本發(fā)明涉及含有5-氨基乙酰丙酸類或其鹽(ALA類)的受精卵正常發(fā)育率提高劑、用于提高受精卵正常發(fā)育率的試劑盒、使受精卵與ALA類接觸以提高受精卵正常發(fā)育率的方法、用于提高受精卵正常發(fā)育率的ALA類、用于配制受精卵正常發(fā)育率提高劑的ALA類的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：對(duì)具有優(yōu)良遺傳性狀的雌性牲畜的卵子用同樣具有優(yōu)良遺傳性狀的雄性牲畜的精子進(jìn)行授精，將受精卵進(jìn)行體外培養(yǎng)之后移植到其它雌性牲畜(受體)的子宮內(nèi)，這種胚胎移植技術(shù)作為高效生產(chǎn)良種家畜和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的技術(shù)被廣泛應(yīng)用。例如，體內(nèi)受精卵移植和體外受精卵移植都被廣泛施行，所謂體內(nèi)受精卵移植是指將取自供體(提供受精卵的動(dòng)物)的受精卵移植到經(jīng)過(guò)同期發(fā)情處理即通過(guò)激素處理等使其處于擬妊娠狀態(tài)的受體(接受受精卵的動(dòng)物)，使之妊娠、產(chǎn)仔；而體外受精卵移植則是，從已在食肉處理場(chǎng)判定肉質(zhì)等好壞后的家畜的卵巢取出未成熟卵子，在體外進(jìn)行卵子的成熟、受精、發(fā)育培養(yǎng)，使用這樣得到的處于可進(jìn)行子宮內(nèi)移植狀態(tài)的受精卵。對(duì)于人而言，在1978年報(bào)道了Edwards博士和Steptoe博士成功進(jìn)行體外受精(IVF)-胚胎移植(ET)，即在體外培養(yǎng)液內(nèi)使卵子與精子受精，然后將經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)的胚胎移植到子宮內(nèi)(參照例如非專利文獻(xiàn)1)。進(jìn)而，作為用于人體外受精的培養(yǎng)基，具有與受精時(shí)人輸卵管液的電解質(zhì)組成近似的組成的HTF培養(yǎng)基(HumanTubalFluidMedium)被開發(fā)了出來(lái)(參照例如非專利文獻(xiàn)2)，以此為開端，人們開始研究體外受精用培養(yǎng)基，用以代替此前一直使用的HamF-10培養(yǎng)基等通用性培養(yǎng)基。關(guān)于體外受精用培養(yǎng)基，有下列各種方案：含有絲膠，能夠培養(yǎng)體內(nèi)人工授精所得胚胎或體外受精所得胚胎的人工受精用培養(yǎng)基組合物(參照例如專利文獻(xiàn)1)；含有葉黃素的人工受精用培養(yǎng)基組合物(參照例如專利文獻(xiàn)2)；含有丙酮酸或乳酸或它們的鹽以及牛磺酸或其前體作為必要成分的豬胚胎的體外培養(yǎng)用培養(yǎng)基(參照例如專利文獻(xiàn)3)；提高哺乳動(dòng)物受精卵發(fā)育率的方法，該方法在哺乳動(dòng)物受精卵的發(fā)育培養(yǎng)基中添加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，實(shí)施與飼養(yǎng)層細(xì)胞(支持細(xì)胞)的共培養(yǎng)，由此提高受精卵的正常發(fā)育率(參照例如專利文獻(xiàn)4)；含有氨基酸的體外受精用培養(yǎng)基組合物，該組合物實(shí)質(zhì)上不含L-谷氨酰胺或其能水解生成L-谷氨酰胺的衍生物(參照例如專利文獻(xiàn)5)；可用于哺乳類卵子或初期胚胎的培養(yǎng)或者精子的配制或培養(yǎng)的體外受精用培養(yǎng)基組合物，該組合物含有游離形式或藥理學(xué)上可接受的鹽的形式的卵泡液所含的21種氨基酸或能水解生成這類氨基酸的它們的衍生物(參照例如專利文獻(xiàn)6)；牛受精卵的無(wú)血清體外培養(yǎng)用培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由含有乳酸或其可溶性鹽、丙酮酸或其可溶性鹽、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和腫瘤生長(zhǎng)因子-β1的低葡萄糖濃度TCM199培養(yǎng)基構(gòu)成(參照例如專利文獻(xiàn)7)；對(duì)雄性的精子或雌性的卵子或者由它們形成的受精卵進(jìn)行磁力作用，由此提高受孕率的方法(參照例如專利文獻(xiàn)8)等。此外，作為上述IVF法的一種模式，開發(fā)出了使用精子注入用移液管吸取精子并注入卵細(xì)胞質(zhì)中的卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)精子注入法(intracytoplasmicsperminjection：ICSI)。該方法只要有一個(gè)精子就能高效獲得受精卵，因此對(duì)以嚴(yán)重少精癥為首的男性不孕導(dǎo)致的不孕有效。象這樣，在體外進(jìn)行受精卵培養(yǎng)已成為常用手段，但被培養(yǎng)的受精卵未到胚泡階段而在桑椹胚以前就停止發(fā)育的比率已知很高。關(guān)于其原因，雖然有人提出是多種因素導(dǎo)致初期發(fā)育停止的，但并不確曉其機(jī)理。例如，人體外受精的妊娠率占全部體外受精數(shù)的約20-25％,到出生則更是只有5-15％，還有報(bào)道指出，體外培養(yǎng)牛的受精卵時(shí)，從8細(xì)胞期到16細(xì)胞期發(fā)育頻繁停止(參照例如非專利文獻(xiàn)3)。另一方面，已知5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)是動(dòng)物、植物、菌類中廣泛存在的四吡咯生物合成過(guò)程的中間體，通?？赏ㄟ^(guò)5-氨基乙酰丙酸合成酶由丁二酰CoA與甘氨酸生物合成。還開發(fā)出了使用5-ALA的光動(dòng)力療法(光線力學(xué)的療法又は光動(dòng)力學(xué)的治療，ALA-PDT)，該療法因侵襲性低，能維持生活質(zhì)量(QOL)而受到注意，報(bào)道有使用ALA等的腫瘤診斷、治療劑等。另外，還已知5-ALA可用作成人病、癌癥、男性不孕的預(yù)防改善劑或治療劑(參照例如專利文獻(xiàn)9-11)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:特開2012-105585號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:特開2010-187629號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3:特開2003-024055號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4:特開2002-272315號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5:特開2001-017160號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6:特開平09-070240號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7:特開平08-289779號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)8:特開平06-189650號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)9:國(guó)際公開WO2010/050179號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)10:特開2011-16753號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)11:國(guó)際公開WO2009/139156號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1：日醫(yī)大志,第66卷，第1號(hào)45-48頁(yè)非專利文獻(xiàn)2：Quinn,P.J.etal.，F(xiàn)ertilityandSterility，44,493-498,1985非專利文獻(xiàn)3：Wrightetal.,J.Anim.Sci.，53，702-729,1981發(fā)明簡(jiǎn)述發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的課題在于提供一種體外培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基能使受精卵的體外培養(yǎng)正常進(jìn)行至胚泡階段，而不會(huì)發(fā)育停止。用以解決課題的方法本發(fā)明者們?yōu)榻鉀Q上述課題，使用各種培養(yǎng)基成分進(jìn)行了深入研究，實(shí)際將小鼠的受精卵在添加了5-ALA的體外培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提高了受精卵的正常發(fā)育率，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明為下列各項(xiàng)。(1)受精卵正常發(fā)育率提高劑，其特征在于含有下式(I)所示化合物或其鹽；[化1](式中R1表示氫原子或?；?，R2表示氫原子、直鏈或支鏈烷基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基)(2)上述(1)所記載的受精卵正常發(fā)育率提高劑，其特征在于R1和R2為氫原子；(3)上述(1)或(2)所記載的受精卵正常發(fā)育率提高劑，其特征在于還含有鐵化合物；(4)上述(3)所記載的受精卵正常發(fā)育率提高劑，其特征在于所述鐵化合物為一種或多種選自下列的化合物：氯化鐵、三氧化二鐵、硫酸鐵、焦磷酸亞鐵、檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵鈉、檸檬酸亞鐵鈉、檸檬酸鐵銨、焦磷酸鐵、乳酸鐵、葡萄糖酸亞鐵、二乙烯三胺五乙酸鐵鈉、二乙烯三胺五乙酸鐵銨、乙二胺四乙酸鐵鈉、乙二胺四乙酸鐵銨、二羧甲基谷氨酸鐵鈉、二羧甲基谷氨酸鐵銨、富馬酸亞鐵、乙酸鐵、草酸鐵、琥珀酸亞鐵、琥珀酸檸檬酸鐵鈉、血紅素鐵、葡聚糖鐵、三乙烯四胺鐵、乳鐵蛋白鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵、鐵葉綠酸鈉、鐵蛋白鐵、含糖氧化鐵和硫化甘氨酸鐵；(5)上述(1)-(4)任一項(xiàng)所記載的受精卵正常發(fā)育率提高劑，其特征在于能夠提高受孕率；(6)上述(1)-(5)任一項(xiàng)所記載的受精卵正常發(fā)育率提高劑，其特征在于所述受精卵是通過(guò)體外受精或體內(nèi)受精所獲得的受精卵；(7)上述(1)-(6)任一項(xiàng)所記載的受精卵正常發(fā)育率提高劑，其特征在于該提高劑是用于提高受精卵發(fā)育率的培養(yǎng)基，其還含有哺乳動(dòng)物受精卵的體外培養(yǎng)基；(8)提高受精卵正常發(fā)育率的方法，其特征在于使受精卵與上述(1)-(7)任一項(xiàng)所記載的受精卵正常發(fā)育率提高劑接觸；(9)提高受精卵正常發(fā)育率的方法，其特征在于將上述(1)-(7)任一項(xiàng)所記載的受精卵正常發(fā)育率提高劑給予對(duì)象母本(雌親)；(10)用于提高受精卵正常發(fā)育率的試劑盒，該試劑盒包含：a)上式(I)所示化合物或其鹽、以及b)鐵化合物；(11)上述(10)所記載的用于提高受精卵正常發(fā)育率的試劑盒，其特征在于該試劑盒還包含：c)哺乳動(dòng)物受精卵的體外培養(yǎng)基；(12)上式(I)所示化合物或其鹽用于配制受精卵正常發(fā)育率提高劑的應(yīng)用；(13)上述(12)所記載的應(yīng)用，其特征在于使用式(I)所示化合物或其鹽與鐵化合物；(14)上述(13)所記載的應(yīng)用，其特征在于使用式(I)所示化合物或其鹽與鐵化合物以及哺乳動(dòng)物受精卵的體外培養(yǎng)基；(15)用于提高受精卵正常發(fā)育率的上述式(1)所示化合物或其鹽。發(fā)明效果本發(fā)明可以提高人或牲畜的人工授精的發(fā)育率和受孕率、自然妊娠的受孕率，能夠提高家畜繁殖的生產(chǎn)能力、品種改良的效率。附圖簡(jiǎn)述圖1為C57BL/6J系的受精卵的發(fā)育率圖，該圖中，對(duì)各個(gè)階段正常發(fā)育的胚胎數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，以0小時(shí)的受精卵數(shù)為100％計(jì)；圖2為C57BL/6J系的受精卵的發(fā)育率圖，該圖中，對(duì)各個(gè)階段正常發(fā)育的胚胎數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，以受精卵培養(yǎng)開始后24小時(shí)之后的2細(xì)胞期的卵數(shù)為100％計(jì)；圖3為BDF2系雌性小鼠與BDF1系雄性小鼠交配得到的受精卵的發(fā)育率圖，該圖中，以0小時(shí)的受精卵數(shù)為100％計(jì)；圖4為BDF2系雌性小鼠與BDF1系雄性小鼠交配得到的受精卵的發(fā)育率圖，該圖中，對(duì)各個(gè)階段正常發(fā)育的胚胎數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，以受精卵培養(yǎng)開始后24小時(shí)之后的2細(xì)胞期的卵數(shù)為100％計(jì)；圖5是在KSOM中以受精卵(0小時(shí))的數(shù)為100％計(jì)時(shí)發(fā)育率的經(jīng)時(shí)變化圖(自然交配受精卵)；圖6是在KSOM中以受精后24小時(shí)之后的2細(xì)胞期的胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)發(fā)育率的經(jīng)時(shí)變化圖(自然交配受精卵)；圖7是在mWM中以受精卵(0小時(shí))的數(shù)為100％計(jì)時(shí)發(fā)育率的經(jīng)時(shí)變化圖(自然交配受精卵)；圖8是在mWM中以受精后24小時(shí)之后的2細(xì)胞期的胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)發(fā)育率的經(jīng)時(shí)變化圖(自然交配受精卵)；圖9是在KSOM中以受精后24小時(shí)之后的2細(xì)胞期的胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)育率的影響圖(體外受精卵)；圖10是在mWM中以受精后24小時(shí)之后的2細(xì)胞期的胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)育率的影響圖(體外受精卵)；圖11是在KSOM中35℃培養(yǎng)條件下，以受精后24小時(shí)之后的2細(xì)胞期胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)發(fā)育率的經(jīng)時(shí)變化圖(體外受精卵)；圖12是在mWM中35.5℃培養(yǎng)條件下，以受精后24小時(shí)之后的2細(xì)胞期胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)發(fā)育率的經(jīng)時(shí)變化圖(體外受精卵)；圖13是在mWM中35℃培養(yǎng)條件下，以受精后24小時(shí)之后的2細(xì)胞期胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)發(fā)育率的經(jīng)時(shí)變化圖(體外受精卵)。發(fā)明的實(shí)施方式本發(fā)明的受精卵正常發(fā)育率提高劑，只要含有上式(I)所示化合物或其鹽(以下統(tǒng)稱為“ALA類”)即可，對(duì)其并沒(méi)有特別限定，可以是包含哺乳動(dòng)物受精卵體外培養(yǎng)基的適用于人工授精的受精卵發(fā)育率提高用培養(yǎng)基，另外優(yōu)選除ALA類外還含有鐵化合物，進(jìn)一步優(yōu)選能夠提高受孕率。作為本發(fā)明中受精卵來(lái)源的生物物種，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，例如人、猴、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、天竺鼠、牛、豬、馬、兔、綿羊、山羊、貓、狗等。上述ALA類中，優(yōu)選例如式(I)的R1和R2同為氫原子時(shí)的5-ALA或其鹽。5-ALA也被稱為δ-氨基乙酰丙酸，是氨基酸的一種。作為5-ALA衍生物，可以例舉式(I)中R1為氫原子或?；⑹?I)中R2為氫原子、直鏈或支鏈烷基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基的5-ALA以外的化合物。作為式(I)中的酰基，可以例舉甲?；⒁阴；⒈；?、丁?；?、異丁酰基、戊?；愇祯；?、新戊?；?、己?；⑿刘；?、芐基羰基等直鏈或支鏈狀碳原子數(shù)為1-8的鏈烷?；?；苯甲?；?、1-萘酰基、2-萘?；忍荚訑?shù)為7-14的芳?；Ｗ鳛槭?I)中的烷基，可以例舉甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等直鏈或支鏈狀碳原子數(shù)為1-8的烷基。作為式(I)中的環(huán)烷基，可以例舉環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)十二烷基、1-環(huán)己烯基等飽和或者可存在部分不飽和鍵的碳原子數(shù)為3-8的環(huán)烷基。作為式(I)中的芳基，可以例舉苯基、萘基、蒽基、菲基等碳原子數(shù)為6-14的芳基。作為式(I)中的芳烷基，芳基部分可以例舉與上述芳基相同的例子，烷基部分可以例舉與上述烷基相同的例子，具體例如苯甲基、苯乙基、苯丙基、苯丁基、二苯甲基、三苯甲基、萘甲基、萘乙基等碳原子數(shù)為7-15的芳烷基。作為上述5-ALA衍生物,優(yōu)選上述R1為甲?；⒁阴；?、丙?；?、丁?；鹊幕衔?，上述R2為甲基、乙基、丙基、丁基、戊基等的化合物，上述R1與R2的組合可優(yōu)選例舉甲?；c甲基、乙?；c甲基、丙酰基與甲基、丁?；c甲基、甲?；c乙基、乙?；c乙基、丙酰基與乙基、丁?；c乙基的組合等。ALA類只要在生物體內(nèi)以式(I)的5-ALA或其衍生物的狀態(tài)作為有效成分發(fā)揮作用，根據(jù)給予形態(tài)，可以是為提高溶解性的各種鹽，也可以是在生物體內(nèi)能經(jīng)酶分解的前藥(前體)形式的酯給予。例如，作為5-ALA及其衍生物的鹽，可以是藥理學(xué)上容許的酸加成鹽、金屬鹽、銨鹽、有機(jī)胺加成鹽等。作為酸加成鹽，可以例舉鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽等各種無(wú)機(jī)酸鹽，甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、甲苯磺酸鹽、琥珀酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、乙醇酸鹽、甲磺酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、蘋果酸鹽等各種有機(jī)酸加成鹽。作為金屬鹽，可以例舉鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽等各種堿金屬鹽，鎂鹽、鈣鹽等各種堿土金屬鹽，鋁、鋅等各種金屬鹽。作為銨鹽，可以例舉銨鹽、四甲基銨鹽等烷基銨鹽等。作為有機(jī)胺鹽,可以例舉三乙胺鹽、哌啶鹽、嗎啉鹽、甲苯胺鹽等各種鹽。此外，這些鹽在使用時(shí)可以以溶液形式使用。上述ALA類中，優(yōu)選5-ALA和5-ALA甲酯、5-ALA乙酯、5-ALA丙酯、5-ALA丁酯、5-ALA戊酯等各種酯類，以及它們的鹽酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽，特別優(yōu)選例舉5-ALA鹽酸鹽、5-ALA磷酸鹽。上述ALA類可通過(guò)化學(xué)合成、經(jīng)由微生物生成、經(jīng)由酶生成等任何公知的方法制造。并且，上述ALA類也可以形成水合物或溶劑合物，還可以任何一種單獨(dú)使用或者兩種或多種適當(dāng)組合使用。上述鐵化合物可以是有機(jī)鹽，也可以是無(wú)機(jī)鹽。無(wú)機(jī)鹽的例子有氯化鐵、三氧化二鐵、硫酸鐵、焦磷酸亞鐵。有機(jī)鹽的例子有羧酸鹽，例如作為羥基羧酸鹽，有檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵鈉、檸檬酸亞鐵鈉、檸檬酸鐵銨等檸檬酸鹽，焦磷酸鐵、乳酸鐵、葡萄糖酸亞鐵、二乙烯三胺五乙酸鐵鈉、二乙烯三胺五乙酸鐵銨、乙二胺四乙酸鐵鈉、乙二胺四乙酸鐵銨、二羧甲基谷氨酸鐵鈉、二羧甲基谷氨酸鐵銨、富馬酸亞鐵、乙酸鐵、草酸鐵、琥珀酸亞鐵、琥珀酸檸檬酸鐵鈉等有機(jī)酸鹽，血質(zhì)鐵、葡聚糖鐵、三乙烯四胺鐵、乳鐵蛋白鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵、鐵葉綠酸鈉、鐵蛋白鐵、含糖氧化鐵和硫化甘氨酸鐵；其中優(yōu)選檸檬酸亞鐵鈉、檸檬酸鈉。上述鐵化合物可以各自單獨(dú)使用,也可以兩種或多種混合使用。鐵化合物的用量(添加量、給予量)以摩爾比計(jì)，為ALA類給予量(5-ALA換算)的0.01-100倍，優(yōu)選0.05-10倍，更優(yōu)選0.1-8倍。本發(fā)明的受精卵正常發(fā)育率提高劑結(jié)合使用ALA類與鐵化合物，可以以含有ALA類和鐵化合物的組合物形式使用，或者也可以各自單獨(dú)同時(shí)或先后使用。雖然在各自單獨(dú)使用時(shí)優(yōu)選同時(shí)使用，但在各自單獨(dú)先后使用的情況下，優(yōu)選使ALA類與鐵化合物的給予能夠取得相加的效果，最好是取得協(xié)同效應(yīng)。本發(fā)明中的受精卵是指精子進(jìn)入卵子內(nèi)，精核與卵核融合受精，由此形成的可通過(guò)體細(xì)胞分裂生長(zhǎng)的單細(xì)胞。作為取得受精卵的方法，可以是例如將體內(nèi)受精后的受精卵采集到體外(取卵)的方法，或者通過(guò)體外受精得到受精卵的方法，或者將通過(guò)這些方法得到的受精卵冷凍保存后解凍使用的方法。上述體內(nèi)受精例如可以是這樣在體內(nèi)進(jìn)行的受精：臨近成熟的卵子從卵巢被排出(排卵)進(jìn)入輸卵管，在一邊成熟一邊下行到輸卵管的中途，與精子相遇受精。獲取體內(nèi)受精的受精卵的方法可以是例如這樣的方法：比如在小鼠的情況下，用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ褂惺芫训男∈蟀矘?lè)死，通過(guò)常規(guī)方法取出輸卵管，用注射針劃開輸卵管膨大部，將受精卵塊通過(guò)透明質(zhì)酸酶處理除去卵丘細(xì)胞，由此獲得受精卵。上述體外受精例如可以是在體外人為進(jìn)行上述受精，體外受精的方法例如有:將取出到體外的卵子與精子共同培養(yǎng)進(jìn)行受精的方法、透明帶開孔法、卵周隙內(nèi)精子注入法、卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)精子注入法等顯微授精法。其中優(yōu)選用極細(xì)移液管在顯微鏡下將精子注入卵子細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的ISCI。上述體外受精中所使用的卵子例如可以是這樣的卵子：將排卵的卵子或者臨近排卵的成熟卵泡內(nèi)卵子；采集到體外后的取卵卵子；將采集到體外的未成熟卵子通過(guò)常規(guī)方法培養(yǎng)成熟的成熟培養(yǎng)卵子；或者是將這些卵子冷凍保存后再解凍的卵子等。將卵泡內(nèi)卵子采集到體外的方法可以例舉將注射針刺入卵泡抽吸的注射器抽吸法、將卵泡切開后取出內(nèi)容物的小卵泡切開法、將卵巢表面細(xì)切的卵巢細(xì)切法等。例如，在豬的情況下，通過(guò)給予前列腺素F2α、氯前列烯醇、絨膜促性腺激素等激素進(jìn)行過(guò)量排卵處理而獲得體內(nèi)成熟卵子，此外，也可以從來(lái)自屠宰場(chǎng)的卵巢采集卵子，使其成熟后使用，不過(guò)優(yōu)選體內(nèi)成熟卵子，特別是從性成熟(6個(gè)月齡以上)后的母豬采集的體內(nèi)成熟卵子。所述體內(nèi)成熟卵子可以是這樣采集的卵子，即對(duì)經(jīng)過(guò)量排卵處理得到的母豬子宮和卵巢，用PBS溶液等進(jìn)行卵巢灌注而得到的卵子，不過(guò)優(yōu)選對(duì)附著有卵丘細(xì)胞的卵子進(jìn)行透明質(zhì)酸酶處理以除去卵丘細(xì)胞。上述體外受精中所用的精子可以是通過(guò)采精、睪丸內(nèi)精子采集法、顯微鏡下附睪精子采集法、經(jīng)皮附睪精子采集法、精子濃縮洗凈法等獲得的精子，或者是將該精子進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)后的精子，或者是將這些精子冷凍保存后再解凍的精子等。本發(fā)明中，受精卵正常發(fā)育的概率(正常發(fā)育率)是指，例如，上述受精卵在體內(nèi)或體外通過(guò)體細(xì)胞分裂，沒(méi)有發(fā)生細(xì)胞分裂的停止，也沒(méi)有出現(xiàn)與本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的通常預(yù)定的細(xì)胞分裂模式不同的卵裂，依次變化為各階段的胚胎的比例，例如2細(xì)胞期的胚胎,優(yōu)選4細(xì)胞期的胚胎，更優(yōu)選8細(xì)胞期的胚胎，進(jìn)一步優(yōu)選桑椹胚，特別優(yōu)選胚泡(胚泡階段的胚胎)。此外，在本發(fā)明中，提高正常發(fā)育率是指提高至少8細(xì)胞期或以后的胚胎的正常發(fā)育率。上述桑椹胚是指雖然細(xì)胞數(shù)增加，但各個(gè)細(xì)胞仍可確認(rèn)的具有16-32個(gè)左右細(xì)胞數(shù)的胚胎。上述胚泡是指具有這樣的構(gòu)造的胚胎：形成卵裂腔，外細(xì)胞層(滋養(yǎng)外胚層：TE)與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)塊(內(nèi)細(xì)胞群：ICM)分開。在自然妊娠的情況下，是相應(yīng)于在子宮內(nèi)膜著床前的構(gòu)造的胚胎(體內(nèi)發(fā)育胚胎)。在體外受精的情況下，已知對(duì)正常發(fā)育至胚泡階段的胚胎(體外發(fā)育胚胎)進(jìn)行移植可提高受孕率，但胚胎移植的時(shí)期并不限定于胚泡期。這樣，發(fā)育有受精卵在體外進(jìn)行體細(xì)胞分裂的體外發(fā)育(體外培養(yǎng))和受精卵在體內(nèi)進(jìn)行體細(xì)胞分裂的體內(nèi)發(fā)育。因此，受精與發(fā)育的組合有體內(nèi)受精-體外發(fā)育、體內(nèi)受精-體內(nèi)發(fā)育、體外受精-體內(nèi)發(fā)育、體外受精-體外發(fā)育四種。作為使用本發(fā)明的受精卵正常發(fā)育率提高劑提高體外發(fā)育的正常發(fā)育率的方法，可以例舉下列方法：使正常發(fā)育率提高劑與受精卵接觸的方法，優(yōu)選在用于提高受精卵發(fā)育率的培養(yǎng)基中培養(yǎng)受精卵的方法，其中所述用于提高受精卵發(fā)育率的培養(yǎng)基是含有ALA類和鐵化合物的哺乳動(dòng)物受精卵的體外培養(yǎng)基，此外，還有將正常發(fā)育率提高劑添加到用于進(jìn)行取卵卵子的體外成熟的培養(yǎng)基中的方法，將正常發(fā)育率提高劑添加到卵子冷凍保存劑中的方法等。作為使用本發(fā)明的受精卵正常發(fā)育率提高劑提高體內(nèi)發(fā)育的正常發(fā)育率的方法，例如可以是將正常發(fā)育率提高劑經(jīng)口、舌下、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻、卵泡、陰道給予作為卵子來(lái)源的人或非人動(dòng)物母本。與未使用本發(fā)明受精卵正常發(fā)育率提高劑的情況相比，在使用了本發(fā)明正常發(fā)育率提高劑的情況下，受精卵的正常發(fā)育率得到有義(有意)提高，進(jìn)而受孕率也得到有義提高。當(dāng)本發(fā)明的受精卵正常發(fā)育率提高劑是用于提高受精卵發(fā)育率的培養(yǎng)基時(shí)，對(duì)于此時(shí)所用的上述哺乳動(dòng)物受精卵的體外培養(yǎng)基沒(méi)有特別限定，只要是能培養(yǎng)哺乳動(dòng)物受精卵的培養(yǎng)基即可，例如可以是HTF培養(yǎng)基、m-HTF培養(yǎng)基、Ham培養(yǎng)基、HamF-10培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、199培養(yǎng)基、BME培養(yǎng)基、CMRL1066培養(yǎng)基、McCoy-5A培養(yǎng)基、Weymouth培養(yǎng)基、TrowellT-8培養(yǎng)基、LeibovitzL-15培養(yǎng)基、NCTC培養(yǎng)基、William-E培養(yǎng)基、KaneandFoote培養(yǎng)基、Brinster培養(yǎng)基、m-Tyrode培養(yǎng)基、BWW培養(yǎng)基、WKWhitten培養(yǎng)基、TYH培養(yǎng)基、Hoppes&Pitts培養(yǎng)基、m-KRB培養(yǎng)基、BO培養(yǎng)基、T6培養(yǎng)基、GPM培養(yǎng)基、KSOM、HECM培養(yǎng)基以及這些培養(yǎng)基的改良培養(yǎng)基。還可以使用CARDMEDIUM小鼠體外受精用培養(yǎng)基、用于豬胚胎發(fā)育培養(yǎng)的培養(yǎng)基(PZM-5)(功能性肽研究所社生產(chǎn))等市售的專用體外受精用培養(yǎng)基。具體優(yōu)選例如含有NcCl、KCl、KH2PO4,MgSO4·7H2O,NaHCO3、乳酸鈣、丙酮酸鈉、葡萄糖、BSA的培養(yǎng)基，特別優(yōu)選下表1所示M16培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是在小鼠受精卵的回收、操作實(shí)驗(yàn)中最為頻繁使用的合成培養(yǎng)基。[表1]M16培養(yǎng)基的組成成分濃度供貨商N(yùn)aC15.98g/L(102mM)和光純藥社生產(chǎn)KC10.356g/L(4.78mM)和光純藥社生產(chǎn)KH2PO40.163g/L(1.20mM)和光純藥社生產(chǎn)MgSO4·7H2O0.294g/L(1.19mM)和光純藥社生產(chǎn)NaHCO31.9g/L(22.62mM)和光純藥社生產(chǎn)DL-乳酸鈣5水合物0.528g/L(1.71mM)和光純藥社生產(chǎn)丙酮酸鈉0.025g/L(0.23mM)西格瑪奧德里奇公司生產(chǎn)葡萄糖1g/L(5.55mM)和光純藥社生產(chǎn)BSA3g/L西格瑪奧德里奇公司生產(chǎn)青霉素100IU/mLGibco公司生產(chǎn)鏈霉素50mg/mLGibco公司生產(chǎn)酚紅0.01g/L和光純藥社生產(chǎn)將上述成分溶解于MiLiQ水后，用0.22μm濾器過(guò)濾殺菌，用于進(jìn)行培養(yǎng)。關(guān)于本發(fā)明受精卵正常發(fā)育率提高劑在體外發(fā)育中的使用量，只要能取得受精卵正常發(fā)育率提高的效果即可，對(duì)此沒(méi)有特別限定，當(dāng)添加到哺乳動(dòng)物受精卵的體外培養(yǎng)基中時(shí)，以5-ALA換算，為0.05μM-5μM，優(yōu)選0.08μM-2μM，更優(yōu)選0.1μM-1.5μM。關(guān)于本發(fā)明受精卵正常發(fā)育率提高劑在體內(nèi)發(fā)育中的給予量，只要能取得受精卵正常發(fā)育率提高的效果即可，對(duì)此沒(méi)有特別限定，以5-ALA換算，為0.1-20mg/kg·天，優(yōu)選0.5-10mg/kg·天，更優(yōu)選1-5mg/kg·天。作為本發(fā)明為提高受精卵正常發(fā)育率的用于體外發(fā)育或體內(nèi)發(fā)育的試劑盒，只要包含ALA類和鐵化合物即可，對(duì)其沒(méi)有特別限定，可以使用還包含一種或多種哺乳動(dòng)物受精卵的體外培養(yǎng)基的試劑盒。此外，本發(fā)明還涉及ALA類，優(yōu)選ALA類和鐵化合物，或者ALA類和鐵化合物以及體外養(yǎng)基在用于配制體外發(fā)育或體內(nèi)發(fā)育所用受精卵正常發(fā)育率提高劑方面的使用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于提高受精卵正常發(fā)育率的ALA類，優(yōu)選ALA類和鐵化合物，或者ALA類和鐵化合物以及體外養(yǎng)基。下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1[自然交配所得受精卵的采集與體外培養(yǎng)(1)](小鼠的交配)使用C57BL/6J系的雌性小鼠(21周齡-27周齡，體重21.0-24.5g)作為采集受精卵的雌性小鼠。使用C57BL/6J系的雄性小鼠(32-38周齡，體重30.0-35.5g)作為交配用的雄性小鼠。根據(jù)誘導(dǎo)過(guò)量排卵的常規(guī)方法，將5U(單位)的馬絨毛膜促性腺激素(血清促性腺激素，ASKA制藥株式會(huì)社生產(chǎn))腹腔內(nèi)給予各雌性小鼠，45-48小時(shí)后將5U(單位)的促性腺激素(ゴナトロピン，人絨毛膜促性腺激素，ASKA制藥株式會(huì)社生產(chǎn))經(jīng)腹腔內(nèi)給予各雌性小鼠。給予促性腺激素(ゴナトロピン)后立即使各雌性小鼠與上述各雄性小鼠交配。(受精卵的回收)翌日，確定交配后的雌性小鼠是否有乳白色樹脂樣的陰道栓，從確認(rèn)有陰道栓的雌性小鼠采集輸卵管。將采集到的輸卵管在生理鹽水(0.9％(w/v)NaCl)中靜置15分鐘左右，然后將輸卵管移至添加了約300μg/mL透明質(zhì)酸酶(西格瑪奧德里奇公司生產(chǎn))的M16培養(yǎng)基中，以處理除去卵丘細(xì)胞。切開輸卵管，取出受精卵，在CO2保溫箱內(nèi)于37℃靜置5-10分鐘，之后回收已分離卵丘細(xì)胞的受精卵，用未添加透明質(zhì)酸酶的M16培養(yǎng)基洗凈，除去透明質(zhì)酸酶。將所得除去了卵丘細(xì)胞的受精卵靜置于37℃、CO2保溫箱內(nèi)。(體外培養(yǎng))另外，在35mm培養(yǎng)皿中制作100μL的M16培養(yǎng)基的點(diǎn)滴，該點(diǎn)滴層疊了礦物油(西格瑪奧德里奇公司生產(chǎn))并添加了ALA鹽酸鹽(SBI制藥公司生產(chǎn))至最終濃度分別為0μM(對(duì)照)、0.1μM、0.5μM或1μM，將其靜置于37℃、CO2保溫箱內(nèi)。向所述點(diǎn)滴移送29個(gè)或30個(gè)上述除去了卵丘細(xì)胞的受精卵，在CO2保溫箱內(nèi)于37℃進(jìn)行體外培養(yǎng)。(胚胎發(fā)育)從點(diǎn)滴內(nèi)的體外培養(yǎng)開始時(shí)(0小時(shí))起，經(jīng)過(guò)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)后，通過(guò)立體顯微鏡觀察，確定各胚胎的發(fā)育階段，算出正常進(jìn)行發(fā)育的胚胎的數(shù)、發(fā)育率的變化。具體就是，作為在各個(gè)階段正常進(jìn)行發(fā)育的胚胎，計(jì)算培養(yǎng)開始24小時(shí)后2細(xì)胞期的卵數(shù)，48小時(shí)后3細(xì)胞期、4細(xì)胞期和8細(xì)胞期的卵數(shù)，72小時(shí)后桑椹胚和胚泡的數(shù)，96小時(shí)后胚泡的數(shù)。各階段的胚胎數(shù)記錄在表2中，以受精卵(0小時(shí))的數(shù)為100％時(shí)的發(fā)育率顯示在表3和圖1中。對(duì)于發(fā)育率的評(píng)價(jià)，是以受精卵(0小時(shí))的卵數(shù)為100％，算出24小時(shí)后、48小時(shí)后、72小時(shí)后、96小時(shí)后正常進(jìn)行發(fā)育的胚胎數(shù)的比例，作為正常發(fā)育率。另外，由于是自然交配，回收到的受精卵(0小時(shí))的數(shù)目包含一定程度的未受精卵，即使是同一實(shí)驗(yàn)中回收到的受精卵(0小時(shí))的集落(集団)，在分配到各條件群間的受精卵(0小時(shí))集落中，未受精卵的含有率也可能偶然變化。以受精24小時(shí)后的2細(xì)胞期的胚胎數(shù)為100％所算出的發(fā)育率，是為了排除在各條件群間偶然變化的未受精卵含有率的影響而進(jìn)行的計(jì)算。也就是說(shuō)，為了以確實(shí)開始了胚胎發(fā)育的卵數(shù)為基礎(chǔ)計(jì)算發(fā)育率，將24小時(shí)后的2細(xì)胞期的卵數(shù)設(shè)定為100％，這種情況下的發(fā)育率顯示在表4和圖2中。各結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)卡方檢驗(yàn)進(jìn)行，p<0.01(**)、p<0.05(*)時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。[表2][表3](vs對(duì)照卡方檢驗(yàn)**:p<0.01,*:p<0.05)<添加ALA對(duì)發(fā)育率的影響>從表2、表3和圖1可以確定，當(dāng)以受精卵(0小時(shí))的數(shù)為100％時(shí)，與未添加ALA的對(duì)照品相比，分別添加了0.1μM、0.5μM、1μM的ALA的情況下的發(fā)育率提高了。特別是在添加0.1μMALA的情況下，72小時(shí)后的發(fā)育率為47％，96小時(shí)后的發(fā)育率為23％，在添加0.5μMALA的情況下，72小時(shí)后的發(fā)育率為48％，與對(duì)照品的值相比，發(fā)育率得到有義(有意)提高。在添加0.5μMALA的情況下，96小時(shí)后的發(fā)育率為45％，在添加了1μMALA的情況下，72小時(shí)后的發(fā)育率為52％，96小時(shí)后的發(fā)育率為45％，與對(duì)照品的值相比，發(fā)育率得到顯著提高。[表4](vs對(duì)照卡方檢驗(yàn)**:p<0.01,*:p<0.05)從表4和圖2可以確定，當(dāng)以受精之后24小時(shí)后的2細(xì)胞期的胚胎數(shù)為100％時(shí)，與未添加ALA的對(duì)照品相比，通過(guò)添加0.1μM、0.5μM、1μM的ALA，提高了發(fā)育率。特別是在添加0.1μMALA的情況下，96小時(shí)后的發(fā)育率為32％，與對(duì)照品的值相比，發(fā)育率得到有義提高。在添加0.5μMALA的情況下，96小時(shí)后的發(fā)育率為54％，與對(duì)照品的值相比，發(fā)育率得到顯著提高。此外，在添加1μMALA的情況下，72小時(shí)后的發(fā)育率為79％，96小時(shí)后的發(fā)育率為68％，與對(duì)照品的值相比，發(fā)育率得到顯著提高。實(shí)施例2[自然交配所得受精卵的采集與體外培養(yǎng)(2)]使用BDF1系(C57BL/6雌×DBA/2雄的F1)的雌性與雄性交配得到的BDF2系的雌性小鼠(5-24周齡，體重16-25g)作為采集受精卵的雌性小鼠，使用BDF1系(C57BL/6雌×DBA/2雄的F1)的雄性小鼠(46-52周齡，體重30-45g)作為交配用的雄性小鼠，對(duì)1μM的ALA進(jìn)行研究，除此之外與實(shí)施例1一樣進(jìn)行。結(jié)果如下表5-7、圖3和4所示。[表5][表6]<添加ALA對(duì)發(fā)育率的影響>從表5、表6和圖3可以確定，當(dāng)以BDF2系統(tǒng)雌性小鼠與BDF1系統(tǒng)雄性小鼠交配所得受精卵(0小時(shí))的數(shù)為100％時(shí)，與未添加ALA的對(duì)照品相比，添加1μM的ALA使發(fā)育率上升了。[表7](vs對(duì)照卡方檢驗(yàn)**:p<0.01,*:p<0.05)從表7和圖4可以確定，當(dāng)以受精之后24小時(shí)后的2細(xì)胞期的胚胎數(shù)為100％時(shí)，與未添加ALA的對(duì)照品相比，通過(guò)添加1μM的ALA提高了發(fā)育率。特別是在添加1μMALA的情況下，72小時(shí)后和96小時(shí)后的發(fā)育率為98％，與對(duì)照品的值相比，發(fā)育率顯著提高。接下來(lái)，將小鼠C57BL/6J通過(guò)自然交配和體外受精得到的受精卵在體外培養(yǎng)系中進(jìn)行低溫培養(yǎng)，研究ALA對(duì)其的胚胎發(fā)育促進(jìn)作用。實(shí)施例3[自然交配所得受精卵的采集與體外培養(yǎng)(3)]根據(jù)誘導(dǎo)過(guò)量排卵的常規(guī)方法，將5U(單位)的馬絨毛膜促性腺激素(血清促性腺激素,ASKA制藥株式會(huì)社生產(chǎn))腹腔內(nèi)給予C57BL/6J系統(tǒng)的雌性小鼠(4周齡-6周齡)，45-48小時(shí)后腹腔內(nèi)給予5U(單位)的促性腺激素(ゴナトロピン，人絨毛膜促性腺激素，ASKA制藥株式會(huì)社生產(chǎn))。給予促性腺激素(ゴナトロピン)后立即使各雌性小鼠與C57BL/6J系統(tǒng)的各雄性小鼠交配。第二天早晨，從確認(rèn)有陰道栓的雌性小鼠回收輸卵管到生理鹽水(0.9％(w/v)NaCl)中，用添加了透明質(zhì)酸酶(約300μg/ml，西格瑪奧德里奇公司生產(chǎn))的KSOM或mWM(都購(gòu)自ARKResource公司，http://www.ark-resource.co.jp/seihin/cryopreservation-liquid/)回流灌注輸卵管，等除去所得受精卵的卵丘細(xì)胞后回收受精卵。用KSOM或mWM的各培養(yǎng)基洗滌受精卵以除去透明質(zhì)酸酶，并用KSOM或mWM(ARKResource公司)將其維持在37℃、5％CO2的保溫箱內(nèi)，直至從全部雌性小鼠回收受精卵。所用兩種培養(yǎng)基是用于小鼠胚胎培養(yǎng)的具有代表性的培養(yǎng)基，KSOM是具有代表性的低葡萄糖含量的培養(yǎng)基，而mWM則是高葡萄糖含量的培養(yǎng)基。向未添加ALA或添加了ALA(1μM或3μM)的100μl培養(yǎng)基(KSOM或mWM)形成的點(diǎn)滴(層疊有礦物油(西格瑪奧德里奇公司生產(chǎn)))中移入20-50個(gè)所回收的受精卵。此后，在37℃、5％CO2和35℃、5％CO2這兩種培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)從采集受精卵開始24小時(shí)后的2細(xì)胞期卵數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)96小時(shí)后的胚泡數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。發(fā)育率的評(píng)價(jià)與實(shí)施例1一樣進(jìn)行。KSOM的結(jié)果顯示在表8-表10、圖5和圖6中，mWM的結(jié)果顯示在表11-表13、圖7和圖8中。[表8][表9][表10][表11][表12][表13]<低溫(35℃)培養(yǎng)條件下對(duì)發(fā)育率的影響>對(duì)未添加ALA組的對(duì)照品在37℃培養(yǎng)與35℃培養(yǎng)時(shí)的發(fā)育率進(jìn)行比較，使用KSOM的情況(表9、圖5，表10、圖6)下，當(dāng)以受精卵(0)小時(shí)的數(shù)為100％計(jì)時(shí)(表9)，培養(yǎng)96小時(shí)后發(fā)育為胚泡的發(fā)育率從23％變?yōu)?％，當(dāng)以受精24小時(shí)后2細(xì)胞期的胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)(表10)，培養(yǎng)96小時(shí)后的發(fā)育率從56％變?yōu)?％，分別都出現(xiàn)了有義降低,使用mWM的情況(表12、圖7，表13、圖8)下，當(dāng)以受精卵(0)小時(shí)的數(shù)為100％計(jì)時(shí)(表12)，培養(yǎng)96小時(shí)后的發(fā)育率從35％變?yōu)?3％,當(dāng)以受精24小時(shí)后2細(xì)胞期的胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)(表13)，培養(yǎng)96小時(shí)后的發(fā)育率從71％變?yōu)?9％，也都分別出現(xiàn)了有義降低。從上述結(jié)果可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的C57BL/6J受精卵的低溫培養(yǎng)會(huì)阻礙發(fā)育的進(jìn)行。<在低溫(35℃)培養(yǎng)條件下添加ALA對(duì)發(fā)育率的影響>在35℃培養(yǎng)條件下,使用KSOM時(shí)，未添加ALA組的對(duì)照品在培養(yǎng)96小時(shí)后發(fā)育成胚泡的發(fā)育率，以受精卵(0小時(shí))的數(shù)為100％計(jì)時(shí)為4％(表9)，以受精24小時(shí)后的2細(xì)胞期胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)為6％(表10)，而與此相對(duì)，1μMALA添加組的發(fā)育率，以受精卵(0小時(shí))的數(shù)為100％計(jì)時(shí)為10％(表9),以受精24小時(shí)后的2細(xì)胞期胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)為15％(表10),各自都出現(xiàn)了有義上升。另一方面，使用mWM時(shí)，未添加ALA組的對(duì)照品在培養(yǎng)96小時(shí)后發(fā)育成胚泡的發(fā)育率，以受精卵(0小時(shí))的數(shù)為100％計(jì)時(shí)為23％(表12)，以受精24小時(shí)后的2細(xì)胞期胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)為49％(表13)，而與此相對(duì)，3μMALA添加組的發(fā)育率，以受精卵(0小時(shí))的數(shù)為100％計(jì)時(shí)為32％(表12)，以受精24小時(shí)后的2細(xì)胞期胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)為65％(表13),各自都出現(xiàn)了有義上升,不過(guò)與使用KSOM時(shí)不同,1μMALA添加組的發(fā)育率并未出現(xiàn)有義上升(表12、13)。實(shí)施例4[體外受精所得受精卵的采集與體外培養(yǎng)]將5U(單位)的馬絨毛膜促性腺激素(血清促性腺激素,ASKA制藥株式會(huì)社生產(chǎn))腹腔內(nèi)給予C57BL/6J系統(tǒng)的雌性小鼠(3.9周齡-4.0周齡)，45-48小時(shí)后腹腔內(nèi)給予5U(單位)的促性腺激素(ゴナトロピン，人絨毛膜促性腺激素，ASKA制藥株式會(huì)社生產(chǎn))，誘導(dǎo)其過(guò)量排卵。給予促性腺激素(ゴナトロピン)15小時(shí)后，開腹回收輸卵管。在礦物油中，用解剖針切開輸卵管膨大部，將卵子回收到mHTF培養(yǎng)基(ARKResource公司)的點(diǎn)滴中。從C57BL/6J雄性小鼠的附睪尾部回收精子，在mHTF培養(yǎng)基中于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)40分鐘到1小時(shí)，使精子獲能。向加入了所回收的卵子的培養(yǎng)基點(diǎn)滴中，加入2μl-4μl含有精子的mHTF培養(yǎng)基進(jìn)行授精，在37℃、5％CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。受精之后4小時(shí)到6小時(shí)后，用KSOM(ARKResource公司)或mWM(ARKResource公司)洗滌受精卵，去除卵丘細(xì)胞和精子。暫且用KSOM或mWM培養(yǎng)在37℃、5％CO2的保溫箱內(nèi)，直至回收完全部受精卵。向未添加ALA或添加了ALA(1μM或3μM)的100μl培養(yǎng)基(KSOM或mWM)形成的點(diǎn)滴(層疊有礦物油(西格瑪奧德里奇公司生產(chǎn)))每個(gè)點(diǎn)滴中移入25個(gè)受精卵。此后，在37℃、5％CO2和35℃、5％CO2及35.5℃、5％CO2這三種培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。計(jì)測(cè)卵子回收24小時(shí)后的2細(xì)胞期胚胎個(gè)數(shù)、96小時(shí)后的胚泡個(gè)數(shù)。并且，由于從體外受精獲得的受精卵的發(fā)育會(huì)稍遲，對(duì)卵子回收120小時(shí)后的胚泡個(gè)數(shù)也進(jìn)行計(jì)測(cè)。以受精24小時(shí)后的2細(xì)胞期的胚胎數(shù)為100％計(jì)，以此為基礎(chǔ)計(jì)算各培養(yǎng)時(shí)間的胚胎發(fā)育率。KSOM的結(jié)果顯示在表14、表15、圖9和圖11中，mWM的結(jié)果顯示在表16、表17、圖10、圖12和圖13中。[表14][表15][表16][表17]<低溫(35℃和35.5℃)培養(yǎng)條件下對(duì)發(fā)育率的影響>對(duì)未添加ALA組的對(duì)照品在37℃、35.5℃、35℃培養(yǎng)時(shí)的發(fā)育率進(jìn)行比較，使用KSOM的情況(表15、圖9)下，當(dāng)以受精24小時(shí)后2細(xì)胞期胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)，培養(yǎng)120小時(shí)后發(fā)育成胚泡的發(fā)育率從37℃的74％變?yōu)?5.5℃的41％、35℃的24％，有義降低了。使用mWM的情況(表17、圖10)也同樣地，以受精24小時(shí)后2細(xì)胞期的胚胎數(shù)為100％計(jì)時(shí)，培養(yǎng)96小時(shí)后發(fā)育成胚泡的發(fā)育率從37℃的83％變?yōu)?5.5℃的53％、35℃的25％，隨著溫度有義降低了。從上述結(jié)果可知，與自然交配所得受精卵一樣，本實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的C57BL/6J的體外受精卵的低溫培養(yǎng)會(huì)阻礙發(fā)育的進(jìn)行。<在低溫(35℃和35.5℃)培養(yǎng)條件下添加ALA對(duì)發(fā)育率的影響>使用KSOM(表14和表15)時(shí)，在35℃培養(yǎng)條件下(圖11)，未添加ALA的組在培養(yǎng)120小時(shí)后，以受精24小時(shí)后的2細(xì)胞期的胚胎數(shù)為100％計(jì)，發(fā)育成胚泡的發(fā)育率為24％，而與此相對(duì),1μMALA添加組為36％,3μMALA添加組為27％,35℃培養(yǎng)且添加1μMALA的情況有義提高了發(fā)育成胚泡的發(fā)育率。其次，使用mWM時(shí)(表16和表17)，在35.5℃培養(yǎng)條件下(圖12)，未添加ALA的組在培養(yǎng)96小時(shí)后，以受精24小時(shí)后的2細(xì)胞期的胚胎數(shù)為100％計(jì)，發(fā)育成胚泡的發(fā)育率為53％，而與此相對(duì)，1μMALA添加組為70％，3μMALA添加組為75％，通過(guò)添加ALA的情況有義提高了發(fā)育成胚泡的發(fā)育率。另外，在35℃培養(yǎng)條件下(圖13)，未添加ALA的組在培養(yǎng)96小時(shí)后，以受精24小時(shí)后的2細(xì)胞期的胚胎數(shù)為100％計(jì)，發(fā)育成胚泡的發(fā)育率為25％，而與此相對(duì),1μMALA添加組為53％,3μMALA添加組為38％，35℃培養(yǎng)且添加1μMALA的情況有義提高了發(fā)育成胚泡的發(fā)育率。(研究)<ALA對(duì)發(fā)育率的影響>關(guān)于未正常進(jìn)行發(fā)育的受精卵或胚胎，考慮有可能是細(xì)胞內(nèi)血紅素合成量下降，即，內(nèi)源性5-ALA供應(yīng)不足引起能量生產(chǎn)障礙，從而導(dǎo)致初期發(fā)育停止。認(rèn)為通過(guò)補(bǔ)充5-ALA還有鐵，能夠提高發(fā)育率和受孕率。<低溫培養(yǎng)對(duì)胚胎發(fā)育的影響>在自然交配與體外受精兩種方式得到的C57/BL6受精卵的體外發(fā)育體系中，與37℃的正常培養(yǎng)相比，35.5℃和35℃的低溫培養(yǎng)降低了發(fā)育成胚泡的發(fā)育率，證明發(fā)育受到抑制。特別是在體外受精卵的胚胎培養(yǎng)中，可觀察到隨著溫度變化對(duì)發(fā)育成胚泡的發(fā)育抑制(圖9和圖10)，表明該體系可作為低體溫癥導(dǎo)致不孕的模型。<低溫培養(yǎng)條件下ALA對(duì)胚胎發(fā)育的促進(jìn)效果>對(duì)在本實(shí)驗(yàn)條件下ALA對(duì)低溫培養(yǎng)的小鼠胚胎發(fā)育的作用進(jìn)行分析后，可確認(rèn)，在自然交配所得受精卵和體外受精卵的體外發(fā)育中，低溫培養(yǎng)條件下，ALA顯現(xiàn)出發(fā)育促進(jìn)作用。特別是使用mWM的情況觀察到了強(qiáng)促進(jìn)作用。由于mWM是高葡萄糖培養(yǎng)基，而KSOM是低葡萄糖培養(yǎng)基，所以考慮ALA的作用可能具有葡萄糖依賴性。<ALA作為人不孕癥治療藥物的可能性>本實(shí)驗(yàn)雖然使用的是小鼠受精卵，但低溫下的受精卵發(fā)育推測(cè)是一種與不孕原因之一的低體溫癥類似的壓力下狀態(tài)，這就揭示了一種可能性，即服用ALA有對(duì)改善低體溫導(dǎo)致的人不孕癥可能有效。工業(yè)上的可應(yīng)用性本發(fā)明可提高從受精卵到胚胎的制備效率，所述胚胎適合用于進(jìn)行胚胎移植到母體中，因而在畜牧業(yè)和不孕癥治療領(lǐng)域有用。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3