本申請要求于2014年5月4日提交的美國臨時申請?zhí)?1/988,293，于2014年5月5日提交的美國臨時申請?zhí)?1/988,841，于2014年8月11日提交的美國臨時申請?zhí)?2/036,085，于2015年3月19日提交的臨時申請?zhí)?2/135,658的權(quán)益。上述申請的全部內(nèi)容通過引用并入本文。

背景

腸易激綜合征(IBS)是以頻繁和虛弱的癥狀(例如腹瀉，腹脹，腹痛，緊急排便，排氣，和糞便失禁)為特征的不同種類的胃腸(GI)病癥，常常伴有周期性癥狀加強(qiáng)和減弱。IBS導(dǎo)致健康相關(guān)的生活質(zhì)量(QOL)實質(zhì)性損害，工作和生產(chǎn)力的損失，社交尷尬和高醫(yī)療保健成本。認(rèn)為IBS的流行率為美國(US)人口的10％至15％；然而，只有15％的IBS患者實際上尋求醫(yī)療，這可能部分是由于缺乏有效的治療。盡管IBS的巨大負(fù)擔(dān)，但在患者和保健系統(tǒng)上，仍然存在對有效和安全的治療的顯著未滿足的需求，特別是對于伴有腹瀉的IBS(IBS-D)。

IBS的確切原因是未知的，但已經(jīng)提出了幾個假設(shè)。牽涉腸道細(xì)菌失調(diào)的一個流行假說表明IBS癥狀是由腸微生物組的改變和異常定居引起的，所述腸微生物組也參與正常的生理功能。最好將腸道細(xì)菌性失調(diào)視為改變的微生物生態(tài)系統(tǒng)，而不是感染本身。

本領(lǐng)域需要診斷需要IBS治療的那些。本領(lǐng)域還需要提供待治療IBS的那些或正在或已經(jīng)進(jìn)行IBS治療的那些的預(yù)后指示。

本領(lǐng)域還需要一種在短期治療過程之后為IBS-D受試者提供癥狀緩解以及不利促成多藥物抗生素抗性問題的低風(fēng)險的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本文提供診斷和/或治療IBS的方法。

在某些實施方案中，方法還包括診斷將對IBS治療反應(yīng)的受試者。

在某些實施方案中，方法還包括診斷將對IBS的利福昔明治療反應(yīng)的受試者。

在某些實施方案中，方法還包括診斷將對IBS的利福昔明治療和再治療反應(yīng)的受試者。

在某些實施方案中，治療包括550mg利福昔明TID，持續(xù)14天。

在某些實施方案中，再治療包括在第一次或其它治療復(fù)發(fā)后550mg利福昔明TID，持續(xù)14天。

所述方法包括確定胃腸(GI)道中細(xì)菌群落(例如，群體)的身份。

所述方法包括確定胃腸(GI)道中細(xì)菌群落的身份和流行性。

在某些實施方案中，微生物組包括胃腸道微生物組。在某些實施方案中，微生物組包括胃腸道細(xì)菌群體。在某些實施方案中，微生物組包括糞便細(xì)菌。

所述方法包括測定胃腸(GI)道中的細(xì)菌的身份。

所述方法包括通過宏基因組學(xué)分析微生物組。

所述方法包括分析胃腸(GI)微生物組中的細(xì)菌群落的身份以產(chǎn)生細(xì)菌群落的多樣性概況。

所述方法包括通過宏基因組學(xué)確定胃腸(GI)道GI微生物組的身份，流行性和多樣性。

所述方法包括通過宏基因組學(xué)分析胃腸(GI)微生物組。

所述方法包括確定皮膚，鼻和胃腸道中的一個或多個上的細(xì)菌的身份。

所述方法包括通過宏基因組學(xué)確定皮膚，鼻和胃腸道中的一個或多個上的細(xì)菌的身份。

所述方法包括確定皮膚，鼻和胃腸道中的一個或多個上的細(xì)菌的身份和流行性。

本文提供了使用例如宏基因組學(xué)來治療受試者的IBS的方法，包括確定和/或檢測和/或分析受試者的GI道微生物組。

在某些實施方案中，所述方法包括通過宏基因組學(xué)治療受試者的IBS，包括，確定和/或檢測和/或分析受試者的GI道微生物組。

在某些實施方案中，所述方法包括向具有特定細(xì)菌的受試者施用利福昔明，其中反應(yīng)者對藥物的相對豐度高于無反應(yīng)者的相對豐度確定為存在的。

在某些實施方案中，微生物組包括胃腸道微生物組。在某些實施方案中，微生物組包括胃腸道細(xì)菌群體。在某些實施方案中，微生物組包括糞便細(xì)菌。

在某些實施方案中，檢測包括分析16S rRNA基因。

在某些實施方案中，分析16S rRNA基因的V4超變區(qū)。

在某些實施方案中，表1中分類群的分析，其中平均反應(yīng)者數(shù)目高于平均無反應(yīng)者數(shù)目確定為存在的，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，表1中分類群的分析，其中平均反應(yīng)者數(shù)目低于平均無反應(yīng)者數(shù)目確定為不存在的，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，表1中分類群的分析，其中平均無反應(yīng)者數(shù)目高于平均反應(yīng)者數(shù)目確定為存在的，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，表1中分類群的分析，其中平均無反應(yīng)者數(shù)目低于平均反應(yīng)者數(shù)目確定為不存在的，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果其中平均反應(yīng)者數(shù)目高于平均無反應(yīng)者數(shù)目的細(xì)菌種類確定為存在的，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果其中平均反應(yīng)者數(shù)目低于平均無反應(yīng)者數(shù)目的細(xì)菌種類確定為不存在的，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果其中平均無反應(yīng)者數(shù)目高于平均反應(yīng)者數(shù)目的細(xì)菌種類確定為存在的，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果其中平均無反應(yīng)者數(shù)目低于平均反應(yīng)者數(shù)目的細(xì)菌種類確定為不存在的，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果Sutterellacae在平均無反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果Sutterellacae在平均無反應(yīng)者中以顯著較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果鞘氨醇桿菌科在平均反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果鞘氨醇桿菌科在平均反應(yīng)者中以顯著較大的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果葉桿菌科在平均反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果葉桿菌科在平均反應(yīng)者中以顯著較大的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果熱厭氧桿菌科在平均無反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果熱厭氧桿菌科在平均無反應(yīng)者中以顯著較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)在平均無反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)在平均無反應(yīng)者中以顯著較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果黃桿菌科在平均反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果黃桿菌科在平均反應(yīng)者中以顯著較大的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果Sutterellacae，熱厭氧桿菌科或分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一種或多種在平均無反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果Sutterellacae，熱厭氧桿菌科或分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一種或多種在平均無反應(yīng)者以顯著較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科或黃桿菌科中的一種或多種以大于平均反應(yīng)者的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科或黃桿菌科中的一種或多種以顯著大于平均反應(yīng)者的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果Sutterellacae，熱厭氧桿菌科或分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一種或多種在平均無反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)和/或如果鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科或黃桿菌科中的一種或多種以大于平均反應(yīng)者的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果Sutterellacae，熱厭氧桿菌科或分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一種或多種在平均無反應(yīng)者中以顯著較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)和/或如果鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科，或黃桿菌科中的一種或多種以顯著大于平均反應(yīng)者的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

本文還提供了提供IBS治療的預(yù)后的方法。

本文提供選擇用利福昔明治療的受試者的方法。

本文提供了用利福昔明治療患有腹瀉型IBS(d-IBS)的受試者的方法，包括向受試者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，隨后進(jìn)行利福昔明的一次或多次后續(xù)治療，其中后續(xù)治療在IBS相關(guān)腹痛的病征或癥狀復(fù)發(fā)后開始，或在一周內(nèi)松散或水樣糞便的每天數(shù)量增加50％后開始，并且其中對受試者的糞便微生物群(microbiota)或受試者對其它抗生素的交叉抗性或受試者對利福昔明后續(xù)治療后微生物出現(xiàn)的傾向沒有影響。

在一個實施方案中，對受試者的總糞便微生物群沒有影響。

在一個實施方案中，通過Bray-Curtis相似性測量來評價對受試者的糞便微生物群的影響。

在一個實施方案中，通過Shannon多樣性指數(shù)評價對受試者的糞便微生物群的影響。

在一個實施方案中，對受試者對除利福平之外的抗生素的抗性沒有影響。

在一個實施方案中，對受試者對利福平的抗性有影響。

在一個實施方案中，對受試者對非利福霉素抗生素的交叉抗性沒有影響。

在一個實施方案中，通過從受試者的糞便拭子樣品生長的分離株培養(yǎng)物來評價對受試者對抗生素的交叉抗性的影響。

在一個實施方案中，通過從受試者的皮膚樣品生長的分離株培養(yǎng)物來評價對受試者對抗生素的交叉抗性的影響。

在一個實施方案中，抗生素包括利福昔明，利福平，萬古霉素，非達(dá)霉素，甲硝唑，頭孢他啶，頭孢曲松，頭孢噻吩，環(huán)丙沙星，亞胺培南，美羅培南，哌拉西林或三唑巴坦，甲氧芐啶，磺胺甲噁唑或萬古霉素。

在一個實施方案中，抗生素包括利福昔明，利福平，萬古霉素，非達(dá)霉素，甲硝唑，頭孢他啶，頭孢曲松，環(huán)丙沙星，亞胺培南，美羅培南，哌拉西林或三唑巴坦。

在一個實施方案中，抗生素包括利福昔明，利福平，頭孢他啶，頭孢曲松，頭孢噻吩，環(huán)丙沙星，亞胺培南，美羅培南，哌拉西林或三唑巴坦，甲氧芐啶，磺胺甲噁唑或萬古霉素。

在一個實施方案中，對受試者在利福昔明的后續(xù)治療后出現(xiàn)微生物的傾向沒有影響。

在一個實施方案中，利福昔明的后續(xù)治療不影響受試者對受試者糞便中微生物出現(xiàn)的傾向。

在一個實施方案中，利福昔明的后續(xù)治療不影響受試者對受試者皮膚上微生物出現(xiàn)的傾向。

在一個實施方案中，微生物是酵母。

在一個實施方案中，微生物是病原菌。

在一個實施方案中，微生物是革蘭氏陽性細(xì)菌。

在一個實施方案中，微生物是革蘭氏陰性細(xì)菌。

在一個實施方案中，病原菌包括以下種類：大腸桿菌，克雷伯氏菌，假單胞菌，腸桿菌，沙雷氏菌，變形桿菌，擬桿菌，腸球菌，葡萄球菌或艱難梭菌。

在一個實施方案中，病原菌是葡萄球菌。

在一個實施方案中，病原菌是腸球菌。

在一個實施方案中，病原菌是梭菌。

在一個實施方案中，對受試者對利福平的抗性有影響。

本文提供了用利福昔明治療患有腹瀉型IBS(d-IBS)的受試者的方法，包括：向受試者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，隨后進(jìn)行利福昔明的一次或多次后續(xù)治療，其中后續(xù)治療在IBS相關(guān)腹痛的病征或癥狀復(fù)發(fā)后開始，或在一周內(nèi)松散或水樣糞便的每天數(shù)量增加50％后開始，并且其中利福平抗性遵循(track)利福昔明抗性。

在一個實施方案中，在表現(xiàn)出利福昔明抗性增加的受試者中觀察到利福平抗性的增加。

在一個實施方案中，在沒有表現(xiàn)出利福昔明抗性增加的受試者中沒有觀察到利福平抗性的增加。

本文提供了用利福昔明治療患有腹瀉型IBS(d-IBS)的受試者的方法，包括：向受試者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，隨后進(jìn)行利福昔明的一次或多次后續(xù)治療，其中后續(xù)治療在IBS相關(guān)腹痛的病征或癥狀復(fù)發(fā)后開始，或在一周內(nèi)松散或水樣糞便的每天數(shù)量增加50％后開始，并且其中受試者表現(xiàn)出利福昔明最小抑制濃度(MIC)的瞬時變化。

在一個實施方案中，MIC的變化隨時間可逆。

在一個實施方案中，針對葡萄球菌顯示MIC的瞬時增加。

在一個實施方案中，所述方法還包括利福平MIC的瞬時變化。

在一個實施方案中，MIC的變化隨時間可逆。

本文提供了用利福昔明治療患有腹瀉型IBS(d-IBS)的受試者的方法，包括：向受試者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，隨后進(jìn)行利福昔明的一次或多次后續(xù)治療，其中后續(xù)治療在IBS相關(guān)腹痛的病征或癥狀復(fù)發(fā)后開始，或在一周內(nèi)松散或水樣糞便的每天數(shù)量增加50％后開始，并且其中利福平MIC的變化類似于利福昔明MIC的變化。

在一個實施方案中，類似于，包括例如遵循，為在相同的方向上相似的量或水平的改變。

本文提供了用利福昔明治療患有腹瀉型IBS(d-IBS)的受試者的方法，包括向受試者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，隨后進(jìn)行利福昔明的一次或多次后續(xù)治療，其中后續(xù)治療在IBS相關(guān)腹痛的病征或癥狀復(fù)發(fā)后開始。

本文提供了用利福昔明治療患有腹瀉型IBS(d-IBS)的受試者的方法，包括向受試者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，隨后進(jìn)行利福昔明的一次或多次后續(xù)治療，其中后續(xù)治療在一周內(nèi)松散或水樣糞便的每天數(shù)量增加50％后開始。

本文提供了用利福昔明治療患有腹瀉型IBS(d-IBS)的受試者的方法，包括向受試者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，然后進(jìn)行利福昔明的一次或多次后續(xù)治療，其中對受試者的糞便微生物群體沒有影響。

本文提供了用利福昔明治療患有腹瀉型IBS(d-IBS)的受試者的方法，包括向受試者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，隨后進(jìn)行利福昔明的一次或多次后續(xù)治療，其中受試者對除利福平之外的抗生素的交叉抗性沒有變化。

本文提供了用利福昔明治療患有腹瀉型IBS(d-IBS)的受試者的方法，包括向受試者每天三次(TID)施用550mg利福昔明14天，隨后進(jìn)行利福昔明的一次或多次后續(xù)治療，其中在利福昔明的后續(xù)治療后受試者對微生物出現(xiàn)的傾向沒有可檢測的變化。

本文提供了用利福昔明治療患有腹瀉型IBS(d-IBS)的受試者的方法，包括施用第一治療，施用一次或多次利福昔明的后續(xù)治療，其中沒有證據(jù)表明所述一次或多次后續(xù)治療對受試者的糞便或皮膚樣品中的病原體出現(xiàn)產(chǎn)生顯著影響，并且其中所述利福昔明的治療和各后續(xù)治療包括向受試者每天三次(TID)施用550mg利福昔明，持續(xù)14天。

本文提供了用利福昔明治療患有腹瀉型IBS(d-IBS)的受試者的方法，包括施用第一治療，施用一次或多次利福昔明的后續(xù)治療，其中沒有證據(jù)表明所述一次或多次后續(xù)治療對受試者的糞便或皮膚樣品中的病原體易感性產(chǎn)生顯著影響，并且其中所述利福昔明的治療和各后續(xù)治療包括向受試者每天三次(TID)施用550mg利福昔明，持續(xù)14天。

本文提供了用利福昔明治療患有腹瀉型IBS(d-IBS)的受試者的方法，包括施用第一治療，施用一次或多次利福昔明的后續(xù)治療，其中沒有證據(jù)表明所述一次或多次后續(xù)治療對受試者的糞便或皮膚樣品中的總體微生物群體產(chǎn)生顯著影響，并且其中所述利福昔明的治療和各后續(xù)治療包括向受試者每天三次(TID)施用550mg利福昔明，持續(xù)14天。

本文提供診斷或治療受試者的腸易激綜合征(IBS)的方法。該方法包括分析受試者的樣品中是否存在一種或多種細(xì)菌，所述細(xì)菌屬于平均反應(yīng)者數(shù)目高于平均無反應(yīng)者數(shù)目的分類群，其中如果檢測到所述細(xì)菌，則所述受試者對利福昔明有反應(yīng)，并且其中所述受試者的樣品包括來自受試者的胃腸微生物群；和向受試者施用利福昔明。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，利福昔明以550mg每天三次持續(xù)14天的給藥方案施用。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法還包括在與IBS相關(guān)的一種或多種癥狀復(fù)發(fā)后重復(fù)給藥方案。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述一種或多種癥狀包括腹痛或松散或水樣糞便。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法還包括在一周內(nèi)松散或水樣糞便的每天數(shù)量增加50％或更多后重復(fù)給藥方案。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，樣品是糞便樣品。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，通過從樣品分離的細(xì)菌DNA，更具體地16S rRNA基因或16S rRNA基因的V4超變區(qū)的基因組分析來確定所述細(xì)菌存在或不存在。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，通過擴(kuò)增16S rRNA基因的V4超變區(qū)并測序V4超變區(qū)的擴(kuò)增序列來確定細(xì)菌的存在或不存在。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，通過細(xì)菌培養(yǎng)，任選地與基因組分析組合來確定細(xì)菌的存在或不存在。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述一種或多種細(xì)菌屬于選自下組的一個或多個分類群：Sutterellaceae，鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科，熱厭氧桿菌科，分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)和黃桿菌科。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述一種或多種細(xì)菌屬于選自下組的一個或多個分類群：Sutterellaceae，熱厭氧桿菌科，和分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述一種或多種細(xì)菌屬于選自下組的一個或多個分類群：鞘氨醇桿菌科(Sphingobacteriaceae)，葉桿菌科(Phyllobacteriaceae)和黃桿菌科(Flavobacteriaceae)。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，基于對施用550mg利福昔明TID 14天的患者的胃腸微生物群數(shù)據(jù)集的監(jiān)督分類來確定平均反應(yīng)者數(shù)目和平均無反應(yīng)者數(shù)目。

本文提供了治療腸易激綜合征(IBS)的方法，所述方法包括將利福昔明施用給已知具有一種或多種屬于平均反應(yīng)者數(shù)目高于平均無反應(yīng)者數(shù)目的分類群的細(xì)菌的受試者，其中利福昔明以550mg每天三次持續(xù)14天的給藥方案施用給受試者。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法還包括在與IBS相關(guān)的一種或多種癥狀，例如，不排除地，腹痛和/或松散或水樣糞便復(fù)發(fā)后重復(fù)給藥方案。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法還包括在一周內(nèi)松散或水樣糞便的每天數(shù)量增加50％或更多后重復(fù)給藥方案。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述一種或多種細(xì)菌屬于選自下組的一個或多個分類群：Sutterellaceae，鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科，熱厭氧桿菌科，分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)和黃桿菌科。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述一種或多種細(xì)菌屬于選自下組的一個或多個分類群：Sutterellaceae，熱厭氧桿菌科，和分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述一種或多種細(xì)菌屬于選自下組的一個或多個分類群：鞘氨醇桿菌科(Sphingobacteriaceae)，葉桿菌科(Phyllobacteriaceae)和黃桿菌科(Flavobacteriaceae)。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，基于對施用550mg利福昔明TID 14天的患者的胃腸微生物群數(shù)據(jù)集的監(jiān)督分類來確定平均反應(yīng)者數(shù)目和平均無反應(yīng)者數(shù)目。

本文還提供了在受試者中治療腹瀉型IBS(d-IBS)的方法，所述方法包括以550mg利福昔明每天三次(TID)的給藥方案向受試者施用利福昔明，持續(xù)14天；和在一周內(nèi)松散或水樣糞便的每天數(shù)量增加50％或更多后重復(fù)給藥方案。

本文還提供了通過分析受試者的樣品中細(xì)菌的存在或不存在來診斷受試者中利福昔明反應(yīng)性IBS的方法，所述細(xì)菌具有高于平均無反應(yīng)者數(shù)目的平均反應(yīng)者數(shù)目，其中如果檢測到所述細(xì)菌，則所述受試者診斷為患有利福昔明反應(yīng)性IBS，并且其中受試者的樣品含有來自受試者的胃腸微生物群。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，IBS是d-IBS。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，樣品是糞便樣品。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，通過從樣品分離的細(xì)菌DNA的基因組分析，例如通過分析16S rRNA基因，例如通過分析16S rRNA基因的V4超變區(qū)來確定細(xì)菌的存在或不存在。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，通過擴(kuò)增16S rRNA基因的V4超變區(qū)并測序V4超變區(qū)的擴(kuò)增序列來確定細(xì)菌的存在或不存在。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，通過細(xì)菌培養(yǎng)，任選地與基因組分析組合來確定細(xì)菌的存在或不存在。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，基于對施用550mg利福昔明TID持續(xù)14天的患者的胃腸微生物群數(shù)據(jù)集的監(jiān)督分類來確定所述平均反應(yīng)者數(shù)目和平均無反應(yīng)者數(shù)目。

以下公開了其它實施例。

附圖說明

圖1顯示了研究設(shè)計。

圖2顯示了具有449個樣品* 2配對端的排序圖。根據(jù)就診日期沒有明顯的聚類。

圖3顯示了根據(jù)反應(yīng)者/無反應(yīng)者狀態(tài)的聚類。

圖4顯示來自V3的配對端讀數(shù)之一的樣品。

圖5顯示來自V4的配對端讀數(shù)之一的樣品。

圖6顯示了表1標(biāo)記物的相對豐度。

圖7顯示了V3和V4之間的不同(n = 100)。

圖8顯示通過使用配對的Wilcoxon檢驗來詢問誰在V3和治療結(jié)束之間是不同的(n = 94)，其可以顯示微生物群落具有長期的恢復(fù)力。

圖9顯示在抗生素抑制的細(xì)菌和預(yù)測反應(yīng)者的細(xì)菌之間沒有一般性關(guān)系。

圖10顯示統(tǒng)計建模的結(jié)果，其表明微生物群落在利福昔明治療時間點內(nèi)的個體中是高度穩(wěn)定的。

圖11顯示了開放標(biāo)簽期的微生物組豐富度。

圖12顯示了開放標(biāo)簽期豐富度自基線的變化。

圖13顯示了接受雙盲的受試者中豐富度自基線的變化。

圖14顯示接受雙盲利福昔明的受試者中豐富度自基線的變化。

圖15顯示了在開放標(biāo)簽和雙盲期的雙盲安慰劑治療的受試者中糞便微生物群的豐富度。

圖16顯示了在開放標(biāo)簽和雙盲期的雙盲利福昔明治療的受試者中糞便微生物群的豐富度。

發(fā)明詳述

多重證據(jù)已經(jīng)暗示腸道微生物組的生態(tài)失調(diào)，以及宿主對該生態(tài)失調(diào)的反應(yīng)，作為腸易激綜合征(IBS-D)的原因。利福昔明在治療IBS-D中的功效已經(jīng)在許多研究中確立，所述研究在藥物單一和多療程治療后顯示出統(tǒng)計學(xué)和臨床學(xué)顯著作用。利福昔明的臨床藥理學(xué)特征使其與其它經(jīng)測試用于治療IBS-D的抗生素區(qū)分開。具體地，其是腸靶向的，導(dǎo)致最少的全身暴露(比全身抗生素或其它最少吸收的抗生素低數(shù)個數(shù)量級)，并組合了在口服給藥后在GI道中的高局部濃度。利福昔明激活人類孕烷X受體，導(dǎo)致宿主解毒機(jī)制的上調(diào)和炎癥過程的調(diào)節(jié)，其可以調(diào)節(jié)宿主對生態(tài)失調(diào)的反應(yīng)。盡管利福昔明在體外具有可證明的抗微生物作用，但在公開的文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)表明其不根除有益的腸道菌群；在這項研究中收集的數(shù)據(jù)提供了在這方面以前發(fā)表的發(fā)現(xiàn)結(jié)果的驗證。此外，已顯示利福昔明改變細(xì)菌毒力和附著到宿主上皮。

抗生素給藥的普遍問題是細(xì)菌對多藥抗生素抗性的發(fā)展。文獻(xiàn)中已經(jīng)論述了細(xì)菌對利福霉素的抗性的機(jī)制；并且本文提供的本發(fā)明的一個方面顯示，對非利福霉素抗生素的交叉抗性的發(fā)生的可能性低，利福霉素抗性細(xì)菌的適合度差，以及缺乏用于發(fā)展臨床顯著抗性的明顯信號。

本文提供的本發(fā)明部分基于16S rRNA細(xì)菌深度基因測序數(shù)據(jù)的預(yù)期評估。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，證明利福昔明治療對安慰劑與利福昔明治療的IBS-D受試者之間的Shannon多樣性或均勻度沒有顯著影響，并且導(dǎo)致微生物群豐富度的瞬時變化。這些在豐富度方面的減少在利福昔明治療過程結(jié)束后恢復(fù)。

還顯示，受利福昔明治療影響的細(xì)菌科中，16S rRNA基因的測序顯示低豐度分類群比更高豐度分類群更受利福昔明治療的影響。總的來說，與使用單一療程的開放標(biāo)簽利福昔明，然后雙盲安慰劑的受試者相比，在使用利福昔明重復(fù)治療期間，在受試者中未觀察到糞便微生物群的干擾。

本文的發(fā)明還部分基于3期研究，其設(shè)計用于評估利福昔明550 TID在IBS-D受試者中重復(fù)治療2周的功效，所述受試者先前已經(jīng)對利福昔明550 mg TID的2周治療反應(yīng)并且正經(jīng)歷IBS癥狀的復(fù)發(fā)。

利福昔明的低全身吸收以及該微生物學(xué)數(shù)據(jù)和總體安全性特征支持使用口服利福昔明作為IBS-D治療的最合適和充分表征的選擇，并且滿足本領(lǐng)域中對于在短期治療過程之后為IBS-D受試者提供癥狀緩解，且不利促成多藥物抗生素抗性問題的風(fēng)險低的方法的需要

關(guān)于利福昔明抗性的一個臨床考慮是對利福平(利福昔明的化學(xué)類似物)產(chǎn)生交叉抗性的可能性。利福平作為傳染病抗生素的價值主要在于其治療結(jié)核病。在結(jié)核病的治療中，利福平不用作單一藥劑，而是與其它抗結(jié)核抗生素組合以減少臨床顯著抗性的可能性。

利福昔明是由利福霉素O產(chǎn)生的半合成抗生素。利福昔明是屬于利福霉素類抗生素例如吡啶并咪唑并利福霉素的分子。利福昔明例如在胃腸道中對引起感染性腹瀉，腸易激綜合征，小腸細(xì)菌過度生長，克羅恩病和/或胰腺功能不全的局部胃腸道細(xì)菌發(fā)揮廣泛的抗菌活性。

利福昔明也描述于意大利專利IT 1154655和EP 0161534中。EP專利0161534公開了使用利福霉素O作為起始材料生產(chǎn)利福昔明的方法(The Merck Index, XIII Ed., 8301)。US 7,045,620公開了利福昔明的多晶型形式，如同USSN 11/658,702; USSN 61/031,329; USSN 12/119,622; USSN 12/119,630; USSN 12/119,612; USSN 12/119,600; USSN 11/873,841; 公開WO 2006/094662;和USSN 12/393012。這里引用的申請和專利為了所有目的通過引用整體并入本文。

本文所用的“利福昔明”包括該分子的溶劑合物和多晶型，包括例如利福昔明的晶型α, 晶型β, 晶型γ, 晶型δ, 晶型ε, 晶型ζ, 晶型η, 晶型ι, 晶型κ, 晶型θ, 晶型μ, 晶型ω, 晶型π, 晶型λ, 晶型ξ，甲磺酸鹽形式，無定形形式或固體分散體形式。這些形式更詳細(xì)地描述于例如2005年3月3日提交的EP 05 004 635.2;美國專利號7,045,620;美國專利號7,612,199;美國專利號7,709,634;美國專利號7,915,275;美國專利號8,067,429;美國專利8,193,196;美國專利8,227,482; GC Viscomi等人，CrystEngComm，2008,10,1074-1081(2008年4月)，美國專利公開號2010/0174064，美國專利公開號2009/0028940，美國專利公開號2005/0272754，美國專利公開號2012/0077835和美國專利公開號2012/0108620。這些參考文獻(xiàn)中的每一篇通過引用整體并入本文。

如在“獲得GI特異性抗生素”中的術(shù)語“獲得”意在包括購買，合成或以其它方式獲取GI特異性抗生素。例如，獲得利福昔明可包括購買，合成或以其它方式獲取利福昔明。

本文所用的術(shù)語“藥劑組合物”(或藥劑或藥物)是指當(dāng)適當(dāng)?shù)厥┯糜诨颊邥r能夠誘導(dǎo)所需治療效果的化合物，組合物，藥劑或藥物。它不一定需要多于一種類型的成分。

如本文所使用的，“反應(yīng)的持久性”包括例如在去除治療后充分緩解癥狀，在去除治療后連續(xù)充分緩解癥狀，或反應(yīng)大于或優(yōu)于安慰劑反應(yīng)。受試者的反應(yīng)可以被認(rèn)為是持久的，例如，如果將利福霉素類抗生素(例如利福昔明)從治療中去除后，他們對利福霉素類抗生素(例如利福昔明)具有反應(yīng)。反應(yīng)持續(xù)時間可以是例如2天，7天，2周，3周，4周，12周，約1周至約24周或更長。在一些實施方案中，反應(yīng)的持久性是在三個月期間內(nèi)觀察到的至少兩個月的治療效果?？梢岳缡褂靡韵赂攀龅囊环N或多種方法測量反應(yīng)，包括例如受試者對他們的癥狀的主觀評價，或醫(yī)療保健提供者或看護(hù)者對受試者癥狀的評估。

如本文所使用的，“選擇反應(yīng)的受試者”，“反應(yīng)的受試者的選擇”等包括例如基于腸疾病(BD)或IBS癥狀的減少和/或遵循標(biāo)簽說明書施用產(chǎn)品(例如，利福霉素類抗生素)一段時間等，確定受試者對治療反應(yīng)。所述確定或選擇可以基于標(biāo)簽(例如，包裝或包裝說明書)說明或基于受試者對其癥狀的主觀評價或醫(yī)療保健提供者或護(hù)理者對受試者癥狀的評估。

如本文所用，“反應(yīng)者”是經(jīng)施用利福昔明用于治療本文所述的疾病，病癥或感染的受試者，其通過經(jīng)歷癥狀緩解，不適或疼痛緩解，或相對于基線的一般健康改善而作出反應(yīng)。例如，反應(yīng)者可以是經(jīng)施用利福昔明用于治療IBS的受試者，其基于每周對腹痛和糞便稠度的反應(yīng)的每天問題，在4周中的至少2周期間具有陽性反應(yīng)。在一個實施方案中，反應(yīng)者的每周平均腹痛評分減少和每周腹痛天＃減少，其中至少1次糞便的稠度大于或等于6 (根據(jù)Bristol糞便量表)，如由Rome III標(biāo)準(zhǔn)定義的。

在一些實施方案中，反應(yīng)者可以被鑒定為具有以下一種或多種的IBS-D受試者：中度腹脹和腹痛，糞便松散和/或惱人的排便緊急。例如，以下標(biāo)準(zhǔn)中的任一個可用于鑒定可能對利福昔明治療反應(yīng)的受試者：腹痛大于或等于例如2、2.5、3或3.5；腹脹大于例如2、2.5、3或3.5；糞便松散，且平均糞便稠度評分大于或等于3、3.5、4、4.5；或惱人的排便緊急，例如大于或等于3.0、3.5、4.0或4.5天排便緊急?；蛘撸瑑煞N或更多種上述標(biāo)準(zhǔn)可用于鑒定可能對利福昔明治療反應(yīng)的受試者。例如，腹痛和腹脹；腹痛和糞便松散，腹痛和惱人的排便緊急；腹痛，腹脹和糞便松散等。

反應(yīng)者也可以定義為：1)腹痛的改善≥30％，糞便稠度＜4％，每天IBS癥狀≥1分降低；2)與基線相比，在給定的一周內(nèi)腹痛改善≥30％，和松散/水樣糞便減少≥50％；3)在給定周內(nèi)使用3個最差的每天項目，平均腹痛疼痛評分從基線降低≥30％；4)與基線相比，在給定周內(nèi)，排便緊急天數(shù)減少≥30％；5)所選最差基線癥狀改善≥30％；或6)在給定周內(nèi)至少50％的天數(shù)，每天反應(yīng)者評分為0(完全沒有)或1(幾乎沒有)；或者在選定的最差基線癥狀中，在給定周內(nèi)100％的天數(shù)，每天反應(yīng)者評分為0(完全沒有)，1(幾乎沒有)或2(稍微有點)。

在具體實施方案中，如果已經(jīng)向受試者施用利福昔明并且在治療后2周被認(rèn)為是反應(yīng)者，其中治療包括施用利福昔明14天，則受試者被定義為“一個月反應(yīng)者”。

如本文所使用的，當(dāng)在4周時間內(nèi)，反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)在至少3周不存在時，受試者被認(rèn)為具有“復(fù)發(fā)”。或者，“復(fù)發(fā)”可以定義為糞便稠度，腹痛或糞便稠度和腹痛中的一種或多種的惡化。

本文提供了治療，預(yù)防或緩解疾病，病癥或感染的方法，其包括向有需要的受試者施用有效量的利福昔明。感染可以是例如由艱難梭菌引起的感染。疾病或病癥可以是例如腸相關(guān)病癥。腸相關(guān)病癥(例如腸疾病)包括以下的一種或多種：腸易激綜合征(IBS)，交替型IBS，腹瀉型腸易激綜合征(d-IBS, IBS-D)，克羅恩病，旅行者腹瀉，潰瘍性結(jié)腸炎，腸炎，小腸細(xì)菌過度生長，慢性胰腺炎，胰腺功能不全，結(jié)腸炎，憩室病，肝性腦病，與IBS和/或囊炎相關(guān)的腹痛。在一些實施方案中，腸相關(guān)病癥是肝性腦病。在一些實施方案中，腸相關(guān)病癥是IBS。在一個實施方案中，通過本文所述的方法治療的IBS是輕度，中度或重度。在具體實施方案中，IBS是嚴(yán)重的。在另一個具體實施方案中，IBS是IBS-D。

艱難梭菌是革蘭氏陽性厭氧細(xì)菌，并且被認(rèn)為是引起從輕度腹瀉到暴發(fā)性假膜性結(jié)腸炎(PMC)的一系列疾病的重要人病原體。該細(xì)菌是醫(yī)院特有的，研究表明，在急性護(hù)理醫(yī)療病房中接受抗生素治療的約三分之一的患者在醫(yī)院中被艱難梭菌定居(Kyne, L.,等人, 2002, Clin. Infect. Dis. 34(3), pp346-53, PMID: 11774082)?；加蠧DI的患者對萬古霉素的治療反應(yīng)良好。然而，使用萬古霉素是最后的手段之一，因為它與幾個問題相關(guān)。其不僅可能引起腎毒性，耳毒性，骨髓毒性和紅人綜合征，而且萬古霉素治療通常對于治療CDI無效。另外，有證據(jù)表明艱難梭菌變得至少部分地耐萬古霉素，表明在治療CDI中需要新的替代品。

因此，本文提供了治療，預(yù)防或緩解受試者中的艱難梭菌感染(CDI)的方法，其中所述方法包括向受試者施用有效量的利福昔明。在一些實施方案中，受試者是對其它治療或用利福昔明以外的抗生素治療無反應(yīng)的受試者。在一些實施方案中，受試者是對萬古霉素治療無反應(yīng)的受試者。

本文還提供了治療，預(yù)防或緩解抗生素抗性的艱難梭菌感染的方法，其包括向有需要的受試者施用利福昔明，其中施用利福昔明有效治療抗生素抗性的CDI。在本發(fā)明的實施方案中，提供了預(yù)防CDI的方法，其中所述方法包括向需要對病癥進(jìn)行抗生素治療的受試者施用非全身性抗生素。在一些實施方案中，所述病癥選自：克羅恩病，旅行者腹瀉，肝性腦病，輕微型肝性腦病，腸易激綜合征，不寧腿綜合征，皮膚感染，小腸細(xì)菌過度生長，慢性胰腺炎，胰腺功能不全，憩室炎，腸炎和結(jié)腸炎，皮膚感染，粘膜病癥，囊炎，陰道感染，肛裂，耳感染，肺部感染，牙周病癥，酒渣鼻和其它皮膚感染和/或其它相關(guān)病癥。在一些實施方案中，非全身性抗生素是利福昔明。

利福昔明可用于各種治療方案。這些方案可以根據(jù)受試者和治療的類型而變化。例如，利福昔明可以例如每天兩次，每天三次，或每天四次或根據(jù)需要更頻繁地施用。利福昔明可以以例如約2mg每天一次至約3000mg TID的劑量施用。例如，利福昔明可以以下列的日劑量施用：約5 mg- 100 mg, 約5 mg, 約10 mg, 約15 mg, 約20 mg, 約25 mg, 約30 mg, 約35 mg, 約40 mg, 約45 mg, 約50 mg, 約55 mg, 約60 mg, 約65 mg, 約70 mg, 約75 mg, 約80 mg, 約85 mg, 約90 mg, 約95 mg或約100 mg。在一些實施方案中，利福昔明可以以下列的日劑量施用：約125 mg, 約150 mg, 約175 mg, 約200 mg, 約225 mg, 約250 mg, 約275 mg, 約300 mg, 約325 mg, 約350 mg, 約375 mg, 約400 mg, 約425 mg, 約450 mg, 約475 mg或約500 mg。在一些實施方案中，利福昔明可以以下列的日劑量施用：約550 mg, 約600 mg, 約650 mg, 約700 mg, 約750 mg, 約800 mg, 約850 mg, 約900 mg, 約950 mg或約1000 mg。在一些實施方案中，利福昔明可以以下列的日劑量施用：約1100 mg, 約1200 mg, 約1300 mg, 約1400 mg, 約1500 mg, 約1600 mg, 約1700 mg, 約1800 mg, 約1900 mg, 約2000 mg, 約2100 mg, 約2200 mg, 約2300 mg, 約2400 mg, 約2500 mg, 約2600 mg, 約2700 mg, 約2800 mg, 約2900 mg或約3000 mg。在一些實施方案中，利福昔明可以以下列的劑量施用：約25 mg BID, 約30 mg BID, 約35 mg BID, 約40 mg BID, 約45 mg BID, 約50 mg BID, 約55 mg BID, 約60 mg BID, 約65 mg BID, 約70 mg BID, 約75 mg BID, 約80 mg BID, 約85 mg BID, 約90 mg BID, 約95 mg BID或約100 mg BID。在一些實施方案中，利福昔明可以以下列的劑量施用：約125 mg BID, 約150 mg BID, 約175 mg BID, 約200 mg BID, 約225 mg BID, 約250 mg BID, 約275 mg BID, 約300 mg BID, 約325 mg BID, 約350 mg BID, 約375 mg BID, 約400 mg BID, 約425 mg BID, 約450 mg BID, 約475 mg BID或約500 mg BID。在一些實施方案中，利福昔明可以以下列的劑量施用：約550 mg BID, 約600 mg BID, 約650 mg BID, 約700 mg BID, 約750 mg BID, 約800 mg BID, 約850 mg BID, 約900 mg BID, 約950 mg BID或約1000 mg BID。在一些實施方案中，利福昔明可以以下列的劑量施用：約1100 mg BID, 約1200 mg BID, 約1300 mg BID, 約1400 mg BID, 約1500 mg BID, 約1600 mg BID, 約1700 mg BID, 約1800 mg BID, 約1900 mg BID, 約2000 mg BID, 約2100 mg BID, 約2200 mg BID, 約2300 mg BID, 約2400 mg BID, 約2500 mg BID, 約2600 mg BID, 約2700 mg BID, 約2800 mg BID, 約2900 mg BID或約3000 mg BID。在一些實施方案中，利福昔明可以以下列的劑量施用：約25 mg TID, 約30 mg TID, 約35 mg TID, 約40 mg TID, 約45 mg TID, 約50 mg TID, 約55 mg TID, 約60 mg TID, 約65 mg TID, 約70 mg TID, 約75 mg TID, 約80 mg TID, 約85 mg TID, 約90 mg TID, 約95 mg TID或約100 mg TID。在一些實施方案中，利福昔明可以以下列的劑量施用：約125 mg TID, 約150 mg TID, 約175 mg TID, 約200 mg TID, 約225 mg TID, 約250 mg TID, 約275 mg TID, 約300 mg TID, 約325 mg TID, 約350 mg TID, 約375 mg TID, 約400 mg TID, 約425 mg TID, 約450 mg TID, 約475 mg TID或約500 mg TID。在一些實施方案中，利福昔明可以以下列的劑量施用：約550 mg TID, 約600 mg TID, 約650 mg TID, 約700 mg TID, 約750 mg TID, 約800 mg TID, 約850 mg TID, 約900 mg TID, 約950 mg TID或約1000 mg TID。在一些實施方案中，利福昔明可以以下列的劑量施用：約1100 mg TID, 約1200 mg TID, 約1300 mg TID, 約1400 mg TID, 約1500 mg TID, 約1600 mg TID, 約1700 mg TID, 約1800 mg TID, 約1900 mg TID, 約2000 mg TID, 約2100 mg TID, 約2200 mg TID, 約2300 mg TID, 約2400 mg TID, 約2500 mg TID, 約2600 mg TID, 約2700 mg TID, 約2800 mg TID, 約2900 mg TID或約3000 mg TID。利福昔明可以例如以片劑形式，粉末形式，液體形式或膠囊形式施用。在一些實施方案中，利福昔明可以以時間釋放的制劑施用。

在一些實施方案中，利福昔明作為可溶性固體分散體施用。例如，利福昔明可以以約2mg至550mg的利福昔明的可溶性固體分散體施用。

在一些實施方案中，向受試者施用利福昔明持續(xù)約1周至約6周，持續(xù)約8周至約12周，或持續(xù)約1天至約21天。在一個實施方案中，施用利福昔明10天。利福昔明可以在約1天至約1年，或1周至約52周施用。利福昔明可以在治療過程中間歇地或連續(xù)地施用。治療的時間長度可以根據(jù)疾病的類型和時間長度而變化，并且受益于本公開的本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定適當(dāng)?shù)闹委煏r間長度。

對于任何實施方案，可以向受試者施用利福昔明，例如每天一次，每天兩次，每天三次，或每天四次(或者對于特定受試者而言根據(jù)需要更頻繁地)。在一些實施方案中，所述方法包括每天一次向受試者施用利福昔明，因為其可以例如使副作用最小化并增加患者依從性。在一些實施方案中，利福昔明每天施用兩次和/或三次。

根據(jù)某些優(yōu)選的實施方案，劑量范圍為每天施用約50至約6000mg的利福昔明。例如，可以向受試者每天三次施用400mg的劑量，或者可以每天兩次向受試者施用550mg的劑量，或者可以每天三次施用550mg劑量。本文公開的方法的其它合適劑量可以由保健專業(yè)人員或受試者確定。每天施用的利福昔明的量可以基于受試者的體重，年齡，健康，性別或醫(yī)學(xué)狀況而增加或減少。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠基于本公開確定受試者的適當(dāng)劑量。

雖然以前已經(jīng)注意到(Bajaj JS等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.2012; 302(1)：G168-G175)，患者的微生物組，認(rèn)知不良和炎癥標(biāo)記物與肝硬化和HE之間存在相關(guān)性；以及大多數(shù)認(rèn)知測試的損傷與肝硬化患者中的產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligeneceae)和卟啉單孢菌科(Porphyromonadaceae)分類群的相對豐度之間存在相關(guān)性，以及(Bajaj JS等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.2012; 303(6)：G675-G685)在具有HE病史的患者中，利福昔明維持治療對粘膜腸微生物群有影響(利福昔明組中自身細(xì)菌和榮球菌科(Veillonellaceae)的豐度減少，但是丙酸桿菌的豐度增加)，本文令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，存在特定細(xì)菌，其在受試者預(yù)治療中存在或不存在可預(yù)測IBS中對利福昔明治療的反應(yīng)和無反應(yīng)。

本文提供診斷IBS的方法。

在某些實施方案中，方法還包括診斷將對IBS治療反應(yīng)的受試者。

在某些實施方案中，方法還包括診斷對IBS的利福昔明治療反應(yīng)的受試者。

在某些實施方案中，方法還包括診斷將對IBS的利福昔明治療和再治療反應(yīng)的受試者。

在某些實施方案中，治療包括550mg利福昔明TID持續(xù)14天。

在某些實施方案中，再治療包括在第一次或其它治療復(fù)發(fā)后550mg利福昔明TID持續(xù)14天。

所述方法包括確定胃腸(GI)道中細(xì)菌群落(例如，群體)的身份。

所述方法包括確定胃腸(GI)道中細(xì)菌群落的身份和流行性。

在某些實施方案中，微生物組是胃腸道微生物組。在某些實施方案中，微生物組是胃腸道微生物組。在某些實施方案中，微生物組是由糞便細(xì)菌群體代表的胃腸道微生物組。

所述方法包括測定胃腸(GI)道中的細(xì)菌的身份。

所述方法包括通過宏基因組學(xué)分析微生物組。

所述方法包括分析胃腸(GI)道微生物組中的細(xì)菌群落的身份以產(chǎn)生細(xì)菌群落的多樣性概況。

所述方法包括通過宏基因組學(xué)確定胃腸(GI)道GI微生物組的身份，流行性和多樣性。

所述方法包括通過宏基因組學(xué)分析胃腸(GI)微生物組。

所述方法包括確定皮膚，鼻和胃腸道的一個或多個上的細(xì)菌的身份。

所述方法包括通過宏基因組學(xué)確定皮膚，鼻和胃腸道的一個或多個上的細(xì)菌的身份。

所述方法包括確定皮膚，鼻和胃腸道的一個或多個上的細(xì)菌的身份和流行性。

本文提供了治療受試者的IBS的方法，包括使用例如宏基因組學(xué)來確定和/或檢測和/或分析受試者的GI道微生物組。

在某些實施方案中，所述方法包括治療受試者的IBS，包括通過宏基因組學(xué)確定和/或檢測和/或分析受試者的GI道微生物組。

在某些實施方案中，所述方法包括向具有特定細(xì)菌的受試者施用利福昔明，對于該特定細(xì)菌，反應(yīng)者對藥物的相對豐度被確定為高于無反應(yīng)者的相對豐度。

在某些實施方案中，微生物組是胃腸道微生物組。在某些實施方案中，微生物組是胃腸道細(xì)菌群體。在某些實施方案中，微生物組是由糞便細(xì)菌群體代表的胃腸道細(xì)菌群體。

在某些實施方案中，檢測包括分析16S rRNA基因。

在某些實施方案中，分析16S rRNA基因的V4超變區(qū)。

在某些實施方案中，表1中分類群的分析和檢測(其平均反應(yīng)者數(shù)目高于平均無反應(yīng)者數(shù)目)表明受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，表1中分類群的分析和確定的不存在(其平均反應(yīng)者數(shù)目低于平均無反應(yīng)者數(shù)目)表明受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，表1中分類群的分析和檢測(其平均無反應(yīng)者數(shù)目高于平均反應(yīng)者數(shù)目)表明受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，表1中分類群的分析和確定的不存在(其中平均無反應(yīng)者數(shù)目低于平均反應(yīng)者數(shù)目)，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果細(xì)菌種類(其平均反應(yīng)者數(shù)目高于平均無反應(yīng)者數(shù)目)確定為存在的，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果細(xì)菌種類(其平均反應(yīng)者數(shù)目低于平均無反應(yīng)者數(shù)目)確定為不存在的，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果細(xì)菌種類(其平均無反應(yīng)者數(shù)目高于平均反應(yīng)者數(shù)目)確定為存在的，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果細(xì)菌種類(其平均無反應(yīng)者數(shù)目低于平均反應(yīng)者數(shù)目)確定為不存在的，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果Sutterellacae在平均無反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果Sutterellacae在平均無反應(yīng)者中以顯著較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果鞘氨醇桿菌科在平均反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果鞘氨醇桿菌科在平均反應(yīng)者中以顯著較大的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果葉桿菌科在平均反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果葉桿菌科在平均反應(yīng)者中以顯著較大的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果熱厭氧桿菌科在平均無反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果熱厭氧桿菌科在平均無反應(yīng)者中以顯著較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)在平均無反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)在平均無反應(yīng)者中以顯著較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果黃桿菌科在平均反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果黃桿菌科在平均反應(yīng)者中以顯著較大的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果Sutterellacae，熱厭氧桿菌科或分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一種或多種在平均無反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果Sutterellacae，熱厭氧桿菌科或分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一種或多種在平均無反應(yīng)者以顯著較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科或黃桿菌科中的一種或多種以大于平均反應(yīng)者的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科或黃桿菌科中的一種或多種以顯著大于平均反應(yīng)者的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果Sutterellacae，熱厭氧桿菌科或分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一種或多種在平均無反應(yīng)者中以較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)和/或如果鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科或黃桿菌科中的一種或多種以大于平均反應(yīng)者的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果Sutterellacae，熱厭氧桿菌科或分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一種或多種在平均無反應(yīng)者中以顯著較大的量存在，則受試者不會對治療反應(yīng)和/或如果鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科，或黃桿菌科中的一種或多種以顯著大于平均反應(yīng)者的量存在，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果存在Sutterellaacae，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果存在鞘氨醇桿菌科，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果存在葉桿菌科，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果存在熱厭氧桿菌科，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果存在分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果存在黃桿菌科，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果存在Sutterellacae，熱厭氧桿菌科或分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一種或多種，則受試者不會對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果存在鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科或黃桿菌科中的一種或多種，則受試者將對治療反應(yīng)。

在某些實施方案中，如果存在Sutterellacae，熱厭氧桿菌科或分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)中的一種或多種，則受試者不會對治療反應(yīng)和/或如果存在鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科或黃桿菌科中的一種或多種，則受試者將對治療反應(yīng)。

本文還提供了提供IBS治療的預(yù)后的方法。

本文提供選擇用利福昔明治療的受試者的方法。

本文提供診斷或治療受試者的腸易激綜合征(IBS)的方法。該方法包括分析受試者的樣品中一種或多種細(xì)菌的存在或不存在，所述細(xì)菌屬于平均反應(yīng)者數(shù)目高于平均無反應(yīng)者數(shù)目的分類群，其中如果檢測到所述細(xì)菌，則受試者將對利福昔明反應(yīng)，并且其中所述受試者的樣品包括來自所述受試者的胃腸微生物群；和給受試者施用利福昔明。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，利福昔明以550mg每天三次持續(xù)14天的給藥方案施用。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法還包括在與IBS相關(guān)的一種或多種癥狀復(fù)發(fā)后重復(fù)給藥方案。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述一種或多種癥狀包括腹痛或松散或水樣糞便。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法還包括在一周內(nèi)松散或水樣糞便的每天數(shù)量增加50％或更多后重復(fù)給藥方案。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，樣品是糞便樣品。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，通過從樣品分離的細(xì)菌DNA，更具體地16S rRNA基因或16S rRNA基因的V4超變區(qū)的基因組分析來確定所述細(xì)菌存在或不存在。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，通過擴(kuò)增16S rRNA基因的V4超變區(qū)并測序V4超變區(qū)的擴(kuò)增序列來確定細(xì)菌的存在或不存在。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，通過細(xì)菌培養(yǎng)，任選地與基因組分析組合來確定細(xì)菌的存在或不存在。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述一種或多種細(xì)菌屬于選自下組的一個或多個分類群：Sutterellaceae，鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科，熱厭氧桿菌科，分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)和黃桿菌科。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述一種或多種細(xì)菌屬于選自下組的一個或多個分類群：Sutterellaceae，熱厭氧桿菌科，和分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述一種或多種細(xì)菌屬于選自下組的一個或多個分類群：鞘氨醇桿菌科(Sphingobacteriaceae)，葉桿菌科和黃桿菌科。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，基于對施用550mg利福昔明TID 14天的患者的胃腸微生物群數(shù)據(jù)集的監(jiān)督分類來確定平均反應(yīng)者數(shù)目和平均無反應(yīng)者數(shù)目。

本文提供了治療腸易激綜合征(IBS)的方法，所述方法包括將利福昔明施用給已知具有一種或多種屬于平均反應(yīng)者數(shù)目高于平均無反應(yīng)者數(shù)目的分類群的細(xì)菌的受試者，其中利福昔明以550mg每天三次持續(xù)14天的給藥方案施用給受試者。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法還包括在與IBS相關(guān)的一種或多種癥狀復(fù)發(fā)后重復(fù)給藥方案，例如，不排除地，腹痛和/或松散或水樣糞便。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法還包括在一周內(nèi)松散或水樣糞便的每天數(shù)量增加50％或更多后重復(fù)給藥方案。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述一種或多種細(xì)菌屬于選自下組的一個或多個分類群：Sutterellaceae，鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科，熱厭氧桿菌科，分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)和黃桿菌科。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述一種或多種細(xì)菌屬于選自下組的一個或多個分類群：Sutterellaceae，熱厭氧桿菌科，和分類位置未定的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales incertae sedis)。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，所述一種或多種細(xì)菌屬于選自下組的一個或多個分類群：鞘氨醇桿菌科，葉桿菌科和黃桿菌科。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，基于對施用550mg利福昔明TID 14天的患者的胃腸微生物群數(shù)據(jù)集的監(jiān)督分類來確定平均反應(yīng)者數(shù)目和平均無反應(yīng)者數(shù)目。

本文還提供了在受試者中治療腹瀉型IBS(d-IBS)的方法，所述方法包括以550mg利福昔明每天三次(TID)的給藥方案向受試者施用利福昔明，持續(xù)14天；和在一周內(nèi)松散或水樣糞便的每天數(shù)量增加50％或更多后重復(fù)給藥方案。

本文還提供了通過分析受試者的樣品中細(xì)菌的存在或不存在來診斷受試者中利福昔明反應(yīng)性IBS的方法，所述細(xì)菌具有高于平均無反應(yīng)者數(shù)目的平均反應(yīng)者數(shù)目，其中如果檢測到所述細(xì)菌，則所述受試者診斷為患有利福昔明反應(yīng)性IBS，并且其中受試者的樣品含有來自受試者的胃腸微生物群。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，IBS是d-IBS。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，樣品是糞便樣品。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，通過從樣品分離的細(xì)菌DNA的基因組分析，例如通過分析16S rRNA基因，例如通過分析16S rRNA基因的V4超變區(qū)來確定細(xì)菌的存在或不存在。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，通過擴(kuò)增16S rRNA基因的V4超變區(qū)并測序V4超變區(qū)的擴(kuò)增序列來確定細(xì)菌的存在或不存在。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，通過細(xì)菌培養(yǎng)，任選地與基因組分析組合來確定細(xì)菌的存在或不存在。

在本文所述的本發(fā)明的一些實施方案中，基于對施用550mg利福昔明TID持續(xù)14天的患者的胃腸微生物群數(shù)據(jù)集的監(jiān)督分類來確定所述平均反應(yīng)者數(shù)目和平均無反應(yīng)者數(shù)目。

實施例

應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不應(yīng)解釋為限于現(xiàn)在描述的實施例；相反，本發(fā)明應(yīng)解釋為包括本文提供的任何和所有應(yīng)用以及普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)的所有等效變化。

實施例1

一項研究，檢查了在所有收集時間的糞便樣品，在組成和多樣性方面表征腸道微生物群。(圖1顯示了研究設(shè)計并定義了V3，V4，V6時間點)。在研究期間，受試者分別在基線和開放標(biāo)簽利福昔明550mg TID兩周后提供糞便樣品；在使用利福昔明550mg TID或安慰劑雙盲再治療兩周之前和之后立即提供糞便樣品，并在研究結(jié)束時提供糞便樣品。將糞便樣品在聚丙烯冷凍管中分成2-mL等分試樣，在≤-20℃下在臨床地點存儲，在干冰上運(yùn)輸并且在≤-70℃下長期儲存。

從糞便樣品中分離細(xì)菌DNA，并使用利用Illumina HiSeq2000測序技術(shù)的兩步PCR擴(kuò)增16S rRNA基因的V4超變區(qū)。

設(shè)計測序反應(yīng)，使得正向和反向配對的Illumina讀數(shù)不重疊。正向和反向讀數(shù)作為技術(shù)重復(fù)用獨立分析處理。

通過兩種方法分析序列。

OTU(操作分類單位)，其是具有平均97％同一性的序列簇。

測序樣品數(shù)：

治療2(V3) 101

治療2結(jié)束(V4) 102

治療3(V6) 69

治療3結(jié)束(V7) 72

隨訪/研究結(jié)束 96

共有449個樣品* 2個配對端

通過RDP pipeline以50％置信度歸為每個分類水平的序列數(shù)

圖2顯示了具有449個樣品2個配對端的排序圖。根據(jù)就診日期沒有明顯的聚類。

圖3是根據(jù)反應(yīng)者/無反應(yīng)者狀態(tài)的聚類。

在治療之前，反應(yīng)者具有比無反應(yīng)者更低的多樣性。減少的分類群是IBS的可能原因

在治療期間，利福昔明主要通過影響低豐度分類群暫時抑制多樣性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)利福昔明在治療IBS中是有效的。令人驚訝的是，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了用于預(yù)測將從IBS的利福昔明治療中獲益的受試者的方法。

本文使用微生物群落的分析作為反應(yīng)者狀態(tài)的預(yù)測因子。

基于該研究，表1顯示了根據(jù)分類群的平均反應(yīng)者和無反應(yīng)者數(shù)目。可以看出，當(dāng)平均反應(yīng)者數(shù)目高于平均無反應(yīng)者數(shù)目確定為存在時，則受試者將對治療反應(yīng)。在某些實施方案中，如果表1中的分類群，其中平均反應(yīng)者數(shù)目低于平均無反應(yīng)者數(shù)目確定為不存在的，則受試者將對治療反應(yīng)。

因此，來自表1的這些分類群將來自V3數(shù)據(jù)的反應(yīng)者與無反應(yīng)者區(qū)分開。

表1：

標(biāo)記物通常具有相當(dāng)?shù)偷呢S度(參見圖6)。使用監(jiān)督分類以從V3數(shù)據(jù)區(qū)分反應(yīng)者與無反應(yīng)者。

在研究中，有數(shù)據(jù)顯示微生物群落的長期恢復(fù)力。

實施例2

GI微生物群表征

在這項研究中，我們檢查了研究群體的大約10％中在所有收集時間的糞便樣品，并在組成和多樣性方面表征腸道微生物群。

在研究期間，受試者在就診3和4(分別在基線和開放標(biāo)簽利福昔明550mg TID兩周[治療2]后)，就診6和7(在利福昔明550mg TID或安慰劑的雙盲再治療[治療3]兩周之前和之后立即)，和就診11(研究結(jié)束)提供糞便樣品。從糞便樣品中分離細(xì)菌DNA，并使用利用Illumina HiSeq2000測序技術(shù)的兩步PCR擴(kuò)增16S rRNA基因的V4超變區(qū)。

設(shè)計測序反應(yīng)，使得正向和反向配對的Illumina讀數(shù)不重疊。因此，正向和反向讀數(shù)將作為技術(shù)重復(fù)處理，并在我們的pipeline中進(jìn)行獨立分析，以確保我們的結(jié)論不依賴于利用16S rRNA基因的任何特定亞區(qū)。

除去所有非微生物序列，具有低質(zhì)量評分的序列和與預(yù)期引物序列不具有精確匹配的序列。通過兩種方法分析序列。程序AbundantOTU將被用于以不依賴于數(shù)據(jù)庫的方式執(zhí)行序列的從頭聚類。

在IBS-D重復(fù)治療研究TARGET 3中利福昔明對腸微生物群的影響通過兩種方法評估：傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)和在試驗中從約100個隨機(jī)選擇的受試者收集的糞便樣品的下一代基因測序。還從另外113個隨機(jī)選擇的受試者獲得皮膚拭子，并培養(yǎng)葡萄球菌細(xì)菌。

使用下一代16S rRNA基因測序方法，我們從約100個隨機(jī)選擇的受試者在研究過程中收集的糞便樣品產(chǎn)生約22億個堿基對。數(shù)據(jù)顯示，根據(jù)多樣性(參見表2)和Bray-Curtis相似性(參見表3)量度，與采用單一療程的利福昔明接著在試驗剩余部分采用安慰劑的受試者相比，采用利福昔明重復(fù)療程的受試者中的糞便微生物群沒有受到干擾。

培養(yǎng)和易感性試驗的結(jié)果證明，沒有證明表明在從糞便或皮膚拭子培養(yǎng)物生長的分離株中對非利福霉素抗生素的交叉抗性。利福昔明的重復(fù)治療過程顯示不會使患者對糞便或皮膚上潛在病原菌(例如艱難梭菌，腸球菌或葡萄球菌)的出現(xiàn)易感?？紤]到在糞便中獲得的高濃度的利福昔明，在一些正常菌群中觀察到利福昔明最小抑制濃度(MIC，微生物對抗生素的敏感性的量度)的瞬時變化，但這些變化隨時間可逆。在糞便樣品中鑒定了非常少量的艱難梭菌分離株，該比率與一般群體中無癥狀攜帶者的文獻(xiàn)報道一致，并且這些分離株中沒有一個顯示利福昔明抗性。

這是目前IBS患者中最全面的微生物組數(shù)據(jù)集，收集了超過20億個數(shù)據(jù)點?？v向樣品證明重復(fù)利福昔明給藥的微生物組穩(wěn)定性(參見圖a)，并且在利福昔明重復(fù)使用時，對于潛在主要病原體的抗生素易感性的改變不明顯。

實施例3

GI細(xì)菌培養(yǎng)和抗性

在本研究中，(參見圖1的研究設(shè)計)，我們檢查了研究群體中的在所有收集時間的糞便樣品，并且我們還表征了糞便微生物群(包括革蘭氏陰性桿菌和艱難梭菌)對臨床重要的抗生素的易感性。如對于微生物群研究所述收集糞便樣品。

將來自所選受試者的糞便等分試樣接種到具有5％綿羊血液的胰蛋白酶大豆瓊脂平板上以鑒定需氧生物體。將需氧板在34-36℃與5-7％CO₂孵育24小時或在所需條件下孵育。將厭氧生物體的糞便等分試樣接種到環(huán)絲氨酸頭孢西丁果糖瓊脂或擬桿菌膽汁七葉苷瓊脂上，用于選擇艱難梭菌和擬桿菌種類。在厭氧條件下接種厭氧平板，并從糞便樣品接種另外的樣品。將厭氧平板在34-36℃下在厭氧條件(例如，厭氧室)下孵育48小時。

用受試者的標(biāo)本將糞便樣品接種在瓊脂板的第一象限上。使用標(biāo)準(zhǔn)接種方法，將樣品劃線穿過瓊脂平板的互連象限以分離細(xì)菌菌落。使用1+，2+，3+和4+的半定量標(biāo)準(zhǔn)評價瓊脂平板的生長。標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于接種的瓊脂平板的四分位分法而定義。使用肉湯微量稀釋法測試需氧分離株對一組抗生素的易感性。使用瓊脂稀釋法測試厭氧分離株對一組抗生素的易感性。

分離并測試抗菌素易感性的每種細(xì)菌被分組成更大類，即腸桿菌科，腸球菌科，擬桿菌科，葡萄球菌科，梭菌科或假單胞菌科。所研究的腸桿菌科包括埃希氏菌屬，克雷伯氏菌屬，變形菌屬，腸桿菌屬和檸檬酸桿菌屬的成員。通過就診來匯編治療組(雙盲(DB)安慰劑，DB利福昔明，開放標(biāo)簽(OL)利福昔明)中每個受試者的MIC數(shù)據(jù)，以確定治療群體的MIC范圍。抑制≥50％的分離株的MIC濃度是群體的MIC50。MIC90值表示抑制≥90％群體的MIC值。

對于對特定細(xì)菌種類具有CLSI限定的分割點的所有抗生素(M100-S24)，使用那些分割點解釋MIC值。然而，對于該分析，如果抗生素定義了敏感和中間類別，則兩者都被分類為敏感的。如果沒有為抗生素確定分割點，但抗生素產(chǎn)品標(biāo)簽指出了體外易感性的范圍，則那些值用于分類MIC。在所有其它情況下，在MIC組中測試的最高稀釋度或以上的MIC值被認(rèn)為是抗性的，并且低于最高稀釋度的MIC值被認(rèn)為是敏感的。

從RFIB3053中測試的糞便樣品中分離的細(xì)菌總結(jié)如下。

革蘭氏陰性

大腸桿菌

克雷伯氏菌

假單胞菌屬

腸桿菌屬

沙雷氏菌屬

變形桿菌屬

擬桿菌屬

革蘭氏陽性

腸球菌屬

葡萄球菌屬

艱難梭菌

使用以下抗生素，通過肉湯微量稀釋(對需氧細(xì)菌)和通過瓊脂稀釋(對厭氧細(xì)菌)進(jìn)行敏感性測試：

利福昔明 - 厭氧菌

利福平 - 厭氧菌

萬古霉素 - 厭氧菌

非達(dá)霉素-厭氧菌

甲硝唑 - 厭氧菌

利福昔明 - 需氧菌

利福平 - 需氧菌

頭孢他啶 - 需氧菌

頭孢曲松 - 需氧菌

環(huán)丙沙星 - 需氧菌

亞胺培南 - 需氧菌，

美羅培南 - 需氧菌，

哌拉西林/三唑巴坦 - 需氧菌

從分離的糞便培養(yǎng)物中分離的主要細(xì)菌家族是擬桿菌科(525個分離株，占總分離株的36.7％)，腸桿菌科(484個分離株，代表總分離株的33.9％)和腸球菌科(286個分離株，占總分離株的20％)。在各就診中，不管治療組，從糞便培養(yǎng)了22個艱難梭菌分離株。艱難梭菌占總培養(yǎng)細(xì)菌的1.5％。葡萄球菌分離株僅占總分離株的約6.4％。

在研究的OL期登記并接受治療2的受試者在第1天總共有336個從糞便培養(yǎng)的分離株。腸桿菌科(124個分離株)和擬桿菌科(122個分離株)家族占分離株的大部分。在第1天，葡萄球菌占總分離株的18個(5.4％)。在第1天鑒定出艱難梭菌的四個分離株。該分離株比例在整個OL期保持一致，艱難梭菌和假單胞菌分離株是罕見的，并且在就診中偶發(fā)培養(yǎng)。

在DB期的第1天，從登記在安慰劑組的受試者的糞便中鑒定出113個分離株，并且從登記在利福昔明治療組中的受試者中鑒定出131個分離株。與OL期一樣，來自擬桿菌科和腸桿菌科的細(xì)菌代表了兩組中從糞便培養(yǎng)的大多數(shù)分離株。在第1天在安慰劑治療的受試者中發(fā)現(xiàn)兩種艱難梭菌分離株，在第1天隨機(jī)化接受利福昔明的受試者中鑒定出4個艱難梭菌分離株。在用利福昔明或安慰劑治療2周后，在2個治療組中分離相似數(shù)目的細(xì)菌。在第2周，從安慰劑治療的受試者的糞便中回收了2個艱難梭菌分離株，并從利福昔明治療的受試者中回收了1個分離株。在整個隨訪期間，分離株的相對百分比與在第1天和第2周觀察到的一致。在隨訪期間在利福昔明治療的受試者中沒有發(fā)現(xiàn)艱難梭菌分離株，而在隨訪期間從安慰劑治療的受試者中培養(yǎng)5個艱難梭菌分離株。

從14個受試者中分離出7個酵母菌株，總共17個酵母分離株?？傮w上，酵母培養(yǎng)物代表從糞便分離的培養(yǎng)物的1.2％(1429個總培養(yǎng)物，包括細(xì)菌和酵母)。從利福昔明治療前取得的治療2樣品培養(yǎng)4個分離株。只有一個受試者在多次就診時分離了酵母。

在培養(yǎng)生物體的能力和對利福昔明，利福平和非利福霉素抗生素的易感性方面，本文所述研究中的利福昔明治療顯示出對糞便微生物群具有很小的影響。除了在治療組中培養(yǎng)的生物體數(shù)目的一些微小變化外，利福昔明治療沒有出現(xiàn)過度生長。此外，存在從糞便培養(yǎng)的最少酵母分離株，符合正常的傳播模式。

用從糞便培養(yǎng)的葡萄球菌分離株觀察到利福昔明和利福平的MIC值的瞬時增加。在OL期的治療2結(jié)束時和在DBR期的治療3結(jié)束時觀察到MIC的增加。在隨訪(其根據(jù)受試者返回的時間分組)中，葡萄球菌的MIC返回到基線，因為自從最后一次利福昔明治療以來的時間增加。雖然利福昔明對某些物種(例如擬桿菌)的MIC50或MIC90有一些增加，但是增加均在基線時報告的MIC范圍內(nèi)。對于腸桿菌科，MIC50在RFIB3053中增加1至2倍稀釋，快速恢復(fù)至基線易感性水平。這種在糞便中的快速恢復(fù)與來自糞便的利福昔明抗性細(xì)菌，特別是需氧細(xì)菌快速消失(其似乎迅速恢復(fù))的報道一致。連同觀察到的MIC的最小變化，從糞便培養(yǎng)的潛在病原體的數(shù)量沒有增加。在糞便細(xì)菌對其它抗生素的易感性方面沒有明顯的治療相關(guān)作用，鑒于利福昔明抗性的機(jī)制這是可以預(yù)期的。利福昔明和其它利福霉素抗生素是細(xì)菌RNA合成的抑制劑，其通過結(jié)合細(xì)菌DNA依賴性RNA聚合酶的β亞基而起作用。對利福霉素類的細(xì)菌抗性的已知機(jī)制，編碼聚合酶的基因的突變是染色體介導(dǎo)的，而不是質(zhì)粒介導(dǎo)的。已知突變在rpoB基因的兩個特異性位點中以最高頻率發(fā)生，并導(dǎo)致抗性但次最佳功能的酶。因此，對其它抗生素類的交叉抗性受到質(zhì)粒轉(zhuǎn)移缺乏的限制，并且利福昔明具有低的將抗性擴(kuò)散至非利福霉素抗生素的風(fēng)險。

在本文所述的研究中，在來自糞便樣品的培養(yǎng)物中僅鑒定了對葡萄球菌物種的瞬時抗性，并且未觀察到對非利福霉素抗生素的交叉抗性。當(dāng)利福昔明治療停止時，利福昔明和利福平的MIC值的瞬時增加迅速恢復(fù)，支持沒有藥物壓力下的缺乏突變適應(yīng)性的證據(jù)。對于在糞便中培養(yǎng)的任何細(xì)菌，沒有證據(jù)表明利福昔明介導(dǎo)的對任何測試的非利福霉素抗生素的交叉抗性。此外，雖然在糞便中培養(yǎng)的葡萄球菌的MIC瞬時增加，但它們隨時間可逆。其它細(xì)菌的敏感性似乎不受利福昔明治療的影響。在IBS患者中使用利福昔明單次或重復(fù)治療療程后沒有增加的感染率，這與利福昔明用于治療IBS的長期安全性和功效一致。

利福昔明治療導(dǎo)致針對葡萄球菌的MIC瞬時增加。這種MIC增加在利福昔明治療中斷后迅速恢復(fù)，因此不能長期維持。換句話說，利福昔明對微生物對其或其它抗生素的易感性不具有長期效應(yīng)。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在重復(fù)治療中利福平MIC和MIC的變化與利福昔明的相當(dāng)。總體而言，在研究的OL和DB期，利福平具有MIC的瞬時升高和對細(xì)菌例如葡萄球菌的抗性，該抗性在中斷利福昔明治療時恢復(fù)。沒有觀察到與其它抗生素的模式。

本文提供的是來自3期研究的糞便培養(yǎng)物和抗生素易感性數(shù)據(jù)的預(yù)期評估。該數(shù)據(jù)證明，總體上沒有證據(jù)表明，與從受試者培養(yǎng)的糞便樣品中的安慰劑相比，病原體(例如艱難梭菌)的水平增加。所有培養(yǎng)的艱難梭菌在易感性試驗期間對利福昔明高度敏感。沒有證據(jù)表明，對于在糞便中培養(yǎng)的任何細(xì)菌，利福昔明介導(dǎo)的對測試的任何非利福霉素抗生素的交叉抗性。盡管在糞便中培養(yǎng)的葡萄球菌的利福昔明最小抑制濃度暫時增加，但它們隨時間可逆。其它細(xì)菌的敏感性不受利福昔明治療的影響。

令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，利福昔明的重復(fù)治療過程不會使患者對糞便的潛在病原菌(例如艱難梭菌，腸球菌或葡萄球菌)的出現(xiàn)易感。在糞便樣品中鑒定了非常少量的艱難梭菌分離株，該比率與一般群體中無癥狀攜帶者的文獻(xiàn)報道一致，并且這些分離株中沒有一個顯示利福昔明抗性。考慮到在糞便中獲得的高濃度的利福昔明，在一些正常菌群中觀察到利福昔明最小抑制濃度(MIC，微生物對抗生素的敏感性的量度)的瞬時變化，但這些變化隨時間可逆。

實施例4

皮膚拭子

在這項伴隨腹瀉的腸易激綜合征(IBS-D)患者的研究中，我們描述了來自IBS-D患者的皮膚拭子樣品培養(yǎng)的葡萄球菌菌株的生長和抗生素易感性。

對于皮膚拭子研究，在以下每次就診時對受試者亞群(約10％的研究群體)進(jìn)行皮膚拭子收集：就診3和4(分別在基線和開放標(biāo)簽利福昔明550mg TID兩周[治療2]后)，就診6和7(在利福昔明550mg TID或安慰劑的雙盲再治療[治療3]兩周之前和之后立即)，和就診11(研究結(jié)束)。對于本研究中的每個受試者，從直腸周圍，鼻孔，手掌和前臂收集皮膚拭子，并且將拭子在含有介質(zhì)的管中在環(huán)境溫度下立即運(yùn)送到微生物學(xué)實驗室。進(jìn)行皮膚拭子培養(yǎng)以分離所有葡萄球菌種類。

在開放標(biāo)簽(OL)利福昔明期間(治療2)，所有受試者接受利福昔明。對利福昔明治療反應(yīng)的受試者有資格參加本研究的雙盲(DB)再治療期。為了評估利福昔明單次治療的效果而沒有潛在再治療的并發(fā)癥，對于參與研究的DB期的受試者，來自治療3開始的其皮膚拭子樣品用作研究的開放標(biāo)簽期的“研究結(jié)束”樣品。

將參與研究的DB期的受試者隨機(jī)化以接受利福昔明或安慰劑。在治療3就診，EOT3就診和EOS就診時比較受試者。

使用以下程序收集拭子：

?左下臂和右下臂的皮膚：下臂用單個棉簽擦拭，總共用大約10次擦拭。使棉簽隨著每次擦拭旋轉(zhuǎn)，使得棉簽的所有側(cè)面暴露于皮膚。一個棉簽用于各手臂。

?手掌：手的整個手掌被擦拭，旋轉(zhuǎn)棉簽，使所有側(cè)面暴露于皮膚。兩個手掌都用相同的棉簽擦拭。

?鼻孔：將棉簽的尖端小心地插入每個鼻孔，并旋轉(zhuǎn)兩次。注意確保棉簽沒有深插入到鼻孔中，因為棉簽僅用于對外部鼻孔取樣。對于每個鼻孔，棉簽沒有插入超過約?英寸。使用相同的棉簽對兩個鼻孔取樣。

?直腸周圍：將棉簽在直腸區(qū)域周圍用力擦拭，并且隨著每次擦拭旋轉(zhuǎn)，以確保棉簽的所有側(cè)面暴露于皮膚。棉簽沒有插入直腸，并且僅在直腸的外側(cè)周圍擦拭。

在微生物學(xué)實驗室收到時，將每個皮膚拭子涂布在含有5％綿羊血液的胰蛋白酶大豆瓊脂和具有5％綿羊血液的Columbia-粘菌素萘啶酸瓊脂上，以選擇革蘭氏陽性菌落。將樣品拭子接種在瓊脂平板的第一象限上。使用標(biāo)準(zhǔn)接種方法，將樣品劃線穿過瓊脂平板的互連象限以分離細(xì)菌菌落。將接種的平板在35℃下在5-7％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在24和48小時檢查平板中的細(xì)菌生長。使用1+，2+，3+和4+的半定量標(biāo)準(zhǔn)評價瓊脂平板的生長。標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合接種的瓊脂平板的四分位分法而定義。

皮膚拭子分離株的培養(yǎng)和易感性試驗

使用肉湯微量稀釋法測試葡萄球菌分離株對一組抗生素的易感性。對于最小抑制濃度(MIC)測定，從繼代培養(yǎng)平板中選擇約3至5個分離的菌落以產(chǎn)生根據(jù)CLSI指南接近0.5 McFarland標(biāo)準(zhǔn)品的懸浮液。在接種孵育平板之前立即制備細(xì)菌懸浮液。

制備抗生素儲液，然后稀釋到陽離子調(diào)節(jié)的Mueller-Hinton肉湯中。將每個測試平板在35±1℃下在CO₂中孵育合適的時間量。質(zhì)量控制菌株包括在適當(dāng)?shù)臏y試平板中。每個樣品運(yùn)行包括純度對照平板和陽性和陰性生長對照。

使用以下抗生素通過肉湯微量稀釋進(jìn)行敏感性測試：

利福昔明

利福平

頭孢他啶

頭孢曲松

頭孢噻吩

環(huán)丙沙星

亞胺培南

美羅培南

哌拉西林

三唑巴坦

甲氧芐啶

磺胺甲噁唑

萬古霉素

在研究的OL期中，從參與皮膚拭子研究的受試者(113個受試者)收集的皮膚拭子中鑒定了1115個葡萄球菌分離株。在治療2就診(第1天)，在OL利福昔明開始前，培養(yǎng)373個分離株，并在EOT2就診(第2周)，培養(yǎng)336個葡萄球菌分離株。從皮膚拭子中鑒定的葡萄球菌最豐富的種是表皮葡萄球菌(S.epidermidis)，占總分離株計數(shù)的55％。在研究的OL期中鑒定了總共52個金黃色葡萄球菌(S.aureus)分離株(在OL期中所有分離株的4.7％)。在這些分離株中，在第1天培養(yǎng)22個，在第2周培養(yǎng)11個，在隨訪期間培養(yǎng)剩余的19個。關(guān)于位置，各次就診的大多數(shù)分離株從鼻孔和直腸周圍皮膚培養(yǎng)。

在研究的雙盲(DB)重復(fù)治療期中，從隨機(jī)接受安慰劑的12名受試者中培養(yǎng)171個葡萄球菌分離株，并從隨機(jī)接受利福昔明的18名受試者中培養(yǎng)208個葡萄球菌分離株。從安慰劑治療的受試者中鑒定出81個表皮葡萄球菌分離株和9個金黃色葡萄球菌分離株，以及從利福昔明治療的受試者中鑒定114個表皮葡萄球菌分離株和17個金黃色葡萄球菌分離株。關(guān)于位置，各次就診的大多數(shù)分離株從鼻孔和直腸周圍皮膚培養(yǎng)。

利福昔明的MIC分析

僅參與研究的OL期并且僅接受治療2的受試者具有在治療2就診(第1天)培養(yǎng)的總共373個葡萄球菌分離株。治療2的葡萄球菌分離株的利福昔明MIC₅₀值為0.015μg/ mL，MIC₉₀值為0.03μg/ mL。在EOT2就診時(第2周)，利福昔明的MIC₅₀為0.015μg/ mL，但是MIC₉₀值增加至32μg/ mL。在第2周就診時，MIC值的總體范圍更寬，從≤0.001μg/ mL至128μg/ mL。對于在第7周和第32周之間發(fā)生的OL最后一次評估就診，利福昔明的MIC₉₀值從第7周至第10周期間的2μg/ mL降低至從第11周開始的0.03μg/ mL的MIC₉₀值。隨著除去利福昔明治療的時間推移，MIC濃度范圍變得更窄，觀察到最大MIC濃度從64μg/ mL降至0.06μg/ mL。

在DB期的第1天(治療3)，從隨機(jī)化接受參與皮膚拭子研究的安慰劑的12名受試者中回收48個葡萄球菌分離株，利福昔明MIC₅₀值為0.015μg/ mL，MIC₉₀值為0.03μg/mL。這些值在整個研究的其余部分保持一致，表明利福昔明治療對葡萄球菌分離株對利福昔明的易感性沒有長期影響。第1天的MIC范圍很寬(≤0.001μg/ mL至64μg/ mL)，這至少部分是由于以下事實：受試者先前在OL治療2中用利福昔明治療，并且在葡萄球菌分離株完全恢復(fù)到預(yù)治療易感性之前可能已經(jīng)參與DB治療3。對于所有DL最后一次評估就診(發(fā)生在第11周和第38周之間)，利福昔明的MIC范圍變窄(0.004μg/ mL至0.06μg/ mL)。

對于在研究的DB期(18名受試者)中隨機(jī)接受利福昔明的皮膚拭子受試者，在第1天，初始MIC₅₀和MIC₉₀值分別為0.015μg/ mL和0.03μg/ mL，顯示與安慰劑治療組沒有差異。在EOT3就診時(第2周)，利福昔明的MIC₉₀值為32μg/ mL。對DB最后一次評估就診，MIC50值保持低(0.015至0.06μg/ mL)，而MIC₉₀保持升高。對于在第11周和第14周之間取樣的受試者，MIC₉₀為64μg/ mL。在第15周至第22周之間，MIC₉₀值降低至0.5μg/ mL，并且對于在第23周和第38周之間取樣的受試者，MIC₉₀值為0.06μg/ mL。在接受多達(dá)三次利福昔明治療后，葡萄球菌分離株不表現(xiàn)出利福昔明MIC值的持續(xù)升高。

利福平的MIC分析

基于CLSI定義的葡萄球菌分割點分析利福平MIC，其中MIC≥4μg/ mL被認(rèn)為是抗性的。為了分析的目的，所有MIC值<4μg/ mL被認(rèn)為對利福平敏感。在使用利福昔明治療之前，參與研究的OL期的受試者在治療2的第1天具有≤0.015-0.12μg/ mL的MIC范圍，在治療2就診時的MIC₅₀和MIC₉₀≤0.015μg/ mL。在使用利福昔明治療后，在第2周，有39個分離株的MIC值≥4μg/ mL，297個分離株的MIC值<4μg/ mL。利福平抗性分離株主要位于直腸周圍(32個抗性分離株)，且4個抗性分離株從手掌培養(yǎng)和3個抗性分離株從左下臂拭子培養(yǎng)。EOT2的MIC₅₀≤0.015μg/ mL，MIC₉₀為16μg/ mL。在第7周和第32周之間發(fā)生的OL最后一次評估就診中，總共406個葡萄球菌分離株中的16個具有≥4μg/ mL的利福平MIC值。在第7至10周期間，利福平的MIC₉₀為0.5μg/ mL，從第11周起降低至≤0.015μg/ mL。在第7周至第10周之間從皮膚拭子樣品中分離出7個利福平抗性分離株(9.5％的分離株)，且大多數(shù)抗性分離株定位于直腸周圍。在第11周和第14周之間，從皮膚拭子培養(yǎng)7個抗性分離株(2.8％的分離株)。在第15周至第32周的皮膚拭子樣品中未觀察到利福平抗性分離株。

在DB期接受安慰劑治療的受試者在從第1天(治療3)到DB最后一次評估就診的所有就診中具有≤0.015μg/ mL的利福平MIC₅₀和MIC₉₀值。與利福昔明一樣，在第1天和第2周就診時，利福平的最大觀察到的MIC值升高，這可能歸因于在DB期隨機(jī)化之前沒有完全返回易感水平。對于安慰劑治療的受試者，在治療期間有3個利福平抗性分離株：第1天的1個分離株和第2周的2個分離株，全部來自直腸周圍。

對于其它抗生素，不管治療組(OL利福昔明，DB安慰劑或DB利福昔明)，RFIB3053 MIC變化沒有模式。一些葡萄球菌分離株顯示對抗生素(例如環(huán)丙沙星)的低水平抗性，其對隨時間的利福昔明治療沒有實質(zhì)性改變。

用利福昔明單次和重復(fù)治療觀察到利福昔明和利福平的MIC的瞬時變化。MIC的增加在長時間內(nèi)不持續(xù)，并且受試者在研究結(jié)束時具有返回到易感水平的皮膚葡萄球菌菌群。大多數(shù)抗性分離株在直腸周圍發(fā)現(xiàn)，在手前臂，手掌或鼻孔上具有最少的抗性分離株。

其它測試的抗生素沒有顯示可能由利福昔明治療引起的MIC變化。

培養(yǎng)和易感性試驗的結(jié)果證明，沒有證據(jù)表明從糞便或皮膚拭子培養(yǎng)物生長的分離株中對非利福霉素抗生素的交叉抗性。利福昔明的重復(fù)治療過程顯示出不會使患者對皮膚上潛在致病性葡萄球菌菌株的出現(xiàn)易感。

利福昔明的重復(fù)治療過程顯示出不會使患者對糞便或皮膚上潛在病原菌(例如艱難梭菌，腸球菌或葡萄球菌)的出現(xiàn)易感。在糞便樣品中鑒定了非常少量的艱難梭菌分離株，該比率與一般群體中無癥狀攜帶者的文獻(xiàn)報道一致，并且這些分離株中沒有一個顯示利福昔明抗性?？紤]到在糞便中獲得的高濃度的利福昔明，在一些正常菌群中觀察到利福昔明最小抑制濃度(MIC，微生物對抗生素的敏感性的量度)的瞬時變化，但這些變化隨時間可逆。

總的來說，來自皮膚拭子培養(yǎng)物的數(shù)據(jù)表明用利福昔明治療不導(dǎo)致臨床上顯著的抗生素抗性。沒有觀察到與其它測試的抗生素的交叉抗性。利福昔明或利福平的MIC50值沒有變化。觀察到利福昔明和利福平對于葡萄球菌分離株的MIC90值的瞬時變化，并且在研究結(jié)束時觀察到回到基線值。這些瞬時變化預(yù)期不會導(dǎo)致對臨床實踐的干擾，因為利福昔明和利福平都不是葡萄球菌感染的一線治療。此外，在研究的OL或DB期中沒有觀察到金黃色葡萄球菌分離株的數(shù)量增加，并且沒有金黃色葡萄球菌分離株顯示對利福昔明或利福平的抗性。

實施例5

研究設(shè)計

3期試驗的整體研究設(shè)計如圖1所示。

受試者進(jìn)入篩選/治療1期，其包括10(±3)天治療，在此期間受試者接受單盲安慰劑TID并完成每天癥狀日記。篩選/治療1期后，合格的受試者進(jìn)入治療2期，并接受開放標(biāo)簽的利福昔明550mg TID持續(xù)2周，伴隨4周無治療的隨訪。在治療2期結(jié)束時，在4周隨訪期間的至少2周期間實現(xiàn)IBS相關(guān)腹痛和糞便稠度兩者的治療成功的受試者被分類為反應(yīng)者，并進(jìn)入無治療的維持期1。治療2期中的無反應(yīng)者從研究中撤出，以提供對利福昔明治療反應(yīng)的受試者的富集群體。

無治療的維持期1隨時間變化(總共最長達(dá)18周)，并且取決于癥狀復(fù)發(fā)的時間。在維持期1結(jié)束時未滿足復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)的受試者從研究中撤出。

復(fù)發(fā)的受試者進(jìn)入治療3期，也稱為雙盲(DB)重復(fù)治療期。在該期，受試者以1：1隨機(jī)接受利福昔明550mg TID或安慰劑TID持續(xù)2周，伴隨4周無治療的隨訪。然后來自治療3期的所有受試者進(jìn)入6周維持期(維持期2)。來自維持期2的所有受試者然后進(jìn)入第二重復(fù)治療(SRT)期(即，治療期4)，其中他們接受與之前在治療3期(利福昔明550mg TID或安慰劑TID)中指定的治療相同的治療2周，伴隨4周無治療的隨訪。在SRT期結(jié)束后，所有受試者接受額外的4周，無治療的隨訪，以研究結(jié)束(EOS)就診作為終止。

在圖1中，糞便收集時間點以深灰色方框表示。參與RFIB3053的所有受試者在治療2(T2)就診，治療2結(jié)束(EOT2)就診，治療3(T3)就診，EOT 3就診和研究結(jié)束(EOS)就診提供糞便樣品。隨訪期對于受試者而言是可變的；因此，為了數(shù)據(jù)分析和解釋的目的，隨訪被分為4周，以確定是否對葡萄球菌分離株的抗生素易感性在時間上有影響。此外，如果受試者具有癥狀的復(fù)發(fā)并且參與研究的DB期，則將治療3就診視為OL治療期的最終就診。治療3就診也作為參與研究的DB期的受試者的DB基線就診。

16S rRNA基因測序：

冷凍運(yùn)送來自所選受試者的糞便等分試樣用于基因組測序。在測試時解凍樣品。從糞便中提取DNA。使用下一代測序技術(shù)(Illumina HiSeq2500)來測序16S核糖體RNA的V4區(qū)。為此，使用F515(正向)：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA和R806 (反向)：

GGACTACHVGGGTWTCTAAT引物(17)，擴(kuò)增286個堿基對(bp)區(qū)。

首先使用Illumina的適配器信息對數(shù)據(jù)進(jìn)行多路分配，然后進(jìn)行第二輪多路分配。

隨機(jī)選擇總共103個受試者以包括在糞便微生物群分析中。中位年齡為48.0歲(最低，最高：19,85歲)，大多數(shù)受試者為白人(82.5％)，大多數(shù)為女性(73.8％)。這些受試者中總共73位參與了研究的雙盲期：安慰劑組36位，利福昔明組37位。安慰劑和利福昔明受試者在人口統(tǒng)計學(xué)特征方面通常相似。

從所選糞便樣品中產(chǎn)生總共約46億個(約22億x 2個配對端)序列。該分析基于在來自非重疊配對端的50％閾值處具有匹配的RDP(核糖體數(shù)據(jù)庫項目)家族調(diào)用的大約19億次讀數(shù)。從隨機(jī)選擇的受試者中鑒定出172個獨立科。為了集中在具有潛在臨床相關(guān)性的分類群，從該172個科中鑒定分類群的子集，其包括從相同受試者培養(yǎng)的細(xì)菌科，通過測序方法將其鑒定為在IBS中被擾亂的細(xì)菌科，以及在3期研究過程中顯示被改變的細(xì)菌科(表4)。該列表還包括含有已知病原體的細(xì)菌科。

豐富度，多樣性和相似性分析：

使用Shannon多樣性指數(shù)來確定每次就診時糞便微生物群的多樣性(其不僅考慮存在的細(xì)菌科的數(shù)目，而且還考慮那些科的相對豐度)。在研究的OL期使用利福昔明治療的糞便微生物群的多樣性沒有顯著變化。

此外，在研究的OL期每次就診時評估微生物群的均勻性。微生物群的均勻性不受利福昔明治療的影響，僅在基線后就診時微生物群的整體均勻性有微小的變化。

微生物群的豐富度，反映在糞便微生物群中觀察到的細(xì)菌科的數(shù)量的量度，顯示出在OL期中從治療前基線至第2周稍微降低，這對應(yīng)于利福昔明的治療期(圖11)。從基線到第2周，豐富度降低了1.235個科。在兩周OL利福昔明治療結(jié)束后的隨訪期間，豐富度被歸一化為基線水平。圖11顯示提供數(shù)據(jù)的視覺印象，而圖12顯示在OL期第2周和隨訪期間自基線的變化。

對于從糞便微生物群測序的細(xì)菌科，在研究的OL期從受試者測序的最豐富的科如下：氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)，擬桿菌科(Bacteroidaceae)，雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)，科里氏桿菌科(Coriobacteriaceae)，腸球菌科(Enterococcaceae)，毛螺菌科(Lachnospiraceae)，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)，理研菌科(Rikenellaceae)，瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)，韋榮球菌科(Veillonellaceae)和疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)。這十一(11)個細(xì)菌科代表研究的OL期的第1天的讀數(shù)的約90％。與第1天相比，就觀察到在第2周(開放標(biāo)簽利福昔明治療兩周后立即)減少的細(xì)菌科而言，在第1天代表約2.0％的群體的雙歧桿菌科在豐度上減少12％至49％。在第1天代表總?cè)后w的約14％的擬桿菌科在第2周時豐度增加1％至66％。重要的是注意到，一些細(xì)菌科例如乳桿菌科在研究的OL期中從第1天到第2周具有統(tǒng)計學(xué)顯著的變化，但是具有低豐度，因此對整個群落結(jié)構(gòu)具有較小的貢獻(xiàn)。同樣地，乳桿菌科在第2周減少8％至51％，但總體上代表測序群體的0.2％。因此，不僅要考慮每個科觀察到的變化，而且還要考慮其對整個糞便微生物群的定量貢獻(xiàn)。

雙盲期的豐富度，多樣性和相似性分析：

在研究的DB期的基線，在隨機(jī)化接受安慰劑或利福昔明之前，DB安慰劑和DB利福昔明組的Shannon多樣性相似，分別為1.733和1.786。在2周治療期后，安慰劑組的Shannon多樣性為1.743，DB利福昔明組為1.698，治療之間沒有顯著差異(p值= 0.4335)。在隨訪期間，Shannon多樣性基本保持不變，在治療組之間沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。

在研究的DB期，通過利福昔明或安慰劑治療，微生物群中的均勻性的量度也沒有改變。在治療組內(nèi)或治療組之間沒有觀察到微生物群的均勻性的顯著變化。

在研究的DB期，微生物群的豐富度被利福昔明治療瞬時地影響。在用DB安慰劑治療的受試者中微生物群的豐富度保持不變(圖13)，而在利福昔明治療的受試者中在第2周豐富度降低(對于利福昔明治療組從基線到第2周的變化，p = 0.0331，而在第2周比較安慰劑與利福昔明治療的受試者p = 0.0224)。在隨訪期間，利福昔明治療引起的下降的豐富性逆轉(zhuǎn)，并且在隨訪期間在任何就診時安慰劑或利福昔明治療的受試者的微生物群的豐富度沒有顯著差異(圖14)。

關(guān)于從糞便微生物群測序的細(xì)菌科，在研究的DB期從受試者測序的最豐富的細(xì)菌科如下：氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)，擬桿菌科(Bacteroidaceae)，雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)，科里氏桿菌科(Coriobacteriaceae)，腸球菌科(Enterococcaceae)，毛螺菌科(Lachnospiraceae)，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)，理研菌科(Rikenellaceae)，瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)，韋榮球菌科(Veillonellaceae)和疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)。在研究的DB期的第1天，這11個細(xì)菌科代表安慰劑組和利福昔明組的讀數(shù)的約90％。

如在研究的DB期，在幾個細(xì)菌科中從基線到第2周治療結(jié)束有變化，但是如在OL期中，許多這些變化發(fā)生在低豐度科中。在DB安慰劑組和DB利福昔明組中的變化是明顯的。用利福昔明治療的受試者中一些科的變化可能與利福昔明的抗菌活性相關(guān)，如在第2周時降低35％至88％(p值= 0.004)的梭菌科1科所觀察到的。該科在安慰劑和利福昔明治療的受試者中代表約0.2％的序列。利福昔明已顯示對梭菌科中的物種具有有效的體外抗菌活性。該科的豐度恢復(fù)到隨訪期的基線。與在第2周用安慰劑治療的受試者的樣品相比，在梭菌科中觀察到的減少不顯著(p值= 0.062)。總體而言，低豐度類群顯示利福昔明治療的一些影響，但是改變是短暫的，并且在研究結(jié)束時恢復(fù)。

隨機(jī)進(jìn)行雙盲治療的受試者中的糞便微生物群的微生物豐富度的分析：

在隨機(jī)化到研究的DB期以接受利福昔明(37名受試者)或安慰劑(36名受試者)的受試者中研究在RFIB3053的OL和DB兩期過程中微生物豐富度的變化。在研究的OL期中接受利福昔明的DB安慰劑治療的受試者在OL期的第2周顯示豐富度減少，其在DB期的開始恢復(fù)(圖15)。此外，豐富度在OL期的開始和DB期的結(jié)束時是類似的。

對于接受DB利福昔明的受試者，在OL第2周和DB第2周均觀察到豐富度的減少，對應(yīng)于各利福昔明治療的結(jié)束(圖16)。兩種治療后豐富度恢復(fù)，表明使用利福昔明單次或重復(fù)治療后，不發(fā)生細(xì)菌分類群的長期抑制。利福昔明治療對安慰劑和利福昔明治療的IBS-D受試者之間的Shannon多樣性或均勻性沒有顯著影響，并且導(dǎo)致微生物群豐富度的瞬時變化。這些在豐富度方面的減少在利福昔明治療過程結(jié)束后恢復(fù)。在受利福昔明治療影響的細(xì)菌科中，16S rRNA基因的測序顯示低豐度分類群比更豐富分類群更受利福昔明治療的影響?？偟膩碚f，與使用單一療程的開放標(biāo)簽利福昔明，然后是雙盲安慰劑的受試者相比，在使用利福昔明重復(fù)治療期間，在受試者中未觀察到糞便微生物群的干擾。