異性的引物組的RNA量化，證明了在第2天收集的肺中高水平的MERS-CoV復制RNA，且這些水平維持至感染后第4天(圖5)。VeroE6細胞上的肺勻漿的噬斑測定量化了MERS-CoV(Jordan)水平在感染后的第2天為～7.27x104pfu/g肺，且在感染后的第4天為～3.75x105pfu/g肺(圖6)，這證明MERS-CoV在huDPP4小鼠的肺中活躍復制。這些數(shù)據(jù)表明使用技術的受體DPP4的人源化在小鼠中創(chuàng)建了穩(wěn)固的MERS-CoV模型，其可用于評估體內MERS-CoV治療。對來自用MERS-CoV(Jordan株)或PBS(模擬感染的)鼻內接種的huDPP4小鼠的肺分析了病理學變化。在感染后第2天，周圍支氣管炎癥明顯，其中遍及肺部發(fā)現(xiàn)支氣管細胞結構的改變。在該時間點注意到最小外周血管炎癥或對肺泡結構的影響。在感染后第4天，觀察到顯著的間質浸潤及外周血管擴張和廣泛的肺泡增厚。支氣管改變也仍存在。重要的是，該病理學與間質性肺炎發(fā)展和在具有MERS-CoV的人中看到的顯著的肺部疾病的射線照相發(fā)現(xiàn)相一致，表明該MERS-CoV感染的人源化DPP4體內模型概括了在人的MERS-CoV感染中看到的病理后遺癥。在進一步的實驗中(參加下文)，預防性和/或治療性地以一個或多個劑量的純化抗體(如實施例1中所述)或抗體組合施用感染的小鼠以測試其針對MERS感染的效力。H1H15211P和H1H15277N保護人源化的DPP4小鼠免于MERS-CoV感染已建立了人源化的DPP4小鼠對MERS-CoV易感后，將該模型用于評估兩種單克隆抗體的體內活性。在以1x105pfu的MERS-CoV(Jordan株)鼻內感染前24小時，用200ug、20ug或2ug的H1H15211P或H1H15277N或用200ug的hIgG1同種型對照抗體腹膜內(i.p.)注射小鼠。如圖7和8中所見，在200ug每小鼠劑量，相比同種型對照抗體，兩種抗體都能夠以超過2log顯著減少肺中的MERS-CoV特異性RNA水平。相比相同劑量的H1H15277N，20ug劑量的H1H15211P在降低MERS-CoVRNA水平上更加有效。相比同種型對照治療的小鼠，每種抗體的2ug給藥在減少病毒RNA水平方面無效。當在肺中分析MERS-CoV滴度時(圖9)，發(fā)現(xiàn)了200ug和20ug劑量的H1H15211P都將病毒水平減少至接近測定中所檢測的水平(2x103pfu/ml)。H1H15277N在200ug劑量與H1H15211P等效，而20ug和2ug顯示病毒抑制的劑量依賴性抑制。這些數(shù)據(jù)表明H1H15211P和H1H15277N在體內可有效地阻斷MERS-CoV感染。還在來自感染前24小時用H1H15277N、H1H15211P或用hIgG1同種型對照抗體在感染后第4天處理的小鼠的肺上實施組化分析。來自用hIgG同種型對照小鼠預處理的小鼠的肺顯示顯著的肺病理，其具有增加的間質炎癥、外周血管套囊(cuffing)和肺泡間隔增厚。用200ug的H1H15277N或H1H15211P處理的小鼠具有減少的炎癥，在間質和小支氣管套囊方面具有炎癥細胞的最小病灶。在用20ug的H1H15277N和H1H15211P預處理的小鼠中，相比更高的抗體組，發(fā)現(xiàn)了中等水平的外周血管套囊和間質炎癥。相對而言，2ug抗體預處理組具有與顯示顯著間質炎癥和主要的外周血管炎癥的hIgG1同種型對照相似的病理。盲化的組織學評分(圖10)反映了治療小鼠減少的炎癥評分。這些發(fā)現(xiàn)證明MERS-CoV感染后，H1H15277N和REGN3051賦予肺病理的劑量依賴性減少，確證了為這些小鼠確定的病毒RNA水平和病毒滴度。總的來說，這些數(shù)據(jù)指示當在感染前1天注射時，H1H15211P和H1H15277N可在體內阻斷MERS-CoV感染和疾病。就我們所知，H1H15211P和H1H15277N是在MERS-CoV感染的體內模型中展示效力的最早的全長人抗體。H1H15211P和H1H15277N可治療用MERS-CoV感染的人源化DPP4小鼠感染后抑制MERS-CoV復制和肺病理的能力在潛在的療法中是理想的性狀。為評估H1H15211P是否能夠具有治療效果，huDPP4小鼠用MERS-CoV感染，且隨后24小時后用500ug的hIgG同種型對照或500ug或200ug的H1H15211P腹膜內注射。在感染后第4天，使小鼠安樂死并分析小鼠肺的病毒RNA、病毒滴度和肺病理。相比對照抗體治療的小鼠，500ug和200ug劑量的H1H15211P都能將小鼠肺中的病毒RNA水平減少約10倍(圖11和12)。在感染后第4天，相同的小鼠的肺的滴度證明了肺中以大于2log減少的病毒水平的顯著減少(圖13)。這些數(shù)據(jù)證明即使當接種病毒24小時后施用，H1H15211P也可顯著抑制病毒復制。在感染后24小時用hIgG對照抗體、500ug或200ugH1H15211P治療的小鼠上實施組織學分析。用對照抗體治療的小鼠展示與上述對照相似的病理，具有顯著間質炎癥，外周血管套囊和肺泡間隔增厚。用200ug或500ug的H1H15211P治療的小鼠遍及肺部具有最小間質炎癥且具有減少的且僅有的局灶性外周血管炎癥。盲化的組織學評分證明對于治療的小鼠減少的炎癥評分(圖14)。這些數(shù)據(jù)證明即使在感染后24小時給予，H1H15211P的治療劑量也減少MERS-CoV誘導的肺病理。本發(fā)明不限于本文所述具體實施方案的范圍。事實上，從上述說明和附圖，本發(fā)明的多種修飾以及本文所述的那些對本領域的技術人員將變得顯而易見。這些修飾意欲落入所附的權利要求的范圍內。當前第1頁1 2 3