被描述為“附加器官”的腸道微生物群落(或腸道微生物叢)通過(guò)行使眾多生物學(xué)功能來(lái)發(fā)揮對(duì)于宿主有益的關(guān)鍵作用，例如有助于消化的效率、底物的代謝、針對(duì)病原體的斗爭(zhēng)或者免疫應(yīng)答的確立和穩(wěn)態(tài)。不同腸道細(xì)菌種群之間的不平衡具有有時(shí)有害的回應(yīng)，其導(dǎo)致各種不同的病理學(xué)狀況(例如，慢性炎性疾病，或代謝病癥，包括肥胖癥或者2型糖尿病)的發(fā)展。這些不平衡還潛在地牽涉癌癥的發(fā)展和行為綜合征的確立。因此，維持腸道微生物叢的平衡是必需的：影響其組成和/或其活性將會(huì)是用于治療上述綜合征的一個(gè)主要成功手段。本著該精神，使用所謂“益生的”細(xì)菌菌株來(lái)干預(yù)由所述微生物叢所影響的病理學(xué)狀況的想法體現(xiàn)了其全部意義。

2001年由世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)定義，益生菌是“當(dāng)以足夠的量攝入時(shí)對(duì)于健康產(chǎn)生超過(guò)傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)之外的正面效應(yīng)的活微生物”。

至于本發(fā)明，其屬于允許優(yōu)化幼年生長(zhǎng)或者在營(yíng)養(yǎng)不良的背景下恢復(fù)正常的幼年生長(zhǎng)的條件重建。

因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于提出新的組合物，其允許在已經(jīng)經(jīng)歷或正經(jīng)歷營(yíng)養(yǎng)不良(尤其是進(jìn)食不足和/或同化不良)的人或動(dòng)物受試者中促進(jìn)幼年生長(zhǎng)或者重建正常的幼年生長(zhǎng)。

本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)在于提供這樣的組合物，其基于使用具有腸道向性的細(xì)菌菌株，尤其是共生的或者作為益生菌可接受的菌株。

本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)在于提供這樣的組合物，其還可以被納入在治療背景中。

本發(fā)明的另外一個(gè)目標(biāo)在于提供益生性處理或治療性處理的方法。

本發(fā)明的另外一個(gè)目標(biāo)在于提供這樣的組合物和方法，其允許支持按照現(xiàn)行法規(guī)(尤其是歐洲法規(guī))的健康和/或營(yíng)養(yǎng)主張。

本發(fā)明基于這樣的事實(shí)，即某些在動(dòng)物物種中具有腸道向性的細(xì)菌菌株具有在經(jīng)歷營(yíng)養(yǎng)不良(尤其是進(jìn)食不足或同化不良)的該同一物種或另一物種的受試者中促進(jìn)或重建幼年生長(zhǎng)的效應(yīng)。因此，已經(jīng)能夠證明乳桿菌屬(Lactobacillus)的細(xì)菌菌株在果蠅模型中和在與營(yíng)養(yǎng)缺乏型營(yíng)養(yǎng)飲食制度相聯(lián)合的小鼠模型中均能夠促進(jìn)幼年生長(zhǎng)，和此外，已經(jīng)能夠在這些在小鼠中的結(jié)果與在這些條件下用這些細(xì)菌處理的小鼠中的IGF-1血清滴度的增加之間建立聯(lián)系。

因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于包含至少一種具有腸道向性的細(xì)菌菌株(特別是乳酸細(xì)菌)的組合物，所述組合物用于為了在營(yíng)養(yǎng)不良的情況下促進(jìn)幼年生長(zhǎng)而進(jìn)行使用。營(yíng)養(yǎng)不良的概念集合了進(jìn)食不足、進(jìn)食過(guò)量和同化不良。本發(fā)明特別地針對(duì)進(jìn)食不足和/或同化不良。本發(fā)明優(yōu)選地針對(duì)進(jìn)食不足。所述組合物的適應(yīng)癥將可以是治療性的或健康的，例如藥物，或者是營(yíng)養(yǎng)性的，例如益生制劑。

具有“腸道向性”的細(xì)菌是指具有通過(guò)胃屏障的能力和能夠在腸中堅(jiān)持的細(xì)菌。

按照本發(fā)明的一個(gè)有利的特征，所述細(xì)菌可以在用根據(jù)本發(fā)明的組合物進(jìn)行處理的人或動(dòng)物中促進(jìn)IGF-1的產(chǎn)生。

本發(fā)明尤其提出了屬于下列科的細(xì)菌菌株：乳桿菌科(Lactobacillaceae)、鏈球菌科(Streptoccaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)。依照一種方式，本發(fā)明使用一種或多種乳桿菌屬菌株，特別是下列物種之一：德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、類干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)。

更特別地，所述細(xì)菌為屬于植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌、類干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌這些物種的細(xì)菌。依照一種方式，所述菌株選自植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌這些物種。

依照一個(gè)實(shí)施方案，所述細(xì)菌菌株選自植物乳桿菌WJL、植物乳桿菌G821、干酪乳桿菌ATCC 393、干酪乳桿菌L919、類干酪乳桿菌ATCC25302、類干酪乳桿菌Shirota、發(fā)酵乳桿菌ATCC9338、鼠李糖乳桿菌L900、鼠李糖乳桿菌L908、鼠李糖乳桿菌GG。依照一種方式，所述菌株選自植物乳桿菌WJL、植物乳桿菌G821、干酪乳桿菌ATCC 393、干酪乳桿菌L919、發(fā)酵乳桿菌ATCC9338。

在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌是植物乳桿菌這一物種的細(xì)菌，例如菌株WJL，或菌株G821，其于2015年5月11日以登記號(hào)CNCM I-4979保藏于國(guó)家微生物保藏中心(Collection Nationale de Culture de Microorganismes)(Institut Pasteur)。已經(jīng)通過(guò)植物乳桿菌NIZO2877這一菌株的實(shí)驗(yàn)進(jìn)化(即通過(guò)天然變體的積累和選擇)而獲得了菌株G821。

依照一種方式，根據(jù)本發(fā)明的組合物包含至少一種從這些群中選擇的細(xì)菌菌株，其具有所要求的特性并且允許促進(jìn)或重建幼年生長(zhǎng)，盡管有著營(yíng)養(yǎng)不良的插曲。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含多于一種符合本發(fā)明的需求的細(xì)菌菌株。尤其，所述組合物包含選自相同物種或不同物種的2種或更多種這些細(xì)菌菌株。

依照一個(gè)令人感興趣的實(shí)施方案，所述細(xì)菌為植物乳桿菌。合適的菌株為植物乳桿菌G821和植物乳桿菌WJL(Eun-Kyoung Kim等人,Genome Announcements,2013年11/12月,vol.1,no.6e00937-13,GenBank AUTE00000000,Lactobacillus plantarum WJL,whole genome shotgun sequencing project)。該菌株WJL最初已分離出并且可以從果蠅中分離(JH Ryu等人,Science 2008,319:777-782)。

合適菌株的其他例子為下列：干酪乳桿菌ATCC 393、干酪乳桿菌L919(Koryszewska-Baginska A.等人,2013年9月26日,Genome Announc)、類干酪乳桿菌ATCC25302、類干酪乳桿菌Shirota(Yuki N等人,Int J Food Microbiol.1999年4月1日,48(1):51-7)、發(fā)酵乳桿菌ATCC9338、鼠李糖乳桿菌L900(Aleksandrzak-Piekarczyk T.等人,Genome Announc,2013年8月15日)、鼠李糖乳桿菌L908(Koryszewska-Baginska A.等人,2014年2月20日,Genome Announc)、鼠李糖乳桿菌GG(Kankainen M.等人,Proc Natl Acad Sci USA,2009年10月6日)。

因此，本發(fā)明在技術(shù)上提供了教導(dǎo)，即具有腸道向性的細(xì)菌菌株促進(jìn)幼年生長(zhǎng)，尤其是在營(yíng)養(yǎng)不良的(人或動(dòng)物)患者中。但是，本發(fā)明并不局限于該教導(dǎo)，它還向技術(shù)人員提供可靠地測(cè)定對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)有用的細(xì)菌菌株。不同的標(biāo)準(zhǔn)可以基于測(cè)試，其中單獨(dú)地或相聯(lián)合地進(jìn)行使用。在這些標(biāo)準(zhǔn)中，將會(huì)注意到在模型動(dòng)物(例如小鼠)中的IGF-1血清水平、在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中的幼蟲(chóng)生長(zhǎng)、模型小鼠的生長(zhǎng)(例如通過(guò)股骨大小或動(dòng)物大小的獲取來(lái)舉例說(shuō)明)。在這些標(biāo)準(zhǔn)或相似標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)之上，對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)可能的是，制定這樣的測(cè)試，其比較在營(yíng)養(yǎng)不良的條件下在待測(cè)試細(xì)菌存在或不存在下所飼養(yǎng)的個(gè)體。通過(guò)下述方式，本發(fā)明還提供了更多：提出無(wú)菌動(dòng)物模型和在待測(cè)試細(xì)菌存在或不存在下的動(dòng)物飼養(yǎng)，從而使得能夠?qū)y(cè)試集中在所測(cè)試的菌株的內(nèi)在特性的分析上并因此擺脫常規(guī)動(dòng)物的常駐腸道微生物叢在功能測(cè)試的背景下可能具有的效應(yīng)。由此得到關(guān)于所測(cè)試的菌株的功能潛力的測(cè)試的增加的可預(yù)測(cè)性。

“無(wú)菌(的)”生物是指在沒(méi)有微生物并因此沒(méi)有腸道微生物區(qū)系的環(huán)境中飼養(yǎng)的生物(例如果蠅、小鼠)。

“單菌(的)”生物是指在單一微生物存在下進(jìn)行飼養(yǎng)并因此攜帶該單一微生物作為腸道微生物區(qū)系的相關(guān)聯(lián)的無(wú)菌生物(例如果蠅、小鼠)。

依照本發(fā)明的一個(gè)特征，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌菌株的特征在于，它們對(duì)于這樣的測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)或者已通過(guò)使用這樣的測(cè)試而被選擇，在所述測(cè)試中將在缺乏酵母(并因此缺乏蛋白質(zhì))的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上來(lái)自無(wú)菌果蠅的幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)與在常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基通常至少包含植物粉，典型地玉米粉，滅活酵母，典型地啤酒酵母或面包酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))，瓊脂，和水。缺乏滅活酵母的培養(yǎng)基不允許果蠅幼蟲(chóng)的最佳的胚胎后(即幼年)發(fā)育，如已經(jīng)在G.Storelli等人,Cell Metabolism 14,403-414,2011中所報(bào)告的。此外，用待測(cè)試細(xì)菌接種一組胚胎，這允許將從胚胎出現(xiàn)的幼蟲(chóng)與待測(cè)試細(xì)菌相關(guān)聯(lián)。因此，可以檢測(cè)該細(xì)菌是否能夠促進(jìn)或允許幼年生長(zhǎng)，盡管是缺乏酵母的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。

所述果蠅測(cè)試典型地以下述方式來(lái)進(jìn)行：

-擁有一批來(lái)自無(wú)菌的黑腹果蠅親本(例如，果蠅yw這一株系，或任何其他所謂“野生型”的株系)的胚胎；

-在第1天：在包含玉米粉、瓊脂和水且缺乏酵母的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上將這些胚胎分配成至少2個(gè)組(40個(gè)胚胎，以三次重復(fù)實(shí)施，對(duì)于總共120個(gè)胚胎/組)，此外將所述胚胎組之一用在鹽水緩沖液(例如PBS)中的大約10⁸CFU的待測(cè)試細(xì)菌的懸浮液進(jìn)行接種，這形成單菌組，另一組形成無(wú)菌組，在大約25℃下進(jìn)行飼養(yǎng)直至第7天；典型地，所述培養(yǎng)基由7.14g的瓊脂、80g的玉米粉和6g的滅活酵母(對(duì)于1升的培養(yǎng)基而言)組成，將所述培養(yǎng)基在沸水中煮10分鐘，然后冷卻；典型地，不缺乏滅活酵母的相同的培養(yǎng)基包含50g的滅活酵母；

-在第7天：從每個(gè)組中回收至少60只來(lái)自經(jīng)接種或未接種的胚胎的果蠅幼蟲(chóng)(分別為單菌幼蟲(chóng)和無(wú)菌幼蟲(chóng))，對(duì)它們施行快速的熱休克(例如5秒鐘；典型地，將幼蟲(chóng)在加熱至100℃的板上放置5秒鐘；這涉及殺死幼蟲(chóng)而不使其變形以便使得能夠測(cè)量其大小)；

-測(cè)定每個(gè)組的幼蟲(chóng)的長(zhǎng)度平均值，并比較所獲得的平均值；

-如果單菌組的幼蟲(chóng)的長(zhǎng)度平均值以下述程度大于無(wú)菌組的幼蟲(chóng)的長(zhǎng)度平均值，那么認(rèn)為所測(cè)試的細(xì)菌菌株對(duì)于所述測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)：在對(duì)于所述兩個(gè)組的幼蟲(chóng)的整套大小數(shù)據(jù)進(jìn)行的Mann-Whitney統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)中具有小于或等于0.001，優(yōu)選地小于或等于0.0001的p值。

因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于包含至少一種具有腸道向性的細(xì)菌菌株(特別是乳酸細(xì)菌)的組合物，所述組合物用于為了在營(yíng)養(yǎng)不良的情況下促進(jìn)幼年生長(zhǎng)而進(jìn)行使用，其中所述細(xì)菌菌株對(duì)于上面所描述的在果蠅上的測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)。作為例子，可以提及下列菌株：植物乳桿菌WJL、植物乳桿菌G821、干酪乳桿菌ATCC 393、干酪乳桿菌L919、類干酪乳桿菌ATCC25302、類干酪乳桿菌Shirota、發(fā)酵乳桿菌ATCC9338、鼠李糖乳桿菌L900、鼠李糖乳桿菌L908、鼠李糖乳桿菌GG。其他菌株可以從具有腸道向性的細(xì)菌中和尤其是從上面提及的物種中鑒定出來(lái)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用菌株WJL或具有“明顯的”效應(yīng)的任何其他菌株(例如，干酪乳桿菌ATCC 393、發(fā)酵乳桿菌ATCC 9338、類干酪乳桿菌ATCC 25302)作為參照菌株以便鑒定和選擇這樣的細(xì)菌菌株，其具有“明顯的”對(duì)于幼年生長(zhǎng)的效應(yīng)，即與該參照菌株例如WJL的效應(yīng)接近的效應(yīng)(并非顯著地不同于參照菌株例如WJL的效應(yīng))，或者“強(qiáng)的”對(duì)于幼年生長(zhǎng)的效應(yīng)(顯著地大于參照菌株例如WJL的效應(yīng))。

為此，將所述果蠅測(cè)試(包括60只幼蟲(chóng)/條件)應(yīng)用于參照菌株例如WJL和待測(cè)試菌株(平行地，優(yōu)選地或者可以擁有對(duì)于參照菌株例如WJL事先產(chǎn)生的參照數(shù)據(jù)，例如在實(shí)施例中所給出的數(shù)據(jù))。然后，比較關(guān)于所述兩個(gè)菌株而獲得的平均值。如果單菌組的幼蟲(chóng)的長(zhǎng)度平均值并不顯著地不同于參照組(例如WJL)的幼蟲(chóng)的長(zhǎng)度平均值，那么認(rèn)為所測(cè)試的細(xì)菌菌株為具有明顯的效應(yīng)的菌株，其中在對(duì)于整套數(shù)據(jù)進(jìn)行的Mann-Whitney統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)中具有大于0.001的p值。如果關(guān)于待測(cè)試菌株的所述平均值顯著地大于關(guān)于參照菌株例如WJL的平均值，那么該效應(yīng)是強(qiáng)的，這是當(dāng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的p值小于或等于0.001，優(yōu)選地小于或等于0.0001時(shí)的情況。如果關(guān)于待測(cè)試菌株的所述平均值顯著地小于關(guān)于參照菌株例如WJL的平均值，那么該效應(yīng)被視為中間的，這是當(dāng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的p值小于或等于0.001，優(yōu)選地小于或等于0.0001時(shí)的情況。

因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于包含至少一種具有腸道向性的細(xì)菌菌株(特別是乳酸細(xì)菌)的組合物，所述組合物用于為了在營(yíng)養(yǎng)不良的情況下促進(jìn)幼年生長(zhǎng)而進(jìn)行使用，其中所述細(xì)菌菌株在上面所描述的果蠅模型中對(duì)于生長(zhǎng)具有明顯或強(qiáng)的效應(yīng)。作為例子，可以提及下列菌株：植物乳桿菌WJL、植物乳桿菌G821、干酪乳桿菌ATCC 393、干酪乳桿菌L919、類干酪乳桿菌ATCC25302、類干酪乳桿菌Shirota、發(fā)酵乳桿菌ATCC9338、鼠李糖乳桿菌L900、鼠李糖乳桿菌L908、鼠李糖乳桿菌GG。其他菌株可以從具有腸道向性的細(xì)菌中和尤其是從上面提及的物種中鑒定出來(lái)。

本發(fā)明的目標(biāo)尤其在于包含具有腸道向性的細(xì)菌菌株(其尤其屬于上面提及的科、屬或物種，優(yōu)選地屬于乳桿菌屬)的組合物，所述組合物用于旨在在營(yíng)養(yǎng)不良的情況下促進(jìn)幼年生長(zhǎng)的用途，其中所述細(xì)菌菌株對(duì)于下述測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)：

-擁有一批無(wú)菌的黑腹果蠅親本的胚胎；

-在第1天：在包含玉米粉、瓊脂和水且缺乏酵母的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上將這些胚胎分配成至少2個(gè)組(40個(gè)胚胎，以三次重復(fù)實(shí)施，即120個(gè)胚胎/組)，將所述胚胎組之一用在鹽水緩沖液中的大約10⁸CFU的所述細(xì)菌的懸浮液進(jìn)行接種，這形成測(cè)試單菌組，將另一組用在鹽水緩沖液中的大約10⁸CFU的參照細(xì)菌即植物乳桿菌WJL、干酪乳桿菌ATCC 393、發(fā)酵乳桿菌ATCC 9338或類干酪乳桿菌(L.paracasei)ATCC 25302的懸浮液進(jìn)行接種，從而形成參照單菌組，在大約25℃下進(jìn)行這兩個(gè)組的飼養(yǎng)直至第7天；

-在第7天：從每個(gè)組中回收至少60只果蠅幼蟲(chóng)，對(duì)它們施行熱休克；

-測(cè)定每個(gè)組的幼蟲(chóng)的長(zhǎng)度平均值，并比較所獲得的平均值；

-所述細(xì)菌菌株相對(duì)于參照細(xì)菌而言具有強(qiáng)的效應(yīng)，其中用該細(xì)菌菌株的測(cè)試單菌組的幼蟲(chóng)的長(zhǎng)度平均值顯著地大于關(guān)于用參照菌株的單菌組的平均值，其中在對(duì)于所述兩個(gè)組的幼蟲(chóng)的整套大小數(shù)據(jù)進(jìn)行的Mann-Whitney統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)中p值小于或等于0.001，優(yōu)選地小于或等于0.0001。

根據(jù)本發(fā)明，還可能的是，通過(guò)使用無(wú)菌小鼠模型來(lái)測(cè)定具有腸道向性的細(xì)菌菌株是否允許在營(yíng)養(yǎng)不良的情況下促進(jìn)生長(zhǎng)，所述無(wú)菌小鼠模型使得能夠與微生物叢的不存在和/或與參照細(xì)菌菌株的存在相比較地實(shí)施在待測(cè)試細(xì)菌存在下小鼠骨骼生長(zhǎng)的監(jiān)測(cè)。該模型可以以最初的意圖進(jìn)行使用或者在對(duì)于果蠅測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)的菌株上進(jìn)行使用。

依照本發(fā)明的一個(gè)特征，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌菌株的特征在于，它們對(duì)于下面的骨骼生長(zhǎng)測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)：

-從相同的小鼠品系(典型地，Balb/c小鼠)開(kāi)始，建立無(wú)菌親本小鼠品系和單菌親本小鼠品系(與待測(cè)試細(xì)菌相關(guān)聯(lián)的)，并且產(chǎn)生幼年鼠，將所述幼年鼠與親本一起用常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行飼養(yǎng)直至其斷奶(在第21天)；為了形成單菌幼年鼠組，使用與待測(cè)試細(xì)菌菌株單相關(guān)聯(lián)的親本；

-在第21天：擁有來(lái)自這兩個(gè)品系中每一個(gè)品系的8只經(jīng)斷奶的幼年鼠，從而形成單菌組和無(wú)菌組，并且將它們以缺乏蛋白質(zhì)(8％)和脂質(zhì)(2.5％)的營(yíng)養(yǎng)飲食制度進(jìn)行飼養(yǎng)；典型地，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)飲食制度包含23％的蛋白質(zhì)和5％的脂質(zhì)；

-在第56天：通過(guò)對(duì)每個(gè)個(gè)體從口鼻部端部至尾巴基部進(jìn)行測(cè)量，測(cè)定關(guān)于所考慮的組的小鼠的大小平均值；另一種可能的測(cè)量在于處死個(gè)體、從中取出股骨和測(cè)量這些股骨；

-如果單菌組的個(gè)體和/或股骨的平均大小分別以下述程度大于無(wú)菌組的個(gè)體和/或股骨的平均大小，那么認(rèn)為所述乳酸細(xì)菌菌株對(duì)于所述測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)：在Tukey統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)中具有小于或等于0.05的p值。

因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于包含至少一種具有腸道向性的細(xì)菌菌株(特別是乳酸細(xì)菌)的組合物，所述組合物用于為了在營(yíng)養(yǎng)不良的情況下促進(jìn)幼年生長(zhǎng)而進(jìn)行使用，其中所述細(xì)菌菌株對(duì)于在小鼠上的骨骼生長(zhǎng)測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)。果蠅測(cè)試允許更快速的篩選，因而通常也擁有在果蠅上的測(cè)試，并且所述細(xì)菌菌株對(duì)于果蠅測(cè)試和骨骼生長(zhǎng)測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)。作為例子，可以提及下述菌株：植物乳桿菌WJL。其他菌株可以從具有腸道向性的細(xì)菌中，和尤其是從上面提及的物種和菌株中，尤其是從植物乳桿菌G821、干酪乳桿菌ATCC 393、干酪乳桿菌L919、類干酪乳桿菌ATCC25302、類干酪乳桿菌Shirota、發(fā)酵乳桿菌ATCC9338、鼠李糖乳桿菌L900、鼠李糖乳桿菌L908、鼠李糖乳桿菌GG這些菌株中鑒定出來(lái)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用菌株WJL或具有“明顯的”效應(yīng)的其他菌株作為參照菌株以便鑒定和選擇這樣的細(xì)菌菌株，其具有“明顯的”對(duì)于幼年生長(zhǎng)的效應(yīng)，即與該參照菌株例如WJL的效應(yīng)接近的效應(yīng)(并非顯著地不同于參照菌株例如WJL的效應(yīng))，或者“強(qiáng)的”對(duì)于幼年生長(zhǎng)的效應(yīng)(顯著地大于參照菌株例如WJL的效應(yīng))。

為此，將所述小鼠測(cè)試(包括8只小鼠/條件)應(yīng)用于參照菌株例如WJL和待測(cè)試菌株(平行地，優(yōu)選地或者可以擁有對(duì)于菌株WJL事先產(chǎn)生的參照數(shù)據(jù)，例如在實(shí)施例中所給出的數(shù)據(jù))。然后，比較關(guān)于所述兩個(gè)菌株而獲得的平均值。如果單菌組的個(gè)體和/或股骨的平均大小的平均值并不顯著地不同于關(guān)于參照組(例如WJL)的相應(yīng)的平均值，那么認(rèn)為所測(cè)試的細(xì)菌菌株為具有明顯的效應(yīng)的菌株，其中在Tukey統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)中具有大于0.05的p值。如果關(guān)于待測(cè)試菌株的所述平均值顯著地大于關(guān)于參照菌株例如WJL的平均值，那么該效應(yīng)是強(qiáng)的，這是當(dāng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的p值小于或等于0.05時(shí)的情況。如果關(guān)于待測(cè)試菌株的所述平均值(其已在前面的測(cè)試中相關(guān)于無(wú)菌小鼠進(jìn)行了描述)顯著地小于關(guān)于參照菌株例如WJL的平均值，那么該效應(yīng)被視為中間的，這是當(dāng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的p值小于或等于0.05時(shí)的情況。

根據(jù)本發(fā)明的組合物優(yōu)選地將會(huì)包含具有這樣的明顯或強(qiáng)的效應(yīng)的細(xì)菌菌株。

根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌菌株的特征可以在于，它們對(duì)于血清IGF-1水平具有正面影響。因此，在無(wú)菌小鼠模型的基礎(chǔ)之上，可能的是證明，用具有低的蛋白質(zhì)含量的培養(yǎng)基但在細(xì)菌存在下進(jìn)行飼養(yǎng)的小鼠(單菌小鼠)具有更大的生長(zhǎng)和同時(shí)更高的血清IGF-1水平，相對(duì)于用該缺乏蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基并且在細(xì)菌不存在下進(jìn)行飼養(yǎng)的這些相同小鼠(無(wú)菌小鼠)而言。這使得能夠提出這樣的測(cè)試，其使得能夠測(cè)定細(xì)菌菌株是否具有增加IGF-1血清水平的潛力，該測(cè)試可以與骨骼生長(zhǎng)測(cè)試相聯(lián)合地進(jìn)行應(yīng)用以便明確或提煉所述菌株在該幼年生長(zhǎng)背景下的效應(yīng)，或者以最初的意圖進(jìn)行應(yīng)用。

在該情況下，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌菌株的特征在于，它們對(duì)于下面的血清IGF-1水平測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)：

-從相同的無(wú)菌小鼠品系(典型地，Balb/c小鼠)開(kāi)始，建立無(wú)菌親本小鼠品系和單菌親本小鼠品系(與待測(cè)試細(xì)菌相關(guān)聯(lián)的)，并且產(chǎn)生幼年鼠，將所述幼年鼠與親本一起用常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行飼養(yǎng)直至其斷奶(第21天)；為了形成單菌幼年鼠組，使用與待測(cè)試細(xì)菌菌株單相關(guān)聯(lián)的親本；

-在第21天：擁有來(lái)自這兩個(gè)品系中每一個(gè)品系的8只經(jīng)斷奶的幼年鼠，從而形成單菌組和無(wú)菌組，并且將它們以缺乏蛋白質(zhì)(8％)和脂質(zhì)(2.5％)的營(yíng)養(yǎng)飲食制度進(jìn)行飼養(yǎng)；典型地，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)飲食制度包含23％的蛋白質(zhì)和5％的脂質(zhì)；

-在第56天：抽取每個(gè)組的幼年鼠的血液，并測(cè)定關(guān)于每個(gè)組的IGF-1的平均血清水平；IGF-1血清水平的該測(cè)量?jī)?yōu)選地在經(jīng)稀釋的(1:25)血清上進(jìn)行；優(yōu)選地使用IGF-1檢測(cè)的商業(yè)ELISA試劑盒，其中依照制造商的使用說(shuō)明書(shū)；

-如果單菌組的IGF-1的平均血清水平以下述程度大于無(wú)菌組的平均血清水平，那么認(rèn)為所述乳酸細(xì)菌菌株對(duì)于所述測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)：在Tukey統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)中具有小于或等于0.05的p值。

因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于包含至少一種具有腸道向性的細(xì)菌菌株(特別是乳酸細(xì)菌)的組合物，所述組合物用于為了在營(yíng)養(yǎng)不良的情況下促進(jìn)幼年生長(zhǎng)而進(jìn)行使用，其中所述細(xì)菌菌株增加血清IGF-1水平。它尤其是對(duì)于上面所描述的在小鼠上的測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)菌菌株。

本發(fā)明的目標(biāo)還在于包含至少一種具有腸道向性的細(xì)菌菌株(特別是乳酸細(xì)菌)的組合物，所述組合物用于為了在營(yíng)養(yǎng)不良的情況下促進(jìn)幼年生長(zhǎng)而進(jìn)行使用，其中所述細(xì)菌菌株對(duì)于在小鼠上的骨骼生長(zhǎng)測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)并在這些相同小鼠中增加IGF-1血清水平，所述菌株尤其還對(duì)于在果蠅上的測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)。

作為例子，可以提及下述菌株：植物乳桿菌WJL。其他菌株可以從具有腸道向性的細(xì)菌中，和尤其是從上面提及的物種和菌株中，尤其是從植物乳桿菌G821、干酪乳桿菌ATCC 393、干酪乳桿菌L919、類干酪乳桿菌ATCC25302、類干酪乳桿菌Shirota、發(fā)酵乳桿菌ATCC9338、鼠李糖乳桿菌L900、鼠李糖乳桿菌L908、鼠李糖乳桿菌GG這些菌株中鑒定出來(lái)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用菌株WJL或具有“明顯的”效應(yīng)的其他菌株作為參照菌株以便鑒定和選擇這樣的細(xì)菌菌株，其具有“明顯的”對(duì)于IGF-1血清水平的效應(yīng)，即與該參照菌株例如WJL的效應(yīng)接近的效應(yīng)(并非顯著地不同于參照菌株例如WJL的效應(yīng))，或者“強(qiáng)的”對(duì)于IGF-1血清水平的效應(yīng)(顯著地大于參照菌株例如WJL的效應(yīng))。

為此，將所述用于測(cè)量IGF-1血清水平的小鼠測(cè)試(包括8只小鼠/條件)應(yīng)用于參照菌株例如WJL和待測(cè)試菌株(平行地，優(yōu)選地或者可以擁有對(duì)于參照菌株例如WJL事先產(chǎn)生的參照數(shù)據(jù)，例如在實(shí)施例中所給出的數(shù)據(jù))。然后，比較關(guān)于所述兩個(gè)菌株而獲得的IGF-1血清水平平均值。如果單菌組的IGF-1水平平均值并不顯著地不同于關(guān)于參照組(例如WJL)的平均值，那么認(rèn)為所測(cè)試的細(xì)菌菌株為具有明顯的效應(yīng)的菌株，其中在Tukey統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)中具有大于0.05的p值。如果當(dāng)p值小于或等于0.05時(shí)，關(guān)于待測(cè)試菌株的所述平均值顯著地大于關(guān)于參照菌株例如WJL的平均值，那么該效應(yīng)是強(qiáng)的。如果當(dāng)p值小于或等于0.05時(shí)，關(guān)于待測(cè)試菌株的所述平均值(其事先對(duì)于前面的無(wú)菌測(cè)試進(jìn)行了描述)顯著地小于關(guān)于參照菌株例如WJL的平均值，那么該效應(yīng)被視為中間的。因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物優(yōu)選地將會(huì)包含具有這樣的明顯或強(qiáng)的效應(yīng)的細(xì)菌菌株，和特別地該細(xì)菌菌株同時(shí)對(duì)于骨骼生長(zhǎng)和對(duì)于IGF-1血清水平具有明顯或強(qiáng)的效應(yīng)。

包含至少一種按照本發(fā)明的細(xì)菌菌株的根據(jù)本發(fā)明的組合物能夠用作旨在在營(yíng)養(yǎng)不良(尤其是具有蛋白質(zhì)缺乏的營(yíng)養(yǎng)不良)的情況下促進(jìn)幼年生長(zhǎng)的藥物或益生制劑。依照本發(fā)明的一個(gè)特征，待處理的受試者(其是營(yíng)養(yǎng)不良的或已經(jīng)經(jīng)過(guò)了營(yíng)養(yǎng)不良的)可以具有比在相同年齡和性別的且非營(yíng)養(yǎng)不良的個(gè)體中所碰到的IGF-1血清水平低的IGF-1血清水平。

所述組合物可用于從出生至青春期的人。

所述組合物可用于處于斷奶和性成熟之間的哺乳動(dòng)物，尤其是農(nóng)用動(dòng)物(牛、綿羊、山羊、豬、禽類)、伴侶動(dòng)物(狗、貓)和體育運(yùn)動(dòng)用動(dòng)物(馬、單峰駝、雙峰駝)。

所述組合物包含10⁵至10¹²，尤其是10⁶至10¹²，優(yōu)選地10⁸至10¹²個(gè)根據(jù)本發(fā)明的形成菌落的細(xì)菌細(xì)胞(CFU)/克組合物這樣的量。按照英語(yǔ)的技術(shù)表述，術(shù)語(yǔ)“CFU”表示“菌落形成單位”?！敖M合物的克數(shù)”優(yōu)選地涉及由細(xì)菌、共組分和賦形劑或載體形成的藥物組合物或益生組合物。“細(xì)菌細(xì)胞”涉及按照本發(fā)明的單一細(xì)菌菌株，或者至少兩種按照本發(fā)明的細(xì)菌的混合物。

所述組合物包含以活的形式的乳酸細(xì)菌。所述組合物可以是細(xì)菌懸浮液，其可以進(jìn)行冷凍和在使用前進(jìn)行解凍；或者凍干粉末，其可以就這樣進(jìn)行使用或在接納在合適的載體中之后進(jìn)行使用。在這種情況下，所述組合物可以包含慣用的凍干賦形劑。

所述組合物可以是口服施用形式(例如，粉劑、明膠膠囊、片劑)，其任選地以使得能夠通過(guò)胃并在腸中釋放細(xì)菌的保護(hù)胃的形式。

本發(fā)明的目標(biāo)還在于用于在營(yíng)養(yǎng)不良的情況下促進(jìn)幼年生長(zhǎng)的益生性處理或治療性處理的方法，所述方法包括向有此需要的(即營(yíng)養(yǎng)不良的或已經(jīng)經(jīng)歷了營(yíng)養(yǎng)不良時(shí)期的，所述營(yíng)養(yǎng)不良尤其具有蛋白質(zhì)缺乏)人患者(從出生至青春期)或動(dòng)物患者(從斷奶至性成熟)施用根據(jù)本發(fā)明的組合物。有此需要的患者可以具有比在相同年齡和性別的且非營(yíng)養(yǎng)不良的個(gè)體中所碰到的IGF-1血清水平低的IGF-1血清水平。

如所指出的，所述方法可以是治療性處理或益生性(或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充的)處理。所述方法包括施用足夠量的上面所描述的組合物。數(shù)量和施用頻率將會(huì)尤其取決于營(yíng)養(yǎng)不良的嚴(yán)重度、患者的年齡和患者的狀況。所述方法將會(huì)包括以一次或幾次施用根據(jù)本發(fā)明的組合物的劑量，所述施用可以在受試者的生長(zhǎng)期(直至青春期或性成熟)內(nèi)分期進(jìn)行。所述劑量可以是分成幾部分的以有助于施用，尤其是根據(jù)患者的年齡。施用頻率尤其在每天一劑(單一的或分成幾部分的)和每月一劑之間。典型地，施用頻率將會(huì)在每天一劑(單一的或分成幾部分的)和每周一劑之間，甚至每2、3、4、5或6天一劑。每個(gè)劑量(單一的或分成幾部分的)尤其相當(dāng)于幾克至幾十克的組合物。所述方法尤其包括施用這樣的組合物，其包含10⁵至10¹²，尤其是10⁶至10¹²，優(yōu)選地10⁸至10¹²個(gè)形成菌落的細(xì)菌細(xì)胞(CFU)/克組合物這樣的量(細(xì)菌細(xì)胞涉及按照本發(fā)明的單一細(xì)菌菌株，或者至少兩種按照本發(fā)明的細(xì)菌的混合物)。所述方法尤其包括施用包含以活的形式的乳酸細(xì)菌的組合物。該組合物可以是細(xì)菌懸浮液，其可以進(jìn)行冷凍和在使用前進(jìn)行解凍；或者凍干粉末，其可以就這樣進(jìn)行使用或在接納在合適的載體中之后進(jìn)行使用。在這種情況下，該組合物可以包含慣用的凍干賦形劑，可以是口服施用形式(例如，粉劑、明膠膠囊、片劑)，其任選地以使得能夠通過(guò)胃并在腸中釋放細(xì)菌的保護(hù)胃的形式，或者可以是直腸形式(例如，栓劑)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物，尤其是在所述處理方法中所使用的組合物，包含至少一種不在待處理的患者所屬于的物種中天然地存在的細(xì)菌菌株。因此，它可以是不在人中或在動(dòng)物中天然地存在的細(xì)菌。在該設(shè)定下，當(dāng)存在幾種不同的細(xì)菌時(shí)，它們之一不是天然存在的就足夠了。另一方面，該細(xì)菌經(jīng)證明在待處理的患者中或在相應(yīng)的物種(根據(jù)本發(fā)明，人或動(dòng)物)中具有腸道向性，并且符合根據(jù)本發(fā)明的活性菌株的定義。

本發(fā)明還涉及通過(guò)使用無(wú)菌果蠅模型和/或無(wú)菌小鼠模型來(lái)篩選能夠在營(yíng)養(yǎng)不良的情況下促進(jìn)幼年生長(zhǎng)的細(xì)菌的方法。

用果蠅模型的方法包括下列步驟：

-擁有一批來(lái)自無(wú)菌的黑腹果蠅(例如，果蠅yw這一株系或任何其他所謂“野生型”的株系)的胚胎；

-在包含對(duì)于果蠅來(lái)說(shuō)有營(yíng)養(yǎng)的介質(zhì)且缺乏酵母的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上將這些胚胎分配成至少2個(gè)組，此外將所述胚胎組之一用待測(cè)試細(xì)菌的懸浮液進(jìn)行接種，這形成單菌個(gè)體組，另一組形成無(wú)菌組；

-在合適的溫度(通常大約25℃)下進(jìn)行飼養(yǎng)；

-在合適的飼養(yǎng)期(通常大約7天)結(jié)束時(shí)，從每個(gè)組中回收來(lái)自最初經(jīng)接種或未接種的胚胎的果蠅幼蟲(chóng)(無(wú)菌幼蟲(chóng)和單菌幼蟲(chóng))，優(yōu)選地以相等的數(shù)目進(jìn)行回收；

-測(cè)定每個(gè)組的幼蟲(chóng)的長(zhǎng)度平均值，并比較所獲得的平均值；

-如果單菌組的幼蟲(chóng)的長(zhǎng)度平均值以下述程度大于無(wú)菌組的幼蟲(chóng)的長(zhǎng)度平均值，那么認(rèn)為所測(cè)試的細(xì)菌菌株對(duì)于所述測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)：在對(duì)于所述兩個(gè)組的幼蟲(chóng)的整套大小數(shù)據(jù)進(jìn)行的Mann-Whitney統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)中具有小于或等于0.001，優(yōu)選地小于或等于0.0001的p值。

優(yōu)選地，所述篩選方法重新采取上面描述過(guò)的果蠅測(cè)試的特征。

用小鼠模型的方法包括下列步驟：

-擁有來(lái)自源于相同小鼠株系(典型地，Balb/c小鼠)的兩個(gè)品系的幼年鼠，所述兩個(gè)品系即無(wú)菌親本小鼠品系和單菌親本小鼠品系(與待測(cè)試細(xì)菌相關(guān)聯(lián)的)；

-將它們以缺乏蛋白質(zhì)和優(yōu)選地還缺乏脂質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)飲食制度進(jìn)行飼養(yǎng)；

-在合適的飼養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，測(cè)定每個(gè)組的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的值的平均值，這些參數(shù)與生長(zhǎng)(例如，體重增加，骨骼生長(zhǎng)，例如通過(guò)測(cè)量個(gè)體的大小或其股骨的大小)相關(guān)和/或與血清IGF-1水平相關(guān)；

-如果單菌組的所測(cè)量的參數(shù)的平均值以下述程度大于無(wú)菌組的所測(cè)量的參數(shù)的平均值，那么認(rèn)為所述乳酸細(xì)菌菌株對(duì)于所述測(cè)試作出陽(yáng)性反應(yīng)：在Tukey統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)中具有小于或等于0.05的p值。

優(yōu)選地，所述篩選方法重新采取上面所描述的關(guān)于骨骼生長(zhǎng)或IGF-1血清水平的小鼠測(cè)試的特征。

所述篩選方法還可以是與參照菌株(例如菌株WJL)的比較測(cè)試，并且該測(cè)試在這種情況下重新采取上面對(duì)于果蠅測(cè)試或小鼠測(cè)試所描述的特征。

本發(fā)明的目標(biāo)還在于以活的或殺死的形式的菌株G821(CNCM I-4979)的純培養(yǎng)物或分離物，在保存介質(zhì)或培養(yǎng)介質(zhì)中包含活的該菌株的組合物，包含該菌株和任選地凍干賦形劑和/或防腐劑的凍干組合物，在保存介質(zhì)中包含以殺死的形式的該菌株或在保存介質(zhì)中包含殺死的該菌株的組合物，在對(duì)于口服施用或直腸施用來(lái)說(shuō)可接受的介質(zhì)或賦形劑中包含活的或殺死的該菌株的可施用給人或動(dòng)物的組合物。所述保存介質(zhì)、培養(yǎng)介質(zhì)、凍干賦形劑、防腐劑、對(duì)于口服施用或直腸施用來(lái)說(shuō)可接受的介質(zhì)或賦形劑是上面所描述的那些或者技術(shù)人員熟知的那些。

現(xiàn)在，將借助于作為非限制性實(shí)例而選取的本發(fā)明的實(shí)施方案并參考附圖來(lái)更詳細(xì)地描述本發(fā)明，在所述附圖中：

-圖1是顯示了從第28天至第56天小鼠的生長(zhǎng)速率(以“cm/天”表示)的圖；GF：無(wú)菌小鼠；WJL：在植物乳桿菌WJL這一菌株存在下飼養(yǎng)的小鼠；NIZO 2877：在植物乳桿菌WJL NIZO 2877這一菌株存在下飼養(yǎng)的小鼠；^*p<0.05；^***p<0.001；

-圖2是顯示了在第56天在GF、WJL或NIZO 2877小鼠中股骨的大小的圖；^*p<0.05；^***p<0.001；

-圖3是顯示了在第56天GF、WJL或NIZO 2877組的雄性小鼠的血清水平(以“ng/ml”表示)的圖；^*p<0.05；^***p<0.001；

-圖4是顯示了在營(yíng)養(yǎng)不足的條件下在7天時(shí)果蠅幼蟲(chóng)的大小的圖：陰性對(duì)照組(在產(chǎn)卵后未在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上添加細(xì)菌)，和以在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上添加植物乳桿菌NIZO 2877、WJL或G821這一菌株為特征的組。

實(shí)施例1：在單菌果蠅上的細(xì)菌的功能篩選

第1天：采用無(wú)菌的成年果蠅(黑腹果蠅yw)；將它們放置在包括底的產(chǎn)卵籠(培養(yǎng)皿類型)中，在所述底上布置常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基；通過(guò)在25℃下將該成年群體在籠中維持一夜來(lái)確保產(chǎn)卵。

第0天：切割出6個(gè)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基碎塊以便以6次收集40個(gè)胚胎，將所述碎塊中的每一個(gè)放置在包含在培養(yǎng)皿中的營(yíng)養(yǎng)缺乏型營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的1×PBS接種三個(gè)平皿，然后用在1×PBS中的細(xì)菌的懸浮液接種另外三個(gè)平皿。

在25℃下溫育7天。

第7天：然后從每個(gè)平皿中回收已在那里發(fā)育的幼蟲(chóng)(從20只幼蟲(chóng)/平皿開(kāi)始該實(shí)驗(yàn)是可采用的，我們因此在下面使用具有多于60只個(gè)體的組)。使幼蟲(chóng)經(jīng)歷熱休克處理(在加熱至100℃的板上5秒鐘)，然后測(cè)量幼蟲(chóng)的大小。

將該實(shí)驗(yàn)方案應(yīng)用于不同的細(xì)菌菌株，并且將實(shí)驗(yàn)和結(jié)果概括在下面的表1中：

關(guān)于“幼蟲(chóng)生長(zhǎng)”表型測(cè)試的驗(yàn)證有效標(biāo)準(zhǔn)的指導(dǎo)：

所述菌株應(yīng)當(dāng)至少滿足標(biāo)準(zhǔn)1以便經(jīng)驗(yàn)證是有效的，并且其活性的程度可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)1+2來(lái)定性。

定性標(biāo)準(zhǔn)1＝相對(duì)于無(wú)菌條件而言促進(jìn)生長(zhǎng)的菌株：

相對(duì)于無(wú)菌個(gè)體的值而言，將統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用于相關(guān)聯(lián)的個(gè)體的全部長(zhǎng)度值(至少60只幼蟲(chóng)/條件)。小于0.001的p值(Mann-Whitney檢驗(yàn))將所述菌株視為是“促進(jìn)生長(zhǎng)的”。在該情況下，下列菌株被視為是促進(jìn)生長(zhǎng)的：

植物乳桿菌WJL

植物乳桿菌NIZO2877

干酪乳桿菌ATCC 393

發(fā)酵乳桿菌ATCC 9338

類干酪乳桿菌ATCC 25302

類干酪乳桿菌Shirota

干酪乳桿菌L919

鼠李糖乳桿菌L900

鼠李糖乳桿菌L908

鼠李糖乳桿菌GG。

下列菌株不具有促進(jìn)生長(zhǎng)的效應(yīng)：

發(fā)酵乳桿菌KLD

發(fā)酵乳桿菌LMG

類干酪乳桿菌BL23

德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii spp.bulgaricus)ATCC 11842。

定量標(biāo)準(zhǔn)2＝促進(jìn)生長(zhǎng)的效應(yīng)的程度(具有事先經(jīng)驗(yàn)證有效的標(biāo)準(zhǔn)1)：

相對(duì)于與植物乳桿菌WJL這一菌株單相關(guān)聯(lián)的個(gè)體的值而言，將統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用于與所測(cè)試的菌株相關(guān)聯(lián)的個(gè)體的全部長(zhǎng)度值(至少60只幼蟲(chóng)/條件)。

出現(xiàn)三種特定情形：

統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的p值大于0.001(Mann-Whitney檢驗(yàn))，該菌株將被視為對(duì)于幼蟲(chóng)生長(zhǎng)具有“明顯的”效應(yīng)(與植物乳桿菌WJL這一菌株類似的效應(yīng))。

在本實(shí)施例中，下列菌株具有明顯的效應(yīng)：

干酪乳桿菌ATCC 393

發(fā)酵乳桿菌ATCC 9338

類干酪乳桿菌ATCC 25302

類干酪乳桿菌Shirota

干酪乳桿菌L919

鼠李糖乳桿菌L900

鼠李糖乳桿菌L908

鼠李糖乳桿菌GG

植物乳桿菌WJL。

統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的p值小于0.001(Mann-Whitney檢驗(yàn))，如果個(gè)體的平均大小小于與植物乳桿菌WJL相關(guān)聯(lián)的個(gè)體的平均大小，那么該菌株將被視為對(duì)于幼蟲(chóng)生長(zhǎng)具有“中間的”效應(yīng)(在本實(shí)施例中，植物乳桿菌NIZO 2877這一菌株的情況)。如果個(gè)體的平均大小大于與植物乳桿菌WJL相關(guān)聯(lián)的個(gè)體的平均大小，那么該菌株將被視為具有“強(qiáng)的”效應(yīng)(在本實(shí)施例中未鑒定出的情況)。

“幼蟲(chóng)生長(zhǎng)”表型測(cè)試實(shí)施例的分析

-已經(jīng)測(cè)試了14個(gè)乳桿菌屬菌株(表1)以便借助于在黑腹果蠅中的“幼蟲(chóng)生長(zhǎng)”測(cè)試來(lái)測(cè)定其促進(jìn)生長(zhǎng)的潛力。

-這些菌株是從ATCC、巴黎巴斯德研究所、里爾巴斯德研究所處可得的，或者是在科學(xué)文獻(xiàn)中發(fā)表且從所提及的出版物的負(fù)責(zé)研究者處可得的(表2)。

-在與待測(cè)試細(xì)菌菌株相關(guān)聯(lián)和然后在缺乏酵母的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中飼養(yǎng)幼年個(gè)體之后的第7天，關(guān)于每種條件研究最少60只個(gè)體的大小。表1呈現(xiàn)了這些數(shù)據(jù)集的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

-這些結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使得能夠根據(jù)“幼蟲(chóng)生長(zhǎng)測(cè)試”的標(biāo)準(zhǔn)1來(lái)選出符合要求的10個(gè)屬于不同乳桿菌屬物種的菌株。該選擇揭示了嚴(yán)格菌株特異性的且并不必然地與給定的乳桿菌屬物種相關(guān)的功能效應(yīng)。

-結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使得能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)2將植物乳桿菌NIZO2877這一菌株的效應(yīng)視為“中間的”，而9個(gè)其他的促進(jìn)生長(zhǎng)的菌株具有“明顯的”效應(yīng)。

實(shí)施例2：在果蠅模型上具有強(qiáng)的效應(yīng)的菌株的描述

用3個(gè)細(xì)菌菌株重做實(shí)施例1的果蠅測(cè)試：

-植物乳桿菌WJL

-植物乳桿菌NIZO2877

-植物乳桿菌G821。

結(jié)果的分析(參見(jiàn)圖4)顯示了下列效應(yīng)：

“無(wú)菌的”對(duì)“NIZO 2877”，p<0.001(^***)

“NIZO 2877”對(duì)“WJL”，p<0.0001(^****)

“G821”對(duì)“WJL”，p<0.0001(^****)

“無(wú)菌的”對(duì)“WJL”或“G821”，p<0.0001(^****)。

結(jié)論：

-植物乳桿菌WJL：明顯的效應(yīng)

-植物乳桿菌NIZO2877：中間的效應(yīng)

-植物乳桿菌G821：強(qiáng)的效應(yīng)。

實(shí)施例3：在小鼠上的細(xì)菌的功能篩選-表型分析

在小鼠中研究了借助于實(shí)施例1的“幼蟲(chóng)生長(zhǎng)”測(cè)試而鑒定出的具有“中間的”和“明顯的”效應(yīng)的兩個(gè)菌株(分別為植物乳桿菌NIZO2877和植物乳桿菌WJL)的促進(jìn)幼年生長(zhǎng)的效應(yīng)。

研究了在三個(gè)來(lái)自相同無(wú)菌小鼠集群的個(gè)體組中的雄性后代(最少15只個(gè)體)：第一組由無(wú)菌幼年鼠組成(GF組)，第二組由來(lái)自與植物乳桿菌WJL這一菌株單相關(guān)聯(lián)的親本的幼年鼠組成(WJL組)，和第三組由來(lái)自與植物乳桿菌NIZO2877這一菌株單相關(guān)聯(lián)的親本的幼年鼠組成(NIZO 2877組)。將親本和幼年鼠用常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行飼養(yǎng)直至幼年鼠斷奶(第21天)，然后將經(jīng)斷奶的幼年鼠用缺乏蛋白質(zhì)和脂質(zhì)(分別為8％和2.5％)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行飼養(yǎng)直至第56天。

常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：23％蛋白質(zhì)和5％脂質(zhì)。

營(yíng)養(yǎng)缺乏型營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：8％蛋白質(zhì)和2.5％脂質(zhì)。

研究了闡明這些個(gè)體的幼年生長(zhǎng)的三個(gè)參數(shù)：(1)在斷奶后28天的時(shí)間段(從第28天至第56天)期間的大小增加；(2)在第56天，代表了所測(cè)試的群體的一批個(gè)體(最少9只個(gè)體)的股骨大?。缓妥詈?，(3)在第56天，在至少8只個(gè)體中生長(zhǎng)因子IGF-1的血清水平。

通過(guò)使用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中使用軟件GraphPad(GraphPad Prism 5.04,San Diego,USA)；p值<0.05被認(rèn)為是顯著的。

(1)大小增加：

在第28天和第56天，通過(guò)短暫暴露于異氟烷來(lái)使小鼠麻醉，以使得能夠測(cè)量小鼠的大小(從口鼻部至尾巴基部)。

表3：生長(zhǎng)速率(以cm表示的大小增加/天，從第28天至第56天)-Nb＝小鼠數(shù)目

這些數(shù)據(jù)匯集在圖1中。

(2)股骨大?。?/p>

在第56天處死小鼠，取出無(wú)肌肉的股骨，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量其長(zhǎng)度。

表4：在第56天，在雄性中以mm表示的股骨長(zhǎng)度

這些數(shù)據(jù)匯集在圖2中。

(3)在血清中IGF-1的滴度：

在從在第56天處死的小鼠的血液開(kāi)始獲得的血清上測(cè)量IGF-1的滴度。所述測(cè)量在經(jīng)稀釋的(1:25)血清上進(jìn)行，其中使用試劑盒ELISA Ready-Set-Go(eBioscience,USA)，依照制造商的使用說(shuō)明書(shū)。

表5：以pg/ml表示的IGF-1血清滴度(從ELISA平板開(kāi)始的雙重測(cè)量)

這些數(shù)據(jù)匯集在圖3中。

結(jié)果闡明了植物乳桿菌WJL這一菌株于對(duì)生長(zhǎng)速率的“明顯的”效應(yīng)(相對(duì)于無(wú)菌條件而言p值<0.001)和植物乳桿菌NIZO2877這一菌株的“中間的”效應(yīng)(相對(duì)于無(wú)菌條件而言p值<0.05，和相對(duì)于植物乳桿菌WJL條件而言p值<0.001)。這些效應(yīng)用參數(shù)“IGF-1水平”得到了證實(shí)(不同測(cè)試的相同的p值范圍)，然后用參數(shù)“股骨大小”得到了加強(qiáng)(在無(wú)菌條件和植物乳桿菌NIZO 2877條件之間，p值<0.001)。

所有這些結(jié)果通過(guò)科學(xué)證據(jù)證明了某些對(duì)于“幼蟲(chóng)生長(zhǎng)”測(cè)試也作出陽(yáng)性反應(yīng)的乳桿菌屬菌株的促進(jìn)幼年生長(zhǎng)的效應(yīng)。

在此所引用的所有公共文獻(xiàn)通過(guò)提及而合并入本文。同樣地，技術(shù)人員將能夠參考這些各種各樣的文獻(xiàn)和在此已提及的商業(yè)菌株保藏物。