本發(fā)明涉及癌癥治療。特別地，本發(fā)明涉及用于癌癥治療的溶瘤性痘苗病毒和病毒載體。

背景技術(shù)：

盡管微創(chuàng)手術(shù)、超分割放療和化療藥物新組合方面取得了進(jìn)展，但是許多類型的實(shí)體瘤患者的存活率仍保持不變。溶瘤病毒是治療對(duì)常規(guī)治療有抗性的癌癥的一種有吸引力的治療劑。溶瘤病毒是能夠特異性靶向并殺死癌細(xì)胞的病毒。此外，溶瘤病毒還可以提供提高宿主自身抗癌反應(yīng)所必需的免疫刺激信號(hào)。

痘苗病毒是雙鏈DNA病毒，其具有許多使其具有溶瘤治療吸引力的候選項(xiàng)的特征。其能夠快速復(fù)制，有效擴(kuò)散到腫瘤以及強(qiáng)溶解能力。此外，痘苗已經(jīng)得到廣泛研究，并且具有被清楚理解的分子生物學(xué)，具有高克隆能力和多種商業(yè)可用的天然和合成啟動(dòng)子，使其成為攜帶異源核酸序列的載體的理想選擇。痘苗具有良好的安全性，并且容易獲得對(duì)不受控制的感染的治療。此外，通常在實(shí)體瘤中發(fā)現(xiàn)的缺氧微環(huán)境，不利于許多類型的溶瘤病毒的復(fù)制和發(fā)揮功效，但不會(huì)對(duì)痘苗病毒的復(fù)制和功效不利。

已報(bào)道了溶瘤痘苗病毒的幾種菌株，例如Western Reserve，Wyeth和Lister菌株。已經(jīng)創(chuàng)建了每一種所述菌株的各種缺失突變體。McCart等人(Cancer Res.2001,61；8751-8757)描述了一種在胸苷激酶(TK)基因和病毒生長(zhǎng)因子(VGF)基因中具有缺失的Western Reserve(WR)株。這些缺失突變體能夠有效地交叉觸發(fā)針對(duì)腫瘤抗原的免疫系統(tǒng)。然而，生物分布研究表明，其在正常卵巢組織中具有顯著病毒滴度而在骨髓中則較小，提高了痘苗病毒治療后發(fā)生不育和骨髓抑制的預(yù)期。Hung等人(Gene Therapy,2007,14；20–29)描述了一種TK缺陷型痘苗Lister菌株。然而，觀察到該菌株還在卵巢腫瘤之外的正常卵巢中定位。

將異源基因例如細(xì)胞因子編碼基因插入病毒中，可以進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)免疫應(yīng)答。然而，細(xì)胞因子的插入可以通過早期病毒清除來降低病毒復(fù)制功效。這確實(shí)已用”武裝”有一些免疫調(diào)節(jié)基因如IL-2，IL-15，TNF和CD40配體的痘苗病毒在體內(nèi)觀察到。

盡管溶瘤病毒領(lǐng)域已經(jīng)取得了進(jìn)展，但是市場(chǎng)上尚無基于痘苗的治療產(chǎn)品。因此，需要更有效的溶瘤性痘苗來治療癌癥。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供改進(jìn)的溶瘤性痘苗病毒。本申請(qǐng)的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中，具有失活的N1L基因的TK缺陷型痘苗病毒株顯示出比現(xiàn)有技術(shù)更強(qiáng)的選擇性和抗腫瘤功效。本發(fā)明還提供了痘苗病毒載體。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的第一方面提供了包含至少三種痘苗病毒啟動(dòng)子的核酸序列，其中所述至少三種啟動(dòng)子以相同取向位于核酸序列中。

線性DNA具有兩種可能取向：5'至3'方向和3'至5'方向。例如，如果一個(gè)啟動(dòng)子位于5'至3'方向，并且如果第二啟動(dòng)子也位于相同多核苷酸分子/鏈內(nèi)的5'至3'方向，則兩個(gè)啟動(dòng)子的位置具有相同取向。

核酸序列可以是天然的、合成的或重組的。它可以是例如cDNA、PCR產(chǎn)物或基因組序列。其可以是分離的，或作為質(zhì)粒、載體或宿主細(xì)胞的一部分。質(zhì)粒是具有獨(dú)立于染色體DNA復(fù)制的能力的環(huán)狀染色體外DNA分子。

質(zhì)?？捎糜趯⒈磉_(dá)盒導(dǎo)入宿主細(xì)胞。質(zhì)粒也可以用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽。例如，可以用能夠編碼特定多肽的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)菌宿主細(xì)胞，以便表達(dá)該多肽。該術(shù)語還包括能夠容納DNA更長(zhǎng)部分的酵母人工染色體和細(xì)菌人工染色體。

啟動(dòng)子是具有可啟動(dòng)特定基因轉(zhuǎn)錄的特異性序列的DNA區(qū)域。用于在痘苗中表達(dá)異源基因的啟動(dòng)子，包括控制早期和晚期轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，例如mH5、H5、P7.5和PE/L。本申請(qǐng)所述的異源基因，是病毒中通常不存在的基因。修飾的H5啟動(dòng)子(mH5)主要具有早期活性，且具有比天然存在的H5更高的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，所述至少三個(gè)啟動(dòng)子是mH5。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，啟動(dòng)子包含與圖1所示序列基本上同源的核苷酸序列。具有大于20％一致性(例如25％，30％，40％，50％60％，70％，80％，90％，95％或99％)則認(rèn)為是同源序列。如本申請(qǐng)所述，基本上同源是指表現(xiàn)出至少60％或70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％，96％，97％，98％，99％％或更高的一致性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述序列與如圖1中所示的序列集具有至少80％或更高(例如，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％等)的一致性。

如本申請(qǐng)所使用的術(shù)語同源性和一致性是可互換的。

用于確定同源性的序列比較，可以使用容易獲得的序列比較軟件來進(jìn)行。示例包括但不限于BLAST(參見Ausubel et al.,1999Short Protocols in Molecular Biology,4th Ed-第18章)和FASTA((Altschul et al.,1990J.Mol.Biol.403-410)。BLAST和FASTA都可用于離線和在線搜索(參見Ausubel et al.,1999,Short Protocols in Molecular Biology，第7-58至7-60頁)。

在第一方面的一個(gè)實(shí)施例中，核酸序列存在于載體中。如本申請(qǐng)所述的載體是指，用于將核酸序列引入細(xì)胞或病毒中以進(jìn)行表達(dá)或復(fù)制的構(gòu)建體。其是指重組構(gòu)建體，例如質(zhì)粒、病毒或能夠在引入細(xì)胞或病毒后表達(dá)或復(fù)制核酸序列的任何其它構(gòu)建體。

第一方面的核酸序列可以是表達(dá)盒的一部分。表達(dá)盒是載體的一部分。其包含啟動(dòng)子、開放閱讀框和3'非翻譯區(qū)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，痘苗病毒載體包含與圖2所示序列具有至少80％或更高(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)同源性的核苷酸序列。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，核酸序列編碼異源多肽。

本申請(qǐng)所述的多肽，是指通過肽鍵連接在一起的多個(gè)氨基酸殘基。其可與蛋白質(zhì)、肽、寡肽互換使用，并且包括糖蛋白及其衍生物。術(shù)語“多肽”還旨在涵蓋保有與原始多肽相同生物學(xué)功能或活性的多肽類似物和衍生物。

如本申請(qǐng)所述的異源多肽是指，通常不由天然病毒表達(dá)的任何多肽。異源多肽可以是生物活性的。如本申請(qǐng)所述的生物活性多肽，是指具有生物學(xué)功能或活性的多肽。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，生物活性多肽是治療性的。治療性多肽是已經(jīng)或正在開發(fā)的用于治療用途的多肽。治療性多肽的示例包括但不限于細(xì)胞因子，趨化因子和生長(zhǎng)因子。

細(xì)胞因子可以是免疫調(diào)節(jié)劑，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35和IL-36)、干擾素(INF-α、INF-β、INF-γ和INF-ω)、腫瘤壞死因子(TNF)和/或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，多肽是白細(xì)胞介素。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，多肽是IL-12。IL-12可以來自任何動(dòng)物，例如人(hIL-12)、小鼠(mIL-12)、馬、牛、豬等。它可以是天然的或重組的。優(yōu)選地，編碼IL-12的核苷酸序列是全長(zhǎng)IL-12基因。在其它實(shí)施例中，核苷酸序列編碼全長(zhǎng)基因的30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％基因。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，該多肽是GM-CSF，或該多肽可以是IL-21。如上所述的涉及IL-12的所有特征應(yīng)比照適用于GM-CSF和IL-21。

本申請(qǐng)所稱的IL-12，包括IL-12A(例如GenBank索引號(hào)AF404773.1GI:15128214)和/或IL-12B(例如GenBank索引號(hào)AY008847.1GI:11192034)。兩個(gè)亞基均包括在成熟IL-12蛋白中。本申請(qǐng)所稱的IL-21包括同種型1(例如GenBank索引號(hào)NP_068575.1GI:11141875)和/或同種型2(GenBank索引號(hào)NP_001193935.1GI:333033767)。本申請(qǐng)中所稱的GM-CSF包括GenBank索引號(hào)AF373868.2GI:14278709。通常，所述序列是人序列。

異源多肽也可以是報(bào)告子多肽。如本申請(qǐng)所述的報(bào)告子多肽是指其表達(dá)可指示宿主細(xì)胞或病毒中所存在的核酸序列、表達(dá)盒或載體的多肽。報(bào)告子多肽的示例包括但不限于熒光多肽、化學(xué)發(fā)光多肽、生物發(fā)光多肽、磷光多肽以及酶。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，報(bào)告子多肽是熒光多肽。熒光多肽包括但不限于綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白及其衍生物。

限制性位點(diǎn)是由限制酶識(shí)別和切割的特異性核苷酸序列。限制酶的示例為SalI、BglII、HindIII、SmaI、BamHI和MluI。BamHI限制性位點(diǎn)是由BamHI識(shí)別的限制性位點(diǎn)。其他酶的限制性位點(diǎn)亦類似命名。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，核酸序列或載體包含一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例是包含SalI、BglII、HindIII、SmaI、BamHI和MluI限制性位點(diǎn)的核酸序列或載體。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，核酸序列或載體包含在痘苗病毒中。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，核酸序列具有圖3所示的通式。

痘苗已經(jīng)進(jìn)化出了許多策略來回避宿主免疫系統(tǒng)。例如，病毒分泌許多蛋白質(zhì)來抑制參與宿主抗病毒反應(yīng)的細(xì)胞因子和趨化因子。這樣的蛋白質(zhì)之一是N1基因產(chǎn)物N1L，其被認(rèn)為抑制感染細(xì)胞的凋亡以及NF-kB活化。NF-kB是控制參與病毒清除的許多細(xì)胞因子的產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子。已發(fā)現(xiàn)N1L基因缺失會(huì)導(dǎo)致由NF-kB控制的促炎抗病毒細(xì)胞因子(例如IL1β、TNFα和IFNα/β)的增加。還發(fā)現(xiàn)N1L能調(diào)節(jié)自然殺傷(NK)細(xì)胞反應(yīng)。NK細(xì)胞通常是病毒感染的宿主防御第一前線。已發(fā)現(xiàn)N1L缺失會(huì)誘導(dǎo)NK細(xì)胞局部活性提高。與這些發(fā)現(xiàn)一致，Bartlett等人(J General Virology,2002,83:1965-1976)發(fā)現(xiàn)，與野生型VV毒株相比，N1L缺失的Western Reserve痘苗病毒株通過宿主免疫應(yīng)答更快速地清除。如本申請(qǐng)所述的免疫應(yīng)答是指免疫系統(tǒng)對(duì)外來物質(zhì)的反應(yīng)。

本發(fā)明的第二方面，提供了包含第一方面的核酸序列或載體的痘苗病毒，其中所述核酸序列插入到N1L基因中。

將核酸序列插入靶序列可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來進(jìn)行。例如，描述于Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,by J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis(2003),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Virology Methods Manual,edited by Brian W J Mahy and Hillar O Kangro(1996)Academic Press and Expression of genes by Vaccinia virus vectors.Current Protocols in Molecular Biology,published by John Wiley and Son(1998),Chapter 16中的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過同源重組將核酸序列插入N1L基因中。

本發(fā)明的第三方面，提供了包含失活N1L基因的TK缺陷型痘苗病毒。

存在多種痘苗菌株，對(duì)人和動(dòng)物具有不同的毒力水平。作為50年代天花根除計(jì)劃的一部分，在世界各地曾使用過多種病毒株。在世界不同地區(qū)使用過不同的菌株，例如，紐約市健康委員會(huì)(NYCBOH)菌株及其衍生物Wyeth在美國(guó)廣為應(yīng)用，而哥本哈根(CPN)和Lister菌株則在歐洲占主要地位。在第三方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述痘苗病毒株是Lister。

如本申請(qǐng)所述的TK缺陷型痘苗病毒是指具有缺乏內(nèi)源性胸苷激酶(TK)的表型的痘苗病毒。TK缺陷型痘苗病毒依賴于宿主細(xì)胞產(chǎn)生的胸苷激酶。胸苷激酶在腫瘤細(xì)胞中組成型產(chǎn)生，但在正常細(xì)胞中不產(chǎn)生。因此，缺乏TK的痘苗病毒可以在腫瘤細(xì)胞中選擇性存活，特別是在EGFR/Ras/ERK途徑激活的情況下下。宿主細(xì)胞是病毒可以感染的任何細(xì)胞。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，缺乏TK的痘苗病毒包含失活的N1L基因。如本申請(qǐng)所述的失活，是指在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平上的基因沉默，基因缺失，基因中的突變，通過插入核酸序列或任何使得病毒不能產(chǎn)生功能完全的基因產(chǎn)物的其它方法來破壞基因?；虻氖Щ羁梢允遣糠只蛲耆摹Ｔ诒景l(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，N1L的失活是通過插入核酸序列?？梢酝ㄟ^同源重組進(jìn)行插入。

插入的核酸序列可以包含在載體或表達(dá)盒中。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，核酸序列編碼異源多肽。異源多肽可以是生物活性的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，生物活性多肽是治療性的。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，核酸序列編碼RNAi誘導(dǎo)劑、RNAi劑、siRNA、shRNA、miRNA、反義RNA、核酶、催化性DNA等。在另一個(gè)實(shí)施例中，核酸序列編碼了輻射和/或化療敏化劑。

在第四方面，本發(fā)明提供了包含如本發(fā)明第三方面所述的TK缺陷型痘苗病毒的組合物。在如第四方面所述的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述組合物任選地包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

所述組合物可以適于通過任何合適的途徑給藥，例如通過口服(包括口腔或舌下)、局部(包括口腔、舌下或經(jīng)皮)或胃腸外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、胸膜內(nèi)、眼內(nèi)、心內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮內(nèi))途徑。

適于腸胃外給藥的藥物組合物包括：水性和非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與預(yù)期接受者的血液基本等滲的溶質(zhì)；和水性和非水性無菌懸浮液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。

可用于注射溶液的賦形劑包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。組合物可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以以冷凍干燥(凍干)條件儲(chǔ)存，使用前只需要立即加入所攜帶的無菌液體例如注射用水即可。臨時(shí)注射溶液和懸浮液可以由無菌粉末、顆粒和片劑制備。

藥物組合物可以含有防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、香料、鹽(本發(fā)明的物質(zhì)本身可以提供為藥學(xué)上可接受的鹽的形式)、緩沖劑或抗氧化劑。除了本發(fā)明的物質(zhì)之外，它們還可以含有治療活性劑。

在第五方面中，本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，包括向?qū)ο笠灾委熡行Я渴┯冒幋a異源多肽的載體或核酸序列的缺乏TK的痘苗病毒，其中所述病毒還包含失活的N1L基因。

如本申請(qǐng)所述，對(duì)象是指動(dòng)物，包括人。動(dòng)物可包括小鼠、大鼠、家禽例如雞、反芻動(dòng)物例如牛、山羊、鹿、綿羊和其它動(dòng)物，例如豬、貓、狗，和靈長(zhǎng)類例如人、黑猩猩、大猩猩和猴。

治療有效量是足以誘導(dǎo)溶瘤作用的劑量。用于遞送和施用的劑量可以是基于當(dāng)前現(xiàn)有的方案、根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定、使用動(dòng)物疾病模型或可選地在人類臨床試驗(yàn)。初始研究劑量可以基于本申請(qǐng)所述的動(dòng)物研究，例如小鼠。劑量可以變化并且取決于治療是預(yù)防性還是治療性、治療所針對(duì)疾病的類型、發(fā)作、進(jìn)展、嚴(yán)重性、頻率、持續(xù)時(shí)間或概率，期望的臨床終點(diǎn)、先前或同時(shí)的治療，總體健康、年齡、性別、對(duì)象的種族或免疫能力，和本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的其它因素。根據(jù)治療或療法的任何不良副作用、并發(fā)癥或其它風(fēng)險(xiǎn)因素和對(duì)象的狀態(tài)，可以按比例增加或減少劑量、數(shù)量、頻率或持續(xù)時(shí)間。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可能影響提供足以提供治療或預(yù)防效用的量所需的劑量和時(shí)間的因素。

在第五方面的一個(gè)實(shí)施例中，所述方法還包括對(duì)對(duì)象施用另外的癌癥治療。本申請(qǐng)所述的癌癥治療是指通過任何醫(yī)學(xué)或物理手段治療癌癥的療法。額外的癌癥治療可以是化療、生物治療、放射治療、免疫治療、激素治療、抗血管治療、冷凍治療、毒素治療和/或手術(shù)，包括其組合。

本申請(qǐng)公開的本發(fā)明的方法和用途，可以在對(duì)象已經(jīng)被鑒定為作為需要治療的目標(biāo)疾病之后立即或數(shù)天、數(shù)月或數(shù)年進(jìn)行。

所述方法包括以不同的時(shí)間安排施用所述病毒?？梢栽?、2、5、10、15、20或24小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)向?qū)ο蠡蚰[瘤施用單劑量的病毒。病毒可以在1、2、3、4、5、6、7或更多天或數(shù)周內(nèi)施用。注射之間的間隔可以是1、2、3、4、5、6、7天或數(shù)周。通常，將多個(gè)劑量施用于相同的一般目標(biāo)區(qū)域，例如在腫瘤附近，或在靜脈內(nèi)施用的情況下，在對(duì)象的血流或淋巴系統(tǒng)中的特定入口點(diǎn)。痘苗病毒載體可以施用2、3、4、5或更多次。痘苗病毒載體可以在以不同的時(shí)間安排和劑量，在切除腫瘤之前給予。

所述方法包括施用不同病毒濃度的病毒。在某些方面，給予對(duì)象至少5x10⁷、1x10⁸、2x10⁸、5x10⁸、1x10⁹、2x10⁹、5x10⁹、1x10¹⁰、5x10¹⁰、1x10¹¹、5x10¹¹、1x10¹²或更多病毒顆?；蚴删咝纬蓡挝?pfu)，包括各值及其之間的范圍。施用的病毒劑量可以是0.1mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL或更多，包括所有值及其之間的范圍。劑量可以隨時(shí)間擴(kuò)散或通過單獨(dú)注射。

在某些實(shí)施例中，對(duì)象是患有癌癥和/或腫瘤的人。癌癥可以是胃腸癌，呼吸道癌，泌尿生殖道癌，造血癌，肉瘤，腺癌，鱗狀細(xì)胞癌或非惡性腫瘤/增生。腫瘤可以是在治療之前不可切除，而在治療后可切除的。腫瘤可以是復(fù)發(fā)性、原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性和/或多重耐藥性腫瘤。在某些方面，腫瘤位于胰腺上或胰腺中。在其它方面，腫瘤可以是神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、內(nèi)分泌腫瘤、外周中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、腦癌腫瘤、頭頸癌腫瘤、食管癌腫瘤、皮膚癌腫瘤、肺癌腫瘤、肝腫瘤、胸腺腫瘤、胃癌腫瘤、結(jié)腸癌腫瘤、卵巢癌腫瘤、子宮癌腫瘤、膀胱癌腫瘤、睪丸癌腫瘤、膀胱腫瘤、直腸癌腫瘤、黑素瘤或乳腺癌腫瘤。

本發(fā)明公開的組合物和方法可用于不同類型的基因治療，例如腫瘤抑制基因治療、自殺基因治療、病毒載體免疫策略、抗血管生成治療、促凋亡基因治療和基因替代治療?！癘ncolytic Viruses for Cancer Therapy：Overcoming the Obstacles”(Wong et al，Viruses 2010,2,78-106)通過引用全文并入本申請(qǐng)。

本發(fā)明中公開的組合物和方法可以與其它治療手段或方法聯(lián)合用于治療癌癥，例如手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法、分子癌癥治療或另外的基因治療，其可以用于施用與本申請(qǐng)所述的本發(fā)明核酸不同的基因。

本發(fā)明的第二和隨后方面的優(yōu)選方面如對(duì)于第一方面加以必要的變更

細(xì)胞系：使用的所有腫瘤細(xì)胞系均儲(chǔ)存在發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中，其來自ATCC或英國(guó)癌癥研究細(xì)胞系服務(wù)單位(CancerResearchUKCelllineServiceUnit)或由合作者友好提供。通過STR測(cè)定法對(duì)所有人癌細(xì)胞系進(jìn)行基因分型。在本研究中使用的鼠腫瘤細(xì)胞系包括：結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系CT26，衍生自BALB/c毒株，而CMT93(結(jié)腸直腸)、LLC(Lewis肺癌)和B16-F10(轉(zhuǎn)移性黑素瘤)則來源于C57BL/6菌株。SCC7是來自C3H/HeN小鼠的頭頸癌衍生的鱗狀細(xì)胞癌，并由OsamMazda博士(日本京都府立醫(yī)科大學(xué)微生物系)捐贈(zèng)，MOSEC是一種鼠卵巢癌細(xì)胞系。Panc02是化學(xué)誘導(dǎo)的鼠胰腺癌細(xì)胞系；DT6606(胰腺腫瘤)源自于C57BL/6株轉(zhuǎn)基因小鼠，其在K-Ras條件下在胰腺中具有突變。這是DavidTuveson教授(CRUK，劍橋研究所，英國(guó)劍橋)的贈(zèng)與。此外，我們的研究組此前用含有雞卵白蛋白基因(DT6606-ova)的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了DT6606細(xì)胞系。最后，CV1是從ATCC、VA、USA獲得的非洲綠猴“正常”腎細(xì)胞系，并且用作促進(jìn)病毒大量生產(chǎn)的儲(chǔ)備細(xì)胞系以及所有病毒滴定測(cè)定。用于本發(fā)明的人癌細(xì)胞系包括：人胰腺癌細(xì)胞系SUIT-2、MIAPaCa2、PANC1、PT-45和Capan-2；人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系HT29、HCT116和SW620，胃腺癌MKN45和人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780。

病毒：通過分別在合成的早期/晚期p7.5啟動(dòng)子的控制下，使用先前描述于Timiryasova TM et al.Biotechniques.2001；31:534,6,8-40中的體外細(xì)胞內(nèi)重組技術(shù)，將lacZ報(bào)道子和螢火蟲熒光素酶基因插入到痘苗病毒Lister菌株的TK區(qū)中，來構(gòu)建VVL15。VVL15是TK缺陷的。WRLuc、TK缺失和WRDD，雙缺失(TK和VGF)病毒，分別由Steve Thorne博士(美國(guó)匹茲堡大學(xué))和A.McCart博士(加拿大多倫多大學(xué))友情提供。

大規(guī)模病毒生產(chǎn)：將上述初級(jí)病毒擴(kuò)增物迅速凍融兩次，并稀釋到感染含有CV1細(xì)胞(80-90％匯合度)的36-40個(gè)T175燒瓶所需的5％FCS CM中。48小時(shí)后，收獲感染的CV1細(xì)胞，并通過以2000rpm的速度重復(fù)離心5分鐘(在4℃)，收集為單一沉淀物。將沉淀物在PBS中洗滌，重懸于12ml的10mM Tris-HCl(pH9)緩沖液中，并儲(chǔ)存在-80℃下以便稍后進(jìn)行純化。

病毒純化：將濃縮的上述病毒裂解物懸浮液凍融兩次，并轉(zhuǎn)移至Dounce勻漿器(Thermofisher)并通過60次沖程勻漿。然后將其進(jìn)行超聲處理30秒。在4℃以2000rpm離心5分鐘后，收集上清液(含有釋放的病毒顆粒)并用10mM Tris-HCl緩沖液稀釋至總體積為30ml。將溶液分成四等份；各在36ml Beckman超速離心管中輕輕地分層到17ml的36％葡萄糖溶液中，并在4℃下以13500rpm離心80分鐘。將所得的沉淀重懸于總共16ml的10mM Tris-HCl中，再次分成四份，并小心地分層到另外四個(gè)葡萄糖梯度上，本次梯度為從各管表面附近的25％w/m到底部的40％。進(jìn)行第二輪超速離心。必須如此才能進(jìn)一步去除顆粒細(xì)胞碎片，所述碎片當(dāng)靜脈內(nèi)施用到小鼠中時(shí)可能是毒性的。將最終沉淀重懸于1至4ml的病毒重懸浮緩沖液(PBS；10％甘油；138mM NaCl；pH 7.4)中。如下所述，通過TCID50測(cè)定法滴定純化的病毒樣品。

病毒復(fù)制：在具有10％FCS培養(yǎng)基的6孔板的三個(gè)孔中，根據(jù)生長(zhǎng)速率，以2至4×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔接種細(xì)胞，并且在16-18小時(shí)后，用1PFU/細(xì)胞的痘苗病毒感染。以24小時(shí)為間隔，一式三份地收獲樣品直至72小時(shí)。如Wang et al(J Clin Invest,2009,119:1604-1615)所述，通過TCID 50(50％組織培養(yǎng)感染劑量)檢測(cè)病毒復(fù)制。

統(tǒng)計(jì)分析：除非另有說明，使用Graphpad Prism 5進(jìn)行比較統(tǒng)計(jì)分析。使用未配對(duì)student t檢驗(yàn)進(jìn)行雙重條件比較。對(duì)于多于一個(gè)條件或諸如時(shí)間的附加變量，分別進(jìn)行單或雙因素方差分析。用事后檢驗(yàn)(對(duì)單因素ANOVA為Knewman-Keuls和對(duì)于雙因素ANOVA為Bonferroni)比較實(shí)驗(yàn)內(nèi)的特定條件對(duì)。存活數(shù)據(jù)表示為具有對(duì)數(shù)秩分析的Kaplan-Meier圖，以描繪各組之間的任何差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

現(xiàn)在將通過參考以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于參考目的，而不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。

參考多個(gè)附圖，其中：

圖1顯示了修飾的痘苗啟動(dòng)子mH5序列。

圖2顯示了包含三個(gè)mH5啟動(dòng)子的表達(dá)盒序列。

圖3顯示包含根據(jù)本發(fā)明所述核酸序列的載體的通式。

圖4顯示了用于產(chǎn)生新VVL15N1L載體的VVL15N1L載體和N1L pShuttle質(zhì)粒的示意圖。載體命名如所示。長(zhǎng)水平條描繪VV的雙鏈DNA基因組。L024、N1L(L025)、L026和TK指代轉(zhuǎn)錄單位。

圖5顯示了VVL15N1L載體中N1L缺失的確認(rèn)。

圖6顯示了VVL15和VVL15N1L載體在腫瘤組織(圖6a)和位點(diǎn)外位置(圖6b和6c)中的生物分布。

圖7顯示了VVL15N1L在不同細(xì)胞系中的復(fù)制。左圖表示VVL15(實(shí)線)與VVL15-N1L(虛線)相比的復(fù)制曲線；而右圖對(duì)應(yīng)于VVL15-RFP(實(shí)線)與VVL15-N1L(虛線)的比較。

圖8顯示了與VVL15-RFP(實(shí)線)不同細(xì)胞系相比，VVL15N1L(陰影線)的細(xì)胞毒性效力。

圖9顯示了”武裝”有mIL-12或mGM-CSF的VVL15N1L和VVL15N1L的細(xì)胞毒性效力。

圖10顯示了與生長(zhǎng)停滯的SCC7細(xì)胞(圖10a)和熱滅活的VVL15(圖10b)共培養(yǎng)并用VVL15，VVL15N1L或PBS處理的脾細(xì)胞中IFN-γ的產(chǎn)生。

圖11顯示了與DT6606-ova細(xì)胞(圖11a)、卵白蛋白抗原(圖11b)和B8R肽(圖11c)共培養(yǎng)，并用VVL15、VVL15N1L或PBS處理的脾細(xì)胞中的IFN-γ產(chǎn)生。

圖12顯示在用VVL15，VVL15N1L或PBS處理后與生長(zhǎng)停滯的LLC細(xì)胞(圖12a)和B8R肽(圖12b)共培養(yǎng)的脾細(xì)胞中IFN-γ的產(chǎn)生。

圖13顯示VVL15N1L在胰腺癌小鼠模型中的功效-用VVL15、VVL15N1L或PBS處理后的DT6606(圖13a)和CMT-93(圖13c)中的腫瘤生長(zhǎng)速率，和在用VVL15，VVL15N1L或PBS處理后的DT6606(圖13b)和CMT-93(圖13d)側(cè)翼腫瘤模型中的存活率。

圖14顯示了VVL15N1L在原位肺癌小鼠模型中的功效。圖14a展示了PBS處理小鼠的個(gè)體重量分布，圖14b展示了每組中小鼠的平均體重作為時(shí)間的函數(shù)、圖14c和14d分別展示了相應(yīng)的Kaplan-Meier存活曲線和存活中位值曲線。

圖15顯示了經(jīng)VVL15RFP、VVL15N1L或PBS(圖15a)的IT給藥后的LLC腫瘤模型中的腫瘤體積，和處死時(shí)各處理組中的轉(zhuǎn)移(圖15b)。

圖16顯示DT6606側(cè)翼模型中，用VVL15N1L、VVL15N1L-mIL-12、VVL15N1L-mGM-CSF或PBS(圖16a)處理后的腫瘤生長(zhǎng)和相應(yīng)的Kaplan Meir存活曲線(圖16b)。

圖17顯示了以IL-21”武裝”的VV的體外評(píng)估。

圖18顯示了VV-ΔTkΔN1L-mIL-21、VV-ΔTkΔN1L-hIL-21和對(duì)照病毒VV-ΔTkΔN1L的抗腫瘤功效。

圖19顯示了人IL-12A、IL-12B、IL-21同種型1，IL-21同種型2和GM-CSF的序列。

實(shí)施例

實(shí)施例1：pUC19-N1L穿梭載體的構(gòu)建和

本發(fā)明人構(gòu)建了如圖3所示的pUC19-N1L穿梭載體，其包含側(cè)翼為含有L024和31bp的L025片段(左臂)、含有22bp的L025以及L026的片段(右臂)的特異性表達(dá)盒。所述表達(dá)盒具有以下特征：(1)存在三個(gè)痘苗病毒mH5啟動(dòng)子，并且在每個(gè)啟動(dòng)子下有用于容易插入任何目的基因的克隆限制酶位點(diǎn)；(2)報(bào)告基因RFP由一個(gè)mH5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，用于重組病毒的陽性選擇；(3)mH5啟動(dòng)子僅驅(qū)動(dòng)插入基因從左到右的表達(dá)。本發(fā)明中使用的同源重組策略設(shè)計(jì)為，代替L025(N1L)基因座的幾乎整個(gè)編碼序列。在L024/25和L025/26的連接處的序列分析，證實(shí)了L025的上游(22bp)和下游(31bp)的ORF保持完整。

使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將m-GM-CSF、h-GM-CSF、m-IL12和h-IL12的cDNA克隆到載體中，用于在mH5啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，使用合適的限制酶來合成pUC19超級(jí)穿梭載體。

實(shí)施例2：VVL15N1L的構(gòu)建

圖4描述了本發(fā)明人制備的痘苗病毒Lister菌株和各種痘苗病毒構(gòu)建體。將每個(gè)pUC19超穿梭載體轉(zhuǎn)染(使用基于Effectene的方案Qiagen)到已經(jīng)用VVL15(每個(gè)細(xì)胞0.1PFU)預(yù)感染(2小時(shí)前)的CV1細(xì)胞中。48小時(shí)后，熒光顯微鏡下紅色熒光的存在證實(shí)了相關(guān)盒的表達(dá)，其來自胞質(zhì)質(zhì)?；騺碜韵鄬?duì)少的已經(jīng)成功同源重組的病毒。后者如下選擇。通過從培養(yǎng)皿刮取細(xì)胞并冷凍-融化兩次來收獲細(xì)胞和上清液。將1μl該裂解物用于感染含有生長(zhǎng)至80-90％匯合度的CV1細(xì)胞的6孔板的所有6個(gè)孔。這種低病毒載量將確保產(chǎn)生分離良好的斑塊。

再過48小時(shí)后，在熒光顯微鏡下仔細(xì)檢查每個(gè)孔，尋找發(fā)出紅色熒光的病毒誘導(dǎo)噬菌斑。在鑒定陽性集落時(shí)，用細(xì)尖的永久性標(biāo)記物在板的下表面上標(biāo)記其位置。從孔中吸出培養(yǎng)基后，用填充有5ul 5％FCS CM的20μl尖端小心挑取菌落。然后將尖端浸入含有250μl 5％FCS CM的冷凍管中。在進(jìn)一步的凍融循環(huán)后，如前所述將5-20μl該病毒溶液加入到含有CV1細(xì)胞的新6孔板的每個(gè)孔中。重復(fù)該過程，直到每個(gè)噬菌斑發(fā)出紅色熒光，即所有病毒菌落都是源于重組病毒。一般來說，需要4-8輪噬菌斑純化以獲得一批純凈的重組病毒。此時(shí)，刮取收集病毒裂解物，并通過基于柱的系統(tǒng)(即來自Qiagen的Blood Mini Kit)提取病毒DNA。還通過ELISA測(cè)試了上清液樣品中相關(guān)細(xì)胞因子的存在。病毒的純度通過來自提取病毒DNA的N1L基因的PCR擴(kuò)增來確認(rèn)。其存在將表明親本病毒VVL15的污染。

一旦初步研究證實(shí)可能產(chǎn)生表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)基因的純重組病毒，將50μl病毒裂解物加入到含有CV1細(xì)胞的T175燒瓶中，再次在約30ml 5％FCS CM中生長(zhǎng)至80-90％匯合。48小時(shí)后刮取細(xì)胞和培養(yǎng)基，并將其作為“初次病毒擴(kuò)增物”保存。

實(shí)施例3：確認(rèn)重組VVL中N1L的缺失：

所有新型VVL重組體中缺失N1L基因(圖5a)。使用正義和反義N1L基因引物，通過PCR擴(kuò)增提取自感染的CV1細(xì)胞的病毒DNA。只有VVL15病毒含有該基因。預(yù)期含有跨越引物對(duì)的區(qū)段的N1L基因測(cè)量為約750bp。A52R基因存在于所有VVL重組體中。使用正義和反義A52R基因引物，從提取自感染的CV1細(xì)胞的DNA中，經(jīng)PCR擴(kuò)增該基因座。跨越引物對(duì)的A52R基因區(qū)段預(yù)期測(cè)量為大約880bp(圖5b)。

實(shí)施例4：驗(yàn)證來自N1L基因缺失的重組VVL的轉(zhuǎn)基因表達(dá)：

根據(jù)廠商方案(ebioscience，Biolegend)，使用相關(guān)細(xì)胞因子特異性ELISA試劑盒，分析來自每個(gè)轉(zhuǎn)基因”武裝”的重組病毒的最終噬斑純化循環(huán)的上清液樣品。為了評(píng)估每種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)基因在腫瘤細(xì)胞感染時(shí)是否由相關(guān)重組病毒表達(dá)，進(jìn)行與上述病毒復(fù)制測(cè)定相同的實(shí)驗(yàn)裝置。在病毒感染后24、48和72小時(shí)內(nèi)，從每組重復(fù)的孔收集上清液，并根據(jù)制造商的說明書通過ELISA測(cè)定細(xì)胞因子的濃度。對(duì)照樣品是從VVL15-N1L感染的孔收集的上清液。

實(shí)施例5：評(píng)估VVL15N1L載體的病毒生物分布

將含2x10⁶CT26細(xì)胞的100μl無血清DMEM皮下注射到7周齡雌性BALB/c小鼠的剃毛右脅腹中。當(dāng)腫瘤約100mm³時(shí)，將其隨機(jī)分成兩組。通過尾靜脈注射1×10⁸PFU IV劑量的VVL15或VVL15-N1L。在病毒注射后的第1、3、7和10天，通過吸入CO₂處死來自每組的3只小鼠。通過心臟穿刺將血液收集到預(yù)先肝素化的1.5ml Eppendorf管中。將這些與收獲的腫瘤、腦、肺、肝、脾、腎和卵巢一起快速冷凍在漂浮在預(yù)冷(至-80℃)異戊烷的培養(yǎng)皿上。稍后，將它們解凍、稱重并在無血清DMEM中勻漿(或在血液的情況下渦旋)。用5μl/mg(或5μl/μl血液)的體積稀釋樣品。在進(jìn)一步的凍融循環(huán)后，隨后使用TCID50測(cè)定法滴定組織勻漿，用于后續(xù)的活病毒PFUs。

進(jìn)行生物分布實(shí)驗(yàn)以確定IV遞送的病毒是否擴(kuò)散到腫瘤，并測(cè)定任何脫靶復(fù)制(即，確定腫瘤的選擇性程度，從而確定安全性)。如方法部分所述，將CT26皮下側(cè)腹模型用于該切片。在尾靜脈注射后，可以從腫瘤組織中回收這兩種病毒，直到注射后至少10天。峰滴度在3至7天之間。出乎意料地，與VVL15相比，腫瘤組織中的VVL15N1L病毒回收沒有降低(圖6a)。

關(guān)于脫靶復(fù)制，除了肺組織之外，在注射后24小時(shí)內(nèi)，沒有從任何其他器官或血液中回收病毒。24小時(shí)后，VVL15-N1L病毒回收顯著小于來自肝和脾組織的VVL15，并且完全不存在于腎組織中。在該實(shí)驗(yàn)的任何時(shí)間點(diǎn)，都沒有從腦、心臟、卵巢或循環(huán)系統(tǒng)中回收到可檢測(cè)水平的病毒(圖6b)。相反，病毒存留在肺中直到至少3天。即使在該器官中，VVL15-N1L的回收與VVL15相比顯著更少。因此，新型骨架VVL15N1L似乎對(duì)腫瘤組織具有比VVL15更大的選擇性。

實(shí)施例6：VVL15N1L在不同細(xì)胞系中的復(fù)制

存在以痘苗病毒殺死腫瘤細(xì)胞的多種機(jī)制。其中包括天然宿主防御觸發(fā)凋亡，因病毒介導(dǎo)的細(xì)胞爆發(fā)和宿主免疫防御機(jī)制而引起的凋亡。如果病毒對(duì)細(xì)胞而言細(xì)胞毒性過高，則其可能無法產(chǎn)生足以在整個(gè)腫瘤中自我繁殖的足夠后代。此外，可以預(yù)期其復(fù)制能力與其治療性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)正相關(guān)，因?yàn)榇嬖诟嗟牟《究截悺?/p>

所有細(xì)胞系都容許用VVL15和VVL15N1L感染。最能容許的腫瘤細(xì)胞系是SCC7，其在最初用1PFU/每細(xì)胞感染后三天，得到超過1000PFU/每細(xì)胞的病毒滴度。該結(jié)果與來自細(xì)胞細(xì)胞毒性測(cè)定(MTS)的結(jié)果形成對(duì)比，其中SCC7是最具抗性的細(xì)胞系。最難容許復(fù)制的細(xì)胞系是CMT93。CMT93和DT6606細(xì)胞系中的病毒滴度在第3天達(dá)到穩(wěn)定。這可能反映了病毒復(fù)制相對(duì)于未感染細(xì)胞復(fù)制(病毒體有效地耗盡可感染細(xì)胞)的性能表現(xiàn)，結(jié)合從裂解細(xì)胞釋放的蛋白酶的可能病毒降解。僅在CMT-93中觀察到VVL15N1L復(fù)制的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性衰減(圖7)。

實(shí)施例7：VVL15N1L的細(xì)胞毒性效力

在一系列鼠癌細(xì)胞系中將VVL15-N1L與VVL15-RFP的細(xì)胞毒性進(jìn)行體外比較。根據(jù)生長(zhǎng)速率，在96孔板中以1x10³或1x10⁴個(gè)細(xì)胞/孔接種細(xì)胞，并在16-18小時(shí)后用病毒感染。通過MTS分析確定病毒感染后第6天的細(xì)胞存活，并如Wang et al(J Clin Invest,2009,119:1604-1615)所述計(jì)算EC 50值(殺死50％腫瘤細(xì)胞的病毒劑量)。所有測(cè)定進(jìn)行至少三次。基于EC 50值(即殺死50％細(xì)胞所需的PFU)，在CT26和DT6606細(xì)胞中的兩種病毒之間的細(xì)胞毒性沒有顯著差異。相比之下，在殺死CMT93、LLC和SCC7細(xì)胞時(shí)，VVL15-N1L與VVL15相比顯著更有效(圖8)。

還比較了“武裝”VVL15N1L的細(xì)胞毒性效力。在除了LLC和CMT93之外的所有細(xì)胞系中，EC 50值顯著高于VVL15-N1L(即，其在殺死相關(guān)細(xì)胞系方面不如VVL15-N1L有效)。在所有細(xì)胞系中，VVL15-N1L-mIL12重組體似乎比VVL15-N1L-mGMCSF更有效，該特征在SCC7和DT6606細(xì)胞中達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(圖9)。

實(shí)施例8：VVL15N1L誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤抗原的更高水平宿主免疫應(yīng)答

使用了三種同基因體內(nèi)腫瘤模型：C3H/HeN系小鼠中的SCC7細(xì)胞；C57BL/6系小鼠中的DT6606-ova細(xì)胞；和C57BL/6系小鼠中的LLC細(xì)胞。

建立了皮下側(cè)腹腫瘤模型，并用單劑量的病毒或PBS處理，如表2所示。為了確保及時(shí)產(chǎn)生病毒和腫瘤特異性T細(xì)胞，在感染后14天收獲脾臟。對(duì)隨后產(chǎn)生的脾細(xì)胞懸液進(jìn)行IFN-γ釋放測(cè)定。

(1)從收獲的脾制備脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液

對(duì)于相關(guān)腫瘤細(xì)胞系，如下所述建立同基因皮下側(cè)腹腫瘤(也參見表2)。當(dāng)腫瘤體積為約100mm³時(shí)，將小鼠隨機(jī)分成三組。使用連接到29號(hào)針頭的1ml胰島素注射器，以含1x10⁸PFUVVL15或VL15-N1L病毒的50μlPBS進(jìn)行瘤內(nèi)(IT)注射。在病毒部署期間，用針在整個(gè)腫瘤的不同方向上穿過數(shù)次以便廣泛傳播。第三組注射等體積載體緩沖液，即50μl PBS。感染后第14天，通過吸入CO₂使動(dòng)物安樂死。在無菌條件下收獲脾，使用2ml注射器的柱塞平端通過70μm細(xì)胞過濾器(Becton Dickinson Falcon)搗碎，并用T細(xì)胞培養(yǎng)基(TCM)(RPMI-1640,10％FCS，1％鏈霉素/青霉素，1％丙酮酸鈉)沖洗到50ml錐形瓶中。在1200rpm離心后，將沉淀的脾細(xì)胞重懸浮于5ml RBC裂解緩沖液(Sigma-Aldrich)中，并在冰上放置5分鐘。在洗滌-離心循環(huán)后，將其用TCM再懸浮至5x10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的終濃度。(2)生長(zhǎng)停滯的全腫瘤刺激細(xì)胞的制備：

在50ml錐形瓶中，在細(xì)胞培養(yǎng)基(CM)中制備5x10⁶/ml刺激細(xì)胞(即相關(guān)靶或?qū)φ漳[瘤細(xì)胞系-SCC7、LLC或DT6606-ova)的單細(xì)胞懸浮液。將1mg/ml絲裂霉素C(MMC)(Roche)溶液加入到該懸浮液中，至達(dá)到100μg/ml的最終濃度，并在加濕培養(yǎng)箱中在37℃、5％CO₂的空氣中培養(yǎng)1小時(shí)。隨后，用40ml PBS洗滌細(xì)胞兩次，重懸于40ml CM中，培養(yǎng)直到準(zhǔn)備接種(在30-60分鐘內(nèi))。將此時(shí)生長(zhǎng)停滯的刺激細(xì)胞重懸于TCM中，達(dá)到5x10⁵個(gè)細(xì)胞/ml的終濃度。

(3)IFN-γ釋放測(cè)定作為腫瘤/抗原特異性T細(xì)胞活化的替代標(biāo)記：

該測(cè)定是基于當(dāng)記憶T細(xì)胞被其同源表位-MHC復(fù)合物激活時(shí)的IFNγ釋放。脾細(xì)胞庫應(yīng)含有刺激CD8+T細(xì)胞所必需的所有細(xì)胞類型(例如APCs、Th細(xì)胞)。將來自(1)的每種脾細(xì)胞懸浮液各100μl與上述靶-腫瘤刺激細(xì)胞懸浮液100μl一起在圓底96孔板(即具有5x10⁴個(gè)生長(zhǎng)停滯的腫瘤細(xì)胞的5x10⁵個(gè)脾細(xì)胞)的三個(gè)孔中共培養(yǎng)。僅脾細(xì)胞對(duì)照孔含有200μlTCM中的5x10⁵個(gè)脾細(xì)胞。在合適的情況下，也將脾細(xì)胞與含100μl ova-肽(H-2Kb/SIINFEKL，Proimmune)的TCM(以達(dá)到終濃度5μg/ml)或100μl含有5x10⁴個(gè)MHC-相容的生長(zhǎng)停滯對(duì)照腫瘤細(xì)胞(當(dāng)使用C56BL/6小鼠衍生的腫瘤模型時(shí)為B16-F10)的TCM共培養(yǎng)。

此外，為了證明已經(jīng)施用病毒，且重要的是，動(dòng)物本身能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，另將脾細(xì)胞如上所述地與熱滅活VVL15(100PFU/細(xì)胞，加熱至56℃2小時(shí))或VV B8R肽(H-2Kb/TSYKFESV，ProImmune，強(qiáng)抗原性痘苗病毒表位)(以達(dá)到5μg/ml的終濃度)。該實(shí)驗(yàn)也將用作測(cè)定本身的陽性對(duì)照。

將板在37℃、5％CO₂的空氣中培養(yǎng)1小時(shí)中培養(yǎng)三天，隨后將其在1200rpm下離心5分鐘。使用鼠特異性IFN-γELISA試劑盒(Biolegend)確定取自各孔的上清液中的IFN-γ濃度。在扣除來自僅含脾細(xì)胞的孔的相應(yīng)值后，IFN-γ的終濃度確定為重復(fù)試樣的孔的平均值。

SCC模型是一種侵略性小鼠頭頸部鱗狀癌模型，與類似的人類頭頸部癌癥一樣，具有很差的免疫原性。如圖10a-b所示，來自VVL15-N1L處理組的脾細(xì)胞響應(yīng)于與生長(zhǎng)停滯的SCC7細(xì)胞共培養(yǎng)而產(chǎn)生的IFN-γ水平顯著高于VVL15組。來自PBS處理的脾細(xì)胞的IFN-γ產(chǎn)量低但水平顯著。這可能反映了宿主對(duì)腫瘤的天然免疫應(yīng)答。如所預(yù)期地，脾細(xì)胞沒有響應(yīng)于與PBS組中的熱滅活VVL15共培養(yǎng)而產(chǎn)生IFN-γ。令人驚奇的是，其他兩組在與滅活病毒共培養(yǎng)時(shí)，IFN-γ水平?jīng)]有顯著差異(圖10b)。應(yīng)當(dāng)注意，與滅活VVL15共培養(yǎng)后的IFN-γ絕對(duì)水平，其量值低于與生長(zhǎng)停滯的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后的絕對(duì)水平。這可能是起因于呈遞的免疫原性腫瘤或病毒表位的變化。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，為了確保表位標(biāo)準(zhǔn)化，使用免疫原性VVB8R表位代替失活的VVL15。

還研究了胰腺癌模型中由VV誘導(dǎo)的宿主免疫。由于尚未定義DT6606細(xì)胞系的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)譜，遂建立了穩(wěn)定表達(dá)外源抗原卵清蛋白的細(xì)胞系DT6606-ova，以證明抗原特異性免疫應(yīng)答(在此例中為抗卵白蛋白反應(yīng))的推定產(chǎn)生。該細(xì)胞系用于產(chǎn)生如表2所述的同基因皮下側(cè)腹模型。在IT注射病毒后第14天，相對(duì)于與生長(zhǎng)停滯的DT6606-ova細(xì)胞共培養(yǎng)的VVL15或PBS處理組，VVL-N1L處理組顯示來自收獲的脾細(xì)胞的IFN-γ應(yīng)答顯著更高(圖11a)。在PBS組中存在相對(duì)高水平的IFN-γ產(chǎn)量，實(shí)際上與VVL15處理組沒有不同。卵清蛋白是外來抗原，具有刺激強(qiáng)大抗ova反應(yīng)的傾向，因此這個(gè)結(jié)果是不令人驚訝的。當(dāng)脾細(xì)胞與卵白蛋白抗原共培養(yǎng)時(shí)(雖然沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性)，N1L處理組也產(chǎn)生了最高水平的IFN-γ(圖11b)。

此外，與B8R表位共培養(yǎng)后，病毒組之間的脾細(xì)胞IFN-γ應(yīng)答沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，盡管與腫瘤/腫瘤抗原共培養(yǎng)測(cè)定相比，其應(yīng)答幅度高了接近10倍。

外源選擇標(biāo)記如RFP可能是免疫原性的，并且可以證明已經(jīng)導(dǎo)致迄今獲得的體內(nèi)結(jié)果。為了控制這種可能性，在皮下同基因LLC側(cè)翼模型(參見表2)中使用VVL15-RFP作為對(duì)照病毒(代替VVL15)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置同樣與SSCVII和DT6606實(shí)驗(yàn)相同。

在該模型中重復(fù)了先前的結(jié)果，其中與生長(zhǎng)停滯的LLC細(xì)胞共培養(yǎng)的VVL15-N1L治療組的脾細(xì)胞展示了最高的IFN-γ產(chǎn)量(圖12a)。這與VVL15-RFP和PBS組相比是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。在脾細(xì)胞與B8R肽共培養(yǎng)時(shí)，病毒處理組之間沒有顯著差異(圖12b)。對(duì)于VVL15-N1L組，相對(duì)于與生長(zhǎng)抑制的LLC細(xì)胞共培養(yǎng)，脾細(xì)胞與生長(zhǎng)停滯的B16-F10細(xì)胞(作為MHC單倍型特異性對(duì)照刺激細(xì)胞群體)的共培養(yǎng)導(dǎo)致了較低但統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著的IFNγ水平(p＝0.0594)。很可能這些實(shí)體瘤細(xì)胞系和其他實(shí)體瘤細(xì)胞系之間共享許多腫瘤表位。針對(duì)其而產(chǎn)生的CTL可以解釋在B16-F10組中獲得的IFN-γ水平。

實(shí)施例9：VVL15N1L在胰腺癌模型中的功效

如上所述將5x10⁶個(gè)CMT93細(xì)胞或3x10⁶個(gè)DT6606細(xì)胞皮下植入C57BL/6雄性小鼠的剃毛右側(cè)。一旦腫瘤體積達(dá)到約1100mm³，即將它們隨機(jī)分成三組，并按照表3(時(shí)間表1和2)中所述的治療時(shí)間表，注射一劑含1x10⁸PFU病毒的50μl PBS或50μl PBS載體緩沖液對(duì)照。通過每周兩次的卡尺測(cè)量來監(jiān)測(cè)腫瘤體積，并每周稱重小鼠。每周兩次跟蹤腫瘤生長(zhǎng)，并且當(dāng)腫瘤體積接近1000mm³時(shí)，按照內(nèi)政部(Home Office)指導(dǎo)方針對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂死。在DT6606側(cè)翼腫瘤模型治療時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)速率的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著減少和延長(zhǎng)的存活說明了VVL15-N1L劑的優(yōu)勢(shì)(圖13a-b)，而在CMT93模型中，在IT施用任一種病毒劑后的腫瘤生長(zhǎng)速率之間沒有差異，盡管兩者的生長(zhǎng)均比PBS組顯著更慢(圖13c-c)。

實(shí)施例10：施用VVL15N1L后的原位肺癌存活率

為了評(píng)估當(dāng)靜脈內(nèi)施用時(shí)病毒是否有效，使用了原位肺癌模型。將含5x10⁶個(gè)LLC細(xì)胞的100μl PBS注射到7周齡雌性C57BL/6小鼠的尾靜脈中。

使用肺部非造影增強(qiáng)CT掃描來評(píng)估三周時(shí)間內(nèi)個(gè)體小鼠的肺容積，以及用于外推腫瘤負(fù)荷的任何減少。一次，通過在CT上確定腫瘤的初始存在，如表3(方案5)中所述施用三劑IV病毒/PBS。每周稱重小鼠兩次，如果其顯示出痛苦跡象或如果體重減輕超過其最大重量的20％，則處死小鼠。

所有小鼠均發(fā)展了腫瘤，死亡發(fā)生在14至21天之間，此時(shí)通過開胸手術(shù)確認(rèn)了大范圍肺腫瘤。腫瘤最初在注射LLC細(xì)胞后第4至7天之間在CT上顯現(xiàn)，因此選擇注射后5天作為治療的開始時(shí)間。

向21只小鼠尾靜脈注射含0.5x10⁶LLC細(xì)胞的100μl無血清DMEM。將它們隨機(jī)分成三組，并且從第5天開始治療(參見表3，方案5)。在注射LLC細(xì)胞10天后，通過體重減輕證實(shí)PBS處理組中的所有小鼠都具有癥狀，并且所有小鼠都死于第21天(圖14)。與PBS組相比，VVL15病毒處理將存活中位值延長(zhǎng)了而VVL15-N1L病毒處理將存活中位值延長(zhǎng)了6.5天，盡管在病毒組之間存活沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。

實(shí)施例11：施用VVL15N1L后肺癌模型中的轉(zhuǎn)移傳播

LLC是非常具有侵襲性的腫瘤模型，在皮下側(cè)面注射后具有轉(zhuǎn)移到肺的傾向。事實(shí)上，已經(jīng)報(bào)道手術(shù)切除皮下生長(zhǎng)的LLC腫瘤令肺轉(zhuǎn)移速率提高，可能是因?yàn)槌チ嗽l(fā)性分泌的血管生成抑制劑。

為了研究VV重組體的IT注射是否可以降低該轉(zhuǎn)移速率，將1x10⁶個(gè)LLC細(xì)胞皮下注射到7周齡雌性C57BL/6小鼠的脅腹中。當(dāng)腫瘤體積為約100mm³時(shí)，將它們隨機(jī)分成三組。根據(jù)表3(時(shí)間表3)中的治療時(shí)間表，施用IT注射病毒/PBS。通過卡尺測(cè)量來監(jiān)測(cè)腫瘤，直到一組達(dá)到需要處死的終點(diǎn)(植入后約17-20天)。所有動(dòng)物同時(shí)安樂死，收獲它們的肺并記錄任何大體腫瘤沉積物。分離肺葉，在4％福爾馬林中固定，包埋在石蠟中，用蘇木精和曙紅染色，并通過最大橫截面尺寸切片。對(duì)于每個(gè)葉，也在最大橫截面上方和下方進(jìn)行切片。所有三個(gè)切片由對(duì)治療時(shí)間表不知情的病理學(xué)家來仔細(xì)檢查腫瘤沉積物。

處死時(shí)的腫瘤體積在各組之間沒有顯著差異(圖15a)。然而，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，N1L、VVL15和PBS組中具有肺轉(zhuǎn)移的小鼠百分比分別是14、43和57％(圖15b)。這些數(shù)字在統(tǒng)計(jì)上彼此不同。然而，很難用每組(n＝7)如此少量的小鼠得出推論，需要用更大樣本量來重復(fù)實(shí)驗(yàn)。然而，該結(jié)果確實(shí)表明即使VVL15N1L對(duì)侵襲性原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)可能沒有影響，病毒治療可使傳播最小化。因此，可以證明其是一種良好的輔助治療。

實(shí)施例12：IL-12和GM-CSF”武裝”的VV15N1L的功效

為了增強(qiáng)VVL15N1L的抗腫瘤功效，將GM-CSF和IL-12插入VVL15N1L載體的N1L區(qū)域。針對(duì)同基因DT6606皮下側(cè)腹模型(見表3，時(shí)間表1)測(cè)試各個(gè)重組體在體內(nèi)的效力。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到平均100mm³時(shí)，以1x10⁸PFU病毒(VVL15-N1L、VVL15-N1L-mGMCSF或VVL15-N1L-mIL12)或等量載體緩沖液對(duì)照(50μl PBS)作為每日劑量(每組n＝7)進(jìn)行IT注射。通過每周兩次卡尺測(cè)量來跟蹤腫瘤生長(zhǎng)(圖16a)。相應(yīng)的Kaplan Meir存活曲線(圖16b)是基于當(dāng)腫瘤體積超過1000mm³時(shí)動(dòng)物人道處死必要性。圖16a-b證明了單獨(dú)的攜帶GMCSF轉(zhuǎn)基因的病毒并未顯著優(yōu)于VVL15-N1L，然而攜帶IL12的病毒則顯示出顯著的效力，得到了實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的6/7小鼠治愈率和100％存活。這些”武裝”病毒將在其他模式中進(jìn)行測(cè)試，以確定這一結(jié)果的普遍性。

實(shí)施例13和14：IL-21構(gòu)建體

材料和方法：

小鼠胰腺癌模型：在雄性C57BL/6小鼠中建立DT6606皮下同基因腫瘤。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到5-6mm時(shí)，腫瘤內(nèi)施用PBS(5×10⁷pfu/注射)的VV-ΔTkΔN1L-mIL-21，VV-ΔTkΔN1L-hIL-21或?qū)φ詹《綱V-ΔTkΔN1L)。在第1,3,7,9和11天測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)。每周測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)兩次，并監(jiān)測(cè)動(dòng)物存活。使用(GraphPad Software，CA，USA)比較存活數(shù)據(jù)，并使用對(duì)數(shù)秩(Mantel Cox)測(cè)試來確定存活差異的顯著性。使用未配對(duì)的學(xué)生T檢驗(yàn)確定顯著性(*p<0.05；**p>0.01；***p<0.001)。

敘利亞倉鼠癌模型：攜帶HPD-1NR腫瘤的敘利亞倉鼠-通過皮下注射將1x10⁶個(gè)HPD-1NR細(xì)胞接種到攜帶HPD-1NR腫瘤的敘利亞倉鼠的右側(cè)。當(dāng)腫瘤達(dá)到313mm³時(shí)，在第一天給予腫瘤內(nèi)(5×10⁷pfu/注射)的PBS，VV-ΔTkΔN1L-mIL-21，VV-ΔTkΔN1L-hIL-21或?qū)φ詹《綱V-ΔTkΔN1L每周測(cè)量腫瘤兩次，并監(jiān)測(cè)動(dòng)物存活。使用(GraphPad Software，CA，USA)比較存活數(shù)據(jù)，并使用對(duì)數(shù)秩(Mantel Cox)測(cè)試來確定存活差異的顯著性。使用未配對(duì)的學(xué)生T檢驗(yàn)確定顯著性(*p<0.05；**p>0.01；***p<0.001)。敘利亞倉鼠腹膜腔播散性胰腺癌模型-將1×10⁷個(gè)SHPC6細(xì)胞接種到敘利亞倉鼠的右下腹腔中。四天后，在第4,6和8天，每組10只倉鼠各自腹膜內(nèi)(IP)注射500μlPBS，2x10⁷PFU的不同VV。監(jiān)測(cè)倉鼠的存活率。使用(GraphPad Software，CA，USA)比較存活數(shù)據(jù)，并使用對(duì)數(shù)秩(Mantel Cox)測(cè)試來確定存活差異的顯著性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

實(shí)施例13：體外的IL-21”武裝”VV產(chǎn)生和抗腫瘤效力評(píng)估

將人和小鼠IL-21cDNA序列插入puc19N1L穿梭載體(如圖3所示)。通過將所得質(zhì)粒pShuttleN1L-mIL-21或pShuttleN1L-hIL-21共轉(zhuǎn)染到以0.05PFU/細(xì)胞的VVL15預(yù)感染的CV-1(非洲綠猴腎)細(xì)胞中，在Lister氏菌痘苗病毒(VVL15)的TK缺失主鏈中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)同源重組。對(duì)轉(zhuǎn)染后的CV-1細(xì)胞裂解物進(jìn)行噬菌斑測(cè)定。進(jìn)行五輪噬菌斑純化以繁殖單一克隆病毒，并且通過PCR再次證實(shí)修飾中缺失N1L基因。所得病毒命名為VV-ΔTkΔN1L-mIL-21和VV-ΔTkΔN1L-hIL-21。為了測(cè)試所述病毒的效力，使用細(xì)胞死亡分析(MTS分析)來檢測(cè)來源于突變型Ras-p53轉(zhuǎn)基因胰腺癌模型的鼠胰腺癌細(xì)胞系(DT6606)中的三種痘苗病毒的細(xì)胞毒性。

圖17展示了對(duì)IL-21”武裝”VV的體外評(píng)估。圖17A和B展示了不同溶瘤痘苗病毒在鼠胰腺癌細(xì)胞系中的細(xì)胞毒性。用不同病毒感染來自Ras-p53轉(zhuǎn)基因胰腺癌小鼠的鼠胰腺癌細(xì)胞系DT6606培養(yǎng)物，并在病毒感染后6天通過MTS分析檢測(cè)細(xì)胞殺傷。病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡曲線顯示在圖17A；計(jì)算EC 50值(殺死50％癌細(xì)胞的病毒劑量)(圖17B)。較高的EC 50值意味著病毒具有較低的效力。圖17C&D展示了體外胰腺癌細(xì)胞中檢測(cè)到的新一代痘苗病毒的不同突變體的IL-21表達(dá)和病毒復(fù)制。用不同病毒感染來自Ras-p53轉(zhuǎn)基因胰腺癌小鼠的鼠胰腺癌細(xì)胞系DT6606的培養(yǎng)物，并在病毒感染后24小時(shí)通過ELISA測(cè)定來檢測(cè)IL-21表達(dá)(圖17C)。通過TCID50測(cè)定檢測(cè)到病毒復(fù)制，如圖17D所示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。如圖17A和B所示，新一代溶瘤痘苗病毒(VV-ΔTkΔN1L)在殺死癌細(xì)胞方面仍然非常有效；用細(xì)胞因子IL-21”武裝”病毒不會(huì)減弱病毒，而是通過(至今)未知機(jī)制增加對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性(p<0.01)。

為了檢查治療基因IL-21在病毒感染的癌細(xì)胞中是否可表達(dá)以及表達(dá)水平，使用ELISA來檢測(cè)來自VV-ΔTkΔN1L-mIL-21、VV-ΔTkΔN1L-hIL-21和對(duì)照病毒VV-ΔTkΔN1L感染的胰腺癌細(xì)胞(DT6606)的IL-21蛋白的表達(dá)。如圖17C所示，IL-21在用VV-ΔTkΔN1L-mIL-21，VV-ΔTkΔN1L-hIL-21感染后的細(xì)胞中以非常高的水平表達(dá)，但對(duì)照病毒VV-ΔTkΔN1L感染不產(chǎn)生任何IL-21蛋白。與主鏈病毒相比，IL-21”武裝”病毒的復(fù)制沒有減弱(圖17D)。

實(shí)施例14：IL-21”武裝”的VV15N1L的抗腫瘤功效

為了測(cè)試IL21是否可以增強(qiáng)VV-ΔTkΔN1L的抗腫瘤功效，針對(duì)同基因DT6606皮下側(cè)腹模型測(cè)試每種所述病毒(小鼠IL21或人IL21)的體內(nèi)效力。

圖18展示了VV-ΔTkΔN1L-mIL-21、VV-ΔTkΔN1L-hIL-21和對(duì)照病毒VV-ΔTkΔN1L的抗腫瘤功效。鼠胰腺癌模型——用不同藥劑處理的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線(圖18A)和存活(圖18B)如圖所示(n＝7/組)。攜帶HPD-1NR腫瘤的敘利亞倉鼠——用不同藥劑治療的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線(圖18C)和存活(圖18D)如圖所示(n＝7/組)。在每種情況下，均展示了平均腫瘤大小±SEM，直到每組中的第一只倉鼠死亡，并通過單因素ANOVA和事后Bonferroni測(cè)試進(jìn)行比較。(圖18E)顯示了病毒株在免疫活性敘利亞倉鼠腹膜腔彌漫性胰腺癌模型中的抗腫瘤功效。

攜帶IL21的病毒表現(xiàn)出顯著的效力、腫瘤生長(zhǎng)退行(圖18A)和攜帶胰腺癌的小鼠顯著延長(zhǎng)的存活(圖18B)。考慮到人細(xì)胞因子可能在敘利亞倉鼠中比小鼠中作用更好，使用皮下敘利亞倉鼠胰腺癌模型來評(píng)價(jià)IL21-裝載的病毒的抗腫瘤功效。引人注目的是，IL21“武裝”的病毒顯示出顯著的效力，是的7只動(dòng)物中有6只治愈，并且在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活為86％(圖18C和D)。基于在皮下模型中的抗腫瘤功效，與對(duì)照病毒相比，IL12或IL21”武裝”的VV展示了具有潛力的功效。

改善胰腺癌患者存活的主要障礙，是缺乏用于晚期胰腺癌的有效治療劑。為此，使用良好表征的敘利亞倉鼠腹膜擴(kuò)散胰腺癌模型來評(píng)估IL12和IL21”武裝”的VV的可行性、功效和安全性。IL-12”武裝”的VVLΔTKΔN1L在全身給藥后顯示為誘導(dǎo)了嚴(yán)重毒性(圖18E)。引人注目的是，VVLΔTKΔN1L-IL21具有治療腹膜擴(kuò)散性胰腺癌的最高治療指數(shù)，70％的敘利亞倉鼠得到了治愈。