本申請(qǐng)要求2014年5月14日提出的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)61/993,056、2014年5月27日提出的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)62/003,256、2015年2月12日提出的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)62/115,326和2015年4月30日提出的美國專利申請(qǐng)序列號(hào)62/155,079的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，這些專利申請(qǐng)的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文中。

本發(fā)明是在政府支持下以美國國家衛(wèi)生研究院(the National Institutes of Health)頒予的許可號(hào)1R21AI098122進(jìn)行的。政府在本發(fā)明中具有一定權(quán)利。

背景

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)定殖于人類和動(dòng)物的皮膚和粘膜，并連同葡萄球菌屬(genus Staphylococcus)的其它成員一起，與多種感染病相關(guān)。金黃色葡萄球菌含有許多毒力因子，包括稱為“識(shí)別粘附基質(zhì)分子的微生物表面組分”的表面蛋白，其促進(jìn)與表面的粘附并起始感染(Gordon和Lowy(2008)Clin.Infect.Dis.46:S350-S359)。金黃色葡萄球菌還可以形成生物膜(Donlan和Costerton(2002)Clin.Microbiol.Rev.15:167-193)，此允許其逃避免疫系統(tǒng)與抗生素。大部分菌株具有多醣莢膜并分泌多種酶，這些酶在感染期間用以增強(qiáng)細(xì)菌傳播(Foster(2005)Nat.Rev.Microbiol.3:948-958)。金黃色葡萄球菌還會(huì)引起中毒性休克綜合癥，且研究已經(jīng)展示金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的肽聚糖和脂胞壁酸共同起作用，引起大鼠中毒性休克(Kimpe等人,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10359-10363)。

青霉素后出現(xiàn)的葡萄球菌的抗生素抗性首先用于治療葡萄球菌感染。到20世紀(jì)60年代，超過80％臨床分離株中存在的此抗性的發(fā)展(Lowy(2003)J.Clin.Invest.111:1265-1273)促使新的更有效的藥物發(fā)展以抗擊機(jī)會(huì)病原體。這些努力產(chǎn)生了甲氧西林，甲氧西林是一種經(jīng)設(shè)計(jì)以減輕葡萄球菌感染負(fù)荷的窄譜性青霉素酶抗性藥物。然而，僅僅一年就發(fā)現(xiàn)了首批甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)臨床分離株。

最初，MRSA感染僅僅與長期住院治療和侵入性手術(shù)程序相關(guān)，并被分類為護(hù)理獲得性MRSA(HCA-MRSA)。然而，近年來，MRSA又顯現(xiàn)為社區(qū)獲得性感染(CA-MRSA)，其影響著高強(qiáng)度身體接觸的群體，例如比賽運(yùn)動(dòng)員、軍隊(duì)新兵和托兒中心的幼兒(Romano等人,(2006)J.Athl.Train.41:141-145；Kazakova等人,(2005)New Engl.J.Med.352:468-475；Zinderman等人,(2004)Emerg.Infect.Dis.10:941-944；Adcock等人,(1998)J.Infect.Dis.178:577-580)。

金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁由N-乙?；咸前泛蚇-乙?；谒岬慕惶娑嗵莵唵卧獦?gòu)成，其中每個(gè)N-乙?；谒徇B接至肽鏈。肽聚糖的交聯(lián)通過四個(gè)主要青霉素結(jié)合蛋白(PBP1、PBP2、PBP3和PBP4)實(shí)現(xiàn)，這些青霉素結(jié)合蛋白經(jīng)由五甘氨酸肽間橋連接胞壁肽鏈。當(dāng)金黃色葡萄球菌獲得mecA基因時(shí)，產(chǎn)生甲氧西林抗性，mecA基因編碼具有轉(zhuǎn)肽酶活性但對(duì)青霉素和β-內(nèi)酰胺抗生素的親和力降低的青霉素結(jié)合蛋白PBP2A?？剐约?xì)胞仍然產(chǎn)生PBP，但考慮到PBP2A的表達(dá)，在甲氧西林和其它β-內(nèi)酰胺存在下肽聚糖合成繼續(xù)(Hiramatsu等人,(2001)Trends Microbiol.9:486-493)。

溶葡萄球菌酶是一種由模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)產(chǎn)生的甘氨酰基-甘氨酸鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶，其選擇性地靶向五甘氨酸肽間橫橋。已經(jīng)分離溶葡萄球菌酶的基因并表征。已經(jīng)進(jìn)行基因截短，以去除36個(gè)殘基的信號(hào)肽和224個(gè)殘基長的前肽，由此促進(jìn)與起始甲硫氨酸的融合以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，或者與外源性信號(hào)序列的融合，例如以允許單一種類的溶葡萄球菌酶分泌至大腸桿菌的壁膜間隙中(參見例如US 2005/0118159)。成熟的247個(gè)殘基酶由N端催化結(jié)構(gòu)域(138個(gè)氨基酸)構(gòu)成，該N端催化結(jié)構(gòu)域經(jīng)由18個(gè)殘基的連接子連接至C端細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(92個(gè)氨基酸)(Lu等人,(2013)Antimicrob.Agents Chemother.57:1872-1881)。

溶葡萄球菌酶已經(jīng)顯示有望成為治療金黃色葡萄球菌感染的治療劑。已展示所述蛋白質(zhì)溶解葡萄球菌菌株(Schindler和Schuhardt(1964)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 51:414421)和臨床分離株(Cropp和Harrison(1964)Can.J.Microbiol.10:823-828)，并在動(dòng)物模型中顯示顯著功效(Schuhardt和Schindler(1964)J.Bacteriol.88:815-816；Schaffner等人,(1967)Yale J.Biol.Med.39:230-244；Goldberg等人,(1967)Antimicrob.Agents Chemother.7:45-53；Kokai-Kun等人,(2007)J.Antimicrob.Ther.60:1051–1059；Placencia等人,(2009)Ped.Res.65:420-424；Climo等人,(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:1355-60)，包括葡萄球菌生物膜的模型(Kokai-Kun等人,(2009)J.Antimicrob.Ther.64:94-100)。在若干這些研究中，在長時(shí)間接受藥物的動(dòng)物中觀測(cè)到針對(duì)溶葡萄球菌酶的抗體(Climo等人,(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:1355–1360)。類似地，使用鼻內(nèi)溶葡萄球菌酶的人類臨床試驗(yàn)指示抗溶葡萄球菌酶抗體滴度輕微升高(Kokai-Kun(2012),Antimicrobial Drug Discovery:Emerging Strategies(Tegos和Mylonakis編)Ch.10,147-165)。

為了提高藥物動(dòng)力學(xué)并降低免疫原性，溶葡萄球菌酶已與支鏈聚乙二醇(PEG)有關(guān)。雖然聚乙二醇化降低免疫反應(yīng)性，但酶的聚乙二醇化顯著降低其活性(Walsh等人,(2003)Antimicrob.Agents Chemother.47:554-558)。另外，US 2008/0095756描述溶葡萄球菌酶的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)域的去免疫化。然而，未描述具有去免疫化催化結(jié)構(gòu)域的變異體。

發(fā)明概述

本發(fā)明為一種去免疫化溶葡萄球菌酶，其在SEQ ID NO:49的Ser124、Ser122、Asn121、Arg118、Ile99、Lys95、Tyr93、Leu83、Lys46、Ile41、Asn13、Asn12中一個(gè)或多個(gè)上具有突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶去糖基化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，突變?yōu)镾er124Gly、Ser122Asp、Asn121Gly、Arg118Thr、Ile99Gln、Lys95Glu、Tyr93His、Leu83Met、Lys46His、Ile41Glu、Asn13His、Asn12Gly或其組合。在另一實(shí)施方案中，去免疫化溶葡萄球菌酶進(jìn)一步在C端結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。提供一種含有去免疫化溶葡萄球菌酶和抗生素的藥物組合物，以及預(yù)防或治療微生物感染的方法。

附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1E展示本發(fā)明的溶葡萄球菌酶變異體的序列比對(duì)。

圖2展示溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域的表位定位。將預(yù)測(cè)結(jié)合事件的總數(shù)針對(duì)溶葡萄球菌酶一級(jí)序列繪圖。使用EpiMatrix，預(yù)測(cè)MHCII對(duì)偶基因DRB*0101、0301、0401、0701、0801、1101、1301和1501的表位。最大評(píng)分為8且表示預(yù)測(cè)結(jié)合所有8個(gè)對(duì)偶基因的表位。在位置116觀測(cè)到此類表位。EpiSweep突變的位點(diǎn)用箭頭和殘基編號(hào)表示。表位組分成五個(gè)不同簇。還指示發(fā)現(xiàn)對(duì)溶葡萄球菌酶表達(dá)和活性不利的隨后略去的突變(Phe38Gly和Ser124Tyr)。

圖3展示針對(duì)全長設(shè)計(jì)計(jì)算的免疫原性評(píng)分的集合。設(shè)計(jì)中的每個(gè)肽被評(píng)估為八種MHC類別II對(duì)偶基因的強(qiáng)(IC₅₀<1μM)、中度(1μM<IC₅₀<10μM)或弱(10μM<IC₅₀<100μM)結(jié)合子。接著將強(qiáng)、中度和弱結(jié)合子求和以獲得圖中所示的總分。具有“a”的線指示野生型溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域中強(qiáng)結(jié)合子的數(shù)目，而具有“b”的線展示中度結(jié)合子的數(shù)目。柱上的數(shù)字表示每個(gè)設(shè)計(jì)的突變負(fù)荷。*指示回復(fù)設(shè)計(jì)。

圖4A-4C展示柔性5和柔性9變異體的體內(nèi)功效和免疫原性分析。圖4A：在用金黃色葡萄球菌感染和用野生型LST、變異體柔性5、變異體柔性9或PBS對(duì)照處理后C57Bl/6小鼠的肺中的細(xì)菌負(fù)荷。每組N＝6。圖4B：HUMI小鼠(都從單一供體人類化)皮下免疫接種野生型LST(WT)、變異體柔性5或變異體柔性9，并收獲脾細(xì)胞且用相同蛋白質(zhì)或者DMSO離體再刺激。增殖測(cè)量為氚化胸腺嘧啶的吸收。每組N＝4，匯集，并一式三份測(cè)量。圖4C，轉(zhuǎn)基因DR4小鼠通過多次皮下注射野生型LST而免疫接種。最后加打后，使小鼠恢復(fù)20周，分成兩組，并用野生型LST或變異體柔性5再攻擊。收獲脾細(xì)胞，且用再攻擊蛋白質(zhì)或DMSO離體再刺激，且增殖測(cè)量為氚化胸腺嘧啶的吸收。每組N＝5，匯集并一式三份測(cè)量。統(tǒng)計(jì)顯著性通過單向ANOVA(圖4A)或雙向ANOVA(圖4B和4C)評(píng)估。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

圖5展示變異體Lib5(頂)、Opt4(中間)和LST^WT(底)的預(yù)測(cè)DR4T細(xì)胞表位。九聚體表位顯示為LST氨基酸序列中對(duì)應(yīng)位置的水平線(X軸)。LST^WT含有16個(gè)假定表位，Opt4含有5個(gè)，且Lib5僅僅含有三個(gè)。LST^WT中重疊表位密度區(qū)域在x軸上用實(shí)心方塊突出顯示。Lib5(頂)和Opt4(中間)中去免疫化突變的位置顯示為實(shí)心垂直條。每個(gè)設(shè)計(jì)的突變(M)和表位(E)數(shù)指示在右側(cè)。

圖6A和6B分別展示溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域的整體表位圖譜。預(yù)測(cè)HLA對(duì)偶基因DRB1*0101、0301、0401、0701、0801、1101、1301和1501的表位。九個(gè)殘基肽表位用實(shí)線(1％-2％閾值)和虛線(3％-5％閾值)指示。在x軸上指示溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域一級(jí)序列，且在y軸上展示與每個(gè)肽表位相關(guān)的HLA對(duì)偶基因。用于可設(shè)計(jì)性分析的較高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)在頂部用實(shí)心方框標(biāo)記。虛線方框表示中等風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域，其在去免疫化柔性9去免疫化催化結(jié)構(gòu)域的研發(fā)期間也重新設(shè)計(jì)。

圖7展示F11、F12和F13針對(duì)MRSA菌株USA400的最低抑制濃度(MIC)。

圖8展示C57BL/6小鼠中F11變異體的體內(nèi)功效。小鼠通過腹膜內(nèi)注射2×10⁸MRSA菌株USA400來攻擊，且1小時(shí)后，小鼠用100μg野生型LST、F11或PBS處理。展示存活百分比。

發(fā)明詳述

現(xiàn)在已經(jīng)展示溶葡萄球菌酶的催化結(jié)構(gòu)域可以去免疫化，而不會(huì)顯著改變酶活性。具體地說，溶葡萄球菌酶的EpiSweep分析用以鑒別MHC II結(jié)合事件。產(chǎn)生在催化結(jié)構(gòu)域中含有突變的去免疫化溶葡萄球菌酶變異體，表達(dá)，純化，并展示活性水平可與商業(yè)來源的溶葡萄球菌酶相當(dāng)。通過將催化結(jié)構(gòu)域的突變與細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域的突變組合，本發(fā)明提供了一種完全去免疫化溶葡萄球菌酶變異體和其用于治療微生物感染的方法。

如本文所用，術(shù)語“去免疫化”在提及溶葡萄球菌酶時(shí)使用時(shí)，是指其中特異性去除和/或修飾高免疫原性區(qū)域或殘基的溶葡萄球菌酶(例如溶葡萄球菌酶變異體、其衍生物和/或同源物)。術(shù)語“去免疫化”為本領(lǐng)域中已知，且尤其已用于從包括抗體在內(nèi)的其它治療分子去除T細(xì)胞表位(參見例如WO 98/52976或WO 00/34317)。

體液抗體形成需要輔助T細(xì)胞與抗原特異性B細(xì)胞的合作。為了降低分子的免疫原性，一種方法是降低抗原與B細(xì)胞相互作用和刺激B細(xì)胞的能力和/或降低其刺激輔助T細(xì)胞的能力。然而，考慮到B細(xì)胞表位具有不確定的長度并常依賴于標(biāo)靶抗原的三級(jí)結(jié)構(gòu)的事實(shí)，鑒別其存在著問題。相比之下，T細(xì)胞表位是短(9-15個(gè)氨基酸)的線性肽(參見例如Doytchinova和Flower(2006)Mol.Immunol.43(13):2037-44)。另外，證據(jù)表明降低T細(xì)胞活化更容易實(shí)現(xiàn)且能夠極大地影響抗體產(chǎn)生(參見例如Tangri等人,(2005)J.Immunol.174:3187-3196)。包括刺激T細(xì)胞的抗原決定子的氨基酸序列稱為T細(xì)胞表位且在主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子情況下展示在抗原呈遞細(xì)胞上。改變T細(xì)胞表位結(jié)合MHC分子的能力(例如通過抑制表位與MHC分子的結(jié)合、改變表位與MHC分子之間的親和力、在MHC分子的結(jié)合區(qū)內(nèi)時(shí)以改變表位的取向的方式改變表位或通過改變MHC分子對(duì)其呈遞的方式改變表位)能夠使改變的表位不能或不太能刺激免疫原性反應(yīng)(例如刺激輔助T細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng))。因此，使用本文中描述的方法，鑒別溶葡萄球菌酶的表位并隨后改變以降低溶葡萄球菌酶的免疫原性和其誘發(fā)體液抗體反應(yīng)的能力。

因此，去免疫化涉及T細(xì)胞表位、較佳輔助T細(xì)胞表位的鑒別、修飾和/或去除。在此情況下，術(shù)語T細(xì)胞表位在MHC I類和/或II類分子情況下是指由T細(xì)胞識(shí)別的T細(xì)胞表位(即小肽)。用于鑒別T細(xì)胞表位的方法是本領(lǐng)域中已知的(參見例如WO 98/52976、WO 00/34317和US 2004/0180386)。多種鑒別方法包括(但不限于)肽穿線、肽-MHC結(jié)合、人類T細(xì)胞分析、細(xì)胞因子表達(dá)模式的分析、ELISPOT檢定、II類四聚體表位定位、搜索MHC結(jié)合基元數(shù)據(jù)庫和T細(xì)胞表位的其它去除/修飾。在具體實(shí)施方案中，使用結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的去免疫化法，例如EpiSweep法所采用的方法。EpiSweep整合基于結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)、基于序列的蛋白質(zhì)去免疫化和用于尋找設(shè)計(jì)空間的帕累托前沿的算法(Parker等人,(2013)J.Comput.Biol.20:152-65)。

通過應(yīng)用以上敘述的技術(shù)鑒別出T細(xì)胞表位后，可以通過所鑒別的MHC結(jié)合肽內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，從溶葡萄球菌酶或其片段(例如催化結(jié)構(gòu)域)消除、取代和/或修飾表位，如本文中進(jìn)一步描述。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)消除或極大地減少與MHC I類和/或II類分子的結(jié)合的氨基酸取代，或者將MHC結(jié)合肽改變成保留其結(jié)合MHC I類或II類分子的能力但未能觸發(fā)T細(xì)胞活化和/或增殖的序列。

已展示成熟溶葡萄球菌酶具有兩個(gè)功能域，結(jié)合金黃色葡萄球菌外部細(xì)胞壁的92個(gè)殘基的C端結(jié)構(gòu)域和具有肽鏈內(nèi)切酶活性的N端活性位點(diǎn)(Baba和Schneewind(1996)EMBO J.15:4789-4797)。部分由于溶葡萄球菌酶兩個(gè)分開結(jié)構(gòu)域的不同溶解特征，故溶葡萄球菌酶尚未成功地結(jié)晶。然而，使用本文中描述的電腦模擬方法，已經(jīng)產(chǎn)生包括不同突變組合的高功能性的溶葡萄球菌酶蛋白質(zhì)。選擇催化結(jié)構(gòu)域中每個(gè)位置的易變氨基酸(除活性位點(diǎn)殘基外)，產(chǎn)生預(yù)測(cè)具有較低免疫原性，同時(shí)保留穩(wěn)定性的溶葡萄球菌酶變異體。評(píng)估每個(gè)突變的表達(dá)和活性。僅僅選擇在兩方面都令人滿意的突變，并再次重復(fù)去免疫化過程。在所產(chǎn)生的計(jì)劃的適當(dāng)能量最小化后，選擇具有最佳預(yù)測(cè)能量評(píng)分的設(shè)計(jì)并通過實(shí)驗(yàn)測(cè)試。接著純化能夠表達(dá)的溶葡萄球菌酶變異體并進(jìn)一步表征活性、穩(wěn)定性和免疫原性。

因此，本發(fā)明提供了多種溶葡萄球菌酶變異體，包括免疫原性表位的修飾(例如突變，例如氨基酸取代)，其保留活性，同時(shí)顯示降低的免疫原性。如本文所用，術(shù)語“溶葡萄球菌酶”是指編碼全長溶葡萄球菌酶或其部分的氨基酸序列和/或核酸序列、任何溶葡萄球菌酶突變體或變異體(例如SEQ ID NO:1-48或218-220中任一個(gè)的溶葡萄球菌酶)、任何溶葡萄球菌酶截短(例如其中已經(jīng)從蛋白質(zhì)的氨基端、羧基端或兩者去除一個(gè)或多個(gè)氨基酸)和保留針對(duì)葡萄球菌的細(xì)胞壁肽聚糖中含甘氨酸橋的蛋白水解襲擊的體外和體內(nèi)蛋白水解能力的任何重組表達(dá)的溶葡萄球菌酶蛋白質(zhì)。溶葡萄球菌酶變異體(例如本文中描述的去免疫化溶葡萄球菌酶)也可以呈截短形式表達(dá)。經(jīng)修飾的全長溶葡萄球菌酶或溶葡萄球菌酶變異體可以通過蛋白質(zhì)的翻譯后加工(通過存在于宿主細(xì)胞菌株中的酶或借助于在此過程的任何階段引入的酶或試劑)或通過結(jié)構(gòu)基因的突變來產(chǎn)生。如本文所描述的溶葡萄球菌酶變異體可以包括缺失、插入、結(jié)構(gòu)域去除、點(diǎn)和替換/取代突變。

本發(fā)明不限于任何具體的溶葡萄球菌酶變異體。實(shí)際上，本發(fā)明提供多種變異體，包括(但不限于)實(shí)施例中描述和圖1A-1E中描繪的變異體。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)與野生型序列比較時(shí)，溶葡萄球菌酶變異體具有單一氨基酸取代(例如任一本文中描述的氨基酸取代)：AATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNPTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK(SEQ ID NO:49)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)與野生型序列比較時(shí)，溶葡萄球菌酶變異體具有兩個(gè)氨基酸取代。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)與野生型序列比較時(shí)，溶葡萄球菌酶變異體具有三個(gè)氨基酸取代。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)與野生型序列比較時(shí)，溶葡萄球菌酶變異體具有四個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在某些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體在催化結(jié)構(gòu)域中具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶突變體在Ser124、Ser122、Asn121、Arg118、Ile99、Lys95、Tyr93、Leu83、Lys46、Ile41、Asn13、Asn12或其組合具有突變。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體具有以下突變之一或組合：Ser124Gly、Ser122Asp、Asn121Gly、Arg118Thr、Ile99Gln、Lys95Glu、Tyr93His、Leu83Met、Lys46His、Ile41Glu、Asn13His和Asn12Gly。在其它實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體在C端結(jié)合結(jié)構(gòu)域中也具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體在Asn236、Arg186、Ala169、Ser166、Tyr160或其組合具有C端結(jié)合結(jié)構(gòu)域突變。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體在C端結(jié)合結(jié)構(gòu)域突變中具有以下突變之一或組合：Asn236Asp、Arg186Thr、Ala169Gly、Ser166Asn和Tyr160His。C端結(jié)合結(jié)構(gòu)域中其它適合的氨基酸取代包括(但不限于)US 2008/0095756中公開的氨基酸取代。

類似地，本發(fā)明不限于任何具體的突變類型。本發(fā)明的突變包括(但不限于)氨基酸交換、插入、缺失、添加、取代、倒置和/或復(fù)制。這些突變/修飾還包括保守和/或同源氨基酸交換。已經(jīng)描述關(guān)于如何制備表型/功能上沉默的氨基酸取代的指導(dǎo)(參見例如Bowie(1990),Science 247:1306-1310)。

本發(fā)明還提供了氨基酸序列與圖1中所示的多肽序列(SEQ ID NO:1-48)或SEQ ID NO:218-220中至少60％、更優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選90％、更優(yōu)選至少95％和最優(yōu)選99％一致或同源的溶葡萄球菌酶變異體。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的溶葡萄球菌酶變異體引起的免疫反應(yīng)(例如如通過抗溶葡萄球菌酶抗體滴度測(cè)量)比未去免疫化溶葡萄球菌酶引起的免疫反應(yīng)少90％、更優(yōu)選少80％、更優(yōu)選少70％、更優(yōu)選少60％、更優(yōu)選少50％、更優(yōu)選少40％、更優(yōu)選少30％、更優(yōu)選少20％且甚至更優(yōu)選少10％。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種質(zhì)粒，其具有編碼去免疫化溶葡萄球菌酶變異體的核酸序列。在某些實(shí)施方案中，質(zhì)粒為具有編碼溶葡萄球菌酶變異體的核酸序列的表達(dá)載體(例如其顯示殺菌活性和降低的免疫原性和)。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體表達(dá)為融合蛋白，例如與促進(jìn)純化的序列(例如組氨酸延伸)融合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體具有編碼去免疫化溶葡萄球菌酶變異體的核酸序列，該去免疫化溶葡萄球菌酶變異體具有如SEQ ID NO:1-48(圖1A-1E)或SEQ ID NO:218-220中闡述的氨基酸序列。

除溶葡萄球菌酶變異體核酸外，本發(fā)明的質(zhì)粒還可以包括調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄強(qiáng)化子和/或允許溶葡萄球菌酶變異體誘導(dǎo)性表達(dá)的序列。舉例來說，一種適合的誘導(dǎo)系統(tǒng)為四環(huán)素調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)(參見例如Gossen和Bujard(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551；Gossen等人(1994)Trends Biotech.12:58-62)。在一些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)系統(tǒng)為異丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。

使用表達(dá)質(zhì)粒，本發(fā)明的溶葡萄球菌酶變異體可以通過大量已知的方法產(chǎn)生。舉例來說，溶葡萄球菌酶變異體可以從以下表達(dá)和分離：球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)(US 4,931,390)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NICE表達(dá)系統(tǒng)(NIsin控制的基因表達(dá))(Mierau等人,(2005)Microb.Cell Fact.4:1-9)；pET23b(+)和pBAD/Thio-TOPO大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(Szweda等人,(2005)J.Biotechnol.117:203–213)；BL21(DE-3)大腸桿菌(Sharma等人,(2006)Prot.Exp.Purific.45:206–215)；或巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)，如本文和其它地方關(guān)于產(chǎn)生治療蛋白所描述(Gasser等人,(2013)Future Microbiol.8:191–208；Walsh(2010)Nature Biotechnol.28:917-924；Shekhar(2008)Chem.Biol.15:201-202；Meyer等人,(2008)Bioproc.Internat.6:10-21)。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的溶葡萄球菌酶變異體通過在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)而獲得，巴斯德畢赤氏酵母的特征在于有效和選擇性分泌、高蛋白滴度和高細(xì)胞密度培養(yǎng)(Vogl等人,(2013)Curr.Opin.Biotechnol.24:1094-1101)。此外，巴斯德畢赤氏酵母被認(rèn)為是一種安全(GRAS)生物體，具有可以用于蛋白質(zhì)分泌的若干信號(hào)序列，且具有已知的最強(qiáng)啟動(dòng)子之一(AOX)。因?yàn)槠湓试S蛋白質(zhì)直接分泌至培養(yǎng)基中，所以巴斯德畢赤氏酵母極大地簡(jiǎn)化了蛋白質(zhì)回收和下游純化。

本發(fā)明的溶葡萄球菌酶變異體可以通過大量已知的方法來純化。舉例來說，由于其具有高正電荷，所以已使用陽離子交換步驟從例如模仿葡萄球菌、球形芽孢桿菌或乳酸乳球菌等細(xì)菌宿主純化溶葡萄球菌酶(Recsei等人,(1990)上述；Mierau等人,(2005)上述；Fedorov等人,(2003)Biochemistry(Moscow)68:50-53)。當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，已使用親和層析法純化溶葡萄球菌酶(Szweda等人,(2005)上述；Sharma等人,(2006)上述)。

可以用若干不同的方式測(cè)定溶葡萄球菌酶活性：最低抑制濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)、圓盤擴(kuò)散和濁度降低(Kusuma和Kokai-Kun(2005)Antimicrob.Agents Chemother.49:3256–3263)。進(jìn)行MIC檢定以獲得預(yù)防金黃色葡萄球菌細(xì)胞生長所需的溶葡萄球菌酶最低濃度，而在MIC檢定后通常進(jìn)行MBC檢定，以確定殺死金黃色葡萄球菌所需的藥物最低濃度。MIC檢定被認(rèn)為是測(cè)定治療劑值的金標(biāo)準(zhǔn)。進(jìn)行圓盤擴(kuò)散檢定以通過測(cè)定當(dāng)含溶葡萄球菌酶的圓盤位于金黃色葡萄球菌菌苔上且隨時(shí)間擴(kuò)散至板培養(yǎng)基中時(shí)所產(chǎn)生的清除區(qū)直徑來測(cè)量活性。濁度降低檢定涉及測(cè)量當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行溶解時(shí)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物的吸光度隨時(shí)間的下降(Schindler和Schuhardt(1964)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 51:414-421)。

可以使用若干不同的方法測(cè)定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。用于測(cè)量熱穩(wěn)定性的三種公認(rèn)方法包括例如差示掃描量熱法(DSC)、差示掃描光散射(DSLS)和差示掃描量熒光測(cè)定法(DSF)。所有方法都是基于測(cè)定在溫度增加下蛋白質(zhì)展開的速率，此為蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的量度。舉例來說，如果溫度的小幅上升引起蛋白質(zhì)展開，那么認(rèn)為蛋白質(zhì)不是很穩(wěn)定。DSC直接測(cè)量與熱變性相關(guān)的吸熱并已經(jīng)證明其足夠定量評(píng)估蛋白質(zhì)治療劑的穩(wěn)定性(Wen等人,(2011)J.Pharmaceut.Sci.101:955-964)。DSLS方法基于以下假設(shè)測(cè)量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)暴露于遞增的溫度時(shí)，蛋白質(zhì)變性不可逆。使用光散射，此方法監(jiān)測(cè)作為變性結(jié)果的聚集物。在DSF中，使用熒光染料，其在結(jié)合疏水性殘基后發(fā)熒光。隨著溫度增加，蛋白質(zhì)開始展開且暴露其核心中發(fā)現(xiàn)的疏水性殘基，引起熒光信號(hào)的增加。在一定的溫度變化范圍內(nèi)監(jiān)測(cè)此信號(hào)增加且用以確定Tm值。

為了評(píng)估免疫原性，產(chǎn)生體外和體內(nèi)模型。因?yàn)镸HC分子在T細(xì)胞依賴性免疫反應(yīng)中起重要作用，所以體外檢定可以用于測(cè)試肽結(jié)合MHC的能力(Salvat等人,(2014)J.Vis.Exp.85)。另外，例如大鼠、小鼠和非人類靈長類動(dòng)物等若干動(dòng)物模型目前用于蛋白質(zhì)治療劑的臨床前評(píng)估中，其中模型越接近人類，其預(yù)測(cè)患者中有害抗體的產(chǎn)生越準(zhǔn)確(Brinks等人,(2013)Pharma.Res.30:1719-1728)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其含有本發(fā)明的溶葡萄球菌酶變異體。舉例來說，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，其含有溶葡萄球菌酶變異體和藥學(xué)上可接受的載劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種溶葡萄球菌酶變異體(例如去免疫化溶葡萄球菌酶)，其用于藥物組合物中，用于治療或預(yù)防葡萄球菌感染(例如皮膚、傷口或器官)或作為多種活性金黃色葡萄球菌感染的療法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括治療有效量的本發(fā)明溶葡萄球菌酶以及藥學(xué)上可接受的載劑。本發(fā)明不受所利用的藥學(xué)上可接受的載劑的類型限制。實(shí)際上，多種載劑是本領(lǐng)域眾所周知的，包括(但不限于)無菌液體，例如水、油，包括石油、動(dòng)物油、植物油、花生油、豆油、礦物油、芝麻油等等。還可以采用鹽水溶液、右旋糖水溶液和甘油溶液作為液體載劑，尤其用于注射用溶液制劑。適合的藥學(xué)載劑描述于Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版中。

治療有效量為合理地相信溶葡萄球菌酶變異體在治療感染中提供緩解、幫助、防治或預(yù)防作用的一定量度的量。治療有效量可以是相信足夠阻斷細(xì)菌定殖或感染的量。類似地，治療有效量可以是相信足夠減輕(例如根除)已存在的細(xì)菌感染的量。本發(fā)明的藥物組合物尤其可用于預(yù)防、改善和/或治療細(xì)菌感染。

本發(fā)明的組合物可以局部(例如表面)或全身(例如靜脈內(nèi))施用。用于不經(jīng)腸施用的制劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的實(shí)例為丙二醇、聚乙二醇、例如橄欖油等植物油和例如油酸乙酯等可注射有機(jī)酯。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括生理鹽水和緩沖培養(yǎng)基。不經(jīng)腸媒介物包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖和氯化鈉、乳酸化林格氏或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)媒介物包括流體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(例如基于林格氏右旋糖的補(bǔ)充劑)等等。防腐劑和其它添加劑也可以存在，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等等。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以包含其它藥劑，取決于藥物組合物的預(yù)期用途。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“治療(treatment)”、“治療(treating)”等等在本文中一般用以指獲得所需藥理學(xué)和/或生理作用。根據(jù)完全或部分預(yù)防感染，所述作用可以是預(yù)防性的，和/或根據(jù)完全或部分治療(例如根除)細(xì)菌感染，可以治療性的。如本文所用，術(shù)語“治療”包括預(yù)防受試者(例如可能易感染(例如醫(yī)院感染)但尚未被診斷為感染的受試者)中細(xì)菌感染；抑制細(xì)菌感染；和/或(c)減輕感染(例如完全或部分減少負(fù)責(zé)感染的細(xì)菌的存在)。

葡萄球菌感染，例如金黃色葡萄球菌引起的感染，是尤其例如醫(yī)院、學(xué)校和養(yǎng)老院等環(huán)境中發(fā)病率和死亡率的重要原因。尤其處于風(fēng)險(xiǎn)中的患者包括嬰兒、老年人、免疫受損者、免疫抑制者和患有需要頻繁住院的慢性病狀的人。也處于獲得葡萄球菌感染的風(fēng)險(xiǎn)中的患者包括進(jìn)行住院患者或門診患者手術(shù)的患者、在重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)內(nèi)的患者、進(jìn)行連續(xù)血液透析的患者、具有HIV感染的患者、AIDS患者、燒傷受害者、免疫性減弱的人(例如由藥物治療或疾病引起)、長期生病或虛弱的患者、老年受試者、具有不成熟免疫系統(tǒng)的嬰兒和具有血管內(nèi)(例如植入)裝置的人。因此，在一些實(shí)施方案中，含有溶葡萄球菌酶變異體的組合物施用這些類型受試者的任一個(gè)以及具有細(xì)菌感染或容易細(xì)菌感染(例如由金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌(S.epidermidis)引起)的其它受試者。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的溶葡萄球菌酶變異體被調(diào)配成水溶液、半固體配方或用于重構(gòu)的干制劑(例如凍干、結(jié)晶或非晶形，有或無其它溶質(zhì)用于滲透平衡)?？梢栽诶鐭o毒穩(wěn)定的藥學(xué)上可接受的水性運(yùn)載介質(zhì)中在約3至8、典型5至8的pH值下調(diào)配或重構(gòu)，用于通過常規(guī)方案和方式施用，或呈半固體配方，例如乳膏。傳遞可以例如經(jīng)眼施用、靜脈內(nèi)(iv)、肌肉內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)途徑，或鞘內(nèi)，或通過吸入或用于涂布醫(yī)學(xué)裝置、導(dǎo)管和可植入裝置，或通過直接安裝至感染部位中，以允許實(shí)現(xiàn)血液和組織含量超過活性劑的最低抑制濃度(MIC)(例如以實(shí)現(xiàn)微生物滴度減少，從而治愈、減輕或預(yù)防感染)。在一些實(shí)施方案中，抗微生物劑被調(diào)配成半固體配方，例如乳膏(例如用于表面或鼻內(nèi)配方中)。

此外，溶葡萄球菌酶變異體可以與其它抗微生物劑同時(shí)或交替地共同施用，以便更有效地治療感染性疾病。配方可以呈以下或重構(gòu)成以下：用于表面、眼睛或鼻內(nèi)涂覆的半固體配方；適于經(jīng)眼施用的液體；靜脈內(nèi)推注或周圍注射；或添加至較大體積靜脈內(nèi)滴注溶液；或可以呈較大體積或重構(gòu)成較大體積，以通過緩慢的靜脈內(nèi)輸注來施用。舉例來說，溶葡萄球菌酶變異體可以結(jié)合干擾或抑制細(xì)胞壁合成的抗生素施用，這些抗生素為例如青霉素、萘夫西林和其它α或β-內(nèi)酰胺抗生素、頭孢菌素(例如頭孢金素(cephalothin))、氨基糖苷、磺酰胺、抗葉酸劑、大環(huán)內(nèi)酯、喹諾酮(quinolone)、糖肽(例如萬古霉素(vancomycin))和多肽。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體結(jié)合一種或多種抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素(例如氨基糖苷，例如鏈霉素(streptomycin)、四環(huán)素(tetracycline)和鏈陽性菌素(streptogramin))施用。本發(fā)明不受與去免疫化溶葡萄球菌酶共同施用的藥劑的類型限制。實(shí)際上，多種藥劑可以共同施用，包括(但不限于)每一個(gè)以引用的方式整體并入本文中的US 6,028,051、US 6,569,830和US 7,078,377中描述的那些藥劑。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體與以下一起施用：?jiǎn)慰寺】贵w；其它非結(jié)合抗菌酶，例如溶葡萄球菌酶、溶菌酶、變?nèi)芫睾桶０谫|(zhì)酶；肽(例如防御素)；和硫醚抗生素(例如乳鏈菌肽)；或任何其它含羊毛硫氨酸的分子(例如枯草菌素)。

與溶葡萄球菌酶變異體共同施用的藥劑可以連同溶葡萄球菌酶變異體一起呈固定組合調(diào)配，或可以呈可獲得和實(shí)用的任何配方和通過已知在感染部位提供足夠含量的這些藥劑的任何投藥途徑臨時(shí)使用。

在優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的溶葡萄球菌酶變異體具有對(duì)應(yīng)的未去免疫化抗微生物劑的抗菌活性的至少一部分。由于免疫原性降低，所以本發(fā)明的溶葡萄球菌酶變異體施用的劑量可以增加和/或時(shí)間間隔更不頻繁。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體保留對(duì)應(yīng)的未去免疫化抗微生物劑的活性的至少10％。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體保留未去免疫化抗微生物劑的活性的至少20％。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體保留未去免疫化抗微生物劑的活性的至少30％。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體保留未去免疫化抗微生物劑的活性的至少40％。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體保留未去免疫化抗微生物劑的活性的至少50％。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體保留未去免疫化抗微生物劑的活性的至少60％。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體保留未去免疫化抗微生物劑的活性的至少70％。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體保留未去免疫化抗微生物劑的活性的至少80％。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體保留未去免疫化抗微生物劑的活性的至少90％。在一些實(shí)施方案中，溶葡萄球菌酶變異體保留未去免疫化抗微生物劑的活性的90％或更多(例如95％、97％、99％或更多)。

去免疫化溶葡萄球菌酶的適合劑量和方式可以隨感染的嚴(yán)重程度和感染生物體的敏感性而變，且在組合療法的情況下，可能取決于共同施用的具體藥劑(例如抗葡萄球菌劑)。劑量可以在約0.05至約500mg/kg/天范圍內(nèi)(例如在一些實(shí)施方案中，在0.1-10mg/kg/天范圍內(nèi)，在一些實(shí)施方案中，在10-100mg/kg/天范圍內(nèi)，在一些實(shí)施方案中，在100-200mg/kg/天范圍內(nèi)，在一些實(shí)施方案中，在200-400mg/kg/天范圍內(nèi)，在一些實(shí)施方案中，在400-500mg/kg/天范圍內(nèi))，不過可以提供更高(例如500-1000mg/kg/天)或更低(例如0.1-0.5mg/kg/天)，呈單次或分次劑量給與，或通過連續(xù)輸注給與。在一些實(shí)施方案中，去免疫化溶葡萄球菌酶一天一次、一天兩次、一天三次或更頻繁地(例如一天四次或更多次)施用。在一些實(shí)施方案中，去免疫化溶葡萄球菌酶一周一次、一周兩次或每隔一天施用。在一些實(shí)施方案中，去免疫化溶葡萄球菌酶每隔一周一次、一個(gè)月一次、每?jī)蓚€(gè)月一次、每三個(gè)月一次、每四個(gè)月一次、每五個(gè)月一次、每六個(gè)月一次、每九個(gè)月一次、每年一次或更少頻繁地施用。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的去免疫化溶葡萄球菌酶是無糖基化的?？扇绫疚乃鲞M(jìn)行無糖基化，并可在殘基Ser126和/或Thr127處包括突變。示例性突變包括Ser126Pro和Thr127Ala。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的去免疫化溶葡萄球菌酶可以經(jīng)進(jìn)一步修飾以進(jìn)一步降低溶葡萄球菌酶分子的免疫原性，同時(shí)保留抗微生物活性。舉例來說，在一些實(shí)施方案中，去免疫化溶葡萄球菌酶結(jié)合于水溶性聚合物。本發(fā)明不受去免疫化溶葡萄球菌酶結(jié)合的水溶性聚合物的類型限制。實(shí)際上，可以使用多種水溶性聚合物，包括(但不限于)聚(環(huán)氧烷)、聚氧乙基化多元醇和聚(乙烯醇)。聚(環(huán)氧烷)包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、泊洛沙姆(poloxamer)和泊洛沙胺(poloxamine)。本發(fā)明不受所用的結(jié)合類型限制(例如使去免疫化溶葡萄球菌酶連接至一種或多種水溶性聚合物(例如PEG))。在一些實(shí)施方案中，聚(環(huán)氧烷)經(jīng)由聚(環(huán)氧烷)的酰胺鍵(例如由例如N-羥基琥珀酰亞胺酯等活性酯形成)結(jié)合于游離氨基。在一些實(shí)施方案中，在結(jié)合后酯鍵保留在結(jié)合物中。在一些實(shí)施方案中，連接通過去免疫化溶葡萄球菌酶分子中存在的賴氨酸殘基進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合通過短效的可降解鍵進(jìn)行。本發(fā)明不受所利用的可降解鍵的類型限制。實(shí)際上，涵蓋多種鍵可用于本發(fā)明，包括(但不限于)生理學(xué)上可裂解的鍵，包括酯、碳酸酯、氨基甲酸脂、硫酸酯、磷酸酯、酰氧基烷基醚、乙縮醛和縮酮鍵。在一些實(shí)施方案中，利用以下中描述的任一方法、試劑和/或鍵，使去免疫化溶葡萄球菌酶結(jié)合于PEG：US 4,424,311；US 5,672,662；US 6,515,100；US 6,664,331；US 6,737,505；US 6,894,025；US 6,864,350；US 6,864,327；US 6,610,281；US 6,541,543；US 6,515,100；US 6,448,369；US 6,437,025；US 6,432,397；US 6,362,276；US 6,362,254；US 6,348,558；US 6,214,966；US 5,990,237；US 5,932,462；US 5,900,461；US 5,739,208；US 5,446,090和US 6,828,401；和WO 02/02630和WO 03/031581。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的去免疫化溶葡萄球菌酶-水溶性聚合物結(jié)合物由第三方(例如NEKTAR,San Carlos,CA)生產(chǎn)。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合物包括存在于聚合物與去免疫化溶葡萄球菌酶之間的鍵中的可裂解鍵(例如使得當(dāng)裂解時(shí)，聚合物或鍵部分不保留在去免疫化溶葡萄球菌酶分子上)。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合物包括存在于聚合物本身中的可裂解鍵(例如使得當(dāng)裂解時(shí)，少部分的聚合物或鍵部分保留在去免疫化溶葡萄球菌酶分子上)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的去免疫化溶葡萄球菌酶用于治療和/或預(yù)防生物膜(例如如US 2003/0215433和WO 03/082148中所描述)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的去免疫化溶葡萄球菌酶用于預(yù)防和/或治療微生物感染，包括葡萄球菌屬成員的細(xì)菌感染。根據(jù)此類方法，向需要治療的受試者(例如出現(xiàn)金黃色葡萄球菌感染或處于出現(xiàn)金黃色葡萄球菌感染風(fēng)險(xiǎn)中的受試者)施用有效量的去免疫化溶葡萄球菌酶，從而預(yù)防或治療微生物感染。得益于此治療的受試者包括展現(xiàn)感染的臨床征象或癥狀的受試者、暴露于細(xì)菌(例如金黃色葡萄球菌)的受試者或懷疑暴露于細(xì)菌(例如金黃色葡萄球菌)的受試者。有效治療將減少、減弱、抑制或改善眾所周知的感染征象或癥狀。在一些實(shí)施方案中，治療包括鼻部涂覆，例如如US 2003/0211995中所描述；或表面涂覆，例如如US 2004/0192581中所描述。

所選劑量將取決于多種因素，包括所采用的具體去免疫化溶葡萄球菌酶的活性、施用途徑、施用時(shí)間、具體去免疫化溶葡萄球菌酶的排泄或代謝速率、治療持續(xù)時(shí)間、與所采用的具體去免疫化溶葡萄球菌酶組合使用的其它藥物、化合物和/或物質(zhì)、所治療患者的年齡、性別、體重、病狀、整體健康和先前病史以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的類似因素。

本領(lǐng)域的普通醫(yī)師或獸醫(yī)可以容易確定和指定所需要的藥物組合物的有效量。舉例來說，醫(yī)師或獸醫(yī)可以從低于實(shí)現(xiàn)所需治療作用所需水平的水平開始去免疫化溶葡萄球菌酶的劑量，且逐漸增加劑量，直到實(shí)現(xiàn)所需作用。認(rèn)為此在技術(shù)人員技能內(nèi)。

有效劑量還可以在領(lǐng)域公認(rèn)的金黃色葡萄球菌感染模型中確定。存在許多不同的體內(nèi)模型系統(tǒng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用以進(jìn)一步證明在人類中將安全和有效的劑量的功效并幫助鑒別這些劑量。此類動(dòng)物模型系統(tǒng)為公認(rèn)的并在研發(fā)新的人類藥物期間使用。此類模型系統(tǒng)的實(shí)例包括(但不限于)金黃色葡萄球菌傷口感染的豚鼠模型(Kernodle和Kaiser(1994)Antimicrob.Agents Chemother.38:1325-1330)；兔中金黃色葡萄球菌膿腫的兔模型(Fernandez等人,(1999)Antimicrob.Agent Chemother.43:667-671)；金黃色葡萄球菌皮膚感染的小鼠模型(Gisby和Bryant(2000)Antimicrob.Agents Chemother.44:255-260)；深度皮膚金黃色葡萄球菌感染的小鼠模型(Godin等人,(2005)J.Antimicrob.Chemother.55:989-994)；和小鼠腹膜內(nèi)感染模型(Patel等人,(2004)Antimicrob.Agents Chemother.48:4754-4761)。在此類模型中，可以針對(duì)感染測(cè)試治療劑，其中所建立的感染來自用多種金黃色葡萄球菌菌株接種動(dòng)物。此類模型中功效的證明用多種方式測(cè)量，并包括(但不限于)死亡率降低，通過對(duì)取自動(dòng)物的組織或血液樣品的微觀檢驗(yàn)確定的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)減少，乃至評(píng)估動(dòng)物中的傷口愈合。

提供了以下非限制性實(shí)施例以進(jìn)一步說明本發(fā)明。

實(shí)施例1：溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域的去免疫化

材料與方法

試劑和培養(yǎng)基。引物通過標(biāo)準(zhǔn)脫鹽，從IDT Technologies(Coralville,IA)訂購。PCR清除和凝膠提取試劑盒來自Zymo Research(Irvine,CA)。商業(yè)溶葡萄球菌酶購自Sigma(St.Louis,MO)。使用QIAPREP Spin Miniprep試劑盒(Qiagen；Valencia,CA)純化質(zhì)粒。除非另作說明，否則所有酶都從New England BioLabs(Ipswich,MA)獲得，且所有試劑都從VWR Scientific(Philadelphia,PA)獲得。來源于溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域的肽從GenScript(Piscataway,NJ)訂購，并超過85％純。MHC-II DR分子購自Benaroya Research Institute(Seattle,WA)，抗-MHC-IIDR抗體購自Biolegend(San Diego,CA)，且DELFIA Eu標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素來自PerkinElmer(Boston,MA)。

表位預(yù)測(cè)。使用EpiMatrix預(yù)測(cè)溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞表位含量，EpiMatrix是一種預(yù)測(cè)已經(jīng)展示與臨床上觀測(cè)到的治療劑免疫原性非常相關(guān)的評(píng)分矩陣。EpiMatrix是一種用于預(yù)測(cè)HLA結(jié)合的袖珍型方法(Groot和Moise(2007)Curr.Opin.Drug Discover.12月10日)。在此方法中，蛋白質(zhì)被分成重疊9聚體肽，接著評(píng)估每一個(gè)與HLA對(duì)偶基因的結(jié)合潛能?？紤]八種最常見的HLA對(duì)偶基因(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、DRB1*1501)，其代表超過90％的人口(Southwood等人,(1998)J.Immunol.160:3363-3373)?；诮Y(jié)合潛能，分配每種肽對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化Z評(píng)分，接著定位至簇免疫原性量表，此量表表示與隨機(jī)產(chǎn)生的肽所預(yù)期的含量的表位含量偏差(Groot等人,(2013)Exp.Rev.Clin.Pharmacol.6:651-662)。認(rèn)為EpiMatrix“Z”量表上評(píng)分超過1.64的肽(大約最高5％)很可能結(jié)合于對(duì)應(yīng)MHC分子，而最高1％中肽評(píng)分(量表上超過2.32)極有可能結(jié)合(Koren等人,(2007)Clin.Immunol.124:26-32)。如果對(duì)于四個(gè)或更多個(gè)對(duì)偶基因，肽的評(píng)分高于1.64，那么稱含有EpiBar(Weber等人,(2009)Adv.Drug Deliv.Rev.61:965-976)。

溶葡萄球菌酶的同源性模型化。EpiSweep基于兩個(gè)定量量度分析去免疫化變異體：表位評(píng)分和力場(chǎng)能量值。然而，算法使用蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)計(jì)算能量。因?yàn)槿芷咸亚蚓傅木w結(jié)構(gòu)未知，所以基于類似于溶葡萄球菌酶的催化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的可得晶體結(jié)構(gòu)，構(gòu)筑溶葡萄球菌酶模型。通過比較溶葡萄球菌酶的序列與PDB數(shù)據(jù)庫并選擇三種高度類似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(PDB寄存編號(hào)：2B0PA、2B44A和1QWYA)，來選擇模板。出于同源性模型化的目的，認(rèn)為超過30％的序列一致性足夠準(zhǔn)確(Rost(1999)Prot.Eng.Design Select.12:85-94)。所有模板結(jié)構(gòu)都屬于LytM(一種來自金黃色葡萄球菌的自溶素)，其與溶葡萄球菌酶的催化結(jié)構(gòu)域具有48％序列一致性和63％相似性(Lu等人,(2013)上述)。

通過采用MODELLER，使用LytM晶體結(jié)構(gòu)，建立催化結(jié)構(gòu)域模型，MODELLER是一種同源性模型化方案，其基于模板結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)建立蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)(Shen和Sali(2006)Protein Sci.15:2507-2524)。產(chǎn)生250個(gè)模型并根據(jù)DOPE統(tǒng)計(jì)勢(shì)選擇最準(zhǔn)確的一個(gè)(Shen和Sali(2006)上述)。

對(duì)于沒有足夠的坐標(biāo)信息來允許完整和準(zhǔn)確地構(gòu)筑模型的蛋白質(zhì)區(qū)域，使用蛋白質(zhì)環(huán)模型化方法FREAD，來重塑已存在的間隙(Choi和Deane(2010)Proteins 78:1431-1440)。所得同源性模型針對(duì)AMBER99sb與隱式溶劑模型(GB/SA)減到最少。通過使用Scwrl4將電腦模擬突變應(yīng)用至原始模型(Krivov等人,(2009)Proteins:Struct.Funct.Bioinform.77:778-795)，接著能量重新最小化，將去糖基化野生型(125NPT)模型化。

進(jìn)化信息。去免疫化過程需要使預(yù)測(cè)參與MHC結(jié)合的殘基突變。然而，T細(xì)胞表位可能存在于蛋白質(zhì)任一部分中。因此，突變的隨機(jī)選擇會(huì)引起適當(dāng)折疊和功能的破壞。此問題可以通過采用發(fā)現(xiàn)在序列上與標(biāo)靶序列不太相似的點(diǎn)突變來減輕。為了確定哪些突變可用于去免疫化過程，通過運(yùn)行PSI-BLAST(3次迭代，e-值<0.001)收集總共10,000個(gè)LST^CAT同源物。對(duì)這些序列進(jìn)行過濾，以去除與野生型具有>50％間隙或<35％序列一致性的序列。對(duì)一組多樣的218個(gè)代表性序列進(jìn)行次選擇，以使彼此具有至多90％序列一致性。允許的突變是預(yù)測(cè)消去至少一個(gè)假定表位，而如根據(jù)背景概率分布所預(yù)期頻繁地出現(xiàn)的突變(McCaldon和Argos(1988)Proteins 4:99-122)。其它篩選程序排除Pro和Cys的突變、涉及活性位點(diǎn)殘基的突變(32His、36Asp、82His、113His和115His)和先前認(rèn)為不利的突變(Thr43Asp、Ser50Asp、Asn121Asp和Leu135Ser)。

EpiSweep。基于結(jié)構(gòu)的EpiSweep是一種蛋白質(zhì)重新設(shè)計(jì)工具，其允許蛋白質(zhì)去免疫化，同時(shí)保留蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和功能性。該算法將經(jīng)驗(yàn)證的免疫信息與結(jié)構(gòu)模型組合，產(chǎn)生帕累托最佳設(shè)計(jì)，帕累托最佳設(shè)計(jì)接著可以通過實(shí)驗(yàn)針對(duì)最佳免疫原性、穩(wěn)定性和活性評(píng)分進(jìn)行選擇。已經(jīng)描述EpiSweep選擇最佳設(shè)計(jì)的方法(Parker等人,(2013)J.Computation.Biol.20:152-165)。簡(jiǎn)單地說，該算法通過假定蛋白質(zhì)主鏈為剛性并從一組離散旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體選擇最佳側(cè)鏈構(gòu)象解決了穩(wěn)定性問題，構(gòu)象經(jīng)選擇以使總蛋白質(zhì)能量減到最少。評(píng)估所有旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體和旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體對(duì)與主鏈以及彼此發(fā)生沖突的可能性。舉例來說，將發(fā)現(xiàn)含有具有顯著范德華半徑重疊或具有格外高的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體內(nèi)或旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體間能量的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的構(gòu)象棄去(Parker等人,(2013)上述)。

對(duì)于溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域的EpiSweep分析，允許突變負(fù)荷在兩個(gè)至八個(gè)突變之間變化，且限制算法不允許活性位點(diǎn)的突變(His32、Asp36、His82、His113和His115)。此外，算法將不僅在每個(gè)突變負(fù)荷下產(chǎn)生帕累托最佳計(jì)劃(具有最低可能的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體能量的設(shè)計(jì))，而且還產(chǎn)生其它19個(gè)次最佳計(jì)劃(與帕累托最佳計(jì)劃相比具有依序更差的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體能量的設(shè)計(jì))。進(jìn)行此分析，以校正可能由剛性主鏈假設(shè)引起的任何可能的錯(cuò)誤，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的特征為高度柔性。事實(shí)上，已經(jīng)注意到其它側(cè)鏈最佳化改變了EpiSweep設(shè)計(jì)的帕累托最優(yōu)性，因此可能影響到設(shè)計(jì)選擇(Parker等人,(2013)上述)。

Ser126Pro主鏈的EpiSweep分析。對(duì)于使用Ser126Pro溶葡萄球菌酶主鏈的分析，算法僅僅考慮12個(gè)耐受良好的突變(Ser124Gly、Ser122Asp、Asn121Gly、Arg118Thr、Ile99Gln、Lys95Glu、Tyr93His、Leu83Met、Lys46His、Ile41Glu、Asn13His和Asn12Gly)。因?yàn)镾er122Asp突變是極有效的表位去除子(表6)，所以也限制算法在所有產(chǎn)生的計(jì)劃中都包括此突變。使用分子模型化軟件TINKER，針對(duì)AMBER(AMBER99sb)力場(chǎng)和隱式溶劑模型(GB/SA)，進(jìn)行EpiSweep設(shè)計(jì)的其它加工后能量最小化。

質(zhì)粒和菌株。巴斯德畢赤氏酵母菌株GS115和表達(dá)載體pPIC9從Invitrogen(Grand Island,NY)獲得，金黃色葡萄球菌菌株SA113和金黃色葡萄球菌金黃色亞種(ATCC 25923)從美國典型菌種保藏中心(the American Type Culture Collection)(Manassas,VA)獲得。金黃色葡萄球菌的其它菌株(甲氧西林敏感品菌株6445和3425-1，和MRSA菌株3425-3)是臨床分離株。

為表達(dá)巴斯德畢赤氏酵母而最佳化的溶葡萄球菌酶基因的合成.如所述，進(jìn)行合成溶葡萄球菌酶基因的合成(Zhao等人,(2014)Appl.Environ.Microbiol.80:2746-53)。大部分密碼子被替換以反映巴斯德畢赤氏酵母的密碼子偏愛(Zhao等人,(2000)Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 16:308-11)。為破壞基因序列中長A+T核苷酸延伸，根據(jù)需要引入第二頻繁的密碼子。

基于PCR的單點(diǎn)突變體的合成。如所述來合成溶葡萄球菌酶單點(diǎn)突變體(Zhao等人,(2014)上述)。簡(jiǎn)單地說，使用剪接重疊延伸PCR，利用表1中列出的引物，來引入突變。舉例來說，通過首先使用Syn_F和S122G_R以及S122G_F和Syn_R引物擴(kuò)增溶葡萄球菌酶基因，來引入Ser122Gly突變。接著所得(凝膠純化)基因片段以等摩爾比率混合，并用作使用Syn_F和Syn_R引物的隨后反應(yīng)中的模板。最終產(chǎn)物是具有Ser122Gly突變的全長溶葡萄球菌酶基因。所有PCR反應(yīng)都使用PHUSION高保真度DNA聚合酶進(jìn)行。接著用EcoRI和XhoI消化具有所需突變的溶葡萄球菌酶基因，并使用T4DNA接合酶接合至pPIC9質(zhì)粒。接合的最終產(chǎn)物是與來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α交配因子分泌信號(hào)融合的溶葡萄球菌酶基因。將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α電勝任細(xì)胞(F^-80lacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169recA1endA1hsdR17(r^-_K m⁺_K)phoA supE44λ^-thi1gyrA96relA1)中。使用Syn_F和Syn_R引物，評(píng)估克隆中溶葡萄球菌酶基因的存在，并進(jìn)行定序，以證實(shí)突變的存在(引物AOX1_F和AOX1_R)。

表1

LST整合設(shè)計(jì)的克隆。在無Arg118Thr突變下合成在第一輪篩選中未表達(dá)且含有Arg118Thr突變的溶葡萄球菌酶變異體，并再次檢查表達(dá)。使用引物T118R_F和T118R_R(表1)，剪接重疊延伸PCR用以使Arg118Thr突變回復(fù)至野生型(Thr118)。

為制備pPIC9質(zhì)粒用于插入合成基因，將沉默突變引入溶葡萄球菌酶連接子(殘基135-136)中以容納用于限制酶AflII的切割位點(diǎn)。為了引入必要的突變，剪接重疊延伸PCR與引物AflII_F和AflII_R(表1)一起使用。合成基因用XhoI和AflII限制酶消化，并使用T4DNA接合酶接合在類似消化的pPIC9質(zhì)粒中。將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α電勝任細(xì)胞中并對(duì)所得克隆進(jìn)行定序以證實(shí)突變的存在。

巴斯德畢赤氏酵母的表達(dá)和純化。在通過序列分析證實(shí)DH5α克隆存在正確的催化結(jié)構(gòu)域突變后，用SacI高保真度限制酶消化經(jīng)純化的質(zhì)粒，接著電穿孔至巴斯德畢赤氏酵母菌株GS115中。所得轉(zhuǎn)化體在MD板(1.34％酵母氮源、0.000004％生物素、2％右旋糖和1％瓊脂)上生長。對(duì)于表達(dá)研究，克隆在500ml搖瓶中在BMGY培養(yǎng)基(1％酵母提取物、2％胨、1.34％酵母氮源、0.000004％生物素、1％甘油、100mM磷酸鹽緩沖液，pH 6)中在30℃下生長，該搖瓶用四層粗濾布覆蓋以增強(qiáng)流至酵母的氧流量。24小時(shí)后，細(xì)胞在臺(tái)式離心機(jī)中在3,000rpm下離心10分鐘。接著細(xì)胞再懸浮于100ml BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1％酵母提取物、2％胨、1.34％酵母氮源、0.000004％生物素、0.5％甲醇、100mM磷酸鹽緩沖液，pH 6)中并在30℃下生長隨后48小時(shí)。以12小時(shí)的時(shí)間間隔，添加100％甲醇，最終濃度為1％。誘導(dǎo)48小時(shí)后，搖瓶培養(yǎng)物在臺(tái)式離心機(jī)中在3,000rpm下離心15分鐘。所得上清液進(jìn)行過濾以去除任何酵母細(xì)胞并用10mM的pH7.5的KH₂PO₄緩沖劑1:5稀釋。稀釋的上清液流過填充500μlSP-SEPHAROSE快速流動(dòng)樹脂(GE Healthcare；Cleveland,OH)的重力柱。柱用于10mM KH₂PO₄中的50mM NaCl的5ml含在pH 7.5下洗滌。蛋白質(zhì)用于的10mM KH₂PO₄中的200mM NaCl的500μl等分試樣在pH 7.5下洗脫。使用SDS-PAGE測(cè)定溶葡萄球菌酶的純度。使用ND-1000光譜儀(NanoDrop Technologies；Wilmington,DE)定量蛋白質(zhì)濃度。為確保準(zhǔn)確性，針對(duì)野生型溶葡萄球菌酶與其變異體，使用0.4的吸光度調(diào)節(jié)系數(shù)，調(diào)整蛋白質(zhì)吸光度量度。簡(jiǎn)單地說，調(diào)節(jié)系數(shù)計(jì)算為報(bào)導(dǎo)的Abs 0.1％(＝1g/L)值(ProtParam,ExPASy)的倒數(shù)。

培養(yǎng)物上清液的溶解檢定,金黃色葡萄球菌細(xì)胞在胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中在37℃下在震蕩下生長至對(duì)數(shù)中期或者生長至飽和。細(xì)胞通過離心收獲，并在磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS：2.7mM KCl、1.5mM KH₂PO₄、8.9mM Na₂HPO₄、136.9mM NaCl pH 7.4)中洗滌一次。在來自Greiner Bio-One(Monroe,NC)的96孔黑色透明底板中進(jìn)行檢定。最終(250μl)反應(yīng)物由都在PBS中的10μl巴斯德畢赤氏酵母培養(yǎng)物上清液、OD600＝1.5的金黃色葡萄球菌細(xì)胞和5μM SYTOX Green(Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA)構(gòu)成。使用SPECTRAMAX GEMINI熒光微板讀數(shù)器(Molecular Devices；Sunnyvale,CA)，使用504/523nm的激發(fā)/發(fā)射收集數(shù)據(jù)，并從跡線的最陡直線部分的斜率確定速率。用500ng商業(yè)來源的溶葡萄球菌酶(ssLys)作為內(nèi)部對(duì)照，進(jìn)行每個(gè)檢定。

從SDS-PAGE凝膠估計(jì)每個(gè)檢定中使用的蛋白質(zhì)的量。簡(jiǎn)單地說，10μl培養(yǎng)物上清液連同0.5μg、0.7μg和1μg ssLys一起在SDS-PAGE凝膠上在分開的泳道中跑動(dòng)。使用來自Thermo Fisher Scientific(Carlsbad,CA)的GELCODE藍(lán)色染色試劑將凝膠染色，并使用來自Image Lab 5.1軟件(Bio-Rad Laboratories；Hercules,CA)的定量工具定量亮帶。

使用純化蛋白質(zhì)的溶解檢定。使用如先前第2章部分3.2.6中描述的動(dòng)力學(xué)檢定，檢查經(jīng)純化的溶葡萄球菌酶變異體的活性。每個(gè)反應(yīng)中使用200ng經(jīng)純化的酶(代替培養(yǎng)物上清液)。

MIC檢定。通過添加酶的2倍連續(xù)稀釋液至含有補(bǔ)充有2％NaCl和0.1％牛血清白蛋白的Muller Hinton肉湯(BD)中約40,000金黃色葡萄球菌SA113(或金黃色葡萄球菌6445、3425-1、3425-3)細(xì)胞的聚丙烯96孔板(Costar 3879)的孔中達(dá)100μl總體積，來確定野生型溶葡萄球菌酶和其變異體的MIC。培養(yǎng)板在Orbit P4回轉(zhuǎn)式震蕩器(Labnet；Edison,NJ)上在37℃下在900rpm震蕩下生長過夜。經(jīng)純化的溶葡萄球菌酶的抑制活性通過完全抑制細(xì)菌生長的酶的濃度來測(cè)定。針對(duì)每種酶，一式三份地進(jìn)行檢定。

PNGase F處理。將巴斯德畢赤氏酵母培養(yǎng)物上清液用1μl10x G7緩沖液和相同體積的REMOVE-IT PNGase F處理。將反應(yīng)物在37℃下培育1小時(shí)并通過SDS-PAGE分析結(jié)果。

飽和突變誘發(fā)。使用已知的方法進(jìn)行溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域位置125的飽和突變誘發(fā)(Zhao等人,(2014)上述)。簡(jiǎn)單地說，通過使用溶葡萄球菌酶合成基因作為模板和簡(jiǎn)并NNK引物，進(jìn)行剪接重疊延伸PCR，來進(jìn)行飽和突變誘發(fā)。將所得到的32成員的文庫轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤氏酵母中，且轉(zhuǎn)化體在YPD培養(yǎng)基(1％酵母提取物、2％胨、1％甲醇、1％瓊脂)上在30℃下生長48小時(shí)。為了找到表達(dá)活性酶的酵母克隆，將含有金黃色葡萄球菌SA113細(xì)胞的熔融頂部瓊脂(0.5％酵母提取物、1％胨、1％NaCl、0.75％瓊脂)傾倒在YPM酵母板上且在37℃下培育10小時(shí)。使用引物Syn_F和Syn_R挑選形成暈環(huán)的菌落并擴(kuò)增，且使用引物AOX1_F和AOX1_R對(duì)基因定序。

使用巴斯德畢赤氏酵母培養(yǎng)物上清液的MIC檢定。溶葡萄球菌酶MIC基本上如所述(Zhao等人,(2014)上述)測(cè)定。簡(jiǎn)單地說，在TSB中連續(xù)稀釋100μl等分試樣的巴斯德畢赤氏酵母培養(yǎng)物上清液。每個(gè)孔接種100μl含約10⁶CFU/ml金黃色葡萄球菌SA113的TSB。微板在37℃下培育24小時(shí)。培養(yǎng)物上清液中抑制活性被評(píng)估為MIC₅₀，處理稀釋產(chǎn)生50％生長抑制。通過在微板讀數(shù)器中測(cè)量650nm下光散射，定量MIC₅₀。

熱穩(wěn)定性。溶葡萄球菌酶變異體的相對(duì)熱穩(wěn)定性通過如先前所述的差異掃描熒光測(cè)定法來測(cè)定(Niesen等人,(2007)Nat.Protocols2:2212-2221)。蛋白質(zhì)和SYPRO橙在PBS中稀釋(最終濃度分別為20μl反應(yīng)體積中100μg/ml和5x)，并使用Applied Biosystems ABI 7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，從25至94℃以1℃增量，定量熒光。使用Fast Thermocyclers(VWR；Radnor,PA)的PCR板進(jìn)行反應(yīng)。使用預(yù)設(shè)TAMRA參數(shù)定量熒光。通過用‘DSF Analysis v3.0.xlsx’EXCEL表和GraphPad Prism v.6.02軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，來確定熔融溫度。

MHC結(jié)合檢定。如先前所述，使用384孔高通量檢定，進(jìn)行MHC II競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢定(Salvat等人,(2014)上述)。針對(duì)八種對(duì)偶基因進(jìn)行結(jié)合檢定：DRB1*0101、0301、0401、0701、0801、1101、1301和1501。簡(jiǎn)單地說，將由每種MHC II對(duì)偶基因的已知肽抗原構(gòu)成的100nM生物素標(biāo)記的對(duì)照肽在聚丙烯384孔板中與50nM經(jīng)純化的重組MHC II蛋白質(zhì)和LST或變異肽片段的連續(xù)稀釋液(100μM至10nM)一起培育。使用涂布在高度結(jié)合ELISA板上的構(gòu)象特異性抗HLA-DR抗體L243，從平衡溶液捕捉肽-MHC II復(fù)合物。使用DELFIA抗生蛋白鏈菌素-銪結(jié)合物和時(shí)間分辨的熒光(SpectraMax Gemini Fluorescence Microplate Reader)定量結(jié)合的對(duì)照肽。

生物膜降解檢定。金黃色葡萄球菌SA113在TSB中在37℃震蕩下生長過夜。接著細(xì)胞在補(bǔ)充有5％乙醇和0.1％葡萄糖的TSB中1:100稀釋并添加100μl細(xì)胞懸浮液至96孔板(Costar 3595)的孔中。細(xì)胞靜置在37℃下過夜，無震蕩，以形成生物膜。接著所得生物膜在水中洗滌三次，并用100μl中200ng酶處理75分鐘。未處理孔含有含0.1％BSA的PBS。處理后，板在水中洗滌三次，并用0.1％結(jié)晶紫染色15分鐘。接著板在水中再次洗滌三次，且干燥。將200μl 30％乙酸添加至每個(gè)孔并在震蕩下在25℃下溶解結(jié)晶紫染色15分鐘。將脫色物(150μl)轉(zhuǎn)移至新的96孔板并在SPECTRAMAX 190光譜儀(Molecular Devices；Sunnyvale,CA)中在550nm下測(cè)量每個(gè)孔的吸光度。

鼠類肺感染模型。使金黃色葡萄球菌菌株ATCC 25923的過夜LB培養(yǎng)物成球粒，用PBS洗滌兩次，并再懸浮以得到40μl PBS中10⁸-10⁹菌落形成單位(CFU)。通過輸入細(xì)菌懸浮液在LB瓊脂(DIFCO)上連續(xù)稀釋，確定實(shí)際接種物，接著在37℃下培育24小時(shí)。成年雌性C57BL/6J小鼠(8至12周齡；Jackson Laboratories,Detroit,MI)暫時(shí)用異氟烷麻醉并經(jīng)由口咽吸氣，接種40μl細(xì)菌懸浮液。感染后1小時(shí)，第二次40μl PBS接種，含有2.5μg野生型LST、2.5μg變異體柔性5、2.5μg變異體柔性9或空白對(duì)照。感染后24小時(shí)，處死小鼠，且切除肺，置于1ml冷PBS中并均質(zhì)化。通過將連續(xù)稀釋液涂鋪至LB瓊脂上，接著在37℃下培育24小時(shí)來確定肺勻漿中活細(xì)菌數(shù)。

HUMI鼠類免疫原性研究。通過如所述，手術(shù)移植人類骨髓、肝和胸腺組織至NOD/SCID/γ_c^-/-小鼠(Dartmouth Transgenics&Genetic Constructs Shared Resource)，來構(gòu)筑HUMI小鼠(Brainard等人,(2009)J.Virol.83:7305-21)。從相同人類供體人類化所有動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)使用的小鼠具有至少其總外周血白血球25％的人類淋巴細(xì)胞。移植后十四周，將12只雌性HUMI小鼠分成3組，每組4只，并通過單次50μl皮下注射完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)中的100μg野生型LST、100μg變異體柔性5或100μg變異體柔性9來接種。免疫接種后兩周，處死小鼠并針對(duì)每個(gè)組，收獲脾細(xì)胞且匯集。匯集的脾細(xì)胞(5×10⁵個(gè)/孔)用含有5％胎牛血清、l-谷氨酰胺、抗生素和最終濃度為10μg/ml LST或變異體(或1％DMSO作為對(duì)照)的培養(yǎng)基一式三份涂鋪至96孔板中。培育72小時(shí)后，孔用1μCi[³H]胸苷(Dupont NEN,Boston,Mass.)進(jìn)行脈沖，且6小時(shí)后收獲至UNIFILTER 96孔GF/C板上，以通過閃爍計(jì)數(shù)(Packard MicroSant NXT計(jì)數(shù)器)評(píng)估胸苷并入。

轉(zhuǎn)基因DR4鼠類免疫原性研究。將12只雌性6-8周齡DR4轉(zhuǎn)基因小鼠(Abb剔除/轉(zhuǎn)基因HLA-DR4；B6.129S2-H2-Ab1tm1GruTg(HLA-DRA/H2-Ea,HLA-DRB1*0401/H2-E b)1Kito；Taconic Farms,Germantown,NY)分成四組，每組三只，并通過50μl野生型LST的皮下注射液使用以下四個(gè)方案之一進(jìn)行免疫接種：(i)初始用CFA中100μg酶免疫接種，接著在第14天和第28天加打不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)中100μg；(ii)初始用CFA中20μg酶免疫接種，接著在第14天和第28天加打IFA中20μg；(iii)初始用PBS緩沖液中100μg酶免疫接種，接著在第7天、第14天、第21天和第28天加打PBS緩沖液中100μg；(iv)初始用PBS緩沖液中20μg酶免疫接種，接著在第7天、第14天、第21天和第28天加打PBS緩沖液中20μg。在第13天、第20天、第27天、第34天和第62天測(cè)量針對(duì)野生型LST的血清IgG抗體滴度。最后加打后五周，所有12只小鼠展現(xiàn)1:40血清稀釋下同等的最大ELISA信號(hào)且所有信號(hào)都在1:160稀釋下的20％內(nèi)。小鼠無進(jìn)一步操縱下圈養(yǎng)，直至研究第23周，此時(shí)再次測(cè)量血清IgG抗體滴度且小鼠被分成具有同等平均抗體滴度的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組。注意在第9周至第23周恢復(fù)時(shí)期期間，兩只小鼠(最低滴度100μg無佐劑和一個(gè)高滴度100μg佐劑)開始經(jīng)歷掉發(fā)、重量減輕和活動(dòng)性降低并根據(jù)IACUC批準(zhǔn)方案處死。在第24周，一組用IFA中100μg野生型LST再攻擊，且另一組用IFC中100μg變異體柔性5攻擊。在第26周，處死小鼠并針對(duì)每個(gè)組，收獲脾細(xì)胞且匯集。如上所述進(jìn)行增殖檢定。

生物信息分析。使用ClustalW進(jìn)行溶葡萄球菌酶和其同源序列ALE-1和LytM的序列比對(duì)。

表位預(yù)測(cè)

Asn125Gln突變體的溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域的EpiMatrix分析(Zhao等人,(2014)上述)展示該結(jié)構(gòu)域具有許多預(yù)測(cè)的T細(xì)胞表位，總表位評(píng)分為46。蛋白質(zhì)具有14例預(yù)測(cè)最高1％結(jié)合子(評(píng)分>2.32)和32例最高5％結(jié)合子(評(píng)分>1.64)。還發(fā)現(xiàn)序列含有三個(gè)EpiBar(至少四個(gè)對(duì)偶基因具有1.64或更高的評(píng)分的肽)，其中肽¹¹⁶FQRMVNSFS¹²⁴(SEQ ID NO:88)被預(yù)測(cè)為對(duì)所有八種對(duì)偶基因具有高度免疫原性(表2)。

表2

選擇最頻繁的突變用于初步設(shè)計(jì)分析

EpiSweep產(chǎn)生總共1,533個(gè)計(jì)劃，其中81個(gè)計(jì)劃被評(píng)估為在兩個(gè)至八個(gè)突變的突變負(fù)荷下的帕累托最佳計(jì)劃。此時(shí)，可僅僅選擇一組設(shè)計(jì)，接著針對(duì)適當(dāng)折疊和活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。然而，先前的根據(jù)基于序列的EpiSweep產(chǎn)生去免疫化溶葡萄球菌酶的工作未產(chǎn)生活性變異體?；诮Y(jié)構(gòu)的EpiSweep被設(shè)計(jì)成一種交替法，其應(yīng)產(chǎn)生更佳的結(jié)果。假定不準(zhǔn)確的溶葡萄球菌酶代表可能引起誤差，使用迭代反饋策略，其中測(cè)試15個(gè)最頻繁的突變(個(gè)別)對(duì)蛋白質(zhì)折疊(表達(dá))和活性的影響。

結(jié)果(表3)展示最頻繁的15個(gè)突變存在于總計(jì)劃的9％-67％和帕累托最佳計(jì)劃的1％-65％中。發(fā)現(xiàn)突變都在催化結(jié)構(gòu)域的表面上。EpiSweep不常使用隱藏的殘基。實(shí)際上，隱藏的殘基Ser49Gly和Ser49Ala分別占據(jù)第18和第20突變。預(yù)測(cè)參與MHC結(jié)合的氨基酸包括堿性(Arg/Lys)、極性不帶電(Ser/Asn/Tyr)和非極性殘基(Phe/Leu/Ile)。這些殘基經(jīng)非極性(Gly/Met)、酸性(Asp/Glu)、堿性(His)或極性不帶電(Thr/Gln/Tyr)氨基酸置換。

表3

預(yù)測(cè)突變顯著減少肽與MHC的結(jié)合且產(chǎn)生更少免疫原性的變異體(表4)。在所有產(chǎn)生的肽中，可以看到突變命中的數(shù)目(預(yù)測(cè)肽結(jié)合的對(duì)偶基因的數(shù)目)低于野生型肽。舉例來說，預(yù)測(cè)野生型QRMVNSFSQ(SEQ ID NO:107)肽中位置118的Arg至Thr突變消去兩個(gè)表位且導(dǎo)致跨越所有對(duì)偶基因，Z評(píng)分為0。一些更多免疫原性的區(qū)域更難以處理單一突變。然而，可以觀測(cè)到即使單個(gè)突變也會(huì)對(duì)降低總免疫原性評(píng)分具有有意義的影響。舉例來說，Ser122Asp突變消去兩個(gè)表位并使總命中數(shù)目從14降低至8。

表4

突變以粗體展示。

修飾溶葡萄球菌酶序列用于巴斯德畢赤氏酵母表達(dá)

最初企圖在巴斯德畢赤氏酵母中制備模仿葡萄球菌溶葡萄球菌酶被缺乏蛋白質(zhì)表達(dá)阻礙。因此，對(duì)基因進(jìn)行修飾以在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)(Zhao等人,(2014)上述)。簡(jiǎn)單地說，調(diào)整野生型溶葡萄球菌酶的序列以反映巴斯德畢赤氏酵母的密碼子偏愛。另外，鑒別序列中具有不相稱A+T含量的長區(qū)段并加以破壞。發(fā)現(xiàn)基因的新型式(SYN溶葡萄球菌酶)在搖瓶培養(yǎng)物中產(chǎn)生多達(dá)80mg/L的蛋白質(zhì)，并在2L生物反應(yīng)器中產(chǎn)生500mg/L(Zhao等人,(2014)上述)。

隨后用SYN溶葡萄球菌酶進(jìn)行的表達(dá)實(shí)驗(yàn)展示蛋白質(zhì)作為SDS-PAGE中雙重線遷移。懷疑所觀測(cè)到的雙重線歸因于蛋白質(zhì)N-糖基化。溶葡萄球菌酶序列的仔細(xì)檢查揭露其在位置125含有糖基化序列子。N-聚糖的存在通過培養(yǎng)物上清液的PNGase處理證實(shí)。一經(jīng)處理，蛋白質(zhì)即作為SDS-PAGE中單線遷移。

通過引入保守Asn->Gln、Asn->Ser和Asn->Asp單點(diǎn)突變，企圖破壞Asn125糖基化序列子。此分析的結(jié)果表明這些突變體展現(xiàn)類似的表達(dá)水平，但活性分別比野生型酶降低10、20和40倍。

在隨后研究中，通過飽和突變誘發(fā)來構(gòu)筑文庫以確定在位置125上可以容許除Asn以外的哪些其它殘基且仍然允許破壞N-糖基化序列(Zhao等人,(2014)上述)。文庫結(jié)果和隨后溶葡萄球菌酶序列與其同源物(ALE-1和LytM)的比對(duì)表明Asn125是保守殘基，因而需要集中于使糖基化序列子的其它殘基突變。因此，合成兩種其它突變體Ser126Pro和Thr127Ala，且發(fā)現(xiàn)其成功預(yù)防N-糖基化。將這些突變體與野生型溶葡萄球菌酶相比且發(fā)現(xiàn)其展現(xiàn)同等活性。因?yàn)樾枰耆钚缘娜ヌ腔蛔凅w，所以選擇溶葡萄球菌酶Ser126Pro用于使用EpiSweep算法進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)評(píng)估。

去糖基化溶葡萄球菌酶的EpiSweep校正

用EpiMatrix和EpiSweep分析Ser126Pro溶葡萄球菌酶主鏈，以確定表位評(píng)分并比較最頻繁的突變。結(jié)果展示變成Ser126Pro突變體增加預(yù)測(cè)的表位評(píng)分。與Asn125Gln主鏈的表位評(píng)分46相比，Ser126Pro的總表位評(píng)分為50(表2)。EpiMatrix分析還展示Ser126Pro具有五個(gè)EpiBar(至少四個(gè)對(duì)偶基因具有1.64或更高的Z評(píng)分的肽)，而Asn125Gln具有三個(gè)。Ser126Pro主鏈具有15例預(yù)測(cè)最高1％結(jié)合子(評(píng)分>2.32)和35例最高5％MHC結(jié)合子(評(píng)分>1.64)。肽¹¹⁶FQRMVNSFS¹²⁴(SEQ ID NO:88)與Asn125Gln主鏈中一樣仍然有同等問題，且預(yù)測(cè)其對(duì)所有八種都具有高免疫原性。存在于Ser126Pro主鏈中的四個(gè)新表位被引入肽¹¹⁹MVNSFSNPT¹²⁷(SEQ ID NO:142)和¹²⁰VNSFSNPTA¹²⁸(SEQ ID NO:143)(表5)。

表5

Ser126Pro主鏈的EpiSweep分析產(chǎn)生總共2,333個(gè)計(jì)劃，其中96個(gè)計(jì)劃被評(píng)估為在兩個(gè)至八個(gè)突變的突變負(fù)荷下帕累托最佳計(jì)劃(與Asn125Gln主鏈比較，Asn125Gln主鏈產(chǎn)生總共1,533個(gè)計(jì)劃，其中81個(gè)計(jì)劃為帕累托最佳)。表6比較在Asn125Gln和Ser126Pro主鏈中發(fā)現(xiàn)的最頻繁的突變。在變成新的主鏈后突變模式未顯著改變。大部分的突變保持在最高15個(gè)，其中僅僅四個(gè)突變例外：分別移至位置16、18、23和24的Ser122Gly、Ser124Gly、Leu83Met和Ile99Gln。最頻繁的突變Arg118Thr在兩個(gè)主鏈中仍然占優(yōu)勢(shì)。雖然在Asn125Gln主鏈中，所有15個(gè)最頻繁的突變都是表面暴露的殘基，但新的主鏈推動(dòng)隱藏殘基Ser49Gly至最高15個(gè)。大部分的突變?cè)诳傆?jì)劃和最佳計(jì)劃中類似地代表，其中例外為Ser124Gly，其從存在于72％計(jì)劃中變成不存在于用Ser126Pro主鏈選擇的任何最佳計(jì)劃中。最頻繁的15個(gè)突變(根據(jù)Asn125Gln主鏈評(píng)估)存在于使用Ser126Pro主鏈產(chǎn)生的總計(jì)劃的2％-82％和帕累托最佳計(jì)劃的0％-88％中。

表6

仍然預(yù)測(cè)基于Asn125Gln主鏈的15個(gè)突變顯著地降低殘基與MHC II的結(jié)合且在Ser126Pro主鏈中產(chǎn)生更少免疫原性的變異體(表7)。預(yù)測(cè)的缺失基本上類似于由Asn125Gln得到的缺失。Asn125Gln下總突變體命中率為35(Ser126Pro下為40)，且野生型命中率為84(Ser126Pro下為88)，因此兩個(gè)主鏈靶向約相同數(shù)目的表位。

觀測(cè)到的一個(gè)顯著差異是Arg118Thr突變，其在Asn125Gln主鏈中消去兩個(gè)表位，在Ser126Pro主鏈中未消去任何表位。然而，更仔細(xì)的檢查展示Arg118Thr幫助其它突變消去更多表位。舉例來說，當(dāng)Arg118Thr與Ser122Asp組合時(shí)，兩個(gè)突變消去總共13個(gè)表位。因而，進(jìn)一步的研究不排除Arg118Thr突變。然而，排除Ser122Gly突變，因?yàn)槠浒邢蚺cSer122Asp相同的殘基，但僅僅消去三個(gè)表位(與預(yù)測(cè)Ser122Asp去除10個(gè)相對(duì)比)。

表7

突變以粗體展示。

溶葡萄球菌酶變異體的表達(dá)水平和活性

即使算法集中在僅僅催化結(jié)構(gòu)域的去免疫化上，也要注意在全長成熟蛋白質(zhì)的情況下測(cè)試單點(diǎn)突變體以確保適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊。因?yàn)槿芷咸亚蚓阜置谥僚囵B(yǎng)基中，所以認(rèn)為從培養(yǎng)上清液簡(jiǎn)單分析溶葡萄球菌酶活性足夠評(píng)估單點(diǎn)突變對(duì)蛋白質(zhì)的作用。

溶葡萄球菌酶單點(diǎn)突變體的分析揭露所有變異體都在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)。因此，最頻繁的EpiSweep突變中無一個(gè)消除表達(dá)。具有最低表達(dá)水平的兩種突變是Arg118Thr和Ser124Tyr，分別是野生型表達(dá)水平的47％和35％。此外，13個(gè)溶葡萄球菌酶變異體之活性等于或者超過野生型酶。點(diǎn)突變體Phe38Gly是活性低于野生型(69％)的兩種突變之一。具有低活性的第二突變是Ser124Tyr，具有野生型活性的16％。因?yàn)镻he38Gly和Ser124Tyr未滿足超過野生型活性70％的閾值活性水平，所以沒有酶包括在進(jìn)一步研究中。雖然Arg118Thr突變的表達(dá)水平少于野生型酶的50％，但考慮到此突變所去除的表位數(shù)目，進(jìn)一步分析此酶。

主鏈柔性調(diào)整

使用EpiSweep獲得的所有設(shè)計(jì)都采用剛性主鏈(本文中稱為“剛性”主鏈設(shè)計(jì))。然而，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)以其高水平柔性出名，所以設(shè)想在加工后能量最小化步驟中保持主鏈固定通過引起不精確的能量評(píng)估而可能有損去免疫化變異體的準(zhǔn)確性。已經(jīng)觀測(cè)到完全剛性設(shè)計(jì)與在最小化期間允許側(cè)鏈松馳(而主鏈固定)的設(shè)計(jì)在能量-表位評(píng)分概況上完全不同(Parker等人,(2013)上述)。因此，為以計(jì)算允許的方式實(shí)現(xiàn)柔性，進(jìn)行EpiSweep設(shè)計(jì)的其它加工后能量最小化(本文中稱為“柔性”主鏈設(shè)計(jì))。此分析的結(jié)果展示兩個(gè)主鏈之間存在實(shí)際上明顯移動(dòng)。

所選突變的EpiSweep分析

如上所述，分析15個(gè)最頻繁的突變的表達(dá)和活性?；诖朔治?，兩個(gè)突變由于不令人滿意的活性值而略去。另外，因?yàn)镾er122Gly靶向與Ser122Asp相同的殘基，所以去除Ser122Gly，與Ser122Gly突變的三個(gè)表位比較，Ser122Asp消去10個(gè)表位。在Ser126Pro主鏈情況下最頻繁的突變Arg118Thr未消去任何表位，且具有相對(duì)較低的表達(dá)水平。然而，因?yàn)锳rg118Thr幫助其它突變靶向表位，所以維持Arg118Thr。舉例來說，當(dāng)Arg118Thr與Ser122Asp組合時(shí)，Arg118Thr突變靶向總共13個(gè)表位。結(jié)果，數(shù)據(jù)集含有12個(gè)不同的突變：Ser124Gly、Ser122Asp、Asn121Gly、Arg118Thr、Ile99Gln、Lys95Glu、Tyr93His、Leu83Met、Lys46His、Ile41Glu、Asn13His和Asn12Gly。

再一次進(jìn)行EpiSweep分析，但限制算法使用僅僅12個(gè)非常容許的突變。允許突變負(fù)荷在兩個(gè)至八個(gè)突變之間變化，且限制算法不在活性位點(diǎn)引入突變(His32、Asp36、His82、His113和His115)。因?yàn)橛^測(cè)到Ser122Asp突變是極有效的表位去除子，所以限制算法在所有產(chǎn)生的計(jì)劃中包括此突變。如前所述，算法在每個(gè)突變負(fù)荷下產(chǎn)生帕累托最佳計(jì)劃和其它19個(gè)次最佳計(jì)劃。發(fā)現(xiàn)最低表位評(píng)分是24，且僅僅可用含有八種突變的計(jì)劃實(shí)現(xiàn)。最高表位評(píng)分是40，且具有此評(píng)分的計(jì)劃僅僅具有強(qiáng)迫的Ser122Asp突變。

選擇沿著帕累托最佳曲線的大量計(jì)劃(在固定表位評(píng)分和突變負(fù)荷下具有最低可能的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體能量的設(shè)計(jì))。EpiSweep分析產(chǎn)生剛性主鏈計(jì)劃，且選擇在兩個(gè)至八個(gè)突變范圍內(nèi)的突變負(fù)荷下總共14個(gè)帕累托最佳計(jì)劃，其中表位評(píng)分在24(最低)至36范圍內(nèi)。因?yàn)橐吧腿芷咸亚蚓钢麈溇哂?0的表位評(píng)分，所以設(shè)想此范圍覆蓋顯著去免疫化的設(shè)計(jì)。

為解決蛋白質(zhì)柔性問題，還包括14個(gè)在加工后進(jìn)行能量最小化的設(shè)計(jì)(柔性主鏈設(shè)計(jì))。選擇與剛性主鏈設(shè)計(jì)相同表位評(píng)分和突變負(fù)荷的設(shè)計(jì)，使得可以直接評(píng)估獲得變異體的兩種不同方法。舉例來說，如果選擇具有八個(gè)突變和表位評(píng)分為24的帕累托最佳剛性計(jì)劃，那么選擇相同突變負(fù)荷和表位評(píng)分的柔性主鏈設(shè)計(jì)。當(dāng)面對(duì)若干選項(xiàng)時(shí)，選擇最低旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體能量的柔性主鏈設(shè)計(jì)。因?yàn)槠淠芰孔钚』?，所以這些設(shè)計(jì)不出現(xiàn)在帕累托邊界上。應(yīng)注意剛性與柔性主鏈設(shè)計(jì)之間共享兩個(gè)突變計(jì)劃。

合成變異體的表達(dá)水平和活性

每個(gè)溶葡萄球菌酶變異體在搖瓶培養(yǎng)中生長，且通過SDS-PAGE檢查表達(dá)水平。對(duì)發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)上清液中以有意義的水平表達(dá)的計(jì)劃(通過SDS-PAGE檢測(cè))進(jìn)一步表征其相對(duì)特定活性。結(jié)果展示28個(gè)剛性和柔性主鏈計(jì)劃中，僅僅11個(gè)表達(dá)。發(fā)現(xiàn)除剛性1外所有變異體的表達(dá)水平都低于野生型溶葡萄球菌酶。

所有計(jì)劃(除柔性1外；SEQ ID NO:32)都具有低于野生型酶的活性，但僅僅兩個(gè)具有低于商業(yè)大腸桿菌產(chǎn)生的溶葡萄球菌酶的活性。注意到在巴斯德畢赤氏酵母中產(chǎn)生的野生型溶葡萄球菌酶的活性與ssLys之間存在顯著差異。在總共11個(gè)表達(dá)計(jì)劃中，六個(gè)是柔性主鏈設(shè)計(jì)且五個(gè)是剛性主鏈設(shè)計(jì)。剛性設(shè)計(jì)突變負(fù)荷在兩個(gè)至六個(gè)范圍內(nèi)，且柔性在兩個(gè)至八個(gè)范圍內(nèi)。

計(jì)劃的活性水平隨突變數(shù)目增加而降低。在柔性而非剛性主鏈設(shè)計(jì)中更觀測(cè)到此趨勢(shì)。類似地，在柔性計(jì)劃中，發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平隨突變負(fù)荷增加而減少。在剛性主鏈設(shè)計(jì)中未觀測(cè)到此趨勢(shì)，因?yàn)闊o論突變負(fù)荷如何，其表達(dá)水平仍舊低。具有高表達(dá)水平的唯一剛性設(shè)計(jì)是兩個(gè)突變?cè)O(shè)計(jì)剛性1，其為剛性與柔性設(shè)計(jì)之間共享(又稱為柔性14)。

未表達(dá)突變體的分析

因?yàn)樯儆谝话氲暮铣稍O(shè)計(jì)以有意義的水平表達(dá)，所以分析未表達(dá)的設(shè)計(jì)的突變模式。此分析展示表達(dá)和未表達(dá)的設(shè)計(jì)共享大部分突變。例如Leu83Met、Tyr93His和Lys95Glu等一些突變存在于大部分未表達(dá)的計(jì)劃中，但僅僅存在于幾個(gè)表達(dá)計(jì)劃中。類似地，Arg118Thr存在于僅僅幾個(gè)表達(dá)計(jì)劃中，但不同于任何其它突變(排除強(qiáng)迫的Ser122Asp突變)，可以在所有未表達(dá)的計(jì)劃中發(fā)現(xiàn)其(表8)。

表8

^E，表達(dá)。^N，未表達(dá)。雙線將表達(dá)與未表達(dá)的計(jì)劃分開。

因?yàn)檩^早期的結(jié)果展示突變Arg118Thr具有相對(duì)較低表達(dá)水平(少于野生型50％)，所以設(shè)想大部分合成計(jì)劃中觀測(cè)到的表達(dá)缺乏可歸因于Arg118Thr突變。為測(cè)試此，在所有具有此突變的計(jì)劃中，使突變回復(fù)至野生型。

原始與回復(fù)計(jì)劃的表征

所有表達(dá)計(jì)劃進(jìn)行純化，用于活性和穩(wěn)定性的進(jìn)一步表征。此外，評(píng)估最初具有Arg118Thr突變但現(xiàn)在在相同位置具有野生型殘基的所有設(shè)計(jì)(回復(fù)計(jì)劃)。此分析的結(jié)果展示于表9中。

表9

回復(fù)計(jì)劃用*指示。

總共32個(gè)計(jì)劃(原始和回復(fù))中，發(fā)現(xiàn)28個(gè)表達(dá)。28個(gè)良好表達(dá)的計(jì)劃進(jìn)行純化并針對(duì)其活性和穩(wěn)定性表征。在初步分析期間，發(fā)現(xiàn)剛性3和剛性14在培養(yǎng)上清液中微弱表達(dá)。剛性8和12的回復(fù)型式未顯著地提高表達(dá)。此四個(gè)計(jì)劃可能由于存在除Arg118Thr外的其它突變而具有低表達(dá)水平，但未能發(fā)現(xiàn)明顯突變模式。發(fā)現(xiàn)Arg118Thr突變變回野生型序列的所有其它計(jì)劃良好表達(dá)。因而，Arg118Thr突變似乎影響大部分計(jì)劃的表達(dá)。

結(jié)果展示與野生型酶相比，變異體具有高水平的活性和穩(wěn)定性?；钚灾当磉_(dá)為野生型活性％，且在92％(剛性13*)至36％(柔性4*)范圍內(nèi)。觀測(cè)到的MIC值接近野生型，最高為0.25μg/ml(柔性3*、柔性7*和剛性4*)。Tm值還類似于在野生型酶中觀測(cè)到的值，其中最低Tm展示穩(wěn)定性下降12.3℃(剛性13，表9)。

此分析表明突變負(fù)荷增加引起變異體的活性/Tm值下降和MIC值增加。平均下來，與柔性設(shè)計(jì)相比，剛性設(shè)計(jì)具有更高特定活性和更低MIC值。然而，柔性設(shè)計(jì)的總穩(wěn)定性比剛性設(shè)計(jì)好，如平均Tm值更高所證明?；陔p尾t檢驗(yàn)的結(jié)果，在兩個(gè)設(shè)計(jì)組之間觀測(cè)到的差異是統(tǒng)計(jì)上顯著的(p值<0.03)。

設(shè)計(jì)被分成七個(gè)不同組(表10)，用于進(jìn)一步表征。使用來自表9的數(shù)據(jù)，計(jì)算每個(gè)設(shè)計(jì)組的柔性/剛性能量、突變負(fù)荷、活性和穩(wěn)定性之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient)。

表10

NM，突變數(shù)目；Act.，活性；FE，柔性能量；RE，剛性能量。

當(dāng)一起考慮時(shí)，所有28個(gè)設(shè)計(jì)都展示突變數(shù)目與MIC值之間的弱正相關(guān)(表10，所有設(shè)計(jì))。因此，因?yàn)樽儺愺w的突變負(fù)荷增加，所以其活性降低(MIC值增加)。發(fā)現(xiàn)在回復(fù)的剛性和所有剛性計(jì)劃中突變數(shù)目與MIC之間的正相關(guān)更強(qiáng)。

當(dāng)所有計(jì)劃一起分析時(shí)不明顯的其它相關(guān)性在分別評(píng)估設(shè)計(jì)時(shí)變得顯而易見。舉例來說，觀測(cè)到在原始柔性計(jì)劃、回復(fù)的剛性計(jì)劃和所有剛性計(jì)劃中突變負(fù)荷與活性之間存在強(qiáng)的負(fù)相關(guān)。還發(fā)現(xiàn)柔性原始、柔性回復(fù)和所有柔性計(jì)劃中突變數(shù)目與Tm值之間發(fā)現(xiàn)強(qiáng)的負(fù)相關(guān)。

總體上，當(dāng)一起考慮所有設(shè)計(jì)時(shí)，未在能量與活性/穩(wěn)定性項(xiàng)之間觀測(cè)到強(qiáng)相關(guān)。唯一觀測(cè)到的有意義的相關(guān)性是柔性能量與Tm之間的弱負(fù)相關(guān)(表10，所有設(shè)計(jì))。觀測(cè)到的柔性能量與活性項(xiàng)之間的相關(guān)性具有與預(yù)期相反的符號(hào)。另一方面，剛性能量與活性之間的相關(guān)性不顯著，而剛性能量與Tm之間的相關(guān)性具有不正確的符號(hào)。因此，為進(jìn)一步檢查能量是否是一種可靠的預(yù)測(cè)工具，評(píng)估能量組分與實(shí)驗(yàn)測(cè)定的活性和穩(wěn)定性值之間的相關(guān)性。

即使柔性和剛性能量不是活性的重要預(yù)測(cè)因子，也發(fā)現(xiàn)可以使用由溶劑相互作用產(chǎn)生的能量代之(表11)。如針對(duì)功能預(yù)測(cè)因子所預(yù)期，溶劑能量與活性具有負(fù)(不過弱)相關(guān)，且與MIC值更強(qiáng)正相關(guān)。

表11

綜合來說，這些結(jié)果表明柔性主鏈能量為相對(duì)優(yōu)良的穩(wěn)定性預(yù)測(cè)工具，而由溶劑相互作用產(chǎn)生的能量似乎為使用MIC檢定觀測(cè)到的實(shí)驗(yàn)活性的最佳預(yù)測(cè)因子。

表征溶葡萄球菌酶變異體的免疫反應(yīng)性

野生型溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域中的預(yù)測(cè)表位廣泛分布在溶葡萄球菌酶序列中，但大部分表位可以分成五個(gè)簇(圖2)。預(yù)測(cè)大部分的表位具有大量結(jié)合事件。

為了評(píng)估變異體的相對(duì)免疫原性，設(shè)計(jì)總共26個(gè)跨越溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域的序列的合成肽。具體地說，集中在圖2中所示的五個(gè)免疫原性簇。對(duì)于所列出的每個(gè)簇，設(shè)計(jì)野生型肽和對(duì)應(yīng)的突變肽。突變肽含有計(jì)劃中出現(xiàn)的單個(gè)突變與突變組合。

在合成肽的情況下，評(píng)估每個(gè)突變消除表位的預(yù)測(cè)潛能。在簇2(⁴⁵VKAISSGKI⁵³，SEQ ID NO:97)、簇3(⁸⁰WMHLSKYNV⁸⁸，SEQ ID NO:147)和簇5(¹¹⁶FQRMVNSFS¹²⁴，SEQ ID NO:88；¹¹⁹MVNSFSNPT¹²⁷，SEQ ID NO:142；和¹²⁰VNSFSNPTA¹²⁸，SEQ ID NO:143)中發(fā)現(xiàn)EpiBars(在EpiMatrix免疫原性量表上至少四個(gè)對(duì)偶基因具有1.64或更高的Z評(píng)分的肽)。

在高通量MHC II結(jié)合檢定中實(shí)驗(yàn)評(píng)估每種肽與八種MHC II對(duì)偶基因的結(jié)合潛能。EpiSweep產(chǎn)生的突變一般減輕肽與MHC的結(jié)合。168個(gè)逐對(duì)比較中，在73個(gè)情況下突變降低結(jié)合親和力，在60個(gè)情況下沒有影響，且在35個(gè)情況下增加結(jié)合。如果觀測(cè)到IC₅₀值小于0.1μM，那么肽分類為強(qiáng)結(jié)合子，如果IC₅₀值在0.1-1μM范圍內(nèi)，那么為中度結(jié)合子，且如果IC₅₀值在1-10μM范圍內(nèi)，那么為弱結(jié)合子。所有超過10μM的肽都視為非結(jié)合子。

使用10μM截止值將結(jié)合子與非結(jié)合子分離，將EpiMatrix預(yù)測(cè)(在5％閾值下)與MHC II結(jié)合結(jié)果相比。計(jì)算真陽性(準(zhǔn)確預(yù)測(cè)的結(jié)合子)、真陰性(準(zhǔn)確預(yù)測(cè)的非結(jié)合子)、假陽性(不正確預(yù)測(cè)的結(jié)合子)和假陰性(不正確預(yù)測(cè)的非結(jié)合子)的百分比。結(jié)果表明總預(yù)測(cè)成功率為70％，結(jié)果稍微低于先前公布的研究，先前公布的研究指出預(yù)測(cè)率為約76％(Groot等人,(2011)Immunome Res.7:2-7；Moise等人,(2013)Humm.Vaccin.Immunother.9:2060-2068)。對(duì)偶基因特定的檢查揭露了對(duì)于DRB1*0101、0301、0401和0701，預(yù)測(cè)在先前觀測(cè)的范圍內(nèi)。未能發(fā)現(xiàn)0801的數(shù)據(jù)。觀測(cè)到對(duì)于1301，大部分肽登記為弱或非結(jié)合子。此觀測(cè)將表明用于1301的測(cè)試肽可能為真實(shí)強(qiáng)結(jié)合子，因而將數(shù)據(jù)移向較小預(yù)測(cè)成功率。類似地，1101和1501的預(yù)測(cè)率低于先前報(bào)導(dǎo)且也認(rèn)為促成較低總預(yù)測(cè)率。

預(yù)測(cè)簇1野生型(C1WT)表位結(jié)合八種測(cè)試的MHC II對(duì)偶基因中的四者。根據(jù)預(yù)測(cè)，Asn12Gly與Asn13His突變破壞MHC II結(jié)合。Asn13His突變更佳地去除DRB1*0801和1101表位，且突變同樣利于去除DRB1*1501表位。然而，突變還引起DRB1*0101(Asn12Gly)的強(qiáng)結(jié)合，且引起DRB1*1301(Asn13His)的弱結(jié)合(表12)。

表12

¹SAQWLNNYKKGYGYG(SEQ ID NO:148)。²SAQWLGNYKKGYGYG(SEQ ID NO:221)。³SAQWLNHYKKGYGYG(SEQ ID NO:222)。^*預(yù)測(cè)結(jié)合子與實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到的結(jié)合子之間的正相關(guān)。預(yù)測(cè)的結(jié)合閾值設(shè)定為5％，且實(shí)驗(yàn)為10μM。

在簇2野生型(C2WT)表位情況下，預(yù)測(cè)七種MHC II對(duì)偶基因的結(jié)合，其中DRB1*0101、0301、0401、0701和1501為多個(gè)表位(表13)。預(yù)測(cè)突變靶向除DRB1*0101和0701外的七種對(duì)偶基因，且對(duì)于另三種對(duì)偶基因(除0401之外)，觀測(cè)到結(jié)合增加。一種例外為Lys46His突變體，其展示與0101的結(jié)合下降兩倍。Lys46His也降低與1101的結(jié)合，而Ile41Glu和Ile41Glu/Lys46His引起強(qiáng)結(jié)合。如所預(yù)測(cè)，所有突變體對(duì)0301都具有較低親和力。Ile41Glu和Lys46His展示降低的與1501的結(jié)合，而Ile41Glu/Lys46His顯現(xiàn)為強(qiáng)結(jié)合子。此突變組合尤其不好，因?yàn)槠湟鸪?301外的所有對(duì)偶基因的結(jié)合增加。此簇的高結(jié)合親和力可以通過大量表位說明?？偣?3個(gè)跨越八個(gè)對(duì)偶基因的表位中，預(yù)測(cè)突變破壞僅僅四個(gè)表位。此外，此具體區(qū)域含有EpiBar，且先前的研究展示這些表位往往比不具有EpiBar的表位更具免疫原性(Groot等人,(2011)上述)。

表13

¹GVDFFMNIGTPVKAISSGKIV(SEQ ID NO:223)。²GVDFFMNEGTPVKAISSGKIV(SEQ ID NO:224)。³GVDFFMNIGTPVHAISSGKIV(SEQ ID NO:225)。⁴GVDFFMNEGTPVHAISSGKIV(SEQ ID NO:226)。^*預(yù)測(cè)結(jié)合子與實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到的結(jié)合子之間的正相關(guān)。預(yù)測(cè)的結(jié)合閾值設(shè)定為5％，且實(shí)驗(yàn)為10μM。

簇3野生型(C3WT)表位是DRB1*0101、0701和1101的預(yù)測(cè)結(jié)合子，其中0801和1501為多個(gè)表位(表14)。實(shí)驗(yàn)展示C3WT也微弱地結(jié)合1301。預(yù)期Leu83Met突變僅僅破壞0801和1501中的結(jié)合。按照所述預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)0801的結(jié)合下降大約五倍。然而，還觀測(cè)到0701下降超過兩倍(強(qiáng)至中度)、1101降低十倍和0101下降約2000倍(強(qiáng)至弱)。檢測(cè)到1501(預(yù)測(cè)其相反者)、1301和0301的結(jié)合增加。對(duì)于1501，觀測(cè)到從弱移至中度結(jié)合子，而1301仍然是弱結(jié)合子，且0301為非結(jié)合子。因此，Leu83Met突變基本上是有成效的，因?yàn)槠浣档团c四個(gè)對(duì)偶基因的結(jié)合且不引起兩個(gè)其它對(duì)偶基因分類的改變(肽仍然是弱或非結(jié)合子)。

表14

¹GVHRQWYMHLSKYNVKVGD(SEQ ID NO:149)。²GVHRQWYMHMSKYNVKVGD(SEQ ID NO:150)。^*預(yù)測(cè)結(jié)合子與實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到的結(jié)合子之間的正相關(guān)。預(yù)測(cè)的結(jié)合閾值設(shè)定為5％，且實(shí)驗(yàn)為10μM。

預(yù)測(cè)簇4野生型(C4WT)表位結(jié)合八種測(cè)試的MHC II對(duì)偶基因中的三個(gè)：DRB1*0101、0401和0801。除0101和0401外，觀測(cè)到0301(弱)、1101(強(qiáng))、1301(弱)和1501(強(qiáng))的結(jié)合，但未觀測(cè)到0801的結(jié)合(表15)。根據(jù)預(yù)測(cè)，突變破壞MHC II結(jié)合。一種例外是突變Lys95Glu，預(yù)測(cè)其減少與0101和0801的結(jié)合，而代之以跨越所有八種對(duì)偶基因的更強(qiáng)結(jié)合(或仍然為強(qiáng)結(jié)合子)。突變顯著地降低與0101的結(jié)合：Tyr93His、Ile99Gln和Tyr93His/Lys95Glu/Ile99Gln使強(qiáng)結(jié)合子轉(zhuǎn)變成弱或非結(jié)合子，且Tyr93His/Lys95Glu使強(qiáng)結(jié)合子轉(zhuǎn)成中度結(jié)合子。所有突變和其組合使0301的結(jié)合從弱降低至非結(jié)合子。類似地，除了Tyr93His/Ile99Gln的所有突變都引起與1101的結(jié)合顯著降低(強(qiáng)至弱/非結(jié)合子)，且除Tyr93His/Lys95Glu外的所有突變體都減輕與1301的結(jié)合。最后，僅僅Ile99Gln和Tyr93His/Lys95Glu/Ile99Gln消除與1501的結(jié)合(強(qiáng)至弱/非結(jié)合子)。突變Ile99Gln、Tyr93His/Ile99Gln和Tyr93His/Lys95Glu通過使非結(jié)合子C4WT轉(zhuǎn)成弱結(jié)合子而略微增加對(duì)0701的結(jié)合親和力?？傮w來說，Tyr93His、Ile99Gln、Tyr93His/Lys95Glu、Lys95Glu/Ile99Gln和Tyr93His/Lys95Glu/Ile99Gln是跨越所有八種對(duì)偶基因最有成效的。Tyr93His/Lys95Glu/Ile99Gln尤其優(yōu)良，因?yàn)槠湎c所有八種對(duì)偶基因的結(jié)合。

表15

¹DYVKAGQIIGWSGSTGY(SEQ ID NO:151)。²DHVKAGQIIGWSGSTGY(SEQ ID NO:152).³DYVEAGQIIGWSGSTGY(SEQ ID NO:153)。⁴DYVKAGQQIGWSGSTGY(SEQ ID NO:154)。⁵DHVKAGQQIGWSGSTGY(SEQ ID NO:155)。⁶DHVEAGQIIGWSGSTGY(SEQ ID NO:156)。⁷DYVEAGQQIGWSGSTGY(SEQ ID NO:157)。⁸DHVEAGQQIGWSGSTGY(SEQ ID NO:158)。^*預(yù)測(cè)結(jié)合子與實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到的結(jié)合子之間的正相關(guān)。預(yù)測(cè)的結(jié)合閾值設(shè)定為5％，且實(shí)驗(yàn)為10μM。

預(yù)測(cè)簇5野生型(C5WT)表位結(jié)合所有八種對(duì)偶基因，其中除DRB1*0301和0801外都是多個(gè)表位。除0301和1301外都在實(shí)驗(yàn)上觀測(cè)到結(jié)合，其中0701和0801測(cè)量為弱結(jié)合子(表16)。最去免疫化突變是Arg118Thr/Ser122Asp/Ser124Gly和Asn121Gly/Ser122Asp/Ser124Gly，因?yàn)槠涿恳粋€(gè)顯著地降低對(duì)六個(gè)對(duì)偶基因的結(jié)合親和力。對(duì)于0301對(duì)偶基因，突變體的IC₅₀值略微降低，但肽仍然為非結(jié)合子。此結(jié)果與EpiSweep預(yù)測(cè)一致，其中突變破壞對(duì)所有八種對(duì)偶基因的結(jié)合。Asn121Gly減弱與四種對(duì)偶基因的結(jié)合，而Ser124Gly和Asn121Gly/Ser122Asp降低與三種對(duì)偶基因的結(jié)合。Asn121Gly/Ser122Asp還略微增加與0301的結(jié)合(非結(jié)合子至弱結(jié)合子)。類似地，Arg118Thr和R118T/S122D減輕對(duì)兩種對(duì)偶基因的親和力，但展示與0301的結(jié)合增加(非結(jié)合子至弱結(jié)合子)。在突變組合中觀測(cè)到的對(duì)0301對(duì)偶基因的結(jié)合親和力可以通過預(yù)測(cè)Ser122Asp引入對(duì)偶基因的一個(gè)表位的事實(shí)說明。事實(shí)上，可以觀測(cè)到Ser122Asp將非結(jié)合子肽C5WT變成中度結(jié)合子。

表16

¹HLHFQRMVNSFSNPTAQ(SEQ ID NO:159)。²HLHFQTMVNSFSNPTAQ(SEQ ID NO:160)。³HLHFQRMVGSFSNPTAQ(SEQ ID NO:161)。⁴HLHFQRMVNDFSNPTAQ(SEQ ID NO:162)。⁵HLHFQRMVNSFGNPTAQ(SEQ ID NO:163)。⁶HLHFQTMVNDFSNPTAQ(SEQ ID NO:164)。⁷HLHFQTMVNDFGNPTAQ(SEQ ID NO:165)。⁸HLHFQRMVGDFSNPTAQ(SEQ ID NO:166)。⁹HLHFQRMVGDFGNPTAQ(SEQ ID NO:167)。^*預(yù)測(cè)結(jié)合子與實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到的結(jié)合子之間的正相關(guān)。預(yù)測(cè)的結(jié)合閾值設(shè)定為5％，且實(shí)驗(yàn)為10μM。

為比較全長設(shè)計(jì)之間的免疫原性，計(jì)算每個(gè)設(shè)計(jì)的合計(jì)表位評(píng)分(圖3)。此分析展示野生型溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域具有總共26個(gè)結(jié)合相互作用(或表位)：14個(gè)強(qiáng)、1個(gè)中度和11個(gè)弱。此酶還具有14個(gè)非結(jié)合相互作用。相比之下，18個(gè)設(shè)計(jì)具有低于野生型的表位評(píng)分，六個(gè)具有相同評(píng)分，且僅僅四個(gè)具有超過野生型的表位評(píng)分(按兩個(gè)表位的最大值)。除三個(gè)設(shè)計(jì)外的所有設(shè)計(jì)還具有比野生型更高數(shù)目的非結(jié)合相互作用。表位的最小數(shù)目是18，且其存在于三個(gè)變異體中：柔性4*(5個(gè)突變)、柔性11*(7個(gè)突變)和柔性13*(6個(gè)突變)。此外，與野生型相比，18個(gè)設(shè)計(jì)展示強(qiáng)結(jié)合子的數(shù)目減少。

注意到突變數(shù)目與實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到的強(qiáng)結(jié)合子之間強(qiáng)負(fù)相關(guān)(皮爾森系數(shù)-0.69)。類似地，觀測(cè)到表位評(píng)分與強(qiáng)結(jié)合子數(shù)目之間正相關(guān)(皮爾森系數(shù)0.52)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)突變負(fù)荷/表位評(píng)分與結(jié)合子總數(shù)之間無相關(guān)。此結(jié)果表明算法不僅降低結(jié)合，還主要靶向強(qiáng)表位。

一般說來，與剛性主鏈設(shè)計(jì)相比，在柔性中發(fā)現(xiàn)更去免疫化的計(jì)劃。平均下來，與剛性計(jì)劃相比，在柔性發(fā)現(xiàn)更少的強(qiáng)、中度、弱和總結(jié)合相互作用。此趨勢(shì)可以通過大部分剛性設(shè)計(jì)回復(fù)和錯(cuò)過一個(gè)突變的事實(shí)部分說明。在柔性11*和剛性5*中觀測(cè)到最低數(shù)目的強(qiáng)結(jié)合子。如所預(yù)期，最侵襲性計(jì)劃柔性9展示免疫原性顯著下降，其中總共僅僅22個(gè)結(jié)合相互作用：9個(gè)強(qiáng)、6個(gè)中度和7個(gè)弱。

柔性5和柔性9變異體的體外分析

變異體柔性5和柔性9在生物復(fù)制品中表達(dá)、純化和表征。作為另一對(duì)照，從商業(yè)供應(yīng)商獲得野生型LST并同時(shí)分析。兩種變異體的表觀熔融溫度與在初步測(cè)試期間獲得的數(shù)值一致，但在更精密的分析時(shí)發(fā)現(xiàn)其細(xì)菌溶解的特定速率稍微更高(表17)。重要地，在兩種檢定中，去免疫化變異體等同于或優(yōu)于商業(yè)來源LST。酶的抗菌活性通過評(píng)估對(duì)金黃色葡萄球菌的四個(gè)菌株的最小抑制濃度(MIC)進(jìn)一步定量。菌株SA113的柔性5MIC等同于野生型和商業(yè)LST，且其在三個(gè)臨床分離株的單一2倍連續(xù)稀釋液內(nèi)，包括MRSA菌株3425-3。變異體柔性9還保留優(yōu)良的殺菌/抑菌作用，預(yù)防所有四個(gè)菌株的副產(chǎn)物在200ng/ml(約7nM)或更少下?？紤]到LSTCAT變異體分別編碼四個(gè)或八個(gè)突變的事實(shí)，其高水平的抗葡萄球菌活性是驚人的。

表17

*誤差是與一式三份測(cè)量的生物復(fù)制品中最小值的標(biāo)準(zhǔn)偏差

柔性5和柔性9變異體的體內(nèi)功效和免疫原性

為以更臨床相關(guān)的方式評(píng)估抗菌活性，采用鼠類肺感染模型，其使用金黃色葡萄球菌臨床分離株。經(jīng)由口咽吸氣，小鼠感染活細(xì)菌，且一小時(shí)后，其經(jīng)由相同的途徑用含有2.5μg野生型LST、變異體柔性5或變異體柔性9的溶液處理。感染后二十四小時(shí)，處死小鼠，收獲肺，且通過涂鋪肺勻漿的連續(xù)稀釋液，確定活細(xì)菌數(shù)。所有三種酶相對(duì)于生理鹽水緩沖液對(duì)照，使得細(xì)菌負(fù)荷減少統(tǒng)計(jì)上顯著10倍(單向ANOVA P＝0.007，圖基事后檢驗(yàn)(Tukey post test))，但三個(gè)處理之間沒有顯著差異(圖4A)。因此，去免疫化候選酶在感染和發(fā)炎肺環(huán)境中保留野生型功效。

使用已通過手術(shù)用人類免疫細(xì)胞、肝組織和胸腺組織(HUMI小鼠)人類化的NOD/SCID/γ_c^-/-小鼠，評(píng)估體內(nèi)免疫原性。在六周齡移植人類組織后，使HUMI小鼠成熟且形成人類B和T細(xì)胞的循環(huán)譜系。在移植后14周，小鼠被分成三組，每組四只，且皮下免疫接種含100μg野生型LST、柔性5或柔性9的佐劑。免疫接種后十三天，對(duì)各組，處死小鼠，收獲脾細(xì)胞，且匯集，且匯集的細(xì)胞用其同源蛋白質(zhì)離體再刺激。通過在72小時(shí)氚化胸腺嘧啶吸收測(cè)量細(xì)胞增殖。雖然刺激指數(shù)(蛋白質(zhì)對(duì)比DMSO增殖反應(yīng))是野生型LST的2倍不到(圖4B)，但注意到公認(rèn)來自人類化小鼠的T細(xì)胞展現(xiàn)削弱的功能。具體地說，已經(jīng)展示人類化小鼠脾細(xì)胞展現(xiàn)差的離體增殖反應(yīng)，甚至是在例如植物血球凝集素、伊屋諾霉素-PMA和抗CD3/抗CD28抗體混合液等有效刺激劑存在下(Watanabe等人,(2009)Internatl.Immunol.21:843-858)。此外，在兩次至三次體內(nèi)免疫接種含有效抗原鑰孔血藍(lán)素的完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)后，再刺激的人類化小鼠脾細(xì)胞未能產(chǎn)生IFN-γ或IL-4(Watanabe等人,(2009)Internatl.Immunol.21:843-858)且僅僅展現(xiàn)2至6倍離體刺激指數(shù)(Tonomura等人,(2008)Blood 111:4293-6)。因此，野生型LST脾細(xì)胞的顯著(P＝0.0005，雙向ANOVA)1.6倍刺激指數(shù)是抗原特異性免疫反應(yīng)的合理標(biāo)記，尤其在當(dāng)前研究的小鼠接受僅僅一個(gè)免疫接種的事實(shí)。相對(duì)于野生型免疫接種組，從柔性5和柔性9免疫接種小鼠匯集的脾細(xì)胞展現(xiàn)顯著降低的增殖(圖4B)。背景減去后，柔性5匯集細(xì)胞展示50％降低反應(yīng)且柔性9匯集細(xì)胞展示65％降低反應(yīng)。

除未處理免疫系統(tǒng)的情況下固有免疫原性外，還考慮去免疫化蛋白質(zhì)可逃避針對(duì)天然序列已建立的記憶反應(yīng)的程度。由于此類研究的長時(shí)限和HUMI小鼠的短壽命，故評(píng)估轉(zhuǎn)基因DR4小鼠中的記憶反應(yīng)。此同型結(jié)合菌株具有完整的鼠類免疫系統(tǒng)，其中例外為其具有基于來自人類HLA DRA和DRB1*0401的肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合類別IIMHC(Ito等人,(1996)J.Exp.Med.183:2635-44)。此穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因模型具有正常的能夠進(jìn)行長期研究的健康壽命，然而其抗原呈遞細(xì)胞展現(xiàn)人類肽結(jié)合特異性。十只DR4小鼠通過皮下注射野生型LST而免疫接種和重復(fù)加打。最后加打后十九周，其被分成兩組，每組五只，使得每組展現(xiàn)類似的平均抗體滴度。接著用100μg野生型LST或者100μg變異體柔性5再攻擊小鼠。十三天后，對(duì)各組，收獲脾細(xì)胞，匯集，并用來自最終再攻擊的同源蛋白質(zhì)離體再刺激。類似于HUMI小鼠中的結(jié)果，用野生型LST離體再刺激DR4脾細(xì)胞產(chǎn)生1.8倍刺激指數(shù)(圖4C)。注意到DR2、DR3和DQ8轉(zhuǎn)基因小鼠中類似小的刺激指數(shù)展示與抗原特異性抗體產(chǎn)生有關(guān)且指示抗原特異性免疫反應(yīng)(Depil等人,(2006)Vaccine 24:2225-9)。因此，此處看到的顯著(P＝0.0002，雙向ANOVA)1.8倍刺激指數(shù)是抗藥物免疫反應(yīng)的合理標(biāo)記。與野生型LST再攻擊小鼠相比，來自柔性5攻擊組的匯集脾細(xì)胞的增殖處于或低于背景水平(圖4C)。因此，初打的識(shí)別野生型LST的免疫細(xì)胞在用柔性5再攻擊后展現(xiàn)降低活性，表明去免疫化變異體有效逃避針對(duì)野生型酶的記憶反應(yīng)。

實(shí)施例2：針對(duì)HLA對(duì)偶基因DRB1*0401的溶葡萄球菌酶催化和細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域的去免疫化

概述

進(jìn)行此分析以證明LST中假定T細(xì)胞表位的消除將減輕抗藥物抗體反應(yīng)并因此增強(qiáng)治療功效。使用兩個(gè)不同的通過計(jì)算引導(dǎo)的策略發(fā)展表位消除的變異體：個(gè)別去免疫化變異體的基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，接著憑經(jīng)驗(yàn)改善(稱為“opt”變異體)；和基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)并篩選富集了功能上去免疫化的成員的組合文庫(稱為“l(fā)ib”變異體)。人類化HLA轉(zhuǎn)基因小鼠用以評(píng)估每種方法消除假定免疫原性表位并由此預(yù)防抗LST抗體在體內(nèi)形成的效率。隨后，復(fù)發(fā)性菌血癥模型用以計(jì)量LST去免疫化清除全身性金黃色葡萄球菌感染能夠達(dá)到的程度。去免疫化變異體與其野生型對(duì)應(yīng)物之間的此系統(tǒng)比較提供了假定T細(xì)胞表位、體內(nèi)免疫原性和治療功效之間的臨床相關(guān)聯(lián)系的直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

作為概念證明，集中于對(duì)偶基因DRB1×0401(此后為DR4)，其在北美和歐洲人口中高度流行。在5％閾值(即最高5％預(yù)測(cè)結(jié)合子中的肽)下，ProPred分析工具(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics 17:1236-7)預(yù)測(cè)野生型LST內(nèi)16個(gè)DR4限制的T細(xì)胞表位(LST^WT表位評(píng)分＝16)。肽表位排列成重疊簇與分離的九聚體，分布在蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)中(圖5)。有趣地，ProPred預(yù)測(cè)DR4比七個(gè)其它代表性DRB1對(duì)偶基因任一個(gè)更多的表位：0101、0301、0701、0801、1101、1301和1501?？紤]任何單個(gè)對(duì)偶基因，因此DR4模型代表總蛋白質(zhì)重新設(shè)計(jì)的高目標(biāo)。

材料與方法

材料.引物用標(biāo)準(zhǔn)脫鹽，從IDT Technologies(Coralville,IA)訂購。用于分子克隆的限制酶和Phusion DNA聚合酶購自New England Biolabs(Ipswich,MA)。除非特別指示，否則所有其它試劑和供應(yīng)品都來自VWR Scientific(Philadelphia,PA)。

巴斯德畢赤氏酵母表達(dá)載體pPIC9和巴斯德畢赤氏酵母菌株GS115(his4)購自Invitrogen(Grand Island,NY)。大腸桿菌DH5[F–Φ80lacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rK–,mK+)phoA supE44λ–thi-1 gyrA96 relA1]、金黃色葡萄球菌菌株SA113和MRSA菌株USA400來自美國典型菌種保藏中心(Manassas,VA)。

LST同源性模型.因?yàn)槿芷咸亚蚓傅木w結(jié)構(gòu)不可獲得，所以構(gòu)筑兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的同源性模型。選擇來自LytM的三個(gè)模板結(jié)構(gòu)用于催化結(jié)構(gòu)域(2B0P:A、2B44:A和1QWY:A)(Firczuk等人,(2005)J.Mol.Biol.354:578-90；Odintsov等人,(2004)J.Mol.Biol.335:775-85)。三個(gè)模板結(jié)構(gòu)共享顯著序列一致性(95％-97％)，但其在保守活性位點(diǎn)周圍具有高度可移動(dòng)的環(huán)(Firczuk等人,(2005)J.Mol.Biol.354:578-90)。針對(duì)溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域的最高序列一致性是46.7％，其足夠建立質(zhì)量模型結(jié)構(gòu)(Baker和Andrej(2001)Science 294:93-96)。使用MODELLER建立初始同源性模型。使用環(huán)模型化方法FREAD(Choi和Deane(2010)Proteins 78:1431-1440)，將次模板區(qū)域(²⁴PLGINGG³⁰；SEQ ID NO:168)模型化，其從1GMN:A(¹⁸⁰PRGEEGG¹⁸⁶；SEQ ID NO:169)選擇序列類似環(huán)(Lietha等人,(2001)EMBO J.20:5543-5555)。使用具有高度序列一致性(83.5％)的單一模板結(jié)構(gòu)(1R77:A，ALE-1的靶向細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，溶葡萄球菌酶同源物)構(gòu)筑細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Lu等人,(2006)J.Biol.Chem.281:549-558)。根據(jù)DOPE統(tǒng)計(jì)勢(shì)函數(shù)評(píng)分選擇最佳模型(Shen和Sali(2006)Protein Sci.15:2507-2524)。催化結(jié)構(gòu)域模型針對(duì)AMBER99sb與GB/SA減到最少，以使預(yù)測(cè)環(huán)松馳(Hornak等人,(2006)Proteins 65:712-725；Still等人,(1990)J.Am.Chem.Soc.112:6127-6129)。

突變選擇的預(yù)處理.對(duì)于每個(gè)結(jié)構(gòu)域，針對(duì)非冗余數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行三次迭代PSI-BLAST(Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402)以找到同源物。針對(duì)所鑒別的序列，構(gòu)筑多重序列比對(duì)，并加工以鑒別不過多間隙(至多25％)且足夠類似于LST(至少35％)但足夠彼此不同(至多90％一致)的序列。剩余一組114個(gè)代表性催化結(jié)構(gòu)域同源物和23個(gè)代表性細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)域序列。在每個(gè)多重序列比對(duì)中鑒別每個(gè)位置的氨基酸，并隨后用作設(shè)計(jì)的可能突變。視為功能上重要的具體位置和突變不允許突變(位置32、36、82、113、115、117、118、119、125、126、127鎖?。徊辉试S特異性突變Y33T、F38A、F38G、M39A、I41R、S124Y和R118T)。第二過濾步驟僅僅保持預(yù)測(cè)消去至少一個(gè)表位的那些突變，如使用ProPred在5％閾值下所確定。為避免所推測(cè)的不利作用，還排除脯氨酸和半胱氨酸的突變。

擴(kuò)大突變選擇用于文庫設(shè)計(jì)，因?yàn)楹Y選使得取代更危險(xiǎn)。具體地說，Chou-Fasman(Chou和Fasman(1974)Biochem.13:222–45)傾向用以根據(jù)1.5的嚴(yán)格閾值，鑒別可能在野生型二級(jí)結(jié)構(gòu)環(huán)境中可接受的殘基。另外，因?yàn)槲膸煊每刹⒂谐^所需氨基酸的其它氨基酸的簡(jiǎn)并寡核苷酸構(gòu)筑，所以允許這些添加，只要簡(jiǎn)并寡核苷酸內(nèi)需要與不需要的比率保持超過2:3即可。

個(gè)別變異體的基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì).為產(chǎn)生消去表位的設(shè)計(jì)，基于結(jié)構(gòu)的去免疫化方法EpiSweep應(yīng)用于每個(gè)結(jié)構(gòu)域，如實(shí)施例1中所描述。OSPREY(2.0版)(Chen等人,(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106:7678-7678)用以針對(duì)突變選擇，根據(jù)AMBER力場(chǎng)(Pearlman等人,(1995)Comput.Phys.Commun.91:1-41)和參考能量(Lippow和Tidor(2007)Curr.Opin.Biotechnol.18:305-311)，評(píng)估可能旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的一體和二體能量項(xiàng)(Lovell等人,(2000)Proteins 40:389-408)。在5％閾值下ProPred(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics 17:1236-7)用以評(píng)估DR4表位(HLA對(duì)偶基因DRB1*0401)含量，表征每個(gè)九聚體為結(jié)合子或者非結(jié)合子。發(fā)現(xiàn)消去催化結(jié)構(gòu)域中所有預(yù)測(cè)的DR4表位需要至少七個(gè)突變；完全消去細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域需要六個(gè)。經(jīng)由EpiSweep最佳化算法，針對(duì)各結(jié)構(gòu)域，鑒別一組20個(gè)能量最佳和接近最佳的完全消去設(shè)計(jì)。能量最佳的催化結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)在Ser124含有突變，所述分析已鑒別為可能不利。然而，預(yù)測(cè)替代雙重突變Asn121Gly和Ser122Gly去除相同的表位，然而此兩個(gè)突變顯現(xiàn)比LST^WT高的實(shí)驗(yàn)確定活性。能量最佳的設(shè)計(jì)(含有不利的Ser124突變)與替代雙重突變?cè)O(shè)計(jì)之間的能量差很微小(-294.94和-293.9)。因此，選擇一種設(shè)計(jì)(Opt1)，以具有對(duì)于細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域的C端部分中替代雙重突變來說能量最佳的設(shè)計(jì)(Asn121Gly和Ser122Gly)。

去免疫化文庫的基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì).為設(shè)計(jì)富集穩(wěn)定的去免疫化變異體的組合文庫，發(fā)展一種稱為EpiSOCoM的方法，其加強(qiáng)了具有表位分析的SOCoM基于結(jié)構(gòu)的文庫設(shè)計(jì)方法，并采用基于掃描的帕累托最佳化算法(Parker等人,(2013)J.Comput.Biol.20:152-65)以同時(shí)最佳化能量與表位含量。考慮到突變所在的一組可能位置和在那些位置并入的可能氨基酸，連同所需文庫尺寸，EpiSOCoM選擇位置子集和那些位置的取代子集。由此，其指定了構(gòu)筑由取代和對(duì)應(yīng)野生型殘基的所有組合構(gòu)成的文庫。EpiSOCoM將文庫針對(duì)其構(gòu)成變異體上平均能量評(píng)分和平均表位評(píng)分最佳化，使得一般說來變異體將“優(yōu)良”。其帕累托最佳化算法鑒別所有文庫設(shè)計(jì)(位置和取代)，使得兩個(gè)評(píng)分之間均衡，因?yàn)閷?duì)于兩者來說，沒有更佳的其它文庫設(shè)計(jì)。

為了在沒有每個(gè)變異體的明確旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體模型化下能夠快速評(píng)估基于結(jié)構(gòu)的能量，SOCoM采用集團(tuán)展開法(Grigoryan等人,(2009)Nature 458:859–64；Grigoryan等人,(2006)PLoS Comput.Biol.2:e63)(CE)技術(shù)，其根據(jù)氨基酸序列的蛋白質(zhì)特定功能表現(xiàn)基于結(jié)構(gòu)的特性。此處，Rosetta(Rohl等人,(2004)Methods Enzymol.383:66–93)用于預(yù)處理步驟中以基于所允許的突變選擇模擬隨機(jī)LST變異體和評(píng)估隨機(jī)LST變異體的能量。這些結(jié)構(gòu)訓(xùn)練組允許CE經(jīng)由在位置特異性的一體和二體序列勢(shì)上求和來表達(dá)可能LST變異體S的能量Ψ：

Ψ(S)＝∑_iψ_i(a_i)+∑_i，jψ_i，j(a_i，a_j) (1)

其中和涉及位置i的氨基酸a_i和位置j的a_j?？偣?000個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和6000個(gè)細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域模型用以按照CE準(zhǔn)則訓(xùn)練CE模型。接著這些能夠在不相重疊的測(cè)試背景(尺寸為訓(xùn)練組的約20％)下準(zhǔn)確預(yù)測(cè)新的隨機(jī)變異體的能量，實(shí)現(xiàn)催化結(jié)構(gòu)域的CE序列勢(shì)與Rosetta能量之間0.8的相關(guān)性，和細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域0.9的相關(guān)性。因此，此模型化步驟能夠快速準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)最佳化“內(nèi)環(huán)”內(nèi)的能量。

為了在不計(jì)數(shù)所有其變異體下(當(dāng)在可能文庫的大規(guī)模設(shè)計(jì)空間上最佳化時(shí)不易處理)評(píng)估文庫，SOCoM采用文庫平均的位置特異性評(píng)分。舉例來說，如果組{Arg,Lys}將并入一個(gè)位置，那么在文庫所有變異體上求平均值的該位置的能量貢獻(xiàn)將為Arg能量和Lys能量的平均值；類似地，在文庫上求平均值的來自該位置的逐對(duì)貢獻(xiàn)和另一并入{Asp,Glu}將為Arg:Asp、Arg:Glu、Lys:Asp和Lys:Glu的平均值。因此，假定所允許的突變，SOCoM預(yù)先計(jì)算在位置i可以選擇的氨基酸的可能子集的平均能量貢獻(xiàn)；以及一對(duì)位置i和j的平均值。其接著利用類似于單一變異體的等式，評(píng)估整個(gè)文庫T上平均能量

其中和涉及位置i的氨基酸T_i和位置j的T_j的集合。因此，在最佳化內(nèi)評(píng)估文庫與評(píng)估單一變異體一樣有效。

為了形成EpiSOCoM，還需要以類似于SOCoM處理能量評(píng)分的方式，將表位評(píng)分“提高”至文庫平均的貢獻(xiàn)。如果氨基酸{T_i,T_i+1,…,T_i+8}將并入以i開始的連續(xù)九個(gè)位置，那么氨基酸的多個(gè)九聚體組合的平均表位評(píng)分貢獻(xiàn)計(jì)算為：

其中和是在氨基酸的每個(gè)組合上，一個(gè)來自每個(gè)集合，且函數(shù)e(·)給出九聚體的表位評(píng)分。接著文庫的平均表位評(píng)分Ξ僅僅是所有九聚體的和：

SOCoM使用整數(shù)線性規(guī)劃公式來選擇位置最佳集合和氨基酸集合以最佳化受文庫尺寸約束影響的方程式2。在EpiSOCoM下，存在兩個(gè)目標(biāo)，能量(方程式2)和表位評(píng)分(方程式4)。因?yàn)闆]有確定這些不相稱特性之間最佳平衡的先驗(yàn)方式，所以EpiSOCoM產(chǎn)生代表最佳平衡的所有帕累托最佳設(shè)計(jì)，從而能夠隨后表征折衷方案和選擇適合的設(shè)計(jì)。為了鑒別帕累托最佳設(shè)計(jì)，其采用基于EpiSweep的掃描算法。在掃描中的每個(gè)步驟，根據(jù)平均表位評(píng)分(方程式4)上的約束最佳化平均文庫能量(方程式2)。連續(xù)收緊約束，使得每個(gè)文庫必須具有比先前一個(gè)更佳的表位評(píng)分(且因此能量更差)。帕累托最佳化被執(zhí)行為SOCoM的約束型式上的迭代層，其又使用IBM CPLEX整數(shù)規(guī)劃解算機(jī)來最佳化每個(gè)設(shè)計(jì)。

蛋白質(zhì)表達(dá)、純化和表征.LST和其衍生物從巴斯德畢赤氏酵母分泌。簡(jiǎn)單地說，將重組畢赤氏酵母屬菌株在2.5L生物反應(yīng)器(Applicon Biotechnology)中培養(yǎng)，且通過聚乙二醇-6000(PEG-6000)沉淀從上清液捕捉蛋白質(zhì)并通過SP SEPHAROSE F.F.陽離子交換色譜法純化到均質(zhì)。通過TRITON-X114提取從蛋白質(zhì)制劑去除內(nèi)毒素(Liu等人,(1997)Clin.Biochem.30:455-63)。通過SDS-PAGE凝膠的密度測(cè)定分析，估計(jì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。蛋白質(zhì)的活性通過確定針對(duì)金黃色葡萄球菌菌株SA113的最小抑制濃度(MIC)來評(píng)估，并報(bào)導(dǎo)為相對(duì)于針對(duì)LST^WT確定的MIC稀釋的標(biāo)準(zhǔn)化百分比(即50％活性相對(duì)于野生型MIC高2倍，且25％活性是相對(duì)于野生型MIC高4倍)。

文庫構(gòu)筑和篩選.通過剪接重疊PCR與表18中所示的引物，構(gòu)筑LST文庫。

表18

將PCR產(chǎn)物接合到pPIC9載體中且轉(zhuǎn)化到DH5a中。構(gòu)筑體經(jīng)序列驗(yàn)證，并通過電穿孔轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤氏酵母中(Wu和Letchworth(2004)Biotechniques 36:152-4)。文庫構(gòu)筑和篩選如迭代定向進(jìn)化策略執(zhí)行。使用中等通量板暈環(huán)形成檢定，鑒別活性文庫成員。簡(jiǎn)單地說，來自每輪文庫構(gòu)筑的巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化體在YPM瓊脂培養(yǎng)基(1％酵母提取物、2％胨、1％甲醇、1％瓊脂糖)上傳播并在30℃下培育2天。指示頂部瓊脂糖(0.5％酵母提取物、1％胨、1％NaCl、0.1OD₆₀₀SA113、1％低熔瓊脂糖)傾倒在YPM酵母板上，并在37℃下培育板10小時(shí)。表達(dá)活性酶的酵母克隆通過其暈環(huán)或清除區(qū)域來鑒別。每輪篩選大約10,000個(gè)克隆。編碼展現(xiàn)最大暈環(huán)的10個(gè)變異體的基因經(jīng)PCR，從基因整合的卡匣擴(kuò)增，亞克隆回pPIC9，定序并再轉(zhuǎn)化到新制備的巴斯德畢赤氏酵母細(xì)胞中，以通過確定MIC來驗(yàn)證功能。最去免疫化和功能變異體用作隨后輪的文庫構(gòu)筑和篩選的起點(diǎn)。

體內(nèi)研究。進(jìn)行動(dòng)物感染、處理和免疫接種的方案以使動(dòng)物痛苦減到最少。C57Bl/6小鼠購自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)。C57Bl/6背景Abb剔除/轉(zhuǎn)基因HLA-DR4小鼠(B6.129S2-H2-Ab1^tm1GruTg(HLA-DRA/H2-Ea,HLA-DRB1*0401/H2-Eb)1Kito)購自Taconic Farms(Germantown,NY)。

體內(nèi)免疫原性。100μl體積的含100μg純化野生型或變異酶的完全弗氏佐劑(CFA)皮下注射在DR4(每組N＝5)或C57Bl/6(每組N＝4)小鼠。免疫接種后十三天，收集血清并通過ELISA測(cè)量抗LST IgG抗體滴度(對(duì)野生型或變異蛋白質(zhì)具特異性)。簡(jiǎn)單地說，將野生型或變異蛋白質(zhì)抗原涂布到高度結(jié)合ELISA板上，接著用BSA阻斷。來自小鼠的免疫血清連續(xù)稀釋到涂布板中，接著使用山羊抗小鼠IgG-HRP結(jié)合物(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)在1:1000的工作濃度下探測(cè)。隨后使用TMB底物(Santa Cruz Biotechnology)使板顯影，報(bào)導(dǎo)滴度定義為產(chǎn)生1.5的吸光度的血清稀釋倍數(shù)。

體內(nèi)功效。在細(xì)菌攻擊前，DR4小鼠(每組N＝3)的免疫系統(tǒng)通過每周皮下注射含100μg LST^WT或Lib5變異體的無菌磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS：2.7mM KCl、1.5mM KH₂PO₄、8.9mM Na₂HPO₄、136.9mM NaCl，pH 7.4)初打3次。這些免疫接種和加打不含佐劑?？筁ST抗體滴度如上所述測(cè)定。對(duì)于感染和處理的第一周期，通過腹膜內(nèi)施用豬科粘蛋白的3％懸浮液中2×10⁸CFU金黃色葡萄球菌菌株USA400，對(duì)小鼠進(jìn)行攻擊，并在一小時(shí)后，通過靜脈內(nèi)尾靜脈施用含500μg LST^WT或Lib5變異體的無菌PBS處理。通過酶處理拯救的小鼠每隔一周進(jìn)行隨后感染和處理周期。為了補(bǔ)償?shù)谝淮渭?xì)菌暴露后先天性鼠類抗菌免疫性的發(fā)展，小鼠在第二和第三周期中用1×10⁹CFU USA400攻擊，但處理保持在500μg適當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)下。作為驗(yàn)證每個(gè)周期中致命細(xì)菌劑量的對(duì)照，給與一只小鼠PBS的假處理。

個(gè)別變異體的基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)

EpiSweep算法(Parker等人,(2013)J.Comput.Biol.20:152-65)用以最佳化去免疫化變異體，在如ProPred評(píng)估的表位含量的預(yù)測(cè)減少與如基于結(jié)構(gòu)的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體能量評(píng)估的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的預(yù)測(cè)維持之間達(dá)成最佳平衡。分別產(chǎn)生催化結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域兩者的20種完全消去設(shè)計(jì)(即DR4表位評(píng)分＝0)的組。選擇組合來自每個(gè)結(jié)構(gòu)域的低能量設(shè)計(jì)的變異體Opt1(表19)用于實(shí)驗(yàn)分析，并克隆到最佳化的巴斯德畢赤氏酵母表達(dá)系統(tǒng)中。不幸地，此14突變?cè)O(shè)計(jì)未能產(chǎn)生功能蛋白(表20)。

表19

請(qǐng)調(diào)整圖，有些數(shù)字在里面，并不是沒有，需要調(diào)整

表20

^a活性測(cè)量為最小抑制濃度(MIC)，報(bào)導(dǎo)為相對(duì)于實(shí)現(xiàn)MIC的野生型的稀釋倍數(shù)％。

^b未檢出。

實(shí)施例1中的LST重新設(shè)計(jì)工作展示單個(gè)突變可以用其它方式破壞穩(wěn)定和活性的去免疫化變異體。因此，通過系統(tǒng)回復(fù)突變和突變組合來鑒別Opt1設(shè)計(jì)中的不利突變。分離Opt1突變的分析揭露Met119Arg獨(dú)力消除蛋白質(zhì)分泌，但設(shè)計(jì)Opt2(表19)中此單個(gè)突變的回復(fù)未能恢復(fù)表達(dá)(表20)。最終，發(fā)現(xiàn)三個(gè)突變組合Ser166Glu、Ser168Lys和Val193Trp也破壞表達(dá)，且在此三個(gè)位點(diǎn)回復(fù)至野生型以及Met119產(chǎn)生可以表達(dá)的10突變變異體Opt3(表20)。

雖然Opt3實(shí)現(xiàn)合理的表達(dá)水平(表20)，但SDS-PAGE的純度分析揭露兩個(gè)亮帶：一個(gè)在預(yù)期25kDa質(zhì)量下，且第二個(gè)在大約30kDa下?；趯?shí)施例1中的結(jié)果，懷疑C端細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域中潛在的N-連接的糖基化序列子(²³²NKS²³⁴)已活化。因此，將去免疫化Asn236Asp突變換成Ser234Lys突變，Ser234Lys突變消去C端表位與N-連接的糖基化序列子。所得到的10突變變異體Opt4僅僅具有五個(gè)預(yù)測(cè)的DR4表位且表現(xiàn)為單一25kDa亮帶，同時(shí)產(chǎn)率低于Opt3(表20)。雖然高度工程改造的Opt4變異體呈折疊和能夠分泌的狀態(tài)產(chǎn)生，但隨后發(fā)現(xiàn)其僅僅具有小部分的野生型酶抗菌活性(表20)。

經(jīng)由計(jì)算文庫設(shè)計(jì)的基于結(jié)構(gòu)的去免疫化

與設(shè)計(jì)個(gè)別變異體同時(shí)，進(jìn)行一種替代組合方法，其中計(jì)算設(shè)計(jì)用以產(chǎn)生預(yù)測(cè)富集功能性去免疫化變異體的LST文庫?；诮Y(jié)構(gòu)的文庫設(shè)計(jì)法SOCoM經(jīng)表位分析加強(qiáng)，以鑒別組合產(chǎn)生具有如ProPred所評(píng)估的低表位評(píng)分以及如Rosetta模型上訓(xùn)練的集團(tuán)展開勢(shì)評(píng)估的優(yōu)良能量的變異體的殘基位置和突變。在最初一輪中，設(shè)計(jì)基于野生型參考，而在隨后各輪中，參考變成選自先前文庫篩選的主導(dǎo)克隆。

文庫A靶向催化結(jié)構(gòu)域中的九個(gè)位點(diǎn)，且互補(bǔ)文庫B群體靶向細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的八個(gè)位點(diǎn)(表18)。雖然去免疫化LST設(shè)計(jì)空間大，但約束初始文庫少于40,000個(gè)成員，以便維持文庫尺寸與瓊脂板暈環(huán)形成檢定的篩選能力之間的一定平衡。從文庫A與B篩選大約10,000個(gè)克隆，并對(duì)來自每個(gè)文庫的10個(gè)形成大暈環(huán)的菌落進(jìn)行定序并驗(yàn)證功能。來自文庫A的最有前景的變異體(克隆Lib1)在催化結(jié)構(gòu)域中含有四個(gè)突變且發(fā)揮等于LST^WT的抗菌活性(表19和20)。同樣地，來自文庫B的最有前景的變異體(克隆Lib2)在細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域中具有四個(gè)突變(表19)且也具有野生型抗菌活性(表20)。

將變異體Lib1和Lib2的相應(yīng)去免疫化結(jié)構(gòu)域組合，產(chǎn)生變異體Lib3，其含有八個(gè)突變(表19)，預(yù)測(cè)表位含量減少50％且保留50％野生型活性(表20)。隨后將兩個(gè)Lib3結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)模型化并用作另一輪去免疫化文庫設(shè)計(jì)的模板。所得到的文庫C靶向催化結(jié)構(gòu)域中的五個(gè)位點(diǎn)和細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的三個(gè)位點(diǎn)(表19)。10,000個(gè)克隆的功能篩選產(chǎn)生變異體Lib4，其消去10/16DR4表位。相對(duì)于其Lib3開始模板，Lib4在催化結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域中含有一個(gè)其它突變，且保留同等的抗菌活性(表20)。Lib4的結(jié)構(gòu)域用于迭代的另一輪模型化和去免疫化文庫設(shè)計(jì)中，產(chǎn)生文庫D，從文庫D篩選10,000個(gè)克隆以分離變異體Lib5。變異體Lib5消去13/16假定DR4表位(表19)，但保留50％野生型表達(dá)和50％抗菌活性(表20)。與變異體Opt4比較，來自個(gè)別蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)工作的最佳酶Lib5展現(xiàn)較低的預(yù)測(cè)表位評(píng)分和較高的測(cè)量功能性。

進(jìn)一步文庫構(gòu)筑和篩選工作(文庫E)未能鑒別其它的功能構(gòu)筑體。因此，13突變Lib5變異體被指定為主要候選變異體用于進(jìn)一步分析。有趣地注意到，保留在變異體Lib5中的三個(gè)假定表位(³³YGVDFFMTI⁴¹，SEQ ID NO:215；³⁸FMTIGTPVK⁴⁶，SEQ ID NO:216；和¹¹⁶FQRMDNTFS¹²⁴，SEQ ID NO:217)涵蓋負(fù)責(zé)活性位點(diǎn)Zn²⁺配位的氨基酸(His32、Asp36和His115)或與其鄰接。此事實(shí)可能說明這些區(qū)域內(nèi)功能突變的逃避性；不同文庫群體的篩選僅僅鑒別區(qū)域33-46中一個(gè)功能取代和區(qū)域116-124中兩個(gè)功能取代(表19)。

表位消去設(shè)計(jì)顯示體內(nèi)顯著降低的免疫原性

隨后評(píng)估表位消去影響體內(nèi)免疫原性的程度。在C57Bl/6和轉(zhuǎn)基因DR4小鼠中確定抗LST抗體反應(yīng)，后者不存在內(nèi)源性鼠類MHC II，但載有來源于人類HLA DRB1*0401的嵌合MHC II受體(Ito等人,(1996)J.Exp.Med.183:2635-44)。作為去免疫化的嚴(yán)格基準(zhǔn)，將小鼠皮下免疫接種含蛋白質(zhì)的完全弗氏佐劑(一種有效免疫刺激劑)。單次免疫接種LST^WT后兩周，所有DR4小鼠發(fā)起有效的抗LST IgG抗體反應(yīng)，滴度在1:150與1:1700之間。相比之下，免疫接種Opt4的小鼠展示滴度顯著減少；僅僅2/5小鼠展現(xiàn)任何可檢測(cè)的抗LST抗體，并且甚至相對(duì)于LST^WT免疫接種動(dòng)物基本上降低。變異體Lib5還引起降低的抗體反應(yīng)；僅僅一種動(dòng)物展現(xiàn)高抗體滴度(1:1200)，三只展示顯著較低的抗體滴度(1:15至1:26)，且1只小鼠展現(xiàn)接近背景水平的抗LST抗體。重要地，LST^WT與Opt4在C57Bl/6實(shí)驗(yàn)室小鼠菌株中具有同等免疫原性，而Lib5免疫原性實(shí)際上比LST^WT多(分別IgG滴度1:4400至1:15,000對(duì)比1:560至1:2100)。因此，與天然鼠類MHC II相對(duì)比，Opt4和Lib5免疫原性的顯著減少特別與人類DR4對(duì)分子識(shí)別的破壞相關(guān)。

注意到，雖然蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)過程對(duì)除對(duì)偶基因DR4外所有對(duì)偶基因不知情，但ProPred預(yù)測(cè)指示對(duì)于七種其它代表性人類DRB1對(duì)偶基因，Opt4和Lib5都不含新表位(補(bǔ)充圖S1)。事實(shí)上，超出從Opt4消去的11個(gè)假定DR4表位，預(yù)測(cè)表明還消去12個(gè)與對(duì)偶基因DR1、DR3、DR7、DR13和DR15相關(guān)的表位。對(duì)于Lib5類似地，除消去13個(gè)DR4限制的表位外，ProPred預(yù)測(cè)消去與其它七種DRB1對(duì)偶基因相關(guān)的18個(gè)其它表位。

溶葡萄球菌酶去免疫化轉(zhuǎn)變成提高治療功效

在一些實(shí)施方案中，LST的治療應(yīng)用可能需要重復(fù)施用以完全根除金黃色葡萄球菌感染。因此，為了更接近地模擬潛在的臨床應(yīng)用，在每周給藥期間在缺乏佐劑的情況下監(jiān)測(cè)LST^WT和Lib5的免疫原性。第三次免疫接種后七天，所有接受LST^WT的DR4小鼠已發(fā)起相對(duì)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，其中抗LST滴度在1:40至1:160范圍內(nèi)。在相同時(shí)限期間，三只免疫接種Lib5的小鼠中僅僅一只發(fā)展高抗體滴度(1:120)，其中另外兩只Lib5小鼠展現(xiàn)僅僅略高過背景的滴度。

隨后使用金黃色葡萄球菌復(fù)發(fā)性菌血癥模型，評(píng)估LST免疫原性影響體內(nèi)功效的程度。在第三周確定抗體滴度后，以上DR4小鼠通過腹膜內(nèi)施用2×10⁸菌落形成單位(CFU)的甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株USA400來感染。一小時(shí)后，小鼠分別靜脈內(nèi)推注500μg LST^WT或Lib5。兩種酶從此初始感染拯救其相應(yīng)組，而給與PBS假處理的對(duì)照小鼠由于過度發(fā)病而不得不處死。

一周后，LST^WT組(1:300至1:650)和Lib5組(1小鼠>1:1000，剩余兩者在1:15與1:20之間)的抗體滴度增加，但后者繼續(xù)展現(xiàn)較低總趨勢(shì)。小鼠現(xiàn)在感染10⁹CFU的MRSA并在1小時(shí)后通過靜脈內(nèi)推注500μg相應(yīng)酶再次處理。在此第二次感染周期中，在小鼠發(fā)展更高的抗體滴度下，LST^WT未能拯救三個(gè)處理小鼠中的任一只。類似地，展現(xiàn)高抗體滴度的單個(gè)Lib5小鼠死于感染，但從第二次MRSA攻擊拯救出兩只較低滴度Lib5小鼠。

隨后一周，發(fā)現(xiàn)兩只存活的Lib5小鼠的抗體滴度再一次增加(1:70和1:120)，但值得注意地，其保持低于第4周LST^WT滴度。MRSA第三次感染周期后，一只小鼠用Lib5處理且存活，而第二只小鼠給與PBS假并死于感染。總體上，這些結(jié)果表明人類化DR4小鼠發(fā)起對(duì)LST^WT的強(qiáng)免疫反應(yīng)，甚至是在缺乏佐劑的情況下。在重復(fù)施用期間，每周抗LST^WT抗體滴度增加與功效喪失相關(guān)。相反地，在接受Lib5去免疫化變異體的三只小鼠中的兩只中免疫反應(yīng)減弱，且再一次體內(nèi)功效用抗LST抗體滴度追蹤。Lib5對(duì)MRSA多達(dá)三次的連續(xù)攻擊發(fā)揮有效的抗菌功效。

在整個(gè)研究中，低于1:256的抗LST抗體滴度與酶介導(dǎo)的免于金黃色葡萄球菌感染相關(guān)，而超過256的滴度普遍與抗菌酶療法的失敗相關(guān)。因此，變異體Lib5減輕抗藥物抗體反應(yīng)的能力顯現(xiàn)為相對(duì)于LST^WT的功效增強(qiáng)。

實(shí)施例3：人類群體中溶葡萄球菌酶催化結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域針對(duì)代表HLA結(jié)合特異性的HLA對(duì)偶基因的去免疫化

為了將LST針對(duì)人類HLA對(duì)偶基因DRB1*0101、0301、0401、0701、0801、1101、1301和1501去免疫化，產(chǎn)生預(yù)測(cè)富集功能性去免疫化的變異體的個(gè)別變異體和文庫。如實(shí)施例2中所描述，進(jìn)行催化結(jié)構(gòu)域(圖6A)和細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖6B)的表位定位。使用此信息以及溶劑可及性和進(jìn)化保守性，產(chǎn)生去免疫化LST突變體。

具體地說，細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域的突變(表21)與柔性9突變體(實(shí)施例1)或柔性9衍生物的催化結(jié)構(gòu)域的突變組合。

表21

篩選變異體并鑒別三個(gè)相關(guān)變異體F11、F12和F13(表22)。

表22

*真核宿主細(xì)胞中有效產(chǎn)生的無糖基化的突變。細(xì)菌宿主中表達(dá)不需要這些突變。

^#相對(duì)于野生型溶葡萄球菌酶序列(SEQ ID NO:49)。

針對(duì)MRSA菌株USA400的體外抑制活性篩選F11、F12和F13(圖7)。此分析指示變異體F11和F13相對(duì)于野生型LST保留12.5％MIC活性，而變異體F12相對(duì)于野生型LST保留25％MIC活性。此外，在確定針對(duì)MRSA菌株USA400的活性前，在50℃下加熱變異體1小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)野生型LST保留完全MIC活性，F(xiàn)13保留25％其原始MIC活性，且F12保留50％其原始MIC活性。

在C57BL/6小鼠中進(jìn)一步分析F11變異體的體內(nèi)功效。小鼠通過腹膜內(nèi)注射2×10⁸MRSA菌株USA400攻擊，且1小時(shí)后，小鼠用100μg呈單次靜脈內(nèi)推注施用的野生型LST、F11或PBS處理。兩種蛋白質(zhì)處理的存活率是1/3。選擇100μg劑量，因?yàn)橐阎吧蚅ST僅僅在此劑量下部分有效。通過使用此劑量，可證明F11變異體清楚的功效同等性。此分析指示兩種蛋白質(zhì)在體內(nèi)具有同等功效(圖8)。

在DR4HLA轉(zhuǎn)基因小鼠(即載有部分人類化免疫系統(tǒng)的小鼠)中，將F13變異體的免疫原性與野生型LST相比。將100μg野生型LST或變異體F13與完全弗氏佐劑混合且皮下注射至DR4小鼠中。十四天后，通過ELISA測(cè)量抗體滴度。與野生型LST比較，變異體F13產(chǎn)生超過200倍抗體滴度。為了評(píng)估抗體滴度對(duì)抗菌功效的影響，小鼠用腹膜內(nèi)注射2×10⁸MRSA菌株USA400攻擊，且1小時(shí)后，小鼠用500μg呈單次靜脈內(nèi)推注施用的野生型LST、變異體F13或PBS處理。接受PBS假處理的兩種小鼠如用野生型LST處理的兩只小鼠一樣死亡。相比之下，用變異體F13處理的兩種小鼠存活。因此，F(xiàn)13的免疫原性降低使得體內(nèi)治療功效增強(qiáng)。

在類似組的實(shí)驗(yàn)中，在缺乏佐劑的情況下，使用DR4HLA轉(zhuǎn)基因小鼠，將變異體F12的免疫原性和功效與野生型LST相比。在第0周，小鼠用腹膜內(nèi)注射2×10⁸MRSA菌株USA400攻擊，且1小時(shí)后，小鼠用呈單次皮下推注施用的500μg野生型LST或500μg變異體F12處理。隨后，小鼠每周用腹膜內(nèi)注射1×10⁹MRSA菌株USA400攻擊，且如上處理。從第2周開始，每周測(cè)量抗體滴度。野生型LST能夠?qū)⑿∈髲目偣菜拇螐?fù)發(fā)性全身性MRSA感染中拯救，但未能從第五次感染拯救任何小鼠(表23)。變異體F12從四次復(fù)發(fā)性全身性MRSA感染拯救所有小鼠(表24)。變異體F12引起的基本上較低的抗體滴度指示此變異體比野生型LST更有效。

表23

*僅僅測(cè)量總共五只中四只代表性小鼠的ELISA抗體滴度

表24

*僅僅測(cè)量總共九只中八只的ELISA抗體滴度。