本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其是用轉基因微生物特別是大腸桿菌(E.coli)，用蔗糖作為其專用碳源的重組寡糖、特別是人乳寡糖(HMO)的微生物制備。

背景技術：

近來，使用重組微生物的異種(foreign)或外源寡糖的發(fā)酵合成在商業(yè)和工業(yè)上已經(jīng)變得備受關注。在這種合成中，目的寡糖將通過由微生物的一種或多種異源糖基轉移酶介導的糖受體的酶促糖基化來合成，并且糖基化所需的一種或多種活化的糖核苷酸將由相同的微生物通過過表達一種或多種編碼內源活化的糖核苷酸產生酶的基因來制備。這種合成的代謝路徑需要碳源，其主要為簡單的碳結構單元，通常為甘油或葡萄糖(參見，例如，WO01/04341，Priem等人的Glycobiology12,235(2002)，F(xiàn)ort等人的Chem.Comm.2558(2005)，Drouillard等人的Angew.Chem.Int.Ed.45,1778(2006)，WO2010/070104，WO2012/112777，WO2013/182206，WO2014/048439)。在一些合成中，如果乳糖也用作受體，則其可以是碳源(Lee等人的Microb.Cell Fact.11：48(2012))。由于微生物已經(jīng)經(jīng)過基因操作，抗生素抗性選擇標記基因已經(jīng)采用，以將轉化的微生物與接種物和發(fā)酵液中未轉化的微生物分開。然而，通過將編碼參與供體糖的重新(de novo)生物合成的酶的基因整合進微生物的染色體中，已經(jīng)避免了抗生素的使用(等人的Microb.Cell Fact.12：40(2013))。

大約50％的野生型大腸桿菌能夠采用蔗糖作為碳源和能量來源，但是它們中的大多數(shù)是致病的。在工業(yè)中合成化學物質主要使用的大腸桿菌菌株無法在蔗糖上存活和生長(Bruschi等人，Biotechnol.Adv.30，1001(2012))。然而，在某些情況下，蔗糖可以是更廉價的碳源和能量來源。出于這個原因，已經(jīng)在嘗試開發(fā)能夠在蔗糖上存活并生長的大腸桿菌的suc⁺菌株(例如，Sabri等人的Appl.Environ.Microbiol 79，478(2013))并且通過它們來制備工業(yè)上可獲利的產品，比如氨基酸、生物燃料、類胡蘿卜素等(例如，EP-A-1149911，EP-A-2239336，EP-A-2371952，EP-A-2405006，WO2010/051849，WO2012/078311，Kim等人的Biores.Technol.130，288(2013))進行了嘗試。然而，這些suc⁺轉化株通常沒有suc^—菌株多產(Khamduang等人的J.Ind.Microbiol.Biotechnol.36，1267(2009))。

WO2012/007481描述了表達蔗糖磷酸化酶或蔗糖轉化酶與果糖激酶聯(lián)合的大腸桿菌轉化株。從而，微生物能夠采用蔗糖作為其主要碳源產生2’-巖藻糖基乳糖。而且，WO2014/067696描述了包含能夠使其在蔗糖上生長并產生巖藻糖的csc基因簇的大腸桿菌轉化株。

然而，一直需要使用能夠采用更有效的蔗糖作為碳源和能量來源的轉化微生物，用于制造重組寡糖、特別是HMO的替代方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一方面涉及通過使碳水化合物受體糖基化來制備重組寡糖、優(yōu)選3～8個單糖單元的重組寡糖、更優(yōu)選3～5個單糖單元的重組寡糖、特別是HMO的方法，所述碳水化合物受體優(yōu)選為乳糖，并且不是蔗糖，所述方法包括以下步驟：

a)提供一種細胞，優(yōu)選為大腸桿菌細胞，其能夠使所述受體內化至所述細胞，并且其包含

-編碼糖基轉移酶的重組基因，所述糖基轉移酶能夠使活化的糖核苷酸的糖殘基轉移至在所述細胞中內化的受體，和

-在所述細胞中制造所述活化的糖核苷酸的生物合成路徑，

b)在所述受體和蔗糖的存在下培養(yǎng)所述細胞，以及

c)從所述細胞、培養(yǎng)基或二者中分離所述寡糖，

所述方法特征在于所述細胞還包含一種或多種編碼蔗糖利用系統(tǒng)、優(yōu)選編碼異源蔗糖利用系統(tǒng)、更優(yōu)選編碼異源PTS-依賴性蔗糖利用轉運系統(tǒng)的基因，更優(yōu)選scr基因，由此所述細胞能夠使用蔗糖作為碳源、優(yōu)選作為主要碳源、更優(yōu)選作為唯一的碳源，用于制造所述活化的糖核苷酸，以及作為能量來源、優(yōu)選作為主要能量來源、更優(yōu)選作為唯一能量來源，用于制造所述寡糖。

本發(fā)明的第二方面涉及優(yōu)選為大腸桿菌細胞的細胞，其能夠使碳水化合物受體內化至所述細胞，所述碳水化合物受體優(yōu)選為乳糖，并且不是蔗糖，所述方法包括：

-編碼糖基轉移酶的重組基因，所述糖基轉移酶能夠使活化的糖核苷酸的糖殘基轉移至在所述細胞中內化的受體，

-在所述細胞中制造所述活化的糖核苷酸的生物合成途徑，和

-一種或多種編碼蔗糖利用系統(tǒng)、優(yōu)選編碼異源蔗糖利用系統(tǒng)的基因，更優(yōu)選scr基因，由此所述細胞能夠使用蔗糖作為碳源，優(yōu)選作為主要碳源，更優(yōu)選作為唯一碳源。

附圖說明

附圖意在對本發(fā)明進行進一步說明，而不意在限制本發(fā)明的主題。

改造的微生物是完全代謝活性的細胞，其中生長和寡糖的合成可以同時進行。該細胞包含異源PTS-依賴性蔗糖利用轉運系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括蔗糖特異性孔蛋白(促進蔗糖通過外膜的擴散)、蔗糖轉運蛋白(由細胞外蔗糖提供細胞內蔗糖-6-磷酸)和蔗糖-6-磷酸水解酶(提供葡萄糖-6-磷酸和果糖)。通過有機體自身的代謝系統(tǒng)，葡萄糖-6-磷酸和果糖的氧化提供了生物能量來源。另外，葡萄糖-6-磷酸和果糖作為碳源，用于在細胞的天然生物合成路徑中制備糖核苷酸。如此制備出的糖核苷酸是用于使由細胞通過特異性透性酶而內化的碳水化合物受體(例如乳糖)糖基化的供體，從而制備出目的寡糖。糖基化由一種或多種糖基轉移酶介導，所述糖基轉移酶通過表達異源基因而直接制備。有機體缺乏任何使細胞中的受體或者寡糖產物降解的酶。

具體實施方式

令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，外源單糖或二糖受體，優(yōu)選乳糖，能夠通過涉及微生物透性酶的轉運機制而在合適的轉基因微生物中，特別是大腸桿菌中內化，在微生物中，使用蔗糖作為其碳源和能量來源，能夠使碳水化合物受體糖基化，并且能夠以良好的產率制備和分離外源寡糖。從而，可以得到一種有效、價廉且易于擴大的用于制備寡糖的方法。為了使該方法獲得成功，需要特殊的制備寡糖的微生物，所述微生物能夠在蔗糖上生存、利用蔗糖用于糖基化所必需的核苷酸糖供體的代謝合成、能夠使簡單的碳水化合物受體內化并且對它們進行糖基化反應以合成更復雜的寡糖。

因此，本發(fā)明第一方面涉及一種通過以下步驟制造寡糖的方法：

a)提供一種微生物細胞，優(yōu)選大腸桿菌細胞，其能夠使蔗糖和碳水化合物受體，優(yōu)選乳糖，內化至所述細胞，并且其包含：

-編碼糖基轉移酶的重組基因，所述糖基轉移酶能夠將活化的糖核苷酸的糖殘基轉移至細胞中的受體，和

-用于從蔗糖制造活化的糖核苷酸的生物合成路徑，

b)在受體和蔗糖的存在下，在含水培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，以及

c)從細胞、從培養(yǎng)基或從二者中分離寡糖產物。

該方法特征在于細胞以一種或多種編碼蔗糖利用系統(tǒng)的異種基因轉化，所述蔗糖利用系統(tǒng)允許細胞使用蔗糖作為碳源、優(yōu)選作為主要碳源、更優(yōu)選作為唯一碳源，用于通過細胞進行活化的糖核苷酸的生物合成。細胞以之轉化的蔗糖利用系統(tǒng)，還優(yōu)選允許細胞使用蔗糖作為能量來源、優(yōu)選作為主要能量來源、更優(yōu)選作為唯一能量來源，用于寡糖的生物合成。

根據(jù)本發(fā)明，術語“碳水化合物受體”或“受體”優(yōu)選表示除了蔗糖及其糖苷之外的單糖或二糖。單糖受體或者二糖受體的單糖部分包括任意5～6個碳原子的糖部分，其為醛糖(例如，D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖等)、酮糖(例如，D-果糖、D-山梨糖、D-塔格糖等)、脫氧糖(例如，L-鼠李糖、L-巖藻糖等)或者脫氧氨基糖(例如，N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰半乳糖胺等)。在糖苷型碳水化合物受體中，糖部分通過共價鍵或者連接鍵(linker)連接至非糖殘基(苷元)，所述共價鍵是糖殘基的糖苷碳原子與非糖部分的任意原子之間的直接鏈接，所述連接鍵由一個、兩個、三個或四個以下原子組成：如-O-、-C-、-NH-、-N(OH)-、-S-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝NH)-、-C(＝N-OH)-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝O)-S-、-S-C(＝O)-、-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝NH)-O-、-O-C(＝NH)-、-C(＝S)-NH-、-NH-C(＝S)-、-C(＝NH)-S-和-S-C(＝NH)-。因此，單糖或二糖殘基還原端處的C-1(在醛糖的情況下)或C-2(在酮糖的情況下)異頭碳原子與非糖部分通過共價鍵或者形成O-、N-、S-或C-糖苷的連接鍵相連。優(yōu)選地，這些具有或不具有連接鍵的糖苷衍生物的苷元為下組的一種：

a)-OR_A，其中R_A為直鏈或支鏈烴鏈，當飽和時，其具有1～24個、優(yōu)選1～6個碳原子(如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正己基等)，或者當不飽和時，其具有2～24個、優(yōu)選2～6個碳原子(如乙烯基、烯丙基、炔丙基等)，或者R_A表示芳基部分(同芳香族基團如苯基或萘基)，或者R_A表示可通過氫解作用除去的基團，即與氧鍵接的基團能夠在催化量的鈀、雷尼鎳(Raney nickel)或其他已知適用于氫解的金屬催化劑的存在下通過氫加成而切除，結果使OH基團再生；這樣的保護基團是本領域技術人員已知的，并在Protective Groups in Organic Synthesis,PGM Wuts and TW Greene,John Wiley&Sons 2007中進行了討論。合適的基團包括苯甲基、二苯基甲基(二苯甲基)、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基(三苯甲基)基團。上述任意R_A基團可任選地被選自以下基團的一種或多種取代：烷基(僅用于芳基和可通過氫解除去的基團)、羥基、烷氧基、羧基、氧代、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酸基、芳基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基氨基、芳基羰基、氨基、單烷基氨基和二烷基氨基、氨基甲?；瓮榛被驶投榛被驶?、烷基羰基氨基、氰基、烷酰氧基、硝基、烷硫基和鹵素；在可通過氫解除去的基團的情況下，如果存在這樣的取代，優(yōu)選在芳環(huán)上；

b)-X-R_B，其中X為N或S，并且R_B表示直鏈或支鏈烴鏈，當飽和時，其具有1～24個、優(yōu)選1～6個碳原子(如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正己基等)，或者當不飽和時，其具有2～24個、優(yōu)選2～6個碳原子(如乙烯基、烯丙基、炔丙基等)?；蛘逺_B表示芳基部分(同芳香族基團如苯基或萘基)，或者R_B表示苯甲基基團。上述任意R_B基團可任選地被選自以下基團的一種或多種取代：烷基(僅用于芳基和苯甲基)、羥基、烷氧基、羧基、氧代、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酸基、芳基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基氨基、芳基羰基、氨基、單烷基氨基和二烷基氨基、氨基甲?；瓮榛被驶蚨榛被驶?、烷基羰基氨基、氰基、烷酰氧基、硝基、烷硫基和鹵素；

c)將異頭碳原子與相鄰碳原子通過-NH-C(＝O)-O-橋彼此連接的基團，從而形成如下醛糖的情況所示的稠合五元環(huán)：

d)疊氮化物；

e)-NH-C(R”)＝C(R’)₂，其中每個R’獨立地表示吸電子基團，其選自-CN、-COOH、-COO-烷基、-CO-烷基、-CONH₂、-CONH-烷基和-CON(烷基)₂，或者其中兩個R’基團連接在一起形成-CO-(CH₂)_2-4-CO-，并因此與其連接的碳原子形成5～7元的環(huán)烷基-1,3-二酮，所述二酮中任意的亞甲基基團任選地被1或2個烷基基團取代，并且其中R”為H或烷基；

f)氨基酸殘基，其為任何天然或非天然的氨基酸，即具有至少一個氨基基團作為取代基的鏈烷酸衍生物。優(yōu)選地，氨基酸選自：如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val、羥基脯氨酸、α-甲基絲氨酸、β-丙氨酸等的α-氨基酸和β-氨基酸。這些氨基酸可以直接或者通過如上所述的連接鍵(例如，用于脲連接的糖肽，參見WO 2009/040363)連接到碳水化合物的C-1(在醛糖的情況下)或C-2(在酮糖的情況下)異頭碳原子上，從而形成O-、N-、S-或C-糖苷。O-糖苷(O-多糖)能通過涉及含有OH-的氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、羥基脯氨酸等形成，N-糖苷(N-多糖)能用任意氨基酸的α-、β-等氨基基團或者例如賴氨酸、天門冬酰胺或谷氨酰胺的側鏈的額外的氨基制得，S-糖苷能用半胱氨酸制得，而C-糖苷(C-多糖)包含將氨基酸的C原子與寡糖部分非還原端的異頭碳原子耦聯(lián)的C-C鍵；

g)聚乙二醇殘基。聚乙二醇(PEG)是分子式為C_2nH_4n+2O_n+1的水溶性聚醚，其具有氧乙烯(-CH₂-O-CH₂-或CH₂-CH₂-O-)重復單元，且其中n為2～100、優(yōu)選2～50、特別是2～25、更特別是2～10。較低分子量的PEG可以以純化形式使用，指作為“單分散性PEG”，也可以作為PEG的混合物使用，指作為“多分散性PEG”。就其幾何形狀而言，PEG可以是直鏈、支鏈、星型或梳型構造的。直鏈PEG優(yōu)選為較低分子量PEG(即，n為2～10、優(yōu)選3～6)。支鏈PEG優(yōu)選具有3～10個直鏈的、優(yōu)選低分子量的、從中心核基團發(fā)出的PEG鏈。星型PEG優(yōu)選具有10～100個直鏈或支鏈的、優(yōu)選低分子量的、從中心核基團發(fā)出的PEG鏈。梳型PEG具有多個直鏈、支鏈和/或星型的、優(yōu)選低分子量的、與聚合物骨架相連的PEG鏈。PEG的末端伯羥基可以通過醚鍵與烷基基團、優(yōu)選甲基相連。此外，它們的末端羥基基團可以被氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰胺基、巰基或烷硫基所代替，或者它們的末端羥基基團可以被氧化成羧基，其可以被酯化或以氨或伯胺或仲胺的酰胺形式存在。該連接為類似于糖苷的鍵；

h)聚乙烯醇殘基。聚乙烯醇(PVA)是分子式為(C₂H₄O)_x的水溶性聚合物，具有-CH₂-CH(OH)-的單體單元。當連接至碳水化合物時，任意OH-基團可以被糖基化；

i)式A的α,β-不飽和酰胺基團

其中Q₁、Q₂、Q₃和Q₄獨立地為H和C₁-C₆烷基，其中烷基可任選地被鹵素、OH、硝基或苯基基團取代。式A的殘基通過其N原子以共價鍵連接至糖，優(yōu)選連接至N-糖苷形式的碳水化合物的異頭碳原子；或者

j)式B的α,β-不飽和羰基基團

其中Q₁、Q₂和Q₃如式A的殘基所定義。

優(yōu)選地，碳水化合物受體為半乳糖基二糖、特別是乳糖。

此外，根據(jù)本發(fā)明，術語“寡糖產物”或“寡糖”優(yōu)選表示如上所述的碳水化合物受體的糖基化衍生物，其中糖殘基通過內糖苷鍵合連接至碳水化合物受體的碳水化合物部分。優(yōu)選地，寡糖產物為3～8個單糖單元的寡糖、特別是3～5個單糖單元的寡糖。本發(fā)明的寡糖產物為重組產物，即，其通過轉基因微生物制得，并且對該微生物來說是異體或異源的。

進一步根據(jù)本發(fā)明，術語“微生物”或“細胞”優(yōu)選表示一種微生物細胞，特別是大腸桿菌細胞，其中在其DNA序列中存在至少一種替換(alternation)。該替換可以導致野生型細胞的原始特性的改變，例如，由于引入的新遺傳物質，其編碼不在野生型細胞中的酶的表達，改造的細胞能夠進行額外的化學轉化，或者由于基因的移除(敲除)無法進行像降解這樣的轉化。轉基因細胞可以以常規(guī)方式通過本領域技術人員熟知的基因工程技術制備。

用于本發(fā)明方法中的轉基因微生物或細胞選自細菌或酵母，優(yōu)選細菌。細菌優(yōu)選為選自以下者：大腸桿菌(Escherichia coli)、芽孢桿菌(Bacillus spp.)(例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))、幽門彎曲桿菌(Campylobacter pylori)、幽門螺旋桿菌(helicobacter pylori)、根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、水生嗜熱鏈球菌(Thermophilus aquaticus)、莖瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitis)、乳桿菌屬(Lactobacillus spp.)、乳酸菌屬(Lactococcus spp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp.)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium spp.)、芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus spp.)、Micromomospora spp.、微球菌屬(Micrococcus spp.)、紅球菌屬(Rhodococcus spp.)、假單胞菌(Peudomonas)，其中優(yōu)選大腸桿菌。

本發(fā)明的方法還涉及將外源碳水化合物受體、優(yōu)選乳酸轉運至用于糖基化的轉基因微生物中，以制備異體目的寡糖，優(yōu)選不會不利地影響細胞的基本功能或者破壞其完整性的寡糖。在一個實施方式中，轉運通過被動機制發(fā)生，在這期間外源受體被動地擴散穿過細胞的質膜。受體進入微生物的擴散是發(fā)酵液與細胞的胞外和胞內空間之間相對于受體濃度差異的作用，借此受體從高濃度區(qū)轉移至低濃度區(qū)。在另一個實施方式中，受體在主動轉運的幫助下被內化。在此情況下，轉基因微生物包含轉運子蛋白、所謂的透性酶，其起到酶的作用，借此，微生物能夠允許外源物質進入并在使其集中在細胞質中。特別地，乳糖透性酶(LacY)特異性作用于半乳糖、簡單的半乳糖基二糖比如乳糖及其糖苷。對要被內化的外源碳水化合物受體的糖部分的特異性，可以通過常規(guī)重組DNA操作技術手段對微生物進行突變而改變。在優(yōu)選的實施方式中，外源乳糖或其衍生物的內化經(jīng)由乳糖透性酶介導的主動轉運機制發(fā)生。轉基因微生物優(yōu)選缺乏任何可能使受體降解的酶活性(如LacZ)。同樣，微生物無法使寡糖產物水解或降解。

而且，在發(fā)明的方法中使用的轉基因細胞包含一種或多種外源或重組的基因，所述基因編碼一種或多種能夠將活化的糖核苷酸的糖殘基轉移至內化的受體的糖基轉移酶。如果該基因或者其等同的DNA序列是重組的，則能夠通過常規(guī)技術例如使用表達載體或者通過染色體整合被引入細胞中。異源核酸序列的來源可以是任何動物(包括人類)或植物、真核細胞比如那些來自于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、白色念珠菌(Candida albican)或者來自藻類的那些、原核細胞比如源自大腸桿菌、脆弱擬桿菌(Bacterioides fragilis)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium sp.)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、幽門彎曲桿菌(Campylobacter pylori)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、水生嗜熱鏈球菌(Thermophilus aquaticus)、莖瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)和腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的那些、或者病毒。糖基轉移酶或者通過基因或等同的DNA序列編碼的蛋白質表達的酶優(yōu)選為葡萄糖基轉移酶、半乳糖基轉移酶、N-乙酰葡糖胺基轉移酶、N-乙酰半乳糖胺基轉移酶、葡糖醛酸基轉移酶、木糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、巖藻糖基轉移酶、唾液酸基轉移酶等。在優(yōu)選的實施方式中，糖基轉移酶選自β-1,3-N-乙酰葡糖胺基-轉移酶、β-1,6-N-乙酰葡糖胺基-轉移酶、β-1,3-半乳糖基-轉移酶、β-1,4-半乳糖基-轉移酶、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺基-轉移酶、β-1,3-葡糖醛酸基-轉移酶、α-2,3-唾液酸基-轉移酶、α-2,6-唾液酸基-轉移酶、α-2,8-唾液酸基-轉移酶、α-1,2-巖藻糖基-轉移酶、α-1,3-巖藻糖基-轉移酶和α-1,4-巖藻糖基-轉移酶。更優(yōu)選地，糖基轉移酶選自β-1,3-N-乙酰葡糖胺基轉移酶、β-1,6-N-乙酰葡糖胺基轉移酶、β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-2,3-唾液酸基轉移酶、α-2,6-唾液酸基轉移酶、α-1,2-巖藻糖基轉移酶、α-1,3-巖藻糖基轉移酶和α-1,4-巖藻糖基轉移酶，其為來自參與構建HMO核結構以及巖藻糖基化的和/或唾液酸基化的HMO及其糖基衍生物的那些酶，其中苷元為在以上碳水化合物受體的基團處所定義的部分。編碼上述轉移酶的基因已在文獻中有述。

在本發(fā)明的糖基轉移酶介導的糖基化方法中，活化的糖核苷酸作為供體使用。每個活化的糖核苷酸通常包括連接至核苷酸的磷酸化糖殘基，并且特異性糖基轉移酶僅接受特異性糖核苷酸。因此，優(yōu)選以下的活化的糖核苷酸參與到糖基轉移中：UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-Xyl、GDP-Man、GDP-Fuc和CMP-唾液酸，特別優(yōu)選選自UDP-Gal、UDP-GlcNAc、GDP-Fuc和CMP-唾液酸的那些。

在本發(fā)明方法中使用的轉基因微生物具有通向上述活化的糖核苷酸的生物合成路徑，即，其具有一組或多組基因，所述基因編碼一種或多種負責合成一種或多種活化的糖核苷酸的酶，在培養(yǎng)細胞時，為細胞中糖基轉移酶介導的反應中的糖基化做好準備。該組基因或者天然存在于細胞中，或者通過重組DNA操作技術的手段引入細胞中。通過細胞制備活化的糖核苷酸在參與各個糖核苷酸逐步反應序列的生物合成途徑的酶的作用下產生，所述糖核苷酸逐步反應序列始自碳源(對于單糖代謝的綜述參見例如，H.H.Freeze和A.D.Elbein的Essentials of Glycobiology第二版(A.Varki等人編著)，Cold Spring Harbour Laboratory Press(2009)，第四章中的Glycosylation precursors)。

應當強調的是，與轉移糖基化的體外形式相比，通過轉基因微生物經(jīng)由其自身生物合成路徑而制備活化的糖核苷酸是有優(yōu)勢的，由于其避免了使用非常昂貴的外源加入的糖核苷酸型供體，因此供體由細胞原位形成，并且磷脂酰核苷離去基團在細胞內再循環(huán)。

此外，用在發(fā)明方法中的微生物包含編碼蔗糖利用系統(tǒng)的基因，即，細胞具有利用蔗糖分解代謝作為碳源和能量來源的能力。能夠使細胞利用蔗糖的系統(tǒng)可以為細胞的基因池中通常發(fā)現(xiàn)的一種，但優(yōu)選為異源系統(tǒng)(即，衍生自不同有機體，并通過常規(guī)重組DNA操作技術、優(yōu)選經(jīng)由表達載體轉移至宿主細胞轉移至宿主細胞)。通常可使用兩種蔗糖分解代謝系統(tǒng)。根據(jù)磷酸烯醇丙酮酸(PEP)-依賴性的磷酸轉移酶系統(tǒng)(“PTS”)，蔗糖被轉運至微生物中并伴隨著磷酸化，以產生細胞內蔗糖-6-磷酸，其被水解為葡萄糖-6-磷酸和果糖，接著它們參與到細胞中心碳代謝中。PTS可以由scr或sac基因編碼。根據(jù)非-磷酸轉移酶-依賴性的系統(tǒng)(“非-PTS”)，細胞外蔗糖在質子同向轉運系統(tǒng)(蔗糖透性酶)的幫助下進入細胞，并且在轉運之后，通過轉化酶水解為葡萄糖和果糖，接著它們被磷酸化。就此而言，csc調節(jié)子由編碼負責非-PTS蔗糖利用的酶的基因組成。

在本發(fā)明方法的發(fā)酵期間，向制備寡糖的微生物喂養(yǎng)通過糖酵解提供能量的蔗糖用于生長、繁殖和保持其結構。此外，細胞攝取的蔗糖通過蔗糖分解代謝提供用于合成在細胞中發(fā)生的糖基化過程所必需的活化的糖核苷酸的前體。內化的碳水化合物受體參與到糖基轉移酶誘導的糖基化反應中，其中由細胞產生的活化的核苷酸供體的糖殘基被轉移，使得受體被糖基化。任選地，當細胞表達多于一種糖基轉移酶時，可以發(fā)生額外的糖基化反應，導致目標寡糖的形成。當然，細胞優(yōu)選缺乏任何可能降解細胞中產生的寡糖衍生物的酶活性。

在用于制備寡糖產物的方法的優(yōu)選實現(xiàn)方式中，蔗糖利用系統(tǒng)是異源的。這是對工業(yè)上可獲利的類似于寡糖制備的轉化而言，當微生物、優(yōu)選細菌、更優(yōu)選大腸桿菌為最佳的菌株時的情況，因為這樣的菌株通常沒有利用蔗糖的能力。因此，應當用合適的表達質?；蛘呓?jīng)由染色體整合，在不能利用蔗糖的細胞中引入蔗糖攝取盒，以使其成為可以利用蔗糖的。更優(yōu)選地，蔗糖路徑基因包括PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)，并且特別地，蔗糖調節(jié)子為scr。具有scr基因的微生物為例如，沙門氏菌屬(Salmonella ssp.)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。

scr基因包括以下者：scrY、scrA、scrB和scrR?；騭crA編碼蔗糖轉運蛋白酶II^Scr，其從經(jīng)由主動轉運通過細胞膜的細胞外蔗糖和伴隨的磷酸化提供了細胞內蔗糖-6-磷酸。蔗糖特異性ScrY膜孔蛋白(由scrY編碼)促進蔗糖通過外膜的擴散。ScrB轉化酶(由scrB編碼)通過水解將累積的蔗糖-6-磷酸分解為葡萄糖-6-磷酸和果糖。任選地，果糖激酶ScrK(由scrK編碼)將果糖磷酸化為果糖-6-磷酸，然而這種酶的存在不是關鍵性的，因為果糖可以通過細胞擁有的其他機制被磷酸化。阻遏蛋白ScrR(由scrR編碼)負向控制scrYAB基因的表達，并ScrR由蔗糖或果糖誘導。在葡萄糖的存在下，蔗糖基因的表達被抑制。

在優(yōu)選的實施方式中，用質粒、更優(yōu)選通過雙質粒體系將異源scr基因引入微生物中，所述雙質粒體系中的一個包含scrA基因且另一個包含scrB基因。scrY、scrR和任選的scrK基因可以由任一質粒攜帶。

此外優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，發(fā)酵液中不加入抗生素。

在本發(fā)明的方法中，要由微生物糖基化的碳水化合物受體為單糖或二糖，其選自半乳糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖基化的單糖、N-乙?；?葡糖胺基化的單糖以及如上定義的其糖苷衍生物。所有這些碳水化合物衍生物可以容易地被具有LacY通透酶的細胞通過主動轉運吸收(take up)并在糖基化之前積累在細胞中(WO01/04341、Fort等人Chem.Soc.,Chem.Comm.2558(2005)、EP-A-1911850、WO2013/182206、WO2014/048439)。這是因為細胞能夠用其LacY透性酶將這些碳水化合物受體轉運進入細胞，并且細胞缺乏任何能夠降解這些受體的酶、特別是LacZ。優(yōu)選地，細胞在lac操縱子上具有缺失的或者不足的lacA基因。

根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，在微生物中，lac阻遏子的lacl基因也是缺失的。在沒有功能性抑制子的情況下，不需要誘導劑來表達LacY。。

根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，在以下階段，在含水培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉基因細胞、特別是LacZ^-Y⁺大腸桿菌細胞：

(a)由蔗糖確保的指數(shù)級細胞生長階段；然后

(b)以連續(xù)加入、確保有限的細胞生長的蔗糖喂養(yǎng)階段。

在進食階段，可以向培養(yǎng)基一次性、按順序地或者連續(xù)地加入要在細胞中內化并糖基化的外源碳水化合物受體、優(yōu)選乳糖。在該第二階段，受體可以以純的固體/液體或者以濃縮的水溶液或懸浮液的形式加入。寡糖的制備發(fā)生在該第二階段，并且可以持續(xù)6～7天。優(yōu)選地，該喂養(yǎng)階段在允許制備高細胞密度培養(yǎng)物的條件下進行。

本發(fā)明方法的特征在于，在微生物的生長階段和制備階段之間，沒有必要改變碳源和/或能量來源。

任選地，該方法還包括向培養(yǎng)基中加入誘導劑，以誘導細胞表達參與受體轉運的、和/或參與內化的受體糖基化的、和/或參與活化的糖核苷酸供體的生物合成的酶和/或蛋白質。誘導劑優(yōu)選為異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，并且在喂養(yǎng)階段的開始加入到培養(yǎng)基中。然而，如果細胞為Lacl^-表型的話，沒有必要使用誘導劑。

我們相信，上述微生物在本發(fā)明的處理條件下是高度穩(wěn)定的。因此，相信這些微生物可以使用蔗糖作為其碳源和能量的來源，至少與使用甘油和/或葡萄糖作為其碳源和/或能量來源的微生物以相同的制備率、并且以更可靠和可重現(xiàn)的方式，制備寡糖。就此而言，包含scr基因(用于利用蔗糖的微生物所需要的)加上一個或多個糖基轉移酶基因(用于制備外源寡糖的微生物所需要的)的一個或多個質粒、優(yōu)選一個或兩個質粒，在上述微生物超過4天、優(yōu)選5～7天的發(fā)酵期間是特別穩(wěn)定的。

在第二階段的末尾，寡糖產物已經(jīng)累積在微生物的細胞內和細胞外基質中。然后優(yōu)選地該產物以被動的方式轉運至細胞的外部上清液中，即，其可以穿過細胞膜擴散到外部。細胞中的一種或多種糖流出轉運子，即促進糖衍生物由細胞向上清液流出的蛋白質，能夠促進該轉運。該糖流出轉運子可以是外源或內源存在的，并且在發(fā)酵的條件下可以被過表達以增強產生的寡糖衍生物的輸出。對于將分泌的產物的糖部分的特異性能夠通過細胞突變以常規(guī)重組DNA操作技術手段來改變。優(yōu)選地，寡糖在細胞外基質中累積?；蛘?，寡糖可以通過以常規(guī)方式破壞細胞壁而轉運至細胞外部上清液中。

然后可以以常規(guī)方式將寡糖產物從含水培養(yǎng)基中分離，其中所述產物由細胞制得。

從培養(yǎng)基中分離寡糖的第一個步驟優(yōu)選包括將寡糖從生產它的微生物中分離。這優(yōu)選包括澄清培養(yǎng)基以除去由培養(yǎng)轉基因微生物產生的懸浮的顆粒和污染物，特別是細胞、細胞組分、不溶性代謝產物和由培養(yǎng)轉基因微生物產生的碎片。在這一步驟中，可以以常規(guī)的方式澄清包含寡糖產物的含水培養(yǎng)基。優(yōu)選地，通過離心和/或過濾澄清培養(yǎng)基。

從培養(yǎng)基中分離寡糖的第二個步驟優(yōu)選包括從含水培養(yǎng)基中除去可能干涉后續(xù)分離步驟的所有蛋白質、和肽、氨基酸、RNA和DNA以及任何內毒素和糖脂，優(yōu)選在其已經(jīng)被澄清之后進行。在這一步驟中，可以以常規(guī)的方式從培養(yǎng)基中除去蛋白質和相關的雜質。優(yōu)選地，通過超濾、切向流高效過濾、切向流超濾、親和層析、離子交換色譜、疏水相互作用色譜和/或凝膠過濾(即尺寸排阻層析)，特別是通過色譜、更特別是通過離子交換色譜或疏水相互作用色譜從培養(yǎng)基中除去蛋白質和相關的雜質。除了尺寸排阻層析之外，蛋白質和相關雜質通過色譜介質或者選擇的膜而保留，而寡糖產物保留在含水培養(yǎng)基中。

如果需要，在已經(jīng)將蛋白質和相關雜質從培養(yǎng)基中除去之后，隨后可以將含水培養(yǎng)基中的寡糖產物從類糖副產物和從培養(yǎng)基中分離。這可以適當?shù)赝ㄟ^對培養(yǎng)基進行色譜分離而完成。在中性寡糖產物的情況下這樣的分離可以在色譜分離柱中進行，所述色譜分離柱填充有常規(guī)酸性陽離子交換樹脂。酸性陽離子交換樹脂可以為單價或二價陽離子形式，且優(yōu)選為H⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺或Ca²⁺的形式，特別是Ca²⁺。色譜分離可以以常規(guī)方式在溶液的pH為2～9的條件下進行。用在色譜分離中的洗脫液優(yōu)選為水，特別是去離子水，但是也可以使用含水鹽溶液。還可以使用醇，如乙醇，以及含水醇混合物。

根據(jù)優(yōu)選的實施方式，用于制備寡糖、優(yōu)選在還原端具有乳糖單元的寡糖、或其糖苷的本發(fā)明的方法包括以下步驟：

(i)提供轉基因細胞，所述細胞包括：

-編碼糖基轉移酶的重組基因，所述酶能夠使活化的糖核苷酸的糖殘基轉移至內化的乳糖或其糖苷，和

-通向活化的糖核苷酸的生物合成路徑，

(ⅱ)在外源乳糖或其糖苷以及蔗糖的存在下，對轉基因細胞進行培養(yǎng)，其誘導

-由轉基因細胞經(jīng)由主動轉運機制使外源乳糖或其糖苷內化，以及

-通過由細胞表達的糖基轉移酶介導的糖基轉移，從內化的乳糖或其糖苷形成在還原末端具有乳糖單元的寡糖或其糖苷，

(ⅲ)從細胞、從培養(yǎng)基或者從兩者中分離寡糖產物，

其特征在于，細胞還包含異源蔗糖利用系統(tǒng)、優(yōu)選PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)、特別是其中蔗糖調節(jié)子為scr的PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)，以提供蔗糖作為碳源，用于通過所述細胞進行所述活化的糖核苷酸的生物合成。

用在該優(yōu)選方法中的轉基因細胞，可以具有多于一個重組基因，其編碼多于一種的糖基轉移酶，所述糖基轉移酶能夠將活化的糖核苷酸的糖殘基轉移至內化的受體分子或者之前由相同的細胞制得的糖基化受體，由此，內化的受體通過由細胞表達的多種糖基轉移酶介導的多重糖基轉移來形成寡糖產物。因此，得到的寡糖產物可以為糖基化乳糖或其糖苷。糖基化乳糖優(yōu)選為N-乙?；?葡糖胺基化的、半乳糖基化的、巖藻糖基化的和/或唾液酸基化的乳糖。為了制備這些衍生物，細胞包含一種或多種編碼N-乙?；?葡糖胺基轉移酶、半乳糖基轉移酶、唾液酸基轉移酶和/或巖藻糖基轉移酶的重組基因，并且還包含通向相應的活化的糖型核苷酸，即UDP-GlcNAc、UDP-Gal、GDP-Fuc和/或CMP-唾液酸的生物合成路徑。

更優(yōu)選地，通過本方法制得的寡糖產物的特征在于式1：

其中Y為OH或以上限定的非糖苷元，優(yōu)選為OH，

R₁為巖藻糖基或者H，

R₂為巖藻糖基或者H，

R₃選自H、唾液酸基、N-乙?；?乳糖胺基和乳-N-二糖基基團，其中N-乙?；?乳糖胺基基團可以攜帶有包含一個或多個N-乙?；?乳糖胺基和/或一個或多個乳-N-二糖基基團的糖殘基；每個N-乙?；?乳糖胺基和乳-N-二糖基基團可以被一個或多個唾液酸殘基和/或巖藻糖殘基取代，

R₄選自H、唾液酸基和N-乙酰基-乳糖胺基基團，所述N-乙?；?乳糖胺基基團任選被包含一個或多個N-乙?；?乳糖胺基和/或一個或多個乳-N-二糖基基團的糖殘基取代；每個N-乙?；?乳糖胺基和乳-N-二糖基基團能夠被一個或多個唾液酸殘基和/或巖藻糖殘基取代，

條件是R₁、R₂、R₃和R₄基團中的至少一個與H不同。

甚至更優(yōu)選的是，由本方法制得的式1的化合物的特征在于式1a、1b或1c

其中Y、R₁和R₂如上所定義，優(yōu)選為OH，

R_3a為N-乙酰基-乳糖胺基，所述N-乙酰基-乳糖胺基任選被包含一個N-乙?；?乳糖胺基和/或一個乳-N-二糖基基團的糖殘基取代；每個N-乙?；?乳糖胺基和乳-N-二糖基基團可以被一個或多個唾液酸殘基和/或巖藻糖殘基所取代，

R_4a為H或N-乙?；?乳糖胺基，所述N-乙?；?乳糖胺基任選被乳-N-二糖基基團取代；每個N-乙?；?乳糖胺基和乳-N-二糖基基團可以被一個或多個唾液酸殘基和/或巖藻糖殘基取代，

R_3b為乳-N-二糖基基團，所述乳-N-二糖基基團任選被一個或多個唾液酸殘基和/或巖藻糖殘基取代，

R_4b為H或N-乙酰基-乳糖胺基，所述N-乙?；?乳糖胺基任選被一個或兩個N-乙?；?乳糖胺基和/或一個乳-N-二糖及基團取代；每個N-乙?；?乳糖胺基和乳-N-二糖基基團可以被一個或多個唾液酸殘基和/或巖藻糖殘基取代，

R₅獨立地為H或唾液酸基，

并且其中R₁、R₂或R₅的至少一個不為H。

仍然更優(yōu)選地，根據(jù)通過本方法制得的式1a或1b的化合物的特征在于：

-R_3a的糖殘基中的N-乙?；?乳糖胺基基團連接至另一個具有1～3個內糖苷鍵的N-乙酰基-乳糖胺基基團，

-R_3a的糖殘基中的乳-N-二糖基基團連接至具有1～3個內糖苷鍵的N-乙?；?乳糖胺基基團，

-R_4a的糖殘基中的乳-N-二糖基基團連接至具有1～3個內糖苷鍵的N-乙?；?乳糖胺基基團基團，

-R_4b的糖殘基中的N-乙酰基-乳糖胺基連接至具有1～3個或1～6個內糖苷鍵的N-乙?；?乳糖胺基，

-R_4b的糖殘基中的乳-N-二糖基基團連接至具有1～3個內糖苷鍵的N-乙?；?乳糖胺基基團。

更優(yōu)選地，根據(jù)通過本方法制得的式1a、1b和1c的化合物為人乳寡糖(當Y為OH時)或其糖苷(當Y為非糖苷元時)。

通過本方法制得的式1a的優(yōu)選化合物選自乳-N-新四糖、對-乳-N-六糖、對-乳-N-新六糖、乳-N-新六糖、對-乳-N-八糖、乳-N-新八糖及其糖苷，所有這些可以任選地被一個或多個唾液酸和/或巖藻糖殘基所取代。通過本方法制得的式1b的優(yōu)選化合物選自乳糖-N-四糖、乳糖-N-六糖、乳糖-N-八糖、異-乳糖-N-八糖、乳糖-N-十糖、乳糖-N-十一糖及其糖苷，所有這些可以任選地被一個或多個唾液酸殘基和/或巖藻糖殘基取代。

式1a或1b特別優(yōu)選的化合物的特征在于：

-連接至N-乙酰基-乳糖胺基和/或乳-N-二糖基基團的巖藻糖殘基連接至

·具有1～2個內糖苷鍵的乳-N-二糖基基團的半乳糖，和/或

·具有1～4個內糖苷鍵的乳-N-二糖基基團的N-乙酰基-葡糖胺，和/或

·具有1～3個內糖苷鍵的N-乙?；?乳糖胺基基團的N-乙?；?葡糖胺，

-連接至N-乙?；?乳糖胺基和/或乳-N-二糖基基團的唾液酸殘基連接至

·具有2～3個內糖苷鍵的乳-N-二糖基基團的半乳糖，和/或

·具有2～6個內糖苷鍵的乳-N-二糖基基團的N-乙?；?葡糖胺，和/或

·具有2～6個內糖苷鍵的N-乙?；?乳糖胺基基團的半乳糖。

根據(jù)最優(yōu)選的方面，子式1a、1b或1c的化合物選自2’-巖藻糖基乳糖、3-巖藻糖基乳糖、2’,3-二巖藻糖基乳糖、3’-唾液酸基乳糖、6’-唾液酸基乳糖、3’-唾液酸基-3-巖藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V、LST-a、LST-b、LST-c、FLST-a、FLST-b、FLST-c、LNDFH-I、LNDFH-II、LNDFH-III、DS-LNT、FDS-LNT I、FDS-LNT II及其糖苷，或其鹽。糖苷可以是α-或者β-異頭物，但優(yōu)選為β-異頭物。

優(yōu)選的加入培養(yǎng)基中的外源碳水化合物受體為乳酸，且優(yōu)選的寡糖產物為人乳寡糖(HMO)。HMO由在還原端處的乳糖單元和一種或多種單糖單元組成，所述單糖單元為來自以下者：N-乙?；?葡糖胺、半乳糖、巖藻糖和唾液酸(參見：Urashima等人的Milk Oligosaccharides,Nova Biomedical Books,New York,2011,ISBN:978-1-61122-831-1)。然后，為了制備HMO，細胞包含一種或多種編碼β-1,3-N-乙酰基-葡糖胺基轉移酶、β-1,6-N-乙?；?葡糖胺基轉移酶、β-1,3-半乳糖基轉移酶，β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-2,3-唾液酸基轉移酶、α-2,6-唾液酸基轉移酶、α-1,2-巖藻糖基轉移酶、α-1,3-巖藻糖基轉移酶和/或α-1,4-巖藻糖基轉移酶的重組基因，并且還包含通向相應的活化糖型核苷酸，即UDP-GlcNAc、UDP-Gal、GDP-Fuc和/或CMP-唾液酸的生物合成路徑。

根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明用于制備N-乙?；疕MO、優(yōu)選3～5個單糖單元的N-乙?；疕MO的方法包括以下步驟：

(i)提供LacZ^-、LacY⁺基因型或者LacZ^-、LacY⁺、Lacl^-基因型的轉基因大腸桿菌細胞，其包含：

-編碼N-乙?；?葡糖胺基轉移酶的重組基因，所述酶能夠將UDP-GlcNAc的GlcNAc轉移至內化的乳糖，

-任選的編碼半乳糖基轉移酶的重組基因，所述酶能夠將UDP-Gal的半乳糖殘基轉移至N-乙?；?葡糖胺基化的乳糖，和

-一種或多種編碼通向UDP-GlcNAc及任選的UDP-Gal的生物合成路徑的基因，

(ⅱ)在外源乳糖和蔗糖的存在下，對LacZ^-、LacY⁺基因型或者LacZ^-、LacY⁺、Lacl^-基因型的轉基因大腸桿菌細胞進行培養(yǎng)，從而誘導：

-由細胞經(jīng)由主動轉運機制使外源乳糖內化，和

-在細胞內形成任選被半乳糖基化的N-乙?；?葡糖胺基化的乳糖，然后

(ⅲ)從細胞、從培養(yǎng)基或從兩者中分離任選被半乳糖基化的N-乙?；?葡糖胺基化的乳糖，

其特征在于，細胞還包含異源PTS-依賴性的蔗糖利用系統(tǒng)，以提供蔗糖作為碳源以及能量來源，用于通過細胞的UDP-GlcNAc和任選的UDP-Gal的生物合成。

異源PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)優(yōu)選包括scr基因、更優(yōu)選包括scrY、scrA、scrB和scrR，并且特別是不包括scrK。

如果N-乙?；?葡糖胺基轉移酶為β-1,3-N-乙酰基-葡糖胺基轉移酶，并且細胞中不存在編碼半乳糖基轉移酶的重組基因，產物優(yōu)選為乳-N-三糖，如果細胞中還存在β-1,3-半乳糖基轉移酶或者β-1,4-半乳糖基轉移酶，產物優(yōu)選分別為LNT或LNnT。

根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明用于制備巖藻糖基化的HMO、優(yōu)選3～5個單糖單元的巖藻糖基化的HMO的方法包括以下步驟：

(i)提供LacZ^-、LacY⁺基因型或者LacZ^-、LacY⁺、Lacl^-基因型的轉基因大腸桿菌細胞，其包含：

-編碼巖藻糖基轉移酶的重組基因，所述酶能夠將GDP-Fuc的巖藻糖殘基轉移至內化的乳糖，和

-一種或多種編碼通向GDP-Fuc的生物合成路徑的基因，

(ⅱ)在外源乳糖和蔗糖的存在下，對細胞進行培養(yǎng)，從而誘導：

-由轉基因細胞經(jīng)由主動轉運機制使外源乳糖內化，和

-形成巖藻糖基化的乳糖，然后

(ⅲ)從細胞、從培養(yǎng)基或從兩者中分離巖藻糖基化的乳糖，

其特征在于，細胞還包含異源PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)，以提供蔗糖作為碳源以及能量來源，用于通過細胞的GDP-Fuc的生物合成。優(yōu)選地，在該方法中，培養(yǎng)步驟包括兩步喂養(yǎng)，第二喂養(yǎng)階段通過向培養(yǎng)中連續(xù)加入少于第一喂養(yǎng)階段中連續(xù)加入量的蔗糖，以便減慢細胞生長并增加在高細胞濃度培養(yǎng)中制備的產物的含量。在第二喂養(yǎng)階段期間，向細胞培養(yǎng)中連續(xù)加入蔗糖的投料率比在第一喂養(yǎng)階段期間連續(xù)加入的蔗糖少大約30～40％。在兩個喂養(yǎng)階段期間，乳糖可以被連續(xù)地加入，優(yōu)選與蔗糖在相同的喂養(yǎng)溶液中，或者乳糖與蔗糖依次地加入。任選地，當在第二階段之后有相當大量的未使用受體留在細胞外部分時，培養(yǎng)還包括第三喂養(yǎng)階段。然后，優(yōu)選以與第二喂養(yǎng)階段設定的大概相同的投料率，繼續(xù)加入蔗糖而不加入受體，直到受體消耗。

異源PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)優(yōu)選包括scr基因、更優(yōu)選包括scrY、scrA、scrB和scrR，特別地不包括scrK。

如果巖藻糖基轉移酶為α-1,2-巖藻糖基轉移酶，產物優(yōu)選為2’-巖藻糖基乳糖，如果巖藻糖基轉移酶為α-1,3-巖藻糖基轉移酶，產物優(yōu)選為3-巖藻糖基乳糖，如果α-1,2-巖藻糖基轉移酶和α-1,3-巖藻糖基轉移酶二者都在細胞中表達，產物優(yōu)選為二巖藻糖基乳糖。

仍根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明用于制備唾液酸基化的HMO、優(yōu)選3～5個單糖單元的唾液酸基化的HMO的方法包括以下步驟：

(ⅰ)提供LacZ^-、LacY⁺基因型或者LacZ^-、LacY⁺、Lacl^-基因型的轉基因大腸桿菌細胞，其包含：

-編碼唾液酸基轉移酶的重組基因，所述酶能夠將CMP-唾液酸的唾液酸殘基轉移至內化的乳糖，和

-一種或多種編碼通向CMP-唾液酸的生物合成路徑的基因，

(ⅱ)在外源乳糖和蔗糖的存在下，對LacZ^-、LacY⁺基因型或者LacZ^-、LacY⁺、Lacl^-基因型的轉基因大腸桿菌細胞進行培養(yǎng)，從而誘導：

-由轉基因細胞經(jīng)由主動轉運機制的外源乳糖內化，和

-唾液酸基化的乳糖的形成，然后

(ⅲ)從細胞、從培養(yǎng)基或從兩者中分離唾液酸基化的乳糖，

其特征在于，細胞還包含異源PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)，以提供蔗糖作為碳源以及能量來源，用于通過細胞的CMP-唾液酸的生物合成。

異源PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)優(yōu)選包括scr基因、更優(yōu)選包括scrY、scrA、scrB和scrR，并且特別是不包括scrK。

如果唾液酸基轉移酶為α-2,3-唾液酸基轉移酶，產物優(yōu)選為3’-唾液酸基乳糖，如果唾液酸基轉移酶為α-2,6-唾液酸基轉移酶，產物優(yōu)選為6’-唾液酸基乳糖。

根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明用于制備巖藻糖基化的和唾液酸基化的HMO、優(yōu)選3～5個單糖單元的巖藻糖基化的和唾液酸基化的HMO的方法包括以下步驟：

(ⅰ)提供LacZ^-、LacY⁺基因型或者LacZ^-、LacY⁺、Lacl^-基因型的轉基因大腸桿菌細胞，其包含：

-編碼唾液酸基轉移酶的重組基因，所述酶能夠將CMP-唾液酸的唾液酸殘基轉移至內化的乳糖或者在先的巖藻糖基化的乳糖，

-編碼巖藻糖基轉移酶的重組基因，所述酶能夠將GDP-Fuc的巖藻糖殘基轉移至內化的乳糖或者在先的唾液酸基化的乳糖，和

-一種或多種編碼通向CMP-唾液酸和GDP-Fuc的生物合成路徑的基因，

(ⅱ)在外源乳糖和蔗糖的存在下，對LacZ^-、LacY⁺基因型或者LacZ^-、LacY⁺、Lacl^-基因型的轉基因大腸桿菌細胞進行培養(yǎng)，從而誘導：

-由轉基因細胞經(jīng)由主動轉運機制的外源乳糖內化，和

-唾液酸基-巖藻糖基-乳糖的形成，然后

(ⅲ)從細胞、從培養(yǎng)基或從兩者中分離唾液酸基-巖藻糖基-乳糖，

其特征在于，細胞還包含異源PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)，以提供蔗糖作為碳源以及能量來源，用于通過細胞的CMP-唾液酸和GDP-Fuc的生物合成。

異源PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)優(yōu)選包括scr基因、更優(yōu)選包括scrY、scrA、scrB和scrR，并且特別是不包括scrK。

如果唾液酸基轉移酶為α-2,3-唾液酸基轉移酶且?guī)r藻糖基轉移酶為α-1,3-巖藻糖基轉移酶，產物優(yōu)選為3’-唾液酸基-3-巖藻糖基乳糖。

本發(fā)明的第二方面涉及提供一種轉基因微生物，其能夠使蔗糖和并非蔗糖、優(yōu)選乳糖的碳水化合物受體內化至所述微生物中，并且其包含：

-編碼糖基轉移酶的重組基因，所述酶能夠將活化的糖核苷酸的糖殘基轉移至微生物中的受體，

-用于由蔗糖制備活化的糖核苷酸的生物合成路徑，和

-一種或多種編碼異源PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)的基因，優(yōu)選scr基因，由此所述細胞能夠使用蔗糖作為碳源、優(yōu)選作為主要碳源、更優(yōu)選作為唯一碳源，用于制備所述活化的糖核苷酸，并且作為能量來源、優(yōu)選作為主要能量來源、更優(yōu)選作為唯一能量來源，用于制備所述寡糖。

第二方面的轉基因微生物選自細菌和酵母，優(yōu)選細菌。細菌優(yōu)選為選自以下者：大腸桿菌(Escherichia coli)、芽孢桿菌(Bacillus spp.)(例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))、幽門彎曲桿菌(Campylobacter pylori)、幽門螺旋桿菌(helicobacter pylori)、根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、水生嗜熱鏈球菌(Thermophilus aquaticus)、莖瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitis)、乳桿菌屬(Lactobacillus spp.)、乳酸菌屬(Lactococcus spp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp.)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium spp.)、芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus spp.)、Micromomospora spp.、微球菌屬(Micrococcus spp.)、紅球菌屬(Rhodococcus spp.)、假單胞菌(Peudomonas)，其中優(yōu)選大腸桿菌。

而且，第二方面的轉基因細胞包含一種或多種內源或重組基因，其編碼一種或多種糖基轉移酶，所述酶能夠將活化的糖核苷酸的糖殘基轉移至內化的受體。異源核酸序列的來源可以是任何動物(包括人)或者植物、真核細胞比如那些來自于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、白色念珠菌(Candida albican)或者來自藻類的那些、原核細胞比如源自大腸桿菌、脆弱擬桿菌(Bacterioides fragilis)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium sp.)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、幽門彎曲桿菌(Campylobacter pylori)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、水生嗜熱鏈球菌(Thermophilus aquaticus)、莖瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)和腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的那些、或者病毒。糖基轉移酶或者通過基因或等同的DNA序列編碼的蛋白質表達的酶優(yōu)選為葡萄糖基轉移酶、半乳糖基轉移酶、N-乙酰葡糖胺基轉移酶、N-乙酰半乳糖胺基轉移酶、葡糖醛酸基轉移酶、木糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、巖藻糖基轉移酶、唾液酸基轉移酶等。在優(yōu)選的實施方式中，糖基轉移酶選自β-1,3-N-乙酰葡糖胺基-轉移酶、β-1,6-N-乙酰葡糖胺基-轉移酶、β-1,3-半乳糖基-轉移酶、β-1,4-半乳糖基-轉移酶、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺基-轉移酶、β-1,3-葡糖醛酸基-轉移酶、α-2,3-唾液酸基-轉移酶、α-2,6-唾液酸基-轉移酶、α-2,8-唾液酸基-轉移酶、α-1,2-巖藻糖基-轉移酶、α-1,3-巖藻糖基-轉移酶和α-1,4-巖藻糖基-轉移酶。更優(yōu)選地，糖基轉移酶選自β-1,3-N-乙酰葡糖胺基轉移酶、β-1,6-N-乙酰葡糖胺基轉移酶、β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-2,3-唾液酸基轉移酶、α-2,6-唾液酸基轉移酶、α-1,2-巖藻糖基轉移酶、α-1,3-巖藻糖基轉移酶和α-1,4-巖藻糖基轉移酶，其為來自參與構建HMO核結構以及巖藻糖基化的和/或唾液酸基化的HMO及其糖基衍生物的那些酶，其中苷元為在以上碳水化合物受體的基團處所定義的部分。

進而，本發(fā)明第二方面的轉基因微生物包括使外源碳水化合物受體、優(yōu)選乳酸、內化至用于糖基化的微生物中的轉運系統(tǒng)，以制備異體目的寡糖，優(yōu)選不會不利地影響細胞的基本功能或者破壞其完整性的寡糖。優(yōu)選地，碳水化合物在由轉運子蛋白、所謂的透性酶介導的主動轉運的幫助下被內化，所述轉運蛋白起到酶的作用，并且借此，微生物可以允許外源物質進入并在使其集中在細胞質中。特別地，乳糖透性酶(LacY)特異性地作用于半乳糖、簡單的半乳糖基二糖比如乳糖及其糖苷。轉基因微生物優(yōu)選缺乏任何可能使受體降解的酶活性(比如LacZ)。同樣，微生物不能使寡糖產物水解或降解。

此外，第二方面的轉基因微生物包含編碼磷酸烯醇丙酮酸(PEP)-依賴性的磷酸轉移酶(PTS)蔗糖利用系統(tǒng)的基因，即，細胞具有利用蔗糖分解代謝作為碳源和能量來源的能力。PTS系統(tǒng)是異源的(即，衍生自不同有機體，并通過常規(guī)重組DNA操作技術、優(yōu)選經(jīng)由表達載體轉移至宿主細胞)，并由scr或sac基因、優(yōu)選scr基因編碼。

優(yōu)選由轉基因微生物、優(yōu)選大腸桿菌、包含的scr基因為以下者：scrY、scrA、scrB和scrR。scrA基因編碼蔗糖轉運蛋白酶II^Scr，其從經(jīng)由主動轉運通過細胞膜的細胞外蔗糖和伴隨的磷酸化提供了細胞內蔗糖-6-磷酸。蔗糖特異性ScrY膜孔蛋白(由scrY編碼)促進蔗糖通過外膜的擴散。ScrB轉化酶(由scrB編碼)通過水解將累積的蔗糖-6-磷酸分解為葡萄糖-6-磷酸和果糖。果糖激酶ScrK(由scrK編碼)的存在不是關鍵性的，因為果糖可以通過細胞擁有的其他機制被磷酸化。阻遏蛋白ScrR(由scrR編碼)負向控制scrYAB基因的表達，并ScrR由蔗糖或果糖誘導。

在優(yōu)選的實施方式中，用質粒、更優(yōu)選通過雙質粒體系將異源scr基因引入微生物中，所述雙質粒體系中的一個包含scrA基因且另一個包含scrB基因。scrY、scrR基因可以由任一質粒攜帶

優(yōu)選地，第二方面的轉基因微生物在lac操縱子上具有缺失的或者不足的lacA基因。

還優(yōu)選的是，在轉基因微生物中還缺失lac阻遏子的lacl基因。

以上公開的轉基因微生物適用于從具有上述苷元的乳糖或乳糖苷來制備式1的寡糖

其中Y為OH或以上限定的非糖苷元，優(yōu)選為OH，

R₁為巖藻糖基或者H，

R₂為巖藻糖基或者H，

R₃選自H、唾液酸基、N-乙?；?乳糖胺基和乳-N-二糖基基團，其中N-乙?；?乳糖胺基基團可以攜帶有包含一個或多個N-乙酰基-乳糖胺基和/或一個或多個乳-N-二糖基基團的糖殘基；每個N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基基團可以被一個或多個唾液酸殘基和/或巖藻糖殘基取代，

R₄選自H、唾液酸基和N-乙?；?乳糖胺基基團，所述N-乙?；?乳糖胺基基團任選被包含一個或多個N-乙?；?乳糖胺基和/或一個或多個乳-N-二糖基基團的糖殘基取代；每個N-乙?；?乳糖胺基和乳-N-二糖基基團能夠被一個或多個唾液酸殘基和/或巖藻糖殘基取代，

條件是R₁、R₂、R₃和R₄基團中的至少一個與H不同。

優(yōu)選地，式1的寡糖為人乳寡糖(當Y為OH時)或其糖苷(當Y為非糖苷元時)，更優(yōu)選為人乳寡糖。

根據(jù)優(yōu)選的實施方式，轉基因微生物為LacZ^-、LacY⁺基因型或者LacZ^-、LacY⁺、Lacl^-基因型的大腸桿菌細胞，其包含：

-編碼N-乙?；?葡糖胺基轉移酶的重組基因，所述酶能夠將UDP-GlcNAc的GlcNAc轉移至內化的乳糖，

-任選的編碼半乳糖基轉移酶的重組基因，所述酶能夠將UDP-Gal的半乳糖殘基轉移至N-乙?；?葡糖胺基化的乳糖，

-一種或多種編碼通向UDP-GlcNAc及任選的UDP-Gal的生物合成路徑的基因，和

-包括scrY、scrA、scrB和scrR基因的異源PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)，以提供碳源以及能量來源，用于由細胞制備的UDP-GlcNAc和任選的UDP-Gal的生物合成。

特別地，異源scr簇不包括scrK。

更優(yōu)選地，N-乙?；?葡糖胺基轉移酶為β-1,3-N-乙?；咸前坊D移酶，并且細胞中不存在編碼半乳糖基轉移酶的基因。在此情況下，轉基因大腸桿菌主要制備出乳-N-三糖。

此外更加優(yōu)選的是，N-乙?；?葡糖胺基轉移酶為β-1,3-N-乙?；咸前坊D移酶，并且半乳糖基轉移酶為β-1,3-半乳糖基轉移酶。在此情況下，轉基因大腸桿菌主要制備出LNT。

仍更加優(yōu)選的是，N-乙?；?葡糖胺基轉移酶為β-1,3-N-乙?；咸前坊D移酶，并且半乳糖基轉移酶為β-1,4-半乳糖基轉移酶。在此情況下，轉基因大腸桿菌主要制備出LNnT。

根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，轉基因微生物為LacZ^-、LacY⁺基因型或者LacZ^-、LacY⁺、Lacl^-基因型的大腸桿菌細胞，其包含：

-編碼唾液酸基轉移酶的重組基因，所述酶能夠將GDP-Fuc的巖藻糖殘基轉移至內化的乳糖，和

-一種或多種編碼通向GDP-Fuc的生物合成路徑的基因，

-包括scrY、scrA、scrB和scrR的異源PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)，以提供蔗糖作為碳源以及能量來源，用于通過細胞的GDP-Fuc的生物合成。

特別地，異源scr簇不包括scrK。

更優(yōu)選地，巖藻糖基轉移酶為α-1,2-巖藻糖基轉移酶。在此情況下轉基因大腸桿菌主要制備出2’-FL。

另外更加優(yōu)選的是，巖藻糖基轉移酶為α-1,3-巖藻糖基轉移酶。在此情況下轉基因大腸桿菌主要制備出3’-FL。

仍更加優(yōu)選的是，細胞中存在有兩種巖藻糖基轉移酶：α-1,2-巖藻糖基轉移酶和α-1,3-巖藻糖基轉移酶。在此情況下轉基因大腸桿菌主要制備出DFL。

根據(jù)另一優(yōu)選的實施方式，轉基因微生物為LacZ^-、LacY⁺基因型或者LacZ^-、LacY⁺、Lacl^-基因型的大腸桿菌細胞，其包含：

-編碼唾液酸基轉移酶的重組基因，所述酶能夠將CMP-唾液酸的唾液酸殘基轉移至內化的乳糖，

-一種或多種編碼通向CMP-唾液酸的生物合成路徑的基因，和

-包括scrY、scrA、scrB和scrR的異源PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)，以提供蔗糖作為碳源以及能量來源，用于由細胞制備的CMP-唾液酸的生物合成。

特別地，異源scr簇不包括scrK。

更優(yōu)選地，唾液酸基轉移酶為α-2,3-唾液酸基轉移酶。在此情況下轉基因大腸桿菌主要制備出3’-SL。

另外更加優(yōu)選的是，唾液酸基轉移酶為α-2,6-唾液酸基轉移酶。在此情況下轉基因大腸桿菌主要制備出6’-SL。

根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，轉基因微生物為LacZ^-、LacY⁺基因型或者LacZ^-、LacY⁺、Lacl^-基因型的大腸桿菌細胞，其包含：

-編碼唾液酸基轉移酶的重組基因，所述酶能夠將CMP-唾液酸的唾液酸殘基轉移至任選被巖藻糖基化的內化的乳糖，

-編碼巖藻糖基轉移酶的重組基因，所述酶能夠將GDP-Fuc的巖藻糖殘基轉移至任選被唾液酸基化的內化的乳糖，

-一種或多種編碼通向CMP-唾液酸的生物合成路徑的基因，

-一種或多種編碼通向GDP-Fuc的生物合成路徑的基因，和

-包括scrY、scrA、scrB和scrR的異源PTS-依賴性蔗糖利用系統(tǒng)，以提供蔗糖作為碳源以及能量來源，用于由細胞制備的CMP-唾液酸和GDP-Fuc的生物合成。

特別地，異源scr簇不包括scrK。

更優(yōu)選地，唾液酸基轉移酶為α-2,3-唾液酸基轉移酶且?guī)r藻糖基轉移酶為α-1,3-巖藻糖基轉移酶。在此情況下，轉基因大腸桿菌主要制備出3’-唾液酸基-3-巖藻糖基乳糖。

實施例

實施例1：利用大腸桿菌由甘油或蔗糖制備LNnT的比較試驗

細菌菌株：

兩種菌株均由大腸桿菌(Escherichia coli)K12菌株DH1通過以下方法構建：使lacZ nanKETA lacA melA wcaJ mdoH基因缺失，并且插入Plac啟動子，保留參與UDP-GlcNAc和UDP-Gal生物合成的基因，所述菌株從德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganism)獲得(參照DSM 5346)。甘油利用菌株(菌株I)包含pBBR3-lgtA-tet質粒以及pBS-galT-amp質粒，所述pBBR3-lgtA-tet質粒攜帶有β-1,3-N-乙?；咸前坊D移酶的腦膜炎奈瑟菌(N.Meningitidis)的lgtA基因和四環(huán)素抗性基因，所述pBS-galT-amp質粒攜帶有β-1,4-半乳糖基轉移酶的幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)的galT基因和氨芐青霉素抗性基因。蔗糖利用菌株(菌株II)包含以下兩種質粒：

-pBS-scrBR-galT-amp，其是攜帶有編碼β-1,4-半乳糖基轉移酶的galT基因、編碼蔗糖阻遏子的scrR基因、編碼蔗糖-6-磷酸水解酶的scrB基因以及氨芐青霉素抗性基因的pUC衍生物；

-pBBR3-scrYA-lgtA-tet，其是攜帶有編碼β-1,3-N-乙?；咸前坊D移酶的lgtA基因、編碼PTS系統(tǒng)蔗糖特異性EIIBC組分的scrA基因、編碼蔗糖膜孔蛋白的scrY基因和四環(huán)素抗性基因的pBBR1-MCS3衍生物。

發(fā)酵步驟：

將葡萄糖、甘油、蔗糖和乳糖各自在120℃下進行滅菌。將異丙基巰基β-D-半乳糖苷(IPTG)過濾滅菌。

在包含大約0.9升的礦物培養(yǎng)基的3升發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)(Samain等人的J.Biotechnol.72,33(1999)；對于蔗糖系統(tǒng)而言不包含抗生素)。溫度保持在33℃，用28％的NH₄OH將pH調節(jié)至6.8。將包括在LB培養(yǎng)基(20ml)或者M9培養(yǎng)基(20ml)中的生產菌株的接種物加入到發(fā)酵罐中，所述LB培養(yǎng)基用于菌株I并補充有氨芐青霉素和四環(huán)素，所述M9培養(yǎng)基用于菌株II并補充有蔗糖。指數(shù)級生長階段以接種開始，直到初始加入到培養(yǎng)基中的碳源(用于菌株I的葡萄糖或用于菌株II的蔗糖，≈17.5g/l)耗盡而結束。然后在開始用碳源(500g/l溶液，對菌株I而言4.5g/h甘油，對菌株II而言3g/l的蔗糖)喂養(yǎng)之前加入乳糖溶液(70g乳糖/500ml水)。還加入誘導劑(異丙基巰基-β-D-半乳糖苷，IPTG，1～2ml 50mg/ml的溶液)。在細胞死亡之后(LNnT滴度：45g/l)甘油喂養(yǎng)的發(fā)酵(菌株I)持續(xù)90小時。在116小時之后蔗糖喂養(yǎng)的發(fā)酵(菌株II)產生了56g/l的LNnT濃度。

實施例2：利用大腸桿菌由蔗糖制備2’-FL

細菌菌株：

兩種菌株均由大腸桿菌(Escherichia coli)K12菌株DH1通過以下方法構建：使lacZ nanKETA lacA melA wcaJ mdoH基因缺失，并且在gmd基因上游插入Plac啟動子，所述菌株從德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganism)獲得(參照DSM 5346)。此外，菌株包含以下兩種質粒：

-pBS-futC-scrBR-amp，其是攜帶有編碼α-1,2-巖藻糖基轉移酶的futC基因、編碼蔗糖阻遏子的scrR基因、編碼蔗糖-6-磷酸水解酶的scrB基因以及氨芐青霉素抗性基因的pUC衍生物；

-pBBR3-GMAB-scrYA-tet，其是攜帶有參與GDP-Fuc生物合成的manB、manC、gmd和wcaG基因，編碼PTS系統(tǒng)蔗糖特異性EIIBC組分的scrA基因、編碼蔗糖膜孔蛋白的scrY基因和四環(huán)素抗性基因的pBBR1-MCS3衍生物。

發(fā)酵步驟：

將蔗糖和乳糖各自在120℃下進行滅菌。將異丙基巰基β-D-半乳糖苷(IPTG)過濾滅菌。

在包含大約0.9升的礦物培養(yǎng)基的2升發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)(Samain等人的J.Biotechnol.72,33(1999)；不包含抗生素)。溫度保持在33℃，用28％的NH₄OH將pH調節(jié)至6.8。將包括在M9培養(yǎng)基(20ml)中的生產菌株的接種物加入到發(fā)酵罐中，所述M9培養(yǎng)基補充有蔗糖。指數(shù)級生長階段以接種開始，直到初始加入到培養(yǎng)基中的蔗糖(≈22g/l)耗盡而結束。然后加入誘導劑(異丙基巰基-β-D-半乳糖苷，IPTG，1～2ml50mg/ml的溶液)。用乳糖+蔗糖(每升水中160g乳糖+500g蔗糖)的喂養(yǎng)以9ml/h的速率開始進行6小時，然后以6ml/h的速率繼續(xù)進行115小時。在發(fā)酵結束時上清液中的2’-FL的濃度大約為100g/l。