本發(fā)明涉及包含交聯(lián)多糖的水凝膠的領(lǐng)域以及此類水凝膠在醫(yī)學(xué)應(yīng)用和/或美容應(yīng)用中的用途。更具體地，本發(fā)明涉及與右旋糖酐接枝的交聯(lián)的透明質(zhì)酸。

發(fā)明背景

針對醫(yī)學(xué)用途最廣泛地使用的生物相容性聚合物之一是透明質(zhì)酸(HA)。其是自然存在的多糖，屬于糖胺聚糖(GAG)的組。透明質(zhì)酸和其他GAG是帶負電荷的雜多糖鏈，該帶負電荷的雜多糖鏈具有吸收大量水的能力。透明質(zhì)酸以及衍生自透明質(zhì)酸的產(chǎn)品被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和美容領(lǐng)域中，例如，在粘性手術(shù)(viscosurgery)期間并且作為真皮填充物。

吸水凝膠或水凝膠被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。它們一般通過將聚合物化學(xué)交聯(lián)至無限網(wǎng)絡(luò)來制備。雖然天然的透明質(zhì)酸和某些交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品吸收水直到它們被完全溶解時，但交聯(lián)的透明質(zhì)酸凝膠通常吸收一定量的水直到它們飽和，即，它們具有有限的液體保持容量或溶脹度。

由于透明質(zhì)酸以相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)存在(除了其在大部分生命有機體中的分子質(zhì)量之外)，它給出了反應(yīng)的最小程度并且允許用于先進的醫(yī)學(xué)用途。透明質(zhì)酸分子的交聯(lián)和/或其他改性對于改善其在體內(nèi)的持續(xù)時間是必要的。此外，此類改性影響透明質(zhì)酸分子的液體保持容量。作為其結(jié)果，透明質(zhì)酸一直是許多改性嘗試的主題。

發(fā)明概述

本發(fā)明的目的是提供交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其適合于用作真皮填充物。

本發(fā)明的另外的目的是提供交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其適合在作為真皮填充物的使用中具有改善的耐久性。

本發(fā)明的另外的目的是提供交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其適合具有降低的溶脹。

對于將從本公開內(nèi)容明顯的這些和其他目的，根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供透明質(zhì)酸產(chǎn)品，所述透明質(zhì)酸產(chǎn)品包含交聯(lián)的透明質(zhì)酸和一種或更多種右旋糖酐分子，其中透明質(zhì)酸通過醚鍵交聯(lián)，并且其中一種或更多種右旋糖酐分子被共價地接枝至交聯(lián)的透明質(zhì)酸。

如本文中使用的術(shù)語交聯(lián)是指涉及現(xiàn)有的大分子上的位點或基團的反應(yīng)或?qū)е略诖蠓肿又行纬尚^(qū)域的在大分子之間的相互作用，至少四條鏈發(fā)源于所述小區(qū)域。線型大分子的反應(yīng)性鏈端與另一個線型大分子的內(nèi)部反應(yīng)性位點的反應(yīng)導(dǎo)致支化點或接枝的形成，但不視作交聯(lián)反應(yīng)。

如本文中使用的術(shù)語接枝是指這樣的反應(yīng)，在所述反應(yīng)中，一種或更多種嵌段物質(zhì)被連接至大分子的主鏈，作為具有不同于主鏈中的那些的構(gòu)成特征或構(gòu)型特征的側(cè)鏈。

本發(fā)明人驚異地發(fā)現(xiàn)，可能以高轉(zhuǎn)化率將右旋糖酐接枝至玻尿酸水凝膠。這一發(fā)現(xiàn)是意料之外的，因為交聯(lián)的透明質(zhì)酸網(wǎng)絡(luò)將被預(yù)期以防止右旋糖酐的擴散，導(dǎo)致降低的接枝效率。

根據(jù)本發(fā)明的包含交聯(lián)的透明質(zhì)酸與接枝的一種或更多種右旋糖酐分子的透明質(zhì)酸產(chǎn)品展現(xiàn)出若干有利以及令人驚異的性質(zhì)，例如，包括對熱降解、水解降解、自由基降解和酶降解的改善的穩(wěn)定性，導(dǎo)致在作為真皮填充物的使用中的改善的耐久性以及降低的溶脹度。降低的溶脹度意指可以產(chǎn)生較硬的凝膠，而不增大在透明質(zhì)酸中的交聯(lián)劑的量。

根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品可以例如用作用于美容手術(shù)或醫(yī)學(xué)手術(shù)(類似真皮填充和體形塑造)的可注射的組合物，根據(jù)本發(fā)明的使透明質(zhì)酸與右旋糖酐組合的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品與無右旋糖酐的透明質(zhì)酸產(chǎn)品相比呈現(xiàn)出降低的溶脹。這是有用的，因為它意指可以產(chǎn)生較硬的凝膠，而不增大在透明質(zhì)酸中的交聯(lián)劑的量。根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品還已被發(fā)現(xiàn)與無右旋糖酐的透明質(zhì)酸產(chǎn)品相比具有較好的熱穩(wěn)定性以及對自由基降解和酶降解的較好的穩(wěn)定性?？赡艿慕忉屖峭该髻|(zhì)酸骨架通過右旋糖酐來保護。這導(dǎo)致與無右旋糖酐的透明質(zhì)酸產(chǎn)品相比的根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品的在體內(nèi)的改善的耐久性。

在優(yōu)選的實施方案中，右旋糖酐通過酰胺鍵被附接至透明質(zhì)酸。與例如酯鍵相比，酰胺鍵在右旋糖酐-透明質(zhì)酸接枝物中的使用已被發(fā)現(xiàn)是有利的，因為酰胺鍵對于在體內(nèi)的降解是更穩(wěn)定的。

有利的是，將右旋糖酐分子接枝在已經(jīng)交聯(lián)的透明質(zhì)酸上，該交聯(lián)的透明質(zhì)酸可以已經(jīng)以具有定義的物理-化學(xué)性質(zhì)的合意的形式來制備。這允許用右旋糖酐明顯改性交聯(lián)的HA，而不誘導(dǎo)交聯(lián)的HA的解聚。

根據(jù)本文闡釋的第二方面，提供了制備透明質(zhì)酸產(chǎn)品的工藝，所述透明質(zhì)酸產(chǎn)品包含交聯(lián)的透明質(zhì)酸和一種或更多種官能化的右旋糖酐分子，所述工藝包括以下步驟：

(a)提供交聯(lián)的透明質(zhì)酸和一種或更多種官能化的右旋糖酐分子；

(b)將一種或更多種官能化的右旋糖酐分子共價地接枝至所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸。

將右旋糖酐分子共價地接枝至交聯(lián)的透明質(zhì)酸。在優(yōu)選的實施方案中，通過單一的端-點附接將右旋糖酐分子接枝至交聯(lián)的透明質(zhì)酸。為了能夠?qū)崿F(xiàn)共價接枝，將右旋糖酐分子用合適的反應(yīng)性官能團來官能化。右旋糖酐分子可以例如被提供有具有氨基的連接基，以便能夠通過酰胺鍵接枝至交聯(lián)的透明質(zhì)酸。

由于通過根據(jù)本發(fā)明的工藝可獲得的產(chǎn)品的性質(zhì)是復(fù)雜的，產(chǎn)品也可以被定義為是這些工藝的結(jié)果。根據(jù)本文中闡釋的另一個方面，提供了通過本文描述的工藝可獲得的包含透明質(zhì)酸和右旋糖酐的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品。

本公開內(nèi)容的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品可以例如在用于治療軟組織紊亂的可注射制劑中使用，包括但不限于，矯正治療和美學(xué)治療。

本公開內(nèi)容的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品可以例如在用于美容手術(shù)、醫(yī)學(xué)手術(shù)中以及用于使皮膚保濕和/或賦予皮膚活力的可注射制劑中使用，所述美容手術(shù)為例如，真皮填充、體形塑造和面部塑造，所述醫(yī)學(xué)手術(shù)為例如，真皮填充、體形塑造、防止組織粘連、形成通道、失禁治療和整形外科應(yīng)用。

根據(jù)本文中闡釋的方面，提供了一種從美容方面治療皮膚的方法，所述方法包括向皮膚施用如本文描述的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品。

交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品也可以被提供在可注射的真皮的美學(xué)制劑或藥物制劑中。

本發(fā)明的其他方面和優(yōu)選的實施方案依據(jù)本發(fā)明的以下詳細公開內(nèi)容和所附權(quán)利要求將是明顯的。

附圖簡述

圖1是示出透明質(zhì)酸凝膠的溶脹如何隨著增加用右旋糖酐的接枝而降低的圖。

圖2是HA-右旋糖酐混合的水凝膠的熱重分析。

圖3是作為右旋糖酐-連接基/HA的比率的函數(shù)的在HA上接枝的右旋糖酐。

發(fā)明詳述

本發(fā)明的透明質(zhì)酸(透明質(zhì)酸在本文中也被稱作“HA”或“玻尿酸”)產(chǎn)品包含交聯(lián)的透明質(zhì)酸和一種或更多種右旋糖酐分子，其中透明質(zhì)酸通過醚鍵交聯(lián)，并且其中一種或更多種右旋糖酐分子被共價地接枝至交聯(lián)的透明質(zhì)酸。

透明質(zhì)酸產(chǎn)品可以存在于水溶液中，但它也可以以干燥形式或沉淀形式存在，例如，在乙醇中。透明質(zhì)酸產(chǎn)品優(yōu)選地是可注射的。

透明質(zhì)酸產(chǎn)品可以以凝膠的形式存在(在本文中也被稱作“水凝膠”)。在凝膠中的多糖的總量優(yōu)選地在5mg/mL-150mg/mL的范圍內(nèi)、更優(yōu)選地在10mg/mL-100mg/mL的范圍內(nèi)。

接枝至交聯(lián)的透明質(zhì)酸的右旋糖酐的摩爾量為在0.1％-99％的范圍內(nèi)、優(yōu)選地在1％-60％的范圍內(nèi)。

透明質(zhì)酸產(chǎn)品通過它們的溶脹即它們吸收水的能力來評估。溶脹表示為一克干燥產(chǎn)品可以吸收的按mL計的水(或鹽水)的量。溶脹也可以關(guān)于凝膠來測量并且以mL每克凝膠來表示。透明質(zhì)酸產(chǎn)品的溶脹優(yōu)選地在0.5mL/g-10mL/g的范圍內(nèi)、更優(yōu)選地在1mL/g-5mL/g的范圍內(nèi)。

本發(fā)明的透明質(zhì)酸產(chǎn)品可以呈凝膠顆粒、線、圓盤等等的形式。在優(yōu)選的實施方案中，交聯(lián)的透明質(zhì)酸呈凝膠顆粒的形式。凝膠顆粒優(yōu)選地具有在0.01mm-5mm、優(yōu)選地0.1mm-1mm的范圍內(nèi)、例如0.2-0.5mm或0.5-0.8mm的平均溶脹大小(除非另有陳述，否則本文給出的所有粒度是指重量平均粒度)。根據(jù)某些實施方案，交聯(lián)的透明質(zhì)酸呈具有在0.01mm-5mm、優(yōu)選地0.1mm-1mm的范圍內(nèi)的平均大小的凝膠顆粒的形式。

根據(jù)某些實施方案，一種或更多種右旋糖酐分子和交聯(lián)的透明質(zhì)酸的二糖具有0.1％-99％例如0.1％-60％例如1％-60％或例如1％-20％的摩爾比。50％的摩爾比意指HA二糖的一半具有接枝的右旋糖酐鏈。

根據(jù)某些實施方案，右旋糖酐分子具有小于10kDa、優(yōu)選地小于5kDa的平均分子量。

根據(jù)某些實施方案，右旋糖酐分子通過單一的端-點附接被共價地連接至透明質(zhì)酸。單一的端-點附接意指右旋糖酐僅經(jīng)由右旋糖酐分子的末端殘基、優(yōu)選地經(jīng)由右旋糖酐分子的還原端被附接至透明質(zhì)酸。根據(jù)某些實施方案，右旋糖酐分子經(jīng)由在右旋糖酐的還原端與透明質(zhì)酸的羧基之間的雙官能連接基或多官能連接基通過單一的端-點附接被共價地連接至透明質(zhì)酸。

根據(jù)某些實施方案，右旋糖酐分子包含連接基，所述連接基具有氨基、酰肼、肼基甲酸酯、氨基脲、硫代氨基脲、硫代肼基甲酸酯或氨基氧基官能團，并且其中所述連接基的官能團與交聯(lián)的透明質(zhì)酸的羧基形成共價鍵。

根據(jù)某些實施方案，雙官能連接基或多官能連接基包括獨立地選自以下的至少兩種官能團：氨基、酰肼、肼基甲酸酯、氨基脲、硫代氨基脲、硫代肼基甲酸酯或氨基氧基。根據(jù)某些實施方案，雙官能連接基或多官能連接基是二胺或二酰肼。根據(jù)某些實施方案，雙官能連接基或多官能連接基是六亞甲基二胺、2,2’-(亞乙基二氧基)雙(乙胺)、O,O’-1,3-丙二基雙羥胺、己二酸二酰肼或亞精胺。

除非另有提供，否則術(shù)語“透明質(zhì)酸”涵蓋各種鏈長度和電荷狀態(tài)以及具有各種化學(xué)改性的透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸鹽或玻尿酸的所有變體以及變體的組合。換言之，該術(shù)語還涵蓋具有各種抗衡離子的透明質(zhì)酸的各種透明質(zhì)酸鹽，例如透明質(zhì)酸鈉。透明質(zhì)酸的各種改性也被以下術(shù)語涵蓋：例如氧化，例如-CH₂OH基團至-CHO和/或-COOH的氧化；相鄰羥基的高碘酸鹽氧化，任選地然后是還原，例如，-CHO至-CH₂OH的還原，或與胺偶聯(lián)以形成亞胺，然后還原成仲胺；硫酸化、脫酰胺、任選地然后是脫氨基或利用新的酸的酰胺形成；酯化；以及脫乙酰。改性的其他實例是異脲偶聯(lián)、酰肼偶聯(lián)、溴化氰(bromocyan)偶聯(lián)、單環(huán)氧化物偶聯(lián)和單砜偶聯(lián)。

透明質(zhì)酸可以從動物起源和非動物起源的各種來源獲得。非動物起源的來源包括酵母以及優(yōu)選地細菌。單一透明質(zhì)酸分子的分子量通常在0.1MDa-10MDa的范圍內(nèi)，但其他分子量是可能的。

在某些實施方案中，交聯(lián)的透明質(zhì)酸的濃度為在1mg/ml至100mg/ml的范圍內(nèi)。在某些實施方案中，交聯(lián)的透明質(zhì)酸的濃度為在2mg/ml至50mg/ml的范圍內(nèi)。在具體的實施方案中，交聯(lián)的透明質(zhì)酸的濃度為在5mg/ml至30mg/ml的范圍內(nèi)或在10mg/ml至30mg/ml的范圍內(nèi)。

交聯(lián)的透明質(zhì)酸包含在透明質(zhì)酸鏈之間的交聯(lián)鍵，其產(chǎn)生了透明質(zhì)酸分子的通過共價交聯(lián)鍵、透明質(zhì)酸鏈的物理糾纏以及各種相互作用例如靜電相互作用、氫鍵和范德華力保持在一起的連續(xù)網(wǎng)絡(luò)。

交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品優(yōu)選地是生物相容的。這意味著在被治療的個體中不發(fā)生或僅發(fā)生非常溫和的、免疫應(yīng)答。即，在被治療的個體中不發(fā)生或僅發(fā)生非常溫和的不合意的局部或全身效果。

根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品可以是凝膠，或水凝膠。即，它可以被視作水不溶性的，但當(dāng)經(jīng)受液體、通常地含水液體時大體上稀釋透明質(zhì)酸分子的交聯(lián)體系。

凝膠按重量計主要包含液體并且可以例如包含90％-99.9％的水，但它表現(xiàn)得類似固體，這歸因于在液體內(nèi)的三維交聯(lián)的透明質(zhì)酸網(wǎng)絡(luò)。由于凝膠的顯著的液體含量，凝膠在結(jié)構(gòu)上是柔性的并且類似于天然組織，這使得它作為組織工程中的支架以及用于組織增大的支架是非常有用的。

透明質(zhì)酸的交聯(lián)可以通過用交聯(lián)劑改性來實現(xiàn)。透明質(zhì)酸濃度和交聯(lián)的程度影響了凝膠的機械性質(zhì)例如彈性模量G'以及穩(wěn)定性性質(zhì)。交聯(lián)的透明質(zhì)酸凝膠常常依據(jù)“改性度”來表征。透明質(zhì)酸凝膠的改性度一般地在0.1摩爾％與15摩爾％之間的范圍內(nèi)。改性度(摩爾％)描述了結(jié)合至HA的交聯(lián)劑的量，即，相對于重復(fù)的HA二糖單元的總摩爾量的結(jié)合的交聯(lián)劑的摩爾量。改性度反映出HA已通過交聯(lián)劑被化學(xué)地改性的程度。用于交聯(lián)的反應(yīng)條件和用于確定改性度的合適的分析技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員全部都是熟知的，這些技術(shù)人員可以容易地調(diào)節(jié)這些和其他相關(guān)因素并且從而提供合適的條件以獲得在0.1％-2％的范圍內(nèi)的改性度并且證實了相對于改性度的得到的產(chǎn)品特性。BDDE(1,4-丁二醇二縮水甘油醚)交聯(lián)的透明質(zhì)酸凝膠可以例如根據(jù)在公布的國際專利申請WO 9704012的實施例1和2中描述的方法來制備。

在優(yōu)選的實施方案中，交聯(lián)的透明質(zhì)酸以通過交聯(lián)劑交聯(lián)的凝膠的形式存在，其中所述透明質(zhì)酸的濃度為在10mg/ml至30mg/ml的范圍內(nèi)，并且利用所述交聯(lián)劑的改性度為在0.1摩爾％至2摩爾％的范圍內(nèi)。

透明質(zhì)酸凝膠也可以包含透明質(zhì)酸的未交聯(lián)的即未結(jié)合至三維交聯(lián)的透明質(zhì)酸網(wǎng)絡(luò)的部分。然而，優(yōu)選的是，在凝膠組合物中的按重量計至少50％、優(yōu)選地按重量計至少60％、更優(yōu)選地按重量計至少70％、并且最優(yōu)選地按重量計至少80％的透明質(zhì)酸形成交聯(lián)的透明質(zhì)酸網(wǎng)絡(luò)的一部分。

透明質(zhì)酸可以以顆粒、線、圓盤等等的形式存在。在優(yōu)選的實施方案中，交聯(lián)的透明質(zhì)酸呈凝膠顆粒的形式。凝膠顆粒優(yōu)選地具有在0.01mm-5mm、優(yōu)選地0.1mm-1mm例如0.2mm-0.5mm或0.5mm-0.8mm的范圍內(nèi)的平均大小。

透明質(zhì)酸鏈經(jīng)由連接基彼此交聯(lián)，所述連接基衍生自雙官能交聯(lián)劑或多官能交聯(lián)劑。透明質(zhì)酸組合物的雙官能交聯(lián)劑或多官能交聯(lián)劑使透明質(zhì)酸鏈彼此連接。雙官能交聯(lián)劑或多官能交聯(lián)劑還充當(dāng)透明質(zhì)酸鏈之間的間隔基。

雙官能交聯(lián)劑或多官能交聯(lián)劑包含能夠與透明質(zhì)酸的官能團反應(yīng)、導(dǎo)致共價鍵的形成的兩種或更多種官能團。雙官能交聯(lián)劑或多官能交聯(lián)劑可以例如選自由以下組成的組：二乙烯基砜、二環(huán)氧化物和多環(huán)氧化物。

優(yōu)選類型的雙官能交聯(lián)劑或多官能交聯(lián)劑是雙環(huán)氧化物或多環(huán)氧化物，例如二縮水甘油醚。根據(jù)實施方案，雙官能交聯(lián)劑或多官能交聯(lián)劑包含兩個或更多個縮水甘油醚官能團?？s水甘油醚官能團與透明質(zhì)酸的伯羥基反應(yīng)，導(dǎo)致醚鍵的形成。由此斷定，當(dāng)二縮水甘油醚交聯(lián)劑與玻尿酸的伯羥基反應(yīng)時，形成了兩個醚鍵且余留來自交聯(lián)劑的中間間隔基。

用于使透明質(zhì)酸鏈交聯(lián)的優(yōu)選的雙官能交聯(lián)劑或多官能交聯(lián)劑包括1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)、1,2-雙(2,3-環(huán)氧丙氧基)乙烯(EGDGE)和乙二醇二縮水甘油醚(EGDE)、1,2-乙二醇二縮水甘油醚(EDDE)以及二環(huán)氧辛烷。特別優(yōu)選的雙官能交聯(lián)劑或多官能交聯(lián)劑是BDDE。

右旋糖酐可以具有通常在0.2kDa至3000kDa的范圍內(nèi)的任何平均分子量(除非另有指定，否則本文給出的右旋糖酐的全部平均分子量是指數(shù)均分子量，M_n)。在某些實施方案中，優(yōu)選的是，右旋糖酐具有較低的分子量，例如小于100kDa、小于50kDa、小于25kDa、小于10kDa或小于5kDa。右旋糖酐具有大于0.2kDa、優(yōu)選地大于0.5kDa的分子量。在某些實施方案中，右旋糖酐具有在10kDa-100kDa的范圍內(nèi)或在10kDa-50kDa的范圍內(nèi)的分子量。在某些優(yōu)選的實施方案中，右旋糖酐具有在0.5kDa-10kDa的范圍內(nèi)或在0.5kDa-5kDa的范圍內(nèi)的分子量。在一個優(yōu)選的實施方案中，右旋糖酐具有在0.5kDa-3kDa的范圍內(nèi)的平均分子量。

右旋糖酐常常被化學(xué)改性以便改善它們在水中的溶解度和/或以優(yōu)化它們在特定應(yīng)用中的性能。如本文中使用的術(shù)語右旋糖酐還意圖涵蓋功能上等效的變體或其衍生物。

根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品是優(yōu)選地生物相容的。這意味著當(dāng)該產(chǎn)品被引入至個體的組織中時不發(fā)生或僅發(fā)生非常溫和的免疫應(yīng)答。即，在被治療的個體中不發(fā)生或僅發(fā)生非常溫和的不合意的局部或全身效果。

本公開內(nèi)容的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品可以例如在用于治療軟組織紊亂的可注射制劑中使用，包括但不限于，矯正治療和美學(xué)治療。

本公開內(nèi)容的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品可以例如在用于美容手術(shù)、醫(yī)學(xué)手術(shù)中以及用于使皮膚保濕和/或賦予皮膚活力的可注射制劑中使用，所述美容手術(shù)為例如，真皮填充、體形塑造和面部塑造，所述醫(yī)學(xué)手術(shù)為例如，真皮填充、體形塑造、防止組織粘連、形成通道、失禁治療和整形外科應(yīng)用。

交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品也可以被提供在可注射的真皮的美學(xué)制劑或藥物制劑中。

本公開內(nèi)容的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品還可以在用于運輸或施用以及緩慢釋放或控制釋放各種藥物物質(zhì)或美容物質(zhì)的可注射制劑中使用。

可注射制劑可以任選地包括一種或更多種其他藥學(xué)上可接受的組分，包括但不限于，緩沖劑、防腐劑、緊張性調(diào)節(jié)劑、鹽、抗氧化劑、同滲重摩調(diào)節(jié)劑、乳化劑、潤濕劑、增甜劑或調(diào)味劑、以及類似物。

可注射制劑可以任選地包括藥學(xué)上有效量的麻醉劑。麻醉劑可以是局部麻醉劑，例如，氨基酰胺局部麻醉劑或氨基酯局部麻醉劑。麻醉劑的實例包括，但不限于，利多卡因、氨布卡因、阿莫拉酮、阿米卡因、丁氧普魯卡因、苯佐卡因、貝托卡因、珍尼柳酯、布比卡因、布他卡因、氨苯丁酯、布坦卡因、丁胺卡因、丁托西卡因、卡鐵卡因、氯普魯卡因、可卡乙堿、環(huán)美卡因、狄步卡因、二甲異喹、二甲卡因、地哌冬、雙環(huán)胺、芽子定、芽子堿、氯乙烷、依替卡因、β-優(yōu)卡因、尤普羅辛、非那可明、仿可卡因(formocaine)、海克卡因、羥丁卡因、對氨基苯甲酸異丁酯、亮氨卡因甲磺酸鹽、左沙屈爾、利多卡因、甲哌卡因、美普卡因、美布卡因、甲基氯、麥替卡因、納衣卡因、奧他卡因、奧索卡因、羥乙卡因、對乙氧卡因、非那卡因、酚、哌羅卡因、匹多卡因、聚多卡醇、丙嗎卡因、丙胺卡因、普魯卡因、丙泮卡因、丙美卡因、丙哌卡因、丙氧卡因、假可卡因、吡咯卡因、羅哌卡因、水楊醇、丁卡因、托利卡因、三甲卡因、佐拉敏、其組合、及其鹽。氨基酯局部麻醉劑的實例包括但不限于普魯卡因、氯普魯卡因、可卡因、環(huán)美卡因、二甲卡因(拉羅卡因)、丙氧卡因、普魯卡因(奴佛卡因)、丙美卡因、丁卡因(阿美索卡因)。氨基酰胺局部麻醉劑的非限制性實例包括阿替卡因、布比卡因、辛可卡因(狄步卡因)、依替卡因、左布比卡因、利多卡因(利諾卡因)、甲哌卡因、哌羅卡因、丙胺卡因、羅哌卡因、三甲卡因、或其組合。

如本文中描述的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品或包含交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品的可注射的藥物制劑可以用于改善皮膚的外觀、填充皺紋或塑造受試者的面部或身體。

如本文中描述的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品或包含交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品的可注射的藥物制劑可以有利地用作真皮填充物。

如本文中描述的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品或包含交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品的可注射的藥物制劑可以用于從美容方面治療皮膚的方法，所述方法包括向皮膚施用如本文描述的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品。

如本文中描述的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品或包含交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品的可注射的藥物制劑還可以用于通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療關(guān)節(jié)紊亂。

交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品或包含交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品的可注射的藥物制劑的上述用途可以是醫(yī)學(xué)程序或純粹地美容的非醫(yī)學(xué)程序。

在優(yōu)選的實施方案中，右旋糖酐分子通過酰胺鍵被接枝至交聯(lián)的透明質(zhì)酸。右旋糖酐分子被官能化，例如胺化，以便能夠通過酰胺鍵接枝至交聯(lián)的透明質(zhì)酸。因此，本發(fā)明允許進行溫和的偶聯(lián)反應(yīng)，在右旋糖酐與具有定義的物理-化學(xué)性質(zhì)例如以顆粒形式的交聯(lián)的透明質(zhì)酸之間產(chǎn)生酰胺鍵。與例如酯鍵相比，右旋糖酐-透明質(zhì)酸連接(接枝)中的酰胺鍵的使用已被發(fā)現(xiàn)是有利的，因為酰胺鍵對于在體內(nèi)的降解是更穩(wěn)定的。得到的交聯(lián)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品具有有用的穩(wěn)定性性質(zhì)并且因此適合作為真皮填充物以及適合于緩釋應(yīng)用。另一個優(yōu)點在于右旋糖酐分子經(jīng)由酰胺鍵至醚交聯(lián)的透明質(zhì)酸的接枝允許用右旋糖酐顯著改性交聯(lián)的透明質(zhì)酸而不誘導(dǎo)其解聚。

透明質(zhì)酸產(chǎn)品可以通過包括以下步驟的工藝制備：

(a)提供交聯(lián)的透明質(zhì)酸和一種或更多種官能化的右旋糖酐分子；

(b)將一種或更多種官能化的右旋糖酐分子共價地接枝至所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸。

根據(jù)某些實施方案，在步驟(a)中的交聯(lián)的透明質(zhì)酸呈凝膠顆粒的形式，所述凝膠顆粒具有在0.01mm-5mm、優(yōu)選地0.1mm-1mm的范圍內(nèi)的平均大小。

根據(jù)某些實施方案，得到的透明質(zhì)酸產(chǎn)品的一種或更多種右旋糖酐分子和交聯(lián)的透明質(zhì)酸的二糖具有0.1％-99％、優(yōu)選地1％-60％的摩爾比。

根據(jù)某些實施方案，在步驟(a)中提供的右旋糖酐分子具有小于10kDa、優(yōu)選地小于5kDa的平均分子量。

根據(jù)某些實施方案，右旋糖酐分子通過單一的端-點附接被共價地連接至所述透明質(zhì)酸。根據(jù)某些實施方案，右旋糖酐分子經(jīng)由在右旋糖酐的還原端與透明質(zhì)酸的羧基之間的雙官能連接基或多官能連接基通過單一的端-點附接被共價地連接至透明質(zhì)酸。

根據(jù)某些實施方案，在步驟(a)中提供的官能化的右旋糖酐分子在還原端處被雙官能連接基或多官能連接基官能化，所述雙官能連接基或多官能連接基具有可用于將右旋糖酐分子連接至所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸的羧基的至少一種官能團。

根據(jù)某些實施方案，雙官能連接基或多官能連接基包括獨立地選自以下的至少兩種官能團：氨基、酰肼、肼基甲酸酯、氨基脲、硫代氨基脲、硫代肼基甲酸酯或氨基氧基。根據(jù)某些實施方案，雙官能連接基或多官能連接基是二胺或二酰肼。根據(jù)某些實施方案，雙官能連接基或多官能連接基是六亞甲基二胺、2,2’-(亞乙基二氧基)雙(乙胺)、O,O’-1,3-丙二基雙羥胺、己二酸二酰肼或亞精胺。

根據(jù)某些實施方案，步驟(a)的一種或更多種官能化的右旋糖酐分子包含連接基，所述連接基具有氨基、酰肼、肼基甲酸酯、氨基脲、硫代氨基脲、硫代肼基甲酸酯或氨基氧基官能團，并且其中連接基的官能團與交聯(lián)的透明質(zhì)酸的羧基形成共價鍵。

根據(jù)某些實施方案，該工藝的步驟(a)還包括在還原端用雙官能連接基或多官能連接基使右旋糖酐分子官能化，所述雙官能連接基或多官能連接基具有可用于將右旋糖酐分子連接至交聯(lián)的透明質(zhì)酸的羧基的至少一種官能團。該工藝在反應(yīng)方案1中一般地描述。

反應(yīng)方案1.

雙官能連接基或多官能連接基可以具有通式X-R-Y，其中X是能夠與右旋糖酐的還原端形成鍵的官能團，并且其中X和Y可以是相同的官能團或兩種不同的官能團。R是合適的間隔基團，并且可以例如包括但不限于，烷基、烷氧基、醚、硫醚或類似物。官能團X能夠與開環(huán)形式的右旋糖酐的醛基反應(yīng)以便形成亞胺，該亞胺然后可以被還原劑還原以形成穩(wěn)定的鍵。連接基可以僅在右旋糖酐上的一個位點上，因為它在還原端基團處僅具有一個醛基，因此使得反應(yīng)是高度特異性的。官能團X可以例如是胺、酰肼、肼基甲酸酯、氨基脲、硫代氨基脲、硫代肼基甲酸酯或氨基氧基官能團。還原劑可以例如是NaCNBH₃、NaBH₄、STAB(三乙酰氧基硼氫化鈉)、或2-皮考啉硼烷絡(luò)合物。官能團Y可以任選地在與右旋糖酐的還原端反應(yīng)期間被合適的保護基(例如，叔丁氧基羰基(boc))保護，并且在偶聯(lián)至交聯(lián)的透明質(zhì)酸的羧基之間脫保護。用于使右旋糖酐分子官能化的合適的反應(yīng)條件包括在3-11的范圍內(nèi)的pH、在1h-48h的范圍內(nèi)的反應(yīng)時間、在20℃-60℃的范圍內(nèi)的反應(yīng)溫度、在1:1至50:1的范圍內(nèi)的連接基與右旋糖酐的摩爾比、以及在1:1至50:1的范圍內(nèi)的還原劑與右旋糖酐的摩爾比。

官能化的右旋糖酐(右旋糖酐-連接基)可以經(jīng)由連接基的游離官能團Y被接枝至交聯(lián)的透明質(zhì)酸，例如使用三嗪-或碳二亞胺-介導(dǎo)的酰胺化。該工藝在反應(yīng)方案2中一般地描述。

反應(yīng)方案2

交聯(lián)的透明質(zhì)酸的羧基與活化劑反應(yīng)以形成活性酯。官能團Y是能夠與活性酯反應(yīng)的官能團。官能團Y可以例如是胺、酰肼、肼基甲酸酯、氨基脲、硫代氨基脲、硫代肼基甲酸酯或氨基氧基官能團?；罨瘎┦呛线m的偶聯(lián)劑(例如，碳二亞胺偶聯(lián)劑以及活化劑例如羥胺衍生物、或三嗪)。官能團Y與活性酯反應(yīng)以將右旋糖酐接枝至交聯(lián)的透明質(zhì)酸。用于將官能化的右旋糖酐(右旋糖酐-連接基)接枝至交聯(lián)的透明質(zhì)酸的合適的反應(yīng)條件包括在3-12的范圍內(nèi)的pH、在1h-48h的范圍內(nèi)的反應(yīng)時間、在15℃-70℃的范圍內(nèi)的反應(yīng)溫度、在0.1:1至10:1的范圍內(nèi)的偶聯(lián)劑與透明質(zhì)酸羧基的摩爾比、在0.05:1至5:1的范圍內(nèi)的右旋糖酐-連接基與透明質(zhì)酸羧基的摩爾比以及在1mg/mL-50mg/mL的范圍內(nèi)的交聯(lián)的透明質(zhì)酸的濃度。

根據(jù)該工藝的某些實施方案，步驟(b)的接枝包括：

(i)用偶聯(lián)劑使交聯(lián)的透明質(zhì)酸上的羧基活化以形成活化的交聯(lián)的透明質(zhì)酸；和

(ii)將一種或更多種官能化的右旋糖酐分子的連接基偶聯(lián)至活化的交聯(lián)的透明質(zhì)酸的羧基。

根據(jù)某些實施方案，在步驟(b)中，同時發(fā)生交聯(lián)的透明質(zhì)酸的活化以及右旋糖酐分子至活化的交聯(lián)的透明質(zhì)酸的偶聯(lián)。

根據(jù)某些實施方案，在步驟(b)中，交聯(lián)的透明質(zhì)酸的活化在右旋糖酐分子至活化的交聯(lián)的透明質(zhì)酸的偶聯(lián)之前且與右旋糖酐分子至活化的交聯(lián)的透明質(zhì)酸的偶聯(lián)分開地發(fā)生。

根據(jù)某些實施方案，偶聯(lián)劑選自由以下組成的組：基于三嗪的偶聯(lián)劑、碳二亞胺偶聯(lián)劑、咪唑鎓衍生的偶聯(lián)劑、Oxyma和COMU。根據(jù)某些實施方案，偶聯(lián)劑是基于三嗪的偶聯(lián)劑。根據(jù)某些實施方案，基于三嗪的偶聯(lián)劑選自由以下組成的組：4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓氯化物(DMTMM)和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)。在優(yōu)選的實施方案中，基于三嗪的偶聯(lián)劑是DMTMM。

步驟(a)和(b)的另外的優(yōu)選的實施方案依據(jù)與得到的透明質(zhì)酸產(chǎn)品相關(guān)的上述描述是明顯的。特別地，步驟(b)還可以包括將交聯(lián)的透明質(zhì)酸尺寸縮減成顆粒、線、圓盤等等。

由于通過根據(jù)本發(fā)明的工藝可獲得的產(chǎn)品的性質(zhì)是復(fù)雜的，因此產(chǎn)品也可以被定義為是這些工藝的結(jié)果。

本發(fā)明人已驚異地發(fā)現(xiàn)，可能以高轉(zhuǎn)化率將右旋糖酐直接地接枝至交聯(lián)的透明質(zhì)酸。接枝優(yōu)選地經(jīng)由合適的連接基通過右旋糖酐至透明質(zhì)酸的共價的單一的端-點附接來進行。根據(jù)本發(fā)明的包含交聯(lián)的透明質(zhì)酸和一種或更多種右旋糖酐分子的透明質(zhì)酸產(chǎn)品展現(xiàn)出若干優(yōu)點以及令人驚異的性質(zhì)。

溶脹度以及因此的吸水能力通過將右旋糖酐接枝至透明質(zhì)酸凝膠的羧基被驚異地降低。在圖1中示出了溶脹度的這種降低。降低的溶脹是有用的，因為這意指可以產(chǎn)生較硬的凝膠，而不增大在透明質(zhì)酸中的交聯(lián)劑的量。

右旋糖酐接枝物被期望以保護水凝膠骨架免于熱降解，因為右旋糖酐相比透明質(zhì)酸對降解是更穩(wěn)定的?；趤碜酝该髻|(zhì)酸和右旋糖酐的混合水凝膠的熱重分析的結(jié)果，右旋糖酐的熱穩(wěn)定性已被示出為遠高于透明質(zhì)酸的熱穩(wěn)定性(圖2)。

右旋糖酐接枝以保護交聯(lián)的透明質(zhì)酸免于被例如軟骨素酶和玻璃酸酶酶降解，這歸因于可用的羧基的空間位阻和/或還原數(shù)目(對于酶功能是必需的)。

右旋糖酐接枝物被期望以保護水凝膠骨架免于水解，因為右旋糖酐中的1-6糖苷鍵比透明質(zhì)酸中的1-3和1-4糖苷鍵更具抗性。

用于通過酰胺鍵將右旋糖酐接枝至透明質(zhì)酸的合成方案涉及溫和且中性的條件，并且因此避免了玻尿酸骨架的不需要的降解。

根據(jù)本發(fā)明的工藝還通過改變所添加的官能化的右旋糖酐的量能夠?qū)崿F(xiàn)HA網(wǎng)絡(luò)的高度可控制的接枝比、取代或改性的程度(圖3).

右旋糖酐接枝物被相信以保護水凝膠骨架免于自由基降解，因為右旋糖酐相比HA水凝膠網(wǎng)絡(luò)可以更優(yōu)選地與自由基反應(yīng)。通過單一的端-點附接被附接至HA水凝膠的右旋糖酐對于自由基也將是更可用的。

最終，接枝是高度化學(xué)選擇性的且區(qū)域特異性的，因為雙官能連接基僅通過單一的端-點附接與右旋糖酐的還原端以及在HA水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的玻尿酸的羧酸反應(yīng)，產(chǎn)生了高度定義的結(jié)構(gòu)。

不希望受限于此，本發(fā)明將在下文中通過實施例的方式來闡釋。

實施例

表征

在右旋糖酐上的還原胺化

用連接基對右旋糖酐的改性利用¹H NMR和LC-QToF-MS來分析。

右旋糖酐至玻尿酸凝膠的接枝

水凝膠在分析之前用軟骨素酶ABC或HCl降解。在玻尿酸上的接枝的右旋糖酐的量利用¹H NMR光譜學(xué)來分析。

進行LC-QToF-MS分析以確認右旋糖酐-連接基-玻尿酸之間的連接，但前提是材料可以用酶降解。

溶脹在鹽水中進行。

實施例1-右旋糖酐的還原胺化

將具有750Da的數(shù)均分子量(M_n)的50.0g右旋糖酐、118.4g六亞甲基二胺二鹽酸鹽和39.4g NaCNBH₃稱重于500mL玻璃瓶中。將反應(yīng)物溶解在250g 50mM四硼酸鈉緩沖液中。用1M NaOH將pH調(diào)節(jié)至pH 9.8。將瓶子置于60℃的水浴中持續(xù)3h。

將反應(yīng)粗產(chǎn)物用稀HCl中和至pH 7并且轉(zhuǎn)移至3L塑料燒杯中。在用頂置式攪拌器攪拌并且使用蠕動泵緩慢添加乙醇直到最終的乙醇濃度為90％時，反應(yīng)粗產(chǎn)物沉淀。將沉淀物用90％乙醇洗滌多次以完全地除去未鍵合的反應(yīng)化學(xué)品并且在真空干燥器中干燥。

將干燥的粉末溶解在D₂O中并且通過¹H NMR來分析。通過比較來自右旋糖酐的異頭質(zhì)子的信號(4.94ppm)與六亞甲基二胺信號(1.33ppm)發(fā)現(xiàn)的是，樣品中的總右旋糖酐的87％被偶聯(lián)至六亞甲基二胺。

實施例2-麥芽三糖的還原胺化

將1.0g麥芽三糖、1.9g六亞甲基二胺二鹽酸鹽和0.7g NaCNBH₃稱重于20mL的具有鋁蓋的玻璃小瓶中。將反應(yīng)物溶解在5g 50mM四硼酸鈉緩沖液中。用1M NaOH將pH調(diào)節(jié)至10。然后將小瓶置于60℃的水浴中持續(xù)3h。

反應(yīng)粗產(chǎn)物用稀HCl中和至pH 7。粗產(chǎn)物在稀釋之后在LC-QToF-MS上使用負電噴霧來分析。發(fā)現(xiàn)的是，溶液包含80面積％的麥芽三糖-HMDA(m/z 603.30)、10面積％的麥芽三糖-HMDA-麥芽三糖(m/z 1091.47)和10面積％的還原的麥芽三糖(m/z 505.18)構(gòu)成。

實施例3-右旋糖酐的還原胺化

將具有M_n 1100Da的5.0g右旋糖酐、5.4g亞精胺三鹽酸鹽和1.6g NaCNBH₃稱重于50mL玻璃瓶中。將反應(yīng)物溶解在14.3g 50mM四硼酸鈉緩沖液中。用1M NaOH將pH調(diào)節(jié)至pH 9.3。將瓶子置于60℃的水浴中持續(xù)2h。

反應(yīng)粗產(chǎn)物用稀HCl中和至pH 7并且轉(zhuǎn)移至3L塑料燒杯中。在用頂置式攪拌器攪拌并且使用蠕動泵緩慢添加乙醇直到最終的乙醇濃度為90％時，反應(yīng)粗產(chǎn)物沉淀。沉淀物用90％乙醇洗滌多次以完全地除去未鍵合的反應(yīng)化學(xué)品并且在真空干燥器中干燥。

將干燥的粉末溶解在D₂O中并且通過¹H NMR來分析。確認的是，當(dāng)來自右旋糖酐的異頭質(zhì)子的信號(4.94ppm)與亞精胺信號(1.76ppm)相比時，右旋糖酐被亞精胺改性。

實施例4-右旋糖酐的還原胺化

將具有M_n 1100Da的5.0g右旋糖酐、3.4g 2,2’-(亞乙基二氧基)雙(乙胺)和1.5g NaCNBH₃稱重于50mL玻璃瓶中。將反應(yīng)物溶解在15.0g 50mM四硼酸鈉緩沖液中。用1M NaOH將pH調(diào)節(jié)至10.3。將瓶子置于60℃的水浴中持續(xù)2h。

反應(yīng)粗產(chǎn)物用稀HCl中和至pH 7并且轉(zhuǎn)移至3L塑料燒杯中。在用頂置式攪拌器攪拌并且使用蠕動泵緩慢添加乙醇直到最終的乙醇濃度為90％時，反應(yīng)粗產(chǎn)物沉淀。沉淀物用90％乙醇洗滌多次以完全地除去未鍵合的反應(yīng)化學(xué)品并且在真空干燥器中干燥。

將干燥的粉末溶解在D₂O中并且通過¹H NMR來分析。確認的是，當(dāng)來自右旋糖酐的異頭質(zhì)子的信號(4.94ppm)與2,2’-(亞乙基二氧基)雙(乙胺)信號(3.20ppm)相比時，右旋糖酐被2,2’-(亞乙基二氧基)雙(乙胺)改性。

實施例5-右旋糖酐的還原胺化

將具有M_n 1100Da的5.1g右旋糖酐、4.1g O,O’-1,3-丙二基雙羥胺二鹽酸鹽和1.5g NaCNBH₃稱重于50mL玻璃瓶中。將反應(yīng)物溶解在13.4g 50mM四硼酸鈉緩沖液中。用1M NaOH將pH調(diào)節(jié)至9.7。將瓶子置于60℃的水浴中持續(xù)2h。

反應(yīng)粗產(chǎn)物用稀HCl中和至pH 7并且轉(zhuǎn)移至3L塑料燒杯中。在用頂置式攪拌器攪拌并且使用蠕動泵緩慢添加乙醇直到最終的乙醇濃度為90％時，反應(yīng)粗產(chǎn)物沉淀。沉淀物用90％乙醇洗滌多次以完全地除去未鍵合的反應(yīng)化學(xué)品并且在真空干燥器中干燥。

將干燥的粉末溶解在D₂O中并且通過¹H NMR來分析。確認的是，當(dāng)來自右旋糖酐的異頭質(zhì)子的信號(4.94ppm)與O,O’-1,3-丙二基雙羥胺信號(4.18ppm)相比時，右旋糖酐被O,O’-1,3-丙二基雙羥胺改性。

實施例6-右旋糖酐的還原胺化

將具有M_n 1100Da的5.0g右旋糖酐、4.1g己二酸二酰肼和1.7gNaCNBH₃稱重于50mL玻璃瓶中。將反應(yīng)物溶解在13.5g 50mM四硼酸鈉緩沖液中。用1M NaOH將pH調(diào)節(jié)至9.5。將瓶子置于60℃的水浴中持續(xù)2h。

反應(yīng)粗產(chǎn)物用稀HCl中和至pH 7并且轉(zhuǎn)移至3L塑料燒杯中。在用頂置式攪拌器攪拌并且使用蠕動泵緩慢添加乙醇直到最終的乙醇濃度為90％時，反應(yīng)粗產(chǎn)物沉淀。沉淀物用90％乙醇洗滌多次以完全地除去未鍵合的反應(yīng)化學(xué)品并且在真空干燥器中干燥。

將干燥的粉末溶解在D₂O中并且通過¹H NMR來分析。確認的是，當(dāng)來自右旋糖酐的異頭質(zhì)子的信號(4.94ppm)與己二酸二酰肼信號(1.60ppm)相比時，右旋糖酐被己二酸二酰肼改性。

實施例7至13-官能化的右旋糖酐至玻尿酸凝膠的接枝

在實施例7-13中，官能化的右旋糖酐分子被接枝至透明質(zhì)酸水凝膠。透明質(zhì)酸凝膠根據(jù)在國際專利申請WO 97/04012(Agerup等人)的實施例1和2中描述的一般程序來制備。

實施例7-13中使用的術(shù)語轉(zhuǎn)化率定義為接枝的改性的右旋糖酐的摩爾數(shù)除以在反應(yīng)中使用的改性的右旋糖酐的總摩爾數(shù)。

實施例7-將具有六亞甲基二胺的右旋糖酐(1kDa)接枝至水凝膠

將在還原端處用六亞甲基二胺改性的1.1g右旋糖酐1kDa和5.6gDMTMM稱重于100mL玻璃瓶中。添加80g 1mM磷酸鹽緩沖液pH 7.4以溶解反應(yīng)物。在攪拌的同時將1.6g沉淀的玻尿酸水凝膠添加至反應(yīng)溶液，使得獲得了濃度為20mg/mL的玻尿酸。將樣品置于50℃水浴中并且允許反應(yīng)持續(xù)一天。

水凝膠被減小粒度并且在0.2μm過濾器上用0.9％NaCl洗滌一次。用0.25M NaOH使pH增加至13。在90分鐘之后，用稀HCl將水凝膠中和至中性pH。凝膠用0.9％NaCl連續(xù)地洗滌，并且然后通過用頂置式攪拌器攪拌該凝膠并且用蠕動泵緩慢添加乙醇直到70％乙醇來沉淀。沉淀物用70％乙醇洗滌數(shù)次。然后，沉淀的水凝膠在真空干燥器中干燥。

¹H NMR示出了通過比較右旋糖酐(4.94ppm)的異頭質(zhì)子與HA(2.02ppm)的N-乙?；|(zhì)子得到的27％的改性度(右旋糖酐鏈的摩爾數(shù)/HA二糖重復(fù)單元的摩爾數(shù))。右旋糖酐在反應(yīng)中的轉(zhuǎn)化率為85％。偶聯(lián)的右旋糖酐-連接基-HA用LC-QToF-MS來確認。凝膠的初始溶脹因子為1.6mL/g并且在反應(yīng)后其已降低至0.9mL/g。

實施例8-將具有六亞甲基二胺的右旋糖酐(1kDa)接枝至水凝膠

將在還原端處用六亞甲基二胺改性的3.5g右旋糖酐1kDa和5.6g DMTMM稱重于100mL玻璃瓶中。添加80g 1mM磷酸鹽緩沖液pH 7.4以溶解反應(yīng)物。在攪拌的同時將1.6g沉淀的玻尿酸水凝膠添加至反應(yīng)溶液，使得獲得了濃度為20mg/mL的玻尿酸。將樣品置于50℃水浴中并且允許反應(yīng)持續(xù)一天。

水凝膠被減小粒度并且在0.2μm過濾器上用0.9％NaCl洗滌一次。用0.25M NaOH使pH增加至13。在90分鐘之后，用稀HCl將水凝膠中和至中性pH。凝膠用0.9％NaCl連續(xù)地洗滌，并且然后通過用頂置式攪拌器攪拌該凝膠并且用蠕動泵緩慢添加乙醇直到70％乙醇來沉淀。沉淀物用70％乙醇洗滌若干次。然后，沉淀的水凝膠在真空干燥器中干燥。

¹H NMR示出了通過比較右旋糖酐(4.94ppm)的異頭質(zhì)子與HA(2.02ppm)的N-乙酰基質(zhì)子得到的47％的改性度(右旋糖酐鏈的摩爾數(shù)/HA二糖重復(fù)單元的摩爾數(shù))。右旋糖酐在反應(yīng)中的轉(zhuǎn)化率為46％。偶聯(lián)的右旋糖酐-連接基-HA用LC-QToF-MS來確認。凝膠的初始溶脹因子為5.1mL/g并且在反應(yīng)后其已降低至2.7mL/g。

實施例9-將具有亞精胺的右旋糖酐(1kDa)接枝至水凝膠

將在還原端處用亞精胺改性的0.5g右旋糖酐1kDa和0.6g DMTMM稱重于50mL塑料瓶中。添加20g 1mM磷酸鹽緩沖液pH 7.4以溶解反應(yīng)物。用稀HCl將溶液的pH調(diào)節(jié)為7.0。在攪拌的同時將0.4g沉淀的玻尿酸水凝膠添加至反應(yīng)溶液，使得獲得了濃度為20mg/mL的玻尿酸。將樣品置于50℃水浴中并且允許反應(yīng)持續(xù)一天。

水凝膠被減小粒度并且在0.2μm過濾器上用0.9％NaCl洗滌一次。用0.25M NaOH使pH增加至13。在70分鐘之后，用稀HCl將水凝膠中和至中性pH。將凝膠轉(zhuǎn)移至聯(lián)接至蠕動泵的柱中。水凝膠通過從底部泵送2.5L 0.9％NaCl到頂部來連續(xù)地洗滌。然后，凝膠從柱被除去并且分析。

¹H NMR示出了通過比較右旋糖酐(4.94ppm)的異頭質(zhì)子與HA(2.02ppm)的N-乙酰基質(zhì)子得到的18％的改性度(右旋糖酐鏈的摩爾數(shù)/HA二糖重復(fù)單元的摩爾數(shù))。右旋糖酐在反應(yīng)中的轉(zhuǎn)化率為78％。偶聯(lián)的右旋糖酐-連接基-HA不能用LC-QToF-MS確認，因為材料未被軟骨素酶ABC完全地降解。

實施例10-將具有2,2’-(亞乙基二氧基)雙(乙胺)的右旋糖酐(1kDa)接枝至水凝膠

將在還原端處用2,2’-(亞乙基二氧基)雙(乙胺)改性的0.5g右旋糖酐1kDa和0.6g DMTMM稱重于50mL塑料瓶中。添加20g 1mM磷酸鹽緩沖液pH 7.4以溶解反應(yīng)物。用稀HCl將溶液的pH調(diào)節(jié)為7.1。在攪拌的同時將0.4g沉淀的玻尿酸水凝膠添加至反應(yīng)溶液，使得獲得了濃度為20mg/mL的玻尿酸。將樣品置于50℃水浴中并且允許反應(yīng)持續(xù)一天。

水凝膠被減小粒度并且在0.2μm過濾器上用0.9％NaCl洗滌一次。用0.25M NaOH使pH增加至13。在70分鐘之后，用稀HCl將水凝膠中和至中性pH。將水凝膠轉(zhuǎn)移至聯(lián)接至蠕動泵的柱中。凝膠通過從底部泵送2.5L 0.9％NaCl到頂部來連續(xù)地洗滌。然后，凝膠從柱被除去并且分析。

¹H NMR示出了通過比較右旋糖酐(4.94ppm)的異頭質(zhì)子與HA(2.02ppm)的N-乙?；|(zhì)子得到的21％的改性度(右旋糖酐鏈的摩爾數(shù)/HA二糖重復(fù)單元的摩爾數(shù))。右旋糖酐在反應(yīng)中的轉(zhuǎn)化率為90％。偶聯(lián)的右旋糖酐-連接基-HA用LC-QToF-MS確認。

實施例11-將具有O,O’-1,3-丙二基雙羥胺的右旋糖酐(1kDa)接枝至水凝膠

將在還原端處用O,O’-1,3-丙二基雙羥胺改性的0.5g右旋糖酐1kDa和0.6g DMTMM稱重于50mL塑料瓶中。添加20g 1mM磷酸鹽緩沖液pH 7.4以溶解反應(yīng)物。用稀HCl將溶液的pH調(diào)節(jié)為6.9。在攪拌的同時將0.4g沉淀的玻尿酸水凝膠添加至反應(yīng)溶液，使得獲得了濃度為20mg/mL的玻尿酸。將樣品置于50℃水浴中并且允許反應(yīng)持續(xù)一天。

水凝膠被減小粒度并且在0.2μm過濾器上用0.9％NaCl洗滌一次。用0.25M NaOH使pH增加至13。在75分鐘之后，用稀HCl將水凝膠中和至中性pH。將水凝膠轉(zhuǎn)移至聯(lián)接至蠕動泵的柱中。凝膠通過從底部泵送2.5L 0.9％NaCl到頂部來連續(xù)地洗滌。然后，凝膠從柱被除去并且分析。

¹H NMR示出了通過比較右旋糖酐(4.94ppm)的異頭質(zhì)子與HA(2.02ppm)的N-乙酰基質(zhì)子得到的11％的改性度(右旋糖酐鏈的摩爾數(shù)/HA二糖重復(fù)單元的摩爾數(shù))。右旋糖酐在反應(yīng)中的轉(zhuǎn)化率為49％。偶聯(lián)的右旋糖酐-連接基-HA用LC-QToF-MS確認。

實施例12-將具有己二酸二酰肼的右旋糖酐(1kDa)接枝至水凝膠

將在還原端處用己二酸二酰肼改性的0.5g右旋糖酐1kDa和0.6g DMTMM稱重于50mL塑料瓶中。添加20g 1mM磷酸鹽緩沖液pH 7.4以溶解反應(yīng)物。用稀HCl將溶液的pH調(diào)節(jié)為7.1。在攪拌的同時將0.4g沉淀的玻尿酸水凝膠添加至反應(yīng)溶液，使得獲得了濃度為20mg/mL的玻尿酸。將樣品置于50℃水浴中并且允許反應(yīng)持續(xù)一天。

水凝膠被減小粒度并且在0.2μm過濾器上用0.9％NaCl洗滌一次。用0.25M NaOH使pH增加至13。在75分鐘之后，用稀HCl將水凝膠中和至中性pH。將水凝膠轉(zhuǎn)移至聯(lián)接至蠕動泵的柱中。凝膠通過從底部泵送2.5L 0.9％NaCl到頂部來連續(xù)地洗滌。然后，凝膠從柱被除去并且分析。

¹H NMR示出了通過比較右旋糖酐(4.94ppm)的異頭質(zhì)子與HA(2.02ppm)的N-乙?；|(zhì)子得到的5％的改性度(右旋糖酐鏈的摩爾數(shù)/HA二糖重復(fù)單元的摩爾數(shù))。右旋糖酐在反應(yīng)中的轉(zhuǎn)化率為20％。偶聯(lián)的右旋糖酐-連接基-HA不能用LC-QToF-MS確認，因為材料未被軟骨素酶ABC完全地降解。

實施例13-將具有六亞甲基二胺的麥芽三糖接枝至水凝膠

將在還原端處用六亞甲基二胺改性的0.3g麥芽三糖和0.6g DMTMM稱重于50mL塑料瓶中。添加20g 1mM磷酸鹽緩沖液pH 7.4以溶解反應(yīng)物。用稀HCl將溶液的pH調(diào)節(jié)為7.0。在攪拌的同時將0.4g沉淀的玻尿酸水凝膠添加至反應(yīng)溶液，使得獲得了濃度為20mg/mL的玻尿酸。將樣品置于50℃水浴中并且允許反應(yīng)持續(xù)一天。

水凝膠被減小粒度并且在0.2μm過濾器上用0.9％NaCl洗滌一次。用0.25M NaOH使pH增加至13。在80分鐘之后，用稀HCl將水凝膠中和至中性pH。將水凝膠轉(zhuǎn)移至聯(lián)接至蠕動泵的柱中。凝膠通過從底部泵送2.5L 0.9％NaCl到頂部來連續(xù)地洗滌。然后，凝膠從柱被除去并且分析。

¹H NMR示出了通過比較麥芽三糖(4.94ppm)的異頭質(zhì)子與HA(2.02ppm)的N-乙?；|(zhì)子得到的10％的改性度(麥芽三糖鏈的摩爾數(shù)/HA二糖重復(fù)單元的摩爾數(shù))。麥芽三糖在反應(yīng)中的轉(zhuǎn)化率為43％。偶聯(lián)的麥芽三糖-連接基-HA用LC-QToF-MS確認。

權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)

1.一種透明質(zhì)酸產(chǎn)品，包含交聯(lián)的透明質(zhì)酸和一種或更多種右旋糖酐分子，其中所述透明質(zhì)酸通過醚鍵交聯(lián)，并且所述一種或更多種右旋糖酐分子被共價地接枝至所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸，其中所述右旋糖酐分子經(jīng)由在右旋糖酐的還原端與透明質(zhì)酸的羧基之間的雙官能連接基或多官能連接基通過單一的端-點附接被共價地連接至所述透明質(zhì)酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其中所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸呈凝膠的形式。

3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其中所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸呈凝膠顆粒的形式，所述凝膠顆粒具有在0.01mm-5mm、優(yōu)選地0.1mm-1mm的范圍內(nèi)的平均大小。

4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其中透明質(zhì)酸鏈經(jīng)由連接基彼此交聯(lián)，所述連接基衍生自雙官能交聯(lián)劑或多官能交聯(lián)劑。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其中所述雙官能交聯(lián)劑或多官能交聯(lián)劑是雙環(huán)氧化物或多環(huán)氧化物。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其中所述雙官能交聯(lián)劑或多官能交聯(lián)劑是二縮水甘油醚。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其中所述雙官能交聯(lián)劑或多官能交聯(lián)劑選自由以下組成的組：1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)、1,2-雙(2,3-環(huán)氧丙氧基)乙烯(EGDGE)和乙二醇二縮水甘油醚(EGDE)、1,2-乙二醇二縮水甘油醚(EDDE)以及二環(huán)氧辛烷。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其中所述雙官能交聯(lián)劑或多官能交聯(lián)劑是1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)。

9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其中所述一種或更多種右旋糖酐分子和所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸的二糖具有0.1％-99％的摩爾比。

10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其中所述一種或更多種右旋糖酐分子和所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸的二糖具有1％-60％的摩爾比。

11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其中所述右旋糖酐分子具有小于10kDa的平均分子量。

12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其中所述右旋糖酐分子具有小于5kDa的平均分子量。

13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其中所述右旋糖酐分子包含連接基，所述連接基具有氨基、酰肼、肼基甲酸酯、氨基脲、硫代氨基脲、硫代肼基甲酸酯或氨基氧基官能團，并且其中所述連接基的官能團與所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸的羧基形成共價鍵。

14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其中所述雙官能連接基或多官能連接基包括二胺或二酰肼。

15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，其中所述一種或更多種右旋糖酐分子通過酰胺鍵被共價地接枝至所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸。

16.一種制備透明質(zhì)酸產(chǎn)品的工藝，所述透明質(zhì)酸產(chǎn)品包含交聯(lián)的透明質(zhì)酸和一種或更多種右旋糖酐分子，所述工藝包括以下步驟：

(a)提供交聯(lián)的透明質(zhì)酸和一種或更多種官能化的右旋糖酐分子；

(b)將一種或更多種官能化的右旋糖酐分子共價地接枝至所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸；

其中在步驟(a)中提供的所述官能化的右旋糖酐分子在還原端處被雙官能連接基或多官能連接基官能化，所述雙官能連接基或多官能連接基具有可用于將所述右旋糖酐分子連接至所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸的羧基的至少一種官能團。

17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的工藝，其中在步驟(a)中的所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸呈凝膠的形式。

18.根據(jù)權(quán)利要求16-17中任一項所述的工藝，其中在步驟(a)中的所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸呈凝膠顆粒的形式，所述凝膠顆粒具有在0.01mm-5mm、優(yōu)選地0.1mm-1mm的范圍內(nèi)的平均大小。

19.根據(jù)權(quán)利要求16-18中任一項所述的工藝，其中得到的透明質(zhì)酸產(chǎn)品中的所述一種或更多種右旋糖酐分子和所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸的二糖具有0.1％-99％的摩爾比。

20.根據(jù)權(quán)利要求16-19中任一項所述的工藝，其中得到的透明質(zhì)酸產(chǎn)品中的所述一種或更多種右旋糖酐分子和所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸的二糖具有1％-60％的摩爾比。

21.根據(jù)權(quán)利要求16-20中任一項所述的工藝，其中在步驟(a)中提供的所述右旋糖酐分子具有小于10kDa的平均分子量。

22.根據(jù)權(quán)利要求16-21中任一項所述的工藝，其中在步驟(a)中提供的所述右旋糖酐分子具有小于5kDa的平均分子量。

23.根據(jù)權(quán)利要求16-22中任一項所述的工藝，其中步驟(a)的所述一種或更多種官能化的右旋糖酐分子包含連接基，所述連接基具有氨基、酰肼、肼基甲酸酯、氨基脲、硫代氨基脲、硫代肼基甲酸酯或氨基氧基官能團，并且其中所述連接基的官能團與所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸的羧基形成共價鍵。

24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的工藝，其中所述雙官能連接基或多官能連接基包括二胺或二酰肼。

25.根據(jù)權(quán)利要求16-24中任一項所述的工藝，其中步驟(b)的共價接枝包括：

(i)用偶聯(lián)劑使所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸上的所述羧基活化，以形成活化的交聯(lián)的透明質(zhì)酸；以及

(ii)將所述一種或更多種官能化的右旋糖酐分子的所述連接基偶聯(lián)至所述活化的交聯(lián)的透明質(zhì)酸的所述羧基。

26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的工藝，其中，在步驟(b)中，所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸的所述活化和所述右旋糖酐分子至所述活化的交聯(lián)的透明質(zhì)酸的所述偶聯(lián)同時發(fā)生。

27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的工藝，其中，在步驟(b)中，所述交聯(lián)的透明質(zhì)酸的所述活化在所述一種或更多種右旋糖酐分子至所述活化的交聯(lián)的透明質(zhì)酸的所述偶聯(lián)之前且與所述一種或更多種右旋糖酐分子至所述活化的交聯(lián)的透明質(zhì)酸的所述偶聯(lián)分開地發(fā)生。

28.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項所述的工藝，其中所述偶聯(lián)劑選自由以下組成的組：基于三嗪的偶聯(lián)劑、碳二亞胺偶聯(lián)劑、咪唑鎓衍生的偶聯(lián)劑、Oxyma和COMU。

29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的工藝，其中所述偶聯(lián)劑是基于三嗪的偶聯(lián)劑。

30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的工藝，其中所述基于三嗪的偶聯(lián)劑選自由以下組成的組：4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓氯化物(DMTMM)和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)。

31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的工藝，其中所述基于三嗪的偶聯(lián)劑是DMTMM。

32.一種透明質(zhì)酸產(chǎn)品，通過根據(jù)權(quán)利要求16-31中任一項所述的工藝是可獲得的。

33.根據(jù)權(quán)利要求1-15或32中任一項所述的透明質(zhì)酸產(chǎn)品用作真皮填充物的用途。