本發(fā)明涉及抗MUC1抗體，或其抗原結(jié)合片段，及它們的用途。更具體地，涉及針對MUC1糖肽的抗體，或其抗原結(jié)合片段，以及涉及采用其的用于惡性腫瘤的診斷技術(shù)和預(yù)防和/或治療技術(shù)。

相關(guān)申請的交叉引用

該申請要求2014年4月28日提交的日本專利申請?zhí)?014-92299的優(yōu)先權(quán)，其整體明確通過引用并入本文。

背景技術(shù)：

“MUC1”是一類粘蛋白糖蛋白。其包含由MUC1基因(MUC1)編碼的核心蛋白和許多通過O-型糖鏈鍵與核心蛋白鍵接的糖鏈。粘蛋白具有的形式有分泌的粘蛋白，其由上皮細(xì)胞等產(chǎn)生，以及膜結(jié)合的粘蛋白，其包含疏水跨膜部分且和細(xì)胞膜結(jié)合。MUC1是上皮細(xì)胞的膜結(jié)合的粘蛋白，其存在于正常細(xì)胞中在乳腺細(xì)胞遠(yuǎn)端表面，存在于乳脂肪滴中，以及存在于多種腺體上皮細(xì)胞中，例如在胰腺和腎中(非專利文獻(xiàn)1)。其分子量大于或等于400kDa，其中50％由O-鍵-類型糖鏈組成。該糖蛋白包含短的N端區(qū)域，含串聯(lián)重復(fù)(其25％由具有羥基基團(tuán)的氨基酸表征)的中央?yún)^(qū)域，含31個氨基酸的跨膜區(qū)域，以及在胞質(zhì)側(cè)的短C端區(qū)域。含有中央?yún)^(qū)域的胞外區(qū)域在許多情況下被切掉并釋放。每個串聯(lián)重復(fù)(串聯(lián)單元)包含20個氨基酸(Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala)，具有五個可以由O-糖鏈修飾的位點。等位基因之間所述串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目可以在20至125個變化，因此該區(qū)域稱作可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)。VNTR區(qū)域具有大小多態(tài)性，其中所表達(dá)的重復(fù)的數(shù)目具有遺傳學(xué)個體差異。已知基于特定氨基酸遺傳突變的四種類型的序列多態(tài)性。在該序列多態(tài)性中，從Pro-Asp-Thr-Arg(PDTR)至Pro-Glu-Ser-Arg(PESR)的突變的頻率高(非專利文獻(xiàn))。

已知MUC1在許多癌癥中過表達(dá)，例如乳腺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌。具體而言，在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中觀察到90％或更多的過表達(dá)。此外，升高的MUC1表達(dá)伴隨著多種癌癥不良預(yù)后，血液中MUC1的濃度在癌癥患者中升高(非專利文獻(xiàn)1)。

最初通過O-糖鏈修飾轉(zhuǎn)移至MUC1的VNTR區(qū)域的絲氨酸和蘇氨酸殘基的頻率最高的糖是GalNAc(有時表示為Tn)。因此，產(chǎn)生了Tn抗原。盡管Tn在正常MUC1罕見，其在癌癥衍生的MUC1中被發(fā)現(xiàn)。之后，唾液酸、半乳糖或GlcNAc被添加至Tn，產(chǎn)生唾液酸-Tn(STn)，核心1(T)，或核心2。當(dāng)唾液酸被添加至核心2，產(chǎn)生唾液酸T(ST)。其它糖鏈不再添加至STn，但GlcNAc和GalNAc被轉(zhuǎn)移至Tn。在癌癥細(xì)胞中，O-型糖鏈被不完全加工，導(dǎo)致表達(dá)癌癥中常見的糖抗原Tn(GalNAcα-1-Ser/Thr)、STn(Siaα2-6GalNAcα-1-O-Ser/Thr)、T(Galβ1-3GalNAcα-1-O-Ser/Thr)、核心2(GlcNAcβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr)、ST(Siaα2-3Balβ1-3Ga1Nacα1-O-Ser/THR/Siaα2-6(Galβ1-3)GalNAcα1-O-Ser/Thr)。由于不同糖鏈的修飾(例如MUC1的串聯(lián)重復(fù)中可以用O-糖鏈修飾的五個位點的修飾)，抗原結(jié)構(gòu)(表位)隨著癌癥進(jìn)展而變化(非專利文獻(xiàn)4)。GalNAc最初被轉(zhuǎn)移至的O-糖苷的多種核心結(jié)構(gòu)是已知的且已經(jīng)被分配編號。核心0、1和2的核心結(jié)構(gòu)給出如下：

核心0(Tn抗原)：GalNAc

核心1(T抗原)：Galβ1-3GalNAc

核心2：Galβ1-3(GlcNAcβ1-6)GalNAc

MUC1蛋白通過O-糖基化的糖鏈的添加在上皮細(xì)胞層的保護(hù)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞粘附、炎性反應(yīng)、癌癥發(fā)生和癌轉(zhuǎn)移起重要作用。已經(jīng)報道了MUC1在癌癥發(fā)生中的過表達(dá)以及O-糖基化的劇烈變化和癌癥發(fā)生和轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系。此外，采用MUC1單克隆抗體的乳腺癌和卵巢癌診斷和治療性藥物的研發(fā)正在進(jìn)行(非專利文獻(xiàn)1)。最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MUC糖蛋白和半乳凝素之間的相互作用在癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移中是重要的(非專利文獻(xiàn)5)。

已經(jīng)報道多種單克隆抗體用于純化MUC1和衍生自MUC1的合成肽和糖肽(專利文獻(xiàn)1-5，非專利文獻(xiàn)6和7)。大部分這些抗體的最小序列識別被認(rèn)為是位于MUC1串聯(lián)重復(fù)中的肽中Ala-Pro-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro。該序列所含的蘇氨酸被認(rèn)為是大量O-糖基化，且因此被認(rèn)為對結(jié)合MUC1的抗體的選擇性和親和力有影響。然而，對于上述報道中的所有單克隆抗體，即使基于構(gòu)成表位的肽中糖鏈鍵的存在或不存在鑒別到差異，也沒有鑒別到糖鏈結(jié)構(gòu)的差異。因此，癌癥細(xì)胞選擇性是不足夠的。相反，本發(fā)明人已經(jīng)制備了對于MUC1的STn正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)相對于癌癥相關(guān)結(jié)構(gòu)具有高交叉反應(yīng)性比例的抗體(專利文獻(xiàn)6和7)。

然而，即使這些抗體也難以精確識別O-糖基化核心肽和MUC1核心肽結(jié)構(gòu)形式的不同糖鏈肽結(jié)構(gòu)的差異。

專利文獻(xiàn)1：JP Patent No.3698370

專利文獻(xiàn)2：JP-A-2002-502621

專利文獻(xiàn)3：JP-A-2003-519096

專利文獻(xiàn)4：US-A-2006/0292643

專利文獻(xiàn)5：JP-A-2010-505775

專利文獻(xiàn)6：W02010/050528

專利文獻(xiàn)7：W02011/135869

專利文獻(xiàn)8：JP-A-2006-111618

非專利文獻(xiàn)1：Beatson et al.,Immunotherapy 2:305-327(2010)

非專利文獻(xiàn)2：Engelmann et al.,J.Bioi.Chem.276:27764-27769(2001)

非專利文獻(xiàn)3：Bafina et al.,Oncogene 29:2893-2904(2010)

非專利文獻(xiàn)4：Clin.Cancer Res.19:1981-1983(2013)

非專利文獻(xiàn)5：Liu et al.,Nature Rev Cancer 5:29-41(2005)

非專利文獻(xiàn)6：Danielczyk et al.,Cancer lmmunol.lmmunother.55:1337-1347(2006)

非專利文獻(xiàn)7：Cao et al.,Histochem.Cell Biol.115:349-356(2001)

非專利文獻(xiàn)8：Ohyabu et al.,J.Am.Chem.Soc.131:17102-17109(2009)

非專利文獻(xiàn)9：Matsusita et al.,Biochim.Biophy.Acta 1840:1105-1116(2014)

非專利文獻(xiàn)10：Hashimoto et al.,Chem.Eur.J.17:2393-2404(2011)

非專利文獻(xiàn)11：Lu-Gang et al.,J.Bioi.Chem.282:773-781(2007)

專利文獻(xiàn)1-8和非專利文獻(xiàn)1-11明確地通過引用以其整體并入本文。

發(fā)明概述

待通過本發(fā)明解決的問題

本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了高靈敏度的、高性能的糖肽固定化陣列，其能夠精確地實現(xiàn)表位定位以及抗體的特異性分析，并且已經(jīng)建立了確定真表位結(jié)構(gòu)的新方法。使用該方法，他們對上述七種已存在的抗MUC1抗體進(jìn)行表位分析。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)這些抗體中沒有一種能夠識別MUC1的核心肽中的差異或核心肽中O-糖基化糖肽結(jié)構(gòu)的差異(非專利文獻(xiàn)8和9)。

本發(fā)明人進(jìn)一步通過NMR證明在所述抗MUC1抗體的表位區(qū)域，主鏈肽中被誘導(dǎo)出構(gòu)象改變，其特異于與側(cè)鏈結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)。他們還澄清了肽構(gòu)象靈敏地被特性氨基酸殘基的糖鏈修飾所改變，而這限定出抗MUC1抗體的抗原結(jié)構(gòu)(非專利文獻(xiàn)8)。他們還通過MS和NMR分析了粘蛋白衍生的合成糖肽的三維結(jié)構(gòu)的變化。在此基礎(chǔ)上，他們確定糖肽的構(gòu)象受到存在于所述肽中若干個蘇氨酸殘基的糖鏈修飾的影響，以及在特定位置的糖鏈修飾賦予肽主鏈的穩(wěn)定構(gòu)象(非專利文獻(xiàn)10)。

基于該知識，本發(fā)明的目的是提供抗MUC1抗體，特異于在癌癥細(xì)胞高度表達(dá)的具有O-鍵-類型糖鏈的糖肽。本文中，術(shù)語“特異于具有O-鍵-類型糖鏈的糖肽”指的是能夠精確識別O-糖基化核心肽的多種糖肽結(jié)構(gòu)和MUC1的核心肽結(jié)構(gòu)中的差異。

本發(fā)明的另一目的是提供合成的糖肽作為適于制備該抗體的抗原。本發(fā)明的仍另一目的是提供用該抗體診斷、預(yù)防和/或治療癌癥的新工具和方法。

本發(fā)明人利用他們收集的關(guān)于糖鏈和糖肽的新技術(shù)知識來實現(xiàn)上述目的。他們?nèi)斯さ睾铣闪税琓n的糖肽，并應(yīng)用該人工合成的糖肽作為抗原來制備單克隆抗體，所述Tn構(gòu)成了最初通過O-糖鏈修飾被轉(zhuǎn)移至MUC1的VNTR區(qū)域中的絲氨酸或蘇氨酸殘基的核心糖結(jié)構(gòu)。對于從包含Tn的糖肽獲得的大量抗MUC1抗體(下文也稱作“Tn抗原”)，他們采用裝載有來自不同粘蛋白的VNTR區(qū)域的糖肽的微陣列(含有用作抗原的糖肽)來分析抗體特異性，并檢查抗體的特性。他們還針對于多種癌癥細(xì)胞表達(dá)的MUC1的結(jié)合和累積，與癌癥患者血清反應(yīng)，抑制癌癥細(xì)胞增殖的效果以及抑制轉(zhuǎn)移的效果來檢查這些抗體。該檢查的結(jié)果是，他們發(fā)現(xiàn)能夠精確識別MUC1的核心肽結(jié)構(gòu)和由核心肽的O-糖基化產(chǎn)生的多種糖肽結(jié)構(gòu)中的差異。以該基礎(chǔ)創(chuàng)造本發(fā)明。

解決問題的手段

本發(fā)明如下所示。

[1]

針對人MUC1的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異性識別在人MUC1串聯(lián)單元的氨基酸序列中的任意蘇氨酸或絲氨酸上具有O-鍵-類型糖鏈核心0(Tn)的MUC1串聯(lián)單元和糖肽。

[2]

[1]的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述人MUC1串聯(lián)單元的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，且所述O-鍵-類型糖鏈核心0(Tn)結(jié)合SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中第8位蘇氨酸。

[3]

[1]的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述人MUC1串聯(lián)單元的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述O-鍵-類型糖鏈核心0(Tn)結(jié)合SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中第8位絲氨酸。

[4]

[1]-[3]中任一項的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其具有以下i)-iii)中給出的結(jié)合特性。

i)不結(jié)合其中O-鍵-類型糖鏈核心0(Tn)被O-鍵-類型糖鏈T或STn取代的糖肽；

ii)不結(jié)合包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的肽(裸肽)；和

iii)不結(jié)合MUC2的串聯(lián)單元肽或MUC4的串聯(lián)單元肽中Tn被修飾的糖肽。

[5]

[1]-[4]中任一項的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含至少一個抗原結(jié)合部分，所述抗原結(jié)合部分包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)結(jié)構(gòu)域，所述重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域在其序列中包含互補決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3，CDR1包含SEQ ID NO:8所述氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列，且CDR3包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域在其序列中包含互補決定區(qū)CDR1’、CDR2’和CDR3’，CDR1’包含SEQ ID NO:11所述氨基酸序列，CDR2’包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列，且CDR3’包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列。

[6]

[1]-[4]中任一項的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含至少一個抗原結(jié)合部分，所述抗原結(jié)合部分包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)結(jié)構(gòu)域，所述重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域在其序列中包含互補決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3，CDR1包含SEQ ID NO:16所述氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列，且CDR3包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域在其序列中包含互補決定區(qū)CDR1’、CDR2’和CDR3’，CDR1’包含SEQ ID NO:19所述氨基酸序列，CDR2’包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列，且CDR3’包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列。

[7]

[5]的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:7。

[8]

[6]的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:15。

[9]

[1]-[8]中任一項的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗原結(jié)合片段是包含互補決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’中的至少一個的肽。

[10]

[1]-[9]中任一項的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體結(jié)合片段是Fab、F(ab’)2、Fab’、雙抗體、單鏈抗體(例如scFv或dsFv)、雙特異性抗體、嵌合抗體或人源化抗體。

[11]

[1]-[10]中任一項的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其用于特異性檢測MUC1。

[12]

一種特異性檢測人體液樣品中MUC1的方法，包括:

(a)使[1]至[10]中任一項的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述樣品接觸；和

(b)在接觸后測量所述樣品中抗體(或其抗原結(jié)合片段)-抗原復(fù)合物的形成。

[13]

[12]的方法，其用于檢測惡性腫瘤的存在或不存在，其中所述惡性腫瘤在所述體液樣品中展現(xiàn)MUC1的不正常表達(dá)。

[14]

[13]的方法，其中所述惡性腫瘤選自乳腺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌。

[15]

用于應(yīng)用[12]至[14]中任一項的方法的試劑盒，包含：

(a)[1]至[10]中任一項的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；和

(b)用于測量抗體(或其抗原結(jié)合片段)-抗原復(fù)合物的試劑。

[16]

用于預(yù)防或治療惡性腫瘤的藥物組合物，其包含[1]至[10]中任一項的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段作為活性成分。

[17]

[16]的組合物，其中所述惡性腫瘤選自乳腺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌。

發(fā)明效果

本發(fā)明提供針對人MUC1的單克隆抗體形式的抗MUC1抗體，其特異性識別MUC1的串聯(lián)單元肽的O-鍵-類型糖鏈?zhǔn)呛诵?(Tn)的MUC1，不識別或不結(jié)合沒有添加O-鍵-類型糖鏈的裸肽或者除了O-鍵-類型糖鏈?zhǔn)荰n的那些之外的MUC1鏈肽，并且提供采用抗原糖肽制備抗體的方法。使用本發(fā)明的抗MUC1抗體，有可能特異性地、高度靈敏地、可靠地和便利地檢測MUC1蛋白，并且檢測MUC1表達(dá)相對于正常對照發(fā)生改變的惡性腫瘤和炎癥疾病。通過本發(fā)明的抗MUC1抗體抑制癌癥進(jìn)展或轉(zhuǎn)移，其能夠被應(yīng)用為預(yù)防和/或治療癌癥的藥物。

附圖簡述

[圖1]MUC1-衍生糖肽的MALDI-TOFMS譜。

[圖2]MUC2-衍生糖肽的MALDI-TOFMS譜。

[圖3]MUC4-衍生糖肽的MALDI-TOFMS譜。

[圖4]通過糖肽-固定化微陣列評價SN-101和SN-102的反應(yīng)特異性。

[圖5]用抗體SN-101和SN-102對表達(dá)MUC1的細(xì)胞的免疫熒光染色的結(jié)果。

[圖6]用抗體SN-101的細(xì)胞增殖阻斷測試結(jié)果。

[圖7]顯示抗體SN-101和SN-102可變區(qū)的氨基酸序列的實例。

[圖8]顯示含有抗體SN-101的可變區(qū)的氨基酸序列。

[圖9]顯示含有抗體SN-102的可變區(qū)的氨基酸序列。

本發(fā)明實施方式

下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

1.抗原糖肽和抗體

本發(fā)明的抗體是針對人MUC1的單克隆抗體，其特異性識別在人MUC1串聯(lián)單元的氨基酸序列中的任意蘇氨酸或絲氨酸上具有O-鍵-類型糖鏈核心0(Tn)的MUC1串聯(lián)單元和糖肽。

本發(fā)明的抗體的實例是這樣的單克隆抗體，其中所述人MUC1串聯(lián)單元的氨基酸序列包含上述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，且所述O-鍵-類型糖鏈核心0(Tn)鍵接至SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中第8位蘇氨酸。本發(fā)明的抗體的另一實例是這樣的單克隆抗體，其中所述MUC1串聯(lián)單元的氨基酸序列包含上述SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述O-鍵-類型糖鏈核心0(Tn)鍵接至SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中第8位絲氨酸。

本發(fā)明的這些抗體可以是具有以下i)-iii)中的結(jié)合特性的那些：

i)不結(jié)合其中O-鍵-類型糖鏈核心0(Tn)被O-鍵-類型糖鏈T或STn取代的糖肽；

ii)不結(jié)合包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的肽(裸肽)；和

iii)不結(jié)合具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的MUC2的串聯(lián)單元肽或具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的MUC4的串聯(lián)單元肽中Tn被修飾的糖肽。

1-1.抗原糖肽

作為MUC1串聯(lián)重復(fù)的O-鍵-類型糖鏈被最初轉(zhuǎn)移至核心肽的糖最經(jīng)常是GalNAc。因此，產(chǎn)生了Tn抗原。盡管Tn在正常MUC1罕見，但其在癌癥衍生的MUC1中被發(fā)現(xiàn)。

人MUC1的串聯(lián)單元肽具有以下氨基酸序列：Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr(SEQ ID NO:1)。

人MUC1的串聯(lián)單元肽變體具有以下氨基酸序列：Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Glu-Ser-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr(SEQ ID NO:2)。

在制備抗原中，其中O-鍵-類型糖鏈被添加至上述肽兩者之一的前述氨基酸的糖肽可以被用作抗原。O-鍵-類型糖鏈被添加至的該肽是人工合成的。

所述O-鍵-類型糖鏈?zhǔn)前琓n(GalNAc)的核心結(jié)構(gòu)的糖鏈。所述O-鍵-類型糖鏈結(jié)合具有上述SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列的串聯(lián)單元肽的第八位氨基酸蘇氨酸(Thr)或絲氨酸(Ser)。

通過本發(fā)明人開發(fā)的高度利用微波和酶合成方法的合成技術(shù)進(jìn)行抗原糖肽的合成。更具體地，例如，其可以基于非專利文獻(xiàn)9和專利文獻(xiàn)6至8描述的方法實施。非專利文獻(xiàn)9和專利文獻(xiàn)6至8的全部內(nèi)容具體地通過引用并入本文.

1-2.抗體：

本發(fā)明的抗體可以通過常規(guī)方法采用1-1描述的糖肽作為抗原制備。所述抗原糖肽可以與載體蛋白連接以增強其抗原性特性.在該情況下,可以合成結(jié)合載體蛋白所需的Cys被添加至糖肽的C端的抗原糖肽并用作所示抗原糖肽.載體蛋白包括鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等等?？少徺I獲得本領(lǐng)域已知的商業(yè)試劑盒.將抗原施用至哺乳動物例如小鼠、兔或大鼠。免疫主要通過靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或足墊注射進(jìn)行。免疫間隔不特別限制。免疫可以以若干天至若干周的間隔進(jìn)行1至5次。在最后免疫之后從幾天至90天收集產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的實例為淋巴細(xì)胞、脾細(xì)胞和外周血細(xì)胞。所述產(chǎn)生抗體的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合以獲得雜交瘤。可以采用通?？色@得的已經(jīng)建立的骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞系。期望采用具有藥物選擇性、在非融合狀態(tài)不能在HAT選擇性培養(yǎng)基(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)上生長、以及僅僅能夠在與產(chǎn)生抗體的細(xì)胞融合的狀態(tài)存活的特性的細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞的實例為骨髓瘤細(xì)胞株例如SP2、P3X63-Ag.8.UI(P3U)、和NS-1。

細(xì)胞融合后從細(xì)胞中篩選靶雜交瘤。例如，細(xì)胞懸浮液用含胎牛血清的RPM-1640培養(yǎng)基合適地稀釋，然后接種至微量滴定板。將選擇性培養(yǎng)基(如HAT培養(yǎng)基)添加至各孔，接著培養(yǎng)細(xì)胞，合適地替換培養(yǎng)基。結(jié)果，在開始用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，生長大約10至30天的細(xì)胞可以收獲為雜交瘤。接著，用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)等篩選雜交瘤上清液以測定與MUC1反應(yīng)的抗體是否存在。融合的細(xì)胞通過有限稀釋法等建立產(chǎn)生靶單克隆抗體的雜交瘤。

可以采用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法、腹水形成方法等從已經(jīng)建立的雜交瘤收集單克隆抗體。所述抗體可以通過合適地選擇已知的方法例如硫酸銨沉淀、離子交換色譜法、凝膠過濾、親和色譜法或其一些組合純化。

可以用于本發(fā)明的單克隆抗體的球蛋白類型并不具體限定?？梢允荌gG、IgM、IgA、IgE或IgD，優(yōu)選IgG和IgM。

使用上述方法制備的本發(fā)明的抗-MUC1單克隆抗體是小鼠抗體。通過已經(jīng)建立的若干已知技術(shù)，它們可以被轉(zhuǎn)換成嵌合抗體或人源化抗體(轉(zhuǎn)換方法將在下文進(jìn)一步描述)。和本發(fā)明的抗小鼠MUC1單克隆抗體具有相同抗原特異性的嵌合抗體和人抗體包括在本發(fā)明的抗體內(nèi)。和本發(fā)明的抗小鼠MUC1單克隆抗體具有相同抗原特異性且具有一不同抗原特異性的雙特異性抗體包括在本發(fā)明的抗體內(nèi)。

本發(fā)明的單克隆抗體的具體實例是單克隆抗體SN-101和SN-102，其在實施例中描述。單克隆抗體SN-101是由根據(jù)布達(dá)佩斯條約以保藏號NITE BP-01845于2014年4月16日保藏于國立技術(shù)與評價研究所專利微生物保藏所(NPMD)(2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba Prefecture,Japan,292-0818)的雜交瘤細(xì)胞系統(tǒng)分泌的單克隆抗體。單克隆抗體SN-102是由雜交瘤株3C10-E11分泌的單克隆抗體(見實施例)。

單克隆抗體SN-101是具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID No:6的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID No:7的氨基酸序列。單克隆抗體SN-101包含至少一個抗原結(jié)合位點，其含有免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)結(jié)構(gòu)域。所述重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域在其序列內(nèi)包含互補決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3。CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:8。CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:9。以及CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO:10。上面所述輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域在其序列內(nèi)包含互補決定區(qū)CDR1’、CDR2’和CDR3’。CDR1’包含氨基酸序列SEQ ID NO:11。CDR2’包含氨基酸序列SEQ ID NO:12。以及CDR3’包含氨基酸序列SEQ ID NO:13。

單克隆抗體SN-102是具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。單克隆抗體SN-102包含至少一個抗原結(jié)合位點，其含有免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)結(jié)構(gòu)域。所述重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域在其序列內(nèi)包含互補決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3。CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:16。CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:17。以及CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO:18。上面所述輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域在其序列內(nèi)包含互補決定區(qū)CDR1’、CDR2’和CDR3’。CDR1’包含氨基酸序列SEQ ID NO:19。CDR2’包含氨基酸序列SEQ ID NO:20。以及CDR3’包含氨基酸序列SEQ ID NO:21。

單克隆抗體SN-101具有如下i)至v)的結(jié)合特性：

i)結(jié)合MUC1衍生糖肽Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys；

ii)不結(jié)合其中MUC1衍生糖肽的Tn糖鏈已經(jīng)被T或STn取代的糖肽；

iii)不結(jié)合包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的肽(裸肽)；和

iv)不結(jié)合具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的MUC2的串聯(lián)單元肽或具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的MUC4的串聯(lián)單元肽中Tn被修飾的糖肽。

單克隆抗體SN-101還結(jié)合無C端Cys的MUC1-衍生糖肽Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr，且不結(jié)合具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽(裸肽)。

單克隆抗體SN-102具有如下i)至vi)的結(jié)合特性：

i)結(jié)合糖肽Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr，其中Tn糖鏈鍵接至具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽的第8位蘇氨酸；

ii)不結(jié)合或僅僅弱結(jié)合其中MUC1衍生糖肽的Tn糖鏈已經(jīng)被T或STn取代的糖肽；

iii)不結(jié)合包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽(裸肽)；

iv)不結(jié)合這樣的糖肽，其中Tn在具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽的第14位絲氨酸或第15位蘇氨酸處修飾；

v)結(jié)合這樣的糖肽，其中Tn糖鏈在具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽的全部蘇氨酸和絲氨酸處修飾；和

vi)不結(jié)合MUC2的串聯(lián)單元肽或MUC4的串聯(lián)單元肽中Tn被修飾的糖肽。

單克隆抗體SN-102結(jié)合糖肽Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys，所述糖肽在其C端具有Cys且其中Tn糖鏈被鍵接至具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的肽的第8位蘇氨酸，并且不結(jié)合具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的肽(裸肽)。

本發(fā)明除了上述單克隆抗體外還涵蓋單克隆抗體的抗原結(jié)合片段。所述抗原結(jié)合片段是含有SN-101或SN-102的互補決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’中的至少一個的肽。所述抗原結(jié)合片段例如是Fab、F(ab’)2、Fab’雙抗體、或單鏈抗體(如scFv或dsFv)。然而，所述抗原結(jié)合片段并不旨在限定于上述的。其僅需要是含有SN-101或SN-102的互補決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’中的至少一個，且具有和上述SN-101的i)-v)相同的結(jié)合特性或和上述SN-102的i)-vi)相同的結(jié)合特性的肽。在嵌合抗體、人抗體或雙特異性抗體中，其足以使得所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)結(jié)構(gòu)域為含有SN-101或SN-102的互補決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’中的至少一個的肽，具有和上述SN-101的i)-v)相同的結(jié)合特性或具有和上述SN-102的i)-vi)相同的結(jié)合特性。

抗原結(jié)合片段及其制備方法將解釋如下。

[Fab、F(ab')2、Fab']

制備方法(1)：通過用預(yù)先制備的酶消化小鼠單克隆抗體并通過還原反應(yīng)切斷二硫鍵制備。

-Fab:用木瓜蛋白酶消化。

-F(ab')2:用胃蛋白酶消化。

-Fab':用胃蛋白酶消化并用β-巰基乙醇還原處理以切斷二硫鍵。

制備方法(2)：采用遺傳重組技術(shù)通過蛋白表達(dá)技術(shù)制備

-Fab:

-編碼VH(H鏈可變區(qū))和CH1(H鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域1)的堿基序列

-編碼VL(L鏈可變區(qū))和CL(L鏈恒定區(qū))的堿基序列

為使得上述兩種序列被大腸桿菌和動物細(xì)胞(CHO、HEK293、昆蟲細(xì)胞)表達(dá)，它們被并入適于特定細(xì)胞的表達(dá)載體，之后所述基因被導(dǎo)入至細(xì)胞，通過產(chǎn)生重組蛋白獲得Fab。

-F(ab')2、Fab':

-編碼VH(H鏈可變區(qū))和CH1(H鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域1)以及含有用于形成二聚體半胱氨酸的鉸鏈區(qū)的堿基序列

-編碼VL(L鏈可變區(qū))和CL(L鏈恒定區(qū))的堿基序列

為使得上述兩種序列被大腸桿菌或動物細(xì)胞(CHO、HEK293、昆蟲細(xì)胞)表達(dá)，它們被并入適于特定細(xì)胞的表達(dá)載體，之后所述基因被導(dǎo)入至細(xì)胞，通過產(chǎn)生重組蛋白獲得F(ab’)2和Fab’。

[scFv、dsFv]

制備方法:采用遺傳重組技術(shù)通過蛋白表達(dá)技術(shù)制備

-scFv:

-編碼VH(H-鏈可變區(qū))的堿基序列

-編碼柔性氨基酸例如接頭序列”GSSSGSSSSGSSSSGSSSS”等的堿基序列。

-編碼VL(L-鏈可變區(qū))的堿基序列

為使得在大腸桿菌或動物細(xì)胞(CHO、HEK293、昆蟲細(xì)胞)中表達(dá)為連續(xù)的VH-接頭-VL或VL-接頭-VH融合蛋白，其被并入適于特定細(xì)胞的表達(dá)載體，之后所述基因被導(dǎo)入至細(xì)胞，通過產(chǎn)生重組蛋白獲得scFv。

-dsFv:

-編碼VH(H鏈可變區(qū))的堿基序列

-編碼VL(L鏈可變區(qū))的堿基序列

在VH的C端側(cè)和VH之間插入半胱氨酸。為使得在大腸桿菌或動物細(xì)胞(CHO、HEK293、昆蟲細(xì)胞)中表達(dá)為連續(xù)的VH-接頭-VL或VL-接頭-VH融合蛋白，其被并入適于特定細(xì)胞的表達(dá)載體，之后所述基因被導(dǎo)入至細(xì)胞，通過產(chǎn)生重組蛋白獲得dsFv。

[雙抗體]

制備方法:采用遺傳重組技術(shù)通過蛋白表達(dá)技術(shù)制備

(1)編碼針對抗原X的VH(H鏈可變區(qū))的堿基序列(2)編碼針對抗原X的VL(L鏈可變區(qū))的堿基序列(3)編碼針對抗原X的VH(H連可變區(qū))的堿基序列(4)編碼針對抗原X的VL(L鏈可變區(qū))的堿基序列

(5)編碼柔性氨基酸例如接頭序列”GSSSGSSSSGSSSSGSSSS”的堿基序列。

為使得在大腸桿菌或動物細(xì)胞(CHO、HEK293、昆蟲細(xì)胞)表達(dá)VH(1)-接頭(5)-VL(4)和VH(3)-接頭(5)-VL(2)為連續(xù)的融合蛋白，它被并入適于特定細(xì)胞的表達(dá)載體，之后所述基因被導(dǎo)入至細(xì)胞，通過產(chǎn)生重組蛋白獲得雙抗體。

[嵌合抗體或人源化抗體]

-嵌合抗體

制備方法:采用遺傳重組技術(shù)通過蛋白表達(dá)技術(shù)制備

-編碼小鼠VH(H鏈可變區(qū))和人抗體H鏈恒定區(qū)的堿基序列

-編碼小鼠VL(L鏈可變區(qū))和人抗體L鏈恒定區(qū)的堿基序列

為使得上述兩種序列在動物細(xì)胞(CHO、HEK293、昆蟲細(xì)胞)表達(dá)，它們被并入適于特定細(xì)胞的表達(dá)載體，之后所述基因被導(dǎo)入至細(xì)胞，通過產(chǎn)生重組蛋白獲得嵌合抗體。

-人源化抗體

制備方法:采用遺傳重組技術(shù)通過蛋白表達(dá)技術(shù)制備

-編碼人源化VH的堿基序列，其中CDR1、CDR2和CDR3被插入至FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4中人抗體可變區(qū)VH的FR1、FR2、FR3和FR4之間，構(gòu)成小鼠VH(H-鏈可變區(qū))和人抗體H鏈恒定區(qū)

-編碼人源化VL的堿基序列，其中CDR1、CDR2和CDR3被插入至FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4中人抗體可變區(qū)VL的FR1、FR2、FR3和FR4之間，構(gòu)成小鼠VL(H-鏈可變區(qū))和人抗體L鏈恒定區(qū)

為使得上述兩種序列在動物細(xì)胞(CHO、HEK293、昆蟲細(xì)胞)表達(dá)，它們被并入適于特定細(xì)胞的表達(dá)載體，之后所述基因被導(dǎo)入至細(xì)胞，通過產(chǎn)生重組蛋白獲得人源化抗體。

2-1.檢測人體液樣品中MUC1的方法

本發(fā)明包括在人體液樣品中特異性檢測MUC1的方法。該方法包括如下步驟(a)和(b)：

(a)使本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與所述樣品接觸；和

(b)在接觸后測量所述樣品中抗體(或其抗原結(jié)合片段)-抗原復(fù)合物的形成。

2-2.用于免疫學(xué)測量人MUC1的試劑盒

本發(fā)明的試劑盒使得可以應(yīng)用本發(fā)明的檢測人MUC1的方法。其包括：

(a)本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；和(b)用于測量抗體(或其抗原結(jié)合片段)-抗原復(fù)合物的試劑。

該試劑盒所采用的本發(fā)明的單克隆抗體(也稱作“抗-MUC1抗體”)可以被固定于支持物上。所述支持物可以是抗原會粘附的任何支持物，其是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。例如，所述支持物可以使微量滴定板的測試孔，硝酸纖維素或一些其它合適的膜。或者，所述支持物可以是珠或盤(例如玻璃、纖維玻璃、乳膠或塑料材料如聚苯乙烯或聚氯乙烯)。所述支持物還可以是磁性顆粒或纖維光學(xué)傳感器。

本發(fā)明的抗-MUC1抗體可以用可通過簡單測量方法可視化檢測的放射性同位素、酶、熒光材料、發(fā)光材料或金屬膠體、有色乳膠等標(biāo)記?？梢杂糜跇?biāo)記的放射性同位素為：¹⁴C、³H、³²P、¹²⁵I、¹³¹I等等。特別適合使用¹²⁵I。這可以通過氯胺-T方法、過氧化物酶方法、iodogen法、Bolton-Hunter法等連接至所述單克隆抗體。可以用作標(biāo)記的酶的實例為β-半乳糖苷酶(βGAL)、堿性磷酸酶(ALP)和辣根過氧化物酶(HRP)。這些可以通過常規(guī)方法連接至所述單克隆抗體?？梢杂米鳂?biāo)記的熒光材料包括熒光素(fluorescein)、熒光胺、異硫氰酸熒光素和四甲基異硫氰酸羅丹明?？梢杂米鳂?biāo)記的發(fā)光材料包括：熒光素(luciferin)、魯米諾衍生物和吖啶酯類。金膠體和有色乳膠可以應(yīng)用于簡單的檢測方法。

可以基于所采用的免疫學(xué)檢測方法合適地確定用于測量抗體(或其抗原結(jié)合片段)-抗原復(fù)合物的試劑?？梢圆捎媚軌驒z測抗體(或其抗原結(jié)合片段)-抗原復(fù)合物(當(dāng)人體液樣品含人MUC1時形成)的已知試劑。

在本發(fā)明中，屬于“人體液樣品”是潛在地含有人MUC1的材料，例如人血漿、血清、血液、尿、唾液或癌癥組織分泌物。

除了使用本發(fā)明的單克隆抗體作為抗體外，本發(fā)明的MUC1檢測方法可以使用常規(guī)已知免疫學(xué)測量方法實現(xiàn)。常規(guī)已知免疫學(xué)測量方法的實例為免疫組化染色方法、免疫電子顯微術(shù)和免疫測定(例如酶促免疫測定(ELISA、EIA)、熒光免疫測定、放射性免疫測定(RIA)、免疫色譜、免疫凝集方法以及蛋白印跡法)。步驟(b)中在接觸后測量抗體-抗原復(fù)合物形成的方法可以基于所述免疫學(xué)測量方法合適地選擇。

所述免疫學(xué)測量方法將更詳細(xì)地描述。一個實例是夾心式免疫學(xué)測量方法，包含將本發(fā)明的單克隆抗體(第一單克隆抗體)固定于固相上并將其與含抗原的樣品孵育的步驟；添加將標(biāo)記的第二單克隆抗體并孵育所獲得的混合物的步驟；和檢測在混合物中產(chǎn)生的經(jīng)標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物的步驟。在本發(fā)明的免疫學(xué)測量方法中，可以同時孵育所述樣品、固定的第一單克隆抗體和經(jīng)標(biāo)記的第二單克隆抗體。任何的夾心式免疫學(xué)測量方法例如夾心式放射性免疫測定(RIA)、夾心式酶促免疫測定(EIA)、夾心式熒光免疫測定(FIA)、夾心式發(fā)光免疫測定(CLEIA)和基于夾心式測定的免疫色譜術(shù)都可以采用為所述夾心式免疫學(xué)測量方法，取決于檢測方法。對于定量，RIA和EIA方法是期望的。

夾心式RIA方法可以基于期望的實施方式進(jìn)行。在夾心式RIA方法中，具體地，上面已經(jīng)固定有第一單克隆抗體(本發(fā)明的單克隆抗體)的珠與標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品混合，混合物在4至45℃(優(yōu)選25至37℃)孵育1至4小時(優(yōu)選2小時)(第一個反應(yīng))。在清洗后，添加含有例如已經(jīng)用¹²⁵I標(biāo)記的第二單克隆抗體的溶液，混合物在4至45℃(優(yōu)選25至37℃)孵育1至4小時(優(yōu)選2小時)(第二個反應(yīng))。在清洗后，用伽馬計數(shù)器等檢測結(jié)合至珠上的抗原-抗體復(fù)合物的放射活性以定量。在另一優(yōu)選的實施方式中，進(jìn)行夾心式EIA方法。在夾心式EIA方法中，具體地，上面已經(jīng)固定有第一單克隆抗體的珠與經(jīng)標(biāo)記的溶液或樣品混合，混合物在4至45℃(優(yōu)選25至37℃)孵育1至4小時(優(yōu)選2小時)(第一個反應(yīng))。在清洗后，添加含有用酶標(biāo)記如辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的第二單克隆抗體的溶液，混合物在4至45℃(優(yōu)選25至37℃)孵育1至4小時(優(yōu)選2小時)，包含抗體-抗體的免疫復(fù)合物在珠上形成(第二個反應(yīng))。珠上的酶活性用該酶特異性的底物測量，例如，當(dāng)酶標(biāo)記是HRP時，通過色度法用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)測量。因此可以測量捕獲在珠上的量。色度法定量可以使用常規(guī)分光光度計進(jìn)行。

2-3.檢測人MUC1

本發(fā)明的方法可以用于檢測在體液樣品中是否存在展現(xiàn)異常MUC1表達(dá)的惡性腫瘤。舉例而言，展現(xiàn)異常MUC1表達(dá)的惡性腫瘤選自乳腺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌。本發(fā)明的抗體和MUC1特異性反應(yīng)，并因此有效地檢測和人MUC1相關(guān)的惡性腫瘤例如乳腺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌。

已報道MUC1在惡性腫瘤中的過表達(dá)，例如乳腺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌。具體而言，在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中發(fā)現(xiàn)MUC1的90％或更高的過表達(dá)。MUC1的過表達(dá)伴隨著多種癌癥的不良預(yù)后?；颊哐褐械腗UC1的濃度升高(非專利文獻(xiàn)1)。

據(jù)報道MUC1的O-糖苷出現(xiàn)劇烈變化伴隨著癌變、癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移(非專利文獻(xiàn)1)。在健康上皮組織中，MUC1的VNTR區(qū)域中的O-糖鏈修飾正常地由含8-10個單糖單元的聚乳糖胺長鏈和支鏈糖組成。由于正常MUC1的細(xì)胞外區(qū)域被如此大量的糖鏈修飾，其顯示出對粘膜的保護(hù)、吸水和潤滑作用；對細(xì)菌和外來物質(zhì)的攻擊的保護(hù)作用；和細(xì)胞間的調(diào)節(jié)作用和對細(xì)胞基質(zhì)相互作用的調(diào)節(jié)作用。此外，MUC1表達(dá)于健康細(xì)胞的細(xì)胞頂端。然而，在癌癥細(xì)胞中頂端表達(dá)消失，變成非極性表達(dá)，MUC1在整個細(xì)胞表面出現(xiàn)。當(dāng)這出現(xiàn)時，VNTR區(qū)域的O-糖鏈修飾的模式劇烈變化，出現(xiàn)簡單的短糖鏈的O-糖鏈修飾而不是正常細(xì)胞中看到的包含長鏈和支鏈的復(fù)雜糖鏈。伴隨癌癥發(fā)展的MUC1低糖鏈修飾和非極性表達(dá)是由正常隱藏的肽表位的暴露和產(chǎn)生新的碳水化合物表位引起。因此，本發(fā)明的抗體，其與MUC1的這些表位特異性反應(yīng)，能夠區(qū)分和識別健康和癌性MUC1，且能用于檢測與人MUC1相關(guān)的惡性腫瘤。僅僅攻擊對癌癥細(xì)胞陽性的MUC1也變得可能。

本發(fā)明的免疫學(xué)測量試劑盒含有上面描述的抗-MUC1抗體。因此，本發(fā)明的試劑盒可以用于檢測包含于收集自懷疑受疾病阻礙或患疾病的樣本的樣品中的人MUC1，并因此快速和容易地確定樣本中障礙或疾病的存在。用于采用此種免疫學(xué)測量方法測定疾病或障礙的試劑是廣泛已知的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠容易地選擇除抗體外的合適組分。只要本發(fā)明的免疫學(xué)測量試劑盒是用于實現(xiàn)免疫學(xué)測量方法的技術(shù)，其可以用作任何方法的一部分。

本發(fā)明還提供用于采用本發(fā)明的抗體診斷癌癥的方法、含有本發(fā)明的抗體的診斷劑和含有抗體的診斷試劑盒。本發(fā)明所述診斷癌癥的方法、診斷劑和診斷試劑盒中含有的所述抗體是本發(fā)明上文所述的抗體。本發(fā)明的抗體可以用于這些癌癥診斷中，因為它們特異性地結(jié)合上述特定癌癥。

本發(fā)明的抗體可以用作用于診斷上述惡性腫瘤和用于檢測患者中疾病進(jìn)展的標(biāo)志物。在一種實施方式中，可以通過比較和評估獲得自患者的生物學(xué)樣品相對于事先基于MUC1水平確定的截斷值來診斷患者中的癌癥。

通過上述(b)獲得的測量結(jié)果和通過相同步驟(a)和(b)對對照樣品獲得的測量結(jié)果可以比較并用于檢測在已經(jīng)測量的體液樣品中是否存在惡性腫瘤。對照樣品可以使獲得自健康人的體液樣品。

為了確定癌癥存在與否，檢測自結(jié)合至并保留于固相支持物上的報道基團(tuán)的信號通常與相應(yīng)于預(yù)定截斷值的信號相比較。在一實施方式中，所述截斷值是通過將固定的抗體與來自無癌癥患者的樣品孵育而獲得的信號的平均值。通常而言，當(dāng)樣品產(chǎn)生超出預(yù)定截斷值三個標(biāo)準(zhǔn)差的信號時，其被認(rèn)為是癌癥陽性的。可以例如從一組假陽性比例(100％-特異性)和真陽性比例(即，靈敏度)的圖(對應(yīng)于各自可能的診斷測試結(jié)果的截斷值)確定所述截斷值。最接近圖左上邊緣的截斷值(即該值含有最大區(qū)域)是最精確的截斷值。產(chǎn)生高于本發(fā)明的方法確定的截斷值的信號的樣品將被認(rèn)為是陽性?；蛘撸鼋財嘀狄部梢匝刂鴪D遷移至圖的左邊以最小化假陽性的比例，或遷移至右邊以最小化假陰性的比例。通常而言，產(chǎn)生高于該方法確定的截斷值的信號的樣品將被認(rèn)為是癌癥陽性。

3.藥物組合物

本發(fā)明的藥物組合物含有單克隆抗體作為活性成分，用于預(yù)防和/或治療惡性腫瘤，且可以含有任何藥學(xué)可接受載體。所述惡性腫瘤選自乳腺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌。

本發(fā)明的抗-MUC1抗體及其抗原結(jié)合片段可用于預(yù)防和/或治療涉及MUC1的疾病。涉及MUC1的疾病包括惡性腫瘤，例如乳腺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌。在具有這些惡性腫瘤的患者中，MUC1表達(dá)異常、MUC1糖鏈結(jié)構(gòu)異常和導(dǎo)致的功能異常是公認(rèn)的。因此，本發(fā)明的抗-MUC1抗體能夠通過抑制惡性腫瘤的作用預(yù)防和/或治療惡性腫瘤。

本發(fā)明的抗-MUC1抗體和其抗原結(jié)合片段抑制加速的細(xì)胞增殖、癌癥轉(zhuǎn)移等等(其由于不正常MUC1表達(dá)、MUC1不正常糖鏈結(jié)構(gòu)而出現(xiàn)并導(dǎo)致在乳腺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌中觀察到的功能不正常)，允許預(yù)防和/或治療癌癥。

最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MUC1和半乳凝素之間的相互作用在乳腺癌和結(jié)腸癌等的轉(zhuǎn)移中是重要的(非專利文獻(xiàn)11)。在癌癥細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中，癌癥細(xì)胞離開最初部位，侵入周圍的細(xì)胞外基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞，并穿透血管和淋巴管。最終，它們附著于第二位點并增殖。癌癥細(xì)胞從循環(huán)到轉(zhuǎn)移部位的遷移包括(i)循環(huán)癌癥細(xì)胞的停止以及癌癥細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的瞬時弱接觸(對接)；(ii)用不同的粘附受體誘導(dǎo)局部改變和配體表達(dá)(整合素、鈣粘蛋白等)，和隨后(iii)癌癥細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的強粘附(鎖定)。已經(jīng)了解MUC1和半乳凝素3的相互作用在這三個過程中起重要作用。半乳凝素是識別β-半乳糖苷結(jié)構(gòu)并結(jié)合或交聯(lián)糖鏈的蛋白的通稱。半乳凝素3是15種半乳凝素之一且已知是存在于內(nèi)皮細(xì)胞，以及在免疫細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核中、在表面上和在細(xì)胞外基質(zhì)等。已經(jīng)證明癌癥細(xì)胞的MUC1結(jié)合半乳凝素3，半乳凝素3的血液濃度在具有轉(zhuǎn)移性癌癥的患者中相對于健康對照升高，循環(huán)癌癥細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附取決于癌癥細(xì)胞的MUC1表達(dá)和在上皮細(xì)胞中存在細(xì)胞外半乳凝素3，細(xì)胞外半乳凝素3與癌癥細(xì)胞MUC1的結(jié)合導(dǎo)致MUC1的細(xì)胞表面的顯著局部改變，加強了癌癥細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合等等。其還顯示血液中半乳凝素和MUC1的相互作用是癌癥細(xì)胞轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端器官的重要基礎(chǔ)分子機(jī)制。因此，如果能夠阻斷MUC1和半乳凝素3的結(jié)合，將認(rèn)為可能抑制全部上述轉(zhuǎn)移過程(i)至(iii)并抑制轉(zhuǎn)移。

在下文較遠(yuǎn)給出的實施例中，本發(fā)明的抗體描述為阻斷MUC1和半乳凝素3的結(jié)合。這提示使用本發(fā)明的抗體，將可能預(yù)防和/或治療在癌癥發(fā)展中過表達(dá)MUC1的癌癥如胰腺癌、卵巢癌和肺癌的轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明的抗-MUC1單克隆抗體是小鼠抗體。本發(fā)明的藥物組合物所用的抗體優(yōu)選是已經(jīng)轉(zhuǎn)換成嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體的小鼠抗體。小鼠抗體可以使用已知方法轉(zhuǎn)換成嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。

本發(fā)明的藥物組合物可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法配制，活性成分是本發(fā)明的抗體。例如，其能夠以在水中或一些其它藥學(xué)可接受液體中的無菌溶液的形式胃腸外使用，或作為懸浮液注射。例如，可能通過和藥學(xué)可接受載體或介質(zhì)的合適組合來配制，所述藥學(xué)可接受載體或介質(zhì)具體為無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、賦形劑、媒介物、防腐劑、粘劑等，混合于一般公認(rèn)的制劑所需的單位劑量形式。確定在這些制劑中活性成分的量以產(chǎn)生在指定范圍內(nèi)的合適的劑量。

用于注射的無菌組合物可以根據(jù)采用例如注射用蒸餾水的媒介物的常用制劑來配制。注射用水性溶液的實例為生理鹽水和含有葡萄糖或一些其他佐劑如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉的等張溶液。例如，合適的增溶劑例如醇，具體而言，乙醇和多元醇如丙二醇和聚乙二醇，以及非離子型表面活性劑如聚山梨酯80^TM和HCO-6，可以組合使用。

油性液體的實例是芝麻油和大豆油；苯甲酸芐酯和苯甲醇形式的增溶劑可以組合使用。緩沖液例如磷酸緩沖液、醋酸鈉緩沖液；安撫劑如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑如苯甲醇和酚；以及氧化抑制劑也可以配制。制備的注射劑通常裝載于合適的安瓿中。為了遞送至細(xì)胞，可以使用脂質(zhì)體包裹藥物。

施用可以是口服或胃腸外。優(yōu)選胃腸外施用。具體實例是注射劑、鼻施用劑、通過肺的施用劑和透皮施用。實例是全身性施用或局部施用，以注射的形式如靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射或皮下注射。

本發(fā)明的抗體的劑量和施用方法可以基于患者的年齡、體重和性別；待治療的癥狀的性質(zhì)；它們的嚴(yán)重程度等等合適地選擇。以示例的方式，含有所述抗體的藥物組合物的單劑量可以在0.0001mg至1,000mg每公斤體重的范圍內(nèi)選擇。或者，施用的劑量可以在0.01至100,000mg/患者身體的范圍內(nèi)選擇。然而，這些數(shù)字并不是必然限制。施用的劑量和施用的方法可以基于患者年齡、體重、性別、癥狀等合適地變化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠做出合適的選擇。

實施例

下面將通過實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明不限于這些實施例。

糖肽合成

合成用于評價抗體特異性的糖肽的方法如下給出。對于每種化合物，合成具有與用于特異性評價的交聯(lián)酮連接的序列以及化合物1至4中的Cys的化合物。

合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH₂(化合物1)

使用TentaGel S RAM樹脂(0.24mmol/g,50mg,12μmol)形式的固相支持物合成肽固相。氨基酸延伸反應(yīng)在微波輻照條件(40W,2,450MHz,50℃)通過將Fmoc氨基酸衍生物(48μmol),HBTU(48μmol),HOBt(48μmol)和DIEA(72μmol)在DMF溶液中反應(yīng)6分鐘進(jìn)行?；旌衔镌谑覝赜靡宜狒?DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液處理1分鐘以乙?；捶磻?yīng)的氨基基團(tuán)。接著，通過微波輻照(40W,2,450MHz,50℃),進(jìn)行20％哌啶/DMF處理3分鐘以去除Fmoc基團(tuán)保護(hù)。在糖肽合成中,(1)用不同F(xiàn)moc氨基酸延伸，(2)乙?；幚恚?3)Fmoc去除的三個步驟順序地重復(fù)進(jìn)行。所獲得的固相樹脂用三氟乙酸:水(95:5,v/v)處理2小時。過濾反應(yīng)溶液，加入乙醚誘導(dǎo)沉淀，獲得粗結(jié)晶。粗產(chǎn)物通過反相高效液相色譜法純化，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物6(6.3mg,產(chǎn)率22％)。

合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH₂(化合物2)

使用TentaGel S RAM樹脂(0.24mmol/g,100mg,36μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反應(yīng)在微波輻照條件(40W,2,450MHz,50℃)通過將Fmoc氨基酸衍生物(144μmol),HBTU(144μmol),HOBt(144μmol)和DIEA(216μmol)在DMF溶液中反應(yīng)6分鐘進(jìn)行。糖鏈取代氨基酸延伸反應(yīng)通過使Fmoc-Thr(Ac₃Ga1Naca(1→0))(43μmol),HBTU(43μmol)和HOBt(43μmol)以及DIEA(108μmol)在DMF溶液中用微波輻照反應(yīng)10分鐘進(jìn)行。添加HBTU(43μmol)和HOBt(43μmol)且混合物用微波輻照反應(yīng)10分鐘?；旌衔镌谑覝赜靡宜狒?DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液處理1分鐘以乙?；捶磻?yīng)的氨基基團(tuán)。接著，通過微波輻照(40W,2,450MHz,50℃),進(jìn)行20％哌啶/DMF處理3分鐘以去除Fmoc基團(tuán)保護(hù)。在糖肽合成中,(1)用不同F(xiàn)moc氨基酸延伸，(2)乙?；幚?，和(3)Fmoc去除的三個步驟順序地重復(fù)進(jìn)行。所獲得的固相樹脂用三氟乙酸:水(95:5,v/v)處理2小時。過濾反應(yīng)溶液，加入乙醚誘導(dǎo)沉淀，獲得粗結(jié)晶。粗產(chǎn)物溶解于甲醇，加入1N氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)為pH12.0-12.5，且處理在室溫進(jìn)行1小時。向其添加10％乙酸將溶液調(diào)節(jié)至pH7附近，之后蒸餾掉溶劑。獲得的殘余物通過反相高效液相色譜法純化，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物2(13.3mg,產(chǎn)率15％)。

合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(T)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH₂(化合物3)

使用TentaGel S RAM樹脂(0.24mmol/g,200mg,48μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反應(yīng)在微波輻照條件(40W,2,450MHz,50℃)通過將Fmoc氨基酸衍生物(192μmol),HBTU(192μmol),HOBt(192μmol)和DIEA(288μmol)在DMF溶液中反應(yīng)6分鐘進(jìn)行。糖鏈取代氨基酸延伸反應(yīng)通過使Fmoc-Thr(Ac₄Galβ(1→3)Ac₂GalNAcα(1→O)(58μmol),HBTU(58μmol)和HOBt(58μmol)以及DIEA(144μmol)在DMF溶液中用微波輻照反應(yīng)10分鐘進(jìn)行。添加HBTU(58μmol)和HOBt(58μmol)且混合物用微波輻照反應(yīng)10分鐘。混合物在室溫用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液處理1分鐘以乙?；捶磻?yīng)的氨基基團(tuán)。接著，通過微波輻照(40W,2,450MHz,50℃),進(jìn)行20％哌啶/DMF處理3分鐘以去除Fmoc基團(tuán)保護(hù)。在糖肽合成中,(1)用不同F(xiàn)moc氨基酸延伸，(2)乙?；幚?，和(3)Fmoc去除的三個步驟順序地重復(fù)進(jìn)行。所獲得的固相樹脂用三氟乙酸:水(95:5,v/v)處理2小時。過濾反應(yīng)溶液，加入乙醚誘導(dǎo)沉淀，獲得粗結(jié)晶。粗產(chǎn)物溶解于甲醇，加入1N氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)為pH12.0-12.5，且處理在室溫進(jìn)行1小時。向其添加10％乙酸將溶液調(diào)節(jié)至pH7附近，之后蒸餾掉溶劑。獲得的殘余物通過反相高效液相色譜法純化，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物3(22.0mg,產(chǎn)率17％)。

合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(唾液酸-T)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH₂(化合物4)

將化合物3(10mM,300μL,水)與通過混合1,000mM HEPES緩沖液(pH 7.3,30μL),1,000mM HEPES緩沖液(pH 7.0,30μL),1,000mM MnCl₂(6μL),150mM CMP-NeuAc(60μL),1.4U/mLα2,3-(O)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶,大鼠,重組,草地夜蛾(30μL,Calbiochem),和水(74μL)獲得的反應(yīng)溶液混合?；旌衔镌?5℃孵育24小時，之后通過反向高效液相色譜法純化反應(yīng)液，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物4(5.5mg,60％產(chǎn)率)。

合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH₂(化合物5)

使用Rink Amide-ChemMatrix樹脂(0.45mmol/g,100mg,45μmol,Biotage的產(chǎn)品)形式的固相支持物合成肽固相。氨基酸延伸反應(yīng)在微波輻照條件(40W,2,450MHz,50℃)通過將Fmoc氨基酸衍生物(180μmol),HBTU(180μmol),HOBt(180μmol)和DIEA(270μmol)在DMF溶液中反應(yīng)6分鐘進(jìn)行。混合物在室溫用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液處理1分鐘以乙?；捶磻?yīng)的氨基基團(tuán)。接著，通過微波輻照(40W,2,450MHz,50℃),進(jìn)行20％哌啶/DMF處理3分鐘以去除Fmoc基團(tuán)保護(hù)。在糖肽合成中,(1)用不同F(xiàn)moc氨基酸延伸，(2)乙?；幚?，和(3)Fmoc去除的三個步驟順序地重復(fù)進(jìn)行。所獲得的固相樹脂用三氟乙酸:水(95:2.5,v/v)處理2小時。過濾反應(yīng)溶液，加入乙醚誘導(dǎo)沉淀，獲得粗結(jié)晶。粗產(chǎn)物通過反相高效液相色譜法純化，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物5(45.8mg,產(chǎn)率45％)。

合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH₂(化合物6)

使用Rink Amide-ChemMatrix樹脂(0.45mmol/g,100mg,45μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反應(yīng)在微波輻照條件(40W,2,450MHz,50℃)通過將Fmoc氨基酸衍生物(180μmol),HBTU(180μmol),HOBt(180μmol)和DIEA(270μmol)在DMF溶液中反應(yīng)6分鐘進(jìn)行。糖鏈取代氨基酸延伸反應(yīng)通過使Fmoc-Thr(Ac₃Ga1Nacα(1→O))(54μmol),HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)以及DIEA(135μmol)在DMF溶液中用微波輻照反應(yīng)10分鐘進(jìn)行。添加HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)且混合物用微波輻照反應(yīng)10分鐘。混合物在室溫用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液處理1分鐘以乙?；捶磻?yīng)的氨基基團(tuán)。接著，通過微波輻照(40W,2,450MHz,50℃),進(jìn)行20％哌啶/DMF處理3分鐘以去除Fmoc基團(tuán)保護(hù)。在糖肽合成中,(1)用不同F(xiàn)moc氨基酸延伸，(2)乙酰化處理，和(3)Fmoc去除的三個步驟順序地重復(fù)進(jìn)行。所獲得的固相樹脂用三氟乙酸:水(95:2.5,v/v)處理2小時。過濾反應(yīng)溶液，加入乙醚誘導(dǎo)沉淀，獲得粗結(jié)晶。粗產(chǎn)物溶解于甲醇，加入1N氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)為pH12.0-12.5，且處理在室溫進(jìn)行1小時。向其添加10％乙酸將溶液調(diào)節(jié)至pH7附近，之后蒸餾掉溶劑。獲得的殘余物通過反相高效液相色譜法純化，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物6(43.2mg,產(chǎn)率39％)。

合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser(Tn)-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH₂(化合物7)

使用Rink Amide-ChemMatrix樹脂(0.45mmol/g,100mg,45μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反應(yīng)在微波輻照條件(40W,2,450MHz,50℃)通過將Fmoc氨基酸衍生物(180μmol),HBTU(180μmol),HOBt(180μmol)和DIEA(270μmol)在DMF溶液中反應(yīng)6分鐘進(jìn)行。糖鏈取代氨基酸延伸反應(yīng)通過使Fmoc-Ser(Ac₃GalNacα(1→O))(54μmol),HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)以及DIEA(135μmol)在DMF溶液中用微波輻照反應(yīng)10分鐘進(jìn)行。添加HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)且混合物用微波輻照反應(yīng)10分鐘?；旌衔镌谑覝赜靡宜狒?DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液處理1分鐘以乙酰化未反應(yīng)的氨基基團(tuán)。接著，通過微波輻照(40W,2,450MHz,50℃),進(jìn)行20％哌啶/DMF處理3分鐘以去除Fmoc基團(tuán)保護(hù)。在糖肽合成中,(1)用不同F(xiàn)moc氨基酸延伸，(2)乙?；幚?，和(3)Fmoc去除的三個步驟順序地重復(fù)進(jìn)行。所獲得的固相樹脂用三氟乙酸:水(95:2.5,v/v)處理2小時。過濾反應(yīng)溶液，加入乙醚誘導(dǎo)沉淀，獲得粗結(jié)晶。粗產(chǎn)物溶解于甲醇，加入1N氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)為pH12.0-12.5，且處理在室溫進(jìn)行1小時。向其添加10％乙酸將溶液調(diào)節(jié)至pH7附近，之后蒸餾掉溶劑。獲得的殘余物通過反相高效液相色譜法純化，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物7(21.1mg,產(chǎn)率19％)。

合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr(Tn)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH₂(化合物8)

使用Rink Amide-ChemMatrix樹脂(0.45mmol/g,100mg,45μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反應(yīng)在微波輻照條件(40W,2,450MHz,50℃)通過將Fmoc氨基酸衍生物(180μmol),HBTU(180μmol),HOBt(180μmol)和DIEA(270μmol)在DMF溶液中反應(yīng)6分鐘進(jìn)行。糖鏈取代氨基酸延伸反應(yīng)通過使Fmoc-Thr(Ac₃Ga1Nacα(1→O))(54μmol),HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)以及DIEA(135μmol)在DMF溶液中用微波輻照反應(yīng)10分鐘進(jìn)行。添加HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)且混合物用微波輻照反應(yīng)10分鐘。混合物在室溫用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液處理1分鐘以乙?；捶磻?yīng)的氨基基團(tuán)。接著，通過微波輻照(40W,2,450MHz,50℃),進(jìn)行20％哌啶/DMF處理3分鐘以去除Fmoc基團(tuán)保護(hù)。在糖肽合成中,(1)用不同F(xiàn)moc氨基酸延伸，(2)乙?；幚?，和(3)Fmoc去除的三個步驟順序地重復(fù)進(jìn)行。所獲得的固相樹脂用三氟乙酸:水(95:2.5,v/v)處理2小時。過濾反應(yīng)溶液，加入乙醚誘導(dǎo)沉淀，獲得粗結(jié)晶。粗產(chǎn)物溶解于甲醇，加入1N氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)為pH12.0-12.5，且處理在室溫進(jìn)行1小時。向其添加10％乙酸將溶液調(diào)節(jié)至pH7附近，之后蒸餾掉溶劑。獲得的殘余物通過反相高效液相色譜法純化，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物8(48.2mg,產(chǎn)率43％)。

合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr(Tn)-Ser(Tn)-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser(Tn)-Thr(Tn)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH₂(化合物9)

使用Rink Amide-ChemMatrix樹脂(0.45mmol/g,100mg,45μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反應(yīng)在微波輻照條件(40W,2,450MHz,50℃)通過將Fmoc氨基酸衍生物(180μmol),HBTU(180μmol),HOBt(180μmol)和DIEA(270μmol)在DMF溶液中反應(yīng)6分鐘進(jìn)行。糖鏈取代氨基酸延伸反應(yīng)通過使Fmoc-Thr(Ac₃GalNacα(1→O)或Fmoc-Ser(Ac₃GalNacα(1→O)(54μmol),HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)以及DIEA(135μmol)在DMF溶液中用微波輻照反應(yīng)10分鐘進(jìn)行。添加HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)且混合物用微波輻照反應(yīng)10分鐘。混合物在室溫用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液處理1分鐘以乙?；捶磻?yīng)的氨基基團(tuán)。接著，通過微波輻照(40W,2,450MHz,50℃),進(jìn)行20％哌啶/DMF處理3分鐘以去除Fmoc基團(tuán)保護(hù)。在糖肽合成中,(1)用不同F(xiàn)moc氨基酸延伸，(2)乙?；幚?，和(3)Fmoc去除的三個步驟順序地重復(fù)進(jìn)行。所獲得的固相樹脂用三氟乙酸:水(95:2.5,v/v)處理2小時。過濾反應(yīng)溶液，加入乙醚誘導(dǎo)沉淀，獲得粗結(jié)晶。粗產(chǎn)物溶解于甲醇，加入1N氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)為pH12.0-12.5，且處理在室溫進(jìn)行1小時。向其添加10％乙酸將溶液調(diào)節(jié)至pH7附近，之后蒸餾掉溶劑。獲得的殘余物通過反相高效液相色譜法純化，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物9(37.8mg,產(chǎn)率25％)。

合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(T)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala--Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH₂(化合物10)

使用Rink Amide-ChemMatrix樹脂(0.90mmol/g,200mg,90μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反應(yīng)在微波輻照條件(40W,2,450MHz,50℃)通過將Fmoc氨基酸衍生物(360μmol),HBTU(360μmol),HOBt(360μmol)和DIEA(540μmol)在DMF溶液中反應(yīng)6分鐘進(jìn)行。糖鏈取代氨基酸延伸反應(yīng)通過使Fmoc-Thr(Ac₃Ga1Nacβ(1→3)Ac₂Ga1Nacα(1→O))(108μmol),HBTU(108μmol)和HOBt(108μmol)以及DIEA(270μmol)在DMF溶液中用微波輻照反應(yīng)10分鐘進(jìn)行。添加HBTU(108μmol)和HOBt(108μmol)且混合物用微波輻照反應(yīng)10分鐘?；旌衔镌谑覝赜靡宜狒?DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液處理1分鐘以乙?；捶磻?yīng)的氨基基團(tuán)。接著，通過微波輻照(40W,2,450MHz,50℃),進(jìn)行20％哌啶/DMF處理3分鐘以去除Fmoc基團(tuán)保護(hù)。在糖肽合成中,(1)用不同F(xiàn)moc氨基酸延伸，(2)乙?；幚?，和(3)Fmoc去除的三個步驟順序地重復(fù)進(jìn)行。所獲得的固相樹脂用三氟乙酸:水(95:2.5,v/v)處理2小時。過濾反應(yīng)溶液，加入乙醚誘導(dǎo)沉淀，獲得粗結(jié)晶。粗產(chǎn)物溶解于甲醇，加入1N氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)為pH12.0-12.5，且處理在室溫進(jìn)行1小時。向其添加10％乙酸將溶液調(diào)節(jié)至pH7附近，之后蒸餾掉溶劑。獲得的殘余物通過反相高效液相色譜法純化，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物10(110mg,產(chǎn)率46％)。

合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(唾液酸-T)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH₂(化合物11)

將化合物8(10mM,496μL,水)與通過混合1,000mM HEPES緩沖液(pH 7.0,30μL),1,000mM MnCl₂(8μL),200mM CMP-NeuAc(95μL),1.4U/mLα2,3-(O)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶,大鼠,重組,草地夜蛾(28μL,Calbiochem),和水(212μL)獲得的反應(yīng)溶液混合?；旌衔镌?5℃孵育24小時，之后通過反向高效液相色譜法純化反應(yīng)液，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物11(14mg,96％產(chǎn)率)。

合成5-氧代己酰-Pro-Pro-Thr-Thr-Thr-Pro-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Thr-Thr-Thr-Leu-Pro-Pro-Thr-NH₂(化合物12)

使用Rink Amide-ChemMatrix樹脂(0.48mmol/g,25mg,12μmol)形式的固相支持物合成肽固相。氨基酸延伸反應(yīng)在微波輻照條件(40W,2,450MHz,50℃)通過將Fmoc氨基酸衍生物(48μmol),HBTU(48μmol),HOBt(48μmol)和DIEA(72μmol)在DMF溶液中反應(yīng)9分鐘進(jìn)行?；旌衔镌谑覝赜靡宜狒?DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液處理1分鐘以乙?；捶磻?yīng)的氨基基團(tuán)。接著，通過微波輻照(40W,2,450MHz,50℃),進(jìn)行20％哌啶/DMF處理3分鐘以去除Fmoc基團(tuán)保護(hù)。在糖肽合成中,(1)用不同F(xiàn)moc氨基酸延伸，(2)乙酰化處理，和(3)Fmoc去除的三個步驟順序地重復(fù)進(jìn)行。所獲得的固相樹脂用三氟乙酸:水:三異丙基硅烷(95:2.5:2.5,v/v/v)處理1小時。過濾反應(yīng)溶液，加入乙醚誘導(dǎo)沉淀，獲得粗結(jié)晶。粗產(chǎn)物溶解于甲醇，加入1N氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)為pH12.0-12.5，且處理在室溫進(jìn)行1小時。向其添加10％乙酸將溶液調(diào)節(jié)至pH7附近，之后蒸餾掉溶劑。獲得的殘余物通過反相高效液相色譜法純化，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物12(7.2mg,產(chǎn)率30％)。

合成5-氧代己酰-Pro-Pro-Thr-Thr(Tn)-Thr(Tn)-Pro-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Thr-Thr(Tn)-Thr(Tn)-Leu-Pro-Pro-Thr-NH₂(化合物13)

使用Rink Amide-ChemMatrix樹脂(0.48mmol/g,25mg,12μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反應(yīng)在微波輻照條件(40W,2,450MHz,50℃)通過將Fmoc氨基酸衍生物(48μmol),HBTU(48μmol),HOBt(48μmol)和DIEA(72μmol)在DMF溶液中反應(yīng)9分鐘進(jìn)行。糖鏈取代氨基酸延伸反應(yīng)通過使Fmoc-Thr(Ac₃Ga1Nacα(1→O))(14μmol),PyBOP(14μmol)和HOBt(14μmol)以及DIEA(36μmol)在DMF溶液中用微波輻照反應(yīng)10分鐘進(jìn)行。添加PyBOP(14μmol)和HOBt(14μmol)且混合物用微波輻照反應(yīng)10分鐘?；旌衔镌谑覝赜靡宜狒?DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液處理1分鐘以乙酰化未反應(yīng)的氨基基團(tuán)。接著，通過微波輻照(40W,2,450MHz,50℃),進(jìn)行20％哌啶/DMF處理3分鐘以去除Fmoc基團(tuán)保護(hù)。在糖肽合成中,(1)用不同F(xiàn)moc氨基酸延伸，(2)乙?；幚恚?3)Fmoc去除的三個步驟順序地重復(fù)進(jìn)行。所獲得的固相樹脂用三氟乙酸:水:三異丙基硅烷(95:2.5:2.5,v/v/v)處理2小時。過濾反應(yīng)溶液，加入乙醚誘導(dǎo)沉淀，獲得粗結(jié)晶。粗產(chǎn)物溶解于甲醇，加入1N氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)為pH12.0-12.5，且處理在室溫進(jìn)行1小時。向其添加10％乙酸將溶液調(diào)節(jié)至pH7附近，之后蒸餾掉溶劑。獲得的殘余物通過反相高效液相色譜法純化，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物13(4.7mg,產(chǎn)率14％)。

合成5-氧代己酰-Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser-Cys-NH₂(化合物14)

使用TentaGel S RAM樹脂(0.24mmol/g,200mg,48μmol,獲得自Rapp Polymere,GmbH)形式的固相支持物合成肽固相。氨基酸延伸反應(yīng)在微波輻照條件(40W,2,450MHz,50℃)通過將Fmoc氨基酸衍生物(192μmol),HBTU(192μmol),HOBt(192μmol)和DIEA(288μmol)在DMF溶液中反應(yīng)6分鐘進(jìn)行。添加HBTU(58μmol)和HOBt(58μmol)且混合物用微波輻照反應(yīng)10分鐘。混合物在室溫用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液處理1分鐘以乙?；捶磻?yīng)的氨基基團(tuán)。接著，通過微波輻照(40W,2,450MHz,50℃),進(jìn)行20％哌啶/DMF處理3分鐘以去除Fmoc基團(tuán)保護(hù)。在糖肽合成中,(1)用不同F(xiàn)moc氨基酸延伸，(2)乙?；幚恚?3)Fmoc去除的三個步驟順序地重復(fù)進(jìn)行。所獲得的固相樹脂用三氟乙酸:水(95:5,v/v)處理2小時。過濾反應(yīng)溶液，加入乙醚誘導(dǎo)沉淀，獲得粗結(jié)晶。粗產(chǎn)物通過反相高效液相色譜法純化，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物14(9.0mg,產(chǎn)率11％)。

合成5-氧代己酰-Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr(Tn)-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser-Cys-NH₂(化合物15)

使用TentaGel S RAM樹脂(0.24mmol/g,200mg,48μmol,獲得自Rapp Polymere,GmbH)形式的固相支持物合成肽固相。氨基酸延伸反應(yīng)在微波輻照條件(40W,2,450MHz,50℃)通過將Fmoc氨基酸衍生物(192μmol),HBTU(192μmol),HOBt(192μmol)和DIEA(288μmol)在DMF溶液中反應(yīng)6分鐘進(jìn)行?；旌衔镌谑覝赜靡宜狒?DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液處理1分鐘以乙?；捶磻?yīng)的氨基基團(tuán)。糖鏈取代氨基酸延伸反應(yīng)通過使Fmoc-Thr(Ac3Ga1Nacα(1→O))(58μmol),HBTU(58μmol)和HOBt(58μmol)以及DIEA(108μmol)在DMF溶液中用微波輻照反應(yīng)10分鐘進(jìn)行。添加HBTU(58μmol)和HOBt(58μmol)且混合物用微波輻照反應(yīng)10分鐘?；旌衔镌谑覝赜靡宜狒?DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液處理1分鐘以乙?；捶磻?yīng)的氨基基團(tuán)。接著，通過微波輻照(40W,2,450MHz,50℃),進(jìn)行20％哌啶/DMF處理3分鐘以去除Fmoc基團(tuán)保護(hù)。在糖肽合成中,(1)用不同F(xiàn)moc氨基酸延伸，(2)乙?；幚恚?3)Fmoc去除的三個步驟順序地重復(fù)進(jìn)行。所獲得的固相樹脂用三氟乙酸:水(95:5,v/v)處理2小時。過濾反應(yīng)溶液，加入乙醚誘導(dǎo)沉淀，獲得粗結(jié)晶。粗產(chǎn)物溶解于甲醇，加入1N氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)為pH12.0-12.5，且處理在室溫進(jìn)行1小時。向其添加10％乙酸將溶液調(diào)節(jié)至pH7附近，之后蒸餾掉溶劑。獲得的殘余物通過反相高效液相色譜法純化，產(chǎn)生凍干粉末形式的化合物15(13.0mg,產(chǎn)率14％)。

化合物1至15的鑒定數(shù)據(jù)總結(jié):

衍生自MUC1的糖肽的MALDI-TOFMS譜：圖1

(a)化合物1,m/z calcd for C100H160N30O34S[M+H]+2358.151,found 2358.383；

(b)化合物2,m/z calcd for C108H173N31O39S[M+H]+2561.231,found 2561.457；

(c)化合物3,m/z calcd for C114H183N31O44S[M+H]+2723.283,found 2723.504；

(d)化合物4,mlz calcd for C125H200N32O52S[M+H]+3014.379,found 3014.640

(e)化合物5,m/z calcd for C97H156N29O33[M+H]+2255.142,found 2254.927；

(f)化合物6,m/z calcd for C105H169N30O38[M+H]+2458.221,found 2457.954；

(g)化合物7,mlz calcd for C105H169N30O38[M+H]+2458.221,found 2458.077；

(h)化合物8,m/z calcd for C105H169N30O38[M+H]+2458.221,found 2458.159

(i)化合物9,m/z calcd for C137H221N34O58[M+H]+3270.538,found 3270.308

(j)化合物10,m/z calcd for C111H179N30O43[M+H]+2620.274,found 2620.049；

(k)化合物11,m/z calcd for C122H196N31O51[M+H]+2911.369,found 2911.207；

衍生自MUC2的糖肽的MALDI-TOFMS譜：圖2

(l)化合物12,m/z calcd for C₉₀H₁₄₄N₂₀O₃₁[M+Na]+2024.020,found 2024.111；

(m)化合物13,m/z calcd for C₁₂₂H₁₉₆N₂₄O₅₁[M+Na]+2836.338,found 2836.501；

衍生自MUC4的糖肽的MALDI-TOFMS譜：圖3

(n)化合物14,m/z calcd for C73H181N20O28S[M+Na]+1777.804,found 1777.910；

(o)化合物15,m/z calcd for C81H131N21O33S[M+Na]+1980.884,found 1981.045。

實施例1

采用Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr作為抗原制備單克隆抗體

通過向Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr的C端添加載體蛋白結(jié)合所需的Cys獲得化合物Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr Cys-NH2(85μg)與鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)綴合并施用至BDF(注冊商標(biāo))-1小鼠的尾巴基部以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。17個小時后采用相同方法用化合物3進(jìn)行額外的免疫。3天后收集血液并收集髂淋巴結(jié)。所收集的細(xì)胞和骨髓瘤SP2細(xì)胞融合。雜交瘤在HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并選擇產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。接著，雜交瘤培養(yǎng)上清液接種至ELISA板并在結(jié)合反應(yīng)中用化合物2篩選。

融合細(xì)胞克隆通過有限稀釋法進(jìn)行。分別建立了產(chǎn)生靶單克隆抗體SN-102的雜交瘤株3A9-4B1(NPMD,保藏號NITE BP-01845)，產(chǎn)生靶單克隆抗體SN-102的3C10-E11。

實施例2培養(yǎng)產(chǎn)生單克隆抗體(SN-101和SN-102)的細(xì)胞株并獲得純化的抗體

培養(yǎng)方法：產(chǎn)生SN-101的雜交瘤株NITE BP-01845生長于含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基。將22mL量的無血清培養(yǎng)基Panserin H4000(PAN-Biotech)添加至8.1x10⁶回收的細(xì)胞以獲得上清液。培養(yǎng)細(xì)胞使他們馴化于培養(yǎng)基。馴化的細(xì)胞在相同培養(yǎng)基中生長至1.0x10⁸并繼代培養(yǎng)至5.0x10⁵/mL。然后靜止培養(yǎng)2周,在該點通過離心去除培養(yǎng)物上清液.另一雜交瘤株3C10-E11通過相同辦法培養(yǎng)以獲得培養(yǎng)物上清液。

純化方法：通過如下給出的方法從經(jīng)培養(yǎng)的雜交瘤株NITE BP-01845純化SN-101。使200mL量的培養(yǎng)物上清液通過0.45μm濾器以獲得純化的抗體材料?；蛘?，將硫酸銨添加至培養(yǎng)物上清液實現(xiàn)50％飽和，并10,000g離心20分鐘以收集沉淀物。其溶解于10mL的PBS中，透析溶液獲得純化的材料，并采用HiTrap Protein G HP柱(GE Healthcare)進(jìn)行親和色譜。連接于AKTA Explorer 100(GE Healthcare)后的HiTrap Protein G HP柱用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡，添加培養(yǎng)物上清液。沒有結(jié)合至柱的不需要的組分用相同緩沖液洗掉，之后用小量的0.1M甘氨酸-HCl緩沖液(pH2.5)洗脫并通過添加小量1M tris-HCl緩沖液(pH9.0)中和。將通過柱的級分重復(fù)添加至柱以增加抗體的收集率。到該點的操作產(chǎn)生2.3mg的SN-101。從200ml的3C10-E11的培養(yǎng)物上清液中，通過相同方法產(chǎn)生8.3mg的SN-102。

實施例3抗體的反應(yīng)特異性評估

制備固定化糖肽的陣列

用于固定化糖鏈陣列的底材(Sumitomo Bakelite制造)用2M HCl在37℃處理2小時,去除t-叔丁氧羰基基團(tuán)(Boc基團(tuán))保護(hù)。產(chǎn)物用水洗滌兩次，然后干燥以將氨氧基(aminoxy)置于所述底材的表面上。將點樣溶液(25mM AcOH/吡啶,0.005％Triton X-100,pH 5.4)添加至表1所示的不同合成糖肽以將它們?nèi)芙狻｜c樣器(BioChip Arrayer,Cartesian制造)采用點樣針(CMP,針直徑0.4mm,Arraylt Corp.)來對底材點樣。反應(yīng)在80℃進(jìn)行1小時以將糖肽固定化在所述底材上。用水進(jìn)行一次洗滌，產(chǎn)物浸沒于10mg/mL的琥珀酸酐中，在室溫進(jìn)行反應(yīng)3小時，未反應(yīng)的氨氧基得到保護(hù)。用水進(jìn)行兩次洗滌并干燥產(chǎn)物。

反應(yīng)上清液用如下給出的反應(yīng)溶液稀釋10-倍。將Hybricover(Sumitomo Bakelite制備)置于固定化的糖肽陣列上，鋪開70μL的所述稀釋的溶液，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行2小時。去除Hybricover并用清潔溶液和水各洗滌一次底材以使其清潔。干燥所述底材，放置Hybricover，并將在如下溶液中制備為1μg/mL的Anti-IgG(H+L),小鼠,山羊-多抗,和Cy3(Rockland Immunochemicals)接種在所述底材上。這些在室溫反應(yīng)1小時。在反應(yīng)后，用清潔溶液洗滌產(chǎn)物。用掃描儀(Typhoon TRIO+,GE Healthcare)測量Cy3的熒光強度。用Array VisionTM軟件(GE Healthcare)創(chuàng)建熒光響應(yīng)數(shù)字圖像。結(jié)果在圖4給出。

反應(yīng)溶液：50mM Tris·HCl(pH 7.4),100mM NaCl,1mM CaCl₂,MnCl₂,MgCl₂,0.05％Tween 20

清潔溶液：50mM Tris·HCl(pH 7.4),100mM NaCl,1mM CaCl₂,MnCl₂,MgCl₂,0.05％Triton X-100

表1.

[表1]用作免疫原的MUC1衍生糖肽及其類似物的序列數(shù)據(jù)(結(jié)合交聯(lián)酮和Cys的序列)

化合物1-4：SEQ ID NO:3

化合物5-11：SEQ ID NO:1

化合物12和13：SEQ ID NO:4

化合物14和15：SEQ ID NO:5

抗體SN-101和SN-102的表征

抗體SN-101和SN-102分別識別如下MUC1的糖鏈Tn結(jié)構(gòu)和修飾的位置：

SN-101

i)結(jié)合MUC1衍生糖肽Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys；

Ii)不結(jié)合其中MUC1衍生糖肽的Tn糖鏈已經(jīng)被T或STn取代的糖肽；

iii)不結(jié)合包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的肽(裸肽)；和

iv)不結(jié)合具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的MUC2的串聯(lián)單元肽或具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的MUC4的串聯(lián)單元肽中Tn被修飾的糖肽。

SN-102

i)結(jié)合糖肽Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr，其中Tn糖鏈鍵接至具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽的第8位蘇氨酸；

ii)不結(jié)合或僅僅弱結(jié)合其中MUC1衍生糖肽的Tn糖鏈已經(jīng)被T或STn取代的糖肽；

iii)不結(jié)合包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽(裸肽)；

Iv)不結(jié)合這樣的糖肽，其中Tn在具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽的第14位絲氨酸或第15位蘇氨酸處修飾；

V)結(jié)合這樣的糖肽，其中Tn糖鏈在具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽的全部蘇氨酸和絲氨酸處修飾；和

iv)不結(jié)合MUC2的串聯(lián)單元肽或MUC4的串聯(lián)單元肽中Tn被修飾的糖肽。

實施例4在患者血清中檢測MUC1糖肽

檢查是否使用抗體SN-101會在乳腺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌樣本血清中檢測出抗原肽。樣本數(shù)目是來自清楚地臨床診斷為所述疾病的患者的5-10個血清樣品且若干正常血清樣品作為陰性對照。在正常血清中沒有檢測出抗原糖肽，而在患者血清樣品檢測出抗原糖肽。

實施例5通過抗體SN-101和SN-102對表達(dá)MUC1的細(xì)胞的免疫熒光染色

乳腺癌株OCUB-M在含10％FBS的DMEM中在37℃下5％CO₂中培養(yǎng)過夜。吸掉培養(yǎng)基。細(xì)胞層用PBS洗滌并用含4％多聚甲醛的PBS固定10分鐘。然后，在含0.1％Triton XTM-100的PBS中進(jìn)行浸沒處理，隨后用封閉緩沖液(含1％BSA的PBS)封閉20分鐘。用封閉緩沖液稀釋的抗體SN-101或SN-102的10μg/mL溶液然后反應(yīng)1小時。通過反應(yīng)封閉溶液而不是一抗來制備負(fù)對照。去除抗體溶液，用PBS洗滌，然后和2μg/mL Alexa555-標(biāo)記的抗-小鼠IgG抗體反應(yīng)。產(chǎn)物用PBS洗滌，封裝，然后用用BZ-9000(KEYENCE)一體化熒光顯微鏡觀察，產(chǎn)生特異性染色圖像(見圖5)。

實施例6細(xì)胞增殖阻斷測試

DMEM(10％FBS)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞OCUB-M接種于96孔板，每孔3x10³細(xì)胞。細(xì)胞在5％CO₂大氣中37℃培養(yǎng)48小時，然后添加抗體SN-101至終濃度0.565mg/ml或1.3mg/mL。細(xì)胞在5％CO₂大氣中37℃培養(yǎng)48小時，此時加入20μL每孔的Cell Titer 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)試劑。細(xì)胞在37℃在5％CO₂大氣中孵育2小時。在490nm吸光度的測量顯示，相對于對照，細(xì)胞數(shù)目以濃度依賴性方式降低(見圖6)。

實施例7測試阻斷半乳凝素3的結(jié)合

將懸浮于RPMI-1640(10％FBS)的4.8xl0³乳腺癌細(xì)胞MCF-7添加至8孔腔室載玻片的各孔，細(xì)胞在5％CO2大氣在37℃培養(yǎng)16小時。吸掉培養(yǎng)基并添加PBS中4％甲醛以浸沒所述細(xì)胞于大約2mm。細(xì)胞被固定15分鐘。吸掉固定溶液，用PBS洗滌孔3次，每次5分鐘。封閉用封閉緩沖液(含5％BSA的PBS)進(jìn)行1小時。吸掉封閉溶液。制備單獨抗體以及不同濃度的抗體和半乳凝素3的混合物。這些在4℃孵育2小時。吸掉抗體，之后用PBS洗滌孔3次，每次5分鐘。添加Cy5標(biāo)記的抗-小鼠IgG抗體，混合物在室溫于暗室中孵育1小時。吸掉二抗，之后用PBS洗滌孔3次，每次5分鐘。BZ-9000(KEYENCE)一體化熒光顯微鏡的觀察顯示半乳凝素3和MUC1結(jié)合的阻斷依賴于抗體濃度。

工業(yè)實用性

本發(fā)明提供了抗體，其以極其高的特異性識別人MUC1的串聯(lián)單元肽已經(jīng)用O-鍵-類型糖鏈Tn修飾的糖肽。本發(fā)明的抗MUC抗體的使用允許以高靈敏度、可靠地以及便利地以特異于Tn修飾的糖肽中的表位的方式檢測MUC1的存在，以及允許測定惡性腫瘤為MUC1相關(guān)疾病，且因此被認(rèn)為在醫(yī)療診斷領(lǐng)域中有用。本發(fā)明的抗MUC1抗體還影響MUC1相關(guān)癌癥細(xì)胞的功能，并因此被認(rèn)為在癌癥治療等領(lǐng)域有用。

[序列表]

SEQ ID NO:1:人MUC1的串聯(lián)單元肽的氨基酸序列

SEQ ID NO:2:人MUC1的串聯(lián)單元肽突變體的氨基酸序列

SEQ ID NO:3:cys添加至C端的人MUC1的串聯(lián)單元肽的氨基酸序列

SEQ ID NO:4:人MUC2的串聯(lián)單元肽的氨基酸序列

SEQ ID NO:5:人MUC4的串聯(lián)單元肽的氨基酸序列

SEQ ID NO:6:SN101H的氨基酸序列

SEQ ID NO:7:SN101L的氨基酸序列

SEQ ID NO:8:SN101H的CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO:9:SN101H的CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO:10:SN101H的CDR3的氨基酸序列

SEQ ID NO:11:SN101L的CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO:12:SN101L的CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO:13:SN101L的CDR3的氨基酸序列

SEQ ID NO:14:SN1021H的氨基酸序列

SEQ ID NO:15:SN102L的氨基酸序列

SEQ ID NO:16:SN102H的CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO:17:SN102H的CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO:18:SN102H的CDR3的氨基酸序列

SEQ ID NO:19:SN102L的CDR1的氨基酸序列

SEQ ID NO:20:SN102L的CDR2的氨基酸序列

SEQ ID NO:21:SN102L的CDR3的氨基酸序列

序列表

<110> 醫(yī)化學(xué)創(chuàng)藥株式會社

<120> 抗MUC1抗體或其抗原結(jié)合片段及其用途

<130> 151297H

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 1

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

1 5 10 15

Pro Pro Ala His Gly Val Thr

20

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 2

Gly Val Thr Ser Ala Pro Glu Ser Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

1 5 10 15

Pro Pro Ala His Gly Val Thr

20

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 3

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

1 5 10 15

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Cys

20

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 4

Pro Pro Thr Thr Thr Pro Ser Pro Pro Pro Thr Ser Thr Thr Thr Leu

1 5 10 15

Pro Pro Thr

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 5

Ser Ala Ser Thr Gly His Ala Thr Pro Leu Pro Val Thr Asp Thr Ser

1 5 10 15

Cys

<210> 6

<211> 135

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 6

Met Asp Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ile Ile Val Leu Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Ser Glu Val Asn Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His

65 70 75 80

Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser

85 90 95

Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Gly Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

115 120 125

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 7

<211> 132

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 7

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

35 40 45

Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys

100 105 110

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys

130

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 8

Asn Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 9

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 9

Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 10

Gly Val Phe Asp Tyr

1 5

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 11

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 12

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 13

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Trp Thr

1 5 10

<210> 14

<211> 139

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 14

Met Lys Cys Ser Trp Ile Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

1 5 10 15

Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile

35 40 45

Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala

65 70 75 80

Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ile Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Val His Phe Tyr Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Arg Gly Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 15

<211> 131

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 15

Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys

130

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 16

Asp Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 17

Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 18

Phe Tyr Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Arg Gly Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 19

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 20

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapience

<400> 21

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Thr

1 5