本申請要求于2014年5月1日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/987,098；和于2014年12月10日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/090,169的優(yōu)先權權益。

背景技術：

脂質具有多種工業(yè)應用，包括在化妝品和食品工業(yè)中，以及用作生物柴油和生物化學產品的前體。微生物脂質由包括經充分表征的酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）在內的許多產油生物體生產?？梢酝ㄟ^上調或下調或缺失涉及脂質通路的基因來提高產油生物體內的脂質產率。例如，據(jù)報道，上調天然解脂耶氏酵母DGA1顯著提高脂質產率和生產率(Metabolic Engineering 15:1-9 (2013))。

解脂耶氏酵母DGA1是由解脂耶氏酵母二酰基甘油?；D移酶基因DGAT2編碼的2型二?；视王；D移酶。DGA1是脂質通路中的關鍵酶之一，并且其涉及三?；视?TAG)合成的最終步驟。三酰基甘油是解脂耶氏酵母中儲存性脂質的主要形式。最新數(shù)據(jù)表明，DGA1效率可能是產油生物體內高水平的脂質積聚的顯著因素(Metabolic Engineering 15:1-9 (2013))。另外，來自其它物種的DGA1基因可以被引入到宿主基因組中并對脂質產量和組成具有顯著影響。例如，相比野生型解脂耶氏酵母菌株，其它產油酵母如圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）和斯達氏油脂酵母（Lipomyces starkeyi）能夠積聚明顯更多的脂質。結果表明，在解脂耶氏酵母中過表達來自具有更高天然脂質產量水平的生物體的DGA1，相比過表達天然解脂耶氏酵母DGA1，對解脂耶氏酵母脂質產量具有更大的影響(USSN 61/943,664；通過引用并入)。盡管試圖通過過表達來自高山被孢霉（Mortierella alpine）的DGA1來提高解脂耶氏酵母中的脂質產率，但尚未報道對脂質產量水平有顯著影響(美國專利7,198,937；通過引用并入)。

還已經研究了涉及脂質分解或從脂質生物合成中吸取流量的通路的基因的缺失。Dulermo 等人證實，三酰甘油脂酶基因TGL3的缺失使得解脂耶氏酵母所積聚的總脂質含量幾乎加倍(Biochimica Biophysica Acta 1831:1486-95 (2013))。TGL3蛋白是負責解脂耶氏酵母中三?；视徒到獾牡谝徊降膬煞N細胞內脂肪酶之一。

發(fā)明概述

在一些實施方案中，本發(fā)明提供了經轉化的產油細胞，其包含第一基因修飾和第二基因修飾，其中所述第一基因修飾提高天然二?；视王；D移酶的活性或編碼所述產油細胞原生的或來自不同物種的二?；视王；D移酶基因的至少一個拷貝，而其中所述第二基因修飾降低所述產油細胞中三酰甘油脂酶的活性。

在一些方面，本發(fā)明提供了提高細胞的脂質含量的方法，其包括用第一核酸和第二核酸轉化親代細胞，其中所述第一核酸提高天然二?；视王；D移酶的活性或包含二?；视王；D移酶基因，而所述第二核酸降低三酰甘油脂酶的活性。作為另外一種選擇，同一核酸可以同時包含上述兩種元件。因此，本發(fā)明還提供了提高細胞的脂質含量的方法，其包括用核酸轉化親代細胞，其中所述核酸降低所述細胞中三酰甘油脂酶的活性，并且所述核酸包含二?；视王；D移酶基因或提高天然二?；视王；D移酶的活性。

另外，在一些方面，本發(fā)明提供了提高細胞的三?；视秃康姆椒?，其包括：(a) 提供細胞，包含(i) 第一基因修飾，其中所述第一基因修飾提高天然二?；视王；D移酶的活性，或編碼產油細胞原生的或來自不同物種的二?；视王；D移酶基因的至少一個拷貝；和(ii) 第二基因修飾，其降低所述細胞中三酰甘油脂酶的活性；(b) 在表達所述第一基因修飾的條件下生長所述細胞，從而生產三?；视?；以及(c) 任選地回收所述三酰基甘油。

本領域技術人員將容易認識到，本發(fā)明非常適于實施目標并獲得所提及的以及本文內在的那些結果和優(yōu)點。本文所述的實施方案不旨在限制本發(fā)明的范圍。參照以下說明、附圖和權利要求將更好地理解本發(fā)明的這些以及其它特征、方面和優(yōu)點。

附圖簡述

圖1 示出了用于在解脂耶氏酵母菌株NS18（得自ARS培養(yǎng)物保藏中心，NRRL# YB 392）中過表達二?；视王；D移酶DGA1基因NG66的pNC243構建體的圖譜。在轉化前，通過PacI/NotI限制性內切酶消化使載體pNC243線性化。“2u ori”表示釀酒酵母的來自2 μm 環(huán)形質粒的復制起點；“pMB1 ori”表示大腸桿菌pMB1的來自pBR322質粒的復制起點；“AmpR”表示用作氨芐青霉素選擇標志物的bla基因；“PR2”表示解脂耶氏酵母GPD1啟動子，-931至-1；“NG66”表示由GenScript合成的天然圓紅冬孢酵母DGA1 cDNA；“TER1”表示解脂耶氏酵母CYC1終止子，停止后300個堿基對；“PR22”表示釀酒酵母TEF1啟動子，-412至-1；“NG3”表示用作諾爾絲菌素選擇標志物的諾爾斯鏈霉菌Nat1基因；“TER2”表示釀酒酵母CYC1終止子，停止后275個堿基對；而“Sc URA3”表示釀酒酵母URA3營養(yǎng)缺陷型酵母選擇標志物。

圖2 是描繪解脂耶氏酵母菌株NS421（其為三酰甘油脂酶敲除菌株）和解脂耶氏酵母菌株NS377（其為過表達二?；视王；D移酶DGA1基因NG66的三酰甘油脂酶敲除菌株）的基于熒光的脂質測定法的結果的圖。

圖3 是描繪解脂耶氏酵母菌株NS281（其過表達二?；视王；D移酶DGA1基因NG66）和解脂耶氏酵母菌株NS377（其包含三酰甘油脂酶敲除并且過表達二酰基甘油?；D移酶DGA1基因NG66）的氣相色譜分析的結果的圖。

圖4 描繪了用于在解脂耶氏酵母中過表達NG112基因(麥角菌（C. purpurea）DGA2)的pNC327構建體的圖譜。在轉化前，通過PacI/AscI限制性內切酶消化使載體pNC327線性化。“2u ori”表示釀酒酵母的來自2 μm 環(huán)形質粒的復制起點；“pMB1 ori”表示大腸桿菌pMB1的來自pBR322質粒的復制起點；“AmpR”表示用作氨芐青霉素選擇標志物的bla基因；“PR3”表示解脂耶氏酵母TEF1啟動子，-406至+125；“NG112”表示由GenScript合成的麥角菌DGA2基因；“TER1”表示解脂耶氏酵母CYC1終止子，停止后300 bp；“PR1”表示釀酒酵母TEF1啟動子，-406至-1；“NG76”表示用作博萊霉素選擇標志物的印度斯坦鏈異壁菌BLE基因；“TER7”表示解脂耶氏酵母TEF1終止子，停止后400 bp；而“Sc URA3”表示釀酒酵母URA3營養(yǎng)缺陷型酵母選擇標志物。

圖5 包括三個圖板，標記為圖板(A)、(B)和(C)。本圖描繪了通過基于熒光的測定法或如由氣相色譜法測定的干細胞重量 的百分比所測量的解脂耶氏酵母菌株NS297、NS281、NS450、NS377和NS432的脂質積聚。Ns297表達 解脂耶氏酵母 DGA1的額外的拷貝；NS281表達圓紅冬孢酵母DGA1；NS450表達圓紅冬孢酵母DGA1和麥角菌DGA2；NS377表達圓紅冬孢酵母并且攜帶解脂耶氏酵母TGL3的缺失；NS432表達圓紅冬孢酵母DGA1和麥角菌DGA2并且攜帶解脂耶氏酵母TGL3的缺失。在圖板(A)中，于48孔平板中發(fā)酵96小時后，通過熒光測定法分析菌株，其中針對每種構建體分析兩個或三個轉化體。在圖板(B)中，于50-mL燒瓶中發(fā)酵96小時后，通過熒光測定法和氣相色譜法分析菌株。在圖板(C)中，于1-L生物反應器中發(fā)酵140小時后，通過氣相色譜法分析菌株。NS281、NS377和NS432的數(shù)據(jù)是得自重復的生物反應器發(fā)酵的平均值。NS450的數(shù)據(jù)表示得自單次生物反應器發(fā)酵的值。

發(fā)明詳述

概述

公開了用于生成具有增加的三?；视秃康慕涋D化的產油細胞的方法和組合物。破壞酵母的三酰甘油脂酶基因TGL3消除耗盡三?；视秃康耐?。另外，過表達二酰基甘油?；D移酶DGA1增加可以合成三酰基甘油的蛋白質的量。因此，將DGA1過表達與TGL3缺失結合可能是進一步提高細胞的三?；视秃康挠形Φ姆椒?；然而，操縱影響代謝途徑的蛋白質即使在最好的情況下也是不可預測的。抑制基因修飾的作用的細胞相對于獲得所需特性的那些往往具有選擇優(yōu)勢。因此，顯示所需表型的細胞通常難以工程改造。

公開了成功結合TGL3缺失與DGA1過表達以提高細胞的三?；视秃?。在解脂耶氏酵母菌株中缺失TGL3并同時表達圓紅冬孢酵母DGA1二?；视王；D移酶得到相比攜帶單一基因修飾的菌株更高的三?；视秃俊?/p>

定義

本文中所用的冠詞“一（個、種……）”（“a”和“an”）指代物品的一（個、種……）或不止一（個、種……）（即，至少一（個、種……））語法對象。譬如，“要素”意指一個（種）要素或不止一個（種）要素。

術語“活性”指代細胞發(fā)揮功能的總體能力。例如，降低細胞中三酰甘油脂酶的活性的基因修飾可能減少細胞中三酰甘油脂酶的量或降低三酰甘油脂酶的效率。三酰甘油脂酶敲除減少所述細胞中三酰甘油脂酶的量。作為另外一種選擇，三酰甘油脂酶基因的突變可能降低其三酰甘油脂酶蛋白質產物的效率，而對細胞的三酰甘油脂酶的量影響甚微。降低三酰甘油脂酶效率的突變可能影響活性位點，例如，通過改變一個或多個活性位點殘基；其可能損害該酶的動力學（kinetics），例如，通過空間阻擋底物或產物；其可能影響蛋白質折疊或動力學（dynamics），例如，通過降低正確折疊的酶的比例；其可能影響蛋白質定位，例如，通過防止所述脂肪酶定位到脂質顆粒上；或其可能影響蛋白質降解，例如，通過添加一個或多個蛋白質裂解位點或通過添加靶向所述蛋白質的蛋白水解的一個或多個殘基或氨基酸序列。這些突變影響編碼區(qū)。降低三酰甘油脂酶活性的突變可能轉而影響基因的轉錄或翻譯。例如，三酰甘油脂酶增強子或啟動子的突變可以通過減少其表達而降低三酰甘油脂酶活性。突變或缺失三酰甘油脂酶基因的非編碼部分（如其內含子）也可能減少轉錄或翻譯。另外，三酰甘油脂酶的上游調節(jié)因子的突變可能影響三酰甘油脂酶活性；例如，過表達一種或多種阻遏子可能降低三酰甘油脂酶活性，而一種或多種活化因子的敲除或突變可能類似地降低三酰甘油脂酶活性。提高細胞中二酰基甘油?；D移酶的活性的基因修飾可能增加細胞中二?；视王；D移酶的量或提高二?；视王；D移酶的效率。例如，所述基因修飾可能簡單地將二酰基甘油?；D移酶的額外的拷貝插入到細胞中，使得所述額外的拷貝被轉錄并翻譯成額外的功能性二?；视王；D移酶。所添加的二?；视王；D移酶基因可以是所述宿主生物體原生的或來自不同的生物體。作為另外一種選擇，突變或缺失天然二酰基甘油?；D移酶基因的非編碼部分（如其內含子）也可能增加翻譯?？梢酝ㄟ^添加引起更多轉錄的新的啟動子來改變天然的二?；视王；D移酶基因。類似地，可將增強子添加到二酰基甘油?；D移酶基因中以增加轉錄，或可從二酰基甘油?；D移酶基因中突變或缺失沉默子以增加轉錄。天然基因的編碼區(qū)的突變也可能提高二酰基甘油?；D移酶活性，例如，通過產生不與抑制性蛋白質或分子相互作用的蛋白質變體。過表達一種或多種活化因子可能通過增加二?；视王；D移酶蛋白質的表達來提高二?；视王；D移酶活性，而敲除或突變一種或多種阻遏子可能類似地提高二?；视王；D移酶活性。

術語“生物活性部分”指代這樣的氨基酸序列，其短于全長氨基酸序列，但具有所述全長序列的至少一種活性。例如，二?；视王；D移酶的生物活性部分可能指代DGA1或DGA2的一個或多個域，其具有將?；o酶A和二酰基甘油轉化成三?；视偷纳锘钚?。DGA1的生物活性部分包括這樣的肽或多肽，其包含與所述DGA1蛋白的氨基酸序列充分相同或來源于所述DGA1蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列，例如，如SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示的氨基酸序列，其包含少于所述全長DGA1的氨基酸，并具有DGA1蛋白的至少一種活性。類似地，DGA2蛋白的生物活性部分包括這樣的肽或多肽，其包含與所述DGA2蛋白的氨基酸序列充分相同或來源于所述DGA2蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列，例如，如SEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、63、65、67、69、71、73或75中所示的氨基酸序列，其包含少于所述全長DGA2的氨基酸，并具有DGA2蛋白的至少一種活性。DGA3蛋白的生物活性部分包括這樣的肽或多肽，其包含與所述DGA3蛋白的氨基酸序列充分相同或來源于所述DGA3蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列，例如，如SEQ ID NO: 83或85中所示的氨基酸序列，其包含少于所述全長DGA3的氨基酸，并具有DGA3蛋白的至少一種活性。二酰基甘油?；D移酶的生物活性部分可能包含，例如，100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695或696個氨基酸。通常，生物活性部分包含具有催化活性的域或基序，所述催化活性是將?；o酶A和二?；视娃D化成三酰基甘油。DGA1蛋白的生物活性部分可以是多肽，其長度為例如278個氨基酸。

術語“DGAT1”指代編碼1型二?；视王；D移酶蛋白的基因，如編碼DGA2蛋白的基因。

術語“DGAT2”指代編碼2型二?；视王；D移酶蛋白的基因，如編碼DGA1蛋白的基因。

術語“DGAT3”指代編碼2型二?；视王；D移酶蛋白的基因，如編碼DGA3蛋白的基因。

“二?；视王?/i>”、“二?；视?/i>”和“甘油二酯”是由甘油和兩個脂肪酸構成的酯類。

術語“二?；视王；D移酶”和“DGA”指代催化從二?；视托纬扇；视王サ娜魏蔚鞍踪|。二?；视王；D移酶包括1型二酰基甘油?；D移酶(DGA2)、2型二?；视王；D移酶(DGA1)以及所有催化上述反應的同系物。

術語“二酰基甘油?；D移酶，1型”和“1型二?；视王；D移酶”指代DGA2和DGA2直系同源物。

術語“二?；视王；D移酶，2型”和“2型二?；视王；D移酶”指代DGA1和DGA1直系同源物。

術語“二?；视王；D移酶，3型”和“3型二?；视王；D移酶”指代DGA3和DGA3直系同源物。

術語“域”指代蛋白質的氨基酸序列的一部分，其能夠獨立于該蛋白質的其余部分而折疊成穩(wěn)定的三維結構。

術語“藥物”指代任何這樣的分子，其抑制細胞生長或增殖，從而為含有賦予針對該藥物的抗性的基因的細胞提供選擇優(yōu)勢。藥物包括抗生素、抗菌劑、毒素和殺蟲劑。

“干重”和“干細胞重量”意指在相對不存在水的情況下測定的重量。例如，提到產油細胞包含以干重計指定百分比的特定組分意指該百分比是基于已經除去基本上所有水之后的細胞重量計算的。

術語“編碼”指代包含編碼區(qū)、編碼區(qū)的一部分的核酸，或其補體。DNA和RNA均可編碼基因。DNA和RNA均可編碼蛋白質。

術語“外源性”指代被引入細胞中的任何物質。“外源性核酸”是穿過細胞膜進入細胞的核酸。外源性核酸可含有存在于細胞的天然基因組中的核苷酸序列和/或此前不存在于該細胞的基因組中的核苷酸序列。外源性核酸包括外源性基因。“外源性基因”是已經被引入細胞中的（例如，通過轉化/轉染）編碼用于RNA和/或蛋白質表達的核酸，并且也被稱為“轉基因”。包含外源性基因的細胞可被稱為重組細胞，可向其中引入額外的外源性基因。外源性基因可來自與接受轉化的細胞相同或不同的物種。因此，外源性基因可以包括在細胞的基因組中占據(jù)不同位置的天然基因或相對于該基因的內源性拷貝處于不同的控制之下。外源性基因可在細胞中具有不止一個拷貝。外源性基因可作為基因組中（核或質體）的插入或作為游離分子被保持在細胞中。

術語“表達”指代細胞中核酸或氨基酸序列（例如，肽、多肽或蛋白質）的量?；虻谋磉_增加指代該基因的轉錄增加。氨基酸序列、肽、多肽或蛋白質的表達增加指代編碼該氨基酸序列、肽、多肽或蛋白質的核酸的翻譯增加。

術語“基因”，如本文中所用，可涵蓋含有外顯子（特別是編碼涉及特定活性的多肽序列的多核苷酸序列）的基因組序列。該術語還涵蓋并非來源于基因組序列的合成的核酸。在某些實施方案中，所述基因缺少內含子，因為其是根據(jù)cDNA的已知DNA序列和蛋白質序列合成的。在其它實施方案中，所述基因是合成的、非天然cDNA，其中密碼子已經基于密碼子使用而被優(yōu)化用于在解脂耶氏酵母中表達。該術語還可以包括包含上游、下游和/或內含子核苷酸序列的核酸分子。

術語“基因修飾”指代轉化的結果。根據(jù)定義，每種轉化均引起基因修飾。

術語“同系物”，如本文中所用，指代：(a) 肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶，其相對于未經修飾的所考慮的蛋白質具有氨基酸置換、缺失和/或插入并且與其所來源于的未經修飾的蛋白質具有相似的生物及功能活性，和(b)核酸，其編碼具有(a)中所述的相同特性的肽、寡肽、多肽、蛋白質和酶。

“誘導型啟動子”是這樣的啟動子，其響應于特定刺激而介導可操作地連接的基因的轉錄。

術語“整合的”指代作為細胞的基因組中的插入（如染色體中的插入，包括質體基因組中的插入）而保持在該細胞中的核酸。

“處于可操作的連接”指代兩個核酸序列（如控制序列（通常是啟動子）和所連接的序列（通常是編碼蛋白質的序列，也被稱為編碼序列））之間的功能性連接。如果啟動子可以介導基因的轉錄，則其與該基因處于可操作的連接。

術語“敲除突變”或“敲除”指代這樣的基因修飾，其阻止天然基因被轉錄及翻譯成功能性蛋白質。

術語“天然的”指代細胞或親代細胞在轉化事件之前的組成?！?i>天然基因”指代尚未通過轉化事件被引入細胞中的編碼蛋白質的核苷酸序列。“天然蛋白質”指代由天然基因編碼的氨基酸序列。

術語“核酸”指代任何長度的核苷酸的聚合形式，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物。多核苷酸可具有任何三維結構，并且可發(fā)揮任何功能。以下是多核苷酸的非限制性實例：基因或基因片段的編碼或非編碼區(qū)、由連鎖分析所定義的基因座、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、支鏈多核苷酸、質粒、載體、具有任何序列的分離的DNA、具有任何序列的分離的RNA、核酸探針以及引物。多核苷酸可包含經修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸及核苷酸類似物。如果存在，可能在組裝該聚合物之前或之后將修飾賦予所述核苷酸結構。多核苷酸可如通過與標記組分結合而被進一步修飾。在本文提供的所有核酸序列中，U核苷酸與T核苷酸是可互換的。

術語“親代細胞”指代細胞從其演變而來的每種細胞。細胞的基因組由親代細胞的基因組和對所述親代細胞的基因組的任何后續(xù)基因修飾所構成。

如本文中所用，術語“質粒”指代與生物體的基因組DNA在物理上分離的環(huán)狀DNA分子。質?？稍诒灰胨拗骷毎氨痪€性化（本文中稱為線性化質粒）。線性化質?？赡懿粫晕覐椭?，但可能整合到生物體的基因組DNA中并與之一同復制。

術語“部分”指代肽、寡肽、多肽、蛋白質域以及蛋白質。編碼“蛋白質的一部分”的核苷酸序列既包括可以被轉錄和/或翻譯的核苷酸序列，也包括必須經歷一個或多個重組事件從而被轉錄和/或翻譯的核苷酸序列。例如，核酸可包含編碼選擇標志物蛋白的一個或多個氨基酸的核苷酸序列。此核酸可以經工程改造以與編碼所述蛋白質的其余部分的一個或多個不同的核苷酸序列重組。此類核酸可用于生成敲除突變，因為只有與靶序列的重組可能重構全長選擇標志物基因，而隨機整合事件不太可能得到可以產生功能性標志物蛋白的核苷酸序列。多肽的“生物活性部分”是存在于該多肽的氨基酸序列中的任何氨基酸序列，其短于完整的氨基酸序列但可以發(fā)揮與全長多肽相同的功能。二酰基甘油?；D移酶的生物活性部分包括存在于全長二?；视王；D移酶中的任何氨基酸序列，其可以催化從二?；视秃王；o酶A形成三?；视汀６嚯牡纳锘钚圆糠职ㄔ摱嚯牡倪@些部分，其具有與全長肽相同的活性，并且每個部分具有高于背景的活性。例如，二?；视王；D移酶的生物活性部分可能相對于全長多肽具有百分之0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9、100、100.1、100.2、100.3、100.4、100.5、100.6、100.7、100.8、100.9、101、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400或更高的活性。多肽的生物活性部分可能包括肽的這些部分，其缺少將該多肽靶向細胞區(qū)室的域。

“啟動子”是指導核酸轉錄的核酸控制序列。如本文中所用，啟動子包含轉錄起始位點附近的必要核酸序列。啟動子還任選地包含遠端增強子或阻遏子元件，其可以位于距離轉錄起始位點多達數(shù)千堿基對。

“重組體”指代這樣的細胞、核酸、蛋白質或載體，其由于外源性核酸的引入或天然核酸的改變已經被修飾。因此，例如，重組細胞可以表達不存在于天然形式的（非重組的）細胞中的基因，或以與由非重組細胞表達那些基因不同的方式表達天然基因。重組細胞可以包含但不限于這樣的重組核酸，其編碼基因產物或抑制元件如降低細胞中活性基因產物水平的突變、敲除、反義、干擾RNA(RNAi)或dsRNA。“重組核酸”是這樣的核酸，其通常通過操縱核酸例如使用聚合酶、連接酶、核酸外切酶和核酸內切酶而最初體外形成，或者處于通常不存在于自然界中的形式。可產生重組核酸例如以將兩個或多個核酸置于可操作的連接。因此，通過連接通常不天然相連的DNA分子而在體外形成的分離的核酸或表達載體，對于本發(fā)明而言均被認為是重組的。一旦重組核酸被制造并引入宿主細胞或生物體中，其可使用該宿主細胞的體內細胞機制進行復制；然而，這類核酸，一旦被重組產生，盡管之后被細胞內復制，對于本發(fā)明而言其依然被認為是重組的。類似地，“重組蛋白”是采用重組技術（即，通過表達重組核酸）制造的蛋白質。

術語“調控區(qū)”指代影響基因的轉錄或翻譯但不編碼氨基酸序列的核苷酸序列。調控區(qū)包括啟動子、操縱子、增強子和沉默子。

“轉化”指代將核酸轉移到宿主生物體或宿主生物體的基因組中，得到基因上穩(wěn)定的遺傳。含有轉化的核酸片段的宿主生物體被稱為“重組的”、“轉基因的”或“轉化的”生物體。因此，本發(fā)明的分離的多核苷酸可以被并入重組構建體（通常為DNA構建體），其能夠被引入宿主細胞并在其中復制。此類構建體可以是這樣的載體，其包含復制系統(tǒng)和能夠在給定的宿主細胞中轉錄并翻譯多肽編碼序列的序列。通常，表達載體包含，例如，處于5'和3'調控序列的轉錄控制下的一個或多個克隆的基因以及選擇標志物。此類載體還可以含有啟動子調控區(qū)（例如，控制誘導型或組成型、環(huán)境或發(fā)育調控的、或位置特異性表達的調控區(qū)）、轉錄起始位點、核糖體結合位點、轉錄終止位點和/或多腺苷酸化信號。

術語“經轉化的細胞”指代已經歷過轉化的細胞。因此，經轉化的細胞包含親代的基因組和可遺傳的基因修飾。

術語“三酰基甘油酯”、“三酰基甘油”、“三甘油酯”和“TAG”是由甘油和三個脂肪酸構成的酯類。

術語“三酰甘油脂酶”指代可以催化從三?；视鸵瞥舅徭湹娜魏蔚鞍踪|。三酰甘油脂酶包括TGL3、TLG3/4和TGL4。

術語“載體”指代這樣的裝置，通過其可以使核酸在生物體、細胞或細胞組分之間傳播和/或轉移。載體包括質粒、線性DNA片段、病毒、細菌噬菌體、原病毒、噬粒、轉座子和人工染色體等，其可能或可能無法自主復制或整合到宿主細胞的染色體中。

微生物工程改造

A.概述

在本發(fā)明的某些實施方案中，微生物經基因修飾以增加其三?；视秃俊?/p>

基因和基因產物可被引入微生物宿主細胞中。用于表達基因和核酸分子的合適的宿主細胞是可廣泛見于真菌或細菌科的微生物宿主。合適的宿主菌株的實例包括但不限于：真菌或酵母物種，如Arxula、曲霉菌屬、裂殖壺菌屬、假絲酵母屬、麥角菌屬、隱球菌屬、小克銀漢霉屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、Leucosporidiella、油脂酵母屬、被孢霉屬、Ogataea、畢赤酵母屬、原囊藻屬、根霉菌屬、紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、酵母菌屬、裂殖酵母屬、銀耳屬、絲孢酵母屬、耶氏酵母屬；或細菌物種，如蛋白菌和放線菌的成員，以及不動桿菌屬、節(jié)桿菌屬、短桿菌屬、食酸菌屬、芽孢桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、鏈霉菌屬、埃希桿菌屬、沙門氏菌屬、假單胞菌屬和棒狀桿菌屬。解脂耶氏酵母和Arxula adeninivorans適合用作宿主微生物，因為其可以積聚占其重量的很大百分比的三?；视?。

微生物表達系統(tǒng)和含有指導外來蛋白質的高水平表達的調控序列的表達載體是本領域技術人員已知的。這些中的任一者均可被用于構建嵌合基因以產生相關序列的基因產物中的任一者。然后這些嵌合基因可以通過轉化技術被引入到適當?shù)奈⑸镏幸蕴峁┻@些酶的高水平表達。

例如，編碼酶的基因可以被克隆到合適的質粒中，并可以用所得質粒轉化作為宿主的上述起始親代菌株。此方法可以增加編碼這些酶的基因中的每一者的拷貝數(shù)，并因而可以提高這些酶的活性。所述質粒不受特定的限制，只要其使得所需的基因修飾能遺傳給該微生物的子代。

可用于轉化合適的宿主細胞的載體或盒是本領域熟知的。所述載體或盒通常含有指導相關基因的轉錄和翻譯的序列、選擇標志物和允許自主復制或染色體整合的序列。合適的載體包含攜帶轉錄起始控制的基因的5’區(qū)和控制轉錄終止的DNA片段的3’區(qū)。當兩個控制區(qū)均來源于與轉化的宿主細胞同源的基因時，是優(yōu)選的，但應當理解，此類控制區(qū)不必來源于被選作生產宿主的特定物種原生的基因。

載體的啟動子、cDNA和3'UTR以及其它元件可以通過克隆技術使用分離自天然來源的片段生成(Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (第4版, 2012); 美國專利號 4,683,202; 通過引用并入)。作為另外一種選擇，元件可以使用已知方法合成生成(Gene 164:49-53 (1995))。

B.同源重組

同源重組是互補DNA序列對齊并交換同源區(qū)的能力。含有與所靶向的基因組序列(“模板”)同源的序列的轉基因DNA(“供體”)被引入到生物體中并隨后被重組至基因組中對應的同源基因組序列的位點。

在宿主生物體中進行同源重組的能力對于什么可以在分子遺傳學水平上進行具有許多實際的影響，并且可用于生成可以生產所需產物的微生物。就其本質，同源重組是精確的基因靶向事件，并因此，大多數(shù)生成的具有相同靶向序列的轉基因系在表型上將基本上相同，使得需要篩選少得多的轉化事件。同源重組還靶向基因插入宿主染色體事件，可能導致出色的遺傳穩(wěn)定性，即使在不存在遺傳選擇的情況下。因為不同的染色體基因座將可能影響基因表達（即使來自外源性啟動子/UTR），所以同源重組可以是在不熟悉的基因組環(huán)境中查詢基因座并評估這些環(huán)境對基因表達的影響的方法。

使用同源重組的特別有用的基因工程改造方法是指派特定的宿主調控元件（如啟動子/UTR）從而以高度特異的方式驅動異源基因表達。

因為同源重組是精確的基因靶向事件，所以其可以被用于精確地修飾目標基因或區(qū)內的任何核苷酸，只要已經識別出足夠的側接區(qū)。因此，同源重組可以被用作修飾影響RNA和/或蛋白質的基因表達的調控序列的方法。其還可以被用于修飾蛋白質編碼區(qū)，借此修飾酶活性如底物特異性、親和力和Km，從而影響宿主細胞代謝中的所需變化。同源重組提供了操縱宿主基因組的有力手段，其導致基因靶向、基因轉換、基因缺失、基因重復、基因倒置以及交換基因表達調控元件如啟動子、增強子和3'UTR。

同源重組可以通過以下方式實現(xiàn)：使用含有內源性序列片斷的靶向構建體以“靶向”內源性宿主細胞基因組內的目標基因或區(qū)。此類靶向序列可以位于目標基因或區(qū)的5’、目標基因/區(qū)的3’或甚至側接目標基因/區(qū)。此類靶向構建體可以作為具有額外的載體主鏈的超螺旋質粒DNA、不含載體主鏈的PCR產物或作為線性化分子而被轉化到宿主細胞中。在一些情況下，可能有利的是先通過用限制性內切酶切割轉基因DNA而使轉基因DNA（供體DNA）內的同源序列暴露。此步驟可以提高重組效率并降低不期望事件的發(fā)生率。提高重組效率的其它方法包括使用PCR以生成含有與被靶向的基因組序列同源的線性末端的轉化轉基因DNA。

C.載體和載體組分

根據(jù)本發(fā)明的用于轉化微生物的載體可以通過本領域技術人員熟悉的已知技術根據(jù)本文的公開內容制備。載體通常含有一個或多個基因，其中每個基因編碼表達所需產物（基因產物），并且被可操作地連接至一個或多個控制序列，所述控制序列調控基因表達或將基因產物靶向重組細胞中的特定位置。

1.控制序列

控制序列是這樣的核酸，其調控編碼序列的表達或將基因產物引導至細胞內或細胞外的特定位置。調控表達的控制序列包括例如，調控編碼序列轉錄的啟動子和終止編碼序列轉錄的終止子。另一種控制序列是位于編碼序列末端的3'未翻譯序列，其編碼多腺苷酸化信號。將基因產物引導至特定位置的控制序列包括編碼信號肽的那些，其將其所附接的蛋白質引導至細胞內或細胞外的特定位置。

因此，用于在微生物中表達基因的示例性載體設計含有所需基因產物（例如，選擇標志物或酶）的編碼序列，所述編碼序列與在酵母中有活性的啟動子處于可操作的連接。作為另外一種選擇，如果所述載體不含與目標編碼序列處于可操作連接的啟動子，則所述編碼序列可以被轉化到細胞中使得在載體整合時其被可操作地連接至內源性啟動子。

用于表達基因的啟動子可以是天然連接至該基因的啟動子或不同的啟動子。

啟動子通?？梢员槐碚鳛榻M成型或誘導型。組成型啟動子通常是活躍或發(fā)揮功能以在所有時間（或在細胞生命周期中的某些時間）以相同水平驅動表達。相反地，誘導型啟動子僅響應于刺激而活躍（或使之失活）或顯著上調或下調。兩種類型的啟動子均可應用于本發(fā)明的方法中。可用于本發(fā)明的誘導型啟動子包括響應于刺激（如外源提供的小分子、溫度（加熱或冷卻）、培養(yǎng)基中缺氮，等）而介導可操作連接的基因的轉錄的那些。合適的啟動子可以活化基本上沉默的基因的轉錄，或（優(yōu)選大幅度地）上調以低水平轉錄的可操作連接的基因的轉錄。

包含終止區(qū)控制序列是任選的，并且如果采用，則該選擇主要是出于方便，因為終止區(qū)是相對可互換的。所述終止區(qū)可能是轉錄起始區(qū)（啟動子）原生的，可能是目標DNA序列原生的，或可能是得自另一種來源的（參見，例如，Chen & Orozco, Nucleic Acids Research 16:8411 (1988)）。

2.基因和密碼子優(yōu)化

通常，基因包含啟動子、編碼序列和終止控制序列。當通過重組DNA技術組裝時，基因可能被稱為表達盒并且可能側接限制性位點以方便插入到載體中，所述載體用于將所述重組基因引入到宿主細胞中。所述表達盒可以側接來自基因組或其它核酸靶標的DNA序列以促進通過同源重組將所述表達盒穩(wěn)定整合到基因組中。作為另外一種選擇，所述載體及其表達盒可能保持未整合的狀態(tài)（例如，附加體），在這種情況下，所述載體通常包含復制起點，其能夠提供所述載體DNA的復制。

載體上常見的基因是編碼蛋白質的基因，其表達允許將含有該蛋白質的重組細胞與不表達該蛋白質的細胞區(qū)分開來。此類基因及其對應的基因產物被稱為可選擇標志物或選擇標志物。在可用于轉化本發(fā)明的生物體的轉基因構建體中可以采用多種選擇標志物中的任一種。

為了重組蛋白的最優(yōu)表達，采用產生具有待轉化的宿主細胞所優(yōu)化使用的密碼子的mRNA的編碼序列是有利的。因此，轉基因的正確表達可以要求該轉基因的密碼子使用與將在其中表達該轉基因的生物體的特定密碼子偏好相匹配。雖然構成此效應的基礎的精確機制有許多，但包括可用的氨?；痶RNA集合與正在細胞中合成的蛋白質的適當平衡，再加上轉基因信使RNA(mRNA)的更有效的翻譯（當此需要滿足時）。當轉基因中的密碼子使用未被優(yōu)化，可用的tRNA集合不足以允許轉基因mRNA的有效翻譯，導致核糖體延誤和終止以及該轉基因mRNA可能的不穩(wěn)定性。

D.轉化

可以通過任何合適的技術轉化細胞，例如，基因槍、電穿孔、玻璃微珠轉化以及碳化硅晶須轉化。用于將轉基因引入到微生物中的任何便利的技術均可用于本發(fā)明中。轉化可以通過以下方法實現(xiàn)：例如，D. M. Morrison (Methods in Enzymology 68:326 (1979))的方法、通過用氯化鈣增加受體細胞對DNA的滲透性的方法(Mandel & Higa, J. Molecular Biology, 53:159 (1970))等。

在產油酵母（例如，解脂耶氏酵母）中表達轉基因的實例可見于文獻中(Bordes 等人，J. Microbiological Methods, 70:493 (2007); Chen 等人，Applied Microbiology & Biotechnology 48:232 (1997))。在細菌如大腸桿菌中表達外源性基因的實例是眾所周知的(Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (第4版，2012))。

根據(jù)本發(fā)明的用于轉化微生物的載體可以通過本領域技術人員熟悉的已知技術制備。在一個實施方案中，用于在微生物中表達基因的示例性載體設計含有編碼酶的基因，所述基因與在該微生物中有活性的啟動子處于可操作的連接。作為另外一種選擇，如果所述載體不含與目標基因處于可操作連接的啟動子，則所述基因可以被轉化到細胞中使得在載體整合時其被可操作地連接至天然啟動子。所述載體還可以含有編碼蛋白質的第二個基因。任選地，一個或兩個基因均后接含有多腺苷酸化信號的3'未翻譯序列。編碼這兩個基因的表達盒可以在所述載體上物理連接或位于單獨的載體上。還可以使用微生物共轉化，其中同時使用不同的載體分子以轉化細胞(Protist 155:381-93 (2004))?？梢匀芜x地基于在存在抗生素或其它選擇標志物的情況下生長的能力（在缺少所述抗性盒的細胞將無法生長的條件下）選擇經轉化的細胞。

示例性核酸、細胞和方法

A. 二?；视王；D移酶核酸分子及載體

所述二酰基甘油?；D移酶可能是1型二?；视王；D移酶、2型二酰基甘油?；D移酶、3型二?；视王；D移酶或催化二?；视娃D化成三?；视王サ娜魏纹渌鞍踪|。在一些實施方案中，所述二?；视王；D移酶是DGA1。例如，所述二?；视王；D移酶可能是由選自以下的DGAT2基因編碼的DGA1蛋白：Arxula adeninivorans、土曲霉、裂殖壺菌、麥角菌、密粘褶菌、斯達氏油脂酵母、花藥黑粉菌、季也蒙畢赤酵母、三角褐指藻、禾柄銹菌、倒卵形紅冬孢酵母、圓紅冬孢酵母、禾本紅酵母和解脂耶氏酵母。

所述DGAT2基因可能具有SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62中所示的核苷酸序列。在其它實施方案中，所述DGAT2基因與SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62基本上相同，并且所述核苷酸序列編碼的蛋白質保持了由SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62編碼的蛋白質的功能活性，盡管由于天然的等位基因變化或誘變而在核苷酸序列上有所不同。在另一個實施方案中，所述DGAT2基因包含與SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或以上相同的核苷酸序列。

所述DGA1可能具有SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61中所示的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述DGA1與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61基本上相同，并且保持了SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61的蛋白質的功能活性，盡管由于天然的等位基因變化或誘變而在氨基酸序列上有所不同。在另一個實施方案中，所述DGA1蛋白包含與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59或61至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或以上相同的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述二?；视王；D移酶是DGA2。例如，所述二酰基甘油?；D移酶可能是由存在于選自以下的生物體中的DGAT1基因編碼的DGA2蛋白：Arxula adeninivorans、土曲霉、球毛殼菌、麥角菌、斯達氏油脂酵母、蝗綠僵菌、冬蟲夏草菌、三角褐指藻、季也蒙畢赤酵母、圓紅冬孢酵母、禾本紅酵母、綠木霉和解脂耶氏酵母。

所述DGAT1基因可能具有SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、64、66、68、70、72、74或76中所示的核苷酸序列。在其它實施方案中，所述DGAT1基因與SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、64、66、68、70、72、74或76基本上相同，并且所述核苷酸序列編碼的蛋白質保持了由SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、64、66、68、70、72、74或76編碼的蛋白質的功能活性，盡管由于天然的等位基因變化或誘變而在核苷酸序列上有所不同。在另一個實施方案中，所述DGAT1基因包含與SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、64、66、68、70、72、74或76至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或以上相同的核苷酸序列。

所述DGA2可能具有SEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、63、65、67、69、71、73或75中所示的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述DGA2與SEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、63、65、67、69、71、73或75基本上相同，并且保持了SEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、63、65、67、69、71、73或75的蛋白質的功能活性，盡管由于天然的等位基因變化或誘變而在氨基酸序列上有所不同。在另一個實施方案中，所述DGA2蛋白包含與SEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、63、65、67、69、71、73或75至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或以上相同的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述二?；视王；D移酶是DGA3。例如，所述二?；视王；D移酶可能是由存在于選自以下的生物體中的DGAT3基因編碼的DGA3蛋白：蓖麻和花生。

所述DGAT3基因可能具有SEQ ID NO: 84或86中所示的核苷酸序列。在其它實施方案中，所述DGAT3基因與SEQ ID NO: 84或86基本上相同，并且所述核苷酸序列編碼的蛋白質保持了由SEQ ID NO: 84或86編碼的蛋白質的功能活性，盡管由于天然的等位基因變化或誘變而在核苷酸序列上有所不同。在另一個實施方案中，所述DGAT3基因包含與SEQ ID NO: 84或86至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或以上相同的核苷酸序列。

所述DGA3可能具有SEQ ID NO: 83或85中所示的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述DGA3與SEQ ID NO: 83或85基本上相同，并且保持了SEQ ID NO: 83或85的蛋白質的功能活性，盡管由于天然的等位基因變化或誘變而在氨基酸序列上有所不同。在另一個實施方案中，所述DGA3蛋白包含與SEQ ID NO: 83或85至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或以上相同的氨基酸序列。

所述DGAT1、DGAT2和DGAT3基因可包含保守置換、缺失和/或插入，而同時仍然編碼具有功能性二酰基甘油?；D移酶活性的蛋白質。例如，可針對特定的宿主細胞優(yōu)化所述DGAT1、DGAT2或DGAT3密碼子，可置換不同的密碼子以便于如引入限制性位點或生成最佳PCR引物，或者可出于另一目的而置換密碼子。類似地，可改變所述核苷酸序列以產生保守氨基酸置換、缺失和/或插入。

所述DGA1、DGA2和DGA3多肽可包含保守置換、缺失和/或插入，而同時仍然保持功能性二?；视王；D移酶活性。保守置換表是本領域熟知的(Creighton, Proteins (第2版, 1992))。

可使用重組DNA操縱技術容易地制造氨基酸置換、缺失和/或插入。操縱DNA序列以產生蛋白質的置換、插入或缺失變體的方法是本領域熟知的。這些方法包括：M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB, Cleveland, OH)、Quick Change定點誘變(Stratagene, San Diego, CA)、PCR介導的定點誘變以及其它定點誘變方案。

為了確定兩個氨基酸序列或兩個核苷酸序列的百分比同一性，可以出于最佳比較的目的而將這些序列對齊（例如，可以出于最佳比對的目的而在第一和第二氨基酸或核苷酸序列的一個或兩個中引入空位，并且可以出于比較目的而忽略非相同序列）。出于比較目的而對齊的參考序列的長度可以是所述參考序列的長度的至少95%。然后可以比較處于對應的氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當所述第一序列中的位置與所述第二序列中的對應位置被相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，則所述分子在該位置是相同的（如本文中所用，氨基酸或核酸的“同一性”等同于氨基酸或核酸的“同源性”）。所述兩個序列之間的百分比同一性是所述序列共享的相同位置的數(shù)量的函數(shù)，并同時考慮到空位的數(shù)量以及每個空位的長度，需要引入所述空位以用于所述兩個序列的最佳比對。

比較序列并確定兩個序列之間的百分比同一性可以使用數(shù)學算法完成。在一個實施方案中，兩個氨基酸序列之間的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch(J. Molecular Biology 48:444-453 (1970))的算法確定，該算法已經被結合到GCG軟件包的GAP程序中(可從http://www.gcg.com獲得)，使用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣，而空位權重為16、14、12、10、8、6或4并且長度權重為1、2、3、4、5或6。在又另一個實施方案中，兩個核苷酸序列之間的百分比同一性可以使用GCG軟件包的GAP程序(可從http://www.gcg.com獲得)確定，使用NWSgapdna.CMP矩陣，而空位權重為40、50、60、70或80并且長度權重為1、2、3、4、5或6。在另一個實施方案中，兩個氨基酸或核苷酸序列之間的百分比同一性可以使用E. Meyers和W. Miller的算法(Computer Applications in the Biosciences 4:11-17 (1988))確定，該算法已經被結合到ALIGN程序(版本 2.0 或 2.0U)中，使用PAM120權重殘基表，空位長度罰分為12并且空位罰分為4。

可以用于確定兩個序列之間的同一性的示例性計算機程序包括但不限于：BLAST程序套件，例如，BLASTN、MEGABLAST、BLASTX、TBLASTN、TBLASTX和BLASTP，以及Clustal程序，例如，ClustalW、ClustalX和Clustal Omega。

當相對于GenBank DNA序列以及其它公共數(shù)據(jù)庫中的核酸序列而評價給定的核酸序列時，通常使用BLASTN程序進行序列搜索。BLASTX程序可有效用于針對GenBank蛋白質序列以及其它公共數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列來搜索已經在全部閱讀框中被翻譯的核酸序列。

使用例如CLUSTAL-W程序進行選定序列的比對以確定兩個或多個序列之間的“%同一性”。

“編碼序列”或“編碼區(qū)”指代具有生產蛋白質產物（如氨基酸或多肽）所必需的序列信息（當表達該序列時）的核酸分子。所述編碼序列可能在已翻譯區(qū)內包含未翻譯序列（包括內含子或5'或3'未翻譯區(qū)）并且/或者由其組成，或可能缺少此類介入的未翻譯序列（例如，如在cDNA中）。

用于整個說明書中以指代包含核苷酸序列和/或由其組成的核酸的縮寫是常規(guī)的單字母縮寫。因此，當包含在核酸中時，天然存在的編碼核苷酸縮寫如下：腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。同樣，除非另外指明，否則本文提供的核酸序列均為5?’→3?’方向。

如本文中所用，術語“互補的”及其派生詞被用于涉及通過眾所周知的法則為核酸配對，其中A與T或U配對，而C與G配對?；パa可以是“部分的”或“完全的”。在部分互補中，根據(jù)堿基配對法則，僅一些核酸堿基是匹配的；而在完全或總體互補中，根據(jù)配對法則，所有的堿基都是匹配的。正如本領域眾所周知的，核酸鏈之間的互補程度可能對核酸鏈之間雜交的效率和強度有顯著影響。所述雜交的效率和強度取決于檢測方法。

如本文中所用，“DGA1”意指二酰基甘油?；D移酶2型(DGAT2)。DGA1是膜整合蛋白，其催化油類生物合成的最終酶促步驟以及植物、真菌和哺乳動物中三?；视偷纳a。DGA1可能在改變產生于產油生物體的油類中的長鏈多不飽和脂肪酸的數(shù)量上起關鍵作用。DGA1與?；o酶A:膽固醇?；D移酶("ACAT")有關。此酶負責將?；鶑孽；o酶A轉移至1,2-二?；视?"DAG")的sn-3位置以形成三?；视?"TAG")(從而涉及TAG生物合成的最終步驟)。在植物和真菌中，DGA1與膜和脂質體部分結合，特別是在含油種子中，其有助于儲存用作能量儲備的碳。據(jù)信，TAG是細胞中用于儲存能量的重要化學物質。已知DGA1可以調節(jié)TAG結構并指導TAG合成。

DGA1多核苷酸和多肽序列可能來源于具有極高的天然的脂質積聚水平的高產油生物體。(Bioresource Technology 144:360-69 (2013); Progress Lipid Research 52:395-408 (2013); Applied Microbiology & Biotechnology 90:1219-27 (2011); European Journal Lipid Science & Technology 113:1031-51 (2011); Food Technology & Biotechnology 47:215-20 (2009); Advances Applied Microbiology 51:1-51 (2002); Lipids 11:837-44 (1976))。具有據(jù)報道約50%及更高的脂質含量的生物體的列表示于表1中。圓紅冬孢酵母和斯達氏油脂酵母具有最高的脂質含量。在表1的生物體中，有五種具有可公開訪問的DGA1序列：圓紅冬孢酵母、斯達氏油脂酵母、裂殖壺菌、土曲霉和麥角菌（在表1中以粗體表示）。

表1：具有據(jù)報道約50%及以上的脂質含量的產油真菌的列表。具有可公開訪問的DGA1基因序列的生物體以粗體表示。

用于過表達DGA1基因的核酸構建體在USSN 61/943,664中有述(在此通過引用并入)。圖1示出了用于在解脂耶氏酵母中過表達圓紅冬孢酵母DGA1基因NG66(SEQ ID No.6)的表達構建體pNC243。在轉化前，通過PacI/NotI限制性內切酶消化使DGA1表達構建體線性化（圖1）。所述線性表達構建體各自包含DGA1基因和Nat1基因的表達盒，用作諾爾絲菌素(NAT)選擇的標志物。

用于過表達DGA2基因和/或其它二?；视王；D移酶的核酸構建體可使用上述方法和/或本領域已知的其它方法來生成。

B.三酰甘油脂酶核酸分子及載體

三酰甘油脂酶通過移除一個或多個脂肪酸鏈來耗盡細胞的三?；视汀Ｒ虼?，降低細胞的凈三酰甘油脂酶活性可增加所述細胞的三?；视汀＿@種降低可通過降低所述酶的效率而實現(xiàn)，例如，通過使其活性位點的氨基酸突變，或通過減少所述酶的表達。例如，TGL3敲除突變將降低三酰甘油脂酶的活性，因為其阻止細胞轉錄TGL3。

在一些實施方案中，所述三酰甘油脂酶是TGL3、TGL3/4或TGL4。

解脂耶氏酵母中的TGL3基因編碼三酰甘油脂酶蛋白TGL3(SEQ ID No. 19)。SEQ ID No.20含有TGL3核苷酸序列、100個上游核苷酸和100個下游核苷酸。因此，SEQ ID No.20核苷酸序列可被用于設計能夠與天然解脂耶氏酵母三酰甘油脂酶基因中的核酸序列重組的核酸。

敲除盒SEQ ID No.27和28能夠與解脂耶氏酵母中的天然TGL3基因重組。因此，在一些實施方案中，由SEQ ID No.27和28編碼的核酸可被用于在解脂耶氏酵母中生成三酰甘油脂酶敲除突變。SEQ ID No.27和28各自含有潮霉素抗性基因hph的一些部分。分離的序列均不編碼功能性蛋白質，但所述兩個序列能夠編碼功能性激酶，其在成功重組時賦予潮霉素抗性。另外，SEQ ID No.27和SEQ ID No.28均不含啟動子或終止子，因而其依靠與解脂耶氏酵母TGL3基因的同源重組以使得hph基因被轉錄和翻譯。這樣，可通過在含有潮霉素的培養(yǎng)基上生長細胞而選擇成功轉化的產油細胞。

敲除盒SEQ ID NO.27可通過用引物NP1798(SEQ ID NO.23)和引物NP656(SEQ ID NO.24)擴增潮霉素抗性基因hph(SEQ ID NO.22)而制備。敲除盒SEQ ID NO.28可通過用引物NP655(SEQ ID NO.25)和引物NP1799(SEQ ID NO.26)擴增潮霉素抗性基因hph(SEQ ID NO.22)而制備。

可使用不同的方法設計敲除了解脂耶氏酵母中的TGL3基因的核酸(Biochimica Biophysica Acta 1831:1486-95 (2013))。本文公開的方法以及本領域已知的其它方法可被用于敲除其它物種中的不同三酰甘油脂酶基因。例如，這些方法可被用于降低下列基因的活性：Arxula adeninivorans的TGL3基因(SEQ ID NO:78)、Arxula adeninivorans的TGL3/4基因(SEQ ID NO:80)和/或Arxula adeninivorans的TGL4基因(SEQ ID NO:82)。類似地，這些方法可被用于降低解脂耶氏酵母中TGL4基因(SEQ ID NO:88)的活性。

C.經轉化的產油細胞

在一些實施方案中，所述經轉化的產油細胞是原核細胞，如細菌細胞。在一些實施方案中，所述細胞是真核細胞，如哺乳動物細胞、酵母細胞、絲狀真菌細胞、原生生物細胞、藻類細胞、禽類細胞、植物細胞或昆蟲細胞。

所述細胞可選自：Arxula、曲霉菌屬、裂殖壺菌屬、假絲酵母屬、麥角菌屬、隱球菌屬、小克銀漢霉屬、地霉屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、Kodamaea、Leucosporidiella、油脂酵母屬、被孢霉屬、Ogataea、畢赤酵母屬、原囊藻屬、根霉屬、紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、酵母菌屬、裂殖酵母屬、銀耳屬、絲孢酵母屬、Wickerhamomyces以及耶氏酵母屬。

在一些實施方案中，所述細胞選自：Arxula adeninivorans、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、裂殖壺菌、產朊假絲酵母、麥角菌、白色隱球菌、彎曲隱球菌、Cryptococcus ramirezgomezianus、土隱球菌、Cryptococcus wieringae、刺孢小克銀漢霉、山茶小克銀漢霉、發(fā)酵地霉、多形漢森酵母、乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母、奧默柯達菌、Leucosporidiella creatinivora、產油油脂酵母、斯達氏油脂酵母、子囊菌油脂酵母、深黃被孢霉、高山被孢霉、Ogataea polymorpha、Pichia ciferrii、季也蒙畢赤酵母、巴斯德畢赤酵母、樹干畢赤酵母、左氏原壁菌、少根根霉、Rhodosporidium babjevae、圓紅冬孢酵母菌、海洋紅冬孢酵母、粘紅酵母、膠紅酵母、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、Tremella enchepala、皮狀絲孢酵母、發(fā)酵性絲孢酵母、Wickerhamomyces ciferrii和解脂耶氏酵母。

在某些實施方案中，所述經轉化的產油細胞是耐高溫酵母細胞。在一些實施方案中，所述經轉化的產油細胞是馬克斯克魯維酵母。

在某些實施方案中，所述細胞是解脂耶氏酵母或Arxula adeninivorans。

D. 增加細胞中的二?；视王；D移酶

蛋白質活性可通過過表達該蛋白質而提高?？墒褂酶鞣N基因修飾而在細胞中過表達蛋白質。在一些實施方案中，所述基因修飾增加天然二?；视王；D移酶的表達?？赏ㄟ^修飾天然二?；视王；D移酶基因的上游轉錄調節(jié)因子來過表達天然二酰基甘油?；D移酶，例如，通過增加轉錄活化因子的表達或減少轉錄阻遏子的表達。作為另外一種選擇，可通過與外源性核酸重組而用組成活性的或誘導型啟動子置換天然二?；视王；D移酶基因的啟動子。

在一些實施方案中，所述基因修飾編碼二?；视王；D移酶基因的至少一個拷貝。所述二?；视王；D移酶基因可能是該細胞原生的或來自不同物種的基因。在某些實施方案中，所述二?；视王；D移酶基因是來自以下的II型二?；视王；D移酶基因：Arxula adeninivorans、土曲霉、裂殖壺菌、麥角菌、密粘褶菌、斯達氏油脂酵母、花藥黑粉菌、季也蒙畢赤酵母、三角褐指藻、禾柄銹菌、倒卵形紅冬孢酵母、圓紅冬孢酵母、禾本紅酵母或解脂耶氏酵母。在某些實施方案中，所述二酰基甘油?；D移酶基因是來自以下的I型二?；视王；D移酶基因：Arxula adeninivorans、土曲霉、球毛殼菌、麥角菌、斯達氏油脂酵母、蝗綠僵菌、冬蟲夏草菌、三角褐指藻、季也蒙畢赤酵母、圓紅冬孢酵母、禾本紅酵母、綠木霉或解脂耶氏酵母。在某些實施方案中，所述二?；视王；D移酶基因是來自以下的III型二酰基甘油?；D移酶基因：蓖麻或花生。在某些實施方案中，通過用編碼二?；视王；D移酶的基因轉化細胞來過表達二酰基甘油?；D移酶。所述基因修飾可編碼二酰基甘油?；D移酶基因的一個或不止一個拷貝。在某些實施方案中，所述基因修飾編碼來自圓紅冬孢酵母的DGA1蛋白的至少一個拷貝。在一些實施方案中，所述基因修飾編碼來自圓紅冬孢酵母的DGA1蛋白的至少一個拷貝，并且所述經轉化的產油細胞是解脂耶氏酵母。

在某些實施方案中，所述二?；视王；D移酶基因可遺傳給經轉化的產油細胞的子代。在一些實施方案中，所述二?；视王；D移酶基因是可遺傳的，因為其位于質粒上。在某些實施方案中，所述二?；视王；D移酶基因是可遺傳的，因為其被整合到經轉化的產油細胞的基因組中。

E. 降低細胞中的三酰甘油脂酶活性

在一些實施方案中，所述經轉化的產油細胞包含降低天然三酰甘油脂酶的活性的基因修飾。此類基因修飾可影響調控三酰甘油脂酶基因轉錄的蛋白質，所述修飾包括減少轉錄活化因子的表達和/或增加轉錄阻遏子的表達。影響調控蛋白的修飾可同時減少三酰甘油脂酶的表達并且改變其它基因的表達概況，使得細胞平衡向增加三酰基甘油積聚的方向移動。作為另外一種選擇，所述基因修飾可以是引入小干擾RNA或編碼小干擾RNA的核酸。在其它實施方案中，所述基因修飾包括核酸與天然三酰甘油脂酶基因的調控區(qū)的重組，所述調控區(qū)包括操縱子、啟動子、該啟動子的上游序列、增強子以及該基因的下游序列。

在一些實施方案中，所述經轉化的產油細胞包含由同源重組事件組成的基因修飾。在某些實施方案中，所述經轉化的產油細胞包含由天然三酰甘油脂酶基因與核酸之間的同源重組事件組成的基因修飾。因此，所述基因修飾使三酰甘油脂酶基因缺失、阻止其轉錄或阻止可以被轉錄成完全活性蛋白質的基因的轉錄。同源重組事件可突變或缺失天然三酰甘油脂酶基因的一部分。例如，所述同源重組事件可突變天然三酰甘油脂酶的活性位點處的一個或多個殘基，從而降低所述脂肪酶的效率或使其失活。作為另外一種選擇，所述同源重組事件可影響翻譯后修飾、折疊、穩(wěn)定性或在細胞內的定位。在某些實施方案中，所述基因修飾是三酰甘油脂酶敲除突變。敲除突變是優(yōu)選的，因為其消除了耗盡細胞的三?；视秃康耐罚瑥亩黾恿思毎娜；视秃俊?/p>

敲除突變可缺失三酰甘油脂酶基因。另外，所述敲除突變可用編碼不同蛋白質的基因置換三酰甘油脂酶基因。所述基因可被可操作地連接至外源性啟動子。在某些實施方案中，所述基因并未被連接至外源性啟動子，而是將所述基因構造成與三酰甘油脂酶基因重組，使得所述三酰甘油脂酶基因的啟動子驅動所述基因的轉錄。因此，如果所述基因隨機整合到細胞的基因組中，其不太可能被表達。用于生成敲除的方法是本領域熟知的(參見，例如，F(xiàn)ickers 等人，J. Microbiological Methods 55:727 (2003))。

在某些實施方案中，所述基因修飾包括兩個同源重組事件。在第一個事件中，編碼基因的一部分的核酸與三酰甘油脂酶基因重組，而在第二個事件中，編碼所述基因的其余部分的核酸與三酰甘油脂酶基因重組。所述基因的這兩個部分經過設計使得它們除非相互重組，否則均沒有功能。這兩個事件進一步減小所述基因可以在隨機整合事件之后被表達的可能性。

在某些實施方案中，所述基因編碼顯性選擇標志物。因此，可通過篩選所述標志物來選擇敲除細胞。在一些實施方案中，所述顯性選擇標志物是藥物抗性標志物。藥物抗性標志物是這樣的顯性選擇標志物：當由細胞表達時，其允許該細胞在存在通常將抑制細胞生長和/或存活的藥物的情況下生長和/或存活。表達藥物抗性標志物的細胞可以通過使細胞在存在該藥物的情況下生長來進行選擇。在一些實施方案中，所述藥物抗性標志物是抗生素抗性標志物。在一些實施方案中，所述藥物抗性標志物賦予針對選自下列的藥物的抗性：兩性霉素B、殺念菌素、菲律賓菌素、哈霉素、納他霉素、制霉菌素、裂霉素、白呋唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、異康唑、酮康唑、盧立康唑、咪康唑、奧莫康唑、奧昔康唑、絲他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬凈、阿莫羅芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬凈、卡泊芬凈、米卡芬凈、苯甲酸、環(huán)吡酮、氟胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、灰黃霉素、鹵普羅近、水蓼二醛、托萘酯、結晶紫、阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龍霉素、大觀霉素、格爾德霉素、除莠霉素、利福昔明、鏈霉素、氯碳頭孢、厄他培南、多利培南、亞胺培南、美羅培南、頭孢羥氨芐、頭孢唑林、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢丙烯、頭孢呋辛、頭孢克肟、頭孢地尼、頭孢妥侖、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢布烯、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢洛林酯、頭孢比普、替考拉寧、萬古霉素、特拉萬星、克林霉素、林可霉素、達托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地紅霉素、紅霉素、羅紅霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、硝基呋喃妥因、利奈唑胺、潑斯唑來、雷得唑來、特地唑胺、阿莫西林、氨芐青霉素、阿洛西林、羧芐青霉素、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、青霉素G、替莫西林、替卡西林、克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦、克拉維酸、桿菌肽、粘桿菌素、多粘菌素B、環(huán)丙沙星、依諾沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替馬沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶銀、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺酰亞胺、柳氮磺胺吡啶、磺胺異噁唑、甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲噁唑、復方新諾明、磺酰胺橘紅、去甲金霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、氯法齊明、氨苯砜、卷曲霉素、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、異煙肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福噴汀、鏈霉素、胂凡納明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹羅星、平板霉素、奎奴普丁、達福普汀、甲砜霉素、替加環(huán)素、替硝唑、甲氧芐氨嘧啶、遺傳霉素、諾爾絲菌素、潮霉素、博萊霉素和嘌呤霉素。

在一些實施方案中，所述顯性選擇標志物是營養(yǎng)標志物。營養(yǎng)標志物是這樣的顯性選擇標志物：當由細胞表達時，其使得細胞能夠使用一種或多種特定的營養(yǎng)來源而生長或存活。表達營養(yǎng)標志物的細胞可以通過使細胞在有限營養(yǎng)的條件下生長來進行選擇，在該條件下，表達所述營養(yǎng)標志物的細胞可以存活和/或生長，但缺少所述營養(yǎng)標志物的細胞無法存活和/或生長。在一些實施方案中，所述營養(yǎng)標志物選自：乳清酸核苷5-磷酸脫羧酶、亞磷酸特異性氧化還原酶、α-酮戊二酸依賴性次磷酸雙加氧酶、堿性磷酸酶、氨腈水合酶、三聚氰胺脫氨酶、氰尿酸酯酰胺水解酶、縮二脲水解酶、尿素?；呀饷?、氰尿酰胺氨基水解酶、鳥嘌呤脫氨酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶、亞磷酸氫化酶、甘油磷酸二酯酶、對硫磷水解酶、亞磷酸脫氫酶、二苯并噻吩脫硫酶、芳香脫亞磺酸酶、NADH依賴性FMN還原酶、氨基嘌呤轉運蛋白、羥胺氧化還原酶、蔗糖酶、β-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、纖維素酶和普魯蘭酶。

可使用不同的方法敲除解脂耶氏酵母中的TGL3基因(參見，例如，Dulermo 等人，Biochimica Biophysica Acta 1831:1486 (2013))。本文公開的方法以及本領域已知的其它方法可被用于敲除其它物種中的不同三酰甘油脂酶基因。例如，這些方法可被用于敲除下列基因：Arxula adeninivorans的TGL3基因(SEQ ID NO:78)、Arxula adeninivorans的TGL3/4基因(SEQ ID NO:80)或Arxula adeninivorans的TGL4基因(SEQ ID NO:82)。類似地，這些方法可被用于敲除解脂耶氏酵母的TGL4基因(SEQ ID NO:88)。

在一些實施方案中，基因修飾減少天然三酰甘油脂酶基因的表達，其減少程度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%。

在一些實施方案中，基因修飾降低天然三酰甘油脂酶基因的效率，其降低程度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%。

在一些實施方案中，基因修飾降低天然三酰甘油脂酶基因的活性，其降低程度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%。

F.通過同時過表達二?；视王；D移酶來降低細胞中的三酰甘油脂酶活性

在一些實施方案中，所述經轉化的產油細胞包含三酰甘油脂酶敲除突變和增加天然二?；视王；D移酶的表達的基因修飾。在某些實施方案中，所述經轉化的產油細胞包含三酰甘油脂酶敲除突變和編碼二?；视王；D移酶基因的至少一個拷貝的基因修飾，所述二?；视王；D移酶基因是所述細胞原生的或來自不同物種的細胞。在其它實施方案中，TGL3基因被破壞而DGA1蛋白被過表達。

在一些實施方案中，一個核酸增加天然二?；视王；D移酶的表達或編碼二?；视王；D移酶基因的至少一個拷貝，而第二個核酸降低細胞中三酰甘油脂酶的活性。在一些實施方案中，同一個核酸編碼二?；视王；D移酶基因的至少一個拷貝并且降低細胞中三酰甘油脂酶的活性。例如，被設計成敲除三酰甘油脂酶基因的核酸還可含有二?；视王；D移酶基因的一個拷貝。

G.三酰基甘油的生產

在某些實施方案中，所述經轉化的產油細胞在存在外源性脂肪酸、葡萄糖、乙醇、木糖、蔗糖、淀粉、淀粉糊精、甘油、纖維素和/或乙酸的情況下生長。可在培養(yǎng)過程中加入這些底物以提高脂質產量。所述外源性脂肪酸可包括：硬脂酸、油酸、亞油酸、γ-亞麻酸、二高-γ-亞麻酸、花生四烯酸、α-亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳二烯酸和/或二十碳三烯酸。

在某些實施方案中，本發(fā)明涉及由本文所述的經修飾的宿主細胞生產的產物。在某些實施方案中，所述產物是油、脂質或三?；视汀Ｔ谝恍嵤┓桨钢?，所述產物是棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸或亞油酸。在某些實施方案中，所述產物是飽和脂肪酸。因此，所述產物可能是：辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山崳酸、二十四酸或蠟酸。在一些實施方案中，所述產物是不飽和脂肪酸。因此，所述產物可能是：肉豆蔻腦酸、棕櫚油酸、6(Z)-十六碳烯酸（sapienic acid）、油酸、反油酸、異油酸、亞油酸、亞反油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥子酸或二十二碳六烯酸。

在一些實施方案中，所述產物包括18-碳脂肪酸。在一些實施方案中，所述產物包括油酸、硬脂酸或亞油酸。例如，所述產物可能是油酸。

在一些實施方案中，本發(fā)明涉及經轉化的產油細胞，其包含第一基因修飾和第二基因修飾。所述第一基因修飾可提高天然二酰基甘油?；D移酶的活性。作為另外一種選擇，所述第一基因修飾可編碼二?；视王；D移酶基因的至少一個拷貝，所述二?；视王；D移酶基因是所述產油細胞原生的或來自不同物種。所述第二基因修飾可降低所述產油細胞中三酰甘油脂酶的活性。

在一些實施方案中，所述第二基因修飾是三酰甘油脂酶敲除突變。

在一些實施方案中，所述第一基因修飾編碼二酰基甘油?；D移酶基因的至少一個拷貝，所述二?；视王；D移酶基因是所述產油細胞原生的或來自不同物種。在一些實施方案中，二?；视王；D移酶基因被整合到所述細胞的基因組中。

在一些實施方案中，所述經轉化的產油細胞選自：藻類、細菌、霉菌、真菌、植物和酵母。在某些實施方案中，所述經轉化的產油細胞是酵母。所述經轉化的產油細胞可選自：Arxula、曲霉菌屬、裂殖壺菌屬、假絲酵母屬、麥角菌屬、隱球菌屬、小克銀漢霉屬、地霉屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、Kodamaea、Leucosporidiella、油脂酵母屬、被孢霉屬、Ogataea、畢赤酵母屬、原囊藻屬、根霉屬、紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、酵母菌屬、裂殖酵母屬、銀耳屬、絲孢酵母屬、Wickerhamomyces以及耶氏酵母屬。在某些實施方案中，所述經轉化的產油細胞選自：Arxula adeninivorans、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、裂殖壺菌、產朊假絲酵母、麥角菌、白色隱球菌、彎曲隱球菌、Cryptococcus ramirezgomezianus、土隱球菌、Cryptococcus wieringae、刺孢小克銀漢霉、山茶小克銀漢霉、發(fā)酵地霉、多形漢森酵母、乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母、奧默柯達菌、Leucosporidiella creatinivora、產油油脂酵母、斯達氏油脂酵母、子囊菌油脂酵母、深黃被孢霉、高山被孢霉、Ogataea polymorpha、Pichia ciferrii、季也蒙畢赤酵母、巴斯德畢赤酵母、樹干畢赤酵母、左氏原壁菌、少根根霉、Rhodosporidium babjevae、圓紅冬孢酵母菌、海洋紅冬孢酵母、粘紅酵母、膠紅酵母、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、Tremella enchepala、皮狀絲孢酵母、發(fā)酵性絲孢酵母、Wickerhamomyces ciferrii和解脂耶氏酵母。在其它實施方案中，所述經轉化的產油細胞是解脂耶氏酵母或Arxula adeninivorans。

在一些實施方案中，所述二?；视王；D移酶基因是II型二?；视王；D移酶基因。所述二?；视王；D移酶基因可能是來自以下的II型二酰基甘油?；D移酶基因：Arxula adeninivorans、土曲霉、裂殖壺菌、麥角菌、密粘褶菌、斯達氏油脂酵母、花藥黑粉菌、季也蒙畢赤酵母、三角褐指藻、禾柄銹菌、倒卵形紅冬孢酵母、圓紅冬孢酵母、禾本紅酵母或解脂耶氏酵母。

在一些實施方案中，所述二?；视王；D移酶基因是I型二?；视王；D移酶基因。所述二?；视王；D移酶基因可能是來自以下的I型二?；视王；D移酶基因：Arxula adeninivorans、土曲霉、球毛殼菌、麥角菌、斯達氏油脂酵母、蝗綠僵菌、冬蟲夏草菌、三角褐指藻、季也蒙畢赤酵母、圓紅冬孢酵母、禾本紅酵母、綠木霉或解脂耶氏酵母。

在一些實施方案中，所述二?；视王；D移酶基因是III型二?；视王；D移酶基因。所述二?；视王；D移酶基因可能是來自以下的III型二?；视王；D移酶基因：蓖麻或花生。

在一些實施方案中，所述三酰甘油脂酶是TGL3、TGL3/4或TGL4。

在一些實施方案中，本發(fā)明涉及來源于經轉化的產油細胞的產物。在某些實施方案中，所述產物是油、脂質或三?；视?。

在一些實施方案中，本發(fā)明涉及提高細胞的脂質含量的方法，其包括用第一核酸和第二核酸轉化親代細胞。所述第一核酸可提高天然二?；视王；D移酶的活性，或包含二酰基甘油?；D移酶基因。所述第二核酸可降低三酰甘油脂酶的活性。所述第一核酸和第二核酸可能是相同的。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明涉及提高細胞的脂質含量的方法，其包括用核酸轉化親代細胞，其中所述核酸降低所述細胞中三酰甘油脂酶的活性，并且包含二酰基甘油?；D移酶基因或提高天然二酰基甘油?；D移酶的活性。

在一些實施方案中，本發(fā)明涉及提高細胞的三酰基甘油含量的方法，其包括提供細胞并生長該細胞。所述細胞可包含第一基因修飾和第二基因修飾。所述第一基因修飾可提高天然二?；视王；D移酶的活性或編碼二酰基甘油?；D移酶基因的至少一個拷貝，所述二?；视王；D移酶基因是所述產油細胞原生的或來自不同物種。所述第二基因修飾可降低所述細胞中三酰甘油脂酶的活性。所述細胞可在其中所述第一基因修飾被表達的條件下生長，從而生產三?；视?。在一些實施方案中，回收所述三?；视?。

在一些實施方案中，所述第一核酸包含二?；视王；D移酶基因。所述二?；视王；D移酶基因可編碼I型二酰基甘油?；D移酶多肽、II型二?；视王；D移酶多肽或III型二?；视王；D移酶多肽。

在一些實施方案中，所述二?；视王；D移酶基因包含下列中所示的核苷酸序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 84或SEQ ID NO: 86，或其中任一項的補體。

在一些實施方案中，所述二?；视王；D移酶基因包含與下列中所示的核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 84或SEQ ID NO: 86，或其中任一項的補體。

在一些實施方案中，所述二酰基甘油?；D移酶多肽包含下列中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 85，或其中任一項的生物活性部分。

在一些實施方案中，所述二酰基甘油?；D移酶多肽包含與下列中所示的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 85，或其中任一項的生物活性部分。

在一些實施方案中，所述第二核酸能夠與三酰甘油脂酶基因中的核酸序列和/或三酰甘油脂酶基因的調控區(qū)中的核酸序列重組。在某些實施方案中，所述第二核酸能夠與TGL3、TGL3/4或TGL4基因中的核酸序列和/或TGL3、TGL3/4或TGL4基因的調控區(qū)中的核酸序列重組。所述第二核酸可包含編碼蛋白質或蛋白質的一部分的基因。在某些實施方案中，所述第二核酸包含編碼蛋白質的基因，所述蛋白質賦予對藥物的抗性。在其它實施方案中，所述第二核酸包含編碼蛋白質的基因，所述蛋白質使得細胞能夠在一種或多種特定營養(yǎng)來源上較同一物種的天然生物體更快地生長或增殖。

本說明書通過下列實施例進一步說明，在任何情況下這些實施例都不應被理解為限制性的。所有引用的參考文獻（包括如在整個本申請中所引用的文獻參考、授權專利、公布的專利申請和GenBank登錄號）的內容均明確地以引用方式并入本文。當以引用方式并入本文的資料中術語的定義與本文所用的那些沖突時，以本文所用的定義為準。

實施例

實施例1：在解脂耶氏酵母中過表達DGA1的方法

用于過表達DGA1基因的核酸構建體在USSN 61/943,664中有述(在此通過引用并入)。圖1示出了用于在解脂耶氏酵母中過表達圓紅冬孢酵母DGA1基因NG66(SEQ ID No.6)的表達構建體pNC243。在轉化前，通過PacI/NotI限制性內切酶消化使DGA1表達構建體線性化。所述線性表達構建體各自包含DGA1基因和Nat1基因的表達盒，用作諾爾絲菌素(NAT)選擇的標志物。

使用如Chen(Applied Microbiology & Biotechnology 48:232-35 (1997))中所述的轉化方案將DGA1表達構建體隨機整合到解脂耶氏酵母菌株NS18(得自ARS培養(yǎng)物保藏中心, NRRL# YB 392)的基因組中。在含有500 μg/mL NAT的YPD平板上選擇轉化體，并通過如下所述的熒光染色脂質測定法篩選積聚脂質的能力。對于每種表達構建體，分析了八個轉化體。

對于大多數(shù)構建體，轉化體之間存在顯著的菌落變異，這可能是由于僅具有功能性Nat1盒的細胞中缺少功能性DGA1表達盒，或由于DGA1整合位點對DGA1表達的負面影響。然而，所有的轉化體均具有顯著提高的脂質含量。

在強力啟動子下過表達天然解脂耶氏酵母DGA1(NG15)，相比親代菌株NS18，將脂質含量提高了約2倍（如通過細胞熒光測得的）。通過過表達圓紅冬孢酵母DGA1(NG66、NG67)和斯達氏油脂酵母DGA1(NG68)生成顯示出最高熒光的轉化體（相比NS18高出約3倍）。

在某些實驗中，天然圓紅冬孢酵母DGA1(NG49)的過表達對解脂耶氏酵母中脂質產量的影響不如合成版的不含有內含子的圓紅冬孢酵母DGA1基因的影響那么高。此結果可能表明，解脂耶氏酵母中圓紅冬孢酵母DGA1基因的基因剪接不是很有效。在某些實驗中，針對在解脂耶氏酵母中表達圓紅冬孢酵母DGA1基因的密碼子優(yōu)化對脂質產量沒有積極效果。

為了選擇具有最高脂質產量水平的菌株，對表達NG15(解脂耶氏酵母DGA1)或NG66(圓紅冬孢酵母DGA1)的解脂耶氏酵母菌株NS18轉化體進行了篩選。對于NG15，通過脂質測定法就最高脂質積聚篩選了約50個菌落，并將最佳轉化體命名為NS249。對于NG66，篩選了80個菌落，并選擇了8個最佳菌落用于進一步分析。在搖瓶中生長菌株NS249以及選定的8個NG66轉化體，并通過脂質測定法分析脂質含量，以及通過HPLC分析葡萄糖消耗。過表達圓紅冬孢酵母DGA1的解脂耶氏酵母菌株具有明顯高于具有在與圓紅冬孢酵母DGA1相同的啟動子下表達的天然解脂耶氏酵母DGA1基因的解脂耶氏酵母菌株的脂質含量。同時，NG66轉化體具有明顯更少的葡萄糖殘留在培養(yǎng)基中，表明NG66能更有效地將葡萄糖轉化成脂質。兩種DGA1基因之間效率的差異可能歸因于解脂耶氏酵母中圓紅冬孢酵母DGA1更高水平的表達，或更高水平的圓紅冬孢酵母DGA1特異活性，或二者皆有。將表現(xiàn)最好的具有整合的NG66基因的轉化體之一命名為NS281。

實施例2：在解脂耶氏酵母中敲除三酰甘油脂酶敲除基因的方法

為了測試將DGA1過表達與TGL3缺失結合而導致解脂耶氏酵母中更高的脂質積聚的想法，在解脂耶氏酵母野生型菌株NS18(得自NRLL# YB-392)及其過表達DGA1的衍生型NS281中缺失了TGL3。NS281過表達如上所述來自圓紅冬孢酵母的DGA1基因。如下，缺失解脂耶氏酵母TGL3基因(YALI0D17534g, SEQ ID NO: 20)：通過PCR從含有潮霉素抗性基因(“hph,” SEQ ID NO:22)的質粒擴增兩片段式缺失盒，使用引物對NP1798-NP656和NP655-NP1799(SEQ ID NO: 23-26)。根據(jù)USSN 61/819,746中開發(fā)的方案(通過引用并入本文)，將所得PCR片段(SEQ ID NO: 27 & 28)共轉化到NS18和NS281中。在hph盒中省略啟動子和終止子以及將hph編碼序列分為兩個PCR片段減少了這些片斷的隨機整合將賦予潮霉素抗性的可能性。只有當hph基因通過同源重組整合在TGL3基因座時，才應當表達該基因，使得TGL3啟動子和終止子可以指導其轉錄。通過PCR篩選潮霉素抗性菌落以確認不存在TGL3并且存在tgl3::hyg特定產物。在NS18中缺失TGL3得到菌株NS421。在NS281中缺失TGL3得到菌株NS377。

實施例3：過表達DGA1的TGL3敲除相比僅TGL3敲除積聚更多的脂質

使含有TGL3敲除的NS421和含有TGL3缺失并同時過表達圓紅冬孢酵母DGA1的NS377在24孔平板中于有限氮條件下生長，以促進脂質積聚。

具體地講，在經過高壓蒸汽消毒的24孔平板的每個孔中裝入1.5 mL的含有0.5 g/L 尿素、1.5 g/L 酵母提取物、0.85 g/L 酪蛋白氨基酸、1.7 g/L YNB(不含氨基酸和硫酸銨)、100 g/L 葡萄糖 和 5.11 g/L 鄰苯二甲酸氫鉀(25mM)的過濾滅菌的培養(yǎng)基。使用已經在YPD瓊脂平板上于30℃溫育1-2天的酵母菌株給每個孔接種。用多孔蓋覆蓋該24孔平板，并在30℃、70-90% 濕度以及900 rpm下于Infors Multitron ATR搖床上溫育。96小時后，在分析型微孔板上向20 μL的細胞中加入20 μL 100%的乙醇，并在4℃溫育30分鐘。然后，在Costar 96孔、黑色、底部透明的平板中，將20 μL的細胞/乙醇混合物加入到80 μl的含有50 μL 1 M 碘化鉀、1 mM μL Bodipy 493/503、0.5 μL 100% DMSO、1.5 μL 60% PEG 4000 和 27 μL 水的預混合溶液中，并用透明封條覆蓋。用SpectraMax M2分光光度計(Molecular Devices)動力學測定法在30℃監(jiān)測Bodipy熒光，并通過用熒光除以600 nm處的吸光度進行標準化。將一式三份生長實驗數(shù)據(jù)取平均值。

NS377積聚了大約兩倍于NS421的脂質量，這表明TGL3缺失與DGA1過表達的組合相對于僅TGL3缺失，提高了細胞的脂質含量(圖2)。

實施例4：過表達DGA1并含有TGL3缺失的細胞較過表達DGA1但沒有TGL3修飾的細胞積聚更多的TAG

使用高細胞密度補料分批葡萄糖工藝在1升的生物反應器中生長過表達圓紅冬孢酵母DGA1的NS281和含有TGL3缺失并同時過表達圓紅冬孢酵母DGA1的NS377。118小時后，通過氣相色譜法分析細胞以測量脂質含量（以干細胞重量的百分比的形式）。將同一樣品的一式三份色譜法測量結果取平均值。NS377的脂質含量較NS281高出大約4%，這表明TGL3缺失與DGA1過表達的組合得到優(yōu)于僅DGA1過表達的結果(圖3)。

實施例5：包含編碼二酰基甘油?；D移酶并降低三酰甘油脂酶的活性的基因修飾的細胞積聚更多的TAG

為了測試將DGA1和DGA2過表達與TGL3缺失結合而導致解脂耶氏酵母中更高的脂質積聚的想法，在菌株NS377中過表達來自麥角菌的DGA2。如實施例4中所述，菌株NS377含有TGL3缺失并過表達來自圓紅冬孢酵母的DGA1?；谙惹暗膶嶒炦x擇了來自麥角菌的DGA2，所述實驗證實此基因與來自圓紅冬孢酵母的DGA1的組合提高解脂耶氏酵母的脂質含量(USSN 62/004,502, 通過引用并入)。

圖4示出了pNC327的圖譜，該表達構建體用于在NS377中過表達麥角菌DGA2。在轉化前，用PacI/AscI限制性內切酶消化使所述構建體線性化。所述線性表達構建體包含麥角菌DGA2基因和BLE基因的表達盒，用作博萊霉素(ZEO)選擇的標志物。通過熒光脂質測定法分析轉化體，并將最佳脂質生產者定名為NS432。

比較了菌株NS297、NS281、NS450、NS377和NS432的脂質產量。使用分批葡萄糖工藝(在48孔平板或50-mL燒瓶中)或使用高細胞密度補料分批葡萄糖工藝(在1-L生物反應器中)生長 這些菌株的子集。通過熒光測定法或氣相色譜法分析脂質含量，并發(fā)現(xiàn)菌株NS432相比其親代菌株NS377和不含TGL3敲除的菌株具有更高的脂質含量(圖5)。這些結果證實了在TGL3敲除中過表達DGA1和DGA2的優(yōu)點。

通過引用的并入

本文引用的所有美國專利、美國專利申請公布、外國專利、外國專利公布以及非專利文獻均以引用方式并入本文。

等同形式

本領域技術人員在不使用超過常規(guī)實驗的情況下將認識到或將能夠確定本文所述的本發(fā)明的特定實施方案的許多等同形式。此類等同形式旨在為以下權利要求書所涵蓋。