相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求美國臨時(shí)申請?zhí)枮?2/031099、申請日為2014年7月30日專利的優(yōu)先權(quán)，將其公開的全部內(nèi)容以引用的方式合并。

當(dāng)前公開的主題涉及脂質(zhì)合成的方法、組合物和試劑盒以及使用復(fù)合脂質(zhì)的混合物作為內(nèi)標(biāo)，用于分析生物樣品和其它含有復(fù)合脂質(zhì)的樣品。

背景技術(shù)：

使用內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)樣品中目標(biāo)物的濃度是一種公認(rèn)的定量方法。簡而言之，一種化合物加入到?jīng)]有出現(xiàn)過的待測樣品中，滿足兩個(gè)條件：（1）內(nèi)標(biāo)的作用類似于目標(biāo)化合物在樣品制備的所有階段（例如萃取、色譜等等）和（2）通過選擇的檢測方法區(qū)別于目標(biāo)化合物。因此，如果知道加到樣品中的內(nèi)標(biāo)的濃度，和檢測相關(guān)的目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)的反應(yīng)（例如，峰面積），就可計(jì)算出起初樣品中目標(biāo)化合物的量。

生物樣品中的脂質(zhì)的通過內(nèi)標(biāo)來定量仍然存在問題，因?yàn)樯踔猎谝呀?jīng)給出的脂質(zhì)種類中，脂質(zhì)也具有不同的化學(xué)屬性。脂質(zhì)還具有組合復(fù)雜性，例如，許多潛在的脂肪酸中的幾種被?；绞畮讉€(gè)骨架之一上。所以，少量的內(nèi)標(biāo)不能滿足上述兩個(gè)條件中的第一個(gè)。一般來說，分析師使用少量內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化合物，并且通常僅選擇單一化合物來代表用作大類脂質(zhì)（例如磷脂，中性脂質(zhì)）的內(nèi)標(biāo)。對于廣泛的標(biāo)準(zhǔn)的選擇，歷史上更多地涉及生物樣品中化合物的缺乏以及合成化合物的合成的容易性，而不是標(biāo)準(zhǔn)與目標(biāo)分析物的化學(xué)性質(zhì)的相似性。大部分的脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)是從單一的奇數(shù)鏈或者短鏈脂肪酸（例如pc12:0/12:0或tag17:0/17:0/17:0）中選擇的。大部分的內(nèi)標(biāo)混合物對每個(gè)脂質(zhì)大類采用單一內(nèi)標(biāo)。然而，目前開發(fā)內(nèi)標(biāo)的方法有限，因?yàn)椋?）短鏈脂肪酸或者完全飽和脂肪酸內(nèi)標(biāo)在測定中不像靶化合物那樣起作用；2）使用簡單的內(nèi)標(biāo)策略難以表示脂質(zhì)的組合復(fù)雜性。

需要結(jié)構(gòu)上不同的一組標(biāo)準(zhǔn)，其具有用于每個(gè)脂質(zhì)類的適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)性質(zhì)以用作內(nèi)標(biāo)。這樣一組內(nèi)標(biāo)提供了廣泛的化學(xué)多樣性，從而更好地覆蓋分析。

概要

本發(fā)明描述的是質(zhì)譜分析中用到的內(nèi)標(biāo)的組分物、試劑盒以及使用方法。復(fù)合脂質(zhì)是具有與其連接的多種脂肪酸陣列的脂質(zhì)類。本文提供了合成和使用組合物和試劑盒的方法，所述組合物和試劑盒包括具有足夠不同組成的脂質(zhì)分子作為內(nèi)標(biāo)的混合物，以有效地表示本發(fā)明所提供的感興趣樣品中的復(fù)合脂質(zhì)類的脂肪酸。合成的內(nèi)標(biāo)包含本發(fā)明所描述的特征。合成的內(nèi)標(biāo)可以包裝成試劑盒供脂質(zhì)分析用。

本發(fā)明所述的脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)可用于任何應(yīng)用，包括例如質(zhì)譜法。

在本發(fā)明公開的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種用于合成脂質(zhì)分子的一種或多種混合物的方法，該脂質(zhì)分子代表存在于感興趣樣品中的一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類的組成，所述方法包括：通過具有至少兩個(gè)酰基的脂質(zhì)類的?；磻?yīng)在脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)連接同位素標(biāo)記的脂肪酸；通過酰化反應(yīng)將至少兩種不同脂肪酸的混合物連接到脂質(zhì)主鏈上的不同位點(diǎn)，其中所述脂肪酸混合物代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂肪酸，所述脂肪酸混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在。

在本發(fā)明公開的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種用于合成脂質(zhì)分子的一種或多種混合物的方法，該脂質(zhì)分子代表存在于感興趣樣品中的一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類的組成，所述方法包括：通過具有至少一個(gè)?；闹|(zhì)類的?；磻?yīng)將至少兩種不同脂肪酸的混合物連接到同位素標(biāo)記的脂質(zhì)主鏈上的單個(gè)位點(diǎn)上，其中所述脂肪酸混合物代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂肪酸，所述脂肪酸混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在。

在本發(fā)明公開的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種用作內(nèi)標(biāo)的組合物，其包含代表存在于感興趣樣品中的一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類組成的脂質(zhì)分子的一種或多種混合物，每種脂質(zhì)分子混合物包含：在脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)具有同位素標(biāo)記的脂肪酸的脂質(zhì)主鏈，所述脂質(zhì)主鏈用于具有至少兩個(gè)?；闹|(zhì)類；和存在于脂質(zhì)主鏈上的不同位點(diǎn)的至少兩種不同脂肪酸的混合物，所述脂肪酸的混合物代表存在于感興趣樣品中的脂質(zhì)類中的脂肪酸，所述脂肪酸混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在。

在本發(fā)明公開的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種用作內(nèi)標(biāo)的組合物，其包含代表存在于感興趣樣品中的一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類組成的脂質(zhì)分子的一種或多種混合物，每種脂質(zhì)分子混合物包含：具有一個(gè)或多個(gè)同位素標(biāo)記的脂質(zhì)主鏈，其中所述脂質(zhì)主鏈用于具有至少一個(gè)?；闹|(zhì)類；和存在于脂質(zhì)主鏈上的單個(gè)位點(diǎn)的至少兩種不同脂肪酸的混合物，所述脂肪酸的混合物代表存在于感興趣樣品中的脂質(zhì)類中的脂肪酸，所述脂肪酸混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在。

在本發(fā)明公開的一個(gè)實(shí)施例中，提供一種試劑盒，包括：?。┯米鲀?nèi)標(biāo)的一種或多種脂質(zhì)分子的混合物，其中，每種脂質(zhì)分子混合物都代表存在于感興趣樣品中的一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類的每一種中的脂質(zhì)分子種類的組成，每種脂質(zhì)分子混合物包含：在脂質(zhì)主鏈上的第一位點(diǎn)處具有同位素標(biāo)記的脂肪酸的脂質(zhì)主鏈和在脂質(zhì)主鏈上的不同位點(diǎn)存在的至少兩種不同脂肪酸的混合物，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有兩個(gè)酰基的脂質(zhì)類，或具有一個(gè)或多個(gè)同位素標(biāo)記的脂質(zhì)主鏈，和存在于脂質(zhì)主鏈上單個(gè)位點(diǎn)的至少兩種不同脂肪酸的混合物，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有一個(gè)?；闹|(zhì)類，其中所述脂肪酸混合物代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂肪酸，并且，脂肪酸混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在；ⅱ）使用所述一種或多種脂質(zhì)分子混合物作為內(nèi)標(biāo)物用于檢測和定量存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類的說明書。

在本發(fā)明公開的一個(gè)實(shí)施例中，提供一種用于檢測和定量存在于樣品中的脂質(zhì)分子的方法，包含：向感興趣的樣品中加入已知量的具有一種或多種脂質(zhì)分子混合物的組合物，所述混合物代表存在于感興趣樣品中的一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類組成，其中，每種脂質(zhì)分子混合物包含?。┰谥|(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)具有同位素標(biāo)記的脂肪酸的脂質(zhì)主鏈，所述脂質(zhì)主鏈用于具有至少兩個(gè)酰基的脂質(zhì)類，和ⅱ）存在于脂質(zhì)主鏈上的不同位點(diǎn)的至少兩種不同脂肪酸的混合物，所述脂肪酸的混合物代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂肪酸，所述脂肪酸混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在；通過使用脂質(zhì)分子的代表性混合物作為內(nèi)標(biāo)，檢測和定量存在于目標(biāo)樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類。

在本發(fā)明公開的一個(gè)實(shí)施例中，提供一種用于檢測和定量存在于樣品中的脂質(zhì)分子的方法，包含：向感興趣的樣品中加入已知量的具有一種或多種脂質(zhì)分子混合物的組合物，所述混合物代表存在于感興趣樣品中的一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類組成，其中，每種脂質(zhì)分子混合物包含?。┚哂幸粋€(gè)或多個(gè)同位素標(biāo)記的脂質(zhì)主鏈，其中所述脂質(zhì)主鏈用于具有至少一個(gè)?；闹|(zhì)類；和ⅱ）存在于脂質(zhì)主鏈上的單個(gè)位點(diǎn)的至少兩種不同脂肪酸的混合物，所述脂肪酸的混合物代表存在于感興趣樣品中的脂質(zhì)類中的脂肪酸，所述脂肪酸混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在；通過使用脂質(zhì)分子的代表性混合物作為內(nèi)標(biāo)，檢測和定量存在于目標(biāo)樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類。

在本發(fā)明公開的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種用于合成一種或多種脂質(zhì)分子混合物的方法，其用作代表存在于感興趣樣品中的一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類的組成的內(nèi)標(biāo)，所述方法包括以下一種或多種：通過具有至少一個(gè)?；闹|(zhì)類的酰化反應(yīng)將至少兩種不同的同位素標(biāo)記的脂肪酸的混合物連接到脂質(zhì)主鏈上的單個(gè)位點(diǎn)；通過具有至少一個(gè)酰基的脂質(zhì)類的?；磻?yīng)將至少兩種不同脂肪酸的混合物連接到同位素標(biāo)記的脂質(zhì)主鏈上；或者通過具有至少兩種脂肪酸的脂質(zhì)類的?；磻?yīng)將單一同位素標(biāo)記的脂肪酸連接到脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)，并通過?；磻?yīng)將至少兩種不同脂肪酸的混合物連接到脂質(zhì)主鏈上的不同位點(diǎn)，其中，所述至少兩種不同脂肪酸的混合物代表在感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中出現(xiàn)的脂肪酸，并且，混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在。

在本發(fā)明公開的一個(gè)實(shí)施例中，提供了用作內(nèi)標(biāo)的組合物，其包含代表存在于感興趣樣品中的一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類組成的脂質(zhì)分子的一種或多種混合物，每種脂質(zhì)分子的混合物包含以下一種或多種：在脂質(zhì)主鏈上的單個(gè)位點(diǎn)處具有至少兩種不同的同位素標(biāo)記的脂肪酸的混合物的脂質(zhì)主鏈，其中脂質(zhì)主鏈用于具有至少一個(gè)?；闹|(zhì)類；在脂質(zhì)主鏈上的單個(gè)位點(diǎn)處具有至少兩種不同脂肪酸的混合物的同位素標(biāo)記的脂質(zhì)主鏈，其中所述脂質(zhì)主鏈用于具有至少一個(gè)?；闹|(zhì)類；或者在脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)處具有單一同位素標(biāo)記的脂肪酸的脂質(zhì)主鏈，并且在脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)具有至少兩種不同脂肪酸的混合物，其中所述脂質(zhì)主鏈用于具有至少兩種脂肪酸的脂質(zhì)類，所述的具有至少兩種不同脂肪酸的混合物代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂肪酸，混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類中的脂肪酸的存在比例的比例存在。

在本發(fā)明公開的一個(gè)實(shí)施例中，提供一種試劑盒，包括?。┯米鲀?nèi)標(biāo)的一種或多種脂質(zhì)分子的混合物，其中，每種一種或多種脂質(zhì)分子混合物都代表存在于感興趣樣品中的一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類的每一種中的脂質(zhì)分子種類的組成，每種脂質(zhì)分子混合物包含一種或多種：在脂質(zhì)主鏈的單個(gè)位點(diǎn)具有至少兩種不同的同位素標(biāo)記的脂肪酸的混合物的脂質(zhì)主鏈，其中脂質(zhì)主鏈用于具有至少一個(gè)?；闹|(zhì)類；在脂質(zhì)主鏈上的單個(gè)位點(diǎn)處具有至少兩種不同脂肪酸的混合物的同位素標(biāo)記的脂質(zhì)主鏈，其中所述脂質(zhì)主鏈用于具有至少一個(gè)酰基的脂質(zhì)類；或者在脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)處具有單一同位素標(biāo)記的脂肪酸的脂質(zhì)主鏈，并且在脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)具有至少兩種不同脂肪酸的混合物，其中所述脂質(zhì)主鏈用于具有至少兩種脂肪酸的脂質(zhì)類，所述的具有至少兩種不同脂肪酸的混合物代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂肪酸，混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類中的脂肪酸的存在比例的比例存在；和ⅱ）使用所述一種或多種脂質(zhì)分子混合物作為內(nèi)標(biāo)物用于檢測和定量存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類的說明書。

在本發(fā)明公開的一個(gè)實(shí)施例中，提供一種用于檢測和定量存在于樣品中的脂質(zhì)分子的方法，包含：?。┫蚋信d趣的樣品中加入已知量的具有一種或多種脂質(zhì)分子混合物的組合物，所述混合物代表存在于感興趣樣品中的一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類組成，所述組合物包含以下的一種或多種：a）在脂質(zhì)主鏈上的單個(gè)位點(diǎn)處具有至少兩種不同的同位素標(biāo)記的脂肪酸的混合物的脂質(zhì)主鏈，其中脂質(zhì)主鏈用于具有至少一個(gè)?；闹|(zhì)類；b）在脂質(zhì)主鏈上的單個(gè)位點(diǎn)處具有至少兩種不同脂肪酸的混合物的同位素標(biāo)記的脂質(zhì)主鏈，其中所述脂質(zhì)主鏈用于具有至少一個(gè)酰基的脂質(zhì)類；或者c）在脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)處具有單一同位素標(biāo)記的脂肪酸的脂質(zhì)主鏈，并且在脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)具有至少兩種不同脂肪酸的混合物，其中所述脂質(zhì)主鏈用于具有至少兩種脂肪酸的脂質(zhì)類，所述的具有至少兩種不同脂肪酸的混合物代表存在于感興趣樣品中的脂質(zhì)類中的脂肪酸，混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類中的脂肪酸的存在比例的比例存在；和ⅱ）通過使用具有一種或多種脂質(zhì)分子的代表性混合物的組合物作為內(nèi)標(biāo)物來檢測和定量存在于感興趣樣品中的一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類的每一種中的脂質(zhì)分子種類。

附圖說明

圖1為磷脂示意圖，顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例合成磷脂內(nèi)標(biāo)物的總體戰(zhàn)略。

圖2a-2c為本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中的磷脂酰膽堿（pc）內(nèi)標(biāo)物結(jié)構(gòu)圖。（a）氘化棕櫚酸酯（16：0）位于sn-1位點(diǎn)，“r”位于sn-2位點(diǎn)，（b）典例脂肪酸油酸酯(18：ln9)位于sn-2位點(diǎn)，（c）可以?；羢n-2位點(diǎn)的8種典例脂肪酸。

圖3為本發(fā)明的一種或多種實(shí)施例中的溶血磷脂酰膽堿(lpc)內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)圖。

圖4a-4c為本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中的磷脂酰乙醇胺（pe）內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)圖。（a）氘化硬脂酸(18：0)位于sn-1位點(diǎn)，脂肪酸“r”位于sn-2位點(diǎn)，（b）典例脂肪酸油酸酯(18：ln9)位于sn-2位點(diǎn)，（c）可以?；羢n-2位點(diǎn)的8種典例脂肪酸。

圖5為本發(fā)明的一種或多種實(shí)施例中的溶血磷脂酰乙醇胺內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)圖。

圖6a-6c為本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中的鞘磷脂內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)圖。（a）氘化鞘氨醇位于第一位點(diǎn)，脂肪酸“r”位于sn-2位點(diǎn)，（b）典例脂肪酸棕櫚酸鹽(16：0)位于sn-2位點(diǎn)，（c）可以?；羢n-2位點(diǎn)的4種典例脂肪酸。

圖7a-7c為本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中的三酰基甘油內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)圖。（a）氘標(biāo)記棕櫚酸鹽(16：0)位于sn-1位點(diǎn)，油酸酯(18：ln9)位于sn-2位點(diǎn)，（b）典例脂肪酸棕櫚酸鹽(16：0)位于sn-3位點(diǎn)，（c）可以?；羢n-3位點(diǎn)的8種典例脂肪酸。

圖8a-8c為本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中的二?；视蛢?nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)圖。（a）氘標(biāo)記棕櫚酸鹽(16：0)位于sn-1位點(diǎn)，脂肪酸“r”位于sn-2位點(diǎn)，（b）典例脂肪酸棕櫚酸鹽(16：0)位于sn-2位點(diǎn)，（c）可以?；羢n-2位點(diǎn)的8種典例脂肪酸

圖9a-9c為本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中的膽固醇酯內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)圖。（a）氘標(biāo)記n6位點(diǎn)，脂肪酸“r”?；亮u基，（b）典例脂肪酸亞油酸酯(18：2n6)?；亮u基，（c）可以?；亮u基的8種典例脂肪酸

圖10a-10b為本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中的典例游離脂肪酸內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)圖。（a）氘標(biāo)記棕櫚酸鹽，（b）內(nèi)標(biāo)混合物中的17：ln7。

圖11為本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中未標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合試樣中的指示磷脂酰膽堿種類的實(shí)際濃度與使用傳統(tǒng)內(nèi)標(biāo)（is）pcl7：0/17：0和典例is混合物計(jì)算濃度相比較圖。濃度顯示為組合物的摩爾%。

圖12為本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中使用內(nèi)標(biāo)混合物的計(jì)算濃度和通過15份人體血清樣品計(jì)算得到的精準(zhǔn)度（%cv）示意圖。

圖13為本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中通過15份人體血清樣品測量三次，使用內(nèi)標(biāo)混合物計(jì)算得到的膽固醇酯（ce）脂質(zhì)類整個(gè)濃度的箱線圖。

圖14為本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中通過15份人體血清樣品測量三次，使用內(nèi)標(biāo)混合物計(jì)算得到的三?；视停╰ag）脂質(zhì)類整個(gè)濃度的箱線圖。

圖15為本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中通過單個(gè)內(nèi)標(biāo)物和多個(gè)內(nèi)標(biāo)物計(jì)算得到(a)膽固醇酯（ce）的濃度示意圖;(b)磷脂酰膽堿（pc）的濃度示意圖;(c)磷脂酰乙醇胺（pe）脂質(zhì)類的濃度示意圖。

圖16為本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中使用單個(gè)內(nèi)標(biāo)物和多個(gè)內(nèi)標(biāo)物計(jì)算出膽固醇酯（ce）脂質(zhì)類中22種脂肪酸相對含量示意圖。

圖17a-17d為本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中使用單個(gè)內(nèi)標(biāo)物和多個(gè)內(nèi)標(biāo)物計(jì)算出磷脂酰膽堿（pc）或膽固醇酯（ce）脂質(zhì)類中典例多不飽和脂肪酸的濃度示意圖。(a)pc20：5；(b)pc22：6；(c)ce40：4以及(d)ce20：5。

詳細(xì)說明

為了對本發(fā)明的原理進(jìn)行更好的理解，作出優(yōu)選實(shí)施例，并使用特定的語言來描述優(yōu)選實(shí)施例。但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例，本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明公開內(nèi)容進(jìn)行變更和進(jìn)一步的修改。

使用內(nèi)標(biāo)物定量脂質(zhì)時(shí)會(huì)遇到一些問題，原因在于即使在已經(jīng)給出的脂質(zhì)類中，脂質(zhì)也具有不同的化學(xué)屬性。脂質(zhì)還具有組合復(fù)雜性，例如，許多脂肪酸中的若干個(gè)可以被?；绞畮坠羌苤簧?。因而少量的內(nèi)標(biāo)物不能滿足上述兩個(gè)條件中第一個(gè)條件。需要的是合成一組內(nèi)標(biāo)物的方法（1）代表復(fù)雜脂質(zhì)的化學(xué)多樣性和（2）創(chuàng)建具有相對含量的標(biāo)準(zhǔn)物混合物，代表樣品中預(yù)期脂質(zhì)成分，使得這些混合物可以作為內(nèi)標(biāo)使用。本發(fā)明公開的主題是提供能夠代表復(fù)雜脂質(zhì)化學(xué)多樣性內(nèi)標(biāo)物的組分和合成方法。

本文所描述的試劑和試劑盒由一組結(jié)構(gòu)不同的脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物組成，這些脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物對于每一種脂質(zhì)類具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)性質(zhì)和/或分析性質(zhì)。關(guān)于本文使用的脂肪酸“脂質(zhì)代謝產(chǎn)物”（或者在本文的其它地方提及的“脂質(zhì)分子”）的命名法，標(biāo)有前綴“ce”、“dg”、“fa”、“pc”、“pe”、“l(fā)pc”、“l(fā)pe”、“o-pc”、“p-pe”、“sm”、“tg”或“cer”的脂肪酸代表著指示脂肪酸，這些前綴分別代表膽固醇酯、甘油二酯(雙甘酯)、游離脂肪酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、1-醚連接的磷脂酰膽堿、1-乙烯醚連接的磷脂酰乙醇胺(縮醛磷脂)、鞘磷脂、三?；视停ǜ视腿?和神經(jīng)酰胺。在一些實(shí)施例中，這些指示脂肪酸成分定量為占前綴脂質(zhì)類中整個(gè)脂肪酸的比例。沒有特定脂質(zhì)類前綴或者其它標(biāo)記的脂肪酸通常表明這些脂肪酸存在于樣品的整個(gè)脂質(zhì)中。前綴“ce”、“dg”、“fa”、“pc”、“pe”、“l(fā)pc”、“l(fā)pe”、“o-pc”、“p-pe”、“sm”、“tg”或“cer”之后的“l(fā)c”是指被前綴整個(gè)脂質(zhì)類的含量（例如，這類脂質(zhì)的濃度表示為納摩爾每克血清或血漿）。例如，在一些對血漿或血清進(jìn)行測量的實(shí)施例中，縮寫“pc18：2n6”表示由亞油酸酯(18：2n6)組成的血漿或血清磷脂酰膽堿百分?jǐn)?shù)，“tglc”表示血漿或血清中甘油三酯絕對量（如納摩爾每克）?！癿ufa”、“pupa”和“sfa”分別代表單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸。

在本文中使用的“脂質(zhì)主鏈”指的是脂質(zhì)分子除去脂肪酸基團(tuán)或?；哪遣糠帧Ｔ诖耸褂玫男g(shù)語“脂肪酸基團(tuán)”和“?；倍呖山粨Q使用。在此使用的“脂質(zhì)分子種類”或“分子種類”指的是由特定脂肪酸或?；B接于特定脂質(zhì)主鏈組成的脂質(zhì)分子（如pc18：2n6、ce16：ln6等）。

在此使用的“同位素標(biāo)記的”指的是內(nèi)標(biāo)或內(nèi)標(biāo)任何部分使用任何合適的一部分（例如，氘（2h、¹³c、¹⁵n））標(biāo)記用于測量。任何內(nèi)標(biāo)原子或任意數(shù)量的內(nèi)標(biāo)原子可以用同位素進(jìn)行標(biāo)記。例如，同位素可以是氘，內(nèi)標(biāo)可以含有9個(gè)氘原子。在另一個(gè)實(shí)例中，同位素可以是氘，內(nèi)標(biāo)可以包含11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31個(gè)氘原子。

本文所述方法的一種使用是校準(zhǔn)或協(xié)助校準(zhǔn)質(zhì)譜或多級串聯(lián)質(zhì)譜（即“平臺(tái)”）。在一個(gè)實(shí)例中，需要兩種類型的校準(zhǔn)物，一種校準(zhǔn)脂質(zhì)類濃度，一種校準(zhǔn)脂質(zhì)類中的脂肪酸組分。該平臺(tái)校準(zhǔn)的結(jié)果可能通過使用對照樣品或?qū)Λ@得的定量數(shù)據(jù)進(jìn)行比較來計(jì)算校準(zhǔn)。

本文所述的合成內(nèi)標(biāo)混合物的方法可用于任何脂質(zhì)或者脂質(zhì)類。術(shù)語“脂質(zhì)類”表示一類脂質(zhì)，例如甘油三酯、甘油二酯、膽固醇酯、游離脂肪酸、磷脂酰膽堿、o-磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、雙磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸、血磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油、磷脂酸、溶血磷脂酸、cdp-甘油二酯、溶血cdp-甘油二酯、神經(jīng)酰胺、乳糖基神經(jīng)酰胺、葡糖基神經(jīng)酰胺、植物神經(jīng)酰胺、6-羥基神經(jīng)酰胺、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、蠟酯、蠟二酯、1-單酰甘油。甘油三酯、甘油二酯、膽固醇酯、游離脂肪酸為中性脂質(zhì)。磷脂酰膽堿、o-磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、雙磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸、血磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油、磷脂酸、溶血磷脂酸、cdp-甘油二酯、溶血cdp-甘油二酯為磷脂。

內(nèi)標(biāo)混合物可以包括磷脂，每個(gè)磷脂頭部基團(tuán)（如pc、pe、se）包含：a)一個(gè)同位素標(biāo)記的脂肪酸，該同位素標(biāo)記的脂肪酸位于sn-1或sn-2位點(diǎn)；和b)脂肪酸的酰化混合物，該脂肪酸?；旌衔镂挥诓煌奈稽c(diǎn)（即這個(gè)位點(diǎn)沒有被同位素標(biāo)記的脂肪酸所占），且該脂肪酸?；旌衔锝茷槟繕?biāo)復(fù)雜脂質(zhì)中的脂肪酸濃度。

在一個(gè)實(shí)例中，同位素標(biāo)記的脂肪酸是飽和脂肪酸，脂肪酸?；旌衔锸遣伙柡椭舅岬暮投嗖伙柡椭舅岬念A(yù)先混合物。在一個(gè)實(shí)例中，同位素標(biāo)記的飽和脂肪酸是位于sn-1位點(diǎn)的棕櫚酸鹽（16：0），不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的?；旌衔锸穷A(yù)先混合物，位于sn-2位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)例中，?；旌衔镉刹伙柡椭舅峤M成。在一個(gè)實(shí)例中，磷脂是溶血磷脂酰膽堿，磷脂頭部基團(tuán)含有位于sn-1位點(diǎn)的同位素標(biāo)記的棕櫚酸鹽（16：0）。在另一實(shí)例中，磷脂是溶血磷脂酰乙醇胺，并且磷脂頭部基團(tuán)含有同位素標(biāo)記的硬脂酸酯（18：0）位于sn-1位點(diǎn)。制備脂肪酸混合物的方法如下：1)測定給定樣品類型中的脂肪酸濃度，此濃度事先已知或者通過脂肪酸組分分析測定；2）選定一個(gè)或多個(gè)具有代表性不飽和度（如單烯、二烯、三烯、四烯、五烯、己烯等）的脂肪酸，其中脂質(zhì)類中含量豐富的脂肪酸被選定；3）根據(jù)上述給定樣品類型中的脂肪酸濃度，分配混合物中各個(gè)脂肪酸高含量或低含量；4）根據(jù)高含量和低含量分配混合物中相應(yīng)脂肪酸的百分比值（如具有高含量的脂肪酸占混合物的20%，具有低含量的脂肪酸占混合物的5%）；5）確定不飽和脂肪酸中含量最高的脂肪酸，如上述分配高含量或低含量，作為混合物中其余的百分?jǐn)?shù)成分，從而形成整個(gè)混合物。

內(nèi)標(biāo)混合物可以包括磷脂，每個(gè)磷脂頭部基團(tuán)（如pc、pe、sm）包含：a)沒有標(biāo)記的脂肪酸，該無標(biāo)記的脂肪酸位于sn-1或sn-2位點(diǎn)；和b)mufa或pupa，該mufa或pupa位于無標(biāo)記脂肪酸沒有占有的位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)例中，頭部基團(tuán)包括a)沒有標(biāo)記的奇數(shù)鏈飽和脂肪酸，該沒有標(biāo)記的奇數(shù)鏈飽和脂肪酸位于sn-1位點(diǎn)；b)奇數(shù)鏈mufa或pupa，該奇數(shù)鏈mufa或pupa位于sn-2位點(diǎn)。

內(nèi)標(biāo)混合物可以包括中性脂質(zhì)，其中中性脂質(zhì)包含同位素標(biāo)記的mufa或奇數(shù)鏈mufa（如17：1，19：1等）。

在一些實(shí)施例中，定量脂肪酸分析測定內(nèi)標(biāo)混合物的具體成分。在磷脂的一個(gè)實(shí)例中，每個(gè)磷脂頭部基團(tuán)的sn-1位點(diǎn)被單個(gè)氘化的飽和脂肪酸（如dl6：0）完全標(biāo)記，因此剩余的脂肪酸位于sn-2位點(diǎn)。公式如下：1=a/x+b/x+c/x等，其中x是在混合物中的單個(gè)氘化的飽和脂肪酸的百分比；其中a、b、c等是該混合物中的脂肪酸；脂肪酸a、b、c等在內(nèi)標(biāo)混合物的百分比相對于x是已知的。并且其中脂肪酸a在內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)混合物中的百分比。進(jìn)一步，a/x=由a組成的混合物含量。例如，pc內(nèi)標(biāo)混合物的組成通過fame分析測定為：dl6：0-50%，18：ln9-10%，18：2n6-20%，和20：4n6-20%，然后1=(0.1/0.5)+(0.2/0.5)+(0.2/0.5)以及0.1/0.5=0.2；0.2/0.5=0.4；以及0.2/0.5=0.4，混合物包括20%的pcdl16：0/18：ln9，40%的pdl6：0/18：2n6以及40%的pcdl6：0/20：4n6。

游離脂肪酸是中性脂質(zhì)的一種類型，可組成內(nèi)標(biāo)混合物。游離脂肪酸可以為任意游離脂肪酸，包括，例如單奇數(shù)鏈脂肪酸（如17：1、17：2、17：0等）和/或同位素標(biāo)記的脂肪酸（如16：0、16：1、17：0等）。游離脂肪酸也可以為mufa或者脂肪酸可以為pupa。

膽固醇酯是中性脂質(zhì)的一種類型，可組成內(nèi)標(biāo)混合物。膽固醇酯可以為任何膽固醇酯，包括，例如標(biāo)記的膽固醇分子酯化到脂肪酸混合物形成的膽固醇酯，代表在樣品中膽固醇酯的預(yù)期成分（見表1）。

二?；视褪侵行灾|(zhì)的一種類型，可組成內(nèi)標(biāo)混合物。二?；视涂梢詾槿魏味；视停?，例如單奇數(shù)鏈脂肪酸或同位素標(biāo)記的脂肪酸。二?；视偷闹舅徭湴ǎ篴)同位素標(biāo)記的脂肪酸，其中同位素標(biāo)記的脂肪酸位于sn-1或sn-2位點(diǎn)（第一位點(diǎn)）；b)脂肪酸的酰化混合物，其中脂肪酸酰化混合物位于不同的位點(diǎn)（即這個(gè)位點(diǎn)沒有被同位素標(biāo)記的脂肪酸所占）。在一個(gè)實(shí)例中，同位素標(biāo)記的脂肪酸為飽和脂肪酸。在一個(gè)實(shí)例中，同位素標(biāo)記的脂肪酸為棕櫚酸鹽（16：0）位于第一位點(diǎn)，脂肪酸酰化混合物位于不同的位點(diǎn)，該脂肪酸?；旌衔锇?6：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：4n6、20：5n3和22：6n3。在一個(gè)實(shí)例中，同位素標(biāo)記的脂肪酸是棕櫚酸鹽（16：0）位于第一位點(diǎn)，位于不同位點(diǎn)的脂肪酸?；旌衔餅椴伙柡椭舅岷投嗖伙柡椭舅岬幕旌衔?。在另一個(gè)實(shí)例中，內(nèi)標(biāo)混合物中的二酰基甘油的脂肪酸鏈包括：a)未標(biāo)記的奇數(shù)鏈飽和脂肪酸，其中未標(biāo)記的奇數(shù)鏈飽和脂肪酸位于第一位點(diǎn)；b)奇數(shù)鏈mufa或pufa，其中奇數(shù)鏈mufa或pufa位于不同位點(diǎn)。內(nèi)標(biāo)混合物中二?；视涂梢詾槎鄠€(gè)同質(zhì)內(nèi)標(biāo)物（例如dg17：0/17：0和dg17：1/17：1等）。

三?；视褪侵行灾|(zhì)的一種類型，可以組成內(nèi)標(biāo)混合物。三?；视涂梢詾槿魏稳；视停?，例如奇數(shù)鏈脂肪酸和/或同位素標(biāo)記的脂肪酸按照混合標(biāo)準(zhǔn)形成的混合物。三?；视偷闹舅徭湴ǎ篴)標(biāo)記的脂肪酸位于一個(gè)位點(diǎn)；b)未標(biāo)記的脂肪酸位于不同的位點(diǎn)；c)脂肪酸的酰化混合物位于另外一個(gè)不同的位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)例中，標(biāo)記的脂肪酸為飽和脂肪酸，未標(biāo)記的脂肪酸為不飽和脂肪酸。在一個(gè)實(shí)例中，標(biāo)記為氘標(biāo)。在一個(gè)實(shí)例中，內(nèi)部混合物中的三?；视偷闹舅徭湴ǎ篴)同位素標(biāo)記的棕櫚酸鹽（16：0）位于一個(gè)位點(diǎn)（如位于sn-1位點(diǎn)）；b)油酸酯（18：ln9）位于不同或第二個(gè)位點(diǎn)（如位于sn-2位點(diǎn)）；c)脂肪酸的酰化混合物位于另外一個(gè)不同或第三個(gè)位點(diǎn)（如位于sn-3位點(diǎn)）。位于第三個(gè)位點(diǎn)（如sn-3）的脂肪酸?；旌衔锇ǎ?6：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6和22：6n3。

內(nèi)標(biāo)混合物可包括：a）磷脂酰膽堿脂質(zhì)類，其中同位素標(biāo)記的棕櫚酸鹽（16：0）位于sn-1位點(diǎn)，mufa和pufa混合物位于sn-2位點(diǎn)；b)磷脂酰乙醇胺脂質(zhì)類，其中同位素標(biāo)記的棕櫚酸鹽（16：0）或硬脂酸（18：0）位于sn-1位點(diǎn)，mufa和pufa混合物位于sn-2位點(diǎn)；c)溶血磷脂酰膽堿脂質(zhì)類，其中同位素標(biāo)記的棕櫚酸鹽（16：0）位于sn-1位點(diǎn)；d)溶血磷脂酰乙醇胺脂質(zhì)類，其中同位素標(biāo)記的棕櫚酸鹽（16：0）或硬脂酸（18：0）位于sn-1位點(diǎn)；e)鞘磷脂脂質(zhì)類，其中同位素標(biāo)記的鞘氨醇類骨架和脂肪酸混合物位于sn-2位點(diǎn)；f)甘油三酯脂質(zhì)類，其中同位素標(biāo)記的棕櫚酸鹽位于sn-1位點(diǎn)，未標(biāo)記的油酸酯（或其它脂肪酸）位于sn-2位點(diǎn)，脂肪酸的混合物位于sn-3位點(diǎn)；g)膽固醇酯脂質(zhì)類，由同位素標(biāo)記的膽固醇頭基團(tuán)與脂肪酸混合物?；@得；h)二?；视椭|(zhì)類，其中同位素標(biāo)記的棕櫚酸鹽（16：0）位于sn-1位點(diǎn)，脂肪酸混合物位于sn-2位點(diǎn)；i)游離脂肪酸脂質(zhì)類，包括有同位素標(biāo)記的脂肪酸或同位素標(biāo)記的15：1或同位素標(biāo)記的17：1；和/或j）神經(jīng)酰胺脂質(zhì)類，同位素標(biāo)記的神經(jīng)鞘脂類骨架和脂肪酸混合物適量混合形成神經(jīng)酰胺類。

在一個(gè)實(shí)例中，神經(jīng)酰胺脂質(zhì)類包括以下神經(jīng)鞘脂類骨架：鞘氨醇、二氫神經(jīng)鞘氨醇、植物鞘氨醇或6一羥基鞘氨醇。

本文中描述的試劑可被組合形成制品，例如，試劑盒。

復(fù)雜脂質(zhì)根據(jù)不同種類分類：每個(gè)種類由脂質(zhì)頭部基團(tuán)定義（如pc含有磷酸膽堿頭部基團(tuán)，ce含有膽固醇頭部基團(tuán)）。脂質(zhì)類中，有許多分子種類由連接至頭部基團(tuán)的脂肪酸定義。因?yàn)橹舅峋哂谢瘜W(xué)結(jié)構(gòu)多樣性，每個(gè)脂質(zhì)類含有大量的不同成分從而導(dǎo)致差異化的脂質(zhì)分子種類。為了定量脂質(zhì)類，必須定量每種分子種類，并準(zhǔn)確求和。

與傳統(tǒng)的對于范圍較寬的脂質(zhì)（例如磷脂）通常使用一種內(nèi)標(biāo)物的脂類組學(xué)戰(zhàn)略不同，本文提供包括脂肪酸混合物（每種脂質(zhì)類最多有10個(gè)脂肪酸）的內(nèi)標(biāo)物的合成方法。本方法中，內(nèi)標(biāo)混合物（is混合物）中的脂肪酸選擇可以代表分析樣品中脂質(zhì)類的化學(xué)結(jié)構(gòu)（脂質(zhì)分子種類）多樣性。表1為根據(jù)本發(fā)明方法測量的對應(yīng)于每種脂質(zhì)類各脂肪酸的濃度值，每種脂質(zhì)類剩余的脂肪酸歸屬于最接近的內(nèi)標(biāo)物類似物，并賦予測量值；每種脂質(zhì)類的總濃度通過該脂質(zhì)類中所有分子種類值（測量和賦值的）相加而得。

在一個(gè)實(shí)施例中，表1為對應(yīng)10種脂質(zhì)類內(nèi)標(biāo)物其相應(yīng)的脂肪酸組成。內(nèi)標(biāo)物的脂質(zhì)類如表1第一行所示，脂肪酸“r”列于表1第一列。表1中，“d”代表加入有氘標(biāo)記。例如，16：0-d9表示含有9個(gè)氘原子的棕櫚酸鹽。

表1.合成的脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)物中脂肪酸混合物組分

在一個(gè)實(shí)施例中，提供了磷脂酰膽堿和o-磷脂酰膽堿的典型的內(nèi)標(biāo)物組分，這些內(nèi)標(biāo)物的sn-2位點(diǎn)脂肪酸（sn-2脂肪酸）的組成如表2所示。磷脂酰膽堿和sn-2脂肪酸組成的混合物結(jié)構(gòu)如圖2所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記棕櫚酸鹽（16：0）以及位于sn-2位點(diǎn)的以“r”脂肪酸來指示的磷脂酰膽堿結(jié)構(gòu)如圖2a所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記棕櫚酸鹽（16：0）以及位于sn-2位點(diǎn)的作為典例脂肪酸的油酸酯（18：ln9）的磷脂酰膽堿結(jié)構(gòu)如圖2b所示。脂肪酸混合物中?；亮字Ｄ憠Asn-2位點(diǎn)的十種脂肪酸（16：ln7、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6、20：5n3、22：4n6、22：5n3和22：6n3）結(jié)構(gòu)如圖2c所示。

表2.磷脂酰膽堿和o-磷脂酰膽堿內(nèi)標(biāo)物的sn-2位點(diǎn)脂肪酸組成

在一個(gè)實(shí)施例中，作為溶血磷脂酰膽堿內(nèi)標(biāo)物的典型內(nèi)標(biāo)物及其結(jié)構(gòu)如圖3所示。

對于磷脂酰乙醇胺和p-磷脂酰乙醇胺內(nèi)標(biāo)物，其sn-2位點(diǎn)脂肪酸的組分如表3所示。磷脂酰乙醇胺和sn-2位點(diǎn)脂肪酸組成的混合物結(jié)構(gòu)如圖4所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記硬脂酸（18：0）以及位于sn-2位點(diǎn)的以“r”脂肪酸來指示的磷脂酰乙醇胺結(jié)構(gòu)如圖4a所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記硬脂酸（18：0）以及位于sn-2位點(diǎn)作為典例脂肪酸的油酸酯（18：ln9）的磷脂酰乙醇胺結(jié)構(gòu)如圖4b所示。脂肪酸混合物中酰化至磷脂酰乙醇胺sn-2位點(diǎn)的八種脂肪酸（18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6、20：5n3、22：5n3和22：6n3）結(jié)構(gòu)如圖4c所示。

表3磷脂酰乙醇胺和p-磷脂酰乙醇胺內(nèi)標(biāo)物的sn-2位點(diǎn)脂肪酸組成

在一個(gè)實(shí)施例中，作為溶血磷脂酰乙醇胺的典例內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)如圖5所示。

在一個(gè)實(shí)施例中，提供作為鞘磷脂的典例內(nèi)標(biāo)物，其脂肪酸組分如表4所示。鞘磷脂和sn-2位點(diǎn)脂肪酸組成的混合物結(jié)構(gòu)如圖6所示。含有位于第一位點(diǎn)的氘標(biāo)記鞘氨醇以及位于sn-2位點(diǎn)的的“r”脂肪酸的鞘磷脂結(jié)構(gòu)如圖6a所示。含有位于第一位點(diǎn)的氘標(biāo)記鞘氨醇以及位于sn-2位點(diǎn)作為典例脂肪酸的棕櫚酸鹽（16：0）的鞘磷脂結(jié)構(gòu)如圖6b所示。脂肪酸混合物中連接在鞘磷脂sn-2位點(diǎn)的四種脂肪酸（16：0、18：ln9、24：0和24：ln9）結(jié)構(gòu)如圖6c所示。

表4鞘磷脂內(nèi)標(biāo)物的脂肪酸組分

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供三?；视偷牡淅齼?nèi)標(biāo)物，其sn-3位點(diǎn)脂肪酸的組分如表5所示。三?；视秃蛃n-3位點(diǎn)脂肪酸組成的混合物結(jié)構(gòu)如圖7所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記棕櫚酸鹽（16：0）、位于sn-2位點(diǎn)的油酸酯（18：ln9）以及位于sn-3位點(diǎn)的“r”脂肪酸指示的三酰基甘油結(jié)構(gòu)如圖7a所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記棕櫚酸鹽（16：0）、位于sn-2位點(diǎn)的油酸酯（18：ln9）以及位于sn-3位點(diǎn)作為典例脂肪酸的棕櫚酸鹽（16：0）的三?；视徒Y(jié)構(gòu)如圖7b所示。脂肪酸混合物中連接在三?；视蛃n-3位點(diǎn)的八種脂肪酸（16：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6和22：6n3）結(jié)構(gòu)如圖7c所示。

表5三?；视蛢?nèi)標(biāo)物sn-3位點(diǎn)脂肪酸組成

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供二酰基甘油的典例內(nèi)標(biāo)物。其sn-2位點(diǎn)脂肪酸的組分如表6所示。二?；视秃蛃n-2位點(diǎn)脂肪酸組成的混合物結(jié)構(gòu)如圖8所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記棕櫚酸鹽（16：0）以及位于sn-2位點(diǎn)的以“r”脂肪酸指示的二?；视徒Y(jié)構(gòu)如圖8a所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記棕櫚酸鹽（16：0）以及位于sn-2位點(diǎn)作為典例脂肪酸的棕櫚酸鹽（16：0）的二?；视徒Y(jié)構(gòu)如圖8b所示。脂肪酸混合物中連接在二?；视蛃n-2位點(diǎn)的八種脂肪酸（16：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：4n6、20：5n3和22：6n3）結(jié)構(gòu)如圖8c所示。

表6二?；视蛢?nèi)標(biāo)物sn-2位點(diǎn)脂肪酸組成

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供膽固醇酯的典例內(nèi)標(biāo)物，其脂肪酸組分如表7所示。膽固醇酯和脂肪酸組成的混合物結(jié)構(gòu)如圖9所示。含有位于n6位點(diǎn)的氘標(biāo)記物以及?；亮u基的“r”脂肪酸的膽固醇酯結(jié)構(gòu)如圖9a所示。含有位于n6位點(diǎn)的氘標(biāo)記物的膽固醇酯和?；亮u基的作為典例脂肪酸的亞油酸酯（18：2n6）的結(jié)構(gòu)如圖9b所示。用來?；聊懝檀减チu基的脂肪酸混合物中的八種脂肪酸（16：0、16：ln7、18：ln9、18：2n6、20：3n6、20：4n6、20：5n3和22：6n3）結(jié)構(gòu)如圖9c所示。

表7膽固醇酯內(nèi)標(biāo)物的脂肪酸組成

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供游離脂肪酸的典例內(nèi)標(biāo)物，其脂肪酸組分如表8所示。游離脂肪酸組成的混合物結(jié)構(gòu)如圖10所示。含有氘標(biāo)記的游離脂肪酸棕櫚酸鹽（16：0）結(jié)構(gòu)如圖10a所示。游離脂肪酸17：ln7的結(jié)構(gòu)如圖10b所示。

表8游離脂肪酸內(nèi)標(biāo)物組分

制備脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)物的方法

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，合成脂質(zhì)分子的一種或多種混合物作為內(nèi)標(biāo)物，該脂質(zhì)分子代表存在于感興趣樣品內(nèi)一種或多種對應(yīng)的脂質(zhì)類的脂質(zhì)分子種類組分，本制備方法包括一個(gè)或多個(gè)：通過與具有至少一個(gè)?；闹|(zhì)類發(fā)生?；磻?yīng)，連接至少含有兩種同位素標(biāo)記脂肪酸的混合物于脂質(zhì)主鏈，該同位素標(biāo)記脂肪酸位于單個(gè)位點(diǎn)；通過與具有至少一個(gè)?；闹|(zhì)類發(fā)生酰胺化反應(yīng)，連接至少含有兩種脂肪酸的混合物于同位素標(biāo)記的脂質(zhì)主鏈，該脂肪酸位于單個(gè)位點(diǎn)；或者通過與具有至少含有兩種脂肪酸的脂質(zhì)類發(fā)生酰胺化反應(yīng)，連接一個(gè)同位素標(biāo)記脂肪酸于脂質(zhì)主鏈，該同位素標(biāo)記脂肪酸位于第一位點(diǎn)，然后通過酰胺化反應(yīng)，連接至少含有兩種脂肪酸的混合物于脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)，其中至少含有兩種脂肪酸的混合物代表存在于感興趣樣品內(nèi)對應(yīng)脂質(zhì)類的脂肪酸，其中混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類別中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在。相應(yīng)的脂質(zhì)類包括三?；视汀⒍；视?、1-單酰甘油、磷脂、磷脂酰膽堿、o-磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、膽固醇酯、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰絲氨、溶血酸磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血cdp-二?；视?、cdp-二酰基甘油、鞘磷脂、心磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、神經(jīng)酰胺、乳糖基神經(jīng)酰胺、葡糖基神經(jīng)酰胺、植物神經(jīng)酰胺、6-羥基神經(jīng)酰胺、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、蠟酯、蠟二酯中的一種或多種。位于脂質(zhì)分子的一種或多種混合物中的每一種脂肪酸的一種或多種混合物可以包括表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂質(zhì)分子種類的一種或多種混合物。位于一種或多種脂質(zhì)分子中的一種或多種脂肪酸可以由表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂質(zhì)分子種類的一種或多種混合物組成。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，公開一種合成一種或多種脂質(zhì)分子混合物作為內(nèi)標(biāo)物，代表存在于感興趣樣品內(nèi)一種或多種對應(yīng)的脂質(zhì)類的脂質(zhì)分子種類組分，本制備方法包括：通過與具有至少兩個(gè)?；闹|(zhì)類發(fā)生酰胺化反應(yīng)，連接一個(gè)同位素標(biāo)記脂肪酸于脂質(zhì)主鏈第一位點(diǎn)；然后通過酰胺化反應(yīng)，連接至少含有兩種脂肪酸的混合物于脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)，其中脂肪酸的混合物代表存在于感興趣樣品內(nèi)對應(yīng)的脂質(zhì)類的脂肪酸，其中混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類別中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在。本方法中，一種或多種含有至少兩個(gè)?；闹|(zhì)類包括三酰基甘油、二?；视?、磷脂、磷脂酰膽堿、o-磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、心磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、cdp-二?；视?、神經(jīng)酰胺、乳糖基神經(jīng)酰胺、葡糖基神經(jīng)酰胺、植物神經(jīng)酰胺、6-羥基神經(jīng)酰胺、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂或蠟二酯。位于脂質(zhì)分子的一種或多種混合物中的每一種脂肪酸的一種或多種混合物可以包括表1、表2、表3、表4、表5或表6中所列的脂質(zhì)分子種類的一種或多種混合物。位于一種或多種脂質(zhì)分子中的一種或多種脂肪酸可以由表1、表2、表3、表4、表5或表6中所列的脂質(zhì)分子種類的一種或多種混合物組成。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，合成一種或多種脂質(zhì)分子混合物作為內(nèi)標(biāo)物，代表存在于感興趣樣品內(nèi)一種或多種對應(yīng)的脂質(zhì)類的脂質(zhì)分子種類組分，本制備方法：通過與具有至少一個(gè)?；闹|(zhì)類發(fā)生酰胺化反應(yīng)，連接至少含有兩種脂肪酸的混合物于同位素標(biāo)記的脂質(zhì)主鏈，脂肪酸位于單個(gè)位點(diǎn)，其中脂肪酸的混合物代表存在于感興趣樣品內(nèi)對應(yīng)的脂質(zhì)類的脂肪酸，其中混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類別中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在。本方法中，一種或多種含有至少一個(gè)?；闹|(zhì)類包括三?；视汀⒍；视汀?-單酰甘油、磷脂、磷脂酰膽堿、o-磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、膽固醇酯、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰絲氨、溶血酸磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血cdp-二?；视汀dp-二?；视?、鞘磷脂、心磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、神經(jīng)酰胺、乳糖基神經(jīng)酰胺、葡糖基神經(jīng)酰胺、植物神經(jīng)酰胺、6-羥基神經(jīng)酰胺、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、蠟酯、蠟二酯。位于脂質(zhì)分子的一種或多種混合物中的每一種脂肪酸的一種或多種混合物可以包括表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂質(zhì)分子種類的一種或多種混合物。位于一種或多種脂質(zhì)分子中的一種或多種脂肪酸可以由表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂質(zhì)分子種類的一種或多種混合物組成。

上述方法中，感興趣的樣品可以為復(fù)雜混合物包括脂質(zhì)分子、生物樣品如植物樣品或動(dòng)物樣品。動(dòng)物樣品可來自哺乳動(dòng)物，如人、老鼠、非人類靈長類動(dòng)物、兔子或者其它哺乳動(dòng)物，或者非哺乳動(dòng)物，如斑馬魚樣品等。感興趣的生物樣品包括血液、血漿、血清、分離脂蛋白、唾液、尿液、淋巴液以及腦脊液，組織樣品，細(xì)胞樣品或皮膚樣品。

上述方法中，該方法可以進(jìn)一步包括脂肪酸定量分析，對混合物中每個(gè)脂肪酸進(jìn)行定量測定。

上述方法中，脂肪酸可以為飽和脂肪酸。

上述方法中，同位素標(biāo)記物可以為任何同位素標(biāo)記物，包括²h、¹³c或¹⁵n。

在所述方法的一個(gè)實(shí)施例中，脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)。脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)或sn-3位點(diǎn)。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)。脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)或sn-3位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施例中，脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)可以為sn-3位點(diǎn)。脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)可以為sn-3位點(diǎn)，脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)或sn-2位點(diǎn)。

上述方法中，一種或多種具有至少兩個(gè)酰基的脂質(zhì)類可以由磷脂酰膽堿或o-磷脂酰膽堿組成，其中第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，或者其中第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，其中氘標(biāo)記的十六烷酰基-d9(16：0-d9)可以位于第一位點(diǎn)，其中位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物包括9z-十六碳烯?；?16：ln7)、9z-十八碳烯?；?18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯?；?18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯酰基(l8：3n3)、8z，11z，14z-二十碳三烯?；?20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯?；?20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z-二十碳五烯?；?20：5n3)、7z，10z，13z，16z-二十二碳四烯?；?22：4n6)、7z，10z，13z，16z，19z-二十二碳五烯?；?22：5n3)、4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯?；?22：6n3)。位于sn-2位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表2所示。

上述方法中，一種或多種具有至少兩個(gè)?；闹|(zhì)類可以由磷脂酰乙醇胺和p-磷脂酰乙醇胺組成，其中第一位點(diǎn)為sn-1位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，或其中第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，其中氘標(biāo)記的十八烷?；?d9(18：0-d9)可以位于第一位點(diǎn)，其中位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物包括9z-十八碳烯?；?18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯?；?18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯?；?18：3n3)、8z，11z，14z二十碳三烯酰基(20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯?；?20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯?；?20：5n3)、7z，10z，13z，16z，19z-二十二碳五烯基酰(22：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯?；?22：6n3)。位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表3所示。

上述方法中，一種或多種具有至少兩個(gè)?；闹|(zhì)類可以由鞘磷脂組成，其中氘標(biāo)記的鞘氨醇位于第一位點(diǎn)，其中脂肪酸混合物位于不同位點(diǎn)包括十六烷酰基(16：0)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、二十四烷?；?24：0)、15z-二十四碳烯?；?24：ln9)。位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表4所示。

上述方法中，一種或多種具有至少兩個(gè)?；闹|(zhì)類可以由三酰基甘油組成，其中第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)或sn-3位點(diǎn)，或其中第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)或sn-3位點(diǎn)，或其中第一位點(diǎn)可以為sn-3位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)或sn-2位點(diǎn)，其中氘標(biāo)記的棕櫚酸鹽(16：0-d9)可以位于第一位點(diǎn)，油酸酯（18：ln9）位于其中一個(gè)不同位點(diǎn)，位于另外一個(gè)不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物包括十六烷?；?16：0)、十八烷?；?18：0)、9z-十八碳烯?；?18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯酰基(18：3n3)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯酰基(20：4n6)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯?；?22：6n3)。位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表6所示。

上述方法中，一種或多種具有至少兩個(gè)酰基的脂質(zhì)類可以由甘油二酯組成，其中第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，或其中第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，其中氘標(biāo)記的棕櫚酸鹽(16：0-d9)可以位于第一位點(diǎn)，其中位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物包括十六烷?；?16：0)、十八烷?；?18：0)、9z-十八碳烯?；?18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯?；?18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯?；?18：3n3)、8z，11z，14z-二十碳三烯?；?20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯?；?20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯?；?20：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯?；?22：6n3)。位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表5所示。

上述方法中，一種或多種具有至少一個(gè)?；闹|(zhì)類可以由膽固醇酯組成，其中單個(gè)位點(diǎn)為羥基，其中連接于羥基的脂肪酸混合物包括十六烷酰基(16：0)、9z-十六碳烯酰基(16：ln7)、9z-十八烷酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯?；?18：2n6)、8z，11z，14z-二十碳三烯?；?20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯?；?20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯酰基(20：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于羥基的脂肪酸混合物各比例如表7所示。

作為內(nèi)標(biāo)物使用的組合物

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供一種組合物，該組合物作為內(nèi)標(biāo)物使用，包含一種或多種脂質(zhì)分子混合物，代表存在于感興趣樣品內(nèi)一種或多種相對應(yīng)的脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類組成，每種脂質(zhì)分子混合物包括一種或多種：脂質(zhì)主鏈具有至少有兩種同位素標(biāo)記的脂肪酸混合物，該同位素標(biāo)記的脂肪酸混合物位于脂質(zhì)主鏈的單個(gè)位點(diǎn)，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有一個(gè)?；闹?；一種同位素標(biāo)記的脂質(zhì)主鏈具有至少兩種脂肪酸的混合物，該脂肪酸混合物位于脂質(zhì)主鏈的單個(gè)位點(diǎn)，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有一個(gè)?；闹?；或者脂質(zhì)主鏈具有一種同位素標(biāo)記的脂肪酸，該同位素標(biāo)記的脂肪酸位于脂質(zhì)主鏈的第一個(gè)位點(diǎn)，并且具有至少有兩種不同脂肪酸的混合物，該脂肪酸位于脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有兩種脂肪酸的脂類，其中至少有兩種不同脂肪酸的混合物代表感興趣樣品內(nèi)相應(yīng)脂類中的脂肪酸，其中混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類別中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在。脂質(zhì)類包括三?；视?、二?；视汀?-單酰甘油、磷脂、磷脂酰膽堿、o-磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、膽固醇酯、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰絲氨、溶血酸磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血cdp-二?；视汀dp-二?；视汀⑶柿字?、心磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、神經(jīng)酰胺、乳糖基神經(jīng)酰胺、葡糖基神經(jīng)酰胺、植物神經(jīng)酰胺、6-羥基神經(jīng)酰胺、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、蠟酯、蠟二酯中一種或多種。位于脂質(zhì)分子的一種或多種混合物中的每一種脂肪酸的一種或多種混合物可以包括表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂質(zhì)分子種類的一種或多種混合物。位于一種或多種脂質(zhì)分子中的一種或多種脂肪酸可以由表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂質(zhì)分子種類的一種或多種混合物組成。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供一種組合物，該組合物作為內(nèi)標(biāo)物使用，包含一種或多種脂質(zhì)分子混合物，代表存在于感興趣樣品內(nèi)一種或多種相對應(yīng)的脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類組成，每種脂質(zhì)分子混合物包括：脂質(zhì)主鏈具有一種同位素標(biāo)記的脂肪酸，該同位素標(biāo)記的脂肪酸位于脂質(zhì)主鏈的第一個(gè)位點(diǎn)，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有兩個(gè)酰基的脂類；至少有兩種不同脂肪酸的混合物位于脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)，其中脂肪酸混合物代表感興趣樣品內(nèi)相應(yīng)脂類中的脂肪酸，其中混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類別中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在。在這個(gè)組合物中，脂質(zhì)類包括三?；视汀⒍；视?、磷脂、磷脂酰膽堿、o-磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、心磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、cdp-二?；视?、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、乳糖基神經(jīng)酰胺、葡糖基神經(jīng)酰胺、植物神經(jīng)酰胺、6-羥基神經(jīng)酰胺、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、蠟二酯中一種或多種。位于脂質(zhì)分子的一種或多種混合物中的每一種脂肪酸的一種或多種混合物可以包括表1、表2、表3、表4、表5、或表6中所列的脂質(zhì)分子種類的一種或多種混合物。位于一種或多種脂質(zhì)分子中的一種或多種脂肪酸可以由表1、表2、表3、表4、表5、或表6中所列的脂質(zhì)分子種類的一種或多種混合物組成。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供一種組合物，該組合物作為內(nèi)標(biāo)物使用，包含一種或多種脂質(zhì)分子混合物，代表存在于感興趣樣品內(nèi)一種或多種相對應(yīng)的脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類組成，每種脂質(zhì)分子混合物包括：脂質(zhì)主鏈具有一個(gè)或多個(gè)同位素標(biāo)記物，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有一個(gè)?；闹?；至少有兩種不同脂肪酸的混合物位于脂質(zhì)主鏈的單個(gè)位點(diǎn)，其中脂肪酸混合物代表感興趣樣品內(nèi)相應(yīng)脂類中的脂肪酸，其中混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類別中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在。本組合物中，脂質(zhì)類包括三?；视汀⒍；视?、1-單酰甘油、磷脂、磷脂酰膽堿、o-磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、膽固醇酯、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰絲氨、溶血酸磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血cdp-二?；视汀dp-二?；视?、鞘磷脂、心磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、神經(jīng)酰胺、乳糖基神經(jīng)酰胺、葡糖基神經(jīng)酰胺、植物神經(jīng)酰胺、6-羥基神經(jīng)酰胺、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、蠟酯、蠟二酯中一種或多種。位于脂質(zhì)分子的一種或多種混合物中的每一種脂肪酸的一種或多種混合物可以包括表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂質(zhì)分子種類的一種或多種混合物。位于一種或多種脂質(zhì)分子中的一種或多種脂肪酸可以由表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂質(zhì)分子種類的一種或多種混合物組成。

在上面所述的組合物中，感興趣的樣品可以為復(fù)雜混合物包括脂質(zhì)分子、生物樣品如植物樣品或動(dòng)物樣品。動(dòng)物樣品可來自哺乳動(dòng)物，如人、老鼠、非人類靈長類動(dòng)物、兔子或者其它哺乳動(dòng)物，或者非哺乳動(dòng)物，如斑馬魚樣品等。感興趣的生物樣品包括血液、血漿、血清、分離脂蛋白、唾液、尿液、淋巴液以及腦脊液，組織樣品，細(xì)胞樣品或皮膚樣品。

在上面所述的組合物中，同位素標(biāo)記物可以為任何同位素標(biāo)記物，包括²h、¹³c或¹⁵n。

在上面所述的組合物中，脂肪酸可以為飽和脂肪酸。

在上面所述的組合物中，脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)。脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)或sn-3位點(diǎn)。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)。脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)或sn-3位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施例中，脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)可以為sn-3位點(diǎn)。脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)可以為sn-3位點(diǎn)，脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)或sn-2位點(diǎn)。

在上面所述的組合物中，一種脂質(zhì)類可以由磷脂酰膽堿或o-磷脂酰膽堿組成，其中第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，或者其中第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，其中氘標(biāo)記的十六烷?；?d9(16：0-d9)可以位于第一位點(diǎn)，其中位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物包括9z-十六碳烯?；?16：ln7)、9z-十八碳烯?；?18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯?；?18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯?；?l8：3n3)、8z，11z，14z-二十碳三烯?；?20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯?；?20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z-二十碳五烯?；?20：5n3)、7z，10z，13z，16z-二十二碳四烯?；?22：4n6)、7z，10z，13z，16z，19z-二十二碳五烯?；?22：5n3)、4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯?；?22：6n3)。位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表2所示。

在上面所述的組合物中，一種脂質(zhì)類可以由磷脂酰乙醇胺和p-磷脂酰乙醇胺組成，其中第一位點(diǎn)為sn-1位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，或其中第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，其中氘標(biāo)記的十八烷酰基-d9(18：0-d9)可以位于第一位點(diǎn)，其中位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物包括9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯?；?18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯?；?18：3n3)、8z，11z，14z二十碳三烯酰基(20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯?；?20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯?；?20：5n3)、7z，10z，13z，16z，19z-二十二碳五烯?；?22：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯?；?22：6n3)。位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表3所示。

在上面所述的組合物中，一種脂質(zhì)類可以由鞘磷脂組成，其中氘標(biāo)記的鞘氨醇位于第一位點(diǎn)，其中脂肪酸混合物位于不同位點(diǎn)包括十六烷?；?16：0)、9z-十八碳烯?；?18：ln9)、二十四烷?；?24：0)、15z-二十四碳烯?；?24：ln9)。位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表4所示。

在上面所述的組合物中，一種脂質(zhì)類可以由甘油二酯組成，其中第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，或其中第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，其中氘標(biāo)記的棕櫚酸鹽(16：0-d9)可以位于第一位點(diǎn)，其中位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物包括十六烷酰基(16：0)、十八烷?；?18：0)、9z-十八碳烯?；?18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯?；?18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯?；?18：3n3)、8z，11z，14z-二十碳三烯?；?20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯?；?20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯酰基(20：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表6所示。

在上面所述的組合物中，一種脂質(zhì)類可以由三酰基甘油組成，其中第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)或sn-3位點(diǎn)，或其中第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)或sn-3位點(diǎn)，或其中第一位點(diǎn)可以為sn-3位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)或sn-2位點(diǎn)，其中氘標(biāo)記的棕櫚酸鹽(16：0-d9)可以位于第一位點(diǎn)，油酸酯(18：ln9)位于sn-2位點(diǎn)，位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物包括十六烷酰基(16：0)、十八烷?；?18：0)、9z-十八碳烯?；?18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯?；?18：3n3)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯?；?20：4n6)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯?；?22：6n3)。位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表5所示。

在上面所述的組合物中，脂質(zhì)類中的一種可以由膽固醇酯組成，其中單個(gè)位點(diǎn)為羥基，其中連接于羥基的脂肪酸混合物包括十六烷?；?16：0)、9z-十六碳烯?；?16：ln7)、9z-十八碳烯?；?18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯?；?18：2n6)、8z，11z，14z-二十碳三烯?；?20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯?；?20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯?；?20：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯?；?22：6n3)。位于羥基的脂肪酸混合物各比例如表7所示。

檢測和定量感興趣樣品中脂質(zhì)分子的方法

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供一種檢測和定量存在于感興趣樣品中脂質(zhì)分子的方法，此方法包括：i)加入一定量的組合物于感興趣樣品中，組合物具有一種或多種脂質(zhì)分子混合物，代表著存在于感興趣樣品內(nèi)一種或多種對應(yīng)的脂質(zhì)類的脂質(zhì)分子種類組分，組合物包括以下的一種或多種：a）脂質(zhì)主鏈具有至少有兩種不同同位素標(biāo)記脂肪酸的混合物，同位素標(biāo)記脂肪酸位于脂質(zhì)主鏈的單個(gè)位點(diǎn)，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有一個(gè)?；闹|(zhì)類；b)一種同位素標(biāo)記的脂質(zhì)主鏈具有至少兩種脂肪酸的混合物，該脂肪酸位于脂質(zhì)主鏈的單個(gè)位點(diǎn)，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有一個(gè)酰基的脂類；或者c)或者脂質(zhì)主鏈具有一種同位素標(biāo)記的脂肪酸，該同位素標(biāo)記的脂肪酸位于脂質(zhì)主鏈的第一個(gè)位點(diǎn)，并且具有至少有兩種不同脂肪酸的混合物，該脂肪酸位于脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有兩種脂肪酸的脂類，其中至少有兩種不同脂肪酸的混合物代表感興趣樣品內(nèi)相應(yīng)脂類中的脂肪酸，其中混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類別中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在；ii)使用含有一種或多種代表脂質(zhì)分子混合物的組合物作為內(nèi)標(biāo)，來檢測和定量感興趣樣品內(nèi)一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類的每種脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供一種檢測和定量存在于感興趣樣品中脂質(zhì)分子的方法，此方法包括：加入一定量的組合物于感興趣樣品中，組合物具有一種或多種脂質(zhì)分子混合物代表著感興趣樣品內(nèi)一種或多種相應(yīng)的脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類組分，其中每種脂質(zhì)分子混合物包括：i）脂質(zhì)主鏈具有一個(gè)同位素標(biāo)記的脂肪酸，同位素標(biāo)記脂肪酸位于脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有兩個(gè)?；闹悾籭i)至少含有兩種不同脂肪酸的混合物，位于脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)，其中脂肪酸混合物代表著感興趣樣品內(nèi)相應(yīng)脂類中的脂肪酸，其中混合物中每種脂肪酸代表著存在于感興趣樣品內(nèi)相應(yīng)的脂質(zhì)類的脂質(zhì)分子種類中的脂肪酸比例；使用含有一種或多種代表脂質(zhì)分子混合物的組合物作為內(nèi)標(biāo)，來檢測和定量感興趣樣品內(nèi)一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類的每種脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供一種檢測和定量存在于感興趣樣品中脂質(zhì)分子的方法，此方法包括：加入一定量的組合物于感興趣樣品中，組合物具有一種或多種脂質(zhì)分子混合物代表著存在于感興趣樣品內(nèi)一種或多種對應(yīng)的脂質(zhì)類的脂質(zhì)分子種類組分，其中每種脂質(zhì)分子混合物包括：i）脂質(zhì)主鏈具有一個(gè)或多個(gè)同位素標(biāo)記物，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有一個(gè)酰基的脂類；ii)至少含有兩種不同脂肪酸的混合物，位于脂質(zhì)主鏈的單個(gè)位點(diǎn)，其中脂肪酸混合物代表著感興趣樣品內(nèi)相應(yīng)脂類中的脂肪酸，其中混合物中每種脂肪酸代表著存在于感興趣樣品內(nèi)相應(yīng)的脂質(zhì)類的脂質(zhì)分子種類中的脂肪酸比例；使用含有一種或多種代表脂質(zhì)分子混合物的組合物作為內(nèi)標(biāo)，來檢測和定量感興趣樣品內(nèi)一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類的每種脂質(zhì)類中的脂質(zhì)分子種類。

檢測和/或定量存在感興趣樣品中脂質(zhì)分子種類的方法包括質(zhì)譜（ms）、高效液相色譜（hplc）、等度hplc、梯度洗脫hplc、正相色譜、反相hplc、尺寸排阻色譜、離子交換色譜、毛細(xì)管電泳、微流體、色譜、氣相色譜（gc）、薄層色譜(tlc)中的一種或幾種結(jié)合。檢測和/或定量存在于生物樣品的脂質(zhì)分子種類的方法包括質(zhì)譜（ms）的使用。

在檢測和/或定量存在于感興趣樣品內(nèi)脂質(zhì)分子種類的方法中，感興趣樣品可以為復(fù)雜混合物包括脂質(zhì)分子、生物樣品如植物樣品或動(dòng)物樣品。動(dòng)物樣品可來自哺乳動(dòng)物，如人、老鼠、非人類靈長類動(dòng)物、兔子或者其它哺乳動(dòng)物，或者非哺乳動(dòng)物，如斑馬魚樣品等。感興趣的生物樣品包括血液、血漿、血清、分離脂蛋白、唾液、尿液、淋巴液以及腦脊液，組織樣品，細(xì)胞樣品或皮膚樣品。

在檢測和/或定量存在于感興趣樣品內(nèi)脂質(zhì)分子種類的方法中，位于脂質(zhì)分子的一種或多種混合物中的每一種脂肪酸的一種或多種混合物可以包括表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂質(zhì)分子種類的一種或多種混合物。位于一種或多種脂質(zhì)分子中的一種或多種脂肪酸可以由表1、表2、表3、表4、表5、表6或表7中所列的脂質(zhì)分子種類的一種或多種混合物組成。

試劑盒

一般來說，本發(fā)明的試劑盒包括一種或多種內(nèi)標(biāo)物以及使用內(nèi)標(biāo)物來檢測和/或定量感興趣樣品中脂質(zhì)的說明書。試劑盒可進(jìn)一步包括一種或多種對照樣品和樣品收集容器。試劑盒內(nèi)的內(nèi)標(biāo)物組分以一種或多種脂質(zhì)類相互結(jié)合包裝在一起或包裝成單個(gè)的小瓶或容器。一個(gè)試劑盒可能包括標(biāo)簽和/或關(guān)于制備和使用指示的包裝說明書、樣本收集容器、一個(gè)運(yùn)輸容器、和/或一個(gè)運(yùn)輸?shù)泥]包。獨(dú)立包裝試劑盒的其它成分包括緩沖劑和其它試劑，用于檢測和/或定量感興趣樣品中的脂質(zhì)。

所述試劑盒包括一種或多種內(nèi)標(biāo)混合物。在一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒包含一內(nèi)標(biāo)混合物，該內(nèi)標(biāo)混合物包括同位素標(biāo)記的脂肪酸，其中感興趣樣品內(nèi)每種脂質(zhì)類至少含有一個(gè)同位素標(biāo)記脂肪酸。在一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒包含一系列內(nèi)標(biāo)混合物，該系列內(nèi)標(biāo)混合物包括表1中列出的脂質(zhì)類和同位素標(biāo)記的脂肪酸。在又一實(shí)施例中，系列內(nèi)標(biāo)物中同位素標(biāo)記脂肪酸的比例如表1所示。

所述試劑盒進(jìn)一步包括一具有體積的容器。該容器可以為能夠容納液體樣品的任一容器（如一個(gè)杯子、瓶子、微量離心管、微量滴定板等）。該容器可選擇地性地包含體積測量功能，用來測量得到樣品或其它試劑的理想體積。該容器可以由任何材料（如塑料、鋁合金、不銹鋼等）制成。該容器的內(nèi)容量跟收集的樣品類型有關(guān)。該容器可包括一杯體和一杯蓋。在一些實(shí)施例中，內(nèi)標(biāo)物材料粘附于杯蓋。在一些實(shí)施例中，內(nèi)標(biāo)物材料涂覆于容器杯體的內(nèi)表面。

在一些實(shí)施例中，會(huì)根據(jù)收集樣品的類型格外配置該容器，并用于樣品的收集。另一方面，樣品收集容器單獨(dú)位于試劑盒中，可以為杯子、瓶子、微量離心管。

所述試劑盒可以選擇性地包含一運(yùn)輸容器。該運(yùn)輸容器可以為任何適用于樣品運(yùn)輸?shù)慕Y(jié)構(gòu)。該容器被配置為使得樣品材料可以塞進(jìn)容器中，容器可以是密封的。

所述試劑盒可任選地包括一種萃取溶液。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供的試劑盒包括：i)一種或多種脂質(zhì)分子混合物作為內(nèi)標(biāo)物，其中一種或多種脂質(zhì)分子混合物中的每種代表著感興趣樣品內(nèi)一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類的脂質(zhì)分子種類的組成，每種脂質(zhì)分子混合物包括一種或多種：脂質(zhì)主鏈具有至少有兩種同位素標(biāo)記的脂肪酸的混合物，該同位素標(biāo)記的脂肪酸位于脂質(zhì)主鏈的單個(gè)位點(diǎn)，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有一個(gè)?；闹悾灰环N同位素標(biāo)記的脂質(zhì)主鏈具有至少兩種脂肪酸的混合物，該脂肪酸位于脂質(zhì)主鏈的單個(gè)位點(diǎn)，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有一個(gè)酰基的脂類；或者脂質(zhì)主鏈具有一種同位素標(biāo)記的脂肪酸，該同位素標(biāo)記的脂肪酸位于脂質(zhì)主鏈的第一個(gè)位點(diǎn)，并且具有至少有兩種不同脂肪酸的混合物，該脂肪酸位于脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有兩個(gè)?；闹悾渲兄辽儆袃煞N不同脂肪酸的混合物代表感興趣樣品內(nèi)相應(yīng)脂類中的脂肪酸，其中混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類別中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在；ii)一種或多種脂質(zhì)分子混合物作為內(nèi)標(biāo)物來檢測和定量感興趣樣品內(nèi)脂質(zhì)類的脂質(zhì)分子種類的使用說明。該脂質(zhì)類包括三?；视?、二酰基甘油、1-單酰甘油、磷脂、磷脂酰膽堿、o-磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、膽固醇酯、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰絲氨、溶血酸磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血cdp-二酰基甘油、cdp-二?；视?、鞘磷脂、心磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、神經(jīng)酰胺、乳糖基神經(jīng)酰胺、葡糖基神經(jīng)酰胺、植物神經(jīng)酰胺、6-羥基神經(jīng)酰胺、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、蠟酯、蠟二酯中一種或多種。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供的試劑盒包括：i)一種或多種脂質(zhì)分子混合物作為內(nèi)標(biāo)物，其中一種或多種脂質(zhì)分子混合物中的每種代表著感興趣樣品內(nèi)一種或多種相應(yīng)脂質(zhì)類的脂質(zhì)分子種類的組成，每種脂質(zhì)分子混合物包括：脂肪骨架具有一同位素標(biāo)記脂肪酸位于脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)，和至少有兩種不同脂肪酸的混合物位于脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有兩個(gè)?；闹悾蛘咭恢|(zhì)主鏈具有一種或多種同位素標(biāo)記物，和至少有兩種不同脂肪酸的混合物位于脂質(zhì)主鏈的單個(gè)位點(diǎn)，其中脂質(zhì)主鏈用于至少具有一個(gè)酰基的脂類，其中脂肪酸混合物代表著感興趣樣品內(nèi)相應(yīng)脂類中的脂肪酸，其中混合物中的每種脂肪酸以代表存在于感興趣樣品中的相應(yīng)脂質(zhì)類別中的脂質(zhì)分子種類中脂肪酸的存在比例的比例存在。具有至少兩種酰基的脂質(zhì)類包括三?；视?、二?；视汀⒘字?、磷脂酰膽堿、o-磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、p-磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、心磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、cdp-二?；视汀⑸窠?jīng)酰胺、乳糖基神經(jīng)酰胺、葡糖基神經(jīng)酰胺、植物神經(jīng)酰胺、6-羥基神經(jīng)酰胺、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、蠟二酯中一種或多種。

所述試劑盒包括兩種或多種脂質(zhì)分子混合物代表著感興趣樣品內(nèi)兩種或多種脂質(zhì)分子混合物的脂質(zhì)分子種類的組成。兩種或多種脂質(zhì)分子混合物可以包裝成一個(gè)組份。兩種或多種脂質(zhì)分子混合物可以分別包裝成單獨(dú)組分。

所述試劑盒可以進(jìn)一步包括用于檢測和定量的試劑。

所述試劑盒可以進(jìn)一步包括一對照樣品，該對照樣品具有已知濃度的脂質(zhì)分子種類組分。

所述試劑盒可以進(jìn)一步包括游離脂肪酸混合物作為內(nèi)標(biāo)物，代表著感興趣樣品內(nèi)游離脂肪酸成分。用于試劑盒的游離脂肪酸可包括如表8所示的游離脂肪酸。

所述試劑盒中，感興趣樣品可以為復(fù)雜混合物包括脂質(zhì)分子、生物樣品如植物樣品或動(dòng)物樣品。動(dòng)物樣品可來自哺乳動(dòng)物，如人、老鼠、非人類靈長類動(dòng)物、兔子或者其它哺乳動(dòng)物，或者非哺乳動(dòng)物，如斑馬魚樣品等。感興趣的生物樣品包括血液、血漿、血清、分離脂蛋白、唾液、尿液、淋巴液以及腦脊液，組織樣品，細(xì)胞樣品或皮膚樣品。

所述試劑盒中，脂肪酸可以為飽和脂肪酸。

所述試劑盒中，同位素標(biāo)記物包括²h、¹³c或¹⁵n。

所述試劑盒中，位于一種或多種脂質(zhì)分子混合物的每種脂質(zhì)分子中的脂肪酸混合物可以包括如表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7或表8所示的脂質(zhì)分子種類混合物的一種或多種。所述試劑盒中，位于一種或多種脂質(zhì)分子混合物的每種脂質(zhì)分子中的脂肪酸混合物可以由如表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7或表8所示的脂質(zhì)分子種類混合物的一種或多種組成。

所述試劑盒中，脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)。脂質(zhì)主鏈的第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，脂質(zhì)主鏈的不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)或sn-3位點(diǎn)。

所述試劑盒中，脂質(zhì)類的一種由磷脂酰膽堿或o-磷脂酰膽堿組成，其中第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，或者其中第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，其中氘標(biāo)記的十六烷?；?d9(16：0-d9)可以位于第一位點(diǎn)，其中位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物包括9z-十六碳烯?；?16：ln7)、9z-十八碳烯?；?18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯?；?18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯?；?l8：3n3)、8z，11z，14z-二十碳三烯?；?20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯?；?20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z-二十碳五烯?；?20：5n3)、7z，10z，13z，16z-二十二碳四烯酰基(22：4n6)、7z，10z，13z，16z，19z-二十二碳五烯?；?22：5n3)、4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯酰基(22：6n3)。位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表2所示。

所述試劑盒中，脂質(zhì)類的一種由磷脂酰乙醇胺和磷脂酰乙醇胺組成，其中第一位點(diǎn)為sn-1位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，或其中第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，其中氘標(biāo)記的十八烷?；?d9(18：0-d9)可以位于第一位點(diǎn)，其中位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物包括9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯酰基(18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯基酰(18：3n3)、8z，11z，14z二十碳三烯?；?20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯?；?20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯?；?20：5n3)、7z，10z，13z，16z，19z-二十二碳五烯?；?22：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯?；?22：6n3)。位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表3所示。

所述試劑盒中，脂質(zhì)類的一種由鞘磷脂組成，其中氘標(biāo)記的鞘氨醇位于第一位點(diǎn)，其中脂肪酸混合物位于不同位點(diǎn)包括十六烷酰基(16：0)、9z-十八碳烯?；?18：ln9)、二十四烷?；?24：0)、15z-二十四碳烯?；?24：ln9)。位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表4所示。

所述試劑盒中，脂質(zhì)類的一種由甘油二酯組成，其中第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，或其中第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，其中氘標(biāo)記的棕櫚酸鹽(16：0-d9)可以位于第一位點(diǎn)，其中位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物包括十六烷酰基(16：0)、十八烷酰基(18：0)、9z-十八碳烯酰基(18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯?；?18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯?；?18：3n3)、8z，11z，14z-二十碳三烯?；?20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯?；?20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯?；?20：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯?；?22：6n3)。位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表6所示。

所述試劑盒中，脂質(zhì)類的一種可以由三?；视徒M成，其中第一位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)或sn-3位點(diǎn)，或其中第一位點(diǎn)可以為sn-2位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)或sn-3位點(diǎn)，或其中第一位點(diǎn)可以為sn-3位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可以為sn-1位點(diǎn)或sn-2位點(diǎn)，其中氘標(biāo)記的棕櫚酸鹽(16：0-d9)可以位于第一位點(diǎn)，油酸酯（(18：ln9)）位于其中一個(gè)不同的位點(diǎn)，位于另外一個(gè)不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物包括十六烷?；?16：0)、十八烷?；?18：0)、9z-十八碳烯?；?18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯?；?18：2n6)、9z，12z，15z-十八碳三烯?；?18：3n3)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯?；?20：4n6)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯?；?22：6n3)。位于不同位點(diǎn)的脂肪酸混合物各比例如表5所示。

所述試劑盒中，脂質(zhì)類的一種可以包括膽固醇酯、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰絲氨、溶血酸磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血cdp-二酰基甘油、蠟酯或1-單酰甘油。

所述試劑盒中，脂質(zhì)類的一種可以由膽固醇酯組成，其中單個(gè)位點(diǎn)為羥基，其中連接于羥基的脂肪酸混合物包括十六烷?；?16：0)、9z-十六碳烯酰基(16：ln7)、9z-十八碳烯?；?18：ln9)、9z，12z-十八碳二烯?；?18：2n6)、8z，11z，14z-二十碳三烯?；?20：3n6)、5z，8z，11z，14z-二十碳四烯?；?20：4n6)、5z，8z，11z，14z，17z二十碳五烯?；?20：5n3)和4z，7z，10z，13z，16z，19z二十二碳六烯?；?22：6n3)。位于羥基的脂肪酸混合物各比例如表7所示。

測量脂質(zhì)分子的方法

脂質(zhì)代謝物或脂質(zhì)分子含量測定適用于任何樣品類型，如體液樣品（例如，血液，血漿，尿液，腦脊髓液（csp）、組織樣品、細(xì)胞樣品、皮膚樣品、溶液、復(fù)雜混合物、體外培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)。在一些實(shí)施例中，脂質(zhì)分子含量的測定樣品選自包含脂質(zhì)、血液、血漿、血清、分離脂蛋白、唾液、尿液、淋巴液以及腦脊液等復(fù)雜混合物。在一些實(shí)施例中，脂質(zhì)分子含量的測定樣品選自全血、血漿、血清或分離脂蛋白。在一些實(shí)施例中，樣品是血漿或血清。

在一些實(shí)施方案中，多個(gè)不同的脂質(zhì)分子在同一樣品中進(jìn)行測量。在其他實(shí)施方案中，多個(gè)不同的脂質(zhì)分子的每種于不同樣品中進(jìn)行測量。如果使用到多種樣品，這些樣品可以來自受試者相同或不同體液。

脂質(zhì)分子和其它生物標(biāo)志物可以容易地通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行分離和/或定量，這些方法包括但不限于：質(zhì)譜（ms）、高效液相色譜（hplc）、等度hplc、梯度洗脫hplc、正相色譜、反相hplc、尺寸排阻色譜、離子交換色譜、毛細(xì)管電泳、微流體、色譜、氣相色譜（gc）、薄層色譜（(tlc)）、固定金屬離子親和層析（imac）、親和層析、免疫分析和/或比色測定。在一些實(shí)施例中，使用ms來確定脂質(zhì)分子含量。

脂肪酸甲基酯（fame）分析，脂質(zhì)通過使用folch等(生物化學(xué)226：497-509)公開的氯仿：甲醇（2：1v/v）的方法提取獲得。中性脂質(zhì)通過固相色譜法從極性脂質(zhì)中分離。極性脂質(zhì)通過安捷倫公司的1100lc分離成單個(gè)脂質(zhì)類，單個(gè)脂質(zhì)類收集用于脂肪酸分析。中性脂質(zhì)通過薄層色譜法使用包括：石油醚/乙醚/乙酸（80：20：1）的有機(jī)系統(tǒng)分離成單個(gè)脂質(zhì)類，然后脂質(zhì)類收集用于脂肪酸分析。每個(gè)脂質(zhì)類在1%硫酸的甲醇溶液中進(jìn)行酯交換，于密閉小瓶內(nèi)氮保護(hù)氣氛下在100°c反應(yīng)45min。所得脂肪酸甲基酯從混合物中用含有0.05％丁基化羥基甲苯的己烷溶液萃取，在氮?dú)庀旅芊饧和樘崛∥镉糜趃c分析制備。脂肪酸甲基酯通過裝配有30m的db88毛細(xì)管壁（安捷倫公司）以及火焰離子化檢測器的毛細(xì)管gc(安捷倫6890gc）進(jìn)行分離和定量。

對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的各種分析方法，進(jìn)一步在下面文件中描述，并給出這些方法的全部引用出處：質(zhì)譜：cyrd，等.gcims驗(yàn)證的羊水和血漿中琥珀酰丙酮的納摩爾范圍測定方法：i型酪氨酸血癥的分析工具.生物醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)中的色譜b分析技術(shù)學(xué)報(bào).2006年2月17;832(1)：24-9;vogeserm.摘要液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法-在臨床實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用.臨床化學(xué)，2003年二月;41(2)：117-26.高效液相色譜：khalilpn等.驗(yàn)證和應(yīng)用高效液相色譜法測定紅細(xì)胞中5'單磷酸脫氫酶肌苷的活性.生物醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)中的色譜b分析技術(shù)學(xué)報(bào).2006年5月23日;fouassierm等；通過hplc和elisa測定血清素從血小板中的釋放在肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥的診斷中：與通過（c）-血清素釋放測定的參考方法比較;血栓形成和血管造影，2006年5月;4(5)：1136-9;badious等，通過熒光衍生化和反相液相色譜分離測定血漿氨基酸.臨實(shí)驗(yàn)室床，2004;50(3-4)：153-8;brunellit等，總同型半胱氨酸血漿測定的三種方法的比較.臨實(shí)驗(yàn)室床，2001;47(7-8)：393-7.毛細(xì)管電泳：zinellua等，通過毛細(xì)管電泳同時(shí)測定血漿和尿液中的胍基乙酸，肌酸酐和肌酸的測定uv-檢測.分離科學(xué)雜志，2006年三月;29(5)：704-8;jabeenr等，毛細(xì)管電泳和臨床實(shí)驗(yàn)室.電泳，2006年5月23日;gaop等，通過單克隆抗體包被的乳膠和毛細(xì)管電泳的組合快速檢測金黃色葡萄球菌，電泳2006年5月;27(9)：1784-9.微流體：johannessenea等，一種用于超低體積生物分析的懸浮膜納米光度計(jì).ieee納米生物學(xué)學(xué)報(bào).2002三月;l(l)：29-36;herrmannm，等.酶聯(lián)產(chǎn)生的熒光檢測微通道與內(nèi)部磁混合的平行微流體elisa的發(fā)展.芯片實(shí)驗(yàn)室.2006四月;6(4)：555-60.電子版2006三月3;yangs，等.使用流速控制的微流體通道中的血漿分離.美國人工內(nèi)臟器官協(xié)會(huì)雜志.2005九月-十月;51(5)：585-90;dupuyam，等.蛋白生物芯片系統(tǒng)臨床實(shí)驗(yàn)室.臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué).2005;43(12)：1291-302.色譜：patersons，等.確定用于檢測非法海洛因用于治療阿片類藥物依賴的藥物海洛因的技術(shù).成癮.2005十二月;100(12)：1832-9;bottcherm，等.使用來自替代治療患者的尿樣，對丁丙諾啡cedia測定與gc-ms和elisa的評價(jià).分析毒理學(xué)雜志.2005十一月-十二月;29(8)：769-76;julakj.血培養(yǎng)，滲出物和支氣管肺泡灌洗液的細(xì)菌學(xué)診斷中的色譜分析.布拉格醫(yī)學(xué)報(bào)告.2005;106(2)：175-94;boettcherm，等.利用abuscreen在線測定法在日立917上進(jìn)行的對尿液中濫用藥物的篩查與其他免疫化學(xué)測試和gc/ms的精度和可比性。臨床實(shí)驗(yàn)室.2000;46(l-2)：49-52.免疫分析：boettcherm，等.利用abuscreen在線測定法在日立917上進(jìn)行的對尿液中濫用藥物的篩查與其他免疫化學(xué)測試和gc/ms的精度和可比性.臨床實(shí)驗(yàn)室.2000;46(l-2)：49-52;westermannj，等.與hplc方法相比，通過非競爭性酶免疫簡單，快速和靈敏地測定尿液和血漿中的腎上腺素和去甲腎上腺素.臨床實(shí)驗(yàn)室.2002;48(1-2)：61-71;aoyagik，等.在丙型肝炎感染的早期階段對丙型肝炎病毒核心抗原的常規(guī)酶免疫測定的執(zhí)行.臨床實(shí)驗(yàn)室.2001;47(3-4)：119-27;hubiw，等.不同ca15-3免疫測定的多中心質(zhì)量控制研究.臨床實(shí)驗(yàn)室.2005;51(11-12)：641-5;hallerca，等.在臨床實(shí)驗(yàn)室中對尿液羥考酮測試的自動(dòng)化和即時(shí)免疫測定與gc-ms的比較.分析毒理學(xué)雜志.2006三月;30(2)：106-11;bayerm，等.用于測定新蝶呤的新的酶聯(lián)免疫吸附測定的評價(jià).臨床實(shí)驗(yàn)室.2005;51(9-10)：495-504;groched，等.根據(jù)新的ifcc參考方法標(biāo)準(zhǔn)化兩種免疫h(yuǎn)ba1c常規(guī)測定.臨床實(shí)驗(yàn)室.2003;49(11-12)：657-61;;ivano，等，德國研究所，近期建立的血清胰島素樣生長因子i的參考值的適用性：兩種測定的比較-（自動(dòng)）化學(xué)發(fā)光免疫測定和酶聯(lián)免疫吸附測定，臨床實(shí)驗(yàn)室，2005;51(7-8)：381-7。色度分析：kramerka，等，在培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞中線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性的自動(dòng)分光光度分析，臨床化學(xué)，2005年11月;51(11)：2110-6；groched，等，根據(jù)新的ifcc參考方法標(biāo)準(zhǔn)化兩種免疫h(yuǎn)ba1c常規(guī)測定，.臨床實(shí)驗(yàn)室，2003;49(11-12)：657-61；wolfpl，診斷酶學(xué)的歷史：重大調(diào)查的回顧，，臨床化學(xué)，2006年3月24日。

真實(shí)質(zhì)量分析平臺(tái)也可用于本發(fā)明的檢測方法中，真實(shí)質(zhì)量是一種分析平臺(tái)可以從含有大概400個(gè)代謝物包括結(jié)構(gòu)和能量脂質(zhì)代謝物如甘油三酯、膽固醇酯和磷脂代謝物的樣品中獲得定量數(shù)據(jù)。這個(gè)平臺(tái)可用來分析疾病，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)和能量脂質(zhì)作為新陳代謝的中央組件，幾乎與個(gè)體的每個(gè)生物過程融為一體。來自如血漿、血清或其它生物樣品的一組數(shù)據(jù)，包括游離膽固醇以及下述脂肪酸的定量測量，這些脂肪酸為磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿、甘油三酯、甘油二酯、游離脂肪酸和膽固醇酯：14：0、15：0、16：0、18：0、20：0、22：0、24：0、14：ln5、16：ln7、t16：ln7、18：ln9、t18：ln9、18：ln7、18：2n6、t18：2n6、18：3n6、18：3n3、18：4n3、20：ln9、20：2n6、20：3n9、20：3n6、20：4n6、20：3n3、20：4n3、20：5n3、22：1n9、22：2n6、22：4n6、22：5n3、22：6n3、24：1n9、24：6n3以及16：0、18：0、18：ln9和18：1n7的縮醛磷脂衍生物。使用真值的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知常識(shí)，也在下面文件中描述，并給出這些方法的全部引用出處：美國專利申請?zhí)枺?1/296，829（申請時(shí)間2005/12/06）;mutchdm等，整合代謝方法將硬脂酰輔酶a去飽和酶鑒定為富含花生四烯酸酯的飲食的靶標(biāo)，美國實(shí)驗(yàn)生物學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)雜志，2005年4月；19(6)：599-601.電子版2005年1月24日;stonesj等，dgat2缺陷小鼠中的脂蛋白和皮膚屏障異常.生物化學(xué)雜志，2004年3月19日;279(12)：11767-76;watkinssm等，磷脂酰乙醇胺-n-甲基轉(zhuǎn)移酶活性和膳食膽堿調(diào)節(jié)小鼠肝臟血漿脂質(zhì)通量和必需脂肪酸代謝，營養(yǎng)學(xué)雜志，2003年11月;133(11)：3386-91;watkinssm等，pparγ激動(dòng)劑羅格列酮的脂質(zhì)代謝組效應(yīng).脂質(zhì)研究雜志，2002年11月;43(11)：1809-17。

以下實(shí)施例為進(jìn)一步提供說明，不用于限制目的。

實(shí)施例

實(shí)施例1內(nèi)標(biāo)混合物的合成組分

與傳統(tǒng)的對于范圍較寬的脂質(zhì)（例如磷脂）通常使用一種內(nèi)標(biāo)物的脂類組學(xué)戰(zhàn)略相比，在此提供包括脂肪酸混合物（每種脂質(zhì)類最高有10個(gè)脂肪酸）內(nèi)標(biāo)物的合成方法。本方法中，內(nèi)標(biāo)混合物（is混合物）中的脂肪酸選擇可以代表分析樣品中脂質(zhì)類的化學(xué)結(jié)構(gòu)（脂質(zhì)分子種類）多樣性。表1為根據(jù)本發(fā)明方法測量的對應(yīng)于每種脂質(zhì)類各脂肪酸的濃度值，每種脂質(zhì)類剩余的脂肪酸歸屬于最接近的內(nèi)標(biāo)物類似物，并賦予測量值；每種脂質(zhì)類的總濃度通過該脂質(zhì)類所有分子種類值（測量和賦值的）相加而得。

這10種脂質(zhì)類的每種內(nèi)標(biāo)物根據(jù)表1的脂肪酸組分合成。內(nèi)標(biāo)物的脂質(zhì)類如表1第一行所示，脂肪酸“r”列于表1第一列。表1中，“d”代表加入有氘標(biāo)記。例如，16：0-d9表示含有9個(gè)氘原子的棕櫚酸鹽。

實(shí)施例2內(nèi)標(biāo)物及其混合物的合成和描述

磷脂酰膽堿、o-磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和p-磷脂酰乙醇胺的典例磷脂內(nèi)標(biāo)物，合成開始于磷酸甘油頭部基團(tuán)，酰化氘標(biāo)記棕櫚酸鹽（16：0）于sn-1位點(diǎn)；然后?；伙柡椭舅峄旌衔镉趕n-2位點(diǎn)。磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺的標(biāo)記特征如表1所示。

對于磷脂酰膽堿和o-磷脂酰膽堿典例內(nèi)標(biāo)物，位于sn-2位點(diǎn)的脂肪酸（sn-2脂肪酸）的組分如表2所示。磷脂酰膽堿和sn-2脂肪酸組成的混合物結(jié)構(gòu)如圖2所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記棕櫚酸鹽（16：0）以及位于sn-2位點(diǎn)的的“r”脂肪酸的磷脂酰膽堿結(jié)構(gòu)如圖2a所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記棕櫚酸鹽（16：0）以及位于sn-2位點(diǎn)的作為典例脂肪酸的油酸酯（18：ln9）的磷脂酰膽堿結(jié)構(gòu)如圖2a所示。脂肪酸混合物中?；亮字Ｄ憠Asn-2位點(diǎn)的十種脂肪酸（16：ln7、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6、20：5n3、22：4n6、22：5n3和22：6n3）結(jié)構(gòu)如圖2c所示。

典例溶血磷脂酰膽堿內(nèi)標(biāo)物的合成開始于磷脂頭部基團(tuán)，然后酰化氘標(biāo)記棕櫚酸鹽（16：0）。結(jié)構(gòu)如圖3所示。

對于磷脂酰乙醇胺和p-磷脂酰乙醇胺內(nèi)標(biāo)物，其sn-2位點(diǎn)脂肪酸的組分如表3所示。磷脂酰乙醇胺和sn-2位點(diǎn)脂肪酸組成的混合物結(jié)構(gòu)如圖4所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記硬脂酸（18：0）以及位于sn-2位點(diǎn)的以“r”脂肪酸指示的磷脂酰乙醇胺結(jié)構(gòu)如圖4a所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記硬脂酸（18：0）以及位于sn-2位點(diǎn)作為典例脂肪酸的油酸酯（18：ln9）的磷脂酰乙醇胺結(jié)構(gòu)如圖4b所示。脂肪酸混合物中?；亮字Ｒ掖及穝n-2位點(diǎn)的八種脂肪酸（18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6、20：5n3、22：5n3和22：6n3）結(jié)構(gòu)如圖4c所示。

溶血磷脂酰乙醇胺內(nèi)標(biāo)物的合成開始于磷脂頭部基團(tuán)，然后酰化氘標(biāo)記硬脂酸（18：0）。結(jié)構(gòu)如圖5所示。

鞘磷脂內(nèi)標(biāo)物的合成開始于磷酸膽堿頭部基團(tuán)，然后將氘標(biāo)記鞘氨醇酰化于sn-1位點(diǎn)，?；舅峄旌衔镉趕n-2位點(diǎn)。位于sn-2位點(diǎn)的脂肪酸?；旌衔锇?，例如，16：0，18：ln9，24：0和24：ln9。

對于典例內(nèi)標(biāo)物鞘磷脂，其脂肪酸組分如表4所示。鞘磷脂和sn-2位點(diǎn)脂肪酸組成的混合物結(jié)構(gòu)如圖6所示。含有位于第一位點(diǎn)的氘標(biāo)記鞘氨醇以及位于sn-2位點(diǎn)的以“r”脂肪酸指示的鞘磷脂結(jié)構(gòu)如圖6a所示。含有位于第一位點(diǎn)的氘標(biāo)記鞘氨醇以及位于sn-2位點(diǎn)作為典例脂肪酸的棕櫚酸鹽（16：0）的鞘磷脂結(jié)構(gòu)如圖6b所示。脂肪酸混合物中連接在鞘磷脂sn-2位點(diǎn)的四種脂肪酸（16：0、18：ln9、24：0和24：ln9）結(jié)構(gòu)如圖6c所示。

三酰基甘油內(nèi)標(biāo)物的合成，開始于甘油二酯骨架，酰化氘標(biāo)記棕櫚酸鹽(16：0)于sn-1位點(diǎn)，酰化油酸酯（18：ln9）位于sn-2位點(diǎn)，?；舅峄旌衔镉趕n-3位點(diǎn)。位于sn-3位點(diǎn)的?；舅峄旌衔锟梢园?，例如，16：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6和22：6n3。

對于典例內(nèi)標(biāo)物三?；视?，其sn-3位點(diǎn)脂肪酸的組分如表5所示。三?；视秃蛃n-3位點(diǎn)脂肪酸組成的混合物結(jié)構(gòu)如圖7所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記棕櫚酸鹽（16：0）、位于sn-2位點(diǎn)的油酸酯（18：ln9）以及位于sn-3位點(diǎn)的“r”脂肪酸的三?；视徒Y(jié)構(gòu)如圖7a所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記棕櫚酸鹽（16：0）、位于sn-2位點(diǎn)的油酸酯（18：ln9）以及位于sn-3位點(diǎn)作為典例脂肪酸的棕櫚酸鹽（16：0）的三酰基甘油結(jié)構(gòu)如圖7b所示。脂肪酸混合物中連接在三酰基甘油sn-3位點(diǎn)的八種脂肪酸（16：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：3n6、20：4n6和22：6n3）結(jié)構(gòu)如圖7c所示。

典例內(nèi)標(biāo)物二?；视偷暮铣桑_始于甘油骨架，?；畼?biāo)記棕櫚酸鹽(16：0)于sn-1位點(diǎn)，?；舅峄旌衔镉趕n-2位點(diǎn)。位于sn-2位點(diǎn)的?；舅峄旌衔锟梢园?，例如16：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：4n6、20：5n3和22：6n3。

例如，對于二?；视?，其sn-2位點(diǎn)脂肪酸的組分如表6所示。二?；视秃蛃n-2位點(diǎn)脂肪酸組成的混合物結(jié)構(gòu)如圖8所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記棕櫚酸鹽（16：0）以及位于sn-2位點(diǎn)的的“r”脂肪酸的二酰基甘油結(jié)構(gòu)如圖8a所示。含有位于sn-1位點(diǎn)的氘標(biāo)記棕櫚酸鹽（16：0）以及位于sn-2位點(diǎn)作為典例脂肪酸的棕櫚酸鹽（16：0）的二?；视徒Y(jié)構(gòu)如圖8b所示。脂肪酸混合物中連接在二?；视蛃n-2位點(diǎn)的八種脂肪酸（16：0、18：0、18：ln9、18：2n6、18：3n3、20：4n6、20：5n3和22：6n3）結(jié)構(gòu)如圖8c所示。

典例內(nèi)標(biāo)物膽固醇酯的合成，開始于膽固醇骨架，在骨架n6位點(diǎn)上加入氘標(biāo)記物，?；舅峄旌衔镉诹u基基團(tuán)。?；亮u基的酰化脂肪酸混合物可以包括，例如，16：0、16：ln7、18：ln9、18：2n6、20：3n6、20：4n6、20：5n3和22：6n3。

例如，對于膽固醇酯，其脂肪酸組分如表7所示。膽固醇酯和脂肪酸組成的混合物結(jié)構(gòu)如圖9所示。含有位于n6位點(diǎn)的氘標(biāo)記物以及?；亮u基的“r”脂肪酸指示的膽固醇酯結(jié)構(gòu)如圖9a所示。含有位于n6位點(diǎn)的氘標(biāo)記物以及?；亮u基的作為典例脂肪酸的亞油酸酯（18：2n6）的膽固醇酯結(jié)構(gòu)如圖9b所示。脂肪酸混合物中用來?；聊懝檀减チu基的八種脂肪酸（16：0、16：ln7、18：ln9、18：2n6、20：3n6、20：4n6、20：5n3和22：6n3）結(jié)構(gòu)如圖9c所示。

游離脂肪酸內(nèi)標(biāo)物由50：50混合物合成，包含50%氘標(biāo)記脂肪酸和50%單奇數(shù)鏈脂肪酸。氘標(biāo)記脂肪酸可以為，例如棕櫚酸鹽（16：0），單奇數(shù)鏈脂肪酸，例如17：ln7。

例如，對于游離脂肪酸，其脂肪酸組分如表8所示。游離脂肪酸組成的混合物結(jié)構(gòu)如圖10所示。含有氘標(biāo)記的游離脂肪酸棕櫚酸鹽（16：0）結(jié)構(gòu)如圖10a所示。游離脂肪酸17：ln7的結(jié)構(gòu)如圖10b所示。

實(shí)施例3脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)混合物的驗(yàn)證和性能評估

脂質(zhì)使用甲醇：二氯甲烷從樣品中萃取，含有內(nèi)標(biāo)物的二氯甲烷：甲醇（50：50）溶液加入到萃取溶液中，隨后進(jìn)行一系列的離心和底層再離心步驟。整合的底層通過氮?dú)鉂饪s，然后溶解于0.25ml的10mm醋酸銨二氯甲烷：甲醇（50：50）溶液中。萃取物轉(zhuǎn)移到小瓶中使用infusion-ms進(jìn)行分析，infusion-ms分析在具有納米聚醚醚酮管的島津lc結(jié)合sciex公司的selexlon和5500qtrap上進(jìn)行。樣品通過正離子和負(fù)離子模式電噴霧進(jìn)行分析。5500qtrap掃描在mrm模式下執(zhí)行，總共有+1100mrm，包括內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。

組合成了一種典例內(nèi)標(biāo)混合物，該內(nèi)標(biāo)混合物包括表9中的成分，將合成的內(nèi)標(biāo)混合物進(jìn)行評價(jià)，以檢測混合物的濃度和純度。標(biāo)記和未標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)混合物濃度為10.3mgs/ml?；旌衔镏袃?nèi)標(biāo)物的實(shí)際濃度使用nmr分析和定量脂肪酸分析確定；這兩個(gè)分析的結(jié)果相差2%。表9的第2欄為混合物中每種內(nèi)標(biāo)物成分的目標(biāo)濃度，表9的第3欄和第4欄為每種成分的實(shí)際濃度。第3欄為標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)物的濃度，第4欄為未標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)物的濃度。樣品的完整脂肪酸分析確定內(nèi)標(biāo)物混合物純度＞99%。

表9一種典例內(nèi)標(biāo)混合物的組分

對標(biāo)記和未標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)混合物的性能進(jìn)行評估，以確定標(biāo)記物的存在是否會(huì)引起色譜保留時(shí)間的轉(zhuǎn)變。與未標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物對比，標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物基本上不會(huì)引起保留時(shí)間的轉(zhuǎn)變。

對標(biāo)記和未標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)混合物的定量性能進(jìn)行評估，在未標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)物溶液和血清中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。脂質(zhì)分別從未標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物樣品和血清樣品中萃取，每種都在有標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物和pcl7：0/17：0（一種傳統(tǒng)的脂質(zhì)組學(xué)內(nèi)標(biāo)物）中萃取。樣品提取五次以產(chǎn)生10種樣品（5種血清和5種未標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)混合物）。從樣品中提取的脂質(zhì)使用描述的方法進(jìn)行分析。每種磷脂酰膽堿種類的濃度計(jì)算為納摩爾每毫升材料。濃度使用內(nèi)標(biāo)混合物和傳統(tǒng)的內(nèi)標(biāo)物pcl7：0/17：0計(jì)算。在血清中，精確度通過計(jì)算分析cv得到，傳統(tǒng)pcl7：0/17：0內(nèi)標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物混合物得到的精確值分別為20%和11%。在未標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)混合物樣品中，精確度通過計(jì)算分析cv（變異系數(shù)）得到，傳統(tǒng)pcl7：0/17：0內(nèi)標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物混合物得到的精確值分別為11%和3%。

使用is混合物和傳統(tǒng)is計(jì)算脂肪酸組份摩爾%含量，并且與樣品中脂肪酸實(shí)際濃度進(jìn)行對比。使用is混合物獲得的計(jì)算值比使用傳統(tǒng)is更接近實(shí)際值。結(jié)果如圖11所示。

實(shí)施例4內(nèi)標(biāo)混合物在人體樣品中的評估

評估內(nèi)標(biāo)混合物的定量性能，15份人體血清樣品中的脂質(zhì)分子種類，使用表1中的內(nèi)標(biāo)混合物進(jìn)行測量，測量三次。在有標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)混合物存在下從血清樣品中提取脂質(zhì)，脂質(zhì)提取物使用所述方法進(jìn)行分析。使用內(nèi)標(biāo)混合物來計(jì)算1100種中每種脂質(zhì)分子種類的平均濃度，精確度通過計(jì)算分析cv得到。15種樣品測量三次得到所有1100種測量脂質(zhì)分子種類的平均濃度和cv值。散點(diǎn)圖示出了%cv與脂質(zhì)分子種類濃度關(guān)系，具體見圖12。在高濃度下，脂質(zhì)分子種類的cv值較低，然而一定的分子種類在低濃度下(如0.001um)cv可低至10%。

所有血清樣品中的ce脂質(zhì)類平均濃度為3676.72，平均cv為1.22%。這些結(jié)果呈現(xiàn)在圖13的箱線圖中。信號為血清樣品中ce脂質(zhì)類濃度與空白樣的比值，其值為1729.02。tag脂質(zhì)類的平均濃度為4105.8，平均cv為2.79%。這些結(jié)果呈現(xiàn)在圖14的箱線圖中。tag脂質(zhì)類的信號值為1348.33。

在另一個(gè)例子中，以25份人體血漿作為樣品，對內(nèi)標(biāo)混合物的性能與傳統(tǒng)內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行比較。使用本文描述的方法，內(nèi)標(biāo)物的組分見表1，計(jì)算了三種典例脂質(zhì)類(ce、pc和pe)的脂肪酸組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與使用傳統(tǒng)每種脂質(zhì)類使用單個(gè)內(nèi)標(biāo)的計(jì)算方法相比較，并且比較了定量數(shù)值。

對于每種脂質(zhì)類使用單個(gè)內(nèi)標(biāo)的定量方法（傳統(tǒng)方法），膽固醇酯使用dce(16：0)內(nèi)標(biāo)物，磷脂酰膽堿使用dpc(16：0/18：1)內(nèi)標(biāo)物，磷脂酰乙醇胺使用dpe(18：0/18：1)內(nèi)標(biāo)物。對于單個(gè)內(nèi)標(biāo)物定量，ce、pc或者pe脂質(zhì)類中的脂肪酸分別歸屬到單個(gè)的ce、pc或者pe內(nèi)標(biāo)物。

對于使用典例混合物作為內(nèi)標(biāo)物來定量，使用了每種脂質(zhì)類的完整內(nèi)標(biāo)物（表1）。在所有情況下，被定量的脂質(zhì)分子種類歸屬于在脂肪酸組分中具有相同雙鍵數(shù)量的內(nèi)標(biāo)混合物。例如，分子種類pc(16：0/22：5)、pc(18：0/22：5)和pc(14：0/22：5)都?xì)w屬于內(nèi)標(biāo)物dpc(16：0/22：5)。

膽固醇酯（celc）、磷脂酰膽堿（pclc）和磷脂酰乙醇胺（pelc）脂質(zhì)類的總濃度，以25份人體血漿為樣品，用每種脂質(zhì)類使用單個(gè)內(nèi)標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物混合物（多種is）進(jìn)行計(jì)算（圖15）。gc-fid（真實(shí)質(zhì)量，在別處描述）定量分析。偏差計(jì)算方式為：

((計(jì)算值-真實(shí)質(zhì)量值)/真實(shí)質(zhì)量值)*100

計(jì)算得到單個(gè)內(nèi)標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物混合物的偏差。結(jié)果如表10所示。

表10三種典例脂質(zhì)類總濃度的計(jì)算偏差

接下來，測定ce、pc和pe脂質(zhì)類的脂肪酸組分。所有的數(shù)值用摩爾％表示，這一種數(shù)據(jù)形式，提供了存在于每種脂質(zhì)類的單個(gè)脂肪酸相對于所有脂肪酸的相對含量。在一個(gè)實(shí)例中，使用單個(gè)is(dce(16：0))以及多個(gè)is方法測量的膽固醇酯（ce）的脂肪酸組分與相對定量（真實(shí)質(zhì)量）值進(jìn)行比較，結(jié)果如圖16所示。y=x線表示偏差為零。所有25份受試驗(yàn)品測量ce脂質(zhì)類的22種脂肪酸中每種脂肪酸。雖然一些脂肪酸使用單個(gè)內(nèi)標(biāo)物測定非常有效，其它顯示出明顯的偏差，然而，當(dāng)使用多個(gè)is測定時(shí)偏差較低。

特別是，多不飽和脂肪酸使用單個(gè)is方法似乎有些偏差。針對ce和pc脂質(zhì)類中多不飽和脂肪酸的偏差的具體例子如下所示。偏差使用上述方法計(jì)算并列于表11中。25種血漿樣品中的每種樣品測量pc和ce脂質(zhì)類的典例脂肪酸的真實(shí)（定量）值（μμ）和估計(jì)值（使用內(nèi)標(biāo)計(jì)算得到）。結(jié)果如圖17所示。

表11給定脂質(zhì)類中的典例脂肪酸相對含量的偏差

我們的研究證明每種脂質(zhì)類使用單個(gè)內(nèi)標(biāo)物測量會(huì)引起結(jié)果的定量和組分偏差，因?yàn)閱蝹€(gè)內(nèi)標(biāo)物不能精準(zhǔn)地定量每種脂質(zhì)類所有的分子種類。使用本文描述的方法，脂質(zhì)組學(xué)分析中定量和組分偏差可以得到有效降低。

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