本發(fā)明提供了通式(I)的磷酰膽堿衍生物，其適用于被固定于固體載體上以得到通式(II)的分離材料，其與蛋白質(zhì)的結(jié)合兼具高親和力和高特異性，更特異地與C反應(yīng)蛋白和抗-磷酰膽堿抗體結(jié)合。所述分離材料尤其可用于從患者的生物流體體外去除C反應(yīng)蛋白和抗-磷酰膽堿抗體，用于預(yù)防和/或治療免疫功能障礙和心血管疾病。還提供了包含通式(II)的分離材料的柱，以及包含所述柱的裝置。

發(fā)明背景

C反應(yīng)蛋白(CRP)是肝臟應(yīng)答炎癥期間細(xì)胞因子釋放所生成的急性期反應(yīng)物。其長(zhǎng)期以來被用于追蹤全身炎癥、尤其是細(xì)菌感染的臨床實(shí)踐。最近，流行病學(xué)證據(jù)已顯示在沒有明顯的炎性疾病時(shí)，CRP基礎(chǔ)水平可在對(duì)于將來的心肌或腦血管事件的預(yù)測(cè)中提供信息(Ridker等人Circulation,2001 103,1813)。還令人感興趣的是以下事實(shí)：CRP是被認(rèn)為在冠狀動(dòng)脈事件的預(yù)測(cè)中具有價(jià)值的潛在的炎癥標(biāo)識(shí)物(Danesh等人N.Engl.J.Med.2004 350,1387)，且CRP是在心肌梗死后的數(shù)周期間所觀測(cè)到的破壞過程的誘發(fā)因素(Slagman等人,Blood Purif.2011,31,9)。

若干研究已展現(xiàn)了磷酰膽堿(PC)對(duì)CRP的親和力。因此，固定于固體載體的PC衍生物廣泛用于從不同的生物源分離PC結(jié)合蛋白。然而，以上提及的固定于固體載體的PC衍生物的最重要的臨床應(yīng)用是從生物流體體外去除C反應(yīng)蛋白和抗-磷酰膽堿抗體。

WO 90/12632描述了從生物流體除去CRP和抗-磷酰膽堿抗體以改善其細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法，和通過經(jīng)磷酰膽堿-基質(zhì)吸附裝置進(jìn)行患者血漿的體外灌注來從癌癥患者的循環(huán)除去CRP和抗-磷酰膽堿抗體以改善患者對(duì)癌癥的細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法。

WO 2007/076844描述了通過在呈現(xiàn)心血管疾病或免疫功能障礙、諸如自身免疫疾病的風(fēng)險(xiǎn)的患者中，憑借包含能吸收的基質(zhì)材料(包括PC衍生物)的柱，進(jìn)行血漿的體外灌注以從患者的生物液體清除CRP來處理CRP累積的風(fēng)險(xiǎn)，從而預(yù)防和/或治療自身免疫疾病、心血管疾病、諸如心肌梗死、卒中、糖尿病、風(fēng)濕病和腎功能不全的方法。

還描述了牛血清清蛋白的PC衍生物(PC-BSA)的合成，其在HW 65的固定及其在CRP親和性純化中的應(yīng)用(Stults等人Anal.Biochem.1987,161,567)。在該項(xiàng)研究中，通過形成磷酸二酯鍵實(shí)現(xiàn)PC衍生物在固體載體上的固定。其它的PC衍生物以類似的方式固定于固體載體上(Spande T.F.J.Org.Chem.1980,45,3081；Martin,L.M.Tetrahedron Lett.1996 37,7921)。

WO 2013/176084 A1也公開了用于涂覆醫(yī)療裝置以抑制生物材料、諸如血小板的粘附的通式(1)的氨基磷酸甲硅烷基烷基酯化合物：

WO 2012/160187 A1提供了用于治療炎性、自身免疫和/或變應(yīng)性障礙的含銨磷酸衍生物。假定公開的化合物通過抑制磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt激酶通路發(fā)揮它們的藥理學(xué)活性。

在我們的知識(shí)范圍內(nèi)，直至目前PC在固體載體上的固定僅通過形成磷酸二酯鍵來實(shí)現(xiàn)。PC衍生物通過磷酸二酯鍵所形成的固定具有一些優(yōu)勢(shì)，但也有嚴(yán)重的缺點(diǎn)。該方法的主要缺點(diǎn)是磷酸二酯鍵的形成改變了PC分子的總電荷(凈電荷)，并由此改變了結(jié)合口袋中以此方式修飾的PC的朝向。此外，磷酸二酯鍵可以容易地被生物流體中存在的非特異性的磷酸二酯酶裂解，導(dǎo)致基質(zhì)的不穩(wěn)定問題，其以該方式被取代。

為消除上述缺陷，本發(fā)明的目的是提供可以被固定在固體載體上以提供分離材料的化合物，所述分離材料與CRP的結(jié)合兼具高親和力和高特異性，用于通過體外去除CRP和抗-磷酰膽堿抗體來預(yù)防和/或治療免疫功能障礙和心血管疾病。

該目的通過根據(jù)獨(dú)立權(quán)利要求1的通式(I)的化合物、根據(jù)獨(dú)立權(quán)利要求5的分離材料(用于從患者的生物流體體外去除CRP和抗-磷酰膽堿抗體來預(yù)防和/或治療免疫功能障礙和心血管疾病)來實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明的目的通過獨(dú)立權(quán)利要求的教導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)。從本申請(qǐng)的從屬權(quán)利要求、說明書、附圖和實(shí)施例可明白本發(fā)明另外的有利特征、方面和細(xì)節(jié)。

發(fā)明描述

因此，本發(fā)明涉及通式(I)的化合物

其中

b選自2和3；

R¹和R²彼此獨(dú)立地選自：–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇、–C₄H₉、–C₅H₁₁和–C₆H₁₃，或R¹和R²可以與它們所連接的氮原子一起形成選自以下的雜環(huán):

其中一個(gè)或若干個(gè)氫原子可以被一個(gè)或多個(gè)氟原子替代；

X選自：–SH、–NHR³、–C≡CH、–CH＝CH₂、–N₃和–CHO；

R³選自：–H、–CH₃、–C₂H₅和–C₃H₇；

–L–選自：–L^a–、–L^a–L^e–、–L^a–L^b–L^e–和–L^a–L^b–L^d–L^c–L^e–，

其中

–L^a–選自：–(CH₂)_m–、–(CH₂–CH₂–O)_m–CH₂–、

–L^b–和–L^c–彼此獨(dú)立地選自：–O–、–NH–C(O)–、–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–和–SO₂–；

–L^d–選自：–(CH₂)_n–、–(CH₂–CH₂–O)_n–CH₂–、

–L^e–選自：–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–、

m、n、p1和p2彼此獨(dú)立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；

及上文提及的化合物的對(duì)映異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體的混合物、互變異構(gòu)體、水合物、溶劑化物、外消旋物、質(zhì)子化和去質(zhì)子化形式。

技術(shù)人員清楚片段–L–的左側(cè)連接于X，且片段–L–的右側(cè)連接于

同樣適用于以下片段：–L^a–、–L^b–、–L^c–、–L^d–和–L^e–。

因此，例如，如果–L–表示–L^a–L^b–L^e–，其中–L^a–是–(CH₂)_m–，–L^b–是–O–C(O)–NH–，且–L^e–是–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–，則通式(I)的化合物如下:

如本文使用的表述互變異構(gòu)體是指可通過稱為互變異構(gòu)化的化學(xué)反應(yīng)互相轉(zhuǎn)化的有機(jī)化合物?；プ儺悩?gòu)化通過堿、酸或其他適合的化合物催化。

本發(fā)明的優(yōu)選的化合物是通式(I)的化合物：

其中b選自2和3；

R¹和R²彼此獨(dú)立地選自：–CH₃和–C₂H₅，或R¹和R²可以與它們所連接的氮原子一起形成選自以下的雜環(huán):

其中一個(gè)或若干個(gè)氫原子可以被一個(gè)或多個(gè)氟原子替代；

X選自：–SH、–NHR³、–C≡CH、–CH＝CH₂、–N₃和–CHO；

R³選自：–H、–CH₃、–C₂H₅和–C₃H₇；

–L–選自：–L^a–、–L^a–L^e–、–L^a–L^b–L^e–和–L^a–L^b–L^d–L^c–L^e–，其中

–L^a–表示：–(CH₂)_m–或–(CH₂–CH₂–O)_m–CH₂–；

–L^b–和–L^c–彼此獨(dú)立地選自：–O–、–NH–C(O)–、–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–和–SO₂–；

–L^d–表示：–(CH₂)_n–或–(CH₂–CH₂–O)_n–CH₂–；

–L^e–選自：–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；且

m、n、p1和p2彼此獨(dú)立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及通式(I)的化合物，其中X選自：–SH、–NHR³和–CHO，且更優(yōu)選選自：–SH和–NHR³。

本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及通式(I)的化合物，其中X表示：–C≡CH、–CH＝CH₂或–N₃。

本發(fā)明的優(yōu)選的化合物為以下通式(III)、(IV)、(V)和(VI)的化合物：

其中

–L^a–表示：–(CH₂)_m–或–(CH₂–CH₂–O)_m–CH₂–；

–L^b–和–L^c–彼此獨(dú)立地選自：–O–、–NH–C(O)–、–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–和–SO₂–；

–L^d–表示：–(CH₂)_n–或–(CH₂–CH₂–O)_n–CH₂–；

–L^e–選自：–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–，

m、n、p1和p2彼此獨(dú)立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；

且b、X、R¹和R²具有上文定義的含義。

尤其優(yōu)選的化合物是通式(I)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的化合物，其中

R¹和R²彼此獨(dú)立地選自：–CH₃和–C₂H₅；

X選自：–SH和–NHR³；

R³選自：–H、–CH₃、–C₂H₅和–C₃H₇；且

–L^a–表示：–(CH₂)_m–。

甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案涉及通式(I)的化合物

其中b選自2和3；

R¹和R²彼此獨(dú)立地選自：–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇、–C₄H₉、–C₅H₁₁、–C₆H₁₃，或R¹和R²可以與它們所連接的氮原子一起形成選自以下的雜環(huán)：

其中一個(gè)或若干個(gè)氫原子可以被一個(gè)或多個(gè)氟原子替代；

X選自：–SH、–NHR³、–C≡CH、–CH＝CH₂、–N₃和–CHO；

R³選自：–H、–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇；

–L–選自：–(CH₂)_m–、–(CH₂)_m–O–C(O)–NH––(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–O–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–C(O)–NH–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–NH–C(O)–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–C(O)–NH–(CH₂)_n–O–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–O–C(O)–NH–(CH₂)_n–O–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–C(O)–NH–(CH₂)_n–C(O)–NH–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–和–(CH₂)_m–O–C(O)–NH–(CH₂)_n–C(O)–NH–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

且m、n、p1和p2彼此獨(dú)立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

優(yōu)選地通式(I)的化合物選自：

1磷酸單2-[2-(2-氨基乙氧基)乙基-二乙基-銨基]乙酯

2磷酸單2-[4-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]嗎啉-4-鎓-4-基]乙酯

3磷酸單2-[1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]哌啶-1-鎓-1-基]乙酯

4磷酸單2-[2-(2-氨基乙氧基)乙基-二甲基-銨基]乙酯

5磷酸單2-[3-氨基丙基(二甲基)銨基]乙酯

6磷酸單2-[二甲基(4-硫烷基丁基)銨基]乙酯

7磷酸單2-[4-疊氮基丁基(二甲基)銨基]乙酯

8磷酸單2-[二甲基(戊-4-炔基)銨基]乙酯

9磷酸單2-[3-(6-氨基己酰氨基)丙基-二乙基-銨基]乙酯

10磷酸單2-[1-[2-[2-(6-氨基己酰氨基)乙氧基]乙基]哌啶-1-鎓-1-基]乙酯

11磷酸單2-[4-[2-[2-[3-(6-氨基己酰氨基)丙?；被鵠乙氧基]乙基]嗎啉-4-鎓-4-基]乙酯

12磷酸單2-[1-[2-[2-[6-(6-氨基己酰氨基)己酰氨基]乙氧基]乙基]吡咯烷-1-鎓-1-基]乙酯

13磷酸單2-[2-烯丙氧基乙基(二甲基)銨基]乙酯

14磷酸單2-[2-烯丙氧基乙基(二乙基)銨基]乙酯

15磷酸單2-[4-(2-烯丙氧基乙基)嗎啉-4-鎓-4-基]乙酯

16磷酸單2-[1-(2-烯丙氧基乙基)哌啶-1-鎓-1-基]乙酯

17磷酸單2-[2-[2-(6-氨基己酰氨基)乙氧基]乙基-二甲基-銨基]乙酯

18磷酸單2-[2-[2-[3-(6-氨基己酰氨基)丙酰基氨基]乙氧基]乙基-二甲基-銨基]乙酯

19磷酸單2-[3-疊氮基丙基(二甲基)銨基]乙酯

20磷酸單2-[二甲基-[2-[2-(丙-2-炔氧基羰基氨基)乙氧基]乙基]銨基]乙酯

21磷酸單2-[2-[2-(烯丙氧基羰基氨基)乙氧基]乙基-二甲基-銨基]乙酯

22磷酸單2-[2-[2-[6-(烯丙氧基羰基氨基)己酰氨基]乙氧基]乙基-二甲基-銨基]乙酯

23磷酸單2-[2-(6-氨基己酰氨基)乙基-二甲基-銨基]乙酯

24磷酸單2-[二甲基-[3-[6-(丙-2-炔氧基羰基氨基)己酰氨基]丙基]銨基]乙酯

25磷酸單2-[3-(6-氨基己酰氨基)丙基-二甲基-銨基]乙酯

本發(fā)明的化合物被設(shè)計(jì)使得它們可以被固定于固體載體上以提供分離材料，與現(xiàn)有技術(shù)公開的分離材料相比，其呈現(xiàn)增加的穩(wěn)定性、增加的親和力和增加的對(duì)于CRP的選擇性。這通過用–L–X部分來替換磷酰膽堿的三-烷基銨基的烷基取代基中的一個(gè)而實(shí)現(xiàn)。所述–L–X部分能使通式(I)的化合物固定于固體載體而不改變磷酰膽堿分子的總電荷，且避免結(jié)構(gòu)物中出現(xiàn)不穩(wěn)定的磷酸二酯鍵。

因此，本發(fā)明還提供了通式(II)的分離材料及該分離材料的質(zhì)子化和去質(zhì)子化形式：

其中

b選自2和3；

R¹和R²彼此獨(dú)立地選自：–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇、–C₄H₉、–C₅H₁₁和–C₆H₁₃，或R¹和R²可以與它們所連接的氮原子一起形成選自以下的雜環(huán)：

其中一個(gè)或若干個(gè)氫原子可以被一個(gè)或多個(gè)氟原子替代；

Y選自：–CH(OH)–CH₂–N(R⁴)–、–CH(OH)–CH₂–S–、–CH₂–NH–、–NH–CH₂–、–CH₂–CH₂–S–、–S–CH₂–CH₂–、

R⁴選自：–H、–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇和–C(O)–CH₃；

–L–選自：–L^a–、–L^a–L^e–、–L^a–L^b–L^e–和–L^a–L^b–L^d–L^c–L^e–，其中

–L^a–選自：–(CH₂)_m–、–(CH₂–CH₂–O)_m–CH₂–，

–L^b–和–L^c–彼此獨(dú)立地選自：–O–、–NH–C(O)–、–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–和–SO₂–；

–L^d–選自：–(CH₂)_n–、–(CH₂–CH₂–O)_n–CH₂–、

–L^e–選自：–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–、

–L*–選自：–L*^a–、–L*^a–L*^e–和–L*^a–L*^b–L*^e–，其中

–L*^a–選自：–(CH₂)_o–、–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–、–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–和–CH₂–CH(OH)–CH₂–；

–L*^e–選自：–(CH₂)_q–、–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_q–和–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_q–；

–L*^b–選自：–O–(CH₂)_r–O–、–S–(CH₂)_r–S–、–SO₂–、–S–、–O–、–NH–C(O)、–C(O)–NH–和–S–S–；且

m、n、p1、p2、o、r、q彼此獨(dú)立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；

A是固體載體，其選自：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、聚丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)(PGMA)、聚(羥基甲基丙烯酸酯)、聚苯乙烯(PS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯酰胺、聚丙烯醛、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚丙烯腈(PAN)、聚氨酯(PU)、聚乙二醇(PEG)、高氟碳或高氟烴(hyperfluorocarbon)、瓊脂糖、藻酸鹽、角叉菜膠、殼多糖、淀粉、纖維素、硝化纖維素、玻璃、硅石、硅藻土、氧化鋯、氧化鋁、氧化鐵及所述固體載體的混合物和/或衍生物。

技術(shù)人員清楚–L*–的左側(cè)片段連接于A，–L*–片段的右側(cè)連接于Y片段的左側(cè)，Y片段的右側(cè)連接于–L–片段的左側(cè)，–L–片段的右側(cè)連接于

同樣適用于以下片段：–L^a–、–L^b–、–L^c–、–L^d–、–L^e–、–L*^a–、–L*^b–和–L^*e–。

因此，例如，如果–L*–表示–L*^a–L*^b–L*^e–，其中–L*^a–是–CH₂–CH(OH)–CH₂–，–L*^b–是–O–，–L*^e–是–(CH₂)_q–，Y表示–CH(OH)–CH₂–N(R⁴)–，–L–表示–L^a–L^b–L^e–，其中–L^a–是–(CH₂)_m–，–L^b–是–O–C(O)–NH–，且–L^e–是–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–，則通式(II)的分離材料如下:

本文所用的固體載體A是指這樣的惰性固體載體：預(yù)期用部分–L*–FG官能化實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的通式(I)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的化合物的共價(jià)固定，其中FG是適合與官能團(tuán)X反應(yīng)的反應(yīng)性官能團(tuán)。FG基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于：環(huán)氧化物、–CHO、–C≡CH、–CH＝CH₂、–N₃、–CH(OH)–CH₂–N₃、–NH₂、–SH、三氟乙磺?；?tresyl)。固體載體的官能化通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法實(shí)現(xiàn)(Chin.J.Chem.2012,30,2473；Polym.Int.2013,62,991)。此外，官能化的固體載體已經(jīng)商業(yè)可得：AF-環(huán)氧、AF-氨基、AF-三氟乙磺?；⑷一酋；?、環(huán)氧-活化的6B(GE Healthcare Life Sciences)、CNBr-活化的4fast flow(GE Healthcare Life Sciences)、ECH4B(GE Healthcare Life Sciences)、NHS-活化的4fast flow(GE Healthcare Life Sciences)、末端乙烯基砜活化的4fast flow(Affiland)、醛(瓊脂糖)4B、ECH(瓊脂糖)4B(Separopore)。

可以對(duì)所述固體載體進(jìn)行交聯(lián)或其他處理以增加物理或化學(xué)穩(wěn)定性，且可使其形成各種形狀，包括但不限于纖維、片、桿、小球和膜。

優(yōu)選地，固體載體A選自聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、其混合物和/或衍生物。

可以修飾基于PS、PES和PAES的固體載體使得部分–L*–FG出現(xiàn)在它們表面上，其中FG是適合與官能團(tuán)X反應(yīng)的反應(yīng)性官能團(tuán)(Chin.J.Chem.2012,30,2473；Polym.Int.2013,62,991)。所述修飾導(dǎo)致增加了抗污性、生物相容性和其它特定功能。

本發(fā)明的優(yōu)選的分離材料是通式(II)的分離材料及其質(zhì)子化和去質(zhì)子化形式：

其中

b選自2和3；

R¹和R²彼此獨(dú)立地選自：–CH₃、–C₂H₅，或R¹和R²可以與它們所連接的氮原子一起形成選自以下的雜環(huán):

其中一個(gè)或若干個(gè)氫原子可以被一個(gè)或多個(gè)氟原子替代；

Y選自：–CH(OH)–CH₂–N(R⁴)–、–CH(OH)–CH₂–S–、–CH₂–NH–、–NH–CH₂–、–CH₂–CH₂–S–、–S–CH₂–CH₂–、

R⁴選自：–H、–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇、–C(O)–CH₃；

–L–選自：–L^a–、–L^a–L^e–、–L^a–L^b–L^e–和–L^a–L^b–L^d–L^c–L^e–，其中

–L^a–表示：–(CH₂)_m–或–(CH₂–CH₂–O)_m–CH₂–；

–L^b–和–L^c–彼此獨(dú)立地選自：–O–、–NH–C(O)–、–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–和–SO₂–；

–L^d–選自：–(CH₂)_n–和–(CH₂–CH₂–O)_n–CH₂–，

–L^e–選自：–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

–L*–選自：–L*^a–、–L*^a–L*^e–和–L*^a–L*^b–L*^e–，其中

–L*^a–選自：–(CH₂)_o–、–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–、–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–和–CH₂–CH(OH)–CH₂–；

–L*^e–選自：–(CH₂)_q–、–C₂H₄–(O–CH₂–CH₂)_q–和–CH₂–(O–CH₂–CH₂)_q–；

–L*^b–選自：–O–(CH₂)_r–O–、–S–(CH₂)_r–S–、–SO₂–、–S–、–O–、–NH–C(O)–、–C(O)–NH–和–S–S–；

m、n、p1、p2、o、r、q彼此獨(dú)立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；

且A具有如上文定義的含義、且更優(yōu)選A選自聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、其混合物和/或衍生物。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及通式(II)的分離材料，其中Y選自：–CH(OH)–CH₂–N(R⁴)–、–CH(OH)–CH₂–S–、–CH₂–NH–、–NH–CH₂–、–CH₂–CH₂–S–、–S–CH₂–CH₂–、

且更優(yōu)選選自：–CH(OH)–CH₂–N(R⁴)–和–CH(OH)–CH₂–S–。

還優(yōu)選的是通式(II)的分離材料，其中Y表示:

本發(fā)明的優(yōu)選的化合物是以下通式(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的化合物

其中

–L^a–選自：–(CH₂)_m–和–(CH₂–CH₂–O)_m–CH₂–；

–L^b–和–L^c–彼此獨(dú)立地選自：–O–、–NH–C(O)–、–C(O)–NH–、–O–C(O)–NH–和–SO₂–；

–L^d–選自：–(CH₂)_n–和–(CH₂–CH₂–O)_n–CH₂–；

–L^e–選自：–(CH₂)_p1–和–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

m、n、p1、p2、o、r、q彼此獨(dú)立地選自：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；且b、A、L*、Y、R¹和R²具有上文定義的含義。

尤其優(yōu)選的分離材料是通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的分離材料，其中

–L*–選自：–L*^a–、–L*^a–L*^e–和–L*^a–L*^b–L*^e–；且

–L*^a–選自：–(CH₂)_o–和–CH₂–CH(OH)–CH₂–；

–L*^e–表示–(CH₂)_q–；

–L*^b–選自：–O–(CH₂)_r–O–、–S–(CH₂)_r–S–、–S–和–O–；且

o、q和r彼此獨(dú)立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

在通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)中，L*優(yōu)選地表示–L*^a–L*^b–L*^e–，且A優(yōu)選地選自：聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、其混合物和/或衍生物。

另一個(gè)優(yōu)選的本發(fā)明的實(shí)施方案涉及通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的分離材料，其中

R¹和R²彼此獨(dú)立地選自：–CH₃和–C₂H₅；

Y選自：–CH(OH)–CH₂–N(R⁴)–、–CH(OH)–CH₂–S–、–CH(OH)–CH₂–O–、–CH₂–NH–、–S–CH₂–CH₂–和–CH₂–CH₂–S–；

R⁴選自：–H、–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇和–C(O)–CH₃；且

–L^a–表示–(CH₂)_m–。

甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案涉及通式(II)的分離材料

和所述分離材料的質(zhì)子化和去質(zhì)子化形式，其中

R¹和R²彼此獨(dú)立地選自：–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇、–C₄H₉、–C₅H₁₁和–C₆H₁₃，或R¹和R²可以與它們所連接的氮原子一起形成選自以下的雜環(huán):

其中一個(gè)或若干個(gè)氫原子可以被一個(gè)或多個(gè)氟原子替代；

Y選自：–CH(OH)–CH₂–N(R⁴)–、–CH(OH)–CH₂–S–、–CH₂–NH–、–NH–CH₂–、–S–CH₂–CH₂–和–CH₂–CH₂–S–、

R⁴選自：–H、–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇和–C(O)–CH₃；

–L–選自：–(CH₂)_m–、–(CH₂)_m–O–C(O)–NH–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–O–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–C(O)–NH–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–NH–C(O)–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–C(O)–NH–(CH₂)_n–O–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–O–C(O)–NH–(CH₂)_n–O–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–C(O)–NH–(CH₂)_n–C(O)–NH–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–和–(CH₂)_m–O–C(O)–NH–(CH₂)_n–C(O)–NH–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；

m、n、p1和p2彼此獨(dú)立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，且b、A和L*具有上文定義的含義，更優(yōu)選A選自：聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、其混合物和/或衍生物。

另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及通式(II)的分離材料

其中b選自2和3；

R¹和R²彼此獨(dú)立地選自：–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇、–C₄H₉、–C₅H₁₁和–C₆H₁₃，或R¹和R²可以與它們所連接的氮原子一起形成選自以下的雜環(huán):

其中一個(gè)或多個(gè)氫原子可以被一個(gè)或多個(gè)氟原子替代；

Y選自：–CH(OH)–CH₂–N(R⁴)–、–CH(OH)–CH₂–S–、–S–CH₂–CH₂–和–CH₂–CH₂–S–；

R⁴選自：–H、–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇和–C(O)–CH₃；

–L–選自：–(CH₂)_m–、–(CH₂)_m–O–C(O)–NH–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–O–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–C(O)–NH–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–NH–C(O)–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–C(O)–NH–(CH₂)_n–O–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–O–C(O)–NH–(CH₂)_n–O–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–C(O)–NH–(CH₂)_n–C(O)–NH–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–和–(CH₂)_m–O–C(O)–NH–(CH₂)_n–C(O)–NH–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；且m、n、p1和p2彼此獨(dú)立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；

–L*–選自：–(CH₂)_o–、–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–、–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–C(O)–NH–(CH₂)_q–、–(CH₂)_o–SO₂–(CH₂)_q–、–CH₂–CH(OH)–CH₂–O–CH₂–、–CH₂–CH(OH)–CH₂–O–(CH₂)_r–O–CH₂–和–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–O–CH₂–；

o、r和q彼此獨(dú)立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；A具有如上文定義的含義、更優(yōu)選選自：聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、其混合物和/或衍生物。

另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及通式(II)及其質(zhì)子化和去質(zhì)子化形式的分離材料

其中b選自2和3；

R¹和R²彼此獨(dú)立地選自：–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇、–C₄H₉、–C₅H₁₁和–C₆H₁₃，或R¹和R²可以與它們所連接的氮原子一起形成選自以下的雜環(huán):

其中一個(gè)或若干個(gè)氫原子可以被一個(gè)或多個(gè)氟原子替代；

Y選自：

–L–選自：–(CH₂)_m–、–(CH₂)_m–O–C(O)–NH––(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–O–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–C(O)–NH–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–NH–C(O)–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–C(O)–NH–(CH₂)_n–O–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–O–C(O)–NH–(CH₂)_n–O–(CH₂)_p1–、–(CH₂)_m–C(O)–NH–(CH₂)_n–C(O)–NH–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–和–(CH₂)_m–O–C(O)–NH–(CH₂)_n–C(O)–NH–(CH₂)_p1–O–(CH₂)_p2–；且m、n、p1和p2彼此獨(dú)立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；

–L*–選自：–(CH₂)_o–、–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–、–(CH₂–CH₂–O)_o–CH₂–C(O)–NH–(CH₂)_q–、–(CH₂)_o–SO₂–(CH₂)_q–、–CH₂–CH(OH)–CH₂–O–CH₂–、–CH₂–CH(OH)–CH₂–O–(CH₂)_r–O–CH₂–和–(CH₂–CH₂–O)_o–C₂H₄–O–CH₂–；

o、r和q彼此獨(dú)立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；A具有如上文定義的含義、且更優(yōu)選選自聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)、其混合物和/或衍生物。

適應(yīng)癥:

令人驚訝地發(fā)現(xiàn)以上提及的通式(I)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的化合物以及通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的分離材料高親和力和高選擇性地結(jié)合CRP和抗-磷酰膽堿抗體。因此，本發(fā)明化合物和分離材料可用于從生物流體除去CRP和抗-磷酰膽堿抗體。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及從患者的生物流體體外去除CRP以預(yù)防和/或治療免疫功能障礙和心血管疾病的方法，所述方法包括以下步驟:

a)提供通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)或(X)的分離材料；和

b)使患者的生物流體與所述分離材料接觸。

為該目的，將通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的分離材料載入柱中，所述柱可用于從患者的生物流體體外去除CRP以預(yù)防和/或治療免疫功能障礙和心血管疾病。

本文所用的術(shù)語生物流體包括血、血漿、腹水和淋巴液。

柱的尺寸不是關(guān)鍵性的，必須對(duì)它們進(jìn)行選擇使得它們適合生物流體離開患者的流速，所述流速與患者的體重高度相關(guān)。包含本發(fā)明的分離材料的柱必須被滅菌，例如使用殺菌氣體、諸如環(huán)氧乙烷，并直接使用或密封并存儲(chǔ)用于之后的使用。使用前，必須用生理鹽水洗滌柱，隨后用含任何其他適合的制備成分(preparatory ingredients)的生理鹽水洗滌。柱可以具有常規(guī)的筒設(shè)計(jì)、流化床、膨脹床或整體柱(monolith)。技術(shù)人員熟知所述柱的制備。例如，常規(guī)筒設(shè)計(jì)的柱的制備可以如專利申請(qǐng)EP0237659A1中所述進(jìn)行。

柱的再生也是可能的。用于再生目的，例如可使用0.9％鹽水溶液沖洗柱。隨后通過使用甘氨酸/HCl緩沖液(pH 2.8)降低pH值以切斷CRP和分離材料之間的連接，隨后用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)在pH值7.4進(jìn)行洗滌步驟，最后用0.9％鹽水溶液進(jìn)行洗滌步驟。

任選地，包含本發(fā)明的分離材料的柱含有另外的適用于從患者的生物流體除去其他有意義的物質(zhì)的分離材料。所述其他物質(zhì)優(yōu)選為蛋白質(zhì)。其他物質(zhì)的實(shí)例為白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1、TNFα、血清淀粉樣P成分(SAP)、PTX3、血纖蛋白原、抗體(諸如IgG、IgE)、抗磷酯抗體和補(bǔ)體系統(tǒng)成分、諸如C1q、C3a或C5a。

可以將本發(fā)明的柱結(jié)合至設(shè)備中以提供適用于從患者的生物流體體外去除CRP以預(yù)防和/或治療免疫功能障礙和心血管疾病的裝置。

因此，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備包含:

a)包含通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的分離材料的柱；和

b)用于將包含分離材料的柱與患者的生物流體離體接觸由此降低所述生物流體的CRP水平及用于使生物流體返回至患者的裝置。

由于通式(I)的化合物的高親和力和選擇性，通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)和(X)的分離材料、包含通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)或(X)的分離材料的柱和包含該柱(所述柱含有通式(II)、(VII)、(VIII)、(IX)或(X)的分離材料)的設(shè)備尤其可用于從患者的生物流體體外去除CRP以預(yù)防和/或治療免疫功能障礙和心血管疾病。

優(yōu)選地，生物流體選自：血、血漿、腹水和淋巴液。

如本文使用的術(shù)語“心血管疾病”包括但不限于梗死、卒中、糖尿病、晚期腎病、腎功能不全、由于高血壓導(dǎo)致的腎功能不全、內(nèi)皮損害(endothelial lesions)、內(nèi)皮破壞(endothelial destruction)、動(dòng)脈硬化、血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化、狹窄、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化或血栓形成疾病、血流不足、缺血事件、肺栓塞、穩(wěn)定和不穩(wěn)定型心絞痛、冠狀動(dòng)脈疾病、心肌梗死，以及動(dòng)脈硬化或血栓形成疾病的病理結(jié)果。

如本文使用的術(shù)語“免疫功能障礙”包括但不限于免疫性疾病、自身免疫疾病、移植術(shù)中的排斥反應(yīng)、異體移植物排斥、異種移植排斥、移植物抗宿主排斥、宿主抗移植物排斥、糖尿病、風(fēng)濕病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊椎炎、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、尋常性銀屑病、毒性彌漫性甲狀腺腫、古德帕斯丘綜合征、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、再生障礙性貧血、炎癥性腸病(IBD)、克羅恩病(也稱為節(jié)段性回腸炎)、潰瘍性結(jié)腸炎、擴(kuò)張型心肌病(DCM)、自身免疫性甲狀腺炎、橋本甲狀腺炎、激素替代療法(HRT)、骨關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)。

化學(xué)合成

A.通式(I)的化合物的合成

A.1根據(jù)流程1可以從市售的通式NHR³–L¹–OH(1)的氨基醇(其中L¹表示–L^a–、–L^a–O–L^e–、–L^a–L^e–、–L^e–、–L^d–O–L^e–或–L^d–L^e–)起始裝配本發(fā)明的通式I的化合物，其中X表示–NHR³，R³選自：–H、–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇，且–L–表示–L^a–、–L^a–O–L^e–、–L^a–L^e–(即通式6的化合物)，或X表示–C≡CH或–CH＝CH₂，且–L–表示–L^a–O–C(O)–NH–L^e–或–L^a–O–C(O)–NH–L^d–O–L^e–(即通式5的化合物，其中PG¹表示烯丙氧基羰基或炔丙基氧基羰基，且R³表示–H)。

流程1：通式5和6的化合物的合成：a.保護(hù)氨基；b.將羥基轉(zhuǎn)化為離去基團(tuán)LG；c.季銨化；d.磷酸化；e.脫保護(hù)。

該合成涉及用保護(hù)基團(tuán)PG¹保護(hù)醇1的末端氨基，隨后將末端羥基轉(zhuǎn)化為離去基團(tuán)LG，得到中間體3。適合的氨基保護(hù)基團(tuán)PG¹為技術(shù)人員熟知，且包括氨基甲酸酯、鄰苯二甲?；鶊F(tuán)和取代的鄰苯二甲?；鶊F(tuán)。氨基甲酸酯的實(shí)例包括但不限于：芐氧基羰基(Cbz或Z)、4-硝基-芐氧基羰基、4-氯-芐氧基羰基、4-甲氧基-芐氧基羰基、4-甲基-芐氧基羰基、4-疊氮基-芐氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、烯丙氧基羰基(Aloc)、炔丙基氧基羰基、叔丁氧基羰基(Boc)。鄰苯二甲酰(Phtaloyl)和取代的鄰苯二甲酰保護(hù)基團(tuán)尤其可用于保護(hù)伯胺(R³表示H)。取代的鄰苯二甲?；鶊F(tuán)的實(shí)例包括但不限于4-硝基-鄰苯二甲酰、3-硝基-鄰苯二甲酰和四氯鄰苯二甲酰。優(yōu)選地，保護(hù)基團(tuán)PG¹選自烯丙氧基羰基、炔丙基氧基羰基、芐氧基羰基和鄰苯二甲酰。在步驟b引入的離去基團(tuán)LG可以選自氯化物、溴化物、碘化物、甲苯磺酸酯、苯磺酸酯、對(duì)-硝基-苯磺酸酯、甲磺酸酯或三氟甲磺酸酯基團(tuán)。優(yōu)選地，離去基團(tuán)LG是磺酸的酯(即磺酸酯)、且更優(yōu)選LG是甲磺酸酯基團(tuán)。醇官能團(tuán)至的基團(tuán)LG的轉(zhuǎn)化可以例如通過用MsCl或TsCl在三乙胺的存在下、使用二氯甲烷作為溶劑、在0℃處理醇2來實(shí)現(xiàn)。將中間體3進(jìn)一步與通式NHR¹R²–(CH₂)_b–OH的氨基醇、諸如二甲基乙醇胺、二甲基丙醇胺、N,N-二乙基乙醇胺、N-(2-羥基乙基)嗎啉或N-(2-羥基乙基)哌啶反應(yīng)，通過季銨化反應(yīng)得到氨基醇4。隨后用POCl₃和三乙胺在乙腈中在0℃處理醇4，結(jié)果在分子上引入磷酸酯基團(tuán)。對(duì)末端氨基的脫保護(hù)得到根據(jù)本發(fā)明的通式6的目標(biāo)化合物，其可隨時(shí)通過末端氨基固定于固體載體。如果保護(hù)基團(tuán)PG¹是烯丙氧基羰基或炔丙基氧基羰基，且R³表示–H，則脫保護(hù)步驟是任選的，因?yàn)橥ㄊ?的化合物可以通過末端烯基團(tuán)(硫醇-烯化學(xué)、點(diǎn)擊化學(xué)、置換(methathesis))或炔基團(tuán)(點(diǎn)擊化學(xué))直接固定于固體載體。

多種市售的通式NHR³–L¹–OH(1)的氨基醇可用作流程1中描述的合成途徑的起始材料。所述市售的氨基醇包括但不限于2-氨基乙醇、3-氨基丙-1-醇、4-氨基丁-1-醇、5-氨基戊-1-醇、6-氨基己-1-醇、2-(2-氨基乙氧基)乙醇、2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇、2-(3-氨基丙氧基)乙醇、3-(3-氨基丙氧基)丙-1-醇、4-(3-氨基丙氧基)丁-1-醇、2-(甲氨基)乙醇、3-(甲氨基)丙-1-醇、4-(甲氨基)丁-1-醇、5-(甲氨基)己-1-醇、6-(甲氨基)己-1-醇、7-(甲氨基)庚-1-醇、2-[2-(甲氨基)乙氧基]乙醇、2-[2-[2-(甲氨基)乙氧基]乙氧基]乙醇、2-[3-(甲氨基)丙氧基]乙醇、3-[3-(甲氨基)丙氧基]乙醇、3-[3-(甲氨基)丙氧基]丙-1-醇、4-[3-(甲氨基)丙氧基]丁-1-醇。

技術(shù)人員會(huì)理解通過進(jìn)行流程1中描述的合成方法的步驟b、c和d和(如果必要的話)對(duì)通式PG²S–L¹–OH、HC≡C–L¹–OH、CH₂＝CH–L¹–OH、N₃–L¹–OH或PG³＝C–L¹–OH的醇(其中PG²是巰基保護(hù)基團(tuán)(例如芐基)，且PG³是醛保護(hù)基團(tuán)(例如二噻烷或縮醛))的適合的脫保護(hù)步驟，會(huì)得到類似的6a、6b、6c、6d和6e。

在該情況中炔丙基醇、3-疊氮基丙-1-醇、2-疊氮基乙醇、4-疊氮基丁-1-醇、2-(2-疊氮基乙氧基)乙醇、2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙醇、2-[2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙醇、2-(2-疊氮基乙基磺酰基)乙醇、丁-3-炔-1-醇、戊-4-炔-1-醇、2-丙-2-炔氧基乙醇、2-(2-丙-2-炔氧基乙氧基)乙醇、2-[2-(2-丙-2-炔氧基乙氧基)乙氧基]乙醇可以用作原料。

A.2根據(jù)流程2，可以從通式NHR³–L²–CO₂H的氨基酸9(其中–L²–表示–La–或–Ld–)、通式NH₂–L¹–OH(1)的氨基醇10(其中L¹表示–L^e–)或通式NH₂–L³–NR¹R²的二胺11(其中L³表示–L^e–)起始來裝配本發(fā)明的通式I的化合物，其中X表示–NHR³，R³選自：–H、–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇，且–L–表示–L^a–C(O)–NH–L^e–(即通式7和19的化合物)或X表示–C≡CH或–CH＝CH₂，且–L–表示–L^a–O–C(O)–NH–L^d–C(O)–NH–L^e–(即通式8和18的化合物，其中PG¹表示烯丙氧基羰基或炔丙基氧基羰基，R³表示–H)。

所述合成起始為用保護(hù)基團(tuán)PG¹保護(hù)氨基酸9上的氨基，其中PG¹具有A.1段所定義的含義，得到羧酸12。將羧酸12與氨基醇10偶聯(lián)，得到伯醇13，在其上將羥基進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為離去基團(tuán)LG，其中離去基團(tuán)LG具有A.1段所定義的含義，得到中間體14。用通式NHR¹R²–(CH₂)_b–OH的氨基醇10(例如二甲基乙醇胺、二甲基丙醇胺、N,N-二乙基乙醇胺、N-(2-羥基乙基)嗎啉或N-(2-羥基乙基)哌啶)處理中間體14，形成醇15，將其進(jìn)行季銨化反應(yīng)，隨后進(jìn)行包括裂解保護(hù)基團(tuán)PG¹的脫保護(hù)，得到目標(biāo)化合物7。如前所述，可以將具有為烯丙氧基羰基或炔丙基氧基羰基的PG¹的前體8直接固定于固體載體。

流程2：通式7、8、18和19的化合物的合成：a.保護(hù)氨基；b.10、偶聯(lián)；c.將羥基轉(zhuǎn)化為離去基團(tuán)LG；d.季銨化；e.磷酸化；f.脫保護(hù)；g.11，偶聯(lián)；h.季銨化。

或者，可以將羧酸醇12與二胺11偶聯(lián)，得到酰胺16，隨后通過用2-羥基乙基或3-羥基丙基衍生物處理對(duì)其進(jìn)行季銨化反應(yīng)。適合的2-羥基乙基和3-羥基丙基衍生物包括2-溴-和2-碘-乙醇和3-溴和3-碘丙醇。所述季銨化反應(yīng)優(yōu)選在乙腈中在室溫進(jìn)行。最后，對(duì)醇18進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，隨后進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，得到目標(biāo)化合物19。

通式NHR³–L²–CO₂H的氨基酸9包括但不限于7-氨基庚酸、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、4-氨基丁酸、3-氨基丙酸、2-氨基乙酸、2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸、2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸、2-(2-氨基乙氧基)乙酸、2-(3-氨基丙氧基)乙酸、3-(3-氨基丙氧基)丙酸、4-(3-氨基丙氧基)丁酸、2-(甲氨基)乙酸、3-(甲氨基)丙酸、4-(甲氨基)丁酸、5-(甲氨基)戊酸、6-(甲氨基)己酸、7-(甲氨基)庚酸、2-[2-(甲氨基)乙氧基]乙酸、2-[2-[2-(甲氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸、2-[3-(甲氨基)丙氧基]乙酸、3-[3-(甲氨基)丙氧基]丙酸、4-[3-(甲氨基)丙氧基]丁酸、2-[2-[2-[2-(甲氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸。

適合用于流程2所示的合成流程的通式NHR¹R²–(CH₂)_b–OH的氨基醇10包括但不限于：2-氨基乙醇、3-氨基丙-1-醇、4-氨基丁-1-醇、5-氨基戊-1-醇、6-氨基己-1-醇、2-(2-氨基乙氧基)乙醇、2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇、2-(3-氨基丙氧基)乙醇、3-(3-氨基丙氧基)丙-1-醇、4-(3-氨基丙氧基)丁-1-醇。

商購(gòu)可得的通式H₂N–L^e–NR¹R²的二胺11的實(shí)例包括但不限于乙二胺；1,3-二氨基丙烷；N-甲基乙二胺；1,4-二氨基丁烷；3-(甲氨基)-丙胺；N,N′-二甲基乙二胺；N-乙基乙二胺；3-(二甲氨基)-1-丙胺；N-異丙基-乙二胺；N-丙基乙二胺；六亞甲基二胺；1,2-二氨基環(huán)己炔；1,4-二氨基環(huán)己烷；和N-己基乙二胺。

技術(shù)人員會(huì)理解通過進(jìn)行流程2中所述的合成方法的步驟b-e和(如果必要的話)對(duì)通式PG²S–L²–CO₂H、HC≡C–L²–CO₂H、CH₂＝CH–L²–CO₂H、N₃–L²–CO₂H或PG³＝C–L²–CO₂H的羧酸(其中PG²是巰基保護(hù)基團(tuán)(例如芐基)，且PG³是醛保護(hù)基團(tuán)(例如二噻烷或乙縮醛))的適合的脫保護(hù)步驟，會(huì)得到類似物7a、7b、7c、7d和7e。

用作獲得類似物7a-7e的起始材料的適合的羧酸的實(shí)例包括但不限于：6-硫代己酸、6-疊氮基己酸、5-硫代戊酸、5-疊氮基戊酸、4-硫代丁酸、4-疊氮基丁酸、3-硫代丙酸、3-疊氮基丙酸、硫代乙酸、3-丁炔酸、4-戊炔酸。

A.3或者，通式R³HN–L⁴–NR¹R²(20)的二胺可以成功地用于得到通式I的化合物，其中X表示–NHR³，R³選自：–H、–CH₃、–C₂H₅、–C₃H₇和–L–表示–L^a–(參見流程3)。二胺20可以商購(gòu)獲得(例如N,N-二甲基-1,3-丙二胺)或可以例如從相應(yīng)的鹵代衍生物起始、經(jīng)兩個(gè)合成步驟(包括將鹵代衍生物轉(zhuǎn)化為疊氮基衍生物，并將該疊氮基衍生物還原為相應(yīng)的伯胺)容易地獲得。

從通式R³HN–L⁴–NR¹R²的二胺20起始，可以在四個(gè)步驟中得到通式24的化合物，所述步驟包括用保護(hù)基團(tuán)PG¹(其中PG¹具有A.1段所定義的含義)保護(hù)伯胺或仲胺，通過用適合的2-羥基乙基或3-羥基丙基衍生物處理將該叔胺季銨化，隨后進(jìn)行磷酸化和伯胺或仲胺的脫保護(hù)。

流程3：通式24的化合物的合成：a.保護(hù)氨基；b.季銨化；c.磷酸化；d.脫保護(hù)。

B.通式(II)的分離材料的制備

通式(II)的分離材料可以通過將通式(I)的化合物與用部分–L*–FG官能化的固體載體A偶聯(lián)來制備，其中FG是適合與官能團(tuán)X反應(yīng)的官能團(tuán)。FG基團(tuán)的的實(shí)例包括–CHO、–C≡CH、–N₃、–CH＝CH₂、–NH₂、–SH、環(huán)氧化物、三氟乙磺?；?。流程4概述了不同的可以用于得到通式(II)的分離材料的偶聯(lián)方法。優(yōu)選地，將通式(I)的化合物(其中X選自–SH、–OH和–NHR³)經(jīng)環(huán)氧化物開環(huán)偶聯(lián)至固體載體A(參見流程5a、b)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行通式(I)的化合物(其中X＝–C≡CH、–N₃或–CH＝CH₂)和固體載體的偶聯(lián)，形成三唑部分(參見流程5c、d、e)。從疊氮化物和炔烴形成三唑，也稱為炔烴疊氮化物Huisgen環(huán)加成反應(yīng)，作為1,3-環(huán)加成反應(yīng)進(jìn)行。Huisgen1,3-偶極環(huán)加成的特別的變型是銅(I)催化的變型，其中聯(lián)合有機(jī)疊氮化物和末端炔烴，得到為單產(chǎn)物的1,2,3-三唑的1,4-位置異構(gòu)體。該反應(yīng)稱為銅(I)-催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成(CuAAC)。該反應(yīng)可以使用商購(gòu)來源的銅(I)諸如溴化亞銅或碘化亞銅進(jìn)行。然而，使用銅(II)(例如硫酸銅(II))和還原劑(例如抗壞血酸鈉)的混合物，該反應(yīng)進(jìn)行得更好，原位得到Cu(l)。由于Cu(l)在水性溶劑中不穩(wěn)定，所以穩(wěn)定配體對(duì)改善該反應(yīng)產(chǎn)出有效，尤其是如果使用三-(芐基三唑基甲基)胺(TBTA)。該反應(yīng)可以在多種溶劑、及水與多種(部分)易混合有機(jī)溶劑的的混合物中進(jìn)行，所述易混合有機(jī)溶劑包括醇、DMSO、DMF、t-BuOH、二噁烷、丙酮及其混合物。此外，該反應(yīng)可通過釕催化。釕-催化的1,3-偶極疊氮化物-炔烴環(huán)加成(RuAAC)生成1,5-三唑。因此，使用疊氮化物-炔烴環(huán)加成可以容易地得到通式(II)的分離材料，其中Y選自:

以相同的方式，可以從疊氮化物和烯烴起始得到通式(II)的分離材料，其中Y選自：

通過還原性胺化反應(yīng)、使用例如NaBH₄作為還原劑、從通式(I)的化合物(其中X是–NH₂或–CH(O))和固體載體(用部分–L*–FG官能化的A，其中官能團(tuán)FG分別表示–CH(O)和–NH₂(參見流程4f、g))起始，可以制備通式(II)的分離材料，其中Y選自–CH₂–NH–和–NH–CH₂–。

可以通過復(fù)分解反應(yīng)或維悌希反應(yīng)將通式(I)的化合物(其中X＝–CH＝CH₂)固定于固體載體，得到通式(II)的分離材料，其中Y選自:

通式(I)的化合物(其中X＝–CH＝CH₂或–SH)可以通過硫醇-烯化學(xué)固定于固體載體，得到通式(II)的分離材料，其中Y表示–S–CH₂–CH₂–或–CH₂–CH₂–S–。

所包括的以下實(shí)施例證明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在以下實(shí)施例中公開的技術(shù)代表由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明實(shí)踐中良好地發(fā)揮功能的技術(shù)，并且因此可以被認(rèn)為構(gòu)成了用于其實(shí)踐的優(yōu)選模式。然而，本領(lǐng)域那些技術(shù)人員應(yīng)該依據(jù)本公開內(nèi)容理解，所公開的特定實(shí)施方案中可以做出許多改變，并且仍獲得相似或類似的結(jié)果而不背離本發(fā)明的精神和范圍。

根據(jù)本說明書，本發(fā)明不同方面的其他修飾和替代實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。因此，本說明書應(yīng)被理解為僅是示例性的，并且其目的是用于教導(dǎo)本領(lǐng)域的技術(shù)人員執(zhí)行本發(fā)明的一般方式。應(yīng)當(dāng)理解，本文所示和所述的本發(fā)明的形式將被視為實(shí)施方案的實(shí)例。元件與材料可被本文所示和所述的那些元素與材料所替代，可顛倒各部分和工藝并且可獨(dú)立地利用本發(fā)明的某些特征，在受益于本發(fā)明的本說明書之后，所有這些對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言都將是顯而易見的?？稍诓槐畴x以下權(quán)利要求書中所描述的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的情況下對(duì)本文所述的元素作出修改。

實(shí)施例

實(shí)施例1：N-[3-(二甲氨基)丙基]氨基甲酸芐基酯(1*)的合成。

在氬氣氣氛、0℃下向N-(芐氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(68.8g，0.276mol)在氯仿(300ml)中的攪拌的溶液中，滴加溶于氯仿(150ml)中的N',N'-二甲基丙-1,3-二胺(24.52g，0.24mol)，同時(shí)將該反應(yīng)混合物溫度保持在0℃。將該反應(yīng)混合物在0℃攪拌2h，然后用氯仿(400ml)稀釋，并用飽和的碳酸氫鈉水溶液(3x 200ml)和飽和的氯化鈉(2x 200ml)洗滌。將有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鎂干燥，過濾，并在真空下濃縮，得到56g(98.7％)粘性油，為所需產(chǎn)物1*，將其原樣用于下一個(gè)反應(yīng)。MS m/z 236.31(M+H)⁺(236.15，計(jì)算值)。

實(shí)施例2：3-(芐氧基羰基氨基)丙基-(2-羥基乙基)-二甲基-溴化銨(2*)的合成。

向N-[3-(二甲氨基)丙基]氨基甲酸芐基酯(1*，56g，0.237mol，實(shí)施例1)在乙腈中的約1M溶液中加入2-溴乙醇(32.58g，0.261mol)，并將該反應(yīng)混合物在室溫溫育，直至所有N-[3-(二甲氨基)丙基]氨基甲酸芐基酯被消耗(通過LC/MS和TLC監(jiān)測(cè))。向得到的3-(芐氧基羰基氨基)丙基-(2-羥基乙基)-二甲基-溴化銨溶液中加入5體積的甲基叔丁基醚。將該渾濁的混合溶液攪拌直至觀察到相分離。通過傾析將上層有機(jī)相與3-(芐氧基羰基氨基)丙基-(2-羥基乙基)-二甲基-溴化銨分離，并再重復(fù)沉淀另外三次。最后，在真空下抽出微量溶劑后得到目標(biāo)化合物，為粘性油狀物(76.7g，89.6％，為氫溴酸鹽)。通過LC/MS和TLC得知目標(biāo)產(chǎn)物2*為均質(zhì)的，并將其并未經(jīng)進(jìn)一步純化地用于磷酸化步驟。MS m/z 281.33M⁺(281.19，計(jì)算值)。

實(shí)施例3：6-(芐氧基羰基氨基)己酸(3*)的合成。

向細(xì)粉狀的6-氨基己酸(32.79g，0.25mol)在二氯甲烷(500ml)中的攪拌的混懸液中，加入三乙胺(63.24g，0.625mol)。然后，在劇烈攪拌下滴加三甲基氯硅烷(54.32g，0.5mol)，并將得到的混合物回流2h。然后將該反應(yīng)混合物在冰浴上冷卻，并加入氯甲酸芐基酯(95％，53.31g，0.313mol)。將得到的混合物在冰上攪拌60min，并在室溫?cái)嚢?h。除去溶劑后，將殘余物在1000ml 4％(v/w)碳酸氫鈉溶液和500ml甲基叔丁基醚之間分配。將水層分離，用2N鹽酸酸化至pH 2.0，并用乙酸乙酯萃取三次。將合并的有機(jī)層經(jīng)無水硫酸鎂干燥，過濾，并濃縮，得到澄清的油狀物(62.4g，94.1％)，為目標(biāo)羧酸3*，通過LC/MS和TLC檢測(cè)其是均質(zhì)的，并將其未經(jīng)進(jìn)一步純化地用于下一個(gè)步驟。MS m/z 265.33(M+1)⁺(265.13，計(jì)算值)。

實(shí)施例4：N-[6-[3-(二甲氨基)丙基氨基]-6-氧代-己基]氨基甲酸芐基酯(4*)的合成

向6-(芐氧基羰基氨基)己酸(3*，66.3g，0.25mol，實(shí)施例3)在干燥的二氯甲烷(500ml)中的溶液中加入催化量的二甲基甲酰胺(1.25ml)，并將該反應(yīng)混合物在冰/鹽浴上冷卻至0℃。緩慢加入草酰氯(38.08g，0.3mol)在二氯甲烷(150ml)中的溶液，同時(shí)保持該反應(yīng)混合物溫度為0℃。將該反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?h。在真空下蒸發(fā)揮發(fā)物，并將殘余物溶于干燥的二氯甲烷(500ml)中。將得到的溶液在冰/鹽浴上冷卻至0℃，在攪拌下滴加N,N-二甲基-1,3-丙二胺(25.55g，0.25mol)和三乙胺(55.65g，0.55mol)的混合物，并在2h的時(shí)間內(nèi)冷卻。將該反應(yīng)混合物攪拌6h，并通過TLC和LC-MS監(jiān)測(cè)該反應(yīng)過程。將沉淀過濾，用少量二氯甲烷洗滌。然后，將該二氯甲烷溶液依次用飽和的碳酸氫鈉、飽和的氯化鈉洗滌，經(jīng)無水硫酸鎂干燥，并濃縮，得到N-[6-[3-(二甲氨基)丙基氨基]-6-氧代-己基]氨基甲酸芐基酯(4*,76.4g，87.4％)，為澄清的微黃油狀物。將粗制的物質(zhì)經(jīng)LC/MS和TLC純化，并未經(jīng)進(jìn)一步純化地用于下一個(gè)步驟中。MS m/z249.13(M+1)⁺(349.24，計(jì)算值)。

實(shí)施例5：3-[6-(芐氧基羰基氨基)己酰氨基]丙基-(2-羥基乙基)-二甲基-溴化銨(5*)的合成。

向N-[6-[3-(二甲氨基)丙基氨基]-6-氧代-己基]氨基甲酸芐基酯(4*,56g，0.16mol，實(shí)施例4)在乙腈中的約1M溶液中加入2-溴乙醇(22.03g，0.176mol)，并將該反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柚敝了蠳-[6-[3-(二甲氨基)丙基氨基]-6-氧代-己基]氨基甲酸芐基酯被消耗(通過LC/MS和TLC監(jiān)測(cè))。向得到的3-[6-(芐氧基羰基氨基)己酰氨基]丙基-(2-羥基乙基)-二甲基-溴化銨溶液中加入5體積的甲基叔丁基醚。將該渾濁的混合物溶液攪拌直至觀察到相分離。通過傾析將上層有機(jī)相與3-[6-(芐氧基羰基氨基)己酰氨基]丙基-(2-羥基乙基)-二甲基-溴化銨分離，并再重復(fù)沉淀另外三次。最后，在真空下抽出微量溶劑后得到目標(biāo)化合物，為粘性油狀物(5*，66.3g，87.2％，為氫溴酸鹽)。通過LC/MS和TLC得知產(chǎn)物為均質(zhì)的，并將其并未經(jīng)進(jìn)一步純化地用于磷酸化步驟。MS m/z 394.1M⁺(394.27，計(jì)算值)。

實(shí)施例6：N-[2-(2-羥基乙氧基)乙基]氨基甲酸芐基酯(6*)的合成。

將2-(2-氨基乙氧基)乙醇(25.23g，0.240mol)溶于530mL在MeOH中的10％三乙胺(48ml，0.345mol三乙胺，480ml甲醇)中，并冷卻至0℃。立即加入全部氯甲酸芐基酯(工業(yè)級(jí)，95％，34.4ml，0.229mol)，并將該反應(yīng)混合物升溫至室溫。12h后，通過蒸發(fā)除去溶劑，并使用硅膠柱色譜純化產(chǎn)物(乙酸乙酯/己烷)，得到無色油狀物(6*，52g，0.163mol，95％基于氯甲酸芐基酯)。經(jīng)LC/MS和TLC分析得知粗制的物質(zhì)為分析純的，并未經(jīng)進(jìn)一步純化地用于下一個(gè)步驟中。MS m/z 239.17(M+1)⁺(239.12，計(jì)算值)。

實(shí)施例7：N-[6-[2-(2-羥基乙氧基)乙基氨基]-6-氧代-己基]氨基甲酸芐基酯(7*)的合成。

將亞磷酸三甲酯(12.5g，0.101mol)在二氯甲烷(290ml)中的溶液在冰/鹽浴上冷卻。然后，分批加入粉狀碘(25.6g，0.101mol)，同時(shí)將該反應(yīng)混合物溫度保持在0℃。在固體碘完全溶解后，相繼加入6-(芐氧基羰基氨基)己酸(3*,25.5g，0.096mol，實(shí)施例3)和三乙胺(23.3g，0.23mol)，并將得到的溶液在冷卻浴中在0℃攪拌20min。加入溶于二氯甲烷(50ml)中的2-(2-氨基乙氧基)乙醇(10.6g，0.101mol)，并將該反應(yīng)混合物在0℃攪拌30min。除去冷卻浴后，將該反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柽^夜。通過TLC和LC/MS監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。然后，將該反應(yīng)混合物依次用10％(v/w)硫酸氫鈉、飽和的氯化鈉、飽和的碳酸氫鈉洗滌，并經(jīng)無水硫酸鎂干燥。通過蒸發(fā)除去溶劑，并使用硅膠柱色譜純化產(chǎn)物(乙酸乙酯/己烷)，得到無色油狀物(34.7g，0.091mol，95.1％，基于6-(芐氧基羰基氨基)己酸)。將粗制的物質(zhì)7*經(jīng)LC/MS和TLC純化，并未經(jīng)進(jìn)一步純化地用于下一個(gè)步驟中。MS m/z 352.42(M+H)⁺(352.20，計(jì)算值)。

實(shí)施例8：甲磺酸2-[2-[6-(芐氧基羰基氨基)己酰氨基]乙氧基]乙基酯(8*)的合成。

在氬氣下將N-[6-[2-(2-羥基乙氧基)乙基氨基]-6-氧代-己基]氨基甲酸芐基酯(7*，17.25g，0.049mol，實(shí)施例7)在亞甲基氯(115ml)中的溶液在冰-鹽浴中冷卻至-5℃。加入三乙胺(8.2ml，0.059mol)，并將得到的溶液在-5℃攪拌10min。滴加甲磺酰氯(4.5ml，0.059mol)，同時(shí)將該反應(yīng)混合物溫度保持在0℃至-5℃。添加完成后，將該反應(yīng)混合物升溫至室溫。4h后，將該反應(yīng)混合物用水、飽和的氯化鈉洗滌，并再次用水洗滌。將有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，并在真空下濃縮。將粗制的物質(zhì)8*經(jīng)LC/MS和TLC純化，并未經(jīng)進(jìn)一步純化地用于下一個(gè)步驟中。MS m/z 430.52(M+H)⁺(430.18，計(jì)算值)。

實(shí)施例9：2-[2-[6-(芐氧基羰基氨基)己酰氨基]乙氧基]乙基-(2-羥基乙基)-二甲基-銨甲磺酸鹽(9*)的合成。

歷經(jīng)20-30分鐘向甲磺酸2-[2-[6-(芐氧基羰基氨基)己酰氨基]乙氧基]乙酯(8*，18.6g，0.043mol，實(shí)施例8)在乙腈中的1M溶液中加入2-(二甲氨基)乙醇(4.24g，0.048mol)。添加完成后，在持續(xù)攪拌下將得到的溶液回流直至所有的甲磺酸烷基酯被消耗。通過LC/MS和TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。12h后，將該反應(yīng)混合物冷卻，并在真空下蒸發(fā)乙腈。將得到的混合物溶于200ml熱的甲基叔丁基醚中。將該溶液緩慢冷卻至室溫，然后將其在0-5℃放置12h直至結(jié)晶完成?；厥占s19.7g(87.7％，為甲磺酸鹽)白色固體，為目標(biāo)醇9*。將粗制的物質(zhì)經(jīng)LC/MS和TLC純化，并未經(jīng)進(jìn)一步純化地用于下一個(gè)步驟中。MS m/z 424.55M⁺(424.28，計(jì)算值)。

實(shí)施例10：6-(1,3-二氧代異二氫吲哚-2-基)己酸(10*)的合成。

將6-氨基己酸(65.6g，0.5mol)、鄰苯二甲酸酐(74.1g，0.5mol)和乙酸(115ml)的攪拌的混合物加熱至回流達(dá)9h。通過過濾分離冷卻后結(jié)晶的產(chǎn)物，用水洗滌若干次，并在真空下在100℃干燥，得到124.2g(95.1％)的6-(1,3-二氧代異二氫吲哚-2-基)己酸10*，通過LC/MS和TLC得知其是均質(zhì)的，并未經(jīng)進(jìn)一步純化地用于下一個(gè)步驟中。MS m/z 261.24(M+H)⁺(261.10，計(jì)算值)。

實(shí)施例11：2-[2-(2-羥基乙氧基)乙基]異二氫吲哚-1,3-二酮(11*)的合成。

向裝備有機(jī)械攪拌器、氮?dú)膺M(jìn)氣口-排氣口和蓋有回流冷凝器的迪安斯達(dá)克分水器的1L三頸圓底燒瓶中加入鄰苯二甲酸酐(88.87g，0.6mol)和2-(2-氨基乙氧基)乙醇(63.08g，0.6mol)在甲苯(540ml)中的溶液。將該反應(yīng)混合物回流直至在迪安斯達(dá)克分水器中收集到1當(dāng)量的水(約24h)。24h后，在真空下除去甲苯，并將殘余物溶于乙酸乙酯(550ml)中，并依次用10％(v/w)硫酸氫鈉、飽和的氯化鈉、飽和的碳酸氫鈉洗滌，并經(jīng)無水硫酸鎂干燥。在真空下除去溶劑，并將殘余物從甲基叔丁基醚中結(jié)晶。回收約130g(92.1％)白色固體，為目標(biāo)醇11*。將粗制的物質(zhì)經(jīng)LC/MS和TLC純化，并未經(jīng)進(jìn)一步純化地用于下一個(gè)步驟中。MS m/z 235.27(M+H)⁺(235.08，計(jì)算值)。

實(shí)施例12：甲磺酸2-[2-(1,3-二氧代異二氫吲哚-2-基)乙氧基]乙酯(12*)的合成。

該實(shí)施例示例證明制備N-保護(hù)的2-(2-氨基乙氧基)乙醇的甲磺酸酯的方法。

在氬氣下將2-[2-(2-羥基乙氧基)乙基]異二氫吲哚-1,3-二酮(11*,47.05g，0.2mol，實(shí)施例11)在亞甲基氯(300ml)中的溶液在冰-鹽浴中冷卻至-5℃。加入三乙胺(33.4ml，0.24mol)，并將得到的溶液在-5℃攪拌10min。滴加甲磺酰氯(18.6ml，0.24mol)，同時(shí)將該反應(yīng)混合物的溫度保持在0℃至-5℃。添加完成后，將該反應(yīng)混合物升溫至室溫。4h后，將該反應(yīng)混合物用水、飽和的氯化鈉洗滌，并再次用水洗滌。將有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，并在真空下濃縮。將粗制的物質(zhì)經(jīng)LC/MS和TLC純化，并未經(jīng)進(jìn)一步純化地用于下一個(gè)步驟中。MS m/z 313.17(M+H)⁺(313.06，計(jì)算值)。

實(shí)施例13：2-[2-(1,3-二氧代異二氫吲哚-2-基)乙氧基]乙基-(2-羥基乙基)-二甲基-銨甲磺酸鹽(13*)的合成。

歷經(jīng)20-30分鐘向甲磺酸2-[2-(1,3-二氧代異二氫吲哚-2-基)乙氧基]乙酯(12*，32.53g，0.104mol，實(shí)施例12)在乙腈中的約1M溶液中加入2-(二甲氨基)乙醇(10.18g，0.114mol)。添加完成后，在持續(xù)攪拌下將得到的溶液回流直至所有的甲磺酸烷基酯被消耗。通過LC/MS和TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。12h后，將該反應(yīng)混合物冷卻，并在真空下蒸發(fā)乙腈。將得到的混合物溶于150ml熱乙腈中，隨后向得到的溶液中加入200ml熱甲基叔丁基醚。將該溶液緩慢冷卻至室溫，然后將其在0-5℃放置過夜直至完成結(jié)晶?；厥占s50.7g(92.6％，為甲磺酸鹽)白色固體。將對(duì)應(yīng)于目標(biāo)化合物13*的粗制的物質(zhì)經(jīng)LC/MS和TLC純化，并未經(jīng)進(jìn)一步純化地用于下一個(gè)步驟中。MS m/z 307.07M⁺(307.17，計(jì)算值)。

實(shí)施例14：2-[2-(1,3-二氧代異二氫吲哚-2-基)乙氧基]乙基-(3-羥基丙基)-二甲基-銨甲磺酸鹽(14*)的合成。

向甲磺酸2-[2-(1,3-二氧代異二氫吲哚-2-基)乙氧基]乙酯(12*，30.41g，0.097mol，實(shí)施例12)在乙腈中的約1M溶液中加入3-(二甲氨基)丙-1-醇(11.01g，0.107mol)。在20-30分鐘之間的某個(gè)時(shí)間加入3-(二甲氨基)丙-1-醇。當(dāng)加入所有物料，將得到的溶液在持續(xù)攪拌下回流直至所有的甲磺酸烷基酯被消耗。通過LC/MS和TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。12h后，將該反應(yīng)混合物冷卻，并在真空下蒸發(fā)乙腈。將得到的混合物溶于120ml熱乙腈中，隨后向得到的溶液中加入200ml熱的甲基叔丁基醚。將該溶液緩慢冷卻至室溫，然后將其在0-5℃放置過夜直至結(jié)晶完成。回收約46.1g(88.1％)白色固體。將對(duì)應(yīng)于目標(biāo)化合物14*的粗制的物質(zhì)經(jīng)LC/MS和TLC純化，并未經(jīng)進(jìn)一步純化地用于下一個(gè)步驟中。MS m/z 321.11M⁺(321.18，計(jì)算值)。

實(shí)施例15：Sepharose 6B的環(huán)氧-活化。

將Sepharose 6B(GE Healthcare Life Sciences)在玻璃過濾器-漏斗用3x 1000ml部分的水洗滌，并吸干。然后將100克吸干的Sepharose 6B與100ml的1,4-丁二醇二環(huán)氧甘油醚(CAS N°2425-79-8)和每毫升含2mg硼氫化鈉的100ml的0.6M氫氧化鈉溶液混合。將該混懸液在室溫通過旋轉(zhuǎn)混合8h，并通過在玻璃過濾器-漏斗用10x 400ml部分的熱(40–60℃)水洗滌凝膠停止該反應(yīng)。該凝膠的環(huán)氧乙烷含量為67μmol/g吸干的凝膠。

實(shí)施例16：用于測(cè)定環(huán)氧-基數(shù)量的測(cè)試。

將環(huán)氧-活化的Sepharose 6B與巰基乙酸反應(yīng)，并根據(jù)Scoble,JA和Scopes,RK Journal of Chromatography A,1996,752,67中所述的方法通過滴定測(cè)定引入的酸基數(shù)量。

實(shí)施例17：疊氮化物-官能化的Sepharose 6B的合成

將10克吸干的環(huán)氧-活化的Sepharose 6B(實(shí)施例15)加入50ml疊氮化鈉在水中的1M溶液中。在室溫將該混合物在實(shí)驗(yàn)室旋轉(zhuǎn)式混合機(jī)上溫育24h。將該凝膠用4x 100ml水洗滌，并保持在20％(v/v)乙醇中至進(jìn)一步使用。

實(shí)施例18：用于測(cè)定疊氮基-基團(tuán)數(shù)量的測(cè)試。

通過與DTT反應(yīng)將疊氮基Sepharose 6B的疊氮基定量還原為氨基(Handlon、AL和Oppenheimer,NJ,Pharmaceutical Research 1988,5,297)，并根據(jù)公開的方法用TNBS量化得到的氨基(Antoni,G等人Analytical Biochemistry 1983,129,60)。該方法基于基質(zhì)與過量的2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)的反應(yīng)和隨后通過與甘氨酸反應(yīng)對(duì)未反應(yīng)的TNBS的定量測(cè)定。

實(shí)施例19：通過分光光度法測(cè)定游離的伯氨基。

使用在L-谷氨酸與鄰苯二醛、N-乙?；?L-半胱氨酸在室溫和pH 9.5反應(yīng)后生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線直接測(cè)量伯氨基的量(Medina Hernandez,MJ等人Microchemical Journal 1990,42,288)。N-乙酰基-L-半胱氨酸衍生物是高度穩(wěn)定的，且不需要反應(yīng)時(shí)間的嚴(yán)格限制(不同于2-巰基乙醇)。發(fā)現(xiàn)335nm處的UV吸光度與氨基-基團(tuán)的濃度呈線性關(guān)系。

實(shí)施例20：通過分光光度法測(cè)定游離的仲氨基。

使用化合物的該基團(tuán)與硝普鈉和乙醛的反應(yīng)直接定量評(píng)估仲氨基的量(Lin,CML和Wagner,C Analytical Biochemistry 1974,60,278)。

實(shí)施例21：磷酸單2-[3-氨基丙基(二甲基)銨基]乙酯在環(huán)氧-活化的Sepharose 6B(分離材料1)上的固定。

磷酸化。

向保持在0℃至-10℃的磷酰氯(3.7g)在干燥的乙腈中的0.2M溶液中加入三乙胺(2.68g)。加入三乙胺后，歷經(jīng)30min滴加3-(芐氧基羰基氨基)丙基-(2-羥基乙基)-二甲基-溴化銨(2*，5.81g，實(shí)施例2)的約0.2M溶液，同時(shí)將該反應(yīng)混合物的溫度保持在0℃至-5℃。添加完成后，將該混懸液在室溫再溫育24h。通過LC/MS和TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。將該鹽酸三乙胺沉淀過濾，并在攪拌下向得到的溶液中加入水(1.8ml)，同時(shí)將溫度保持在0-5℃。在真空下除去水-溶劑混合物，得到磷酸化產(chǎn)物，其純度足夠進(jìn)行之后的脫保護(hù)和固定。

保護(hù)基團(tuán)裂解。

在25℃向以上磷酸化產(chǎn)物在水(50ml)中的攪拌的溶液中加入10％活性炭載鈀(10mol％)。將得到的混合物在25℃在H₂(1atm)下攪拌24h，然后過濾。將催化劑用水(2x 10ml)洗滌，并將該澄清的溶液減壓濃縮，過濾后得到具有高純度的磷酸單2-[3-氨基丙基(二甲基)銨基]乙酯。

固定。

將20克吸干的環(huán)氧-活化的Sepharose 6B(實(shí)施例15)加入磷酸單2-[3-氨基丙基(二甲基)銨基]乙酯的溶液(40ml)中。用1M氫氧化鈉溶液將得到的混懸液的pH調(diào)節(jié)至11.0。將該混合物在室溫在實(shí)驗(yàn)室旋轉(zhuǎn)式混合機(jī)溫育24h。將該凝膠用4x 100ml高壓滅菌的水洗滌，并保持在20％(v/v)乙醇中直至進(jìn)一步使用。

實(shí)施例22：磷酸單2-[3-(6-氨基己酰氨基)丙基-二甲基-銨基]乙酯在環(huán)氧-活化的Sepharose 6B(分離材料2)上的固定。

磷酸化。

向保持在0℃至-10℃的磷酰氯(3.7g)在干燥的乙腈中的約0.2M溶液中加入三乙胺(2.68g)。加入三乙胺后，歷經(jīng)30min的時(shí)間滴加3-[6-(芐氧基羰基氨基)己酰氨基]丙基-(2-羥基乙基)-二甲基-溴化銨(5*，7.63g，實(shí)施例5)的約0.2M溶液，同時(shí)將該反應(yīng)混合物的溫度保持在0℃至-5℃。添加完成后，將該混懸液在室溫再溫育24h。通過LC/MS和TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。將該鹽酸三乙胺沉淀過濾，并在攪拌下向得到的溶液中加入水(1.8ml)，同時(shí)將溫度保持在0-5℃。在真空下除去水-溶劑混合物，得到磷酸化產(chǎn)物，其純度足夠進(jìn)行之后的脫保護(hù)和固定。

保護(hù)基團(tuán)裂解。

在25℃向以上磷酸化產(chǎn)物在水(50ml)中的攪拌的溶液中加入10％活性炭載鈀(10mol％)。將得到的混合物在25℃在H₂(1atm)下攪拌24h，然后過濾。將催化劑用水(2x 10ml)洗滌，并將該澄清的溶液減壓濃縮，過濾后得到具有高純度的磷酸單2-[3-氨基丙基(二甲基)銨基]乙酯。

固定。

將20克吸干的環(huán)氧-活化的Sepharose 6B(實(shí)施例15)加入磷酸單2-[3-(6-氨基己酰氨基)丙基-二甲基-銨基]乙酯的溶液(40ml)中。用1M氫氧化鈉溶液將得到的混懸液的pH調(diào)節(jié)至11.0。將該混合物在室溫在實(shí)驗(yàn)室旋轉(zhuǎn)式混合機(jī)溫育24h。將該凝膠用4x 100ml高壓滅菌的水洗滌，并保持在20％(v/v)乙醇中直至進(jìn)一步使用。

實(shí)施例23：磷酸單2-[2-[2-(6-氨基己酰氨基)乙氧基]乙基-二甲基-銨基]乙酯在環(huán)氧-活化的Sepharose 6B(分離材料3)上的固定。

磷酸化。

向保持在0℃至-10℃的磷酰氯(3.7g)在干燥的乙腈中的約0.2M溶液中加入三乙胺(2.68g)。加入三乙胺后，歷經(jīng)30min的時(shí)間滴加2-[2-[6-(芐氧基羰基氨基)己酰氨基]乙氧基]乙基-(2-羥基乙基)-二甲基-銨甲磺酸鹽(9*，8.36g，實(shí)施例9)的約0.2M溶液，同時(shí)將該反應(yīng)混合物的溫度保持在0℃至-5℃。添加完成后，將該混懸液在室溫再溫育24h。通過LC/MS和TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。將該鹽酸三乙胺沉淀過濾，并在攪拌下向得到的溶液中加入水(1.8ml)，同時(shí)將溫度保持在0-5℃。在真空下除去水-溶劑混合物，得到磷酸化產(chǎn)物，其純度足夠進(jìn)行之后的脫保護(hù)和固定。

保護(hù)基團(tuán)裂解。

在25℃向以上磷酸化產(chǎn)物在水(50ml)中的攪拌的溶液中加入10％活性炭載鈀(10mol％)。將得到的混合物在25℃在H₂(1atm)下攪拌24h，然后過濾。將催化劑用水(2x 10ml)洗滌，并將該澄清的溶液減壓濃縮，過濾后得到具有高純度的磷酸單2-[3-氨基丙基(二甲基)銨基]乙酯。

固定。

將20克吸干的環(huán)氧-活化的Sepharose 6B(實(shí)施例15)加入磷酸單2-[2-[2-(6-氨基己酰氨基)乙氧基]乙基-二甲基-銨基]乙酯的溶液(40ml)中。用1M氫氧化鈉溶液將得到的混懸液的pH調(diào)節(jié)至11.0。將該混合物在室溫在實(shí)驗(yàn)室旋轉(zhuǎn)式混合機(jī)溫育24h。將該凝膠用4x 100ml高壓滅菌的水洗滌，并保持在20％(v/v)乙醇中直至進(jìn)一步使用。

實(shí)施例24：磷酸單2-[2-(2-氨基乙氧基)乙基-二甲基-銨基]乙酯在環(huán)氧-活化的Sepharose 6B(分離材料4)上的固定。

磷酸化。

向保持在0℃至-10℃的磷酰氯(3.7g)在干燥的乙腈中的約0.2M溶液中加入三乙胺(2.68g)。加入三乙胺后，歷經(jīng)30min的時(shí)間滴加2-[2-(1,3-二氧代異二氫吲哚-2-基)乙氧基]乙基-(2-羥基乙基)-二甲基-銨甲磺酸鹽(6.47g，實(shí)施例13)的約0.2M溶液，同時(shí)將該反應(yīng)混合物的溫度保持在0℃至-5℃。添加完成后，將該混懸液在室溫再溫育24h。通過LC/MS和TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。將該鹽酸三乙胺沉淀過濾，并在攪拌下向得到的溶液中加入水(1.8ml)，同時(shí)將溫度保持在0-5℃。在真空下除去水-溶劑混合物，得到磷酸化產(chǎn)物，其純度足夠進(jìn)行之后的脫保護(hù)和固定。

保護(hù)基團(tuán)裂解。

向以上磷酸化產(chǎn)物在水(50ml)中的攪拌的溶液中加入1M氫氧化鈉直至該溶液的pH達(dá)到11.5。將得到的混合物在25℃攪拌1h，然后加入6M鹽酸直至該溶液的pH達(dá)到2。將得到的混合物在25℃攪拌12h，然后將該反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)至7。

固定。

將20克吸干的環(huán)氧-活化的Sepharose 6B(實(shí)施例15)加入磷酸單2-[2-(2-氨基乙氧基)乙基-二甲基-銨基]乙酯的溶液(40ml)中。用1M氫氧化鈉溶液將得到的混懸液的pH調(diào)節(jié)至11.0。將該混合物在室溫在實(shí)驗(yàn)室旋轉(zhuǎn)式混合機(jī)溫育24h。將該凝膠用4x 100ml高壓滅菌的水洗滌，并保持在20％(v/v)乙醇中直至進(jìn)一步使用。

實(shí)施例25：磷酸單3-[2-(2-氨基乙氧基)乙基-二甲基-銨基]丙酯在環(huán)氧-活化的Sepharose 6B(分離材料5)上的固定。

磷酸化。

向保持在0℃至-10℃的磷酰氯(3.7g)在干燥的乙腈中的約0.2M溶液中加入三乙胺(2.68g)。加入三乙胺后，歷經(jīng)30min的時(shí)間滴加2-[2-(1,3-二氧代異二氫吲哚-2-基)乙氧基]乙基-(3-羥基丙基)-二甲基-銨甲磺酸鹽(14*，6.7g，實(shí)施例14)的約0.2M溶液，同時(shí)將該反應(yīng)混合物的溫度保持在0℃至-5℃。添加完成后，將該混懸液在室溫再溫育24h。通過LC/MS和TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。將該鹽酸三乙胺沉淀過濾，并在攪拌下向得到的溶液中加入水(1.8ml)，同時(shí)將溫度保持在0-5℃。在真空下除去水-溶劑混合物，得到磷酸化產(chǎn)物，其純度足夠進(jìn)行之后的脫保護(hù)和固定。

保護(hù)基團(tuán)裂解。

向以上磷酸化產(chǎn)物在水(50ml)中的攪拌的溶液中加入1M氫氧化鈉直至該溶液的pH達(dá)到11.5。將得到的混合物在25℃攪拌1h，然后加入6M鹽酸直至該溶液的pH達(dá)到2。將得到的混合物在25℃攪拌12h，然后將該反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)至7。

固定。

將20克吸干的環(huán)氧-活化的Sepharose 6B(實(shí)施例15)加入磷酸單3-[2-(2-氨基乙氧基)乙基-二甲基-銨基]丙酯的溶液(40ml)中。用1M氫氧化鈉溶液將得到的混懸液的pH調(diào)節(jié)至11.0。將該混合物在室溫在實(shí)驗(yàn)室旋轉(zhuǎn)式混合機(jī)溫育24h。將該凝膠用4x 100ml高壓滅菌的水洗滌，并保持在20％(v/v)乙醇中直至進(jìn)一步使用。

實(shí)施例26：對(duì)比實(shí)施例

磷酸(4-氨基苯基)2-(三甲基銨基)乙酯在環(huán)氧-活化的Sepharose6B(分離材料6)上的固定。

固定。

將20克吸干的環(huán)氧-活化的Sepharose 6B(實(shí)施例15)加入磷酸(4-氨基苯基)2-(三甲基銨基)乙酯的溶液中(4.41g，在40ml水中)。用1M氫氧化鈉溶液將得到的混懸液的pH調(diào)節(jié)至11.5。將該混合物在室溫在實(shí)驗(yàn)室旋轉(zhuǎn)式混合機(jī)溫育24h。將該凝膠用4x 100ml高壓滅菌的水洗滌，并保持在20％(v/v)乙醇中直至進(jìn)一步使用。

實(shí)施例27：親和力的測(cè)定

結(jié)合和洗滌緩沖液：100mM Tris、pH 8,0、200mM氯化鈉、2mM氯化銨。

洗脫緩沖液：100mM Tris、pH 8,0、200mM氯化鈉、2mM EDTA。

所有色譜操作在室溫進(jìn)行。

將0.5g的各分離材料裝入小柱中，并用12樹脂床體積(6ml)的結(jié)合緩沖液平衡。將40–50ml人血清或血漿(CRP>0.1mg/ml)以1.2ml/min施加至各柱。用60樹脂床體積的結(jié)合緩沖液(30ml)將未結(jié)合材料洗掉，直至OD₂₈₀讀數(shù)接近0基線。用洗脫緩沖液以1,2ml/min的速度洗脫親和性樹脂結(jié)合的蛋白質(zhì)，并收集3.6ml級(jí)分。將收集的級(jí)分在4℃儲(chǔ)存至SDS-PAGE測(cè)試。通過ELISA進(jìn)行人C反應(yīng)蛋白(CRP)的定量測(cè)定。

將結(jié)果在表1中總結(jié)。

表1。