本發(fā)明要求于2014年4月16日向美國專利商標局提交的美國臨時專利申請61/980,506“用于擴增細胞群的方法、試劑盒及裝置(Methods,Kits And Apparatus For Expanding A Population Of Cells)”的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其內(nèi)容特此出于所有目的通過引用整體并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細胞群諸如淋巴細胞群的擴增(增殖)。本發(fā)明大體上提供了一種用于細胞群擴增(增殖)的新方法及試劑，其需要受體結(jié)合分子(諸如文本所述的第一試劑)與細胞表面的受體分子結(jié)合，從而向細胞提供初級激活信號。本發(fā)明采用一種多聚化劑，其具有固定(結(jié)合)結(jié)合于其上的、向細胞提供初級激活信號的第一試劑。這種初級激活信號可足以激活細胞以擴增/增殖。此種第一試劑能可逆或不可逆地與多聚化劑結(jié)合。該多聚化劑還可以具有固定(結(jié)合)于其上的、刺激細胞表面輔助分子的第二試劑。該第二試劑當與細胞表面的輔助分子結(jié)合時，可由此刺激已激活的細胞擴增。此外，第二試劑能可逆或不可逆地與多聚化劑結(jié)合。多聚化劑可以被固定在固體載體上或是可溶的。一方面，本文所公開的方法是細胞群的連續(xù)擴增，其中一個完整的淋巴細胞群被刺激/擴增，然后在適合的固定相中通過層析除去擴增所必需的試劑，被擴增/刺激的細胞任選地用如T細胞受體或嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)進行轉(zhuǎn)染，并用與所引入的T細胞受體或嵌合抗原受體結(jié)合的不同刺激分子進行二次刺激擴增。本發(fā)明還涉及一種用于選定細胞群擴增的裝置。

背景技術(shù)：

體外增殖T細胞群技術(shù)的發(fā)展對T細胞識別抗原和T細胞激活理解方面的許多進展是至關(guān)重要的。用于人抗原特異性T細胞克隆繁殖的培養(yǎng)方法的開發(fā)已經(jīng)用于界定被T細胞識別的由病原體和腫瘤表達的抗原，從而建立免疫療法以治療多種人類疾病?？乖禺愋訲細胞可在體外擴增用于過繼性細胞免疫療法或癌癥療法，其中輸注這樣的T細胞已在荷瘤宿主中顯示出抗腫瘤活性。此外，過繼性免疫療法也被用于治療免疫妥協(xié)個體的病毒感染。

近幾年已建立的在缺乏外源性生長因子和佐細胞的情況下體外擴增人T細胞的方法在美國專利US 6,352,694 B1和歐洲專利EP 0 700 430 B1中有所描述。這些專利中公開了一種用于誘導(dǎo)T細胞群增殖的體外方法。該方法包括使T細胞群與固體表面接觸，所述固體表面具有直接固定于其上的：(a)第一試劑，其向T細胞提供初級激活信號，從而激活T細胞；和(b)第二試劑，其刺激T細胞表面的輔助分子，從而刺激已激活的T細胞。第一試劑和第二試劑與T細胞的結(jié)合誘導(dǎo)T細胞增殖/擴增。在美國專利US 6,352,694 B1和歐洲專利EP 0 700 430 B1中所述的優(yōu)選第一試劑是單克隆抗CD3抗體，其在T細胞中與TCR/CD3(TCR＝T細胞受體(T cell receptor))復(fù)合物結(jié)合，從而刺激TCR/CD3復(fù)合物相關(guān)的信號。根據(jù)這兩篇專利所述的優(yōu)選第二試劑是與T細胞呈遞的輔助分子CD28結(jié)合的單克隆抗CD28抗體。該第二試劑與CD28輔助分子的結(jié)合提供了對激活的T細胞擴增/增殖所必需的必要共刺激。同時，市售的CD3/CD28(Invitrogen)可用于T細胞擴增。CD3/CD28CTS^TM是均質(zhì)的、4.5μm超順磁性無菌無熱原的、涂覆有抗人T細胞的CD3和CD28細胞表面分子的經(jīng)親和純化的單克隆抗體混合物的聚苯乙烯珠。

然而，這種磁珠，例如，在臨床試驗或治療目的所要求的條件下，難以整合到擴增細胞的方法中，因為必須保證這些磁珠在向患者施用擴增的T細胞于之前被完全去除。因此，本發(fā)明的目的在于為研究、診斷特別是治療的目的提供一種用于擴增細胞群諸如調(diào)節(jié)性T細胞或中樞記憶T細胞的替代方法。理想地，這種新方法也應(yīng)當適于整合到可用于快速簡便擴增為治療應(yīng)用所需的細胞群的自動化過程中。

這一目的是通過獨立權(quán)利要求的主題，尤其是獨立權(quán)利要求中所述的方法、試劑盒、排布和裝置實現(xiàn)的。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了用于體外擴增所需細胞群的方法、試劑盒、排布和裝置，所述細胞表面具有受體分子，其一旦與合適的試劑結(jié)合便會向細胞群提供初級激活信號，并從而激活細胞群擴增(增殖)。因此，本發(fā)明的方法也可用于誘導(dǎo)細胞群增殖。

第一方面，本發(fā)明提供了一種擴增細胞群的體外方法，其包括使包含細胞群的樣品與多聚化劑接觸，

其中所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、向細胞提供初級激活信號的第一試劑；

其中所述多聚化劑包含至少一個結(jié)合位點Z1用于第一試劑的可逆結(jié)合，

其中所述第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點Z1結(jié)合，其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，以及

其中所述第一試劑與細胞表面的受體分子結(jié)合，由此向細胞提供初級激活信號從而激活細胞。

第二方面，本發(fā)明提供了一種擴增細胞群的體外方法，其包括使包含細胞群的樣品與多聚化劑接觸，

其中所述多聚化劑是可溶形式的，并且具有固定(結(jié)合)于其上的、向細胞提供初級激活信號的第一試劑；

其中所述多聚化劑包含至少一個結(jié)合位點Z1用于第一試劑的結(jié)合，

其中所述第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點Z1結(jié)合，其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合，以及

其中所述第一試劑與細胞表面的受體分子結(jié)合，由此向細胞提供初級激活信號從而激活細胞。

第三方面，本發(fā)明提供了用于擴增細胞群的試劑盒，所述試劑盒包括：

(i)多聚化劑，

其中，所述多聚化劑包含至少一個結(jié)合位點Z用于第一試劑的可逆結(jié)合，

(ii)第一試劑，其與細胞表面受體分子結(jié)合，由此向細胞提供初級激活信號從而激活細胞，

其中所述第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點Z1結(jié)合，其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，以及

(iii)第二試劑，其刺激細胞表面的輔助分子，

其中所述第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點Z2結(jié)合，其中所述第二試劑通過結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點Z2之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合，

其中所述第二試劑與細胞表面的輔助分子結(jié)合，從而刺激已激活的細胞。

第四方面，本發(fā)明提供了一種用于擴增細胞群的試劑盒，所述試劑盒包括：

(i)多聚化劑，

其中所述多聚化劑是可溶形式的，并且包含至少一個結(jié)合位點Z用于第一試劑的可逆結(jié)合,

(ii)第一試劑，其與細胞表面的受體分子結(jié)合，由此向細胞提供初級激活信號從而激活細胞，

其中所述第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點Z1結(jié)合，其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合。

第五方面，本發(fā)明提供了一種連續(xù)擴增淋巴細胞群的體外方法，其中所述淋巴細胞群包含T細胞，所述方法包括：

使含有包含T細胞的淋巴細胞群樣品與多聚化劑接觸，

其中所述多聚化劑是可溶形式，并且具有可逆固定于其上的(i)向T細胞提供初級激活信號的第一試劑和(ii)刺激T細胞表面輔助分子的第二試劑，

其中所述多聚化劑包含至少一個結(jié)合位點Z1用于第一試劑的可逆結(jié)合,

其中所述第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點Z1結(jié)合，其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，

其中所述多聚化劑包含至少一個結(jié)合位點Z2用于第二試劑的可逆結(jié)合,

其中所述第二試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點Z2結(jié)合，其中所述第二試劑通過結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點Z2之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，

其中所述第一試劑與T細胞表面的受體分子結(jié)合，由此向細胞提供初級激活信號從而激活T細胞，

其中所述第二試劑與T細胞表面的輔助分子結(jié)合，由此刺激已激活的細胞，從而所述第一試劑和所述第二試劑一同誘導(dǎo)T細胞擴增。

第六方面，本發(fā)明提供了一種包含生物反應(yīng)器和層析固定相的排布，

其中所述生物反應(yīng)器適于細胞的擴增，

其中所述固定相適于細胞分離和試劑去除，所述固定相為凝膠過濾基質(zhì)和/或親和層析基質(zhì)，其中所述凝膠過濾和/或親和層析基質(zhì)包括親和試劑，其中所述親和試劑包含與第一試劑中所含結(jié)合配偶體C1特異性結(jié)合的結(jié)合位點Z1，和/或所述親和試劑包含與第二試劑中所含結(jié)合配偶體C2特異性結(jié)合的結(jié)合位點Z2，由此適于將第一試劑和/或第二試劑、第一結(jié)合配偶體C1和/或游離的第二結(jié)合配偶體C2固定于固定相上，

其中，所述生物反應(yīng)器和所述固定相是流體連接的。

第七方面，本發(fā)明提供了一種用于純化和擴增細胞群的裝置，所述裝置包含至少一個根據(jù)第六方面所述的包含生物反應(yīng)器和層析固定相的排布。

第八方面，本發(fā)明提供了一種能夠擴增細胞群的多聚化劑，

其中所述多聚化劑是可溶形式的，并且包含至少一個結(jié)合位點Z1用于向細胞提供初級激活信號的第一試劑的可逆結(jié)合，

其中所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、向細胞提供初級激活信號所述第一試劑，

其中所述第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠可逆地與多聚化劑的至少一個結(jié)合位點Z1結(jié)合，

其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合。

第九方面，本發(fā)明提供了一種能夠擴增細胞群的組合物，所述組合物包含：

(i)第一多聚化劑，

其中所述第一多聚化劑是可溶形式的，并且包含至少一個結(jié)合位點Z1用于向細胞提供初級激活信號的第一試劑的可逆結(jié)合，

其中所述第一多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、向細胞提供初級激活信號所述第一試劑；

其中所述第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠可逆地與多聚化劑的至少一個結(jié)合位點Z1結(jié)合，其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，以及

(ii)第二多聚化劑，

其中所述第二多聚化劑是可溶形式的，并且包含至少一個結(jié)合位點Z2用于對細胞表面輔助分子進行刺激的第二試劑的可逆結(jié)合，

其中所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、刺激細胞表面輔助分子的所述第二試劑，

其中所述第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的至少一個結(jié)合位點Z2結(jié)合，其中所述第二試劑通過結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點Z2之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合。

附圖說明

參考以下詳細描述并結(jié)合考慮非限制性實施例和附圖，將能更好得理解本發(fā)明。附圖示出了本發(fā)明方法的具體實施方式。不希望受到理論的束縛，附圖包括了關(guān)于下述擴增機制的結(jié)論。所給出的結(jié)論僅用于說明的目的，并僅僅用于使擴增方法在分子水平上可實現(xiàn)可視化。

圖1示出了一種擴增細胞群的體外方法的實施方式，所述細胞群具有細胞表面受體，其與第一試劑的結(jié)合可提供細胞擴增的激活信號。

如圖1a所示，包含攜帶表面受體分子(30)的細胞群(2)的樣品與多聚化劑(4)接觸。細胞群(2)是與其它缺乏表面受體分子(30)的細胞群(22)混合在一起的。多聚化劑(4)具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、向細胞提供初級激活信號的第一試劑(6)。多聚化劑(4)包含至少一個結(jié)合位點Z1(42)用于第一試劑(6)的可逆結(jié)合，而第一試劑(6)包含至少一個結(jié)合配偶體C1(6a)，其中，結(jié)合配偶體C1(6a)能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點Z1(44)結(jié)合。因此，為了固定，第一試劑(6)通過結(jié)合配偶體C1(6a)和結(jié)合位點Z1(42)之間形成的可逆鍵與多聚化劑(4)相結(jié)合。在圖1所示的實施例中，多聚化劑(4)具有該實施例中未使用的第二結(jié)合位點Z2(44)。多聚化劑(4)本身被固定在固體載體(10)上，例如磁珠、聚合珠、細胞培養(yǎng)板或反應(yīng)器的表面。細胞群(2)例如諸如B細胞群的淋巴細胞群可以通過CD40受體而被激活(參見例如Carpenter等人，Journal of Translational Medicine 2009,7:93“Activation of human B cells by the agonist CD40antibody CP-870,893and augmentation with simultaneous toll-like receptor 9stimulation)。在這個示例中，細胞表面分子(30)是CD40，第一試劑(6)可以是任何提供所需激活信號的CD40結(jié)合分子，例如，單克隆抗體CP-870,893或其抗體結(jié)合片段，諸如單價Fab片段。第一試劑(6)的結(jié)合配偶體C1可以是例如與例如抗體分子兩條多肽鏈(重鏈或輕鏈)其中一條的C端融合或綴合的任何親和肽。結(jié)合配偶體C1(6a)可以是例如，諸如肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:01)的鏈霉親和素結(jié)合肽，也稱為美國專利US 5,506,121中所描述的“Strep標記”(Strep-)，或者例如，具有包含兩個或多個單獨結(jié)合模塊的連續(xù)排布的鏈霉親和素結(jié)合肽，如國際專利公開WO 02/077018或美國專利US 7,981,632中所描述的。當使用鏈霉親和素結(jié)合肽作為結(jié)合配偶體C1時，多聚化劑(4)是與鏈霉親和素肽(＝第一結(jié)合配偶體C1(6a))經(jīng)由其(生物素)如圖示于圖1的結(jié)合位點Z1(42)可逆結(jié)合的任意鏈霉親和素突變蛋白。這種多聚化劑可以是在野生型鏈霉親和素序列位點第44至47位上包含氨基酸序列Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:02)的鏈霉親和素突變蛋白(類似物)，或者是在野生型鏈霉親和素序列位點第44至47位上包含氨基酸序列l(wèi)le⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:03)的鏈霉親和素突變蛋白(類似物)，這兩者均在例如美國專利US 6,103,493中有所描述，并且可以商標Strep-購得。在圖1的實施例中，多聚化劑(4)可以進一步包括多聚鈣調(diào)蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，兩者均與鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽或谷胱甘肽形成可逆鍵。因此，結(jié)合位點Z2(44)可由鈣調(diào)蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶構(gòu)成。這種例如鈣調(diào)蛋白與鏈霉親和素突變蛋白形成的蛋白綴合物可通過標準蛋白質(zhì)化學(xué)制備，例如，通過使用雙功能接頭。

如圖1b中所示，在使細胞群(2)與多聚化劑(4)接觸并通常是用多聚化劑(4)孵育細胞群后，細胞群(2)經(jīng)由第一試劑(6)與多聚化劑形成復(fù)合物/相結(jié)合。第一試劑與細胞表面受體分子諸如該實施例中的CD40特異性結(jié)合，并提供例如B細胞擴增的細胞擴增激活信號。包含在初始樣品中的、缺乏特異性細胞表面分子(30)的其它細胞群(22)無法與多聚化劑結(jié)合。在這方面，應(yīng)當注意的是，細胞群(2)通常在其表面具有多個拷貝的細胞表面分子(30)，并且這些多個重拷貝的結(jié)合通常是激活所需要的。因此，多聚化劑(4)通常提供不止一個的結(jié)合位點Z1，這樣使得多個第一試劑(6)可以可逆地結(jié)合以實現(xiàn)第一試劑的“多聚化”，即意味著將足夠密度的第一試劑呈現(xiàn)給細胞群(2)(未在圖1的圖式中示出)。在這方面，應(yīng)當注意的是，本文使用的多聚化試劑本身可具有多個結(jié)合位點Z1，例如，鏈霉親和素突變蛋白(為同源四聚體)其天然態(tài)具有四個這樣的結(jié)合位點Z1。然而也有可能是，多聚化劑是基于一種本身僅有一個結(jié)合位點Z1用于結(jié)合配偶體C1可逆結(jié)合的化合物。這樣的實例是多聚鈣調(diào)蛋白。鈣調(diào)蛋白本身僅具有一個鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽的結(jié)合位點。然而，鈣調(diào)蛋白可以被生物素化，然后與鏈霉親和素寡聚物發(fā)生反應(yīng)(也參見下文)，從而提供其中多個鈣調(diào)蛋白分子在“支架(scaffold)”上以高濃度呈現(xiàn)的多聚化劑，由此提供多聚鈣調(diào)蛋白。

如圖1c所示，孵育(通常進行一段適宜的時間以實現(xiàn)所需細胞群的擴增)后，第一試劑(6)的結(jié)合配偶體C1(6a)和多聚化劑(4)的結(jié)合位點Z1之間的結(jié)合通過破壞各自的可逆鍵而被破壞?？梢酝ㄟ^向含有與多聚化劑結(jié)合的細胞群(2)的孵育/反應(yīng)混合物中加入競爭物來實現(xiàn)這種破壞。為了競爭性破壞(可以理解為競爭性洗脫)第一試劑的結(jié)合配偶體C1(6a)和多聚化劑的結(jié)合位點Z1(22)之間的可逆鍵，孵育混合物/細胞群可以與游離的第一結(jié)合配偶體C1(20)或所述第一結(jié)合配偶體C的類似物接觸，所述第一結(jié)合配偶體C的類似物能夠破壞第一結(jié)合配偶體C1(6a)和結(jié)合位點Z1(22)之間的鍵。在結(jié)合配偶體C1為與鏈霉親和素的生物素結(jié)合位點相結(jié)合的鏈霉親和素結(jié)合肽的實施例中，第一游離配偶體C1(20)可以是相應(yīng)的游離鏈霉親和素結(jié)合肽或者是競爭性結(jié)合的類似物。這樣的類似物可以是例如生物素或諸如脫硫生物素的生物素衍生物。

如圖1d所示，第一游離配偶體(20)或其類似物的加入導(dǎo)致結(jié)合配偶體C1(6a)從多聚化劑(4)上被置換下來，由于結(jié)合配偶體C1被包含在第一試劑(6)中，從而導(dǎo)致第一試劑(6)從多聚化劑(4)上被置換下來。第一試劑(6)的這種置換轉(zhuǎn)而導(dǎo)致第一試劑(6)從細胞表面受體(30)上解離，特別是，如果第一試劑和細胞表面受體(30)之間的鍵的結(jié)合親和力解離常數(shù)(K_d)在10^-2M至10^-13M的范圍內(nèi)并因此也是可逆的。由于這種解離，細胞群(2)的刺激也被終止。因此，本發(fā)明提供了這樣的優(yōu)勢：細胞群的刺激或擴增的時間段可被精確控制，因此細胞群的功能狀態(tài)也可被嚴密控制。關(guān)于這點，應(yīng)當注意的是，抗體分子對其抗原(包括例如細胞表面受體分子，諸如該實施例中的CD40)的結(jié)合親和力通常處于K_d為10^-7M至10^-13M的親和力值范圍內(nèi)。因此，常規(guī)的單克隆抗體可用作本發(fā)明中的第一試劑(當然也可用作如下文所述的第二試劑)。為了避免導(dǎo)致更強結(jié)合的任何不期望的親和作用，單克隆抗體也可以以其單價抗體片段例如Fab片段或單鏈Fv片段的形式使用。

此外，由于第一試劑從細胞表面分子(30)解離，本發(fā)明還具有附加的優(yōu)勢：被刺激的細胞群在刺激期結(jié)束時不含刺激試劑和本方法中使用的所有其它試劑，也就是說第一試劑(6)以及結(jié)合配偶體C1或其類似物的游離第一配偶體(20)可通過國際專利申請WO 2013/124474中所述的“去除筒(removal cartridge)”從被刺激的細胞群(2)上被輕易去除，而被固定于固體載體諸如生物反應(yīng)器表面或磁珠上的多聚化劑(4)被保留。因此，回到游離試劑(6)和游離第一配偶體(20)的去除，依照WO 2013/124474中對“去除筒”的描述(參見例如其中的圖4)，本文圖1d中獲得的洗脫樣品可上樣到WO 2013/124474中所述的第二層析柱上。該層析柱具有合適的固定相，其既是親和層析基質(zhì)，同時也能作為凝膠滲透基質(zhì)。該親和層析基質(zhì)具有固定于其上的親和試劑。在當前實施例中，該親和試劑可以是例如鏈霉親和素、鏈霉親和素突變蛋白、親和素、親和素突變蛋白或其混合物。第一試劑(6)、結(jié)合配偶體C1的游離第一配偶體(20)(在此也被稱為“競爭試劑”)與親和試劑結(jié)合，由此被固定在層析基質(zhì)上。結(jié)果，含有已分離的擴增細胞群(2)的洗脫樣品正耗盡第一試劑(6)和競爭試劑(20)。不含任何試劑的擴增的細胞群(2)此時處于留待進一步使用的條件下，例如，用于診斷應(yīng)用(例如，進一步的FACS^TM分選)或者用于任何基于細胞的治療應(yīng)用。

圖2示出了本發(fā)明擴增方法的另一個實施方式。如圖2a所示，樣品包含攜帶兩個特異性細胞表面分子(30)和(32)的細胞群(2)。細胞表面分子(30)參與向細胞群提供初級激活信號，而細胞表面分子(32)是參與向細胞提供刺激的細胞表面的輔助分子。所述細胞群可以是，例如，細胞表面分子(30)為TCR/CD3復(fù)合物且細胞表面分子(32)為輔助分子CD28的T細胞群。作為初級激活信號的TCR/CD3復(fù)合物的結(jié)合和作為共刺激物的CD28的結(jié)合對于T細胞的擴增/增殖是必要的。T細胞群(2)是與其它缺乏表面受體分子(30)和(32)的細胞群(22)混合在一起的。另外，在本實施方式中，細胞群(2)與多聚化劑(4)相接觸。多聚化劑(4)具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、向細胞提供初級激活信號的第一試劑(6)。此外，多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、刺激作為細胞表面輔助分子的CD28的第二試劑(8)。

多聚化劑(4)包含至少一個結(jié)合位點Z1(42)用于第一試劑(6)的可逆結(jié)合，并且第一試劑(6)包含至少一個結(jié)合配偶體C1(6a)，其中結(jié)合配偶體C1(6a)能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點Z1(44)結(jié)合。因此，為了固定，第一試劑(6)通過結(jié)合配偶體C1(6a)和結(jié)合位點Z1(42)之間形成的可逆鍵與多聚化劑(4)相結(jié)合。此外，在圖2所述的實施例中，第二試劑(8)包含結(jié)合配偶體C2(8a)，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠被可逆地與多聚化劑(4)的結(jié)合位點Z2(44)結(jié)合。第二試劑(8)通過結(jié)合配偶體C2(8a)和結(jié)合位點Z2(44)之間形成的可逆鍵與多聚化劑(4)相結(jié)合。在本實施例中，第一試劑(6)可能是單克隆抗CD3抗體或其抗原結(jié)合片段如Fab片段。第二試劑(8)可能是單克隆抗CD28抗體或其抗原結(jié)合片段如Fab片段。第一結(jié)合配偶體(6a)可能是與抗CD3抗體或抗CD3抗體片段融合或綴合的鏈霉親和素結(jié)合肽(6a)。第二結(jié)合配偶體(8a)可能是也與CD28抗體或CD28結(jié)合抗體片段綴合或融合的鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽。關(guān)于這點，應(yīng)當注意的是，抗例如CD3或CD28的單克隆抗體是眾所周知的(參見例如，如上所述的美國專利US 6,352,694 B或歐洲專利EP 0 700 430 B1)并且可購自許多供應(yīng)商例如Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)、Life Technologies(Carlsbad,CA,USA)、BD Biosciences(San Jose,CA,USA)、Biolegend(San Diego,CA,USA)或者Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach,Germany)，僅僅舉幾個例子。因此，這種單克隆抗體可用作第一試劑和第二試劑，并且可以與例如結(jié)合配偶體C1或C2化學(xué)偶聯(lián)(綴合)。或者，也可以從雜交瘤細胞系克隆可變結(jié)構(gòu)域的基因或者使用氨基酸序列已知的抗體，重組產(chǎn)生各自的抗體片段例如Fab片段或者Fv。當在關(guān)于產(chǎn)生單克隆抗CD3抗體的雜交瘤細胞系OKT3(CRL-8001^TM，如美國專利US 4,361,549所描述的)和抗CD28抗體28.3(如Vanhove等人BLOOD,15July 2003，Vol.102,No.2,pages 564-570和基因庫(GenBank)登錄號AF451974.1中所描述)兩者的實施例部分中使用本文所述的這種方法時，通過用于重組生產(chǎn)的各自表達載體很方便地提供結(jié)合配偶體C1和C2，這樣抗體片段在輕鏈或重鏈的C端攜帶作為融合肽的結(jié)合配偶體C1或C2(關(guān)于這點，如Arakawa等人J.Biochem.120,657-662(1996)中所描述的抗體OKT3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列出于說明的目的以SEQ ID NO 17和18及所附序列表示出，而如上述Vanhove等人中所描述的抗CD28抗體28.3的可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在所附序列表中以SEQ ID NO 19(VH)和20(VL)示出)。克隆抗體分子的可變結(jié)構(gòu)域并重組生產(chǎn)各自抗體片段的這種方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員而言所熟知的，參見例如，Skerra,A.(1994)A general vector,pASK84,for cloning,bacterial production,and single-step purification of antibody Fab fragments.Gene 141,79-84,或者Skerra,A.(1993)Bacterial expression of immunoglobulin fragments.Curr Opin Immunol.5,256-562。最后，如圖2實施例中所述，還可以通過下列眾所周知的進化方法來產(chǎn)生具有抗給定靶物諸如CD3或CD28的抗體樣特性人工結(jié)合分子的抗體分子，諸如噬菌體展示(例如，Kay,B.K.等人(1996)Phage Display of Peptides and Proteins–A Laboratory Manual,1^st Ed.,Academic Press,New York NY；Lowman,H.B.(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26,401–424，或者Rodi,D.J.和Makowski,L.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10,87–93中所綜述的)、核糖體展示(Amstutz,P.等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12,400-405中所綜述的)或者如Wilson,D.S.等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98,3750-3755中所報道的mRNA展示。

在圖2所示的實施例中，多聚化劑(4)具有兩個不同的結(jié)合位點Z1(42)和Z2(44)。當結(jié)合配偶體C1(6a)是鏈霉親和素結(jié)合肽時，多聚化劑(4)的結(jié)合位點Z1(42)由合適的與鏈霉親和素肽(6a)可逆結(jié)合的鏈霉親和素突變蛋白提供。由于結(jié)合配偶體C2是鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽，多聚化劑(4)的結(jié)合位點Z2(44)由多聚鈣調(diào)蛋白提供。多聚化劑(4)可以是單個分子，例如多聚鈣調(diào)蛋白與鏈霉親和素的綴合物(該替代選擇可能通常是在可溶性多聚化的情況下采用)，或者也可以由兩個獨立分子組成。當多聚化劑(44)被固定于如圖2所示的固體載體時，后一種選擇是優(yōu)選的。在這種情況下，鏈霉親和素突變蛋白和鈣調(diào)蛋白的混合物被涂覆(固定)在固體載體上，例如，按結(jié)合位點Z1和Z2為1:1的摩爾比。關(guān)于這點，應(yīng)當注意的是，由于鈣調(diào)蛋白固定在固體載體上，無需再制備如上所述的多聚鈣調(diào)蛋白，但是鈣調(diào)蛋白固定在表面上足以呈現(xiàn)足夠高密度的鈣調(diào)蛋白(如上所述，鈣調(diào)蛋白僅有一個鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽的結(jié)合位點)，以確保細胞群(2)的結(jié)合。例如，在這種情況下，具有兩個抗CD28結(jié)合位點的二價抗體片段或者自身具有兩個相同結(jié)合位點的完整抗體可以用作第二試劑(8)。

如圖2b所示，在使T細胞群(2)與多聚化劑(4)接觸并通常用多聚化劑(4)孵育細胞群之后，T細胞群(2)經(jīng)由第一試劑(6)和第二試劑(8)與多聚化劑形成復(fù)合物/相結(jié)合。第一試劑(6)和第二試劑(8)與TCR/CD3復(fù)合物和輔助分子CD28特異性結(jié)合，由此誘導(dǎo)T細胞增殖/擴增。

如圖2c所示，在孵育(通常進行一段適宜的時間以實現(xiàn)所需細胞群的擴增)之后，第一試劑(6)的結(jié)合配偶體C1(6a)和多聚化劑(4)的結(jié)合位點Z1之間的結(jié)合通過破壞各自的可逆鍵而被破壞。同樣地，第二試劑(8)的結(jié)合配偶體C2(8a)和多聚化劑(4)的結(jié)合位點Z2之間的結(jié)合通過破壞各自的可逆鍵而被破壞。第一試劑(6)的結(jié)合配偶體C1(6a)和結(jié)合位點Z1之間的可逆鍵可被生物素(其充當游離的第一配偶體的類似物(20))破壞，而由于鈣調(diào)蛋白與鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽的結(jié)合是鈣離子(Ca²⁺)依賴型，因此第二試劑(8)的結(jié)合配偶體C2(8a)和結(jié)合位點Z2之間的可逆鍵可通過加入金屬螯合劑(鈣離子螯合劑)諸如EDTA或EGTA(其充當游離的第二配偶體的類似物(20))而被破壞。當然，這意味著與細胞群(2)的接觸是在含Ca²⁺的緩沖液中進行。

如圖2d所示，第一游離配偶體和第二游離配偶體的類似物(20)的加入，分別導(dǎo)致結(jié)合配偶體C1(6a)和C2(8a)從多聚化劑(4)上被置換下來，因而導(dǎo)致第一試劑(6)和第二試劑(8)從多聚化劑(4)上被置換下來。第一試劑(6)和第二試劑(8)的這種置換轉(zhuǎn)而導(dǎo)致第一試劑(6)和第二試劑(8)從TCR/CD3復(fù)合物和輔助分子CD28上解離，由此終止細胞群(2)的刺激/擴增。因此，如上所述，本發(fā)明提供了可精確控制T細胞群刺激或擴增的時間段從而嚴密控制T細胞群功能狀態(tài)的優(yōu)勢。在如圖1d所示的洗脫細胞后，第一試劑(6)、第二試劑(8)以及結(jié)合配偶體C1的游離第一配偶體和結(jié)合配偶體C2的第二游離配偶體的類似物(20)可經(jīng)由如國際專利申請WO 2013/124474中所述的”去除筒”從被刺激過的細胞群(2)上被輕易地除去。此外，重要的是，假使初始樣品是例如由聚蔗糖(Ficoll)梯度得到的PMBC形式的淋巴細胞群，那么T細胞群(2)此時便可用于如本文所定義的連續(xù)擴增。由于擴增的細胞群(例如，通過CD3/CD28的初始刺激)在擴增期間可用例如T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR，也被稱為人造T細胞受體)轉(zhuǎn)染，然后經(jīng)基因修飾的細胞可從初始刺激中釋放出來，并隨后被第二類刺激例如重新引入的受體所刺激。這些第二刺激可以包括以肽/MHC分子形式存在的抗原刺激物、遺傳引入受體的同源(交聯(lián))配體(例如，CAR的天然配體)或在新受體的框架內(nèi)直接結(jié)合(例如，通過在受體內(nèi)識別恒定區(qū))的任意配體(例如抗體)。因此，從這種連續(xù)擴增中獲得的T細胞群可用于過繼性細胞轉(zhuǎn)移。

圖3示出了本發(fā)明擴增方法的又一個實施方式。此外，該實施例所用的樣品包含攜帶兩個特異性細胞表面分子(30)和(32)的T細胞群(2)，其中細胞表面分子(30)是TCR/CD3復(fù)合物且細胞表面分子(32)是輔助分子CD28。在圖3a中，示出的是與多聚化劑(4)接觸后的T細胞群(2)。此外，在該實施例中，多聚化劑(4)具有可逆固定(結(jié)合)于其上作為第一試劑(6)的、向T細胞提供初級激活信號的抗CD3抗體或其抗原結(jié)合片段，以及作為第二試劑(8)的、刺激輔助分子CD28的抗CD28抗體或其抗原結(jié)合片段。

圖3實施例中所示的多聚化劑(4)僅包括一類結(jié)合位點Z1(42)用于第一試劑(6)和第二試劑(8)兩者的可逆結(jié)合。第一試劑(6)和第二試劑(8)兩者都包含至少一個結(jié)合配偶體C1(6a、8a)，其中結(jié)合配偶體C1(6a)和結(jié)合配偶體(8a)兩者都能夠可逆地與多聚化劑的結(jié)合位點Z1(44)結(jié)合。因此，為了固定，第一試劑(6)和第二試劑(8)通過結(jié)合配偶體C1(6a)和結(jié)合配偶體C2與結(jié)合位點Z1(42)之間形成的可逆鍵分別與多聚化劑(4)相結(jié)合。結(jié)合配偶體C1和C2可以是不同的或相同的。例如，結(jié)合配偶體C1可以是序列為Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys((SEQ ID NO:01)，“Strep標記(Strep-)”)的鏈霉親和素結(jié)合肽，而結(jié)合配偶體C2可以是序列為Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₃-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys((SEQ ID NO:04)，也被稱為“di-tag3”)或為Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)₂-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys((SEQ ID NO:05)，也被稱為“the di-tag2”)的鏈霉親和素結(jié)合肽，如Junttila等人,Proteomics 5(2005),1199-1203或美國專利7,981,632中所描述的。所有這些鏈霉親和素結(jié)合肽都與相同的結(jié)合位點相結(jié)合，即鏈霉親和素的生物素結(jié)合位點。如果一個或多個這種鏈霉親和素結(jié)合肽用作結(jié)合配偶體C1和C2，那么多聚化劑(4)是一種鏈霉親和素突變蛋白。如圖3所示，可溶性多聚化劑(4)被使用。在鏈霉親和素突變蛋白的情況下，這種可溶性多聚化劑可以是例如鏈霉親和素或親和素的寡聚物或聚合物，或者鏈霉親和素或親和素的任意突變蛋白(類似物)的寡聚物或聚合物。所述寡聚物可以包含三個或更多個鏈霉親和素、親和素或其突變蛋白的單體。所述寡聚物或聚合物可通過多糖交聯(lián)。這種鏈霉親和素或親和素的寡聚物或聚合物、或鏈霉親和素或親和素突變蛋白的寡聚物或聚合物可通過在第一步中將羧基殘基引入多糖例如葡聚糖來制備，基本上如“Noguchi,A.,Takahashi,T.,Yamaguchi,T.,Kitamura,K.,Takakura,Y.,Hashida,M.&Sezaki,H,(1992).Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextran conjugate.Bioconjugate Chemistry 3,132-137”中所述。在第二步中，采用常規(guī)的碳二亞胺化學(xué)方法，鏈霉親和素或親和素或其突變蛋白經(jīng)由內(nèi)部賴氨酸殘基和/或游離N端的伯氨基基團與葡聚糖骨架上的羧基基團偶聯(lián)?？商娲?，鏈霉親和素或親和素或任意鏈霉親和素或親和素的突變蛋白的交聯(lián)寡聚物或聚合物也可以經(jīng)由雙功能接頭諸如戊二醛通過交聯(lián)或通過文獻中所述的其它方法獲得。

作為結(jié)合配偶體C1和C2使用，與多聚化劑的相同結(jié)合位點結(jié)合(42)相結(jié)合的部分具有的優(yōu)勢在于，如圖3b所示，(第一結(jié)合配偶體C1以及第二結(jié)合配偶體C2的)相同游離配偶體或其類似物可用于終止T細胞群(2)的擴增，并將T細胞群(2)從多聚化劑上釋放出來。在圖3的實施例中，第一和第二配偶體C1和C2的類似物諸如生物素或生物素的衍生物(亞氨基生物素或脫硫生物素)可方便地用于T細胞群(2)的擴增終止和洗脫。

如圖3c所示，在如圖1d所示洗脫細胞后，第一試劑(6)、第二試劑(8)以及生物素作為結(jié)合配偶體C1的游離第一配偶體和結(jié)合配偶體C2的游離第二配偶體的類似物，可以通過如國際專利申請WO 2013/124474中所述的”去除筒”從被刺激的細胞群(2)上輕易地去除。此外，使用可溶性多聚化劑(4)的實施方式具有另一個優(yōu)點，即能夠避開任何固體載體諸如磁珠。這意味著將不存在已激活的T細胞被這種磁珠污染的風險。這也意味著符合GMP標準的過程與已知的方法相比更容易建立，諸如使用則必須采用額外的措施以確保最終的擴增T細胞群不含磁珠。此外，可溶性多聚化劑的使用使得其極易從已激活的細胞群(T細胞、B細胞或天然殺傷細胞)中去除，因為細胞可通過離心簡單沉淀，而含有可溶性多聚化劑的上清液則可棄除?？商娲兀扇苄远嗑刍瘎┛稍趪H專利申請WO 2013/124474的去除筒的凝膠滲透基質(zhì)中從已擴增的細胞群中被去除。由于不存在固相(例如磁珠)，本發(fā)明還提供了一種用于細胞擴增的自動封閉系統(tǒng)，其可整合到已知的細胞擴增系統(tǒng)中，諸如可購于GE Healthcare(Little Chalfont,Buckinghamshire,United Kingdom)的W25型Xuri細胞擴增系統(tǒng)(Xuri Cell Expansion System W25)和WAVE生物反應(yīng)器2/10系統(tǒng)(WAVE Bioreactor2/10System)，或者可購于TerumoBCT Inc.(Lakewood,CO,USA)的細胞擴增系統(tǒng)(Cell Expansion System)。

圖4示出了CD3+ T應(yīng)答細胞在體外用可逆固定于涂覆有鏈霉親和素突變蛋白Strep-的磁珠上的αCD3和αCD28 Fab片段刺激后增殖的實驗結(jié)果。圖4A是示出了被刺激細胞大小分布(前向散射)的直方圖，圖4B示出了代表據(jù)每次細胞分裂時的細胞數(shù)所示的增殖程度的直方圖，細胞分裂次數(shù)如圖4B頂部所標示(0代表未分裂的細胞；5代表經(jīng)歷了至少5次分裂的細胞)，圖4C示出了刺激4天后的培養(yǎng)皿照片。

圖5示出了Jurkat細胞內(nèi)不同的細胞內(nèi)鈣動員的結(jié)果，所述Jurkat細胞是用αCD3抗體OKT3或用Strep-多聚化的OKT3的Fab片段(本文中也稱為Fab多聚體)標記的。圖5A：Jurkat細胞與鈣敏染料Indo-1-AM一起上樣，通過注入αCD3mAb(黑色正方形)觸發(fā)鈣釋放，或者在進行或不進行預(yù)先D-生物素破壞(分別為深灰色三角形和淺灰色圓形)下通過注入αCD3OKT3 Fab多聚體(衍生自親本細胞系OKT3)觸發(fā)鈣釋放，與注入PBS(白色倒三角形)相比較。離子霉素(ionomycine)的應(yīng)用為陽性對照?；贔L6/FL7比率的變化，通過流式細胞術(shù)來監(jiān)控細胞內(nèi)Ca²⁺濃度的時間分辨變化。圖5B：經(jīng)Indo-1-AM標記的Jurkat細胞被如圖4a所述的不同的αCD3刺激所激活(OKT3：上方曲線圖，αCD3 Fab多聚體：中間曲線圖)，隨后(t＝140s)進行D-生物素介導(dǎo)的αCD3 Fab多聚體信號的破壞。注射PBS(下方曲線圖)或離子霉素作為陰性或陽性對照。數(shù)據(jù)代表三個不同的實驗。

圖6示出了用抗CD3OKT3 Fab多聚體對細胞進行可逆染色的結(jié)果。新鮮分離的PBMC用單克隆抗體(左側(cè)散點圖，F(xiàn)ab多聚體的親本克隆)或同源的PE標記的Fab多聚體染色，并在用D-生物素處理之前(左二列)或之后(中間列)進行分析。在后續(xù)的清洗步驟后，使用新鮮的PE標記的Strep-(右二列)檢測剩余的Fab單體。進行二次Fab多聚體染色的可逆染色細胞作為對照(右列)。只有活(PI^陰性)細胞才能顯示出來。散點圖中的數(shù)字表示柵極內(nèi)的細胞百分比。

圖7示出了通過抗CD28 Fab片段的可逆結(jié)合所分離的細胞，所述抗CD28 Fab片段與Strep-多聚化，并用熒光標記藻紅蛋白進行標記。CD28+細胞通過如國際專利申請WO2013/011011中所述的Fab多聚體磁性細胞選擇法從新鮮分離的PMBC中被選擇/分離出來。在選擇之前，用同源的熒光αCD28多聚體(左側(cè)散點圖)或者用直接抗免疫球蛋白κ輕鏈的抗體(左二散點圖，α-IgκmAb)對細胞進行對照染色。在選擇之后，用D-生物素處理細胞，隨后清洗去除磁珠和Fab單體。隨后用CD28 Fab多聚體(右二散點圖)或用α-IgκmAb(右散點圖)對被釋放的CD28+細胞進行(重新)染色，以檢測可能殘余的Fab單體。只有活的(PI^陰性)CD3+細胞才能顯示出來。散點圖中的數(shù)字表示柵極內(nèi)的細胞百分比。

圖8示出了CD3+ T應(yīng)答細胞在體外用可逆固定于充當可溶性多聚化劑的可溶性寡聚Strep-上的可逆性αCD3/αCD28 Fab片段刺激后增殖的實驗結(jié)果。對于圖8所示的實驗結(jié)果，300.000個CD3+應(yīng)答T細胞(Tresp)用2μM羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)進行標記，并用不同量的固定有αCD3 Fab片段和αCD28 Fab組合的可溶性Streptactin寡聚物制劑進行刺激，所述αCD3 Fab片段和αCD28 Fab兩者均在重鏈上攜帶充當鏈霉親和素結(jié)合肽的Strep標記的。(“1x”對應(yīng)于用0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab功能化的3μg多聚Strep-tactin；數(shù)字表示“1x”的倍數(shù))。剩余的未經(jīng)刺激的或用空白Strep-tactin多聚體(無Fab)進行刺激的Tresp細胞作為陰性對照。將Tresp細胞一式兩份連同300.000個CD3陰性自飼養(yǎng)細胞(經(jīng)30Gy輻照)一起接種到48孔板上1ml添加有20U/ml白細胞介素2(IL-2)的細胞培養(yǎng)基中。細胞在37℃下進行孵育，不更換培養(yǎng)基，5天后根據(jù)CFSE稀釋法通過FACS分析對增殖情況進行分析(圖8B)。圖8A示出了培養(yǎng)5天后細胞的大小分布。直方圖示出了活的CD3+細胞，而圖8C示出培養(yǎng)后用1mM D-生物素處理并清洗后由刺激試劑釋放的細胞。通過使用熒光標記藻紅蛋白標記的Strep-(ST-PE)進行重新染色來分析單體Fab片段的解離和去除，并示出了代表性直方圖。圖8D示出了使用Neubauer計數(shù)室計算出的5天后活(臺盼藍陰性)細胞的絕對數(shù)，并按各自的刺激條件繪圖。中位細胞數(shù)在圖8D中示出；誤差線表示標準偏差(SD)。圖8E示出了刺激5天后培養(yǎng)板的照片。

圖9示出了本發(fā)明的連續(xù)擴增方法的圖解(圖9a)，而圖9b簡單介紹了連續(xù)擴增的一些特征和優(yōu)勢。

圖10示出了可與本發(fā)明的擴增方法一同使用的本發(fā)明的一種排布。這種排布(100)包括生物反應(yīng)器(50)、第一“去除筒”(70)和第二“去除筒”(90)。生物反應(yīng)器(50)與第一去除筒(70)流體式連接，而第一去除筒與第二去除筒(90)為流體連接。這種排布(100)可以是本文所述的自動化細胞擴增純化設(shè)備的一部分。

本文所述的擴增方法在生物反應(yīng)器(50)中進行，例如，圖3中所述的使用可溶性多聚化劑的擴增方法。在這種情況下，在通過加入競爭物(20)(結(jié)合配偶體C1的游離配偶體或其類似物)終止細胞群(2)的激活/擴增之后，從生物反應(yīng)器中釋放的反應(yīng)混合物包含擴增的細胞群(2)、第一試劑(6)、第二試劑(8)以及可溶性多聚化劑(4)。在該實施例中，第一試劑(6)是包括作為結(jié)合配偶體C1的鏈霉親和素結(jié)合肽在內(nèi)的CD3結(jié)合抗體片段，第二試劑(8)是包括作為結(jié)合配偶體C1的鏈霉親和素結(jié)合肽在內(nèi)的CD28結(jié)合抗體片段，以及競爭物(20)(結(jié)合配偶體C1的游離類似物)是生物素。這種反應(yīng)混合物被施加到去除筒(70)上。這種第一去除筒(70)是如國際專利申請WO 2013/124474所述的去除筒，其包括具有合適固定相的層析柱。所述固定相可用作親和層析基質(zhì)，并且同時可用作凝膠滲透基質(zhì)。這種親和層析基質(zhì)具有固定于其上的親和試劑。在本實施例中，所述親和試劑可以是例如鏈霉親和素、鏈霉親和素突變蛋白、親和素、親和素突變蛋白或其混合物。因此，第一試劑(6)和第二試劑(8)通過其鏈霉親和素結(jié)合肽與親和試劑結(jié)合。此外，生物素作為競爭物(20)與親和試劑結(jié)合。因此，這三種試劑全部被固定在第一去除筒的層析基質(zhì)上，而擴增的細胞群(2)和可溶性多聚化劑(4)通過固定相。然后這種“流經(jīng)物”被施加到第二去除筒(90)上。此外，這種第二去除筒(90)包括固定相。這種固定相其上包含能夠與多聚化劑(4)的結(jié)合位點Z1(42)結(jié)合的第二親和試劑。這種親和試劑可能是例如與固定相共價結(jié)合的生物素。這種固定相可能是例如獲自Affiland S.A.(Ans-Liege，Belgium)的D-生物素Sepharose^TM瓊脂糖凝膠。因此，可溶性多聚化劑(4)將被結(jié)合(保留)在第二去除筒(90)的固定相上，而擴增的細胞群(2)通過固定相且不含任何試劑。細胞群(2)此時處于留待進一步使用的狀態(tài)下，例如，用于診斷應(yīng)用(例如，進一步FACS^TM分選)或者用于任何基于細胞的治療應(yīng)用。這里應(yīng)當注意的是，改變排布(100)中第一“去除筒”(70)和第二“去除筒”(90)的順序當然也是可以的，這樣，生物反應(yīng)器(50)與第二去除筒(90)(直接)流體連接在，而將第一去除筒(70)安排在其后并與第二去除筒(90)流體式連接。在此排布中，多聚化劑(4)將首先從細胞群(2)中去除，隨后是第一試劑(6)、第二試劑(8)和例如競爭物(20)被去除。這樣的排布也被包含在本發(fā)明中并且也可以是本文所述的自動化細胞擴增純化設(shè)備的一部分。

圖11示出了可與本發(fā)明的擴增方法一同使用的本發(fā)明排布的另一個實施方式。這種排布(110)包括生物反應(yīng)器(50)、第一“去除筒”(70)和第二“去除筒”(90)。生物反應(yīng)器(50)與第一去除筒(70)流體式連接，且第一去除筒與第二去除筒(90)流體式連接。此外，第二去除筒(90)與生物反應(yīng)器(50)流體式連接。這種排布(110)也可以是本文所述的自動化細胞擴增純化設(shè)備的一部分。當例如與采用可溶性多聚化劑(4)的擴增方法一同使用時，經(jīng)純化的擴增細胞群(2)以第二去除筒(90)的洗脫液獲得。由于去除筒(90)與生物反應(yīng)器(50)流體式連接，因此細胞群(2)可轉(zhuǎn)回至生物反應(yīng)器(50)，例如進行本文所述的連續(xù)克隆擴增，通過例如用T細胞受體基因?qū)毎哼M行轉(zhuǎn)染，隨后采用本發(fā)明的擴增方法進一步(二次)擴增。

圖12示出了可與本發(fā)明的擴增方法一同使用的本發(fā)明的排布的又一個實施方式。這種排布(120)包括生物反應(yīng)器(50)、第一“去除筒”(70)和第二“去除筒”(90)。生物反應(yīng)器(50)與第一去除筒(70)流體式連接，并且第一去除筒與第二去除筒(90)流體式連接。類似于圖11中所示的實施方式，第二去除筒(90)與生物反應(yīng)器(50)流體式連接。然而，如國際專利申請WO 2013/124474中所述的“選擇筒”(92)被排布在第二去除筒(90)和生物反應(yīng)器(50)之間。因此，細胞群(2)中包含的細胞亞群(2a)可通過這種如WO 2013/124474中所述的“選擇筒”(92)被選擇/富集。這種細胞亞群(2a)可或被轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器(50)，例如以進行本文所述的連續(xù)擴增。作為替代地(未示出)，這種細胞亞群(2a)可用于基于細胞的治療。這里再次需要注意的是，使用本文所述的可溶性多聚化劑得以設(shè)計出功能性封閉的、且由此不易受污染的自動化細胞純化擴增設(shè)備。此外，由于可溶性多聚化劑避免了對固相材料諸如磁珠的需要，因此這種細胞純化設(shè)備可設(shè)計為連續(xù)流動設(shè)備。

圖13示出了純化的CD4+和CD8+ T應(yīng)答細胞(Tresp)在體外被可逆固定于作為可溶性多聚化劑的兩種可溶性寡聚Strep-突變蛋白上的αCD3/αCD28 Fab片段或αCD3/αCD28/αCD8刺激而增殖的擴增動力學(xué)。第一種寡聚Strep-是實施例5中獲得的寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)的一部分(也被稱為“常規(guī)骨架”，在圖13中以尖端朝下的三角形符號表示)，第二種用做可溶性多聚化劑的寡聚鏈霉親和素突變蛋白是一種通過使可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白與生物素化的人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)發(fā)生反應(yīng)而得到寡聚物。這種基于HSA的可溶性多聚化劑在本文中也被稱為“大骨架”。在圖13的實驗中，擴增是在不更換培養(yǎng)基的情況下進行的。CD4+ T應(yīng)答細胞的結(jié)果在圖13A中示出，CD8+ T應(yīng)答細胞的結(jié)果在圖13B中示出。關(guān)于這點，應(yīng)當注意的是，實驗上使用的可溶性多聚化劑通過可逆地與第一試劑、任選地與第二和第三試劑結(jié)合而被功能化，在圖中被稱為“多聚體”。

圖14示出了純化的CD4+和CD8+ T應(yīng)答細胞(Tresp)在體外被可逆固定于作為可溶性多聚化劑的兩種可溶性寡聚Strep-上的αCD3/αCD28Fab片段刺激而增殖的擴增動力學(xué)。第一種寡聚Strep-是實施例5中獲得的寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)的一部分(也被稱為“常規(guī)骨架”，在圖14中以尖端朝上的三角形符號表示)，第二種用做可溶性多聚化劑的寡聚鏈霉親和素突變蛋白是基于HSA的可溶性多聚化劑(上述的“大骨架”。在圖14的實驗中，擴增是在更換培養(yǎng)基的情況下進行的。CD4+ T應(yīng)答細胞的結(jié)果在圖14A中示出，CD8+ T應(yīng)答細胞的結(jié)果在圖14B中示出。

圖15示出了圖13和14中純化的CD4+和CD8+ T應(yīng)答細胞增殖的擴增動力學(xué)所得結(jié)果的綜合數(shù)據(jù)，其中，圖15A示出了CD4+ T細胞的結(jié)果，圖15B示出了CD8+ T細胞的結(jié)果。在第3天更換培養(yǎng)基的情況下的培養(yǎng)用直線表示，而虛線示出了第3天不更換培養(yǎng)基的情況下的擴增程度的值。圖15中所示的數(shù)據(jù)用輸入的細胞數(shù)歸一化。只有用寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)刺激的Tresp、用市售Dynabeads(陽性對照)刺激的Tresp以及未經(jīng)刺激的T細胞(陰性對照)的數(shù)據(jù)被示出，而具有“大骨架”的多聚化劑卻沒有數(shù)據(jù)。

圖16示出了純化的CD4+和CD8+ T應(yīng)答細胞在體外被可逆固定于如實施例5中所述的可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)上的αCD3/αCD28Fab片段刺激而激活后T細胞的早期群簇形成。圖16A示出了CD4+ T細胞的結(jié)果，而圖16B示出了CD8+ T細胞的結(jié)果。用可溶性多聚化劑(寡聚鏈霉親和素突變蛋白)刺激的Tresp、用市售Dynabeads刺激的Tresp(陽性對照)以及未經(jīng)刺激的T細胞(陰性對照)的數(shù)據(jù)被示出。

圖17示出了在體外被與實施例5中所述的可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)可逆結(jié)合的αCD3/αCD28 Fab片段所多克隆刺激的CD3+中樞記憶T細胞(Tcm)(CD3+CD62L+CD45RA-Tcm)的擴增動力學(xué)和表型。圖17中示出的曲線圖代表了據(jù)每個時間點上收獲的細胞數(shù)所示的增殖程度，其中，圖17A示出了只添加IL-2的培養(yǎng)基中的增殖，圖17B示出了添加了IL-2和IL-15的培養(yǎng)基中的增殖。圖17C示出了在這些可變細胞因子環(huán)境中培養(yǎng)14后CD62L和CD127的表面表達水平的流式細胞分析。

圖18示出了從大量純化的CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細胞中進行選擇性抗原特異性(Ag特異性)擴增的動力學(xué)，其中，所述CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細胞在體外被肽:MHC分子復(fù)合物(充當向細胞提供初級激活信號的第一試劑)和αCD28 Fab片段(充當與細胞表面輔助分子結(jié)合的第二試劑)二者刺激，未刺激的T細胞(陰性對照)也被示出?？乖禺愋噪呐cMHC分子的復(fù)合物和αCD28 Fab片段兩者可逆固定于同一種如實施例5中所述的可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)。用于圖18A中抗原特異性擴增的肽為肽CRVLCCYVL(SEQ ID NO:06)和被HLA-C702MHC分子(如Ameres等人,PLOS Pathogens,May 2013,vol.9,issue 5,e1003383所述)限制的即刻早期1蛋白的第309-317位氨基酸，代表對巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)具有特異性的HLA-C7/IE-1抗原表位。呈遞肽的MHC I分子在其重鏈C端攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽(SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:07)，也就是從IBA GmbH(Germany)購得的“雙Strep標記(Twin-Strep-)”。圖18A示出了對用肽:MHC-I復(fù)合物來增殖的部分Ag特異性細胞的示例性流式細胞分析，其中所述肽:MHC-I復(fù)合物對HLA-C7/IE-1抗原表位具有特異性，并作為第一試劑可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白，并向細胞提供初級激活信號。圖18B至圖18E中的曲線圖示說明了據(jù)每個時間點上收獲的特異性肽:MHCI多聚體-陽性細胞數(shù)所示的其他Ag特異性的擴增動力學(xué)，這與圖18A類似，即使用抗原特異性肽與MHC I分子的不同復(fù)合物作為可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白上、向細胞提供初級激活信號的第一試劑。更詳細地，圖18B示出了使用對CMV的pp65抗原表位有特異性的肽:MHC-I復(fù)合物(被HLA-A2402限制的第341-350位氨基酸(QYDPVAALF,(SEQ ID NO:08)))進行擴增的Ag特異性細胞的擴增結(jié)果，圖18C示出了使用另一種對CMV的pp65抗原表位具有特異性的肽:MHC-I復(fù)合物(被HLA-B702限制的第265-274位氨基酸RPHERNGFTV,(SEQ ID NO:09))進行增殖的Ag特異性細胞的擴增結(jié)果，圖18D示出了使用對腺病毒的Hexon 5抗原表位具有特異性的肽:MHC-I復(fù)合物(被HLA-B702限制的第114-124位氨基酸(CPYSGTAYNSL,(SEQ ID NO:10)))進行增殖的Ag特異性細胞的擴增結(jié)果，圖18E示出了使用對CMV的HLA-B7/IE-1_309-317抗原表位具有特異性的肽:MHC-I復(fù)合物進行增殖的Ag特異性細胞的擴增結(jié)果(示例性的FACS數(shù)據(jù)可參見上圖18A)。所有承載雙標記的肽:MHC分子均可從IBA GmbH購得。關(guān)于這點，攜帶“雙Strep標記(Twin-Strep-)”作為其C端的HLA-A*2402、HLA-B*0702和HLA-C*0702分子的氨基酸序列在所附序列表中的SEQ ID NO:21、22和23中示出，而β₂微球蛋白的氨基酸序列(其與α鏈一起形成，這意味著HLA編碼相應(yīng)的MHC I分子(HLA encoded molecules the respective MHC I molecule))在所附序列表中的SEQ ID NO:24中示出。此外，圖18F示出了對來自圖18D的、經(jīng)HLA-B7/Hexon5_114-124刺激/擴增的細胞進行培養(yǎng)14天后，CD62L和CD127表面表達水平的示例性流式細胞分析。

圖19示出了從純化的CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細胞中進行選擇性Ag特異性擴增的動力學(xué)，其中，所述CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細胞在體外被可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白上作為第一和第二試劑的a)抗原特異性肽MHC I復(fù)合物和b)αCD28 Fab片段刺激。為了這個目的，使用3μl的被0.5μg配有鏈霉親和素結(jié)合肽的肽:MHC I類復(fù)合物(特異性肽表示被HLA-B0702限制的腺病毒的Hexon 5蛋白的第114-124位氨基酸(CPYSGTAYNSL,SEQ ID NO:10)，見上文)和0.5μgαCD28 Fab功能化的Streptactin多聚化劑制劑對500.000個CD3+CD62L+CD45RA-應(yīng)答Tcm細胞(Tresp)進行Ag特異性刺激。作為替代，4.5μl Streptactin多聚化劑制劑負載有0.5μg肽:MHC I類復(fù)合物、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab。為了比較，使用3μl負載有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab組合的Streptactin多聚化劑制劑(1mg/ml)進行多克隆刺激。作為上述刺激條件的另一種替代方案，使用了4.5μl負載有0.5μgαCD3 Fab、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的Streptactin多聚體制劑。未經(jīng)處理(未經(jīng)刺激的)的Tresp細胞作為陰性對照，而經(jīng)Dynabeads多克隆刺激的Tresp細胞作為陽性對照。Tresp細胞被接種到48孔板上添加有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的1ml細胞培養(yǎng)基中。細胞在37℃下孵育，每3天更換一次培養(yǎng)基，并于7天和14天后分析細胞計數(shù)。圖19中所示的照片代表在Ag特異性刺激第5天時群簇形成的程度，以腺病毒HLA-B7/Hexon 5抗原表位為例證。

圖20示出了純化CD8+ T應(yīng)答細胞的擴增產(chǎn)量和表型，其中所述CD8+ T應(yīng)答細胞在體外用可逆固定于兩種起可溶性多聚化劑作用的可溶性寡聚Strep-上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激。第一種寡聚Strep-是實施例5中獲得的寡聚鏈霉親和素突變蛋白(常規(guī)骨架)的一部分，第二種用作可溶性多聚化劑的寡聚鏈霉親和素突變蛋白是上文所述的可溶性寡聚物，在此被稱為“大”骨架。在這些實驗中，寡聚常規(guī)鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)的一部分也被用作多聚化劑，其可被單一的Fab片段(圖20A和圖20B中的第三根柱)或者αCD3和αCD28 Fab片段組合所功能化。除了用αCD3/αCD28 Fab片段組合刺激之外，還有額外的αCD8 Fab片段(從IBA GmbH購得，Germany)被固定，以測試是否可能優(yōu)先刺激特定T細胞亞群。圖20A示出了代表據(jù)第6天收獲的細胞數(shù)所示的增殖程度的柱狀圖，其中，所述細胞數(shù)與陰性對照(未經(jīng)刺激的純化CD8+ T應(yīng)答細胞)相比較，并以陽性對照(用市售Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體的磁珠)刺激的純化CD8+ T應(yīng)答細胞)進行歸一化。圖20B示出了對細胞培養(yǎng)后CD8和T細胞表面分子CD45RO(這是T細胞增殖和激活的指征)的表面表達水平的流式細胞分析。采用單因素方差分析法對各種刺激條件進行比較，并未檢測到顯著性差異(n.s.)。

圖21示出了純化的CD8+ T應(yīng)答細胞擴增的產(chǎn)量和表型，其中，所述CD8+ T應(yīng)答細胞在體外被可逆固定于起可溶性多聚化劑作用的可溶性寡聚Strep-上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激，所述可溶性寡聚Strep-被單一的Fab片段或Fab片段組合(上文已有描述)所功能化。在這些實驗中，CD8+ T應(yīng)答細胞被可溶性多聚化劑(實施例5中的可溶性寡聚Strep-(1mg/ml))刺激，所述可溶性多聚化劑被不同量的αCD3和αCD28 Fab片段(任選地連同上述αCD8 Fab片段)所功能化。術(shù)語“1x”對應(yīng)于被0.5μgαCD3 Fab片段單獨功能化的1.5μg多聚化Streptactin和被0.5μgαCD28 Fab單獨功能化的1.5μg多聚化Streptactin，或負載有0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab的3μl寡聚Streptactin制劑，或負載0.5μg strep標記的αCD3、0.5μg strep標記的αCD8和0.5μg strep標記的αCD28 Fab的4.5μl Streptactin多聚體制劑。相應(yīng)地，術(shù)語“2x”對應(yīng)于被1μgαCD3 Fab片段單獨功能化的3.0μg多聚化Streptactin和被1μgαCD28 Fab單獨功能化的3.0μg多聚化Streptactin，這意味著使用了兩倍于固定化αCD3 Fab片段化的量。未經(jīng)處理的Tresp細胞作為陰性對照，而經(jīng)市售Dynabeads(其上不可逆地固定有αCD3和αCD28單克隆抗體的磁珠)刺激的純化CD8+ T應(yīng)答細胞作為陽性對照。圖21A示出了代表據(jù)第5天收獲的細胞數(shù)所示的增殖程度的柱狀圖，其中所述細胞數(shù)與陰性對照相比較，并以陽性對照進行歸一化。圖21B示出了細胞培養(yǎng)后CD8和CD45RO表面表達水平的FACS分析。

圖22示出了轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat細胞胞內(nèi)信號級聯(lián)的激活，其中所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat細胞被修飾以表達αCD19嵌合抗原受體(CAR)，并被實施例5中用作可溶性多聚化劑的寡聚Strep-刺激。CAR的特異性通常來源于由單克隆抗體(mAb)抗原結(jié)合區(qū)組裝的scFv部位，所述單克隆抗體(mAb)與靶物/腫瘤相關(guān)抗原諸如CD19特異性結(jié)合，并使其與T細胞特異性信號相連(如Hudecek等人,Clin Cancer Res.2013June 15；19(12):3153–3164所述)。在這個實驗中，含有αCD19CAR天然配體的CD19胞外域(extracellular domain,ECD)以及識別αCD19-CAR中IgG4間隔區(qū)的多克隆αIgG F(ab)₂片段(從Jackson Immuno Research商購獲得的驢抗人F(ab)₂)也被用作向Jurkat細胞提供初級激活信號的第一試劑。與可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白的可逆固定由與CD19的ECD的C端融合的鏈霉親和素肽SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:07)提供，或由生物素化的αIgG的(Fab)₂片段提供(由于鏈霉親和素突變蛋白“m2”以降低的親和力與生物素結(jié)合，這種結(jié)合是可逆的并且可例如被加入的過量的游離生物素所置換)。在圖22A的對照實驗中，300.000個CD3+Jurkat應(yīng)答細胞(Jresp)用不同量的、被αCD3 Fab和αCD28 Fab功能化(“x1”對應(yīng)于被0.5μg aCD3-和0.5μg aCD28 Fab功能化的3μg多聚化Streptactin——多克隆Streptamer多聚體)的寡聚Streptactin(1mg/ml)制劑的混合物進行刺激。在圖22B的實驗中，3μl寡聚Streptactin制劑被0.5μg(x1)或1μg(x2)的CD19胞外域(ECD)功能化，或3μl寡聚Streptactin制劑負載有0.5μg(x1)或1μg(x2)識別IgG4間隔區(qū)的αIgG(二者均為CAR特異性多聚體)。經(jīng)Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體的磁珠)或PMA和離子霉素刺激的Jresp作為陽性對照。Jresp細胞被接種在1.5ml Eppendorf管的200μl添加有30U/ml IL-2的細胞培養(yǎng)基中。細胞在37℃下孵育，并在刺激0min至20min后，置于冰上裂解。

圖23示出了在體外被αCD3/αCD28 Fab片段刺激的純化CD3⁺ T應(yīng)答細胞的擴增，所述αCD3/αCD28 Fab片段可逆地固定于實施例5中被用作可溶性多聚化劑的可溶性寡聚Strep-上。在一項實驗中，除αCD3/αCD28 Fab片段以外，從IBA GmbH(Germany)商購獲得的αCD8 Fab片段(目錄編號 6-8000-203)也被固定于鏈霉親和素突變蛋白的可溶性寡聚物，以測試是否可能用其上還可逆固定有αCD8 Fab片段的本發(fā)明多聚化劑在體外優(yōu)先刺激大量CD3⁺培養(yǎng)物中的CD8⁺ T細胞亞群。更詳細地，使用負載有0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab組合的3μl寡聚鏈霉親和素制劑(1mg/ml)對500.000個純化的CD3⁺應(yīng)答T細胞(Tresp)進行刺激。作為一種替代方法，4.5μl Streptactin寡聚物負載有如上所述的0.5μgαCD3、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab。未經(jīng)刺激的Tresp細胞作為陰性對照，經(jīng)Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體的磁珠)刺激的Tresp細胞作為陽性對照。

圖24示出了產(chǎn)生可被用作本發(fā)明的可溶性多聚化劑的寡聚鏈霉親和素突變蛋白的示例性策略。圖24A示出了，在第一步中，使用在野生型鏈霉親和素序列位點第44至47位上包含氨基酸序列l(wèi)le⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:03)的鏈霉親和素突變蛋白“m2”(SAm2)用于產(chǎn)生具有“常規(guī)骨架”的寡聚鏈霉親和素突變蛋白。在第二步中，具有“大骨架”的寡聚可溶性鏈霉親和素突變蛋白可通過鏈霉親和素突變蛋白與生物素化的載體蛋白諸如人血清白蛋白(HSA)的偶聯(lián)或通過鏈霉親和素突變蛋白與合成載體諸如PEG的偶聯(lián)而產(chǎn)生。圖24B：人血清白蛋白(HSA)的生物素化。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了用于擴增細胞群或用于誘導(dǎo)T細胞增殖的方法、試劑盒和裝置。

本文使用的術(shù)語“細胞群”包括所有可通過細胞表面受體與向細胞提供初級激活信號的第一試劑結(jié)合而擴增的細胞。還可能的是，為了擴增細胞群，可能需要第二試劑與第二細胞表面受體(輔助因子)結(jié)合以產(chǎn)生擴增細胞所需的共刺激信號。在一些實施方式中，細胞群可以是淋巴細胞群，包括但不限于B細胞群、T細胞群或天然殺傷細胞群。細胞群的示例性實例是攜帶CD40或CD137的B細胞(這兩種細胞群僅結(jié)合提供激活信號的第一試劑配體就可以進行增殖，例如4-1BB，或者αCD40抗體分子或者αCD137抗體分子(參見例如Zhang等人,2010,J Immunol,184:787-795))?？捎糜贐細胞擴增的試劑(第一或第二試劑)的其他示例性實例是與IgG、CD19、CD28或CD14，例如αCD19、αIgG、αCD28或αCD14抗體分子結(jié)合的試劑。還可設(shè)想，用于B細胞擴增的第一或第二試劑可以包括toll樣受體或白細胞介素諸如IL-21的配體(參見例如Dienz O,等人 2009.J.Exp.Med.206:69)。應(yīng)當注意的是，B細胞的脂多糖依賴性激活也包括在本發(fā)明中，因為脂多糖也可用作第一試劑，并且可用如文本所述的結(jié)合配偶體C1裝配。合適細胞群的其它示例性實例包括T細胞，其通過第一試劑與TCR/CD3的結(jié)合以及第二試劑與T細胞上的輔助分子諸如CD28的結(jié)合而被激活后擴增。在這種情況下，第一試劑刺激T細胞中的TCR/CD3復(fù)合物相關(guān)信號，而第二試劑通過與作為輔助因子的CD28結(jié)合而提供次級刺激?？捎糜赥細胞擴增的試劑可包括白細胞介素，諸如IL-2、IL-7、IL-15或IL-21(參見例如Cornish等人 2006,Blood.108(2):600-8、Bazdar和Sieg,2007,Journal of Virology,2007,81(22):12670-12674、Battalia等人,2013,Immunology,139(1):109-120)?？捎糜赥細胞擴增的試劑的其它示例性實例為與CD8、CD45或CD90，諸如αCD8、αCD45或αCD90抗體結(jié)合的試劑。T細胞群的示例性實例包括抗原特異性T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞(記憶T細胞的一個示例性實例是CD62L⁺CD8⁺特異性中樞記憶T細胞)或調(diào)節(jié)性T細胞(Treg的一個示例性實例是CD4⁺CD25⁺CD45RA+ Treg細胞)。本文使用的術(shù)語“T細胞(群)”也可以包括含有嵌合抗原受體(CAR)的T細胞，嵌合抗原受體(CAR)又稱為人造T細胞受體或嵌合T細胞受體。因此，包含嵌合抗原受體的T細胞群也可以使用本發(fā)明的方法、試劑及設(shè)備進行擴增。這一點也可參見實施例15，其中，表達嵌合CD19特異性抗原受體(CAR)的JurkaT細胞通過使用本發(fā)明的可溶性多聚化劑而被刺激。合適細胞群的另一個示例性實例包括天然殺傷細胞(NK細胞)，其例如可使用與CD16或CD56，諸如αCD16或αCD56抗體相結(jié)合的試劑進行擴增。這種αCD16抗體的示例性實例是具有SEQ ID NO:25中所列的VH序列和SEQ ID NO:26中所列的VL序列的抗體3G8(參見例如Hoshino等人,Blood.1991Dec 15；78(12):3232-40)。用于NK細胞擴增的另一種試劑可以是IL-15(參見例如Vitale等人 2002.The Anatomical Record.266:87-92)。合適細胞群的又一個示例性實例包括單核細胞，其可以例如使用與CD14諸如αCD14抗體分子相結(jié)合的試劑進行擴增。細胞群可以是任意哺乳動物來源，包括但不限于人、兔、豚鼠、松鼠、倉鼠、貓、狗、狐猴、山羊、豬、馬、恒河猴，獼猴或黑猩猩。

因此，根據(jù)上文所述，本發(fā)明涉及在缺乏外源性生長因子諸如淋巴因子和佐細胞的情況下選擇性誘導(dǎo)細胞群諸如B細胞、T細胞或天然殺傷細胞的離體擴增方法。此外，這些細胞諸如B細胞或T細胞的增殖可在不需要抗原的情況下進行誘導(dǎo)，由此提供了具有多克隆反應(yīng)性的擴增細胞群諸如T細胞群。本文公開的方法可以在延長的時間段內(nèi)提供選定T細胞群例如CD4+或CD8+ T細胞的持續(xù)擴增，以產(chǎn)生這些細胞相對于初始T細胞群的數(shù)量的成倍增長。一般而言，在如本文所述的淋巴細胞群的(克隆)擴增的情況下，所有子代可以與被選定擴增的細胞群共享相同的抗原特異性。

同樣，根據(jù)上文所述，本發(fā)明提供了用于抗原特異性T細胞群擴增的方法。為了產(chǎn)生抗原特異性T細胞群，T細胞與適當形式的抗原相接觸以觸發(fā)T細胞中的初級激活信號，即抗原被呈遞到T細胞中以致于信號在T細胞中經(jīng)TCR/CD3復(fù)合物被觸發(fā)。例如，抗原可通過抗原呈遞細胞與MHC分子一起被呈遞到T細胞。抗原呈遞細胞，諸如B細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突細胞、朗格漢斯細胞或其它可以向T細胞呈遞抗原的細胞，可與T細胞在抗原(例如可溶性抗原)存在下進行孵育，抗原這樣抗原呈遞細胞將呈遞至T細胞?？商娲?，表達感興趣抗原的相關(guān)的細胞可與T細胞一起孵育。例如，表達腫瘤相關(guān)抗原的腫瘤細胞可與T細胞一起孵育以誘導(dǎo)腫瘤特異性應(yīng)答。類似地，被病原體例如病毒感染的、呈遞病原體抗原的細胞可與T細胞一起孵育。在T細胞群的抗原特異性激活之后，可依照本發(fā)明的方法擴增細胞。例如，在抗原特異性建立以后，T細胞可根據(jù)本文所述的方法通過與抗CD3抗體(用作第一試劑)和抗CD28抗體(用作第二試劑)一起培養(yǎng)而進行擴增。在另一個實施方式中，第一試劑可以是MHC I:肽復(fù)合物，其可與抗原特異性T細胞群結(jié)合。在這樣一個實施方式中，可以使用任何已知的且可與各自MHC I分子復(fù)合的抗原特異性肽。這一點可參見實施例11和12，其中例證了針對四種不同的抗原特異性細胞，從大量CD3+中樞記憶T細胞中選擇性抗原特異性擴增Tcm應(yīng)答細胞?；蛘?，觸發(fā)細胞擴增的受體的天然配體也可以用作第一試劑。這一點可參見實施例15，其中，CD19胞外域?qū)е陆?jīng)改造得以表達嵌合CD19結(jié)合抗原受體(CAR)的轉(zhuǎn)導(dǎo)Jurkat細胞胞內(nèi)信號級聯(lián)激活。

細胞群樣品可以來自任何合適的來源，通常可以是身體組織或者體液諸如血液的全部樣品。在后一種情況中，樣品可以是例如外周血單核細胞(peripheral blood mononucleated cell，PBMC)群，其可通過標準分離方法如血細胞的聚蔗糖梯度獲得。然而，待擴增的細胞群也可以是純化的形式，并且可以使用如美國專利US 7,776,562、US 8,298,782、國際專利申請WO02/054065或國際專利申請WO2013/011011中所述的可逆細胞染色/分離技術(shù)進行分離?；蛘?，細胞群也可以通過細胞分選經(jīng)由負磁性免疫細胞粘連獲得，正如美國專利US 6,352,649 B1或歐洲專利EP 0 700 430 B1中所述的。如果本文所述的分離方法用于基礎(chǔ)研究，那么樣品可以是體外細胞培養(yǎng)實驗的細胞。樣品通常被制備成流體的形式，例如溶液或分散液。

根據(jù)上文所述，在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種擴增細胞群的體外方法，其包括使含有細胞群的樣品與多聚化劑接觸。多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、向細胞提供初級激活信號的第一試劑，其中所述多聚化劑包含至少一個結(jié)合位點Z1用于第一試劑的可逆結(jié)合。第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點Z1可逆結(jié)合，其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合。第一試劑與細胞表面的受體分子結(jié)合，由此向細胞提供初級激活信號從而激活細胞。

在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種方法，其中所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、刺激細胞表面輔助分子的第二試劑。第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的結(jié)合位點Z2可逆結(jié)合，其中所述第二試劑通過結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點Z2之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合。第二試劑與細胞表面輔助分子結(jié)合，由此刺激已激活的細胞。在這個實施方式中，第一試劑可刺激T細胞中的TCR/CD3復(fù)合物相關(guān)信號，并且可以是特異性結(jié)合CD3的結(jié)合劑。在這個實施方式中，T細胞上的輔助分子可以是CD28，而與輔助分子結(jié)合的第二試劑是特異性結(jié)合CD28的結(jié)合劑。在這種情況下，特異性結(jié)合CD3的第一試劑可以選自抗CD3抗體、抗CD3抗體的二價抗體片段、抗CD3抗體的單價抗體片段和具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD3結(jié)合分子。此外，特異性結(jié)合CD28的第二試劑可以選自抗CD28抗體、抗CD28抗體的二價抗體片段、抗CD28抗體的單價抗體片段和具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD28結(jié)合分子。所述二價抗體片段可以是(Fab)₂’片段，或二價單鏈Fv片段，而單價抗體片段可以選自Fab片段、Fv片段和單鏈Fv片段(scFv)。具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD3或CD28結(jié)合分子可以是適體、基于脂質(zhì)運載蛋白(lipocalin)家族多肽的突變蛋白、glubody、基于錨蛋白支架的蛋白、基于晶體支架的蛋白、adnectin和親和多聚體(avimer)。

一般而言，本發(fā)明使用的第一和第二試劑可以是例如抗體、抗體片段和具有抗體樣功能的蛋白質(zhì)結(jié)合分子。(重組)抗體片段的實例是Fab片段、Fv片段、單鏈Fv片段(scFv)、二價抗體片段諸如(Fab)2'片段、雙特異抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)(Iliades,P.,等人,FEBS Lett(1997)409,437-441)、十鏈抗體(decabody)(Stone,E.,等人,Journal of Immunological Methods(2007)318,88-94)以及其它結(jié)構(gòu)域抗體(Holt,L.J.,等人,.Trends Biotechnol.(2003),21,11,484-490)。在一些實施方式中，第一或第二試劑的一個或多個結(jié)合位點可以是二價蛋白質(zhì)人造結(jié)合分子，諸如也稱為“雙運載蛋白(duocalin)”的二聚脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。在一些實施方式中，受體結(jié)合劑可以具有單個第二結(jié)合位點，即它可以是單價的。單價第一或第二試劑的實例包括但不限于單價抗體片段、具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)結(jié)合分子或MHC分子。單價抗體片段的實例包括但不限于Fab片段、Fv和單鏈Fv片段(scFv)片段，包括二價單鏈Fv片段。

如上所述，具有抗體樣功能的蛋白質(zhì)結(jié)合分子的實例是基于脂質(zhì)運載蛋白家族多肽的突變蛋白(參見例如，WO 03/029462、Beste等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)96,1898-1903)。脂質(zhì)運載蛋白，諸如膽汁三烯結(jié)合蛋白、人中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白、人載脂蛋白D或人淚液脂質(zhì)運載蛋白具有的天然配體結(jié)合位點，其可被修飾以使它們與給定靶物結(jié)合?？捎米魈禺愋越Y(jié)合受體分子的受體結(jié)合劑的、具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)結(jié)合分子的其他實例是包括但不限于所謂的glubody(參見例如，國際專利申請WO 96/23879)、基于錨蛋白支架的蛋白(Mosavi,L.K.,等人,Protein Science(2004)13,6,1435-1448)或基于晶體支架的蛋白(例如，國際專利申請WO 01/04144)、如Skerra,J.Mol.Recognit.(2000)13,167-187中所述的蛋白、AdNectin、tetranectin和親和多聚體(avimer)。親和多聚體，包括由人類受體結(jié)構(gòu)域家族經(jīng)外顯子改組進化而來的多價親和多聚體蛋白，包含作為若干細胞表面受體多域串出現(xiàn)的所謂A結(jié)構(gòu)域(Silverman,J.,等人,Nature Biotechnology(2005)23,1556-1561)。Adnectin，衍生自人纖連蛋白結(jié)構(gòu)域，包含三個可被工程化成用于免疫球蛋白樣結(jié)合至靶物的三個環(huán)狀結(jié)構(gòu)(loop)(Gill,D.S.&Damle,N.K.,Current Opinion in Biotechnology(2006)17,653-658)。Tetranectin，衍生自相應(yīng)的人同源三聚體蛋白，同樣在C型凝集素結(jié)構(gòu)域中包含可被工程化成用于所需結(jié)合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)域(出處同上)。可作為蛋白質(zhì)配體的類肽，是不同于多肽的寡聚(N-烷基)甘氨酸，其側(cè)鏈與酰胺氮連接而不是α碳原子。類肽通常對蛋白酶及其它修飾酶耐受，并且比多肽具有高得多的細胞滲透性(參見例如，Kwon,Y.-U.和Kodadek,T.,J.Am.Chem.Soc.(2007)129,1508-1509)。合適的蛋白質(zhì)結(jié)合分子的另外一些實例是EGF樣結(jié)構(gòu)域、三環(huán)結(jié)構(gòu)域(Kringle-domain)、I型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、II型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、PAN結(jié)構(gòu)域、G1a結(jié)構(gòu)域、SRCR結(jié)構(gòu)域、Kunitz/牛胰胰蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域、淀粉酶抑肽(tendamistat)、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域、三葉型(P型)結(jié)構(gòu)域、C型血管假性血友病因子(von Willebrand factor)結(jié)構(gòu)域、過敏毒素樣結(jié)構(gòu)域、CUB結(jié)構(gòu)域、I型甲狀腺球蛋白重復(fù)、A型LDL受體結(jié)構(gòu)域、Sushi結(jié)構(gòu)域、Link結(jié)構(gòu)域、I型血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(例如，結(jié)構(gòu)域抗體或駱駝重鏈抗體)、C型凝集素結(jié)構(gòu)域、MAM結(jié)構(gòu)域、A型血管假性血友病因子結(jié)構(gòu)域、生長調(diào)節(jié)素B結(jié)構(gòu)域、WAP型四二硫核心結(jié)構(gòu)域、C型F5/8結(jié)構(gòu)域、血液結(jié)合素結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、層粘連蛋白型EGF樣結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、“κ抗體(Kappabody)”(參見Ill.等人,Protein Eng(1997)10,949-57)、所謂的“微抗體(minibody)”(Martin等人,EMBO J(1994)13,5303-5309)、雙特異抗體(參見Holliger等人,PNAS USA(1993)90,6444-6448)、所謂的“Janusis”(參見Traunecker等人,EMBO J(1991)10,3655-3659,或者Traunecker等人,Int J Cancer(1992)Suppl 7,51-52)、納米抗體(nanobody)、微體(microbody)、affilin、親和體(affibody)、打結(jié)素(knottin)、泛素、鋅指蛋白、自體熒光蛋白或富亮氨酸重復(fù)蛋白。具有抗體樣功能的核酸分子的實例是適體。適體折疊成確定的三維基序，并顯示出對給定靶結(jié)構(gòu)的高親和性。

現(xiàn)在轉(zhuǎn)向多聚化劑，多聚化劑的結(jié)合位點Z1和Z2可以是相同的(也可參見圖3的實施例3)。在這種情況下，可以使用單一的多聚化劑。

在使用可逆結(jié)合的第一試劑和任選第二試劑的實施方式中，多聚化劑可以固定在固體表面上。任何固體表面(載體)可用于固定多聚化劑?？晒潭ǘ嗑刍瘎┑墓腆w表面的示例性實例包括磁珠、聚合珠、細胞培養(yǎng)板、微量滴定板、膜或中空纖維。中空纖維例如用作購自TerumoBCT Inc.(Lakewood,CO,USA)的細胞擴增系統(tǒng)中的生物反應(yīng)器。多聚化劑通常與固體載體共價連接，但是如果需要，非共價相互作用也可用于固定化，例如固定于塑料基質(zhì)上。如下文更詳細的說明，多聚化劑可以是例如與鏈霉親和素結(jié)合肽可逆結(jié)合的鏈霉親和素或親和素突變蛋白。這種鏈霉親和素突變蛋白可與任何表面共價連接，例如用于層析純化樹脂(珠)，并且可以從IBA GmbH,商業(yè)購得這種形式，例如，Strep-瓊脂糖凝膠、Strep-大容量Strep-或Strep-易商業(yè)購得的多聚化劑的其它示例性實例是固定化金屬離子親和層析(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)樹脂，諸如樹脂(Westburg,Leusden,The Netherlands)，其一般可用于可逆固定寡聚組氨酸標記的(his標記的)蛋白，在這里意指，用于攜帶第一結(jié)合配偶體C1或第二結(jié)合配偶體C2的第一或第二試劑與低聚組氨酸標記物諸如五組氨酸或六組氨酸標記物的可逆結(jié)合。多聚化劑的其它實例是可購于GE Life Sciences鈣調(diào)蛋白瓊脂糖凝膠，其可與含有鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽作為結(jié)合配偶體C1或C2或瓊脂糖凝膠的第一或第二試劑一起使用，并與谷胱甘肽偶聯(lián)。在這種情況下，結(jié)合配偶體C1或C2是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶。

在本發(fā)明方法的其它實施方式中，多聚化劑可以是可溶形式。原則上，可以使用與固定于固體載體上的多聚化劑相同的多聚化劑?？扇苄问降亩嗑刍瘎┛梢岳缡擎溍褂H和素突變蛋白寡聚物、鈣調(diào)蛋白寡聚物、提供至少兩個螯合基團K的化合物(寡聚物)，其中所述至少兩個螯合基團能夠與過渡金屬離子結(jié)合，由此使A部分能夠與寡聚組氨酸親和標記物、多聚谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶或生物素化的載體蛋白結(jié)合。

如上所述，所述第一和第二試劑除具有能夠與各自細胞表面受體分子結(jié)合的結(jié)合位點以外，還具有結(jié)合配偶體C1或C2(為便于參考，以下將其稱為“結(jié)合配偶體C”)。此結(jié)合配偶體C能夠與多聚化劑的結(jié)合位點Z結(jié)合(Z表示多聚化劑的結(jié)合位點Z1或結(jié)合位點Z2)。包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體C和多聚化劑的結(jié)合位點Z之間形成的非共價鍵可以具有任何期望的強度和親和力，只要其在進行本發(fā)明方法的條件下是可被破壞的或可逆的。包括在受體結(jié)合劑中的結(jié)合配偶體C和多聚化劑的結(jié)合位點Z之間的結(jié)合力的解離常數(shù)(K_D)可以是在約10^-2M至約10^-13M的范圍內(nèi)的值。因此，這種可逆鍵K_D值可以例如為約10^-2M至約10^-13M、或約10^-3M至約10^-12M、或約10^-4M至約10^-11M、或約10^-5M至約10^-10M。這種鍵的K_D值以及受體結(jié)合劑的結(jié)合位點B和受體分子之間形成的鍵的K_D、k_off和k_on率可通過任何合適的手段確定，例如，通過熒光滴定、平衡透析或表面等離子體共振。所述受體分子結(jié)合劑可以包括至少一個，包括兩個、三個或更多個第二結(jié)合配偶體C，所述親和試劑可以包括至少兩個，諸如三個、四個、五個、六個、七個、八個或更多個針對受體分子結(jié)合劑中包括的結(jié)合配偶體的結(jié)合位點。如美國專利US 7,776,562、US 8,298,782或國際專利申請WO 2002/054065中所述，可以選擇結(jié)合配偶體C和具有一個或更多相應(yīng)結(jié)合位點Z的親和試劑的任意組合，只要結(jié)合配偶體C和親和試劑的結(jié)合位點Z能夠可逆地結(jié)合或多聚化成(多價)復(fù)合物，這通常伴隨著親和力效應(yīng)。

包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體可以是寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖、寡糖或多糖。這樣的結(jié)合配偶體對多聚化劑結(jié)合位點的親和力比其它物質(zhì)高。各自結(jié)合配偶體的實例包括但不限于免疫球蛋白分子及其片段和具有抗體樣功能的蛋白質(zhì)結(jié)合分子。

在一些實施方式中，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體C包括生物素，而親和試劑包括與生物素可逆結(jié)合的鏈霉親和素類似物或親和素類似物。

在一些實施方式中，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體C包括與鏈霉親和素或親和素可逆結(jié)合的生物素類似物，而親和試劑包括包括與各自生物素類似物可逆結(jié)合的鏈霉親和素、親和素、鏈霉親和素類似物或親和素類似物。

在一些進一步的實施方式中，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體C包括鏈霉親和素或親和素結(jié)合肽，而親和試劑包括包括與各自鏈霉親和素或親和素結(jié)合肽可逆結(jié)合的鏈霉親和素、親和素、鏈霉親和素類似物或親和素類似物。

在一些實施方式中，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體可以包括鏈霉親和素結(jié)合肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:01)，而親和試劑可以包括在野生型鏈霉親和素序列位點第44至47位上含有氨基酸序列Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:02)的鏈霉親和素突變蛋白(類似物)，或者在野生型鏈霉親和素序列位點第44至47位上含有氨基酸序列l(wèi)le⁴⁴-Gly45-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:03)的鏈霉親和素突變蛋白(類似物)，兩者均如例如美國專利US 6,103,493中所述，并且以商標名Strep-可商業(yè)購得。鏈霉親和素結(jié)合肽可以例如是單一的肽，諸如如美國專利US 5,506,121中所述的“Strep標記(Strep-)”，或者是具有兩個或多個獨立結(jié)合分子連續(xù)排布的鏈霉親和素結(jié)合肽，正如國際專利申請WO 02/077018或美國專利US 7,981,632中所述的。

在一些實施方式中，第一或第二試劑的結(jié)合配偶體C包括技術(shù)人員已知為親和標記物的部分。在這樣的實施方式中，親和試劑包括已知能與親和標記物結(jié)合的相應(yīng)結(jié)合配偶體，例如，抗體或抗體片段。作為已知親和標記物的一些示例性實例，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體可以包括寡聚組氨酸、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、甲殼質(zhì)結(jié)合蛋白(chitin binding protein,CBP)或硫氧還蛋白、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(CBP)、FLAG’肽、HA標記物(序列：Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala,(SEQ ID NO:11))、VSV-G標記物(序列：Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys,(SEQ ID NO:12))、HSV標記物(序列：Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp,(SEQ ID NO:13))、T7抗原表位(Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly,(SEQ ID NO:14))、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、序列為Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp(SEQ ID NO:13)的單純皰疹病毒糖蛋白D的HSV抗原表位、序列為Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu(SEQ ID NO:15)的轉(zhuǎn)錄因子c-myc的“myc”抗原表位、V5標記物(序列：Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr,SEQ ID NO:16)，或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。在這樣的實施方式中，多聚化劑的一個或多個結(jié)合位點(在這種情況下，是抗體或抗體片段)與抗原形成的復(fù)合物可通過添加游離的抗原即游離肽(抗原表位標記物)或游離的蛋白質(zhì)(諸如MBP或CBP)而被競爭性破壞。親和標記物也可以是寡核苷酸標記物。這種寡核苷酸標記物可例如用于與連接至或包括在親和試劑中的、具有互補序列的寡核苷酸雜交。

在一些實施方式中，包括在第一或第二試劑的結(jié)合配偶體C和多聚化劑的一個或多個結(jié)合位點之間的結(jié)合在二價、三價或四價陽離子存在時發(fā)生。在這一點上，在一些實施方式中，多聚化劑包含通常借助于合適的螯合劑容納(例如，與之復(fù)合)的二價、三價或四價陽離子。在這樣的實施方式中，包括在受體結(jié)合劑中的結(jié)合配偶體可以包括含有(例如，復(fù)合有)二價、三價或四價陽離子。各自金屬螯合劑的實例包括但不限于乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、N,N-雙(羧甲基)甘氨酸(也稱為次氮基三乙酸，NTA)、或1,2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)。作為一個實例，EDTA與大多數(shù)一價、二價、三價和四價的金屬離子形成復(fù)合物，諸如，鈣(Ca²⁺)、錳(Mn²⁺)、銅(Cu²⁺)、鐵(Fe²⁺)、鈷(Co³⁺)和鋯(Zr⁴⁺)，而BAPTA對Ca²⁺有特異性。作為一個示例性實例，本領(lǐng)域使用的標準方法是使寡聚組氨酸標記物與銅(Cu²⁺)、鎳(Ni²⁺)、鈷(Co²⁺)或鋅(Zn²⁺)之間形成復(fù)合物，這通過螯合劑次氮基三乙酸(NTA)實現(xiàn)。

在一些實施方式中，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體C包括鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽，而親和試劑包括如美國專利US 5,985,658或者如本文參照例如圖2所述的多聚鈣調(diào)蛋白。在一些實施方式中，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體C包括FLAG肽，而親和試劑包括與FLAG肽結(jié)合的抗體，例如，與如美國專利US 4,851,341中所述的單克隆抗體4E11結(jié)合的FLAG肽。在一個實施方式中，包括在第一或第二試劑中結(jié)合配偶體C包括寡聚組氨酸標記物，而親和試劑包括與寡聚組氨酸標記物結(jié)合的抗體或過渡金屬離子。所有這些結(jié)合復(fù)合物的破壞可以通過金屬離子螯合作用完成，例如鈣螯合，例如通過添加EDTA或EGTA(同上所述)完成。鈣調(diào)蛋白、抗體諸如4E11或螯合金屬離子或游離螯合劑可通過常規(guī)方法進行多聚化，例如，第一步，通過與鏈霉親和素或親和素或其聚合物的生物素化和絡(luò)合作用或者通過將羧基殘基引入多糖例如葡聚糖，基本上如Noguchi,A,等人Bioconjugate Chemistry(1992)3,132-137中所述；第二步，使用常規(guī)碳二亞胺化學(xué)法，將鈣調(diào)蛋白或抗體或螯合金屬離子或游離螯合劑經(jīng)由伯氨基連接到多糖例如葡聚糖主鏈的羧基上。在這樣的實施方式中，包括在第一或第二試劑中的結(jié)合配偶體C與多聚化劑的一個或多個結(jié)合位點Z之間的結(jié)合可通過金屬離子螯合作用而破壞。金屬螯合作用可例如通過添加EGTA或EDTA而完成。

在一些實施方式中，尤其是，如果多聚化劑是可溶形式的并且是基于鏈霉親和素或親和素的，那么它可以是鏈霉親和素或親和素的寡聚物或聚合物或者鏈霉親和素或親和素的任意突變蛋白(類似物)的寡聚物或聚合物。結(jié)合位點Z是親和素或鏈霉親和素的天然生物素結(jié)合。各自的寡聚物或聚合物可以通過多糖交聯(lián)。在一個實施方式中，在第一步中，通過將羧基殘基引入多糖例如葡聚糖中制備鏈霉親和素的寡聚物或聚合物、或親和素的寡聚物或聚合物、或鏈霉親和素類似物的寡聚物或聚合物、或親和素類似物的寡聚物或聚合物，基本上如Noguchi,A,等人,Bioconjugate Chemistry(1992)3,132-137中所述。然后在第二步中，使用常規(guī)碳二亞胺化學(xué)法，可將鏈霉親和素或親和素或其類似物可以經(jīng)由其內(nèi)部的賴氨酸殘基和/或游離N端的伯氨基連接到葡聚糖主鏈的羧基上。此外，鏈霉親和素或親和素的交聯(lián)寡聚物或聚合物、或者鏈霉親和素或親和素的任意突變蛋白(類似物)的交聯(lián)寡聚物或聚合物也可以經(jīng)由諸如戊二醛的雙官能分子作為接頭，通過交聯(lián)單獨的鏈霉親和素或親和素分子(本文中鏈霉親和素或親和素的四聚同源二聚物被稱為“單獨分子”或各自寡聚物或聚合物的最小結(jié)構(gòu)單元)，或者通過本領(lǐng)域的其它方法獲得。例如，通過第一步將硫醇基引入鏈霉親和素突變蛋白(這可例如通過鏈霉親和素突變蛋白和2-亞氨基噻吩(iminothiolane)(Trauts試劑)發(fā)生反應(yīng)而實現(xiàn))，并且在單獨的反應(yīng)中激活鏈霉親和素突變蛋白中可獲得的氨基，可以產(chǎn)生鏈霉親和素突變蛋白的寡聚物。氨基的激活可通過鏈霉親和素突變蛋白與市售異源雙功能交聯(lián)劑諸如磺基琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(磺基SMCC)或琥珀酰亞胺基-6-[(β-馬來酰亞胺丙酰氨基)己酸酯(SMPH)發(fā)生反應(yīng)而實現(xiàn)。在第二步中，將如此獲得兩個反應(yīng)產(chǎn)物混合在一起，導(dǎo)致包含在一批經(jīng)修飾的鏈霉親和素突變蛋白中的硫醇基與另一批經(jīng)修飾的鏈霉親和素突變蛋白中已激活的(通過馬來酰亞胺的功能)氨基發(fā)生反應(yīng)。通過這個反應(yīng)，鏈霉親和素突變蛋白的多聚物/寡聚物形成。這些寡聚物可以具有大于3的任何合適數(shù)目的“單獨分子”或“鏈霉親和素結(jié)構(gòu)單元”，并且寡聚反應(yīng)程度可根據(jù)反應(yīng)條件變化(參見圖24)。這兩批經(jīng)修飾的鏈霉親和素突變蛋白發(fā)生反應(yīng)后，寡聚可溶性多聚化劑通常通過體積排阻色譜法進行分離，并且任何所期望的部分都可用作多聚化劑。通常，寡聚物不具有(且無需具有)單一的分子量，但它們通常遵循統(tǒng)計重量分布諸如高斯分布。任何具有多于三個鏈霉親和素同源四聚體(結(jié)構(gòu)單元；(n≥3))的寡聚物可用作可溶性多聚化劑。寡聚物可以具有例如3至25個鏈霉親和素突變蛋白同源四聚體。具有分子量為約50kDa的鏈霉親和素突變蛋白，諸如下文更詳細描述的突變蛋白“m1”或“m2”，這些可溶性寡聚物的分子量為約150kDa至約1250kDa。由于每個鏈霉親和素分子/突變蛋白具有四個生物素結(jié)合位點，因此這樣的多聚化劑提供12至100個如本文所述的結(jié)合位點Z1(和Z2)。

根據(jù)以上公開內(nèi)容，除了這種只包含交聯(lián)的鏈霉親和素同源四聚體的寡聚多聚化劑以外，可以使四聚鏈霉親和素突變蛋白與載體發(fā)生反應(yīng)而獲得本發(fā)明所用的多聚化劑。除了上述與多糖的反應(yīng)以外，也可以使用生理學(xué)上或藥學(xué)上可接受的蛋白質(zhì)諸如血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA))作為載體蛋白。在這種情況下，鏈霉親和素突變蛋白(無論是單個同源四聚體，還是n≥3的寡聚物形式)可與載體蛋白經(jīng)由非共價相互作用偶聯(lián)。為了這個目的，生物素化的BSA(其可購自多個供應(yīng)商例如ThermoFisher Scientific、Sigma Aldrich或Vectorlabs，這里僅舉幾個例子)可與鏈霉親和素突變蛋白發(fā)生反應(yīng)。當這樣做時，一些鏈霉親和素寡聚物將會經(jīng)由幾個或多個生物素結(jié)合位點(Z1、Z2)與生物素化的載體蛋白非共價結(jié)合，留下大部分寡聚物結(jié)合位點(Z1、Z2)可用于結(jié)合諸如第一試劑和任選第二試劑以及任何如本文所述的另外的試劑。因此，通過這種方法，可方便地制備具有多個結(jié)合位點Z1的可溶性多聚化劑(參見圖24)。或者，鏈霉親和素突變蛋白(無論是單個同源四聚體，還是n≥3的寡聚物形式)可與合成載體諸如聚乙二醇(PEG)分子共價偶聯(lián)。任何適合的PEG分子均可用于此目的，只要這些PEG分子和各自的多聚化劑是可溶的。通常，分子量高達1000Da的PEG分子均可溶于水或本發(fā)明可用的培養(yǎng)基。這種基于PEG的多聚化劑通過使用市售已激活的PEG分子(例如，可購自NOF North America Corporation,Irvine,California,USA的PEG-NHS衍生物，或可購自Creative PEGWorks,Chapel Hills,North Carolina,USA的已激活的PEG衍生物)與鏈霉親和素突變蛋白中的氨基可以很容易制備。

在鏈霉親和素或野生型鏈霉親和素(wt-鏈霉親和素)中，Argarana等人,Nucleic Acids Res.14(1986)1871-1882中所公開的氨基酸序列被提及。鏈霉親和素突變蛋白是通過一個或多個氨基酸的替換、缺失或添加而有別于野生型鏈霉親和素序列的多肽，但其保留了野生型鏈霉親和素的結(jié)合特性。鏈霉親和素樣多肽和鏈霉親和素突變蛋白是與野生型鏈霉親和素基本上免疫學(xué)等同的多肽，并且特別能夠以與野生型鏈霉親和素相同或不同的親和力結(jié)合生物素、生物素衍生物或生物素類似物。鏈霉親和素樣多肽或鏈霉親和素突變蛋白可以含有不是野生型鏈霉親和素一部分的氨基酸，或者其可僅包括野生型鏈霉親和素的一部分。鏈霉親和素樣多肽也可以是與野生型鏈霉親和素的多肽不完全相同的多肽，因為宿主不具有將宿主產(chǎn)生的多肽轉(zhuǎn)化成野生型鏈霉親和素的結(jié)構(gòu)所需的酶。術(shù)語“鏈霉親和素”也包括鏈霉親和素四聚體和鏈霉親和素二聚體，特別是鏈霉親和素同源四聚體、鏈霉親和素同源二聚體、鏈霉親和素異源四聚體和鏈霉親和素異源二聚體。每個亞基通常具有生物素或生物素類似物的結(jié)合位點，或者鏈霉親和素結(jié)合肽的結(jié)合位點。鏈霉親和素或鏈霉親和素突變蛋白的實例在例如WO 86/02077、DE 19641876Al、US 6,022,951、WO 98/40396或WO 96/24606中有所提及。

在一個優(yōu)選的實施方式中，用作多聚化劑的鏈霉親和素突變蛋白是那些如美國專利US 6,103,493和德國專利DE 196 41 876.3中所述的鏈霉親和素突變蛋白。基于野生型鏈霉親和素的氨基酸序列，這些鏈霉親和素突變蛋白在氨基酸位點第44至53位的區(qū)域內(nèi)具有至少一個突變。最小鏈霉親和素的突變蛋白是優(yōu)選的，其N端起始于野生型鏈霉親和素第10至16位氨基酸區(qū)域，C端終止于野生型鏈霉親和素第133至142位氨基酸區(qū)域。這樣的優(yōu)選鏈霉親和素突變蛋白的實例具有第44位的疏水性脂肪族氨基酸而非Glu、第45位的任意氨基酸、第46位的疏水性脂肪族氨基酸或/和第47位的堿性氨基酸而非Val。鏈霉親和素突變蛋白可以是在野生型鏈霉親和素序列位點第44至47位上包含氨基酸序列Va1⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:02)的突變蛋白，或者是在野生型鏈霉親和素序列位點第44至47位上包含氨基酸序列l(wèi)le⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷(SEQ ID NO:03)的鏈霉親和素突變蛋白(類似物)。這種突變蛋白在例如美國專利US 6,103,493中有所描述，并且可以從IBA GmbH以突變蛋白“m1”和突變蛋白“m2”的形式商業(yè)購得，其商標為Strep-

在一些實施例中，可以使用根據(jù)本發(fā)明的方法來排除先前用于細胞擴增的試劑樣品。第一或第二試劑以及各自的游離配偶體(競爭試劑)可以例如存在于上述擴增方法的洗脫液中。使用本發(fā)明的方法，這樣的試劑可被至少基本上(包括完全地)從樣品(例如從細胞群)中去除。作為一個示例性實例，如上所定義的第一或第二試劑可從樣品中排除至低于例如FACS或Western Blot印跡法檢出限的水平。競爭試劑(游離的第一或第二結(jié)合配偶體或其類似物)可用于終止并控制擴增，將細胞群從多聚化劑中釋放出來。這種競爭試劑可以具有能夠在WO 2013/124474中所述的“去除筒”中與親和試劑的結(jié)合位點Z特異性結(jié)合的結(jié)合位點。在這個實施方式中，本發(fā)明的各方法也可用于排除第一和第二試劑以及競爭試劑，包括去除它們。

根據(jù)本發(fā)明所述的方法可在細胞群生存力至少基本不受影響的任何溫度下進行。當在本文中提及至少基本上無害或無毒或至少基本上不影響生存力的條件時，是指這樣的條件，即在其中進行擴增的、具有完全生存力的細胞群百分比不低于至少70％，包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法在約20℃或更高的溫度下進行。根據(jù)待擴增的細胞群，合適的溫度范圍可以例如是從約20℃至約45℃，包括從約25℃至約40℃，或從約32℃至37℃。在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法在恒定的溫度下進行，或在選定的溫度值上±約5℃、±約4℃、±約3℃、±約2℃、±約1℃或±約0.5℃。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠根據(jù)經(jīng)驗并考慮細胞特性和擴增條件來確定合適的溫度。通常人類細胞是在例如37℃溫度下進行擴增。

在進一步的實施方式中，本發(fā)明提供了一種擴增細胞群的體外方法，其包括使含有細胞群的樣品與多聚化劑接觸，其中所述多聚化劑是可溶形式的，并且具有固定(結(jié)合)于其上的、向細胞提供初級激活信號的第一試劑。多聚化劑包含至少一個結(jié)合位點Z1用于結(jié)合第一試劑，其中所述第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點Z1結(jié)合。第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合，并且第一試劑與細胞表面受體分子結(jié)合，由此向細胞提供初級激活信號從而激活細胞。這里應(yīng)明確指出的是，當使用可溶性多聚化劑時，結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間的鍵無需是可逆的。

在第二種方法的一個實施方式中，多聚化劑具有固定(結(jié)合)于其上的、刺激細胞表面輔助分子的第二試劑，其中所述第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的結(jié)合位點Z2結(jié)合。第二試劑通過結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點Z2之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合，其中所述第二試劑與細胞表面輔助分子結(jié)合，由此刺激已激活的細胞。

在第二種方法的一個實施方式中，結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的鍵可以是不可逆的和/或結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點Z2之間形成的鍵也可以是不可逆的。

在第二種方法的一個不同的實施方式中，結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的鍵可以是可逆的。結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點Z2之間形成的鍵也可以是可逆的。在這種情況下，所述結(jié)合位點Z1和所述結(jié)合配偶體C1之間的可逆結(jié)合和/或所述結(jié)合位點Z2和所述結(jié)合配偶體C2之間的可逆結(jié)合的解離常數(shù)(K_d)在10^-2M至10^-13M的范圍內(nèi)。

在基于可溶性多聚化劑的第二種方法中，第一和第二試劑、多聚化劑和所有其它試劑以及細胞群也可以以與上述利用第一或第二試劑和多聚化劑間可逆結(jié)合的方法相同的方式使用。

本發(fā)明進一步提供了用于擴增細胞群的試劑盒，所述試劑盒包括：

(i)多聚化劑，其中所述多聚化劑包含至少一個結(jié)合位點Z用于第一試劑的可逆結(jié)合，

(ii)第一試劑，其與細胞表面受體分子結(jié)合，由此向細胞提供初級激活信號從而激活細胞，其中所述第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點Z1可逆結(jié)合，其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，和

(iii)第二試劑，其刺激細胞表面輔助分子，其中所述第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的結(jié)合位點Z2可逆結(jié)合，其中所述第二試劑通過結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點Z2之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合，其中所述第二試劑與細胞表面輔助分子結(jié)合從而刺激已激活的細胞。

本發(fā)明還提供了用于擴增細胞群的試劑盒，所述試劑盒包括：

(i)多聚化劑，其中所述多聚化劑是可溶形式的并且包含至少一個結(jié)合位點Z用于第一試劑的可逆結(jié)合，

(ii)第一試劑，其與細胞表面受體分子結(jié)合，由此向細胞提供初級激活信號從而激活細胞，其中所述第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點Z1結(jié)合，其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合。

這第二種試劑盒可以進一步包括：(iii)第二試劑，其刺激細胞表面輔助分子，其中所述第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的結(jié)合位點Z2結(jié)合，其中所述第二試劑通過結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點Z2之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合。

本文所公開的試劑盒特別地用于當細胞群是淋巴細胞群時。

根據(jù)上文公開的內(nèi)容，本發(fā)明還提供了新型多聚化劑和包含能夠擴增細胞群的多聚化劑的新型組合物。這種能夠擴增細胞群的多聚化劑是可溶形式的，并且包含至少一個結(jié)合位點Z1用于可逆結(jié)合向細胞提供初級激活信號的第一試劑，其中所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的所述向細胞提供初級激活信號的第一試劑；其中所述第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的至少一個結(jié)合位點Z1可逆結(jié)合，其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合。這里應(yīng)當注意的是，這種多聚化劑可以具有固定于其上的本文所述的任何第一試劑。

本發(fā)明的多聚化劑可以進一步包含至少一個結(jié)合位點Z2用于可逆結(jié)合刺激細胞表面輔助分子的第二試劑，其中，所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的、刺激細胞表面輔助分子的第二試劑，其中所述第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的至少一個結(jié)合位點Z2結(jié)合。在這個實施方式中，第二試劑通過結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點Z2之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合。

同樣根據(jù)上方公開的內(nèi)容，這種多聚化劑能夠擴增淋巴細胞群或包含在淋巴細胞群中的亞群。待擴增的淋巴細胞群可以是任何合適的細胞群，例如，B細胞群、T細胞群或天然殺傷細胞群。T細胞群可以是抗原特異性T細胞群、輔助T細胞群、細胞毒性T細胞、記憶T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞群或天然殺傷T細胞群。因此，在這種多聚化劑的實施方式中，第一試劑能夠刺激T細胞中的TCR/CD3復(fù)合物相關(guān)信號。因此，多聚化劑中存在的第一試劑可以是與CD3特異性結(jié)合的結(jié)合劑，而與輔助分子結(jié)合的第二試劑可以是與CD28或CD137特異性結(jié)合的結(jié)合劑。

在多聚化劑的實施方式中，與CD3特異性結(jié)合的第一試劑可以是抗CD3抗體、抗CD3抗體的二價抗體片段、抗CD3抗體的單價抗體片段、和/或具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD3結(jié)合分子。在這些實施方式中，與CD28或CD137特異性結(jié)合的第二試劑可以是抗CD28抗體、抗CD28抗體的二價抗體片段、抗CD28抗體的單價抗體片段、具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD28結(jié)合分子、抗CD137抗體、抗CD137抗體的二價抗體片段、抗CD137抗體的單價抗體片段、具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD137結(jié)合分子、4-1BB配體及其任意混合物。因此，本發(fā)明的多聚化劑一般可具有固定于其上的一種第一試劑和一種第二試劑混合物，例如，抗CD3抗體作為第一試劑，以及例如，抗CD28抗體和4-1BB配體作為(聯(lián)合)第二試劑。

如果多聚化劑被用于擴增B細胞，那么固定在多聚化劑上的第一試劑可以是與CD40或CD137特異性結(jié)合的結(jié)合劑。根據(jù)本文公開的內(nèi)容，在這樣的實施方式中，與CD40或CD137特異性結(jié)合的第一結(jié)合劑可選自抗CD40抗體、抗CD40抗體的二價抗體片段、抗CD40抗體的單價抗體片段和具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD40結(jié)合分子，或者抗CD137抗體、抗CD137抗體二價抗體片段、抗CD137抗體的單價抗體片段、具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)CD137結(jié)合分子和CD40配體(CD154)。

此外，根據(jù)本發(fā)明的大致公開內(nèi)容，在如本文所述的多聚化劑中，多聚化劑的結(jié)合位點Z1和Z2可以是完全相同的。如上所述，這樣的多聚化劑可以包括鏈霉親和素的寡聚物或聚合物、親和素的寡聚物或聚合物、可逆結(jié)合生物素的鏈霉親和素類似物的寡聚物或聚合物、可逆結(jié)合生物素的親和素類似物的寡聚物或聚合物、含有至少兩個螯合基團K的試劑，其中所述至少兩個螯合基團能夠與過渡金屬離子結(jié)合，由此使所述試劑能夠與寡聚組氨酸親和標記物、多聚谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、多聚鈣調(diào)蛋白和生物素化的載體蛋白結(jié)合。

本文提供了一種能夠擴增細胞群的新型組合物，其可包括：

(i)第一多聚化劑，其中所述第一多聚化劑是可溶形式的，并且包含至少一個結(jié)合位點Z1用于向細胞提供初級激活信號的第一試劑的可逆結(jié)合，其中所述第一多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的所述向細胞提供初級激活信號的第一試劑，其中所述第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的至少一個結(jié)合位點Z1可逆結(jié)合，其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，和

(ii)第二多聚化劑，其中所述第二多聚化劑是可溶形式的，并且包含至少一個結(jié)合位點Z2用于對細胞表面輔助分子進行刺激的第二試劑的可逆結(jié)合，其中所述多聚化劑具有可逆固定(結(jié)合)于其上的所述刺激細胞表面輔助分子的第二試劑，其中所述第二試劑包含結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的至少一個結(jié)合位點Z2結(jié)合，其中所述第二試劑通過結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點Z2之間形成的鍵與多聚化劑相結(jié)合。

這樣的新型組合物是例如實施例13中使用的反應(yīng)混合物，其中兩種單獨的多聚化劑單獨用αCD3 Fab片段或單獨用αCD28 Fab片段功能化。關(guān)于這點應(yīng)注意的是，這樣的組合物在實施例13中顯示出具有與其上共同固定有第一試劑和第二試劑兩者的單一多聚化劑相同的擴增效率。因此，聯(lián)合使用兩種或多種僅被一種試劑(例如，一種第一試劑或一種第二試劑)單獨功能化的多聚化劑與使用一種具有固定于其上的第一試劑和第二試劑兩者的聯(lián)合多聚化劑在用于擴增上功能等同。關(guān)于這點，應(yīng)當指出的是，本發(fā)明的多聚化劑可被多種意在用于擴增選定細胞群的試劑(例如，一種、兩種、三種、四種或甚至更多種的試劑)所功能化。第三或第四試劑可以例如提供用于擴增所期望細胞亞群的刺激。關(guān)于這點可參見例如實施例13，其中可溶性多聚化劑被三種試劑可逆地功能化，即αCD3 Fab片段作為第一試劑、αCD28 Fab片段作為第二試劑和αCD8 Fab片段作為第三試劑以富集在CD3+ T細胞群(淋巴細胞)樣品中的CD8+ T細胞亞群。通過使用這種全都可逆固定于同一個多聚化劑上的試劑組合，本發(fā)明允許存在從樣品例如含有多種不同細胞亞群的樣品中優(yōu)選擴增或選擇性富集任何所期望的細胞(亞)群的可能性。然而關(guān)于這點應(yīng)當注意的是，出于此目的也可以使用三種不同的多聚化劑，例如，僅被αCD3 Fab片段功能化的第一多聚化劑、被αCD28 Fab片段功能化的第二多聚化劑和被αCD8 Fab。同樣地，可以僅用兩種不同的多聚化劑，即僅被αCD3 Fab片段多功能化的第一多聚化劑和被αCD28 Fab片段和αCD8 Fab片段兩者功能化的第二多聚化劑。因此，本發(fā)明允許以模塊化的方式設(shè)計任何種類的想要的擴增試劑。

本發(fā)明還提供了一種連續(xù)擴增淋巴細胞群的體外方法，其中所述淋巴細胞群包括T細胞。這種方法包括：

使含有包含T細胞的淋巴細胞群樣品與多聚化劑接觸，

其中，所述多聚化劑是可溶形式的，并且具有可逆固定于其上的(i)向T細胞提供初級激活信號的第一試劑和(ii)刺激T細胞表面輔助分子的第二試劑，

其中，所述多聚化劑包含至少一個結(jié)合位點Z1用于第一試劑的可逆結(jié)合，

其中，所述第一試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C1，其中所述結(jié)合配偶體C1能夠與多聚化劑的結(jié)合位點Z1可逆結(jié)合，其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，

其中，所述多聚化劑包括至少一個結(jié)合位點Z2用于第二試劑的可逆結(jié)合，

其中，所述第二試劑包含至少一個結(jié)合配偶體C2，其中所述結(jié)合配偶體C2能夠與多聚化劑的結(jié)合位點Z2可逆結(jié)合，其中所述第一試劑通過結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點Z2之間形成的可逆鍵與多聚化劑相結(jié)合，

其中，所述第一試劑與T細胞表面的受體分子結(jié)合，由此向細胞提供初級激活信號從而激活細胞T細胞，

其中，所述第二試劑與T細胞表面的輔助分子結(jié)合，從而刺激已激活的細胞，由此所述第一試劑和所述第二試劑一同誘導(dǎo)T細胞擴增。

在這個方法中，使含有淋巴細胞群進而包含T細胞的樣品與具有固定于其上的第一和第二試劑的可溶性多聚化劑接觸，導(dǎo)致T細胞與多聚化劑特異性結(jié)合。

含有包含T細胞的淋巴細胞群樣品與多聚化劑的接觸可在生物反應(yīng)器中進行，諸如中空纖維生物反應(yīng)器(例如，細胞擴增系統(tǒng)的中空纖維生物反應(yīng)器)或塑料袋生物反應(yīng)器(例如，來自GE Healthcare的Xuri細胞擴增系統(tǒng)W25中使用的)。

這個方法進一步包括使淋巴細胞群(含有經(jīng)由第一試劑和第二試劑與多聚化劑結(jié)合的T細胞的反應(yīng)混合物)與以下項接觸：(i)能夠破壞第一結(jié)合配偶體C1和結(jié)合位點Z1間鍵的游離第一結(jié)合配偶體C1或其類似物和(ii)能夠破壞第二結(jié)合配偶體C2和結(jié)合位點Z2間鍵的游離第二結(jié)合配偶體C2或其類似物。通過這樣做，所述第一試劑結(jié)合配偶體C1和所述結(jié)合位點Z1之間的可逆鍵以及所述第二試劑結(jié)合配偶體C2和所述多聚化劑結(jié)合位點Z2之間的可逆鍵被破壞，從而在洗脫液中釋放經(jīng)由第一試劑和第二試劑與多聚化劑結(jié)合的T細胞并停止T細胞的擴增。

在這個方法中，含有擴增T細胞群的洗脫液(反應(yīng)混合物，其中擴增反應(yīng)已通過加入游離第一配偶體或其類似物被終止)可在合適的(第一)固定相上進行層析。所述(第一)固定相可以是如國際專利申請WO 2013/124474中所述的凝膠過濾基質(zhì)和/或親和層析基質(zhì)。這種凝膠過濾和/或親和層析基質(zhì)包含親和試劑，其中所述親和試劑包含與第一試劑或第二試劑中所包含的結(jié)合配偶體C1和/或C2特異性結(jié)合的結(jié)合位點Z1和/或Z2。通過這樣做，第一試劑、第二試劑、第一結(jié)合配偶體C1和/或游離第二結(jié)合配偶體C2被固定在固定相上。在這種方法中，所述第一固定相與生物反應(yīng)器流體式連接。

在這種連續(xù)擴增的一個實施方式中，多聚化劑的結(jié)合位點Z1和Z2是相同的。此外，可以使用單一的多聚化劑。當使用可溶性多聚化劑時，T細胞群(或一般的擴增T細胞群)從可溶性多聚化劑中分離。分離/除去可以利用第二固定相進行。為此，在施加到上述第一固定相之前或之后，含有T細胞和可溶性多聚化劑的混合物在合適的固定相上進行層析。這種第二固定相可以是凝膠過濾基質(zhì)和/或親和層析基質(zhì)，其中所述凝膠過濾和/或親和層析基質(zhì)包含親和試劑。包含在層析樹脂上的親和試劑包括與多聚化劑的結(jié)合位點Z1和/或結(jié)合位點Z2(如果存在的話)(特異性地)結(jié)合的結(jié)合配偶體D，從而將多聚化劑固定在固定相上。如果使用基于鏈霉親和素的多聚化劑并且第一和第二試劑兩者都具有鏈霉親和素結(jié)合肽作為結(jié)合配偶體C1或C2，那么這種第二固定相上的親和試劑中所包含的結(jié)合配偶體D可以是生物素。用作多聚化劑的鏈霉親和素的可溶性寡聚物或鏈霉親和素突變蛋白的可溶性寡聚物然后和通常與層析基質(zhì)共價偶聯(lián)的生物素結(jié)合，諸如市售的生物素瓊脂糖凝膠(biotin-sepharose^TM)。

在這種連續(xù)擴增的方法中，第一試劑可以刺激T細胞中的TCR/CD3復(fù)合物相關(guān)信號，并且第一試劑可以因此是與CD3特異性結(jié)合的結(jié)合劑。此外，T細胞上的輔助分子可以是CD28。在這種情況下，與輔助分子結(jié)合的第二試劑是與CD28特異性結(jié)合的結(jié)合劑。

在這種連續(xù)擴增的方法中，T細胞可以在擴增期間或者之后用例如T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR，也稱為人造T細胞受體)進行轉(zhuǎn)染。這種用于引入所需受體基因的轉(zhuǎn)染可以用例如任何合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進行。經(jīng)遺傳修飾的細胞群然后從初始刺激物(例如，CD3/CD28刺激物)中釋放出來，隨后被第二類的刺激物刺激，例如通過重新引入的受體。這種第二類刺激物可以包括肽/MHC分子形式的抗原刺激物、經(jīng)遺傳引入的受體的同源(交聯(lián))配體(例如，CAR的天然配體)、或在新受體的框架內(nèi)直接結(jié)合(例如，通過識別受體內(nèi)的恒定區(qū))的任意配體(諸如抗體)。這方面參閱Cheadle等人的“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或者Barrett等人的Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol.65:333-347(2014).

在這種方法中，包含T細胞的淋巴細胞群可以是外周血單核細胞(PBMC)群或經(jīng)富集或經(jīng)純化的T細胞群。淋巴細胞群可以例如源自全血、或源自非流動的血液分離產(chǎn)品或冷凍組織制品。

在這種基于可溶性多聚化劑的連續(xù)擴增方法中，第一和第二試劑、多聚化劑以及所有其它試劑和細胞群也可以以與上述利用第一或第二試劑和多聚化劑間可逆結(jié)合的方法相同的方式使用。

本發(fā)明進一步指向一種包含生物反應(yīng)器和用于層析的第一固定相的排布。生物反應(yīng)器適用于細胞擴增，所述固定相適用于細胞分離和去除試劑。第一固定相是凝膠過濾基質(zhì)和/或親和層析基質(zhì)，其中所述凝膠過濾和/或親和層析基質(zhì)包含親和試劑，其中所述親和試劑包含與第一試劑中所含的結(jié)合配偶體C1特異性結(jié)合的結(jié)合位點Z1，和/或所述親和試劑包含與第二試劑中所含的結(jié)合配偶體C2特異性結(jié)合的結(jié)合位點Z2。所述第一固定相由此適合于將第一試劑和/或第二試劑、第一結(jié)合配偶體C1和/或游離第二結(jié)合配偶體C2固定于其上。此外，生物反應(yīng)器和固定相是流體式連接的。這種排布可用于上述連續(xù)擴增，并且可以整合到已知細胞擴增系統(tǒng)中，諸如細胞擴增系統(tǒng)或Xuri細胞擴增系統(tǒng)W25。

在這種排布中，第一固定相被包括在層析柱中或是平面固定相。這種排布可以進一步包括與第一固定相流體式連接的第二固定相。第二固定相可以是凝膠過濾基質(zhì)和/或親和層析基質(zhì)，其中所述凝膠過濾和/或親和層析基質(zhì)包含親和試劑。這種親和試劑可以包含與多聚化劑的結(jié)合位點Z1(特異性地)結(jié)合的結(jié)合配偶體D，由此適于將多聚化劑固定在固定相上。

本發(fā)明進一步指向一種用于純化和擴增細胞群的裝置，所述裝置包括至少一個如上所定義的包含生物反應(yīng)器和用于層析的第一固定相或第二固定相的排布。

所述裝置還可以進一步包括流體式連續(xù)連接的多個包含生物反應(yīng)器的裝置和固定相的排布。

所述裝置可以包括樣品入口，其與包含生物反應(yīng)器和層析固定相的排布中的生物反應(yīng)器流體式連接。所述裝置還可以包括已純化擴增的靶細胞的樣品出口，所述樣品出口與至少一個包含生物反應(yīng)器和層析固定相的排布中最后一個排布的固定相流體式連接。

最后，所述裝置可被設(shè)計成功能性封閉的系統(tǒng)。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員從本發(fā)明公開的內(nèi)容將容易理解，同樣可能根據(jù)本發(fā)明利用目前存在或之后開發(fā)的、與本文所述的相應(yīng)的示例性實施方式發(fā)揮基本相同功能或取得基本相同結(jié)果的物質(zhì)、手段、用途、方法或步驟的其他組合。

實驗實施例

實施例1：用可逆固定于涂覆有鏈霉親和素突變蛋白Strep-磁珠上的αCD3/αCD28 Fab片段進行的CD3+ T應(yīng)答細胞的刺激/擴增。

用3μM CFSE對300.000個CD3+CD62L應(yīng)答T細胞(Tresp，通過連續(xù)磁富集從非流動供體血液分離產(chǎn)品中分離得到)進行標記，并用 15μl磁珠制劑(10mg磁性微粒/ml，負載有35μg磁珠)中的5μl對細胞進行刺激，其中所述磁珠制劑負載有單獨的0.5μgαCD3 Fab片段、單獨的0.5μgαCD28 Fab片段、或0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab的混合物。

所用的αCD3 Fab片段來源于由雜交瘤細胞系OKT3產(chǎn)生的CD3結(jié)合單克隆抗體。雜交瘤細胞系OKT3和OKT3抗體在美國專利US 4,361,549中有所描述，細胞系以登錄號CRL-8001^TM保藏。所用的CD28 Fab來源于單克隆抗人CD28抗體CD28.3(Vanhove等人,BLOOD,15July 2003,Vol,102,No.2,pages 564-570)。這種抗體CD28.3可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列以合成單鏈Fv構(gòu)建抗人CD28抗體scFv28.3的形式保藏于基因庫中，登錄號AF451974.1。

如國際專利申請WO2013/011011和WO 2013/124474中所述，兩種Fab片段在E.coli中重組生產(chǎn)，其攜帶IgG1保守序列作為恒定結(jié)構(gòu)域(CH1和Cκ)。兩種Fab片段的重鏈在羧基端與兩個鏈霉親和素結(jié)合模塊(SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:07)，可以“雙Strep標記(Twin-Strep-)”購于IBA GmbH,Germany)的順序排列相融合。所述αCD3 Fab片段用作第一試劑，其具有用作結(jié)合配偶體C1的鏈霉親和素結(jié)合肽，而所述αCD28 Fab片段用作第二試劑，其具有用作結(jié)合配偶體C2的鏈霉親和素結(jié)合肽。所述(四聚)鏈霉親和素突變蛋白“Strep-”作為其上可逆固定有兩種Fab片段多聚化劑。

在擴增實驗中，以用空白磁珠(無Fab)刺激的Tresp細胞作為陰性對照。將Tresp細胞連同300.000個CD3自飼養(yǎng)細胞(經(jīng)30Gy輻照)一起一式三份接種到48孔板上3ml添加有10U/ml白細胞介素2(IL-2)的完全細胞培養(yǎng)基(RPMI(Gibco)，添加有10％(v/v)胎牛血清、L-谷氨酰胺、b-巰基乙醇、HEPES、青霉素、鏈霉素和慶大霉素)中。細胞在37°下孵育，不更換培養(yǎng)基，并在4天后通過FACS分析法進行分析。用100μM D-生物素孵育10分鐘后進行FACS染色和分析。每種情況的代表曲線在圖4中示出。曲線示出了活的CD3+細胞，其中CD3+細胞用碘化丙啶(PI)染色以區(qū)分活/死。圖4A是示出了被刺激細胞大小分布(前向散射)的直方圖。圖4A示出了，當在其上固定有0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab混合物的磁珠存在下進行孵育，并在體外被可逆固定于涂覆有鏈霉親和素突變蛋白Strep-的磁珠上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激后，Tresp細胞的特定細胞群被刺激和擴增(與未經(jīng)刺激的“僅磁珠”對照相比較，其大小/數(shù)量增加)。圖4B示出了代表據(jù)每次細胞分裂的細胞數(shù)(如于圖4B頂部所標識，0代表未分裂的細胞；5代表經(jīng)歷了至少5次分裂的細胞)所示增殖程度的增殖染料CFSE稀釋度直方圖。從圖4B可以看出，被其上固定有0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab混合物的磁珠所刺激的T細胞群大多經(jīng)歷了三次細胞分裂，并表現(xiàn)出比單獨的單一刺激更為均勻的增殖模式(未分裂的峰“0”內(nèi)細胞數(shù)較少)。增加的增殖絕對數(shù)(更多的細胞在用αCD3和αCD28功能化的磁珠刺激4天均勻增殖)也可以通過更多的培養(yǎng)基消耗示出，如圖4C所示，指示劑顏色變?yōu)辄S色。

實施例2：對Jurkat細胞中不同的細胞內(nèi)鈣動員的分析

在此檢測了用αCD3抗體克隆OKT3或與Strep-多聚化的OKT3的Fab片段標記的Jurkat細胞內(nèi)誘發(fā)的不同的細胞內(nèi)鈣動員的實時流式細胞分析(low-cytometric analysis)。

為此，Jurkat細胞負載有鈣敏染料Indo-1-AM，通過注射αCD3單克隆抗體OKT3(由雜交瘤細胞系OKT3產(chǎn)生，見上文，黑色正方形)或αCD3Fab片段(源自親本細胞系OKT3)觸發(fā)鈣釋放，其中，αCD3 Fab片段通過其鏈霉親和素結(jié)合肽與熒光綴合有藻紅蛋白的可溶性Strep-Tactin的可逆結(jié)合而多聚化。在完整的多聚OKT3 Fab-Strep-Tactin復(fù)合物的情況下，鈣釋放觸發(fā)持續(xù)一段與親本抗體克隆(深灰色三角形)相同的時間。細胞的激活可以通過注射經(jīng)的D-生物素處理的、預(yù)解離的Fab-Strep-Tactin復(fù)合物(淺灰色圓形)而完全避免，等同于注射PBS陰性對照(白色倒三角形)。應(yīng)用離子霉素作為鈣內(nèi)流的陽性對照。基于FL6/FL7比率的變化，通過流式細胞術(shù)來對細胞內(nèi)Ca²⁺濃度的時間解析的變化進行監(jiān)控。從圖5A中可以看出，親本抗體OKT3以及OKT3的多聚單價Fab片段兩者均影響鈣釋放，這意味著OKT3的多聚單價Fab片段基本上具有與親本抗體相同的功能。值得注意的是，如果在加入Streptactin-OKT3 Fab片段之前，將生物素添加到固定有OKT3 Fab片段的Strep-tactin中，那么多聚OKT3 Fab片段無法觸發(fā)鈣釋放。在這種情況下，生物素破壞了作為多聚化劑的Strep-tactin和OKT3 Fab片段之間形成的可逆鍵。因此單價Fab片段從多聚化劑上被置換出來，并且解離后其不能再通過與Jurkat細胞的CD3結(jié)合而觸發(fā)鈣釋放。

在圖5B所示的實驗中，indo-1-AM標記的Jurkat細胞被源自O(shè)KT3的αCD3 Fab-Strep-Tactin復(fù)合物所激活，如圖5A中所示。注射完整的(上圖)或預(yù)解離的復(fù)合物(下圖)分別作為陽性或陰性對照。此外，用完整的Fab-Strep-Tactin復(fù)合物刺激細胞后接著注射D-生物素(在t＝140s近激活峰處)，導(dǎo)致αCD3 Fab多聚體信號傳導(dǎo)的突然中斷(中圖)。將離子霉素注射入預(yù)解離的Fab復(fù)合物群作為陽性對照。數(shù)據(jù)代表三不同的實驗。重要的是，圖5B示出了加入樣品中的D-生物素迅速將Fab片段從Strep-tactin多聚化劑中置換出來，從而有效地終止鈣釋放，即便是在正在進行的鈣刺激下，并且證明了解離的OKT3 Fab片段不再具有生物學(xué)活性。同樣地，在將Streptactin-OKT3 Fab樣品加入Jurkat細胞之前，將生物素添加到Strep-tactin-OKT3 Fab片段多聚體中，多聚OKT3 Fab片段也無法觸發(fā)鈣釋放。

實施例3：經(jīng)CD3 Fab多聚體進行的細胞可逆染色

本實施例檢測了經(jīng)CD3 Fab多聚體對細胞進行的可逆染色。新鮮分離的PBMC用αCD3單克隆抗體克隆OKT3(左側(cè)散點圖，F(xiàn)ab多聚體的親本克隆)或同源藻紅蛋白(PE)標記的OKT3 Fab多聚體進行染色，并在D-生物素處理之前(左二列)或之后(中間列)進行分析。在后續(xù)的清洗步驟后，使用新鮮PE標記的Strep-(右二列)檢測剩余的Fab單體。對經(jīng)可逆染色的細胞進行二次Fab多聚體染色作為對照(右列)。只有在用于區(qū)分活/死的碘化丙啶(propidium iodide PI)染色中為陰性的活CD3細胞在圖6中示出。散點圖中的數(shù)字表示柵極內(nèi)的細胞百分比。這個實驗表明，用與多聚化劑Streptactin多聚化的抗CD3 Fab片段對CD3+ PBMC進行的染色通過加入D-生物素完全可逆，并且單獨的單價Fab片段無法與存在于PBMC上的CD3分子結(jié)合。

實施例4：通過CD28 Fab多聚體進行的細胞可逆分離

本實施例示出了通過與Strep-磁性顆粒(磁性微粒購自IBA GmbHGermany)多聚化的抗CD28 Fab片段的可逆結(jié)合進行細胞分離。為此目的，使用了來源于上文實施例1所述的抗體CD28.3的Fab片段。通過Fab多聚體磁性細胞選擇法將CD28+細胞從新鮮分離的PMBC中選擇/分離出來，基本上正如國際專利申請WO2013/011011中所述。在選擇之前，用同源熒光αCD28多聚體(左側(cè)散點圖)或用直接抗免疫球蛋白κ輕鏈的抗體(左二散點圖，α-IgκmAb)對細胞進行對照染色作為染色對照。在選擇之后，細胞用D-生物素處理，隨后清洗去除磁珠和Fab單體。被釋放CD28+細胞隨后用CD28 Fab多聚體(右二散點圖)或用α-IgκmAb(右側(cè)散點圖)(重新)進行染色，以檢測可能殘余的Fab單體。只有活的(PI^陰性)CD3+細胞被顯示出來。散點圖中的數(shù)字表示柵極內(nèi)的細胞百分比。圖7表明使用這種多聚抗CD28 Fab片段可以將CD28+細胞能夠從PMBC中分離出來，并且所有分離試劑包括抗CD28 Fab單體可以在選擇后被去除。

實施例5：用可逆固定于可溶性Strep-tactin上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激/擴增CD3+ T應(yīng)答細胞

在本實施例中，CD3+ T應(yīng)答細胞(通過磁性選擇法從由聚蔗糖梯度得到的新鮮PBMC樣品中分離的)在體外被可逆固定于充當可溶性多聚化劑的可溶性寡聚Strep-上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激后擴增。寡聚Strep-是根據(jù)制造商(Thermo Scientific)的方法流程，通過使Strep-與磺基SMCC(磺基琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，產(chǎn)品#22122，Thermo Scientific)與亞氨基噻吩(iminothiolane)(產(chǎn)品#26101，Thermo Scientific)聚合而獲得的。寡聚鏈霉親和素可通過體積排阻色譜法與單體(未反應(yīng)的)和二聚鏈霉親和素突變蛋白分離，并將如此得到的寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)部分用作可溶性多聚化劑。

為了體外擴增，300.000個CD3+應(yīng)答T細胞(Tresp)用2μM羥基熒光素琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)標記，并用不同量的可溶性Strep-寡聚物制劑進行刺激，所述可溶性Strep-寡聚物制劑上固定有上述αCD3OKT3 Fab片段和抗體28.3的αCD28 Fab片段(兩者在重鏈上都攜帶上述作為鏈霉親和素結(jié)合肽的雙Strep標記(Twin-Strep-))的組合(“1x”對應(yīng)于被0.5μgαCD3-和0.5μgαCD28單體Fab片段功能化的3μg多聚化Streptactin，數(shù)字“0.5x”、“2x”和“5x”表示分別為“1x”的n倍量)。剩余的未被刺激的Tresp細胞或用空白Strep-tactin多聚體(無Fab)刺激的Tresp細胞作為陰性對照。將Tresp細胞連同300.000個CD3陰性自飼養(yǎng)細胞(經(jīng)30Gy輻照)一式兩份接種到48孔板上1ml添加有20U/ml IL-2的細胞培養(yǎng)基中。細胞在37℃下孵育，不更換培養(yǎng)基，并在5天后通過FACS分析法按照CFSE稀釋度來對增殖情況進行分析。圖8A示出了在5天后與陰性對照相比培養(yǎng)物中增殖細胞的大小分布增加。圖8B示出了當與其上固定有αCD3 Fab和αCD28 Fab片段混合物的可溶性寡聚Strep-(與圖4中的固體Streptactin磁性顆粒相比)一起孵育時，CD3+Tresp細胞被適當?shù)卮碳げ≡鲋?。圖8A和圖8B的結(jié)果表明，在這些體外條件下，大多數(shù)CD3+ T應(yīng)答細胞在表面CD28和TCR/CD3復(fù)合物與可逆固定于可溶性Strep-寡聚物上的αCD3和αCD28 Fab片段結(jié)合之后進行分裂(2至5次細胞分裂)。在體外擴增后，可溶性Fab-Strep-Tactin刺激試劑在D-生物素處理后被解離并去除。通過用藻紅蛋白標記的Strep-(ST-PE)對細胞重新染色而對單體Fab片段的解離和去除進行流式細胞分析。與適當?shù)膬H用ST-PE標記的陰性對照(淺灰色直方圖)相比，代表性的直方圖(深灰色直方圖)被示出。從圖8C中可以看出，兩種Fab片段都已經(jīng)完全地解離并已從擴增的細胞中完全去除。圖8D示出了5天后活(臺盼藍陰性)細胞的絕對數(shù)。該絕對數(shù)通過使用Neubauer計數(shù)室計數(shù)得到，并按各自的刺激條件繪圖。中位細胞數(shù)在圖8D中示出；誤差線表示標準偏差(SD)。圖8D表明，所有固定于可溶性Strep-tactin多聚化劑上的αCD3 Fab片段和αCD28 Fab片段的混合物在擴增CD3+細胞上同樣有效，并導(dǎo)致絕對細胞數(shù)的約4倍增長。

實施例6：在體外被可逆的aCD3/aCD28 Fab-Streptamer多聚體刺激的純化CD4+和CD8+ T應(yīng)答細胞增殖(不更換培養(yǎng)基)的動力學(xué)

本實施例中檢測了在體外被可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激的純化CD4+和CD8+ T應(yīng)答細胞(Tresp)增殖的擴增動力學(xué)。為此，兩種不同大小的可溶性寡聚Strep-突變蛋白被用作可溶性多聚化劑。第一種寡聚Strep-是在實施例5中獲得的寡聚鏈霉親和素突變蛋白的一部分(n≥3)(也被稱為“常規(guī)骨架”，如圖13中尖端朝下的三角形符號所示)。用作可溶性多聚化劑第二種寡聚鏈霉親和素突變蛋白是與生物素化的人血清白蛋白反應(yīng)的寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)(也被稱為“大骨架”)。

在本實施例中，分別用如上所述的這兩種不同的Streptamer多聚體，即實施例5所述的Streptactin骨架(使用濃度為1mg寡聚鏈霉親和素突變蛋白/ml的溶液)或大Streptactin骨架(0.1mg/ml)刺激500.000個純化的CD4+或CD8+應(yīng)答T細胞(Tresp)。3μl兩種不同的骨架都負載有前述實施例中使用的0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab的組合，其在Fab片段重鏈的C端攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:07)。此外，4.5μl常規(guī)Streptactin骨架負載有0.5μgαCD3 Fab片段、0.5μgαCD8 Fab片段(IBA GmbH在其Fab片段的C端也攜帶有鏈霉親和素結(jié)合肽SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:07))和0.5μgαCD28 Fab片段。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細胞作為陰性對照，經(jīng)市售Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體的磁珠)刺激的Tresp細胞作為陽性對照。將Tresp細胞一式兩份接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細胞培養(yǎng)基(RPMI 1640(Gibco)，添加有10％(v/v)胎牛血清、0.025％(w/v)L-谷氨酰胺、0.025％(w/v)L-精氨酸、0.1％(w/v)HEPES、0.001％(w/v)慶大霉素、0.002％(w/v)鏈霉素、0.002％(w/v)青霉素)中。細胞在37℃下孵育，不更換培養(yǎng)基，并在1、3和6天后進行細胞計數(shù)分析。在圖13的實驗中，擴增在不更換培養(yǎng)基的情況下進行。CD4+ T應(yīng)答細胞的結(jié)果在圖13A中示出，CD8+ T應(yīng)答細胞的結(jié)果在圖13B中示出，其中曲線圖代表據(jù)每個時間點收集的CD4+ Tresp(圖13A)和CD8+ Tresp(圖13B)的細胞數(shù)所示的增殖程度。

從圖13A中可以看出，所述其上可逆固定有αCD3和αCD28 Fab片段的“較小”可溶性多聚化劑提供了與Dynabeads(其是目前為止用于擴增T細胞的標準試劑)相同量的CD4+ T細胞的擴增，而所述“較大”寡聚可溶性Streptactin提供了與Dynabeads相比甚至更好的擴增。這種改善可能是由以下導(dǎo)致的：可溶性“較大寡聚多聚化劑”能夠同時結(jié)合比“較小”可溶性寡聚物更多的T細胞，由此能夠比“較小”寡聚物刺激更多的CD4+ T細胞。

從圖13B中可以明顯看出，使用本發(fā)明的可溶性多聚化劑，CD8+ T細胞可以在最初的3天內(nèi)至少與Dynabeads一樣有效地擴增。值得注意的是，在這個時間段中，使用了除αCD3和αCD28 Fab片段(作為第一和第二試劑)以外還攜帶可逆固定于其上的αCD8 Fab片段的可溶性多聚化劑的擴增實驗在這些培養(yǎng)條件下顯示出了最佳的擴增程度。這表明有可能通過使用對特定亞細胞群具有特異性的刺激物(這里是αCD8 Fab片段)來提高或調(diào)整擴增的選擇性，從而能獲得大量所需的(亞)細胞群。

因此，綜上所述，實施例6表明本發(fā)明所用的可溶性多聚化劑的功能就觸發(fā)T細胞擴增而言，與用于此目的的、使用Dynabeads的現(xiàn)有標準方法相當。然而，由于可通過加入競爭劑控制(并且終止，如果需要)刺激，諸如在第一和第二試劑與多聚化劑之間基于鏈霉親和素的可逆相互作用的情況下加入生物素，因此本發(fā)明提供了顯著優(yōu)于Dynabeads技術(shù)的優(yōu)勢，因為擴增條件可進行優(yōu)化(例如可以在3天后停止圖13B實驗中的刺激)。此外，由于可溶性多聚化劑可以很容易地從反應(yīng)中去除(例如，在擴增反應(yīng)后，通過將試劑固定在生物素化的柱子上)，本發(fā)明的擴增方法可在封閉系統(tǒng)中實施并自動化，而不必處理磁珠諸如Dynabeads的去除問題，該封閉系統(tǒng)例如是用于治療目的的細胞的GMP生產(chǎn)所需的。

實施例7：在體外被可逆的aCD3/aCD28 Fab-Streptamer多聚體刺激的純化CD4+和CD8+ T應(yīng)答細胞增殖(更換培養(yǎng)基)的動力學(xué)

本實施例中也檢測了在體外被可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激的純化CD4+和CD8+ T應(yīng)答細胞(Tresp)增殖的擴增動力學(xué)。為此，兩種不同大小的可溶性寡聚Strep-突變蛋白被用作可溶性多聚化劑。第一種寡聚Strep-是在實施例5中獲得的寡聚鏈霉親和素突變蛋白的一部分(n≥3)(也被稱為“常規(guī)骨架”，如圖13中以尖端朝下的三角形符號所示)。被用作可溶性多聚化劑的第二種寡聚鏈霉親和素突變蛋白通過使實施例5中獲得的寡聚Strep-tactin(n≥3)與生物素化的人血清白蛋白發(fā)生反應(yīng)而獲得。這種可溶性寡聚多聚化劑也被稱為“大骨架”。

在本實施例中，分別用如上所述的這兩種不同的Streptamer多聚體，即用實施例5所述的Streptactin骨架(1.0mg/ml)或用大Streptactin骨架(0.1mg/ml)刺激400.000個純化的CD4+或CD8+應(yīng)答T細胞(Tresp)。3μl兩種不同的骨架都負載有如上所述的0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab片段的組合。此外，4.5μl實施例5所述的Streptactin骨架負載有0.5μgαCD3 Fab片段、0.5μgαCD8 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab片段，如上文所述。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細胞作為陰性對照，用Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體)刺激的Tresp細胞作為陽性對照。將Tresp細胞一式兩份接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細胞培養(yǎng)基中。細胞在37℃下孵育，在第3天更換培養(yǎng)基，并在1、3和6天后進行細胞計數(shù)分析。CD4+ T應(yīng)答細胞的結(jié)果在圖14A中示出，CD8+ T應(yīng)答細胞的結(jié)果在圖14B中示出，其中曲線圖代表了據(jù)每個時間點收集的CD4+ Tresp(圖14A)和CD8+ Tresp(圖14B)的細胞數(shù)所示的增殖程度。

從圖14A中可以看出，本發(fā)明的其上可逆固定有αCD3和αCD28 Fab片段的可溶性多聚化劑提供了比Dynabeads更好的CD4+ T細胞的擴增。

從圖14B中可以明顯看出，使用本發(fā)明的可溶性多聚化劑，CD8+ T細胞可以在最初6天內(nèi)至少與Dynabeads一樣有效地擴增。值得注意的是，在這個時間段中，使用攜帶有αCD3和αCD28 Fab片段(作為第一和第二試劑)的較大可溶性多聚化劑的擴增實驗在這些培養(yǎng)條件下顯現(xiàn)出了最佳的擴增程度。這可能也是由以下導(dǎo)致的：可溶性“較大寡聚多聚化劑”能夠同時結(jié)合比“較小”可溶性寡聚物更多的T細胞，由此能夠比“較小”寡聚物刺激更多的CD4+ T細胞。

實施例8：更換或不更換培養(yǎng)基情況下純化CD4+和CD8+ T細胞培養(yǎng)物的擴增動力學(xué)

在本實施例中，將實施例6和實施例7中關(guān)于“較小”可溶性多聚化劑以及陽性和陰性對照的的綜合數(shù)據(jù)用輸入的細胞數(shù)歸一化。并未獲取關(guān)于“較大”多聚化劑的歸一化數(shù)據(jù)。如實施例6和實施例7中所釋，400.000至500.000個CD4+或CD8+應(yīng)答T細胞(Tresp)被3μl的Streptactin多聚體制劑(1mg/ml；其上固定有0.5μgαCD3 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab片段)刺激。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細胞作為陰性對照，經(jīng)Dynabeads刺激的Tresp細胞作為陽性對照。將Tresp細胞一式兩份接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細胞培養(yǎng)基中。Tresp細胞被一式兩份接種在48孔板中1ml補充以30U/ml IL-2的細胞培養(yǎng)基上。細胞在37℃下孵育，在第3天更換培養(yǎng)基(圖15中的直線)或不更換培養(yǎng)基(圖15中的虛線)，并在1、3和6天后進行細胞計數(shù)分析。從圖15A的歸一化數(shù)據(jù)可以看出，可逆固定有αCD3和αCD28 Fab片段的“較小”可溶性多聚化劑產(chǎn)生了約2.5倍的CD4+T細胞擴增，而使用Dynabeads的擴增產(chǎn)生了約1.8倍的擴增率。因此，使用本發(fā)明的可溶性多聚化劑甚至還提供了在CD4+ T細胞擴增方面超過Dynabeads的改善。類似地，圖15B確認了通過使用本發(fā)明的可溶性多聚化劑，CD8+ T細胞可以在最初3天內(nèi)至少與使用Dynabeads一樣有效地擴增。

實施例9：在體外被可逆的aCD3/aCD28 Fab Streptamer多聚體刺激的純化CD4+和CD8+ T應(yīng)答細胞激活后的早期群簇形成

在本實施例中，用3μl負載有0.5μgαCD3-和0.5μgαCD28 Fab組合的寡聚Streptactin多聚化劑制劑(1mg/ml)刺激400.000個CD4+或CD8+應(yīng)答T細胞(Tresp)。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細胞作為陰性對照，經(jīng)Dynabeads刺激的Tresp細胞作為陽性對照。將Tresp細胞一式兩份接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細胞培養(yǎng)基中。細胞在37℃下孵育并在1天和2天后通過顯微鏡進行分析。CD4+ Tresp(圖16A)和CD8+ Tresp(圖16B)針對Dynabeads(中間一行)和Streptamer多聚體(下邊一行)的刺激被分別示出。照片表示群簇形成的程度：為了更好的可視性，在圖16A和圖16B中用圓圈標出了經(jīng)可溶性鏈霉親和素突變蛋白寡聚物刺激的示例性群簇。Dynabeads刺激中的群簇經(jīng)深色刺激顆粒的積聚變得明顯易見。顯然，對于CD4+和CD8+ T細胞兩者而言，當使用本發(fā)明的采用可溶性寡聚多聚化劑的擴增方法時，早期群簇形成。

實施例10：多克隆刺激/擴增的大量CD3+中樞記憶T細胞(Tcm)的擴增動力學(xué)和表型

在本實施例中，用3μl負載有0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab組合的如實施例5所述的可溶性寡聚Streptactin的制劑(1mg/ml)刺激500.000個CD3+CD62L+CD45RA應(yīng)答Tcm細胞(Tresp)。此外，使用4.5μl負載有0.5μgαCD3、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的Streptactin多聚體制劑作為額外的刺激條件。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細胞作為陰性對照，經(jīng)Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體)刺激的Tresp細胞作為陽性對照。將Tresp細胞一式兩份接種到48孔板上1ml僅添加有30U/ml IL-2或添加有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的細胞培養(yǎng)基上。細胞在37℃下孵育，每3天更換一次培養(yǎng)基，并在7天和14天后進行細胞計數(shù)分析。曲線圖代表了據(jù)每個時間點收獲的細胞數(shù)所示的擴增程度，圖17A中為僅添加有IL-2的培養(yǎng)基，圖17B中為添加有IL-2和IL-15的培養(yǎng)基。在圖17A和圖17B兩圖中可以看出，具有可逆結(jié)合于其上的CD3 Fab片段和αCD28 Fab片段的可溶性多聚化劑產(chǎn)生了比Dynabeads更好的細胞擴增。如圖17C中對在可變細胞因子環(huán)境中培養(yǎng)14天后的CD62L和CD127表面表達水平進行的流式細胞分析進一步所示，使用本發(fā)明的可溶性多聚化劑的實驗方法，在此選擇的兩種條件下，保持著比使用Dynabeads的擴增更高含量的CD127表達型長期存活的記憶T細胞。這闡明了本發(fā)明方法的又一個優(yōu)勢。

實施例11：從大量CD3+中樞記憶T細胞中對Tcm應(yīng)答細胞進行的選擇性抗原特異性擴增(動力學(xué)和表型)

本實施例中檢測了從純化的CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細胞中進行的選擇性抗原特異性(Ag特異性)擴增的動力學(xué)和表型。

更詳細地，在體外用肽:MHC分子復(fù)合物(作為向細胞提供初級激活信號的第一試劑)和αCD28 Fab片段(作為刺激細胞表面輔助分子的第二試劑)兩者刺激CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細胞?？乖禺愋噪呐cMHC分子的復(fù)合物和αCD28 Fab片段兩者均被可逆地固定在實施例5所述的可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白(n≥3)上。用于抗原特異性擴增的肽為肽CRVLCCYVL(SEQ ID NO:06)，即刻早期蛋白1的第309-317位氨基酸(如Ameres等人,PLOS Pathogens,May 2013,vol.9,issue 5,e1003383所述)，其呈現(xiàn)對巨細胞病毒(CMV)具有特異性的HLA-C7/IE-1抗原表位。呈遞所述肽的MHC I分子在α鏈(重鏈)的C端攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽(SAWSHPQFEK(GGGS)₂GGSAWSHPQFEK,(SEQ ID NO:07),可以“雙Strep標記(Twin-Strep-)”購于IBA GmbH,Germany)。

為此，使用3μl被0.5μg配有鏈霉親和素結(jié)合肽的肽:MHC I類復(fù)合物和0.5μg上述αCD28 Fab所功能化的可溶性寡聚Streptactin多聚化劑制劑對500.000個CD3+CD62L+CD45RA應(yīng)答Tcm細胞(Tresp)進行Ag特異性刺激。作為替代，4.5μl Streptactin多聚化劑制劑負載有0.5μg這些肽:MHC I類復(fù)合物、0.5μg CD8αFab和0.5μgαCD28 Fab。為了比較，使用3μl負載有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab組合的Streptactin多聚化劑制劑(1mg/ml)進行多克隆刺激。同樣作為上述刺激條件的替代，使用4.5μl可逆負載有0.5μgαCD3 Fab、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的Streptactin多聚化劑制劑。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細胞作為陰性對照，經(jīng)Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體的磁珠)多克隆刺激的Tresp細胞作為陽性對照。將Tresp細胞接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的細胞培養(yǎng)基中。細胞在37℃下孵育，每3天更換一次培養(yǎng)基，并在7天和14天后進行細胞計數(shù)分析。對經(jīng)可溶性strept-tactin寡聚物刺激/擴增的Ag特異性細胞的一部分進行示例性流式細胞分析(圖18A)，其中所述可溶性strept-tactin寡聚物上固定有含HLA-C7/IE-1抗原表位(針對CMV)的肽:MHC-I復(fù)合物，表明這些抗原特異性T細胞被特異性擴增。圖18B至圖18E的曲線圖(其代表據(jù)每個時間點收獲的肽:MHCI多聚體陽性細胞的細胞數(shù)所示的不同Ag特異性的擴增程度，類似于圖18A中所示的擴增實驗)表明，使用相應(yīng)Ag特異性肽和MHC I分子復(fù)合物的多聚化劑提供了最多數(shù)目的擴增細胞(范圍從對于識別被HLA-A2402限制的CMV的pp65抗原表位(第341-350位氨基酸(QYDPVAALF,(SEQ ID NO:08))的Ag特異性細胞的細胞數(shù)的20倍增長(參見圖18B)到識別CMV的HLA-B7/IE-1_309-317抗原表位(CRVLCCYVL(SEQ ID NO:06))的Ag特異性細胞數(shù)的98倍增長(參見圖18E))，由此表明本發(fā)明的擴增方法完全適用于Ag特異性細胞的擴增。最后，圖18F中示出了HLA-B7/Hexon5抗原表位(針對腺病毒)培養(yǎng)14天后對CD62L和CD127表面表達水平進行的示例性流式細胞分析，其進一步確認了使用本發(fā)明可溶性多聚化劑的實驗方法，在多克隆且Ag特異性刺激的條件下，保持了更高含量的CD127表達型長期存活的記憶T細胞。

實施例12：大量中樞記憶T細胞的選擇性Ag特異性擴增動力學(xué)和表型

本實施例檢測了從使用可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白上的、作為第一和第二試劑的a)抗原特異性肽MHC I復(fù)合物和b)αCD28 Fab片段體外刺激的純化CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細胞中的選擇性Ag抗原特異性擴增的動力學(xué)。

為此，使用3μl被0.5μg配有鏈霉親和素結(jié)合肽(該特異性肽代表被HLA-B07限制的腺病毒Hexon 5蛋白的第 114-124位氨基酸(CPYSGTAYNSL,SEQ ID NO:10))的肽:MHC I類復(fù)合物和0.5μgαCD28 Fab所功能化的Streptactin多聚化劑制劑對500.000個CD3+CD62L+CD45RA應(yīng)答Tcm細胞(Tresp)進行Ag特異性刺激。作為替代，4.5μl Streptactin多聚化劑制劑負載有0.5μg這種肽:MHC I類復(fù)合物、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab。為了比較，使用3μl負載有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab組合的Streptactin多聚化劑制劑(1mg/ml)進行多克隆刺激。同樣作為上述刺激條件的替代，使用4.5μl負載有0.5μgαCD3 Fab、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的Streptactin多聚化劑制劑。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細胞作為陰性對照，經(jīng)Dynabeads多克隆刺激的Tresp細胞作為陽性對照。將Tresp細胞接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的細胞培養(yǎng)基中。細胞在37℃下孵育，每3天更換一次培養(yǎng)基經(jīng)歷，并在7天和14天后進行細胞計數(shù)分析。圖19中示出的照片代表了在第5天時群簇形成的程度，示出了示例性的針對腺病毒的HLA-B7/Hexon 5抗原表位的Ag特異性刺激。從圖19中可以看出，這樣的腺病毒抗原特異性細胞可從最初的CD3+CD62L+CD45RA-Tcm應(yīng)答細胞群中被特異性地擴增出來。

實施例13：擴增的CD8+ T細胞的產(chǎn)量和表型——可溶性多聚化劑的大小變化和用于刺激的αCD8-Fab的加入

本實施例檢測了在體外被可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白上αCD3/αCD28 Fab片段刺激的純化CD8+ T應(yīng)答細胞的擴增。此外，本實施例還檢測了多聚化劑中添加αCD8-Fab對提高CD8+ T細胞擴增特異性的影響。

為此，分別使用兩種不同的基于Streptactin的多聚化劑，即實施例5所述的小寡聚Streptactin多聚化劑(1mg/ml)或上述較大Streptactin寡聚物(0.1mg/ml)刺激300.000個純化的CD8+應(yīng)答T細胞(Tresp)。3μl的兩種不同的多聚化劑(骨架)均負載有上述0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab片段組合。此外，4.5μl較小Streptactin多聚化劑(骨架)負載有上述的0.5μgαCD3、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab片段。此外，使用3μl僅被0.5μgαCD3 Fab片段單獨功能化或0.5μgαCD28 Fab片段單獨功能化的“較小”Streptactin多聚化劑(骨架)。未經(jīng)刺激的Tresp細胞作為陰性對照，經(jīng)Dynabeads刺激的Tresp作為陽性對照。將Tresp細胞一式兩份接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細胞培養(yǎng)基中。細胞在37℃下孵育，每3天更換一次培養(yǎng)基，并在6天后進行分析。圖20A示出了據(jù)第6天收獲的細胞數(shù)所示的增殖程度，其中所述細胞數(shù)與陰性對照相比較，并以陽性對照進行歸一化。圖20A示出了使用本發(fā)明的可溶性多聚化劑的CD8+ T細胞擴增比使用Dynabeads擴增產(chǎn)生了更高產(chǎn)量的CD8+ T細胞。在細胞培養(yǎng)后CD8表面表達水平(圖20B)和CD45RO表面表達水平(圖20C)的FACS分析表明，本發(fā)明的多聚化劑或Dynabeads擴增了相同表型的CD8+T細胞(使用單因素ANOVA分析對不同的刺激條件進行比較，并未檢測到顯著性差異(n.s.))。與使用Dynabeads相比，使用本發(fā)明擴增方法的CD8+細胞產(chǎn)量的提高可能是由于可溶性多聚化劑比固定在Dynabeads上的抗體可以更好地接近其位于細胞表面的靶受體。當從初始樣品中擴增稀少的細胞群時，這種產(chǎn)量提高會變得十分有利。

此外，將使用其上聯(lián)合固定有0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab片段兩者的多聚化劑所獲得的擴增產(chǎn)量(圖20B中的左二列)與使用兩種僅被αCD3 Fab片段單獨功能化或αCD28 Fab片段單獨功能化的多聚化劑所獲得的擴增產(chǎn)量(圖20B中左三列)進行比較，可以看出兩個實驗具有相同的擴增效率。因此，這些實驗表明使用一種其上聯(lián)合固定有第一試劑和第二試劑兩者的多聚化劑在用于擴增的功能上等同于使用兩種分別僅負載有第一試劑或第二試劑的單獨多聚化劑。

實施例14：擴增的CD8+ T細胞的產(chǎn)量和表型——其上固定有不同比例的αCD3-和αCD28 Fab片段的單獨可溶性多聚化劑的滴定

本實施例中檢測了在體外被片段以不同量可逆固定于可溶性寡聚鏈霉親和素突變蛋白上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激的擴增CD8+ T應(yīng)答細胞(Tresp)的產(chǎn)量和表型。

為此，使用不同量的被αCD3 Fab單獨功能化或αCD28 Fab單獨功能化的“小”寡聚Streptactin多聚化劑制劑(1mg/ml)的混合物(“1x”對應(yīng)于被0.5μgαCD3單獨功能化的1.5μg Streptactin多聚化劑和被0.5μgαCD28 Fab片段單獨功能化的1.5μg多聚化Streptactin)、或3μl負載有0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab的Streptactin多聚化劑制劑、或4.5μl負載有0.5μgαCD3、0.5μg strep-標記的αCD8和0.5μgαCD28 Fab的Streptactin多聚化劑制劑對300.000個CD8+應(yīng)答T細胞(Tresp)進行刺激。未經(jīng)處理的Tresp細胞作為陰性對照，經(jīng)Dynabeads刺激的Tresp作為陽性對照。將Tresp細胞接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細胞培養(yǎng)基中。細胞在37℃下孵育，不更換培養(yǎng)基，并在5天后進行分析。圖21A示出了據(jù)第6天收獲的細胞數(shù)所示的增殖程度，其中，所述細胞數(shù)與與陰性對照相比較，并以陽性對照進行歸一化。圖21A表明使用本發(fā)明的不同可溶性多聚化劑的CD8+T細胞擴增比使用Dynabeads的擴增產(chǎn)生了更高產(chǎn)量的CD8+T細胞(特別是5x條件中的累計試劑總量導(dǎo)致細胞的最佳擴增，特別是隨著時間的推移，或者隨著由開始細胞分裂引起的細胞總數(shù)的增加)。在細胞培養(yǎng)后CD8表面表達水平(圖21B)和CD45RO表面表達水平(圖21C)的FACS分析表明，本發(fā)明的不同多聚化劑或市售Dynabeads擴增了相同表型的CD8+ T細胞。

實施例15：Streptamer多聚體刺激aCD19-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat細胞后胞內(nèi)信號級聯(lián)的激活

本實施例檢測了轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat細胞胞內(nèi)信號級聯(lián)的激活，所述Jurkat細胞被修飾以表達腫瘤特異性嵌合抗原受體(CAR)即這里的CD19，并使用作為可溶性多聚化劑的如實施例5所述的寡聚Strep-進行刺激。

為此，用以下試劑對300.000個JurkaT應(yīng)答細胞(Jresp)進行刺激：(A)不同量的被本文所述的αCD3 Fab和αCD28 Fab片段功能化的Streptactin多聚化劑制劑(1mg/ml)的混合物(“x1”對應(yīng)于被0.5μgαCD3-和0.5μgαCD28 Fab功能化的3μg Streptactin多聚化劑——這提供了“基于Streptactin的多克隆多聚化劑”)，或(B)3μl被0.5μg(x1)或1μg(x2)CD19胞外域(ECD)功能化的Streptactin多聚化劑制劑(CD19胞外域是αCD19-CAR的天然配體——這提供了“基于Streptactin的CAR特異性多聚化劑”)，或3μl負載有0.5μg(x1)或1μg(x2)αIgG的Streptactin多聚化劑制劑(αIgG識別αCD19-CAR中的IgG4間隔區(qū)——這也提供了“基于鏈霉親和素突變蛋白的CAR特異性多聚化劑)。裝配有六組氨酸標記物的CD19的ECD從Sino Biological/Life technologies(SEQ ID NO:27)獲得，并通過將CD19的ECD與銜接分子His-STREPPER(IBA GmbH,Germany,訂單編號2-0920-005)按分子比率1:1混合并于室溫下孵育15分鐘而被功能化成可與基于鏈霉親和素的多聚化劑結(jié)合。該His-STREPPER銜接分子含有與六組氨酸標記物結(jié)合的螯合部分和鏈霉親和素結(jié)合肽，從而臨時性提供靶分子，在此CD19的ECD具有可與基于鏈霉親和素突變蛋白的多聚化劑可逆結(jié)合的鏈霉親和素結(jié)合肽。用Dynabeads(具有不可逆固定于其上的αCD3-和αCD28-單克隆抗體的磁珠)或用PMA和離子霉素刺激的Jresp作為陽性對照。將Jresp細胞接種到1.5ml Eppendorf離心管的200μl添加有30U/ml IL-2的細胞培養(yǎng)基中。細胞在37℃下孵育，并在刺激0至20分鐘后置于冰上進行裂解。檢測到磷酸化的ERK表明MAPK信號傳導(dǎo)活躍，對管家β-肌動蛋白的染色表明在每種條件下和在每個時間點時上樣的總蛋白量相同。圖22A示出了Jurkat細胞經(jīng)“多克隆Streptactin多聚化劑”的激活情況，圖22B示出了Jurkat細胞經(jīng)兩種“基于Streptactin的CAR特異性多聚化劑”的激活情況，從圖22A和圖22B的比較中可以看出，Jurkat細胞可以通過CD19胞外域與CD19特異性嵌合抗原受體結(jié)合而被激活/擴增。由于對T細胞的基因下游加工幾乎僅僅在預(yù)先選定的細胞群中進行，因此，所引入的CAR經(jīng)IgG4間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域(在各種具有不同特異性的CAR內(nèi)是保守的)發(fā)生交聯(lián)引起的一般性激活拓寬了可逆細胞刺激/擴增在這些體外細胞處理情況下的適用性。

因此，這個實驗表明，原則上任何通過向細胞群提供初級激活信號的試劑(配體)的結(jié)合而被激活的細胞群都可以使用如本文所述的可逆固定在多聚化劑上的第一試劑進行擴增。

實施例16：加入αCD8-Fab刺激擴增的CD3+ T細胞的產(chǎn)量和亞群組成

本實驗示出了純化的CD3⁺ T應(yīng)答細胞在體外經(jīng)可逆固定于實施例5所述作為可溶性多聚化劑的可溶性寡聚Strep-上的αCD3/αCD28 Fab片段刺激的擴增情況。在一項實驗中，除了αCD3/αCD28 Fab片段以外，從IBA GmbH,Germany購得的αCD8 Fab片段(目錄編號6-8000-203)可被固定在鏈霉親和素突變蛋白的可溶性寡聚物上，以檢測是否可能在體外用可逆的αCD3/αCD28 Fab-Streptamer多聚體優(yōu)先刺激特定的T細胞亞群。更詳細地，用3μl負載有0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab組合的寡聚鏈霉親和素制劑(1mg/ml)對500.000個純化的CD3⁺應(yīng)答T細胞(Tresp)進行刺激。作為一種替代的方法，4.5μl Streptactin寡聚物負載有0.5μgαCD3、0.5μg strep-標記的αCD8 Fab和0.5μg strep-標記的αCD28 Fab。未經(jīng)刺激的Tresp細胞作為陰性對照，經(jīng)Dynabeads(其上不可逆固定有αCD3和αCD28單克隆抗體的磁珠)刺激的Tresp細胞作為陽性對照。從圖23A中可以看出，可逆負載有αCD3 Fab片段、αCD28 Fab片段以及還有αCD8 Fab片段的多聚化劑提供了最高數(shù)量的擴增CD3+ T細胞。擴增細胞數(shù)為1.1x10⁶的產(chǎn)量比使用市售Dynabeads對這些T細胞進行擴增高約30％。此外更重要的是，如圖23B所示，與使用Dynabeads或本發(fā)明的如本文所述僅攜帶αCD3 Fab片段和αCD28 Fab作為第一和第二試劑的可溶性多聚化劑進行的兩種擴增相比，使用攜帶αCD3 Fab片段、αCD28 Fab片段和αCD8 Fab片段的多聚化劑的CD8+ T細胞量是最高的。因此，本實驗還表明了本發(fā)明的優(yōu)勢在于除了向所期望的細胞群提供初級激活信號的第一試劑以及可選地提供共刺激信號的第二試劑以外，另一種用于特異性激活所期望細胞群的試劑也可以固定在多聚化劑上。因此，通過這樣做，本發(fā)明提供了從例如包含各種不同亞群的樣品中優(yōu)先擴增或選擇性富集任何所期望的(亞)細胞群的可能性。

實施例17：從單個細胞池中對Tcm應(yīng)答細胞進行的平行抗原特異性擴增

本實施例檢測了從在體外經(jīng)多種可逆的肽:MHC/αCH28 Fab Streptamer多聚體刺激的T應(yīng)答細胞單個細胞中進行的平行抗原特異性(Ag特異性)擴增的動力學(xué)。

使用3μl被相應(yīng)的攜帶有鏈霉親和素結(jié)合肽的肽:MHC I類復(fù)合物以及0.5μg也攜帶有鏈霉親和素結(jié)合肽的αCD28 Fab所功能化的Streptactin多聚體，對500.000個CD3+CD62L+CD45RA應(yīng)答Tcm細胞(Tresp)同時進行用于每種特異性的多重特異性的刺激。作為一種替代方法，對每種特異性使用4.5μl被如本文所述的0.5μg攜帶有鏈霉親和素結(jié)合肽的肽:MHC I、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab所功能化的基于Streptactin的多聚化劑。為了比較，使用3μl可逆負載有0.5μgαCD3 Fab和0.5μgαCD28 Fab組合的基于Streptactin的多聚化劑制劑(1mg/ml)進行多克隆刺激。同樣，作為上述刺激條件的替代，可以使用4.5μl可逆負載有0.5μgαCD3 Fab、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab(其中每以個都攜帶有鏈霉親和素結(jié)合肽)的基于Streptactin的多聚化劑制劑。未經(jīng)處理的(未刺激的)Tresp細胞作為陰性對照，經(jīng)Dynabeads(涂覆有αCD3-和αCD28-mAb的磁珠)多克隆刺激的Tresp細胞作為陽性對照。將Tresp細胞接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的細胞培養(yǎng)基中。細胞在37℃下孵育，每3天更換一次培養(yǎng)基，并在7天和14天后進行細胞計數(shù)分析。

實施例18：在體外用被αCD3/αCD8/αCD28 Fab片段可逆功能化的基于鏈霉親和素的多聚化劑所刺激的CD3+T應(yīng)答細胞中優(yōu)選擴增CD8+T細胞

使用以下試劑對300.000個CD3+應(yīng)答T細胞(Tresp)進行刺激：3μl負載有0.5μgαCD3和0.5μgαCD28 Fab組合的多聚化Streptactin制劑(1mg/ml)或使用大Streptactin骨架的多聚化劑制劑，或者4.5μl負載有0.5μgαCD3、0.5μgαCD8 Fab和0.5μgαCD28 Fab的基于Streptactin的多聚化劑制劑，或者3μl僅具有0.5μgαCD3 Fab或僅具有0.5μgαCD28 Fab的基于Streptactin的多聚化劑制劑的混合物(各Fab片段也攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽)。未經(jīng)處理的Tresp細胞作為陰性對照，經(jīng)Dynabeads(涂覆有αCD3-和αCD28-mAb的磁珠)刺激的Tresp作為陽性對照。將Tresp細胞一式兩份接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細胞培養(yǎng)基中。細胞在37℃下孵育，3天后更換培養(yǎng)基，6天后進行分析。

實施例19：在體外用被αCD3和αCD28 Fab片段可逆功能化的基于鏈霉親和素的多聚化劑所刺激的CD3+T應(yīng)答細胞中優(yōu)選擴增CD8+T細胞

使用以下試劑對300.000個CD3+應(yīng)答T細胞(Tresp)進行刺激：不同量的被αCD3 Fab片段單獨功能化和被αCD28 Fab片段單獨功能化的基于Streptactin的多聚化劑制劑(1mg/ml)的混合物(1.5μg基于Streptactin的多聚化劑被0.5μgαCD3 Fab單獨功能化，1.5μg基于Streptactin的多聚化劑被0.5μgαCD28 Fab片段單獨功能化)，或者不同量的被αCD3 Fab片段和αCD28 Fab片段具有或不具有αCD8 Fab片段(各Fab片段也攜帶有鏈霉親和素結(jié)合肽)功能化的基于Streptactin的多聚化劑制劑的混合物(3μg基于Streptactin的多聚化劑被0.5μgαCD3-和0.5μgαCD28 Fab片段功能化——無αCD8 Fab片段)，或者4.5μl負載有0.5μgαCD3 Fab片段、0.5μgαCD8 Fab片段和0.5μgαCD28 Fab片段(其中Fab片段也攜帶有鏈霉親和素結(jié)合肽)的Streptactin多聚化劑制劑。未經(jīng)處理的Tresp細胞作為陰性對照，經(jīng)Dynabeads(涂覆有αCD3-和αCD28-mAb的磁珠)刺激的Tresp作為陽性對照。將Tresp細胞接種到48孔板上1ml添加有30U/ml IL-2的細胞培養(yǎng)基中。細胞在37℃下孵育，3天后更換培養(yǎng)基，并在6天后進行分析。

在本說明書中列舉或討論在先出版的文獻不應(yīng)當?shù)乇灰暈槌姓J該文獻是現(xiàn)有技術(shù)的一部分或是公知常識。

本文示例性描述的本發(fā)明以適當?shù)卦谌狈Ρ疚奈淳唧w公開的任何一個或多個元件、一個或多個限制的情況下實施。因此，例如，術(shù)語“包括”、“包含”、“含有”等應(yīng)該在廣義上理解且沒有限制。此外，本文使用的術(shù)語和表述被用作描述而非限制，并且在使用這些術(shù)語和表述時，沒有意圖排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，而應(yīng)認識到各種修改均可能在發(fā)明要求保護的范圍內(nèi)。因此，應(yīng)當理解，盡管已經(jīng)通過示例性實施方案和可選特征具體公開了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以尋求對本文所公開和體現(xiàn)的本發(fā)明做出修改和變化，這樣的修改和變化被認為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本文已經(jīng)全面且一般性地描述了本發(fā)明。屬于一般公開內(nèi)容中的每個更窄的種類和亞屬組也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括本發(fā)明的一般性描述，其具有從該屬中去除任何主題的附帶條件或否定限制，無論所排除的材料是否在本文有具體描述。

其他實施方權(quán)利要求范圍內(nèi)。此外，在本發(fā)明的特征或方面以馬庫什組的方式進行描述時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到本發(fā)明也由此以馬庫什組的任何個體成員或成員亞組的形式進行描述。

序列表

<110> 朱諾治療有限公司

<120> 用于擴增細胞群的方法、試劑盒及裝置

<130> LC16310021P

<150> US 61/980,506

<151> 2014-04-16

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Strep-標記

<400> 1

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素突變蛋白 (類似物) 1

<400> 2

Val Thr Ala Arg

1

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 鏈霉親和素突變蛋白 (類似物) 2

<400> 3

Ile Gly Ala Arg

1

<210> 4

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> di-標記3

<400> 4

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 5

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> di-標記2

<400> 5

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 即刻早期1蛋白 (第309-317位氨基酸)

<400> 6

Cys Arg Val Leu Cys Cys Tyr Val Leu

1 5

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 雙Strep-標記

<400> 7

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25 30

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> CMV的pp65抗原表位 (第341-350位氨基酸)

<400> 8

Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe

1 5

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> CMV的pp65抗原表位 (第265-274位氨基酸)

<400> 9

Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe Thr Val Leu

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 腺病毒的hexon5抗原表位 (第114-124位氨基酸)

<400> 10

Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Leu

1 5 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HA-標記

<400> 11

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> VSV-G-標記

<400> 12

Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HSV-標記

<400> 13

Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> T7 抗原表位

<400> 14

Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly

1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> myc 抗原表位

<400> 15

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> V5-標記

<400> 16

Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr

1 5 10

<210> 17

<211> 119

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 106

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 18

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn

100 105

<210> 19

<211> 116

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 19

Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg

1 5 10 15

Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His

20 25 30

Trp Ile Lys Leu Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Phe

35 40 45

Tyr Pro Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Lys

50 55 60

Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu

65 70 75 80

Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg

85 90 95

Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val

115

<210> 20

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr His Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Cys

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

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<211> 314

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HLA-A*2402

<400> 21

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1 5 10 15

Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr

20 25 30

Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro

35 40 45

Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu

50 55 60

Thr Gly Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr Asp Arg Glu Asn Leu Arg

65 70 75 80

Ile Ala Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu

85 90 95

Gln Met Met Phe Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Arg Phe Leu Arg

100 105 110

Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys

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130 135 140

Lys Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Gln Arg Ala Tyr

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Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

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<210> 22

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HLA-B*0702

<400> 22

Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ser Val Ser Arg Pro

1 5 10 15

Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr

20 25 30

Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Glu Glu Pro

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Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn

50 55 60

Thr Gln Ile Tyr Lys Ala Gln Ala Gln Thr Asp Arg Glu Ser Leu Arg

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Gln Ser Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg

100 105 110

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115 120 125

Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr

130 135 140

Gln Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Glu Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr

145 150 155 160

Leu Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly

165 170 175

Lys Asp Lys Leu Glu Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His

180 185 190

His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly

195 200 205

Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp

210 215 220

Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg

225 230 235 240

Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln

245 250 255

Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr

260 265 270

Leu Arg Trp Glu Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro

275 280 285

Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

290 295 300

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

305 310

<210> 23

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HLA-C*0702

<400> 23

Met Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Cys Ser His Ser Met Arg Tyr Phe

1 5 10 15

Asp Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser

20 25 30

Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala

35 40 45

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50 55 60

Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr Gln Lys Tyr Lys Arg Gln Ala Gln

65 70 75 80

Ala Asp Arg Val Ser Leu Arg Asn Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser

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100 105 110

Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Asp Gln Ser Ala Tyr Asp Gly

115 120 125

Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala

130 135 140

Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Leu Glu Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu

165 170 175

Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Glu Pro

180 185 190

Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Leu Ser Asp His Glu Ala Thr

195 200 205

Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr

210 215 220

Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu

225 230 235 240

Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val

245 250 255

Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Met Gln His Glu

260 265 270

Gly Leu Gln Glu Pro Leu Thr Leu Ser Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro

275 280 285

Thr Ile Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu

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Lys

<210> 24

<211> 100

<212> PRT

<213> 人

<400> 24

Met Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala

1 5 10 15

Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His

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Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu

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65 70 75 80

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Asp Arg Asp Met

100

<210> 25

<211> 118

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 25

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 111

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 26

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 27

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 具有His-標記的人CD19胞外域

<400> 27

Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val

1 5 10 15

Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr

20 25 30

Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly

35 40 45

Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe

50 55 60

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65 70 75 80

Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val

85 90 95

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100 105 110

Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro

115 120 125

Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg

130 135 140

Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser

145 150 155 160

Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr

165 170 175

Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro

180 185 190

Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser

195 200 205

Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu

210 215 220

Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr

245 250 255

Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys

260 265 270

Ala His His His His His His His His His His

275 280