逆轉(zhuǎn)錄病毒感染諸如例如人免疫缺陷病毒(HIV)的感染仍然是最重要和最廣泛的人類疾病之一。

治療逆轉(zhuǎn)錄病毒例如HIV的一種方法是靶向插入宿主細(xì)胞的基因組中的原病毒。從宿主的基因組切除原病毒DNA例如將防止進(jìn)一步HIV復(fù)制，并且與當(dāng)前方法的不同在于其具有根除存在于宿主的基因組中的甚至是休眠病毒的潛力。

考慮用于該替代方法的一類蛋白是位點特異性重組酶(FLOWERS等人，1997)。位點特異性重組酶介導(dǎo)從基因重排至基因組分離的性質(zhì)中的許多功能，諸如例如限定的DNA單位的切除、導(dǎo)致或整合(在STARK等人，1992中綜述)。

最簡單和最好理解的重組酶之一是來自噬菌體P1的Cre重組酶，其通過特定序列的兩個相同的(即對稱的)雙鏈DNA位點之間的重組將基因組二聚體分解成單體(HOESS&ABREMSKI,1985)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在小鼠遺傳學(xué)中廣泛使用Cre重組酶(NAGY,2000)。Cre是38kDa蛋白，以其功能命名，因為其引起重組(STERNBERG&HAMILTON,1981)。該重組的先決條件是由Cre識別的兩個重組位點以反向平行取向?qū)R，然后由接合形成環(huán)的四個相同的Cre亞單位結(jié)合，其中每個亞單位接觸兩個相鄰亞單位和一個重組位點的半個位點(HOESS&ABREMS I,1985)。由Cre識別的重組位點是稱為loxP(來自跨越(x)的基因座，P1(locus of crossing over(x),P1)；STERNBERG&HAMILTON,1981)的34-bp雙鏈DNA序列，其是回文的，除了其八個最內(nèi)部堿基對(稱為間隔區(qū))，所述堿基對為位點賦予方向性。

一些位點特異性重組系統(tǒng)，包括Cre/loxP-系統(tǒng)，在沒有輔助蛋白或輔因子的情況下發(fā)揮作用，并且在各種各樣細(xì)胞條件下發(fā)揮作用。然而，由于位點特異性重組酶通過重組酶亞單位與其同源DNA靶序列的特異性相互作用而發(fā)揮作用，因此這些酶的使用受到被靶向DNA區(qū)必須含有適當(dāng)定位的靶位點的需求的限制(LEWANDOSKI,2001)。到目前為止，沒有鑒定到識別天然逆轉(zhuǎn)錄病毒序列作為其DNA靶序列的野生型重組酶。

近年來已經(jīng)實施位點特異性重組酶的廣泛突變和結(jié)構(gòu)分析，以改變它們的特性并且實現(xiàn)這些酶的復(fù)雜機(jī)制的更好理解(對于綜述，參見VAN DUYNE,2001；和COATES等人,2005)。許多研究集中于Cre重組酶來探索其進(jìn)化。幾個研究表明，當(dāng)改變Cre的loxP識別位點中的幾個核苷酸時，可以改變其靶特異性(BUCHHOLZ&STEWART,2001；SANTORO&SCHULTZ,2002；RUFER&SAUER,2002)。進(jìn)一步研究解決了含有來自HIV-1的LTR的序列的突變的loxP靶位點的工程改造，以開發(fā)可能的靶位點，用于使用Cre作為抗病毒策略(LEE&PARK,1998；LEE等人，2000)。

定向進(jìn)化的方法是選擇具有改變的特異性的酶的有效方法(Yuan等人，2005綜述；和JOHANNES&ZHAO,2006)。在開始時，該方法用于通過基于RNA選擇具有改變的底物位點的RNA分子來分離改進(jìn)的酶。基于PCR的方法的使用允許篩選非常大型的文庫并從候選物的匯集物中回收成功的編碼區(qū)。相比之下，在蛋白的定向進(jìn)化中，通過蛋白特性的改變鑒定的改進(jìn)突變體的篩選和回收需要回收編碼所述蛋白的核酸序列的方法。已經(jīng)經(jīng)常通過區(qū)室化來維持蛋白與其編碼序列之間的聯(lián)系。因此，定向蛋白進(jìn)化中的文庫篩選受限于維持區(qū)室的“一個接一個(one-by-one)”方法，并且還沒有與篩選候選物的匯集物相關(guān)的優(yōu)點。

已經(jīng)通過開發(fā)允許使用mRNA-蛋白融合和核糖體展示使蛋白與其各自的信使RNA(mRNA)交聯(lián)的方法克服了該限制。因此，改進(jìn)蛋白特性的功能篩選與相應(yīng)編碼分子的直接回收相聯(lián)系，并且已經(jīng)體外篩選大型的匯集物(參見例如BUCHHOLZ等人，1998)。通過所謂的底物連接的蛋白進(jìn)化實現(xiàn)了定向蛋白進(jìn)化的進(jìn)一步改進(jìn)(SLiPE；BUCHHOLZ&STEWART,2001)，其中重組酶的底物位于與蛋白編碼區(qū)相同的DNA分子上。以該方式，當(dāng)在區(qū)室內(nèi)表達(dá)重組酶時，其作用改變緊鄰其自身編碼區(qū)的DNA底物。因此，可以通過PCR篩選文庫作為匯集物，以僅擴(kuò)增緊鄰改變的底物的候選編碼區(qū)。這允許方便地篩選大型文庫以快速回收成功的編碼區(qū)。該方法用于改變Cre重組酶的DNA特異性并使其適于新識別靶位點(BUCHHOLZ&STEWART,2001)。

鑒于位點特異性重組酶的潛力以及發(fā)現(xiàn)從宿主細(xì)胞的基因組消除HIV-1原病毒的AIDS療法的需求，WO 2008/083931公開了修整重組酶(TRE)的生成，所述修整重組酶(TRE)能夠重組插入宿主細(xì)胞的基因組中的逆轉(zhuǎn)錄病毒的原病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶位點，因此從宿主細(xì)胞的基因組切除原病毒。實施例中公開的工程改造的重組酶，Tre，識別存在于特定HIV-1毒株中的特定不對稱位點。不對稱靶位點與由Cre識別的對稱loxP位點具有某些同源性。WO 2008/083931認(rèn)識到，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒、特別是HIV的高序列變異性，對于具有不同HIV毒株的患者的治療，可能必須調(diào)整不同的修整重組酶，或者制備含有對各種靶序列有特異性的修整重組酶的重組酶的集合。

相比之下，WO 2011/147590 A2提供了能夠切除多種逆轉(zhuǎn)錄病毒、例如HIV毒株的修整重組酶。因此，生成的重組酶可以用于多種HIV感染，而無需為每種毒株生成新的重組酶。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，盡管逆轉(zhuǎn)錄病毒存在高序列變異性，但使用創(chuàng)新方法，可鑒定存在于高比例特定亞型的病毒中的不對稱靶序列。令人驚訝地，可鑒定存在于96％的HIV-1亞型B毒株(即歐洲和美洲的流行毒株)中的靶序列(SEQ ID NO:1)。還鑒定了存在于較低百分比的HIV-1毒株中的另一靶序列(SEQ ID NO:2)。使用Cre(SEQ ID NO:6)作為分子定向進(jìn)化的基礎(chǔ)，他們還鑒定了能夠重組所述不對稱靶序列的幾種修整重組酶，并提供這些修整重組酶的共有序列，例如SEQ ID NO:7或Tre 3.0(SEQ ID NO:8，能夠重組SEQ ID NO:1)。

鑒于此，本發(fā)明人解決了提供能夠重組存在于多種HIV-1毒株中的不對稱靶序列的改進(jìn)的修整重組酶的問題。本發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，具有與如WO 2011/147590 A2所教導(dǎo)的共有序列SEQ ID NO:8不同的序列的修整重組酶對存在于96％的所有HIV-1亞型B毒株(即歐洲和美洲的流行毒株)的不對稱靶序列SEQ ID NO:1也具有高度活性，并且具有改進(jìn)的特征。根據(jù)本發(fā)明的修整重組酶優(yōu)選包含SEQ ID NO:9的共有氨基酸序列，更優(yōu)選地，SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11-13中任一個的更特定共有序列。本發(fā)明的修整重組酶與根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的修整重組酶相比具有改進(jìn)的特異性，并且因此被人類，特別是在人類T細(xì)胞中被更好地耐受。所述重組酶優(yōu)選地是高度特異性的，因為它們對由其開發(fā)它們的重組酶的已知靶序列，例如對loxP(SEQ ID NO:4)、loxH(SEQ ID NO:5)或還有對loxLTR Tre 1.0(SEQ ID NO:3)，不具有任何可檢測的殘余活性。

本發(fā)明首次提供用于生成編碼良好耐受且高度特異性的修整重組酶的表達(dá)載體的方法，所述修整重組酶能夠重組插入宿主細(xì)胞的基因組中的一種毒種的多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株的原病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列。已經(jīng)通過將底物分成與原始靶具有較小差異的多個新子集并逐步修整重組酶以識別這些子集而修整重組酶，以識別不同于可以存在于多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株中的其天然對稱靶位點的不對稱靶位點(WO 2008/083931和WO 2011/147590)。組合方法允許選擇識別給定序列內(nèi)的不對稱靶位點的功能分子。因此，在定向分子進(jìn)化期間穿過底物中間物，已經(jīng)有可能產(chǎn)生具有遠(yuǎn)程新型不對稱靶特異性的酶。該方法也用于本發(fā)明中。本發(fā)明補(bǔ)充了WO 2008/083931和WO 2011/147590教導(dǎo)的方法，因為其引入選擇被人細(xì)胞、特別是人T細(xì)胞良好耐受的修整重組酶的步驟。

具體地，本發(fā)明提供用于制備編碼良好耐受的修整重組酶的表達(dá)載體的方法，所述修整重組酶能夠重組可以插入宿主細(xì)胞的基因組中的多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株的原病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列，包括以下步驟：在多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株的原病毒DNA的LTR序列中鑒定序列，所述序列與至少一個已知重組酶靶位點的左半位點序列和右半位點序列具有至少30％的同源性，其中所述同源序列被5-12個核苷酸的間隔區(qū)分開，且其中發(fā)現(xiàn)所述不對稱靶序列存在于多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株中；和通過以下的重復(fù)步驟生成：

i)使用基于不對稱靶序列的序列、但經(jīng)修飾以僅含有來自已知靶序列的有限數(shù)目的變異的修飾的靶序列作為底物，對至少一種識別已知同源靶位點的重組酶的分子定向進(jìn)化；其中在每輪中，所述靶序列可以與已知重組酶對其上的一個、兩個或三個核苷酸起作用的靶序列不同；和

ii)改組重組酶文庫以獲得能夠重組與所述不對稱靶序列更同源的靶序列的重組酶文庫；

直到獲得對逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列具有活性的至少一種重組酶；

通過分子定向進(jìn)化和文庫的改組來針對已知靶位點的重組陰性選擇的重復(fù)步驟；

通過在人細(xì)胞、特別是人T細(xì)胞中表達(dá)文庫，和將表達(dá)修整重組酶的所述人細(xì)胞培養(yǎng)至少1周、優(yōu)選至少2周，以及從表達(dá)可選擇標(biāo)記的培養(yǎng)的細(xì)胞分離重組酶的核酸，來選擇一種或多種所述修整重組酶；

和，任選地，將編碼所述重組酶的核酸克隆至合適的表達(dá)載體中。

本發(fā)明具體地提供了用于制備編碼良好耐受且高度特異性修整重組酶的核酸或表達(dá)載體的方法，所述修整重組酶能夠重組多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株的原病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列，其包括以下步驟：

(a)鑒定與多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株的原病毒DNA的LTR的序列中的至少一個已知重組酶靶位點的左半位點序列和右半位點序列具有至少30％同源性的序列，其中所述同源序列被5-12個核苷酸的間隔區(qū)分開，且其中發(fā)現(xiàn)所述不對稱靶序列存在于多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株中；

(b)鑒定兩個序列，其中第一序列對應(yīng)于與所述已知靶位點的左半位點同源的步驟(a)的不對稱靶序列的序列，并稱為“半位點序列1”，且其中第二序列對應(yīng)于與右半位點同源的步驟(a)的不對稱靶序列的序列，并稱為“半位點序列2”；

(c)測定與步驟(a)的至少一個已知同源靶位點的相應(yīng)同源左半位點和右半位點序列不同的步驟(b)的序列內(nèi)的核苷酸；

(d)生成包含靶序列的兩個靶核酸的第一子集，其中第一靶序列被稱為亞位點1，且以5'至3'順序包含彼此相鄰的步驟(b)的半位點序列1、不對稱靶序列的間隔區(qū)序列和半位點序列1的反向重復(fù)，且其中第二靶序列被稱為亞位點2，且以5'至3'順序包含彼此相鄰的半位點序列2的反向重復(fù)、不對稱靶序列的間隔區(qū)序列和步驟(b)的半位點序列2；

(e)基于步驟(d)的第一子集中的靶序列生成包含修飾的靶序列的靶核酸的第二子集，

其中，在基于亞位點1的序列中，在左半位點序列中，與步驟(a)的至少一個已知靶位點的相應(yīng)同源半位點序列不同的一部分核苷酸被所述已知靶位點中發(fā)現(xiàn)的天然核苷酸替代，直至所述半位點序列含有與所述已知靶位點不同的一個、兩個或三個核苷酸，其中所述修飾的靶序列的右半位點由所述修飾的左半位點序列的反向重復(fù)形成，所述修飾的左半位點序列的反向重復(fù)通過不對稱靶序列的間隔區(qū)序列與所述修飾的左半位點序列分開，且

其中，在基于亞位點2的序列中，在右半位點序列中，與步驟(a)的至少一個已知靶位點的相應(yīng)同源半位點序列不同的一部分核苷酸被所述已知靶位點中發(fā)現(xiàn)的天然核苷酸替代，直至所述半位點序列含有與所述已知靶位點不同的一個、兩個或三個核苷酸，其中所述修飾的靶序列的左半位點由所述修飾的右半位點序列的反向重復(fù)形成，所述修飾的左半位點序列的反向重復(fù)通過不對稱靶序列的間隔區(qū)序列與所述修飾的右半位點序列分開，

使得在放在一起的源自步驟(d)的第一子集的一個靶序列的所有修飾的半位點序列中，可以發(fā)現(xiàn)所有偏差核苷酸，而所述修飾的半位點序列無一單獨包含所有偏差核苷酸，

(f)使用步驟(e)中獲得的第二子集中的每個核酸作為底物，對識別根據(jù)步驟(a)的已知同源靶位點的至少一種重組酶分別應(yīng)用分子定向進(jìn)化；

(g)改組步驟(f)中進(jìn)化的重組酶文庫，其中組合并改組在基于亞位點1的序列上進(jìn)化的所有重組酶文庫，且其中組合并改組在基于亞位點2的序列上進(jìn)化的所有重組酶文庫；

(h)使用根據(jù)步驟(d)的子集的每個核酸作為底物對步驟(g)中獲得的改組文庫應(yīng)用分子定向進(jìn)化，優(yōu)選底物連接的蛋白進(jìn)化；

(i)改組步驟(h)中進(jìn)化的重組酶文庫；

(j)使用包含步驟(a)的不對稱靶序列的核酸作為底物，對步驟(g)中獲得的改組文庫應(yīng)用分子定向進(jìn)化，優(yōu)選底物連接的蛋白進(jìn)化，直至獲得至少一種重組酶，所述重組酶對步驟(a)的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列具有活性；

(k)從所述文庫分離編碼步驟(j)中獲得的至少一種重組酶的核酸，并將其克隆至進(jìn)化載體中，所述進(jìn)化載體允許陰性選擇重組根據(jù)步驟(a)的已知靶位點的修整重組酶，由此獲得文庫；

(l)對步驟(k)中獲得的文庫應(yīng)用分子定向進(jìn)化，優(yōu)選底物連接的蛋白進(jìn)化；

(m)改組步驟(1)中獲得的文庫；

(n)分離編碼步驟(m)中獲得的至少一種修整重組酶的核酸，并將其克隆至用于在人細(xì)胞中表達(dá)編碼的重組酶和可選擇標(biāo)記的載體中，由此獲得載體文庫，

(o)用步驟(n)中獲得的所述載體文庫轉(zhuǎn)化人細(xì)胞，優(yōu)選人T細(xì)胞；

(p)將表達(dá)所述可選擇標(biāo)記的細(xì)胞培養(yǎng)至少1周，并選擇所述可選擇標(biāo)記的高表達(dá)；

(q)從步驟(p)中獲得的表達(dá)所述可選擇標(biāo)記的細(xì)胞分離編碼重組酶的核酸；

(r)選擇編碼重組酶的核酸，所述重組酶能夠重組步驟(a)的不對稱靶序列；

(s)從所述文庫分離編碼步驟(f)中獲得的至少一種重組酶的核酸；和，

(t)任選地，將步驟(s)中獲得的核酸克隆至合適的表達(dá)載體中。

在本發(fā)明方法的步驟(a)中，可以確定原病毒DNA的LTR的序列，諸如例如通過使用鏈終止抑制劑的DNA測序(SANGER等人，1977)。然而，如果已經(jīng)確定插入宿主的基因組中的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的LTR的序列，則可以通過參考數(shù)據(jù)庫來確定該序列?；谛蛄行畔?，進(jìn)行序列信息的基于計算機(jī)的分析，以在其中鑒定分別與已知重組酶的已知靶位點的左半位點序列和右半位點序列具有至少30％的同源性的序列，所述已知重組酶的已知靶位點的左半位點序列和右半位點序列由5-12個核苷酸的合適間隔區(qū)分開，其中所述不對稱靶序列被發(fā)現(xiàn)存在于多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株中。優(yōu)選地，與已知靶位點的左半位點序列和右半位點序列的同源性為至少40％或至少50％。優(yōu)選地，這些逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株具有一種毒種或其一種亞型。優(yōu)選地，多種毒株包含多于10種毒株，更優(yōu)選地，多于100種毒株，多于130種毒株，多于200種毒株或多于300種毒株，例如HIV毒株。所述毒株可以來自病毒的一種亞型，例如HIV-1，HIV-1亞型A、B和C，優(yōu)選地，HIV-1亞型B。因此，獲得的重組酶或編碼其的表達(dá)載體可用于治療多種毒株(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒或其亞型的多于50％、多于70％、多于80％、多于90％或所有已知毒株)的感染。

如本文所使用的術(shù)語“重組酶”是指參與重組的蛋白。因此，重組酶識別并結(jié)合稱為“重組位點”或“靶位點”的兩個特定DNA序列，并介導(dǎo)這兩個靶位點之間的重組。因此，術(shù)語“重組酶”意指介導(dǎo)特定DNA基因座中的DNA重排的任何重組系統(tǒng)的任何蛋白組分。天然存在的重組酶識別由形成反向重復(fù)的近似9-20bp的稱為“半位點”的兩個相同序列組成的對稱靶位點，其中半位點序列由5-12bp的間隔區(qū)序列分開。來自酪氨酸整合酶家族的重組酶的特征在于具有酪氨酸作為用于DNA切割的活性位點親核體，而來自絲氨酸整合酶家族的重組酶使用絲氨酸、而非酪氨酸。

在本發(fā)明的一個實施方案中，其靶序列用于步驟(a)中且在步驟(h)和(j)中對其應(yīng)用分子定向進(jìn)化的至少一種已知重組酶屬于絲氨酸整合酶的家族。屬于絲氨酸整合酶的家族的優(yōu)選重組酶選自phiC31整合酶(COMBES等人，2002)、Gln或Hin重組系統(tǒng)的任何組分、Tn3解離酶(KRASNOW&COZZARELLI,1983)或大絲氨酸重組酶的任何其它成員、Rag1、Rag2或VDJ重組系統(tǒng)的任何其它組分或其變體。

在另一個實施方案中，所述重組酶屬于酪氨酸整合酶的家族。屬于酪氨酸整合酶的家族的優(yōu)選重組酶選自來自噬菌體P1的Cre(ABREMSKI等人，1983，1984)、來自酵母的FLP重組酶(VOLERT&BROACH,1986)、來自噬菌體D6的Dre(SAUER&MCDERMOTT,2004)、來自魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)質(zhì)粒pSR1的R重組酶、來自果蠅克魯維酵母(Kluveromyces drosophilarium)質(zhì)粒pKD1的A重組酶、來自沃氏克魯維酵母(Kluveromyces waltii)質(zhì)粒pKW1的A重組酶、來自芽孢桿菌轉(zhuǎn)座子Tn4430的TnpI、λInt重組系統(tǒng)的任何組分或其變體。優(yōu)選地，所述重組酶是Cre重組酶或其變體。

此上下文中的術(shù)語變體是指通過氨基酸的缺失、取代和/或添加而衍生自上述蛋白且保留衍生它們的蛋白中固有的一些或全部功能的蛋白。

在優(yōu)選的實施方案中，已知重組酶是通過例如如CRAMERI等人(1998)所述的“家族改組”獲得的嵌合重組酶。采用家族改組的先決條件是用于生成嵌合重組酶的重組酶之間的顯著同源性?？捎糜诒景l(fā)明中的嵌合重組酶的實例是分別由重組酶Cre的序列和重組酶Dre的序列組成的嵌合重組酶。

在一個更優(yōu)選實施方案中，所述重組酶是識別稱為loxP的34bp的對稱靶位點的Cre重組酶。loxP位點(和還有野生型重組酶的其它重組位點)是回文的，其具有由八個最內(nèi)部堿基對分開的兩個13bp重復(fù)，所述八個最內(nèi)部堿基對代表所謂的間隔區(qū)，其為位點賦予方向性。通過在間隔區(qū)序列內(nèi)的切割發(fā)生重組。根據(jù)兩個參與loxP位點的相對位置和取向，Cre催化DNA整合、切除或重排(HOESS&ABREMSKI,1985)。

一種有用的重組酶是分離自腸沙門氏菌(Salmonella enterica)的Zre或其變體、片段和同源物，例如與野生型序列具有至少約70％、至少約80％、至少約90％或至少約95％的同源性，且具有重組酶功能。Zre重組酶在zox位點重組DNA。它們可以單獨或在文庫的情況下用于開始本發(fā)明的方法。

在最優(yōu)選實施方案中，重組酶文庫用作分子進(jìn)化的起始點，例如，包含不同野生型和/或適應(yīng)/改組的重組酶的重組酶文庫，例如，如例如WO 2011/147590 A2的實施例2中所述。此類文庫優(yōu)選用作用于生成能夠識別SEQ ID NO:1或可替代地SEQ ID NO:2的修整重組酶的起始點。

通過本發(fā)明的方法獲得的修整重組酶能夠重組多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株的原病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列。由重組酶靶向的原病毒DNA可以插入宿主細(xì)胞的基因組中?；蛘?，本發(fā)明的修整重組酶可以重組多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株的原病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列，所述多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株尚未(仍未)整合至宿主細(xì)胞的基因組中，即作為非整合的整合前復(fù)合物(PIC)存在。因此，尚未整合至宿主細(xì)胞的基因組中的HIV以及已經(jīng)整合的HIV可以由本發(fā)明的修整重組酶滅活。

應(yīng)當(dāng)注意，在本發(fā)明中和還在本領(lǐng)域中，術(shù)語“靶序列”、“靶位點”和“重組位點”可互換使用。

與識別對稱靶位點的天然存在的重組酶相反，本發(fā)明的方法提供修整重組酶，其識別并非由通過間隔區(qū)分開的回文序列組成的靶位點。而是，在不對稱靶位點中，所述序列不形成對稱的反向重復(fù)。因此，能夠識別不對稱靶位點的修整重組酶應(yīng)當(dāng)識別和重組由不同序列的半位點組成的靶位點。

在不對稱靶位點內(nèi)，分別稱為“左半位點”和“右半位點”的序列通過其與已知靶位點的左半位點和右半位點的同源性來定義。位于與已知靶位點的左半位點和右半位點同源的序列之間的序列稱為間隔區(qū)。

然而，如果在LTR中發(fā)現(xiàn)僅與已知靶位點的左半位點或右半位點序列具有同源性的序列，則這些序列仍可用于本發(fā)明的實踐中。屬于重組酶(其天然靶序列顯示與LTR內(nèi)的序列的同源性)的靶位點的大小是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，如果在LTR序列內(nèi)發(fā)現(xiàn)與由Cre重組酶識別的靶序列的同源性，則由Cre重組酶識別的不對稱靶位點應(yīng)當(dāng)由34個核苷酸組成，其具有各自由8個核苷酸的間隔區(qū)分開的兩個13個核苷酸的半位點序列。因此，LTR內(nèi)的同源序列被定義為不對稱靶位點的左半位點或右半位點或間隔區(qū)，這取決于與已知靶位點的序列的同源性。因此，與已知靶序列的左半位點具有同源性的序列被定義為左半位點，與已知靶序列的右半位點具有同源性的序列被定義為右半位點。從該定義開始，在考慮已知靶位點的結(jié)構(gòu)的情況下，定義不對稱靶位點的其它部分。因此，已經(jīng)例如相對于與loxP位點(由Cre重組酶識別)的同源性定義LTR內(nèi)的右半位點序列，可以容易地定義對應(yīng)于間隔區(qū)和不對稱靶序列的左半位點的其它序列。間隔區(qū)序列例如通過計數(shù)定義為右半位點序列的序列的5'末端上游的8個核苷酸來定義，而左半位點序列類似地通過計數(shù)先前定義的間隔區(qū)序列的5'末端上游的13個核苷酸來定義。

在此上下文中以及在整個申請中的同源性意為序列同一性。對于同源目的的優(yōu)選比較是使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)比較至少兩個序列，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括但不限于，SMITH&WATERMAN(1981)的局部同源性算法、NEEDLEMAN&WUNSCH(1970)的同源性比對算法或PEARSON&LIPMAN(1988)的相似性搜索方法。為了本申請的目的，除非另有說明，序列同源性優(yōu)選使用可得自歐洲生物信息學(xué)研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)的ClustalW計算機(jī)程序確定。

鑒于原病毒的基因組中必須存在兩個相同靶位點以允許重組酶切除這兩個靶位點之間的序列的要求，在本發(fā)明方法的步驟(a)中查看在基因組中至少存在兩次的原病毒DNA的序列。此類序列是例如原病毒DNA的LTR序列。因此，優(yōu)選查看LTR的序列，因為原病毒DNA的5'-LTR和3'-LTR是相同的。存在于5'-LTR中的不對稱靶位點也存在于3'-LTR中，因此允許切除位于LTR之間的原病毒DNA。

在LTR序列內(nèi)鑒定的與已知靶位點具有足夠同源性的序列中，優(yōu)選選擇與已知重組酶的靶位點的序列具有最高同源性的序列。然而，也可選擇除了具有最高同源性的序列以外的序列，例如，存在于最高數(shù)目的逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株中或存在于目標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株中的那些序列，例如，如果患者感染特定毒株。

應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明方法的潛力甚至允許修整識別與已知靶位點具有小于30％同源性、例如至少11％或至少20％同源性的不對稱靶位點的重組酶。然而，為了確保各個不對稱靶位點或其亞位點的殘余重組活性的存在，優(yōu)選查看與已知重組酶的已知靶位點的左半位點和右半位點序列具有至少30％的同源性的序列。在進(jìn)一步優(yōu)選實施方案中，選擇與已知重組酶的已知靶位點的左半位點和右半位點序列具有至少31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、更優(yōu)選85％、特別優(yōu)選90％、并且最優(yōu)選95％的同源性的不對稱靶序列。

在本發(fā)明的一個實施方案中，在LTR內(nèi)選擇的序列與由位點特異性重組酶Cre識別的對稱loxP靶位點具有同源性。

在一個優(yōu)選實施方案中，重組酶文庫用作分子進(jìn)化的起始點，例如，包含不同野生型和/或適應(yīng)/改組的重組酶的重組酶文庫，諸如WO 2011/147590 A2的實施例2中描述的文庫。示例性文庫包含Cre和由其衍生的重組酶。其還可以包含Tre、Dre、來自沙門氏菌屬和希瓦氏菌屬的重組酶和/或由其衍生的重組酶。所述文庫可以包含，例如，Cre、Dre、Dre"Cre-ed"、希瓦氏菌重組酶(Shew)、Shew"Cre-ed"和/或Zre，如WO 2011/147590 A2中所公開。Tre是如WO 2008/083931所公開的修整重組酶，其也進(jìn)一步稱為Tre 1.0。

在一個實施方案中，所述文庫中的所有重組酶識別具有相同長度的間隔區(qū)的靶序列。包括間隔區(qū)的半位點序列1和2的總長度優(yōu)選為34個核苷酸。

如果所述至少一種重組酶是重組酶文庫，則同源性是與已知重組酶靶位點的匯集物的同源性(即，在給定位置與至少一個靶序列的同源性被定義為同源性)。因此，在步驟(c)中，僅僅是不對應(yīng)于至少一個已知靶序列中的核苷酸的那些核苷酸被定義為偏差核苷酸。在重組酶文庫的情況下，步驟(e)中的“天然核苷酸”可以是存在于任何已知靶序列中的該位置的核苷酸，優(yōu)選地，其為存在于幾個或大多數(shù)已知靶序列中的該位置的核苷酸。

為了鑒定存在于多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株中的靶序列，已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述的重組酶的已知識別位點可以用作對基因組的一段序列檢索保守的不對稱靶序列的查詢。然而，鑒于區(qū)域的重復(fù)性質(zhì)，排除使用標(biāo)準(zhǔn)序列相似性檢索工具。Sarkar等人，2007，使用BLAST(ALTSCHUL等人，1997)以在整個HIV毒株中發(fā)現(xiàn)lox樣結(jié)合位點。當(dāng)橫跨HIV-1LTR序列進(jìn)行時，對lox樣位點的BLAST檢索導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)存在于單一毒株中的僅一個位點。BLAST對于此類短冗余序列不能很好地進(jìn)行，并且替代程序諸如HMMER(EDDY等人，1998)、RepeatMasker或來自軟件包的Embosssuite的回文程序也證明是不合適的。用使用以基于重組酶的已知識別位點的側(cè)翼區(qū)域的位置權(quán)重矩陣為基礎(chǔ)的算法和在序列被轉(zhuǎn)換成比特串之后對其使用二進(jìn)制運算的特定程序，WO 2011/147590 A2鑒定了多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株中發(fā)現(xiàn)的不對稱靶序列。

對于HIV-1，測定合適的不對稱靶序列，其具有如下SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所述的序列。這使得有可能生成重組酶，其實際上可用作針對顯著數(shù)目的患者中的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的治療劑，因為這些重組酶靶向存在于盡可能多的逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株中的識別位點。

SEQ ID NO:1和2的左半位點和右半位點序列加下劃線，且間隔區(qū)以粗體印刷：

SEQ ID NO:1存在于96％的檢索的HIV-1亞型B毒株中(1024/1067)，92％的檢索的HIV-1亞型C毒株中(624/679)和82％的檢索的HIV-1亞型A毒株中(71/87)。SEQ ID NO:2在較低百分比的B亞型和C亞型毒株中是相同的。

SEQ ID NO:1與已知重組酶靶位點的匯集物具有54％的同源性，且SEQ ID NO:2與這些序列的匯集物具有42％的同源性(分別關(guān)于左半位點和右半位點)。與單獨已知靶位點的同源性較低，例如對于SEQ ID NO:1為至少30％，且對于SEQ ID NO:2為至少11％。具體而言，在與已知靶位點具有低單獨同源性的情況下，使用重組酶文庫作為起始材料可以是有利的，例如用于生成能夠重組SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的修整重組酶，所述文庫為包含Cre、Fre、Dre、Zre和Tre的文庫。

在本發(fā)明方法的步驟(b)中，與已知靶位點的左半位點同源的原病毒的LTR內(nèi)的不對稱靶位點的序列被定義為“半位點序列1”。與已知靶位點的右半位點同源的原病毒的LTR內(nèi)的不對稱靶位點的序列被定義為半位點序列2。代表左半位點和右半位點的序列之間的序列被稱為間隔區(qū)。

在步驟(c)中，通過序列比對和序列比較來確定與已知靶的相應(yīng)的同源左半位點和右半位點序列的序列不同的步驟(b)的序列的分別在“半位點序列1”和“半位點序列2”內(nèi)的核苷酸。在此上下文中，將“半位點序列1”的序列與相應(yīng)的天然半位點(其優(yōu)選為左半位點序列)進(jìn)行比較，而將“半位點序列2”的序列與形成回文天然靶位點的另一半位點(其優(yōu)選為右半位點序列)進(jìn)行比較。

WO 2011/147590 A2的圖1顯示了這種SEQ ID NO:1和2與重組酶文庫相比的比較的結(jié)果。在暗背景前顯示偏差核苷酸。

該比較不必在本發(fā)明方法的步驟(b)之后和步驟(d)之前進(jìn)行，但也可以在步驟(a)之后和步驟(e)之前的該方法的不同階段中進(jìn)行。

在步驟(d)中，生成包含靶序列的兩個靶核酸的第一子集，其中第一靶序列被稱為亞位點1，并且以5'至3'順序包含彼此相鄰的步驟(b)的半位點序列1、不對稱靶序列的間隔區(qū)序列和半位點序列1的反向重復(fù)，且其中第二靶序列被稱為亞位點2，并且以5'至3'順序包含彼此相鄰的半位點序列2的反向重復(fù)、不對稱靶序列的間隔區(qū)序列和步驟(b)的半位點序列2。第一子集的靶序列是具有對稱靶位點的結(jié)構(gòu)的回文寡核苷酸序列。這些人工對稱靶位點基于步驟(b)的半位點序列通過作為反向重復(fù)與每個寡核苷酸序列中缺失的半位點序列互補(bǔ)來合成，其中“半位點序列1”和“半位點序列2”的序列分別用于與在間隔區(qū)序列相對末端的第二半位點序列互補(bǔ)。因此，第一子集中的第一靶序列(稱為“亞位點1”)包含由通過間隔區(qū)序列分開的“半位點序列1”和反向重復(fù)的“半位點序列”組成的反向重復(fù)，而第一子集中的第二靶序列(稱為“亞位點2”)包含由通過間隔區(qū)序列分開的反向重復(fù)的“半位點序列2”和“半位點序列2”組成的反向重復(fù)。在“亞位點1”中，所述序列如下排列：5'-"半位點序列1"-間隔區(qū)-"半位點序列1的反向重復(fù)’"-3'，在“亞位點2”中，所述序列如下排列：5'-"半位點序列2的反向重復(fù)”’-間隔區(qū)-"半位點序列2"-3'。

所述第一子集的每兩個合成靶序列內(nèi)的間隔區(qū)序列是優(yōu)選相同的，并且對應(yīng)于代表或定義為不對稱靶位點的間隔區(qū)序列的LTR的序列。然而，在另一個實施方案中，所述間隔區(qū)序列可以包含源自核苷酸取代的一個或兩個序列偏差。

通常，該步驟代表選擇用于修整特異性重組酶的不對稱靶位點的序列的第一分割(參見WO 2008/083931的圖1，其完全通過引用并入本文，和WO 2011/147590 A2的圖2，其也完全通過引用并入本文)。在此步驟中生成序列，其攜帶衍生自選擇用于修整特定重組酶的不對稱靶位點的半位點的對稱靶位點。結(jié)果是，存在于所述不對稱靶位點的一個半位點中的每個突變(即，與原始(野生型)重組酶識別的靶位點的差異)現(xiàn)在已經(jīng)分布于第一子集中的對稱靶標(biāo)序列之間。

在本發(fā)明方法的步驟(e)中，基于步驟(d)的第一子集中的靶序列生成包含修飾的靶序列的靶核酸的第二子集。在基于亞位點1的序列中，在左半位點序列中，與步驟(a)的至少一個已知靶位點的相應(yīng)同源半位點序列不同的一部分核苷酸被所述已知靶位點中發(fā)現(xiàn)的天然核苷酸替代，直至所述半位點序列含有與所述已知靶位點不同的一個、兩個或三個(優(yōu)選兩個)核苷酸，其中所述修飾的靶序列的右半位點由所述修飾的左半位點序列的反向重復(fù)形成，所述修飾的左半位點序列的反向重復(fù)通過不對稱靶序列的間隔區(qū)序列與所述修飾的左半位點序列分開。

在基于亞位點2的序列中，在右半位點序列中，與步驟(a)的至少一個已知靶位點的相應(yīng)同源半位點序列不同的一部分核苷酸被所述已知靶位點中發(fā)現(xiàn)的天然核苷酸替代，直至所述半位點序列含有與所述已知靶位點不同的一個、兩個或三個(優(yōu)選兩個)核苷酸，其中所述修飾的靶序列的左半位點由所述修飾的右半位點序列的反向重復(fù)形成，所述修飾的右半位點序列的反向重復(fù)通過不對稱靶序列的間隔區(qū)序列與所述修飾的右半位點序列分開。

例如，如果一個亞位點包含六個偏差核苷酸，諸如關(guān)于WO 2011/147590 A2的圖1中顯示的重組酶的文庫，基于SEQ ID NO:1的兩個亞位點或SEQ ID NO:2的亞位點2，則可以基于所述亞位點生成三個修飾的靶序列，其各自在左半位點(如果基于亞位點1)或右半位點(如果基于亞位點2)含有兩個(不同的)偏差核苷酸。因此，在每個修飾的靶序列中，將各自亞位點的序列修飾為對應(yīng)于四個核苷酸中的已知靶序列(或至少一個已知靶序列)的序列(WO2011/147590 A2的圖2)。當(dāng)然，也可生成六個修飾的靶序列(其各自含有偏差核苷酸之一)或兩個靶序列(其各自含有偏差核苷酸中的三個)。

在另一個實例中，如果一個亞位點包含九個偏差核苷酸，諸如關(guān)于WO 2011/147590A2的圖1中顯示的重組酶的文庫，SEQ ID NO:2的亞位點1，則可以基于所述亞位點生成三個修飾的靶序列，其各自在半位點中含有三個(不同的)偏差核苷酸。

結(jié)果是，在放在一起的源自步驟(d)的第一子集的一個靶序列的所有修飾的半位點序列中，可以發(fā)現(xiàn)所有偏差核苷酸，而所述修飾的半位點序列無一單獨包含所有偏差核苷酸。

再次，基于修飾的半位點序列生成反向重復(fù)，使得間隔區(qū)序列將形成所述反向重復(fù)的兩個序列分開(參見WO 2011/147590 A2的圖2)。衍生自較高子集的靶序列的新子集的每個修飾的靶序列內(nèi)的間隔區(qū)序列是優(yōu)選相同的，并且對應(yīng)于代表或定義為不對稱靶位點的間隔區(qū)序列的LTR的序列。然而，在另一個實施方案中，所述間隔區(qū)序列可以包含源自核苷酸取代的一個或兩個序列偏差。使用該方法，代表每個子集的靶序列中的突變(即與野生型重組酶識別的靶位點的差異)的數(shù)目小于起始不對稱靶序列中的數(shù)目，但所有突變?nèi)匀辉诎行蛄兄恢斜硎?參見WO 2008/083931的圖1，WO 2011/147590 A2的圖2)。

如本文所使用的術(shù)語“偏差核苷酸”是指LTR內(nèi)鑒定或定義的不對稱靶序列內(nèi)的核苷酸或根據(jù)本發(fā)明生成的子集的靶序列內(nèi)的核苷酸，其與本發(fā)明方法的步驟(a)中選擇的已知重組酶的已知同源對稱靶序列的相應(yīng)同源序列中的相同位置存在的核苷酸有偏差(即不同)。在此上下文中，術(shù)語“偏差核苷酸”和“突變”可互換使用。

WO 2008/083931教導(dǎo)，如果用作底物的靶序列與天然靶序列相差不超過3個核苷酸，則可以使用分子定向進(jìn)化使用靶序列作為底物來修整重組酶。因此，上述不同順序的子集的生成用于將每個靶序列的偏差核苷酸的數(shù)目減少至3個或更少(參見WO 2008/083931的圖1)。偏差核苷酸的數(shù)目的逐步減少最終得到具有減少數(shù)目的偏差核苷酸的不同順序的靶序列的許多子集，直至產(chǎn)生可以用作分子定向進(jìn)化的底物的最終子集。當(dāng)生成不同的子集并由此減少偏差核苷酸的數(shù)目時，與野生型重組酶識別的靶位點的差異分布于各自不包含這些偏差核苷酸中的多于3個的幾個靶序列之間，而作為整體的最終順序的靶序列仍然代表所有偏差核苷酸。

任選地，在本發(fā)明的方法中，可以從第二子集的靶序列開始通過如下生成靶序列的其它子集：逐步重復(fù)步驟(e)的過程，即，將靶序列分成各自半位點序列，且在改變衍生自第二子集的靶序列的半位點的序列之后基于這些半位點序列生成新的回文結(jié)構(gòu)，每次生成靶序列的新子集，其中用于生成反向重復(fù)的半位點序列含有與至少一個已知靶位點的相應(yīng)同源半位點序列不同的較少核苷酸。這些額外靶序列可以用于定向分子進(jìn)化和重組酶文庫的改組的額外步驟。當(dāng)然，此額外步驟也可以僅對所述序列中的一些、例如對其中獲得具有低重組效率的重組酶的序列進(jìn)行。如果生成額外子集且在這些上進(jìn)化的重組酶，則在本發(fā)明方法的步驟(f)中使用重組酶的進(jìn)化文庫。

從步驟(e)中獲得的靶序列的第二子集開始，可以生成第三子集，隨后如果需要，生成第四、第五、第六子集等。然而，如果第二子集的靶序列仍然含有多于三個偏差核苷酸，則第三子集的生成通常僅是必需的。然而，如果先前子集的靶序列仍然含有多于三個偏差核苷酸，則其適用于生成下一子集，這僅是必需的。應(yīng)當(dāng)注意，在一個實施方案中，將生成靶序列的子集，直至最終子集的靶序列僅包含一個偏差核苷酸。因此，根據(jù)每個半位點序列中的偏差核苷酸的數(shù)目，對于不對稱靶位點的每個半位點序列生成的子集的數(shù)目可以不同。例如可能需要為左半位點序列僅生成兩個子集，而對于右半位點必須生成三個或四個子集，以便將所述偏差核苷酸分布于幾個靶序列之間，使得單個靶序列不包含這些偏差核苷酸的多于3個。

WO 2008/083931的圖1中舉例說明了生成靶序列的進(jìn)一步子集以將偏差核苷酸的數(shù)目減少至低于3的數(shù)目的原理，且WO 2011/147590 A2的圖2提供了修飾的靶序列的具體實例。

在步驟(f)中，使用步驟(e)中獲得的含有一個、兩個或三個與步驟(a)的已知同源靶位點的相應(yīng)同源半位點序列不同的核苷酸的最終或第二子集的靶序列作為底物，對識別所述已知同源靶位點的至少一種重組酶應(yīng)用分子定向進(jìn)化的方法。

如本文所使用的術(shù)語“最終子集”是指步驟(e)中生成的最后子集，即，如果對第二子集沒有生成額外子集。取決于不對稱靶位點中的偏差核苷酸的數(shù)目和必須生成以便將每個靶序列的偏差核苷酸的數(shù)目減少至低于3的子集的數(shù)目，所述“最終子集”可以對應(yīng)于任何子集，例如第二、第三、第四或更后面的子集，并且對于LTR內(nèi)的不對稱靶序列的半位點序列可以不同。如果先前已經(jīng)在具有與所述已知同源靶位點的相應(yīng)同源半位點序列不同的較少核苷酸的修飾靶序列的額外子集上進(jìn)化了重組酶，則使用該步驟中獲得的重組酶。

當(dāng)然，可以用針對特定修飾靶序列的特定重組酶和針對另一特定修飾靶序列的另一重組酶(或文庫)開始本發(fā)明的方法。分子定向進(jìn)化的方法，也稱為實驗室進(jìn)化或體外進(jìn)化，是本領(lǐng)域已知的(對于綜述，參見YUAN等人，2005及其中的參考文獻(xiàn)；JOHANNES&ZHAO,2006)。

在分子定向進(jìn)化的第一步驟中，通過本領(lǐng)域已知的方法，例如，通過使用易錯PCR和DNA改組(在例如YUAN等人，2005中綜述)或國際專利申請WO 2002/44409中公開的方法，生成隨機(jī)突變的重組酶序列的文庫。包含突變的重組酶的每個文庫的質(zhì)粒也含有步驟(f)中獲得的最終子集的靶序列之一。在將生成的質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)染至適當(dāng)細(xì)胞中之后，能夠進(jìn)行重組酶的表達(dá)，并且實施分子定向進(jìn)化，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。

在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明方法的步驟(f)中采用的分子定向進(jìn)化是底物連接的蛋白進(jìn)化(SLiPE；Buchholz&Stewart,2001；國際專利申請WO 02/44409)?？梢詫嵤┑孜镞B接的蛋白進(jìn)化，如WO 2008/083931或WO 2011/147590 A2的實施例中所詳細(xì)描述。簡言之，將步驟(e)中獲得的靶序列與隨機(jī)突變的重組酶的編碼序列一起克隆至質(zhì)粒(所謂的進(jìn)化載體)中。隨機(jī)突變通過易錯PCR實施(參見BUCHHOLZ&STEWART,2001)。然后將生成的質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)染至大腸桿菌細(xì)胞中以允許重組酶的表達(dá)。通過使用誘導(dǎo)型啟動子以驅(qū)動重組酶的表達(dá)，可以調(diào)節(jié)表達(dá)水平。孵育過夜之后，從細(xì)胞分離質(zhì)粒DNA，并用NdeI消化以切割未重組的質(zhì)粒，并且隨后用引物僅擴(kuò)增重組的質(zhì)粒。重組形式的質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生1.7Kb條帶。PCR產(chǎn)物用BsrGI和XbaI消化，并亞克隆回類似消化的進(jìn)化載體用于下一進(jìn)化循環(huán)。

在步驟(g)中，組合并改組步驟(f)中進(jìn)化的重組酶文庫。DNA改組的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(對于綜述，參見MINSHULL&STEMMER,1999；STEMMER,1994)。組合并改組基于亞位點1在修飾靶序列上進(jìn)化的重組酶文庫，并且分開地，組合并改組基于亞位點2在修飾靶序列上進(jìn)化的重組酶文庫。然后將組合和改組的文庫克隆至包含下一更高子集的靶序列的新一代載體中，即如果生成生兩個子集，則下一更高子集為步驟(d)中生成的子集。例如，基于亞位點1在序列上進(jìn)化的文庫的載體包含亞位點1的序列作為靶序列，并且基于亞位點2在序列上進(jìn)化的文庫的載體包含亞位點2的序列作為靶序列。

在步驟(h)中，使用下一更高子集的靶序列對步驟(g)中獲得的改組文庫應(yīng)用分子定向進(jìn)化的方法，其如所討論可以是根據(jù)步驟(d)的子集。在該步驟中，可以使用與步驟(f)中之前應(yīng)用方法相同的分子定向進(jìn)化方法，但也可以在本發(fā)明方法的該步驟中使用不同的分子定向進(jìn)化方法。分子定向進(jìn)化的不同方法的實例描述于例如YUAN等人(2005)。優(yōu)選地，底物連接的蛋白進(jìn)化的方法也應(yīng)用于組合和改組的文庫。

該步驟得到識別并重組攜帶來自較低子集的不同靶序列的的突變的組合(并且因此增加數(shù)目)的靶序列的重組酶。來自靶序列的較低子集的不同文庫的突變的組合產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，并導(dǎo)致重組酶的產(chǎn)生，其現(xiàn)在重組更高子集的靶序列，證明穿過中間物的進(jìn)化策略可以用于實現(xiàn)期望活性。

在步驟(i)中，重復(fù)步驟(g)，即重組酶文庫的組合和改組，和(j)，即對組合和改組文庫應(yīng)用分子定向進(jìn)化，直至獲得至少一種重組酶，其對存在于原病毒DNA的LTR中的不對稱靶序列具有活性。

在其中必需生成靶序列的兩個子集以生成僅具有一個、兩個或三個核苷酸偏差的靶序列的方法中，將例如對于靶序列的第二子集進(jìn)化的重組酶文庫組合和改組，并且使用第一子集的靶序列對此改組文庫應(yīng)用分子定向進(jìn)化。在下一步驟中，使用原病毒DNA的LTR內(nèi)的步驟(a)的不對稱靶序列通過分子定向進(jìn)化以使包含識別第一子集的靶序列的重組酶的重組酶文庫進(jìn)化，以獲得至少一種重組酶，其對逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列具有活性。在此步驟中，分子定向進(jìn)化的方法優(yōu)選是底物連接的蛋白進(jìn)化的方法。

“至少一種重組酶”是指以下事實：本發(fā)明的方法可導(dǎo)致一種或多種(單一)重組酶，其各自本身在重組不對稱靶序列中具有活性。其不意欲涵蓋幾種不同的重組酶，所述幾種不同的重組酶僅在一起能夠重組不對稱靶序列。事實上，本發(fā)明的方法不會導(dǎo)致選擇重組酶，所述重組酶需要與其它、不同的重組酶組合以重組不對稱靶序列，因為每個單獨細(xì)胞僅表達(dá)一種重組酶。

方法步驟(a)-(j)本質(zhì)上是本領(lǐng)域已知的，特別是從WO2011/147590已知。

在步驟(j)之后，針對根據(jù)步驟(a)的已知對稱靶位點的重組，例如針對loxP和/或loxH的重組，陰性選擇修整重組酶的文庫。

可以通過包含靶向分子進(jìn)化和載體文庫的改組的一個或多個步驟的至少一個循環(huán)來實現(xiàn)該選擇。

為此，編碼先前步驟中進(jìn)化的至少一種修整重組酶的核酸可以從其中使用的載體分離，并克隆至合適的進(jìn)化載體中。所述載體允許陰性選擇重組根據(jù)步驟(a)的已知靶位點，例如用于重組loxP(SEQ ID NO:4)和/或loxH(SEQ ID NO:5)的修整重組酶。由此獲得載體的文庫。然后利用如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且根據(jù)上述原理的分子定向進(jìn)化，優(yōu)選地，底物連接的蛋白進(jìn)化(SLiPE)。

例如，可以構(gòu)建進(jìn)化載體，使得其包含最終不對稱靶序列(例如SEQ ID NO:1)和已知靶位點(例如，loxP和/或loxH)，各兩次以允許重組。在已知靶位點處的重組和隨后的限制性消化導(dǎo)致線性產(chǎn)物，其不包含以允許產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增的順序的兩個特異性引物位點。如果完全不發(fā)生重組，則通過限制性消化將載體線性化，并且不發(fā)生通過PCR的擴(kuò)增。相比之下，在最終不對稱靶位點(例如SEQ ID NO:1)處的重組切除限制性位點，即載體不通過限制性消化線性化，并且可以通過PCR擴(kuò)增修整重組酶。固有地產(chǎn)生誤差的PCR用于產(chǎn)生變異性。可以在大腸桿菌中實施進(jìn)化。

可以改組在一個或多個、優(yōu)選地約十個循環(huán)的分子定向進(jìn)化之后獲得的文庫?？梢詫嵤┓肿佣ㄏ蜻M(jìn)化和/或改組的一個或多個進(jìn)一步循環(huán)。

任選地，可以交替地實施用于重組幾個已知靶位點、例如用于重組loxP和loxH的陰性選擇，例如，對loxP的陰性選擇的進(jìn)化的一個循環(huán)可以與對loxH的陰性選擇的進(jìn)化的一個循環(huán)交替。例如，可以實施約10至約30或約15-20個循環(huán)的陰性選擇，其與約兩輪的DNA改組組合。在這些進(jìn)化循環(huán)之間，可以改變轉(zhuǎn)錄激活物L(fēng)-阿拉伯糖的量，例如100μg/mL至1μg/mL。優(yōu)選的載體和方法顯示于圖2和實施例中。

在已經(jīng)實施多個進(jìn)化循環(huán)之后，可以針對一個或多個克隆檢查修整重組酶對最終不對稱靶序列的特異性和對已知靶序列的潛在殘余活性。

如果特異性還不令人滿意，則應(yīng)當(dāng)實施進(jìn)一步進(jìn)化循環(huán)。

如圖3中所示，所述陰性選擇去除修整重組酶(諸如由WO 2011/147590 A2(TRE3)教導(dǎo)的那些)對loxP和loxH的已知靶序列的殘余活性。本發(fā)明的生成的重組酶對已知靶位點(例如loxP和/或loxH)的殘余活性甚至在大量(50或100μg/ml)轉(zhuǎn)錄激活物L(fēng)-阿拉伯糖存在的情況下，即，在大量重組酶存在的情況下是檢測不到的。這顯示獲得的修整重組酶對于其靶序列(在該情況下，對于SEQ ID NO:1)是高度特異性的，因為特定不對稱靶序列被重組，但已知對稱靶序列不被重組。

這具有這樣的優(yōu)點，當(dāng)對于人療法應(yīng)用本發(fā)明的修整重組酶時，宿主細(xì)胞中與人序列的交叉反應(yīng)和人序列的重組的風(fēng)險是最小的。這是有助于修整重組酶在人細(xì)胞中的耐受性的一個因素。然而，不僅重組酶的表達(dá)的短期結(jié)果在這里是問題，而且，甚至在低效力下，安全方面，諸如非特異性重組的可能致癌作用也是問題。修整重組酶的甚至殘余活性的消除因此有助于所得修整重組酶在治療環(huán)境中的安全性和可靠性。

針對已知對稱靶序列的重組的選擇之后是選擇在人細(xì)胞中良好耐受的修整重組酶。

在本發(fā)明方法的步驟(n)中，分離編碼步驟(m)中獲得的至少一種修整重組酶的核酸并克隆至用于在真核細(xì)胞(優(yōu)選地，人細(xì)胞)中表達(dá)編碼的重組酶和可選擇標(biāo)記的載體中，由此獲得載體文庫?？梢允褂眠m當(dāng)?shù)南拗菩悦笍奈膸靸?nèi)的各自的質(zhì)粒分離核酸。限制性內(nèi)切酶消化的方法是技術(shù)人員已知的。然后可以通過已知方法諸如凝膠電泳回收編碼重組酶的核酸?？梢詫⑵淇寺≈劣糜谠谡婧思?xì)胞(例如人細(xì)胞)中表達(dá)的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，如本領(lǐng)域已知或如下所述。例如，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如慢病毒載體，例如，如圖4A中所示。編碼的修整重組酶和可選擇標(biāo)記的表達(dá)優(yōu)選是組成型的，或者其可以通過合適的試劑誘導(dǎo)。

所述可選擇標(biāo)記可以賦予對抗生素的抗性，或者其可以是熒光蛋白諸如綠色熒光蛋白(GFP)或其衍生物(例如，EBFB、ECFP、YFP)。熒光蛋白諸如GFP允許根據(jù)表達(dá)強(qiáng)度容易地分選細(xì)胞。

在步驟(1)中，用步驟(k)中獲得的所述載體文庫轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞，優(yōu)選人T細(xì)胞?？梢允褂矛F(xiàn)有技術(shù)中已知的方法。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通常是人細(xì)胞，然而，如果意欲治療非人患者，則建議測試在該患者物種的細(xì)胞中的耐受性。所述人細(xì)胞優(yōu)選是造血細(xì)胞，例如優(yōu)選T細(xì)胞，特別是CD4+T細(xì)胞，但也可以使用干細(xì)胞，諸如CD34+干細(xì)胞?？梢允褂迷?xì)胞，例如原代T細(xì)胞，優(yōu)選原代CD4+T細(xì)胞，但也可以采用細(xì)胞系，諸如Jurkat T細(xì)胞。

在步驟(p)中，將表達(dá)所述可選擇標(biāo)記的細(xì)胞培養(yǎng)足以選擇被人細(xì)胞良好耐受的TRE重組酶的一段時間。所述選擇基于標(biāo)記和修整重組酶的表達(dá)相關(guān)的假設(shè)。針對標(biāo)記的表達(dá)選擇細(xì)胞，例如選擇GFP陽性細(xì)胞，優(yōu)選具有GFP強(qiáng)表達(dá)的細(xì)胞。由于可選擇標(biāo)記和修整重組酶的表達(dá)相關(guān)，這些細(xì)胞也將表達(dá)修整重組酶。因此，在量上消除或減少表達(dá)對其存活或其繁殖能力有害的修整重組酶的細(xì)胞。優(yōu)選地，將表達(dá)該標(biāo)記的細(xì)胞培養(yǎng)至少1周、至少兩周、至少3周或至少4周。因此，T細(xì)胞中表達(dá)的修整重組酶將被人細(xì)胞、例如人T細(xì)胞良好耐受，即其對所述細(xì)胞無毒，或者優(yōu)選地也對所述細(xì)胞的存活和繁殖無害。優(yōu)選地，在培養(yǎng)期間，針對可選擇標(biāo)記的高表達(dá)，將細(xì)胞選擇至少一次，優(yōu)選2、3或4次。例如，用熒光蛋白，可以通過熒光激活的細(xì)胞分選進(jìn)行選擇。用抗生素抗性基因，可以向培養(yǎng)基中添加漸增量的抗生素。

盡管野生型Cre重組酶在人細(xì)胞中的表達(dá)已經(jīng)長時間建立且已經(jīng)以合理表達(dá)水平顯示沒有問題，但Cre的過表達(dá)可以是有毒的(LOONSTRA等人，2001)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，顯著數(shù)目的根據(jù)本發(fā)明的突變的修整重組酶在強(qiáng)過表達(dá)時對人T細(xì)胞的存活和/或繁殖是有害的。有趣的是，即使可以預(yù)期相對低的修整重組酶的特異性以及對靶位點諸如loxP和loxH(人基因組中存在的序列)的殘余活性導(dǎo)致人細(xì)胞中的低耐受性，僅選擇人T細(xì)胞中的耐受性，而無先前對高特異性的選擇，不足以消除對loxP或loxH的殘余交叉反應(yīng)性。因此，僅兩個選擇步驟與本發(fā)明的先前已知方法的組合導(dǎo)致良好耐受和高度特異性的修整重組酶。

在步驟(q)中，培養(yǎng)和選擇步驟之后是從步驟(p)中獲得的表達(dá)所述可選擇標(biāo)記的細(xì)胞分離編碼至少一種重組酶的核酸。

步驟(r)是任選的，并且增加編碼重組酶的核酸的另一選擇，所述重組酶能夠重組步驟(a)的不對稱靶序列、優(yōu)選以高活性重組。優(yōu)選在人細(xì)胞、特別是人CD4+T細(xì)胞中測試重組活性，但其也可以在大腸桿菌中測試。

在步驟(s)中，從文庫中分離對逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的LTR內(nèi)的步驟(a)的不對稱靶序列具有活性的重組酶的核酸。可以使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笍奈膸靸?nèi)的各自質(zhì)粒分離核酸。限制性內(nèi)切酶消化的方法是技術(shù)人員已知的。然后可以通過已知方法諸如凝膠電泳回收編碼重組酶的核酸。

核酸可以儲存(優(yōu)選在低于-80℃的溫度下)，或者可以任選地在步驟(t)中克隆至表達(dá)載體中，其用于進(jìn)一步分析，用于蛋白表達(dá)方法，或用于施用于受試者以供治療和/或預(yù)防逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，特別是HIV感染和/或AIDS。合適的表達(dá)載體在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的或如下公開。

特異性靶向多個HIV-l LTR內(nèi)的不對稱序列諸如SEQ ID NO:1的修整重組酶的開發(fā)允許從大多數(shù)感染HIV-1的受試者的原病毒染色體整合切除各自的原病毒。編碼此重組酶的表達(dá)載體，用其轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和/或由其衍生的重組酶蛋白具有醫(yī)學(xué)用途，例如治療和/或預(yù)防HIV-1感染。制備此修整重組酶或編碼其的表達(dá)載體的優(yōu)選方法在WO 2011/147590中教導(dǎo)。本發(fā)明人向WO 2011/147590中描述的方法添加以下步驟：對于高特異性進(jìn)行活性選擇，即對步驟(a)的已知靶序列(或?qū)鏻oxP和loxH)沒有可檢測的交叉反應(yīng)性，和對于修整重組酶在人細(xì)胞(諸如人T細(xì)胞)中的耐受性進(jìn)行活性選擇。如所述，這顯著改善修整重組酶用于從人T細(xì)胞切除HIV原病毒基因組的醫(yī)學(xué)用途。

可以插入宿主細(xì)胞的基因組中或可能尚未插入的原病毒DNA優(yōu)選是逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA。逆轉(zhuǎn)錄病毒包含包膜RNA病毒的大型和多種家族。所述家族的標(biāo)志特征是其復(fù)制策略，其包括將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成線性雙鏈DNA和隨后將該DNA(原病毒DNA)整合至宿主細(xì)胞的基因組中作為必要步驟。將逆轉(zhuǎn)錄病毒被細(xì)分為由進(jìn)化相關(guān)性定義的七個組。這些組中的5個(α-、β-、δ-、ε-和γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒)代表具有致癌潛力的逆轉(zhuǎn)錄病毒，并且其它兩組是慢病毒和泡沫病毒。人致病性人T細(xì)胞白血病病毒I型和II型(HTLV-I和HTLV-II)屬于δ-逆轉(zhuǎn)錄病毒組，而AIDS病毒人免疫缺陷病毒1型和2型(HIV-1和HIV-2)屬于慢病毒組(關(guān)于綜述，參見標(biāo)準(zhǔn)教科書“逆轉(zhuǎn)錄病毒”，COFFIN JM、HUGHES SH、VAR US HE(編)，1997,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)。

在一個實施方案中，可以插入宿主細(xì)胞的基因組的原病毒DNA是逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒選自以下：小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、Mason Pfizer猴病毒(MPMV)、人T細(xì)胞白血病病毒I型(HTLV-I)、人T細(xì)胞白血病病毒II型(HTLV-II)、猿猴T細(xì)胞白血病病毒I型(STLV-I)、猿猴T細(xì)胞白血病病毒II型(STLV-II)、牛白血病病毒(BLV)、貓白血病病毒(FeLV)和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)。

在另一個實施方案中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是慢病毒，其選自人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、Maedi-visna病毒(MVV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)和山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)。如上所述，HIV、特別是HIV-1是優(yōu)選的。

本發(fā)明方法的步驟(a)中鑒定的不對稱靶序列位于HIV原病毒的5'-LTR和3'-LTR中。優(yōu)選地，所述位于HIV原病毒的5'-LTR和3'-LTR中的不對稱靶序列具有如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所述的序列。

在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明方法中應(yīng)用的分子定向進(jìn)化的方法是底物連接的蛋白進(jìn)化的方法(SLiPE；BUCHHOLZ&STEWART,2001；還參見WO 02/44409)。

通過實施如本文所述的本發(fā)明方法，本發(fā)明人生成了編碼良好耐受的修整重組酶的幾種核酸和修整重組酶本身。因此，本發(fā)明提供了良好耐受的修整重組酶，或編碼其的核酸，所述修整重組酶包含根據(jù)SEQ ID NO:9-13中任一個的序列或由其組成。

令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，這些修整重組酶不同于如WO 2011/147590所教導(dǎo)的能夠重組不對稱靶序列的修整重組酶的共有序列SEQ ID NO:7和8，以及所有其它先前已知的重組酶。

具體而言，新分析的能夠以高特異性重組SEQ ID NO:1的不對稱靶序列的良好耐受的修整重組酶令人驚訝地包含Q89L突變。

在一個實施方案中，本發(fā)明的修整重組酶包含根據(jù)SEQ ID NO:9的序列(Tre 3.1共有序列85％)。SEQ ID NO:9代表共有序列，其中每個突變(與Cre氨基酸序列相比)以85％的概率存在。對于該測定，通過Sanger測序分析通過本發(fā)明方法生成的100個單個克隆，以及通過下一代測序分析整個生成的Tre 3.1文庫(獨特200bp-序列的33,000個讀數(shù))?？勺儼被嵊蒟代表，其可以代表任何天然存在的氨基酸(參見圖1)。SEQ ID NO:9的氨基酸的約三分之一是高度可變的，即這些位置不需要是保守的，以便重組酶能夠重組SEQ ID NO:1的不對稱靶序列且被人良好耐受。另一方面，所述氨基酸位置中的約三分之二對于以高特異性重組SEQ ID NO:1的不對稱靶序列和/或被人良好耐受似乎是重要的。

在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的修整重組酶包含根據(jù)SEQ ID NO:11-13中任一個、最優(yōu)選SEQ ID NO:11的序列。這些修整重組酶針對其特異性進(jìn)行選擇，即，盡管根據(jù)本發(fā)明生成的其它重組酶仍然對loxP、loxH或lox LTR 1.0具有低、但可檢測的重組活性，但用SEQ ID NO:11-13的重組酶，此重組活性不是可檢測的，如實施例中所示。因此，本發(fā)明提供能夠重組可以插入宿主細(xì)胞的基因組中的多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株的原病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列的良好耐受且高度特異性的修整重組酶(即，功能性修整重組酶)，其優(yōu)選包含SEQ ID NO:11-13，優(yōu)選SEQ ID NO:11。此修整重組酶是例如根據(jù)本發(fā)明方法可獲得的。

在一個實施方案中，所述修整重組酶可以包含根據(jù)SEQ ID NO:10的序列。該序列，Tre 3.1共有序列100％(3個克隆)，是SEQ ID NO:11-13的三種優(yōu)選重組酶的共有序列。

所述修整重組酶還可以與SEQ ID NO:10具有至少95％氨基酸同一性，優(yōu)選地，至少99％氨基酸同一性或100％氨基酸同一性，或者其可以與SEQ ID NO:10相差僅一個或兩個氨基酸，且其與Cre序列(SEQ ID NO:6)相比包含以下定義的氨基酸交換：V7L、P12S、P15L、M30V、H40R、M44V、S51T、Y77H、K86N、Q89L、G93A、S108G、C155G、A175S、A249V、R259D、E262R、T268A、D278G、P307A、N317T、I320S。其還可以包含以下交換：N160T、R241Q、K244I、N319E。優(yōu)選地，其與Cre相比包含以下氨基酸交換：N3I、V7L、N10S、P12S、P15L、V23A、M30V、F31L、H40R、M44V、S51T、Y77H、K86N、Q89L、G93A、S102F、S108G、N111D、K122R、A131T、S147A、D153E、C155G、N160T、F163L、I166V、I174V、A175S、V182I、G198S、D232S、R241Q、K244I、A249V、Q255R、R259D、A260V、E262R、G263K、T268A、D278G、P307A、N317T、N319E、I320S。

這些特定交換使得酶特別適合于在SEQ ID NO:1的靶序列或與SEQ ID NO:1具有高序列同一性(例如，與SEQ ID NO:1至少80％、至少90％或至少95％序列同一性)的靶序列處重組。本發(fā)明人可以令人驚訝地顯示單個氨基酸變異，即Q89L，確保所述修整重組酶在人細(xì)胞、例如人造血細(xì)胞或人T細(xì)胞中被良好耐受，且具有高特異性，因為其在重組原始靶序列l(wèi)oxP或loxH中不具有任何可檢測活性，并且優(yōu)選對loxLTR Tre 1也沒有可檢測的活性?？梢酝ㄟ^包含loxP(SEQ ID NO:4)、loxH(SEQ ID NO:5)，或者，為了比較，包含SEQ ID NO:1的loxLTR Tre 3(各自與所述修整重組酶接觸)的樣品的凝膠電泳來檢測活性，例如通過從合適的載體誘導(dǎo)其表達(dá)，如實施例和圖3中所示。如所述圖中可見，Tre 3.0重組酶(根據(jù)WO 2011/147590產(chǎn)生)，盡管與其它重組酶相比已經(jīng)相當(dāng)有特異性，但在所示條件下對loxP和loxH具有殘余活性，而對于uTre(本發(fā)明的重組酶)，重組產(chǎn)物僅對于包含SEQ ID NO:1的loxLTR可見。此高度特異性盡可能降低人基因組中的不期望重組的風(fēng)險。

WO 2008/083931或WO 2011/147590中沒有公開本發(fā)明的修整重組酶的序列。具體而言，現(xiàn)有技術(shù)沒有教導(dǎo)或暗示能夠重組SEQ ID NO:1的不對稱靶序列的修整重組酶具有氨基酸交換Q89L。相比之下，WO 2011/147590明確地教導(dǎo)，該位置應(yīng)當(dāng)保持為Q(參見所述公開的所有特定序列或共有序列)。本發(fā)明的修整重組酶的序列也不同于天然存在的重組酶，諸如Cre、Dre、Fre或Zre，這從其能夠重組可以插入宿主細(xì)胞的基因組中的多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株的原病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列、優(yōu)選SEQ ID NO:1的特征顯而易見。

如果能夠重組插入宿主細(xì)胞的基因組中的多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株的原病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列的修整重組酶將重組SEQ ID NO:1的靶序列，則其優(yōu)選包含共有序列Tre3.1 85％，SEQ ID NO:9，或Tre 3.1共有序列100％，SEQ ID NO:10，或特定序列SEQ ID NO:11-13之一。

能夠重組可以插入宿主細(xì)胞的基因組中的多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株的原病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列的功能性修整重組酶(其可以例如通過本發(fā)明方法獲得)可以與所述序列不同，但所述序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供有價值的指導(dǎo)以產(chǎn)生能夠重組不對稱靶側(cè)諸如SEQ ID NO:1的修整重組酶，甚至不實施本發(fā)明方法。

優(yōu)選地，相對于參考序列的氨基酸交換是保守取代，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(例如Creighton(1984),Proteins.W.H.Freeman和Company(編輯))。例如，保守取代用另一氨基酸取代來自帶負(fù)電荷的氨基酸組的一個氨基酸。最優(yōu)選地，該交換導(dǎo)致在相關(guān)位置存在于SEQ ID NO:11-13中任一個中的氨基酸之一。

能夠重組可以插入宿主細(xì)胞的基因組中的多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株的原病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列的修整重組酶還可以包含2種或更多種序列的組合，所述序列選自SEQ ID NO:11-13，例如這些序列中任一個例如SEQ ID NO:11的C-末端部分，和這些序列中任何其它序列例如SEQ ID NO:12的N-末端部分。所述C-末端部分可以具有1-342個氨基酸的長度。在兩個序列的組合中，N-末端部分可以具有1-342個氨基酸的長度。所述修整重組酶還可以是衍生自這些序列的三個或更多個部分的組合。所述組合包含TRE 3.1共有基序，例如SEQ ID NO:10或優(yōu)選SEQ ID NO:9。

本發(fā)明還提供了編碼修整重組酶的核酸，所述重組酶能夠重組可以插入宿主細(xì)胞的基因組中的多種逆轉(zhuǎn)錄病毒毒株的原病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列諸如SEQ ID NO:1，所述修整重組酶包含如上所定義的氨基酸序列。

在本發(fā)明的上下文中，包含序列的核酸或蛋白可以由所述序列組成。

其可以替代地包含其它序列，例如提供在特定細(xì)胞區(qū)室中的表達(dá)/定位的信號序列，諸如核定位信號，如SEQ ID NO:14中(所述核定位信號在SEQ ID NO:14的位置2-9)。如果蛋白待用于藥物組合物中，則特別優(yōu)選將其表達(dá)為具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域諸如tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(其允許靶細(xì)胞的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo))的融合蛋白。優(yōu)選地，將待用于藥物組合物中的本發(fā)明的修整重組酶制備為具有核定位序列和具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(例如，來自tat)的融合蛋白，且編碼本發(fā)明的修整重組酶的核酸可以編碼此融合蛋白。例如，以下蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可用于具有本發(fā)明的修整重組酶的融合蛋白，其優(yōu)選進(jìn)一步包括核定位信號：

-HIV-1Tat反式激活物的基本結(jié)構(gòu)域(Fawell S,Seery J,Daikh Y,Moore C,Chen LL,Pepinsky B,Barsoum J.,異源蛋白至細(xì)胞的Tat介導(dǎo)的遞送(Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells).,Proc Natl Acad Sci U S A.1994Jan 18；91(2):664-8.)

-果蠅觸角(Antp)的同源結(jié)構(gòu)域(Derossi D,Joliot AH,Chassaing G,Pro-chiantz A.,觸角同源結(jié)構(gòu)域的第三螺旋通過生物膜易位(The third helix of the Antennapedia homeodomaintranslocates through biological membranes.),J Biol Chem.1994Apr 8；269(14):10444-50.)

-HSV VP22轉(zhuǎn)錄因子(Elliott G,O'Hare P.,通過皰疹病毒結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞內(nèi)運輸和蛋白遞送(Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein).,Cell.1997Jan24；88(2):223-33.)-乙型肝炎病毒(HBV)的Pre S2表面抗原的細(xì)胞可滲透易位基序(TLM)(Oess S,Hildt E.,衍生自乙型肝炎病毒表面抗原的Pre S2結(jié)構(gòu)域的新細(xì)胞可滲透易位基序(Novel cell permeable motif derived from the PreS2-domain of hepatitis-B virus surface antigens.),Gene Ther.2000May；7(9):750-8.)。

在蛋白待純化的情況下，還可以添加促進(jìn)蛋白純化的標(biāo)簽，諸如His標(biāo)簽。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇編碼如上定義的Tre重組酶的本發(fā)明的核酸的密碼子使用。例如，可以選擇適合于在人細(xì)胞中表達(dá)的密碼子使用，特別是如果意欲在人細(xì)胞中表達(dá)，例如用于治療目的。密碼子使用也可以基于例如Cre重組酶的密碼子使用。

所述修整重組酶或編碼所述修整重組酶的核酸可以通過本文所述的本發(fā)明方法獲得，或者其可以通過該方法可獲得。還可以基于本文公開的序列，任選地通過組合和/或進(jìn)一步改變這些序列，任選地測試重組不對稱靶位點諸如SEQ ID NO:1的活性來獲得。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了組合物，例如文庫，其包含兩種或更多種核酸，其編碼如上所定義的修整重組酶，例如編碼包含根據(jù)SEQ ID NO:9、優(yōu)選地根據(jù)SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11-13中任一個的不同序列的兩種或更多種修整重組酶。在一個實施方案中，所述組合物包含編碼修整重組酶的核酸，所述修整重組酶包含兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、十種或更多種、20種或更多種或25種或更多種重組酶，其包含根據(jù)SEQ ID NO:9-13中任一個的序列或這些序列的組合。此類組合物，特別是其中核酸是表達(dá)載體的組合物，可以特別適合作為如下所述的藥物組合物。

在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選將編碼修整重組酶的核酸克隆至表達(dá)載體中，所述修整重組酶對逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的LTR內(nèi)的不對稱靶序列具有活性。表達(dá)載體是用于表達(dá)由載體內(nèi)的核酸編碼的蛋白的遺傳構(gòu)建體。此類表達(dá)載體可以是自我復(fù)制的染色體外載體或整合入宿主基因組中的載體。通常，這些表達(dá)載體包括可操作連接至編碼本發(fā)明的修整重組酶的核酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸。

術(shù)語“控制序列”是指在特定宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。適合于原核生物的控制序列，例如，包括啟動子，任選地操縱子序列和核糖體結(jié)合位點。已知真核細(xì)胞利用啟動子、多聚腺苷酸化信號和增強(qiáng)子。

當(dāng)將核酸置于與另一核酸序列的功能關(guān)系中時，其是“可操作連接的”。例如，如果啟動子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則其與該序列可操作連接；或者如果將核糖體結(jié)合位點定位以便于翻譯，則其與編碼序列可操作連接。通過在方便的限制性位點處連接來完成連接。如果此類位點不存在，則根據(jù)常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸適配子或接頭。轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸通常適于用于表達(dá)所述修整重組酶的宿主細(xì)胞。對于各種宿主細(xì)胞，許多類型的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體和合適的調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域已知的。

用于本發(fā)明中的表達(dá)載體可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、泡沫病毒載體、腺病毒載體或腺相關(guān)病毒載體。然而，在一個優(yōu)選實施方案中，所述表達(dá)載體是慢病毒載體，其選自HIV-1-、SIV-、FIV-或EIAV-衍生的慢病毒載體。慢病毒載體例如描述于SCHAMBACH等人(2006)或歐洲專利申請?zhí)? 1000751.5中。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述表達(dá)載體包含細(xì)胞啟動子、細(xì)菌啟動子、病毒啟動子或雜合啟動子。

通常，為了本發(fā)明的目的，所述啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型啟動子。此外，所述啟動子可以是天然存在的啟動子，諸如細(xì)菌啟動子、細(xì)胞啟動子或病毒啟動子，或雜合啟動子。組合多于一種啟動子的元件的雜合啟動子是本領(lǐng)域已知的，并且可用于本發(fā)明中。此外，用于本發(fā)明中的啟動子也可以是天然存在的啟動子的衍生物。如本文所使用的天然存在的啟動子的“衍生物”可以是獲得自不同來源的啟動子或序列的順式活性元件的組合，或者可替代地，可以通過特定天然存在的啟動子中的順式活性元件的缺失或突變來獲得(EDELMAN等人，2000；ALPER等人，2006；HARTENBACH&FUSSENEGGER,2006)。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述組成型啟動子或其衍生物選自或衍生自巨細(xì)胞病毒、勞斯肉瘤病毒、鼠白血病病毒相關(guān)逆轉(zhuǎn)錄病毒、磷酸甘油激酶基因、小鼠脾臟病灶形成病毒或人延伸因子1α的啟動子。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述誘導(dǎo)型啟動子或其衍生物選自或衍生自從慢病毒、泡沫病毒和δ逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的LTR或其衍生物。

在此上下文中，術(shù)語“LTR”是指具有啟動子功能的原病毒的5'和3'長末端重復(fù)(關(guān)于綜述，參見標(biāo)準(zhǔn)教科書"逆轉(zhuǎn)錄病毒"(COFFIN JM,HUGHES SH,VARMUS HE(編)1997,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York))。

優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)型啟動子或其衍生物選自或衍生自從HIV-1、HIV-2、MVV、EIAV、CAEV、SIV、FIV、BIV、HTLV-I和HTLV-II衍生的LTR或其衍生物。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于制備修整重組酶的方法，其中所述方法包括前述用于制備編碼修整重組酶的表達(dá)載體的方法，和在合適的宿主細(xì)胞中從所述表達(dá)載體表達(dá)所述修整重組酶(或包含所述修整重組酶的氨基酸序列的融合多肽)的其它步驟。

優(yōu)選地，在哺乳動物細(xì)胞中測試最終獲得的重組酶，以確保它們在哺乳動物細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮功能。此外，為了在哺乳動物細(xì)胞中獲得良好的表達(dá)，可以針對這些細(xì)胞中的表達(dá)優(yōu)化所述重組酶(例如使用本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行密碼子使用優(yōu)化。參見例如SHIMSHE等人，2002)或者可以將引導(dǎo)蛋白至哺乳動物細(xì)胞的核所需的信號序列，諸如NLS序列(MACARA，2001)添加至所述修整重組酶的核酸?？梢允褂美缂?xì)菌、昆蟲或哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)實施克隆至表達(dá)載體中的編碼修整重組酶的核酸的表達(dá)，例如根據(jù)用于制備編碼修整重組酶的表達(dá)載體的方法的步驟(1)。然而，也可以采用本領(lǐng)域已知的其它表達(dá)系統(tǒng)。將外源核酸引入哺乳動物、昆蟲或細(xì)菌宿主以及其它宿主的方法也是本領(lǐng)域眾所周知的，并且將隨所使用的宿主細(xì)胞而變化。技術(shù)包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、病毒感染、將多核苷酸包封于脂質(zhì)體中以及將DNA直接顯微注射至核中。

融合蛋白通過本領(lǐng)域眾所周知的方法制備。例如，其中克隆編碼所述修整重組酶的核酸的表達(dá)載體已經(jīng)包含編碼第二多肽或蛋白的核酸序列。通過克隆編碼與第二多肽或蛋白的序列同框的修整重組酶的核酸，兩個序列將表達(dá)為融合蛋白。

用于從表達(dá)載體表達(dá)所述修整重組酶的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞，諸如例如細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞，或優(yōu)選真核細(xì)胞，諸如例如昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞，最優(yōu)選人細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是造血細(xì)胞，例如成體造血干細(xì)胞或T-細(xì)胞，例如CD4+細(xì)胞。所述細(xì)胞可以衍生自感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的受試者，并且可以在轉(zhuǎn)化、和任選培養(yǎng)和/或繁殖后，將細(xì)胞施用回受試者。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于制備轉(zhuǎn)化的成體干細(xì)胞的方法，其中所述方法包括用于制備編碼修整重組酶的表達(dá)載體的前述方法，以及將用于制備編碼修整重組酶的表達(dá)載體的前述方法中獲得的表達(dá)載體體外引入合適的成體干細(xì)胞的其它步驟。

在另一個方面，本發(fā)明涉及如本文公開和/或從本發(fā)明的前述方法可獲得的核酸。本文還提供了編碼由序列定義的修整重組酶的核酸。

如本文所使用的“核酸”是由共價連接的稱為核苷酸的亞單位構(gòu)成的聚合化合物。核酸包括多核糖核酸(RNA)，例如mRNA和多脫氧核糖核酸(DNA)，其兩者可以是單鏈或雙鏈的。DNA包括cDNA、基因組DNA、合成DNA和半合成DNA。

在另一個方面，本發(fā)明還涉及從本發(fā)明的前述方法可獲得的表達(dá)載體，以及涉及包含編碼如本文定義的修整重組酶的核酸的表達(dá)載體。

如本文所使用的術(shù)語“蛋白”包括蛋白、多肽和肽。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明的核酸序列可用于生成蛋白序列。本發(fā)明的另一個方面是如例如從本發(fā)明的前述方法可獲得的修整重組酶蛋白，所述重組酶可以任選地是包含功能性重組酶的融合蛋白。在一個實施方案中，使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，可以將修整重組酶蛋白制備為融合多肽。在一個優(yōu)選實施方案中，所述修整重組酶蛋白與第二多肽連接。優(yōu)選地，所述融合多肽從本發(fā)明的前述方法獲得，其中所述修整重組酶與第二多肽連接。

在一個實施方案中，將所述修整重組酶蛋白制備為融合多肽以增加表達(dá)。在另一個實施方案中，將所述修整重組酶蛋白制備為融合多肽，以允許將該多肽引入活細(xì)胞中。通常，純化的蛋白不能進(jìn)入細(xì)胞，因為它們由于其大小而不能通過細(xì)胞膜。然而，特定肽序列與蛋白的融合可以導(dǎo)致這些融合蛋白攝入細(xì)胞中。在細(xì)胞中，所述蛋白可以行使其功能。位點特異性重組酶，包括Cre重組酶，已經(jīng)用該方法成功地遞送至細(xì)胞中(PEITZ等人，2002)。細(xì)胞透性重組酶已經(jīng)由NOLDEN等人(2006)和LIN等人(2004)進(jìn)一步描述。因此，此策略可以用于將所述修整重組酶遞送至細(xì)胞中以從感染的細(xì)胞去除原病毒。因此，所述融合多肽中的第二多肽可以包含信號肽。所述信號肽可以是蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域諸如TAT肽或來自觸角同源結(jié)構(gòu)域的第三螺旋的肽(DEROSSI等人，1994，1996；VIVES等人，1997；VIVES，2003；RICHARD等人，2005)或用于將融合多肽遞送至真核細(xì)胞的核中的NLS(核定位序列)(MACARA，2001)。

本發(fā)明的另一個方面涉及從用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的成體干細(xì)胞的前述方法可獲得的成體干細(xì)胞。所述干細(xì)胞優(yōu)選地用根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體感染或轉(zhuǎn)染。在一個優(yōu)選實施方案中，所述成體干細(xì)胞是表達(dá)所述修整重組酶、前述融合多肽或包含前述述表達(dá)載體的來自造血譜系的干細(xì)胞。造血干細(xì)胞(HSC)是骨髓來源的CD34+細(xì)胞，其可以例如通過常規(guī)白細(xì)胞去除法從供體(例如，HIV感染的患者)的G-CSF動員的外周血純化(SCHERR&EDER,2002)。然后可以配制體外遺傳修飾的細(xì)胞用于再輸注至患者中。

在現(xiàn)有技術(shù)中，術(shù)語“干細(xì)胞”表示這樣的細(xì)胞，其(a)具有自我更新的能力和(b)由于其不對稱分裂能力而形成至少一種和經(jīng)常多種專門細(xì)胞類型的能力(DONOVAN&GEARHART,2001)。成體干細(xì)胞可以分離自成體的不同組織，即分化的個體。此類干細(xì)胞在現(xiàn)有技術(shù)中稱為“多能成體干細(xì)胞”。胚胎多能干細(xì)胞和成體多能干細(xì)胞之間的本質(zhì)區(qū)別在于可以從各自細(xì)胞獲得的分化組織的數(shù)目。

在另一個實施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，HIV)感染的患者的T-細(xì)胞，例如CD4+原代細(xì)胞(血細(xì)胞)。

或者，本發(fā)明的修整重組酶可以經(jīng)配制用于通過病毒樣顆粒(VLP)遞送。VLP可以用于包裝Tre mRNA、Tre蛋白，例如融合蛋白，或DNA，例如表達(dá)Tre的DNA質(zhì)粒，或包含啟動子-Tre cDNA-多聚A位點的構(gòu)建體。因此，本發(fā)明的核酸可以進(jìn)一步含有包裝信號。

在本發(fā)明方法的另一個步驟中，將通過本發(fā)明的方法獲得的本發(fā)明的核酸、包含編碼本發(fā)明的修整重組酶的核酸序列的表達(dá)載體、重組酶蛋白、融合蛋白或成體干細(xì)胞配制為藥物組合物，其用于預(yù)防和/或治療逆轉(zhuǎn)錄病毒感染和/或減少被逆轉(zhuǎn)錄病毒、例如HIV、特別是HIV-1感染的受試者中的病毒載量。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是通過前述方法獲得的藥物組合物。所述藥物組合物優(yōu)選以適于靜脈內(nèi)應(yīng)用(輸注)的溶液的形式存在。

所述藥物制備物可以進(jìn)一步包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和/或佐劑。適用于藥物組合物中的載體、賦形劑和佐劑是本領(lǐng)域已知的。

當(dāng)施用于受試者時，本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選將被逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的受試者中的病毒載量降低至低于5000基因組當(dāng)量/ml血漿，優(yōu)選低于500基因組當(dāng)量/ml血漿，且更優(yōu)選低于50基因組當(dāng)量/ml血漿。因此，包含編碼修整重組酶的表達(dá)載體(或作為蛋白或融合多肽的修整重組酶或包含所述表達(dá)載體的干細(xì)胞)的本發(fā)明的藥物組合物能夠通過根除宿主細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄病毒的遺傳儲庫、由此防止病毒的進(jìn)一步生活周期而減少逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的受試者中的病毒載量。

如本文所使用的術(shù)語“病毒載量”是指例如與1ml患者血漿相關(guān)的HIV RNA當(dāng)量(即基因組)(DYBUL等人，2002)。因此，所述病毒載量通過測量獲自患者的樣品中的病毒DNA的含量來測定。目前，存在三種主要類型的病毒載量測定法可用：

1)HIV RNA逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)：Amplicor(TM)HIV-1Monitor Test；Roche Diagnostics；

2)支鏈DNA(bDNA):Versant(TM)HIV RNA Assay；Bayer Diagnostics；和

3)基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA):NucliSens(TM)Assay；bioMerieux。

在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物能夠?qū)⒛孓D(zhuǎn)錄病毒感染的受試者中的病毒載量降低至低于5000基因組當(dāng)量/ml血漿，優(yōu)選低于500基因組當(dāng)量/ml血漿，且更優(yōu)選低于50基因組當(dāng)量/ml血漿。病毒載量低于5000基因組當(dāng)量/ml血漿的患者被認(rèn)為相對良好地適應(yīng)于藥物治療。然而，目前AIDS療法的目標(biāo)是將病毒載量減少至低于病毒載量測定的檢測限值，其目前低于約50基因組當(dāng)量/ml血漿。所述藥物組合物優(yōu)選地降低選自以下的逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒載量：小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、Mason Pfizer猴病毒(MPMV)、人T細(xì)胞白血病病毒I型(HTLV-I)、人T細(xì)胞白血病病毒II型(HTLV-II)、猿猴T細(xì)胞白血病病毒I型(STLV-I)、猿猴T細(xì)胞白血病病毒II型(STLV-II)、牛白血病病毒(BLV)、貓白血病病毒(FeLV)和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)。在又一個優(yōu)選實施方案中，要用本發(fā)明的藥物治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒是慢病毒。所述慢病毒優(yōu)選地選自人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、Maedi-visna病毒(MVV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)和山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)。最優(yōu)選地，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是HIV，特別是HIV-1。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明也適用于除上述那些之外的其它逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。

被針對其施用所述藥物組合物的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的受試者選自人、靈長類動物、猴、牛、馬、山羊、綿羊和家貓。然而，所述受試者優(yōu)選是人類。

通常，應(yīng)當(dāng)向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的表達(dá)載體、修整重組酶或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。施用可以是例如靜脈內(nèi)或肌內(nèi)施用。

在一個實施方案中，將所述藥物組合物配制用于與高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)的其它活性劑伴隨施用。所述高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法HAART是靶向病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和融合體的組合療法(GULIC等人，1997；LALEZARI等人，2003)。

在另一個實施方案中，將所述藥物組合物配制用于在全身免疫激活療法或原病毒基因表達(dá)的特異性激活的同時或之后施用。免疫激活治療的前提是基于這樣的假設(shè)：潛伏HIV感染的細(xì)胞的有意激活可以加速持續(xù)性病毒儲庫的根除。通過活躍表達(dá)HIV-1(促凋亡)產(chǎn)物的那些細(xì)胞的程序性死亡經(jīng)由免疫清除發(fā)生消除(KULKOSKY&BRAY,2006)。全身免疫激活(免疫細(xì)胞、包括靜息細(xì)胞的激活)通常通過例如施用免疫毒素、細(xì)胞因子(例如，IL-2)或T細(xì)胞激活抗體(例如，OKT3)來實現(xiàn)。

鑒于由于全身T細(xì)胞激活顯然也誘導(dǎo)病毒復(fù)制并使?jié)撛诘腍IV-1靶細(xì)胞的數(shù)目增加超過HAART可以包含的水平的事實(FRASER等人，2000)而導(dǎo)致進(jìn)行有意激活HAART抗性潛伏儲庫的免疫激活不幸地未能永久消除HIV-1和病毒反彈(對于綜述，參見KULOSKY&BRAY 2006；MARCELLO,2006；SHEHU-XHILAGA等人，2005)，必需進(jìn)一步特異性治療來治療HIV。一種方法是激活否則靜止病毒基因組的轉(zhuǎn)錄。潛伏原病毒基因表達(dá)的特異性激活可以通過施用佛波酯酪氨酸激酶抑制劑(prostratin)或人細(xì)胞因子IL-7(其兩者似乎在細(xì)胞增殖不存在的情況下重新激活潛伏的HIV-1)來實現(xiàn)(MARCELLO,2006)。此外，HIV-1的選擇性轉(zhuǎn)錄激活也可以通過組蛋白-脫乙酰酶(HDAC1)抑制劑(諸如例如丙戊酸，其最終在細(xì)胞激活不存在的情況下誘導(dǎo)HIV-1從靜止細(xì)胞的生長暈)來實現(xiàn)(MARCELLO,2006；LEHRMAN等人，2005)。

然而，全身免疫激活療法或原病毒基因表達(dá)的特異性激活或類似的治療策略大大受益于原病毒DNA的同時去除，由此減少患者中的受感染細(xì)胞的匯集物。

本發(fā)明還提供了治療和/或預(yù)防受試者中的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、特別是HIV感染的方法。在一個實施方案中，在獲得自受試者的樣品中分析感染受試者的逆轉(zhuǎn)錄病毒的序列，并且如果來自受試者的原病毒DNA包含已經(jīng)對其選擇所述重組酶的步驟(a)中鑒定的不對稱靶序列，則向所述受試者施用至少一種編碼修整重組酶的表達(dá)載體、至少一種修整重組酶或至少一種用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，例如，一種成體干細(xì)胞。獲得自所述受試者的樣品可以是血液樣品，例如包含感染的CD4+細(xì)胞。

附圖簡述

圖1：圖1提供了以下蛋白序列的比對：

(a)Cre重組酶SEQ ID NO:6；

(b)根據(jù)WO 2011/147590的Tre共同共有序列，SEQ ID NO:7，對HIV-1LTR內(nèi)的不對稱靶位點特異性的Tre重組酶的共有序列；

(c)根據(jù)WO 2011/147590的Tre重組酶3.0共有序列，SEQ ID NO:8，對SEQ ID NO:1特異性的Tre重組酶；

(d)Tre重組酶3.1共有序列85％，SEQ ID NO:9，共有序列中相比于Cre序列的單獨突變存在于通過本發(fā)明的方法生成并通過高通量測序(獨特200bp-序列的33,000個讀數(shù))的所有克隆的85％中；

(e)Tre重組酶3.1共有序列100％，SEQ ID NO:10，針對對SEQ ID NO:1的高特異性(對loxP、loxH或loxLTR Tre 1.0(SEQ ID NO:3-5)無活性)和人的耐受性選擇的三種Tre重組酶3.1的共有序列；

(f)示例性Tre 3.1重組酶uTre，SEQ ID NO:11，對SEQ ID NO:1高度特異性且被人良好耐受。根據(jù)此序列的修整重組酶稱為uTre，分別為“通用Tre”。

粗體字母標(biāo)記表示保守的氨基酸，可變和非指定的位置用X表示。SEQ ID NO:9、10和/或11中突變的Cre的位置在Cre序列中加下劃線，并且突變的位置在序列上方提供。Tre3.1中唯一發(fā)現(xiàn)的Q89L交換以斜體標(biāo)記。

圖2：圖2顯示用于針對loxP上的重組進(jìn)行進(jìn)化選擇的示例性進(jìn)化載體?？梢匀菀椎貥?gòu)建用于針對loxH上的重組進(jìn)行選擇的相應(yīng)載體。loxLTR包含SEQ ID NO:1。Tre3進(jìn)化循環(huán)51-69用pEVOloxLTR-loxP和pEVOloxLTR-loxH，或者100-1μg/mL轉(zhuǎn)錄激活物L(fēng)-ara進(jìn)行，包括兩輪DNA改組。

圖3：圖3顯示uTre相比于Tre3的高特異性。Tre3：克隆分離自Tre3.0文庫循環(huán)43。uTre：克隆分離自Tre3.1文庫循環(huán)71。重組產(chǎn)物用一個三角形標(biāo)記，非重組產(chǎn)物用兩個三角形標(biāo)記。在其中表達(dá)所述修整重組酶(通過L-阿拉伯糖誘導(dǎo))的條件下，uTre在大腸桿菌中重組包含SEQ ID NO:1的loxLTR。相比之下，Tre3重組loxLTR和loxP以及l(fā)oxH，即，其具有相對寬松的特異性。

圖4：圖4A顯示用于在人細(xì)胞中組成型表達(dá)可選擇標(biāo)記EGFP和tre文庫的示例性慢病毒表達(dá)載體。圖4B顯示針對良好耐受的高度特異性Tre的細(xì)胞篩選的流程圖。針對高度活性Tre的最終篩選證實了人細(xì)胞中的活性。選擇重組酶的單個克隆并進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖5：圖5顯示在兩種代表性培養(yǎng)物中的組織培養(yǎng)物中的抗病毒uTre活性。PM1T細(xì)胞用編碼單獨的GFP(對照，空心圓形)或編碼uTre和GFP(uTre，實心正方形)的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。隨后，用HIV-1感染培養(yǎng)物，并使用p24抗原ELISA隨時間監(jiān)測病毒載量。該實驗顯示，所述修整重組酶在降低病毒載量方面是有效的。幾周(8或9周)之后，病毒載量通過p24抗原ELISA不再可檢測到。

圖6顯示了源自HIV感染的患者的原代人CD4+細(xì)胞中顯著的抗病毒uTre活性。細(xì)胞用表達(dá)單獨的GFP的載體(對照實驗；左小圖)或表達(dá)uTre和GFP的載體(uTre；右小圖)轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過HIV-1p24抗原釋放(空心圓圈)監(jiān)測病毒復(fù)制，并通過FACS監(jiān)測轉(zhuǎn)導(dǎo)的(GFP+)人CD4+細(xì)胞的百分比(實心正方形)。uTre的表達(dá)導(dǎo)致顯著的抗病毒效應(yīng)和CD4+細(xì)胞的保護(hù)。值得注意的是，對照實驗中第15天和第20天之間的病毒載量的下降反映了由于未受抑制的病毒復(fù)制導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。

圖7圖7顯示HIV感染的人源化小鼠中的抗病毒uTre活性。用人CD34+造血干細(xì)胞/HSC(對照)或表達(dá)uTre的CD34+HSC(動物#1和#2)移植免疫缺陷小鼠。隨后，動物被HIV-1感染，并隨時間監(jiān)測病毒載量(檢測為HIV-1RNA拷貝數(shù)/ml；空心圓形)和所有淋巴細(xì)胞中人CD45+CD4+細(xì)胞的百分比(實心正方形)。

實施例

實施例1：

如果沒有另外指定，則使用如WO 2008/083931、WO 2011/147590和BUCHHOLZ&STEWART,2001中所述的材料和方法。如WO 2011/147590中所述制備能夠重組多種不同HIV-1毒株中的不對稱靶序列的修整重組酶。所得tre文庫用于進(jìn)一步實驗中。

實施例2：

為了增強(qiáng)uTre特異性，進(jìn)行針對loxP和loxH上的重組活性選擇的額外進(jìn)化循環(huán)。為此目的，將獲得自進(jìn)化循環(huán)50的進(jìn)化Tre文庫克隆至含有分別纏繞有兩個loxP位點或兩個loxH位點的兩個loxLTR位點(SEQ ID NO:1)的進(jìn)化載體。示例性載體顯示于圖2中。誘導(dǎo)重組酶表達(dá)后，loxLTR上的重組導(dǎo)致去除僅存在的NdeI位點，而loxP或loxH上的重組不會如此。每個進(jìn)化循環(huán)之后分離的質(zhì)粒DNA用NdeI消化，并且已經(jīng)成功重組loxLTR、而非loxP或loxH的重組酶編碼序列通過PCR擴(kuò)增，并亞克隆回進(jìn)化載體中，用于下一進(jìn)化循環(huán)。進(jìn)行總共19個額外的Tre3進(jìn)化循環(huán)，包括兩輪DNA改組，交替針對loxP和loxH上的重組進(jìn)行選擇。

實施例3：

為了篩選具有顯著降低的細(xì)胞毒性(即致細(xì)胞病變性)的uTre-重組酶，將tre文庫連接至從內(nèi)部SFFV LTR啟動子組成型表達(dá)EGFP和從組成型EF1α啟動子表達(dá)tre文庫的慢病毒載體中(圖4A)。Jurkat T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)允許依次分選(通過FACS)高GFP表達(dá)細(xì)胞，隨后分離無毒性的uTre克隆(圖4B)。為此，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第3天、第10天和第24天用EGFP表達(dá)的增加的嚴(yán)格性對轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)胞分選。再培養(yǎng)一周之后，分離剩余的tre文庫并關(guān)于增強(qiáng)的Tre活性分析選擇的克隆。

實施例4：

為了分析細(xì)胞系中的uTre活性，用表達(dá)uTre和GFP或單獨的GFP(陰性對照載體)的ASLV衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)PM-1T細(xì)胞的培養(yǎng)物。值得注意的是，GFP表達(dá)允許追蹤轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第10天，用HIV-1_Bal感染細(xì)胞。通過每周ELISA測量培養(yǎng)上清液中的病毒p24抗原的量來監(jiān)測uTre表達(dá)對HIV-1復(fù)制的影響。如所示(圖5)，p24釋放在uTre轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)物中顯著減少，而其在對照培養(yǎng)物(僅表達(dá)GFP)中保持穩(wěn)定或甚至增加。

實施例5：

源自HIV-1感染的患者的原代CD4+細(xì)胞中的uTre活性的分析。CD4+細(xì)胞用CD3/CD28磁珠刺激48小時。隨后，用僅表達(dá)GFP(充當(dāng)陰性對照)或表達(dá)uTre連同GFP的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。將細(xì)胞在100IU的IL2存在的情況下培養(yǎng)20天。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后的指定天數(shù)監(jiān)測病毒載量(通過p24抗原ELISA測量)和人轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+細(xì)胞計數(shù)(通過FACS分析)。如圖6中所示，uTre表達(dá)導(dǎo)致顯著的抗病毒效應(yīng)(由空心圓形表示)和CD4+細(xì)胞的保護(hù)(由實心正方形表示)。相比之下，對照實驗中的第15天和第20天之間病毒載量的下降反映了由于未受抑制的病毒復(fù)制導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。

實施例6：

體內(nèi)uTre活性的分析。用人CD34+造血干細(xì)胞/HSC(對照)或表達(dá)uTre的CD34+HSC移植免疫缺陷NOG小鼠(NOD.Cg-Prkdc^scidIL2rg^tm1Wjl/SzJ)。隨后，用HIV-1_Bal感染動物，并隨時間監(jiān)測病毒載量(通過基于超靈敏PCR的測定法檢測)和人CD45+CD4+細(xì)胞的百分比(通過FACS分析)。如所示(圖7)，uTre表達(dá)導(dǎo)致顯著的體內(nèi)抗病毒活性。

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