本發(fā)明涉及用于選擇性測試液體樣品中特異性活生物實體的存在的方法和設(shè)備。

背景技術(shù)：

我們以前已經(jīng)描述了用于監(jiān)測微生物的代謝/生長的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括密封室，所述密封室具有撓性膜片以提供對在培養(yǎng)液上方的液面上空間(headspace)中的氣體壓力變化的靈敏測量。對于背景技術(shù)，可以參照例如US8,389,274。

圖1a和1b示意性地示出了分別處于標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下和負(fù)壓下相似裝置100的實施方案(在運(yùn)轉(zhuǎn)中可以產(chǎn)生負(fù)壓或正壓)。因此，生物材料的培養(yǎng)物102經(jīng)歷代謝和生長，在代謝和生長期間其與攜帶可能取決于各種因素利用和/或產(chǎn)生氣體的細(xì)胞的水性液體(水)的交換氣體，例如細(xì)胞可以在呼吸過程中產(chǎn)生二氧化碳。密封培養(yǎng)室106的氣體液面上空間104因此經(jīng)歷由于氣體與培養(yǎng)基的交換所引起壓力變化，并且這些通過隔膜108監(jiān)測并且轉(zhuǎn)換為電子壓力信號110，所述電子壓力信號110可以例如通過硬件、軟件或兩者的組合被數(shù)字化和電子處理。優(yōu)選地所述系統(tǒng)還包括攪拌器112和溫度控制(未顯示)，以及可密封的進(jìn)氣口/出氣口114。

圖2顯示帶有2個室202、204的測試單元200的物理實施方案，每個室被構(gòu)造成接納圖1中所示的通用類型的培養(yǎng)容器100。任選地，盡管不只是必須地，但這些中的一個可以充當(dāng)對照。每個室提供用于攪拌器112的磁力驅(qū)動，和溫度控制系統(tǒng)，所述溫度控制系統(tǒng)允許調(diào)節(jié)每個培養(yǎng)容器中的溫度，在實施方案中調(diào)節(jié)至14-44度或10-60度的范圍。所述裝置還具有用戶界面206和通信諸如USB連接和/或有線連接或無線網(wǎng)絡(luò)連接，所述用戶界面206包括顯示器和用戶控制。在優(yōu)選實施方案中，可以獨(dú)立使用所述系統(tǒng)，或可以將所述系統(tǒng)連接至單獨(dú)的計算機(jī)；用于控制系統(tǒng)的外部連接設(shè)施(但不是必不可少的)。例如，質(zhì)量保證主管可以設(shè)計和下載用于所述系統(tǒng)的規(guī)程并上傳測試結(jié)果用于分析和/或?qū)徲?。與外部計算機(jī)系統(tǒng)的連接有利于下載對所述裝置定制的測試規(guī)程。在實施方案中，所述系統(tǒng)還具有可移動Flash^TM儲存卡用于儲存試驗結(jié)果和/或規(guī)定測試規(guī)程的數(shù)據(jù)。所述裝置的優(yōu)選實施方案的重量相對輕，并且是便攜的且由低電壓直流電源供電。

在使用中將樣品引入到兩個培養(yǎng)容器中并且所述系統(tǒng)控制生長條件和記錄壓力變化。如前所述和圖1中所示，在實施方案中的壓力感測使用非侵入方法，所述非侵入方法隔離傳感器，并且很重要的是提供屏障以保護(hù)生物培養(yǎng)物和操作者兩者。

所述系統(tǒng)作為靈敏的微生物呼吸器運(yùn)轉(zhuǎn)，通過測量由于微生物呼吸所引起的與密閉培養(yǎng)容器內(nèi)的氣體交換相關(guān)的壓力瞬變來檢測代謝活性(在實施方案中其體積為10ml-100ml的范圍)?；旌嫌兄谑古囵B(yǎng)物均勻，并且還有利于氣體交換，所述氣體交換對于將代謝過程的效應(yīng)轉(zhuǎn)換成可檢測到的壓力瞬變(其可以是正的或負(fù)的)是很重要的。

盡管上述系統(tǒng)的實施方案非常有效地檢測細(xì)菌和其他活生物實體的生長，但在實踐中重要的是能夠準(zhǔn)確地區(qū)分不同實體，例如不同細(xì)菌的存在。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

根據(jù)本發(fā)明，因此提供了一種選擇性測試液體樣品中特異性活生物實體的存在的方法，所述方法包括：準(zhǔn)備多個培養(yǎng)容器，每個培養(yǎng)容器用于選擇性檢測不同活生物實體的存在，其中準(zhǔn)備所述培養(yǎng)容器包括：提供培養(yǎng)容器，所述培養(yǎng)容器包括可密封室，所述可密封室用于接收和培養(yǎng)液體樣品，使得所述生物實體的存在可通過檢測所述室的液面上空間中的壓力變化來檢測到；在所述培養(yǎng)容器中提供選擇性生長培養(yǎng)基，其中所述選擇性生長培養(yǎng)基是干燥形式的并且選擇性地促進(jìn)特異性活生物實體的生長，以及向所述培養(yǎng)容器設(shè)置標(biāo)識符以標(biāo)識所述特異性生物實體；提供測試系統(tǒng)，所述測試系統(tǒng)包括接納所述培養(yǎng)容器并且檢測所述室的所述液面上空間中的所述壓力變化的裝置，所述裝置進(jìn)一步包括溫度控制系統(tǒng)，和數(shù)據(jù)處理器，所述數(shù)據(jù)處理器用于監(jiān)測所述檢測到的壓力變化，用于控制所述溫度控制系統(tǒng)以調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)容器中液體樣品的溫度，以及用于用信號表示由所述檢測到的壓力變化對所述培養(yǎng)容器中生物實體的存在的檢測；將多個實體-選擇性測試規(guī)程儲存在所述測試系統(tǒng)的存儲器中，其中所述測試規(guī)程規(guī)定所述培養(yǎng)容器中所述液體樣品的孵育溫度和用于檢測目標(biāo)實體的所述室的所述液面上空間中的閾限壓力變化中的一個或兩個，其中所述測試規(guī)程是根據(jù)它們所選擇性促進(jìn)生長的多個特異性生物實體中的一個分別標(biāo)識的；從所述多個培養(yǎng)容器選擇出用于選擇性檢測目標(biāo)即所述特異性生物實體的培養(yǎng)容器；向所述所選擇的培養(yǎng)容器的所述室提供測試液體樣品；使用所述所選擇的培養(yǎng)容器上的所述標(biāo)識符來選擇與所述目標(biāo)特異性生物實體對應(yīng)的測試規(guī)程；以及在所述測試系統(tǒng)上運(yùn)行所述所選擇的測試規(guī)程從而根據(jù)所述測試規(guī)程孵育所述測試液體樣品以確定所述目標(biāo)特異性生物實體是否存在于所述測試液體樣品內(nèi)；其中所述確定包括依賴于所述選擇性生長培養(yǎng)基和所述實體-選擇性測試規(guī)程兩者的選擇。

一般來說，盡管通過選擇特殊生長培養(yǎng)基所提供的特異性就其本身而言不足以使特殊的菌株生長，并且盡管對特殊測試規(guī)程的選擇本身可能不能賦予適當(dāng)?shù)奶禺愋?，但實驗己表明，選擇性生長培養(yǎng)基與規(guī)定的測試規(guī)程的組合可以非常有效地使特定類型的生物實體諸如特殊種的細(xì)菌選擇性生長。對特異性目標(biāo)實體諸如特定種的細(xì)菌的這種選擇性檢測可以通過上述方法的實施方案來實現(xiàn)，所述方法的實施方案將特殊生長培養(yǎng)基與特殊測試規(guī)程例如測試溫度和/或閾限壓力變化(正或負(fù))聯(lián)系起來。任選地，測試規(guī)程可以包括其他參數(shù)，例如，測試時間(例如持續(xù)時間或最小持續(xù)時間或檢測時間窗口)和/或比色分析測量和/或測試樣品混合(例如規(guī)定混合樣品的時間比例)。通常，不同實體的培養(yǎng)物可以產(chǎn)生培養(yǎng)基的顏色變化，所述顏色變化指示該實體的某種代謝過程，并且這可以與測試規(guī)程(孵育溫度和/或壓力變化)和特異性生長培養(yǎng)基組合形成標(biāo)識過程的一部分。

在一些優(yōu)選實施方案中，測試規(guī)程規(guī)定液體樣品的孵育溫度和用于檢測特異性目標(biāo)實體的閾限壓力變化兩者。如后文所述，這種閾限壓力可以是正的或負(fù)的(或甚至兩種的組合，例如規(guī)定的下降接著是規(guī)定的升高，反之亦然)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對特異性閾限壓力的定義在區(qū)分來自背景的相關(guān)信號方面很重要。所述壓力可以例如根據(jù)壓力的毫巴變化數(shù)來定義。

在實施方案中，培養(yǎng)容器被不滲透液體的隔膜密封，通過所述隔膜液體樣品可以被注入到培養(yǎng)容器中(這樣的配置方式本質(zhì)上是自密封的)。這有利于在培養(yǎng)容器內(nèi)維持可控的環(huán)境并且使污染最小化。備選地，帶有可拆卸帽的進(jìn)樣口可以被用于添加樣品并且隨后抑制污染。

在實施方案中，選擇性生長培養(yǎng)基可以與選擇性地抑制除了特異性目標(biāo)實體之外的實體的生長的選擇性生長抑制物質(zhì)組合。在實施方案中，生長抑制物質(zhì)可以包括特殊抗生素或抗生素混合物和/或選擇性影響生長的化學(xué)物質(zhì)和/或一種或多種這樣的化學(xué)物質(zhì)任選地與一種或多種抗生素的混合物。有利地，以在水溶性膠囊殼體內(nèi)的顆粒物形式提供生長培養(yǎng)基和/或生長抑制物質(zhì)，以維持無菌狀態(tài)同時當(dāng)需要時快速釋放生長物質(zhì)和/或生長抑制物質(zhì)。盡管明膠可以用于膠囊殼體，但優(yōu)選材料采用淀粉或纖維素，例如HPMC(羥丙基甲基纖維素)。

使用選擇性生長抑制物質(zhì)諸如抗生素的一個困難在于它們經(jīng)常是熱不穩(wěn)定的，由此難以將生長培養(yǎng)基-抗生素組合滅菌。在實施方案中，因此，在將生長培養(yǎng)基和生長抑制物質(zhì)組合后，所述組合通過用γ射線輻照來滅菌。

令人驚訝地，上述類型的測試不僅可以選擇性地檢測特異性目標(biāo)實體的存在，而且大量實驗也已經(jīng)確定它們可以基于特定壓力變化所需的時間間隔來準(zhǔn)確地預(yù)測原始液體樣品中實體的數(shù)目(計數(shù))。原始液體樣品中實體的數(shù)目(N)的對數(shù)隨時間變化的圖基本上是直線(對于特定實體/測試規(guī)程)。限定此線的一個或多個參數(shù)，尤其是該線的斜率，可以通過校準(zhǔn)程序來確定，并且因為它們不是機(jī)器-特異性的，因此此校準(zhǔn)僅需要對每個實體/測試規(guī)程進(jìn)行一次。(原則上，校準(zhǔn)數(shù)據(jù)可以由曲線而非(直)線來限定，且由一個或多個參數(shù)指定，但這在實踐中發(fā)現(xiàn)并不是必要的)。校準(zhǔn)數(shù)據(jù)然后可以在本地被儲存在裝置上，或儲存在相關(guān)聯(lián)的計算機(jī)系統(tǒng)中，并且被用來由所檢測到的壓力變化確定測試液體樣品中目標(biāo)實體的估計數(shù)目。這可以通過單次測量完成或通過對連續(xù)的測量值擬合成線來完成。

上述測試方法的實施方案可以用來檢測特異性細(xì)菌和/或真菌(諸如酵母和霉菌)、和原生動物以及其他生物實體?？梢砸赃@種方式選擇性檢測的細(xì)菌物種的實例包括大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(salmonella)(其各種類型)、產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌(Listeria monocytogene)，等等。

在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了一種用于選擇性測試液體樣品中特異性活生物實體的存在的液體樣品測試系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：多個培養(yǎng)容器，每個培養(yǎng)容器用于選擇性檢測不同活生物實體的存在，所述培養(yǎng)容器包括可密封室，所述可密封室用于接收和培養(yǎng)液體樣品，使得所述生物實體的存在可通過檢測所述室的液面上空間中的壓力變化來檢測到，所述培養(yǎng)容器室包括在所述培養(yǎng)容器中的選擇性生長培養(yǎng)基，其中所述選擇性生長培養(yǎng)基是干燥形式的并且選擇性地促進(jìn)特異性活生物實體的生長，所述培養(yǎng)容器具有用于標(biāo)識所述特異性生物實體的標(biāo)識符；測試系統(tǒng)，所述測試系統(tǒng)包括接納所述培養(yǎng)容器并且檢測所述室的所述液面上空間中的壓力變化的裝置，所述裝置進(jìn)一步包括溫度控制系統(tǒng)，和數(shù)據(jù)處理器，所述數(shù)據(jù)處理器用于監(jiān)測所述檢測到的壓力變化，用于控制所述溫度控制系統(tǒng)以調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)容器中液體樣品的溫度，以及用于用信號表示由所述檢測到的壓力變化對所述培養(yǎng)容器中生物實體的存在的檢測；其中所述數(shù)據(jù)處理器包括儲存多個實體-選擇性測試規(guī)程的存儲器，其中所述測試規(guī)程規(guī)定所述培養(yǎng)容器中所述液體樣品的孵育溫度和用于檢測目標(biāo)實體的所述室的所述液面上空間中的閾限壓力變化中的一個或兩個，其中所述測試規(guī)程是根據(jù)它們所選擇性促進(jìn)生長的多個特異性生物實體中的一個分別標(biāo)識的；并且其中所述所選擇的培養(yǎng)容器上的所述標(biāo)識符可用來選擇與所述目標(biāo)特異性生物實體對應(yīng)的測試規(guī)程；并且其中所述所選擇的測試規(guī)程可被所述測試系統(tǒng)用來根據(jù)所述測試規(guī)程孵育所述測試液體樣品以確定所述目標(biāo)特異性生物實體是否存在于測試液體樣品內(nèi)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于上述數(shù)據(jù)處理器的處理器控制代碼和/或數(shù)據(jù)，并且在實施方案中，用于估計原始液體樣品中實體的數(shù)目?？梢栽诜桥R時性數(shù)據(jù)載體諸如磁盤或程序控制存儲器上提供這種代碼/數(shù)據(jù)。用來實施本發(fā)明的實施方案的代碼和/或數(shù)據(jù)可以包括常規(guī)編程語言的源代碼、目標(biāo)代碼或可執(zhí)行代碼；這樣的代碼和/或數(shù)據(jù)可以分布在彼此通信的多個耦聯(lián)組件之間。

在進(jìn)一步相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)備培養(yǎng)容器的方法，用于選擇性測試液體樣品中特異性活生物實體的存在，所述方法包括：提供培養(yǎng)容器，所述培養(yǎng)容器包括可密封室，所述可密封室用于接收和培養(yǎng)液體樣品，使得所述生物實體的存在可通過檢測所述室的液面上空間中的壓力變化來檢測到；在所述培養(yǎng)容器中提供選擇性生長培養(yǎng)基，其中所述選擇性生長培養(yǎng)基是干燥形式的并且選擇性地促進(jìn)特異性活生物實體的生長；以及向所述培養(yǎng)容器設(shè)置標(biāo)識符以標(biāo)識所述特異性生物實體。

在相應(yīng)的方面，本發(fā)明提供了通過所述方法準(zhǔn)備的培養(yǎng)容器。

本發(fā)明還提供了一種成套的培養(yǎng)容器，用于選擇性測試液體樣品中特異性活生物實體的存在，所述成套的培養(yǎng)容器包括多個培養(yǎng)容器，每個培養(yǎng)容器用于選擇性檢測不同活生物實體的存在，每個所述培養(yǎng)容器包括：可密封室，所述可密封室用于接收和培養(yǎng)液體樣品，使得所述生物實體的存在可通過檢測所述室的液面上空間中的壓力變化來檢測到；在所述室中的選擇性生長培養(yǎng)基，其中所述選擇性生長培養(yǎng)基是干燥形式的并且選擇性地促進(jìn)特異性活生物實體的生長；每個所述培養(yǎng)容器具有用于標(biāo)識所述特異性生物實體的標(biāo)識符。

令人驚訝地，可以使用非選擇性生長培養(yǎng)基來對原始存在于液體樣品中的活生物實體的數(shù)目進(jìn)行良好的估計，無論存在哪種特殊種的實體。這是令人驚訝的，因為人們可能預(yù)期，例如，不同類型的細(xì)菌將以不同的速率生長/代謝。盡管如此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用非特異性生長培養(yǎng)基時，可以使用公用校準(zhǔn)數(shù)據(jù)，所述校準(zhǔn)數(shù)據(jù)限定直到大于閾限壓力變化(增加)的時間和初始存在于樣品中的實體數(shù)目的對數(shù)之間的關(guān)系。(該線具有負(fù)斜率因為初始存在的實體數(shù)目越少，則對于特定壓力變化的時間越長)。

因此在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種用于測試液體樣品中活生物實體的存在的液體樣品測試系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：培養(yǎng)容器，所述培養(yǎng)容器包括可密封室，所述可密封室用于接收和培養(yǎng)液體樣品使得所述生物實體的存在可通過檢測所述室的液面上空間中的壓力變化來檢測到，所述培養(yǎng)容器室包括用于所述活生物實體的生長培養(yǎng)基；和測試系統(tǒng)，所述測試系統(tǒng)包括接納所述培養(yǎng)容器并且檢測所述室的所述液面上空間的所述壓力變化的裝置，所述裝置進(jìn)一步包括溫度控制系統(tǒng)，和數(shù)據(jù)處理器，所述數(shù)據(jù)處理器用于監(jiān)測所述檢測到的壓力變化，用于控制所述溫度控制系統(tǒng)以調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)容器中液體樣品的溫度，以及用于用信號表示由所述檢測到的壓力變化對所述培養(yǎng)容器中生物實體的存在的檢測；其中所述數(shù)據(jù)處理器包括儲存校準(zhǔn)數(shù)據(jù)的存儲器，所述校準(zhǔn)數(shù)據(jù)限定直到閾限即所述壓力變化的時間和所述生物實體的初始數(shù)目之間的關(guān)系；并且其中所述數(shù)據(jù)處理器包括處理器控制代碼，所述處理器控制代碼用于由所述檢測到的壓力變化和所述校準(zhǔn)數(shù)據(jù)確定所述測試液體樣品中所述目標(biāo)特異性生物實體的估計數(shù)目。

本發(fā)明還提供了對應(yīng)的方法和對應(yīng)的計算機(jī)程序代碼。在此系統(tǒng)/方法的實施方案中，培養(yǎng)容器保持限定量的生長培養(yǎng)基，例如足以使得生長培養(yǎng)基的量不是限制生長的因素，但是還不是使得溶液中的生長培養(yǎng)基濃度對生長的實體有毒性那么多。

在所述系統(tǒng)的實施方案中，所儲存的代碼包括用于根據(jù)儲存在存儲器中的限定關(guān)系的統(tǒng)計數(shù)據(jù)確定原始存在的實體的估計數(shù)目的數(shù)字范圍的代碼。因此，在實施方案中，校準(zhǔn)數(shù)據(jù)包括限定實體的估計數(shù)目的估計標(biāo)準(zhǔn)差的數(shù)據(jù)，由該數(shù)據(jù)可以確定數(shù)字范圍或等效的誤差棒(例如為+/-n標(biāo)準(zhǔn)差的形式，其中n是因數(shù)，比如1-3的范圍內(nèi))。盡管已經(jīng)證明可以使用非特異性生長培養(yǎng)基對原始存在的實體的估計數(shù)目進(jìn)行良好的預(yù)測，不過，在一些優(yōu)選的實施方案中另外地或備選地，校準(zhǔn)數(shù)據(jù)對多個不同類型的生物實體(例如多個細(xì)菌種)中的每一個限定不同的log N～時間關(guān)系。則被儲存的代碼可以包括用于輸入限定期望的(或所選擇的)類型的生物實體的數(shù)據(jù)的代碼，則可以使用對應(yīng)的關(guān)系來確定測試樣品中存在的實體的原始數(shù)目的更準(zhǔn)確數(shù)字估計值和/或范圍。

在實施方案中，實體的估計數(shù)目/范圍(N)以CFU(菌落形成單位)定義。

在還進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種測試水性樣品中的特異性活生物實體的方法，所述方法包括：準(zhǔn)備培養(yǎng)容器，所述培養(yǎng)容器包括可密封室，所述可密封室用于接收和培養(yǎng)液體樣品，使得所述生物實體的生長可通過檢測所述室的液面上空間中的壓力變化來檢測到；在所述室中提供用于所述生物實體的干燥形式選擇性生長培養(yǎng)基，以及標(biāo)識所述培養(yǎng)容器；提供測試系統(tǒng)用于調(diào)節(jié)所述水性樣品的溫度并檢測所述液面上空間中的壓力變化；將多個實體-選擇性測試規(guī)程儲存在所述測試系統(tǒng)的存儲器中，其中所述測試規(guī)程規(guī)定所述水性樣品的孵育溫度和用于檢測所述特異性活生物實體的所述室的所述液面上空間中的閾限壓力變化中的一個或兩個，其中所述測試規(guī)程是根據(jù)它們所選擇性促進(jìn)生長的對應(yīng)特異性生物實體標(biāo)識的；將水性樣品提供至所述培養(yǎng)容器的所述室以將所述生長培養(yǎng)基再水化；使用所述所選擇的培養(yǎng)容器上的所述標(biāo)識符來選擇與所述目標(biāo)特異性生物實體對應(yīng)的測試規(guī)程；以及對應(yīng)于所述生長培養(yǎng)基對其有選擇性的特異性生物實體在所述測試系統(tǒng)上運(yùn)行測試規(guī)程，根據(jù)所述測試規(guī)程孵育所述樣品以確定所述特異性生物實體是否存在。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于測試液體樣品中特異性活生物實體的存在的液體樣品測試系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：培養(yǎng)容器，所述培養(yǎng)容器包括可密封室，所述可密封室用于接收和培養(yǎng)液體樣品，使得所述生物實體的存在可通過檢測所述室的液面上空間中的壓力變化來檢測到，所述培養(yǎng)容器室包括用于所述特異性活生物實體的選擇性生長培養(yǎng)基；和測試系統(tǒng)，所述測試系統(tǒng)包括接納所述培養(yǎng)容器并且檢測所述室的所述液面上空間中的所述壓力變化的裝置，所述裝置進(jìn)一步包括溫度控制系統(tǒng)，和數(shù)據(jù)處理器，所述數(shù)據(jù)處理器用于監(jiān)測所述檢測到的壓力變化，用于控制所述溫度控制系統(tǒng)以調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)容器中液體樣品的溫度，以及用于用信號表示由所述檢測到的壓力變化對所述培養(yǎng)容器中所述特異性生物實體的存在的檢測；其中所述數(shù)據(jù)處理器包括儲存測試規(guī)程數(shù)據(jù)的存儲器，所述測試規(guī)程數(shù)據(jù)規(guī)定所述液體樣品的孵育溫度和用于檢測所述特異性活生物實體的所述室的所述液面上空間中的閾限壓力變化中的一個或兩個；并且其中所述數(shù)據(jù)處理器包括用于由所述檢測到的壓力變化和所述測試規(guī)程數(shù)據(jù)確定所述測試液體樣品中所述目標(biāo)特異性生物實體的存在的處理器控制代碼。

在上述方法和系統(tǒng)的一些優(yōu)選實施方案中，對已經(jīng)在培養(yǎng)容器內(nèi)孵育的活生物實體進(jìn)行處理以使得它們成為無活力的，或至少是不可培養(yǎng)的。在一些優(yōu)選的實施方案中，這通過使用溫度調(diào)節(jié)系統(tǒng)將培養(yǎng)容器中的液體的溫度增加至大于閾限溫度持續(xù)大于閾限時間的時間。例如，可以將培養(yǎng)容器中的液體加熱至大于63℃持續(xù)大于30分鐘。

通常，溫度越高，所需的時間越短，且反之亦然。所使用的準(zhǔn)確溫度可以取決于實體但優(yōu)選大于50℃，更優(yōu)選大于60℃。技術(shù)人員將理解通常(像巴氏消毒法)并不是將殺死所有的活實體，而是將殺死足夠數(shù)目使得經(jīng)處理的液體是安全的。而且因為所述液體容納在密封室內(nèi)，因此有助于用于處置(disposal)的處理。

在一些實施方案中，可以將閾限溫度和/或閾限時間規(guī)定為測試規(guī)程的一部分，但更普遍地可以使用適合于所有被孵育的目標(biāo)實體(例如細(xì)菌)的溫度和時間。

技術(shù)人員將進(jìn)一步理解可以采用有助于安全處置的上述技術(shù)，其與培養(yǎng)特異性目標(biāo)生物體和/或估計初始存在于液體樣品中的(任何類型的)生物體的數(shù)目無關(guān)。

因此在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種選擇性測試液體樣品中活生物實體的存在的方法，所述方法包括：提供培養(yǎng)容器，所述培養(yǎng)容器包括可密封室，所述可密封室用于接收和培養(yǎng)液體樣品，使得所述生物實體的存在可通過檢測所述室的液面上空間中的壓力變化來檢測到；在所述培養(yǎng)容器中提供生長培養(yǎng)基，其中所述生長培養(yǎng)基是干燥形式的并且促進(jìn)活生物實體的生長，以及提供測試系統(tǒng)，所述測試系統(tǒng)包括接納所述培養(yǎng)容器并且檢測所述室的所述液面上空間中的所述壓力變化的裝置，所述裝置進(jìn)一步包括溫度控制系統(tǒng)，和數(shù)據(jù)處理器，所述數(shù)據(jù)處理器用于監(jiān)測所述檢測到的壓力變化，用于控制所述溫度控制系統(tǒng)以調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)容器中液體樣品的溫度，以及用于用信號表示由所述檢測到的壓力變化對所述培養(yǎng)容器中生物實體的存在的檢測；向所述所選擇的培養(yǎng)容器的所述室提供測試液體樣品；孵育所述測試液體樣品以確定所述目標(biāo)特異性生物實體是否存在于所述測試液體樣品內(nèi)；并且然后處理所述經(jīng)孵育的測試液體樣品從而使得所述培養(yǎng)容器內(nèi)的生物實體成為無活力的或不可培養(yǎng)的。

在相關(guān)的進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種用于選擇性測試液體樣品中活生物實體的存在的液體樣品測試系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：接納培養(yǎng)容器并且檢測所述室的所述液面上空間中的壓力變化的裝置，所述培養(yǎng)容器包括可密封室，所述可密封室用于接收和培養(yǎng)液體樣品，使得所述生物實體的存在可通過檢測所述室的液面上空間中的壓力變化來檢測到；溫度控制系統(tǒng)；和數(shù)據(jù)處理器，所述數(shù)據(jù)處理器用于監(jiān)測檢測到的所述液面上空間的壓力變化，用于控制所述溫度控制系統(tǒng)以根據(jù)測試規(guī)程調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)容器中液體樣品的溫度，以及用于用信號表示由所述檢測到的壓力變化對所述培養(yǎng)容器中生物實體的存在的檢測；其中所述數(shù)據(jù)處理器被配置成：孵育測試液體樣品以確定生物實體是否存在于所述測試液體樣品中；并且然后將所述經(jīng)孵育的測試液體樣品的溫度升高至大于閾限溫度持續(xù)大于閾限時間的時間從而使得所述培養(yǎng)容器內(nèi)的生物實體成為無活力的或不可培養(yǎng)的。

本發(fā)明還單獨(dú)地提供了上述液體樣品測試系統(tǒng)的(測試)裝置，以及培養(yǎng)容器。

技術(shù)人員將理解本發(fā)明的此方面可以包括前面所述的本發(fā)明的各個實施方案/方面的特征以提供額外的優(yōu)勢。

附圖說明

現(xiàn)在將參照僅作為實例的附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明的這些和其他方面，在附圖中：

圖1a和1b示出了用于本發(fā)明的實施方案中的分別處于標(biāo)準(zhǔn)大氣壓和減壓下的培養(yǎng)容器；

圖2示出了被配置成接納圖1中所示類型的培養(yǎng)容器的測試單元的實例；

圖3示出了被配置成實施根據(jù)本發(fā)明的實施方案的測試方法的圖2中所示類型的測試單元的框圖；

圖4示出了圖3的測試單元的操作程序的流程圖；

圖5示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的實施方案準(zhǔn)備含有生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器的方法；

圖6a和6b分別示出了大腸桿菌(E.Coli)的示例生長曲線以及初始存在于樣品中的大腸桿菌CFU的數(shù)目以及至檢測到閾限壓力變化的時間的相關(guān)圖；且

圖7示出了被配置用于測試法規(guī)遵從性的測試軟件的框圖。

具體實施方式

現(xiàn)在參照圖3，其示出了圖2中所示的通用類型的測試單元300的框圖，其被配置成實施根據(jù)本發(fā)明的方法的實施方案?？驁D進(jìn)行了簡化以利于理解，省略了例如安全性零件。因此處理器302耦聯(lián)到一個或多個通信接口304，諸如USB端口和/或網(wǎng)絡(luò)連接，以及連接到操作員界面306，例如類似于圖2的界面206。處理器還耦聯(lián)到溫度控制系統(tǒng)308，用于每個培養(yǎng)容器。這包括溫度傳感器和加熱器和/或冷卻器，根據(jù)儲存在編程存儲器312中的控制軟件在處理器302的控制下運(yùn)行。壓力傳感器310感測所述培養(yǎng)容器或每個培養(yǎng)容器的壓力，再次被控制軟件使用。任選地可以包括其他傳感器，例如顏色傳感器以感測培養(yǎng)基的顏色或顏色變化。在簡單的實施方案中，這可以包括波長選擇性光學(xué)照明源和/或波長選擇性檢測器，例如帶有濾色片的光檢測器。該系統(tǒng)包括工作存儲器314和非易失(在實施方案中為Flash^TM)存儲器316，任選地在可移動卡或類似物上。非易失存儲器316儲存限定一套測試規(guī)程的數(shù)據(jù)(一個測試規(guī)程用于待檢測的一個細(xì)菌種)，儲存所記錄的試驗數(shù)據(jù)，特別是壓力、溫度和時間數(shù)據(jù)。在需要點查初始樣品中的CFU數(shù)目的情況下，存儲器316還儲存校準(zhǔn)數(shù)據(jù)。校準(zhǔn)數(shù)據(jù)優(yōu)選為包括一套多行的查找表的形式，一行用于與特異性生長培養(yǎng)基組合的不同種或?qū)俚募?xì)菌中的一種。任選地，校準(zhǔn)數(shù)據(jù)還可以包括一行，其用于與非特異性生長培養(yǎng)基組合的通用實體類型(任何實體、或?qū)嶓w的類諸如細(xì)菌、真菌等)，其中單元用于生物體的非特異性點查。每行中的數(shù)據(jù)限定每個種/屬的直線log N對時間關(guān)系(其中N是樣品中CFU的初始數(shù)目)，任選地但優(yōu)選包括可用來限定N的范圍的數(shù)據(jù)，諸如標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)據(jù)。

圖4示出了用于圖3的測試單元的操作的程序流程圖。由此，在步驟402，所述程序輸入用于培養(yǎng)容器的標(biāo)識符，所述標(biāo)識符標(biāo)識所述生長培養(yǎng)基所特別適用的細(xì)菌的種/屬。然后所述程序查找相應(yīng)的測試規(guī)程。這限定了用于所述測試的溫度或溫度曲線，且優(yōu)選限定了壓力檢測點，即特異性目標(biāo)生物體的陽性檢測所需要的預(yù)設(shè)壓力變化(步驟404)。然后所述測試運(yùn)行406并將壓力和時間和任選的溫度儲存在存儲器316。當(dāng)滿足通過/失敗標(biāo)準(zhǔn)(例如儲存在之前提到的查找表中)時所述測試可以停止。備選地，可以獲得成套壓力-時間數(shù)據(jù)并且之后測試它們以確定樣品是否滿足通過/失敗標(biāo)準(zhǔn)(步驟410)。任選地，使用儲存在查找表中的對應(yīng)關(guān)系，由所述成套壓力-時間數(shù)據(jù)，或更簡單地，由開始所述測試和在步驟410滿足所述標(biāo)準(zhǔn)之間的時間間隔，來確定估計數(shù)目，可以估計測試樣品中CFU的初始數(shù)目412。

圖5示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的實施方案的準(zhǔn)備含有選擇性生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器的方法。因此在實施方案中將選擇性生長培養(yǎng)基和抗生素在球磨機(jī)中研磨502、504，然后混合506并包封508，例如在HPMC中。備選地，可以將起始物料一起研磨。用于干粉形式的一定范圍內(nèi)的不同細(xì)菌的合適的選擇性培養(yǎng)基和合適的抗生素可以從例如Oxoid Limited UK獲得。技術(shù)人員將理解許多不同類型的培養(yǎng)基己知用于不同類型的細(xì)菌；通常這些具有一些特異性。原則上在本發(fā)明的實施方案中可以采用這些己知類型的培養(yǎng)基中的任一種。類似地，己知許多不同類型的抗生素，提供或多或少的選擇性，并且同樣原則上可以采用任何合適類型的抗生素。

在制造了膠囊之后，將它們置于培養(yǎng)容器的室中，優(yōu)選以規(guī)定的量(步驟510)，并用標(biāo)識符513諸如條形碼標(biāo)記培養(yǎng)容器(512)，所述標(biāo)識符513對應(yīng)于被所述膠囊作為目標(biāo)的細(xì)菌(或其他實體)。針對這一點要理解：處于膠囊中的生長培養(yǎng)基或混合物，盡管以特異性實體為目標(biāo)，仍可以能夠使其他類型的實體(例如不同種的細(xì)菌)生長。然后通過γ射線輻照將培養(yǎng)容器滅菌(514)，例如，以25-40kGy的劑量，例如由Synergy Health，UK提供的服務(wù)。

然后標(biāo)記的培養(yǎng)容器可以用于圖4的程序。這通過選擇與培養(yǎng)容器標(biāo)簽上的細(xì)菌(或其他實體)類型的標(biāo)識所對應(yīng)的適宜測試規(guī)程來提供額外的選擇性。己表明，這種選擇性規(guī)程與選擇性生長培養(yǎng)基的組合足以將被標(biāo)識的實體類型作為目標(biāo)，使得測試規(guī)程的結(jié)果有效地對目標(biāo)特異。

可以在如上所述的程序中采用的選擇性生長培養(yǎng)基的一個實例是干燥形式的麥康凱肉湯(MacConkey Broth)。其有區(qū)別地選擇大腸菌(大腸產(chǎn)氣菌——大腸桿菌(Escherichia)和氣桿菌(Aerobacter)屬的細(xì)菌)的生長。更特別地，這種培養(yǎng)基含有膽汁鹽，膽汁鹽抑制大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌。此生長培養(yǎng)基的制造對于技術(shù)人員來說是眾所周知的；一種配方包括例如大約：20g蛋白胨、10g乳糖、5g膽汁鹽、5g氯化鈉、補(bǔ)足至1升水。任選地可以添加指示劑以監(jiān)測酸的產(chǎn)生，例如結(jié)晶紫(其還抑制一些革蘭氏陽性細(xì)菌)或溴甲酚紫——顏色變化(例如從紫色到黃色)可以與如前面所提到的比色分析規(guī)程組合。技術(shù)人員將知曉，取決于對生長的所述抑制效應(yīng)是合乎需要的和/或不合乎需要的，對于此基本式存在許多變化形式。在制備肉湯后，可以將其干燥并保存；備選地其可以從供應(yīng)商諸如Oxoid、LabM和Merck(商標(biāo))以脫水形式購買。

對沙門氏菌(革蘭氏陰性細(xì)菌)諸如沙門氏菌屬有選擇性的選擇性生長培養(yǎng)基的另一實例可以如下所述制備：示例生長培養(yǎng)基配方包括大致：5g蛋白胨、5g酵母提取物、5g鹽緩沖液，和任選的附加的生長促進(jìn)劑，補(bǔ)足至1升水。同樣這樣的生長培養(yǎng)基可以從供應(yīng)商諸如Oxoid、LabM和Merck(商標(biāo))以脫水形式購買。向此生長培養(yǎng)基優(yōu)選還加入抗生素諸如新生霉素(變形桿菌(Proteus)的抑制劑)和/或頭孢磺啶(假單胞菌(Pseudomonas)的抑制劑)。比向肉湯添加抗生素更好的是添加干燥形式的抗生素——將抗生素和(干燥的)生長培養(yǎng)基兩者(在球磨機(jī)中)研磨并合并為在水溶性膠囊內(nèi)的單一脫水物質(zhì)，其之后進(jìn)行γ-輻照。同樣，任選地，如果需要，還可以將一種或多種發(fā)色團(tuán)指示劑加入到生長培養(yǎng)基，例如通過改變顏色與特異性酶的存在發(fā)生反應(yīng)的發(fā)色團(tuán)(這些也可購買獲得)。

采用這些方式，將選擇性生長培養(yǎng)基保持無菌，并在使用中自動地將其再水化(當(dāng)向培養(yǎng)室添加水性樣品時)，對使用者來說不存在可能要處置有害物質(zhì)的需要。

技術(shù)人員將理解可以通過簡單的技術(shù)(例如修改現(xiàn)有的用于制備瓊脂平板的配方)制備干燥的選擇性生長培養(yǎng)基的許多其他變化形式。

作為檢測沙門氏菌的測試規(guī)程的實例，將上述用于沙門氏菌的選擇性生長培養(yǎng)基，包括新生霉素和頭孢磺啶兩者，維持在36℃-37℃的溫度(持續(xù)48小時)。在此范圍之外，在此實例中沙門氏菌的差別生長基本上不太有效。作為檢測大腸桿菌的測試規(guī)程的實例，將上述大腸桿菌-選擇性生長培養(yǎng)基對于一般大腸菌類(coliform)在36℃+/-1℃使用或僅用于檢測大腸桿菌(E.Coli)在44℃+/-1℃使用(持續(xù)48小時)，這取決于所采用的液體樣品的類型：在此實例中，液體是含有兩種不同的調(diào)味劑的食品——通過一系列實驗確定測試規(guī)程以明確哪一個是最可靠的和有效的；發(fā)現(xiàn)使用的規(guī)程取決于食品的調(diào)味劑(和推定的組成)。技術(shù)人員將認(rèn)識到可以以相似的方式確定其他測試規(guī)程。不希望受理論約束，一般來說，最適溫度似乎是目標(biāo)生物體存活并快速繁殖時的最大溫度，由此抑制其他生物體生長，此時該溫度對它們來說太高。不過，其他效應(yīng)也可能在起作用。通常，不需要對規(guī)程采用時間截止值或檢測-時間窗，盡管原則上可以采用其來提供較快和較慢生長的生物體之間的差別和/或具有不同的CFU初始數(shù)目的樣品之間的差別。如上所述，測試樣品的顏色變化原則上可以用來提供額外的差別檢測參數(shù)——例如，對顏色變化的檢測是大腸桿菌或大腸菌類測試的重要部分。這樣的測試原則上可以用作進(jìn)一步的目標(biāo)實體檢測參數(shù)，或可能更有用地用作測試的潛在可靠性的指標(biāo)(例如指示在還沒有達(dá)到對目標(biāo)生物體的良好區(qū)分的意義上的“污染”)。

現(xiàn)在參照圖6a，其示出了大腸桿菌(E.Coli)的兩個示例性生長曲線602、604，示出了在大約24小時的時期內(nèi)壓力隨時間的變化。曲線602的樣品在樣品中初始數(shù)目為1000個CFU；曲線604的樣品在樣品中的初始數(shù)目為30個CFU。垂直線606a、b標(biāo)記了直到檢測出閾限壓力變化的各自的時間(對于兩個樣品相同的閾限壓力變化)。如在此實例中可見到的，通過初始的壓力下降隨后壓力升高檢測到大腸桿菌的存在。線608、610示出了樣品的(穩(wěn)定的、受調(diào)節(jié)的)溫度，在此例中在測試規(guī)程中為36℃+/-1℃(盡管如可以見到的，溫度優(yōu)選被控制為好于+/-0.5℃、+/-0.25℃或+/-0.1℃)。

用于檢測生物體的閾限壓力變化可以是正的或負(fù)的(或甚至兩者的組合，例如規(guī)定的下降，接著規(guī)定的升高，或反之亦然)。圖6a的生長曲線的具體形狀作為實例——其他細(xì)菌可以具有不同形狀的曲線。例如，大腸桿菌是兼性厭氧生物，即其可以需氧地生長或厭氧地生長，盡管優(yōu)先前者，因為這能夠使生物體更快地產(chǎn)生更多的能量。因此在圖6a的實施例中，壓力曲線初始地下降，同時氧被利用，然后細(xì)菌轉(zhuǎn)換為厭氧代謝并開始產(chǎn)生二氧化碳(此發(fā)酵過程的產(chǎn)物)，使得壓力開始再次升高。

還已經(jīng)進(jìn)行了許多試驗，使用特異性生長培養(yǎng)基和對應(yīng)的測試規(guī)程，來測量直到檢測出(生物體)的時間相對于初始存在的生物體的數(shù)目。在每一種情況下，發(fā)現(xiàn)在測試液體樣品中的CFU初始數(shù)目/克或CFU初始數(shù)目/ml的對數(shù)(例如，底為10)與直到檢測出生物體的時間之間有良好的相關(guān)性(具有負(fù)斜率的直線：生物體的初始數(shù)目越小，則直到檢測出的時間越長)。這種關(guān)系在寬范圍內(nèi)有效，例如從＜10CFU/g至＞1000CFU/g。

參照圖6b，其示出了對于一定范圍的不同初始CFU接種數(shù)(通過連續(xù)稀釋得到)，在樣品中初始存在的大腸桿菌CFU數(shù)目與直到檢測出閾限壓力變化的時間的圖的實施例。如可以見到的，存在高度的相關(guān)性，甚至對于低初始CFU值。而且，由于壓力變化測量的靈敏性，可以看到直到檢測出時的時間非常快?？梢岳斫庖坏y量了曲線諸如圖6b中所示的曲線，并且儲存了限定曲線的一個或多個參數(shù)，則在直到檢測出時的時間的情況下，簡單地使用該曲線讀出預(yù)測的樣品中的細(xì)菌初始數(shù)目。

如上所述的系統(tǒng)的一個應(yīng)用是建立例如食品的法規(guī)遵從性或用于廢水排放的法規(guī)遵從性。作為實例，將考慮船只壓艙水處理系統(tǒng)的情況——但所述原理以簡單的方式適用于其他應(yīng)用。在此實例中，船只擁有者需要確信排放的廢水滿足規(guī)定在排放物中所允許的一種或多種細(xì)菌種的濃度的法規(guī)，例如，大腸桿菌、腸球菌和霍亂弧菌的最大濃度(例如100ml經(jīng)處理水中不超過250CFU)。此外，可能有多個不同的法規(guī)要遵守，在此實例中取決于船只的地點。

另外，海岸警衛(wèi)隊隊員需要能夠驗證已經(jīng)滿足了法規(guī)要求，因而對結(jié)果和對它們所基于的數(shù)據(jù)存在審計要求。后一種要求(當(dāng)存在時)可以通過至少將得出測試結(jié)果的數(shù)據(jù)加密，并且確保僅加密的數(shù)據(jù)被永久儲存在裝置內(nèi)(以避免修改)來滿足。解密鑰匙可以被安全地構(gòu)建在測試機(jī)器/計算機(jī)系統(tǒng)中(以不容易通過反編譯程序代碼來訪問的方式)。

為了滿足法規(guī)要求，在校準(zhǔn)和測試規(guī)程之間建立一對一關(guān)系，并且一旦已經(jīng)開始校準(zhǔn)程序則固定規(guī)程。許多測試組成單一校準(zhǔn)；優(yōu)選系統(tǒng)軟件使使用者能夠通過選擇將用來生成校準(zhǔn)數(shù)據(jù)的測試和規(guī)程來形成新的校準(zhǔn)。所述校準(zhǔn)由用來形成它的數(shù)據(jù)的圖的一個或多個參數(shù)來表示；許多測試可以針對單一校準(zhǔn)來進(jìn)行驗證，并且這些測試必須使用與所述校準(zhǔn)相關(guān)聯(lián)的規(guī)程。來自測試的優(yōu)選輸出包括對初始存在于樣品中的CFU數(shù)目的指示和/或通過/失敗指示(當(dāng)與規(guī)則相聯(lián)系時)。

示例性校準(zhǔn)程序如下。優(yōu)選地，使使用者一步一步地通過這樣的程序。由此對(水的)樣品進(jìn)行一系列n個實驗，每個試驗具有不同的己知初始濃度的CFU/ml的目標(biāo)細(xì)菌；優(yōu)選n＝＞5。優(yōu)選地CFU/ml的范圍應(yīng)當(dāng)適宜于樣品中所期望的范圍。然后可以將結(jié)果作圖(用于可視化)，并且通過任何標(biāo)準(zhǔn)手段擬合曲線。然后任選地可以通過針對另一測試技術(shù)檢查未知樣品來驗證校準(zhǔn)。在鹽水的情況下，任選地，可以改變鹽濃度——如果看到效果，則可以對一定范圍的不同鹽濃度確定一系列校準(zhǔn)曲線。相同的原理可以適用于其他表征樣品的變量，例如在食品或飲料的情況下表征調(diào)味劑/組成的變量。對每個需要評價的單獨(dú)的目標(biāo)實體遵循此類型的校準(zhǔn)程序。

在軟件的優(yōu)選實施方案中，做出規(guī)定以形成“規(guī)則”(在實施方案中是軟件對象)，以有助于建立與規(guī)則的一致性。典型地，這樣的規(guī)則對象與用于一個或多個特異性目標(biāo)生物實體的一個或多個測試相聯(lián)系或相關(guān)聯(lián)，所述一個或多個特異性目標(biāo)生物實體是所述規(guī)則的對象。所述測試每個均規(guī)定樣品中實體的最大允許水平，例如按CFU/ml計。在實施方案中規(guī)則與校準(zhǔn)并不具有直接的關(guān)系，但存在間接的關(guān)系。因此參照圖7，規(guī)則對象702限定大腸桿菌(E.Coli)、腸球菌(Enterococci)和霍亂弧菌(Cholera)的最大允許濃度，并且向三個測試提供濃度限值數(shù)據(jù)704，對每個目標(biāo)提供一個數(shù)據(jù)，用來限定測試的各個通過/失敗標(biāo)準(zhǔn)。每個測試704與各個校準(zhǔn)數(shù)據(jù)706相聯(lián)系并提出測試規(guī)程708，將其如前所述應(yīng)用。以此方式所述系統(tǒng)能夠執(zhí)行所述測試，記錄數(shù)據(jù)(優(yōu)選以加密的形式)，并且為規(guī)則以及任選地單獨(dú)地為每個測試提供簡單的通過/失敗輸出。

毫無疑問對于技術(shù)人員來說存在許多其他有效的備選方案。要理解本發(fā)明不限于所述的實施方案并包括對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的在附帶的權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的各種改型。