本申請要求2014年5月6日提交的美國臨時申請?zhí)?1/989,509的優(yōu)先權(quán)益，所述文獻因而通過引用的方式完整并入。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生異多聚體蛋白的方法。

背景技術(shù)：

IgG型單克隆抗體含有兩個相同的抗原結(jié)合臂和恒定結(jié)構(gòu)域(Fc)。在其結(jié)合臂中具有不同特異性的抗體通常在自然界中不存在并且因此不得不借助化學(xué)工程(例如，化學(xué)的交聯(lián)等)、重組DNA和/或細胞融合技術(shù)創(chuàng)造。

雙特異性抗體可以同時結(jié)合兩種不同的抗原。這種性質(zhì)使得能夠開發(fā)采用常規(guī)單克隆抗體時不可能的治療策略。已經(jīng)開發(fā)的一大類構(gòu)想的雙特異性抗體樣式反映了對這類分子的強烈興趣。參見Berg J,Lotscher E,Steimer KS等人,“Bispecific antibodies that mediate killing of cells infected with human immunodeficiency virus of any strain,”Proc Natl Acad Sci USA(1991)88(11):4723-4727和Fischer N and Leger O.,“Biospecific Antibodies:Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies,”Pathobiology(2007)74:3-14。

另一個類別的多特異性分子是重組融合蛋白。由免疫調(diào)節(jié)蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白(Ig)的恒定(Fc)結(jié)構(gòu)域組成的重組融合蛋白代表一個日益增長的人用治療藥類別。免疫黏附素將具有所需特異性的蛋白質(zhì)序列的結(jié)合區(qū)與抗體的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域組合。免疫黏附素具有對其作為治療藥的潛力有意義的兩個重要特性：靶特異性和藥代動力學(xué)穩(wěn)定性(與抗體可比較的體內(nèi)半壽期)。免疫黏附素可以作為拮抗劑用于抑制或阻斷有害相互作用或作為激動劑用于模擬或增強生理學(xué)反應(yīng)。參見Chamow SM,Zhang DZ,Tan XY等人,“A humanized,bispecific immunoadhesin-antibody that retargets CD3+effectors to kill HIV-1-infected cells,”J Hematother 1995；4(5):439-446。

已經(jīng)在其他地方討論其他多特異性分子。例子包括但不限于：Fisher等人,Pathobiology(2007)74:3-14(多種雙特異性樣式的綜述)；2003年12月9日授予Feige等人的美國專利號6,660,843(肽體(peptibody))；2002年1月10日公開的美國專利公開號2002-004587(多特異性抗體)；2009年11月3日授予Wu等人的美國專利號7612181(雙重可變結(jié)構(gòu)域樣式)；美國專利號6,534,628；Nord K等人,Prot Eng(1995)8:601-608；Nord K等人,Nat Biotech(1997)15:772-777和等人,Biotechnol Appl Biochem.(2008)Jun；50(Pt 2):97-112(親和體(Affibodies))；Martens等人,Clin Cancer Res(2006),12:6144-6152以及Jin等人,Cancer Res(2008)68(11):4360-4368(單臂抗體)；Bostrom等人,Science(2009)323:1610-1614(雙重作用Fab,aka混合價態(tài)抗體)。其他樣式是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

對于上文描述的多特異性分子，臨床級材料的生產(chǎn)仍有挑戰(zhàn)性。如上文所示，存在許多途徑以產(chǎn)生具有混合型結(jié)合臂(即，彼此不相同的結(jié)合臂)的分子。這些方法各自具有其缺點。

化學(xué)交聯(lián)法耗費人力，因為仍可能需要從同型二聚體和其他不想要的副產(chǎn)物中純化出相關(guān)種類。此外，化學(xué)修飾步驟可能改變蛋白質(zhì)的完整性，因此導(dǎo)致低劣穩(wěn)定性。因此，這種方法經(jīng)常無效并且可能導(dǎo)致抗體活性喪失。

細胞-融合技術(shù)(例如，雜交瘤)表達隨機裝配的兩條重鏈和兩條輕鏈，從而導(dǎo)致產(chǎn)生10種抗體組合。所需的異多聚體抗體僅是如此產(chǎn)生的抗體的小部分。純化所需的異多聚體蛋白大幅度降低產(chǎn)率并增加生產(chǎn)成本。

重組DNA技術(shù)已經(jīng)用來產(chǎn)生不包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的多種異多聚體樣式，例如，單鏈Fv、雙體抗體等。這種類型的抗體分子的重大缺陷是缺少Fc結(jié)構(gòu)域并且因此缺少抗體觸發(fā)效應(yīng)子功能(例如，補體激活、Fc-受體結(jié)合等)的能力。因此，需要包含有功能的Fc結(jié)構(gòu)域的雙特異性抗體。

重組DNA技術(shù)也已經(jīng)用來產(chǎn)生‘結(jié)入孔’雙特異性抗體。參見美國專利申請20030078385(Arathoon等人,-Genentech)。這種策略的一個局限是因在相同的細胞中表達，兩種親本抗體的輕鏈不得不相同以防止錯誤配對及形成非預(yù)期和/或無活性的分子。

因此，仍需要產(chǎn)生異多聚體蛋白的備選方法。本文所述的發(fā)明提供這類方法。本發(fā)明的這些和其他方面和優(yōu)點將從本文中提供的發(fā)明描述顯而易見。

發(fā)明簡述

本發(fā)明提供勝過本領(lǐng)域已知方法的在哺乳動物細胞中產(chǎn)生多特異性免疫球蛋白復(fù)合物(例如，多特異性抗體)和其他多聚體蛋白(在本文統(tǒng)稱為異多聚體蛋白)的高效和新穎方法。參見WO 2013/055958和WO 2011/133886。

因此，在第一方面，提供了制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)能夠表達第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈的第一宿主細胞；

(b)培養(yǎng)能夠表達第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈的第二宿主細胞；并且，

(c)獲得第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含異多聚體蛋白，并且其中第一宿主細胞和第二宿主細胞各自是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，合并的培養(yǎng)基在不破壞第一和第二宿主細胞的細胞膜的情況下獲得。在某些實施方案中，該方法還包括添加還原劑至合并的培養(yǎng)物。

還提供制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)能夠表達第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈的第一宿主細胞，其中包含兩個第一含有鉸鏈的多肽和兩條第一輕鏈的第一同型二聚體分泌；

(b)培養(yǎng)能夠表達第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈的第二宿主細胞，其中包含兩個第二含有鉸鏈的多肽和兩條第二輕鏈的第二同型二聚體分泌；

(c)在不破壞第一和第二宿主細胞的細胞膜的情況下獲得第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含第一同型二聚體和第二同型二聚體；

(d)在足以允許異多聚體蛋白形成的還原性條件下孵育合并的培養(yǎng)基，并且；

(e)獲得異多聚體蛋白，其中第一宿主細胞和第二宿主細胞各自是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，該方法還包括添加還原劑至合并的培養(yǎng)物。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，第一含有鉸鏈的多肽和第二含有鉸鏈的多肽包含第一和第二重鏈。在根據(jù)(或如適用于)本文所述任何實施方案的某些實施方案中，第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈包含第一半抗體。在根據(jù)(或如適用于)本文所述任何實施方案的某些實施方案中，第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈包含第二半抗體。

在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，獲得合并的培養(yǎng)基包括：(1)收獲第一宿主細胞培養(yǎng)物的第一培養(yǎng)基；

(2)收獲第二宿主細胞培養(yǎng)物的第二培養(yǎng)基；并且

(3)合并第一培養(yǎng)基和第二培養(yǎng)基以獲得合并的培養(yǎng)基。

在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，獲得合并的培養(yǎng)基包括收獲合并細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基，所述合并細胞培養(yǎng)物包含第一宿主細胞和宿主細胞。在某些實施方案中，合并的培養(yǎng)基在不破壞第一和第二宿主細胞的細胞膜的情況下獲得。

在本發(fā)明方法中的第一和第二宿主細胞可以在允許表達和分離目的多肽的任何環(huán)境下培養(yǎng)。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，第一宿主細胞和第二宿主細胞在合并入合并的細胞培養(yǎng)物之前分別培養(yǎng)。

在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，該方法還包括步驟：在約25℃至約40℃的溫度培養(yǎng)合并的細胞培養(yǎng)物。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，在獲得合并的培養(yǎng)基后，孵育合并的培養(yǎng)基約24小時至約7天。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，合并的培養(yǎng)基在約4℃至約8℃孵育。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，攪拌合并的培養(yǎng)基。

在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，該方法還包括從合并的培養(yǎng)基分離異多聚體蛋白。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，使用蛋白A柱分離異多聚體蛋白。在某些實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的方法進一步純化異多聚體蛋白。

在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，該方法還包括在收獲第一和第二細胞培養(yǎng)基之前或之后，添加還原劑至第一細胞培養(yǎng)基和/或至第二細胞培養(yǎng)基。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，該方法還包括在收獲合并細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基之前添加還原劑至合并細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，還原劑在收獲步驟之前約4至約24小時、約5至約20小時、約10至約20小時、約10至約15小時、或約15至約18小時添加。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，將還原劑在收獲步驟之前約15小時添加。

在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，該方法還包括添加還原劑至合并的細胞培養(yǎng)基。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，將含有還原劑的合并培養(yǎng)基進一步孵育約4小時至約7天。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，將含有還原劑的合并培養(yǎng)基進一步孵育約15小時。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，從合并的培養(yǎng)基分離異多聚體蛋白之前添加還原劑至合并的培養(yǎng)基。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，將含有還原劑的合并培養(yǎng)基在分離異多聚體蛋白之前孵育至少約24小時。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，將含有還原劑的合并培養(yǎng)基在分離異多聚體蛋白之前孵育至少約48小時。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，使用蛋白A柱分離異多聚體蛋白。

在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，還原劑選自谷胱甘肽、2-巰基乙醇、2-巰基乙胺、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、半胱氨酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇、半胱氨酸二硫蘇糖醇、二硫丁胺或其組合。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，還原劑是谷胱甘肽，并且其中谷胱甘肽以約5mM至不多于約20mM的濃度添加。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，還原劑是谷胱甘肽，并且其中谷胱甘肽以約2mM至約10mM的濃度添加。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，還原劑是谷胱甘肽，并且其中谷胱甘肽以約5mM至少于約20mM的濃度添加。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，還原劑是谷胱甘肽，并且其中谷胱甘肽以約15mM的濃度添加。

在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，第一宿主細胞是穩(wěn)定細胞系。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，第二宿主細胞是穩(wěn)定細胞系。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，第一宿主細胞是CHO細胞。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，第二宿主細胞是CHO細胞。

在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，調(diào)整第一宿主細胞和第二宿主細胞的比率，從而當?shù)谝凰拗骷毎囵B(yǎng)物和第二宿主細胞培養(yǎng)物合并以形成合并的培養(yǎng)物時，第一含有鉸鏈的多肽和第二含有鉸鏈的多肽的摩爾比是約1:10至約10:1。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，當?shù)谝凰拗骷毎囵B(yǎng)物和第二宿主細胞培養(yǎng)物合并以形成合并的培養(yǎng)物時，第一宿主細胞表達的第一含有鉸鏈的多肽和第二宿主細胞表達的第二含有鉸鏈的多肽的摩爾比是1:1。

在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，含有鉸鏈的多肽包含F(xiàn)c區(qū)或其變體。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，第一和/或第二含有鉸鏈的多肽包含抗體重鏈。

在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，第一異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處包含結(jié)修飾并且第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處包含孔修飾。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，結(jié)修飾包括來自第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的原始氨基酸殘基置換為側(cè)鏈比原始氨基酸殘基更大的氨基酸殘基。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，置換用氨基酸殘基選自色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和精氨酸。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，孔修飾包括來自第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的原始氨基酸殘基置換為側(cè)鏈比原始氨基酸殘基更小的氨基酸殘基。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，置換用氨基酸殘基選自絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和丙氨酸。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，結(jié)修飾包括T366W置換(EU編號)。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，孔修飾包括選自T366S、L368A和Y407V(EU編號)的兩個或更多個氨基酸置換。

在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，所述鏈間二硫鍵在鉸鏈區(qū)之間。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，異多聚體蛋白是抗體。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，異多聚體蛋白是雙特異性抗體。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，所述抗體是人源化抗體或人抗體。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，抗體是全長抗體。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，抗體是包含人CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分的抗體片段。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，抗體選自IgG、IgA和IgD。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，抗體是IgG。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，抗體是IgG1、IgG2或IgG4。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，第一輕鏈和第二輕鏈包含不同的可變結(jié)構(gòu)域序列。

在另一個方面，提供制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并培養(yǎng)物，其中第一宿主細胞能夠表達第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈，其中第二宿主細胞能夠表達第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈，并且其中第一宿主細胞和第二宿主細胞各自是哺乳動物細胞；

(b)添加還原劑至合并的培養(yǎng)物；并且

(c)在不破壞細胞膜的情況下從合并的培養(yǎng)物收獲合并的培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含異多聚體蛋白。

在某些實施方案中，第一宿主細胞分泌包含兩個第一含有鉸鏈的多肽和兩條第一輕鏈的第一同型二聚體，其中第二宿主細胞分泌包含兩個第二含有鉸鏈的多肽和兩條第二輕鏈的第二同型二聚體，其中合并的培養(yǎng)物包含第一同型二聚體和第二同型二聚體。在某些實施方案中，添加還原劑至合并的培養(yǎng)物允許形成異多聚體蛋白。

在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，在合并的培養(yǎng)物已經(jīng)培養(yǎng)不多于約18天后添加還原劑。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，在添加還原劑后4小時至24小時收獲合并的培養(yǎng)基。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，收獲合并的培養(yǎng)基的步驟包括從合并的培養(yǎng)基移除第一宿主細胞和第二宿主細胞。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，孵育合并的培養(yǎng)基4小時至7天。

在某些實施方案中，該方法還包括步驟：調(diào)節(jié)合并的培養(yǎng)物中第一宿主細胞和第二宿主細胞的細胞:細胞比率。在某些實施方案中，調(diào)節(jié)細胞:細胞比率，從而在合并的培養(yǎng)基中表達自第一宿主細胞的第一含有鉸鏈的多肽(具有締合的輕鏈)對表達自第二宿主細胞表達的第二含有鉸鏈的多肽(具有締合的輕鏈)第二含有鉸鏈的多肽的摩爾比達到所需的摩爾比。在某些實施方案中，宿主細胞是穩(wěn)定細胞系。在某些實施方案中，穩(wěn)定細胞系用能夠表達含有鉸鏈的多肽和輕鏈的核酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

應(yīng)當理解，本發(fā)明的方法可以包括其他步驟，所述其他步驟通常是對于啟動和/或完成如本文所述的本發(fā)明方法所涵蓋的過程而言顯而易見的例行步驟。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明方法的步驟(a)前置有一個步驟，其中將編碼第一含有鉸鏈的多肽的核酸引入第一宿主細胞并且將編碼第二含有鉸鏈的多肽的核酸引入第二宿主細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法還包括步驟：純化具有針對至少兩個不同靶的結(jié)合特異性的異多聚體蛋白。

在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈(或其締合的輕鏈)包含針對第一靶的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈(或其締合的輕鏈)包含針對第二靶的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域。第一和第二靶可以是位于單個分子上或位于不同分子上的不同表位。

在另一個方面，提供了采用上述任何方法產(chǎn)生的異多聚體蛋白。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，異多聚體蛋白是雙特異性抗體。還提供是包含采用上述任何方法產(chǎn)生的異多聚體蛋白(如雙特異性抗體)和可藥用載體的組合物。

本發(fā)明的異多聚體蛋白通常能夠結(jié)合、優(yōu)選地特異性結(jié)合至抗原。此類抗原例如包括腫瘤抗原、細胞存活調(diào)節(jié)因子、細胞增殖調(diào)節(jié)因子、與(例如，已知或疑似在功能上有助于)組織發(fā)育或分化相關(guān)的分子、細胞表面分子、淋巴因子、細胞因子、參與細胞周期調(diào)節(jié)的分子、參與血管發(fā)生的分子和與(例如，已知或疑似在功能上有助于)血管生成相關(guān)的分子。能夠與本發(fā)明異多聚體蛋白結(jié)合的抗原可以是上述分類之一的子類中的成員，其中所述分類的其他子類包含(相對于目的抗原)具有不同特征的其他分子/抗原。目的抗原也可以視為屬于兩個或更多個類別。在一個實施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合、優(yōu)選地特異性結(jié)合并非細胞表面分子的腫瘤抗原的異多聚體蛋白。在一個實施方案中，腫瘤抗原是細胞表面分子，如受體多肽。在另一個例子中，在一些實施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白結(jié)合、優(yōu)選地特異性結(jié)合并非簇分化因子的腫瘤抗原。在另一個例子中，本發(fā)明的異多聚體蛋白能夠結(jié)合、優(yōu)選地特異性結(jié)合至簇分化因子，所述簇分化因子在一些實施方案中不是例如CD3或CD4。在一些實施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白是抗VEGF抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白是選自以下者的雙特異性抗體：IL-1α/IL-1β、IL-12/IL-18；IL-13/IL-9；IL-13/IL-4；IL-13/IL-5；IL-5/IL-4；IL-13/IL-lβ；IL-13/IL-25；IL-13/TARC；IL-13/MDC；IL-13/MEF；IL-13/TGF-β；IL-13/LHR激動劑；IL-12/TWEAK、IL-13/CL25；IL-13/SPRR2a；IL-13/SPRR2b；IL-13/ADAM8、IL-13/PED2、IL17A/IL17F、CD3/CD19、CD138/CD20；CD138/CD40；CD19/CD20；CD20/CD3；CD38/CD138；CD38/CD20；CD38/CD40；CD40/CD20；CD-8/IL-6；CD20/BR3、TNFα/TGF-β、TNFα/IL-1β；TNFα/IL-2、TNFα/IL-3、TNFα/IL-4、TNFα/IL-5、TNFα/IL6、TNFα/IL8、TNFα/IL-9、TNFα/IL-10、TNFα/IL-11、TNFα/IL-12、TNFα/IL-13、TNFα/IL-14、TNFα/IL-15、TNFα/IL-16、TNFα/IL-17、TNFα/IL-18、TNFα/IL-19、TNFα/IL-2、TNFα/IL-2、TNFα/IFNα、TNFα/CD4、TNFα/VEGF、TNFα/MIF、TNFα/ICAM-1、TNFα/PGE4、TNFα/PEG2、TNFα/RANK配體、TNFα/Te38；TNFα/BAFF；TNFα/CD22；TNFα/CTLA-4；TNFα/GP130；TNFα/IL-12p40；VEGF/HER2、VEGF-A/HER2、VEGF-A/PDGF、HER1/HER2、VEGF-A/VEGF-C、VEGF-C/VEGF-D、HER2/DR5、VEGF/IL-8、VEGF/MET、VEGFR/MET受體、VEGFR/EGFR、HER2/CD64、HER2/CD3、HER2/CD16、HER2/HER3；EGFR/HER2、EGFR/HER3、EGFR/HER4、IL-13/CD40L、IL4/CD40L、TNFR1/IL-1R、TNFR1/IL-6R、TNFR1/IL-18R、EpCAM/CD3、MAPG/CD28、EGFR/CD64、CSPGs/RGM A；CTLA-4/BTNO2；IGF1/IGF2；IGF1/2/Erb2B；MAG/RGM A；NgR/RGM A；NogoA/RGM A；OMGp/RGM A；PDL-I/CTLA-4；和RGM A/RGM B、IL1β/IL18、NRP1/VEGFA、VEGFA/NRP2、cMET/EGFR、ALK1/BMP9、VEGFA/α5β1、HER1/HER3-BU和CMV。在一些實施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白與選自以下的至少兩種靶分子結(jié)合：α5β1、ALK1、BMP9、IL-1α、IL-1β、TARC、MDC、MEF、TGF-β、LHR激動劑、TWEAK、CL25、SPRR2a、SPRR2b、ADAM8、PED2、CD3、CD4、CD16、CD19、CD20、CD22、CD28、CD40、CD38、CD64、CD138、CD-8、BR3、TNFα、TGF-β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-17A、IL-17F、IL-18、IL-19、IL-20、IL-23、IL-25、IFNα、MIF、ICAM-1、PGE4、PEG2、RANK配體、Te38、BAFF、CTLA-4、GP130、IL-12p40、VEGF、VEGF-A、PDGF、HER1、HER2、HER3、HER3-BU、HER4、VEGF-C、VEGF-D、DR5、cMET、MET、MET受體、VEGFR、EGFR、CD40L、TNFR1、IL-1R、IL-6R、IL-18R、EpCAM、MAPG、CSPGs、BTNO2、IGF1、IGF2、IGF1/2、Erb2B、MAG、NgR、NogoA、NRP1、NRP2、OMGp、PDL-I、RGM A和RGM B。在一些實施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白與CD3和選自以下的至少一種額外靶分子結(jié)合：BLR1、BR3、CD19、CD20、CD22、CD72、CD79A、CD79B、CD180(RP105)、CR2、FcRH1、FcRH2、FcRH5、FCER2、FCRL4、HLA-DOB和NAG14。

可以修飾異多聚體蛋白以增強和/或添加額外的所需特征。這類特征包括生物學(xué)功能如免疫效應(yīng)子功能、合乎需要的體內(nèi)半壽期/清除率、生物利用率、生物分布或其他藥代動力學(xué)特征。這類修飾是本領(lǐng)域熟知的并且也可以經(jīng)驗地確定，并且可以包括借助可以基于或可以不基于肽的部分進行修飾。例如，抗體可以是糖基化或無糖基化的，通常至少部分地取決于宿主細胞的性質(zhì)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是無糖基化的。通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的無糖基化抗體可以隨后例如通過使用本領(lǐng)域熟知的體外糖基化方法糖基化。如上文和本文中所述，可以在原核細胞(如，大腸桿菌)中產(chǎn)生本發(fā)明的異多聚體蛋白。大腸桿菌產(chǎn)生的異多聚體蛋白通常是無糖基化的并且缺少正常情況下與哺乳動物宿主細胞(例如，CHO)產(chǎn)生的異多聚體蛋白中存在的糖基化特征相關(guān)的生物學(xué)功能。

本發(fā)明也提供免疫綴合物，所述免疫綴合物包含與異源部分綴合的本發(fā)明異多聚體蛋白。任何異源部分將是合適的，只要其與抗體的綴合不實質(zhì)降低抗體的所需功能和/或特征。例如，在一些實施方案中，免疫綴合物包含作為細胞毒性藥物的異源部分。在一些實施方案中，所述細胞毒藥物選自放射性同位素、化療藥和毒素。在一些實施方案中，所述毒素選自卡奇霉素、美坦生和單端孢霉烯。在一些實施方案中，免疫綴合物包含作為可檢測標記物的異源部分。在一些實施方案中，所述可檢測標記物選自放射性同位素、配體-受體對的成員、酶-底物對的成員和熒光共振能量轉(zhuǎn)移對的成員。

在另一個方面，提供一種宿主細胞，所述宿主細胞包含多核苷酸或重組載體，所述多核苷酸或重組載體編碼上文描述的異多聚體蛋白的第一含有鉸鏈的多肽，其中宿主細胞不表達異多聚體蛋白的第二含有鉸鏈的多肽。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，含有鉸鏈的多肽是抗體重鏈。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，含有鉸鏈的多肽與抗體輕鏈配對。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，宿主細胞是穩(wěn)定細胞系。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞。在根據(jù)(或如適用于)上述任何實施方案的某些實施方案中，宿主細胞是CHO細胞。

本發(fā)明的其他目的，特征和優(yōu)點將從以下詳述變得顯而易見。然而，應(yīng)當理解盡管詳細描述和具體實施例表示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，然而它們僅以說明的方式給出，因為處于本發(fā)明精神范圍內(nèi)部的各種變化和修改將是本領(lǐng)域技術(shù)人員從這種詳述顯而易見的。

本文援引的全部參考文獻均通過引用的方式完整并入。

附圖簡述

圖1A顯示完全氧化的半抗體。未顯示“結(jié)”或“孔”或其他異二聚化結(jié)構(gòu)域。本圖中所述的半抗體是IgG1同種型。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以將其他免疫球蛋白同種型構(gòu)思為具有相應(yīng)鏈間和鏈內(nèi)鍵的半抗體。在完整的Ab中，鉸鏈半胱氨酸將形成鏈間二硫鍵。

圖1B顯示全長雙特異性抗體。未描述鉸鏈區(qū)中的重鏈間二硫鍵。

圖2顯示可以用來確定半抗體％和共價雙特異性抗體％的兩種測定法的流程圖

圖3顯示在收獲合并的培養(yǎng)基之前4小時、15小時或24小時添加還原劑至合并的細胞培養(yǎng)物時形成的雙特異性抗體％，所述合并的細胞培養(yǎng)物包含表達抗靶A(結(jié))的第一哺乳動物宿主細胞和表達抗靶B(孔)的第二哺乳動物宿主細胞。

圖4顯示在4％-20％Tris-甘氨酸SDS PAGE上運行的結(jié)捕獲匯集物和孔捕獲匯集物。

圖5A顯示抗靶G的基于疏水性分離的樣品的色譜圖，其中同型二聚體和半抗體共同洗脫入一個寬峰。圖5B顯示抗靶H的基于疏水性分離的樣品的色譜圖。

圖6顯示抗靶G/抗靶H雙特異性抗體的質(zhì)譜結(jié)果。

圖7A顯示對未處理的和GSH處理的合并培養(yǎng)基進行的電噴霧電離飛行時間質(zhì)譜(ESI-TOF MS)的實驗結(jié)果，其中抗靶A半抗體和抗靶B半抗體分泌入所述合并的培養(yǎng)基。圖7B顯示雙特異性抗體峰的m/z范圍的放大圖。圖7C顯示半抗體峰的m/z范圍的放大圖。

縮寫

ADCC＝抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性

API＝抗病原體免疫黏附素

BP＝殺菌/通透性增加蛋白

C1q＝補體因子1q

CD＝分化簇

CDC＝補體依賴的細胞毒性

CH1或C_H1＝重鏈第一恒定結(jié)構(gòu)域

CH2或C_H2＝重鏈第二恒定結(jié)構(gòu)域

CH3或C_H3＝重鏈第三恒定結(jié)構(gòu)域

CH4或C_H4＝重鏈第四恒定結(jié)構(gòu)域

CL或C_L＝輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域

CT＝細胞毒T淋巴細胞相關(guān)分子

Fc＝可結(jié)晶片段

FcR＝IgG Fc部分的受體γ

HIV＝人類免疫缺陷病毒

ICAM＝胞間黏附分子

BsAb＝雙特異性抗體

BsDb＝雙特異性雙體抗體

dsFv＝二硫鍵穩(wěn)定的Fv

Fc＝抗體的恒定片段

Fd＝抗體的V_H+C_H1

FcR＝Fc受體

Fv＝抗體的可變片段

IgG＝免疫球蛋白G

mAb＝單克隆抗體

PBL＝外周血淋巴細胞

scDb＝單鏈雙體抗體

scFv＝單鏈Fv

(scFv)2＝scFv-scFv串聯(lián)

Tandab＝串聯(lián)雙體抗體

VH或V_H＝抗體重鏈的可變結(jié)構(gòu)域

VL或V_L＝抗體輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域

發(fā)明詳述

僅使用以下定義和例子，本發(fā)明現(xiàn)在將以參考方式詳述。本文提到的全部專利和出版物，包括這些專利和出版物內(nèi)公開的所有序列在內(nèi)，均明確地通過引用的方式并入。

除非本文中另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第2版,John Wiley and Sons,New York(1994)和Hale與Markham,Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY(1991)為技術(shù)人員提供本發(fā)明中使用的許多術(shù)語的一般含義。盡管與本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料可以用于實施或檢驗本發(fā)明中，然而描述優(yōu)選的方法和材料。數(shù)值范圍包括界定該范圍的數(shù)值。除非另外說明，核酸從左至右以5'至3'方向書寫；氨基酸序列從左至由以氨基至羧基方向書寫。關(guān)于本領(lǐng)域的定義和術(shù)語，尤其指導(dǎo)實施者參考Sambrook等人,1989、和Ausubel FM等人,1993。應(yīng)當理解本發(fā)明不限于所描述的具體方法學(xué)、方案和試劑，因為它們可以變動。

數(shù)值范圍包括界定該范圍的數(shù)值。

除非另外說明，核酸從左至右以5'至3'方向書寫；氨基酸序列從左至由以氨基至羧基方向書寫。

本文提供的小標題不是本發(fā)明的各個方面或?qū)嵤┓绞降南拗?，其中可以通過參考作為一個整體的本說明書來獲得本發(fā)明。因此，通過整體地參考本說明書更完整地描述下文立即定義的術(shù)語。

I.定義

“異多聚體”、“異多聚體復(fù)合物”或“異多聚體蛋白”指一種分子，所述分子包含具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接。異多聚體可以包含由第一含有鉸鏈的多肽、第一輕鏈、第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈形成的“異二聚體”。備選地，異多聚體可以例如形成雙特異性抗體。異多聚體的多肽可以通過非肽的共價鍵(例如，二硫鍵)和/或非共價相互作用(例如，氫鍵、離子鍵、范德瓦爾斯力和/或疏水相互作用)彼此相互作用。

如本文所用，“異多聚化結(jié)構(gòu)域”指對生物分子的如此改變或添加，從而促進異多聚體形成并阻礙同型多聚體形成。具有形成異二聚體超越形成同型二聚體的強烈偏好的任何異二聚化結(jié)構(gòu)域處于本發(fā)明范圍。示意性例子包括但不限于，例如，美國專利申請20030078385(Arathoon等人,–Genentech；描述結(jié)入孔法(knob-into-hole))；WO 2007147901(等人,–Novo Nordisk：描述離子相互作用)；WO 2009089004(Kannan等人,–Amgen：描述靜電轉(zhuǎn)向效應(yīng))；WO 2011/034605(Christensen等人,-Genentech；描述卷曲螺旋)。還見，例如，描述亮氨酸拉鏈的Pack,P.和Plueckthun,A.，Biochemistry 31,1579-1584(1992)或描述螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序的Pack等人，Bio/Technology 11,1271-1277(1993)。短語“異多聚化結(jié)構(gòu)域”和“異二聚化結(jié)構(gòu)域”在本文中互換地使用。

如本文所用的短語“含有鉸鏈的多肽”指包含與如本領(lǐng)域所理解的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)相對應(yīng)的區(qū)域(例如，在重鏈的C_H1結(jié)構(gòu)域和C_H2結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域)的多肽?！般q鏈區(qū)”、“鉸鏈序列”和其變種，如本文所用，包括本領(lǐng)域已知的含義，所述含義例如在以下文獻中說明：Janeway’s Immunobiology,(Garland Science,Taylor&Francis Group,LLC,NY)(第7版,2008)；Bloom等人,Protein Science(1997),6:407-415；Humphreys等人,J.Immunol.Methods(1997),209:193-202。還參見，例如，Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985)以及Papadea,C.和I.J.Check(1989)“Human immunoglobulin G and immunoglobulin G subclasses:biochemical,genetic,and clinical aspects."Crit Rev Clin Lab Sci 27(1):27-58。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會，可用于鏈間二硫鍵形成的氨基酸數(shù)目以及半胱氨酸殘基數(shù)目在免疫球蛋白的各類別和同種型之間變動。全部這類鉸鏈區(qū)均可以在含有鉸鏈的多肽內(nèi)并處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。在某些實施方案中，第一含有鉸鏈的多肽包含第一抗體重鏈。在某些實施方案中，第一重鏈與第一輕鏈締合以形成第一半抗體。術(shù)語“抗體”在本文中以最廣意義使用并且指包含兩條重鏈和兩條輕鏈的任何免疫球蛋白(Ig)分子及其任何片段、突變變體或衍生物，只要它們顯示出合乎需要的生物活性(例如，表位結(jié)合活性)?？贵w的例子包括如本文所述的單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段?？贵w可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的。

作為參考系，如本文所用，抗體將指免疫球蛋白G(IgG)的結(jié)構(gòu)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解/認識到，任何免疫球蛋白類別的抗體可以用于本文所述的本發(fā)明方法中。為了清晰，IgG分子含有一對相同的重鏈(HC)和一對相同的輕鏈(LC)。每條LC具有一個可變結(jié)構(gòu)域(V_L)和一個恒定結(jié)構(gòu)域(C_L)，而每條HC具有一個可變的(V_H)和三個恒定結(jié)構(gòu)域(C_H1、C_H2、和C_H3)。C_H1結(jié)構(gòu)域和C_H2結(jié)構(gòu)域由鉸鏈區(qū)連接。這種結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域熟知的。參考圖1B。

如本文所用，“半抗體”指與一條免疫球蛋白輕鏈締合的一條免疫球蛋白重鏈。圖1A中描述了示例性半抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將輕易地理解，半抗體還可以具有由單一可變域組成的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

術(shù)語“最大抗體(maxibody)”指包含與Fc多肽融合的scFv的融合蛋白。參考WO 2009089004的圖8a。關(guān)于雙特異性最大抗體，參考WO2009089004的圖2。

根據(jù)EU編號體系，術(shù)語人IgG/Fc區(qū)的“C_H2結(jié)構(gòu)域”通常從IgG約殘基231延伸至約殘基340。C_H2結(jié)構(gòu)域的獨特性在于它不與另一個結(jié)構(gòu)域緊密配對。相反，兩個N聯(lián)分枝糖鏈間插在完整的天然IgG分子的兩個C_H2結(jié)構(gòu)域之間。已經(jīng)推測所述糖可以提供結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域配對作用的替代并且有助于穩(wěn)定C_H2結(jié)構(gòu)域。Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985)。

“C_H3結(jié)構(gòu)域”包含在Fc區(qū)中C_H2結(jié)構(gòu)域C末端的一段殘基(即根據(jù)EU編號體系，從IgG的約氨基酸殘基341至約氨基酸殘基447)。

術(shù)語“Fc區(qū)”，如本文所用，通常指包含免疫球蛋白重鏈的C末端多肽序列的二聚體復(fù)合物，其中C末端多肽序列是通過木瓜蛋白酶消化完整抗體可獲得的那種多肽序列。Fc區(qū)可以包含天然或變體Fc序列。盡管免疫球蛋白重鏈的Fc序列的界限可能變動，但是人IgG重鏈Fc序列通常由Fc序列的從約位置Cys226處或從約位置Pro230處的氨基酸殘基至其羧基末端的片段限定。除非本文中另外說明，否則Fc區(qū)或恒定區(qū)中的氨基酸殘基的編號根據(jù)如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU編號體系，也稱作EU index。免疫球蛋白的Fc序列總體上包含2個恒定結(jié)構(gòu)域：C_H2結(jié)構(gòu)域和C_H3結(jié)構(gòu)域，并且任選地包含C_H4結(jié)構(gòu)域?！癋c多肽”在本文中意指構(gòu)成Fc區(qū)的多肽之一，例如，單體Fc。Fc多肽可以從任何合適的免疫球蛋白獲得，如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亞型、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc區(qū)包含由二硫鍵結(jié)合在一起的兩條H鏈的羧基末端部分。抗體的效應(yīng)子功能由Fc區(qū)中的序列決定；該區(qū)域還是由某些類型細胞上存在的Fc受體(FcR)識別的部分。在一些實施方案中，F(xiàn)c多肽包含野生型鉸鏈序列的部分或全部(通常在其N末端處)。在一些實施方案中，F(xiàn)c多肽不包含有功能的或野生型的鉸鏈序列。

“有功能的Fc區(qū)”擁有天然序列Fc區(qū)的“效應(yīng)子功能”。示例性“效應(yīng)子功能”包括C1q結(jié)合；CDC；Fc受體結(jié)合作用；ADCC；吞噬；下調(diào)細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)等。這類效應(yīng)子功能通常需要Fc區(qū)與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，抗體可變結(jié)構(gòu)域)組合并且可以使用例如在本文的定義中公開的各種測定法評估。

“天然序列Fc區(qū)”包含與自然界中存在的Fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc區(qū)包括天然序列人IgG1Fc區(qū)(非A同種型和A同種異型)；天然序列人IgG2Fc區(qū)；天然序列人IgG3Fc區(qū)；和天然序列人IgG4Fc區(qū)，以及其天然存在的變體。

“變體Fc區(qū)”包含因至少一個氨基酸修飾、優(yōu)選地一個或多個氨基酸置換而不同于天然序列Fc區(qū)的氨基酸序列。優(yōu)選地，與天然序列Fc區(qū)或與親本多肽的Fc區(qū)相比，變體Fc區(qū)在天然序列Fc區(qū)中或在親本多肽的Fc區(qū)中具有至少一個氨基酸置換，例如，約1個至約10個氨基酸置換，和優(yōu)選地約1個至約5個氨基酸置換。本文中的變體Fc區(qū)將優(yōu)選地與天然序列Fc區(qū)和/或與親本多肽的Fc區(qū)具有至少約80％同源性，并最優(yōu)選地與之具有至少約90％同源性，更優(yōu)選地與之具有至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％同源性。

如本文所用的“Fc組分”指Fc區(qū)的鉸鏈區(qū)、C_H2結(jié)構(gòu)域或C_H3結(jié)構(gòu)域。

在某些實施方案中，含有鉸鏈的多肽包含IgG/Fc區(qū)、優(yōu)選地衍生自野生型人IgG/Fc區(qū)。對于“野生型”人IgG/Fc，其意指在人群內(nèi)部天然出現(xiàn)的氨基酸序列。當然，正如Fc序列可以在個體之間略微變動，可以對野生型序列進行一或多個改變并且仍然處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，F(xiàn)c區(qū)可以含有與本發(fā)明不相關(guān)的額外改變，如糖基化位點中的突變或納入非天然氨基酸。

術(shù)語“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”指參與抗體結(jié)合至抗原的抗體重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域。天然抗體重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域(分別是V_H和V_L)通常具有相似的結(jié)構(gòu)，每種結(jié)構(gòu)域包含四個保守的構(gòu)架區(qū)(FR)和三個高變區(qū)(HVR)。(參見，例如，Kindt等人,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91頁(2007))。單個V_H結(jié)構(gòu)域或V_L結(jié)構(gòu)域可能足以賦予抗原結(jié)合特異性。另外，結(jié)合特定抗原的抗體可以利用來自結(jié)合該抗原的抗體的V_H或V_L結(jié)構(gòu)域進行分離以分別篩選互補性V_L結(jié)構(gòu)域或V_H結(jié)構(gòu)域的文庫。見，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。

如本文所用的術(shù)語“Fab”指抗體的抗原結(jié)合片段。如上文所示，木瓜蛋白酶可以用來消化完整抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生了兩個相同的抗原結(jié)合片段，即，“Fab片段和殘余“Fc片段(即，上文的Fc區(qū))。Fab片段由整個L鏈連同H鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(V_H)和一條重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(C_H1)組成。

如本文所用的短語“抗原結(jié)合臂”、“靶分子結(jié)合臂”、“靶結(jié)合臂”及其變型指本發(fā)明異多聚體蛋白的組分部分，所述組分部分具有特異性結(jié)合目的靶的能力。通常并且優(yōu)選地，抗原結(jié)合臂是免疫球蛋白多肽序列的復(fù)合物(例如，免疫球蛋白輕鏈和重鏈的CDR和/或可變結(jié)構(gòu)域序列)。

“靶”或“靶分子”指由異多聚體蛋白的結(jié)合臂識別的部分。例如，如果異多聚體蛋白是抗體，則靶可以是在單個分子上或在不同分子上的表位、或病原體或腫瘤細胞，這取決于上下文。類似地，如果異多聚體蛋白是受體-Fc融合蛋白，則靶將是受體的同族結(jié)合配偶體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，靶由靶結(jié)合臂的結(jié)合特異性確定并且不同的靶結(jié)合臂可以識別不同的靶。靶優(yōu)選地以高于1uM Kd的親和力與本發(fā)明的異多聚體蛋白結(jié)合(根據(jù)斯卡查德分析)。靶分子的例子包括，但不限于血清可溶性蛋白和/或其受體，如細胞因子和/或細胞因子受體、黏附素、生長因子和/或其受體、激素、病毒粒子(例如，RSV F蛋白、CMV、StaphA、流感病毒、丙型肝炎病毒)、微生物(例如，細菌細胞蛋白、真菌細胞)、黏附素、CD蛋白和其受體。

“完整”或“全長”抗體的一個例子是一種包含抗原結(jié)合臂以及C_L和至少重鏈恒定結(jié)構(gòu)域、C_H1、C_H2和C_H3的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如，人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。

如本文所用的術(shù)語“偶聯(lián)”指為了彼此連接第一和第二含有鉸鏈的多肽(例如，形成共價鍵)而必需的步驟。這類步驟包括使第一和第二含有鉸鏈的多肽中半胱氨酸殘基還原、復(fù)性和/或氧化以形成鏈間二硫鍵。偶聯(lián)可以通過化學(xué)交聯(lián)或使用氧化還原系統(tǒng)實現(xiàn)。參見，例如Humphreys等人,J.Immunol.Methods(1998)217:1-10和Zhu等人,Cancer Lett.,(1994)86:127-134。

術(shù)語“多特異性抗體”以最廣意義使用并且特別地涵蓋具有多表位特異性的抗體。這類多特異性抗體包括，但不限于包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域(V_H)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(V_L)的抗體，其中所述V_HV_L單位具有多表位特異性；具有兩個或更多個V_L結(jié)構(gòu)域和V_H結(jié)構(gòu)域的其中每個V_HV_L單位與不同表位結(jié)合的抗體、具有兩個或更多個單一可變結(jié)構(gòu)域的其中每個單一可變結(jié)構(gòu)域與不同表位結(jié)合的抗體；全長抗體；抗體片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、雙體抗體、雙特異性雙體抗體和三體抗體、已經(jīng)共價或非共價連接的抗體片段?！岸啾砦惶禺愋浴敝概c相同靶或不同靶上兩個或更多個不同表位特異性結(jié)合的能力?！皢翁禺愋浴敝竷H結(jié)合一個表位的能力。根據(jù)一個實施方案，所述多特異性抗體是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的親和力與每個表位結(jié)合的IgG抗體。圖1B中提供雙特異性抗體的示意圖。

“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選地完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包含F(xiàn)ab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙體抗體(Db)；串聯(lián)雙體抗體(taDb)、線性抗體(例如，美國專利號5 641 870；Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；一臂抗體、單一可變結(jié)構(gòu)域抗體、微型抗體、單鏈抗體分子；和從抗體片段形成的多特異性抗體(例如，包括但不限D(zhuǎn)b-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3和(scFV)4-Fc)。

表示“單一結(jié)構(gòu)域抗體”(sdAb)或“單一可變結(jié)構(gòu)域(SVD)抗體”通常指其中單一可變結(jié)構(gòu)域(V_H或V_L)可以賦予抗原結(jié)合作用的抗體。換而言之，單一可變結(jié)構(gòu)域不需要與另一個可變結(jié)構(gòu)域相互作用以識別靶抗原。單結(jié)構(gòu)域抗體由每條抗原結(jié)合臂上的單一單體可變抗體結(jié)構(gòu)域(V_H或V_L)組成。單一結(jié)構(gòu)域抗體的例子包括源自駝類(camelid)(羊駝和駱駝)和軟骨魚(例如，護士鯊)的那些和源自重組方法來自人和小鼠抗體(Ward等人,Nature(1989)341:544-546；Dooley和Flajnik,Dev Comp Immunol(2006)30:43-56；Muyldermans等人,Trend Biochem Sci(2001)26:230-235；Holt等人,Trends Biotechnol(2003):21:484-490；WO 2005/035572；WO 03/035694；Davies和Riechmann,Febs Lett(1994)339:285-290；WO00/29004；WO 02/051870)的那些。單一可變域抗體可以在具有其他可變區(qū)或可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合臂(例如，同型多聚體或異多聚體)中存在，在這種情況下，它不是單結(jié)構(gòu)域抗體。

表述“線性抗體”通常指在Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)中描述的抗體。簡而言之，這些抗體包含一對串聯(lián)Fd區(qū)段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)，它們與互補性輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異或單特異的。

如本文中提到的術(shù)語“結(jié)入孔”或“KnH”技術(shù)指通過在兩條多肽相互作用的界面處將隆起(結(jié))引入一個多肽中并將腔體(孔)引入另一個多肽在體外或在體內(nèi)指導(dǎo)這兩種多肽配對在一起的技術(shù)。例如，已經(jīng)在抗體的Fc:Fc結(jié)合界面、C_L:C_H1界面或V_H/V_L界面中引入KnH(例如，US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431和Zhu等人，(1997)Protein Science 6:781-788)。這種特別可用于制造多特異性抗體期間驅(qū)動兩條不同的重鏈配對在一起。例如，在其Fc區(qū)中具有KnH的多特異性抗體還可以包含與每個Fc區(qū)連接的單一可變結(jié)構(gòu)域或還包含與相似或不同輕鏈可變結(jié)構(gòu)域配對的不同重鏈可變結(jié)構(gòu)域。KnH技術(shù)也可以用來使兩個不同的受體胞外結(jié)構(gòu)域配對在一起或包含不同靶識別序列的任何其他多肽序列(例如，包括親和體、肽體(peptibody)和其他Fc融合物)配對在一起。

“Fv”由緊密、非共價締合的一個重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。貢獻用于抗原結(jié)合的氨基酸殘基并向該抗體賦予抗原結(jié)合特異性的6個高變環(huán)(分別來自H和L鏈的3個環(huán))源自這兩個結(jié)構(gòu)域的折疊。然而，甚至單一可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含3個抗原特異性CDR的半個Fv)具有識別并結(jié)合抗原的能力，雖然經(jīng)常以小于完整結(jié)合部位的親和力進行。

還縮寫為“sFv”或“scFv”的“單鏈Fv”是包含連接成為單條多肽鏈的V_H和V_L抗體結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選地，sFv多肽還包含在V_H結(jié)構(gòu)域和V_L結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，所述多肽接頭能夠使scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述，參見Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore編著,Springer-Verlag,New York,第269-315頁(1994)；Malmborg等人,J.Immunol.Methods 183:7-13,1995。

術(shù)語“雙體抗體”指通過以下方式制備的小抗體片段(參見前述段落)：構(gòu)建在V_H和V_L結(jié)構(gòu)域之間具有短接頭(約5-10個殘基)的sFv片段，從而實現(xiàn)V結(jié)構(gòu)域的鏈間而非鏈內(nèi)配對，產(chǎn)生雙價片段，即具有兩個抗原結(jié)合位點的片段。雙特異性雙體抗體是兩個“交叉”sFv片段的異二聚體，其中這兩個抗體的V_H和V_L結(jié)構(gòu)域存在于不同的多肽鏈上。在例如EP404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)中更充分地描述雙體抗體。

術(shù)語“一臂抗體”指這樣的抗體，其包含(1)由肽鍵連接至多肽的可變結(jié)構(gòu)域，所述多肽包含C_H2結(jié)構(gòu)域、C_H3結(jié)構(gòu)域或C_H2-C_H3結(jié)構(gòu)域，和(2)第二C_H2、C_H3或C_H2-C_H3結(jié)構(gòu)域，其中可變結(jié)構(gòu)域不借助肽鍵連接至包含第二C_H2、C_H3或C_H2-C_H3結(jié)構(gòu)域的多肽。在一個實施方案中，一臂抗體包含3種多肽：(1)包含可變結(jié)構(gòu)域(例如，V_H)、C_H1、C_H2和C_H3的第一多肽，(2)包含可變結(jié)構(gòu)域(例如，V_L)和C_L結(jié)構(gòu)域的第二多肽，和(3)包含C_H2和C_H3結(jié)構(gòu)域的第三多肽。在另一個實施方案中，一臂抗體具有含有兩個半胱氨酸殘基的部分鉸鏈區(qū)，所述半胱氨酸殘基形成連接恒定重鏈的二硫鍵。在一個實施方案中，一臂抗體的可變結(jié)構(gòu)域形成抗原結(jié)合區(qū)。在另一個實施方案中，一臂抗體的可變結(jié)構(gòu)域是單一可變結(jié)構(gòu)域，其中每個單一可變結(jié)構(gòu)域是抗原結(jié)合區(qū)。在一個實施方案中，單臂抗體是單一可變結(jié)構(gòu)域抗體。

本發(fā)明的抗體可以是“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，同時所述鏈的其余部分與源自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體類別或亞類的抗體以及這種抗體的片段中的相應(yīng)序列相同或同源，只要它們展示想要的生物學(xué)活性(美國專利號4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。目的嵌合抗體在本文中包括靈長類化抗體，所述靈長類化抗體包含源自非人靈長類(例如，舊世界猴、猿等)的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。

非人(例如，嚙齒類)抗體的“人源化”形式是含有源自非人抗體中最少序列的嵌合抗體。對大部分情況而言，人源化抗體是具有所需特異性、親和力和能力的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自所述受體的高變區(qū)中的殘基由來自非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的高變區(qū)中的殘基替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人殘基替換。另外，人源化抗體可以包含在受體抗體中或在供體抗體中不存在的殘基。作出這些修飾以進一步改進抗體性能。通常，人源化抗體將包含至少1個、并且一般2個可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高變環(huán)與非人免疫球蛋白的那些高變環(huán)對應(yīng)并且全部或基本上全部的FR區(qū)是具有人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體任選地也將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白恒定區(qū)的部分。對于進一步細節(jié)，參見Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。

“肽體(peptibody)”指隨機生成的肽與Fc結(jié)構(gòu)域的融合物。參見2003年12月9日授予Feige等人的美國專利號6,660,843(所述文獻通過引用的方式完整并入)。它們包括與N末端、C末端、氨基酸側(cè)鏈連接或與這些位點中多于一者連接的一個或多個肽。肽體技術(shù)令設(shè)計出并入靶向一種或多種配體或受體的肽、腫瘤歸巢肽、膜轉(zhuǎn)運肽等的治療藥成為可能。已經(jīng)證明肽體技術(shù)可用于設(shè)計眾多這類分子，包括線性及二硫鍵約束的肽，“串聯(lián)肽多聚體”(即，在Fc結(jié)構(gòu)域的單鏈上多于一種肽)。參見例如美國專利號6,660,843；2003年10月16日公布的美國專利申請?zhí)?003/0195156(對應(yīng)于2002年11月21日公布的WO 02/092620)；2003年9月18日公布的美國專利申請?zhí)?003/0176352(對應(yīng)于2003年4月17日公布的WO03/031589)；美國專利號6,835,809(對應(yīng)于2000年5月4日公布的WO00/24770)；2003年12月11日公布的美國專利申請?zhí)?003/0229023；2003年7月17日公布的WO 03/057134；2003年12月25日公布的美國專利申請?zhí)?003/0236193(對應(yīng)于2004年4月8日提交的PCT/US04/010989)；2003年9月18日提交的美國專利號6,919,426(對應(yīng)于2004年4月1日公布的WO 04/026329)，所述每篇文獻因而通過引用方式完整地并入。

“親和體”指使用由肽鍵連接至Fc區(qū)的蛋白質(zhì)，其中使用該蛋白質(zhì)作為支架以向靶分子提供結(jié)合表面。該蛋白質(zhì)經(jīng)常是天然存在的蛋白質(zhì)如葡萄球菌蛋白A或結(jié)合IgG的B結(jié)構(gòu)域或從中衍生的Z蛋白(參見Nilsson等人(1987),Prot Eng 1,107-133，和美國專利號5,143,844)或其片段或衍生物。例如，親和體可以從具有改變的靶分子結(jié)合親和力的Z蛋白變體產(chǎn)生，其中Z蛋白的一個區(qū)段已經(jīng)通過隨機誘變法突變以產(chǎn)生能夠結(jié)合靶分子的變體的文庫。親和體的例子包括美國專利號6,534,628；Nord K等人,Prot Eng 8:601-608(1995)和Nord K等人,Nat Biotech 15:772-777(1997)；Biotechnol Appl Biochem.2008Jun；50(Pt 2):97-112。

如本文所用，術(shù)語“免疫黏附素”指這樣的分子，所述分子將異源蛋白(“黏附蛋白”)的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子功能合并。在結(jié)構(gòu)上，免疫黏附素包括具有所需結(jié)合特異性的氨基酸序列，所述氨基酸序列不是抗體的抗原識別和結(jié)合位點(即與抗體的恒定區(qū)相比，是“異源”的)與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列(例如，IgG的C_H2和/或C_H3序列)的融合物。示例性黏附蛋白序列包含連續(xù)氨基酸序列，所述連續(xù)氨基酸序列包含受體或配體中與目的蛋白結(jié)合的部分。黏附蛋白序列也可以是結(jié)合目的蛋白的序列，但不是受體序列或配體序列(例如，肽體中的黏附蛋白序列)?？梢酝ㄟ^各種方法(包括噬菌體展示技術(shù)和高通量分選方法)選擇或鑒定這類多肽序列。免疫黏附素中的免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列可以從任何免疫球蛋白獲得，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgE、IgD或IgM。

如本文中所用的“復(fù)合”或“復(fù)合的”指借助鍵和/或不是肽鍵的力(例如，范德瓦爾斯力、疏水力、親水力)彼此相互作用的兩個或更多個分子的締合。在一個實施方案中，復(fù)合物是異多聚體。應(yīng)當理解，如本文所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)復(fù)合物”或“多肽復(fù)合物”包括具有與蛋白質(zhì)復(fù)合物中蛋白質(zhì)綴合的非蛋白質(zhì)實體的復(fù)合物(例如，包括，但不限于，化學(xué)分子如毒素或檢測劑)。

“結(jié)合”目的抗原的本發(fā)明異多聚體蛋白是這樣的異多聚體蛋白，所述異多聚體蛋白以足夠親和力結(jié)合該靶，從而所述異多聚體蛋白可以作為診斷劑和/或治療劑用于靶向蛋白質(zhì)或表達該靶的細胞或組織，并且與其他蛋白質(zhì)不明顯交叉反應(yīng)。在這類實施方案中，異多聚體蛋白與“非靶”蛋白結(jié)合的程度將小于該抗體與其特定靶蛋白的結(jié)合作用的約10％，如熒光激活細胞分選(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)或ELISA)所測定。就異多聚體蛋白與靶分子的結(jié)合而言，術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異性結(jié)合至”特定多肽或特定多肽靶上表位或是“對其特異的”意指可度量地與非特異性相互作用不同的結(jié)合(例如，非特異性相互作用可以是與牛血清白蛋白或酪蛋白的結(jié)合)?？梢詼y量特異性結(jié)合作用，例如，通過與對照分子的結(jié)合作用相比確定分子的結(jié)合作用來測量。例如，可以通過與類似于靶的對照分子(例如過量的未標記靶)競爭來測定特異性結(jié)合。在這種情況下，如果標記的靶與探針的結(jié)合受過量未標記的靶競爭性抑制，則證實特異性結(jié)合。如本文所用的術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異性結(jié)合于”或者是“特異于”特定多肽或特定多肽靶上的表位，可以例如通過對靶具有至少約200nM、備選地至少約150nM、備選地至少約100nM、備選地至少約60nM、備選地至少約50nM、備選地至少約40nM、備選地至少約30nM、備選地至少約20nM、備選地至少約10nM、備選地至少約8nM、備選地至少約6nM、備選地至少約4nM、備選地至少約2nM、備選地至少約1nM或更大Kd的分子顯示。在一個實施方案中，術(shù)語“特異性結(jié)合”指這樣的結(jié)合，其中某異多聚體蛋白與特定多肽或特定多肽上的表位結(jié)合而基本上不與任何其他多肽或多肽表位結(jié)合。

“結(jié)合親和力”通常指分子(例如，抗體)的單一結(jié)合位點及其結(jié)合配偶物(例如，抗原)之間總非共價相互作用之和的強度。除非另外指出，否則如本文所用，“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對子的成員(例如，抗體和抗原)之間1:1相互作用的固有結(jié)合親和力。分子X對其配偶物Y的親和力可以通常由解離常數(shù)(Kd)代表。例如，Kd可以是約200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM或更強。親和力可以由本領(lǐng)域已知的常見方法測量，包括本文所述的那些方法。低親和力抗體通常緩慢結(jié)合抗原并且傾向于輕易解離，而高親和力抗體通常較快地結(jié)合抗原并且傾向于更長地保持結(jié)合。測量結(jié)合親和力的多種方法是本領(lǐng)域已知的，其中任一個可以用于本發(fā)明的目的。

在一個實施方案中，通過使用表面等離子體共振測定法，使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃采用固定靶(例如，抗原)CM5芯片以約10個響應(yīng)單位(RU)，測量本發(fā)明“Kd”或“Kd值。簡而言之，根據(jù)供應(yīng)商說明書，以鹽酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物傳感器芯片(CM5，BIAcore，Inc.)?？乖?0mM乙酸鈉，pH 4.8稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，隨后以5μl/分鐘的流速上樣以實現(xiàn)偶聯(lián)蛋白的大約10個響應(yīng)單位(RU)。注射抗原后，注入1M乙醇胺以封閉未反應(yīng)的基團。對于動力學(xué)測量，在25℃以大約25μl/分鐘的流速注入含0.05％Tween 20(PBST)的PBS(PBST)中Fab的2倍連續(xù)稀釋物(例如，0.78nM至500nM)。使用簡單一對一Langmuir結(jié)合模型(BIAcore評價軟件3.2版)，通過同時擬合締合和解離傳感圖(sensorgram)，計算結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)。將平衡解離常數(shù)(Kd)計算為koff/kon比。參見，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通過以上表面等離子體共振測定法顯示締合速率超過10⁶M^-1S^-1，則可以使用熒光猝滅技術(shù)測定締合速率，其中在如光譜儀(如配備止流(stop-flow)的分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌型比色皿的8000-系列SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic))中所測量的增加濃度的抗原存在下，所述熒光猝滅技術(shù)在25℃測量在PBS，pH 7.2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)的熒光發(fā)射強度(激發(fā)＝295nm；發(fā)射＝340nm，16nm帶通)增加或減少。

除非另外說明，否則就本發(fā)明的異多聚體蛋白(如抗體、片段、或其衍生物)而言“生物學(xué)活性的”和“生物學(xué)活性”和“生物學(xué)特征”意指具有與生物分子結(jié)合的能力。

當用來描述各種異多聚體多肽時，“分離的”意指已經(jīng)從自其中表達它的細胞或細胞培養(yǎng)物分出和/或回收的異多聚體。其自然環(huán)境的雜質(zhì)組分是將干擾異多聚體的診斷性或治療性用途的物質(zhì)并且可以包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性溶質(zhì)。在某些實施方案中，將該異多聚體純化(1)至按照蛋白質(zhì)的重量計大于95％，如通過Lowry法測定，并且最優(yōu)選地按照重量計大于99％、純化(2)至足以通過轉(zhuǎn)杯測序儀(spinning cup sequenator)獲得至少15個N端殘基或內(nèi)部氨基酸序列的程度或純化(3)至通過還原或非還原條件下使用考馬斯藍或優(yōu)選地銀染SDS-PAGE所確定的均一性。然而，一般將通過至少一個純化步驟制備分離的多肽。

本發(fā)明的異多聚體通常純化至基本上均一。短語“基本上均一的”、“基本上均一形式”和“基本均一性”是用來表示，該產(chǎn)物基本上沒有源自不希望的多肽組合中的副產(chǎn)物(例如，同型多聚體)。

以純度表述時，基本上均一性意指副產(chǎn)物的量不超過以重量計10％、9％、8％、7％、6％、4％、3％、2％或1％或是小于以重量計1％。在一個實施方案中，副產(chǎn)物低于5％。

“生物分子”指核酸、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)及其組合。在一個實施方案中，生物分子存在于自然界中。

如本文所用的“連接的”或“連接意指第一和第二氨基酸序列之間的直接肽鍵連接或涉及第三氨基酸序列的鍵，所述第三氨基酸序列是與第一和第二氨基酸序列結(jié)合并在其之間的肽。例如，接頭肽與一個氨基酸序列的C末端結(jié)合并且與另一個其他氨基酸序列的N末端結(jié)合。

如本文所用的“接頭”意指兩個或更多個氨基酸長度的氨基酸序列。接頭可以由中性、極性或非極性氨基酸組成。接頭可以例如是2至100個氨基酸長度，如在2和50個氨基酸長度之間，例如，3、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個氨基酸長度。接頭可以是“可切割的”，例如，借助自我切割過程或酶促切割過程或化學(xué)切割過程可切割。氨基酸序列和酶中的切割位點和在這類位點處切割的化學(xué)物是本領(lǐng)域熟知的并且還在本文描述。

如本文所用的“系索”意指接合兩個其他氨基酸序列的氨基酸接頭。如本文所述的系索可以將免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域的N末端與免疫球蛋白輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的C末端連接。在具體的實施方案中，系索長度在約15和50個氨基酸長度之間，例如，在20和26個氨基酸長度(例如，20、21、22、23、24、25或26個氨基酸長度)之間。接頭可以系索可以是“可切割的，例如，使用本領(lǐng)域標準的方法和試劑借助自我切割過程或酶促切割過程或化學(xué)切割過程“可切割。

“接頭”或“系索”的酶促切割可以涉及使用內(nèi)肽酶如，例如，Lys-C、Asp-N、Arg-C、V8、Glu-C、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝血酶、Genenase、因子Xa、TEV(煙草蝕紋病毒半胱氨酸蛋白酶)、腸激酶、HRV C3(人鼻病毒C3蛋白酶)、激肽原、以及枯草桿菌蛋白酶樣前蛋白轉(zhuǎn)化酶(例如，弗林蛋白酶(PC1)、PC2或PC3)或N-精氨酸雙堿性轉(zhuǎn)化酶。化學(xué)切割可以包括例如羥胺、N-氯代琥珀酰亞胺、N-溴代琥珀酰亞胺或溴化氰的使用。

如本文所用的“Lys-C內(nèi)肽酶切割位點”是在氨基酸序列中可以由Lys-C內(nèi)肽酶在C端側(cè)切割的賴氨酸殘基。Lys-C內(nèi)肽酶在賴氨酸殘基的C端側(cè)切割。

“離液劑”意指通過干擾穩(wěn)定分子內(nèi)相互作用(例如，氫鍵、范德瓦爾斯力、或疏水性效應(yīng))破壞蛋白質(zhì)(例如，抗體)的三維結(jié)構(gòu)的水溶性物質(zhì)。示例性離液劑包括但不限于尿素、胍-HCl、高氯酸鋰、組氨酸和精氨酸。

“溫和去垢劑”意指水溶性物質(zhì)，所述水溶性物質(zhì)通過干擾穩(wěn)定分子內(nèi)相互作用(例如，氫鍵、范德瓦爾斯力、或疏水性效應(yīng))破壞蛋白質(zhì)(例如，抗體)的三維結(jié)構(gòu)，但是不永久破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以至于造成生物學(xué)活性喪失(即，不使蛋白質(zhì)變性)。示例性溫和去垢劑包括但不限于Tween(例如，Tween-20)、Triton(例如，Triton X-100)、NP-40(壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)、Nonidet P-40(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)和十二烷基硫酸鈉(SDS)。

抗體“效應(yīng)子功能”指歸因于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))的那些生物學(xué)活性性，并隨抗體同種型而變動?？贵w效應(yīng)子功能的例子包括：C1q結(jié)合和補體依賴的細胞毒性；Fc受體結(jié)合作用；抗體依賴的細胞介導(dǎo)細胞毒性(ADCC)；吞噬；下調(diào)細胞表面受體(例如，B細胞受體)；和B細胞活化。

“抗體依賴的細胞介導(dǎo)細胞毒性”或“ADCC”指一種形式的細胞毒性，其中與某些細胞毒性細胞(例如，天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcRs)結(jié)合的分泌型Ig使得這些細胞毒效應(yīng)細胞與攜帶抗原的靶細胞特異性結(jié)合并隨后用細胞毒藥物殺傷靶細胞成為可能?？贵w“武裝”細胞毒性細胞并且是這類殺傷作用絕對需要的。用于介導(dǎo)ADCC的主要細胞即NK細胞，僅表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464頁上的表3中總結(jié)了造血細胞上的FcR表達。為了評估目的分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定法，如美國專利號5,500,362或5,821,337中描述的那種測定法。用于此類測定法的效應(yīng)細胞括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。備選或額外地，可以在體內(nèi)，例如，在動物模型中，如在Clynes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)公開中的那種動物模型中評估目的分子的ADCC活性。

“Fc受體”或“FcR”描述與抗體的Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是人FcR。另外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體(γ受體)的一種受體并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(“激活性受體”)和FcγRIIB(“抑制性受體”)，它們具有主要在其胞質(zhì)域內(nèi)不同的相似氨基酸序列。激活性受體FcγRIIA在其胞質(zhì)域中含有基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受體FcγRIIB在其胞質(zhì)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見MAnnu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)中的綜述)。FcR在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-492(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中綜述。本文中的術(shù)語“FcR”涵蓋其他FcR，包括將來待鑒定的那些。該術(shù)語還包括負責(zé)轉(zhuǎn)移母體IgG至胎兒的新生兒受體FcRn(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。

“人效應(yīng)細胞”是表達一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)子功能的白細胞。優(yōu)選地，細胞至少表達FcγRIII并且執(zhí)行ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細胞的例子包括外周血單核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒T細胞和中性粒細胞，優(yōu)選PBMC和NK細胞。效應(yīng)細胞可以從天然來源(例如，從血液)分離。

“補體依賴細胞毒性”或“ADDC”指在補體存在下靶細胞的溶解。經(jīng)典補體途徑的活化因補體系統(tǒng)(C1q)第一組分與(適宜亞類的)結(jié)合至其同族抗原的抗體結(jié)合而啟動。為評估補體激活，可以進行CDC測定法，例如，如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述。

“治療有效量”指抗體、抗體片段或或衍生物治療受試者中疾病或病癥的量。在腫瘤(例如，癌性腫瘤)的情況下，抗體或抗體片段(例如，多特異性抗體或抗體片段)的治療有效量可以減少癌細胞的數(shù)目；縮減原發(fā)腫瘤大??；抑制(即，某種程度減緩并且優(yōu)選地終止)癌細胞浸潤至外周器官中；抑制(即，某種程度減緩并且優(yōu)選地終止)腫瘤轉(zhuǎn)移；某種程度抑制腫瘤生長和/或某種程度減輕一種或多種與該病癥相關(guān)的癥狀。到抗體或抗體片段可以阻止生長和/或殺死現(xiàn)存癌細胞的程度上，它可以是抑制細胞的和/或細胞毒的。對于癌癥療法，體內(nèi)功效可以例如通過評估存活持續(xù)期、至病情進展時間(TTP)、緩解率(RR)、緩解的持續(xù)期和/或生活質(zhì)量來度量。

“減少或抑制”意指引起總體減少優(yōu)選地20％或更多、更優(yōu)選地50％或更多、并且最優(yōu)選地75％、85％、90％、95％或更多的能力?？s減或抑制可以指正在治療的病癥的癥狀、轉(zhuǎn)移的存在或大小、原發(fā)腫瘤的大小或生血管性病癥中血管的大小或數(shù)目。

術(shù)語“癌癥”和“癌性的”指或描述哺乳動物中一般以失調(diào)的細胞生長/增殖為特征的生理狀況。這個定義中包括良癌和惡性癌。癌癥的例子包括，但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。更多的特定的例子這類癌癥包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌或胃癌(包括胃腸道癌)、胰腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(例如，腎細胞癌)、肝癌、前列腺癌癥、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤和各種類型的頭頸癌?！霸缙诎┌Y”意指即未侵潤或未轉(zhuǎn)移性或劃歸為0、I、或II期癌的癌癥。術(shù)語“癌前期”指一般先于癌或形成癌的狀況或生長?！胺寝D(zhuǎn)移性”意指一種癌，所述癌為良性或留在原發(fā)性部位并且尚未穿透入淋巴系統(tǒng)或血管系統(tǒng)或穿透至原發(fā)性部位之外的組織。通常，非轉(zhuǎn)移性癌癥是作為0期、I期或II期癌及偶爾作為III期癌的任何癌癥。

本文中的“過敏性或炎性疾病”是過度激活個體的免疫系統(tǒng)的疾病或病癥。示例的過敏性或炎性病癥包括，但不限于哮喘、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、異位性皮炎、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、濕疹、器官移植、年齡相關(guān)性黃斑變性、Crohn病、潰瘍性結(jié)腸炎、嗜酸性粒細胞食管炎和與炎癥相關(guān)的自身免疫免疫病。

本文中的“自身免疫病”是源自并且針對個體自身組織或共分離的疾病或病癥或其表現(xiàn)或從其中所致的病狀。自身免疫疾病或病癥的例子包括但不限于關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎如急性關(guān)節(jié)炎、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、慢性炎性關(guān)節(jié)炎、變性關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、萊姆關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、椎骨關(guān)節(jié)炎和幼年發(fā)作型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、慢性進行性關(guān)節(jié)炎、變形性關(guān)節(jié)炎、慢性原發(fā)多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和強直性脊柱炎)、炎性過度增生性皮膚病、銀屑病如斑塊狀銀屑病、滴狀銀屑病、膿皰性銀屑病和趾甲銀屑病、皮炎，包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、過敏性皮炎、過敏性接觸性皮炎、皰疹樣皮炎和特異性皮炎、X連鎖的IgM過多綜合征、蕁麻疹如慢性應(yīng)性蕁麻疹和慢性特發(fā)性蕁麻疹，包括慢性自身免疫性蕁麻疹、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、幼年型皮肌炎、中毒性表皮壞死松解癥、硬皮病(包括全身性硬皮病)、硬化如系統(tǒng)性硬化病、多發(fā)性硬化(MS)如脊髓-視神經(jīng)MS、原發(fā)性進行性MS(PPMS)和復(fù)發(fā)緩解性MS(RRMS)、進行性系統(tǒng)性硬化病、動脈粥樣硬化、動脈硬化、散播性硬化和共濟失調(diào)性硬化、炎性腸病(IBD)(例如，Crohn病、自身免疫介導(dǎo)的胃腸病、結(jié)腸炎如潰瘍性結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎(colitis ulcerosa)、顯微鏡性結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、息肉狀結(jié)腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和透壁性結(jié)腸炎與自身免疫炎性腸病)、壞疽性膿皮病、結(jié)節(jié)性紅斑、原發(fā)性硬化膽管炎、表層鞏膜炎)、呼吸窘迫綜合癥、包括成人或急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、腦膜炎、全部或部分葡萄膜的炎癥、虹膜炎、脈絡(luò)膜炎、自身免疫血液病、類風(fēng)濕性脊椎炎、突發(fā)性聽力喪失、IgE-介導(dǎo)的疾病如過敏反應(yīng)和過敏性鼻炎和特應(yīng)性鼻炎、腦炎如Rasmussen腦炎和邊緣性和/或腦干腦炎、葡萄膜炎、如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎,或自身免疫性葡萄膜炎、伴發(fā)和不伴發(fā)腎病綜合征的腎小球腎炎(GN)，如慢性或急性腎小球腎炎如原發(fā)性GN、免疫介導(dǎo)的GN、膜性GN(膜性腎病)、特發(fā)性膜性GN或特發(fā)性膜性腎病、膜性(membrano)或膜性增生性GN(MPGN)(包括I型和II型)和快速進展性GN、過敏性疾病、變態(tài)反應(yīng)、濕疹，包括變應(yīng)性或特發(fā)性濕疹、哮喘，如支氣管哮喘、支氣管哮喘和自身免疫性哮喘、涉及T細胞浸潤和慢性炎癥反應(yīng)的病狀、慢性肺部炎性疾病、自身免疫性心肌炎、白細胞黏附作用缺損、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)或系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematodes)如皮膚SLE、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、新生兒狼瘡綜合征(NLE)、播散性紅斑狼瘡、狼瘡(包括腎炎、腦炎、兒科、非腎、腎外、盤狀、禿頂性狼瘡)、幼年發(fā)作型(I型)糖尿病，包括兒科胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、成人發(fā)作型糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特發(fā)性尿崩癥、與細胞因子及T-淋巴細胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫反應(yīng)、結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、肉芽腫，包括淋巴瘤樣肉芽腫、韋格納肉芽腫、粒細胞缺乏癥、血管炎類，包括血管炎(包括大血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細胞(Takayasu)動脈炎)、中等血管炎(包括川崎病和結(jié)節(jié)性多動脈炎)、顯微鏡下多動脈炎、CNS血管炎、壞死性、皮膚型或超敏性血管炎、全身性壞死性血管炎和ANCA相關(guān)性血管炎，如Churg-Strauss血管炎或綜合征(CSS))、顳動脈炎、再生障礙性貧血、自身免疫再生障礙性貧血、Coombs陽性貧血、Diamond-Blackfan貧血、溶血性貧血或免疫溶血性貧血，包括自身免疫溶血性貧血(AIHA)、惡性貧血(anemia perniciosa)、Addison病、純紅細胞貧血或純紅細胞再生障礙性貧血(PRCA)、因子VIII缺乏癥、血友病A、自身免疫中性粒細胞減少癥、全血細胞減少癥、白細胞減少癥、涉及白細胞滲出的疾病、CNS炎性疾病、多器官損傷綜合征，如繼發(fā)于敗血癥、創(chuàng)傷或出血的那些多器官損傷綜合征、抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜病、抗磷脂抗體綜合征、變應(yīng)性神經(jīng)炎、Bechet病或Behcet病、Castleman綜合征、Goodpasture綜合征、Reynaud綜合征、Sjogren綜合征、Stevens-Johnson綜合征、類天皰瘡，如大皰性類天皰瘡和皮膚類天皰瘡、天皰瘡(包括尋常性天皰瘡、落葉型天皰瘡、天皰瘡粘膜類天皰瘡(pemphigus mucus-membrane pemphigoid)和紅斑性天皰瘡)、自身免疫多內(nèi)分泌病、萊特爾病或綜合征、免疫復(fù)合物腎炎、抗體介導(dǎo)的腎炎、視神經(jīng)脊髓炎、多發(fā)性神經(jīng)病、慢性神經(jīng)病如IgM多發(fā)性神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病、血小板減少癥(如由心肌梗死患者形成)，包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)和自身免疫性或免疫介導(dǎo)的血小板減少癥，如特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)(包括慢性或急性ITP)、睪丸和卵巢的自身免疫病，包括自身免疫睪丸炎和卵巢炎、原發(fā)性甲狀腺功能減退癥、甲狀旁腺功能減退癥、自身免疫性內(nèi)分泌疾病(包括甲狀腺炎如自身免疫性甲狀腺炎、橋本病、慢性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)或亞急性甲狀腺炎、自身免疫甲狀腺病、特發(fā)性甲狀腺功能減退癥、Grave病、多內(nèi)分泌腺綜合征，如自身免疫多內(nèi)分泌腺綜合征(或多內(nèi)分泌腺內(nèi)分泌病綜合征)、副腫瘤綜合征，包括神經(jīng)系統(tǒng)副腫瘤綜合征如Lambert-Eaton肌無力綜合征或Eaton-Lambert綜合征、僵人或僵者綜合征、腦脊髓炎如變應(yīng)性腦脊髓炎或過敏性腦脊髓炎和實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)、重癥肌無力如胸腺腫瘤相關(guān)性重癥肌無力、小腦變性、神經(jīng)性肌強直、視性眼陣攣或視性眼陣攣肌陣攣綜合征(OMS)和感覺神經(jīng)病、多灶性運動神經(jīng)病、Sheehan綜合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、類狼瘡性肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎或自身免疫慢性活動性肝炎、淋巴細胞間質(zhì)性肺炎、閉塞性細支氣管炎(非移植物)與NSIP、Guillain-Barré綜合征、Berger病(IgA神經(jīng)病)、特發(fā)性IgA神經(jīng)病、線狀I(lǐng)gA皮膚病(linear IgA dermatosis)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肺硬變、自身免疫性腸病綜合征、小腸吸收不良(Celiac disease)、脂瀉病(Coeliac disease)、乳糜瀉(谷蛋白腸病)、難治性口炎性腹瀉、特發(fā)性口炎性腹瀉、冷球蛋白血癥、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS；Lou Gehrig病)、冠狀動脈病、自身免疫性耳病如自身免疫性內(nèi)耳病(AIED)、自身免疫聽力損失、視性眼陣攣肌陣攣綜合征(OMS)、多軟骨炎如難治性或復(fù)發(fā)性多軟骨炎、肺泡蛋白沉積癥、淀粉樣變性、鞏膜炎、非癌性淋巴細胞增多、原發(fā)性淋巴細胞增多，其包括單克隆B細胞淋巴細胞增多(例如，良性單克隆免疫球蛋白病和意義不確定性單克隆免疫球蛋白病，MGUS)、外周神經(jīng)病、副腫瘤性綜合征、離子通道病，如癲癇、偏頭痛、心律失常、肌肉病(muscular disorder)、耳聾、失明、周期性麻痹和CNS離子通道病、孤獨癥、炎性肌病、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)、內(nèi)分泌眼病、葡萄膜視網(wǎng)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、自身免疫性肝病、纖維肌痛、多發(fā)性內(nèi)分泌衰竭、Schmidt綜合征、腎上腺炎、胃萎縮、早老性癡呆、脫髓鞘病，如自身免疫性脫髓鞘病、糖尿病性神經(jīng)病、Dressler綜合征、斑禿、CREST綜合征(鈣質(zhì)沉著癥、雷諾現(xiàn)象、食管運動功能失常、指端硬化和毛細血管擴張癥)、男性和女性自身免疫性不育、混合型結(jié)締組織病、Chaga病、風(fēng)濕熱、反復(fù)流產(chǎn)、霉塵肺(farmer's lung)、多形紅斑、心臟切開術(shù)后綜合征、庫欣綜合征、養(yǎng)鳥人肺(bird-fancier's lung)、變應(yīng)性肉芽腫性血管炎、良性淋巴細胞血管炎、Alport綜合征、肺泡炎如過敏性肺泡炎和纖維化肺泡炎、間質(zhì)性肺病、輸血反應(yīng)、麻風(fēng)病、瘧疾、利什曼病、kypanosomiasis、血吸蟲病、蛔蟲病、曲霉病、Sampter綜合征、Caplan綜合征、登革熱、心內(nèi)膜炎、心內(nèi)膜心肌纖維化、彌漫性間質(zhì)性肺纖維化、間質(zhì)性肺纖維化、特發(fā)性肺纖維化、囊性纖維化、眼內(nèi)炎、持久性隆起性紅斑(erythema elevatum et diutinum)、胎兒幼紅細胞增多癥、嗜酸性筋膜炎、Shulman綜合征、Felty綜合征、絲蟲病(filariasis)、睫狀體炎如慢性睫狀體炎、異色性睫狀體炎(heterochronic cyclitis)、虹膜睫狀體炎或Fuch睫狀體炎、Henoch-Schonlein紫癜、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、艾柯病毒感染、心肌病、阿爾茨海默病、細小病毒感染、風(fēng)疹病毒感染、接種后綜合征、先天性風(fēng)疹感染、Epstein-Barr病毒感染、腮腺炎、Evan綜合征、自身免疫性腺衰竭、Sydenham舞蹈病、鏈球菌感染后腎炎、閉塞性血栓血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲狀腺毒癥、脊髓癆(tabes dorsalis)、脈絡(luò)膜炎、巨細胞多肌痛、內(nèi)分泌眼病、慢性過敏性肺炎、燥性角結(jié)膜炎、流行性角結(jié)膜炎、特發(fā)性腎病綜合征、微小病變腎病、良性家族性和缺血-再灌注損傷、視網(wǎng)膜自體免疫(retinal autoimmunity)、關(guān)節(jié)發(fā)炎、支氣管炎、慢性阻塞性氣道病、矽肺、口瘡、口瘡性口炎、動脈硬化病、無精子發(fā)生癥(aspermiogenese)、自身免疫性溶血、Boeck病、冷球蛋白血癥、Dupuytren攣縮、晶狀體蛋白過敏性眼內(nèi)炎、過敏性腸炎、麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑、特發(fā)性面癱、慢性疲勞綜合征、風(fēng)濕熱(febris rheumatica)、Hamman-Rich病、感覺神經(jīng)性聽力損失、陣發(fā)性血紅蛋白尿、性腺功能減退、局限性回腸炎、白細胞減少癥、傳染性單核細胞增多癥、橫貫性脊髓炎、原發(fā)特發(fā)性粘液性水腫、腎病、交感性眼炎(ophthalmia symphatica)、肉芽腫性睪丸炎、胰腺炎、急性多神經(jīng)根炎、壞疽性膿皮病、奎汶氏甲狀腺炎、獲得性脾萎縮、因抗精子抗體所致的不育、非惡性胸腺腫瘤、白斑癥、SCID和Epstein-Barr病毒相關(guān)疾病、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、寄生蟲病如利什曼原蟲病、中毒性休克綜合征、食物中毒、涉及T細胞浸潤的病狀、白細胞黏附缺陷、與細胞因子及T-淋巴細胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫反應(yīng)、涉及白細胞滲出的疾病、多器官損傷綜合征、抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜病、變應(yīng)性神經(jīng)炎、自身免疫多內(nèi)分泌病s、卵巢炎、原發(fā)粘液性水腫、自身免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、風(fēng)濕病、混合型結(jié)締組織病、腎病綜合征、胰島炎、多內(nèi)分泌衰竭(polyendocrine failure)、周圍神經(jīng)病、自身免疫多內(nèi)分泌腺綜合征I型、成人發(fā)作型特發(fā)性甲狀旁腺功能減退(AOIH)、全禿、擴張型心肌病、獲得性大皰性表皮松解(epidermolisis bullosa acquisita)(EBA)、血色素沉著癥、心肌炎、腎病綜合征、原發(fā)性硬化性膽管炎、化膿性或非化膿性竇炎、急性或慢性竇炎、篩竇炎、額竇炎、上頜竇炎或蝶竇炎、嗜酸細胞相關(guān)性病癥如嗜酸粒細胞增多癥、肺嗜酸細胞增多性浸潤、嗜酸粒細胞增多-肌痛綜合征、Loffler綜合征、慢性嗜酸性粒細胞性肺炎、熱帶肺嗜酸粒細胞增多癥、支氣管肺曲霉病、曲霉腫或含有嗜酸性細胞的肉芽腫、過敏反應(yīng)、血清陰性脊椎關(guān)節(jié)炎、多內(nèi)分泌腺自身免疫病、硬化性膽管炎、鞏膜念珠菌病、鞏膜外層念珠菌病、慢性粘膜皮膚念珠菌病、Bruton綜合征、嬰兒期暫時性低丙球蛋白血癥、Wiskott-Aldrich綜合征、共濟失調(diào)毛細血管擴張癥、與膠原病相關(guān)的自身免疫病、風(fēng)濕病、神經(jīng)疾病、缺血性再灌注病、血壓反應(yīng)下降、血管功能障礙、脈管擴張(angiectasis)、組織損傷、心血管缺血、痛覺過敏、腦缺血癥和伴血管化疾病、變應(yīng)性超敏病(allergic hypersensitivity disorder)、腎小球腎炎、再灌注損傷、心肌組織或其他組織的再灌注損傷、具有急性炎癥組分的皮膚病、急性紫癜性腦膜炎或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病、眼和眼眶炎性病癥、粒細胞輸血相關(guān)合征、細胞因子引起的中毒、急性嚴重炎癥、慢性頑固性炎癥、腎盂炎、肺硬變、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病的大動脈病癥、動脈內(nèi)增生、消化性潰瘍、心瓣炎和子宮內(nèi)膜異位癥。

如本文所用的術(shù)語“細胞毒性藥物”指抑制或阻礙細胞功能和/或造成細胞破壞的物質(zhì)。本術(shù)語意在包括放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、P32和Lu的放射性同位素)；化療藥(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、長春堿類生物堿(長春新堿、長春堿、依托泊苷)、多柔比星、美法侖、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入劑)；酶及其片段如溶核酶；抗生素；和毒素如細菌源、真菌源、植物源或動物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體；和本文公開的各種抗腫瘤藥、抗癌藥和化療藥。本文中描述了其他的細胞毒藥物。殺腫瘤藥造成腫瘤細胞毀滅。

“化療藥”是用于治療癌癥中的化學(xué)化合物?；熕幍睦影ㄍ榛瘎┤缛媾珊铜h(huán)磷酰胺；烷基磺酸酯類如白消安、英丙舒凡和泊舒凡；氮丙啶如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替派(uredopa)；環(huán)乙亞胺和甲基蜜胺類，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺；乙酸原類(尤其布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚，)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙堿；白樺脂酸；喜樹堿(camptothecin)(包括合成性類似物拓撲替康CPT-11(伊立替康，)、乙酰喜樹堿、scopolectin和9-氨基喜樹堿)；草苔蟲內(nèi)酯；海綿多烯酮類化合物(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新、卡澤來新和比折來新合成性類似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；隱藻素類(尤其隱藻素1和隱藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成性類似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；水鬼蕉堿(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇A(sarcodictyin)；海綿素(spongistatin)；氮芥類如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、二氯甲二乙胺、鹽酸氧氮芥、美法侖、新氮芥、苯芥膽甾醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲類如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、羅莫司汀、尼莫司汀和雷莫司?。豢股仡惾缦┒部股?例如，刺孢霉素、尤其刺孢霉素γ1(參見，例如Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994))；達內(nèi)霉素，包括達內(nèi)霉素A；雙膦酸鹽類如氯曲膦酸鹽；埃斯波霉素；以及新制癌菌素發(fā)色團和相關(guān)的色素蛋白烯二炔抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素、放線菌素D、安曲霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素c、卡柔比星(carabicin)、洋紅霉素、嗜癌霉素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素(dactinomycin)、佐柔比星、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括嗎啉代-多柔比星、氰嗎啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊達比星、馬塞羅霉素、絲裂霉素如絲裂霉素C、麥考酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星、鏈黑菌素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝藥如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素類如卡蘆睪酮、丙酸屈他雄酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺藥如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑如亞葉酸；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨酮戊酸；嗯尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶；bestrabucil；比生群；依達曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鳥氨酸(elfornithine)；依利醋銨；埃博霉素(epothilone)；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明(lonidainine)；類美登素如美坦辛和安斯菌素(ansamitocin)；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；噴司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基肼；丙卡巴肼；多糖復(fù)合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；丙亞胺；rhizoxin；西佐喃；鍺螺胺；替奴佐酸；三亞胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；單端孢霉烯類(尤其T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、桿孢菌素A和蛇形菌素)；烏拉坦；長春地辛達卡巴嗪；甘露莫司?。欢甯事洞迹欢逍l(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；塞替派；紫杉醇類化合物，例如，紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ))、ABRAXANETM無Cremophor、白蛋白工程化納米粒子紫杉醇制劑(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,IL)和多西他賽(doxetaxel)(Rorer、Antony、法國)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他濱6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲喋呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春堿鉑；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿奧沙利鉑；亞葉酸(leucovovin)；長春瑞濱米托蒽醌；依達曲沙；柔紅霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸鹽；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類視黃醇如視黃酸(維A酸)；卡培他濱(希羅達)；以上任意藥物的可藥用鹽、酸或衍生物；以及上述兩種或更多種藥物的組合如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX(采用奧沙利鉑(ELOXATINTM)聯(lián)用5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。

在這個定義中還包括發(fā)揮作用以調(diào)節(jié)、減少、阻斷或抑制激素效應(yīng)的抗激素藥，其中所述激素可以促進癌生長并且經(jīng)常處于全身性或整體治療形式。它們可以是激素本身。例子包括抗雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，例如包括他莫西芬(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羥他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮和托瑞米芬；抗孕酮；雌激素受體下調(diào)物(ERD)；起到抑制或關(guān)閉卵巢的藥物，例如，促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動劑如和醋酸亮丙瑞林、醋酸戈舍瑞林、醋酸布舍瑞林和曲普瑞林(tripterelin)；其他抗雄激素藥如氟他胺、尼魯米特和比卡魯胺；和抑制芳香化酶的芳香化酶抑制劑(調(diào)節(jié)腎上腺中的雌激素產(chǎn)生)，如4(5)-咪唑類、氨魯米特、醋酸甲地孕酮、阿諾新依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯唑、弗隆(femara)來曲唑和阿那曲唑。此外，化療藥的這種定義包括雙膦酸鹽類如氯曲膦酸鹽(例如，或)、依替膦酸鹽、NE-58095、唑來膦酸/唑來膦酸鹽、阿侖膦酸鹽、帕米膦酸鹽@、替魯膦酸鹽、或利塞膦酸鹽；以及曲他沙濱(1,3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其抑制涉及異常細胞增殖的信號傳導(dǎo)途徑中基因(如，PK-α、Raf、H-Ras、和表皮生長因子受體(EGF-R))表達那些；疫苗如疫苗和基因治療疫苗，例如，疫苗、疫苗、和疫苗；拓撲異構(gòu)酶1抑制劑；rmRH；二甲苯磺酸拉帕替尼(ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑也稱作GW572016)；和以上任意藥物的可藥用鹽、酸或衍生物。

在本文中使用時，“生長抑制劑”指在體外或在體內(nèi)抑制細胞生長的化合物或組合物。因而，生長抑制劑可以是一種顯著減少處于S期的細胞的百分數(shù)的藥物。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期進程(在除S期之外的位置)的藥物，如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的藥物。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春堿類(例如，長春新堿和長春堿)、紫杉烷和拓撲異構(gòu)酶II抑制劑如多柔比星、表柔比星、佐柔比星、依托泊苷及博來霉素。使G1停滯的藥物還始料未及地導(dǎo)致S期停滯，例如DNA烷基化劑如他莫西芬、潑尼松、達卡巴嗪、氮芥、順鉑、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷(ara-C)。其他信息可以在The Molecular Basis of Cancer，Mendelsohn和Israel編著,Murakami等人,第1章，標題“Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs(細胞周期調(diào)節(jié)、癌基因和抗腫瘤藥物)”(WB Saunders:Philadelphia,1995),尤其第13頁中找到。紫杉烷類(紫杉醇和多西紫杉醇)是均源自紫杉的抗癌藥物。源自歐洲紫杉的多西紫杉醇(Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇的一種半合成性類似物(紫杉酚，Bristol-Myers Squibb)。紫杉醇和多西紫杉醇促進微管從微管蛋白二聚體中裝配并且通過阻止解聚而穩(wěn)定微管，這導(dǎo)致細胞中的有絲分裂抑制。

如本文所用的“抗癌療法”指減少或抑制受試者中癌癥的治療?？拱┋煼ǖ睦影毎拘苑暖煼ㄒ约笆┯弥委熡行Я康募毎拘詣?、化療藥、生長抑制劑、癌疫苗、血管生成抑制劑、前藥、細胞因子、細胞因子拮抗劑、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、抗嘔吐藥、抗體或抗體片段或者鎮(zhèn)痛藥至所述受試者。

如本申請中所用的術(shù)語“前藥”指藥學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，其中與母藥相比，所述前體或衍生物對腫瘤細胞具有較低的細胞毒性并且能夠酶促地被活化或轉(zhuǎn)變成更有活性的母形式。見，例如，Wilman，“Prodrugs in Cancer Chemotherapy(癌癥化療中的前藥)”Biochemical Society Transactions,14,第375-382頁,615th Meeting Belfast(1986)和Stella等人“Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery(前藥：定向藥物遞送的化學(xué)手段)”,Directed Drug Delivery,Borchardt等人(編著),第247-267頁,Human Press(1985)。前藥包括但不限于含有磷酸酯的前藥、含有硫代磷酸酯的前藥、含有硫酸酯的前藥、含有肽的前藥、D-氨基酸修飾的前藥、糖基化前藥、含有β-內(nèi)酰胺的前藥、任選地含有取代型苯氧乙酰胺的前藥或任選地取代型苯乙酰胺的前藥、5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿苷前藥，這些前藥可以轉(zhuǎn)變成細胞毒性更強的游離藥物?？梢匝苌捎糜诒景l(fā)明中的前藥形式的細胞毒藥物的例子包括，但不限于上述的那些化療藥。

術(shù)語“細胞因子”是用于一個細胞群體所釋放的蛋白質(zhì)的類屬術(shù)語，所述蛋白質(zhì)作為細胞間介質(zhì)作用于另一種細胞。此類細胞因子的例子是淋巴因子類、單核因子類和傳統(tǒng)的多肽激素。細胞因子當中包括是生長激素如人生長激素(hGH)、N-甲硫酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)、胸腺刺激激素(TSH)、和促黃體激素(LH)；表皮生長因子(EGF)；肝生長因子；纖維母細胞生長因子(FGF)；催乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α和-β；繆勒管抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；促血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子如NGF-α；血小生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(Tg)如Tg-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；和粒細胞-CSF(G-CSF)；白細胞介素(ILs如IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-18a；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；和其他多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。如本文所用，術(shù)語“細胞因子”包括來自天然來源或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列細胞因子的生物學(xué)活性性等同物。

“細胞因子拮抗劑”意指部分地或完全阻斷、抑制或中和至少一種細胞因子的生物學(xué)活性性的分子。例如，細胞因子拮抗劑可以通過抑制細胞因子表達和/或分泌、或通過與細胞因子結(jié)合或與細胞因子受體結(jié)合，抑制細胞因子活性。細胞因子拮抗劑包括與細胞因子或細胞因子受體結(jié)合的抗體、合成肽或天然序列肽、免疫黏附素和小分子拮抗劑。細胞因子拮抗劑任選地與細胞毒性劑綴合或融合。示例性TNF拮抗劑是依那西普英夫單抗(infliximab)和阿達木單抗(adalimumab)(HUMIRATM)。

如本文所用的術(shù)語“免疫抑制劑”指作用在于抑制或掩蔽正在治療的受試者的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。這包括抑制細胞因子產(chǎn)生、下調(diào)或抑制自身抗原表達或掩蔽MHC抗原的物質(zhì)。免疫抑制劑的例子包括2-氨基-6-芳基-5取代的嘧啶(見美國專利號4,665,077)；麥考酚酸酯如硫唑嘌呤(/6-巰基嘌呤；溴隱亭(bromocryptine)；達那唑；氨苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美國專利號4,120,649中描述)；針對MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環(huán)孢菌素A；類固醇類如皮質(zhì)類固醇和糖皮質(zhì)激素類、例如、潑尼松、潑尼松龍如(潑尼松龍磷酸鈉)或(潑尼松龍磷酸鈉口服溶液劑)、甲潑尼龍和地塞米松；甲氨蝶呤(口服或皮下)(TREXALLTM)；羥氯喹/氯喹；柳氮磺吡啶；來福米特；細胞因子或細胞因子受體拮抗劑，包括抗干擾素-γ、-β或-α抗體、抗腫瘤壞死因子-α抗體(英夫單抗或阿達木單抗)、抗TNFα免疫黏附素(依那西普)、抗腫瘤壞死因子-β抗體、抗白介素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CD11a抗體和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；多克隆或泛T抗體或單克隆抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可溶性肽(WO 90/08187)；鏈激酶；TGF-β；鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脫氧精胍菌素；雷帕霉素；T-細胞受體(Cohen等人，美國專利號5,114,721)；T-細胞受體片段(Offner等人Science 251:430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway,Nature 341:482(1989)；和WO98/07409)；T細胞受體抗體(EP 340,109)如T10B9；環(huán)磷酰胺氨苯砜；青霉胺血漿置換；或靜脈內(nèi)用免疫球蛋白(IVIG)。這些免疫抑制劑可以單獨或彼此組合地使用，尤其類固醇與另一種免疫抑制劑的組合或此類組合后，隨后采用非類固醇藥物維持給藥以減少對類固醇的需求。

“鎮(zhèn)痛藥”指作用在于抑制或壓制受試者中疼痛的藥物。示例性鎮(zhèn)痛藥包括非甾體抗炎藥(NSAID)，包括布洛芬萘普生乙酰水楊酸、吲哚美辛、舒林酸和托美丁，包括鹽及其衍生物、以及用來減少可能出現(xiàn)的刺痛的多種其他藥物，包括抗驚厥藥(加巴噴丁、苯妥英、卡馬西平)或三環(huán)類抗抑郁藥。具體例子包括對乙酰氨基酚、阿斯匹靈、阿米替林卡馬西平苯妥英加巴噴丁(E)-N-香草基-8-甲基-6-壬烯酰胺或神經(jīng)阻滯劑。

“皮質(zhì)類固醇”指模擬或增進天然存在性皮質(zhì)類固醇的作用的具有類固醇總體化學(xué)結(jié)構(gòu)的幾種合成物質(zhì)或天然存在物質(zhì)中任一種。合成性皮質(zhì)類固醇的例子包括潑尼松、潑尼松龍(包括甲潑尼龍)、地塞米松、曲安西龍和倍他米松。

如本文所用，“癌疫苗”是在受試者中刺激針對癌癥的免疫應(yīng)答的組合物。癌疫苗一般由癌相關(guān)材料或細胞(抗原)的來源連同進一步刺激和增強針對該抗原的免疫應(yīng)答的其他組分(例如，佐劑)組成，所述的來源可以是自體的(來自自身)或相對于該受試者是同種異體的(來自其他)。癌疫苗可以導(dǎo)致刺激受試者的免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生針對一種或幾種特異性抗原的抗體，和/或產(chǎn)生殺傷性T細胞以攻擊具有那些抗原的癌細胞。

如本文所用的“細胞毒放療法”指抑制或組織細胞的功能和/或造成細胞破壞的放射療法。放射療法可以包括例如外束照射或采用放射性標記藥物(如抗體)的療法。該術(shù)語意在包括使用放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Ra223、P32和Lu的放射性同位素)。

“受試者”是脊椎動物，如哺乳動物，例如，人。哺乳動物包括，但不限于家畜(如牛)、競賽動物、寵物(如貓、犬和馬)、靈長類、小鼠和大鼠。

除外由上下文另外指示，否則術(shù)語“第一”含有鉸鏈的多肽和“第二”含有鉸鏈的多肽及其變型僅是類屬標示符，并且不得理解為確定本發(fā)明抗體的具體或特定多肽或組分。

除非另外說明，否則實施例中提到的市售試劑(如存在的情況下)根據(jù)制造商的說明書使用。以下實施例中和遍及本說明書中用ATCC登錄號所標識的那些細胞的來源(如存在的情況下)是美國典型培養(yǎng)物保藏中心，馬納薩斯，弗吉尼亞州。除非另外指出，否則本發(fā)明使用重組DNA技術(shù)的標準方法，如上文和以下教材中所述的那些方法：Sambrook等人,上文；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience,NY,1989)；Innis等人,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,Inc.,NY,1990)；Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,1988)；Gait,Oligonucleotide Synthesis(IRL Press,Oxford,1984)；Freshney,Animal Cell Culture,1987；Coligan等人,Current Protocols in Immunology,1991。

遍及本說明書，詞匯“包含”或其變異形式如“包括”或“包含有”應(yīng)理解為表示納入所陳述的整數(shù)或整數(shù)群，但不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)群。

可以理解，本文所述的發(fā)明方面和實施方案包括“由……組成”和/或“基本上由……組成”方面和實施方案。

本文中對“約”某個值或參數(shù)的談及包括(并且描述)涉及該值或參數(shù)本身的變例。例如，提到“約X”的描述包括對“X”的描述。

如本文中所用，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)稱謂，除非上下文另外清楚地說明?？梢岳斫?，本文所述發(fā)明的多個方面和變型包括“由……組成”和/或“基本上由……組成”方面和變型。

II.在哺乳動物宿主細胞中制備異多聚體蛋白的方法

使用現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)生異多聚體蛋白(例如，多特異性抗體)具有多個缺點，包括產(chǎn)生產(chǎn)物的混合物、產(chǎn)率降低和效應(yīng)子功能減低/消除連同其他。因此，需要高效地和以高水平產(chǎn)生異多聚體蛋白。

通過各種手段產(chǎn)生抗體分子通常是充分理解的。例如，美國專利6331415(Cabilly等人)，描述一種重組產(chǎn)生免疫球蛋白的方法，其中重鏈和輕鏈在單個細胞中從單個載體或從兩個獨立載體同時表達。Wibbenmeyer等人(1999,Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202)以及Lee和Kwak(2003,J.Biotechnology 101:189-198)描述了使用獨立的大腸桿菌培養(yǎng)物中表達的質(zhì)粒，從分別產(chǎn)生的重鏈和輕鏈中產(chǎn)生單克隆抗體。下述文獻中描述了與產(chǎn)生抗體有關(guān)的各種其他技術(shù)，例如，Harlow等人,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)和WO 2006028936。然而，這些技術(shù)的每一項都有缺點，如低產(chǎn)率、使用化工品。

本文中提供的方法基于以下令人驚訝的結(jié)果：從第一哺乳動物宿主細胞表達和分泌的第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈和從第二哺乳動物宿主細胞表達和分泌的第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈裝配以在合并的培養(yǎng)基中形成異多聚體蛋白。如下文進一步詳細討論，可以通過以下方式獲得合并的培養(yǎng)基：培養(yǎng)第一細胞培養(yǎng)物中的第一哺乳動物宿主細胞、培養(yǎng)第二細胞培養(yǎng)物中的第二哺乳動物宿主細胞、在不破壞第一和第二宿主細胞的細胞膜情況下收獲第一和第二培養(yǎng)基并且合并收獲的第一和第二培養(yǎng)基以獲得包含異多聚體蛋白的合并的培養(yǎng)基。備選地，可以通過在合并的細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)第一和第二哺乳動物宿主細胞和從合并的培養(yǎng)物收獲包含異多聚體蛋白的合并的細胞培養(yǎng)基，獲得合并的培養(yǎng)基。在某些實施方案中，收獲步驟包括在不破壞細胞膜的情況下移除第一和/或第二宿主細胞。

本文中提供的方法令人驚訝，因為通常認為，真核細胞(如哺乳動物細胞)的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)可能無法有效地生產(chǎn)不完整抗體。參見，例如Spiess等人(2013)Nature,31(8):753-758。

申請人還已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，異多聚體蛋白可以在還原性條件下在合并的培養(yǎng)基中以高產(chǎn)率形成，所述合并的培養(yǎng)基包含已經(jīng)由第一宿主細胞分泌的包含兩個第一含有鉸鏈的多肽和兩條第一輕鏈的第一同型二聚體和已經(jīng)由第二宿主細胞分泌的包含兩個第二含有鉸鏈的多肽和兩條第二輕鏈的第二同型二聚體。

因此，在某些實施方案中，提供制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)能夠表達并分泌第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈的第一宿主細胞，

(b)培養(yǎng)能夠表達并分泌第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈的第二宿主細胞；并且

(c)在不破壞第一和第二宿主細胞的細胞膜的情況下獲得第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并的培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含異多聚體蛋白，并且其中第一宿主細胞和第二宿主細胞各自是哺乳動物細胞。

在某些實施方案中，提供制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)能夠表達第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈的第一宿主細胞，其中包含兩個第一含有鉸鏈的多肽和兩條第一輕鏈的第一同型二聚體分泌；

(b)培養(yǎng)能夠表達第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈的第二宿主細胞，其中包含兩個第二含有鉸鏈的多肽和兩條第二輕鏈的第二同型二聚體分泌；

(c)獲得第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并的培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含第一同型二聚體和第二同型二聚體；

(d)在還原性條件下孵育合并的培養(yǎng)基，并且；

(e)獲得異多聚體蛋白，其中第一宿主細胞和第二宿主細胞各自是哺乳動物細胞。

在某些實施方案中，在不破壞第一和第二宿主細胞的細胞膜的情況下獲得合并的培養(yǎng)基。在某些實施方案中，該方法還包括添加還原劑。在某些實施方案中，還原條件足以允許異多聚體蛋白形成。

在某些實施方案中，第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈包含第一半抗體。在某些實施方案中，第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈包含第二半抗體。

在某些實施方案中，在還原性條件下孵育之前或在添加還原劑之前，約99％、約95％、約90％、約85％、約80％、約75％、約70％、約65％、約60％、約55％、約50％、約45％、約40％、約35％、約30％、約25％、約20％、約15％、約10％、約5％、或少于約5％(如約4％、約3％、約2％、或約1％)(包擴這些值之間的任何范圍)在合并的培養(yǎng)基中存在的第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈(例如，第一半抗體)處于第一同型二聚體形式。在某些實施方案中，在還原性條件下孵育之前或在添加還原劑之前，約10％至約75％、約20％至約65％、或約30％至約55％在合并的培養(yǎng)基中存在的第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈(例如，第一半抗體)處于第一同型二聚體形式。

在某些實施方案中，在還原性條件下孵育之前或在添加還原劑之前，約99％、約95％、約90％、約85％、約80％、約75％、約70％、約65％、約60％、約55％、約50％、約45％、約40％、約35％、約30％、約25％、約20％、約15％、約10％、約5％、或少于約5％(如約4％、約3％、約2％、或約1％)(包擴這些值之間的任何范圍)在合并的培養(yǎng)基中存在的第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈(例如，第二半抗體)處于第二同型二聚體形式。在某些實施方案中，在還原性條件下孵育之前或在添加還原劑之前，約10％至約75％、約20％至約65％、或約30％至約55％在合并的培養(yǎng)基中存在的第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈(例如，第二半抗體)處于第二同型二聚體形式。

在某些實施方案中，在還原性條件下孵育后或在添加還原劑后，合并的培養(yǎng)基包含少于約75％、少于約70％、少于約65％、少于約60％、少于約55％、少于約50％、少于約45％、少于約40％、少于約35％、少于約30％、少于約20％、少于約19％、少于約18％、少于約17％、少于約16％、少于約15％、少于約14％、少于約13％、少于約12％、少于約11％、少于約10％、少于約9％、少于約8％、少于約7％、少于約6％少于約5％、少于約4％、少于約3％、少于約2％或少于約1％(包括這些值之間的任何范圍)的第一同型二聚體。在某些實施方案中，在還原性條件下孵育后或在添加還原劑后，合并的培養(yǎng)基包含少于約2％至約20％、少于約5％至約15％、或少于約10％至約15％的第一同型二聚體。

在某些實施方案中，在還原性條件下孵育后或在添加還原劑后，合并的培養(yǎng)基包含少于約75％、少于約70％、少于約65％、少于約60％、少于約55％、少于約50％、少于約45％、少于約40％、少于約35％、少于約30％、少于約20％、少于約19％、少于約18％、少于約17％、少于約16％、少于約15％、少于約14％、少于約13％、少于約12％、少于約11％、少于約10％、少于約9％、少于約8％、少于約7％、少于約6％少于約5％、少于約4％、少于約3％、少于約2％或少于約1％(包括這些值之間的任何范圍)的第二同型二聚體。在某些實施方案中，在還原性條件下孵育后或在添加還原劑后，合并的培養(yǎng)基包含少于約2％至約20％、少于約5％至約15％、或少于約10％至約15％的第二同型二聚體。

在某些實施方案中，提供一種制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)第一宿主細胞，所述第一宿主細胞包含編碼第一含有鉸鏈的多肽的第一核酸和編碼第一輕鏈的第二核酸；

(b)培養(yǎng)第二宿主細胞，所述第二宿主細胞包含編碼第二含有鉸鏈的多肽的第三核酸和編碼第二輕鏈的第四核酸；并且

(c)獲得第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并的培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含異多聚體蛋白，并且其中第一宿主細胞和第二宿主細胞各自是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，第一和第二核酸是一個核酸分子；而在某些其他實施方案中，第一和第二核酸是不同的核酸分子。在某些實施方案中，第三和第四核酸是一個核酸分子；而在某些其他實施方案中，第三和第四核酸是不同的核酸分子。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)第一宿主細胞，所述第一宿主細胞包含編碼第一含有鉸鏈的多肽的第一核酸和編碼第一輕鏈的第二核酸；其中第一宿主細胞能夠表達第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈，并且其中分泌包含兩個第一含有鉸鏈的多肽和兩條第一輕鏈的第一同型二聚體；

(b)培養(yǎng)第二宿主細胞，所述第二宿主細胞包含編碼第二含有鉸鏈的多肽的第三核酸和編碼第二輕鏈的第四核酸，其中第二宿主細胞能夠表達第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈，并且其中分泌包含兩個第二含有鉸鏈的多肽和兩條第二輕鏈的第二同型二聚體；

(c)在不破壞第一和第二宿主細胞的細胞膜的情況下獲得第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并的培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含第一同型二聚體和第二同型二聚體；

(d)在足以允許異多聚體蛋白的還原性條件下孵育合并的培養(yǎng)基，并且；

(e)獲得異多聚體蛋白，其中第一宿主細胞和第二宿主細胞各自是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，第一和第二核酸是一個核酸分子；而在某些其他實施方案中，第一和第二核酸是不同的核酸分子。在某些實施方案中，第三和第四核酸是一個核酸分子；而在某些其他實施方案中，第三和第四核酸是不同的核酸分子。在某些實施方案中，該方法還包括添加還原劑至合并的培養(yǎng)基。

在某些實施方案中，提供一種制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)第一半抗體，所述第一半抗體包含具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)第二半抗體，所述第二半抗體包含具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)第一宿主細胞，所述第一宿主細胞包含編碼第一含有鉸鏈的多肽的第一核酸和編碼第一輕鏈的第二核酸；

(b)培養(yǎng)第二宿主細胞，所述第二宿主細胞包含編碼第二含有鉸鏈的多肽的第三核酸和編碼第二輕鏈的第四核酸；并且

(c)獲得第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并的培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含異多聚體蛋白，并且其中第一宿主細胞和第二宿主細胞各自是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，該方法還包括添加還原劑至合并的培養(yǎng)物。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)第一半抗體，所述第一半抗體包含具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)第二半抗體，所述第二半抗體包含具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)第一宿主細胞，所述第一宿主細胞包含編碼第一含有鉸鏈的多肽的第一核酸和編碼第一輕鏈的第二核酸；其中第一宿主細胞能夠表達第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈，并且其中分泌包含兩個第一含有鉸鏈的多肽和兩條第一輕鏈的第一同型二聚體；

(b)培養(yǎng)第二宿主細胞，所述第二宿主細胞包含編碼第二含有鉸鏈的多肽的第三核酸和編碼第二輕鏈的第四核酸，其中第二宿主細胞能夠表達第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈，并且其中分泌包含兩個第二含有鉸鏈的多肽和兩條第二輕鏈的第二同型二聚體；

(c)在不破壞第一和第二宿主細胞的細胞膜的情況下獲得第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含第一同型二聚體和第二同型二聚體；

(d)在足以允許異多聚體蛋白形成的還原性條件下孵育合并的培養(yǎng)基，并且；

(e)獲得異多聚體蛋白，其中第一宿主細胞和第二宿主細胞各自是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，該方法還包括添加還原劑至合并的培養(yǎng)基。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)第一細胞培養(yǎng)物中的第一哺乳動物宿主細胞，所述第一哺乳動物宿主細胞包含編碼第一含有鉸鏈的多肽的第一核酸和編碼第一輕鏈的第二核酸；

(b)培養(yǎng)第二細胞培養(yǎng)物中的第二哺乳動物宿主細胞，所述第二宿主細胞包含編碼第二含有鉸鏈的多肽的第三核酸和編碼第二輕鏈的第四核酸；

(c)從第一哺乳動物宿主細胞收獲第一培養(yǎng)基；

(d)從第二哺乳動物宿主細胞收獲第二培養(yǎng)基；

(e)合并第一培養(yǎng)基和第二培養(yǎng)基以獲得合并的培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含異多聚體蛋白。在某些實施方案中，收獲第一培養(yǎng)基包括從第一細胞培養(yǎng)物移除第一宿主細胞。在某些實施方案中，收獲第二培養(yǎng)基包括從第二細胞培養(yǎng)物移除第二宿主細胞。在某些實施方案中，該方法還包括添加還原劑至合并的培養(yǎng)基。

在某些實施方案中，提供制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)第一細胞培養(yǎng)物中的第一宿主細胞，所述第一宿主細胞包含編碼第一含有鉸鏈的多肽的第一核酸和編碼第一輕鏈的第二核酸；其中第一宿主細胞能夠表達第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈，并且其中分泌包含兩個第一含有鉸鏈的多肽和兩條第一輕鏈的第一同型二聚體；

(b)培養(yǎng)第二細胞培養(yǎng)物中的第二宿主細胞，所述第二宿主細胞包含編碼第二含有鉸鏈的多肽的第三核酸和編碼第二輕鏈的第四核酸，其中第二宿主細胞能夠表達第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈，并且其中分泌包含兩個第二含有鉸鏈的多肽和兩條第二輕鏈的第二同型二聚體；

(c)從第一哺乳動物宿主細胞收獲第一培養(yǎng)基，其中第一培養(yǎng)基包含第一同型二聚體；

(d)從第二哺乳動物宿主細胞收獲第二培養(yǎng)基，其中第二培養(yǎng)基包含第二同型二聚體；

(e)合并第一培養(yǎng)基和第二培養(yǎng)基以獲得合并的培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含第一同型二聚體和第二同型二聚體；

(f)在足以允許異多聚體蛋白形成的還原性條件下孵育合并的培養(yǎng)基，并且；

(g)獲得異多聚體蛋白，其中第一宿主細胞和第二宿主細胞各自是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，收獲第一培養(yǎng)基包括從第一細胞培養(yǎng)物移除第一宿主細胞。在某些實施方案中，收獲第二培養(yǎng)基包括從第二細胞培養(yǎng)物移除第二宿主細胞。在某些實施方案中，該方法還包括添加還原劑至合并的培養(yǎng)基。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)第一半抗體，所述第一半抗體包含具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)第二半抗體，所述第二半抗體包含具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二半抗體由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)第一細胞培養(yǎng)物中的第一哺乳動物宿主細胞，所述第一哺乳動物宿主細胞包含編碼第一含有鉸鏈的多肽的第一核酸和編碼第一輕鏈的第二核酸；

(b)培養(yǎng)第二細胞培養(yǎng)物中的第二哺乳動物宿主細胞，所述第二宿主細胞包含編碼第二含有鉸鏈的多肽的第三核酸和編碼第二輕鏈的第四核酸；

(c)從第一哺乳動物宿主細胞收獲第一培養(yǎng)基；

(d)從第二哺乳動物宿主細胞收獲第二培養(yǎng)基；

(e)合并第一培養(yǎng)基和第二培養(yǎng)基以獲得合并的培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含異多聚體蛋白。在某些實施方案中，收獲第一培養(yǎng)基包括移除第一宿主細胞從第一細胞培養(yǎng)物。在某些實施方案中，收獲第二培養(yǎng)基包括移除第二宿主細胞從第二細胞培養(yǎng)物。

在某些實施方案中，提供制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)第一半抗體，所述第一半抗體包含具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)第二半抗體，所述第二半抗體包含具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)第一細胞培養(yǎng)物中的第一宿主細胞，所述第一宿主細胞包含編碼第一含有鉸鏈的多肽的第一核酸和編碼第一輕鏈的第二核酸；其中第一宿主細胞能夠表達第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈，并且其中分泌包含兩個第一含有鉸鏈的多肽和兩條第一輕鏈的第一同型二聚體；

(b)培養(yǎng)第二細胞培養(yǎng)物中的第二宿主細胞，所述第二宿主細胞包含編碼第二含有鉸鏈的多肽的第三核酸和編碼第二輕鏈的第四核酸，其中第二宿主細胞能夠表達第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈，并且其中分泌包含兩個第二含有鉸鏈的多肽和兩條第二輕鏈的第二同型二聚體；

(c)從第一哺乳動物宿主細胞收獲第一培養(yǎng)基，其中第一培養(yǎng)基包含第一同型二聚體；

(d)從第二哺乳動物宿主細胞收獲第二培養(yǎng)基，其中第二培養(yǎng)基包含第二同型二聚體；

(e)合并第一培養(yǎng)基和第二培養(yǎng)基以獲得合并的培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含第一同型二聚體和第二同型二聚體；

(f)在足以允許異多聚體蛋白形成的還原性條件下孵育合并的培養(yǎng)基，并且；

(g)獲得異多聚體蛋白，其中第一宿主細胞和第二宿主細胞各自是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，收獲第一培養(yǎng)基包括從第一細胞培養(yǎng)物移除第一宿主細胞。在某些實施方案中，收獲第二培養(yǎng)基包括從第二細胞培養(yǎng)物移除第二宿主細胞。在某些實施方案中，該方法還包括添加還原劑至合并的培養(yǎng)基。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)第一哺乳動物宿主細胞，所述第一哺乳動物宿主細胞包含編碼第一含有鉸鏈的多肽的第一核酸和編碼第一輕鏈的第二核酸；

(b)培養(yǎng)第二哺乳動物宿主細胞，所述第二哺乳動物宿主細胞包含編碼第二含有鉸鏈的多肽的第三核酸和編碼第二輕鏈的第四核酸；并且

(c)收獲包含第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基以獲得第一哺乳動物宿主細胞和第二哺乳動物宿主細胞的合并培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含異多聚體蛋白。

在某些實施方案中，提供制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)第一哺乳動物宿主細胞，所述第一哺乳動物宿主細胞包含編碼第一含有鉸鏈的多肽的第一核酸和編碼第一輕鏈的第二核酸；其中第一宿主細胞能夠表達第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈，并且其中分泌包含兩個第一含有鉸鏈的多肽和兩條第一輕鏈的第一同型二聚體；

(b)培養(yǎng)第二哺乳動物宿主細胞，所述第二哺乳動物宿主細胞包含編碼第二含有鉸鏈的多肽的第三核酸和編碼第二輕鏈的第四核酸，其中第二宿主細胞能夠表達第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈，并且其中分泌包含兩個第二含有鉸鏈的多肽和兩條第二輕鏈的第二同型二聚體；

(c)收獲包含第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基以獲得第一哺乳動物宿主細胞和第二哺乳動物宿主細胞的合并培養(yǎng)基，其中合并細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基包含第一同型二聚體和第二同型二聚體；

(d)在足以允許異多聚體蛋白形成的還原性條件下孵育培養(yǎng)基，并且；

(e)獲得異多聚體蛋白，其中第一宿主細胞和第二宿主細胞各自是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，該方法還包括添加還原劑至合并的培養(yǎng)基。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)第一半抗體，所述第一半抗體包含具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)第二半抗體，所述第二半抗體包含具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)第一哺乳動物宿主細胞，所述第一哺乳動物宿主細胞包含編碼第一含有鉸鏈的多肽的第一核酸和編碼第一輕鏈的第二核酸；

(b)培養(yǎng)第二哺乳動物宿主細胞，所述第二宿主細胞包含編碼第二含有鉸鏈的多肽的第三核酸和編碼第二輕鏈的第四核酸；并且

(c)收獲包含第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基以獲得第一哺乳動物宿主細胞和第二哺乳動物宿主細胞的合并培養(yǎng)基，其中合并的培養(yǎng)基包含異多聚體蛋白。

在某些實施方案中，提供制備異多聚體蛋白的方法，所述異多聚體蛋白包含i)第一半抗體，所述第一半抗體包含具有第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的第一含有鉸鏈的多肽，其中第一含有鉸鏈的多肽與第一輕鏈締合，和ii)第二半抗體，所述第二半抗體包含具有第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的第二含有鉸鏈的多肽，其中第二含有鉸鏈的多肽與第二輕鏈締合，其中第二異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處與第一異二聚化結(jié)構(gòu)域相互作用，并且其中第一和第二含有鉸鏈的多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，所述方法包括步驟：

(a)培養(yǎng)第一哺乳動物宿主細胞，所述第一哺乳動物宿主細胞包含編碼第一含有鉸鏈的多肽的第一核酸和編碼第一輕鏈的第二核酸；其中第一宿主細胞能夠表達第一含有鉸鏈的多肽和第一輕鏈，并且其中分泌包含兩個第一含有鉸鏈的多肽和兩條第一輕鏈的第一同型二聚體；

(b)培養(yǎng)第二哺乳動物宿主細胞，所述第二哺乳動物宿主細胞包含編碼第二含有鉸鏈的多肽的第三核酸和編碼第二輕鏈的第四核酸，其中第二宿主細胞能夠表達第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈，并且其中分泌包含兩個第二含有鉸鏈的多肽和兩條第二輕鏈的第二同型二聚體；

(c)收獲包含第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基以獲得第一哺乳動物宿主細胞和第二哺乳動物宿主細胞的合并培養(yǎng)基，其中合并細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基包含第一同型二聚體和第二同型二聚體；

(d)在足以允許異多聚體蛋白形成的還原性條件下孵育培養(yǎng)基，并且；

(e)獲得異多聚體蛋白，其中第一宿主細胞和第二宿主細胞各自是哺乳動物細胞。在某些實施方案中，該方法還包括添加還原劑至合并的培養(yǎng)基。

在某些實施方案中，培養(yǎng)包含第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并細胞培養(yǎng)物在約25℃和40℃之間的溫度實施。在某些實施方案中，培養(yǎng)包含第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并細胞培養(yǎng)物在約30℃和37℃之間的溫度實施。在某些實施方案中，培養(yǎng)包含第一宿主細胞和第二宿主細胞的合并細胞培養(yǎng)物在約7.2和8.7之間的pH實施。

在某些實施方案中，將合并的培養(yǎng)基在約4℃和40℃之間的溫度孵育。在某些實施方案中，將合并的培養(yǎng)基在約30℃和37℃之間的溫度孵育。在某些實施方案中，將合并的培養(yǎng)基在約4℃和8℃之間的溫度孵育。

在某些實施方案中，攪拌合并的培養(yǎng)基。在某些實施方案中，在獲得合并的培養(yǎng)基后，攪拌合并的培養(yǎng)基約6小時、約12小時、約18小時、約24小時、約1日、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天或多于8天。在一些實施方案中，間歇攪拌合并的培養(yǎng)基。

在某些實施方案中，該方法還包括從合并的培養(yǎng)基分離異多聚體蛋白(如雙特異性抗體)。在某些實施方案中，使用蛋白A柱分離異多聚體蛋白(如雙特異性抗體)。

在某些實施方案中，該方法包括在產(chǎn)生異多聚體蛋白(如雙特異性抗體)期間添加還原劑。在本文提供的方法的某些實施方案中，所用的還原劑是谷胱甘肽、2-巰基乙醇、2-巰基乙胺、三(2-羧乙基)膦)(TCEP)、半胱氨酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇、半胱氨酸二硫蘇糖醇、二硫丁胺或其組合。在某些實施方案中，還原劑是還原型谷胱甘肽。在某些實施方案中，還原劑不是2-巰基乙醇。在某些實施方案中，還原劑不是二硫蘇糖醇。

在其中分別培養(yǎng)(即，在獨立的培養(yǎng)物中培養(yǎng))第一和第二哺乳動物宿主細胞的某些實施方案中，將還原劑在收獲第一和第二細胞培養(yǎng)基并且合并以獲得合并的培養(yǎng)基之前添加至第一細胞培養(yǎng)基和添加至第二細胞培養(yǎng)基。在第一和第二哺乳動物宿主細胞在相同培養(yǎng)物中培養(yǎng)的某些實施方案中，將還原劑在收獲合并的細胞培養(yǎng)物以獲得合并的培養(yǎng)基之前添加至合并的細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。

在某些實施方案中，在收獲步驟之前約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時、約25小時、約26小時、約27小時、約28小時、約29小時、或約30小時(包括這些值之間的任何范圍)添加還原劑。

在某些實施方案中，添加還原劑至合并的培養(yǎng)基。在某些實施方案中，將含有還原劑的合并的培養(yǎng)基孵育約4小時、約5小時、約6小時、7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約15小時、約18小時、約21小時、約24小時、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、或約7天(包括這些值之間的任何范圍)。

在某些實施方案中，將還原劑(如谷胱甘肽)添加至合并的細胞培養(yǎng)物以實現(xiàn)終濃度約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約9mM、約10mM、約11mM、約12mM、約13mM、約14mM、約15mM、約16mM、約17mM、約18mM、約19mM、約20mM、約21mM、約22mM、約23mM、約24mM、約25mM、約26mM、約27mM、約28mM、約29mM、或約30mM(包括這些值之間的任何范圍)。在某些實施方案中，將還原劑(如谷胱甘肽)添加至合并的細胞培養(yǎng)物以實現(xiàn)少于20mM的終濃度。在某些實施方案中，將還原劑(如谷胱甘肽)添加至合并的細胞培養(yǎng)物以實現(xiàn)不多于20mM的終濃度。

在某些實施方案中，在從合并的培養(yǎng)基分離異多聚體蛋白(如雙特異性抗體)之前添加還原劑至合并的培養(yǎng)基。在某些實施方案中，在從含有還原劑的合并培養(yǎng)基分離異多聚體蛋白(如雙特異性抗體)之前，將含有還原劑的合并的培養(yǎng)基孵育約4小時、約5小時、約6小時、7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約15小時、約18小時、約21小時、約24小時、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、或約7天(包括這些值之間的任何范圍)。在一些實施方案中，使用蛋白A柱分離異多聚體蛋白。

在某些實施方案中，將還原劑(如谷胱甘肽)添加至合并的培養(yǎng)基以實現(xiàn)終濃度約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約9mM、約10mM、約11mM、約12mM、約13mM、約14mM、約15mM、約16mM、約17mM、約18mM、約19mM、約20mM、約21mM、約22mM、約23mM、約24mM、約25mM、約26mM、約27mM、約28mM、約29mM、或約30mM。在某些實施方案中，將還原劑(如谷胱甘肽)添加至合并的培養(yǎng)基以實現(xiàn)少于20mM的終濃度。在某些實施方案中，將還原劑(如谷胱甘肽)添加至合并的培養(yǎng)基以實現(xiàn)不多于20mM的終濃度。

在方法的某些實施方案中，第一宿主細胞是穩(wěn)定細胞系。在某些實施方案中，第二宿主細胞是穩(wěn)定細胞系。在某些實施方案中，第一宿主細胞是CHO細胞。在某些實施方案中，第二宿主細胞是CHO細胞。在第一宿主細胞和第二宿主細胞在相同培養(yǎng)物中培養(yǎng)的某些實施方案中，第一宿主細胞和第二宿主細胞的比率在合并的培養(yǎng)物的起始時間是約1:10、約1：9、約1：8、約1：7、約1：6、約1：5、約1：4、約1：3、約1：2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、約5:1、約6:1、約7:1、約8:1、約9:1或約10:1。

如本文所用，“摩爾比”指已經(jīng)表達和/或分泌的與第一輕鏈締合的第一含有鉸鏈的多肽(如第一半抗體)對已經(jīng)表達和/或分泌的與第二輕鏈締合的第二含有鉸鏈的多肽(如第二半抗體)的比率。在一些實施方案中，與第一輕鏈締合的第一含有鉸鏈的多肽和與第二輕鏈締合的第二含有鉸鏈的多肽的摩爾比在約1.5、約1：4、約1：3、約1：2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1之間，包括這些值之間的任何范圍。在一些實施方案中，與第一輕鏈締合的第一含有鉸鏈的多肽和與第二輕鏈締合的第二含有鉸鏈的多肽的摩爾比是約1:1。在一些實施方案中，第一半抗體和第二半抗體的摩爾比在約1.5、約1：4、約1：3、約1：2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1之間，包括這些值之間的任何范圍。在一些實施方案中，第一半抗體和第二半抗體的摩爾比是約1:1。

III.異多聚體蛋白

本發(fā)明還提供通過本文所述的任一方法產(chǎn)生的異多聚體蛋白。在某些實施方案中，異多聚體蛋白包含抗體Fc區(qū)或其變體(如ADCC功能改變的變體)。在某些實施方案中，異多聚體蛋白包含抗體Fc區(qū)或其變體(例如，ADCC功能改變的變體)的明顯部分。在某些實施方案中，異多聚體蛋白包含重鏈，所述重鏈僅包含C_H1結(jié)構(gòu)域、C_H2結(jié)構(gòu)域和/或C_H3結(jié)構(gòu)域的一部分。在某些實施方案中，異多聚體蛋白是抗體片段，所述抗體片段僅包含C_H1結(jié)構(gòu)域、C_H2結(jié)構(gòu)域和/或C_H3結(jié)構(gòu)域的一部分。在某些實施方案中，異多聚體蛋白是抗體。在某些實施方案中，異多聚體蛋白是雙特異性抗體。在某些實施方案中，異多聚體蛋白是人源化抗體。在某些實施方案中，異多聚體蛋白是人抗體。在某些實施方案中，抗體是IgG(如IgG1、IgG2或IgG4)、IgA或IgD。在某些實施方案中，異多聚體蛋白的第一輕鏈和第二輕鏈包含不同的可變結(jié)構(gòu)域序列。在某些實施方案中，通過本文中提供的方法產(chǎn)生的異多聚體蛋白的第一和第二含有鉸鏈的多肽包含F(xiàn)c區(qū)或其變體。在某些實施方案中，異多聚體蛋白的第一和第二含有鉸鏈的多肽包含抗體重鏈。

異多聚化結(jié)構(gòu)域

異多聚體蛋白包含異多聚化結(jié)構(gòu)域。為了產(chǎn)生基本上同質(zhì)的異二聚體分子群體，異二聚化結(jié)構(gòu)域必須相對于同型二聚體而具有形成異二聚體的強烈偏好性。盡管本文中例舉的異多聚體蛋白使用結(jié)入孔技術(shù)以促進異多聚化，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會，其他異多聚化結(jié)構(gòu)域可用于本發(fā)明中。

結(jié)入孔

使用結(jié)入孔作為產(chǎn)生多特異性抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見1998年3月24日授予Genentech的美國專利號5,731,1680、2009年7月16日公開并授予Amgen的PCT公開號WO 2009089004和2009年7月16日公開并授予Novo Nordisk A/S的美國專利公開號20090182127。還參見Marvin和Zhu,Acta Pharmacologica Sincia(2005)26(6):649-658和Kontermann(2005)Acta Pharacol.Sin.,26:1-9。本文提供簡要討論。

“突出”指至少一個氨基酸側(cè)鏈，所述氨基酸側(cè)鏈從第一多肽的界面伸出并且因此可布置在毗鄰界面(即第二多肽的界面)的補償性空穴中，從而使異多聚體穩(wěn)定化并且因而例如有利于異多聚體形成勝過同型多聚體形成。突出可以存在于原始界面中或可以合成地引入(例如通過改變編碼該界面的核酸)。正常情況下，改變編碼第一多肽的界面的核酸以編碼突出。為了實現(xiàn)這個目的，將編碼第一多肽的界面中至少一個“原始氨基酸殘基的核酸替換為編碼具有比原始氨基酸殘基更大的側(cè)鏈體積的至少一個“輸入”氨基酸殘基的核酸。將可以理解可能存在多于一個原始殘基和相應(yīng)的輸入殘基。被替換的原始殘基的數(shù)目上限是第一多肽的界面中殘基的總數(shù)。下表1中顯示多種氨基殘基的側(cè)鏈體積：

表1

氨基酸殘基的特性

a氨基酸分子量扣減水的分子量。值來自Handbookof Chemistry and Physics,第43版,Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961.

b值來自A.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24:107-123,1972。

c值來自C.Chothia,J.Mol.Biol.105:1-14,1975?？杉氨砻鎱^(qū)域在該參考文獻的圖6-20中定義。

用于形成突出的優(yōu)選輸入殘基通常是天然存在的氨基酸殘基并且優(yōu)選地選自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最優(yōu)選的是色氨酸和酪氨酸。在一個實施方案中，用于形成突出的原始殘基具有小側(cè)鏈體積，如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸。

“空穴”指至少一個氨基酸側(cè)鏈，所述氨基酸側(cè)鏈從第二多肽的界面凹陷并且因此容納毗鄰的第一多肽界面上相應(yīng)的突出?？昭梢源嬖谟谠冀缑嬷谢蚩梢院铣傻匾?例如通過改變編碼該界面的核酸)。正常情況下，改變編碼第二多肽的界面的核酸以編碼空穴。為了實現(xiàn)這個目的，將編碼第二多肽的界面中至少一個“原始氨基酸殘基的DNA替換為編碼具有比原始氨基酸殘基更小的側(cè)鏈體積的至少一個“輸入”氨基酸殘基的核酸。將可以理解可能存在多于一個原始殘基和相應(yīng)的輸入殘基。被替換的原始殘基的數(shù)目上限是第二多肽的界面中殘基的總數(shù)。上表1中顯示多種氨基殘基的側(cè)鏈體積：用于形成空穴的優(yōu)選輸入殘基通常是天然存在的氨基酸殘基并且優(yōu)選地選自丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和纈氨酸(V)。最優(yōu)選的是絲氨酸、丙氨酸或蘇氨酸。在一個實施方案中，用于形成空穴的原始殘基具有大側(cè)鏈體積，如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。

“原始”氨基酸殘基是由可以具有比原始殘基更小或更大側(cè)鏈體積的“輸入”殘基替換的氨基酸殘基。輸入氨基酸殘基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸殘基，但優(yōu)選地是前者?！疤烊淮嬖凇钡陌被釟埢怯蛇z傳密碼編碼并在上表1中列出的那些殘基?！胺翘烊淮嬖凇钡陌被釟埢庵赣刹贿z傳密碼編碼、但能夠共價結(jié)合多肽鏈中相鄰氨基酸殘基的殘基。非天然存在的氨基酸殘基的例子是正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其他氨基酸殘基類似物，例如，在Ellman等人,Meth.Enzym.202:301-336(1991)中描述的那些。為了產(chǎn)生這類非天然存在的氨基酸殘基，可以使用Noren等人Science 244:182(1989)和上文Ellman等人的方法。簡而言之，這涉及用非天然存在的氨基酸殘基化學(xué)活化激活阻抑tRNA，隨后體外轉(zhuǎn)錄并翻譯RNA。本發(fā)明的方法涉及替換至少一個原始氨基酸殘基，但是可以替換多于一個原始殘基。正常情況下，不多于第一或第二多肽的界面中的總殘基將構(gòu)成替換的原始氨基酸殘基。一般，用于替換的原始殘基“埋入”?！奥袢搿币庵笟埢鶎嵸|(zhì)上是溶劑不可及的。通常，輸入殘基不是半胱氨酸以防止二硫鍵的可能氧化或錯誤配對。

突出“可布置”在空穴中，這意指分別在第一多肽界面和第二多肽界面上的突出和空穴的空間位置和突出和空穴的尺寸是這樣的，從而突出可以在不明顯擾動第一多肽和第二多肽在界面處正常締合情況下位于空穴中。由于突出如Tyr；Phe和Trp一般不從界面的軸垂直延伸并且具有優(yōu)選的構(gòu)象，所以在一些情況下，突出與相應(yīng)空穴的對齊依賴于根據(jù)三維結(jié)構(gòu)(如通過X射線結(jié)晶學(xué)或核磁共振(NMR)獲得的那種)，對突出/空穴對建模。這可以使用本領(lǐng)域廣泛接受的技術(shù)實現(xiàn)?！霸己怂峄蚰０搴怂帷币庵妇幋a目的多肽的核酸，所述核酸可以“改變”(即基因工程化或突變)以編碼突出或空穴。原始核酸或起始核酸可以是天然存在的核酸或可以包含已經(jīng)經(jīng)受事先改變的核酸(例如人源化抗體片段)?！案淖儭焙怂嵋庵冈己怂嵋虿迦搿⑷笔Щ蛱鎿Q至少一個編碼目的氨基酸殘基的密碼子而突變。正常情況下，編碼原始殘基的密碼子由編碼輸入殘基的密碼子替換。按照這種方式遺傳修飾DNA的技術(shù)已經(jīng)在Mutagenesis:a Practical Approach,M.J.McPherson編著(IRL Press,Oxford,UK.(1991)中綜述，并且例如包括位點定向誘變、盒誘變和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)誘變。通過突變原始/模板核酸，原始/模板核酸編碼的原始/模板多肽因此相應(yīng)地改變。

可以通過合成的手段，例如通過重組技術(shù)、體外肽合成法、用于引入前述非天然存在氨基酸殘基的那些技術(shù)、通過肽的酶促或化學(xué)偶聯(lián)或這些技術(shù)一些組合，將突出或空穴引入第一或第二多肽的界面。因此，“引入”的突出或空穴是“非天然存在的”或“非天然的”，這意指它在自然界中或在原始多肽中不存在(例如人源化單克隆抗體)。

通常，用于形成突出的輸入氨基酸殘基具有數(shù)目相對少(例如約3-6種)的“旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體”?！靶D(zhuǎn)異構(gòu)體”是氨基酸側(cè)鏈的能量有利構(gòu)象。各種氨基酸殘基的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的數(shù)目在Ponders和Richards,J.Mol.Biol.193:775-791(1987)中綜述。

在本文提供的方法的一些實施方案中，異多聚體蛋白第一異二聚化結(jié)構(gòu)域在界面處包含結(jié)修飾，并且第二異二聚化結(jié)構(gòu)域包含孔修飾。在某些實施方案中，結(jié)修飾包括來自第一異二聚化結(jié)構(gòu)域的原始氨基酸殘基置換為側(cè)鏈比原始氨基酸殘基更大的氨基酸殘基。在某些實施方案中，具有較大側(cè)鏈的置換用氨基酸殘基是色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或精氨酸。在某些實施方案中，結(jié)修飾包括T366W置換(EU編號)。在某些實施方案中，孔修飾包括來自第二異二聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基置換為具有更少側(cè)鏈的氨基酸殘基。在某些實施方案中，具有較小側(cè)鏈的置換用氨基酸殘基是絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸或丙氨酸。在一些實施方案中，孔修飾包括兩個或更多個氨基酸置換，所述氨基酸置換包括T366S、L368A和/或Y407V(EU編號)。

IV.載體、宿主細胞和重組方法

為了重組產(chǎn)生本發(fā)明的異多聚體蛋白(例如，抗體)，將編碼它的核酸分離并插入復(fù)制型載體以進一步克隆(DNA擴增)或表達。使用常規(guī)方法(例如，通過使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)，輕易地分離出編碼抗體的DNA。許多載體是可獲用的。載體的選擇部分地取決于待使用的宿主細胞。通常，宿主細胞是哺乳動物來源的。將可以理解，任何同種型的恒定區(qū)可以用于這個目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定區(qū)，并且這類恒定區(qū)可以從任何人類或動物物種獲得。

a.使用哺乳動物宿主細胞產(chǎn)生異多聚體蛋白：

載體組件通常包括但不限于以下一者或多者：信號序列、復(fù)制起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。

i.信號序列組件

用于哺乳動物宿主細胞的載體還可以含有在成熟蛋白或目的多肽的N末端具有特定切割位點的信號序列或其他多肽。選擇的異源信號序列優(yōu)選地是宿主細胞識別并加工(即，由信號肽酶切割)的一個異源信號序列。在哺乳動物細胞表達中，哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導(dǎo)序列，例如，單純皰疹gD信號，是可用的。這種前體區(qū)域的DNA符合可讀框地連接至編碼所需異多聚體蛋白)(例如，抗體)的DNA。

ii.復(fù)制起點

通常，哺乳動物表達載體不需要復(fù)制起點組件。例如，一般可以使用SV40復(fù)制起點，但是僅因為它含有早期啟動子。

iii.選擇基因組件

表達和克隆載體可以含有選擇基因，也稱作選擇標記。常見的選擇基因編碼這樣的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)(a)賦予針對抗生素或其他毒素的抗性，例如，氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素，(b)互補性營養(yǎng)缺陷型，在有意義的情況下，或(c)供應(yīng)從復(fù)雜培養(yǎng)基不可獲得的關(guān)鍵養(yǎng)分。

選擇方案的一個例子利用使宿主細胞生長停滯的藥物。用異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細胞產(chǎn)生賦予耐藥性的蛋白質(zhì)并且因此實現(xiàn)選擇方案。這種顯性選擇的例子使用藥物新霉素、麥考酚酸和潮霉素。

用于哺乳動物細胞的另一個合適選擇標記例子是這些選擇標記，它們能夠確定有能力攝取抗體的細胞，如DHF、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II、優(yōu)選地靈長類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。

例如，首先通過在含有氨甲喋呤(Mtx)(DHF的競爭性拮抗劑)培養(yǎng)基中培養(yǎng)全部轉(zhuǎn)化體，鑒定用DHF選擇基因轉(zhuǎn)化的細胞。當使用野生型DHFR時，適宜的宿主細胞是DHFR活性缺損的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(例如，ATCC CRL-9096)。

備選地，可以通過在含有針對選擇標記的選擇劑如氨基糖甙類抗生素(例如，卡那霉素、新霉素、或G418)的培養(yǎng)基中生長細胞，選擇用編碼抗體、野生型DHF蛋白和另一個選擇標記如氨基糖苷類抗生素3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細胞(尤其含有內(nèi)源DHF的野生型宿主)。參見，例如，美國專利號4,965,199。

iv.啟動子組件

表達載體和克隆載體通常含有由宿主生物識別并且與編碼含有鉸鏈的所需多肽的核酸有效連接的啟動子。哺乳動物細胞的啟動子序列是已知的。實際上，全部哺乳動物基因均具有一個距其中啟動轉(zhuǎn)錄的位點上游大約25個至30個堿基存在的AT豐富區(qū)。另一個距許多基因的轉(zhuǎn)錄起點上游70個至80個堿基存在的序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大部分哺乳動物基因的3'末端是AATAAA序列，該序列可以是添加多聚腺苷酸尾至編碼序列3’末端的信號。全部這些序均適當?shù)夭迦氩溉閯游锉磉_載體中。

哺乳動物宿主細胞中來自載體的所需含有鉸鏈的多肽轉(zhuǎn)錄和輕鏈轉(zhuǎn)錄例如下述啟動子控制，所述啟動子從病毒(例如，多瘤病毒、禽痘病毒)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40))的基因組獲得、從異源哺乳動物啟動子例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子獲得，或從熱休克啟動子獲得，條件是這類啟動子與宿主細胞系統(tǒng)相容。

SV40病毒的早期啟動子和晚期啟動子作為還含有SV40病毒復(fù)制起點的SV40限制性片段便利地獲得。人巨細胞病毒的立即早期啟動子作為HindIII E限制性片段便利地獲得。美國專利號4,419,446中公開了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統(tǒng)。美國專利號4,601,978中描述了這個系統(tǒng)的修改形式。關(guān)于小鼠細胞中在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子控制下表達人干擾素cDNA，還參見Reyes等人,Nature 297:598-601(1982)。備選地，勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)序列可以用作啟動子。

v.增強子元件組件

可以通過將增強子序列插入載體，增加通過哺乳動物宿主細胞轉(zhuǎn)錄所需的含有鉸鏈的多肽和輕鏈的DNA?，F(xiàn)在已知來自哺乳動物基因(例如，珠蛋白基因、彈性蛋白酶基因、白蛋白基因、α-胎蛋白基因和胰島素基因)的許多增強子序列。另外，可以使用來自哺乳動物細胞病毒的增強子。例子包括在復(fù)制起點晚期側(cè)(bp 100-270)的SV40增強子、細胞巨化病毒早期啟動子增強子、在復(fù)制起點晚期側(cè)上的多瘤增強子和腺病毒增強子。關(guān)于增強真核啟動子激活的元件的描述，還參見Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。增強子可以在編碼抗體多肽的序列5'或3'的位置被剪接入載體，前提是實現(xiàn)增強作用，但通常距啟動子5'的位點處存在。

vi.轉(zhuǎn)錄終止組件

哺乳動物宿主細中所用的表達載體一般還將含有為終止mRNA轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA必需的序列。這類序列常從哺乳動物DNA或cDNA或者病毒DNA或cDNA的5'非翻譯區(qū)和偶爾從其3'非翻譯區(qū)可獲得。這些區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄為編碼抗體的mRNA的非翻譯部分中聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一個可用的轉(zhuǎn)錄終止組件是牛生長激素多聚腺苷化區(qū)。參見WO94/11026并且本文中公開了表達載體。

vii.宿主細胞的選擇和轉(zhuǎn)化

用于克隆或表達本文載體中的DNA的合適宿主細胞包括本文所述的細胞哺乳動物，包括脊椎動物宿主細胞。培養(yǎng)物(組織培養(yǎng))中增殖脊椎動物細胞已經(jīng)變成一項例行程序。可用的哺乳動物宿主細胞系的例子是SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7、ATCC CRL 1651)；人胚腎系(經(jīng)亞克隆用于懸浮培養(yǎng)生長的293或293細胞，Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHF(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠支持細胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴腎細胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(HepG2，HB8065)；小鼠乳腺瘤(MM060562，ATCC CCL 51)；TRI細胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)))；MRC5細胞；FS4細胞；和人肝瘤系(HepG2)。

將宿主細胞用上述用于含有鉸鏈的所需多肽和輕鏈的表達載體或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化并且在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如果適宜，調(diào)整所述常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基以誘導(dǎo)啟動子，選擇轉(zhuǎn)化體或擴增編碼所需序列的基因。在一些實施方案中，宿主細胞是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宿主細胞。在某些實施方案中，宿主細胞是穩(wěn)定細胞系。

viii.培養(yǎng)宿主細胞

用來產(chǎn)生本發(fā)明的含有鉸鏈的所需多肽和輕鏈的宿主細胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售培養(yǎng)基如Ham F10(Sigma)、極限基本培養(yǎng)基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基((DMEM)、Sigma)適于培養(yǎng)宿主細胞。此外，在Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等人,Biochem.102:255(1980)；美國專利號4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利復(fù)審30,985中描述的任何培養(yǎng)基可以作為宿主細胞的培養(yǎng)基使用。這些培養(yǎng)基的任一者可以根據(jù)需要補充激素和/或其他生長因子(如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如慶大霉素^TM藥物)、微量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)和葡萄糖或同等能量源。也可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適宜濃度包括任何其他的必需補充物。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是先前隨被選擇用于表達的宿主細胞所用的那些培養(yǎng)條件，并且將對普通技術(shù)人員是顯而易見的。

ix.異多聚體蛋白的純化

當使用重組技術(shù)時，含有鉸鏈的多肽與締合的輕鏈多肽可以在胞內(nèi)產(chǎn)生或直接分泌入培養(yǎng)基。如果含有鉸鏈的多肽和輕鏈多肽以胞內(nèi)方式產(chǎn)生，則作為第一步驟，移除顆粒狀殘片(宿主細胞或裂解的片段)，例如，通過離心或超濾移除。在與輕鏈多肽締合的含有鉸鏈的多肽分泌入培養(yǎng)基的情況下，首先通常使用市售的蛋白質(zhì)濃縮濾器，例如，Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置，濃縮來自這類表達系統(tǒng)的上清液?？梢栽谇笆鋈我獠襟E中包含蛋白酶抑制劑如PMSF以抑制蛋白酶解，并且可以包含抗生素以防止外來污染物增長。

例如，使用羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析和親和色譜，可以純化從細胞制備的異多聚體組合物，親和色譜是優(yōu)選的純化技術(shù)。蛋白A作為親和力配體的適用性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白A可以用來純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.,62:1-13(1983))。推薦蛋白G用于全部小鼠同種型和用于人γ3(Guss等人,EMBO J.5:15671575(1986))。親和力配體與之連接的基質(zhì)最經(jīng)常是瓊脂糖，但是其他矩陣是可用的。力學(xué)穩(wěn)定的基質(zhì)如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯)苯允許比可以用瓊脂糖所實現(xiàn)的更快的流速和更短的處理時間。在抗體包含CH3結(jié)構(gòu)域的情況下，Bakerbond ABX^TM樹脂(J.T.Baker；Phillipsburg,NJ)可用于純化。根據(jù)待回收的抗體，用于蛋白純化的其他技術(shù)如在離子交換柱上分級、乙醇沉淀、反相HPLC、硅膠上色譜、肝素SEPHAROSE^TM上色譜、陰離子或陽離子交換樹脂(如聚天冬氨酸柱)上色譜、聚焦色譜，SDS-PAGE和硫酸銨沉淀法也可用的。

在任何初步純化步驟后，包含目的抗體和雜質(zhì)的混合物可以經(jīng)歷低pH疏水相互作用色譜，所述低pH疏水相互作用色譜使用pH在約2.5-4.5之間的洗脫緩沖液，優(yōu)選地以低鹽濃度(例如，從約0-0.25M鹽起)進行。異多聚體蛋白的產(chǎn)生可以備選地或額外地(除前述任何特定方法外)包括透析包含多肽混合物的溶液。

V.異多聚體蛋白形成/裝配

完整異多聚體蛋白的形成涉及通過二硫鍵的形成裝配第一含有鉸鏈的多肽、第一輕鏈、第二含有鉸鏈的多肽和第二輕鏈，這在本發(fā)明中稱作再折疊。再折疊包括第一含有鉸鏈的多肽與第二含有鉸鏈的多肽締合及鏈間二硫鍵的形成，例如，以形成雙特異性抗體。因此，在本文提供方法的一些實施方案中，異多聚體蛋白的鏈間二硫鍵在第一和第二含有鉸鏈的多肽的鉸鏈區(qū)之間。本發(fā)明中在體外進行再折疊，也稱作復(fù)性。

一旦含有鉸鏈的多肽和締合的輕鏈從細胞分泌，則異源多聚化結(jié)構(gòu)域?qū)Ⅱ?qū)動異多聚體蛋白的締合。締合的含有鉸鏈的多肽的鏈間二硫鍵形成繼續(xù)進行。所得到的二硫鍵連接的異多聚體蛋白隨后純化。任選地，可以將它配制用于研究目的、診斷目的、治療目的或其他目的。

VI.靶分子

可以由本發(fā)明的異多聚體蛋白靶向的分子的例子包括，但不限于可溶性血清蛋白和它們的受體及其他的膜結(jié)合蛋白(例如，黏附素)。

在另一個實施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白能夠結(jié)合一種、兩種或更多種選自以下的細胞因子、細胞因子相關(guān)蛋白和細胞因子受體：BMP1、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(aFGF)、FGF2(bFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNAl、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNBl、IFNG、IFNWl、FELl、FELl(EPSELON)、FELl(ZETA)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、LTA(TNF-b)、LTB、TNF(TNF-a)、TNFSF4(OX40配體)、TNFSF5(CD40配體)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配體)、TNFSF8(CD30配體)、TNFSF9(4-1BB配體)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、HGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、LL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦蛋白)、PTN和THPO。

在另一個實施方案中，靶分子是選自以下的趨化因子、趨化因子受體或趨化因子蛋白：CCL1(I-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-Ia)、CCL4(MIP-Ib)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCLH(嗜酸細胞趨化因子)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-Id)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MDP-3b)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(SLC/次級非淋巴組織趨化因子-2)、CCL22(MDC/STC-I)、CCL23(MPIF-I)、CCL24(MPIF-2/嗜酸細胞趨化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸細胞趨化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCL1(GRO1)、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCLIl(I-TAC)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYD1)、SCYE1、XCL1(淋巴細胞趨化因子)、XCL2(SCM-Ib)、BLR1(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHKl)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCRlO)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Ra)、IL8RB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCPlO、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCClO(ClO)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HDFlA、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL。

在另一個實施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白能夠結(jié)合一種或多種選自以下的靶：ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；AD0RA2A；聚集蛋白聚糖；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；ANGPT1；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；AZGP1(鋅-a-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF(BLys)；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLR1(MDR15)；BMP1；BMP2；BMP3B(GDF1O)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B；BMPR2；BPAG1(網(wǎng)蛋白)；BRCA1；C19orf10(IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2(D6/JAB61)；CCL1(1-309)；CCLI1(嗜酸性粒細胞趨化因子)；CCL13(MCP-4)；CCL15(MIP-Id)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)；CCL18(PARC)；CCL19(MIP-3b)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20(MIP-3a)；CCL21(MTP-2)；SLC；次級非淋巴組織趨化因子-2；CCL22(MDC/STC-I)；CCL23(MPIF-1)；CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2)；CCL25(TECK)；CCL26(嗜酸性粒細胞趨化因子-3)；CCL27(CTACK/ILC)；CCL28；CCL3(MTP-Ia)；CCL4(MDP-Ib)；CCL5(RANTES)；CCL7(MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1(CKR1/HM145)；CCR2(mcp-1RB/RA)；CCR3(CKR3/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKR7/EBI1)；CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)；CCRL2(L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD22；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A；CD79B；CD8；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1(e-鈣黏著蛋白)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A(p21Wap1/Cip1)；CDKN1B(p27Kip1)；CDKN1C；CDKN2A(P16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；幾丁質(zhì)酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(密蛋白-7)；CLN3；CLU(簇集蛋白)；CMKLR1；CMKOR1(RDC1)；CNR1；COL18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；CR2；CRP；CSF1(M-CSF)；CSF2(GM-CSF)；CSF3(GCSF)；CTLA4；CTNNB1(b-聯(lián)蛋白)；CTSB(組織蛋白酶B)；CX3CL1(SCYD1)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GRO1)；CXCL10(IP-10)；CXCLI1(I-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2(GRO2)；CXCL3(GRO3)；CXCL5(ENA-78/LIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3(GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCL1；DPP4；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FGF；FGF1(aFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6(HST-2)；FGF7(KGF)；FGF8；FGF9；FGFR3；FIGF(VEGFD)；FEL1(EPSILON)；FIL1(ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRT1(纖連蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-I)；FY(DARC)；GABRP(GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNAS1；GNRH1；GPR2(CCR1O)；GPR31；GPR44；GPR81(FKSG80)；GRCC1O(C1O)；GRP；GSN(凝溶膠蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HDP1；組胺和組胺受體；HLA-A；HLA-DRA；HM74；HMOX1；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；ID2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；DFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-I；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；IL1F10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2,IL1RN；IL2；IL20；IL20RA；IL21R；IL22；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST(糖蛋白130)；EL7；EL7R；EL8；IL8RA；DL8RB；IL8RB；DL9；DL9R；DLK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAKI；ERAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6(a6整聯(lián)蛋白)；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b4整聯(lián)蛋白)；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5(GCBoxBP)；KLF6；KLK1O；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)；KRT2A；KHTHB6(發(fā)特異性H型角蛋白)；LAMAS；LEP(瘦蛋白)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-b)；LTB；LTB4R(GPR16)；LTB4R2；LTBR；MACMARCKS；MAG或Omgp；MAP2K7(c-Jun)；MDK；MIB1；中期因子；MEF；MIP-2；MKI67；(Ki-67)；MMP2；MMP9；MS4A1；MSMB；MT3(metallothionectin-III)；MTSS1；MUC1(黏蛋白)；MYC；MYD88；NCK2；神經(jīng)聚糖；NFKB1；NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1(NM23A)；N0X5；NPPB；NROB1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR1I2；NR1I3；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZ1；OPRD1；P2RX7；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PDGFA；PDGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF；PGR；磷酸聚糖(phosphacan)；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG；PLXDC1；PPBP(CXCL7)；PPID；PR1；PRKCQ；PRKD1；PRL；Proc；PROK2；PSAP；PSCA；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；RAC2(p21Rac2)；RARB；RGS1；RGS13；RGS3；RNFI1O(ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2(親脂素B)；SCGB2A1(乳球蛋白2)；SCGB2A2(乳球蛋白1)；SCYE1(內(nèi)皮單核細胞-活化細胞因子)；SDF2；SERPINA1；SERPINA3；SERP1NB5(乳腺絲抑蛋白)；SERPINE1(PAI-I)；SERPDMF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT；SPP1；SPRR1B(Spr1)；ST6GAL1；STAB1；STAT6；STEAP；STEAP2；TB4R2；TBX21；TCP10；TDGF1；TEK；TGFA；TGFB1；TGFB1I1；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBR1；TGFBR2；TGFBR3；TH1L；THBS1(血小板反應(yīng)蛋白-1)；THBS2；THBS4；THPO；TIE(Tie-1)；TMP3；組織因子；TLR10；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TNF；TNF-a；TNFAEP2(B94)；TNFAIP3；TNFRSFI1A；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11(TRANCE)；TNFSF12(APO3L)；TNFSF13(4月)；TNFSF13B；TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF15(VEGI)；TNFSF18；TNFSF4(OX40配體)；TNFSF5(CD40配體)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27配體)；TNFSF8(CD30配體)；TNFSF9(4-1BB配體)；TOLLIP；To11樣受體；TOP拓撲異構(gòu)酶Ea)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TRPC6；TSLP；TWEAK；VEGF；VEGFB；VEGFC；多能聚糖；VHLC5；VLA-4；XCL1(淋巴細胞趨化因子)；XCL2(SCM-Ib)；XCR1(GPR5/CCXCR1)；YY1；和ZFPM2。

由本發(fā)明涵蓋的抗體的優(yōu)選分子靶分子包含CD蛋白質(zhì)如CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD20、CD34；ErbB受體家族的CD64、CD200成員如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；細胞黏附分子如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α/β7整聯(lián)蛋白和α/β3整聯(lián)蛋白(包括其α或β組分)(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗體)；生長因子如VEGF-A、VEGF-C；組織因子(TF)；α干擾(αIFN)；TNFα、白介素如IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-8、IL-9、IL-13、IL17A/F、IL-18、IL-13Rα1、IL13Rα2、IL-4R、IL-5R、IL-9R、IgE；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖癥(OB)受體；mpl受體；CTLA-4；RANKL、RANK、RSV F蛋白、C蛋白等。

在一個實施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白結(jié)合低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)-1或LRP-8或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體以及至少一種選自以下的靶：1)β-分泌酶(BACE1或BACE2)、2)α-分泌酶、3)γ-分泌酶、4)τ-分泌酶、5)淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)、6)死亡受體6(DR6)、7)淀粉樣蛋白β肽、8)α-突觸核蛋白、9)Parkin、10)亨廷頓蛋白、11)p75NTR、和12)胱天蛋白酶-6。

在一個實施方案中，本發(fā)明的異多聚體蛋白與選自以下的至少兩種靶分子結(jié)合：IL-1α和IL-1β、IL-12和IL-18；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-5和IL-4；IL-13和IL-1β；IL-13和IL-2；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MEF；IL-13和Tg-β；IL-13和LHR激動劑；IL-12和TWEAK、IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAM8、IL-13和PED2、IL17A和IL17F、CD3和CD19、CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD38和CD138；CD38和CD20；CD38和CD40；CD40和CD20；CD-8和IL-6；CD20和BR3、TNFα和TGF-β、TNFα和IL-1β；TNFα和IL-2、TNFα和IL-3、TNFα和IL-4、TNFα和IL-5、TNFα和IL6、TNFα和IL8、TNFα和IL-9、TNFα和IL-10、TNFα和IL-11、TNFα和IL-12、TNFα和IL-13、TNFα和IL-14、TNFα和IL-15、TNFα和IL-16、TNFα和IL-17、TNFα和IL-18、TNFα和IL-19、TNFα和IL-2、TNFα和IL-2、TNFα和IFNα、TNFα和CD4、TNFα和VEGF、TNFα和MIF、TNFα和ICAM-1、TNFα和PGE4、TNFα和PEG2、TNFα和RANK配體、TNFα和Te38；TNFα和BAFF；TNFα和CD22；TNFα和CTLA-4；TNFα和GP130；TNFα和IL-12p40；VEGF和HER2、VEGF-A和HER2、VEGF-A和PD、HER1和HER2、VEGF-A和VEGF-C、VEGF-C和VEGF-D、HER2和DR5、VEGF和IL-8、VEGF).和MET、VEGFR和MET受體、VEGFR和EGFR、HER2和CD64、HER2和CD3、HER2和CD16、HER2和HER3；EGFR(HER1)和HER2、EGFR和HER3、EGFR和HER4、IL-13和CD40L、IL4和CD40L、TNFR1和IL-1R、TNFR1和IL-6和TNFR1和IL-18R、EPCAM和CD3、MAP和CD28、EGFR和CD64、CSPG和RGM A；CTLA-4和BTNO2；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；MAG和RGM A；ng和RGM A；NogoA和RGM A；OMGp和RGM A；PDL-I和CTLA-4；和RGM A和RGM B。

其可溶性抗原或片段，任選地與其他分子綴合，可以用作產(chǎn)生抗體的免疫原。對于跨膜分子如受體，這些分子的片段(例如，受體的胞外結(jié)構(gòu)域)可以用作免疫原。備選地，表達所述跨膜分子的細胞可以用作免疫原。此類細胞可以源自天然來源(例如，癌細胞系)或可以是已經(jīng)通過重組技術(shù)轉(zhuǎn)化以表達所述跨膜分子的細胞。其他抗原及其用于制備抗體的形式對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。

VII.活性測定法

本發(fā)明的異多聚體蛋白可以通過本領(lǐng)域已知的各種測定法表征其物理/化學(xué)特性和生物學(xué)功能。

純化的異多聚體蛋白可以進一步通過一系列測定法表征，所述測定法包括但不限于N端測序、氨基酸分析、非變性大小排阻高壓液相色譜(HPLC)、質(zhì)譜、離子交換色譜和木瓜蛋白酶消化。

在本發(fā)明的某些實施方案中，對本文中產(chǎn)生的免疫球蛋白分析就其生物學(xué)活性。在一些實施方案中，對本發(fā)明的免疫球蛋白測試其抗原結(jié)合活性。本領(lǐng)域已知并且可以在本文中使用的抗原結(jié)合測定法包括而不限于使用多種技術(shù)如蛋白質(zhì)印跡、放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫沉淀測定法、熒光免疫測定和蛋白A免疫測定的任何直接結(jié)合測定法或競爭性結(jié)合測定法。下文在實施例部分中提供示意性抗原結(jié)合測定法。

在一個實施方案中，本發(fā)明構(gòu)思了擁有一些但非全部效應(yīng)子功能的改變的抗體，這使得所述抗體成為下述許多應(yīng)用的有利候選物，其中抗體的體內(nèi)半壽期重要，而某些效應(yīng)子功能(如補體和ADCC)是不必要或有害的。在某些實施方案中，測量產(chǎn)生的異多聚體蛋白的Fc活性以確保僅維持所需的特性。可以實施體外和/或體內(nèi)細胞毒性測定法以證實CDC和/或ADCC活性降低/耗盡。例如，可以實施Fc受體(FcR)結(jié)合測定法以確保異多聚體蛋白缺少Fc R結(jié)合作用(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn結(jié)合能力。介導(dǎo)ADCC的原代細胞-NK細胞僅表達而單核細胞表達和Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464頁上的表3中總結(jié)了造血細胞上的FcR表達。美國專利號5,500,362或5,821,337中描述了評估目的分子的ADCC活性的體外測定法的例子。用于此類測定法的效應(yīng)細胞括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。備選或另外，可以在體內(nèi)，例如，在動物模型中，如在Clynes等人,PNAS(USA)95:652-656(1998)公開中的那種動物模型中評估目的分子的ADCC活性。也可以實施C1q結(jié)合測定法以證實抗體不能結(jié)合C1q并因此缺少CDC活性。為評估補體激活，可以進行CDC測定法，例如，如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述。也可以使用本領(lǐng)域已知的方法確定FcRn結(jié)合作用和體內(nèi)清除率/半壽期。

VIII.綴合的蛋白質(zhì)

本發(fā)明也提供綴合的蛋白質(zhì)如綴合的抗體或免疫綴合物(例如，“抗體-藥物綴合物”或“ADC”)，包括本文所述的任何異多聚體蛋白(例如，根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的抗體)，其中輕鏈或重鏈的恒定區(qū)之一綴合至化學(xué)分子如染料或細胞毒藥物如化療藥、藥物、生長抑制劑、毒素(例如，細菌源、真菌源、植物源或動物源的酶活性毒素或其片段)、或放射性同位素(即，放射綴合物)。具體地說，如本文所述，異源多聚化結(jié)構(gòu)域的使用使得構(gòu)建含有兩條不同重鏈(HC1和HC2)以及兩條不同輕鏈(LC1和LC2)的抗體成為可能。使用本文所述方法構(gòu)建的免疫綴合物可以含有與僅一條重鏈(HC1或HC2)或僅一條輕鏈(LC1或LC2)的恒定區(qū)綴合的細胞毒藥物。另外，因為免疫綴合物可以具有與僅一條重鏈或輕鏈連接的細胞毒藥物，正在向受試者施用的細胞毒藥物的量相對于施用具有與兩條重鏈或輕鏈連接的細胞毒藥物抗體減少。減少正在向受試者施用的細胞毒藥物的量限制了與細胞毒藥物相關(guān)的不良副作用。

使用抗體-藥物綴合物局部遞送細胞毒藥物或細胞抑制藥物(即，治療癌癥時殺傷或抑制腫瘤細胞的藥物(Syrigos和Epenetos,Anticancer Research 19:605-614(1999)；Niculescu-Duvaz and Springer,Adv.Drg.Del.Rev。26:151-172(1997)；美國專利號4,975,278))允許定向遞送藥物部分至腫瘤并在其中胞內(nèi)蓄積，其中全身性施用這些未綴合的藥物可能導(dǎo)致對正常細胞以及力圖消除的腫瘤細胞而言不可接受的毒性水平(Baldwin等人,Lancet(Mar.15,1986):603-605(1986)；Thorpe,(1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,”in Monoclonal Antibodies‘84:Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人(編著)，第475-506頁))。因而在毒性最小的情況下尋求最大功效。多克隆抗體和單克隆抗體均已經(jīng)報道為可用于這些策略中(Rowland等人,Cancer Immunol.Immunother.21:183-187(1986))。這些方法中使用的藥物包括柔紅霉素、多柔比星、甲氨蝶呤、和長春地辛(Rowland等人(1986)上文)?？贵w-毒素綴合物中使用的毒素包括細菌毒素如白喉毒素、植物毒素如蓖麻毒蛋白、小分子毒素如格爾德霉素(Mandler等人,Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581(2000)；Mandler等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028(2000)；Mandler等人,Bioconjugate Chem.13:786-791(2002))、類美登素(EP 1391213；Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996))和刺孢霉素(Lode等人,Cancer Res.58:2928(1998)；Hinman等人,Cancer Res.53:3336-3342(1993))。毒素可以通過多種機制(包括微管蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合或拓撲異構(gòu)酶抑制)發(fā)揮其細胞毒作用和細胞抑制作用。與大抗體或蛋白質(zhì)受體配體綴合時，一些細胞毒藥物傾向于無活性或活性更小。

本文中描述了可用于產(chǎn)生免疫綴合物的化療藥(例如，上文)?？梢允褂玫拿富钚远舅鼗蚱淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的無結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒蛋白A鏈、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制蛋白、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制蛋白、多花白樹毒蛋白、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單端孢霉烯類。參見，例如，1993年10月28日公開的WO 93/21232。多種放射性核素可用于產(chǎn)生放射綴合的抗體。例子包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。使用以下多種雙官能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑，產(chǎn)生抗體和細胞毒藥物的綴合物：如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酯的雙功能衍生物(如己二亞氨鹽酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛(如戊二醛)、雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮苯甲?；?己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(如雙-(對-重氮鹽苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(如甲苯2,6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述那樣制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-標記的1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素與抗體綴合的示例性螯合劑。參見，例如，WO 94/11026。

本文中還構(gòu)思了抗體和一種或多種小分子毒素如刺孢霉素、類美登素、海兔毒素(dolastatin)、aurostatin、單端孢霉烯和CC1065和這些毒素的具有毒素活性的衍生物的綴合物。WO 2008/021290中提供關(guān)于這類小分子毒素的詳情。

i.美坦生和類美登素

在一些實施方案中，免疫綴合物包含與一種或多種類美登素分子綴合的本發(fā)明抗體(全長或片段)。

類美登素是通過抑制微管蛋白聚合發(fā)揮作用的有絲分裂抑制劑。美坦辛首次從分離非洲灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)(美國專利號3,896,111)。隨后隨后，發(fā)現(xiàn)某些微生物也產(chǎn)生類美登素，如美登醇和C-3美登醇酯(美國專利號4,151,042)。合成性美登醇和其衍生物和類似物例如在美國專利號4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中公開。

類美登素藥物部分是抗體-藥物綴合物中有吸引力的藥物部分，因為它們：(i)通過發(fā)酵或化學(xué)修飾、衍生化發(fā)酵產(chǎn)物相對容易制備，(ii)適合于采用適合經(jīng)非二硫鍵接頭與抗體綴合的官能團衍生化，(iii)在血漿中穩(wěn)定，和(iv)有效對抗多個腫瘤細胞系。

含有類美登素的免疫綴合物、產(chǎn)生前者的方法及其治療性用途例如在美國專利號5,208,020、5,416,064和歐洲專利EP 0 425 235 B1中公開，所述文獻的公開內(nèi)容因而通過引用的方式明確并入。Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)描述了包含命名為DM1的類美登素的免疫綴合物，所述類美登素與針對人結(jié)直腸癌的單克隆抗體C242連接。發(fā)現(xiàn)該綴合物對培養(yǎng)的結(jié)腸癌細胞具有高度細胞毒性并且在體內(nèi)腫瘤生長測定法中顯示抗腫瘤活性。Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992)描述免疫綴合物，其中類美登素借助二硫鍵接頭綴合至結(jié)合人結(jié)腸癌細胞系上抗原的鼠抗體A7、或綴合至結(jié)合HER-2/neu癌基因的另一個鼠單克隆抗體TA.1。在體外在每個細胞表達3x 105個HER-2表面抗原的人乳腺癌細胞株系SK-BR-3測試TA.1-類美登素綴合物的細胞毒性。該藥物綴合物實現(xiàn)與游離類美登素藥物相似的細胞毒性程度，其中可以通過增加類美登素分子數(shù)目/抗體分子增加所述細胞毒性程度。A7-類美登素綴合物顯示在小鼠中全身性細胞毒性低。

在不顯著地削弱抗體或類美登素分子的生物學(xué)活性的情況下，通過化學(xué)連接抗體至類美登素分子，制備抗體-類美登素綴合物。參見，例如，美國專利號5,208,020(所述文獻的公開內(nèi)容因而通過引用的方式明確并入)。已經(jīng)顯示在并未不利抗體影響功能或溶解度的情況下，每個抗體分子平均綴合的3-4類美登素分子有效增強對靶細胞的細胞毒性，盡管甚至本來預(yù)計相對于使用裸抗體，一摩爾毒素/抗體將增強細胞毒性。類美登素是本領(lǐng)域熟知的并且可以通過已知技術(shù)或從天然來源分離合成。合適的類美登素例如在美國專利號5,208,020和在上文提及的其他專利和非專利出版物中中公開。優(yōu)選的類美登素是美登醇和在芳環(huán)中或在美登醇分子的其他位置修飾的美登醇類似物，如多種美登醇酯。

存在本領(lǐng)域已知用于產(chǎn)生抗體-類美登素綴合物的多種連接基團，例如包括，在美國專利號5,208,020或EP專利0,425,235B1；Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992)和美國專利申請公開號2005/0169933中公開的那些，所述文獻的公開內(nèi)容因而通過引用的方式明確并入。包含接頭組件SMCC的抗體-類美登素綴合物可以如美國專利申請公開號2005/0169933中公開那樣制備。連接基團包括如以上確定的專利中公開的二硫基、硫醚基、酸不穩(wěn)定基、光不穩(wěn)定基、肽酶不穩(wěn)定基或酯酶不穩(wěn)定基，優(yōu)選二硫基和硫醚基。本文中描述并例舉了額外的連接基。

可以使用多種雙官能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑產(chǎn)生抗體和類美登素的綴合物，所述雙官能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酯的雙官能衍生物(如己二亞氨鹽酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛(如戊二醛)、雙-疊氮化合物(如雙(對-重氮鹽苯甲?；?己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(如雙-(對-重氮鹽苯甲酰基)-乙二胺)、二異氰酸酯(如2,6-二異氰酸甲苯酯)和雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。特別優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括提供a二硫鍵的N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人,Biochem.J.173:723-737(1978))和N-琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)。

取決于連接的類型，接頭可以在多個位置與美坦生類分子連接。例如，酯連接可以通過使用常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)與羥基反應(yīng)而形成。該反應(yīng)可以在具有羥基的C-3位置、羥甲基修飾的C-14位置、羥基修飾的C-15位置和具有羥基的C-20位置處發(fā)生。在優(yōu)選的實施方案中，該連接在美登醇或美登醇類似物的C-3位置處形成。

ii.澳瑞司他汀和海兔毒素

在一些實施方案中，免疫綴合物包含與海兔毒素或海兔毒素肽類似物和衍生物、澳瑞司他汀綴合的本發(fā)明抗體(美國專利號5,635,483和5,780,588)。已經(jīng)顯示多拉司他汀和澳瑞司他汀干擾微管動力學(xué)、GTP水解和胞核即細胞分裂(Woyke等人,Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584(2001))并且具有抗癌活性(美國專利號5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等人,Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965(1998))。多拉司他汀或澳瑞司他汀藥物部分可以經(jīng)肽狀藥物部分的N(氨基)端或C(羧基)端與抗體連接(WO 02/088172)。

示例性澳瑞司他汀實施方案包括美國申請公開號2005/0238649“能夠與配體綴合的單甲基纈氨酸化合物”的N末端連接的單甲基澳瑞司他汀藥物部分DE和DF，所述文獻的公開內(nèi)容明確地通過引用的方式完整并入。

一般，基于肽的藥物部分可以通過在兩個或更多個氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵而制備。此類肽鍵可以例如根據(jù)肽化學(xué)領(lǐng)域熟知的液相合成方法制備(參見E.和K.Lübke，“The Peptides”，第1卷，第76-136頁，1965，Academic Press)。澳瑞司他汀/海兔毒素藥物部分可以根據(jù)以下文獻的方法制備：美國專利號5,635,483和5,780,588；Pettit等人,J.Nat.Prod.44:482-485(1981)；Pettit等人,Anti-Cancer Drug Design 13:47-66(1998)；Poncet,Curr.Pharm.Des.5:139-162(1999)；和Pettit,Fortschr.Chem.Org.Naturst.70:1-79(1997)。還參見Doronina,Nat.Biotechnol.21(7):778-784(2003)；和因而通過引用方式完整并入的美國申請公開號2005/0238649“能夠與配體綴合的單甲基纈氨酸化合物”(例如公開了接頭和制備與接頭綴合的單甲基纈氨酸化合物如MMA和MMA的方法)。

iii.刺孢霉素

在其他實施方案中，免疫綴合物包含與一種或多種刺孢霉素分子綴合的本發(fā)明抗體?？股氐拇替呙顾丶易迥軌蛞詠喥つ枬舛纫餌NA斷裂。關(guān)于制備刺孢霉素家族的綴合物，參見美國專利號5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296(均授予American Cyanamid Company)。可以使用的刺孢霉素的結(jié)構(gòu)類似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙?；?γ1I、PSAG和θ1I(Hinman等人,Cancer Research 53:3336-3342(1993)；Lode等人,Cancer Research 58:2925-2928(1998)和授予American Cyanamid的前述美國申請)。另一個可以與抗體綴合的抗腫瘤藥物是作為抗葉酸的QFA。刺孢霉素和QFA具有胞內(nèi)作用位點并不輕易地跨過質(zhì)膜。因此，細胞借助抗體介導(dǎo)的內(nèi)化過程攝取這些藥物大大提高其細胞毒效應(yīng)。

iv.其他細胞毒藥物

可以與本發(fā)明抗體或根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的抗體綴合的其他抗腫瘤藥物包括BCNU、鏈脲佐菌素、長春新堿和5-氟尿嘧啶、美國專利號5,053,394和5,770,710中所述的統(tǒng)稱為LL-E33288復(fù)合物的藥物家族以及埃斯波霉素(美國專利號5,877,296)。

可以使用的酶活性毒素或其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的無結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒蛋白A鏈、α-帚曲菌素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陸蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制蛋白、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制蛋白、多花白樹毒蛋白、絲林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊諾霉素和單端孢霉烯類(參見，例如，WO93/21232、1993年10月28日公開)。

本發(fā)明進一步構(gòu)思在多肽和具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸內(nèi)切酶如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間行程單免疫綴合物。

為了選擇性破壞腫瘤，抗體可以包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于產(chǎn)生放射綴合的抗體。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。當該綴合物用于檢測時，它可以包含用于閃爍法研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或核磁共振(NMR)成像的自旋標記物(也稱作磁共振成像，mri)，如再次碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。

可以將放射標記物或其他標記物以已知方式摻入綴合物。例如，肽可以生物合成或可以使用合適的氨基酸前體(包括例如替換氫的氟-19)通過化學(xué)氨基酸合成法合成?？梢酝ㄟ^肽中的半胱氨酸殘基連接標記物如tc99m或I123、Re186、Re188和In111。釔-90可以通過賴氨酸殘基連接。生碘法(Iodogen method)(Fraker等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57(1978))可以用來摻入碘-123。“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”(Chatal,CRC Press 1989)詳細描述了其他方法。

可以使用多種雙官能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑產(chǎn)生抗體和細胞毒藥物的綴合物，所述雙官能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酯的雙官能衍生物(如己二亞氨鹽酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛(如戊二醛)、雙-疊氮化合物(如雙(對-重氮鹽苯甲酰基)己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(如雙-(對-重氮鹽苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(如2,6-二異氰酸甲苯酯)和雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述那樣制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-標記的1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素與抗體綴合的示例性螯合劑。參見，例如，WO 94/11026。接頭可以是促進細胞毒性劑在細胞中釋放的“可切割接頭”。例如，可以使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、光不穩(wěn)定接頭、二甲基接頭或含有二硫鍵的接頭(Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992)；美國專利號5,208,020)。

本發(fā)明的化合物明確地構(gòu)思、但不限用以下交聯(lián)劑試劑制備的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB和可商業(yè)獲得的SVSB(琥珀酰亞胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，來自Pierce Biotechnology,Inc.，Rockford，伊利諾伊州，美國)。參見2003-2004年使用手冊及目錄第467-498頁。

v.綴合抗體的制備

在本發(fā)明的綴合抗體中，抗體與一個或多個部分(例如，藥物部分)(例如，約1至約20個部分/抗體)、任選地通過接頭綴合。綴合的抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的有機化學(xué)反應(yīng)、條件和試劑，通過幾個途徑制備，所述途徑包括：(1)抗體的親核基團經(jīng)共價鍵與雙價接頭試劑反應(yīng)，隨后與與目的部分反應(yīng)；和(2)某部分的親核基團經(jīng)共價鍵與雙價接頭試劑反應(yīng)，隨后與抗體的親核基團反應(yīng)。本文中描述了用于制備綴合的抗體的額外方法。

接頭試劑可以由一個或多個接頭組件組成。示例性接頭組件包括6-馬來酰亞胺己酰基(“MC”)、馬來酰亞胺丙?；?“MP”)、纈氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、對-氨基苯甲氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1羧化物(“SMCC’)和N-琥珀酰亞胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。額外的接頭組分是本領(lǐng)域已知的并且一些在本文中描述。還參見美國申請公開號2005/0238649“能夠與配體綴合的單甲基纈氨酸化合物”的N末端連接的單甲基澳瑞司他汀藥物部分DE和DF，所述文獻的內(nèi)容因而通過引用的方式完整并入。

在一些實施方案中，接頭可以包含氨基酸殘基。示例性氨基酸接頭組件包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括：纈氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括：甘氨酸-纈氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。構(gòu)成氨基酸接頭組件的氨基酸殘基包括天然存在的那些以及稀少氨基酸和非天然存在的氨基酸類似物，如瓜氨酸。氨基酸接頭組件可以在它們受特定酶(例如，腫瘤相關(guān)的蛋白酶、組織蛋白酶B、C和D、或纖溶酶蛋白酶)酶促裂解的選擇性方面設(shè)計和優(yōu)化。

抗體上的親核基團包括但不限于：(i)N末端胺基、(ii)側(cè)鏈胺基，例如，賴氨酸，(iii)側(cè)鏈硫醇基，例如，半胱氨酸，和(iv)其中抗體糖基化的情況下糖羥基或氨基。胺、巰基、和羥基是親核的，并且通過硫化物交換，能夠與接頭部分和接頭試劑上的親電基團反應(yīng)以形成共價鍵，所述親電基團包括：(i)活性酯如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯和酰鹵；(ii)烷基鹵和芐基鹵，如鹵乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和馬來酰亞胺基。某些抗體具有可還原的鏈間二硫鍵，即，半胱氨酸橋?？梢酝ㄟ^用還原劑如DTT(二硫蘇糖醇)處理，令抗體對綴合至接頭試劑有反應(yīng)性。每種半胱氨酸橋?qū)⒁虼死碚撋闲纬蓛蓚€反應(yīng)性巰基親核體?？梢酝ㄟ^賴氨酸與2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷(Traut試劑)反應(yīng)，導(dǎo)致胺轉(zhuǎn)變成硫醇，向抗體引入額外的親核基團?？梢酝ㄟ^引入一個、兩個、三個、四個或更多個半胱氨酸殘基(例如，制備包含一個或多個非天然半胱氨酸氨基酸殘基的突變體抗體)，向抗體或其片段引入反應(yīng)性硫醇基。

本發(fā)明的綴合抗體也可以通過修飾抗體以引入親電部分來產(chǎn)生，所述的親電部分可以與接頭試劑或藥物或其他部分上的親核性取代基反應(yīng)。糖基化抗體的糖可以是氧化，例如，用高碘酸鹽氧化試劑氧化，以形成可以與接頭試劑或藥物或其他部分的胺基反應(yīng)的醛基或酮基。所產(chǎn)生的亞胺西夫堿基團可以形成穩(wěn)定鍵，或可以還原，例如，通過硼氫化物試劑還原，以形成穩(wěn)定的胺鍵。在一個實施方案中，糖基化抗體的糖部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應(yīng)可以在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生可以與藥物或其他部分上適當基團反應(yīng)的羰基(醛基和酮基)(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一個實施方案中，含有N末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的蛋白質(zhì)可以與偏高碘酸鈉反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)生醛，替代第一氨基酸(Geoghegan和Stroh,Bioconjugate Chem.3:138-146(1992)；美國專利號5,362,852)。這種醛可以與藥物部分或接頭親核體反應(yīng)。

同樣地，部分(如藥物部分)上的親核基團包括但不限于：胺基、巰基、羥基、酰肼基、肟基、肼基、硫代半卡巴腙基、羧化肼基和芳酰肼基，前述基團能夠反應(yīng)以與接頭部分和接頭試劑上的親電基團形成共價鍵，所述親電基團包括：(i)活潑酯如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯和酰鹵；(ii)烷基和芐基鹵如鹵乙酰胺；和(iii)醛、酮類、羧基和馬來酰亞胺基。

可選地，例如，通過重組技術(shù)或肽合成，可以產(chǎn)生包含抗體和細胞毒性劑的融合蛋白。DNA的長度可以包含編碼該綴合物的兩個部分的各自區(qū)域，所述兩個部分毗鄰彼此或由編碼不破壞該綴合物所需特性的接頭肽的區(qū)域分隔。在又一個實施方案中，抗體可以與用于腫瘤預(yù)導(dǎo)引(tumor pretargeting)的“受體”(如，鏈霉親和素)綴合，其中將抗體-受體綴合物施用至個體，隨后使用清除劑從循環(huán)中移除未結(jié)合的綴合物并且隨后施用與細胞毒藥物(例如放射性核苷酸)綴合的“配體”(例如抗生物素蛋白)。

IX.實用性

本文提供的本發(fā)明方法具有產(chǎn)生異多聚體蛋白的工業(yè)適用性。本發(fā)明方法減少涉及兩次獨立發(fā)酵和分離的工作量，也減少兩次獨立發(fā)酵固有的技術(shù)難題。另外，消除先前方法程序的復(fù)性步驟和氧化還原步驟可以增加產(chǎn)率并降低加工復(fù)雜性和成本。

本文所述的異多聚體蛋白例如用于體外、離體和體內(nèi)治療方法。本發(fā)明提供基于使用這些分子中一種或多種分子的多種方法。在某些病理狀況下，需要和/或想要利用異多聚體蛋白，例如，多特異性抗體。本發(fā)明提供這些異多聚體蛋白，所述異多聚體蛋白可以用于多種目的，例如用作治療藥、預(yù)防藥和診斷藥。例如，本發(fā)明提供治療疾病的方法，所述方法包含向需要治療的受試者施用本發(fā)明的異多聚體蛋白，因而治療該疾病。本文所述的本發(fā)明任何異多聚體蛋白可以用于本文所述的治療(或預(yù)防或診斷)方法中。

例如，當異多聚體蛋白是多價時，寶貴益處是它們針對其抗原賦予的親合力增強。除了在結(jié)合單元(即，F(xiàn)ab)上具有針對抗原基礎(chǔ)的內(nèi)在高親和之外、正常IgG抗體還利用親合效應(yīng)以增加它們與抗原的締合，原因在于它們與靶雙價結(jié)合。

針對相同抗原分子上兩個獨立表位的異多聚體蛋白不僅可以提供增結(jié)合親合力增強的益處(因為雙價結(jié)合)，還可以獲得不與任一種親本抗體締合的新特性。因此，本發(fā)明的異多聚體蛋白用于例如阻斷受體-配體相互作用。

本文所述的異多聚體蛋白還用于采用一種分子同時阻斷兩種靶的信號傳導(dǎo)途徑的應(yīng)用中。

X.治療性用途

本文所述的異多聚體蛋白如抗體和抗體片段(例如，根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的抗體和/或其片段)可以用于治療性應(yīng)用。例如，此類異多聚體蛋白可以用于治療腫瘤，包括癌前、非轉(zhuǎn)移性、轉(zhuǎn)移性和癌性腫瘤(例如，早期階段癌癥)，用于治療過敏性或炎性病癥，或用于治療自身免疫免疫病，或用于治療存在形成癌癥例如，乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、腎細胞癌、膠質(zhì)瘤或卵巢癌)、過敏性或炎性病癥或自身免疫免疫病的風(fēng)險的受試者。

術(shù)語癌癥包括增生性病癥的總稱，包括但不限于癌前生長、良性腫瘤和惡性腫瘤。良性腫瘤在發(fā)源部位保持局限并且不具有浸潤、侵入或轉(zhuǎn)移至遠處部位的能力。惡性腫瘤將侵入并損傷在它們周圍的其他組織。它們也可以贏得突破其起源部位并且擴展(轉(zhuǎn)移)至身體其他部的能力，這通常經(jīng)血流或經(jīng)其中存在淋巴結(jié)的淋巴系統(tǒng)進行。原發(fā)腫瘤根據(jù)原發(fā)腫瘤起源的組織類型分類；轉(zhuǎn)移性腫瘤根據(jù)從中衍生癌細胞的組織類型分類。隨時間推移，惡性腫瘤細胞變得更為異常并且顯得更不像正常細胞。癌細胞外觀的這種變化稱作腫瘤分級，并且將癌細胞描述為良好分化的、中等分化的、不良分化的或未分化的。良好分化的細胞在外觀上相當正常并且與它們從中起源的正常細胞相似。未分化的細胞是這樣的細胞，它們已經(jīng)變得如此異常，從而不再可能確細胞的起源。

腫瘤可以是實體腫瘤或非實體或軟組織腫瘤。軟組織腫瘤的例子包括白血病(例如、慢性髓性白血病、急性髓性白血病、成人急性成淋巴細胞性白血病、急性髓性白血病、成熟B-細胞急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞白血病、幼淋巴細胞白血病、或毛細胞白血病)或淋巴瘤(例如、非霍奇金淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤或霍奇金病)。實體腫瘤包括除血液、骨髓或淋巴系統(tǒng)之外的身體組織的任何癌。實體腫瘤可以進一步分成上皮細胞來源的那些實體腫瘤和非上皮細胞來源的那些實體腫瘤。上皮細胞實體腫瘤的例子包括胃腸道、結(jié)腸、乳腺、前列腺、肺、腎、肝臟、胰、卵巢、頭與頸、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、膽囊、唇、鼻咽、皮膚、子宮、男性生殖器官、泌尿器官、膀胱和皮膚的腫瘤。非上皮來源的實體腫瘤包括肉瘤、腦腫瘤和骨腫瘤。

上皮癌癥通常從良性腫瘤演進至侵入前期(例如，原位癌)，演進至惡性癌，其已經(jīng)滲透基底膜并且侵入上皮下間質(zhì)。

多特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物也可以用于這些治療性應(yīng)用中，并且結(jié)合HER2的抗體特別可以用來治療乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、腎細胞癌、膠質(zhì)瘤或卵巢癌。

作為接受本發(fā)明組合物的候選人的其他受試者患有以下病癥或棉鈴形成所述病癥的風(fēng)險：纖維血管組織異常增生、酒渣鼻性痤瘡、獲得性免疫缺陷綜合征、動脈閉塞、異位性角膜炎、細菌性潰瘍、Bechet病、血源腫瘤、頸動脈阻塞病、脈絡(luò)膜血管新生、慢性炎癥、慢性視網(wǎng)膜脫離、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃體炎、隱形眼鏡過度磨損、角膜移植排異、角膜血管新生、角膜移植物血管新生、Crohn病、Eale病、流行性角結(jié)膜炎、真菌性潰瘍、單純皰疹感染、帶狀皰疹感染、高粘滯綜合征、卡波西肉瘤、白血病、脂質(zhì)變性、萊姆病、邊緣角質(zhì)層分離、Mooren潰瘍、除麻風(fēng)病之外的分枝桿菌感染、近視、眼新生血管性疾病、視盤先天性小凹(optic pit)、Osler-Weber綜合征(Osler-Weber-Rendu)、骨關(guān)節(jié)炎、Paget病、睫狀體平坦部炎(pars planitis)、類天皰瘡、小水皰病、多動脈炎、激光后并發(fā)癥、原蟲感染、彈性假黃瘤、翼狀胬肉、干性角膜炎、放射狀角膜切開術(shù)、視網(wǎng)膜血管新生、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、晶體后纖維增生癥、類肉瘤(sarcoid)、鞏膜炎、鐮狀細胞性貧血、Sogren綜合征、實體瘤、Stargart病、Steven-Johnson病、上部角膜緣角膜炎、梅毒、系統(tǒng)性狼瘡、Terrien角膜邊緣性變性、弓形體病、尤文氏肉瘤的腫瘤、成神經(jīng)細胞瘤的腫瘤、骨肉瘤的腫瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤的腫瘤、橫紋肌肉瘤的腫瘤、潰瘍性結(jié)腸炎、靜脈閉塞、維生素A缺乏癥、Wegener肉樣瘤病、與糖尿病相關(guān)的不利血管生成、寄生蟲病、傷口愈合異常、術(shù)后肥大、損傷或創(chuàng)傷(例如，急性肺損傷/ARDS)、抑制毛發(fā)生長、抑制排卵與黃體形成、抑制植入、和抑制子宮內(nèi)胚發(fā)育。

可以使用根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的抗體治療過敏性或炎性病癥或者自身免疫疾病或病癥的實例包括，但是不限于關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎如急性關(guān)節(jié)炎、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、慢性炎性關(guān)節(jié)炎、變性關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、萊姆關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、椎骨關(guān)節(jié)炎，和幼年發(fā)作型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、慢性進行性關(guān)節(jié)炎、變形性關(guān)節(jié)炎、慢性原發(fā)多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和強直性脊柱炎)、炎性過度增生性皮膚病、銀屑病如斑塊狀銀屑病、滴狀銀屑病、膿皰性銀屑病和趾甲銀屑病、皮炎，包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、過敏性皮炎、過敏性接觸性皮炎、皰疹樣皮炎，和特異性皮炎、X連鎖的IgM過多綜合征、蕁麻疹如慢性應(yīng)性蕁麻疹和慢性特發(fā)性蕁麻疹，包括慢性自身免疫性蕁麻疹、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、幼年型皮肌炎、中毒性表皮壞死松解癥、硬皮病(包括全身性硬皮病)、硬化如系統(tǒng)性硬化病、多發(fā)性硬化(MS)如脊髓-視神經(jīng)MS、原發(fā)性進行性MS(PPMS)和復(fù)發(fā)緩解性MS(RRMS)、進行性系統(tǒng)性硬化病、動脈粥樣硬化、動脈硬化、散播性硬化和共濟失調(diào)性硬化、炎性腸病(IBD)(例如，Crohn病、自身免疫介導(dǎo)的胃腸病、結(jié)腸炎如潰瘍性結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎(colitis ulcerosa)、顯微鏡性結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、息肉狀結(jié)腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和透壁性結(jié)腸炎與自身免疫炎性腸病)、壞疽性膿皮病、結(jié)節(jié)性紅斑、原發(fā)性硬化膽管炎、表層鞏膜炎)、呼吸窘迫綜合癥、包括成人或急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、腦膜炎、全部或部分葡萄膜的炎癥、虹膜炎、脈絡(luò)膜炎、自身免疫血液病、類風(fēng)濕性脊椎炎、突發(fā)性聽力喪失、IgE-介導(dǎo)的疾病如過敏反應(yīng)和過敏性與特應(yīng)性鼻炎、腦炎如Rasmussen腦炎和邊緣性和/或腦干腦炎、葡萄膜炎、如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎,或自身免疫性葡萄膜炎、伴有和不伴有腎病綜合征的腎小球腎炎(GN)，如慢性或急性腎小球腎炎如原發(fā)性GN、免疫介導(dǎo)的GN、膜性GN(膜性腎病)、特發(fā)性膜性GN或特發(fā)性膜性腎病、膜性(membrano)或膜性增生性GN(MPGN)，包括I型和II型，和快速進行性GN、過敏性體質(zhì)、變態(tài)反應(yīng)、濕疹，包括變應(yīng)性或特發(fā)性濕疹、哮喘，如支氣管哮喘、支氣管哮喘和自身免疫性哮喘、涉及T細胞浸潤和慢性炎癥反應(yīng)的病狀、慢性肺部炎性疾病、自身免疫性心肌炎、白細胞黏附性缺陷、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)或系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematodes)如皮膚SLE、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、新生兒期狼瘡綜合征(NLE)、播散性紅斑狼瘡、狼瘡(包括腎炎、腦炎、兒科、非腎、腎外、盤狀、禿頂性狼瘡)、幼年發(fā)作型(I型)糖尿病，包括兒科胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、成人發(fā)作型糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特發(fā)性尿崩癥、與細胞因子及T-淋巴細胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫反應(yīng)、結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、肉芽腫，包括淋巴瘤樣肉芽腫、韋格納肉芽腫病、粒細胞缺乏癥、血管炎類，包括血管炎(包括大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細胞(Takayasu's)動脈炎)、中等血管血管炎(包括Kawasaki病和結(jié)節(jié)性多動脈炎)、顯微鏡下多動脈炎、CNS血管炎、壞死性、皮膚型或超敏性血管炎、系統(tǒng)性壞死性血管炎，和ANCA相關(guān)的血管炎，如Churg-Strauss血管炎或綜合征(CSS))、顳動脈炎、再生障礙性貧血、自身免疫性再生障礙性貧血、Coombs陽性貧血、先天性再生障礙性貧、溶血性貧血或免疫性溶血性貧血，包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA)、惡性貧血(anemia perniciosa)、Addison病、純紅細胞貧血或發(fā)育不良(PRCA)、因子VIII缺乏癥、血友病A、自身免疫性嗜中性白血球減少癥、泛白細胞減少癥、白細胞減少癥、涉及白細胞滲出的疾病、CNS炎性病癥、多器官損傷綜合征，如繼發(fā)于敗血癥、創(chuàng)傷或出血的那些多器官損傷綜合征、抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜病、抗磷脂抗體綜合征、變應(yīng)性神經(jīng)炎、Bechet或Behcet病、Castleman綜合征、Goodpasture綜合征、Reynaud綜合征、Sjogren綜合征、Stevens-Johnson綜合征、類天皰瘡，如大皰性類天皰瘡和皮膚類天皰瘡、天皰瘡(包括尋常性天皰瘡、落葉狀天皰瘡、天皰瘡粘膜類天皰瘡(pemphigus mucus-membrane pemphigoid)和紅斑性天皰瘡)、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病、Reiter病或綜合征、免疫復(fù)合物腎炎、抗體-介導(dǎo)的腎炎、視神經(jīng)脊髓炎、多發(fā)性神經(jīng)病、慢性神經(jīng)病如IgM多發(fā)性神經(jīng)病或IgM-介導(dǎo)的神經(jīng)病、血小板減少癥(如由心肌梗死患者發(fā)展)，包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，和自身免疫性或免疫介導(dǎo)的血小板減少癥，如特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)(包括慢性或急性ITP)、睪丸和卵巢的自身免疫病，包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎、原發(fā)性甲狀腺功能減退癥、甲狀旁腺功能減退癥、自身免疫性內(nèi)分泌疾病(包括甲狀腺炎如自身免疫性甲狀腺炎、橋本病、慢性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)或亞急性甲狀腺炎、自身免疫性甲狀腺疾病、特發(fā)性甲狀腺功能減退癥、Grave病、多內(nèi)分泌腺綜合征，如自身免疫性多內(nèi)分泌腺綜合征(或多內(nèi)分泌腺內(nèi)分泌病綜合征)、副腫瘤性綜合征，包括神經(jīng)系統(tǒng)副腫瘤綜合征如Lambert-Eaton肌無力綜合征或Eaton-Lambert綜合征、僵人或僵者綜合征(stiff-man or stiff-person syndrome)、腦脊髓炎，如變應(yīng)性腦脊髓炎或過敏性腦脊髓炎和實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)、重癥肌無力如胸腺腫瘤相關(guān)重癥肌無力、小腦變性、神經(jīng)性肌強直、視性眼陣攣或視性眼陣攣肌陣攣綜合征(OMS)，和感覺神經(jīng)病、多灶性運動神經(jīng)病、Sheehan綜合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎或自身免疫性慢性活動性肝炎、淋巴細胞間質(zhì)性肺炎、閉塞性細支氣管炎(非移植物)vs NSIP、Guillain-Barre綜合征、Berger病(IgA神經(jīng)病)、特發(fā)性IgA神經(jīng)病、線狀I(lǐng)gA皮膚病(linear IgA dermatosis)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肺硬變、自身免疫性腸病綜合征、腹腔疾病、腹腔疾病、乳糜瀉(谷蛋白腸病)、難治性口炎性腹瀉、特發(fā)性口炎性腹瀉、冷球蛋白血癥、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS；Lou Gehrig病)、冠狀動脈病、自身免疫性耳病如自身免疫性內(nèi)耳病(AIED)、自身免疫性聽力喪失、視性眼陣攣肌陣攣綜合征(OMS)、多軟骨炎如難治性或復(fù)發(fā)性多軟骨炎、肺泡蛋白沉著癥、淀粉樣變性病、鞏膜炎、非癌性淋巴細胞增多、原發(fā)性淋巴細胞增多，其包括單克隆B細胞淋巴細胞增多(例如，良性單克隆免疫球蛋白病和意義不確定性單克隆免疫球蛋白病，MGUS)、外周神經(jīng)病、副腫瘤性綜合征、離子通道病，如癲癇、偏頭痛、心律失常、肌肉病(muscular disorder)、耳聾、失明、周期性麻痹，和CNS的離子通道病、自閉癥、炎性肌病、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)、內(nèi)分泌眼病、葡萄膜視網(wǎng)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、自身免疫性肝病(autoimmune hepatological disorder)、纖維肌痛、多發(fā)性內(nèi)分泌衰竭(multiple endocrine failure)、Schmidt綜合征、腎上腺炎、胃萎縮、早老性癡呆、脫髓鞘病，如自身免疫性脫髓鞘病、糖尿病性腎病、Dressler綜合征、斑禿、CREST綜合征(鈣化、雷諾現(xiàn)象、食管運動功能失常、指端硬化和毛細血管擴張癥)、男性和女性自身免疫性不育、混合型結(jié)締組織病、Chaga病、風(fēng)濕熱、反復(fù)流產(chǎn)、霉塵肺(farmer's lung)、多形紅斑、心臟切開術(shù)后綜合征、庫欣綜合征、養(yǎng)鳥人肺(bird-fancier's lung)、變應(yīng)性肉芽腫性血管炎、良性淋巴細胞血管炎、Alport綜合征、肺泡炎，如過敏性肺泡炎和纖維化肺泡炎、間質(zhì)性肺病、輸血反應(yīng)、麻風(fēng)病、瘧疾、利什曼病、kypanosomiasis、血吸蟲病、蛔蟲病、曲霉病、Sampter綜合征、Caplan綜合征、登革熱、心內(nèi)膜炎、心肌內(nèi)膜纖維化、彌漫性間質(zhì)性肺纖維化、間質(zhì)性肺纖維化、特發(fā)性肺纖維化、囊性纖維化、眼內(nèi)炎、持久性隆起性紅斑(erythema elevatum et diutinum)、胎兒幼紅細胞增多癥、嗜酸性細胞增多性肌膜炎、Shulman綜合征、Felty綜合征、絲蟲病(fiariasis)、睫狀體炎,如慢性睫狀體炎、異色性睫狀體炎(heterochronic cyclitis)、虹膜睫狀體炎或Fuch睫狀體炎、Henoch-Schonlein紫癜、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、艾柯病毒感染、心肌病、阿爾茨海默病、細小病毒感染、風(fēng)疹病毒感染、接種后綜合征、先天性風(fēng)疹感染、Epstein-Barr病毒感染、腮腺炎、Evan綜合征、自身免疫性性腺衰竭、Sydenham舞蹈病、鏈球菌感染后腎炎、閉塞性血栓血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲狀腺毒癥、脊髓癆(tabes dorsalis)、脈絡(luò)膜炎、巨細胞多肌痛、內(nèi)分泌眼病、慢性超敏性肺炎、干燥性角膜結(jié)膜炎、流行性角膜結(jié)膜炎、特發(fā)性腎病綜合征、微小病變性腎病、良性家族性和缺血-再灌注損傷、視網(wǎng)膜自體免疫(retinal autoimmunity)、關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、慢性阻塞性氣道疾病、矽肺病、口瘡、口瘡性口炎、動脈硬化性疾病、aspermiogenese、自身免疫性溶血、Boeck病、冷球蛋白血癥、Dupuytren攣縮、晶狀體蛋白過敏性眼內(nèi)炎(endophthalmia phacoanaphylactica)、過敏性腸炎、麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑e、特發(fā)性面癱、慢性疲勞綜合征、風(fēng)濕熱(febris rheumatica)、Hamman-Rich病、感覺神經(jīng)性聽力喪失、陣發(fā)性血紅蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica)、性腺功能減退癥、局限性回腸炎、白細胞減少癥、傳染性單核細胞增多癥,橫貫性脊髓炎、原發(fā)性特發(fā)性粘液性水腫、腎變病、交感性眼炎(ophthalmia symphatica)、肉芽腫性睪丸炎、胰腺炎、急性多發(fā)性神經(jīng)根炎、壞疽性膿皮病、奎汶氏甲狀腺炎、獲得性脾萎縮(acquired spenic atrophy)、因抗精子抗體所致的不育、非惡性胸腺腫瘤、白癜風(fēng)、SCID和Epstein-Barr病毒相關(guān)性疾病、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、寄生蟲病如利什曼原蟲、中毒性休克綜合征、食物中毒、涉及T細胞浸潤的病狀、白細胞黏附性缺陷、與細胞因子和T-淋巴細胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答、涉及白細胞滲出的疾病、多器官損傷綜合征、抗原-抗體復(fù)合物-介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜病、變應(yīng)性神經(jīng)炎、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病、卵巢炎、原發(fā)性粘液水腫、自身免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、風(fēng)濕性疾病、混合型結(jié)締組織病、腎病綜合征、胰島炎、多內(nèi)分泌腺衰竭、外周神經(jīng)病、自身免疫性多內(nèi)分泌腺綜合征I型、成年發(fā)作型特發(fā)性甲狀旁腺功能減退癥(AOIH)、全禿、擴張型心肌病、獲得性大皰性表皮松解癥(EBA)、血色素沉著癥、心肌炎、腎病綜合征、原發(fā)性硬化膽管炎、化膿性或非化膿性鼻竇炎、急性或慢性鼻竇炎、篩竇炎、額竇炎、上頜竇炎或蝶竇炎、嗜酸細胞相關(guān)病癥如嗜酸粒細胞增多癥、嗜酸細胞增多性肺浸潤、嗜酸粒細胞增多-肌痛綜合征、Loffler綜合征、慢性嗜酸細胞性肺炎、熱帶肺嗜酸粒細胞增多癥、支氣管肺曲霉病、曲霉腫,或含有嗜酸性細胞的曲霉腫、過敏反應(yīng)、血清陰性脊椎關(guān)節(jié)炎、多內(nèi)分泌腺自身免疫病、硬化膽管炎、鞏膜念珠菌病、鞏膜外層念珠菌病、慢性粘膜皮膚念珠菌病、Bruton綜合征、嬰兒期暫時性低γ球蛋白血癥、Wiskott-Aldrich綜合征、共濟失調(diào)毛細血管擴張癥、與膠原病相關(guān)的自身免疫功能紊亂、風(fēng)濕病、神經(jīng)學(xué)疾病、缺血性再灌注病、血壓下降反應(yīng)、血管功能障礙、脈管擴張(angiectasis)、組織損傷、心血管缺血、痛覺過敏、腦缺血，和伴血管化疾病、變應(yīng)性超敏病(allergic hypersensitivity disorder)、腎小球腎炎(glomerulonephritides)、再灌注損傷、心肌或其他組織的再灌注損傷、具有急性炎癥組分的皮膚病、急性紫癜性腦膜炎或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性病癥、眼和眼眶炎性病癥、粒細胞輸血相關(guān)合征、細胞因子誘導(dǎo)的中毒、急性嚴重炎癥、慢性頑固性炎癥、腎盂炎、肺硬變、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病性大動脈病、動脈內(nèi)增生、消化性潰瘍、心瓣炎和子宮內(nèi)膜異位。

除治療性用途之外還，本發(fā)明的抗體可以用于其他目的，包括診斷方法，如用于本文所述疾病和病狀的診斷方法。

XI.用藥、制劑和持續(xù)時間

本發(fā)明的蛋白質(zhì)將以符合良好醫(yī)學(xué)實踐的方式配制、定劑量和施用。在這種情況下考慮的因素包括正在治療的具體病癥、正在治療的具體哺乳動物、個體受試者的臨床狀況、病癥原因、送遞藥物的部位、施用方法，施用計劃和醫(yī)療執(zhí)業(yè)者已知的其他因素?！按┯玫牡鞍踪|(zhì)的治療有效量將受此類考慮事項支配，并且是為了預(yù)防、改善或治療特定病癥(，癌癥、變應(yīng)性或炎性疾病、或自身免疫疾病)必需的最小量。該蛋白質(zhì)不必要、但是任選地，與目前用來預(yù)防或治療該病癥的一種或多種藥物一起配制，此類其他藥物的有效量取決于該制劑中存在的蛋白質(zhì)的量、疾病類型或療法和上文討論的其他因素。這些藥物通常以相同的劑量并且以如前文所用的施用途徑或以約從1％至99％的前述所用劑量使用。通常，減輕或治療癌癥包括減弱與癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀或醫(yī)學(xué)問題。藥物的治療有效量可以實現(xiàn)以下一種情況或其組合：減少癌細胞數(shù)目(至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多)；減少或抑制腫瘤尺寸或腫瘤負荷；抑制(即，降低到某個程度和/或制止)癌細胞向外周器官浸潤；；在腺瘤情況下減少激素分泌；降低血管密度；抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；減少或抑制腫瘤生長；和/或緩解一個或多個與癌癥相關(guān)的癥狀到某個程度。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)用來阻止癌癥或自身免疫疾病在受試者中出現(xiàn)或復(fù)現(xiàn)。

在一個實施方案中，本發(fā)明可以用于增加易患或經(jīng)診斷患有癌癥或自身免疫疾病的人類受試者的存活持續(xù)時。存活持續(xù)時間定義為從首次施用藥物至死亡的時間。存活持續(xù)時間也可以由治療組相對于對照組的分層風(fēng)險比(HR)度量，所述的分層風(fēng)險比代表治療期間受試者死亡的風(fēng)險。

在又一個實施方案中，本發(fā)明的治療在易患或經(jīng)診斷患有用多種抗癌療法治療過的癌癥的人類受試者群體中顯著地增加緩解率。緩解率定義為接受治療的對療法有反應(yīng)的受試者的百分比。在一個方面，與采用單一手術(shù)、放射療法或化療治療的群體相比，使用本發(fā)明蛋白質(zhì)和手術(shù)、放射療法或一種或多種化療藥的本發(fā)明聯(lián)合治療在接受治療的受試者組中顯著地增加緩解率，這種增加具有小于0.005的卡方p-值。美國專利申請公開號20050186208中描述了治療癌癥的治療功效的額外量度。

在某些實施方案中，提供一種組合物，所述組合物包含根據(jù)本文所述任何方法產(chǎn)生的異多聚體蛋白和可藥用載體。使用本領(lǐng)域已知的標準方法，通過具有所需純度的活性成分與任選的生理可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，制備治療性制劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences(第20版).A.Gennaro,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)?？山邮艿妮d體包括鹽水或緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他糖，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成鹽反離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如TWEEN、PLURONICS或PEG。

任選的，但是優(yōu)選地，制劑含有可藥用鹽、優(yōu)選地氯化鈉，并且優(yōu)選地以約生理學(xué)濃度含有。任選地，本發(fā)明的制劑可以含有可藥用的防腐劑。在一些實施方案中，防腐劑濃度是從0.1至2.0％，一般按v/v計。合適的防腐劑包括制藥領(lǐng)域已知的那些。芐醇、苯酚、間甲酚、尼泊金甲酯和羥苯丙酯是優(yōu)選的防腐劑。任選地，本發(fā)明的制劑可以按0.005％至0.02％的濃度包含可藥用的表面活性劑。

本文中的制劑也可以根據(jù)正在治療的特定適應(yīng)癥需要而含有多于一種活性化合物，優(yōu)選地是具有并未不利相互影響的互補活性的那些活性化合物。此類分子適當?shù)匾杂行в糜陬A(yù)期目的的量存在。

有效成分也可以包埋于例如分別通過凝聚技術(shù)或界面聚合制備的微膠囊(例如，羥甲基纖維素微膠囊或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、膠態(tài)藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳液、納米粒子和納米膠囊)或乳濁液中。這類技術(shù)在上文的Remington's Pharmaceutical Sciences中公開。

可以制備持續(xù)釋放制品。持續(xù)釋放制品的合適例子包括含有異多聚體蛋白的固態(tài)疏水性聚合物半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)處于成型制品(例如，薄膜或微膠囊)形式。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)或聚(乙烯醇)、聚乳酸(美國專利號3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-谷氨酸酯的共聚物、不可降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和亮丙瑞林乙酸酯組成的可注射微球體)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。盡管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能夠釋放分子超過100日，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)持續(xù)較短的時間。當包囊化的異多聚體蛋白長時間留在體內(nèi)時，它們可能因在37℃暴露于水分而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性喪失和免疫原性可能改變。可以根據(jù)所涉及的機制構(gòu)思用于穩(wěn)定的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機制是因巰基-二硫鍵互換所致的分子間S-S鍵，可以通過修飾硫氫基殘基、從酸性溶液凍干、控制含濕量、使用適宜的添加物和開發(fā)專特定聚合物母體組合物實現(xiàn)穩(wěn)定作用。

根據(jù)已知的方法，如作為大丸劑的靜脈內(nèi)施用或通過經(jīng)一段時間連續(xù)輸注，通過肌內(nèi)、腹內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑，將本文所述的蛋白質(zhì)(例如，根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的異多聚體蛋白如多特異性抗體)施用至受試者，例如，人類受試者。如果廣泛副作用或毒性與拮抗由蛋白質(zhì)識別的靶分子相關(guān)，則可能特別需要局部施用。離體策略也可以用于治療性應(yīng)用。離體策略包括用編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的多核苷酸轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)從受試者獲得的細胞。隨后將轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞返回這位受試者。細胞可以是廣泛類型細胞的任一種，包括而不限于造血細胞(例如，骨髓細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹枝狀細胞、T細胞或B細胞)、成纖維細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、角質(zhì)形成細胞或肌肉細胞。

在一個例子中，當病癥或腫瘤位置允許時，局部施用蛋白質(zhì)復(fù)合物(例如，根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的異多聚體蛋白如多特異性抗體)，例如，通過直接注射，并且注射可以定期地重復(fù)?？梢詫⒌鞍踪|(zhì)復(fù)合物全身性遞送至受試者或直接遞送至腫瘤細胞，例如，在手術(shù)摘除腫瘤后遞送至腫瘤或腫瘤床，目的是防止或減少局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。

XII.制造品

本發(fā)明的另一個實施方案是一種制造品，所述制造品含有本文所述的一種或多種異多聚體蛋白和可用于治療或診斷病癥(例如，自身免疫疾病或癌癥)的材料。該制造物包括容器和或在該容器上或與之結(jié)合的標簽或包裝插頁。合適的容器例如包括瓶、小藥瓶、注射器等。容器可以從多種材料如玻璃或塑料中形成。該容器容納了有效治療所述病癥的組合物并且可以具有無菌接入口(例如該容器可以是靜脈內(nèi)輸液袋或是具有皮下注射針頭可穿透的瓶塞的小藥瓶)。組合物中的至少一種活性物質(zhì)是本發(fā)明的異多聚體蛋白(例如，抗體或抗體片段)。標簽或包裝插頁說明該組合物用于治療特定的病狀。該標簽或包裝插頁會進一步包含用于施用該異多聚體蛋白至受試者的說明書。還構(gòu)思了包含本文所述的組合性治療藥的制造品和試劑盒。

包裝插頁指治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝中習(xí)慣性包含的說明書，所述說明書含有關(guān)于適應(yīng)癥、用法、劑量、施用、禁忌癥和/或涉及此類治療產(chǎn)品用途之警告的信息。在某些實施方案中，包裝插頁說明，該組合物用于治療乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、腎細胞癌、膠質(zhì)瘤或卵巢癌。

額外地，制造品還可以包含第二(或第三)容器，所述容器包含可藥用緩沖液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以還包括從商業(yè)和用戶觀點所認定的其他材料，包括其他緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。

還提供可用于多種目的(例如，從細胞純化或免疫沉淀抗原)的試劑盒。為了分離和純化抗原，試劑盒可以含有與珠(例如，瓊脂糖珠)偶聯(lián)的異多聚體蛋白?？梢蕴峁┖挟惗嗑垠w蛋白用于體外(例如在ELISA或蛋白質(zhì)印跡法中)檢測和定量抗原的試劑盒。與制造品一樣，該試劑盒包括容器和或在該容器上或與之結(jié)合的標簽或包裝插頁。容器容納了包含本發(fā)明的至少一種異多聚體蛋白(例如，多特異性抗體片段或抗體片段)的組合物?？梢园ê欣缦♂寗┖途彌_液或?qū)φ湛贵w的額外容器。標簽或包裝物插頁可以提供對組合物的描述以及預(yù)期體外或診斷用途的說明。

認為前面的書面描述足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員實施本發(fā)明成為可能。以下的實施例僅出于說明目的而提供并且不意在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實際上，除了本文顯示和描述的那些修改之外，本發(fā)明的各種修改將因前面的描述而對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的并且落于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。

在以下的實驗公開中，以下縮略語適用：eq(當量)；M(摩爾)；μM(微摩爾)；N(正常)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；μmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；g(克)；mg(毫克)；kg(千克)；μg(微克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(納米)；℃(攝氏度)；hr(小時)；min(分鐘)；sec(秒)；msec(毫秒)；ADCC(抗體依賴的細胞毒性))；BsAb(雙特異性抗體)；CL(輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；CH(重鏈恒定結(jié)構(gòu)域)；CMC(補體介導(dǎo)的細胞毒性)；Fab(抗原結(jié)合片段)；Fc(可結(jié)晶片段)；Fv(可變片段(VL+VH))；EGFR(表皮生長因子受體)；HC(重鏈)；IGFR(胰島素樣生長因子受體)；LC(輕鏈)；scFv(單鏈可變片段(由氨基酸接頭系留的VL和VH)；VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)；VEGFR2(血管內(nèi)皮生長因子受體2)；V_H(可變重鏈結(jié)構(gòu)域)；V_L(可變輕鏈結(jié)構(gòu)域)。

實施例

本發(fā)明在后續(xù)實例中以進一步細節(jié)描述，其中所述實例不意圖以任何方式限制如要求授權(quán)的本發(fā)明范圍。附圖意在視為本發(fā)明說明書和描述內(nèi)容的不可分割部分。所援引的全部參考文獻通過參考其中所述全部內(nèi)容，通過引用方式結(jié)合在此。提供以下實施例旨在說明，但不限制要求保護的本發(fā)明。

實施例1：合并的細胞培養(yǎng)物中雙特異性抗體的單體組分的摩爾比可以通過調(diào)節(jié)細胞:細胞比率進行控制

以下例子顯示在相同培養(yǎng)物中培養(yǎng)各自表達結(jié)半抗體或孔半抗體的兩個哺乳動物細胞系(CHO細胞)時結(jié)半抗體和孔半抗體的摩爾比。

進行生產(chǎn)研究以確定每個細胞系的生產(chǎn)滴度(即，由細胞產(chǎn)生的抗體的總量，所述抗體包括異二聚體、同型二聚體和單體半抗體)。各細胞系每3天或4天在種子訓(xùn)練培養(yǎng)基中傳代直至各細胞系的生產(chǎn)滴度數(shù)據(jù)變得可獲得的。

隨后培養(yǎng)并誘導(dǎo)兩個細胞系以在獨立的培養(yǎng)物中表達結(jié)半抗體或孔半抗體。每3天或4天將單獨的結(jié)細胞系培養(yǎng)物和孔細胞系培養(yǎng)物以40mL體積在搖瓶中在種子訓(xùn)練培養(yǎng)基內(nèi)傳代。在培養(yǎng)物待合并的當日，借助Vicell(Beckman Coulter)測量細胞計數(shù)。

獨立的培養(yǎng)物隨后按特定結(jié)宿主細胞:孔宿主細胞比率合并。基于針對各個細胞系已知的生產(chǎn)滴度，計算結(jié)宿主細胞:孔宿主細胞比率。對于每種小規(guī)模生產(chǎn)，需要約40x 10⁶個細胞。使用Vicell計數(shù)(細胞/mL)，可以確定需要添加至合并的培養(yǎng)物以實現(xiàn)所需結(jié)宿主細胞:孔宿主細胞比率的每個細胞系體積。將適當體積的每個結(jié)細胞系和孔細胞系在新?lián)u瓶的生產(chǎn)培養(yǎng)基中以終體積40mL合并。

在收獲之前15小時，通過將GSH溶解入400mM琥珀酸中的1M精氨酸(pH＝9.0)至GSH儲液終濃度250mM，制備谷胱甘肽(GSH)儲液。將GSH儲液添加至生產(chǎn)培養(yǎng)物，從而GSH終濃度是15mM。隨后收獲合并的培養(yǎng)基并且在還原性條件下借助反相測量每種合并的培養(yǎng)物的結(jié)半抗體％和孔半抗體％。確定針對每個受檢比率所形成的共價雙特異性抗體％，如圖2中所述。

這些實驗用以下結(jié)半抗體/孔半抗體對進行：

抗靶A(結(jié))/抗靶B(孔)

抗靶C(結(jié))/抗靶D(孔)

抗靶D(結(jié))/抗靶C(孔)

抗靶E(結(jié))/抗靶F(孔)

下表2中提供這些實驗的結(jié)果：

*N/D＝未測定

如表2中所示，當結(jié)半抗體:孔半抗體摩爾比是約或接近于1:1時，共價雙特異性抗體產(chǎn)率％改進。將可能對每種特定雙特異性抗體確定雙特異性形成的最佳摩爾比。產(chǎn)生1:1結(jié)半抗體:孔半抗體摩爾比的結(jié)宿主細胞:孔宿主細胞比率隨細胞系變動并且實驗地確定。

實施例2：在生產(chǎn)雙特異性抗體期間變動合并的細胞培養(yǎng)物中添加還原劑的時間和添加的還原劑的濃度

以下實施例顯示在生產(chǎn)包含抗靶A(結(jié))和抗靶B(孔)的雙特異性抗體的不同階段期間還原劑的添加。最初培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達抗靶A(結(jié))或抗靶B(孔)的兩個哺乳動物細胞系以在獨立的培養(yǎng)物中表達結(jié)半抗體或孔半抗體，所述獨立的培養(yǎng)物隨后在多個獨立的生產(chǎn)培養(yǎng)物中合并以實現(xiàn)抗靶A(結(jié)):抗靶B(孔)的1:1摩爾比，如上文所述。將GSH儲液在收獲之前24小時、15小時、或4小時添加到生產(chǎn)培養(yǎng)物至終濃度2mM、4mM或10mM，或者留下培養(yǎng)物未處理。隨后從每種生產(chǎn)培養(yǎng)物收獲合并的培養(yǎng)基并且在還原性條件下借助反相測量每種合并的培養(yǎng)物的結(jié)半抗體％和孔半抗體％。確定針對每個受檢比率所形成的共價雙特異性抗體％，如圖2中所述。

如圖3中所示，與GSH終濃度為2mM或4mM的生產(chǎn)培養(yǎng)物或未處理的對照組中雙特異性抗體的產(chǎn)率相比，在具有GSH終濃度10mM的生產(chǎn)培養(yǎng)物中共價雙特異性抗體的產(chǎn)率提高。添加GSH的生產(chǎn)階段未顯示影響共價雙特異性抗體的產(chǎn)率。

在進一步實驗中、最初培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達抗靶A(結(jié))或抗靶B(孔)的細胞系以在獨立的培養(yǎng)物中表達結(jié)半抗體或孔半抗體，所述獨立的培養(yǎng)物隨后在多個獨立的生產(chǎn)培養(yǎng)物中合并以實現(xiàn)抗靶A(結(jié)):抗靶B(孔)的0.82:1摩爾比或1:1摩爾比，如上文所述。將GSH儲液在收獲之前15小時添加到生產(chǎn)培養(yǎng)物至終濃度5mM或10mM，或者未處理(“0mM”)。在收獲時測定每種合并的細胞培養(yǎng)物的細胞活力并且隨后借助如圖2中所示的離子交換測定法測定每種測試的情況下形成的雙特異性抗體％。下表3中顯示實驗結(jié)果。

表3

*滴度指合并的培養(yǎng)物中兩個細胞系產(chǎn)生的抗體總量，例如，包括同型二聚體、異二聚體和單體半抗體。

如圖表3中所示，與GSH終濃度為5mM的生產(chǎn)培養(yǎng)物或未處理的對照組中雙特異性抗體的產(chǎn)率相比，在具有GSH終濃度10mM的生產(chǎn)培養(yǎng)物中共價雙特異性抗體的產(chǎn)率提高。發(fā)現(xiàn)向合并的細胞培養(yǎng)物添加GSH到高達10mM的終濃度不影響細胞活力或抗體總產(chǎn)量。在10mM的GSH未觀察到不想要的混合型二硫鍵形成或蛋白質(zhì)雜亂(數(shù)據(jù)未顯示)。

相似的實驗用各自表達抗靶D(結(jié))或抗靶C(孔)的兩個其他哺乳動物細胞系進行。最初培養(yǎng)并誘導(dǎo)這兩個細胞系以在獨立的培養(yǎng)物中表達抗靶D(結(jié))或抗靶C(孔)，所述獨立的培養(yǎng)物隨后在多個獨立的生產(chǎn)培養(yǎng)物中合并以實現(xiàn)抗靶D(結(jié)):抗靶C(孔)的0.82:1摩爾比，如上文所述。將GSH儲液在收獲之前15小時添加到生產(chǎn)培養(yǎng)物至終濃度10mM、15mM或20mM，或者未處理(“0mM”)。在收獲時測定每種合并的細胞培養(yǎng)物的細胞活力，并且隨后如圖2中所示那樣測定每種測試的情況下形成的雙特異性抗體％。下表4中顯示這些實驗的結(jié)果。

表4

*滴度指合并的培養(yǎng)物中兩個細胞系產(chǎn)生的抗體總量，例如，包括蛋白A柱捕獲的同型二聚體、異二聚體和單體半抗體。

如圖表4中所示，與GSH終濃度為10mM或15mM的生產(chǎn)培養(yǎng)物或未處理的對照組中雙特異性抗體的產(chǎn)率相比，在具有GSH終濃度20mM的生產(chǎn)培養(yǎng)物中共價雙特異性抗體的產(chǎn)率提高。發(fā)現(xiàn)向合并的細胞培養(yǎng)物添加GSH到高達20mM的終濃度不影響滴度。然而，向生產(chǎn)培養(yǎng)物添加GSH至終濃度20mM時，觀察到半抗體受GSH共價修飾(數(shù)據(jù)未顯示)。

實施例3：與體外裝配相比，在合并的培養(yǎng)基中形成的雙特異性抗體的產(chǎn)率

使用抗靶E(結(jié))和抗靶F(孔)進行額外的實驗，以比較通過表達抗靶E的哺乳動物宿主細胞(例如，CHO細胞)和表達抗靶F的哺乳動物細胞(例如，CHO細胞)的合并培養(yǎng)物所獲得的雙特異性抗體的產(chǎn)率與通過體外合并使用蛋白A柱純化的抗靶E(結(jié))和純化的抗靶F(孔)所獲得的雙特異性抗體的產(chǎn)率。簡而言之，最初培養(yǎng)并誘導(dǎo)各自表達抗靶E(結(jié))或抗靶F(孔)的兩個哺乳動物細胞系，以在獨立的培養(yǎng)物中表達結(jié)半抗體或孔半抗體。隨后將獨立的培養(yǎng)物合并并培養(yǎng)額外的時間長度。收獲合并的培養(yǎng)基，并且隨后借助如圖2中所示的陽離子交換測定法測定形成的雙特異性抗體％。同時，通過體外合并純化的抗靶E(結(jié))和抗靶F(孔)形成特異性抗體(參見，例如，WO 2013/055958)。兩種條件下形成的雙特異性抗體的最終產(chǎn)率是可比較的(數(shù)據(jù)未顯示)。

實施例4：雙特異性產(chǎn)生

使用抗靶G(結(jié))和抗靶H(孔)進行額外的實驗，以檢驗是否可以從包含抗靶G/抗靶G同型二聚體的純化的抗靶G半抗體的制品和包含抗靶H/抗靶H同型二聚體的純化的抗靶H半抗體的制品中形成雙特異性抗靶G/抗靶H抗體。如上文所述，培養(yǎng)并收獲瞬時表達半抗體抗靶G(結(jié))的哺乳動物宿主細胞(例如，CHO細胞)和瞬時表達半抗體抗靶H(孔)的哺乳動物宿主細胞(例如，CHO細胞)的單獨的培養(yǎng)物。

隨后在5mL MabSURE SELECT蛋白A柱上捕獲每種半抗體。將柱隨后用10個柱體積(CV)的以下緩沖洗滌：由50mM TRIS pH 8.0、150mM NaCl、0.05％Triton X-100、0.05％Triton X-114組成的平衡緩沖液，由25mM檸檬酸鈉pH 6.0組成的洗滌緩沖液。將每條臂洗脫入0.15M乙酸鈉pH 2.7中。通過MS證實每種半抗體的身份。

在雙特異性的情況下，隨后使用1:10 1M精氨酸pH 9.0獨立滴定每種半抗體直至pH 5.0，并且隨后按比率1:1合并在一起。隨后使用1:10 1M TRIS精氨酸pH 9.0，將混合物滴定至pH 8.5并且置于室溫3天，之后按照1:200摩爾比添加新鮮制備的過量0.5M還原型L-谷胱甘肽(Sigma Aldrich)。通過用于雙特異性ID的質(zhì)譜檢查反應(yīng)。

在4％-20％Tris-甘氨酸SDS PAGE上運行結(jié)捕獲匯集物和孔捕獲匯集物，顯示在每種捕獲匯集物中存在與半抗體和同型二聚體的分子量相對應(yīng)的條帶。參見圖4。另外，在MabSURE SELECT捕獲后，將0.5mg每種捕獲匯集物加載于疏水性柱(2.1x 100mm)上。運行緩沖液是25mM磷酸鉀、1M硫酸銨pH 6.5并且洗脫緩沖液是25mM磷酸鉀pH 6.5、25％異丙醇。色譜圖反映隨凝膠所見的異質(zhì)性，并且還揭示出主峰保留時間的差異。參見圖5A和圖5B，所述圖分別顯示抗靶G(結(jié))和抗靶H(孔)的色譜圖。捕獲匯集物中同型二聚體和半抗體的量可以根據(jù)具體的抗體變動。

在谷胱甘肽處理后，還將雙特異性加載于疏水性柱上。色譜圖揭示了保留時間在那些半抗體各自之間的單個主峰(>90％)。參見圖6。質(zhì)譜證實主峰是雙特異性的。這些結(jié)果表明，半抗體捕獲匯集物中存在共價同型二聚體、并且利用上文所述的裝配條件能夠破壞同型二聚體并且這些同型二聚體可用于雙特異性抗體形成。

通過比較合并的培養(yǎng)基中在GSH不存在與存在10mM GSH的情況下抗靶A(結(jié))和抗靶B(孔)的裝配，進一步檢驗雙特異性裝配條件。

根據(jù)制造商的推薦(Invitrogen,Carlsbad,CA)，使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺2000，轉(zhuǎn)染CHO細胞。在多種濃度的MSX(氨基亞砜蛋氨酸)，25μM和50μM)選擇已轉(zhuǎn)染的細胞。通過采樣來自集落的上清液并借助ELISA分析，對挑取的集落評價抗體產(chǎn)量。為了產(chǎn)生穩(wěn)定的匯集物，基于ELISA滴度，將前48個克隆合并比例放大。還擴充并比例放大各個克隆以評價抗體生產(chǎn)力以確定最佳克隆。

接著，使用40L培養(yǎng)物并將細胞按1.2x 10⁶個細胞/mL接種在2.8L培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物定期分割并在90轉(zhuǎn)/分鐘攪拌以及維持處于pH設(shè)定點7.0±0.03和30％溶解氧(dO2)。在第11天，添加15mM GSH，隨后在第12天收獲細胞。

未處理的和GSH處理的無細胞培養(yǎng)基各自經(jīng)MabSURE SELECT加工并且使用ESI-TOF分析捕獲匯集物。參見圖7A。圖7B顯示雙特異性抗體峰的m/z范圍的放大圖(如7A中顯示的右峰)。圖7C顯示半抗體峰的m/z范圍的放大圖(如7A中顯示的左峰)。

圖7A-C顯示當10mM GSH加入培養(yǎng)物時，同型二聚體峰豐度和半抗體峰豐度明顯降低，證明雙特異性形成受共培養(yǎng)物中半抗體和同型二聚體含量驅(qū)動。每種同型二聚體參與雙特異性抗體形成的程度取決于特別的半抗體。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，幾種實施方案能處于本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)。現(xiàn)在將通過參考以下非限制性實施例更詳細地描述本發(fā)明。以下實施例進一步說明本發(fā)明，不過當然不應(yīng)當解釋為以任何方式限制其范圍。