本公開內(nèi)容涉及修飾的磺酰胺酶、包含修飾的磺酰胺酶的組合物以及用于產(chǎn)生修飾的磺酰胺酶的方法。此外，公開了修飾的磺酰胺酶在療法諸如在治療溶酶體貯積疾病中的用途。背景溶酶體貯積疾病溶酶體區(qū)室作為降解細(xì)胞中的廢棄物質(zhì)的分解代謝機(jī)器發(fā)揮作用。降解通過被特別地區(qū)室化至溶酶體的許多水解酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來實(shí)現(xiàn)。現(xiàn)今，存在超過40種其中已在疾病和編碼溶酶體蛋白的基因中的突變之間建立了聯(lián)系的已鑒定的遺傳性疾病。這些疾病被定義為溶酶體貯積疾病(LSD)，并以由降解能力不足造成的不能被降解的代謝物(或多種代謝物)的累積為特征。代謝物的過量溶酶體貯積的結(jié)果是，溶酶體尺寸增加。積累的貯積物質(zhì)如何引起病理尚不完全清楚，但可能涉及諸如自噬抑制和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)(Cox&Cachón-González,JPathol226:241-254(2012))的機(jī)制。酶替代療法貯積可通過施用來自異源性來源的溶酶體酶來減少。被良好地確認(rèn)的是，靜脈施用溶酶體酶導(dǎo)致其經(jīng)由被稱為受體介導(dǎo)的胞吞的機(jī)制被細(xì)胞迅速攝取。該胞吞由細(xì)胞表面上的受體介導(dǎo)，且特別地已顯示兩種甘露糖-6-磷酸受體(M6PR)對(duì)某些溶酶體酶的攝取是關(guān)鍵性的(Neufeld；BirthDefectsOrigArticSer16:77-84(1980))。M6PR識(shí)別磷酸化的寡聚甘露糖聚糖(oligomannoseglycans)，所述磷酸化的寡聚甘露糖聚糖是溶酶體蛋白的特征?；谑荏w介導(dǎo)的胞吞的原則，現(xiàn)今，酶替代療法(ERT)對(duì)于六種LSD((高雪氏癥(Gaucher)、法布瑞氏癥(Fabrys)、龐貝氏癥(Pompe)以及黏多糖貯積癥I、II和VI型)是可用的。這些療法在減少多種外周器官中的溶酶體貯積并從而改善與病理相關(guān)的一些癥狀中是有效的。然而，大部分LSD導(dǎo)致在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的溶酶體貯積，并因此表現(xiàn)出一組(arepertoireof)CNS相關(guān)病征和癥狀。靜脈施用的ERT的主要缺點(diǎn)是向CNS的差的分配。CNS被由CNS內(nèi)皮形成的血腦屏障(BBB)保護(hù)而免于暴露于血源性化合物。BBB的內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出防止細(xì)胞旁通路的緊密連接，顯示出有限的被動(dòng)胞吞并且另外缺乏某些在其他組織中觀察到的受體介導(dǎo)的胞轉(zhuǎn)(transcytotic)能力。值得注意的是，在小鼠中M6PR介導(dǎo)的跨越BBB的轉(zhuǎn)運(yùn)僅在出生之后多至2周被觀察到(Urayama等,MolTher16:1261-1266(2008))。溶酶體酶的糖基化通常，N-糖基化可發(fā)生在Asn-X-Ser/Thr序列基序處。在網(wǎng)狀腔內(nèi)，N-聚糖的初始核心結(jié)構(gòu)被糖基轉(zhuǎn)移酶、寡糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移至該基序。對(duì)于所有N-連接聚糖，該共同的基礎(chǔ)由以下14個(gè)殘基構(gòu)成:3個(gè)葡萄糖、9個(gè)甘露糖和2個(gè)N-乙酰葡糖胺。然后，通過修剪下初始核心和添加新的糖部分兩者的多種酶的作用，該祖先被轉(zhuǎn)化為三大類型的N-聚糖：寡聚甘露糖、復(fù)雜型和雜合型(圖7)。每個(gè)成熟的N-聚糖包含共同的核心Man(Man)2-GlcNAc-GlcNAc-Asn，其中Asn是與蛋白的附接點(diǎn)。另外，被導(dǎo)向溶酶體的蛋白攜帶一個(gè)或更多個(gè)被磷酸化的N-聚糖。磷酸化發(fā)生在高爾基體中并通過將N-乙酰葡糖胺-1-磷酸添加至寡聚甘露糖型N-聚糖的甘露糖殘基的C-6起始。N-乙酰葡糖胺被裂解掉，以產(chǎn)生甘露糖-6-磷酸(M6P)殘基，甘露糖-6-磷酸(M6P)殘基被M6PR識(shí)別并將起始溶酶體蛋白到溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)。然后，將所得到的N-聚糖修剪到M6P是N-聚糖鏈的末端基團(tuán)的程度。(EssentialsofGlycobiology.第2版.VarkiA,CummingsRD,EskoJD,等,編著ColdSpringHarbor(NY):ColdSpringHarborLaboratoryPress；2009.)M6PR的結(jié)合位點(diǎn)要求是完整的末端M6P基團(tuán)，因?yàn)樘遣糠趾土姿峄鶊F(tuán)兩者都參與了與受體的結(jié)合(Kim等,CurrOpinStructBiol19(5):534-42(2009))。通過聚糖修飾靶向腦部的酶替代療法增加溶酶體酶向CNS的分配的潛在策略已被公開于WO2008/109677中。在該公布的申請(qǐng)中，描述了使用偏高碘酸鈉和硼氫化鈉的β-葡萄糖醛酸糖苷酶的化學(xué)修飾(還參見Grubb等，ProcNatlAcadSciUSA105:2616-2621(2008))。由用20mM高碘酸鈉氧化6.5小時(shí)，然后猝滅、透析和用100mM硼氫化鈉還原過夜組成的該修飾(下文稱為已知方法)實(shí)質(zhì)性地改進(jìn)了β-葡糖醛酸糖苷酶的CNS分布并導(dǎo)致LSD黏多糖貯積癥VII的鼠模型中的神經(jīng)元貯積的清除。盡管腦部分布的潛在機(jī)制尚不清楚，但注意到化學(xué)修飾破壞β-葡糖醛酸糖苷酶上的聚糖結(jié)構(gòu)，并且還被證實(shí)通過M6PR的受體介導(dǎo)的胞吞被大大減少。已研究了其他溶酶體酶的化學(xué)修飾策略。例如，根據(jù)已知方法的修飾未改進(jìn)靜脈施用的蛋白酶三肽基肽酶I向腦的分配(Meng等,PLoSOne(2012))。對(duì)于磺酰胺酶也沒有令人滿意的被證實(shí)的結(jié)果。根據(jù)已知方法化學(xué)修飾的磺酰胺酶，確實(shí)在小鼠中顯示了增加的半衰期，但在MPSIIIA小鼠的腦中無影響。當(dāng)通過靜脈施用反復(fù)給予時(shí)，化學(xué)修飾的磺酰胺酶未分配到腦薄壁組織(Rozaklis等,ExpNeurol230:123-130(2011))。因此，對(duì)于具有神經(jīng)參與的LSD，諸如MPSIIIA的治療仍無有效的ERT?？煽缭紹BB轉(zhuǎn)運(yùn)同時(shí)保持酶促活性的新型的磺酰胺酶化合物將在開發(fā)用于治療具有CNS相關(guān)病理的LSD，諸如MPSIIIA的酶替代療法的全身施用的化合物中有重要價(jià)值。發(fā)明的公開內(nèi)容本發(fā)明的目的是，提供允許發(fā)展用于LSD，諸如MPSIIIA的酶替代療法的新型的磺酰胺酶化合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供可跨越哺乳動(dòng)物中的血腦屏障被轉(zhuǎn)運(yùn)并且可在所述哺乳動(dòng)物的腦中表現(xiàn)出酶促(催化)活性的新型磺酰胺酶化合物。本發(fā)明的又另一個(gè)目的是，提供一種表現(xiàn)出改進(jìn)的穩(wěn)定性的新型磺酰胺酶化合物。由本公開內(nèi)容將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的這些目的和其他目的通過如在所附權(quán)利要求書中定義的和如本文一般性公開的本發(fā)明的不同方面來實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種修飾的磺酰胺酶，該修飾的磺酰胺酶基本上不包含針對(duì)聚糖識(shí)別受體的表位，從而使所述磺酰胺酶能夠跨越哺乳動(dòng)物的血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)，其中所述磺酰胺酶在所述哺乳動(dòng)物的腦中具有催化活性。根據(jù)本發(fā)明的修飾的磺酰胺酶從而被修飾為例如與未修飾的磺酰胺酶(SEQIDNO:1)相比針對(duì)聚糖識(shí)別受體的表位已被移除。如例如在所附實(shí)施例中已被申請(qǐng)人證實(shí)的，此類修飾的磺酰胺酶不易被細(xì)胞攝取，這是移除針對(duì)聚糖識(shí)別受體諸如兩種甘露糖-6-磷酸受體(M6PR)的表位的結(jié)果(參見實(shí)施例6和7)。所述表位的幾乎完全不存在降低修飾的磺酰胺酶對(duì)聚糖識(shí)別受體的親和力。特別地，這可降低修飾的磺酰胺酶在外周組織中的受體介導(dǎo)的胞吞，當(dāng)例如被靜脈施用至哺乳動(dòng)物時(shí)這繼而可導(dǎo)致修飾的磺酰胺酶從血漿降低的清除。這可能至少部分地由于，在磺酰胺酶的化學(xué)修飾后，在外周組織中受體介導(dǎo)的攝取的抑制(如在實(shí)施例6的細(xì)胞攝取研究中證實(shí)的)。從給藥的角度，修飾的磺酰胺酶的降低的清除可有利地允許開發(fā)可不太頻繁地施用至患者的長效藥物。聚糖識(shí)別受體意指主要經(jīng)由蛋白的聚糖部分識(shí)別并結(jié)合蛋白的受體。除了甘露糖-6-磷酸受體以外，此類受體可通過甘露糖受體例示；其選擇性結(jié)合其中聚糖表現(xiàn)出暴露的末端甘露糖殘基的蛋白。凝集素構(gòu)成聚糖識(shí)別受體的另一大家族，凝集素可通過識(shí)別聚糖上的末端半乳糖殘基的末端半乳糖識(shí)別脫唾液酸糖蛋白受體1來例示。因此，針對(duì)聚糖識(shí)別受體的表位可被理解為被此類受體識(shí)別的聚糖部分(的一部分)。在該上下文中，基本上不包含針對(duì)聚糖識(shí)別受體的表位的修飾的磺酰胺酶應(yīng)優(yōu)選地被理解為幾乎不包含針對(duì)聚糖識(shí)別受體的表位或僅包含少量此類表位的修飾的磺酰胺酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾的磺酰胺酶不包含(可檢測(cè)的)針對(duì)聚糖識(shí)別受體的表位。特別地，修飾的磺酰胺酶不包含分別構(gòu)成對(duì)胞吞M6PR1型和2型、甘露糖受體和半乳糖受體的表位的(可檢測(cè)的)甘露糖-6-磷酸部分、甘露糖部分、或半乳糖部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位因此可被選自M6PR1型和2型、甘露糖受體和半乳糖受體的至少一種聚糖識(shí)別受體所識(shí)別。特別地，所述至少一種聚糖識(shí)別受體可選自M6PR1型和2型。與以上定義的一致，在天然聚糖部分上發(fā)現(xiàn)的所述表位表示選自甘露糖-6-磷酸部分、甘露糖部分和半乳糖部分的至少一種類型的部分。在特定的實(shí)施方案中，這些部分都不存在于如本文公開的修飾的磺酰胺酶。此外，根據(jù)本文描述的方面，修飾的磺酰胺酶不僅分配向哺乳動(dòng)物的腦，它還在所述哺乳動(dòng)物的腦中表現(xiàn)出(保留的)酶促活性或催化活性。修飾的磺酰胺酶的酶促活性至少部分地被從未修飾形式的磺酰胺酶保留。此外，與根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)方法修飾的在小鼠的腦中不表現(xiàn)出(分布和)酶促活性的磺酰胺酶相比，酶促活性被保留。因此，如本文公開的修飾的磺酰胺酶可影響哺乳動(dòng)物的腦中的溶酶體貯積，諸如降低溶酶體貯積，例如，如例如在實(shí)施例8中證實(shí)的己糖胺N-硫酸酯[α-1,4]糖醛酸(hexosamineN-sulfate[α-1,4]uronicacid，HNS-UA)的溶酶體貯積。例如，保留的催化活性可取決于在磺酰胺酶的活性位點(diǎn)處起催化作用的氨基酸殘基的保留與修飾的水平?；酋０访笇儆诹蛩狨ッ傅鞍准易?。硫酸酯酶是催化來自多種底物的硫酸酯鍵的水解的共同進(jìn)化起源的蛋白家族。因此，如本文使用的修飾的磺酰胺酶的“催化活性”可涉及硫酸酯鍵的水解，優(yōu)選地在外周組織的溶酶體中和/或在哺乳動(dòng)物的腦中的溶酶體中。如此，修飾的磺酰胺酶的催化活性可導(dǎo)致罹患溶酶體貯積疾病的哺乳動(dòng)物的腦中溶酶體貯積，諸如硫酸乙酰肝素貯積的減少。例如，如在實(shí)施例8中概述的，催化活性可例如在動(dòng)物模型中測(cè)量。硫酸酯酶共有具有中心β-折疊的共同折疊部分(fold)，所述中心β-折疊由10個(gè)β鏈組成?；酋０访傅幕钚晕稽c(diǎn)位于中心β-折疊的末端處，并在SEQIDNO:1的位置50中包含保守的半胱氨酸，所述半胱氨酸在翻譯后被修飾為Cα-甲酰甘氨酸(FGly)。該反應(yīng)通過FGly生成酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生。在位置50(FGly50)中的該FGly殘基直接參與硫酸酯鍵的水解，并且修飾對(duì)于酶被激活似乎是必需的。值得注意的是，在芳基硫酸酯酶A和B中保守的半胱氨酸到絲氨酸(Ser)的突變防止FGly形成并產(chǎn)生無活性的酶(Recksiek等,JBiolChem13；273(11):6096-103(1998))。當(dāng)在本文討論活性部位的保留時(shí)，應(yīng)主要被理解為SEQIDNO:1的翻譯后的FGly50的保留。如此，在此類情況中，修飾的磺酰胺酶應(yīng)該被理解為包含由如SEQIDNO:1定義的氨基酸序列或與此氨基酸序列具有如以下定義的序列一致性的氨基酸序列組成的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述活性位點(diǎn)在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的提供所述催化活性的位置50的位置中包含催化殘基。在另外的實(shí)施方案中，該催化殘基為FGly50。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的磺酰胺酶具有為未修飾的重組磺酰胺酶中天然聚糖部分的含量的約25％的相對(duì)含量的天然聚糖部分。如此，針對(duì)聚糖識(shí)別受體的所述表位可被發(fā)現(xiàn)于天然聚糖部分上，并且此類天然聚糖部分因此基本不存在于如本文描述的修飾的磺酰胺酶中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾的磺酰胺酶中天然聚糖部分的相對(duì)含量可小于25％，諸如小于20％，諸如小于15％，諸如小于10％，諸如小于5％。在特定的實(shí)施方案中，天然聚糖部分的含量小于1％。聚糖部分的相對(duì)含量可被理解為在磺酰胺酶的修飾之后保持完整的天然聚糖部分的含量。如在所附實(shí)施例中證實(shí)的，糖肽的相對(duì)定量可基于LC-MS和來自重構(gòu)的離子層析的峰面積?？蛇x的定量方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。相對(duì)含量在小于25％的水平的天然聚糖可有利地降低磺酰胺酶經(jīng)由聚糖識(shí)別受體進(jìn)入細(xì)胞的受體介導(dǎo)的胞吞，并改進(jìn)跨越血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)。如下文進(jìn)一步例示的，相對(duì)含量在25％的水平的天然聚糖可由一種天然聚糖來代表。在該方面，天然聚糖部分應(yīng)該被理解為在真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體區(qū)室中被翻譯后修飾的磺酰胺酶中天然存在的聚糖部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述天然聚糖部分通過在所述修飾的磺酰胺酶中的單鍵斷裂和雙鍵斷裂來破壞，其中通過單鍵斷裂的聚糖破壞是主要的。特別地，所述磺酰胺酶的天然聚糖部分通過單鍵斷裂和雙鍵斷裂來破壞，其中單鍵斷裂的程度在寡聚甘露糖聚糖中為至少60％。在特定的實(shí)施方案中，單鍵斷裂的程度在寡聚甘露糖類型的聚糖中為至少65％，諸如至少70％，諸如至少75％，諸如至少80％，諸如至少82％，諸如至少85％。單鍵斷裂與雙鍵斷裂的程度可如在實(shí)施例10和11中描述的來測(cè)量。如在本文其他方面描述的，磺酰胺酶可通過與高碘酸鹽反應(yīng)諸如以破壞天然存在于磺酰胺酶上的聚糖部分的結(jié)構(gòu)來修飾。修飾的磺酰胺酶的剩余聚糖結(jié)構(gòu)可已至少部分地被破壞，其中至少一個(gè)高碘酸鹽催化的裂解，即至少一個(gè)單鍵斷裂已在每個(gè)天然存在的聚糖部分中發(fā)生。與未修飾的磺酰胺酶相比，所述修飾的磺酰胺酶的“修飾”至少部分地通過所述天然聚糖部分的破壞來表示。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的磺酰胺酶包含由如SEQIDNO:1定義的氨基酸序列組成的多肽，或與如SEQIDNO:1定義的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽。在非限制性實(shí)例中，所述多肽具有與SEQIDNO:1定義的氨基酸序列至少90％的序列同一性，諸如與SEQIDNO:1定義的氨基酸序列至少95％的序列同一性，諸如與SEQIDNO:1定義的氨基酸序列至少98％的序列同一性。如此，根據(jù)本發(fā)明的修飾的磺酰胺酶可包含具有與SEQIDNO:1高度相似的氨基酸序列的多肽。然而，所述多肽可例如被一個(gè)或更多個(gè)C-末端和/或N-末端氨基酸延伸，使得實(shí)際的修飾的磺酰胺酶序列比SEQIDNO:1的序列長。類似地，在其他情況中，修飾的磺酰胺酶可具有比SEQIDNO:1的氨基酸序列短的氨基酸序列，在長度上的差異例如是由于在序列的特定位置中氨基酸殘基的缺失。在一個(gè)實(shí)施方案中，在以下五個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的至少四個(gè)處不存在所述表位：SEQIDNO:1的位置21中的天冬酰胺(N)(N(21))、位置122中的N(N(122))、位置131中的N(N(131))、位置244中的N(N(244))和位置393中的N(N(393))?？蛇x地，所述修飾的磺酰胺酶在不多于一個(gè)所述N-糖基化位點(diǎn)處包含天然聚糖部分。在某些實(shí)施方案中，所述修飾的磺酰胺酶在一個(gè)所述N-糖基化位點(diǎn)處包含天然聚糖部分；所述N-糖基化位點(diǎn)任選地為N(131)?？蛇x地，在所述修飾的磺酰胺酶多肽的N(21)、N(122)、N(244)和N(393)處不存在所述表位或聚糖部分。在所鑒定的位點(diǎn)處缺乏聚糖部分的此類修飾的磺酰胺酶的優(yōu)勢(shì)如以上說明；即，細(xì)胞攝取可被進(jìn)一步降低，并且跨越血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)可被進(jìn)一步促進(jìn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述磺酰胺酶的所述天然聚糖部分對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的位置21中的N(N(21))、位置131中的N(N(131))、位置244中的N(N(244))和位置393中的N(N(393))處的N-糖基化。因此，未修飾的磺酰胺酶可在這四個(gè)位點(diǎn)處被天然地糖基化。在該實(shí)施方案中，修飾的磺酰胺酶因此可在這些位置中具有為未修飾的重組磺酰胺酶的對(duì)應(yīng)位置中聚糖部分的含量的約或少于25％的相對(duì)含量的天然聚糖部分。在修飾的磺酰胺酶的一個(gè)特定實(shí)施方案中，以上鑒定的四個(gè)天然存在的糖基化位點(diǎn)的至少三個(gè)缺乏針對(duì)聚糖識(shí)別受體的表位。如以上提及的，在磺酰胺酶的N-糖基化位點(diǎn)N(131)的聚糖部分為天然存在于未修飾的重組磺酰胺酶上的聚糖部分。N(131)是磺酰胺酶上的糖基化位點(diǎn)，N(131)與其他糖基化位點(diǎn)相比在糖基化之后被認(rèn)為導(dǎo)致外周組織中的大部分受體介導(dǎo)的攝取。天然存在于N(131)上的寡聚甘露糖類型的聚糖部分的破壞因此可影響修飾的磺酰胺從血漿的清除。所述N(131)寡聚甘露糖的破壞可被表征為至少60％單鍵斷裂的程度。如此，通過單鍵斷裂的破壞比通過雙鍵斷裂的破壞更頻繁。在一個(gè)實(shí)施方案中，在修飾的磺酰胺酶的全部所述五個(gè)N-糖基化位點(diǎn)處不存在所述表位。如此，在所有五個(gè)N-糖基化位點(diǎn)處不存在聚糖部分：SEQIDNO:1的位置21中的N(N(21))、位置122中的N(N(122))、位置131中的N(N(131))、位置244中的N(N(244))和位置393中的N(N(393))。在這五個(gè)位點(diǎn)中缺乏聚糖部分的修飾的磺酰胺酶還可改進(jìn)修飾的酶的藥物動(dòng)力學(xué)，例如在哺乳動(dòng)物中的血漿清除可進(jìn)一步被降低。結(jié)果，修飾的磺酰胺酶的給藥頻率也可因此被進(jìn)一步降低。人磺酰胺酶(EC3.10.1.1；SEQIDNO:1)由SGSH基因編碼?；酋０访?Sulfamidase)也被稱為以下名稱：硫酸胺酶(sulphamidase)、N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(N-sulphoglucos-aminesulphohydrolase)、N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(N-sulfoglucosaminesulfohydrolase)、氨基磺酸酯磺基水解酶、硫酸乙酰肝素硫酸酯酶、肝素磺酰胺酶(heparinsulfamidase)、2-脫氧-D-葡萄糖苷-2-氨基磺酸酯磺基水解酶和N-磺基-D-葡萄糖胺磺基水解酶，且如本文使用的術(shù)語“磺酰胺酶”應(yīng)該被理解為等同于這些替代名稱。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的磺酰胺酶是分離的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述磺酰胺酶是人磺酰胺酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，在修飾之前，所述磺酰胺酶被糖基化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的磺酰胺酶是重組的?；酋０访缚衫缛绫疚膶?shí)施例1中描述的重組地產(chǎn)生?；酋０访缚稍谡婧思?xì)胞中產(chǎn)生，所述真核細(xì)胞例如但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞或鼠來源的淋巴樣細(xì)胞系。另外，磺酰胺酶可在昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或酵母細(xì)胞中產(chǎn)生。重組人磺酰胺酶是從例如以下已知的：專利號(hào)US5,863,782；US5,972,333；US6,200,563；US6,458,579；及US6,491,913。應(yīng)理解，為了本發(fā)明的目的，人磺酰胺酶可如在任何所引用的美國專利中描述的來產(chǎn)生，所述美國專利通過引用特此并入。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的磺酰胺酶包含由如SEQIDNO:1定義的氨基酸序列組成的多肽，或與如SEQIDNO:1定義的多肽具有至少95％序列同一性的多肽，其中在以下五個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的至少四個(gè)處不存在聚糖部分：SEQIDNO:1的位置21中的N(N(21))、位置122中的N(N(122))、位置131中的N(N(131))、位置244中的N(N(244))和位置393中的N(N(393))，且所述磺酰胺酶任選地具有完整的C-末端。在其一個(gè)實(shí)施方案中，由SEQIDNO:1的氨基酸436-484表示的C-末端部分是完整的。在一個(gè)方面，提供了包含修飾的磺酰胺酶的磺酰胺酶組合物，所述磺酰胺酶基本上不具有針對(duì)聚糖識(shí)別受體的表位，從而使所述磺酰胺酶能夠跨越哺乳動(dòng)物的血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)，且在活性位點(diǎn)處具有大于1的Cα-甲酰甘氨酸(FGly)與絲氨酸(Ser)的比率，從而在哺乳動(dòng)物的腦中提供催化活性。例如，所述修飾的磺酰胺酶包含由如SEQIDNO:1定義的氨基酸序列組成的多肽，或與如SEQIDNO:1定義的多肽具有至少95％的序列同一性的多肽。在此類實(shí)例中，F(xiàn)Gly與Ser的比率可被稱為FGly50與Ser50的比率。因此定義的比率意味著FGly50以比Ser50大的程度存在。優(yōu)選地，比率大于1.5，更優(yōu)選地大于2.3，更優(yōu)選地大于4，且最優(yōu)選地比率為約9。較大的比率表明修飾的磺酰胺酶的催化活性可由未修飾的形式的磺酰胺酶被較大程度的保留。包含修飾的磺酰胺酶的組合物的優(yōu)勢(shì)與像這樣的修飾的磺酰胺酶的優(yōu)勢(shì)相似。如此，與未修飾的磺酰胺酶或包含未修飾的磺酰胺酶的組合物相比，包含修飾的磺酰胺酶的組合物可表現(xiàn)出在血漿中改進(jìn)的半衰期。另外，例如與未修飾的磺酰胺酶相比，所述修飾的磺酰胺酶可表現(xiàn)出提高的向哺乳動(dòng)物的腦的分配，以及在腦中保留的催化活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，磺酰胺酶組合物具有為未修飾的重組磺酰胺酶中天然聚糖部分的含量的約25％的相對(duì)含量的天然聚糖部分。因此，針對(duì)聚糖識(shí)別受體的所述表位可被發(fā)現(xiàn)于天然聚糖部分上，并且此類天然聚糖部分因此基本上不存在于如本文描述的磺酰胺酶組合物中。其中修飾的磺酰胺酶的組合物的天然聚糖部分的相對(duì)含量因此為約25％的修飾的磺酰胺酶的組合物可例如被表示為其中每個(gè)磺酰胺酶包含一個(gè)天然聚糖的修飾的磺酰胺酶組合物，所述一個(gè)天然聚糖例如在先前提及的N-糖基化位點(diǎn)中的一個(gè)位點(diǎn)處的一個(gè)天然聚糖部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，磺酰胺酶組合物中的天然聚糖表位的相對(duì)含量可小于20％、小于15％、小于10％、小于5％。在一些情況中，天然聚糖部分的相對(duì)含量小于4％、3％、2％、1％、0.5％，諸如小于0.1％，諸如小于0.01％。具有這些水平的相對(duì)含量的天然聚糖部分的磺酰胺酶的組合物是其中僅可發(fā)現(xiàn)微量的天然聚糖部分的組合物。因此，組合物是修飾的磺酰胺酶的混合物，其中天然聚糖部分或多或少地被破壞。在特定的實(shí)施方案中，天然聚糖部分的含量小于1％。約25％或小于25％的水平的相對(duì)含量的天然聚糖可有利地降低磺酰胺酶經(jīng)由聚糖識(shí)別受體進(jìn)入細(xì)胞的受體介導(dǎo)的胞吞，并改進(jìn)跨越血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)。在組合物方面的一個(gè)特定的實(shí)施方案中，在以下五個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的至少四個(gè)處不存在所述表位：SEQIDNO:1的位置21中的天冬酰胺(N)(N(21))、位置122中的N(N(122))、位置131中的N(N(131))、位置244中的N(N(244))和位置393中的N(N(393))，優(yōu)選地在N(21)、N(122)、N(244)和N(393)處不存在所述表位?？蛇x地，組合物的所述修飾的磺酰胺酶在多于一個(gè)所述N-糖基化位點(diǎn)處包含天然聚糖部分；所述N-糖基化位點(diǎn)任選地為N(131)。在組合物方面的一個(gè)實(shí)施方案中，不超過5％(按重量計(jì))的所述修飾的磺酰胺酶以具有大于1010kDa的分子量的多聚體形式存在。在組合物方面的一個(gè)實(shí)施方案中，不超過5％(按重量計(jì))的所述修飾的磺酰胺酶以寡聚體形式存在，所述寡聚體形式具有在180kDa和480kDa之間的分子量。寡聚體、多聚體或聚集形式的存在可，例如通過動(dòng)態(tài)光散射或通過尺寸排阻色譜來確定。在該上下文中，聚集形式應(yīng)該被理解為包括范圍從天然折疊的單體到未折疊的單體的結(jié)構(gòu)的高分子量蛋白形式。蛋白的聚集形式可增強(qiáng)對(duì)單體形式的蛋白的免疫應(yīng)答。對(duì)增強(qiáng)的免疫應(yīng)答的最可能的解釋是，抗原的多價(jià)呈遞交聯(lián)B細(xì)胞受體，并從而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。這是已被用于疫苗生產(chǎn)的現(xiàn)象，其中抗原以聚集的形式呈遞至宿主以確保高的免疫應(yīng)答。對(duì)于治療性蛋白，原則是相反的；任何含量的高分子量形式應(yīng)被最小化或避免，以最小化免疫應(yīng)答(Rosenberg,AAPSJ,8:E501-7(2006))。因此，寡聚、多聚和/或聚集形式的減少可從而提供更適合于在療法中使用的酶。聚集的另一個(gè)方面是，在樣品中甚至少量的存在可誘導(dǎo)正常折疊的蛋白的聚集。聚集的物質(zhì)通常不具有保留的活性或具有低保留的活性和差的溶解性。聚集物的外觀可以是確定生物藥物的貨架期的因素之一(Wang,IntJPharm,185:129-88(1999))。如本文使用的術(shù)語“組合物”應(yīng)該被理解為包括固體形式和液體形式。組合物可優(yōu)選地是適合于例如通過注射或口服施用至患者(例如，哺乳動(dòng)物)的藥物組合物。此外，應(yīng)當(dāng)理解的是，關(guān)于修飾的磺酰胺酶方面公開的實(shí)施方案和它們的優(yōu)勢(shì)也是組合物方面的實(shí)施方案。相同地，組合物方面的實(shí)施方案適用時(shí)也應(yīng)被視為修飾的磺酰胺酶方面的實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的磺酰胺酶或所述磺酰胺酶組合物用于在療法中使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物腦是人類的腦。在相關(guān)的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物因此是人。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物腦是小鼠的腦。在相關(guān)的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物因此是小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的磺酰胺酶或磺酰胺酶組合物用于在治療患有溶酶體貯積疾病，特別是黏多糖貯積癥IIIA(MPSIIIA)的哺乳動(dòng)物中使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用的所述修飾的磺酰胺酶或磺酰胺酶組合物減少所述哺乳動(dòng)物的腦中的硫酸乙酰肝素貯積。特別地，例如在動(dòng)物模型中所述硫酸乙酰肝素貯積被減少了至少3％，諸如至少35％、至少40％或至少50％。在一個(gè)方面，提供了修飾的磺酰胺酶，其中所述磺酰胺酶已通過與堿金屬高碘酸鹽和堿金屬硼氫化物的順序反應(yīng)制備，從而修飾磺酰胺酶的針對(duì)聚糖識(shí)別受體的表位，并降低磺酰胺酶對(duì)所述聚糖識(shí)別受體的活性，同時(shí)保留所述磺酰胺酶的催化活性?；酋０访笍亩蝗缦滦揎棧涸谛揎椫按嬖谟诨酋０访傅奶烊弧⑻腔问街械钠浔砦换蚓厶遣糠忠淹ㄟ^所述修飾基本上被滅活。在修飾的磺酰胺酶中，針對(duì)聚糖識(shí)別受體的表位的存在已如此被減少。應(yīng)該理解的是，關(guān)于本文公開的其他方面，諸如涉及修飾的磺酰胺酶、組合物及制備方法的方面公開的實(shí)施方案和它們的優(yōu)勢(shì)也是本方面的實(shí)施方案。特別地，下文公開的多種方法實(shí)施方案提供了依據(jù)特定反應(yīng)條件制備所述修飾的磺酰胺酶的另外的示例性定義。類似地，以上關(guān)于修飾的磺酰胺酶和組合物方面公開的實(shí)施方案提供了修飾的磺酰胺酶的另外的示例性定義。在一個(gè)方面，提供了制備修飾的磺酰胺酶的方法，所述方法包括：a)使糖基化的磺酰胺酶與堿金屬高碘酸鹽反應(yīng)，以及b)使所述磺酰胺酶與堿金屬硼氫化物反應(yīng)，持續(xù)不超過2h的時(shí)間段；從而修飾磺酰胺酶的聚糖部分并降低磺酰胺酶對(duì)聚糖識(shí)別受體的活性，同時(shí)保留所述磺酰胺酶的催化活性。所述硼氫化物任選地在10mM和80mM之間的濃度、諸如在10mM和80mM之間的濃度來使用。如此，以上方法提供了磺酰胺酶的溫和化學(xué)修飾，其降低了針對(duì)聚糖識(shí)別受體的表位的存在，所述表位例如由如本文描述的天然聚糖部分來表示。這可有利地提供適合于靶向哺乳動(dòng)物的腦的修飾的磺酰胺酶。此外，該溫和方法修飾所述表位而基本上不改變所述磺酰胺酶的催化活性。特別地，催化活性可通過保留在磺酰胺酶的活性位點(diǎn)處的FGly50來保留。如此，盡管改進(jìn)了酶的分配特性，該方法并未消除催化活性。通過溫和的方法制備的修飾的磺酰胺酶的另外的優(yōu)勢(shì)如對(duì)于以上，例如對(duì)于磺酰胺酶和組合物方面說明的。方法允許通過在聚糖(糖類)部分的兩個(gè)相鄰羥基基團(tuán)之間的碳鍵的高碘酸鹽裂解來聚糖修飾。通常，高碘酸鹽氧化裂解發(fā)生在鄰二醇存在處。二醇必須存在于赤道-赤道位置或軸向-赤道位置。如果二醇存在于剛性軸向-軸向位置，則反應(yīng)不發(fā)生(Kristiansen等,Car.Res(2010))。高碘酸鹽治療將打破M6P部分的C2和C3和/或C3和C4之間的鍵，從而產(chǎn)生不能與M6P受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)。通常，其他末端己糖也將以類似的方式被處理。非末端1-4連接的殘基僅在C2和C3之間被裂解，而非末端(1-3)連接的殘基耐受裂解。在圖7中，在三大類型的N-聚糖寡聚甘露糖、復(fù)雜型和雜合型中可能的修飾的點(diǎn)用星號(hào)標(biāo)記。如在附圖8-10中進(jìn)一步顯示的，如本文公開的方法提供了修飾的磺酰胺酶，其中與根據(jù)先前已知的方法修飾的磺酰胺酶相比，天然的聚糖部分已通過有限數(shù)目的鍵斷裂破壞。本文公開的方法主要導(dǎo)致磺酰胺酶的聚糖部分的糖部分中的單鍵型斷裂(參見圖8)。在聚糖部分的糖部分中具有優(yōu)先的單鍵斷裂的部分聚糖氧化是本文描述的相對(duì)溫和的化學(xué)修飾方法的特性。為了實(shí)現(xiàn)在聚糖部分的糖部分中具有部分聚糖氧化和主要單鍵斷裂的磺酰胺酶，可使用如下文描述和如實(shí)施例4中例示的條件。相比于現(xiàn)有技術(shù)方法和化合物，如本文描述的制備修飾的磺酰胺酶的方法及所述修飾的磺酰胺酶被改進(jìn)。首先，本發(fā)明人已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，新型修飾的磺酰胺酶被分配至哺乳動(dòng)物的腦并在其中表現(xiàn)出催化活性。此外，實(shí)施例3和5提供了在現(xiàn)有技術(shù)方法和磺酰胺酶以及如本文公開的方法和磺酰胺酶之間的比較。在這些實(shí)施例中的結(jié)果顯示，根據(jù)已知方法的修飾的磺酰胺酶包含氨基酸殘基修飾，并表現(xiàn)出多肽鏈裂解和蛋白聚集。特別感興趣的是在根據(jù)先前的方法修飾的磺酰胺酶中的活性位點(diǎn)處觀察到的有催化作用的FGly殘基到Ser殘基的轉(zhuǎn)化。在新型方法中還原步驟的相對(duì)短的持續(xù)時(shí)間似乎積極地影響修飾的酶的催化活性。在該方法方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述糖基化的磺酰胺酶多肽在至少四個(gè)天冬酰胺殘基(N-糖基化位點(diǎn))處包含聚糖部分。在該方法方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述糖基化的天冬酰胺殘基為：SEQIDNO:1的位置21中的N(N(21))、位置131中的N(N(131))、位置244中的N(N(244))和位置393中的N(N(393))。如此，這些N-糖基化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于天然聚糖部分。在該方法方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿金屬高碘酸鹽將聚糖部分的順式二醇基團(tuán)氧化為醛基團(tuán)。在該方法方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿金屬硼氫化物將所述醛還原為醇。在該方法方面的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)和步驟b)依次進(jìn)行而不進(jìn)行中間步驟。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，步驟b)可在步驟a)之后，或在如下文描述的任選的猝滅步驟a2)之后立即進(jìn)行，從而省略用于通過例如透析、超濾、沉淀或緩沖液更換去除反應(yīng)性試劑的中間步驟，并從而避免使磺酰胺酶長時(shí)間暴露于反應(yīng)性醛中間體。在步驟a)或任選地a2)之后用步驟b)處理，總的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間也被有利地減少。在以下段落中，公開了步驟a)的特定實(shí)施方案。應(yīng)該理解的是，除非另有定義，否則本文公開的方面的特定實(shí)施方案可被組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿金屬高碘酸鹽為偏高碘酸鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述步驟a)的反應(yīng)進(jìn)行不超過4h，諸如不超過3h，諸如不超過2h，諸如不超過1h，諸如約0.5h的時(shí)間段。在某些實(shí)施方案中，步驟a)的反應(yīng)進(jìn)行至少0.5h。反應(yīng)優(yōu)選地具有約3h、2h、1h、或小于1h的持續(xù)時(shí)間。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，步驟a)不超過4小時(shí)的持續(xù)時(shí)間有效地滅活針對(duì)聚糖識(shí)別受體的表位。另外，與對(duì)根據(jù)已知方法產(chǎn)生的磺酰胺酶觀察到的鏈斷裂的程度相比，不超過4h的持續(xù)時(shí)間仍然產(chǎn)生較小程度的多肽鏈的鏈斷裂。這已被本發(fā)明人例如在實(shí)施例4和5中證實(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述高碘酸鹽以不超過20mM，諸如不超過15mM、諸如約10mM的(最終)濃度使用。高碘酸鹽可以以8-20mM，優(yōu)選地約10mM的濃度使用?？蛇x地，高碘酸鹽以小于20mM，諸如在10mM和19mM之間的濃度使用。已發(fā)現(xiàn)較低濃度的堿金屬高碘酸鹽，諸如偏高碘酸鈉減少多肽鏈的鏈斷裂程度，以及在氨基酸側(cè)鏈上的相關(guān)氧化，諸如在SEQIDNO:1的位置226中的甲硫氨酸殘基(Met226)的氧化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述步驟a)的反應(yīng)在環(huán)境溫度，且優(yōu)選地在0℃和22℃之間的溫度進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述步驟a)的反應(yīng)在0℃-8℃的溫度，諸如在0℃-4℃的溫度進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟a)的反應(yīng)在約8℃的溫度、在約4℃的溫度或在約0℃的溫度進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述步驟a)的反應(yīng)在3至7的pH進(jìn)行。該pH應(yīng)該被理解為在反應(yīng)開始時(shí)的pH。在特定的實(shí)施方案中，在步驟a)中使用的pH為3-6，諸如4-5。在特定的實(shí)施方案中，在步驟a)中使用的pH為約6、約5或約4。通過降低步驟a)的pH，可減少高碘酸鹽的濃度或步驟a)的反應(yīng)時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述高碘酸鹽為偏高碘酸鈉，并且以不超過20mM，諸如不超過15mM、諸如約10mM的(最終)濃度來使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述偏高碘酸鈉以8-20mM的濃度使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，偏高碘酸鈉以約10mM的濃度使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述高碘酸鹽為偏高碘酸鈉，并且以不超過20mM，諸如不超過15mM，諸如約10mM的(最終)濃度來使用，且所述步驟a)的反應(yīng)進(jìn)行不超過4h，諸如不超過3h，諸如不超過2h，諸如不超過1h，諸如約0.5h的時(shí)間段。如此，與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，20mM高碘酸鹽的濃度和不超過4h的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間可導(dǎo)致較少的鏈斷裂和氧化。降低高碘酸鹽濃度，另外同時(shí)保持相對(duì)短的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間積極地影響鏈斷裂和另外的氧化。小于20mM的濃度導(dǎo)致甚至更少的鏈斷裂和氧化，并且不超過15mM的濃度導(dǎo)致甚至更少的鏈斷裂和氧化，并且約10mM的濃度導(dǎo)致最少程度的鏈斷裂和氧化。如在實(shí)施例5中表明的，根據(jù)本文描述的方面的修飾的磺酰胺酶顯示出較少的鏈斷裂，特別在磺酰胺酶的c-末端部分，如例如由SEQIDNO:1的氨基酸436-484表示的。已發(fā)現(xiàn)該C-末端部分在如本文描述的制備的磺酰胺酶中是完整的。此外，在位置226的甲硫氨酸(Met226)的氧化不太頻繁。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述高碘酸鹽為偏高碘酸鈉，并在不超過20mM，諸如不超過15mM，諸如約10mM的(最終)濃度來使用，且所述步驟a)的反應(yīng)在0℃和22℃之間的溫度，諸如約8℃，諸如約0℃進(jìn)行不超過4h，諸如不超過3h，諸如不超過2h，諸如不超過1h，諸如約0.5h的時(shí)間段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述高碘酸鹽在不超過20mM，諸如不超過15mM，諸如約10mM的濃度來使用，且所述步驟a)的反應(yīng)在0℃和22℃之間的溫度，諸如0℃-8℃的溫度，諸如0℃-4℃的溫度，諸如約8℃，諸如約0℃進(jìn)行不超過4h，諸如不超過3h，諸如不超過2小時(shí)，諸如不超過1h，諸如約0.5h的時(shí)間段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述高碘酸鹽為偏高碘酸鈉，且所述步驟a)的反應(yīng)在0℃和22℃之間的溫度，諸如0℃-8℃的溫度，諸如0℃-4℃的溫度，諸如約8℃，諸如約0℃進(jìn)行不超過4h，諸如不超過3h，諸如不超過2h，諸如不超過1h，諸如約0.5h的時(shí)間段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述高碘酸鹽為偏高碘酸鈉，其以不超過20mM，諸如不超過15mM，諸如約10mM的濃度來使用，且所述步驟a)的反應(yīng)在0℃和22℃之間的溫度，諸如0℃-8℃的溫度，諸如0℃-4℃的溫度，諸如約8℃，諸如約0℃進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述高碘酸鹽為偏高碘酸鈉，偏高碘酸鈉以約10mM的濃度被使用，且所述步驟a)的反應(yīng)在約8℃的溫度進(jìn)行并持續(xù)不超過2h的時(shí)間段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述高碘酸鹽為偏高碘酸鈉，偏高碘酸鈉以約10mM的濃度被使用，且所述步驟a)的反應(yīng)在0℃-8℃的溫度進(jìn)行并持續(xù)不超過3h的時(shí)間段。在以下段落中，公開了步驟b)的特定實(shí)施方案。應(yīng)該理解的是，除非另有定義，特定的實(shí)施方案，特別是步驟a)和步驟b)的特定實(shí)施方案可被組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿金屬硼氫化物為硼氫化鈉。在一些例子中，已發(fā)現(xiàn)用于步驟b)的條件部分地取決于用于步驟a)的條件。盡管在步驟b)中使用的硼氫化物的量?jī)?yōu)選地保持盡可能的低，但在此類例子中硼氫化物與高碘酸鹽的摩爾比為0.5-4比1。如此，硼氫化物可在步驟b)中以在步驟a)中使用的高碘酸鹽的量的4倍的摩爾過量來使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述硼氫化物以不超過所述高碘酸鹽的(最終)濃度的4倍的(最終)摩爾濃度來使用。例如，硼氫化物可以不超過所述高碘酸鹽的濃度的3倍，諸如不超過所述高碘酸鹽的濃度的2.5倍，諸如不超過所述高碘酸鹽的濃度的2倍，諸如不超過所述高碘酸鹽的濃度的1.5倍的濃度，諸如在大致對(duì)應(yīng)于所述高碘酸鹽濃度的濃度來使用。然而，在特定的實(shí)施方案中，硼氫化物以對(duì)應(yīng)于高碘酸鹽濃度的一半，或高碘酸鹽濃度的0.5倍的濃度來使用。如此，當(dāng)高碘酸鹽以約20mM的濃度被使用時(shí)，硼氫化物可以以不超過80mM的濃度，或甚至以10mM和80mM之間的濃度，諸如以在10mM和50mM之間的濃度來使用。如果高碘酸鹽以在10mM和20mM之間的濃度被使用，硼氫化物可以以在25mM和80mM之間，諸如，例如50mM的濃度來使用。類似地，如果高碘酸鹽以約10mM的濃度被使用，硼氫化物可以以不超過40mM，諸如，例如不超過25mM的濃度來使用。此外，在此類實(shí)施方案中，硼氫化物可優(yōu)選地以在12mM和50mM之間的濃度來使用。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，硼氫化物的濃度影響在磺酰胺酶的活性位點(diǎn)處的有催化作用的氨基酸殘基的保留程度，并且因此，相對(duì)較低濃度的硼氫化物可提供具有保留的催化活性的修飾的磺酰胺酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述步驟b)的反應(yīng)進(jìn)行持續(xù)以下的時(shí)間段：不超過1.5h，諸如不超過1h，諸如不超過0.75h，諸如約0.5h。該反應(yīng)持續(xù)時(shí)間優(yōu)選地為約1h，或小于1h。在一些例子中，步驟b)的反應(yīng)具有約0.25h的持續(xù)時(shí)間。在另外的實(shí)施方案中，步驟b)的反應(yīng)可進(jìn)行從0.25h至2h的時(shí)間段。對(duì)以上的解釋是，已發(fā)現(xiàn)還原步驟的持續(xù)時(shí)間影響磺酰胺酶的催化活性。相對(duì)短的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間可因此提供包含F(xiàn)Gly50而不是Ser50的修飾的磺酰胺酶。此外，已發(fā)現(xiàn)較短的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間有利地影響酶的整體結(jié)構(gòu)完整性。特別地，導(dǎo)致高分子量形式的磺酰胺酶的蛋白聚集以及鏈斷裂的發(fā)生似乎至少部分地與反應(yīng)時(shí)間相關(guān)。因此，步驟b)的相對(duì)短的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間可減少聚集物以及鏈斷裂的發(fā)生。作為對(duì)該文本中別處的解釋，聚集形式的降低的存在可使蛋白更適合于在療法中使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述步驟b)的反應(yīng)在0℃和8℃之間的溫度進(jìn)行。已發(fā)現(xiàn)步驟b)的反應(yīng)溫度至少部分地影響反應(yīng)產(chǎn)物的催化活性。特別地，在磺酰胺酶的活性位點(diǎn)中的催化殘基的轉(zhuǎn)化與反應(yīng)溫度相關(guān)。因此，在低于8℃的溫度進(jìn)行步驟b)可能是有利的。溫度優(yōu)選地為約0℃。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿金屬硼氫化物為硼氫化鈉，其以所述高碘酸鹽的濃度的0.5-4倍的濃度，諸如不超過所述高碘酸鹽的濃度的2.5倍的濃度來使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿金屬硼氫化物為硼氫化鈉，其以所述高碘酸鹽的濃度的0.5-4倍的濃度，諸如不超過所述高碘酸鹽的濃度的2.5倍的濃度來使用，且所述步驟b)的反應(yīng)進(jìn)行不超過1h，諸如約0.5h的時(shí)間段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿金屬硼氫化物為硼氫化鈉，其以所述高碘酸鹽的濃度的0.5-4倍的濃度，諸如不超過所述高碘酸鹽的濃度的2.5倍的濃度來使用，且所述步驟b)的反應(yīng)在0℃和8℃之間的溫度進(jìn)行不超過1h，諸如約0.5h的時(shí)間段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿金屬硼氫化物以所述高碘酸鹽的濃度的0.5-4倍的濃度，諸如不超過所述高碘酸鹽的濃度的2.5倍的濃度來使用，且所述步驟b)的反應(yīng)在0℃和8℃之間的溫度進(jìn)行不超過1h，諸如約0.5h的時(shí)間段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿金屬硼氫化物為硼氫化鈉，且所述步驟b)的反應(yīng)在0℃和8℃之間的溫度進(jìn)行不超過1h，諸如約0.5h的時(shí)間段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿金屬硼氫化物為硼氫化鈉，其以所述高碘酸鹽的濃度的0.5-4倍的濃度，諸如不超過所述高碘酸鹽的濃度的2.5倍的濃度來使用，且所述步驟b)的反應(yīng)在0℃和8℃之間的溫度進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿金屬硼氫化物為硼氫化鈉，其以所述高碘酸鹽的濃度的0.5-4倍的濃度，諸如所述高碘酸鹽的濃度的2.5倍的濃度來使用，且所述步驟b)的反應(yīng)在約0℃的溫度進(jìn)行約0.5h的時(shí)間段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述高碘酸鹽為偏高碘酸鈉，且所述堿金屬硼氫化物為硼氫化鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)和步驟b)的每一個(gè)單獨(dú)地進(jìn)行不超過2h，諸如不超過1h，諸如約1h或約0.5h的時(shí)間段。任選地，所述硼氫化物以所述高碘酸鹽的濃度的0.5-4倍、優(yōu)選地所述高碘酸鹽的濃度的0.5-2.5倍的濃度來使用。在某些實(shí)施方案中，所述硼氫化物以高碘酸鹽的濃度的0.5倍的濃度，或所述高碘酸鹽的濃度的2.5倍的濃度來使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)進(jìn)行不超過3h的時(shí)間段，且步驟b)進(jìn)行不超過1h。任選地，所述硼氫化物以不超過所述高碘酸鹽的濃度的4倍、優(yōu)選地不超過所述高碘酸鹽的濃度的2.5倍的濃度來使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道控制化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間，諸如步驟a)和b)的每一個(gè)的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間的方法。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法方面還包括a2)猝滅由步驟a)產(chǎn)生的反應(yīng)。例如，所述猝滅具有小于30分鐘，諸如小于15分鐘的持續(xù)時(shí)間。在一些例子中，在步驟a)之后立即進(jìn)行所述猝滅。例如，猝滅可通過添加乙二醇來進(jìn)行。乙二醇可被添加至192mM的最終濃度。優(yōu)選地，猝滅之后立即進(jìn)行步驟b)。這可最小化使磺酰胺酶暴露于反應(yīng)性醛基的時(shí)間段。反應(yīng)性醛可促進(jìn)蛋白的失活和聚集。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括b2)猝滅由步驟b)產(chǎn)生的反應(yīng)。例如，該猝滅可通過添加包含酮基或醛基的分子，諸如環(huán)己酮或丙酮進(jìn)行，所述分子優(yōu)選地可溶于水?？蛇x地，所述猝滅可由通過添加乙酸或其他酸將反應(yīng)混合物的pH降低小于6來進(jìn)行。在一些例子中，所述猝滅通過將丙酮添加至約0.1M的終濃度來進(jìn)行。任選的猝滅步驟允許步驟b)的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間的精確控制。以該方式控制反應(yīng)持續(xù)時(shí)間還可提供該過程在FGly50含量方面的再現(xiàn)性。如此，如本文公開的方法提供了相比于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)修飾的磺酰胺酶具有許多優(yōu)勢(shì)的修飾的磺酰胺酶。如此，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)磺酰胺酶的化學(xué)修飾的條件，所述化學(xué)修飾對(duì)磺酰胺酶多肽鏈的結(jié)構(gòu)完整性具有最小的負(fù)面影響同時(shí)導(dǎo)致基本不存在天然聚糖結(jié)構(gòu)(表明在所有四個(gè)天然糖基化位點(diǎn)處的聚糖的幾乎完全的修飾)同時(shí)保留催化活性。出人意料地，在特定的實(shí)例中，發(fā)現(xiàn)用于步驟a)的條件促進(jìn)用于進(jìn)行步驟b)的條件。方法的示例性實(shí)施方案在圖1B、1C和1D中示出。在一個(gè)方面，提供了一種通過根據(jù)以上定義的方法方面的方法可獲得的修飾的磺酰胺酶。在一個(gè)方面，提供了一種通過如以上描述的用于在療法中使用的方法方面可獲得的修飾的磺酰胺酶。在一個(gè)方面，提供了一種通過如以上描述的用于在治療溶酶體貯積疾病，特別是黏多糖貯積癥IIIA(MPSIIIA)中使用的方法方面可獲得的修飾的磺酰胺酶。在一個(gè)方面，提供了修飾的磺酰胺酶在制備用于跨越血腦屏障以治療哺乳動(dòng)物的腦中的溶酶體貯積疾病，諸如黏多糖貯積癥IIIA(MPSIIIA)的藥物中的用途，所述修飾包括通過用堿金屬高碘酸鹽和堿金屬硼氫化物順序處理酶使聚糖部分被化學(xué)修飾，從而降低磺酰胺酶對(duì)聚糖識(shí)別受體，諸如甘露糖和甘露糖-6-磷酸細(xì)胞遞送系統(tǒng)的活性，同時(shí)保留所述磺酰胺酶的催化活性。在一個(gè)方面，提供了一種治療患有溶酶體貯積疾病，諸如黏多糖貯積癥IIIA(MPSIIIA)的哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括將治療有效量的修飾的磺酰胺酶施用至哺乳動(dòng)物，所述修飾的磺酰胺酶選自：a)如在本文的方面和實(shí)施方案中描述的修飾的磺酰胺酶；b)如在本文的方面和實(shí)施方案中描述的磺酰胺酶組合物；以及c)修飾的磺酰胺酶，其中修飾包括用堿金屬高碘酸鹽和堿金屬硼氫化物順序處理所述修飾的磺酰胺酶，從而磺酰胺酶的聚糖部分被化學(xué)修飾以減少其對(duì)聚糖識(shí)別受體，諸如甘露糖和甘露糖-6-磷酸細(xì)胞遞送系統(tǒng)的活性，同時(shí)保留催化酶活性。在其一個(gè)實(shí)施方案中，所述處理導(dǎo)致在施用10個(gè)劑量的修飾的磺酰胺酶之后在70天的時(shí)間段內(nèi)，約至少48％的溶酶體貯積從哺乳動(dòng)物的腦中清除。另外，所述處理導(dǎo)致在施用13個(gè)劑量的修飾的磺酰胺酶之后在25天的時(shí)間段內(nèi)，約至少30％的溶酶體貯積從哺乳動(dòng)物的腦中清除。本發(fā)明將通過以下非限制性實(shí)施例來進(jìn)一步說明。附圖簡(jiǎn)述圖1是概述實(shí)施例4中公開的由本發(fā)明人開發(fā)的化學(xué)修飾的方法和在WO2008/109677中公開的已知方法之間的差異的圖。圖2A示出了根據(jù)已知方法修飾的磺酰胺酶的SDS-PAGE凝膠。鑒定了由聚糖修飾程序產(chǎn)生的標(biāo)為1-4的四個(gè)蛋白帶。圖2B示出了根據(jù)已知方法修飾的磺酰胺酶以及根據(jù)如本文公開的新方法1修飾的磺酰胺酶兩者的SDS-PAGE凝膠。圖3A示出了根據(jù)已知方法修飾的磺酰胺酶的SEC層析譜。圖3B示出了根據(jù)如本文公開的新方法1修飾的磺酰胺酶的SEC層析譜。由箭頭標(biāo)記的是多聚體形式的修飾的磺酰胺酶的量。圖4A示出了根據(jù)已知方法修飾的磺酰胺酶的通過動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量的散射強(qiáng)度。圖4B示出了根據(jù)如本文公開的新方法1修飾的磺酰胺酶的通過動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量的散射強(qiáng)度。圖5是可視化未修飾的重組磺酰胺酶、根據(jù)已知方法修飾的磺酰胺酶及根據(jù)如本文描述的新方法1和2修飾的磺酰胺酶在MEF-1細(xì)胞中的受體介導(dǎo)的胞吞的圖。圖6A示出了來自MPSIIIA缺陷小鼠的體內(nèi)治療的結(jié)果。圖顯示了在以30mg/kg每隔一天i.v.給予根據(jù)新方法1修飾的磺酰胺酶(13個(gè)劑量)之后，小鼠的腦中硫酸乙酰肝素貯積的清除。圖6B示出了來自MPSIIIA缺陷小鼠的體內(nèi)治療的結(jié)果。圖顯示了在以30mg/kg每隔一天i.v.給予根據(jù)新方法1修飾的磺酰胺酶(13個(gè)劑量)之后，小鼠的肝臟中硫酸乙酰肝素貯積的清除。圖6C示出了來自MPSIIIA缺陷小鼠的體內(nèi)治療的結(jié)果。圖顯示了分別以30mg/kg和10mg/kg每周一次i.v.給予根據(jù)新方法1修飾的磺酰胺酶(10個(gè)劑量)之后，小鼠的腦中硫酸乙酰肝素貯積的清除。圖7是通常存在于蛋白中的三種原型N-聚糖結(jié)構(gòu)的示意圖。左側(cè)的聚糖代表寡聚甘露糖類型，中間的代表復(fù)雜型，且右側(cè)的聚糖代表雜合型。在圖中，描述了以下化合物：黑色實(shí)心菱形對(duì)應(yīng)于N-乙酰神經(jīng)氨酸；黑色實(shí)心圓對(duì)應(yīng)于甘露糖；正方形對(duì)應(yīng)于N-乙酰葡糖胺；黑色實(shí)心三角形對(duì)應(yīng)于巖藻糖；圓圈對(duì)應(yīng)于半乳糖。用星號(hào)標(biāo)記的糖部分可通過本文公開的高碘酸鹽/硼氫化物處理來修飾。圖8A是說明在化學(xué)修飾之后甘露糖上的預(yù)測(cè)的鍵斷裂的示意圖。圖8B是說明Man-6聚糖的模型的示意圖。指示了在用高碘酸鹽氧化之后易于鍵斷裂的糖部分?；疑珗A圈對(duì)應(yīng)于甘露糖，黑色正方形對(duì)應(yīng)于N-乙酰葡糖胺，T13對(duì)應(yīng)于包含N-糖基化位點(diǎn)N(131)的胰蛋白酶肽NITR。圖9展示了在根據(jù)先前的已知方法化學(xué)修飾之前(A)和之后(B-D)的對(duì)應(yīng)于具有附連至N(131)的Man-6聚糖的胰蛋白酶肽T13(T13+Man-6聚糖)的雙電荷離子的質(zhì)譜(S.＝單鍵斷裂；D.＝雙鍵斷裂；例如D.x3＝3個(gè)雙鍵斷裂)。圖10A是可視化在根據(jù)先前的已知方法(黑色柱)、新方法1(黑點(diǎn))、新方法3(白色)和新方法4(交叉方格)化學(xué)修飾之后胰蛋白酶肽T13+Man-6聚糖的鍵斷裂的程度的圖。圖10B是可視化在根據(jù)先前的已知方法(黑色柱)、新方法1(黑點(diǎn))、新方法3(白色)和新方法4(交叉方格)化學(xué)修飾之后胰蛋白酶肽T13+Man-6聚糖中的單鍵斷裂的相對(duì)豐度的圖。圖11是列出人磺酰胺酶的氨基酸序列的表，其中SEQIDNO:1對(duì)應(yīng)于人磺酰胺酶的氨基酸序列，SEQIDNO:2對(duì)應(yīng)于GS-磺酰胺酶，且SEQIDNO:3對(duì)應(yīng)于磺酰胺酶-GS。實(shí)施例以下實(shí)施例公開了根據(jù)本公開內(nèi)容的修飾的磺酰胺酶多肽的開發(fā)。實(shí)施例1：磺酰胺酶的培養(yǎng)、純化和表征材料和方法用于磺酰胺酶的表達(dá)載體的構(gòu)建：編碼人磺酰胺酶的合成的基因由Geneart(LifeTechnologies)合成，智人(H.sapiens)或灰倉鼠(C.griseus)(CHO細(xì)胞)和原始人類序列兩者均為密碼子優(yōu)化形式。在不同的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，諸如pcDNA3.1(+)(Invitrogen)或pQMCF1(Icosagen)中克隆合成的基因?；酋０访傅漠a(chǎn)生：針對(duì)磺酰胺酶產(chǎn)生評(píng)價(jià)了兩種瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，使用pcDNA3.1(+)載體在HEK293細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)和使用pQMCF1載體的QuattromedCellFactory(QMCF)附加型表達(dá)系統(tǒng)(IcosagenAS)。在兩種系統(tǒng)中，細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長，并且通常在轉(zhuǎn)染后6-8天收獲分泌的蛋白。另外，針對(duì)磺酰胺酶的產(chǎn)生評(píng)價(jià)了使用商購可得的CHO表達(dá)系統(tǒng)建立的穩(wěn)定的細(xì)胞系。通過在用20mMTris、1mMEDTA，pH8.0平衡的Q瓊脂糖柱(GEHealthcare)上陰離子交換層析并通過NaCl梯度洗脫來從培養(yǎng)基捕獲磺酰胺酶。將捕獲的磺酰胺酶通過4-巰基-乙基-吡啶(MEP)層析進(jìn)一步純化；將包含磺酰胺酶的級(jí)分裝載在MEPHyperCel層析柱上，并且隨后通過在50mMNaAc、0.1MNaCl、1mMEDTA、1mMDTT，pH4.6中等度洗脫來洗脫。最后的精煉(polishing)通過在在25mMNaAc、2mMDTT，pH4.5中平衡的SP瓊脂糖FF(GEHealthcare)柱上陽離子交換層析(CIEX)來實(shí)現(xiàn)。使用NaCl梯度用于洗脫。來自不同表達(dá)系統(tǒng)的磺酰胺酶批次的純度和身份通過SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS分析，數(shù)據(jù)未示出。糖基化分析：對(duì)所產(chǎn)生的不同磺酰胺酶批次確定糖基化模式。在糖肽分析之前，磺酰胺酶(ca10μg)被還原、烷基化并用胰蛋白酶消化。蛋白的還原通過在70℃于在50mMNH4HCO3中的5μl10mMDTT中孵育持續(xù)1h來完成。隨后的用在50mMNH4HCO3中的5μl55mM碘乙酰胺烷基化在室溫(RT)且在黑暗中進(jìn)行45min。最后，胰蛋白酶消化通過添加30μl50mMNH4HCO3、5mMCaCl2，pH8，和在50mM乙酸中的0.2μg/μl胰蛋白酶來進(jìn)行(蛋白酶：蛋白的比率為1:20(w/w))。允許消化在37℃發(fā)生過夜。胰蛋白酶消化的磺酰胺酶的五種肽片段包含潛在的N-糖基化位點(diǎn)。包含潛在的糖基化位點(diǎn)N(x)的這些肽片段為以下，其中x指如在SEQIDNO:1中定義的磺酰胺酶氨基酸序列中的天冬酰胺的位置：包含N(21)的片段(SEQIDNO:1的殘基4–35，3269.63Da)包含N(122)的片段(SEQIDNO:1的殘基105-130，2910.38Da)包含N(131)的片段(SEQIDNO:1的殘基131-134，502.29Da)包含N(244)的片段(SEQIDNO:1的殘基239-262，2504.25Da)包含N(393)的片段(SEQIDNO:1的殘基374-394)，2542.22Da。每個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺以粗體表示，并給出了每個(gè)肽片段的分子質(zhì)量。五種胰蛋白酶肽片段的可能的糖基化變體通過糖肽分析來研究。這通過液相層析然后在與Agilent6510Quadrupole飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Q-TOF-MS)偶聯(lián)的Agilent1200HPLC系統(tǒng)上的質(zhì)譜法(LC-MS)來進(jìn)行。兩種系統(tǒng)均由MassHunter工作站控制。LC分離通過使用WatersXSELECTCSH130C18柱(150x2.1mm)進(jìn)行，將柱溫設(shè)置為40℃。流動(dòng)相A由5％乙腈、0.1％丙酸和0.02％TFA組成，且流動(dòng)相B由95％乙腈、0.1％丙酸和0.02％TFA組成。以0.2mL/min的流速使用以下梯度：從0％至10％B持續(xù)10分鐘，然后從10％至70％B持續(xù)另外25min。注射體積為10μl。Q-TOF以正-電噴射離子模式操作。在數(shù)據(jù)采集過程期間，將碰撞電壓、撇油器電壓(skimmervoltage)和八極RF分別設(shè)置為90V、65V和650V。質(zhì)量范圍在300m/z和2800m/z之間。結(jié)果在HEK293細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo)致低水平的分泌的磺酰胺酶(少于0.3mg/L培養(yǎng)基，SEQIDNO:3)。QMCF穩(wěn)定的附加型表達(dá)系統(tǒng)(IcosagenAS)導(dǎo)致磺酰胺酶(SEQIDNO:2)在CHO細(xì)胞中以大于10mg/L的滴度產(chǎn)生。從CHO表達(dá)系統(tǒng)建立的穩(wěn)定的細(xì)胞系導(dǎo)致超過40mg/L的磺酰胺酶(SEQIDNO:1)滴度?；酋０访副患兓撩黠@的同質(zhì)性，具有在61-63kDa范圍的分子質(zhì)量?；?5kDa的理論肽鏈質(zhì)量，這指示具有總分子質(zhì)量6-8kDa的聚糖的存在?；酋０访概蔚募兌群蜕矸萃ㄟ^SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS分析(結(jié)果未示出)。對(duì)于胰蛋白酶消化的肽的糖基化分析通過LC-MS進(jìn)行。對(duì)每種糖肽進(jìn)行針對(duì)30種不同類型的糖基化的手動(dòng)搜索。相對(duì)定量通過測(cè)量來自重建的離子層析譜的峰面積來進(jìn)行(未電離效率校正)。遍及所有的磺酰胺酶批次，五個(gè)推定的N-糖基化位點(diǎn)中的四個(gè)(N(21)、N(131)、N(244)和N(393))一致地被糖基化。N(21)和N(393)主要被復(fù)雜型聚糖占據(jù)，具有低度的全唾液酸化。N(131)完全被寡聚甘露糖類型的聚糖占據(jù)。對(duì)于所有批次，聚糖磷酸化的程度大致為50％。N(131)位點(diǎn)耐受通過堿性磷酸酶的去磷酸化。第四個(gè)位點(diǎn)N(244)在CHO細(xì)胞產(chǎn)生的磺酰胺酶(SEQIDNO:2)和HEK293細(xì)胞產(chǎn)生的磺酰胺酶(SEQIDNO:3)之間組成不同：在CHO批次中為寡聚甘露糖和在HEK293批次中為寡聚甘露糖/復(fù)雜型混合物。發(fā)現(xiàn)包含N(122)的胰蛋白酶肽沒有任何附連的聚糖。實(shí)施例2：根據(jù)先前已知的方法化學(xué)修飾磺酰胺酶材料和方法根據(jù)已知方法的化學(xué)修飾(如在WO2008/109677中公開的)：為了修飾磺酰胺酶的聚糖部分，如在實(shí)施例1中描述的在QuattromedCellFactory(QMCF)附加型表達(dá)系統(tǒng)(IcosagenAS)中產(chǎn)生的磺酰胺酶(SEQIDNO:2)最初與20mM偏高碘酸鈉在0℃下在20mM磷酸鈉、100mMNaCl(pH6.0)中孵育6.5h。聚糖氧化通過添加乙二醇至192mM的終濃度來猝滅。允許猝滅在0℃進(jìn)行15min，然后在4℃對(duì)20mM磷酸鈉、100mMNaCl(pH6.0)進(jìn)行透析過夜。在透析之后，通過向反應(yīng)混合物添加硼氫化鈉至100mM的終濃度進(jìn)行還原。允許還原反應(yīng)進(jìn)行過夜。最后，將酶制備物對(duì)20mM磷酸鈉、100mMNaCl(pH7.5)透析。所有孵育在黑暗中進(jìn)行。結(jié)果修飾的磺酰胺酶以一式三份根據(jù)圖1A中所示出的步驟的順序來產(chǎn)生。實(shí)施例3：根據(jù)已知方法修飾的磺酰胺酶的分析材料和方法使根據(jù)對(duì)應(yīng)于已知方法的實(shí)施例2修飾的磺酰胺酶經(jīng)歷以下分析。SDS-PAGE分析：將5μg修飾的磺酰胺酶裝載進(jìn)在NuPAGE4％-12％Bis-Tris凝膠上的每個(gè)孔內(nèi)。使用Seeblue2plus標(biāo)志物，并且將凝膠用InstantBlue(C.B.SScientific)著色。通過尺寸排阻層析(SEC)的分析：修飾的酶通過在系統(tǒng)(GEHealthcare)上進(jìn)行的分析型尺寸排阻層析分析。使用Superdex200PC3.2/30柱與40μL/min制劑緩沖液的流速。樣品體積為10μL并包含10μg酶。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)分析：修飾的磺酰胺酶通過在室溫(RT)以12000rpm離心3分鐘脫氣。DLS實(shí)驗(yàn)在DynaProTitan儀器(WyattTechnologyCorp)上利用25％激光功率以每個(gè)一式3份的75μL進(jìn)行。凝膠內(nèi)消化和MALDI-TOFMS分析：SDS-PAGE分析顯示出一些額外的條帶，將該額外的條帶切離、脫色并通過用胰蛋白酶凝膠內(nèi)消化進(jìn)行處理。程序?yàn)橐韵拢篿.考馬斯脫色：將切離的凝膠條帶放置于eppendorf管中。將管在30℃于在50％乙腈中的100mMNH3HCO3中攪拌兩次，持續(xù)1h。將上清液棄去。ii.還原和烷基化：將凝膠塊在乙腈中脫水，在SpeedVac中干燥，并且隨后用在100mMNH3HCO3中的10mMDTT覆蓋。允許還原在57℃進(jìn)行1h。將上清液棄去，并用在100mMNH3HCO3中的55mM碘乙酰胺替換。在RT，在黑暗中并在輕微攪拌下進(jìn)行烷基化持續(xù)45min。再次將上清液棄去。在30℃，將凝膠用在50％乙腈中的100mMNH3HCO3洗滌20-30min，此后將上清液棄去。將凝膠塊在SpeedVac中完全干燥。iii.用胰蛋白酶凝膠內(nèi)消化：將2-5μL50mMNH3HCO3添加至干燥的凝膠塊，此后添加5μL胰蛋白酶溶液(在1％乙酸中的0.1μg/μL)。添加更多的50mMNH3HCO3，以導(dǎo)致凝膠的膨脹。在37℃進(jìn)行消化過夜(伴隨攪拌)。將上清液轉(zhuǎn)移至新管，并在RT用60％乙腈、0.1％TFA提取(3x20min)。將所得的上清液在SpeedVac中蒸發(fā)至接近干燥。將濃縮的溶液與α-氰基-4-羥基肉桂酸溶液(10mg/mL)1:1混合，并且將0.6μL應(yīng)用于MALDI板上。使用Sciex5800基質(zhì)輔助的激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/TOFMS)來確定胰蛋白酶肽片段的分子質(zhì)量。用3550和400次擊發(fā)的激光能量以正離子反射模式進(jìn)行分析?；钚晕稽c(diǎn)的保留：化學(xué)修飾對(duì)磺酰胺酶的活性位點(diǎn)的任何影響通過使用LC-MS和LC-MS/MS分析來研究。根據(jù)在實(shí)施例1中糖基化分析部分下描述的LC-MS方法來制備樣品。所得的包含半胱氨酸50變體(半胱氨酸50(烷基化的)、氧化的半胱氨酸50、FGly50和Ser50)的胰蛋白酶肽均使用來自重建的離子層析譜的峰面積計(jì)算來半定量。肽的鑒定通過MSMS測(cè)序進(jìn)行。MSMS參數(shù)如下：將碰撞能量設(shè)置為10V、15V和20V，掃描范圍100-1800m/z且掃描速度1次掃描/秒。結(jié)果SDS-PAGE分析：如通過SDS-PAGE分析明顯的，由于化學(xué)修飾，結(jié)果形成了尺寸與全長磺酰胺酶的尺寸不同的幾種肽(圖2A)。通過SEC和DLS的分析：發(fā)現(xiàn)化學(xué)修飾程序促進(jìn)磺酰胺酶的聚集，如在圖3A的層析譜中的前峰表明的。發(fā)現(xiàn)層析譜中的前峰的峰高為主峰的高度的約3％。此外，DLS分析顯示，同一材料包含總蛋白含量的15％-20％的高分子量形式的蛋白(即大于1010kDa)(圖4A)。SDS-PAGE條帶的分析：通過MALDI-TOFMS分析，在SDS-PAGE上觀察到的四個(gè)凝膠條帶#1-4(圖2A)可被鑒定為在化學(xué)修飾期間通過鏈斷裂生成的磺酰胺酶的片段。由于化學(xué)修飾而形成的圖2A的凝膠條帶#1和#2被確定為具有6kDa和30kDa的分子質(zhì)量的兩個(gè)C-末端截短，凝膠條帶#3被確定為一個(gè)41kDa的N-末端截短，且凝膠條帶#4被確定為一個(gè)二聚體形式的磺酰胺酶(111kDa條帶)(MALDI光譜未示出)。如此，發(fā)現(xiàn)根據(jù)已知方法的磺酰胺酶的化學(xué)修飾不僅修飾聚糖，而且還在磺酰胺酶多肽鏈中的特定位置處產(chǎn)生鏈斷裂。還發(fā)現(xiàn)根據(jù)已知方法的化學(xué)修飾在磺酰胺酶上的幾個(gè)甲硫氨酸殘基上，特別地甲硫氨酸184和甲硫氨酸443上引入氧化，甲硫氨酸184和甲硫氨酸443幾乎完全被氧化。甲硫氨酸226(在胰蛋白酶肽T23中發(fā)現(xiàn)的，胰蛋白酶肽T23對(duì)應(yīng)于氨基酸殘基226-238)被氧化至低得多的程度，但該氧化似乎產(chǎn)生比如此的磺酰胺酶更不穩(wěn)定的蛋白，生成41kDa的N-末端截短(圖2A的凝膠條帶#3)。如此，甲硫氨酸226的氧化和鏈斷裂似乎是相關(guān)的，如在MS分析中觀察到的。另外，二聚體條帶(圖2A的#4)也主要包含氧化的甲硫氨酸226(圖2A)。因此，用于聚糖修飾的已知程序催化對(duì)酶的結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要的氨基酸殘基的氧化?；钚晕稽c(diǎn)的保留：此外，發(fā)現(xiàn)，通過使用LC-MSMS還原步驟(圖1A)，在SEQIDNO:1的活性位點(diǎn)位置50處的FGly被還原為Ser。在該位置中的Ser與高效催化不相容(Recksiek等，JBiolChem273(11):6096-103(1998))。基于質(zhì)譜中對(duì)應(yīng)于包含F(xiàn)Gly50和Ser50的兩種胰蛋白酶肽片段的雙電荷離子的峰面積測(cè)量值，評(píng)價(jià)由FGly產(chǎn)生的Ser的相對(duì)量。峰面積基于未電離效率校正的MS響應(yīng)。下文表1示出在根據(jù)已知方法修飾之后FGly至Ser的轉(zhuǎn)化為約56％(還參見實(shí)施例5、表2)。表1.在活性位點(diǎn)處FGly至Ser的轉(zhuǎn)化磺酰胺酶的化學(xué)修飾Ser形成(％)FGly/Ser比率無0已知方法56.0±0.3(n＝3)0.8如此，除了以上提及的修飾以外，已知的化學(xué)修飾程序引起對(duì)酶的催化活性至關(guān)重要的氨基酸殘基的還原。實(shí)施例4：用于磺酰胺酶的化學(xué)修飾的新方法材料和方法新方法1：使根據(jù)實(shí)施例1在QuattromedCellFactory(QMCF)附加型表達(dá)系統(tǒng)(IcosagenAS)中產(chǎn)生的磺酰胺酶通過與20mM偏高碘酸鈉在具有6.0的pH的磷酸鹽緩沖液中在黑暗中在0℃孵育120min被氧化。通過添加乙二醇至192mM的終濃度來猝滅聚糖氧化。允許猝滅在6℃進(jìn)行15min，然后將硼氫化鈉添加至反應(yīng)混合物至50mM的終濃度。在黑暗中在0℃孵育120min之后，將所得的磺酰胺酶制備物對(duì)20mM磷酸鈉、100mMNaCl、pH6.0超濾。用于化學(xué)修飾的新方法1示于圖1B中。新方法2：如新方法1進(jìn)行，不同之處在于在還原步驟中硼氫化鈉的濃度為10mM。用于化學(xué)修飾的新方法2示于圖1C中。新方法3：使根據(jù)實(shí)施例1在穩(wěn)定的細(xì)胞系中產(chǎn)生的磺酰胺酶通過與10mM偏高碘酸鈉在具有4.5至5.7之間的初始pH的乙酸鹽緩沖液中在黑暗中在0℃孵育180min來氧化。通過添加乙二醇至192mM的終濃度來猝滅聚糖氧化。允許猝滅在6℃進(jìn)行15min，然后將硼氫化鈉添加至反應(yīng)混合物至25mM的終濃度。在黑暗中在0℃孵育60min之后，將所得的磺酰胺酶制備物對(duì)10mM磷酸鈉、100mMNaCl、pH7.4來超濾。用于化學(xué)修飾的新方法3示于圖1D中。新方法4：使根據(jù)實(shí)施例1在穩(wěn)定的細(xì)胞系中產(chǎn)生的磺酰胺酶通過與10mM偏高碘酸鈉在具有4.5的初始pH的乙酸鹽緩沖液中在黑暗中在8℃孵育60min被氧化。通過添加乙二醇至192mM的終濃度來猝滅聚糖氧化。允許猝滅在6℃進(jìn)行15min，然后將硼氫化鈉添加至反應(yīng)混合物至25mM的終濃度。在黑暗中在0℃孵育60min之后，將所得的磺酰胺酶制備物對(duì)10mM磷酸鈉、100mMNaCl、pH7.4來超濾。第二猝滅步驟的研究：第二猝滅步驟的影響通過在新方法1中的硼氫化鈉孵育步驟之后添加0.1M丙酮來研究。材料根據(jù)新方法1并行產(chǎn)生，直到并包括硼氫化鈉添加和孵育，之后，在一個(gè)樣品中的反應(yīng)通過添加丙酮猝滅。然后，兩種樣品根據(jù)在新方法1中的超濾步驟來處理。新方法5：使根據(jù)實(shí)施例1在穩(wěn)定的細(xì)胞系中產(chǎn)生的磺酰胺酶通過與10mM偏高碘酸鈉在具有4.5的初始pH的乙酸鹽緩沖液中在黑暗中在8℃孵育60min被氧化。通過添加乙二醇至192mM的終濃度來猝滅聚糖氧化。允許猝滅在6℃進(jìn)行15min，然后將硼氫化鈉添加至反應(yīng)混合物至25mM的終濃度。在黑暗中在0℃孵育45min并用0.1M丙酮猝滅該反應(yīng)之后，將所得的磺酰胺酶制備物對(duì)10mM磷酸鈉、100mMNaCl、pH7.4來超濾。結(jié)果如已在本文別處說明的，偏高碘酸鈉是將糖類的順式二醇基團(tuán)轉(zhuǎn)化為醛基的氧化劑，而硼氫化物是將醛還原為更惰性的醇的還原劑。如此，糖類結(jié)構(gòu)被不可逆地破壞。為了提供用于聚糖的化學(xué)修飾的改進(jìn)的方法，特別是提供具有改進(jìn)性能的修飾的磺酰胺酶的程序，評(píng)價(jià)了不同的反應(yīng)條件?？傻贸鼋Y(jié)論，由偏高碘酸鈉氧化和由硼氫化鈉還原兩者均引入多肽修飾和聚集；負(fù)面影響催化活性和免疫原性傾向的性能。發(fā)現(xiàn)了用于改進(jìn)的化學(xué)修飾程序的條件。出人意料地，在這些條件促進(jìn)了還原步驟可在乙二醇猝滅步驟之后立即進(jìn)行，省略緩沖液更換和磺酰胺酶對(duì)反應(yīng)性醛中間體的長時(shí)間暴露。新的化學(xué)修飾程序在圖1B、圖1C和圖1D中示出。實(shí)施例5：根據(jù)新方法修飾的磺酰胺酶的分析材料和方法使根據(jù)實(shí)施例4的新方法修飾的磺酰胺酶經(jīng)歷以下分析。SDS-PAGE分析：將5μg的根據(jù)已知方法(實(shí)施例2)以及根據(jù)新方法1和2(實(shí)施例4)修飾的磺酰胺酶根據(jù)實(shí)施例3中的描述裝載進(jìn)分離的單獨(dú)的孔。類似地，將5μg的根據(jù)新方法1(實(shí)施例4)以及根據(jù)新方法3、4和5修飾的磺酰胺酶根據(jù)實(shí)施例3中的描述裝載進(jìn)分離的單獨(dú)的孔。通過尺寸排阻層析(SEC)的分析：根據(jù)新方法1-4修飾的磺酰胺酶根據(jù)實(shí)施例3通過分析型尺寸排阻層析分析。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)分析：根據(jù)新方法1修飾的磺酰胺酶根據(jù)實(shí)施例3通過DLS分析?；钚晕稽c(diǎn)的保留：化學(xué)修飾對(duì)根據(jù)新方法1-5產(chǎn)生的磺酰胺酶的活性位點(diǎn)的任何影響，以及研究的第二猝滅步驟根據(jù)實(shí)施例3中的描述來研究。結(jié)果SDS-PAGE分析：由于新的化學(xué)修飾方法1，形成了尺寸與全長磺酰胺酶的尺寸不同的幾種肽(圖2B)。然而，與根據(jù)已知方法修飾的磺酰胺酶相比，新方法1產(chǎn)生了較少的片段化。在通過新方法1、3和4產(chǎn)生的磺酰胺酶樣品中被鑒定為C-末端氨基酸434-482的片段#1(圖2A)未被檢到，且其他片段的量被大大降低。該趨勢(shì)在通過新方法2產(chǎn)生的材料中甚至更加明顯。然而，對(duì)于新方法2，在凝膠上存在更高的分子量形式，指示還原劑的量不足以還原在氧化步驟中產(chǎn)生的所有的反應(yīng)性醛(數(shù)據(jù)未示出)。新方法3、4和5產(chǎn)生類似于通過新方法1產(chǎn)生的修飾的磺酰胺酶材料的修飾的磺酰胺酶材料(數(shù)據(jù)未示出)。如此，與在根據(jù)實(shí)施例2制備的磺酰胺酶中的鏈斷裂發(fā)生相比，在通過新方法制備的磺酰胺酶多肽中的鏈斷裂是有限的。通過尺寸排阻層析(SEC)的分析：發(fā)現(xiàn)，與通過已知方法修飾的磺酰胺酶相比，根據(jù)新方法1修飾的磺酰胺酶包含更少的聚集物。這在圖3的層析譜中被證實(shí)，其中高分子量形式作為前峰存在于層析譜中。相對(duì)于主峰高度，圖3B中的前峰的峰高為0.5％，如此，代表與圖3A中的峰高(3％)相比減少。這也是通過新方法3、4和5修飾的磺酰胺酶的情況(數(shù)據(jù)未示出)。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)分析：DLS分析(圖4B)證實(shí)了來自SEC分析的結(jié)果：根據(jù)新方法產(chǎn)生的磺酰胺酶包含5％的高分子量形式的蛋白(大于1010kDa)。如此，可得出結(jié)論，與已知方法(參見實(shí)施例3)相比，通過新方法，磺酰胺酶的聚集形式的形成被限制。活性位點(diǎn)的保留：在磺酰胺酶的活性位點(diǎn)的位置50處FGly至Ser的還原通過LC-MS/MS確定，并且包含F(xiàn)Gly和Ser的胰蛋白酶肽被明確地鑒定。肽片段的相對(duì)量用LC-MS通過測(cè)量來自雙電荷離子的重建的離子層析譜的峰面積來分析(未電離效率校正)。制備并分析了由實(shí)施例4中使用的化學(xué)修飾方法產(chǎn)生的樣品。(表2)。表2.在活性位點(diǎn)處FGly至Ser的轉(zhuǎn)化磺酰胺酶的化學(xué)修飾Ser形成(％)FGly/Ser比率無0新方法145.4±0.9(n＝3)1.2新方法211.5±1.3(n＝3)7.7新方法344.1±2.0(n＝2)1.2新方法436.1(n＝1)1.6新方法541.7±1.1(n＝2)1.4通過新方法，活性位點(diǎn)FGly的損失被相當(dāng)?shù)叵拗?。修飾磺酰胺酶上的聚糖的新方法使Ser形成的量從使用已知方法的56％(參見表1，實(shí)施例3)顯著地降低到45％、44％、36％和42％(分別為新方法1、3、4和5，表2)。新方法2的Ser形成為約11％，如此指示FGly至Ser的轉(zhuǎn)化高度依賴于硼氫化鈉的濃度。反應(yīng)的第二猝滅步驟提供與不猝滅反應(yīng)產(chǎn)生的磺酰胺酶可比的修飾的磺酰胺酶(與用丙酮猝滅第二反應(yīng)之后43％的Ser形成相比，根據(jù)新方法1產(chǎn)生的修飾的磺酰胺酶具有45％的Ser形成)。這被也包括猝滅步驟的新方法5進(jìn)一步證實(shí)。實(shí)施例6：體外受體介導(dǎo)的胞吞材料和方法磺酰胺酶如在實(shí)施例1、2和4中描述的來制備，在QuattromedCellFactory(QMCF)附加型表達(dá)系統(tǒng)(IcosagenAS)中產(chǎn)生，并根據(jù)已知方法和新方法1和2來修飾。胞吞在表達(dá)M6P受體的MEF-1成纖維細(xì)胞中來評(píng)價(jià)。將MEF-1細(xì)胞在補(bǔ)充有75nM磺酰胺酶的DMEM培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)。將細(xì)胞在DMEM中洗滌兩次并在0.9％的NaCl中洗滌一次，然后用1％TritonX100裂解。確定裂解物磺酰胺酶活性和總蛋白含量，并計(jì)算裂解物比活性。活性通過使用在14.5mM二乙基巴比妥酸、14.5mM乙酸鈉、0.34％(w/v)NaCl和0.1％BSA中的0.25mM4--甲基傘形基-α-D-N-磺基氨基葡萄糖苷作為底物在460nm處的熒光強(qiáng)度來監(jiān)測(cè)?？偟鞍诐舛仁褂靡訠SA作為標(biāo)準(zhǔn)的BCA試劑盒(Pierce)來確定。數(shù)據(jù)被表示為平均值+SD(n＝4)。結(jié)果對(duì)于在胞吞測(cè)定中評(píng)價(jià)的所有制備物，均可在細(xì)胞勻漿中檢測(cè)到磺酰胺酶活性。通過已知方法以及新方法1和2制備的修飾的磺酰胺酶顯示低于用未修飾的重組磺酰胺酶獲得的比活性的10％的在細(xì)胞勻漿中的比活性(圖5)。對(duì)于所有制備物，首先被裝載磺酰胺酶然后在磺酰胺酶的不存在下生長2天的細(xì)胞中保留的活性是可比的，顯示出化學(xué)修飾不負(fù)面地影響溶酶體穩(wěn)定性。因此，可得出結(jié)論，化學(xué)修飾使磺酰胺酶不太易于細(xì)胞攝取，這是去除針對(duì)聚糖識(shí)別受體如M6PR的表位的結(jié)果。在宏觀水平，分子相互作用的這類損失轉(zhuǎn)化為當(dāng)靜脈內(nèi)施用時(shí)從血漿清除的降低。蛋白的清除的降低可允許對(duì)患者不太頻繁的給藥。實(shí)施例7：通過新方法1制備的修飾的磺酰胺酶的體內(nèi)血漿清除材料和方法在小鼠(C57BL/6J)中研究了，如實(shí)施例1中描述的在QuattromedCellFactory(QMCF)附加型表達(dá)系統(tǒng)(IcosagenAS)中產(chǎn)生的未修飾的重組磺酰胺酶以及如實(shí)施例1中描述的在QuattromedCellFactory(QMCF)附加型表達(dá)系統(tǒng)(IcosagenAS)中產(chǎn)生并根據(jù)實(shí)施例4的新方法1修飾的修飾的重組磺酰胺酶的血漿清除(CL)。在尾靜脈中對(duì)小鼠給予靜脈內(nèi)單劑量施用10mg/kg磺酰胺酶和10mg/kg修飾的磺酰胺酶?；酋０访负托揎椀幕酋０访敢?mg/mL配制并以5mL/kg施用。在不同的時(shí)間點(diǎn)直至給藥后24h時(shí)，從隱靜脈或腔靜脈采取血液樣品(每時(shí)間點(diǎn)3只小鼠)。血液被收集在儲(chǔ)存在冰上的EDTA管內(nèi)，并通過離心制備血漿?；酋０访负托揎椀幕酋０访傅难獫{水平通過ECL來分析。使用WinNonlin軟件6.3版本來計(jì)算血漿清除(非區(qū)室分析，Phoenix,PharsightCorp.,USA)。通過電化學(xué)發(fā)光(ECL)免疫測(cè)定定量磺酰胺酶和修飾的磺酰胺酶：血漿PK樣品中的磺酰胺酶和修飾的磺酰胺酶使用MesoScaleDiscovery(MSD)平臺(tái)通過ECL免疫測(cè)定來確定。鏈霉親和素包被的MSD板用在PBS中的5％封閉液-A封閉。將板洗滌，并將標(biāo)準(zhǔn)和PK樣品的不同稀釋液分配在板中。添加生物素化的抗磺酰胺酶小鼠單克隆抗體和Sulfo-Ru-標(biāo)記的兔抗磺酰胺酶抗體的混合物，并將板在RT下孵育。磺酰胺酶和標(biāo)記的抗體的復(fù)合物經(jīng)由生物素化的mAb與鏈霉親和素包被的板結(jié)合。在洗滌之后，結(jié)合的復(fù)合物的量通過將讀取緩沖液添加至孔并將板在MSDSI2400儀器中讀取來確定。所記錄的ECL計(jì)數(shù)與樣品中的磺酰胺酶的量成比例并相對(duì)于相關(guān)磺酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果與未修飾的磺酰胺酶相比，修飾的磺酰胺酶在小鼠中的血漿清除大致低10倍，參見下文表3。這可能至少部分地由于，在磺酰胺酶的化學(xué)修飾后，在外周組織中受體介導(dǎo)的攝取的抑制(如在實(shí)施例6的細(xì)胞攝取研究中證明的)。對(duì)于根據(jù)實(shí)施例1在穩(wěn)定細(xì)胞系中產(chǎn)生并根據(jù)實(shí)施例4的新方法3修飾的修飾的磺酰胺酶所獲得的在小鼠中的清除的數(shù)據(jù)與在表3中呈現(xiàn)的對(duì)于在QMCF系統(tǒng)中產(chǎn)生并通過新方法1修飾的修飾的磺酰胺酶的數(shù)據(jù)一致。蛋白的降低的清除可允許對(duì)病人不太頻繁的給藥。表3.磺酰胺酶和修飾的磺酰胺的血漿清除實(shí)施例8：修飾的磺酰胺酶對(duì)腦硫酸乙酰肝素貯積的體內(nèi)影響材料和方法研究了，靜脈(i.v.)施用的如實(shí)施例1中描述的在QuattromedCellFactory(QMCF)附加型表達(dá)系統(tǒng)(IcosagenAS)中產(chǎn)生并根據(jù)實(shí)施例4的新方法1修飾的修飾的磺酰胺酶對(duì)腦硫酸乙酰肝素貯積的體內(nèi)影響。測(cè)試物品制備：將修飾的磺酰胺酶以6mg/mL配制、無菌過濾并在-70℃冷凍直至被使用。在使用之前使冷凍的修飾的磺酰胺酶和對(duì)應(yīng)的媒介物溶液在注射的當(dāng)天在RT解凍最少一小時(shí)至多達(dá)兩小時(shí)。將氯苯那敏溶解于等滲鹽水中至0.5mg/mL的濃度，并在-20℃儲(chǔ)存。動(dòng)物：使用在mps3a基因具有自發(fā)純合突變的雄性小鼠B6.Cg-Sgshmps3a/PstJ(MPSIIIA)(JacksonLaboratories,ME,USA)。將動(dòng)物在23℃±1℃和40％-60％濕度在籠子中單獨(dú)圈養(yǎng)，并自由獲得水和標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室食物。12/12h光照/黑暗周期被設(shè)置為在7pm開燈。在開始研究前使動(dòng)物適應(yīng)至少兩周。來自相同育種單元的野生型同胞也被包括作為對(duì)照。在研究A中，小鼠為23-24周齡，而在研究B中小鼠為9-10周齡。實(shí)驗(yàn)程序研究A：將修飾的磺酰胺酶以30mg/kg(n＝8)和媒介物(N＝7)每隔一天靜脈施用至MPSIIIA小鼠，持續(xù)25天(13次注射)。在施用修飾的磺酰胺酶或媒介物之前30-45min，將氯苯那敏皮下給藥(2.5mg/kg)。給藥在早上約07.00時(shí)開始。測(cè)試物品和媒介物以5mL/kg施用。在每次給藥時(shí)機(jī)，使最終的施用體積針對(duì)實(shí)際體重校正。對(duì)媒介物重復(fù)該方案。研究在最后一次注射之后2h完成。未處理的鼠齡匹配的野生型小鼠(n＝5)連同測(cè)試物品處理組一起被包括。使小鼠通過異氟烷麻醉。從出血的眶后叢(retro-orbitalplexus)抽取血液。灌注遵循用20mL生理鹽水沖洗通過心臟的左心室進(jìn)行。將組織解剖(腦、肝、脾、肺和心臟)、稱重并在液氮中快速冷凍。制備組織和血液以利用LC-MS/MS測(cè)量己糖胺N-硫酸酯[α-1,4]糖醛酸(HNS-UA)水平。HNS-UA是硫酸乙酰肝素貯積的二糖標(biāo)志物，并因此HNS-UA水平的降低反映硫酸乙酰肝素的降解。將HNS-UA數(shù)據(jù)以相對(duì)于內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)單位計(jì)算，以每mg組織表示并相對(duì)對(duì)照組的平均值標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)通過單因素ANOVA檢驗(yàn)來分析，并且如果總體顯著性被證實(shí)，則還通過組間顯著性檢驗(yàn)的Bonferroni事后多重比較檢驗(yàn)來分析(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。實(shí)驗(yàn)程序研究B：將修飾的磺酰胺酶以30mg/kg(n＝6)、10mg/kg(n＝6)和媒介物(n＝6)每周一次靜脈施用至MPSIIIA小鼠，持續(xù)10周(10次注射)。在施用修飾的磺酰胺酶或媒介物之前30-45min皮下給予氯苯那敏(2.5mg/kg)。在每次給藥時(shí)機(jī)，使最終的施用體積針對(duì)實(shí)際體重校正。對(duì)媒介物重復(fù)該方案。研究在最后一次注射之后24h完成。未處理的鼠齡匹配的野生型小鼠(n＝6)連同測(cè)試物品處理組一起被包括。小鼠通過異氟烷麻醉。從出血的眶后叢抽取血液。灌注遵循用20mL生理鹽水沖洗通過心臟的左心室進(jìn)行。將組織解剖(腦、肝、脾)、稱重并在液氮中快速冷凍。制備組織和血液以利用LC-MS/MS測(cè)量HNS-UA水平。將HNS-UA數(shù)據(jù)以相對(duì)于內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)單位計(jì)算，以每mg組織表示并相對(duì)對(duì)照組平均值標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)通過單因素ANOVA檢驗(yàn)分析，并且如果總體顯著性被證實(shí)，則還通過組間顯著性檢驗(yàn)的Bonferroni事后多重比較檢驗(yàn)來分析(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。組織樣品中HNS-UA的LC-MS/MS分析：根據(jù)由Fuller等(PediatrRes56:733-738(2004))和Ramsay等(MolGenetMetab78:193-204(2003))描述的方法部分地進(jìn)行組織樣品中的己糖胺N-硫酸酯[α-1,4]糖醛酸(HNS-UA)的液相層析串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析。將組織(90-180mg)使用LysingMatrixD裝置(MPBiomedicals,LLC,Ohio,US)在底物緩沖液(29mM二乙基巴比妥酸、29mM乙酸鈉、0.68％(w/v)氯化鈉、100mL水、pH6.5)中均質(zhì)化。均質(zhì)化在SavantFastPrepFP120/Bio101勻漿器(LabWrench,ON,Canada)中進(jìn)行25s，并且隨后將均質(zhì)物以10000rcf在Eppendorf離心機(jī)5417R中離心。上清液被蒸發(fā)至近干。添加150μL衍生化溶液(250mM3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(PMP)，400mMNH3，pH9.1)和5μL內(nèi)標(biāo)軟骨素二糖Δdi-4S鈉(ΔUA-GalNAc4S，0.1mg/mL)儲(chǔ)備溶液。衍生化在攪拌下在70℃進(jìn)行90min，并且然后將溶液用200μL800mM的甲酸來酸化。將去離子水添加至樣品至500μL的最終體積，并用氯仿(3×500μL)進(jìn)行提取以去除過量的PMP。以13000×g進(jìn)行離心持續(xù)5min，并將上層相轉(zhuǎn)移至新的小瓶中。為去除任何過量的甲酸和NH4COOH，將水相在speedvac(SavantInstrumentsInc.,Farmingdale,NY)中蒸發(fā)至干燥。將樣品重構(gòu)至總計(jì)100μL的5％乙腈/0.1％乙酸/0.02％TFA。LC-MS/MS分析在與SciexAPI4000三重四極桿質(zhì)譜儀偶聯(lián)的Waters超高效液相色譜(UPLC)上進(jìn)行。儀器控制、數(shù)據(jù)采集和評(píng)價(jià)用分析軟件完成。LC分離通過使用AcquityC18CSH柱(50×2.1mm，1.7μm)進(jìn)行。流動(dòng)相A由5％乙腈/0.5％甲酸組成，且流動(dòng)相B由95％乙腈/0.5％甲酸組成。以0.35mL/min的流速使用在7min內(nèi)從1％至99％的梯度。注射體積為10μL。API4000以電噴霧負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式操作。在4.5kV操作離子噴霧電壓，并且源溫度為450℃。氬氣被用作碰撞氣體。碰撞能量為34V。MRM轉(zhuǎn)換為764.4/331.2(PMP-HNS-UA)和788.3/534.3(PMP-內(nèi)標(biāo))。HNS-UA的相對(duì)量相對(duì)于內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的水平來計(jì)算。結(jié)果圖6A中示出的來自研究A的結(jié)果表明在以30mg/kg每隔一天重復(fù)靜脈施用25天(13個(gè)劑量)之后，根據(jù)新方法1修飾的磺酰胺酶將腦中的HNS-UA水平降低了30％。另外，用修飾的磺酰胺酶治療完全消除了在肝(圖6B)和肺(未示出)中的HNS-UA水平。來自研究B的結(jié)果示于圖6C中并表明在分別以30mg/kg和10mg/kg每周一次重復(fù)靜脈施用持續(xù)10周之后，根據(jù)新方法1修飾的磺酰胺酶將腦中的HNS-UA的水平分別降低了48％和14％。如此，這些結(jié)果表明長期處理之后，根據(jù)本文描述的新方法1修飾的磺酰胺酶蛋白導(dǎo)致腦中的HNS-UA水平的穩(wěn)健降低以及外周器官中的HNS-UA水平的基本上完全的降低。實(shí)施例9：磺酰胺酶修飾的優(yōu)化化學(xué)修飾過程通?？煞譃閮刹糠?，其中氧化步驟為第一步，下文表示為R1，且還原為第二步，表示為R2。為了優(yōu)化兩個(gè)步驟，建立了研究?jī)蓚€(gè)步驟的溫度、濃度和時(shí)間的影響的全因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DoE)。材料和方法將如在實(shí)施例1中描述的在QuattromedCellFactory(QMCF)附加型表達(dá)系統(tǒng)(IcosagenAS)中產(chǎn)生的磺酰胺酶基本如在實(shí)施例4中對(duì)新方法1描述的來修飾，而經(jīng)歷研究的參數(shù)根據(jù)表4(下文)而變化。R1的研究用與實(shí)施例4(方法1)中描述的相同還原和參數(shù)處理來進(jìn)行。用于分析的端點(diǎn)是實(shí)施例1中描述的聚糖的氧化程度和實(shí)施例6中描述的修飾的蛋白的細(xì)胞攝取水平。表4:在R1和R2中變化的參數(shù)選擇的參數(shù)數(shù)目和設(shè)計(jì)類型對(duì)每個(gè)步驟產(chǎn)生十個(gè)實(shí)驗(yàn)，使用MODDE10軟件(UmetricsAB)評(píng)價(jià)每個(gè)步驟的十個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。另外，測(cè)試了第二猝滅步驟對(duì)用R1參數(shù)8℃、60min及20mM偏高碘酸鈉產(chǎn)生的磺酰胺酶的影響。使兩個(gè)另外的反應(yīng)與DoE實(shí)驗(yàn)并行運(yùn)行，并使用0.1M丙酮或通過添加乙酸直至獲得6.0或更低的pH來猝滅。最終的處理(work-up)遵循其他反應(yīng)的方案。如此產(chǎn)生的磺酰胺酶使用在實(shí)施例5中描述的SDS-PAGE方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。R2實(shí)驗(yàn)用根據(jù)在R1的DoE分析之后發(fā)現(xiàn)是優(yōu)選的參數(shù)修飾的磺酰胺酶來進(jìn)行。結(jié)果R1結(jié)果被歸納于下文表5中：表5：R1實(shí)驗(yàn)及結(jié)果另外，對(duì)根據(jù)已知方法修飾的磺酰胺酶進(jìn)行根據(jù)實(shí)施例1的糖基化分析。在N-糖基化位點(diǎn)N(21)、N(131)、N(244)和N(393)處未檢測(cè)到保留的原始N-聚糖。R1(氧化)的MODDE評(píng)價(jià)顯示，R1的最佳條件為約8℃的溫度，約1h的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間及約10mmol/L的偏高碘酸鈉的濃度。整體蛋白健康(例如結(jié)構(gòu)完整性)似乎得益于仍將經(jīng)由聚糖識(shí)別受體的細(xì)胞攝取限制到新方法1的水平的盡可能最低的氧化劑濃度(詳見實(shí)施例6)。在對(duì)于R1反應(yīng)公開的多種條件中，時(shí)間被認(rèn)為對(duì)于聚糖修飾的程度是重要的參數(shù)。另外，高碘酸鹽濃度可影響聚糖修飾的程度。從而，R2(還原)設(shè)計(jì)使用以上鑒定的R1，即用于磺酰胺酶的氧化的優(yōu)選參數(shù)。由于發(fā)現(xiàn)FGly含量影響修飾的磺酰胺酶的活性(參見實(shí)施例3和5)，因此R2的關(guān)鍵端點(diǎn)為FGly含量。結(jié)果參見下文表6。包含F(xiàn)Gly50和Ser50的肽片段的相對(duì)量用LC-MS通過測(cè)量來自重建的離子層析的峰面積來分析(未電離效率校正)。表6.R2的DoE和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的歸納R2的DoE顯示，Ser形成與硼氫化鈉的濃度和溫度相關(guān)?？紤]到Ser形成和高分子量形式的存在(數(shù)據(jù)未示出，結(jié)果與實(shí)施例4中的新方法2得到的結(jié)果類似)，R2的優(yōu)選條件為約0℃的溫度，約1h或更少的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間，以及超過12mmol/L和多達(dá)并包括50mmol/L的硼氫化鈉濃度。在SDS-PAGE(數(shù)據(jù)未示出)上證實(shí)了在其中還原步驟被猝滅的反應(yīng)中產(chǎn)生的磺酰胺酶與沒有猝滅產(chǎn)生的磺酰胺酶是可比的。這指示通過用0.1M丙酮猝滅或通過由添加乙酸將pH降低至小于6引入第二猝滅步驟不負(fù)面地影響材料的質(zhì)量。實(shí)施例10：根據(jù)先前已知的方法化學(xué)修飾磺酰胺酶之后聚糖結(jié)構(gòu)的分析材料和方法根據(jù)已知方法化學(xué)修飾：如在實(shí)施例2中描述的根據(jù)已知方法進(jìn)行磺酰胺酶的化學(xué)修飾。糖基化分析：化學(xué)修飾后對(duì)磺酰胺酶的聚糖結(jié)構(gòu)的分析根據(jù)在實(shí)施例1中描述的LC-MS方法進(jìn)行。通過LC-MS分析研究了在實(shí)施例1中描述的包含N糖基化位點(diǎn)N(21)、N(131)、N(244)和N(393)的四種胰蛋白酶肽片段上的聚糖部分上的所得的修飾。結(jié)果糖基化分析：如在實(shí)施例1中描述的，在化學(xué)修飾之前在四個(gè)糖基化位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)的糖基化的類型在N(21)和N(393)上主要為復(fù)雜型聚糖，以及在N(131)和N(244)上主要為寡聚甘露糖類型的聚糖。在化學(xué)修飾之后，對(duì)最豐富的化學(xué)修飾的糖肽進(jìn)行修飾的聚糖結(jié)構(gòu)的詳細(xì)表征(由于在化學(xué)修飾之后增加的異質(zhì)性，引起靈敏度的顯著降低，造成不太豐富的聚糖不可檢測(cè))。在本實(shí)施例中，研究了在根據(jù)已知方法化學(xué)修飾之后Man-6-聚糖上的修飾。聚糖的高碘酸鹽處理裂解糖類部分的兩個(gè)相鄰羥基之間的碳鍵，并改變聚糖鏈的分子質(zhì)量。圖8A示出了在化學(xué)修飾之后甘露糖上的預(yù)測(cè)的鍵斷裂的實(shí)例。圖8B示出了顯示在用高碘酸鈉氧化之后可能發(fā)生的理論上的鍵斷裂的Man-6-聚糖的模型。在圖9中示出了，在根據(jù)先前已知的方法化學(xué)修飾之前和之后，具有附連至N(131)的Man-6-聚糖(T13+Man-6聚糖)的胰蛋白酶肽NITR的質(zhì)譜。鑒定了對(duì)應(yīng)于具有不同程度鍵斷裂的化學(xué)修飾的糖肽的離子。對(duì)于Man-6聚糖，在理論上可存在最多3個(gè)雙鍵斷裂和一個(gè)單鍵斷裂。當(dāng)根據(jù)已知方法進(jìn)行修飾時(shí)，發(fā)現(xiàn)在質(zhì)譜中最強(qiáng)烈的離子信號(hào)對(duì)應(yīng)于2個(gè)雙鍵斷裂及2個(gè)單鍵斷裂，而第二強(qiáng)烈的離子信號(hào)對(duì)應(yīng)于可能是最廣泛的鍵斷裂的3個(gè)雙鍵斷裂和一個(gè)單鍵斷裂?？梢暬诟鶕?jù)已知方法化學(xué)修飾之后在T13+Man-6聚糖上發(fā)現(xiàn)的鍵斷裂的程度的圖被示于圖10A中(由于來自觀察到的離子的同位素分布，結(jié)果是近似但可比的)?；瘜W(xué)修飾的再現(xiàn)性通過使用根據(jù)先前已知的方法生產(chǎn)的三個(gè)不同批次的化學(xué)修飾的磺酰胺酶來測(cè)試。對(duì)應(yīng)于不同程度的鍵斷裂的離子在來自三個(gè)不同批次的MS譜中顯示出非常相似的分布。實(shí)施例11：在根據(jù)新方法1、3和4化學(xué)修飾磺酰胺酶之后聚糖結(jié)構(gòu)的分析。新方法1、3和4：根據(jù)新方法化學(xué)修飾磺酰胺酶如在實(shí)施例4中描述的進(jìn)行。糖基化分析：糖基化分析根據(jù)實(shí)施例1中描述的LC-MS方法來進(jìn)行。通過LC-MS分析研究了包含N糖基化位點(diǎn)N(21)、N(131)、N(244)和N(393)的四種胰蛋白酶肽片段的聚糖變體上的所得的修飾。結(jié)果糖基化分析：對(duì)最豐富的化學(xué)修飾的糖肽進(jìn)行在根據(jù)新方法1、3和4化學(xué)修飾的磺酰胺酶上的修飾的聚糖特征的詳細(xì)表征。在本實(shí)施例11中，研究了在根據(jù)新方法1、3和4化學(xué)修飾之后Man-6-聚糖上的修飾。鑒定了對(duì)應(yīng)于具有不同程度鍵斷裂的化學(xué)修飾的糖肽T13+Man-6聚糖的離子。理論上可存在最多3個(gè)雙鍵斷裂和一個(gè)單鍵斷裂(參見圖8B，顯示在用高碘酸鈉氧化之后可能發(fā)生的鍵斷裂的Man-6聚糖的模型)。當(dāng)根據(jù)新方法1進(jìn)行修飾時(shí)，發(fā)現(xiàn)在質(zhì)譜中最強(qiáng)烈的離子信號(hào)對(duì)應(yīng)于一個(gè)雙鍵斷裂及3個(gè)單鍵斷裂，而第二最強(qiáng)烈的離子信號(hào)對(duì)應(yīng)于2個(gè)雙鍵斷裂和2個(gè)單鍵斷裂。當(dāng)根據(jù)新方法3和4進(jìn)行修飾時(shí)，Man-6聚糖上的鍵斷裂甚至被進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至優(yōu)先地單鍵斷裂。在圖10A中示出了可視化在化學(xué)修飾之后胰蛋白酶肽T13+Man-6聚糖的鍵斷裂的程度的圖。化學(xué)修飾的再現(xiàn)性通過使用一式三份(新方法1)或一式兩份(新方法3)的化學(xué)修飾的磺酰胺酶測(cè)試。當(dāng)將從根據(jù)已知方法化學(xué)修飾的磺酰胺酶得到的Man-6聚糖修飾與從根據(jù)新方法1、3和4化學(xué)修飾的磺酰胺酶得到的Man-6聚糖修飾比較時(shí)，在鍵斷裂程度上存在大的差異。這被示于圖10A中，其中對(duì)四種方法繪制了不同程度的鍵斷裂的分布(由于來自觀察到的離子的同位素分布，結(jié)果是近似但可比的)。圖10B示出了對(duì)于使用的方法，單鍵斷裂的相對(duì)豐度。先前已知的方法提供了在被研究的Man-6-聚糖中具有45％的單鍵斷裂的修飾的磺酰胺酶，而新方法1、3和4在化學(xué)修飾后分別具有70％、80％和82％的單鍵斷裂。當(dāng)前第1頁1 2 3