本發(fā)明涉及人源化抗BRDU抗體和人源化抗BRDU衍生物抗體，及使用人源化抗BRDU抗體和人源化抗BRDU衍生物抗體的方法。
背景技術(shù)：
：半抗原結(jié)合抗體可以用作捕獲組件用于治療性和診斷性應(yīng)用。例如，半抗原結(jié)合實(shí)體(如熒光團(tuán)、螯合試劑、肽、核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、納米顆粒和許多其他物質(zhì))可以與半抗原結(jié)合抗體和抗體衍生物反應(yīng)。這使得能夠有效檢測這類“有效負(fù)載(payload)”，以及捕獲、累積在希望的位置、交聯(lián)及其他抗體介導(dǎo)的效應(yīng)。由于半抗原的特征和組成可影響半抗原結(jié)合實(shí)體的組成和“行為”(包括大小、溶解性、活性、生物物理特性、PK、生物學(xué)效應(yīng)等)，高度希望開發(fā)多種不同的半抗原結(jié)合實(shí)體。從而，可能將所選擇的半抗原與給定的有效負(fù)載匹配，以產(chǎn)生優(yōu)化的半抗原綴合物。隨后，可將最優(yōu)半抗原結(jié)合實(shí)體與該綴合物組合，以產(chǎn)生最優(yōu)的抗體-半抗原-有效負(fù)載復(fù)合物。還希望具有人源化的半抗原結(jié)合實(shí)體，如抗體衍生物。這使得能夠開展干擾(如治療性應(yīng)用中的免疫原性)風(fēng)險(xiǎn)顯著降低的應(yīng)用。本文所述的抗體結(jié)合BRDU以及BRDU衍生物。這些抗體在本文中稱為“BRDU結(jié)合”或“抗BRDU”抗體。發(fā)明概述本發(fā)明提供抗BRDU抗體和抗BRDU衍生物抗體，及使用抗BRDU抗體和抗BRDU衍生物抗體的方法。本文中報(bào)道的一個(gè)方面是人源化抗BRDU抗體，其中該抗體包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:01的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:04的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3。此抗體特異性結(jié)合BRDU。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體在重鏈可變結(jié)構(gòu)域的第30位具有脯氨酸氨基酸殘基(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體在重鏈可變結(jié)構(gòu)域的第58位具有苯丙氨酸氨基酸殘基(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體在重鏈可變結(jié)構(gòu)域的第108位具有蘇氨酸氨基酸殘基(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域第30位的氨基酸殘基脯氨酸，重鏈可變結(jié)構(gòu)域第58位的氨基酸殘基苯丙氨酸，及重鏈可變結(jié)構(gòu)域第108位的氨基酸殘基蘇氨酸(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含：(1)含有氨基酸序列SEQIDNO:01的HVR-H1；(2)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第30位的氨基酸殘基脯氨酸；(3)含有氨基酸序列SEQIDNO:04的HVR-H2；(4)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第58位的氨基酸殘基苯丙氨酸；(5)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3；和(6)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第108位的氨基酸殘基色氨酸(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有氨基酸序列SEQIDNO:02的HVR-H1。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有氨基酸序列SEQIDNO:03的HVR-H2。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有氨基酸序列SEQIDNO:12的HVR-H2。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體進(jìn)一步包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:06的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:07的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的第49位包含氨基酸殘基賴氨酸(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第98位包含氨基酸殘基亮氨酸(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第49位的氨基酸殘基賴氨酸和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第98位的氨基酸殘基亮氨酸(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體(1)包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域第30位的氨基酸殘基脯氨酸、重鏈可變結(jié)構(gòu)域第58位的氨基酸殘基苯丙氨酸和重鏈可變結(jié)構(gòu)域第108位的氨基酸殘基蘇氨酸；及(2)包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第49位的氨基酸殘基賴氨酸和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第98位的氨基酸殘基亮氨酸(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含：(1)含有氨基酸序列SEQIDNO:01的HVR-H1；(2)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第30位的氨基酸殘基脯氨酸；(3)含有氨基酸序列SEQIDNO:04的HVR-H2；(4)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第58位的氨基酸殘基苯丙氨酸；(5)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3；(6)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第108位的氨基酸殘基色氨酸；(7)含有氨基酸序列SEQIDNO:06的HVR-L1；(8)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第49位的氨基酸殘基賴氨酸；(9)含有氨基酸序列SEQIDNO:07的HVR-L2；(10)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第98位的氨基酸殘基亮氨酸；和(11)含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含：(a)與氨基酸序列SEQIDNO:09具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)與氨基酸序列SEQIDNO:10具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列，其中(1)包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域第30位的氨基酸殘基脯氨酸、重鏈可變結(jié)構(gòu)域第58位的氨基酸殘基苯丙氨酸和重鏈可變結(jié)構(gòu)域第108位的氨基酸殘基蘇氨酸；和(2)包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第49位的氨基酸殘基賴氨酸和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第98位的氨基酸殘基亮氨酸(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含VH序列SEQIDNO:09。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含VL序列SEQIDNO:10。本文中報(bào)道的一個(gè)方面是包含VH序列SEQIDNO:09和VL序列SEQIDNO:10的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體是全長IgG1抗體或全長IgG4抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體是單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體是結(jié)合BRDU的抗體片段。本文中報(bào)道的一個(gè)方面是鼠抗體的人源化形式，該鼠抗體包含源自氨基酸序列SEQIDNO:11的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和源自氨基酸序列SEQIDNO:12的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，且特異性結(jié)合BRDU。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體在重鏈可變結(jié)構(gòu)域的第30位具有脯氨酸氨基酸殘基(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體在重鏈可變結(jié)構(gòu)域的第58位具有苯丙氨酸氨基酸殘基(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體在重鏈可變結(jié)構(gòu)域的第108位具有蘇氨酸氨基酸殘基(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域第30位的氨基酸殘基脯氨酸，重鏈可變結(jié)構(gòu)域第58位的氨基酸殘基苯丙氨酸，及重鏈可變結(jié)構(gòu)域第108位的氨基酸殘基蘇氨酸(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的第49位包含氨基酸殘基賴氨酸(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體在輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的第98位包含氨基酸殘基亮氨酸(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第49位的氨基酸殘基賴氨酸和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第98位的氨基酸殘基亮氨酸(Kabat編號)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體(1)包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域第30位的氨基酸殘基脯氨酸、重鏈可變結(jié)構(gòu)域第58位的氨基酸殘基苯丙氨酸和重鏈可變結(jié)構(gòu)域第108位的氨基酸殘基蘇氨酸；及(2)包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第49位的氨基酸殘基賴氨酸和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第98位的氨基酸殘基亮氨酸(Kabat編號)。本文中報(bào)道的一個(gè)方面是包含本文中報(bào)道的抗體和可藥用載體的藥物制劑。本文中報(bào)道的一個(gè)方面是本文中報(bào)道的抗體用作藥物。本文中報(bào)道的一個(gè)方面是本文中報(bào)道的抗體在制備藥物中的用途。附圖簡述圖1.A：進(jìn)行SEC-MALLS分析來鑒定和表征抗TfR/BRDU雙特異性抗體與BRDU標(biāo)記的DNA的復(fù)合物，以及游離雙特異性抗體和游離BRDU-DNA。復(fù)合物在244.9kDaMW處從柱洗脫，游離雙特異性抗體在215.4kDaMW處檢測到，游離BRDU-DNA在16.4kDaMW處檢測到。B：進(jìn)行SEC-MALLS分析來鑒定和表征抗TfR/BRDU雙特異性抗體與BRDU標(biāo)記的DNA的復(fù)合物，以及游離雙特異性抗體和游離BRDU-DNA。復(fù)合物顯示6.8nm的流體動(dòng)力學(xué)半徑，而游離雙特異性抗體顯示6.2nm的流體動(dòng)力學(xué)半徑。發(fā)明詳述I.定義如本文所使用，重鏈和輕鏈的所有恒定區(qū)和結(jié)構(gòu)域的氨基酸位置按照Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中描述并在本文中稱為“Kabat編號”的Kabat編號系統(tǒng)編號。具體而言，Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的Kabat編號系統(tǒng)(參見647-660頁)用于κ和λ同種型的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域CL，KabatEU指數(shù)編號系統(tǒng)(參見661-723頁)用于恒定重鏈結(jié)構(gòu)域(CH1、鉸合部、CH2和CH3)。用于本文目的的“受體人構(gòu)架”是包含源自下文定義的人免疫球蛋白構(gòu)架或人共有構(gòu)架的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)構(gòu)架或重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)構(gòu)架的氨基酸序列的構(gòu)架?！霸醋浴比嗣庖咔虻鞍讟?gòu)架或人共有構(gòu)架的受體人構(gòu)架可以包含其相同氨基酸序列，或者它可以包含氨基酸序列改變。在一些實(shí)施方案中，氨基酸改變的數(shù)目為10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些實(shí)施方案中，VL受體人構(gòu)架在序列上與VL人免疫球蛋白構(gòu)架序列或人共有構(gòu)架序列相同?！坝H和力”指分子(例如抗體)的單個(gè)結(jié)合部位與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間非共價(jià)相互作用的總和的強(qiáng)度。除非另有說明，本文所用的“結(jié)合親和力”指內(nèi)在的結(jié)合親和力，其反映結(jié)合對(例如抗體和抗原)的成員之間的1:1相互作用。分子X對其配偶體Y的親和力一般可通過解離常數(shù)(Kd)來表示。親和力可以通過本領(lǐng)域公知的方法來測量，包括本文中所述的那些。用于測量結(jié)合親和力的具體的說明性和示例性實(shí)施方案在下文中描述?！坝H和力成熟的”抗體指在一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)(HVR)中具有一個(gè)或多個(gè)改變的抗體，與不具有這類改變的親本抗體相比，這類改變導(dǎo)致抗體對抗原的親和力的改善。術(shù)語“抗BRDU抗體”和“結(jié)合BRDU的抗體”指這樣的抗體，其能夠以足夠的親和力結(jié)合BRDU，使得該抗體可以在靶向BRDU中用作診斷劑和/或治療劑。術(shù)語“抗體”在本文中以最廣泛的含義使用并涵蓋多種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們顯示希望得到的抗原結(jié)合活性?！翱贵w片段”指除完整抗體以外，包含完整抗體的部分的分子，該部分結(jié)合該完整抗體所結(jié)合的抗原。抗體片段的實(shí)例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及從抗體片段形成的多特異性抗體。術(shù)語“嵌合”抗體指這樣的抗體，其中部分重鏈和/或輕鏈源自特定來源或物種，而重鏈和/或輕鏈的其余部分源自不同的來源或物種?？贵w的“種類”指其重鏈所具有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。存在5個(gè)主要的抗體種類：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些種類中的幾種可以進(jìn)一步劃分為亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應(yīng)于不同種類的免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。本文所用的術(shù)語“細(xì)胞毒劑”指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞死亡或破壞的物質(zhì)。細(xì)胞毒劑包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化療劑或化療藥物(例如氨甲喋呤、阿霉素、長春花生物堿(長春花新堿(vincristine)、長春滅瘟堿(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，如核溶解酶；抗生素；毒素，如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體；及下文公開的多種抗腫瘤劑或抗癌劑。術(shù)語“源自”指通過在至少一個(gè)位置引入改變來從親本氨基酸序列衍生氨基酸序列。因此，衍生的氨基酸序列在至少一個(gè)對應(yīng)的位置(抗體Fc區(qū)的KabatEU指數(shù)編號系統(tǒng)編號)上不同于對應(yīng)的親本氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，源自親本氨基酸序列的氨基酸序列在對應(yīng)的位置上有一個(gè)以上氨基酸殘基不同于親本氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，源自親本氨基酸序列的氨基酸序列在對應(yīng)的位置上有十個(gè)以上氨基酸殘基不同于親本氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，源自親本氨基酸序列的氨基酸序列在對應(yīng)的位置上有15個(gè)以上氨基酸殘基不同于親本氨基酸序列。因此，親本氨基酸序列形成所衍生的氨基酸序列的基礎(chǔ)?！靶?yīng)子功能”指可歸因于抗體的Fc區(qū)且隨抗體種類而變的那些生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)子功能的實(shí)例包括：C1q結(jié)合和依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)；Fc受體結(jié)合；依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)的下調(diào)；及B細(xì)胞激活。藥物(例如藥物制劑)的“有效量”指對在必要的劑量和時(shí)期內(nèi)達(dá)到希望得到的治療或預(yù)防結(jié)果有效的量。本文的術(shù)語“Fc區(qū)”用來定義免疫球蛋白重鏈的C端區(qū)域，其包含至少部分恒定區(qū)。該術(shù)語包括天然序列Fc區(qū)和變體Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人IgG重鏈Fc區(qū)從Cys226或從Pro230延伸至重鏈的羧基端。但是，F(xiàn)c區(qū)的C端賴氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有說明，F(xiàn)c區(qū)或恒定區(qū)中的氨基酸殘基的編號按照Kabat,E.A.等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991),NIHPublication91-3242中所述的EU編號系統(tǒng)，也稱為EU指數(shù)?！皹?gòu)架”或“FR”指高變區(qū)(HVR)殘基之外的可變結(jié)構(gòu)域殘基。可變結(jié)構(gòu)域的FR一般由四個(gè)FR結(jié)構(gòu)域組成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般按以下順序出現(xiàn)在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。術(shù)語“全長抗體”、“完整抗體”和“全抗體”在本文中可互換使用，指具有基本類似于天然抗體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)或具有包含本文所定義的Fc區(qū)的重鏈的抗體。術(shù)語“宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞系”和“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，指已將外源核酸引入其中的細(xì)胞，包括這類細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞包括“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”，其包括最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及從其衍生的后代，而不考慮傳代數(shù)。后代的核酸含量可以并非與親本細(xì)胞完全相同，而是可以包含突變。本文包括具有與在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選或選擇的功能或生物學(xué)活性相同的功能和生物學(xué)活性的突變體后代?！叭丝贵w”是具有這樣的氨基酸序列的抗體，該氨基酸序列對應(yīng)于由人或人細(xì)胞產(chǎn)生或源自利用人抗體庫或其他人抗體編碼序列的非人來源的抗體的氨基酸序列。人抗體的此定義明確排除了包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。“人共有構(gòu)架”是代表人免疫球蛋白VL或VH構(gòu)架序列的選擇中最常出現(xiàn)的氨基酸殘基的構(gòu)架。通常，該人免疫球蛋白VL或VH序列的選擇來自可變結(jié)構(gòu)域序列亞組。通常，該序列亞組是Kabat,E.A.等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991),NIHPublication91-3242,1-3卷中的亞組。在一個(gè)實(shí)施方案中，對于VL，該亞組是Kabat等,上文中的亞組κI。在一個(gè)實(shí)施方案中，對于VH，該亞組是Kabat等,上文中的亞組III?！叭嗽椿笨贵w指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體將包含至少一個(gè)且通常為兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR(例如CDR)對應(yīng)于非人抗體的那些，而全部或基本上全部FR對應(yīng)于人抗體的那些。人源化抗體可以可選地包含源自人抗體的抗體恒定區(qū)的至少一部分?？贵w(例如非人抗體)的“人源化形式”指已進(jìn)行了人源化的抗體。本文所用的術(shù)語“高變區(qū)”或“HVR”指抗體可變結(jié)構(gòu)域的在序列上高變和/或形成結(jié)構(gòu)確定的環(huán)(“高變環(huán)”)的區(qū)域中的每一個(gè)。通常，天然四鏈抗體包含六個(gè)HVR；三個(gè)在VH中(H1、H2、H3)，三個(gè)在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含來自高變環(huán)和/或來自“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)的氨基酸殘基，后者具有最高的序列變異性和/或涉及抗原識別。示例性高變環(huán)存在于氨基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)存在于L1的氨基酸殘基24-34、L2的氨基酸殘基50-56、L3的氨基酸殘基89-97、H1的氨基酸殘基31-35B、H2的氨基酸殘基50-65和H3的氨基酸殘基95-102(Kabat,E.A.等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991),NIHPublication91-3242)。除VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高變環(huán)的氨基酸殘基。CDR還包含“特異性決定殘基”或“SDR”，其是接觸抗原的殘基。SDR包含在CDR的稱為縮短的CDR或a-CDR的區(qū)域內(nèi)。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸殘基31-34、L2的氨基酸殘基50-55、L3的氨基酸殘基89-96、H1的氨基酸殘基31-35B、H2的氨基酸殘基50-58和H3的氨基酸殘基95-102處(參見Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)。除非另有說明，本文按照Kabat等,上文編號可變結(jié)構(gòu)域中的HVR殘基和其他殘基(例如FR殘基)?！懊庖呔Y合物”是與一種或多種異源分子(包括但不限于細(xì)胞毒劑)綴合的抗體?！皞€(gè)體(individual)”或“對象(subject)”是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于飼養(yǎng)的動(dòng)物(例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類(例如人類和非人靈長類，如猴)、兔和嚙齒類(例如小鼠和大鼠)。在某些實(shí)施方案中，該個(gè)體或?qū)ο笫侨??！胺蛛x的”抗體是已從其天然環(huán)境的成分分開的抗體。在一些實(shí)施方案中，將抗體純化至通過例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細(xì)管電泳)或?qū)游?例如離子交換或反相HPLC)測定的純度大于95％或99％。用于評估抗體純度的方法的綜述參見例如Flatman,S.等,J.Chrom.B848(2007)79-87?！胺蛛x的”核酸指已從其天然環(huán)境的成分分開的核酸分子。分離的核酸包括包含在通常含有該核酸分子的細(xì)胞中的核酸分子，但該核酸分子存在于染色體外或不同于其天然染色體位置的染色體位置上?！胺蛛x的編碼抗BRDU抗體的核酸”指編碼抗體重鏈和輕鏈(或其片段)的一個(gè)或多個(gè)核酸分子，包括單個(gè)載體或分開的載體中的這種(類)核酸分子，及存在于宿主細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)位置上的這種(類)核酸分子。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”指獲自基本上同質(zhì)的抗體群體的抗體，即除了例如包含天然存在的突變或在產(chǎn)生單克隆抗體制劑期間出現(xiàn)的可能的變體抗體(這類變體通常以較小的量存在)外，包含在該群體中的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同的表位。與通常包含抗不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑不同，單克隆抗體制劑的每種單克隆抗體抗抗原上的單個(gè)決定簇。因此，修飾詞“單克隆”指抗體獲自基本上同質(zhì)的抗體群體的特征，而不解釋為需要通過任意具體的方法來產(chǎn)生該抗體。例如，將要按照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過多種技術(shù)來制備，其包括但不限于雜交瘤法、重組DNA法、噬菌體展示法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，本文描述用于制備單克隆抗體的這類方法和其他示例性方法?！奥憧贵w”指未與異源部分(例如細(xì)胞毒性部分)或放射性標(biāo)記綴合的抗體。裸抗體可以存在于藥物制劑中?！疤烊豢贵w”指天然存在的具有不同結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是由二硫鍵結(jié)合在一起的兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成的約150,000道爾頓的異源四聚體糖蛋白。從N端至C端，每條重鏈具有可變區(qū)(VH)，也稱為可變重鏈結(jié)構(gòu)域或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，隨后是三個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N端至C端，每條輕鏈具有可變區(qū)(VL)，也稱為可變輕鏈結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，隨后是恒定輕鏈(CL)結(jié)構(gòu)域。根據(jù)其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可以將抗體的輕鏈分配至兩個(gè)類型之一，稱為κ和λ。術(shù)語“包裝說明書”用來指通常包含在治療性產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說明書，其包含關(guān)于適應(yīng)癥、用法、劑量、施用、聯(lián)合治療、禁忌癥的信息和/或有關(guān)這類治療性產(chǎn)品的用途的警告的信息。就參考多肽序列而言的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定義為在比對序列并在必要時(shí)引入缺口來達(dá)到最大百分比序列同一性，而不將任意保守取代視為序列同一性的部分之后，候選序列中與參考多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比?？梢砸员绢I(lǐng)域技術(shù)之內(nèi)的多種方式來實(shí)現(xiàn)測定百分比氨基酸序列同一性為目的的比對，例如，使用公開可得的計(jì)算機(jī)軟件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于比對序列的適當(dāng)參數(shù)，包括在所比較的序列的全長內(nèi)達(dá)到最大比對所需的任意算法。但是，為了本文的目的，用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2來產(chǎn)生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech,Inc.編寫，源代碼已隨用戶文件提交美國版權(quán)辦公室,WashingtonD.C.,20559，它在美國版權(quán)辦公室注冊在美國版權(quán)注冊號TXU510087之下。ALIGN-2程序從Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,California公開可得，或者可以從源代碼編譯。ALIGN-2程序應(yīng)編譯用在UNIX操作系統(tǒng)上，包括數(shù)字UNIXV4.0D。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不變動(dòng)。在使用ALIGN-2來進(jìn)行氨基酸序列比較的情況下，按以下計(jì)算給定氨基酸序列A與給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以備選地?cái)⑹鰹椋哂谢虬c給定氨基酸序列B的某％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)：100乘以分?jǐn)?shù)X/Y其中X是在該程序的A和B的比對中通過序列比對程序ALIGN-2評分為相同的匹配的氨基酸殘基的數(shù)目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數(shù)。應(yīng)理解，在氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度時(shí)，A與B的％氨基酸序列同一性將不等于B與A的％氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是用ALIGN-2計(jì)算機(jī)程序按前一段落中所述獲得。術(shù)語“藥物制劑”指這樣的制備物，其處于這樣的形式，使得包含在其中的活性成分的生物學(xué)活性有效，且不包含對將要施用該制劑的個(gè)體具有不可接受的毒性的附加成分?！翱伤幱幂d體”指藥物制劑中除活性成分外的成分，其對個(gè)體無毒性?？伤幱幂d體包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。本文所用的術(shù)語“BRDU”指具有化學(xué)式5-溴-2’-脫氧尿苷的溴脫氧尿苷。其他縮寫是BrdU、BUdR、BrdUrd。本文所用的“治療”(及其語法變形)指改變所治療的個(gè)體的自然過程的嘗試中的臨床干預(yù)，且可以為了預(yù)防而進(jìn)行或在臨床病理過程中進(jìn)行。希望得到的治療作用包括但不限于預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、減輕癥狀、減少疾病的任何直接或間接的病理學(xué)結(jié)果、預(yù)防轉(zhuǎn)移、減慢疾病進(jìn)展速率、改善或緩和疾病狀態(tài)、及緩解或改善的預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，用本發(fā)明的抗體來延遲疾病的發(fā)展或減慢疾病的進(jìn)展。術(shù)語“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”指抗體重鏈或輕鏈的涉及該抗體與抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域(分別為VH和VL)通常具有相似的結(jié)構(gòu)，每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含四個(gè)保守的構(gòu)架區(qū)(FR)和三個(gè)高變區(qū)(HVR)(參見例如Kindt,T.J.等KubyImmunology,第6版,W.H.FreemanandCo.,N.Y.(2007),第91頁)。單個(gè)VH或VL結(jié)構(gòu)域可以足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，可以分別用來自結(jié)合抗原的抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域篩選互補(bǔ)的VL或VH結(jié)構(gòu)域的文庫，來分離結(jié)合該特定抗原的抗體。參見例如Portolano,S.等,J.Immunol.150(1993)880-887；Clarkson,T.等,Nature352(1991)624-628。本文所用的術(shù)語“載體(vector)”指能夠增殖與它連接的另一核酸的核酸分子。該術(shù)語包括作為自主復(fù)制核酸結(jié)構(gòu)的載體，以及摻入它所引入的宿主細(xì)胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導(dǎo)與它們有效連接的核酸的表達(dá)。這類載體在本文中稱為“表達(dá)載體”。術(shù)語“半抗原”指只有在附著于大負(fù)載者(carrier)(如蛋白質(zhì))時(shí)才可引出免疫反應(yīng)的小分子。示例性半抗原有苯胺、鄰、間和對氨基苯甲酸、醌、肼屈嗪(hydralazine)、鹵烷、熒光素、生物素、BRDU、洋地黃毒苷、茶堿和二硝基苯酚。在一個(gè)實(shí)施方案中，半抗原是生物素或洋地黃毒苷或茶堿或碳硼烷或BRDU。在一個(gè)實(shí)施方案中，半抗原是BRDU。術(shù)語“綴合至…的BRDU”指直接或間接共價(jià)連接至另一部分(如效應(yīng)核酸、多肽或標(biāo)記)的BRDU殘基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該另一部分是核酸。術(shù)語“共價(jià)復(fù)合物形成”指例如在抗BRDU抗體和BRDU之間形成非共價(jià)復(fù)合物后，在復(fù)合物中的兩個(gè)配偶體之間形成共價(jià)鍵。共價(jià)鍵的形成在無需加入其他反應(yīng)物的情況下發(fā)生。II.組合物和方法在一方面，本發(fā)明基于結(jié)合BRDU的人源化抗體。本文提供這些抗體。通過用對含有BRDU的核酸的結(jié)合特異性作為抗體的通用有效負(fù)載特征，本發(fā)明的抗體例如用作用于結(jié)合含有BRDU的核酸的單特異性抗體，及用作用于診斷或治療所有種類疾病的多特異性抗體。A.示例性抗BRDU抗體在一方面，本發(fā)明提供分離的結(jié)合BRDU的抗體。在某些實(shí)施方案中，該抗BRDU抗體是人源化抗BRDU抗體。在某些實(shí)施方案中，本文報(bào)道的抗BRDU抗體結(jié)合含有BRDU的核酸而不干擾核酸的生物學(xué)活性。因此，如果抗體是單特異性抗體，則這些抗體可以用于改善含有BRDU的核酸的藥代動(dòng)力學(xué)特性。另外，如果抗體是這樣的雙特異性或多特異性抗體，則這些抗體可以用于靶向遞送含有BRDU的核酸，該雙特異性或多特異性抗體的一種結(jié)合特異性針對BRDU且可以用作通用有效負(fù)載特異性，而第二結(jié)合特異性特異性結(jié)合例如細(xì)胞表面分子并提供雙特異性或多特異性抗體的靶向特征/成分。對于靶向遞送核酸(即有效負(fù)載核酸)至或入細(xì)胞，希望修飾盡可能少地引入有效負(fù)載核酸。通過將核酸與多肽綴合，在核酸中引入了顯著的修飾。備選地，可能將核酸與非核苷酸半抗原綴合。與從綴合至多肽所產(chǎn)生的修飾相比，從其產(chǎn)生的核酸修飾較少。但非核苷酸半抗原(如生物素、洋地黃毒苷、茶堿、熒光素)仍例如在其結(jié)構(gòu)上顯著不同于核苷酸。因此，與非核苷酸半抗原的綴合仍可以產(chǎn)生不可耐受的修飾。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，胸苷類似物即溴脫氧尿苷(BRDU)可以用于提供半抗原，該半抗原一方面可以被抗體識別，另一方面不在有效負(fù)載核酸中引入顯著的修飾。一方面，本發(fā)明提供抗BRDU抗體，其包含選自以下的至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)HVR：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:01的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:04的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQIDNO:06的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQIDNO:07的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3。一方面，本發(fā)明提供抗BRDU抗體，其包含選自以下的至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)HVR：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:02的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:04的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQIDNO:06的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQIDNO:07的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3。一方面，本發(fā)明提供抗BRDU抗體，其包含選自以下的至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)HVR：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:01的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:03的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQIDNO:06的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQIDNO:07的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3。一方面，本發(fā)明提供抗BRDU抗體，其包含選自以下的至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)HVR：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:02的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:03的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQIDNO:06的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQIDNO:07的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3。一方面，本發(fā)明提供抗BRDU抗體，其包含選自以下的至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VHHVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:01的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:04的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3和含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3。在另一實(shí)施方案中，該抗體包含含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3、含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3和含有氨基酸序列SEQIDNO:04的HVR-L2。在另一實(shí)施方案中，該抗體包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:01的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:04的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3。另一方面，本發(fā)明提供抗BRDU抗體，其包含選自以下的至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VLHVR序列：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:06的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:07的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:06的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:07的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3。另一方面，本發(fā)明的抗BRDU抗體包含：(a)包含選自以下的至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VHHVR序列的VH結(jié)構(gòu)域：(i)含有氨基酸序列SEQIDNO:01的HVR-H1；(ii)含有氨基酸序列SEQIDNO:04的HVR-H2；和(iii)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3；和(b)包含選自以下的至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VLHVR序列的VL結(jié)構(gòu)域：(i)含有氨基酸序列SEQIDNO:06的HVR-L1；(ii)含有氨基酸序列SEQIDNO:07的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3。另一方面，本發(fā)明提供抗BRDU抗體，其包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:01的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:04的HVR-H2；(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3；(d)含有氨基酸序列SEQIDNO:06的HVR-L1；(e)含有氨基酸序列SEQIDNO:07的HVR-L2；和(f)含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗BRDU抗體是人源化的。已發(fā)現(xiàn)，人源化抗BRDU抗體在特定位置需要特定殘基，以維持非人源化親本抗體的特征。人源化抗BRDU抗體在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的Kabat位置30處包含氨基酸殘基P。人源化抗BRDU抗體在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的Kabat位置58處包含氨基酸殘基F。人源化抗BRDU抗體在重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的Kabat位置108處包含氨基酸殘基T。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化抗BRDU抗體包含以上實(shí)施方案的任一個(gè)中的HVR，且進(jìn)一步包含受體人構(gòu)架，例如人免疫球蛋白構(gòu)架或人共有構(gòu)架。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化抗BRDU抗體包含含有以上實(shí)施方案的任一個(gè)中的HVR-H的VH，且進(jìn)一步包含以下的一個(gè)或多個(gè)：-重鏈可變結(jié)構(gòu)域第30位的P；和/或-重鏈可變結(jié)構(gòu)域第58位的F；和/或-重鏈可變結(jié)構(gòu)域第108位的T；和/或-輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第49位的K；和/或-輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第98位的L(所有位置均按照Kabat)。重鏈可變結(jié)構(gòu)域的Kabat位置30對應(yīng)于SEQIDNO:09和11的殘基號30。重鏈可變結(jié)構(gòu)域的Kabat位置58對應(yīng)于SEQIDNO:09和11的殘基號58。重鏈可變結(jié)構(gòu)域的Kabat位置108對應(yīng)于SEQIDNO:09和11的殘基號108。輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的Kabat位置49對應(yīng)于SEQIDNO:10和12的殘基號49。輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的Kabat位置98對應(yīng)于SEQIDNO:10和12的殘基號98?？梢砸脒@些改變(回復(fù)突變)來提高人源化抗BRDU抗體的結(jié)合親和力。另一方面，抗BRDU抗體包含與氨基酸序列SEQIDNO:09具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)序列。在某些實(shí)施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相對于參考序列包含取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列的抗BRDU抗體保留結(jié)合BRDU的能力。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:09中取代、插入和/或缺失了總計(jì)1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，取代、插入或缺失存在于HVR之外的區(qū)域(即在FR中)。可選地，抗BRDU抗體包含SEQIDNO:09中的VH序列，包括該序列的翻譯后修飾。在具體實(shí)施方案中，該VH包含選自以下的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)HVR：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:01或02的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:03或04的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3。另一方面，提供抗BRDU抗體，其中該抗體包含與氨基酸序列SEQIDNO:10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)。在某些實(shí)施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相對于參考序列包含取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列的抗BRDU抗體保留結(jié)合BRDU的能力。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:10中取代、插入和/或缺失了總計(jì)1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，取代、插入或缺失存在于HVR之外的區(qū)域(即在FR中)。可選地，抗BRDU抗體包含SEQIDNO:10中的VL序列，包括該序列的翻譯后修飾。在具體實(shí)施方案中，該VH包含選自以下的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)HVR：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:06的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:07的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3。另一方面，提供抗BRDU抗體，其中該抗體包含上文提供的任意實(shí)施方案中的VH，及上文提供的任意實(shí)施方案中的VL。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含分別在SEQIDNO:09和SEQIDNO:10中的VH和VL序列，包括那些序列的翻譯后修飾。在本發(fā)明的另一方面，任意以上實(shí)施方案的抗BRDU抗體是單克隆抗體，包括嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗BRDU抗體是抗體片段，例如Fv,Fab、Fab’、scFv、雙抗體或F(ab’)2片段。在另一實(shí)施方案中，該抗體是本文定義的全長抗體，例如完整的IgG1或IgG4抗體或其他抗體種類或同種型。在另一方面，任意以上實(shí)施方案的抗BRDU抗體可以單獨(dú)地或組合地?fù)饺胍韵?-5章節(jié)中所述的任意特征：1.抗體親和力可以通過用以下測定所述的Fab形式的目的抗體及其抗原進(jìn)行的放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測定(RIA)來測量Kd。例如，通過在未標(biāo)記抗原的滴定系列的存在下用最小濃度的(125I)-標(biāo)記抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗體包被的平板捕獲結(jié)合的抗原來測量Fab對抗原的溶液結(jié)合親和力(參見例如Chen,Y.等,J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。為了確定用于測定的條件，用50mM碳酸鈉(pH9.6)中的5μg/ml的捕獲抗-Fab抗體(CappelLabs)過夜包被多孔板(ThermoScientific)，然后用含2％(w/v)牛血清白蛋白的PBS在室溫(約23℃)下封閉2至5小時(shí)。在非吸附平板(Nunc#269620)中，將100pM或26pM[125I]-抗原與目的Fab的系列稀釋混合(例如，與Presta,L.G.等,CancerRes.57(1997)4593-4599中的抗-VEGF抗體Fab-12的評估一致)。然后過夜孵育目的Fab；但是，孵育可以持續(xù)更長時(shí)期(例如約65小時(shí))，以確保達(dá)到平衡。然后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕獲平板在室溫下孵育(例如孵育1小時(shí))。然后去除溶液，用含0.1％聚山梨酸酯20()的PBS洗滌平板8次。平板干燥后，加入150μl/孔的閃爍體(MICROSCINT-20TM；Packard)，在TOPCOUNTTMγ計(jì)數(shù)器(Packard)上計(jì)數(shù)平板10分鐘。選擇給出小于或等于最大結(jié)合的20％的每種Fab的濃度用于競爭結(jié)合測定。備選地，可以使用-2000或-3000或T-100(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，用表面等離振子共振測定來測量Kd。例如，將抗原按～10個(gè)響應(yīng)單位(RU)固定在CM5芯片，并用它在25℃下測量Kd值。簡言之，按照供應(yīng)商的說明書，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物傳感芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。在按5μl/分鐘的流速注入前，用10mM檸檬酸鈉pH4.8將抗原稀釋至5μg/ml(～0.2μM)，以達(dá)到約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入1M乙醇胺來封閉未反應(yīng)的基團(tuán)。對于動(dòng)力學(xué)測量，按約25μl/分鐘的流速在25℃下注入兩倍系列稀釋于含0.05％聚山梨酸酯20(TWEEN-20TM)表面活性劑的PBS(PBST)的Fab(0.78nM至500nM)。通過同時(shí)擬合結(jié)合傳感圖和解離傳感圖，用簡單的1:1Langmuir結(jié)合模型(EvaluationSoftware版本3.2)計(jì)算結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)。將平衡解離常數(shù)(Kd)計(jì)算為比值koff/kon。參見例如Chen,Y.等,J.Mol.Biol.293(1999)865-881。如果通過以上表面等離振子共振測定測量的結(jié)合速率(on-rate)超過106M-1s-1，則可以通過使用熒光淬滅技術(shù)來測定結(jié)合速率，如在分光計(jì)，如裝配停流的分光光度計(jì)(AvivInstruments)或具有攪拌杯的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(jì)(ThermoSpectronic)中測量，該技術(shù)在濃度逐漸提高的抗原的存在下測量含20nM抗-抗原的抗體(Fab形式)的PBSpH7.2在25℃下的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)＝295nm；發(fā)射＝340nm，16nm帶通)的提高或降低。2.抗體片段在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體是抗體片段。抗體片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段，及下文所述的其他片段。某些抗體片段的綜述參見Hudson,P.J.等Nat.Med.9(2003)129-134。scFv片段的綜述參見例如PluckthünA.,inThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,113卷,Rosenburg和Moore編輯,(Springer-Verlag,NewYork)(1994),269-315頁；還參見WO93/16185；及US5,571,894和5,587,458。包含補(bǔ)救受體結(jié)合表位殘基且具有增加的體內(nèi)半衰期的Fab和F(ab')2片段的討論參見US5,869,046。雙抗體是具有兩個(gè)抗原結(jié)合部位的抗體片段，其可以是二價(jià)的或雙特異性的。參見例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson,P.J.等,Nat.Med.9(2003)129-134；及Hollinger,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448。三抗體和四抗體還描述于Hudson,P.J.等,Nat.Med.9(2003)129-134中。單結(jié)構(gòu)域抗體是包含抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或部分或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或部分的抗體片段。在某些實(shí)施方案中，單結(jié)構(gòu)域抗體是人單結(jié)構(gòu)域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如6,248,516B1)。可以通過包括但不限于本文所述的完整抗體的蛋白酶解消化以及通過重組宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產(chǎn)生的多種技術(shù)來制備抗體片段。3.嵌合抗體和人源化抗體在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體是嵌合抗體。某些嵌合抗體描述于例如US4,816,567；和Morrison,S.L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81(1984)6851-6855中。在一個(gè)實(shí)例中，嵌合抗體包含非人可變區(qū)(例如衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔、或非人靈長類(如猴)的可變區(qū))和人恒定區(qū)。在另一實(shí)例中，嵌合抗體是“種類轉(zhuǎn)換”抗體，其中種類或亞類已從親本抗體的種類或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結(jié)合片段。在某些實(shí)施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。通常，人源化非人抗體來降低對人類的免疫原性，同時(shí)保留親本非人抗體的特異性和親和力。通常，人源化抗體包含一個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中HVR，例如CDR(或其部分)衍生自非人抗體，F(xiàn)R(或其部分)衍生自人抗體序列。人源化抗體還將可選地包含至少部分人恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，用對應(yīng)的來自非人抗體(例如從其衍生HVR殘基的抗體)的殘基取代人源化抗體中的一些FR殘基，例如以恢復(fù)或改善抗體特異性或親和力。人源化抗體和制備它們的方法綜述于例如Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，并進(jìn)一步描述于例如Riechmann,I.等,Nature332(1988)323-329；Queen,C.等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86(1989)10029-10033；US5,821,337、US7,527,791、US6,982,321；US7,087,409；Kashmiri,S.V.等,Methods36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重建”)；Dall’Acqua,W.F.等,Methods36(2005)43-60(描述“FR改組”)；Osbourn,J.等,Methods36(2005)61-68；及Klimka,A.等,Br.J.Cancer,83(2000)252-260(描述FR改組的“指導(dǎo)選擇”方法)中。可以用來進(jìn)行人源化的人構(gòu)架區(qū)包括但不限于：用“最適”法選擇的構(gòu)架區(qū)(參見例如Sims,M.J.等,J.Immunol.151(1993)2296-2308)；衍生自具體亞組的輕鏈或重鏈可變區(qū)的人抗體的共有序列的構(gòu)架區(qū)(參見例如Carter,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289；和Presta,L.G.等,J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(體細(xì)胞突變)構(gòu)架區(qū)或人種系構(gòu)架區(qū)(參見例如Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和衍生自篩選FR文庫的構(gòu)架區(qū)(參見例如Baca,M.等,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等,J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。4.多特異性抗體在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個(gè)不同部位具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，該結(jié)合特異性中的一種針對BRDU，另一種針對任意其他抗原。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體可以與BRDU的兩個(gè)不同表位結(jié)合。還可以用雙特異性抗體來將細(xì)胞毒劑定位至表達(dá)BRDU的細(xì)胞。雙特異性抗體可以作為全長抗體或抗體片段制備。用于制備多特異性抗體的技術(shù)包括但不限于具有不同特異性的兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表達(dá)(參見Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature305(1983)537-540；WO93/08829；及Traunecker,A.等,EMBOJ.10(1991)3655-3659)和“杵入臼”改造(參見例如US5,731,168)。還可以通過以下來制備多特異性抗體：用于制備抗體Fc-異二聚體分子的工程靜電引導(dǎo)作用(WO2009/089004)；交聯(lián)兩種或多種抗體或片段(參見例如US4,676,980和Brennan,M.等,Science229(1985)81-83)；用亮氨酸拉鏈來產(chǎn)生雙特異性抗體(參見例如Kostelny,S.A.等,J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用用于制備雙特異性抗體片段的“雙抗體”技術(shù)(參見例如Holliger,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448)；使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber,M.等,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；按例如Tutt,A.等,J.Immunol.147(1991)60-69中所述制備三特異性抗體。本文還包括具有三個(gè)或多個(gè)功能性抗原結(jié)合部位的改造抗體，包括“章魚抗體”(參見例如US2006/0025576)。本文的抗體或片段還可以包括含有與BRDU以及另一不同抗原結(jié)合的抗原結(jié)合部位的“雙重作用Fab”或“DAF”(參見例如US2008/0069820)。本文的抗體或片段還可以包括WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、WO2010/112193、WO2010/115589、WO2010/136172、WO2010/145792和WO2010/145793中所述的多特異性抗體。在本文報(bào)道的一個(gè)實(shí)施方案中，本文報(bào)道的多特異性抗體是雙特異性二價(jià)抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文報(bào)道的雙特異性二價(jià)抗體的特征在于包含：a)特異性結(jié)合第一抗原的第一全長抗體的重鏈和輕鏈；和b)特異性結(jié)合第二抗原的第二全長抗體的修飾重鏈和修飾輕鏈，其中恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代?；诖穗p特異性二價(jià)抗體型式的抗體稱為CrossMab。在一個(gè)實(shí)施方案中，該雙特異性二價(jià)抗體的特征在于包含：a)特異性結(jié)合第一抗原的第一全長抗體的重鏈和輕鏈；和b)特異性結(jié)合第二抗原的第二全長抗體的重鏈和輕鏈，其中重鏈的N端通過肽接頭連接至輕鏈的C端。基于此雙特異性二價(jià)抗體型式的抗體稱為單臂單鏈Fab(OascFab)。5.抗體變體在某些實(shí)施方案中，考慮本文提供的抗體的氨基酸序列變體。例如，可以希望改善抗體的結(jié)合親和力和/或其他生物學(xué)特性?？梢酝ㄟ^在編碼抗體的核苷酸序列中引入適當(dāng)?shù)男揎椈蛲ㄟ^肽合成來制備抗體的氨基酸序列變體。這類修飾包括例如從抗體的氨基酸序列缺失殘基和/或在抗體的氨基酸序列內(nèi)插入殘基和/或取代抗體的氨基酸序列內(nèi)的殘基?？梢赃M(jìn)行缺失、插入和取代的任意組合來達(dá)到最終的構(gòu)建體，只要最終的構(gòu)建體具有希望的特征，例如抗原結(jié)合。a)取代、插入和缺失變體在某些實(shí)施方案中，提供具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的抗體變體。進(jìn)行取代誘變的目的位點(diǎn)包括HVR和FR。表1中在“優(yōu)選的取代”的表頭下顯示保守取代。表1中在“示例性取代”的表頭下提供更實(shí)質(zhì)性的改變，如下文參考氨基酸側(cè)鏈種類進(jìn)一步描述?？梢栽谀康目贵w中引入氨基酸取代，并針對希望的活性(例如保留/改善的抗原結(jié)合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)篩選產(chǎn)物。表1原殘基示例性取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Asp,Lys；ArgGlnAsp(D)Glu；AsnGluCys(C)Ser；AlaSerGln(Q)Asn；GluAsnGlu(E)Asp；GlnAspGly(G)AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸LeuLeu(L)正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Trp；Leu；Val；Ile；Ala；TyrTyrPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)Val；SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸Leu氨基酸可以按照共同的側(cè)鏈性質(zhì)分組：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)堿性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守取代將需要將這些種類之一的成員換為另一種類。一類取代變體涉及取代親本抗體(例如人源化抗體或人抗體)的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，所得到的選擇用于進(jìn)一步研究的一種或多種變體將相對于親本抗體具有某些生物學(xué)特性(例如提高的親和力、降低的免疫原性)的修飾(例如改善)和/或?qū)⒒旧媳Ａ粲H本抗體的某些生物學(xué)特性。示例性取代變體是親和力成熟的抗體，其可以例如用基于噬菌體展示的親和力成熟技術(shù)(如本文所述的那些)方便地產(chǎn)生。簡言之，突變一個(gè)或多個(gè)HVR殘基，將變體抗體展示在噬菌體上，并針對具體的生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)進(jìn)行篩選?？梢栽贖VR中進(jìn)行改變(例如取代)，例如以改善抗體親和力?？梢栽贖VR“熱點(diǎn)”(即由在體細(xì)胞成熟過程中以高頻率發(fā)生突變的密碼子編碼的殘基)(參見例如Chowdhury,P.S.,MethodsMol.Biol.207(2008)179-196)和/或SDR(a-CDR)中進(jìn)行這類改變，針對結(jié)合親和力測試所得到的變體VH或VL。通過構(gòu)建二級文庫并從二級文庫重新選擇的親和力成熟已描述于例如Hoogenboom,H.R.等inMethodsinMolecularBiology178(2002)1-37中。在親和力成熟的一些實(shí)施方案中，通過多種方法(例如易錯(cuò)PCR、鏈改組或寡核苷酸定點(diǎn)誘變)中的任一種來在選擇用于成熟的可變基因中引入多樣性。然后產(chǎn)生二級文庫。然后篩選該文庫來鑒定具有希望的親和力的任意抗體變體。引入多樣性的另一種方法涉及HVR定點(diǎn)途徑，其中隨機(jī)化幾個(gè)HVR殘基(例如每次4-6個(gè)殘基)。可以例如用丙氨酸掃描誘變或模擬來明確地鑒定出涉及抗原結(jié)合的HVR殘基。尤其是通常靶向CDR-H3和CDR-L3。在某些實(shí)施方案中，取代、插入或缺失可以發(fā)生在一個(gè)或多個(gè)HVR內(nèi)，只要這類改變不實(shí)質(zhì)性降低抗體結(jié)合抗原的能力。例如，可以在HVR中進(jìn)行不實(shí)質(zhì)性降低結(jié)合親和力的保守改變(例如本文提供的保守取代)。這類改變可以在HVR“熱點(diǎn)”或SDR之外。在上文提供的變體VH和VL序列的某些實(shí)施方案中，各HVR未改變，或包含不超過一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸取代。如Cunningham,B.C.和Wells,J.A.,Science244(1989)1081-1085所述，用于鑒定可以靶向進(jìn)行誘變的抗體的殘基或區(qū)域的方法稱為“丙氨酸掃描誘變”。在此方法中，鑒定殘基或靶殘基組(例如帶電荷的殘基，如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(例如丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以確定抗體與抗原的相互作用是否受到影響?？梢栽谧C明對最初的取代的功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。備選地或此外，用抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來鑒定抗體和抗原之間的接觸點(diǎn)。這類接觸殘基和鄰近殘基可以作為取代的候選殘基靶向或消除。可以篩選變體來確定它們是否包含希望的特性。氨基酸序列插入包括長度在一個(gè)殘基至含有一百或更多個(gè)殘基的多肽的范圍內(nèi)的氨基端和/或羧基端融合，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的實(shí)例包括具有N端蛋氨酰殘基的抗體?？贵w分子的其他插入變體包括抗體的N或C端與酶(例如，對于ADEPT)或增加抗體的血清半衰期的多肽的融合。一個(gè)優(yōu)選的變體是單半胱氨酸變體，其中重鏈可變結(jié)構(gòu)域中Kabat位置53的氨基酸殘基是半胱氨酸。b)糖基化變體在某些實(shí)施方案中，改變本文提供的抗體來提高或降低該抗體糖基化的程度。通過改變氨基酸序列，使得產(chǎn)生或去除一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，可以方便地實(shí)現(xiàn)對抗體進(jìn)行糖基化位點(diǎn)的加入或缺失。在抗體包含F(xiàn)c區(qū)時(shí)，可以改變附著于Fc區(qū)的糖類。哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的天然抗體通常包含分枝的雙觸角寡糖，其一般通過N連接附著于Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297(參見例如Wright,A.和Morrison,S.L.,TIBTECH15(1997)26-32)。寡糖可以包括多種糖類，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在雙觸角寡糖結(jié)構(gòu)的“莖”中附著于GlcNAc的巖藻糖。在一些實(shí)施方案中，可以進(jìn)行本發(fā)明的抗體中的寡糖的修飾來產(chǎn)生具有某些改善的特性的抗體變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有缺乏(直接或間接)附著于Fc區(qū)的巖藻糖的糖類結(jié)構(gòu)的抗體變體。例如，這種抗體中的巖藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。相對于通過例如WO2008/077546中所述的MALDI-TOF質(zhì)譜法測量的附著于Asn297的所有糖結(jié)構(gòu)(例如復(fù)合、雜合和高甘露糖結(jié)構(gòu))的總和，通過計(jì)算Asn297處的糖鏈內(nèi)巖藻糖的平均量來測定巖藻糖的量。Asn297指定位在Fc區(qū)中的約297位(Fc區(qū)殘基的EU編號)的天冬酰胺殘基；但是，由于抗體中小的序列變異，Asn297也可以定位在297位上游或下游約±3氨基酸，即在294位和300位之間。這類巖藻糖基化變體可以具有改善的ADCC功能(參見例如US2003/0157108；US2004/0093621)。涉及“去巖藻糖基化”或“巖藻糖缺乏”的抗體變體的出版物的實(shí)例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A.等,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能夠產(chǎn)生去巖藻糖基化的抗體的細(xì)胞系的實(shí)例包括蛋白質(zhì)巖藻糖基化缺陷的Lec13CHO細(xì)胞(Ripka,J.等,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US2003/0157108；及WO2004/056312，尤其是在實(shí)施例11中)和敲除細(xì)胞系，如α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因FUT8敲除的CHO細(xì)胞(參見例如Yamane-Ohnuki,N.等,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO2003/085107)。還提供具有二等分寡糖的抗體變體，例如其中附著于抗體Fc區(qū)的雙觸角寡糖被GlcNAc二等分。這類抗體變體可以具有減少的巖藻糖基化和/或改善的ADCC功能。這類抗體變體的實(shí)例描述于例如WO2003/011878、US6,602,684和US2005/0123546中。還提供在附著于Fc區(qū)的寡糖中具有至少一個(gè)半乳糖殘基的抗體變體。這類抗體變體可以具有改善的CDC功能。這類抗體變體描述于例如WO1997/30087、WO1998/58964和WO1999/22764中。c)Fc區(qū)變體在某些實(shí)施方案中，可以向本文提供的抗體的Fc區(qū)中引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾，從而產(chǎn)生Fc區(qū)變體。Fc區(qū)變體可以包含在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處含有氨基酸修飾(例如取代)的人Fc區(qū)序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū))。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮具有一些但不是全部效應(yīng)子功能的抗體變體，這使得它成為其中抗體的體內(nèi)半衰期重要但某些效應(yīng)子功能(如補(bǔ)體和ADCC)不必要或有害的應(yīng)用所希望的候選者?？梢赃M(jìn)行體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性測定來確認(rèn)CDC和/或ADCC活性的降低/減損。例如，可以進(jìn)行Fc受體(FcR)結(jié)合測定來確?？贵w缺乏FcγR結(jié)合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結(jié)合能力。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞NK細(xì)胞僅表達(dá)Fc(RIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)總結(jié)在Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464頁上的表3中。評估目的分子的ADCC活性的體外測定的非限制性實(shí)例描述于US5,500,362(參見例如Hellstrom,I.等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83(1986)7059-7063和Hellstrom,I.等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82(1985)1499-1502)；US5,821,337(參見Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。備選地，可以利用非放射性測定方法(參見例如用于流式細(xì)胞術(shù)的ACTITM非放射性細(xì)胞毒性測定(CellTechnology,Inc.MountainView,CA)；和CytoTox非放射性細(xì)胞毒性測定(Promega,Madison,WI))。用于這類測定的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。備選地或此外，可以在體內(nèi)，例如在諸如公開于Clynes,R.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(1998)652-656中的動(dòng)物模型的動(dòng)物模型中評估目的分子的ADCC活性。還可以進(jìn)行C1q結(jié)合測定來確認(rèn)抗體不能結(jié)合C1q，并因此缺乏CDC活性。參見例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c結(jié)合ELISA。為了評估補(bǔ)體活化，可以進(jìn)行CDC測定(參見例如Gazzano-Santoro,H.等,J.Immunol.Methods202(1996)163-171；Cragg,M.S.等,Blood101(2003)1045-1052；及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103(2004)2738-2743)。還可以用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行FcRn結(jié)合和體內(nèi)清除/半衰期測定(參見例如Petkova,S.B.等,Int.Immunol.18(2006)1759-1769)。具有減少的效應(yīng)子功能的抗體包括具有Fc區(qū)殘基238、265、269、270、297、327和329中的一個(gè)或多個(gè)取代的那些(US6,737,056)。這類Fc變體包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的兩個(gè)或多個(gè)處具有取代的Fc突變體，包括具有殘基265和297至丙氨酸的取代的所謂“DANA”Fc突變體(US7,332,581)。描述了某些具有改善或減少的與FcR的結(jié)合的抗體變體(參見例如US6,737,056；WO2004/056312；及Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在某些實(shí)施方案中，抗體變體包含具有一個(gè)或多個(gè)改善ADCC的氨基酸取代(例如Fc區(qū)的298、333和/或334位(殘基的EU編號)的取代)的Fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，例如，如US6,194,551、WO99/51642和Idusogie,E.E.等,J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述，在Fc區(qū)中進(jìn)行改變，該改變導(dǎo)致改變(即改善或減少)的C1q結(jié)合和/或依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)。具有增加的半衰期和改善的與新生兒Fc受體(FcRn)(其負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移至胎兒(Guyer,R.L.等,J.Immunol.117(1976)587-593和Kim,J.K.等,J.Immunol.24(1994)2429-2434))的結(jié)合的抗體描述于US2005/0014934中。那些抗體包含其中具有一個(gè)或多個(gè)取代的Fc區(qū)，該取代改善Fc區(qū)與FcRn的結(jié)合。這類Fc變體包括在Fc區(qū)殘基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一個(gè)或多個(gè)處具有取代的那些，例如，F(xiàn)c區(qū)殘基434的取代(US7,371,826)。關(guān)于Fc區(qū)變體的其他實(shí)例，還參見Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature322(1988)738-740；US5,648,260；US5,624,821；和WO94/29351。d)半胱氨酸改造的抗體變體在某些實(shí)施方案中，可以希望產(chǎn)生半胱氨酸改造的抗體，例如“thioMAb”，其中用半胱氨酸殘基取代抗體的一個(gè)或多個(gè)殘基。在具體實(shí)施方案中，取代的殘基存在于抗體的可接近部位。通過用半胱氨酸取代那些殘基，從而將反應(yīng)性巰基放置在抗體的可接近部位，并可以用于將抗體綴合至其他部分，如藥物部分或接頭-藥物部分，以產(chǎn)生本文進(jìn)一步描述的免疫綴合物。在某些實(shí)施方案中，可以用半胱氨酸取代以下殘基中的任意一個(gè)或多個(gè)：輕鏈的V205(Kabat編號)；重鏈的A118(EU編號)；重鏈Fc區(qū)的S400(EU編號)。半胱氨酸改造的抗體可以按例如美國專利號7,521,541中所述產(chǎn)生。e)抗體衍生物在某些實(shí)施方案中，可以進(jìn)一步修飾本文提供的抗體來包含本領(lǐng)域已知且易于得到的附加的非蛋白質(zhì)部分。適合用于衍生化抗體的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實(shí)例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯比咯烷酮、聚-1,3-二氧戊環(huán)、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或隨機(jī)共聚物)、葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、propropyleneglycol同聚物、prolypropyleneoxide/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的穩(wěn)定性，聚乙二醇丙醛可以在制備中具有優(yōu)勢。聚合物可以具有任意分子量，且可以分枝或不分枝。附著于抗體的聚合物的數(shù)目可以不同，且如果附著超過一個(gè)聚合物，則它們可以是相同或不同的分子。一般而言，可以根據(jù)包括但不限于抗體要改善的具體特性或功能、抗體衍生物是否將在確定的條件下用于治療等的考慮來確定用于衍生化的聚合物的數(shù)目和/或類型。在另一實(shí)施方案中，提供抗體和可通過暴露于照射來選擇性加熱的非蛋白質(zhì)部分的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該非蛋白質(zhì)部分是碳納米管(Kam,N.W.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102(2005)11600-11605)。照射可以具有任意波長，且包括但不限于不損害普通細(xì)胞，但加熱非蛋白質(zhì)部分至殺死靠近抗體-非蛋白質(zhì)部分的細(xì)胞的溫度的波長。f)異二聚化為了產(chǎn)生多特異性抗體，可以有必要促進(jìn)異二聚體重鏈配對的形成。存在幾種進(jìn)行CH3修飾來迫使異二聚化的方法，其詳細(xì)描述于例如WO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012058768、WO2013157954、WO2013096291中。在所有這類方法中，通常以互補(bǔ)方式改造第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域和第二重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域二者，使得每個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域(或包含它的重鏈)不再可與其自己同二聚化，而是迫使與互補(bǔ)的改造的另一CH3結(jié)構(gòu)域異二聚化(使得第一和第二CH3結(jié)構(gòu)域(隨之第一和第二重鏈)異二聚化，而不形成兩個(gè)第一或兩個(gè)第二CH3結(jié)構(gòu)域之間的同二聚體)。考慮將這些用于改善重鏈異二聚化的不同方法作為與本文報(bào)道的多特異性抗體中減少輕鏈錯(cuò)配和Bence-Jones型副產(chǎn)物的重鏈和/或輕鏈修飾(一個(gè)結(jié)合臂中的VH和VL交換/取代和在CH1/CL界面引入帶相反電荷的帶電荷氨基酸的取代)組合的不同選擇。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中(在多特異性抗體在重鏈中包含CH3結(jié)構(gòu)域的情況下)，通過“杵入臼”技術(shù)改變本發(fā)明的多特異性抗體的CH3結(jié)構(gòu)域，“杵入臼”技術(shù)以幾個(gè)實(shí)例詳細(xì)描述于例如WO96/027011；Ridgway,J.B.等,ProteinEng.9(1996)617-621；Merchant,A.M.等,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；WO98/050431中。在此方法中，改變兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的相互作用表面，以增加包含這兩種CH3結(jié)構(gòu)域的兩條重鏈的異二聚化。(兩條重鏈的)兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)可以是“杵”，而另一個(gè)是“臼”。二硫鍵的引入進(jìn)一步穩(wěn)定異二聚體(Merchant,A.M.等,NatureBiotechnol.16(1998)677-681；Atwell,S.等,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)，并提高異二聚體的產(chǎn)率。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，該多特異性抗體(在每條重鏈中包含CH3結(jié)構(gòu)域)進(jìn)一步表征為：多特異性抗體的第一重鏈的第一CH3結(jié)構(gòu)域和多特異性抗體的第二重鏈的第二CH3結(jié)構(gòu)域各自在包含抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的原界面的界面處遇見。其中改變該界面，以促進(jìn)多特異性抗體的形成，其中該改變表征為：i)改變一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，使得在與多特異性抗體內(nèi)的另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原界面遇見的一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原界面內(nèi)，用具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基取代氨基酸殘基，從而在一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生凸起，該凸起可放置在另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凹陷中，和ii)改變另一條重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域，使得在與多特異性抗體內(nèi)的第一CH3結(jié)構(gòu)域的原界面遇見的第二CH3結(jié)構(gòu)域的原界面內(nèi)，用具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基取代氨基酸殘基，從而在第二CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)產(chǎn)生凹陷，該凹陷內(nèi)可放置第一CH3結(jié)構(gòu)域的界面內(nèi)的凸起。優(yōu)選地，具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。優(yōu)選地，具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過引入半胱氨酸作為每個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的對應(yīng)位置上的氨基酸來進(jìn)一步改變兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域，使得兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之間可以形成二硫鍵。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多特異性抗體在“杵鏈”的第一CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸T366W突變，在“臼鏈”的第二CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸T366S、L368A、Y407V突變。也可以在CH3結(jié)構(gòu)域之間使用附加的鏈間二硫鍵(Merchant,A.M.等,NatureBiotech.16(1998)677-681)，例如通過將氨基酸Y349C突變引入“臼鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域和將氨基酸E356C突變或氨基酸S354C突變引入“杵鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多特異性抗體(其在每條重鏈中包含CH3結(jié)構(gòu)域)在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之一中包含氨基酸S354C、T366W突變，在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的另一個(gè)中包含氨基酸Y349C、T366S、L368A、Y407V突變(一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中附加的氨基酸S354C突變和另一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中附加的氨基酸Y349C突變形成鏈間二硫鍵)(Kabat編號)?？紤]將進(jìn)行CH3修飾來迫使異二聚化的其他技術(shù)作為備選，其描述于例如WO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012058768、WO2013157954、WO2013096291中。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用EP1870459A1中所述的異二聚化方法。此方法基于在兩條重鏈間的CH3/CH3結(jié)構(gòu)域界面中的特定位置處引入帶相反電荷的帶電荷氨基酸的取代/突變。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多特異性抗體在(多特異性抗體的)第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸R409D、K370E突變，在(多特異性抗體的)第二重鏈的第二CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸D399K、E357K突變(Kabat編號)。在另一實(shí)施方案中，該多特異性抗體在“杵鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸T366W突變，在“臼鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸T366S、L368A、Y407V突變，此外，在“杵鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸R409D、K370E突變，在“臼鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸D399K、E357K突變。在另一實(shí)施方案中，該多特異性抗體在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之一中包含氨基酸S354C、T366W突變，在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的另一個(gè)中包含氨基酸Y349C、T366S、L368A、Y407V突變，或者該多特異性抗體在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之一中包含氨基酸Y349C、T366W突變，在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的另一個(gè)中包含氨基酸S354C、T366S、L368A、Y407V突變，此外，在“杵鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中包含R409D、K370E突變，在“臼鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸D399K、E357K突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用WO2013/157953中所述的異二聚化方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸T366K突變，而第二CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸L351D突變。在另一實(shí)施方案中，第一CH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包含氨基酸L351K突變。在另一實(shí)施方案中，第二CH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包含選自Y349E、Y349D和L368E的氨基酸突變(優(yōu)選L368E)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用WO2012/058768中所述的異二聚化方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸L351Y、Y407A突變，第二CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸T366A、K409F突變。在另一實(shí)施方案中，第二CH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步在T411、D399、S400、F405、N390或K392位包含氨基酸突變，例如選自：a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W；b)D399R、D399W、D399Y或D399K；c)S400E、S400D、S400R、S400K、F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W、N390R、N390K或N390D、K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E。在另一實(shí)施方案中，第一CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸L351Y、Y407A突變，第二CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸T366V、K409F突變。在另一實(shí)施方案中，第一CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸Y407A突變，第二CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸T366A、K409F突變。在另一實(shí)施方案中，第二CH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包含氨基酸K392E、T411E、D399R和S400R突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用WO2011/143545中所述的異二聚化方法，例如在選自368和409的位置處進(jìn)行氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用WO2011/090762中所述的異二聚化方法，其也使用上述杵入臼技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸T366W突變，第二CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸Y407A突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸T366Y突變，第二CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸Y407T突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多特異性抗體屬于IgG2同種型，且使用WO2010/129304中所述的異二聚化方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用WO2009/089004中所述的異二聚化方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一CH3結(jié)構(gòu)域包含用帶負(fù)電荷氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，優(yōu)選K392D或N392D)取代氨基酸殘基K392或N392，第二CH3結(jié)構(gòu)域包含用帶正電荷氨基酸(例如賴氨酸(K)或精氨酸(R)，優(yōu)選D399K、E356K、D356K或E357K，更優(yōu)選D399K和E356K)取代氨基酸殘基D399、E356、D356或E357。在另一實(shí)施方案中，第一CH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包含用帶負(fù)電荷氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，優(yōu)選K409D或N409D)取代氨基酸殘基K409或R409。在另一實(shí)施方案中，第一CH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步或備選地包含用帶負(fù)電荷氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))取代氨基酸殘基K439和/或K370。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用WO2007/147901中所述的異二聚化方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸K253E、D282K和K322D突變，第二CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸D239K、E240K和K292D突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用WO2007/110205中所述的異二聚化方法。B.抗BRDU抗體核酸復(fù)合物siRNA和含有半抗原的siRNA衍生物siRNA設(shè)計(jì)和構(gòu)建的一般原則為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，此處將不詳細(xì)考慮。我們的模塊靶向方法的重要特征是將siRNA連接至半抗原或含有半抗原的部分，而不使siRNA功能性或半抗原和bsAb(雙特異性抗體)的半抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的相互作用受損。為了直接將半抗原與所選擇的siRNA偶聯(lián)，選擇了雙鏈siRNA衍生物的有義鏈的3’端。之前發(fā)現(xiàn)siRNA中的此位置耐受附加的實(shí)體(如膽固醇(25))而不影響siRNA活性。與此一致，已觀察到，3’-半抗原綴合的siRNA衍生物的功效(即它們降低靶mRNA水平的能力)與未修飾的siRNA相同(13)。作為附加的修飾，可以將熒光化合物如Cy5附著至有義鏈的5’端，以使得能夠顯示和追蹤siRNA(例如Dig-siRNA-Cy5)。按我們的經(jīng)驗(yàn)，半抗原偶聯(lián)至有義鏈的5’端也產(chǎn)生具有良好活性的siRNA，但不優(yōu)于偶聯(lián)至3’端。含有半抗原的納米顆粒半抗原偶聯(lián)的siRNA可以直接與bsAb復(fù)合。這些復(fù)合物能夠特異性遞送siRNA至在其表面表達(dá)各靶抗原的細(xì)胞。但是，siRNA在胞內(nèi)小泡上和胞內(nèi)小泡中(通過內(nèi)化作用)的累積本身在大多數(shù)情況下并不導(dǎo)致特異性基因敲減。原因是未修飾的siRNA累積在內(nèi)體區(qū)室中而不逃逸進(jìn)入胞質(zhì)(13)。為了能夠遞送入胞質(zhì)，可將siRNA包裝入在其表面攜帶半抗原的納米顆粒(1、2、26、27、3、28、29、30、5、31、32、9)。在摻入(大)納米顆粒的結(jié)構(gòu)中時(shí)，這些半抗原需可被bsAb接近。已描述了用于有效siRNA遞送的多種納米顆粒，其中許多包含PEG。因此，產(chǎn)生含有半抗原的納米顆粒的一種方式是用半抗原偶聯(lián)的PEG衍生物作為用于納米顆粒產(chǎn)生的成分。這些試劑摻入制劑產(chǎn)生了半抗原裝飾的納米顆粒(例如Dig-LNP中的siRNA)。半抗原裝飾的納米顆粒在一些情況下也可以通過將半抗原偶聯(lián)的siRNA配制為標(biāo)準(zhǔn)納米顆粒來產(chǎn)生。令人驚奇地，這產(chǎn)生了半抗原分子以抗體可接近的方式暴露于其表面的納米顆粒。熒光標(biāo)記的siRNA可以以相同的方式摻入半抗原裝飾的納米顆粒而不喪失熒光信號。這可以用于顯示和追蹤含有半抗原的bsAb靶向納米顆粒。兩類已建立的納米顆粒是動(dòng)態(tài)聚綴合物(DPC)和脂基納米顆粒(LNP)。含有半抗原綴合的PEG脂質(zhì)的DPC和LNP已用于構(gòu)建用于細(xì)胞靶向的siRNA部分(13)。DPC包括支架試劑，如聚丁基和氨基乙烯醚(PBAVE)，其是通過用聚乙二醇(PEG)可逆共價(jià)修飾而免受非特異性細(xì)胞相互作用的溶內(nèi)體(endosomolytic)聚合物。siRNA和靶抗原都可以通過接頭附著于聚合物，該接頭穩(wěn)定(例如對于半抗原連接)或能夠進(jìn)行pH依賴性有效負(fù)載釋放(30、32、33)。半抗原裝飾的DPC可以按確定的摩爾比(例如1:1或2:1)與bsAb符合，以產(chǎn)生bsAb靶向DPC。bsAb加載含有siRNA的DPC導(dǎo)致可通過SEC-MALLS檢測的分子量和流體動(dòng)力學(xué)半徑增加。例如，不含bsAb的Dig-聚合物-siRNADPC是含有估計(jì)分子量在300-720kDa之間、流體動(dòng)力學(xué)半徑為7-10nm的分子的多分散液。加入bsAb形成半抗原-聚合物-siRNADPC-bsAb復(fù)合物提高分子量范圍至500-1100kDa，提高流體動(dòng)力學(xué)半徑至9-12.5nm(13)。LNP包含聚乙二醇(PEG)-脂質(zhì)，其親脂?；滃^定微粒中的親脂PEG分子。這確保微粒穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)完整性。PEG-脂質(zhì)的酰基鏈可具有多種長度。已成功使用的LNP包含PEG-脂質(zhì)，該P(yáng)EG-脂質(zhì)具有由18個(gè)methandiyl基團(tuán)組成且認(rèn)為不可交換的相對長的C18錨，或由16個(gè)methandiyl基團(tuán)組成且高度可交換的較短的C16錨(34、35)。PBS中的單獨(dú)或與bsAb復(fù)合的含半抗原綴合siRNA的LNP可以通過動(dòng)態(tài)光散射(DLS)來分析，以測定其流體動(dòng)力學(xué)半徑和多分散指數(shù)(Pdi)?？梢詫NP與bsAb一起在室溫孵育(～25℃；至多3小時(shí))，并通過DLS測定微粒大小和多分散性的變化時(shí)程(13、36)。我們成功使用的半抗原裝飾的LNP制劑包含總計(jì)1.4mol％PEG-脂質(zhì)，其中0.4或0.04mol％為半抗原偶聯(lián)(Dig修飾)C18PEG-脂質(zhì)。其余不含半抗原的PEG-脂質(zhì)包含C16脂質(zhì)錨，以使得能夠進(jìn)行有效的LNP去保護(hù)和高siRNA轉(zhuǎn)移/轉(zhuǎn)染功效(34、35、36)。使用這類LNP，以1.7nM的IC50達(dá)到了至多90％敲減的敲減效率。此外，與用其他siRNA制劑(37)獲得的結(jié)果不同，用這些LNP未觀察到任何免疫刺激效應(yīng)(13)。引用的文件：1.Akinc,A.等,Mol.Ther.18(2010)1357-1346.2.Bhattarai,S.R.等,Pharm.Res.27(2010)2556-2568.3.Lee,S.K.等,Meth.Enzymol.502(2012)91-122.4.Leus,N.G.等,Int.J.Pharm.459(2014)40-50.5.Semple,S.C.等,Nat.Biotechnol.28(2010)172-176.6.Song,E.等,Nat.Biotechnol.23(2005)709-717.7.Toloue,M.M.和Ford,L.P.,MethodsMol.Biol.764(2011)123-139.8.Yu,B.等,AAPSJ11(2009)195-203.9.Zimmermann,T.S.等,Nature441(2006)111-114.10.Beck,A.等,Nat.Rev.Immunol.10(2010)345-352.11.Weidle,U.H.等,CancerGenomicsProteomics10(2013)1-18.12.MetzS.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA108(2011)8194-8199.13.Schneider,B.等,Mol.Ther.NucleicAcids.1(2012)e46.14.Jung,S.H.等,Proteins19(1994)35-47.15.Reiter,Y.等,ProteinEng.8(1995)1323-1331.16.Reiter,Y.等,Nat.Biotechnol.14(1996)1239-1245.17.Ridgway,J.B.等,ProteinEng.9(1996)617-621.18.Molina,M.A.等,CancerRes.61(2001)4744-4749.19.Baselga,J.,Eur.J.Cancer37(2001)Suppl.4,S16-S22.20.Kies,M.S.和Harari,P.M.,Curr.Opin.Investig.Drugs3(2002)1092-1100.21.Chitnis,M.M.等,Clin.CancerRes.14(2008)6364-6370.22.Mansfield,E.等,Blood90(1997)2020-2026.23.Brinkmann,U.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(1991)8616-8620.24.Pastan,I.等,CancerRes.51(1991)3781-3787.25.Soutschek,J.等,Nature432(2004)173-178.26.Chan,D.P.等,Biomaterials34(2013)8408-8415.27.Jhaveri,A.M.和Torchilin,V.P.,FrontPharmacol.5(2014)77.28.Malhotra,M.等,Int.J.Nanomedicine8(2013)2041-2052.29.MieleE.等,Int.J.Nanomedicine7(2012)3637-3657.30.Rozema,D.B.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA104(2007)12982-12987.31.Tiera,M.J.等,Curr.GeneTher.13(2013)358-369.32.Wolff,J.A.和Rozema,D.B.,Mol.Ther.16(2008)8-15.33.Wong,S.C.等,NucleicAcidTher.22(2012)380-390.34.Akinc,A.等,Mol.Ther.17(2009)872-879.35.Sou,K.等,Bioconjug.Chem.11(2000)372-379.36.Tao,W.等,Mol.Ther.18(2010)1657-1666.37.Robbins,M.等,Oligonucleotides19(2009)89-102.38.Grote,M.等,MethodsMol.Biol.901(2012)247-263.39.Haas,A.K.等,MethodsMol.Biol.901(2012)265-276.40.Aigner,A.,Curr.Pharm.Des.14(2008)3603-3619.41.Leucuta,S.E.,Curr.Drug.Deliv.10(2013)208-240.42.Burris,T.P.等,Mol.Endocrinol.13(1999)410-417.43.Collins,M.L.等,NucleicAcidRes.25(1997)2979-2984.C.重組方法和組合物抗體可以用例如US4,816,567中所述的方法和組合物產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的編碼本文所述的抗BRDU抗體的核酸。這種核酸可以編碼含有抗體的VL的氨基酸序列和/或含有抗體的VH的氨基酸序列(例如抗體的輕鏈和/或重鏈)。在另一實(shí)施方案中，提供一個(gè)或多個(gè)包含這種核酸的載體(例如表達(dá)載體)。在另一實(shí)施方案中，提供包含這種核酸的宿主細(xì)胞。在一個(gè)這種實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含以下(例如已用以下轉(zhuǎn)化)：(1)包含編碼含有抗體的VL的氨基酸序列和含有抗體的VH的氨基酸序列的核酸的載體；或(2)包含編碼含有抗體的VL的氨基酸序列的核酸的第一載體和包含編碼含有抗體的VH的氨基酸序列的核酸的第二載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞(例如Y0、NS0、Sp20細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供制備抗BRDU抗體的方法，其中該方法包括在適于表達(dá)抗體的條件下培養(yǎng)上文提供的含有編碼抗體的核酸的宿主細(xì)胞，并可選地從宿主細(xì)胞(或宿主細(xì)胞培養(yǎng)基)回收抗體。對于抗BRDU抗體的重組產(chǎn)生，分離例如上文所述的編碼抗體的核酸，并插入一個(gè)或多個(gè)載體用于在宿主細(xì)胞中進(jìn)一步克隆和/或表達(dá)。這種核酸可以用常規(guī)方法(例如通過使用能夠特異性結(jié)合編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易地分離和測序。適合用于克隆或表達(dá)編碼抗體的載體的宿主細(xì)胞包括本文所述的原核或真核細(xì)胞。例如，尤其是在不需要糖基化和Fc效應(yīng)子功能時(shí)，可以在細(xì)菌中產(chǎn)生抗體。抗體片段和多肽在細(xì)菌中的表達(dá)參見例如US5,648,237、US5,789,199和US5,840,523。(還參見Charlton,K.A.,In:MethodsinMolecularBiology,248卷Lo,B.K.C.(編輯),HumanaPress,Totowa,NJ,2003),245-254頁，其描述抗體片段在大腸桿菌中的表達(dá))。表達(dá)后，可以從可溶性級分中的細(xì)菌細(xì)胞糊分離抗體，并可以進(jìn)一步純化。除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母的真核微生物也是編碼抗體的載體的適宜的克隆或表達(dá)宿主，包括糖基化途徑已“人源化”，導(dǎo)致產(chǎn)生具有部分或完全人糖基化模式的抗體的真菌和酵母菌株。參見Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等,Nat.Biotech.24(2006)210-215。適合用于表達(dá)糖基化抗體的宿主細(xì)胞也衍生自多細(xì)胞生物(無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物)。無脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括植物和昆蟲細(xì)胞。已鑒定了許多可以與昆蟲細(xì)胞結(jié)合使用，尤其是用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞的桿狀病毒毒株。植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。見例如US5,959,177、US6,040,498、US6,420,548、US7,125,978和US6,417,429(描述用于在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生抗體的PLANTIBODIESTM技術(shù))。脊椎動(dòng)物細(xì)胞也可以用作宿主。例如，可以使用適應(yīng)懸浮生長的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的其他實(shí)例是SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(COS-7)；人胚腎細(xì)胞系(描述于例如Graham,F.L.等,J.GenVirol.36(1977)59-74中的293或293細(xì)胞)；幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)；小鼠支持細(xì)胞(描述于例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中的TM4細(xì)胞)；猴腎細(xì)胞(CV1)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA)；犬腎細(xì)胞(MDCK)；buffalo大鼠肝細(xì)胞(BRL3A)；人肺細(xì)胞(W138)；人肝細(xì)胞(HepG2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT060562)；描述于例如Mather,J.P.等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中的TRI細(xì)胞；MRC5細(xì)胞；及FS4細(xì)胞。其他有用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，包括DHFR-CHO細(xì)胞(Urlaub,G.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220)；及骨髓瘤細(xì)胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。適合用于抗體產(chǎn)生的某些哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的綜述參見例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,MethodsinMolecularBiology,248卷,Lo,B.K.C.(編輯),HumanaPress,Totowa,NJ(2004),255-268頁。D.測定可以通過本領(lǐng)域已知的多種測定針對其物理/化學(xué)性質(zhì)和/或生物學(xué)活性鑒定、篩選或表征本文提供的抗BRDU抗體。結(jié)合測定和其他測定一方面，例如通過已知的方法(如ELISA、Western印跡等)針對其抗原結(jié)合活性測試本發(fā)明的抗體。另一方面，可以用競爭測定來鑒定與本文報(bào)道的抗體競爭結(jié)合BRDU的抗體。在示例性競爭測定中，在溶液中孵育固定的BRDU，該溶液包含結(jié)合BRDU的第一標(biāo)記抗體和針對其與該第一抗體競爭結(jié)合BRDU的能力進(jìn)行測試的第二未標(biāo)記抗體。該第二抗體可以存在于雜交瘤上清中。作為對照，在溶液中孵育固定的BRDU，該溶液包含該第一標(biāo)記抗體但不包含該第二未標(biāo)記抗體。在允許該第一抗體與BRDU結(jié)合的條件下孵育后，去除過量的未結(jié)合抗體，并測量與固定的BRDU結(jié)合的標(biāo)記的量。如果測試樣品中與固定的BRDU結(jié)合的標(biāo)記的量相對于對照樣品實(shí)質(zhì)性減少，則表明該第二抗體與該第一抗體競爭結(jié)合BRDU。參見Harlow,E.和Lane,D.,Antibodies:ALaboratoryManual,第14章,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1988)。E.免疫綴合物本發(fā)明還提供包含與一種或多種細(xì)胞毒劑(如化療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素綴合的本文的抗BRDU抗體的免疫綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫綴合物是抗體-藥物綴合物(ADC)，其中抗體與一種或多種藥物綴合，該藥物包括但不限于美登木素生物堿(maytansinoid，參見US5,208,020、US5,416,064和EP0425235B1)；auristatin，如monomethylauristatin藥物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(參見US5,635,483、US5,780,588和US7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；棘孢霉素(calicheamicin)或其衍生物(參見US5,712,374、US5,714,586、US5,739,116、US5,767,285、US5,770,701、US5,770,710、US5,773,001和US5,877,296；Hinman,L.M.等,CancerRes.53(1993)3336-3342；和Lode,H.N.等,CancerRes.58(1998)2925-2928)；蒽環(huán)類抗生素(anthracycline)，如柔紅霉素或阿霉素(參見Kratz,F.等,Curr.Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey,S.C.等,Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358-362；Torgov,M.Y.等,Bioconjug.Chem.16(2005)717-721；Nagy,A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(2000)829-834；Dubowchik,G.M.等,Bioorg.&Med.Chem.Letters12(2002)1529-1532；King,H.D.等,J.Med.Chem.45(200294336-4343；和US6,630,579)；氨甲喋呤；長春酰胺；紫杉烷(taxane)，如多西紫杉(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、larotaxel、tesetaxel和ortataxel；單端孢霉烯(trichothecene)；及CC1065。在另一實(shí)施方案中，免疫綴合物包含與酶活性毒素或其片段綴合的本文所述的抗體，該酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白質(zhì)、香石竹毒蛋白(dianthin)蛋白質(zhì)、美洲商陸(Phytolacaamericana)蛋白質(zhì)(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制劑、麻風(fēng)樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、sapaonariaofficinalis抑制劑、白樹毒素(gelonin)、米托潔林(mitogellin)、局限曲霉素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊諾霉素(enomycin)和單端孢霉烯(tricothecenes)。在另一實(shí)施方案中，免疫綴合物包含與放射性原子綴合形成放射性綴合物的本文所述的抗體?？捎枚喾N放射性同位素來產(chǎn)生放射性綴合物。實(shí)例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素。在放射性綴合物用于檢測時(shí)，它可以包含用于閃爍照相研究的放射性原子，例如TC99m或I123，或者用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，MRI)的自旋標(biāo)記物，如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵?？梢杂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來產(chǎn)生抗體和細(xì)胞毒劑的綴合物，如3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-琥珀酰亞胺基酯(SPDP)、4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸-琥珀酰亞胺基酯(SMCC)、亞胺基硫烷(IT)、亞胺基酯的雙功能衍生物(如己二酰亞氨酸二甲基酯HCl)、活性酯(如如辛二酸二琥珀酰亞胺基酯)、醛(如戊二醛)、二-疊氮基化合物(如二(對-疊氮基苯甲?；?己二胺)、二-重氮基衍生物(如二-(對-重氮基苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(如2,6-二異氰酸甲苯酯)和雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以按照Vitetta,E.S.等,Science238(1987)1098-1104中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14標(biāo)記的3-甲基二乙烯三胺五乙酸1-異硫氰基芐酯(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體綴合的示例性螯合劑。參見WO94/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可以使用酸敏感(labile)接頭、肽酶敏感接頭、光敏感接頭、二甲基接頭或包含二硫化物的接頭(Chari,R.V.等,CancerRes.52(1992)127-131；美國專利號5,208,020))。本文的免疫綴合物或ADC明確考慮但不限于用包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB((4-乙烯砜)苯甲酸琥珀酰亞胺基酯)的市售交聯(lián)劑(例如來自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)制備的這類綴合物。F.用于診斷和檢測的方法和組合物本文所用的術(shù)語“檢測”涵蓋定量或定性檢測。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于診斷方法或檢測方法的抗BRDU抗體。這種方法可以是體外或體內(nèi)方法。在某些實(shí)施方案中，提供標(biāo)記的抗BRDU抗體。標(biāo)記包括但不限于直接檢測的標(biāo)記或部分(如熒光標(biāo)記、生色標(biāo)記、電子密度標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記和放射性標(biāo)記)，以及例如通過酶促反應(yīng)或分子相互作用間接檢測的部分(如酶或配體)。示例性標(biāo)記包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，熒光團(tuán)如稀土螯合物或熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹磺酰、傘形酮、螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶(US4,737,456))、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮，辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脫氫酶)，雜環(huán)氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)，與利用過氧化氫來氧化染料前體的酶(如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶)偶聯(lián)，BRDU/抗生物素蛋白，自旋標(biāo)記，噬菌體標(biāo)記，穩(wěn)定自由基等。G.藥物制劑通過將具有希望的純度的這種抗體與一種或多種可選的可藥用載體(Osol,A.(編輯)Remington'sPharmaceuticalSciences第16版(1980))混合，以凍干制劑或水溶液的形式制備本文所述的抗BRDU抗體的藥物制劑。可藥用載體一般在所利用的劑量和濃度下對受體無毒性，且包括但不限于：緩沖劑，如磷酸、檸檬酸和其他有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯己雙銨；氯芐烷銨；芐索氯銨；苯酚；丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬絡(luò)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)；和/或非離子型表面活性劑，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性可藥用載體進(jìn)一步包括間質(zhì)藥物分散劑，如可溶性中性活性透明質(zhì)酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明質(zhì)酸酶糖蛋白，如rHuPH20(BaxterInternational,Inc.)。包括rhuPH20的某些示例性sHASEGP和使用方法描述于US2005/0260186和US2006/0104968中。在一方面，將sHASEGP與諸如軟骨素酶的一種或多種附加的糖胺聚糖酶組合。示例性凍干抗體制劑描述于US6,267,958中。水性抗體制劑包括描述于US6,171,586和WO2006/044908中的那些，后一種制劑包括組氨酸-乙酸緩沖液。本文的制劑還可以根據(jù)所治療的具體適應(yīng)癥的需要包含一種以上活性成分，優(yōu)選相互無不利影響的具有互補(bǔ)活性的那些。這類活性成分以對預(yù)期目的有效的量適宜地組合存在?；钚猿煞挚梢园d在例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微囊(例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米囊(nanocapsule))中或粗滴乳狀液中。這類技術(shù)公開于Remington'sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.(編輯)(1980)中。可以制備緩釋制劑。緩釋制劑的適宜的實(shí)例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是成形物品的形式，例如膜或微囊。待用于體內(nèi)施用的制劑通常是無菌的。無菌可以容易地例如通過濾過無菌濾膜來達(dá)到。H.治療方法和組合物本文提供的任意抗BRDU抗體可以用于治療方法。一方面，提供用作藥物的抗BRDU抗體。在某些實(shí)施方案中，提供用于治療方法的抗BRDU抗體。另一方面，本發(fā)明提供抗BRDU抗體在制造或制備藥物中的用途。另一方面，本發(fā)明提供包含本文提供的任意抗BRDU抗體的藥物制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑包含本文提供的任意抗BRDU抗體和可藥用載體。本發(fā)明的抗體可以在治療中單獨(dú)或與其他活性劑(agent)組合使用。例如，本發(fā)明的抗體可以與至少一種附加的治療劑共同施用。上文指出的這類聯(lián)合治療涵蓋組合施用(兩種或多種治療劑包含在相同或分開的制劑中)和分開施用，在這種情況下，本發(fā)明的抗體的施用可以在施用附加治療劑和/或佐劑之前發(fā)生、與施用附加治療劑和/或佐劑同時(shí)發(fā)生和/或在施用附加治療劑和/或佐劑之后發(fā)生。本發(fā)明的抗體還可以與放射治療組合使用?？梢酝ㄟ^任意適宜的手段來施用本發(fā)明的抗體(和任意附加治療劑)，其包括胃腸外、肺內(nèi)和鼻內(nèi)，如果希望進(jìn)行局部處理，則可以病灶內(nèi)施用。胃腸外輸注包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹腔內(nèi)或皮下施用。部分取決于施用是短暫的還是長期的，可以通過任意適宜的途徑來給藥，例如通過注射，如靜脈內(nèi)或皮下注射。本文考慮多種給藥方案，包括但不限于在多種時(shí)間點(diǎn)單次或多次施用、快速推注施用和脈沖輸注。將以符合良好醫(yī)療實(shí)踐的方式配制、給藥和施用本發(fā)明的抗體。此背景中考慮的因素包括所治療的具體障礙、所治療的具體哺乳動(dòng)物、個(gè)體患者的臨床病癥、障礙的病因、遞送活性劑的部位、施用方法、施用日程及醫(yī)療從業(yè)者已知的其他因素。無需但可選地用目前用來預(yù)防或治療所討論的障礙的一種或多種活性劑配制抗體。這類其他活性劑的有效量取決于存在于制劑中的抗體的量、障礙或處理的類型及上文討論的其他因素。這些通常以相同的劑量，并用本文所述的給藥途徑施用，或者本文所述劑量的1％至99％，或以任意劑量，并通過經(jīng)驗(yàn)/臨床上確定為適當(dāng)?shù)娜我馔緩绞┯?。對于疾病的預(yù)防或治療，本發(fā)明的抗體(在單獨(dú)使用或與一種或多種其他附加治療劑組合使用時(shí))的適當(dāng)劑量將取決于待治療的疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴(yán)重度和過程、為了預(yù)防性還是治療性目的而施用抗體、之前的治療、患者的臨床病史和對抗體的反應(yīng)及主治醫(yī)師的判斷。在一次或一系列的治療中適宜地對患者施用抗體。取決于疾病的類型和嚴(yán)重度，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)的抗體可以是例如通過一次或多次分開的施用或通過連續(xù)輸注來對患者施用的初始候選劑量。取決于上述因素，一個(gè)典型的日劑量可以從約1μg/kg至100mg/kg或更多。對于在幾天或更長時(shí)間內(nèi)反復(fù)施用，取決于病癥，治療通常將持續(xù)直至出現(xiàn)希望的疾病癥狀抑制?？贵w的一個(gè)示例性劑量將在從約0.05mg/kg至約10mg/kg的范圍內(nèi)。因此，可以對患者施用約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意組合)的一個(gè)或多個(gè)劑量。這類劑量可以間歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受約2至約20或例如約6個(gè)劑量的抗體)?？梢允┯米畛踺^高的負(fù)荷劑量，然后施用一個(gè)或多個(gè)較低的劑量。通過常規(guī)技術(shù)和測定容易地監(jiān)測此治療的進(jìn)展。應(yīng)理解，可以用本發(fā)明的免疫綴合物取代抗BRDU抗體來進(jìn)行以上制劑或治療方法的任一個(gè)；或除了抗BRDU抗體之外，用本發(fā)明的免疫綴合物來進(jìn)行以上制劑或治療方法的任一個(gè)。III.制成品在本發(fā)明的另一方面，提供包含用于治療、預(yù)防和/或診斷上述障礙的材料的制成品。制成品包含容器及容器上或伴隨容器的標(biāo)簽或包裝說明書。適宜的容器包括例如瓶、小管、注射器、IV溶液袋等。容器可以形成自多種材料，如玻璃或塑料。容器容納本身或與另一組合物組合時(shí)對治療、預(yù)防和/或診斷病癥有效的組合物，且可以具有無菌接口(例如容器可以是具有可通過皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小管)。組合物中的至少一種活性劑是本發(fā)明的抗體。標(biāo)簽或包裝說明書指示該組合物用于治療所選擇的病癥。此外，制成品可以包含：(a)組合物包含在其中的第一容器，其中該組合物包含本發(fā)明的抗體；和(b)組合物包含在其中的第二容器，其中該組合物包含其他細(xì)胞毒性劑或其他治療劑。本發(fā)明的此實(shí)施方案中的制成品可以進(jìn)一步包含指示該組合物可以用來治療特定病癥的包裝說明書。備選地或此外，制成品可以進(jìn)一步包含第二(或第三)容器，該容器包含可藥用緩沖液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸緩沖鹽溶液、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以進(jìn)一步包含商業(yè)和用戶角度希望的其他材料，包括其他緩沖液、稀釋液、濾器、針頭和注射器。應(yīng)理解，任意以上制成品可以包含本發(fā)明的免疫綴合物來取代抗BRDU抗體；或除了抗BRDU抗體之外，包含本發(fā)明的免疫綴合物。IV.具體實(shí)施方案1.人源化抗BRDU抗體，其中該抗體包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:01的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:04的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3。2.人源化抗BRDU抗體，其中該抗體包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:02的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:04的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3。3.人源化抗BRDU抗體，其中該抗體包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:01的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:03的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3。4.人源化抗BRDU抗體，其中該抗體包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:02的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:03的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3。5.人源化抗BRDU抗體，其中該抗體包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:01的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:13的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3。6.人源化抗BRDU抗體，其中該抗體包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:02的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:13的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3。7.實(shí)施方案1至6中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其進(jìn)一步包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:06的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:07的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3。8.實(shí)施方案1至7中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體在重鏈的第30位具有脯氨酸氨基酸殘基(Kabat編號)。9.實(shí)施方案1至8中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體在重鏈的第58位具有苯丙氨酸氨基酸殘基(Kabat編號)。10.實(shí)施方案1至9中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體在重鏈的第108位具有蘇氨酸氨基酸殘基(Kabat編號)。11.實(shí)施方案1至10中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體在輕鏈的第49位具有賴氨酸氨基酸殘基(Kabat編號)。12.實(shí)施方案1至11中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體在輕鏈的第98位具有亮氨酸氨基酸殘基(Kabat編號)。13.實(shí)施方案1至12中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體包含以下一個(gè)或多個(gè)：-重鏈可變結(jié)構(gòu)域第30位的P；和/或-重鏈可變結(jié)構(gòu)域第58位的F；和/或-重鏈可變結(jié)構(gòu)域第108位的T；和/或-輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第49位的K；和/或-輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第98位的L(所有位置均按照Kabat)。14.實(shí)施方案1至13中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體包含與氨基酸序列SEQIDNO:09具有至少95％序列同一性的VH序列，及與氨基酸序列SEQIDNO:10具有至少95％序列同一性的VL序列。15.實(shí)施方案1至13中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體包含源自重鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SEQIDNO:11的VH氨基酸序列，及源自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SEQIDNO:12的VL氨基酸序列。16.實(shí)施方案1至13中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體是包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:11和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:12的非人抗BRDU抗體的人源化變體。17.實(shí)施方案1至16中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體包含具有氨基酸序列SEQIDNO:09的VH。18.實(shí)施方案1至17中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體包含具有氨基酸序列SEQIDNO:10的VL。19.實(shí)施方案1至18中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體是全長IgG1抗體或全長IgG4抗體。20.實(shí)施方案1至19中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體是單克隆抗體。21.實(shí)施方案1至20中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體是二價(jià)抗體。22.實(shí)施方案1至21中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體是雙特異性抗體。23.實(shí)施方案1至22中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體包含：a)特異性結(jié)合第一抗原的第一全長抗體的重鏈和輕鏈；和b)特異性結(jié)合第二抗原的第二全長抗體的修飾重鏈和修飾輕鏈，其中恒定結(jié)構(gòu)域CL和CH1相互取代；由此第一抗原或第二抗原是BRDU。24.實(shí)施方案1至22中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體包含：a)特異性結(jié)合第一抗原的第一抗體的輕鏈；和b)特異性結(jié)合第一抗原的第一抗體的重鏈，在其C端綴合至源自特異性結(jié)合第二抗原的第二抗體的scFv或scFab；由此第一抗原或第二抗原是BRDU。25.實(shí)施方案1至20中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體是結(jié)合BRDU的抗體片段。26.復(fù)合物，其包含實(shí)施方案1至25中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體和含有BRDU的核酸。27.共價(jià)復(fù)合物，其包含實(shí)施方案3至25中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體和綴合至半胱氨酸殘基的BRDU。28.藥物制劑，其包含實(shí)施方案1至25中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體或?qū)嵤┓桨?6至27中任一個(gè)的復(fù)合物和可藥用載體。29.實(shí)施方案1至25中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體的用途，用于遞送含有BRDU的核酸至細(xì)胞。30.實(shí)施方案1至25中任一個(gè)的人源化抗BRDU抗體的用途，用于遞送含有BRDU的核酸通過血腦屏障。V.實(shí)施例以下是本發(fā)明的方法和組合物的實(shí)例。應(yīng)理解，由于上文所提供的一般描述，可以實(shí)施多種其他實(shí)施方案。實(shí)施例1從小鼠雜交瘤分離和表征編碼鼠抗BRDU抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域的cDNA直接從雜交瘤克隆獲得鼠抗BRDU抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)和(DNA)序列信息。隨后進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)步驟是：(i)從產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞分離RNA；(ii)將此RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，轉(zhuǎn)移入含有VH和VL的PCR片段；(iii)將這些PCR片段整合入用于在大腸桿菌中繁殖的質(zhì)粒載體，并測定其DNA(和推測的蛋白質(zhì))序列。從雜交瘤制備RNA用RNeasyMiniKit(Qiagen)從雜交瘤細(xì)胞分離mRNA。在RLT緩沖液中裂解約106個(gè)細(xì)胞，將裂解物放在Qiashredder柱上。使用RNeasyMini柱濃縮和洗滌mRNA。通過RACEPCR產(chǎn)生編碼VH和VH的DNA片段、將這些DNA片段克隆入質(zhì)粒并測定其DNA和氨基酸序列：按照廠家的流程用SMARTRacecDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech)進(jìn)行特異性抗體cDNA序列的cDNA產(chǎn)生和擴(kuò)增。對于特異性擴(kuò)增，分別使用來自試劑盒的通用引物及來自抗體輕鏈和重鏈恒定區(qū)的特異性引物。通過凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，并從瓊脂糖提取(QIAquickGel提取試劑盒；Qiagen)。將PCR產(chǎn)物克隆入pCR4-TOPO載體(用于測序的TOPOTA克隆試劑盒，LifeTechnologies)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞后，挑取5-10個(gè)克隆，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離質(zhì)粒DNA，并對所克隆的插入片段進(jìn)行DNA序列分析。SEQIDNO:12中顯示抗BRDU抗體的鼠VL序列。SEQIDNO:11中顯示抗BRDU抗體的鼠VH序列。實(shí)施例2鼠抗BRDU抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域的人源化按以下人源化鼠BRDU結(jié)合抗體：WO2011/003557和WO2011/003780中描述了包含來自小鼠雜交瘤的具有κ輕鏈的IgG1種類鼠抗BRDU抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域的編碼序列和氨基酸序列的產(chǎn)生和表征?；诖诵畔ⅲ谌朔N系構(gòu)架IGHV1-18-01和KGKV3-15-01組合產(chǎn)生了對應(yīng)的人源化抗BRDU抗體。SEQIDNO:09中顯示人源化VH的氨基酸序列，SEQIDNO:10中顯示人源化VL的氨基酸序列。實(shí)施例3重組抗BRDU抗體的組成、表達(dá)和純化將鼠抗BRDU抗體可變區(qū)與人源恒定區(qū)組合形成單特異性或雙特異性嵌合抗體。單特異性抗BRDU抗體和特異性結(jié)合BRDU以及不同的非BRDU靶標(biāo)(例如受體酪氨酸激酶或IGF-1R)的雙特異性抗BRDU抗體的產(chǎn)生需要：(i)設(shè)計(jì)和定義這類分子的氨基酸和核苷酸序列；(ii)在轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)這些分子；和(iii)從轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清純化這些分子。按之前在WO2012/093068中所述進(jìn)行這些步驟。通常，為了產(chǎn)生具有鼠抗BRDU抗體的結(jié)合特異性的IgG種類的抗體，將VH序列符合讀框地融合至IgG1亞類的人Fc區(qū)的CH1-鉸合部-CH2-CH3的N端。類似地，將VL序列符合讀框地融合至人CLκ恒定區(qū)的N端。為了產(chǎn)生包含BRDU結(jié)合特異性以及對其他靶標(biāo)的特異性的雙特異性抗體衍生物，將抗BRDU抗體、scFv或Fab片段符合讀框地融合至之前所述抗體的重鏈的C端。在許多情況下，通過引入之前已描述過的VH44-VL100二硫鍵(例如Reiter,Y.等,Naturebiotechnology14(1996)1239-1245)來進(jìn)一步穩(wěn)定所應(yīng)用的抗半抗原scFv。表達(dá)質(zhì)粒：包含用于表達(dá)重鏈和輕鏈的表達(dá)盒的表達(dá)質(zhì)粒分別組裝在哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。由此，編碼單個(gè)元件的基因區(qū)段按上文所述連接。Kabat,E.A.等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991),NIHPublicationNo91-3242中給出了關(guān)于可以從其推測密碼子選擇的人輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息。κ輕鏈的轉(zhuǎn)錄單位由以下元件組成：-來自人巨細(xì)胞病毒(hCMV)的立即早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子；-合成的5’-UT，包括Kozak序列；-鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，包括信號序列內(nèi)含子；-克隆的可變輕鏈cDNA，其放置：5’端的唯一BsmI限制位點(diǎn)放置，剪接供體位點(diǎn)，3’端的唯一NotI限制位點(diǎn)；-基因組人κ基因恒定區(qū)，包括內(nèi)含子2小鼠Ig-κ增強(qiáng)子(Picard,D.和Schaffner,W.Nature307(1984)80-82)；和-人免疫球蛋白κ多腺苷酸化(“polyA”)信號序列。γ1重鏈的轉(zhuǎn)錄單位由以下元件組成：-來自人巨細(xì)胞病毒(hCMV)的立即早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子；-合成的5’-UT，包括Kozak序列；-修飾的鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，包括信號序列內(nèi)含子；-克隆的單特異性可變重鏈cDNA或克隆的雙特異性融合scFv-可變重鏈cDNA，其放置：5’端唯一BsmI限制位點(diǎn)，剪接供體位點(diǎn)，和3’端唯一NotI限制位點(diǎn)；-基因組人γ1重鏈基因恒定區(qū)，包括小鼠Igμ增強(qiáng)子(Neuberger,M.S.,EMBOJ.2(1983)1373-1378)；和-人γ1免疫球蛋白多腺苷酸化(“polyA”)信號序列。除κ輕鏈或γ1重鏈表達(dá)盒外，這些質(zhì)粒包含：-潮霉素抗性基因；-Epstein-Barr病毒(EB病毒,EBV)的復(fù)制起點(diǎn)oriP；-來自載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，其允許此質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制；和-β-內(nèi)酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性。重組DNA技術(shù)：用Sambrook,J.等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHaborLaboratoryPress(1989)中所述的標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)進(jìn)行克隆。所有分子生物學(xué)試劑均為市售(如果未另作說明)，并按照廠家的說明書使用。包含編碼序列、突變或其他遺傳元件的DNA由GeneartAG,Regensburg合成。DNA序列通過在SequiServe(SequiServeGmbH,德國)進(jìn)行的雙鏈測序測定。DNA和蛋白質(zhì)序列分析和序列數(shù)據(jù)管理：用VectorNTIAdvancesuitversion9.0進(jìn)行序列創(chuàng)建、作圖、分析、注釋和說明?？笲RDU抗體和衍生物的表達(dá)：通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染懸浮人胚腎293(HEK293)細(xì)胞來表達(dá)抗BRDU抗體。為此，將對應(yīng)的單特異性或雙特異性抗體的輕鏈和重鏈構(gòu)建在攜帶上述原核和真核選擇標(biāo)記的表達(dá)載體中。在大腸桿菌中擴(kuò)增這些質(zhì)粒，純化，隨后用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。用CurrentProtocolsinCellBiology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(編輯),JohnWiley&Sons,Inc中所述的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞的處理。在37℃/8％CO2下在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染當(dāng)日，按1-2x106個(gè)活細(xì)胞/ml將細(xì)胞接種在新鮮培養(yǎng)基中。在Opti-MEMI培養(yǎng)基(Invitrogen,USA)中制備DNA與轉(zhuǎn)染試劑的復(fù)合物，250ml最終轉(zhuǎn)染體積包含250μg摩爾比1:1的重鏈和輕鏈質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)染后7天通過14,000g離心30分鐘并濾過無菌濾器(0.22μm)來澄清含有單特異性或雙特異性抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清。上清保存于-20℃，直至純化。為了測定細(xì)胞培養(yǎng)物上清中抗體和衍生物的濃度，應(yīng)用了親和HPLC層析。為此，將在含有200mMKH2PO4、100mM檸檬酸鈉、pH7.4的溶液中，含有結(jié)合A蛋白的單特異性或雙特異性抗體或其衍生物的細(xì)胞培養(yǎng)物上清加至AppliedBiosystemsPorosA/20柱。通過應(yīng)用含有200mMNaCl、100mM檸檬酸鈉、pH2.5的溶液來從層析材料進(jìn)行洗脫。使用UltiMate3000HPLC系統(tǒng)(Dionex)。通過UV吸光度和峰面積的積分來定量所洗脫的蛋白質(zhì)。純化的IgG1抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品?？笲RDU抗體的純化：轉(zhuǎn)染7天后，收集HEK293細(xì)胞上清。通過使用A蛋白-SepharoseTM親和層析(GEHealthcare,瑞典)的親和層析和Superdex200大小排阻層析在兩個(gè)步驟中從上清純化包含在其中的重組抗體。簡言之，將包含抗體的澄清培養(yǎng)物上清加至用PBS緩沖液(10mMNa2HPO4、1mMKH2PO4、137mMNaCl和2.7mMKCl，pH7.4)平衡的MabSelectSuReProteinA(5-50ml)柱上。用平衡緩沖液洗出未結(jié)合的蛋白質(zhì)。用50mM檸檬酸緩沖液pH3.2洗脫抗體(或衍生物)。用0.1ml2MTris緩沖液pH9.0中和含有蛋白質(zhì)的級分。然后，混合洗脫的蛋白質(zhì)級分，用AmiconUltra離心過濾裝置(MWCO:30K，Millipore)濃縮，并上樣在用20mM組氨酸、140mMNaCl、pH6.0平衡的Superdex200HiLoad26/60凝膠過濾柱(GEHealthcare,瑞典)上。使用按照Pace等,ProteinScience4(1995)2411-2423根據(jù)氨基酸序列計(jì)算的摩爾消光系數(shù)，通過以320nmOD作為背景校正測定280nm光密度(OD)，來測定純化的抗體和衍生物的蛋白質(zhì)濃度?；旌蠁误w抗體積分，快速冷凍，并保存于-80℃。提供部分樣品用于隨后的蛋白質(zhì)分析和表征。通過存在和缺乏還原劑(5mM1,4-二硫蘇糖醇)情況下的SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色來確認(rèn)抗體的均一性。按照廠家的說明書(4-20％Tris-甘氨酸凝膠)使用Pre-Cast凝膠系統(tǒng)(Invitrogen,USA)。在還原條件下，IgG相關(guān)多肽鏈按類似于計(jì)算分子量的表觀分子大小顯示在SDS-PAGE上。通過A蛋白分析了所有構(gòu)建體的表達(dá)水平。在這類非優(yōu)化的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，平均蛋白質(zhì)產(chǎn)率在每升細(xì)胞培養(yǎng)物上清6mg至35mg純化蛋白質(zhì)之間。圖1顯示表達(dá)和純化結(jié)合BRDU和BRDU衍生物的人源化抗體的結(jié)果。還原和非還原SDSPAGE顯示用A蛋白(MabSelect)和SEC純化后在Kabat53位具有和沒有半胱氨酸的人源化抗體的組成和均一性。分子量標(biāo)記在未標(biāo)記的泳道中。在還原條件下可作為單一條帶檢測到抗體H鏈(50k處的靠上條帶)和L鏈(25k處的靠下條帶)，不存在可見量的其他蛋白質(zhì)污染物。實(shí)施例5BRDU結(jié)合雙特異性抗體與含有BRDU的有效負(fù)載形成復(fù)合物應(yīng)用SEC-MALLS分析來評價(jià)運(yùn)鐵蛋白受體(TfR)和溴脫氧尿苷(BRDU)結(jié)合雙特異性抗體(bsAb)是否能夠和以什么程度結(jié)合含有BRDU的有效負(fù)載。因此，按2:1的化學(xué)計(jì)量比將BRDU-DNA加至TfR-BRDUbsAb(350μg；2.5mg/ml)，并在室溫孵育30分鐘以形成bsAb/有效負(fù)載-復(fù)合物。作為對照試劑，我們制備了游離bsAb(2.5mg/ml)和游離BRDU-DNA(3.2mg/ml)。BRDU-DNA(BRDU-ACCAAGCCTAGAGAGGAGCAATACAACAGTACATATCGCGTGGTAAGCGT；SEQIDNO:14)每個(gè)DNA分子在DNA的5’端包含一個(gè)BRDU。復(fù)合物和對照試劑保存于-80℃，直至分析。對由此產(chǎn)生的復(fù)合物和對照試劑進(jìn)行SEC-MALLS分析來鑒定和表征游離bsAb、游離有效負(fù)載及二者的復(fù)合物。在配有WyattminiDawnTREOS/QELS和OptilabrEX檢測器的DionexUltimate3000HPLC上進(jìn)行SEC-MALLS分析。分析物按1mg/ml溶解在PBS緩沖液pH7.4中，按0.5ml/分鐘流速加至Superdex20010/300GL柱，并用PBS緩沖液pH7.4洗脫60分鐘。這些分析的結(jié)果(圖1中所示)顯示，含有BRDU的DNA與bsAb形成確定的復(fù)合物。這些復(fù)合物按244.9kDa的MW從柱洗脫(圖1A)，并顯示6.8nm的流體動(dòng)力學(xué)半徑(圖1B)，允許計(jì)算每個(gè)bsAb分子約兩個(gè)(1.8)個(gè)DNA分子的化學(xué)計(jì)量比。與之相比，游離bsAb按215.4kDa的MW檢測到，測定其流體動(dòng)力學(xué)半徑在6.2nm。游離BRDU-DNA按16.4kDa的MW檢測到。因此，顯示了TfR-BRDUbsAb有效和按化學(xué)計(jì)量地結(jié)合含有BRDU的DNA，以2:1的摩爾比產(chǎn)生復(fù)合物。實(shí)施例6通過質(zhì)譜分析法分析BRDU結(jié)合抗體用肽-N-糖苷酶F(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,德國)通過酶處理去除N聚糖后，通過之前進(jìn)行還原和不進(jìn)行還原的電噴霧離子化(ESI)質(zhì)譜分析法來確認(rèn)BRDU結(jié)合抗體及其輕鏈和重鏈的同一性和完整性。用TCEP進(jìn)行還原。用等度甲酸梯度在自裝G25-Sephadex-Superfine柱上進(jìn)行脫鹽。在配有nanoESI源(TriVersaNanoMate,Advion)的Q-TOF儀器(maXis,Bruker)上記錄ESI質(zhì)譜(+ve)。MS參數(shù)設(shè)置如下：轉(zhuǎn)移：FunnelRF，400Vpp；ISCID能量，0eV；多極RF，400Vpp；四極：離子能量，3.0eV；低質(zhì)量：850m/z；源：干燥氣體，8L/分鐘；干燥氣體溫度，160℃；碰撞室：碰撞能量，8eV；碰撞RF：3800Vpp；離子冷卻器：離子冷卻器RF，800Vpp；轉(zhuǎn)移時(shí)間：140μs；PrePuls保存，20μs；掃描范圍m/z600至2000。用MassAnalyzer軟件(內(nèi)部開發(fā))進(jìn)行數(shù)據(jù)評價(jià)。所觀察到的脫糖BRDU結(jié)合抗體及其輕鏈和重鏈的分子量符合從氨基酸序列計(jì)算的理論分子量。權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.人源化抗BRDU抗體，其中抗體包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:01的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:04的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3；進(jìn)一步包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:06的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:07的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3；其中抗體包含：-重鏈可變結(jié)構(gòu)域第30位的P；和-重鏈可變結(jié)構(gòu)域第58位的F；和-重鏈可變結(jié)構(gòu)域第108位的T；和-輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第49位的K；和-輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第98位的L(所有位置均按照Kabat)。2.人源化抗BRDU抗體，其中抗體包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:01的HVR-H1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:13的HVR-H2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:05的HVR-H3；進(jìn)一步包含：(a)含有氨基酸序列SEQIDNO:06的HVR-L1；(b)含有氨基酸序列SEQIDNO:07的HVR-L2；和(c)含有氨基酸序列SEQIDNO:08的HVR-L3；其中抗體包含：-重鏈可變結(jié)構(gòu)域第30位的P；和-重鏈可變結(jié)構(gòu)域第58位的F；和-重鏈可變結(jié)構(gòu)域第108位的T；和-輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第49位的K；和-輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第98位的L(所有位置均按照Kabat)。3.權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體包含與氨基酸序列SEQIDNO:09具有至少95％序列同一性的VH序列，及與氨基酸序列SEQIDNO:10具有至少95％序列同一性的VL序列。4.權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體是包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:11和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:12的非人抗BRDU抗體的人源化變體。5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體包含氨基酸序列為SEQIDNO:09的VH。6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的人源化抗BRDU抗體，其中抗體包含氨基酸序列為SEQIDNO:10的VL。7.復(fù)合物，其包含權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的人源化抗BRDU抗體和含有BRDU的核酸。8.共價(jià)復(fù)合物，其包含權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)的人源化抗BRDU抗體和綴合至半胱氨酸殘基的BRDU。9.藥物制劑，其包含權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的人源化抗BRDU抗體或權(quán)利要求7至8中任一項(xiàng)的復(fù)合物，以及可藥用載體。10.包含以下的抗體的用途：a)特異性結(jié)合第一抗原的第一抗體的輕鏈；和b)特異性結(jié)合第一抗原的第一抗體的重鏈，在其C端綴合至源自特異性結(jié)合第二抗原的第二抗體的scFv或scFab；由此第一抗體或第二抗體是權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的抗BRDU抗體；用于遞送含有BRDU的核酸至細(xì)胞。11.權(quán)利要求10的用途，其中抗BRDU抗體包含與氨基酸序列SEQIDNO:09具有至少95％序列同一性的VH序列，及與氨基酸序列SEQIDNO:10具有至少95％序列同一性的VL序列。12.權(quán)利要求10至11中任一項(xiàng)的用途，其中抗BRDU抗體是包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:11和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:12的非人抗BRDU抗體的人源化變體。當(dāng)前第1頁1 2 3