本公開涉及用于產(chǎn)生二胺的微生物和使用該微生物產(chǎn)生二胺的方法。
背景技術(shù)：
：生物胺類(BAs)為含氮化合物，其主要通過氨基酸的脫羧基作用或通過醛和酮的胺化作用和轉(zhuǎn)氨基作用而產(chǎn)生。這些生物胺類為低分子量化合物且在微生物、植物和動(dòng)物的代謝中合成，且因此生物胺類被稱作頻繁發(fā)現(xiàn)于這些細(xì)胞中的組分。特別地，生物胺類為多胺，諸如精脒、精胺、腐胺或1,4-丁二胺和尸胺。一般而言，腐胺為用于產(chǎn)生多胺尼龍-4,6的重要原料，多胺尼龍-4,6通過使腐胺與己二酸反應(yīng)而產(chǎn)生。腐胺通常通過涉及將丙烯轉(zhuǎn)化為丙烯腈和丁二腈的化學(xué)合成而產(chǎn)生。作為使用微生物的腐胺的生產(chǎn)方法，已報(bào)導(dǎo)通過大腸桿菌(E.coli)和棒狀桿菌(Corynebacterium)的轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生高濃度的腐胺的方法(國(guó)際專利公開第WO06/005603號(hào)；國(guó)際專利公開第WO09/125924號(hào)；QianZD等人，Biotechnol.Bioeng.104：4,651-662,2009；Schneider等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.88：4,859-868,2010；Schneider等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.95,169-178.,2012)。此外，已經(jīng)積極地對(duì)大腸桿菌、酵母、植物和動(dòng)物細(xì)胞中的腐胺運(yùn)載體進(jìn)行了研究(KIgarashi,PlantPhysiol.Biochem.48：506-512,2010)。同時(shí)，尸胺為動(dòng)物組織腐敗期間通過蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的惡臭味的二胺化合物。尸胺具有化學(xué)式NH2(CH2)5NH2，其類似于腐胺的化學(xué)式。尸胺用作聚合物諸如聚酰胺或聚氨基甲酸酯、螯合劑或其它添加劑的組分。特別地，已知具有350萬噸的每年全球市場(chǎng)的聚酰胺通過尸胺或丁二酸的縮聚而制備，且因此尸胺作為工業(yè)上有用的化合物已受到大量關(guān)注。尸胺為發(fā)現(xiàn)于一些微生物中的二胺(Tabor和Tabor,MicrobiolRev.,49：81-99,1985)。在革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌中，尸胺通過L-賴氨酸脫羧酶由L-賴氨酸而生物合成。大腸桿菌中尸胺的水平通過尸胺的生物合成、降解、攝取和輸出而調(diào)節(jié)(Soksawatmaekhin等人，MolMicrobiol.,51：1401-1412,2004)。公開內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明人已做出了大量的嘗試來研究具有輸出二胺諸如腐胺或尸胺能力的蛋白質(zhì)以便提高具有二胺生產(chǎn)力的微生物中的二胺生產(chǎn)力。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)有效棒狀桿菌(Corynebacteriumefficiens)來源的蛋白質(zhì)或與其具有高氨基酸序列同源性的蛋白質(zhì)具有二胺輸出活性，且該蛋白質(zhì)被引入用于產(chǎn)生二胺的微生物以增強(qiáng)其活性，導(dǎo)致輸出二胺諸如腐胺和尸胺的能力顯著增加，從而完成本發(fā)明。技術(shù)方案本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于產(chǎn)生二胺的微生物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供產(chǎn)生二胺的方法，包括步驟：(i)培養(yǎng)用于產(chǎn)生二胺的微生物以獲得細(xì)胞培養(yǎng)物；和(ii)從培養(yǎng)的微生物或細(xì)胞培養(yǎng)物回收二胺。最佳方式在實(shí)現(xiàn)以上目的的方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生二胺的微生物，其中引入或增強(qiáng)具有SEQIDNO:6的氨基酸序列或具有55％或更高的與SEQIDNO:6的序列同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的活性。如本文所用，術(shù)語“二胺”共同地指具有兩個(gè)胺基的化合物，且其特定實(shí)例可包括腐胺和尸胺。腐胺為四亞甲基二胺，其可由作為前體的鳥氨酸產(chǎn)生。尸胺稱作1,5-戊二胺或五亞甲基二胺，其可由作為前體的賴氨酸產(chǎn)生。這樣的二胺為工業(yè)上適用的化合物，其充當(dāng)合成聚合物諸如多胺尼龍、聚酰胺或聚氨基甲酸酯的有價(jià)值的原料。如本文所用，術(shù)語“具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的蛋白質(zhì)”為在有效棒狀桿菌中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，且亦稱作CE2495。已研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)保留與棒狀桿菌的膜蛋白NCgl2522的高同源性。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，CE2495蛋白被鑒定為推定蛋白質(zhì)，其涉及在具有二胺生產(chǎn)力的菌株中的二胺輸出，從而顯著增加二胺生產(chǎn)力。此處，具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的CE2495蛋白可以是由SEQIDNO:5的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。然而，在編碼CE2495蛋白的多核苷酸中，可在編碼區(qū)中產(chǎn)生各種修飾，條件是它們不改變從編碼區(qū)表達(dá)的多肽的氨基酸序列，這是由于密碼子簡(jiǎn)并性或考慮到其中將要表達(dá)蛋白的生物體所偏好的密碼子。因此，CE2495蛋白可由多種核苷酸序列以及由SEQIDNO:5的核苷酸序列編碼。此外，本發(fā)明的CE2495蛋白可以是具有SEQIDNO:6的氨基酸序列或具有與其55％或更高、優(yōu)選75％或更高、更優(yōu)選90％或更高、更優(yōu)選95％或更高、甚至更優(yōu)選98％或更高、和最優(yōu)選99％或更高的同源性的任何蛋白質(zhì)，只要該蛋白質(zhì)呈現(xiàn)大量的二胺輸出活性。顯然，其中一部分被刪除、修飾、替代或添加的具有該同源性的氨基酸序列亦在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要所得氨基酸序列具有實(shí)質(zhì)上等于或?qū)?yīng)于SEQIDNO:6的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。如本文所用，術(shù)語“具有與SEQIDNO:6的氨基酸序列55％或更高的序列同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)”意指任何蛋白質(zhì)而無限制，只要該蛋白質(zhì)具有與SEQIDNO:6的氨基酸序列55％或更高的序列同源性的氨基酸序列且其亦實(shí)質(zhì)上具有二胺輸出活性。例如，蛋白質(zhì)可以是具有SEQIDNO:22或SEQIDNO:24的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，但不限于此。例如，具有SEQIDNO:22的氨基酸序列的蛋白質(zhì)是發(fā)現(xiàn)于產(chǎn)氨棒狀桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)中的蛋白質(zhì)，且亦稱作HMPREF0281_01446。已研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)保留與棒狀桿菌的膜蛋白NCgl2522的59％同源性和與有效棒狀桿菌的CE2495的61％同源性。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，已研究發(fā)現(xiàn)HMPREF0281_01446蛋白在具有二胺生產(chǎn)力的菌株中呈現(xiàn)二胺輸出活性，從而顯著增加二胺生產(chǎn)力。具有SEQIDNO:22的氨基酸序列的HMPREF0281_01446蛋白可以是由SEQIDNO:21的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。然而，在編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸中，可在編碼區(qū)中產(chǎn)生各種修飾，條件是其不改變從編碼區(qū)表達(dá)的多肽的氨基酸序列，這歸因于密碼子簡(jiǎn)并性或考慮到其中欲表達(dá)該蛋白質(zhì)的生物體所偏好的密碼子。因此，該蛋白質(zhì)可由多種核苷酸序列以及由SEQIDNO:21的核苷酸序列編碼。此外，具有SEQIDNO:24的氨基酸序列的蛋白質(zhì)為發(fā)現(xiàn)于親脂黃色棒狀桿菌(Corynebacteriumlipophiloflavum)中的蛋白質(zhì)，且亦稱作HMPREF0298_0262。已研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)保留與棒狀桿菌的膜蛋白NCgl2522的52％同源性和與有效棒狀桿菌的CE2495的56％同源性。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，已研究發(fā)現(xiàn)HMPREF0298_0262蛋白在具有二胺生產(chǎn)力的菌株中呈現(xiàn)二胺輸出活性，從而顯著增加二胺生產(chǎn)力。具有SEQIDNO:24的氨基酸序列的HMPREF0298_0262蛋白可以是由SEQIDNO:23的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。然而，在編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸中，可在編碼區(qū)中產(chǎn)生各種修飾，條件是其不改變從該編碼區(qū)表達(dá)的多肽的氨基酸序列，這歸因于密碼子簡(jiǎn)并性或考慮到其中將要表達(dá)該蛋白質(zhì)的生物體所偏好的密碼子。因此，該蛋白質(zhì)可由多種核苷酸序列以及由SEQIDNO:23的核苷酸序列編碼。如本文關(guān)于序列所用的術(shù)語“同源性”指與給定氨基酸序列或核苷酸序列的同一性，且同源性可以表示為百分比。在本發(fā)明中，具有與給定氨基酸序列或核苷酸序列相同或相似活性的同源性序列以“％同源性”表示。例如，同源性可使用計(jì)算評(píng)分、同一性和相似性的參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)軟件程序，具體地BLAST2.0或通過在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中在所定義的嚴(yán)格條件下比較序列來鑒別。定義適當(dāng)雜交條件是在本領(lǐng)域的技能內(nèi)(例如參見Sambrook等人，1989，下文)，且通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確定。如本文所用，術(shù)語“用于產(chǎn)生二胺的微生物”指通過針對(duì)不具有二胺生產(chǎn)力的親本株提供二胺生產(chǎn)力所制備的微生物或具有內(nèi)源二胺生產(chǎn)力的微生物。具體地，具有二胺生產(chǎn)力的微生物可以是具有腐胺或尸胺生產(chǎn)力的微生物?！熬哂懈飞a(chǎn)力的微生物”可以是但不限于這樣的微生物，其中將谷氨酸轉(zhuǎn)化為N-乙酰谷氨酸的乙酰谷氨酸合酶、將乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)化為鳥氨酸的鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(ArgJ)、將乙酰谷氨酸轉(zhuǎn)化為N-乙酰谷氨酰磷酸的乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、將乙酰谷氨酰磷酸轉(zhuǎn)化為N-乙酰谷氨酸半醛的乙酰-γ-谷氨酰-磷酸還原酶(ArgC)、或?qū)⒁阴９劝彼岚肴┺D(zhuǎn)化為N-乙酰鳥氨酸的乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ArgD)的活性與其內(nèi)源活性相比被增強(qiáng)，以便增強(qiáng)從谷氨酸至鳥氨酸的生物合成途徑，且用作腐胺生物合成的前體的鳥氨酸的生產(chǎn)力被增強(qiáng)，但不限于此。此外，具有腐胺生產(chǎn)力的微生物可以是這樣的微生物，其經(jīng)修飾以具有比其內(nèi)源活性弱的從鳥氨酸合成精氨酸所涉及的鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(ArgF)、谷氨酸輸出所涉及的蛋白質(zhì)(NCgl1221)和/或腐胺乙?；婕暗牡鞍踪|(zhì)(NCgl469)的活性，和/或經(jīng)修飾以引入鳥氨酸脫羧酶(ODC)的活性。此處，作為非限制性實(shí)例，乙?；霉劝滨Ａ姿徇€原酶(ArgC)可具有SEQIDNO:14的氨基酸序列，乙酰谷氨酸合酶或鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(ArgJ)可具有SEQIDNO:15的氨基酸序列，乙酰谷氨酸激酶(ArgB)可具有SEQIDNO:16的氨基酸序列，而乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ArgD)可具有SEQIDNO:14的氨基酸序列。然而，各個(gè)酶蛋白的氨基酸序列并未特定限制于此，且酶可以是具有與其80％或更高、優(yōu)選90％或更高、或更優(yōu)選95％或更高的同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，只要其具有各自酶的活性。此外，作為非限制性實(shí)例，鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(ArgF)可具有SEQIDNO:18的氨基酸序列，谷氨酸輸出所涉及的蛋白質(zhì)可具有SEQIDNO:19的氨基酸序列，而鳥氨酸脫羧酶(ODC)可具有SEQIDNO:20的氨基酸序列。然而，各自的酶蛋白的氨基酸序列并未受限于此，且酶可以是具有與其80％或更高、優(yōu)選90％或更高、更優(yōu)選95％或更高、或特別優(yōu)選97％或更高的同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，只要其具有各自酶的活性。同時(shí)，“具有尸胺生產(chǎn)力的微生物”可以是但不限于通過在具有賴氨酸生產(chǎn)力的微生物中另外引入或增強(qiáng)賴氨酸脫羧酶(LDC)的活性而制備的微生物。例如，微生物可以是具有增強(qiáng)的賴氨酸生產(chǎn)力以便增加尸胺產(chǎn)生的微生物。增強(qiáng)賴氨酸生產(chǎn)力的方法可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可預(yù)知的已知方法進(jìn)行。賴氨酸脫羧酶是催化賴氨酸轉(zhuǎn)化為尸胺的酶，且其活性被引入或增強(qiáng)，從而有效地產(chǎn)生尸胺。賴氨酸脫羧酶可具有SEQIDNO:26的氨基酸序列，但未特定受限于此。酶可具有與其80％或更高、優(yōu)選90％或更高、或更優(yōu)選95％或更高的同源性的氨基酸序列，只要其具有以上活性。如本文所用，術(shù)語“產(chǎn)生”為包括二胺的胞外釋放，例如二胺釋放至培養(yǎng)基中，以及在微生物內(nèi)產(chǎn)生二胺的概念。同時(shí)，如本文所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)活性的引入”意指不具有內(nèi)源蛋白質(zhì)的微生物由外部提供該蛋白質(zhì)的活性，且例如，其可通過引入外源基因來進(jìn)行。此外，術(shù)語“蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)”意指保留于或引入微生物中的蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)與其固有活性狀態(tài)相比被增強(qiáng)。蛋白質(zhì)活性的引入或增強(qiáng)的非限制性實(shí)例可包括存在于微生物中的蛋白質(zhì)自身的活性由于突變而提高以便實(shí)現(xiàn)超過內(nèi)源功能的效果，和/或存在于微生物中的蛋白質(zhì)的內(nèi)源基因活性的提高、內(nèi)源基因由內(nèi)部或外部因子擴(kuò)增、基因拷貝數(shù)增加、通過外源基因的額外引入或啟動(dòng)子的置換或修飾增加活性，但不限于此?；蚩截悢?shù)的增加可，但不特定限于，通過將該基因可操作地連接于載體或通過將其整合至宿主細(xì)胞基因組中來進(jìn)行。具體地，宿主細(xì)胞基因組中的多核苷酸的拷貝數(shù)可通過將可操作地連接于編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的多核苷酸且獨(dú)立于宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制和起作用的載體引入宿主細(xì)胞，或通過將可操作地連接于多核苷酸且能夠使該多核苷酸整合至宿主細(xì)胞基因組中的載體引入宿主細(xì)胞中而增加。如本文所用，“用于增加多核苷酸表達(dá)的表達(dá)調(diào)節(jié)序列的修飾”可以，但不特定限于，通過經(jīng)核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守置換或其組合引起表達(dá)調(diào)節(jié)序列上的修飾以便進(jìn)一步增強(qiáng)表達(dá)調(diào)節(jié)序列的活性，或通過用具有較強(qiáng)活性的核苷酸序列替換表達(dá)調(diào)節(jié)序列來進(jìn)行。表達(dá)調(diào)節(jié)序列包括，但不特定限于，啟動(dòng)子、操縱子序列、編碼核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。如本文所用，啟動(dòng)子的置換或修飾，盡管未特定受限于此，可通過用比初始啟動(dòng)子強(qiáng)的啟動(dòng)子進(jìn)行置換或修飾來進(jìn)行。替代初始啟動(dòng)子的強(qiáng)異源啟動(dòng)子可連接于多核苷酸表達(dá)單元的上游，強(qiáng)啟動(dòng)子的實(shí)例可包括CJ7啟動(dòng)子、lysCP1啟動(dòng)子、EF-Tu啟動(dòng)子、groEL啟動(dòng)子、aceA或aceB啟動(dòng)子，且具體地，棒狀桿菌來源的啟動(dòng)子、lysCP1啟動(dòng)子或CJ7啟動(dòng)子可操作地連接于編碼該酶的多核苷酸，使得其表達(dá)率可增加。此處，lysCP1啟動(dòng)子為經(jīng)編碼天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脫氫酶的多核苷酸的啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列取代而改良的啟動(dòng)子(WO2009/096689)。此外，CJ7啟動(dòng)子為源自產(chǎn)氨棒狀桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)的強(qiáng)啟動(dòng)子(韓國(guó)專利第0620092號(hào)和WO2006/065095)。此外，染色體上的多核苷酸序列的修飾，盡管未特定受限于此，可通過經(jīng)多核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守置換或其組合引起表達(dá)調(diào)節(jié)序列上的突變以便進(jìn)一步增強(qiáng)該多核苷酸序列的活性，或通過用經(jīng)修飾以具有更強(qiáng)活性的多核苷酸序列替換該序列來進(jìn)行。如本文所用，術(shù)語“載體”指包括編碼所需蛋白質(zhì)的核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，其可操作地連接于適當(dāng)表達(dá)調(diào)節(jié)序列以在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)所需蛋白質(zhì)。調(diào)節(jié)序列可包括可啟始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、任選的用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。在載體引入至合適的宿主細(xì)胞之后，其可獨(dú)立于宿主基因組復(fù)制或起作用，且可整合至基因組自身中。用于本發(fā)明的載體并未受特定限制，只要其能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制，本領(lǐng)域中已知的任何載體均可使用。常規(guī)載體的實(shí)例可包括天然或重組質(zhì)粒、粘粒、病毒和噬菌體。例如，pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A和Charon21A可用作噬菌體載體或粘粒載體。pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型和pET型可用作質(zhì)粒載體。適用于本發(fā)明的載體并未受特定限制，任何已知表達(dá)載體均可使用。優(yōu)選，可使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118或pCC1BAC載體。此外，染色體中編碼期望內(nèi)源蛋白質(zhì)的多核苷酸可使用用于細(xì)菌染色體插入的載體由突變的多核苷酸替換。多核苷酸插入至染色體中可通過本領(lǐng)域已知的任何方法，例如，同源重組來進(jìn)行。由于本發(fā)明的載體可通過同源重組插入至染色體中，其可進(jìn)一步包括選擇標(biāo)記以確認(rèn)染色體插入。選擇標(biāo)記將選擇用載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即，確認(rèn)期望多核苷酸的插入，選擇標(biāo)記可包括提供可選擇表型，諸如抗藥性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型、對(duì)細(xì)胞毒性劑的抵抗或表面蛋白質(zhì)表達(dá)的標(biāo)記。僅表達(dá)選擇標(biāo)記的細(xì)胞能夠在用選擇性劑處理的環(huán)境下存活或顯示不同表型，且因此可選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”意指包括編碼靶蛋白的多核苷酸的載體以使得由該多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方式引入至宿主細(xì)胞中。只要轉(zhuǎn)化的多核苷酸可在宿主細(xì)胞中表達(dá)，它就可整合至宿主細(xì)胞的染色體中且位于其中，或在染色體外存在。此外，多核苷酸包括編碼靶蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以任何形式引入，只要其可引入至宿主細(xì)胞中且在其中表達(dá)。例如，多核苷酸可以表達(dá)盒的形式被引入至宿主細(xì)胞中，該表達(dá)盒是包括其自主表達(dá)所需的所有元件的基因構(gòu)建物。典型地，表達(dá)盒包括可操作地連接于多核苷酸的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)或翻譯終止信號(hào)。表達(dá)盒可呈可自我復(fù)制表達(dá)載體的形式。同樣，多核苷酸可實(shí)際上引入至宿主細(xì)胞中且可操作地連接于在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的序列。此外，如本文所用，術(shù)語“可操作地連接”意指在編碼本發(fā)明的期望蛋白質(zhì)的多核苷酸序列和起始且介導(dǎo)該多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列之間的功能連接。此外，具有二胺生產(chǎn)力的微生物可以是這樣的微生物，其中二胺乙酰轉(zhuǎn)移酶活性與內(nèi)源活性相比減弱以便增加二胺產(chǎn)生。如本文所用，術(shù)語“二胺乙酰轉(zhuǎn)移酶”是催化乙?；鶑囊阴?CoA轉(zhuǎn)移至二胺的酶，其可由谷氨酸棒狀桿菌NCgl1469或大腸桿菌SpeG示例，但其名稱可根據(jù)具有二胺生產(chǎn)力的微生物的種類而不同。NCgl1469可具有SEQIDNO:11或12的氨基酸序列，SpeG可具有SEQIDNO:13的氨基酸序列，但該序列可根據(jù)微生物的種類而不同。蛋白質(zhì)可具有與其80％或更高、優(yōu)選90％或更高、或更優(yōu)選95％或更高、或特別優(yōu)選97％或更高的同源性的氨基酸序列，只要其具有二胺乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。由于二胺乙酰轉(zhuǎn)移酶將二胺轉(zhuǎn)化為乙?；?二胺(例如，N-Ac-腐胺或N-Ac-尸胺)，二胺生產(chǎn)力可通過減弱其活性——與內(nèi)源活性相比——而增加。如本文所用，術(shù)語“內(nèi)源活性”指初始微生物具有的呈其天然或未變性狀態(tài)的蛋白質(zhì)的活性，而“經(jīng)修飾以具有與內(nèi)源活性相比減弱的活性”意指與初始微生物具有的呈天然或未變性狀態(tài)的相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性相比，蛋白質(zhì)的活性進(jìn)一步減弱。蛋白質(zhì)活性的減弱意指與未修飾的菌株相比蛋白質(zhì)活性降低，或活性消除。有可能將本領(lǐng)域中熟知的方法應(yīng)用于蛋白質(zhì)活性的減弱。方法的實(shí)例可包括用經(jīng)突變以降低酶活性或消除蛋白質(zhì)活性的基因置換染色體上編碼該蛋白質(zhì)的基因的方法；將突變引入至染色體上編碼蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列中的方法；用具有較弱活性的序列替換編碼蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列的方法；刪除染色體上編碼蛋白質(zhì)的基因的部分或全部的方法；引入與染色體上基因的轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)結(jié)合的反義寡核苷酸以抑制mRNA翻譯為蛋白質(zhì)的方法；在編碼蛋白質(zhì)的基因的SD序列的上游人工添加與SD序列互補(bǔ)的序列以形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而阻止核糖體亞基進(jìn)入的方法；和在相應(yīng)序列的開放閱讀框(ORF)的3’-端添加用于逆轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的逆轉(zhuǎn)錄工程(RTE)方法，和其組合，但并未特定受限于此。詳細(xì)地，編碼蛋白質(zhì)的基因的部分或完全刪除可通過將用于染色體插入的載體引入至微生物中，從而用具有部分刪除或標(biāo)記基因的多核苷酸替代染色體上編碼內(nèi)源靶蛋白的多核苷酸來進(jìn)行。“部分”可根據(jù)多核苷酸的類型而變化，但具體地指1至300，優(yōu)選1至100，且更優(yōu)選1至50個(gè)核苷酸。同時(shí)，本發(fā)明的微生物是具有二胺生產(chǎn)力的微生物，包括表達(dá)具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的原核微生物，其實(shí)例可包括屬于埃希氏菌屬某種(Escherichiasp.)、志賀氏菌屬某種(Shigellasp.)、檸檬酸桿菌屬某種(Citrobactersp.)、沙門氏菌屬某種(Salmonellasp.)、腸桿菌屬某種(Enterobactersp.)、耶爾森氏菌屬某種(Yersiniasp.)、克雷伯菌屬某種(Klebsiellasp.)、歐文氏菌屬某種(Erwiniasp.)、棒狀桿菌屬某種(Corynebacteriumsp.)、短桿菌屬某種(Brevibacteriumsp.)、乳桿菌屬某種(Lactobacillussp.)、月形單胞菌屬某種(Selenomanassp.)、弧菌屬某種(Vibriosp.)、假單胞菌屬某種(Pseudomonassp.)、鏈霉菌屬某種(Streptomycessp.)、隱秘桿菌屬某種(Arcanobacteriumsp.)、產(chǎn)堿桿菌屬某種(Alcaligenessp.)或其類似屬種的微生物，但不限于此。本發(fā)明的微生物具體地是這樣的微生物，其屬于棒狀桿菌屬某種或埃希氏菌屬某種，更具體地谷氨酸棒狀桿菌或大腸桿菌，但不限于此。特定實(shí)例可以是通過從基于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的產(chǎn)腐胺菌株KCCM11240P(韓國(guó)專利公開第2013-0082478號(hào))刪除NCgl2522，且接著將CE2495引入至轉(zhuǎn)座子基因中而制備的微生物，NCgl2522為具有腐胺輸出活性的蛋白質(zhì)。因此，此微生物KCCM11240P△NCgl2522Tn:P(cj7)-CE2495被命名為CC01-0757，且在2013年11月15日在布達(dá)佩斯條約下以登錄號(hào)KCCM11475P保藏于韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms(KCCM))。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生二胺的方法，其包括：(i)培養(yǎng)具有腐胺二胺的微生物，其中引入或增強(qiáng)具有SEQIDNO:6的氨基酸序列或具有與其55％或更高的序列同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的活性，以便獲得細(xì)胞培養(yǎng)物；和(ii)從培養(yǎng)的微生物或細(xì)胞培養(yǎng)物回收二胺。具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或具有與其55％或更高的序列同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)活性的引入、蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)、二胺和具有二胺生產(chǎn)力的微生物與上文所述相同。在所述方法中，培養(yǎng)微生物的步驟可——雖然未特定限于——優(yōu)選通過本領(lǐng)域中已知的分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)(fed-batchculture)進(jìn)行。就此而言，培養(yǎng)條件并未受特定限制，但最佳pH(例如pH5至9，優(yōu)選pH6至8，且最優(yōu)選pH6.8)可通過使用堿性化學(xué)藥品(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨)或酸性化學(xué)藥品(例如，磷酸或硫酸)來維持。同樣，需氧條件可通過向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加氧氣或含氧氣體混合物來維持。培養(yǎng)溫度可維持在20至45℃，且優(yōu)選在25至40℃，且培養(yǎng)可進(jìn)行約10至160小時(shí)。此外，欲用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可包括個(gè)別地或組合作為碳源的糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜(molasse)、淀粉和纖維素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、和有機(jī)酸(例如，乙酸)；個(gè)別地或組合作為氮源的含氮有機(jī)化合物(例如，胨、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米溶液、大豆粉和尿素)、或無機(jī)化合物(例如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨)；個(gè)別地或組合作為磷源的磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或與其對(duì)應(yīng)的含鈉鹽；其它必需生長(zhǎng)刺激物，包括金屬鹽(例如，硫酸鎂或硫酸鐵)、氨基酸和維生素。在本發(fā)明中，培養(yǎng)基可用作培養(yǎng)液體的同義詞。如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)物”是通過培養(yǎng)微生物獲得的物質(zhì)，包括培養(yǎng)基、培養(yǎng)的微生物和從培養(yǎng)的微生物釋放的物質(zhì)。例如，可包括細(xì)胞培養(yǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)源，諸如礦物質(zhì)、氨基酸、維生素、核酸和/或除碳源和氮源以外一般包含于培養(yǎng)基(或培養(yǎng)液體)中的其它組分。此外，可包括期望物質(zhì)或由細(xì)胞產(chǎn)生/分泌的酶。由于由培養(yǎng)物產(chǎn)生的二胺可分泌至培養(yǎng)基中或保留于細(xì)胞中，所以細(xì)胞培養(yǎng)物可包括通過培養(yǎng)微生物所產(chǎn)生的二胺?；厥斩啡缭诒景l(fā)明的培養(yǎng)步驟中產(chǎn)生的腐胺或尸胺的方法可，例如，使用本領(lǐng)域中已知的合適方法，根據(jù)培養(yǎng)方法，例如分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)或補(bǔ)料分批培養(yǎng)來進(jìn)行，從而從培養(yǎng)液體收集期望的氨基酸。有益效果在本發(fā)明中，已證明有效棒狀桿菌來源的CE2495蛋白為具有二胺輸出活性的蛋白質(zhì)，腐胺輸出活性可通過將該蛋白質(zhì)活性引入至具有腐胺合成途徑但低腐胺輸出活性的棒狀桿菌屬某種微生物中來增強(qiáng)。也已證明，腐胺和尸胺可同時(shí)通過將該蛋白質(zhì)活性引入至具有腐胺和尸胺的合成途徑的大腸桿菌中來增加。因此，二胺可有效地通過將有效棒狀桿菌來源的CE2495蛋白應(yīng)用于具有二胺生產(chǎn)力的微生物來產(chǎn)生。發(fā)明方式下文中，本發(fā)明將參考實(shí)施例更詳細(xì)地加以描述。然而，這些實(shí)施例僅用于說明性目的，且本發(fā)明不意欲受這些實(shí)施例限制。參考實(shí)施例1.具有腐胺生產(chǎn)力的棒狀桿菌屬某種微生物的制備已證實(shí)當(dāng)在作為具有腐胺生產(chǎn)力的棒狀桿菌屬某種微生物的基于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的產(chǎn)腐胺菌株KCCM11240P(韓國(guó)專利公開第2013-0082478號(hào))和基于谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的產(chǎn)腐胺菌株DAB12-a△NCgl1469(ArgF刪除、NCgl1221刪除、大腸桿菌speC引入、arg操縱子啟動(dòng)子取代、NCgl1469刪除；命名為DAB12-b，韓國(guó)專利公開第2013-0082478號(hào))中刪除NCgl2522——屬于主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(majorfacilitatorsuperfamily(MFS))的通透酶——時(shí)，腐胺產(chǎn)生減少。也已證實(shí)，腐胺在通過將NCgl2522基因額外引入至KCCM11240P或DAB12-b中的轉(zhuǎn)座子中或通過用CJ7啟動(dòng)子替代染色體上的NCgl2522啟動(dòng)子以增強(qiáng)NCgl2522活性而制備的谷氨酸棒狀桿菌菌株中以高產(chǎn)率產(chǎn)生。此外，腐胺的細(xì)胞內(nèi)的量在其中NCgl2522表達(dá)被增強(qiáng)的菌株中測(cè)量，結(jié)果，與對(duì)照組的量相比，觀察到較少量的腐胺。指示NCgl2522具有輸出腐胺的能力。詳細(xì)地，基于編碼谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的NCgl2522的基因的核苷酸序列，一對(duì)用于獲得NCgl2522的N-端區(qū)域的同源重組片段的引物SEQIDNOS:1和2和一對(duì)用于獲得NCgl2522的C-端區(qū)域的同源重組片段的引物SEQIDNOS:3和4如下表1中使用。[表1]使用作為模板的谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的基因組DNA和兩對(duì)引物進(jìn)行PCR以便分別擴(kuò)增N-端和C-端區(qū)域的PCR片段。將這些PCR片段進(jìn)行電泳以獲得期望片段。此時(shí)，進(jìn)行PCR反應(yīng)：在95℃變性30秒，在55℃退火30秒，且在72℃延伸30秒，30個(gè)循環(huán)。將因此獲得的N-端區(qū)域的片段用限制性酶BamHI和SalI處理，并將因此獲得的C-端區(qū)域的片段用限制性酶SalI和XbaI處理。將因此處理的片段克隆至用限制性酶BamHI和XbaI處理的pDZ載體中，以便構(gòu)建質(zhì)粒pDZ-1’NCgl2522(K/O)。質(zhì)粒pDZ-1’NCgl2522(K/O)通過電穿孔引入至谷氨酸棒狀桿菌KCCM11240P中，以便獲得轉(zhuǎn)化體。隨后，將該轉(zhuǎn)化體鋪平板并在含有用于集落形成的卡那霉素(25μg/ml)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚(indolin)-D-半乳糖苷)的BHIS(37g/l腦心浸液(Braineheartinfusion)、91g/l山梨糖醇和2％瓊脂)板上培養(yǎng)。從因此形成的菌落選擇藍(lán)色菌落作為引入質(zhì)粒pDZ-1’NCgl2522(K/O)的菌株。將選擇的菌株在CM培養(yǎng)基(10g/l葡萄糖、10g/l聚胨、5g/l酵母提取物、5g/l牛肉提取物、2.5g/lNaCl和2g/l尿素，pH6.8)中在30℃震蕩培養(yǎng)8小時(shí)。隨后，各細(xì)胞培養(yǎng)物連續(xù)地從10-4稀釋至10-10。隨后，將稀釋的樣品鋪平板并且在用于集落形成的含X-gal固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。從因此形成的菌落選擇以相對(duì)較低頻率出現(xiàn)的白色菌落以最終獲得其中編碼NCgl2522的基因被刪除且腐胺生產(chǎn)力減弱的谷氨酸棒狀桿菌菌株。將其中腐胺輸出活性減弱的谷氨酸棒狀桿菌菌株命名為KCCM11240P△NCgl2522。以相同方式，使用作為模板的谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的基因組DNA和表1中給出的兩對(duì)引物進(jìn)行PCR以便通過上文所述的方法構(gòu)建質(zhì)粒pDZ-2’NCgl2522(K/O)。構(gòu)建谷氨酸棒狀桿菌菌株，其中根據(jù)上文所述的方法使用該載體使編碼DAB12-b菌株的NCgl2522的基因刪除以減弱腐胺生產(chǎn)力。將此具有減弱的腐胺輸出活性的谷氨酸棒狀桿菌菌株命名為DAB12-b△NCgl2522。實(shí)施例1.有效棒狀桿菌CE2495的選擇如參考實(shí)施例1中所證實(shí)，發(fā)現(xiàn)NCgl2522膜蛋白用于輸出腐胺。因此，基于NCgl2522的氨基酸序列，本發(fā)明人使用國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI,www.ncbi.nlm.nih.gov)的BlastP程序獲得與其具有同源性的基因。從除谷氨酸棒狀桿菌外的棒狀桿菌某種，發(fā)現(xiàn)有效棒狀桿菌YS-314具有CE2495，該CE2495顯示與NCgl2522的氨基酸序列71％同源性。獲得其核苷酸序列(SEQIDNO:5)和氨基酸序列(SEQIDNO:6)。以相同方式，獲得源自產(chǎn)氨棒狀桿菌DSM20306的HMPREF0281_01446的核苷酸序列(SEQIDNO:21)和氨基酸序列(SEQIDNO:22)，HMPREF0281_01446顯示與NCgl2522的氨基酸序列59％同源性；和源自親脂黃色棒狀桿菌DSM44291的HMPREF0298_0262的核苷酸序列(SEQIDNO:23)和氨基酸序列(SEQIDNO:24)，HMPREF0298_0262顯示與NCgl2522的氨基酸序列52％同源性。HMPREF0281_01446的氨基酸序列和HMPREF0298_0262的氨基酸序列分別顯示與有效棒狀桿菌YS-314的CE2495的氨基酸序列的61％和56％同源性，如下面表2中所顯示。[表2]氨基酸序列同源性的比較同時(shí)，具有顯示與NCgl2522同源性的基因的棒狀桿菌某種微生物和其同源性在下面表3中給出。[表3]實(shí)施例2.通過將CE2495引入至源自棒狀桿菌某種的產(chǎn)腐胺菌株中使腐胺發(fā)酵<2-1>將CE2495引入至基于ATCC13032的產(chǎn)腐胺菌株染色體中的轉(zhuǎn)座子基因?yàn)榱藱z查CE2495基因的染色體插入是否影響在參考實(shí)施例1中制備的具有降低的腐胺輸出活性的KCCM11240P△NCgl2522中的腐胺輸出，通過以下方法將CE2495引入至轉(zhuǎn)座子基因中。作為允許使用棒狀桿菌某種微生物的轉(zhuǎn)座子基因?qū)⒒虿迦胫寥旧w中的用于轉(zhuǎn)化的載體，使用pDZTn(WO2009/125992)，且CJ7(WO2006/65095)用作啟動(dòng)子。約1.44kb的CE2495基因片段使用有效棒狀桿菌YS-314菌株的染色體作為模板和引物對(duì)SEQIDNO:9和10(參見表4)來擴(kuò)增。此時(shí)，進(jìn)行PCR反應(yīng)：在95℃變性30秒，在55℃退火30秒，和在72℃延伸1分30秒，30個(gè)循環(huán)。接著，該P(yáng)CR產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳以洗脫且純化期望大小的帶。此外，通過使用作為模板的p117-Pcj7-gfp和一對(duì)引物SEQIDNO:7和8(參見表4)進(jìn)行PCR來獲得cj7啟動(dòng)子區(qū)域，PCR在95℃變性30秒，在55℃退火30秒，和在72℃延伸30秒，30個(gè)循環(huán)。cj7啟動(dòng)子基因的片段在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳以洗脫且純化期望大小的帶。[表4]pDZTn載體用XhoI處理，進(jìn)行以上獲得的PCR產(chǎn)物的融合克隆。In-Fusion◎HD克隆試劑盒(Clontech)用于融合克隆。所得質(zhì)粒分別指定為pDZTn-P(cj7)-CE2495。接下來，將質(zhì)粒pDZTn-P(cj7)-CE2495通過電穿孔引入至參考實(shí)施例1中所述的谷氨酸棒狀桿菌KCCM11240P△NCgl2522中以獲得轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在CM培養(yǎng)基(10g/l葡萄糖、10g/l聚胨、5g/l酵母提取物、5g/l牛肉提取物、2.5g/lNaCl和2g/l尿素，pH6.8)中震蕩培養(yǎng)(30℃持續(xù)8小時(shí))。隨后，細(xì)胞培養(yǎng)物從10-4連續(xù)稀釋至10-10。接著，稀釋的樣品鋪平板并且在用于集落形成的含X-gal固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。從所形成的菌落選擇以相對(duì)較低頻率出現(xiàn)的白色菌落以最終獲得其中通過二次交換引入編碼CE2495的基因的菌株。最終選擇的菌株使用引物對(duì)SEQIDNO:7和10進(jìn)行PCR以確認(rèn)編碼CE2495的基因的引入。該谷氨酸棒狀桿菌突變株被指定為KCCM11240P△NCgl2522Tn：P(cj7)-CE2495。<2-2>將CE2495引入至基于ATCC13869的產(chǎn)腐胺菌株染色體中的轉(zhuǎn)座子基因?yàn)榱藱z查CE2495基因的染色體插入是否影響參考實(shí)施例1中制備的具有降低的腐胺輸出活性的DAB12-b△NCgl2522中的腐胺輸出，將上面制備的pDZTn-P(cj7)-CE2495引入至谷氨酸棒狀桿菌DAB12-b△NCgl2522中并以與實(shí)施例<2-1>中相同的方式確認(rèn)菌株的轉(zhuǎn)座子基因中CE2495的引入。因此選擇的谷氨酸棒狀桿菌突變株被指定為DAB12-b△NCgl2522Tn：P(cj7)-CE2495。<2-3>評(píng)估引入CE2495的棒狀桿菌某種來源的產(chǎn)腐胺菌株的腐胺生產(chǎn)力為了確認(rèn)CE2495引入對(duì)產(chǎn)腐胺菌株的腐胺生產(chǎn)力的效果，比較在實(shí)施例<2-1>和<2-2>中制備的谷氨酸棒狀桿菌突變株的腐胺生產(chǎn)力。詳細(xì)地，將6種類型的谷氨酸棒狀桿菌突變體(KCCM11240P；KCCM11240P△NCgl2522；KCCM11240P△NCgl2522Tn：P(cj7)-CE2495；DAB12-b；DAB12-b△NCgl2522；DAB12-b△NCgl2522Tn：P(cj7)-CE2495)分別鋪平板于含1mM精氨酸的CM平板培養(yǎng)基(1％葡萄糖、1％聚胨、0.5％酵母提取物、0.5％牛肉提取物、0.25％NaCl、0.2％尿素、100μl50％NaOH和2％瓊脂，pH6.8，基于1L)上，并在30℃培養(yǎng)24小時(shí)。將1鉑環(huán)的因此培養(yǎng)的各菌株接種于25ml滴度培養(yǎng)基(8％葡萄糖、0.25％大豆蛋白、0.50％玉米浸漬固體、4％(NH4)2SO4、0.1％KH2PO4、0.05％MgSO4·7H2O、0.15％尿素、100μg生物素、3mg鹽酸硫胺素、3mg泛酸鈣、3mg煙酰胺和5％CaCO3，pH7.0，基于1L)中，隨后在30℃和200rpm震蕩培養(yǎng)98小時(shí)。將1mM精氨酸添加至用于培養(yǎng)菌株的所有培養(yǎng)基中。測(cè)量各細(xì)胞培養(yǎng)物中的腐胺濃度，結(jié)果顯示于下面的表5中。[表5]菌株腐胺(g/L)KCCM11240P12.4KCCM11240P△NCgl25221.9KCCM11240P△NCgl2522Tn:P(cj7)-CE249517.8DAB12-b13.1DAB12-b△NCgl25220.5DAB12-b△NCgl2522Tn:P(cj7)-CE249517.9如表5中所顯示，發(fā)現(xiàn)在兩種類型的引入CE2495的谷氨酸棒狀桿菌突變株中腐胺產(chǎn)生均增加。實(shí)施例3.通過在棒狀桿菌某種來源的產(chǎn)賴氨酸菌株中的CE2495引入和賴氨酸脫羧酶表達(dá)使尸胺發(fā)酵<3-1>在產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌KCCM11016P的染色體中的轉(zhuǎn)座子基因中引入CE2495為了確認(rèn)CE2495蛋白的尸胺輸出活性，將CE2495基因引入至產(chǎn)賴氨酸菌株KCCM11016P(此微生物在1995年12月18日以登錄號(hào)KFCC10881保藏于韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心，且隨后在布達(dá)佩斯條約下以登錄號(hào)KCCM11016P保藏于國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)，韓國(guó)專利第10-0159812號(hào))的染色體中。將上面制備的pDZTn-P(cj7)-CE2495引入至谷氨酸棒狀桿菌KCCM11016P中且以與實(shí)施例<2-1>中相同的方式確認(rèn)菌株的轉(zhuǎn)座子中CE2495的引入。因此選擇的谷氨酸棒狀桿菌突變株被指定為KCCM11016PTn：P(cj7)-CE2495。<3-2>將大腸桿菌來源的賴氨酸脫羧酶基因引入至引入CE2495的產(chǎn)L-賴氨酸菌株在實(shí)施例<3-1>中制備的引入CE2495的產(chǎn)L-賴氨酸菌株KCCM11016PTn：P(cj7)-CE2495被引入呈質(zhì)粒形式的大腸桿菌來源的賴氨酸脫羧酶基因用于尸胺產(chǎn)生。從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得賴氨酸脫羧酶ldcC的核苷酸序列(SEQIDNO:25)和氨基酸序列(SEQIDNO:26)。通過使用大腸桿菌W3110菌株的染色體作為模板和引物對(duì)SEQIDNO:29和30(參見表6)進(jìn)行PCR來獲得約2.1kb的ldcC基因片段，PCR在95℃變性30秒，在52℃退火30秒，且在72℃延伸2分鐘，30個(gè)循環(huán)。此產(chǎn)物用HindIII和XbaI處理，隨后在0.8％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳以洗脫和純化期望大小的帶。此外，通過使用p117-Pcj7-gfp作為模板和引物對(duì)SEQIDNO:27和28(參見表6)進(jìn)行PCR來獲得cj7啟動(dòng)子區(qū)域，PCR在95℃變性30秒，在55℃退火30秒，在72℃延伸30秒，30個(gè)循環(huán)。cj7啟動(dòng)子基因的基因片段用KpnI和HindII處理，隨后在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳以洗脫和純化期望大小的帶。[表6]使用T4DNA連接酶(NEB)克隆通過在0.8％瓊脂糖凝膠中對(duì)KpnI和XbaI處理的pECCG117(Biotechnologylettersvol13,No.10,p.721-726(1991))載體進(jìn)行電泳且隨后洗脫和純化期望大小的帶所獲得的基因片段、用KpnI和HindIII處理的cj7啟動(dòng)子基因片段和用HindIII和XbaI處理的賴氨酸脫羧酶ldcC基因片段。通過以上實(shí)驗(yàn)獲得的編碼大腸桿菌ldcC的質(zhì)粒被指定為pECCG117-Pcj7-ldcC。所制備的pECCG117-Pcj7-ldcC載體或pECCG117載體分別通過電穿孔引入至KCCM11016P和KCCM11016PTn：P(cj7)-CE2495中。轉(zhuǎn)化體鋪平板于含有用于選擇的25μg/ml卡那霉素的BHIS培養(yǎng)板上。所選擇的菌株分別被指定為KCCM11016PpECCG117、KCCM11016PpECCG117-Pcj7-ldcC、KCCM11016PTn：P(cj7)-CE2495pECCG117和KCCM11016PTn：P(cj7)-CE2495pECCG117-Pcj7-ldcC。<3-3>評(píng)估具有CE2495的染色體插入和作為質(zhì)粒的賴氨酸脫羧酶基因的棒狀桿菌某種來源的產(chǎn)賴氨酸菌株的尸胺生產(chǎn)力為了檢查將CE2495引入至產(chǎn)尸胺菌株中是否影響尸胺產(chǎn)生，在實(shí)施例<3-2>中制備的谷氨酸棒狀桿菌突變株之間比較尸胺生產(chǎn)力。詳細(xì)地，通過以下方法培養(yǎng)4種類型的谷氨酸棒狀桿菌突變株(KCCM11016PpECCG117；KCCM11016PpECCG117-Pcj7-ldcC；KCCM11016PTn：P(cj7)-CE2495pECCG117；和KCCM11016PTn：P(cj7)-CE2495pECCG117-Pcj7-ldcC)，并且在其間比較尸胺生產(chǎn)力。各自突變株鋪平板于CM平板培養(yǎng)基(1％葡萄糖、1％聚胨、0.5％酵母提取物、0.5％牛肉提取物、0.25％NaCl、0.2％尿素、100μl50％NaOH和2％瓊脂，pH6.8，基于1L)上，并在30℃培養(yǎng)24小時(shí)。所培養(yǎng)的菌株的每一個(gè)接種于含有25ml種子培養(yǎng)基(2％葡萄糖、1％胨、0.5％酵母提取物、0.15％尿素、0.4％KH2PO4、0.8％K2HPO4、0.05％MgSO47H2O、100μg生物素、1000μg硫胺HCl、2000μg泛酸鈣和2000μg煙酰胺，pH7.0，基于1L)的250ml三角燒瓶(corner-baffledflask)中，并在30℃和200rpm震蕩培養(yǎng)20小時(shí)。接著，將1ml種子培養(yǎng)物接種于含有24ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(4％葡萄糖、2％(NH4)2SO4、2.5％大豆蛋白、5％玉米浸漬固體、0.3％尿素、0.1％KH2PO4、0.05％MgSO47H2O、100μg生物素、1000μg鹽酸硫胺素、2000μg泛酸鈣、3000μg煙酰胺、0.2g亮氨酸、0.1g蘇氨酸、0.1g甲硫氨酸和5％CaCO3，pH7.0，基于1L)的250ml三角燒瓶中，隨后在30℃和200rpm震蕩培養(yǎng)72小時(shí)。在培養(yǎng)后，通過HPLC測(cè)量尸胺生產(chǎn)力。各菌株的細(xì)胞培養(yǎng)物中尸胺的濃度在下面的表7中給出。[表7]如表7中所顯示，引入CE2495的谷氨酸棒狀桿菌突變株中的尸胺產(chǎn)生增加。實(shí)施例4.通過將具有二胺輸出活性的蛋白質(zhì)引入至大腸桿菌中使二胺發(fā)酵<4-1>通過將CE2495、HMPREF0281_01446、或HMPREF0298_0262引入至W3110中來制備菌株檢查在大腸桿菌中除CE24952外分別顯示與NCgl2522的59％和52％同源性的產(chǎn)氨棒狀桿菌DSM20306來源的HMPREF0281_01446蛋白和親脂黃色棒狀桿菌DSM44291來源的HMPREF0298_0262蛋白的二胺輸出活性。以與實(shí)施例2-1的pDZTn-P(cj7)-CE2495的構(gòu)建相同的方式構(gòu)建用于引入HMPREF0281_01446和HMPREF0281_01446的載體。使用產(chǎn)氨棒狀桿菌DSM20306菌株的染色體作為模板和引物對(duì)SEQIDNO：31和SEQIDNO：32(參見表8)擴(kuò)增HMPREF0281_01446基因以獲得約1.4kb的基因片段。以相同方式，使用親脂黃色棒狀桿菌DSM44291菌株的染色體作為模板和引物對(duì)SEQIDNO：33及SEQIDNO：34(參見表8)擴(kuò)增HMPREF0298_0262基因以獲得約1.36kb的基因片段。像這樣，進(jìn)行PCR反應(yīng)：在95℃變性30秒，在55℃退火30秒，和在72℃延伸1分30秒，30個(gè)循環(huán)。然后，將PCR產(chǎn)物中的每個(gè)在0.8％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳以洗脫且純化期望大小的帶。[表8]此外，通過使用p117-Pcj7-gfp作為模板和引物對(duì)SEQIDNO：7和8進(jìn)行PCR來獲得cj7啟動(dòng)子區(qū)域：在95℃變性30秒，在55℃退火30秒，和在72℃延伸30秒，30個(gè)循環(huán)。cj7啟動(dòng)子基因的片段在0.8％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳以洗脫且純化期望大小的帶。pDZTn載體用XhoI處理，并進(jìn)行上面獲得的PCR產(chǎn)物的融合克隆。In-Fusion◎HD克隆試劑盒(Clontech)用于融合克隆。所得質(zhì)粒分別指定為pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446和pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262。此后，為了檢查有效棒狀桿菌YS-314來源的CE2495、產(chǎn)氨棒狀桿菌來源的HMPREF0281_01446或親脂黃色棒狀桿菌來源的HMPREF0298_0262蛋白的表達(dá)是否增加具有腐胺和尸胺的生物合成途徑的大腸桿菌野生型菌株W3110中的腐胺和尸胺產(chǎn)生，分別將基于棒狀桿菌和大腸桿菌穿梭載體的pDZTn-P(cj7)-CE2495、pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446、或pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262引入至W3110中。2×TSS溶液(Epicentre)用于轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化體被鋪平板并且于含有卡那霉素(50μg/ml)的LB平板(10g胰胨、5g酵母提取物、10gNaCl和2％瓊脂，基于1L)上培養(yǎng)用于集落形成。因此形成的菌落分別被指定為W3110pDZTn-P(cj7)-CE2495、W3110pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446、或W3110pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262。<4-2>引入CE2495、HMPREF0281_01446或HMPREF0298_0262的大腸桿菌的二胺生產(chǎn)力的比較檢查上面獲得的菌株的腐胺和尸胺生產(chǎn)力。詳細(xì)地，將大腸桿菌W3110和W3110pDZTn-P(cj7)-CE2495、W3110pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446、或W3110pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262在37℃在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)。隨后，其中每個(gè)在25ml滴度培養(yǎng)基(2g(NH4)2PO4、6.75gKH2PO4、0.85g檸檬酸、0.7gMgSO4·7H2O、0.5％(v/v)微量元素、10g葡萄糖、3gAMS和30gCaCO3，基于1L)中在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。痕量金屬溶液含有5MHCl：每1升10gFeSO4·7H2O、2.25gZnSO4·7H2O、1gCuSO4·5H2O、0.5gMnSO4·5H2O、0.23gNa2B4O7·10H2O、2gCaCl2·2H2O和0.1g(NH4)6Mo7O2·4H2O。測(cè)量從各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的腐胺和尸胺的濃度，結(jié)果在下面的表9中給出。[表9]如表9中所顯示，與親本株W3110相比，引入CE2495的W3110pDZTn-P(cj7)-CE2495菌株顯示在細(xì)胞培養(yǎng)物中高的腐胺和尸胺濃度。此外，分別引入HMPREF0281_01446和HMPREF0298_0262的W3110pDZTn-P(cj7)-HMPREF0281_01446和W3110pDZTn-P(cj7)-HMPREF0298_0262菌株中的腐胺和尸胺產(chǎn)生顯著增加。即，已確認(rèn)細(xì)胞培養(yǎng)物中的二胺通過增強(qiáng)CE2495或具有與其55％或更高序列同源性的蛋白質(zhì)的活性而顯著增加，提示輸出二胺諸如腐胺和尸胺的能力可通過增強(qiáng)CE2495或具有與其55％或更高的序列同源性的蛋白質(zhì)的活性而提高。因此，本發(fā)明人證明通過將CE2495引入至具有腐胺合成途徑但具有降低的腐胺輸出活性的棒狀桿菌某種微生物KCCM11240P△NCgl2522的轉(zhuǎn)座子中而制備的具有增強(qiáng)的CE2495活性的谷氨酸棒狀桿菌具有增強(qiáng)的腐胺輸出活性，從而以高產(chǎn)率產(chǎn)生腐胺。因此，此菌株KCCM11240P△NCgl2522Tn：P(cj7)-CE2495被指定為CC01-0757，且在2013年11月15日在布達(dá)佩斯條約下以登錄號(hào)KCCM11475P保藏于韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心(KCCM)。國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)：韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心(國(guó)際的)登錄號(hào)：KCCM11475P登錄日期：20131115【工業(yè)適用性】在本發(fā)明中，證明了有效棒狀桿菌來源的CE2495蛋白是具有二胺輸出活性的蛋白質(zhì)，并且腐胺輸出活性可通過將該蛋白活性引入至具有腐胺合成途徑但低腐胺輸出活性的棒狀桿菌某種微生物中而增強(qiáng)。還證明了通過該蛋白活性引入至具有腐胺和尸胺合成途徑的大腸桿菌中，腐胺和尸胺可同時(shí)增加。因此，通過將有效棒狀桿菌來源的CE2495蛋白應(yīng)用到具有二胺生產(chǎn)力的微生物，可有效地產(chǎn)生二胺。國(guó)際表格原始保藏接收證明根據(jù)第7.1條發(fā)出至：CJ第一制糖株式會(huì)社330,DONGHO-RO,JUNG-GU，首爾100-400，大韓民國(guó)證明上述翻譯與原文無誤2014年4月25日專利代理人SonMin印當(dāng)前第1頁1 2 3