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背景

成簇規(guī)律間隔短回文重復(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR)與cas(CRISPR相關(guān)的)基因一起構(gòu)成適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其提供針對細菌和古菌中的侵入性外源核酸的獲得性抗性(Barrangou等人(2007) Science 315:1709-12)。CRISPR由通過稱為間隔區(qū)的類似大小的獨特可變DNA序列間隔的短保守重復序列陣列組成，所述獨特可變DNA序列通常來源于噬菌體或質(zhì)粒DNA(Barrangou等人(2007) Science315:1709-12; Bolotin等人(2005) Microbiology 151 :2551-61; Mojica等人(2005) J. Mol.Evol.60:174-82)。CRISPR-Cas系統(tǒng)通過獲取插入CRISPR區(qū)域中的外源DNA的短片段(間隔區(qū))發(fā)揮功能，并且提供針對隨后暴露于攜帶匹配序列的噬菌體和質(zhì)粒的免疫性(Barrangou等人(2007) Science 315:1709-12; Brouns等人(2008) Science 321:960-64)。正是這種CRISPR-Cas干擾/免疫性使得實現(xiàn)外源核酸的crRNA介導的沉默(Horvath & Barrangou (2010) Science 327:167-70; Deveau等人(2010) Annu.Rev. Microbiol.64:475-93; Marraffini & Sontheimer (2010) Nat. Rev. Genet.11:181-90; Bhaya等人(2011) Annu.Rev. Genet.45:273-97; Wiedenheft等人(2012) Nature 482:331-338)。

使用與合成向?qū)NA(gRNA)偶聯(lián)的依賴于Cas9蛋白(Makarova等人(2011) Nat. Rev. Microbiol.9:467-77)的核酸酶活性的CRISPR構(gòu)建體最近已經(jīng)徹底改革了基因組工程改造，其允許對DNA序列進行前所未有的操作。CRISPR/Cas9構(gòu)建體對于合成是簡單且快速的，并且可以多重化。然而，盡管它們的合成相對容易，但CRISPR具有與它們接近可靶向基因組空間相關(guān)的技術(shù)限制，這與Cas9本身的特性和其gRNA的合成相關(guān)。

通過CRISPR系統(tǒng)的切割需要gRNA與20-核苷酸DNA序列的互補堿基配對以及必需的前間區(qū)序列鄰近基序(PAM)（在靶位點的3'處發(fā)現(xiàn)的短核苷酸基序）(Jinek等人(2012) Science 337:816-821)。在理論上，技術(shù)人員可以使用CRISPR技術(shù)靶向基因組中的任何獨特的N₂₀-PAM序列。PAM序列的DNA結(jié)合特異性（其根據(jù)采用的特定Cas9的來源物種而變化）提供了一種約束。目前，最少限制性和最常用的Cas9蛋白來自化膿性鏈球菌(S. pyogenes)，其識別序列NGG，因此，可以靶向基因組中的任何獨特的21個核苷酸序列和隨后的兩個鳥苷核苷酸(N₂₀NGG)。由蛋白組分施加的可用的靶向空間的擴展受限于具有改變的PAM需求的新型Cas9蛋白的發(fā)現(xiàn)和使用(Cong等人(2013) Science 339:819-823; Hou等人(2013) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110(39):15644-9)，或未實現(xiàn)的經(jīng)由誘變或定向進化產(chǎn)生新型Cas9變體。

CRISPR系統(tǒng)的第二個技術(shù)約束起因于在5'鳥苷核苷酸起始的gRNA表達。III型類別的RNA聚合酶III啟動子的使用特別適用于gRNA表達，因為這些短的非編碼轉(zhuǎn)錄物具有明確限定的末端，并且在上游啟動子區(qū)域中含有排除1+核苷酸的所有必需的轉(zhuǎn)錄元件。然而，由于常用的U6啟動子需要鳥苷核苷酸來啟動轉(zhuǎn)錄，所以U6啟動子的使用已將基因組靶向位點進一步限制于GN₁₉NGG (Mali等人 (2013) Science 339:823-826; Ding等人 (2013) Cell Stem Cell 12:393-394)。替代方法，諸如通過T7、T3或SP6啟動子的體外轉(zhuǎn)錄，也將需要起始鳥苷核苷酸(Adhya等人 (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:147-151; Melton等人 (1984) Nucleic Acids Res. 12:7035-7056; Pleiss等人 (1998) RNA 4:1313-1317)。

概述

除非另有說明，本發(fā)明的實踐通常采用細胞生物學、細胞培養(yǎng)、分子生物學、轉(zhuǎn)基因生物學、微生物學、重組核酸(例如DNA)技術(shù)、免疫學和RNA干擾(RNAi)的常規(guī)技術(shù)，其在本領(lǐng)域的技術(shù)內(nèi)。這些技術(shù)中的某些的非限制性描述在以下出版物中找到：Ausubel, F.,等人, (編), Current Protocols in Molecular Biology、Current Protocols in Immunology、Current Protocols in Protein Science和Current Protocols in Cell Biology, 均為John Wiley & Sons, N.Y., 至2008年12月的版本為止; Sambrook, Russell,和Sambrook, Molecular Cloning.A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001; Harlow, E.和Lane, D., Antibodies—A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988; Freshney, R. I., “Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique”, 第5版, John Wiley & Sons, Hoboken, N.J., 2005。關(guān)于治療劑和人類疾病的非限制性信息見于Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics,第11版, McGraw Hill, 2005, Katzung, B. (編) Basic and Clinical Pharmacology, McGraw-Hill/Appleton & Lange 第10版 (2006)或第11版(2009年7月)。關(guān)于基因和遺傳病癥的非限制性信息見于McKusick, V. A.:Mendelian Inheritance in Man.A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders.Baltimore:Johns Hopkins University Press, 1998 (第12版)或更近的在線數(shù)據(jù)庫：在線人類孟德爾遺傳(Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM?).McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.)和National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.), 至2010年5月1日為止，可得自萬維網(wǎng):http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/和在線動物孟德爾遺傳(Online Mendelian Inheritance in Animals, OMIA), 基因數(shù)據(jù)庫，動物物種(除人類和小鼠以外)的遺傳疾病和性狀，可得自萬維網(wǎng):http://omia.angis.org.au/contact.shtml。本文提及的所有專利、專利申請和其他出版物(例如，科學文章、書籍、網(wǎng)站和數(shù)據(jù)庫)以其整體通過引用并入。在本說明書和任何并入的參考文獻之間沖突的情況下，應(yīng)當以說明書(包括其可以基于并入的參考文獻的任何修改)為準。除非另有說明，本文使用術(shù)語的標準技術(shù)接受的含義。本文使用各種術(shù)語的標準縮寫。

本公開主題提供用于使用H1啟動子表達CRISPR向?qū)NA的組合物和方法。本公開主題提供包含一種或多種載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)，所述載體包含：a)H1啟動子，其可操作連接至編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列，其中所述gRNA與細胞中的DNA分子的靶序列雜交，且其中所述DNA分子編碼在所述細胞中表達的一種或多種基因產(chǎn)物；和b)在細胞中可操作的調(diào)節(jié)元件，其可操作連接至編碼Cas9蛋白的核苷酸序列，其中組件(a)和(b)位于所述系統(tǒng)的相同或不同的載體上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改變一種或多種基因產(chǎn)物的表達。在一些方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG、GN₁₉NGG、CN₁₉NGG或TN₁₉NGG。在一些方面，所述細胞是真核細胞。在一些方面，所述真核細胞是哺乳動物或人細胞。在一些方面，所述真核細胞是視網(wǎng)膜感光細胞。在一些方面，將所述Cas9蛋白針對細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在一些方面，所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。在一些方面，一種或多種基因產(chǎn)物的表達減少。在一些方面，所述一種或多種基因產(chǎn)物是視紫紅質(zhì)。在一些方面，將所述系統(tǒng)包裝至單個腺相關(guān)病毒(AAV)顆粒中。

在一些方面，本公開主題提供包含一種或多種載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)，所述載體包含：a)H1啟動子，其可操作連接至編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列，其中所述gRNA與真核細胞中的DNA分子的靶序列雜交，且其中所述DNA分子編碼在所述真核細胞中表達的一種或多種基因產(chǎn)物；和b)在真核細胞中可操作的調(diào)節(jié)元件，其可操作連接至編碼II型Cas9蛋白的核苷酸序列，其中組件(a)和(b)位于所述系統(tǒng)的相同或不同的載體上，由此所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子，且由此一種或多種基因產(chǎn)物的表達改變。在另一個方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG、GN₁₉NGG、CN₁₉NGG或TN₁₉NGG。在另一個方面，將所述Cas9蛋白針對細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在又另一個方面，將所述Cas9蛋白針對真核細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在一個進一步方面，所述真核細胞是哺乳動物或人細胞。在另一個方面，一種或多種基因產(chǎn)物的表達減少。

本公開主題還提供改變細胞中的一種或多種基因產(chǎn)物的表達的方法，其中所述細胞包含編碼一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子，所述方法包括將包含一種或多種載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)引入所述細胞中，所述載體包含：a)H1啟動子，其可操作連接至編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列，其中所述gRNA與所述DNA分子的靶序列雜交，和b)在細胞中可操作的調(diào)節(jié)元件，其可操作連接至編碼Cas9蛋白的核苷酸序列，其中組件(a)和(b)位于所述系統(tǒng)的相同或不同的載體上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改變一種或多種基因產(chǎn)物的表達。在一些方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG、GN₁₉NGG、CN₁₉NGG或TN₁₉NGG。在一些方面，所述細胞是真核細胞。在一些方面，所述真核細胞是哺乳動物或人細胞。在一些方面，所述真核細胞是視網(wǎng)膜感光細胞。在一些方面，將所述Cas9蛋白針對細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在一些方面，所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。在一些方面，一種或多種基因產(chǎn)物的表達減少。在一些方面，所述一種或多種基因產(chǎn)物是視紫紅質(zhì)。在一些方面，將所述系統(tǒng)包裝至單個腺相關(guān)病毒(AAV)顆粒中。

在一些方面，本公開主題提供改變真核細胞中的一種或多種基因產(chǎn)物的表達的方法，其中所述細胞包含編碼一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子，所述方法包括將包含一種或多種載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)引入所述細胞中，所述載體包含：a)H1啟動子，其可操作連接至編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列，其中所述gRNA與所述DNA分子的靶序列雜交，和b)在真核細胞中可操作的調(diào)節(jié)元件，其可操作連接至編碼II型Cas9蛋白的核苷酸序列，其中組件(a)和(b)位于所述系統(tǒng)的相同或不同的載體上，由此所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子，且由此一種或多種基因產(chǎn)物的表達改變。在另一個方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG、GN₁₉NGG、CN₁₉NGG或TN₁₉NGG。在另一個方面，將所述Cas9蛋白針對細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在又另一個方面，將所述Cas9蛋白針對真核細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在一個進一步方面，所述真核細胞是哺乳動物或人細胞。在另一個方面，一種或多種基因產(chǎn)物的表達減少。

本公開主題還提供包含載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)，所述載體包含雙向H1啟動子，其中所述雙向H1啟動子包含：a)控制元件，其提供編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列在一個方向的轉(zhuǎn)錄，其中所述gRNA與細胞中的DNA分子的靶序列雜交，且其中所述DNA分子編碼在所述細胞中表達的一種或多種基因產(chǎn)物；和b)控制元件，其提供編碼Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的轉(zhuǎn)錄，其中所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改變一種或多種基因產(chǎn)物的表達。在一些方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG、GN₁₉NGG、CN₁₉NGG或TN₁₉NGG。在一些方面，所述細胞是真核細胞。在一些方面，所述真核細胞是哺乳動物或人細胞。在一些方面，所述真核細胞是視網(wǎng)膜感光細胞。在一些方面，將所述Cas9蛋白針對細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在一些方面，所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。在一些方面，一種或多種基因產(chǎn)物的表達減少。在一些方面，所述一種或多種基因產(chǎn)物是視紫紅質(zhì)。在一些方面，將所述系統(tǒng)包裝至單個腺相關(guān)病毒(AAV)顆粒中。

在一些實施方案中，本公開主題提供包含載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)，所述載體包含雙向H1啟動子，其中所述雙向H1啟動子包含：a)控制元件，其提供編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列在一個方向的轉(zhuǎn)錄，其中所述gRNA與真核細胞中的DNA分子的靶序列雜交，且其中所述DNA分子編碼在所述真核細胞中表達的一種或多種基因產(chǎn)物；和b)控制元件，其提供編碼II型Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的轉(zhuǎn)錄，由此所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子，且由此一種或多種基因產(chǎn)物的表達改變。在另一個方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG、GN₁₉NGG、CN₁₉NGG或TN₁₉NGG。在又另一個方面，將所述Cas9蛋白針對真核細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在一個進一步方面，所述真核細胞是哺乳動物或人細胞。在另一個方面，一種或多種基因產(chǎn)物的表達減少。

本公開主題還提供改變細胞中的一種或多種基因產(chǎn)物的表達的方法，其中所述細胞包含編碼一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子，所述方法包括將包含含有雙向H1啟動子的載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)引入所述細胞中，其中所述雙向H1啟動子包含：a)控制元件，其提供編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列在一個方向的轉(zhuǎn)錄，其中所述gRNA與所述DNA分子的靶序列雜交，和b)控制元件，其提供編碼Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的轉(zhuǎn)錄，其中所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改變所述細胞中的一種或多種基因產(chǎn)物的表達。在一些方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG、GN₁₉NGG、CN₁₉NGG或TN₁₉NGG。在一些方面，所述細胞是真核細胞。在一些方面，所述真核細胞是哺乳動物或人細胞。在一些方面，所述真核細胞是視網(wǎng)膜感光細胞。在一些方面，將所述Cas9蛋白針對細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在一些方面，所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。在一些方面，一種或多種基因產(chǎn)物的表達減少。在一些方面，所述一種或多種基因產(chǎn)物是視紫紅質(zhì)。在一些方面，將所述系統(tǒng)包裝至單個腺相關(guān)病毒(AAV)顆粒中。

本公開主題還提供改變真核細胞中的一種或多種基因產(chǎn)物的表達的方法，其中所述細胞包含編碼一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子，所述方法包括將包含含有雙向H1啟動子的載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)引入所述細胞中，其中所述雙向H1啟動子包含：a)控制元件，其提供編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列在一個方向的轉(zhuǎn)錄，其中所述gRNA與所述DNA分子的靶序列雜交，和b)控制元件，其提供編碼II型Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的轉(zhuǎn)錄，由此所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子，且由此一種或多種基因產(chǎn)物的表達改變。在另一個方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG、GN₁₉NGG、CN₁₉NGG或TN₁₉NGG。在又另一個方面，將所述Cas9蛋白針對真核細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在一個進一步方面，所述真核細胞是哺乳動物或人細胞。在另一個方面，一種或多種基因產(chǎn)物的表達減少。

本公開主題還提供適配子調(diào)節(jié)的核酶，其包含：a)順式作用錘頭核酶，其包含催化核心和由其延伸的螺旋I、螺旋II和螺旋III雙鏈體區(qū)，其中螺旋II雙鏈體區(qū)和螺旋III雙鏈體區(qū)各自包含與所述催化核心相對的環(huán)區(qū)域，且其中所述螺旋II雙鏈體區(qū)包含結(jié)合配體的適配子；b)編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的核苷酸序列，其中所述gRNA與真核細胞中的DNA分子的靶序列雜交，且其中所述DNA分子編碼在所述真核細胞中表達的一種或多種基因產(chǎn)物，其中所述核苷酸序列包含5'末端和3'末端，且其中所述核苷酸序列的5'末端直接偶聯(lián)至所述螺旋III雙鏈體區(qū)；其中所述配體與所述適配子的結(jié)合產(chǎn)生核酶的構(gòu)象變化，使得所述核酶經(jīng)歷在所述核苷酸序列的5'末端和所述螺旋III雙鏈體區(qū)之間的自我切割，由此產(chǎn)生gRNA。還提供表達構(gòu)建體，其包含：(i)編碼序列，其當轉(zhuǎn)錄為RNA時產(chǎn)生適配子調(diào)節(jié)的核酶；和(ii)一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，其調(diào)節(jié)真核細胞中的RNA的轉(zhuǎn)錄。還提供包含所述表達構(gòu)建體的真核細胞。還提供改變真核細胞中的一種或多種基因產(chǎn)物的表達的方法，其中所述細胞包含編碼一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子，所述方法包括將所述表達構(gòu)建體引入所述細胞中，且使所述細胞與所述配體以改變核酶的活性的量接觸，特別是其中所述細胞在哺乳動物或人主體中。在一個方面，所述配體是茶堿。

本公開主題還提供用于在有需要的主體中治療眼部神經(jīng)變性疾病的方法，所述方法包括：(a)提供包含一種或多種載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)，所述載體包含：i)H1啟動子，其可操作連接至編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列，其中所述gRNA與所述主體的細胞中的DNA分子的靶序列雜交，且其中所述DNA分子編碼在所述細胞中表達的一種或多種基因產(chǎn)物；和ii)在細胞中可操作的調(diào)節(jié)元件，其可操作連接至編碼Cas9蛋白的核苷酸序列，其中組件(i)和(ii)位于所述系統(tǒng)的相同或不同的載體上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改變一種或多種基因產(chǎn)物的表達；和(b)向所述主體施用有效量的所述系統(tǒng)。在一些方面，已經(jīng)在主體中觀察到視網(wǎng)膜感光細胞的功能障礙和/或死亡。在一些方面，所述眼部神經(jīng)變性疾病選自青光眼、視網(wǎng)膜變性和年齡相關(guān)性黃斑變性。在一些方面，所述眼部神經(jīng)變性疾病是視網(wǎng)膜色素變性(RP)。在一些方面，所述細胞是視網(wǎng)膜感光細胞。在一些方面，一種或多種基因產(chǎn)物是視紫紅質(zhì)。在一些方面，所述H1啟動子是雙向的。在一些方面，在施用于所述主體之前，將所述系統(tǒng)包裝至單個腺相關(guān)病毒(AAV)顆粒中。在一些方面，施用于所述主體通過視網(wǎng)膜下注射發(fā)生。在一些方面，所述主體是人。在一些方面，所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。在一些方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG、GN₁₉NGG、CN₁₉NGG或TN₁₉NGG。在一些方面，將所述Cas9蛋白針對細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在一些方面，本公開的方法進一步包括以改變核酶活性的量施用所述表達構(gòu)建體和所述配體。在一些方面，所述配體是茶堿。

已經(jīng)在上文中陳述了本公開主題的某些方面，其通過本公開主題全部或部分地解決，當結(jié)合如下文最佳描述的所附實施例和附圖進行描述時，其他方面將變得顯而易見。

附圖簡述

因此已經(jīng)一般地描述了本公開主題，現(xiàn)在將參考附圖，所述附圖不一定按比例繪制，并且其中：

圖1A、圖1B、圖1C和圖1D顯示經(jīng)由從H1啟動子的gRNA合成引導CRISPR靶向的能力的評估。描繪gRNA表達構(gòu)建體的示意圖顯示于圖1A中。上面，U6啟動子僅表達具有+1鳥苷核苷酸的gRNA；下面，H1啟動子可以驅(qū)動在嘌呤(腺苷或鳥苷)核苷酸起始的gRNA的表達。下面，顯示具有g(shù)RNA靶向基因組序列AN₁₉NGG的Cas9蛋白的圖示描繪(所示序列為SEQ ID NO:30)。指示+1 A的位置。eGFP靶向破壞測定的示意性概述顯示于圖1B中。eGFP熒光被CRISPR靶向和隨后的易錯NHEJ介導的修復(其導致破壞編碼序列的移框突變)破壞，導致熒光的損失。圖1C顯示證明通過U6或H1啟動子表達的gRNA的成功的CRISPR靶向的顯微鏡圖像。將H7ES細胞染色，并且使集落可視化以顯示核(左側(cè)，品紅色)，eGFP熒光(中間，綠色)，和合并的圖像(右側(cè))，其指示集落中的GFP熒光鑲嵌的區(qū)域。右側(cè)顯示各個構(gòu)建體的通過流式細胞術(shù)的eGFP熒光損失的定量。下面是通過H1表達的gRNA靶向的H7集落的更高放大倍數(shù)，其顯示表達鑲嵌。比例尺，50μM。NHEJ頻率的基于Surveyor測定的定量顯示于圖1D中。描繪對照(第一泳道)、U6表達的gRNA(第二泳道)、H1表達的gRNA(第三泳道)和標記(第四泳道)的Bioanalyzer凝膠圖像。％插入缺失(如通過未切割(u)條帶相對于切割(c)條帶的分數(shù)計算)如下所示；

圖2顯示HEK-293細胞中的NHEJ的Surveyor分析和定量。上面顯示eGFP示意圖，其中箭頭指示靶向位點。正鏈上的靶位點指示指向右側(cè)，負鏈目標指示指向左側(cè)；藍色箭頭指示H1啟動子gRNA，且橙色箭頭指示U6啟動子gRNA。下面顯示來自Surveyor測定的Bioanalyzer凝膠。上文列出靶位點坐標，且下面指示計算的％插入缺失；

圖3A、圖3B和圖3C顯示在AAVS1基因座處的靶向和同源重組。由H1啟動子表達的三種gRNA(AAVS1-1a至-1-3a)、由U6啟動子表達的三種gRNA(AAVS-1-1至-1-3)和對照非靶向gRNA的Surveyor分析顯示于圖3A中。圖3B顯示AAVS-1靶向供體載體(顯示在AAVS1基因座上方(標記為“AAVS1”))的示意圖和在用H1::AAVS1-3a gRNA和AAVS-1靶向載體電穿孔后GFP陽性H7 ES細胞集落的細胞成像。指示通過同源重組的正確整合的靶向連接區(qū)的Sanger測序顯示于圖3C中(所示序列為SEQ ID NO:31)；

圖4A、圖4B、圖4C和圖4D顯示基因組中的GN₁₉NGG和AN₁₉NGG位點的生物信息學分析。描繪人類基因組中的CRIPSR位點的頻率的Circos圖顯示于圖4A中。外側(cè)圓描繪人類染色體意符(ideogram)。向內(nèi)移動，沿著染色體指示GN₁₉NGG(橙色)、AN₁₉NGG(藍色)和RN₁₉NGG(紫色)CRISPR位點頻率。圓內(nèi)繪制的是人外顯子密度(黑色)和OMIM疾病位點(藍色)。基因組中的CRISPR位點之間的頻率和距離顯示于圖4B中。顯示基因組中的相鄰GN₁₉NGG(橙色)、AN₁₉NGG(藍色)位點的頻率和距離的條形圖。平均值和中值在包括RN₁₉NGG位點的圖中插入。圖4C顯示人基因(左側(cè))或OMIM疾病基因座(右側(cè))的GN₁₉NGG vs AN₁₉NGG位點頻率的條形圖定量。圖4D顯示定量六種基因組(人、牛、小鼠、大鼠，雞和斑馬魚)中GN₁₉NGG vs. AN₁₉NGG頻率的條形圖；

圖5A、圖5B、圖5C、圖5D、 圖5E和圖5F顯示基因組中的GN₁₉NGG和AN₁₉NGG位點的生物信息學分析。顯示描繪人基因組中每個gRNA位點的密度的三個小圖：GN₁₉NGG (圖5A)、AN₁₉NGG (圖5B)和RN₁₉NGG (圖5C)。在每個圖內(nèi)，沿著每條染色體繪制CRISPR位點的密度。半透明(橙色、藍色或紫色)的重疊是計算為平滑高斯核的密度曲線。虛線指示35bp；作為參考，平均來說，估計TALEN靶向位點每35個堿基對出現(xiàn)一次，且ZFN位點每幾百個堿基對出現(xiàn)一次(Sander等人(2011) Nature Methods 8:67-69; Cermak等人(2011) Nucleic Acids Res.39(12):e82)。圖5D中顯示每條人染色體的累積平均CRISPR靶向密度的條形圖。GN₁₉NGG (橙色)、AN₁₉NGG (紫色)和RN₁₉NGG (紫色)指示各個CRISPR位點。虛線指示35bp參考。圖5E顯示基因組中相鄰CRISPR位點之間的頻率和距離。顯示基因組中的相鄰GN₁₉NGG(橙色)和AN₁₉NGG(藍色)位點的頻率和距離的條形圖。平均值和中間值在圖中插入。人基因組中的所有GN₁₉NGG (左上)、AN₁₉NGG (右上)和RN₁₉NGG (底部)位點的SeqLogo顯示于圖5F中；

圖6A、圖6B、圖6C、圖6D、圖6E和圖6F顯示AT/GC基因組含量和CRISPR位點頻率：針對人、牛、小鼠、大鼠、雞和斑馬魚基因組指示AT(藍色)或GC(橙色)的百分比(圖6A)。指示針對AT/GC含量均一化的GN₁₉NGG (橙色)和AN₁₉NGG (藍色)的頻率(圖6B)。代表GN₁₉NGG (左側(cè))、AN₁₉NGG (中間)和RN₁₉NGG (右側(cè))位點的CRISPR位點頻率顯示于圖6C中。正鏈(左側(cè)柱)由藍綠色指示，且負鏈(右側(cè)柱)以紫紅色指示。圖6D中指示果蠅、秀麗隱桿線蟲和釀酒酵母中的GN₁₉NGG(橙色)和AN₁₉NGG(藍色)位點頻率。圖6E顯示AT(藍色)或GC(橙色)百分比含量，且圖6F顯示CRISPR位點的均一化頻率；

圖7A、圖7B、圖7C和圖7D顯示H7 ES細胞中的內(nèi)源基因(MERTK)處的AN₁₉NGG的CRISPR靶向。MERTK基因座和各種蛋白結(jié)構(gòu)域的示意圖顯示于圖7A中。外顯子2中的靶位點以較大比例顯示在下面，指示CRISPR AN₁₉NGG靶位點(顯示的序列為SEQ ID NO:32)。通過Surveyor測定對外顯子2處的CRISPR靶向的定量顯示于圖7B中。上面描繪外顯子2中的CRISPR位點，其中在Surveyor測定中使用各種引物(箭頭)；F1:R1和F2:R2都跨越靶位點，而對照PCR產(chǎn)物F3:R3恰好在靶位點之外。下面顯示來自Surveyor測定的凝膠，其中左側(cè)顯示三種對照產(chǎn)物，且右側(cè)顯示靶向。下面指示％插入缺失頻率。圖7C顯示突變體系的Sanger測序。分離克隆系并測序，表明在AN₁₉NGG位點處的CRISPR靶向?qū)е略搮^(qū)域處的誘變。比對的色譜圖顯示克隆的6個獨特突變(wt是SEQ ID NO:33；Δ12是SEQ ID NO:34；Δ1是SEQ ID NO:35；Δ2, +2是SEQ ID NO:36；Δ6是SEQ ID NO:37；Δ7是SEQ ID NO:38)。圖7D顯示H7來源的RPE細胞中的Mertk表達的Western印跡分析。泳道1、3和4指示敲除系，且泳道2指示來自雜合系的表達；

圖8A、圖8B、圖8C和圖8D顯示通過U6或H1表達的gRNA在中靶和脫靶位點處誘導的脫靶命中的分析。來自滴定量的H1啟動子(藍色)或U6啟動子(橙色)的VEGFA T1 gRNA表達水平的qRT-PCR分析顯示于圖8A中。VEGFA T1的中靶和脫靶分析顯示于圖8B中。在左側(cè)指示Surveyor分析，且在右側(cè)指示靶序列，其中錯配以紅色指示(T1, SEQ ID NO:20；OT1-3, SEQ ID NO:21；OT1-4, SEQ ID NO:22；OT1-6, SEQ ID NO:23；OT1-11, SEQ ID NO:24)。圖8C與圖8B相同，其具有VEGFA T3目標(VEGFA T3, SEQ ID NO:25；OT3-1, SEQ ID NO:26；OT3-2, SEQ ID NO:27；OT3-4, SEQ ID NO:28；OT3-18, SEQ ID NO:29)。VEGFA T1的中靶相對脫靶特異性顯示于圖8D中。顯示H1啟動子(藍色)或U6啟動子(橙色)之間的中靶誘變/脫靶誘變的比率。在1.0處的虛線以下的值指示脫靶誘變多于中靶誘變。對于所有部分，中靶和脫靶位點如Fu等人((2013) Nat. Biotechnol. 31(9):822-6)和Cho等人((2014) Genome Research 24:132-141)中標記；

圖9A和圖9B顯示U6 vs. H1啟動子在表達用于CRISPR靶向的gRNA中的特性。圖9A中的上圖顯示內(nèi)源人U6啟動子和轉(zhuǎn)錄起始位點(SEQ ID NO:39)。圖9A中的下圖指示使用U6啟動子以驅(qū)動具有不同+1核苷酸的gRNA。因為U6需要G來啟動(左上)，所以以A(右上)、C(左下)或T(右下)開始的小圖可能啟動第一下游G，導致截短的gRNA(U6:GN19NGG是SEQ ID NO:40；U6:AN19NGG是SEQ ID NO:41；U6:CN19NGG是SEQ ID NO:42；U6:TN19NGG是SEQ ID NO:43)。圖9B中的上圖顯示內(nèi)源人H1啟動子和轉(zhuǎn)錄起始位點(SEQ ID NO:44)。圖9B中的下圖指示使用H1啟動子以驅(qū)動具有不同+1核苷酸的gRNA。H1可以以G(左上)或A(右上)起始，導致全長gRNA。此外，已報道H1允許在C和T核苷酸處起始轉(zhuǎn)錄，這將允許H1啟動子下游的任何+1核苷酸的全長轉(zhuǎn)錄物(H1:GN19NGG是SEQ ID NO:45；H1:AN19NGG是SEQ ID NO:46；H1:CN19NGG是SEQ ID NO:47；H1:TN19NGG是SEQ ID NO:48)；

圖10A、圖10B、圖10C、圖10D和圖10E顯示使用H1啟動子作為雙向啟動子以同時表達Cas9蛋白和向?qū)NA。顯示雙向H1啟動子，其表達Cas9作為向左(負鏈)的pol II轉(zhuǎn)錄物和向?qū)NA作為向右(正鏈)的pol III轉(zhuǎn)錄物(圖10A)?？偙磉_盒約為4.4kb。圖10B顯示用于測試從雙向H1構(gòu)建體引導CRISPR介導的切割的能力的構(gòu)建體。將使用靶向eGFP的gRNA的雙向構(gòu)建體克隆至質(zhì)粒中并在表達GFP的人干細胞中表達。目視檢測到GFP的丟失(中間圖，箭頭)，表明由于表達構(gòu)建體導致的GFP的成功表達和靶向(圖10C)。還通過Surveyor測定顯示了成功的CRISPR靶向，其中泳道2和3中存在兩個條帶(圖10D)。使用H1啟動子以生成~4.75b的緊密靶向盒的雙向CRISPR構(gòu)建體(其在腺相關(guān)病毒的包裝范圍內(nèi))顯示于圖10E中。以橙色顯示SV40終止子，并且所述構(gòu)建體側(cè)接病毒生產(chǎn)所需的反向末端重復(ITR)序列；

圖11A、圖11B和圖11C顯示生成向?qū)NA的5'末端的錘頭核酶。5'順式-錘頭核酶(SEQ ID NO:49)和gRNA (SEQ ID NO:50)的描繪顯示于圖11A中。指示錘頭核酶的序列，且指示對于催化重要的核苷酸(紅色是關(guān)鍵的，橙色是重要的)。通過箭頭指示切割的位置。在核酶切割后(下圖)，釋放所得gRNA，而不限于在新形成的5'位置處的任何核苷酸。表達錘頭-gRNA的構(gòu)建體顯示于圖11B中。啟動子，通常pol III啟動子如U6、H1或T7，可用于表達5'順式-錘頭核酶，其在自我切割后將釋放gRNA。用Surveyor測定法顯示兩個基因座的靶向(HH1 = SEQ ID NO:51；HH2 = SEQ ID NO:52)，其中通過5'順式-錘頭核酶成功裂解(箭頭)(圖11C)；

圖12顯示可調(diào)節(jié)的CRISPR構(gòu)建體，其使用適體酶在特異性適配子存在的情況下處理gRNA。具體而言，圖12描繪與錘頭核酶的螺旋II融合的茶堿適配子(橙色)，形成茶堿適體酶，其為gRNA的5'(藍色)。茶堿的結(jié)合穩(wěn)定了螺旋II，其然后允許錘頭自我切割，并釋放gRNA(SEQ ID NO:50)。gRNA，連同Cas9，現(xiàn)在能夠靶向CRISPR系統(tǒng)的切割。錘頭核酶，SEQ ID NO:55；

圖13顯示H1RNA和PARP-2基因座的基因組結(jié)構(gòu)。上面顯示向右轉(zhuǎn)錄的PARP-2基因(藍色)和向左轉(zhuǎn)錄的H1RNA基因(橙色)的描繪，按比例繪制。下面是兩個基因的啟動子區(qū)域的放大區(qū)域；

圖14顯示H1 pol II活性的eGFP報道分子。人H1啟動子序列被取向為向右的eGFP的pol II轉(zhuǎn)錄。待優(yōu)化的三個組分以斜體指示；

圖15顯示eGFP報道分子表達。上小圖指示內(nèi)源性H1啟動子，下小圖指示用Kozak序列的表達；

圖16A和圖16B顯示Cas9和gRNA的雙向表達。雙向靶向構(gòu)建體的示意圖顯示于圖16A中。使用標準的雙載體遞送(泳道2和5)或單個靶向質(zhì)粒的遞送(泳道3和6)在兩個不同基因座處的切割的比較顯示于圖16B中。在每個泳道下方指示如通過T7EI測定法確定的％基因組修飾；

圖17顯示來自hRho:GFP敲入小鼠的視紫紅質(zhì)基因座。在上面，至3'UTR的末端的rho啟動子區(qū)域的示意圖上方指示相應(yīng)的小鼠和人序列(按比例繪制)。在下面，下面顯示(箭頭)指示P23和gRNA的位置的放大區(qū)域；

圖18A、圖18B和圖18C顯示P23H等位基因在體內(nèi)的特異性靶向。圖18A顯示P23靶向(WT(C57BL/6J，SEQ ID NO:56；P23H(CCC→CAC)，SEQ ID NO:57；WT(CAST/EiJ)，SEQ ID NO:58)。圖18B顯示來自兩個野生型小鼠品系的視紫紅質(zhì)的測序；SNP由箭頭指示(C57BL/6J DNA序列，SEQ ID NO:56；C57BL/6J蛋白序列，SEQ ID NO:59；CAST/EiJ^+/+ DNA序列，SEQ ID NO:58；CAST/EiJ^+/+蛋白序列，SEQ ID NO:59)。圖18C顯示P23H育種方案：將P23H純合小鼠(黑色)與WT Cast(白色)雜交，并通過AAV5的視網(wǎng)膜下遞送治療所得的雜合幼崽(灰色)；和

圖19顯示視紫紅質(zhì)基因座的等位基因特異性靶向。顯示C57BL/6J(P23H)等位基因 vs 單堿基錯配(Cast)的切割的比較。下面指示通過T7EI測定法確定的％基因組修飾。

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詳述

現(xiàn)在將參考附圖在下文中更全面地描述本公開主題，所述附圖中顯示本公開主題的一些、但不是所有實施方案。類似數(shù)字是指通篇的類似要素。本公開主題可以以許多不同的形式實施，并且不應(yīng)被解釋為限于本文記載的實施方案；反而，提供這些實施方案，使得本公開將滿足適用的法律要求。實際上，具有前述描述和相關(guān)附圖中呈現(xiàn)的教導的益處的本公開主題所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將想到本文所記載的本公開主題的許多修改和其他實施方案。因此，應(yīng)當理解，本公開主題不限于公開的特定實施方案，并且修改和其他實施方案旨在包括于所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

基因組編輯技術(shù)諸如鋅指核酸酶(ZFN)(Porteus,和Baltimore (2003) Science300:763; Miller等人(2007) Nat. Biotechnol.25:778-785; Sander等人(2011) Nature Methods 8:67-69; Wood等人(2011) Science 333:307)和轉(zhuǎn)錄激活劑樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)(Wood等人(2011) Science 333:307; Boch等人(2009) Science 326:1509-1512; Moscou和Bogdanove (2009) Science 326:1501; Christian等人(2010) Genetics 186:757-761; Miller等人(2011) Nat. Biotechnol. 29:143-148; Zhang等人(2011) Nat. Biotechnol. 29:149-153; Reyon等人(2012) Nat. Biotechnol. 30:460-465)已經(jīng)賦予生成靶向的基因組修飾并提供準確地校正疾病突變的潛力的能力。盡管有效，但這些技術(shù)受實際限制的阻礙，因為ZFN和TALEN配對都需要合成用于給定DNA靶位點的大且獨特的識別蛋白。幾個研究組最近已經(jīng)報道了繞過這些關(guān)鍵限制的通過使用工程改造的II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)的高效基因組編輯(Cong等人(2013) Science 339:819-823; Jinek等人(2013) eLife 2:e00471; Mali等人(2013) Science 339:823-826; Cho等人(2013) Nat. Biotechnol.31:230-232; Hwang等人(2013) Nat. Biotechnol.31:227-229)。不同于制備相對耗時且困難的ZFN和TALEN，依賴于與合成向?qū)NA(gRNA)偶聯(lián)的Cas9蛋白的核酸酶活性的CRISPR構(gòu)建體，對于合成是簡單且快速的，并且可以多重化。然而，盡管它們的合成相對容易，但CRISPR具有與它們接近可靶向基因組空間相關(guān)的技術(shù)限制，這與Cas9本身的特性和其gRNA的合成相關(guān)。

通過CRISPR系統(tǒng)的切割需要gRNA與20-核苷酸DNA序列的互補堿基配對以及必需的前間區(qū)序列鄰近基序(PAM)(在靶位點的3'處發(fā)現(xiàn)的短核苷酸基序)(Jinek等人(2012) Science 337:816-821)。在理論上，技術(shù)人員可以使用CRISPR技術(shù)靶向基因組中的任何獨特的N₂₀-PAM序列。PAM序列的DNA結(jié)合特異性（其根據(jù)采用的特定Cas9的來源物種而變化）提供了一種約束。目前，最少限制性和最常用的Cas9蛋白來自化膿性鏈球菌，其識別序列NGG，因此，可以靶向基因組中的任何獨特的21個核苷酸序列和隨后的兩個鳥苷核苷酸(N₂₀NGG)。由蛋白組分施加的可用的靶向空間的擴展受限于具有改變的PAM需求的新型Cas9蛋白的發(fā)現(xiàn)和使用(Cong等人(2013) Science 339:819-823; Hou等人(2013) Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A., 110(39):15644-9)，或未實現(xiàn)的經(jīng)由誘變或定向進化產(chǎn)生新型Cas9變體。CRISPR系統(tǒng)的第二個技術(shù)約束起因于在5'鳥苷核苷酸起始的gRNA表達。III型類別的RNA聚合酶III啟動子的使用特別適用于gRNA表達，因為這些短的非編碼轉(zhuǎn)錄物具有明確限定的末端，并且在上游啟動子區(qū)域中含有排除1+核苷酸的所有必需的轉(zhuǎn)錄元件。然而，由于常用的U6啟動子需要鳥苷核苷酸來啟動轉(zhuǎn)錄，所以U6啟動子的使用已將基因組靶向位點進一步限制于GN₁₉NGG(Mali等人(2013) Science 339:823-826; Ding等人(2013) Cell Stem Cell 12:393-394)。替代方法，諸如通過T7、T3或SP6啟動子的體外轉(zhuǎn)錄，也將需要起始鳥苷核苷酸(Adhya等人(1981) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:147-151; Melton等人(1984) Nucleic Acids Res.12:7035-7056; Pleiss等人(1998) RNA 4:1313-1317)。

本公開主題涉及以下發(fā)現(xiàn)：使用H1啟動子來表達向?qū)NA(gRNA或sgRNA)，由于5'核苷酸的改變的特異性，使許多基因組中的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的精確度超過倍增。使用H1啟動子表達gRNA以表達和修飾內(nèi)源基因的能力可用于靶向AN₁₉NGG和GN₁₉NGG基因組位點。在人基因組中，AN₁₉NGG位點存在的頻率比GN₁₉NGG位點高15%，且靶向空間的增加也富集在人基因和疾病基因座處。因此，本公開主題通過將人基因組和其他真核物種內(nèi)的靶向空間超過倍增來增強CRISPR技術(shù)的通用性。此外，與先前存在的CRISPR、TALEN或鋅指技術(shù)相比，這種修飾允許在人基因組中更高分辨率的靶向。

本公開主題還涉及以下發(fā)現(xiàn)：使用H1啟動子序列作為雙向啟動子來表達Cas9和gRNA同時允許生成可以通過病毒載體插入和遞送的緊密和完全功能表達盒。

本公開主題還涉及使用RNA核酶和可調(diào)節(jié)的適體酶來在體內(nèi)表達和調(diào)節(jié)gRNA表達。

I.使用H1啟動子表達CRISPR向?qū)NA。

A. 組合物

在一些方案中，本公開主題提供包含一種或多種載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)，所述載體包含：a)H1啟動子，其可操作連接至編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列，其中所述gRNA與細胞中的DNA分子的靶序列雜交，且其中所述DNA分子編碼在所述細胞中表達的一種或多種基因產(chǎn)物；和b)在細胞中可操作的調(diào)節(jié)元件，其可操作連接至編碼Cas9蛋白的核苷酸序列，其中組件(a)和(b)位于所述系統(tǒng)的相同或不同的載體上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改變一種或多種基因產(chǎn)物的表達。

在一些方案中，本公開主題提供包含一種或多種載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)，所述載體包含：a)H1啟動子，其可操作連接至編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列，其中所述gRNA與真核細胞中的DNA分子的靶序列雜交，且其中所述DNA分子編碼在所述真核細胞中表達的一種或多種基因產(chǎn)物；和b)在真核細胞中可操作的調(diào)節(jié)元件，其可操作連接至編碼II型Cas9蛋白的核苷酸序列，其中組件(a)和(b)位于所述系統(tǒng)的相同或不同的載體上，由此所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子，且由此改變一種或多種基因產(chǎn)物的表達。在一個方面，所述靶序列可以是以任何核苷酸開始的靶序列，例如N₂₀NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列GN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列CN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列TN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG或GN₁₉NGG。在另一個方面，將所述Cas9蛋白針對細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在另一個方面，將所述Cas9蛋白針對真核細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在一個進一步方面，所述真核細胞是哺乳動物或人細胞。在又另一個方面，一種或多種基因產(chǎn)物的表達減少。

本公開主題還提供包含載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)，所述載體包含雙向H1啟動子，其中所述雙向H1啟動子包含：a)控制元件，其提供編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列在一個方向的轉(zhuǎn)錄，其中所述gRNA與真核細胞中的DNA分子的靶序列雜交，且其中所述DNA分子編碼在所述真核細胞中表達的一種或多種基因產(chǎn)物；和b)控制元件，其提供編碼II型Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的轉(zhuǎn)錄，由此所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子，且由此改變一種或多種基因產(chǎn)物的表達。在一個方面，所述靶序列可以是以任何核苷酸開始的靶序列，例如N₂₀NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列GN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列CN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列TN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG或GN₁₉NGG。在另一個方面，將所述Cas9蛋白針對細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在另一個方面，將所述Cas9蛋白針對真核細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在一個進一步方面，所述真核細胞是哺乳動物或人細胞。在又另一個方面，一種或多種基因產(chǎn)物的表達減少。

在一些實施方案中，所述CRISPR復合物包含強度足以驅(qū)動所述CRISPR復合物以可檢測量在細胞(例如真核細胞)的核中積累的一個或多個核定位序列。不希望受理論束縛，據(jù)信核定位序列不是真核生物中的CRISPR復合物活性必需的，但包括此類序列增強所述系統(tǒng)的活性，特別是關(guān)于靶向核中的核酸分子。在一些實施方案中，所述CRISPR酶是II型CRISPR系統(tǒng)酶。在一些實施方案中，所述CRISPR酶是Cas9酶。在一些實施方案中，所述Cas9酶是肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)、化膿性鏈球菌或嗜熱鏈球菌(S. thermophilus) Cas9，并且可以包括源自這些生物體的突變Cas9。所述酶可以是Cas9同源物或直向同源物。

通常，且在整個本說明書中，術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運與其連接的另一核酸的核酸分子。載體包括但不限于，單鏈、雙鏈、或部分雙鏈的核酸分子；包含一個或多個游離端、無游離端(例如環(huán)狀的)的核酸分子；包含DNA、RNA、或兩者的核酸分子；以及本領(lǐng)域已知的其他多種多樣的多核苷酸。一種類型的載體是“質(zhì)?！保涫侵钙渲锌梢灾T如通過標準分子克隆技術(shù)插入額外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于用于包裝為病毒(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、復制缺陷型腺病毒和腺相關(guān)病毒)的載體中。病毒載體還包括由用于轉(zhuǎn)染入宿主細胞中的病毒攜帶的多核苷酸。

某些載體(例如，具有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)能夠在它們被導入的宿主細胞中自主復制。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)在引入宿主細胞后整合至宿主細胞的基因組中，并且由此與宿主基因組一起復制。而且，某些載體能夠指導它們可操作連接的基因的表達。此類載體在本文中被稱為“表達載體”。在重組DNA技術(shù)中使用的普通表達載體通常是質(zhì)粒形式。

重組表達載體可包含以適合于在宿主細胞中的核酸表達的形式的本公開主題的核酸，這意味著所述重組表達載體包括基于待用于表達的宿主細胞而選擇的一種或多種調(diào)節(jié)元件，所述調(diào)節(jié)元件可操作連接至待表達的核酸序列。

在重組表達載體內(nèi)，“可操作連接”旨在意指目標核苷酸序列以允許核苷酸序列的表達的方式連接至調(diào)節(jié)元件(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或當載體被引入宿主細胞中時，在宿主細胞中)。

術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”旨在包括啟動子、增強子、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)和其他表達控制元件(例如轉(zhuǎn)錄終止信號，諸如多聚腺苷酸化信號和多聚U序列)。此類調(diào)節(jié)序列例如描述于Goeddel (1990) Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif中。調(diào)節(jié)元件包括指導核苷酸序列在許多類型的宿主細胞中的組成型表達的那些以及指導核苷酸序列僅在某些宿主細胞中表達的那些(例如，組織特異性調(diào)節(jié)序列)。組織特異性啟動子可主要指導在所需目標組織中的表達，所述組織諸如肌肉、神經(jīng)元、骨、皮膚、血液、特定器官(例如肝臟、胰腺)、或具體細胞類型(例如淋巴細胞)。調(diào)節(jié)元件還可以時序依賴性方式(諸如以細胞周期依賴性或發(fā)育階段依賴性方式)指導表達，所述方式可以是或者可以不是組織或細胞類型特異性的。

在一些實施方案中，載體包含一個或多個pol III啟動子、一個或多個pol II啟動子、一個或多個pol I啟動子、或其組合。pol III啟動子的實例包括但不限于U6和H1啟動子。pol II啟動子的實例包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子(任選地具有RSV增強子)、巨細胞病毒(CMV)啟動子(任選地具有CMV增強子)(例如，Boshart等人(1985) Cell 41:521-530))、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子、和EF1α啟動子。

還被術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”涵蓋的是增強子元件，諸如WPRE；CMV增強子；HTLV-I的LTR中的R-U5’區(qū)段(Takebe等人(1988) Mol.Cell.Biol.8:466-472)；SV40增強子；以及在兔β-球蛋白的外顯子2和3之間的內(nèi)含子序列(O’Hare等人(1981) Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78(3):1527-31)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，表達載體的設(shè)計可取決于因素諸如待轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇、所需表達水平等。載體可以被引入宿主細胞中，由此產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物、蛋白、或肽，包括由如本文所述的核酸編碼的融合蛋白或肽(例如，成簇規(guī)律間隔短回文重復(CRISPR)轉(zhuǎn)錄物、蛋白、酶、其突變體形式、其融合蛋白，等)。有利的載體包括慢病毒和腺相關(guān)病毒，并且也可選擇此類型載體用于靶向具體類型的細胞。

術(shù)語“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互換使用。它們是指任何長度的核苷酸的聚合形式，無論脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其類似物。多核苷酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)，并且可以執(zhí)行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性實例：基因或基因片段的編碼區(qū)或非編碼區(qū)、從連鎖分析定義的多個基因座(一個基因座)、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運RNA、核糖體RNA、短干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、微-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針、和引物。多核苷酸可以包含一個或多個修飾的核苷酸，諸如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，可以在聚合物組裝之前或之后進行核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾。核苷酸的序列可以被非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在聚合后進一步修飾，諸如通過與標記的組分綴合來進一步修飾。

在本公開主題的方面，術(shù)語“嵌合RNA”、“嵌合向?qū)NA”、“向?qū)NA”、“單個向?qū)NA”和“合成向?qū)NA”可互換使用并且是指包含向?qū)蛄械亩嗪塑账嵝蛄?。術(shù)語“向?qū)蛄小笔侵冈谥付ò形稽c的向?qū)NA內(nèi)約20bp的序列，并且可與術(shù)語“引導”或“間隔區(qū)”互換地使用。

如本文所用，術(shù)語“野生型”是技術(shù)人員所理解的本領(lǐng)域的術(shù)語，并且意指生物體、菌株、基因的典型形式或者當其在自然界中存在時區(qū)別于突變體或變體形式的特征。

如本文所用，術(shù)語“變體”應(yīng)當被理解為意指展現(xiàn)具有衍生自在自然界中存在的模式的性質(zhì)。

術(shù)語“非天然存在的”或“工程改造的”可互換使用并且指示人工的參與。所述術(shù)語，當是指核酸分子或多肽時，意味著核酸分子或多肽至少基本上不含它們在自然界中或如發(fā)現(xiàn)于自然界中的與其天然締合的至少另一種組分。

“互補性”是指核酸與另一核酸序列通過傳統(tǒng)的沃森-克里克或其他非傳統(tǒng)類型形成氫鍵的能力?；パa性百分比表示核酸分子中可與第二核酸序列形成氫鍵(例如，沃森-克里克堿基配對)的殘基的百分比(例如，10個中的5、6、7、8、9、10個為50%、60%、70%、80%、90%和100%互補)?！巴耆パa”意味著核酸序列的所有連續(xù)殘基與第二核酸序列中的相同數(shù)目的連續(xù)殘基形成氫鍵。如本文所用，“基本上互補”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50個或更多個核苷酸的區(qū)域上為至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的互補性程度，或者是指在嚴格條件下雜交的兩個核酸。

如本文所用，對于雜交的“嚴格條件”是指與靶序列具有互補性的核酸主要地與靶序列雜交并且基本上不雜交至非靶序列的條件。嚴格條件通常是序列依賴性的，并且取決于許多因素而變化。一般而言，序列越長，序列特異性地雜交至其靶序列的溫度越高。嚴格條件的非限制性實例描述于Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes，第I部分，第二章，"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y。

“雜交”是指其中一個或多個多核苷酸反應(yīng)形成復合物的反應(yīng)，所述復合物經(jīng)由核苷酸殘基的堿基之間的氫鍵鍵合而穩(wěn)定化。氫鍵鍵合可以通過沃森-克里克堿基配對、Hoogstein結(jié)合或以任何其他序列特異性方式發(fā)生。復合物可包含形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的兩條鏈、形成多鏈復合物的三條或更多條鏈、單個自我雜交鏈、或這些的任何組合。雜交反應(yīng)可以構(gòu)成更廣泛的過程(諸如PCR的起始、或通過酶的多核苷酸的切割)中的步驟。能夠與給定序列雜交的序列被稱為給定序列的“互補物”。

如本文所用，“表達”是指借此從DNA模板轉(zhuǎn)錄成多核苷酸(諸如轉(zhuǎn)錄成mRNA或其他RNA轉(zhuǎn)錄物)的過程和/或轉(zhuǎn)錄的mRNA隨后借此翻譯成肽、多肽或蛋白的過程。轉(zhuǎn)錄物和編碼的多肽可以總稱為“基因產(chǎn)物”。如果多核苷酸源自基因組DNA，則表達可以包括真核細胞中mRNA的剪接。

術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可互換使用，是指任何長度的氨基酸的聚合物。該聚合物可以是直鏈或支鏈的，其可以包含修飾的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中斷。所述術(shù)語還涵蓋已經(jīng)被修飾的氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操作，諸如與標記組分的綴合。

如本文所用，術(shù)語“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光異構(gòu)體、以及氨基酸類似物和肽模擬物。

除非另有說明，本公開主題的實踐采用免疫學、生物化學、化學、分子生物學、微生物學、細胞生物學、基因組學和重組DNA的常規(guī)技術(shù)，其在本領(lǐng)域的技術(shù)內(nèi)(Sambrook, Fritsch和Maniatis (1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版; Ausubel等人, 編(1987) Current Protocols in Molecular Biology); MacPherson等人, 編(1995)Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.):PCR 2:A Practical Approach); Harlow和Lane, 編(1988) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney, 編 (1987) Animal Cell Culture)。

本公開主題的幾個方面涉及包含一種或多種載體的載體系統(tǒng)，或載體本身。載體可以被設(shè)計為用于在原核或真核細胞中表達CRISPR轉(zhuǎn)錄物(例如核酸轉(zhuǎn)錄物、蛋白、或酶)。例如，CRISPR轉(zhuǎn)錄物可表達于細菌細胞諸如大腸桿菌、昆蟲細胞(使用桿狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞中。合適的宿主細胞進一步討論于Goeddel (1990) Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif中?；蛘?，重組表達載體可在體外例如使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶來轉(zhuǎn)錄和翻譯。

載體可以被引入原核生物中并在其中增殖。在一些實施方案中，原核生物用來擴增待引入真核細胞中的載體的多個拷貝，或者作為待引入真核細胞中的載體的產(chǎn)生中的中間載體(例如，擴增質(zhì)粒作為病毒載體包裝系統(tǒng)的一部分)。在一些實施方案中，原核生物用來擴增載體的多個拷貝并且表達一種或多種核酸，諸如提供用于遞送至宿主細胞或宿主生物體中的一種或多種蛋白的來源。蛋白在原核生物中的表達最經(jīng)常在大腸桿菌中用含有指導融合或非融合蛋白的表達的組成型或誘導型啟動子的載體來進行。

融合載體將多個氨基酸添加至在其中編碼的蛋白，諸如重組蛋白的氨基端。此類融合載體可以用于一個或多個目的，諸如：(i)增加重組蛋白的表達；(ii)增加重組蛋白的溶解性；和(iii)通過在親和純化中充當配體來輔助重組蛋白的純化。通常，在融合表達載體中，將蛋白水解切割位點引入融合部分和重組蛋白的接合處以使得能夠在純化融合蛋白之后將重組蛋白與融合部分分離。此類酶以及它們的同源識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。示例性融合表達載體包括pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith和Johnson (1988) Gene 67:31-40)、pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.)和pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.)，其分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白A融合至靶重組蛋白。

合適的誘導型非融合大腸桿菌表達載體的實例包括pTrc (Amrann等人(1988) Gene 69:301-315)和pET 11d (Studier等人(1990) Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.)。

在一些實施方案中，載體是酵母表達載體。用于在酵母釀酒酵母中表達的載體的實例包括pYepSec1 (Baldari,等人(1987)EMBO J. 6:229-234)、pMFa (Kuijan和Herskowitz (1982) Cell 30:933-943)、pJRY88 (Schultz等人(1987) Gene 54:113-123)、pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)和picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)。

在一些實施方案中，使用哺乳動物表達載體，載體能夠驅(qū)動一種或多種序列在哺乳動物細胞中表達。哺乳動物表達載體的實例包括pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840)和pMT2PC (Kaufman等人(1987) EMBO J. 6:187-195)。當用于哺乳動物細胞中時，表達載體的控制功能通常由一種或多種調(diào)節(jié)元件提供。例如，常用的啟動子來源于多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒、猿猴病毒40、以及本文所述和本領(lǐng)域已知的其他病毒。對于用于原核細胞和真核細胞兩者的其他合適的表達系統(tǒng)，參見例如Sambrook等人(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual.(第2版)的第16和第17章，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.。

在一些實施方案中，重組哺乳動物表達載體能夠指導核酸優(yōu)先在特定細胞類型中表達(例如，使用組織特異性調(diào)節(jié)元件來表達核酸)。組織特異性調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域中已知的。合適的組織特異性啟動子的非限制性實例包括白蛋白啟動子(肝臟特異性的；Pinkert等人(1987) Genes Dev.1:268-277)，淋巴特異性啟動子(Calame和Eaton (1988)Adv.Immunol.43:235-275)，特別是T細胞受體的啟動子(Winoto和Baltimore (1989)EMBOJ.8:729-733)和免疫球蛋白(Baneiji等人(1983) Cell 33:729-740; Queen和Baltimore (1983) Cell 33:741-748)，神經(jīng)元特異性啟動子(例如，神經(jīng)絲啟動子；Byrne和Ruddle (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477)，胰腺特異性啟動子(Edlund等人(1985) Science 230:912-916)，以及乳腺特異性啟動子(例如，乳清(milk whey)啟動子；美國專利號4,873,316和歐洲申請公開號264,166)。還涵蓋發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子，例如，鼠科動物同源框蛋白(hox)啟動子(Kessel和Gruss (1990) Science 249:374-379)和甲胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman (1989) Genes Dev.3:537-546)。

在一些實施方案中，調(diào)節(jié)元件可操作連接至CRISPR系統(tǒng)的一個或多個元件，從而驅(qū)動該CRISPR系統(tǒng)的一個或多個元件的表達。一般而言，CRISPR(成簇規(guī)律間隔短回文重復)，也稱為SPIDR(SPacer間隔開的直接重復)，構(gòu)成通常對于特定細菌物種特異性的DNA基因座的家族。CRISPR基因座包含在大腸桿菌中被識別的間隔的短序列重復(SSR)的不同類別(Ishino等人(1987) J. Bacteriol., 169:5429-5433;和Nakata等人(1989) J.Bacteriol., 171:3553-3556)、以及相關(guān)基因。類似的間隔的SSR已經(jīng)鑒定于地中海富鹽菌(Haloferax mediterranei)、化膿性鏈球菌、魚腥藻屬、和結(jié)核分枝桿菌中(Groenen等人(1993) Mol.Microbiol., 10:1057-1065; Hoe等人(1999) Emerg.Infect.Dis., 5:254-263; Masepohl等人(1996) Biochim.Biophys.Acta 1307:26-30;和Mojica等人(1995) Mol.Microbiol., 17:85-93)。所述CRISPR基因座與其他SSR的不同通常在于重復結(jié)構(gòu)，其已被稱為短的規(guī)律間隔重復(SRSR)(Janssen等人(2002) OMICS J. Integ.Biol., 6:23-33;和Mojica等人(2000) Mol.Microbiol., 36:244-246)。一般而言，所述重復是成簇存在的短元件，其被具有基本上恒定長度的獨特間插序列規(guī)律地間隔開(Mojica等人(2000) Mol.Microbiol., 36:244-246)。盡管重復序列在菌株之間是高度保守的，但間隔開的重復的數(shù)目和所述間隔區(qū)的序列一般在菌株與菌株之間不同(van Embden等人(2000) J.Bacteriol., 182:2393-2401)。已經(jīng)在超過40種原核生物中鑒定到CRISPR基因座(參見，例如，Jansen等人(2002) Mol.Microbiol., 43:1565-1575;和Mojica等人(2005) J.Mol.Evol.60:174-82)，所述原核生物包括但不限于：氣火菌屬(Aeropyrum)、熱棒菌屬(Pyrobaculum)、硫化葉菌屬(Sulfolobus)、古球菌屬(Archaeoglobus)、鹽盒菌屬(Halocarcula)、甲烷桿菌屬(Methanobacteriumn)、甲烷球菌屬(Methanococcus)、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)、甲烷火菌屬(Methanopyrus)、熱球菌屬(Pyrococcus)、嗜酸菌屬(Picrophilus)、熱原體屬(Thernioplasnia)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、產(chǎn)水菌屬(Aquifrx)、卟啉單胞菌屬(Porphvromonas)、綠菌屬(Chlorobium)、棲熱菌屬(Thermus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、李斯特菌屬(Listeria)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、梭菌屬(Clostridium)、熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)、支原體屬(Mycoplasma)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、固氮弓菌屬(Azarcus)、色桿菌屬(Chromobacterium)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、地桿菌屬(Geobacter)、粘球菌屬(Myrococcus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、沃林氏菌屬(Wolinella)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、埃希氏菌屬(Escherichia)、軍團菌屬(Legionella)、甲基球菌屬(Methylococcus)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、沙門氏菌屬(Salmonella)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、密螺旋體屬(Treponema)和棲熱袍菌屬(Thermotoga)。

一般而言，“CRISPR系統(tǒng)”總體是指轉(zhuǎn)錄物和參與CRISPR相關(guān)(“Cas”)基因的表達或引導其活性的其他元件，包括編碼Cas基因的序列、向?qū)蛄?在內(nèi)源CRISPR系統(tǒng)背景下也稱為“間隔區(qū)”)、或來自CRISPR基因座的其他序列和轉(zhuǎn)錄物。在一些實施方案中，CRISPR系統(tǒng)的一個或多個元件來源于I型、II型、或III型CRISPR系統(tǒng)。在一些實施方案中，CRISPR系統(tǒng)的一個或多個元件來源于包含內(nèi)源CRISPR系統(tǒng)的特殊生物，諸如化膿性鏈球菌。一般而言，CRISPR系統(tǒng)的特征在于促進在靶序列的位點處的CRISPR復合物(在內(nèi)源CRISPR系統(tǒng)的背景下也稱為前間區(qū))的形成的元件。

在CRISPR復合物形成的背景下，“靶序列”是指向?qū)蛄斜辉O(shè)計為對其具有互補性的序列，其中在靶序列和向?qū)蛄兄g的雜交促進CRISPR復合物的形成。完全互補性不是必需的，條件是存在足夠互補性以引起雜交并且促進CRISPR復合物的形成。靶序列可以包含任何多核苷酸，諸如DNA或RNA多核苷酸。在一些實施方案中，靶序列位于細胞的核或細胞質(zhì)中。在一些實施方案中，靶序列可位于真核細胞的細胞器例如線粒體或葉綠體內(nèi)。可用于重組至包含該靶序列的靶基因座中的序列或模板被稱為“編輯模板”或“編輯多核苷酸”或“編輯序列”。在本公開主題的方面，外源模板多核苷酸可被稱為編輯模板。在本公開主題的一個方面，重組是同源重組。

在一些實施方案中，載體包含一個或多個插入位點，諸如限制性核酸內(nèi)切酶識別序列(也稱為“克隆位點”)。在一些實施方案中，一個或多個插入位點(例如，約或多于約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、或更多個插入位點)位于一種或多種載體的一個或多個序列元件的上游和/或下游。當使用多個不同的向?qū)蛄袝r，可以使用單個表達構(gòu)建體來將CRISPR活性靶向至細胞內(nèi)的多個不同的相應(yīng)靶序列。例如，單個載體可以包含約或多于約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20個、或更多個向?qū)蛄?。在一些實施方案中，可以提供約或多于約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、或更多個含有此類向?qū)蛄械妮d體，并且任選地將其遞送至細胞。

在一些實施方案中，載體包含可操作連接至編碼CRISPR酶(諸如Cas蛋白)的酶編碼序列的調(diào)節(jié)元件。Cas蛋白的非限制性實例包括：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (也稱為Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同系物、或其修飾版本。這些酶是已知的；例如，化膿性鏈球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可見于SwissProt數(shù)據(jù)庫的登錄號Q99ZW2下。在一些實施方案中，未修飾的CRISPR酶具有DNA切割活性，諸如Cas9。在一些實施方案中，所述CRISPR酶是Cas9，并且可以是來自化膿性鏈球菌或肺炎鏈球菌的Cas9。

在一些實施方案中，CRISPR酶引導在靶序列位置處(諸如在靶序列內(nèi)和/或在靶序列的互補物內(nèi))的一條鏈或兩條鏈的切割。在一些實施方案中，CRISPR酶引導距靶序列的第一個或最后一個核苷酸約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500個、或更多個堿基對內(nèi)的一條鏈或兩條鏈的切割。在一些實施方案中，載體編碼相對于相應(yīng)的野生型酶被突變的CRISPR酶，使得突變的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一條鏈和兩條鏈的能力。

在一些實施方案中，編碼CRISPR酶的酶編碼序列針對在特定的細胞諸如真核細胞中表達進行密碼子優(yōu)化。所述真核細胞可以是特定生物的那些或來源于特定生物，所述特定生物諸如哺乳動物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗、或非人靈長類動物。一般而言，密碼子優(yōu)化是指通過用在宿主細胞的基因中更頻繁地或者最頻繁地使用的密碼子代替天然序列的至少一個密碼子(例如約或多于約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個、或更多個密碼子、同時維持天然氨基酸序列而修飾核酸序列用于增強在目標宿主細胞中的表達的方法。各種物種對于特定氨基酸的某些密碼子展現(xiàn)特定的偏好。密碼子偏好性(在生物體之間的密碼子使用的差異)經(jīng)常與信使RNA(mRNA)的翻譯效率相關(guān)，而該翻譯效率據(jù)信依賴于(除其他之外)所翻譯的密碼子的特性和特定的轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)分子的可用性。細胞內(nèi)選定的tRNA的優(yōu)勢一般反映了最頻繁用于肽合成的密碼子。因此，可以基于密碼子優(yōu)化將基因定制為在給定生物中的最佳基因表達。密碼子使用表可以容易地獲得，例如在“Codon Usage Database”，并且這些表可以通過不同的方式調(diào)整適用。參見，Nakamura等人(2000) Nucl.Acids Res.28:292。針對在特定的宿主細胞中表達而密碼子優(yōu)化特定的序列的計算機算法也是可得的，諸如Gene Forge (Aptagen; Jacobus, Pa.)，也是可得的。在一些實施方案中，在編碼CRISPR酶的序列中的一個或多個密碼子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個、或更多個、或所有密碼子)相應(yīng)于對于特定氨基酸最頻繁使用的密碼子。

一般而言，向?qū)蛄惺桥c靶多核苷酸序列具有足夠互補性以便與該靶序列雜交并且引導CRISPR復合物與靶序列的序列特異性結(jié)合的任何多核苷酸序列。在一些實施方案中，當使用合適的比對算法進行最佳比對時，在向?qū)蛄泻推湎鄳?yīng)的靶序列之間的互補性程度是約或多于約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、或更多?？梢允褂糜糜诒葘π蛄械娜魏魏线m的算法來確定最佳比對，所述算法的非限制性實例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler轉(zhuǎn)換的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.)、SOAP (可得自soap.genomics.org.cn)和Maq (可得自maq.sourceforge.net)。在一些實施方案中，向?qū)蛄虚L度為約或多于約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75個、或更多個核苷酸。在一些實施方案中，向?qū)蛄虚L度為少于約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12個、或更少的核苷酸。

可以通過任何合適的測定法來評價向?qū)蛄幸龑RISPR復合物與靶序列的序列特異性結(jié)合的能力。例如，足以形成CRISPR復合物的CRISPR系統(tǒng)的組分，包括待測試的向?qū)蛄?，可以諸如通過用編碼該CRISPR序列的組分的載體進行轉(zhuǎn)染而被提供至具有相應(yīng)靶序列的宿主細胞，隨后通過如本文所述的Surveyer測定來評價靶序列內(nèi)的優(yōu)先切割。類似地，通過提供靶序列、CRISPR復合物的組分，包括待測試的向?qū)蛄泻筒煌跍y試向?qū)蛄械膶φ障驅(qū)蛄校⑶冶容^在測試和對照向?qū)蛄蟹磻?yīng)之間的靶序列處的結(jié)合或切割率，可以在試管中評估靶多核苷酸序列的切割。其他測定法是可能的，并且將由本領(lǐng)域技術(shù)人員想到。

可以選擇向?qū)蛄幸园邢蛉魏伟行蛄?。在一些實施方案中，所述靶序列是細胞基因組內(nèi)的序列。示例性靶序列包括在靶基因組中獨特的那些。

在一些實施方案中，CRISPR酶是包含一個或多個異源蛋白結(jié)構(gòu)域(例如除了CRISPR酶之外，約或多于約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、或更多個結(jié)構(gòu)域)的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何額外蛋白序列，以及任選地在任何兩個結(jié)構(gòu)域之間的連接序列?？梢匀诤现罜RISPR酶的蛋白結(jié)構(gòu)域的實例包括但不限于，表位標簽、報道基因序列、以及具有下列活性中的一種或多種的蛋白結(jié)構(gòu)域：甲基酶活性、脫甲基酶活性、轉(zhuǎn)錄激活活性、轉(zhuǎn)錄抑制活性、轉(zhuǎn)錄釋放因子活性、組蛋白修飾活性、RNA切割活性和核酸結(jié)合活性。表位標簽的非限制性實例包括組氨酸(His)標簽、V5標簽、FLAG標簽、流感血凝素(HA)標簽、Myc標簽、VSV-G標簽、和硫氧還蛋白(Trx)標簽。報道基因的實例包括，但不限于，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、辣根過氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、熒光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色熒光蛋白(CFP)、黃色熒光蛋白(YFP)以及自發(fā)熒光蛋白，包括藍色熒光蛋白(BFP)。CRISPR酶可以融合至編碼蛋白或蛋白片段的基因序列，所述蛋白或蛋白片段結(jié)合DNA分子或結(jié)合其他細胞分子，包括，但不限于，麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、S-標簽、Lex A DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)融合體、GAL4A DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合體、以及單純皰疹病毒(HSV)BP16蛋白融合體。可以形成包含CR ISPR酶的融合蛋白的一部分的額外的結(jié)構(gòu)域描述于US20110059502中，其通過引用并入本文。在一些實施方案中，使用標記的CRISPR酶來鑒定靶序列的位置。

在本公開主題的一個方面，可以將報道基因引入細胞中，以編碼充當測量基因產(chǎn)物的表達的改變或修飾的標記物的基因產(chǎn)物，所述報道基因包括但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、辣根過氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、熒光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色熒光蛋白(CFP)、黃色熒光蛋白(YFP)以及自發(fā)熒光蛋白，包括藍色熒光蛋白(BFP)。在本公開主題的一個進一步實施方案中，可以經(jīng)由載體將編碼基因產(chǎn)物的DNA分子引入細胞中。在本公開主題的一個優(yōu)選實施方案中，所述基因產(chǎn)物是熒光素酶。在本公開主題的一個進一步實施方案中，基因產(chǎn)物的表達減少。

通常，本公開主題的啟動子實施方案包含：1)完整Pol III啟動子，其包括TATA盒、近端序列元件(PSE)和遠端序列元件(DSE)；和2)第二基礎(chǔ)Pol III啟動子，其包括以相反方向與DSE的5'末端融合的PSE和TATA盒。以其核苷酸序列命名的TATA盒是Pol III特異性的主要決定因素。其通常位于相對于轉(zhuǎn)錄序列的nt-23和-30之間的位置，并且是轉(zhuǎn)錄序列的開始的主要決定因素。PSE通常位于nt-45和-66之間。DSE增強基礎(chǔ)Pol III啟動子的活性。在H1啟動子中，在PSE和DSE之間沒有間隙。

雙向啟動子由以下組成：1)完整的、常規(guī)的、單向的Pol III啟動子，其含有3個外部控制元件：DSE、PSE和TATA盒；和2)第二基礎(chǔ)Pol III啟動子，其包括以相反方向與DSE的5'末端融合的PSE和TATA盒。被TATA結(jié)合蛋白識別的TATA盒對于將Pol III募集至啟動子區(qū)是必需的。TATA結(jié)合蛋白與TATA盒的結(jié)合通過SNAPc與PSE的相互作用穩(wěn)定化。一同地，這些元件正確定位Pol III，使得其可以轉(zhuǎn)錄表達的序列。DSE對于Pol III啟動子的完全活性也是必需的(Murphy等人(1992) Mol.Cell Biol.12:3247-3261; Mittal等人(1996) Mol.Cell Biol.16:1955-1965; Ford和Hernandez (1997) J.Biol.Chem., 272:16048-16055; Ford等人(1998) Genes, Dev., 12:3528-3540; Hovde等人(2002) GenesDev.16:2772-2777)。轉(zhuǎn)錄因子Oct-1和/或SBF/Staf與其在DSE內(nèi)的基序的相互作用使轉(zhuǎn)錄增強最多達100倍(Kunkel和Hixon (1998) Nucl.Acid Res., 26:1536-1543)。由于正向和反向取向的基礎(chǔ)啟動子引導在雙鏈DNA模板的相對鏈上的序列的轉(zhuǎn)錄，所以反向取向的基礎(chǔ)啟動子的正鏈附接至DSE的負鏈的5'末端。在H1啟動子控制下表達的轉(zhuǎn)錄物由4或5個T的未斷裂序列終止。

在H1啟動子中，DSE與PSE和TATA盒相鄰(Myslinski等人(2001) Nucl.AcidRes.29:2502-2509)。為了盡可能減少序列重復，通過產(chǎn)生雜交啟動子使該啟動子雙向，其中通過附接源自U6啟動子的PSE和TATA盒來控制反向轉(zhuǎn)錄。為了促進雙向H1啟動子的構(gòu)建，也可以在反向取向的基礎(chǔ)啟動子和DSE之間插入小間隔序列。

B.方法

在一些實施方案中，本公開主題還提供改變細胞中的一種或多種基因產(chǎn)物的表達的方法，其中所述細胞包含編碼一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子，所述方法包括將包含一種或多種載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)引入所述細胞中，所述載體包含：a)H1啟動子，其可操作連接至編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列，其中所述gRNA與所述DNA分子的靶序列雜交，和b)在細胞中可操作的調(diào)節(jié)元件，其可操作連接至編碼Cas9蛋白的核苷酸序列，其中組件(a)和(b)位于所述系統(tǒng)的相同或不同的載體上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改變一種或多種基因產(chǎn)物的表達。

在一些實施方案中，本公開主題還提供改變真核細胞中的一種或多種基因產(chǎn)物的表達的方法，其中所述細胞包含編碼一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子，所述方法包括將包含一種或多種載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)引入所述細胞中，所述載體包含：a)H1啟動子，其可操作連接至編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列，其中所述gRNA與所述DNA分子的靶序列雜交，和b)在真核細胞中可操作的調(diào)節(jié)元件，其可操作連接至編碼II型Cas9蛋白的核苷酸序列，由其中組件(a)和(b)位于所述系統(tǒng)的相同或不同的載體上，由此所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子，且由此改變一種或多種基因產(chǎn)物的表達。在一個方面，所述靶序列可以是以任何核苷酸開始的靶序列，例如N₂₀NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列GN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列CN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列TN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG或GN₁₉NGG。在另一個方面，將所述Cas9蛋白針對細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在又另一個方面，將所述Cas9蛋白針對真核細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在一個進一步方面，所述真核細胞是哺乳動物或人細胞。在另一個方面，一種或多種基因產(chǎn)物的表達減少。

本公開主題還提供改變真核細胞中的一種或多種基因產(chǎn)物的表達的方法，其中所述細胞包含編碼一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子，所述方法包括將包含含有雙向H1啟動子的載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)引入所述細胞中，其中所述雙向H1啟動子包含：a)控制元件，其提供編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列在一個方向的轉(zhuǎn)錄，其中所述gRNA與所述DNA分子的靶序列雜交，和b)控制元件，其提供編碼II型Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的轉(zhuǎn)錄，由此所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子，且由此改變一種或多種基因產(chǎn)物的表達。在一個方面，所述靶序列可以是以任何核苷酸開始的靶序列，例如N₂₀NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列GN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列CN₁₉NGG。在一些實施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列TN₁₉NGG。在另一個方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN₁₉NGG或GN₁₉NGG。在另一個方面，將所述Cas9蛋白針對細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在又另一個方面，將所述Cas9蛋白針對真核細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。在一個進一步方面，所述真核細胞是哺乳動物或人細胞。在另一個方面，一種或多種基因產(chǎn)物的表達減少。

在一些方面，本公開主題提供這樣的方法，其包括向宿主細胞遞送一種或多種多核苷酸，諸如或如本文所述的一種或多種載體、其一種或多種轉(zhuǎn)錄物和/或一種或多種由其轉(zhuǎn)錄的蛋白。在一些方面，本公開主題進一步提供通過此類方法產(chǎn)生的細胞以及包含此類細胞或由此類細胞產(chǎn)生的生物體(諸如動物、植物、或真菌)。在一些實施方案中，將與(并且任選地與其復合)向?qū)蛄薪M合的CRISPR酶遞送至細胞。可以使用常規(guī)的基于病毒和非病毒的基因轉(zhuǎn)移方法來將核酸引入哺乳動物細胞或靶組織中?？梢允褂么祟惙椒▉硐蚺囵B(yǎng)物中或宿主生物中的細胞施用編碼CRISPR系統(tǒng)的組分的核酸。非病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA質(zhì)粒、RNA(例如本文描述的載體的轉(zhuǎn)錄物)、裸核酸以及與遞送媒介物(諸如脂質(zhì)體)復合的核酸。病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA和RNA病毒，其在被遞送至細胞后具有附加型或整合型基因組。對于基因療法程序的綜述，參見Anderson (1992) Science 256:808-813; Nabel和Felgner (1993) TIBTECH 11:211-217; Mitani和Caskey (1993) TIBTECH 11:162-166; Dillon (1993) TIBTECH 11:167-175; Miller (1992) Nature 357:455-460; Van Brunt (1998) Biotechnology 6(10):1149-1154; Vigne (1995) RestorativeNeurologyandNeuroscience 8:35-36; Kremer和Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1):31-44; Haddada等人(1995) Current Topics in Microbiology and Immunology.Doerfler和Bohm (編);和Yu等人(1994) Gene Therapy1:13-26。

核酸的非病毒遞送方法包括脂轉(zhuǎn)染、核轉(zhuǎn)染、顯微注射、基因槍、病毒體、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、聚陽離子或脂質(zhì)：核酸綴合物、裸DNA、人工病毒粒子以及DNA的試劑增強性攝取。脂轉(zhuǎn)染描述于例如美國專利號5,049,386、4,946,787和4,897,355中并且脂轉(zhuǎn)染試劑是市售的(例如，Transfectam?和Lipofectin?)。適合于多核苷酸的有效的受體識別脂轉(zhuǎn)染的陽離子和中性脂質(zhì)包括Felgner，WO 91/17424；WO 91/16024的那些。遞送可以針對細胞(例如體外或離體施用)或靶組織(例如體內(nèi)施用)。

脂質(zhì):核酸復合物(包括靶向的脂質(zhì)體，諸如免疫脂質(zhì)復合物)的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(例如，Crystal (1995) Science 270:404-410; Blaese等人(1995) Cancer Gene Ther.2:291-297:Behr等人(1994) Bioconjugate Chem.5:382-389; Remy等人(1994) Bioconjugate Chem.5:647-654; Gao等人(1995) Gene Therapy 2:710-722; Ahmad等人(1992) Cancer Res.52:4817-4820; 美國專利號4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。

使用基于RNA或DNA病毒的用于遞送核酸的系統(tǒng)利用用于將病毒靶向至體內(nèi)的特定細胞并將病毒有效負荷(payload)轉(zhuǎn)運至核的高度進化的過程。可以將病毒載體直接施用于患者(體內(nèi))或可以使用它們在體外處理細胞，并且任選地，可以將修飾的細胞施用于患者(離體)。常規(guī)的基于病毒的系統(tǒng)可以包括用于基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體以及單純皰疹病毒載體。用逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒基因轉(zhuǎn)移方法整合于宿主基因組中是可能的，這通常導致插入轉(zhuǎn)基因的長期表達。另外，已經(jīng)在不同細胞類型和靶組織中觀察到高轉(zhuǎn)導效率。

可以通過并入外源包膜蛋白、擴展靶細胞的潛在靶群而改變逆轉(zhuǎn)錄病毒的向性。慢病毒載體是能夠轉(zhuǎn)導或感染非分裂細胞并通常產(chǎn)生較高病毒滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的選擇將依賴于靶組織。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由順式作用長末端重復組成，所述長末端重復具有最多達6-10 kb的外源序列的包裝容量。最小順式作用LTR對于載體的復制和包裝是足夠的，其然后用于將治療基因整合入靶細胞中，以提供永久的轉(zhuǎn)基因表達。廣泛使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)及其組合的那些(例如，Buchscher等人(1992) J. Virol.66:2731-2739; Johann等人(1992) J. Virol.66:1635-1640; Sommnerfelt等人(1990) J. Virol.176:58-59; Wilson等人(1989) J. Virol.63:2374-2378; Miller等人(1991) J. Virol.65:2220-2224; PCT/US94/05700)。在瞬時表達是優(yōu)選的應(yīng)用中，可以使用基于腺病毒的系統(tǒng)?；谙俨《镜妮d體在許多細胞類型中能夠具有非常高的轉(zhuǎn)導效率并且無需細胞分裂。用此類載體，已經(jīng)獲得了較高的滴度和表達水平?？梢栽谙鄬唵蔚南到y(tǒng)中大量產(chǎn)生此載體。還可以使用腺相關(guān)病毒(“AAV”)載體轉(zhuǎn)導具有靶核酸的細胞，例如，在體外產(chǎn)生核酸和肽，以及用于體內(nèi)和離體基因療法程序(參見例如，West等人(1987) Virology 160:38-47; 美國專利號4,797,368; WO 93/24641; Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin.Invest.94:1351)。重組AAV載體的構(gòu)建描述于多個出版物，包括美國專利號5,173,414；Tratschin等人(1985) Mol.Cell.Biol.5:3251-3260; Tratschin等人(1984) Mol.Cell.Biol.4:2072-2081; Hermonat和Muzyczka (1984) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470;和Samulski等人(1989) J. Virol.63:03822-3828。

通常使用包裝細胞來形成能夠感染宿主細胞的病毒粒子。此類細胞包括包裝腺病毒的293細胞和包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒的ψ2細胞或PA317細胞。在基因療法中使用的病毒載體通常通過產(chǎn)生將核酸載體包裝入病毒粒子的細胞系來產(chǎn)生。這些載體通常含有包裝并且隨后整合至宿主中所需的最小病毒序列，其他病毒序列由待表達的多核苷酸的表達盒替換。失去的病毒功能通常由包裝細胞系反式提供。例如，在基因療法中使用的AAV載體通常僅具有來自AAV基因組的ITR序列，其為包裝并整合至宿主基因組中所需。將病毒DNA包裝至這樣的細胞系中，所述細胞系含有編碼其他AAV基因(即rep和cap)、但缺少ITR序列的輔助質(zhì)粒。該細胞系還可以被作為輔助者的腺病毒感染。該輔助病毒促進AAV載體的復制和從輔助質(zhì)粒表達AAV基因。由于缺少ITR序列，未以顯著的量包裝該輔助質(zhì)粒?？梢酝ㄟ^例如腺病毒與AAV相比更加敏感的熱處理減少腺病毒的污染。用于將核酸遞送至細胞的額外方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如通過引用并入本文的US 20030087817。

在一些實施方案中，用一種或多種本文描述的載體瞬時地或非瞬時地轉(zhuǎn)染宿主細胞。在一些實施方案中，當細胞天然地出現(xiàn)在主體內(nèi)時將其轉(zhuǎn)染。在一些實施方案中，被轉(zhuǎn)染的細胞取自主體。在一些實施方案中，該細胞來源于取自主體的細胞，諸如細胞系。用于組織培養(yǎng)的多種多樣的細胞系是本領(lǐng)域中已知的。細胞系的實例包括但不限于，C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLa-S3、Huh1、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panel、PC-3、TF1、CTLL-2、C1R、Rat6、CV1、RPTE、A10、T24、J82、A375、ARH-77、Calu1、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388D1、SEM-K2、WEHI-231、HB56、TIB55、Jurkat、J45.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、Hep G2、HeLa B、HeLa T4、COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1猴腎上皮細胞、BALB/3T3小鼠胚胎成纖維細胞、3T3 Swiss、3T3-L1、132-d5人類胎兒成纖維細胞；10.1小鼠成纖維細胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-1細胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C3H-10T1/2、C6/36、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-K1、CHO-K2、CHO-T、CHO Dhfr ?/?、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L23/5010、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CML T1、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepa1c1c7、HL-60、HMEC、HT-29、Jurkat、JY細胞、K562細胞、Ku812、KCL22、KG1、KYO1、LNCap、Ma-MeI 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCK II、MDCK II、MOR/0.2R、MONO-MAC 6、MTD-1A、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT細胞系、Peer、PNT-1A/PNT 2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2細胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THP1細胞系、U373、U87、U937、VCaP、Vero細胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR及其轉(zhuǎn)基因變種。細胞系可得自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種來源(參見例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(Manassus, Va.))。在一些實施方案中，使用用一種或多種本文描述的載體轉(zhuǎn)染的細胞建立包含一種或多種載體來源的序列的新的細胞系。在一些實施方案中，使用用如本文描述的CRISPR系統(tǒng)的組分瞬時轉(zhuǎn)染(諸如通過一種或多種載體的瞬時轉(zhuǎn)染或RNA轉(zhuǎn)染)且通過CRISPR復合物的活性修飾的細胞建立新的細胞系，所述新的細胞系包含以下細胞，所述細胞含有修飾、但缺乏任何其他外源序列。在一些實施方案中，在評價一種或多種測試化合物中使用用一種或多種本文描述的載體瞬時或非瞬時轉(zhuǎn)染的細胞或來源于此類細胞的細胞系。

在一些實施方案中，使用一種或多種本文描述的載體來產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動物。在一些實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因動物是哺乳動物，諸如小鼠、大鼠或兔。在某些實施方案中，所述生物體或主體是植物。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且通常以細胞轉(zhuǎn)染方法(諸如如本文描述的細胞轉(zhuǎn)染方法)開始。

在一個方面，本公開主題提供修飾真核細胞中的靶多核苷酸的方法，其可以是體內(nèi)、離體或體外的。在一些實施方案中，所述方法包括從人或非人動物取樣細胞或細胞群，且修飾一個或多個細胞。培養(yǎng)可以在任何階段離體發(fā)生。所述一個或多個細胞甚至可以被重新引入非人動物中。

在一個方面，本公開主題提供用于修飾真核細胞中的靶多核苷酸的方法。在一些實施方案中，所述方法包括允許CRISPR復合物結(jié)合至靶多核苷酸以實施所述靶多核苷酸的切割，由此修飾靶多核苷酸，其中所述CRISPR復合物包含與雜交至所述靶多核苷酸內(nèi)的靶序列的向?qū)蛄袕秃系腃RISPR酶。

在一個方面，本公開主題提供修飾多核苷酸在真核細胞中的表達的方法。在一些實施方案中，所述方法包括允許CRISPR復合物結(jié)合至多核苷酸，使得所述結(jié)合導致所述多核苷酸的表達增加或減少；其中所述CRISPR復合物包含與雜交至所述多核苷酸內(nèi)的靶序列的向?qū)蛄袕秃系腃RISPR酶。

在一個方面，本公開主題提供用于使用CRISPR系統(tǒng)的一個或多個元件的方法。本公開主題的CRISPR復合物提供用于修飾靶多核苷酸的有效方式。本公開主題的CRISPR復合物具有多種多樣的效用，包括修飾(例如，缺失、插入、轉(zhuǎn)位、失活、激活)多種細胞類型中的靶多核苷酸。因此，本公開主題的CRISPR復合物在例如基因療法、藥物篩選、疾病診斷和預后中具有廣泛范圍的應(yīng)用。示例性CRISPR復合物包含與雜交至靶多核苷酸內(nèi)的靶序列的向?qū)蛄袕秃系腃RISPR酶。

CRISPR復合物的靶多核苷酸可以是對真核細胞而言內(nèi)源或外源的任何多核苷酸。例如，所述靶多核苷酸可以是駐留在真核細胞的核中的多核苷酸。所述靶多核苷酸可以是編碼基因產(chǎn)物(例如，蛋白)的序列或非編碼序列(例如，調(diào)節(jié)多核苷酸或垃圾DNA)。不希望受理論束縛，據(jù)信所述靶序列應(yīng)當與PAM(前間區(qū)序列鄰近基序)相關(guān)；也就是說，與由CRISPR復合物識別的短序列相關(guān)。對PAM的精確序列和長度要求取決于使用的CRISPR酶而不同，但PAM通常是臨近前間區(qū)(也就是說，靶序列)的2-5個堿基對序列。在以下實施例部分中給出PAM序列的實例，并且技術(shù)人員將能夠鑒定與給定CRISPR酶一起使用的另外的PAM序列。

靶多核苷酸的實例包括與信號傳導生化途徑相關(guān)的序列，例如信號傳導生化途徑相關(guān)的基因或多核苷酸。靶多核苷酸的實例包括疾病相關(guān)基因或多核苷酸。“疾病相關(guān)”基因或多核苷酸是指與非疾病對照的組織或細胞相比，在來源于疾病影響的組織的細胞中以異常水平或以異常形式產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物的任何基因或多核苷酸。在改變的表達與疾病的出現(xiàn)和/或進展相關(guān)的情況下，其可以是以異常高的水平變得表達的基因；其可以是以異常低的水平變得表達的基因。疾病相關(guān)基因還指具有突變或直接負責或與負責疾病的病因?qū)W的基因連鎖不平衡的遺傳變異的基因。轉(zhuǎn)錄或翻譯的產(chǎn)物可以是已知的或未知的，并且可以處于正?；虍惓Ｋ?。

本公開主題的實施方案還涉及與敲除基因、擴增基因以及修復與DNA重復不穩(wěn)定性和神經(jīng)病癥相關(guān)的具體突變相關(guān)的方法和組合物(Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, 第2版, Academic Press, Oct. 13, 2011-Medical)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復序列的特定方面負責超過二十種人類疾病 (McIvor 等人(2010) RNA Biol. 7(5):551-8)?？梢岳肅RISPR-Cas系統(tǒng)以校正這些基因組不穩(wěn)定性的缺陷。

在本公開主題的又另一個方面，CRISPR-Cas系統(tǒng)可以用來校正起因于幾種基因突變的眼部缺陷，其進一步描述于Traboulsi, 編 (2012) Genetic Diseases of the Eye, 第2版, Oxford University Press。

本公開主題的幾個進一步方面涉及校正與廣泛范圍的遺傳性疾病相關(guān)的缺陷。例如，遺傳性腦病可以包括但不限于，腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、胼胝體發(fā)育不全、艾卡爾迪綜合征(Aicardi Syndrome)、阿爾佩斯病(Alpers' Disease)、阿爾茨海默氏病、巴特綜合征(Barth Syndrome)、巴滕病(Batten Disease)、CADASIL、小腦變性、法布瑞氏病(Fabry's Disease)、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、亨廷頓氏病和其他三聯(lián)體重復障礙、萊氏病(Leigh's Disease)、萊施-奈恩綜合征(Lesch-Nyhan Syndrome)、門克斯病(Menkes Disease)、線粒體肌病以及NINDS空洞腦(Colpocephaly)。

在一些實施方案中，所述病況可以是瘤形成。在一些實施方案中，所述病況可以是年齡相關(guān)性黃斑變性。在一些實施方案中，所述病況可以是精神分裂性障礙。在一些實施方案中，所述病況可以是三核苷酸重復障礙。在一些實施方案中，所述病況可以是脆性X綜合征。在一些實施方案中，所述病況可以是分泌酶相關(guān)障礙。在一些實施方案中，所述病況可以是朊病毒相關(guān)障礙。在一些實施方案中，所述病況可以是ALS。在一些實施方案中，所述病況可以是藥物成癮。在一些實施方案中，所述病況可以是自閉癥。在一些實施方案中，所述病況可以是阿爾茨海默氏病。在一些實施方案中，所述病況可以是炎癥。在一些實施方案中，所述病況可以是帕金森氏病。

與帕金森氏病相關(guān)的蛋白的實例包括但不限于α-突觸核蛋白、DJ-1、LRRK2、PINK1、帕金蛋白、UCHL1、Synphilin-1和NURR1。

成癮相關(guān)蛋白的實例可以包括例如ABAT。

炎癥相關(guān)蛋白的實例可以包括例如由Ccr2基因編碼的單核細胞趨化蛋白-1(MCP1)、由Ccr5基因編碼的C-C趨化因子受體類型5(CCR5)、由Fcgr2b基因編碼的IgG受體IIB(FCGR2b，也稱為CD32)或由Fcer1g基因編碼的Fc ε R1g(FCER1g)蛋白。

心血管疾病相關(guān)蛋白的實例可以包括例如IL1B(白介素1，β)、XDH(黃嘌呤脫氫酶)、TP53(腫瘤蛋白p53)、PTGIS(前列腺素12(前列腺環(huán)素)合酶)、MB(肌紅蛋白)、IL4(白介素4)、ANGPT1(血管生成素1)、ABCG8(ATP-結(jié)合盒，亞家族G(WHITE)，成員8)或CTSK(組織蛋白酶K)。

阿爾茨海默氏病相關(guān)蛋白的實例可以包括例如由VLDLR基因編碼的極低密度脂蛋白受體蛋白(VLDLR)、由UBA1基因編碼的泛素樣修飾劑激活酶1(UBA1)或由UBA3基因編碼的NEDD8-激活酶E1催化亞基蛋白(UBE1C)。

自閉癥譜系障礙相關(guān)蛋白的實例可以包括例如由BZRAP1基因編碼的苯二氮?受體(外周)相關(guān)蛋白1(BZRAP1)、由AFF2基因編碼的AF4/FMR2家族成員2蛋白(AFF2)(也稱為MFR2)、由FXR1基因編碼的脆性X智力遲鈍常染色體同系物1蛋白(FXR1)或由FXR2基因編碼的脆性X智力遲鈍常染色體同系物2蛋白(FXR2)。

黃斑變性相關(guān)蛋白的實例可以包括例如由ABCR基因編碼的ATP-結(jié)合盒，亞家族A(ABC1)成員4蛋白(ABCA4)、由APOE基因編碼的載脂蛋白E蛋白(APOE)或由CCL2基因編碼的趨化因子(C-C基序)配體2蛋白(CCL2)。

精神分裂癥相關(guān)蛋白的實例可以包括NRG1、ErbB4、CPLX1、TPH1、TPH2、NRXN1、GSK3A、BDNF、DISC1、GSK3B及其組合。

參與腫瘤抑制的蛋白的實例可以包括例如ATM(共濟失調(diào)性毛細血管擴張突變的)、ATR(共濟失調(diào)性毛細血管擴張和Rad3相關(guān)的)、EGFR(表皮生長因子受體)、ERBB2(v-erb-b2成紅細胞白血病病毒癌基因同系物2)、ERBB3(v-erb-b2成紅細胞白血病病毒癌基因同系物3)、ERBB4(v-erb-b2成紅細胞白血病病毒癌基因同系物4)、Notch 1、Notch 2、Notch 3或Notch 4。

與分泌酶障礙相關(guān)的蛋白的實例可以包括例如PSENEN(早老素增強子2同系物(秀麗隱桿線蟲))、CTSB(組織蛋白酶B)、PSEN1(早老素1)、APP(淀粉樣蛋白β(A4)前體蛋白)、APH1B(前咽缺陷1同系物B(秀麗隱桿線蟲))、PSEN2(早老素2(阿爾茨海默氏病4))或BACE1(β-位點APP-切割酶1)。

與肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥相關(guān)的蛋白的實例可以包括SOD1(超氧化物歧化酶1)、ALS2(肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化2)、FUS(在肉瘤中融合)、TARDBP(TAR DNA結(jié)合蛋白)、VAGFA(血管內(nèi)皮生長因子A)、VAGFB(血管內(nèi)皮生長因子B)以及VAGFC(血管內(nèi)皮生長因子C)及其任何組合。

與朊病毒病相關(guān)的蛋白的實例可以包括SOD1(超氧化物歧化酶1)、ALS2(肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化2)、FUS(在肉瘤中融合)、TARDBP(TAR DNA結(jié)合蛋白)、VAGFA(血管內(nèi)皮生長因子A)、VAGFB(血管內(nèi)皮生長因子B)以及VAGFC(血管內(nèi)皮生長因子C)及其任何組合。

與朊病毒病癥中的神經(jīng)變性病況相關(guān)的蛋白的實例可以包括例如A2M(α-2-巨球蛋白)、AATF(凋亡拮抗轉(zhuǎn)錄因子)、ACPP(前列腺的酸性磷酸酶)、ACTA2(平滑肌主動脈肌動蛋白α2)、ADAM22(ADAM金屬肽酶結(jié)構(gòu)域)、ADORA3(腺苷A3受體)或ADRA1D(α-1D腎上腺素能受體(Alpha-1D adrenergic receptor for Alpha-1D adrenoreceptor))。

與免疫缺陷相關(guān)的蛋白的實例可以包括例如A2M [α-2-巨球蛋白]；AANAT [芳烷基胺 N-乙酰轉(zhuǎn)移酶]；ABCA1 [ATP-結(jié)合盒，亞家族A(ABC1)，成員1]；ABCA2 [ATP-結(jié)合盒，亞家族A(ABC1)，成員2]；或ABCA3 [ATP-結(jié)合盒，亞家族A(ABC1)，成員3]。

與三核苷酸重復障礙相關(guān)的蛋白的實例包括例如AR(雄激素受體)、FMR1(脆性X智力遲鈍1)、HTT(亨廷頓蛋白)或DMPK(強直性肌營養(yǎng)不良蛋白激酶)、FXN(弗氏共濟失調(diào)蛋白(frataxin))、ATXN2(共濟失調(diào)蛋白2)。

與神經(jīng)傳遞障礙相關(guān)的蛋白的實例包括例如SST(生長抑素)、NOS1(一氧化氮合酶1(神經(jīng)元的))、ADRA2A(腎上腺素能的，α-2A-，受體)、ADRA2C(腎上腺素能的，α-2C-，受體)、TACR1(速激肽受體1)或HTR2c(5-羥色胺(血清素)受體2C)。

神經(jīng)發(fā)育相關(guān)序列的實例包括例如A2BP1 (共濟失調(diào)蛋白2-結(jié)合蛋白1)、AADAT (氨基己二酸氨基轉(zhuǎn)移酶)，AANAT (芳烷基胺 N-乙酰轉(zhuǎn)移酶)、ABAT (4-氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、ABCA1 (ATP-結(jié)合盒，亞家族A(ABC1)，成員1)或ABCA13 (ATP-結(jié)合盒，亞家族A(ABC1)，成員13)。

可用本系統(tǒng)治療的優(yōu)選病況的進一步實例可以選自：艾卡迪-古鐵雷斯綜合征(Aicardi-Goutières Syndrome)；亞歷山大病(Alexander Disease)；阿倫-赫恩登-達德利綜合征(Allan-Herndon-Dudley Syndrome)；POLG相關(guān)障礙；α-甘露糖苷貯積癥(II和III型)；阿爾斯特倫綜合征(Alstr?m Syndrome)；安格曼綜合征(Angelman Syndrome)；共濟失調(diào)-毛細血管擴張；神經(jīng)元蠟樣-脂褐質(zhì)沉積癥；β-地中海貧血；雙側(cè)視神經(jīng)萎縮和1型(嬰兒)視神經(jīng)萎縮；視網(wǎng)膜母細胞瘤(雙側(cè)的)；卡納萬病(Canavan Disease)；腦-眼-面-骨骼綜合征(Cerebrooculofacioskeletal Syndrome)1 [COFS1]；腦腱黃瘤?。豢颇崂麃喌咸m吉綜合征(Cornelia de Lange Syndrome)；MAPT相關(guān)障礙；遺傳性朊病毒?。坏吕f綜合征(Dravet Syndrome)；早期發(fā)病家族性阿爾茨海默氏??；弗里德賴希共濟失調(diào)[FRDA]；多發(fā)性畸形；巖藻糖苷貯積癥；福山(Fukuyama)先天性肌營養(yǎng)不良；半乳糖唾液酸貯積癥；戈謝病(Gaucher Disease)；有機酸血癥；噬血細胞淋巴組織細胞增生癥；早衰綜合征(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome)；粘脂貯積癥II；嬰兒游離唾液酸貯積?。籔LA2G6相關(guān)神經(jīng)變性；耶韋爾和朗格-尼爾森綜合征(Jervell and Lange-Nielsen Syndrome)；交界型大皰性表皮松解；亨廷頓氏?。豢死?Krabbe Disease)(嬰兒的)；線粒體DNA相關(guān)雷吉綜合征(Mitochondrial DNA-Associated Leigh Syndrome)和NARP；萊施-奈恩綜合征(Lesch-Nyhan Syndrome)；LIS1相關(guān)無腦回畸形；洛氏綜合征(Lowe Syndrome)；槭糖尿??；MECP2成倍綜合征；ATP7A相關(guān)銅轉(zhuǎn)運障礙；LAMA2相關(guān)肌營養(yǎng)不良；芳基硫酸酯酶A缺乏；I、II或III型粘多糖貯積癥；過氧化物酶體生物發(fā)生障礙，齊薇格譜系綜合征(Zellweger Syndrome Spectrum)；伴隨腦鐵累積障礙的神經(jīng)變性；酸性鞘磷脂酶缺乏；C型尼曼-皮克??；甘氨酸腦病；ARX相關(guān)障礙；尿素循環(huán)障礙；COL1A1/2相關(guān)成骨不全；線粒體DNA缺失綜合征；PLP1相關(guān)障礙；佩里綜合征(Perry Syndrome)；費倫-麥克德米德綜合征(Phelan-McDermid Syndrome)；II型糖原貯積癥(蓬佩病(Pompe Disease))(嬰兒的)；MAPT相關(guān)障礙；MECP2相關(guān)障礙；1型肢近端型點狀軟骨發(fā)育不全(Rhizomelic Chondrodysplasia Punctata Type 1)；羅伯茨綜合征(Roberts Syndrome)；桑德霍夫病(Sandhoff Disease)；辛德勒病(Schindler Disease)-1型；腺苷脫氨酶缺乏；史-倫-奧三氏綜合征(Smith-Lemli-Opitz Syndrome)；脊髓性肌萎縮；嬰兒發(fā)病脊髓小腦性共濟失調(diào)；己糖胺酶A缺乏；1型致死性發(fā)育不良；膠原VI型相關(guān)障礙；I型烏謝爾綜合征(Usher Syndrome)；先天性肌營養(yǎng)不良；沃爾夫-赫奇霍恩綜合征(Wolf-Hirschhorn Syndrome)；溶酶體酸脂酶缺乏；和著色性干皮病。

II.表達和在體內(nèi)調(diào)節(jié)GRNA表達的RNA核酶和可調(diào)節(jié)的適體酶。

本公開主題還涉及使用RNA核酶和可調(diào)節(jié)的適體酶來在體內(nèi)表達和調(diào)節(jié)gRNA表達，特別是使用5'錘頭核酶用于順式加工具有不受限的第一核苷酸特異性的向?qū)NA和在體內(nèi)通過RNA適體酶調(diào)節(jié)gRNA功能。

因此，本公開主題還提供適配子調(diào)節(jié)的核酶，其包含：a)順式作用錘頭核酶，其包含催化核心和由其延伸的螺旋I、螺旋II和螺旋III雙鏈體區(qū)，其中螺旋II雙鏈體區(qū)和螺旋III雙鏈體區(qū)各自包含與所述催化核心相對的環(huán)區(qū)域，且其中所述螺旋II雙鏈體區(qū)包含結(jié)合配體的適配子；b)編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的核苷酸序列，其中所述gRNA與真核細胞中的DNA分子的靶序列雜交，且其中所述DNA分子編碼在所述真核細胞中表達的一種或多種基因產(chǎn)物，其中所述核苷酸序列包含5'末端和3'末端，且其中所述核苷酸序列的5'末端直接偶聯(lián)至所述螺旋III雙鏈體區(qū)；其中所述配體與所述適配子的結(jié)合產(chǎn)生核酶的構(gòu)象變化，使得所述核酶經(jīng)歷在所述核苷酸序列的5'末端和所述螺旋III雙鏈體區(qū)之間的自我切割，由此產(chǎn)生gRNA。還提供表達構(gòu)建體，其包含：(i)編碼序列，其當轉(zhuǎn)錄為RNA時產(chǎn)生適配子調(diào)節(jié)的核酶；和(ii)一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，其調(diào)節(jié)真核細胞中的RNA的轉(zhuǎn)錄。還提供包含所述表達構(gòu)建體的真核細胞。還提供改變真核細胞中的一種或多種基因產(chǎn)物的表達的方法，其中所述細胞包含編碼一種或多種基因產(chǎn)物的DNA分子，所述方法包括將所述表達構(gòu)建體引入所述細胞中，且使所述細胞與所述配體以改變核酶的活性的量接觸，特別是其中所述細胞在哺乳動物或人主體中。在一個方面，所述配體是茶堿。

核酶是催化各種化學反應(yīng)諸如自我切割或連接的RNA分子(Long和Uhlenbeck (1993) FASEB J. 7:25-30)。已經(jīng)在病毒、類病毒和原生動物中鑒定了各種天然存在的核酶。在煙草環(huán)點類病毒(sTRSV)的衛(wèi)星RNA中發(fā)現(xiàn)了第一種催化性RNA之一(De la Pena等人(2003) EMBO J. 22:5561-70)。在體內(nèi)，這種致病性類病毒顯示在復制期間順式作用和自我切割。自從發(fā)現(xiàn)第一種核酶以來，已經(jīng)鑒定并廣泛表征了各種類型的天然核酶，包括發(fā)夾和錘頭核酶。

錘頭核酶(hRz)是最廣泛研究的核酶之一(Long和Uhlenbeck (1993) Faseb J. 7:25-30; Pley等人(1994) Nature 372:68-74; Hammann等人(2001) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:5503-8; Blount和Uhlenbeck (2005) Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.34:415-40)。其由聚集在11個核苷酸(nt)的高度保守的催化核心上的三個螺旋區(qū)構(gòu)成(Khvorova等人(2003) Nat. Struct.Biol.10:708-12; Salehi-Ashtiani和Szostak (2001) Nature 414:82-4)。切割是序列特異性的，并靶向5'-NUX-3'三聯(lián)體，其中N是任何堿基，U是尿嘧啶，X是除鳥嘌呤以外的任何堿基。對于有效和快速切割最佳的NUX是GUC。當將來自切割位點的直接3'的X的2'羥基去質(zhì)子化時，催化核酶切割。然后，這種親核體攻擊易裂開的磷酸酯，并通過五配位的三角雙錐形過渡態(tài)產(chǎn)生5'和3'產(chǎn)物(Blount和Uhlenbeck (2005) Annu.Rev. Biophys.Biomol.Struct.34:415-40)。

假設(shè)hRz折疊成活性構(gòu)象通過雙重二價離子結(jié)合事件進行。高親和力結(jié)合事件在500μM下發(fā)生，并調(diào)整(order)三級相互作用的第一集合。離子的第二低親和力添加在10 mM下發(fā)生，并重構(gòu)hRz莖取向，使得螺旋I遠離螺旋III折疊并與螺旋II相互作用(Hammann等人(2001) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:5503-8)。具有不維持特定莖環(huán)的保守催化核心的HRz被稱為最小錘頭核酶(mhRz)。盡管mhRz在高二價離子濃度(10 mM)下具有活性，但在較低濃度下，mhRz是有效地惰性的(De la Pena等人(2003) EMBO J., 22:5561-70; Khvorova等人(2003) Nat. Struct.Biol.10:708-12)。天然hRz的晶體結(jié)構(gòu)描繪了具有作為“接吻環(huán)(kissing loops)”相互作用的兩個莖環(huán)的“Y”形分子(Pley等人(1994) Nature.372:68-74)。提出莖環(huán)中的未配對堿基之間的這些三級相互作用以穩(wěn)定催化活性構(gòu)象并消除高二價離子條件。研究人員已經(jīng)證明通過將環(huán)重新引入mhRz設(shè)計中而在生物學相關(guān)的二價離子濃度(100-500μM)下恢復的體外催化活性(De la Pena等人(2003) EMBOJ.22:5561-70; Khvorova等人(2003) Nat. Struct.Biol.10:708-12; Canny等人(2004) J.Am. Chem.Soc.126:10848-9; Penedo等人(2004) RNA 10:880-8; Saksmerprome等人(2004) RNA 10:1916-24; Weinberg和Rossi (2005) FEBS Lett.579:1619-24)。通過闡明體內(nèi)催化活性的設(shè)計規(guī)則，hRz現(xiàn)在準備成為基因表達的有效調(diào)節(jié)劑。

因此，錘頭核酶含有核心，從核心延伸的三個莖。術(shù)語“莖”和“螺旋”在本文中可互換使用。因此，從核心延伸的三個莖在本文中稱為莖I、莖II和莖III(或螺旋I、螺旋II和螺旋III)，和至少一個環(huán)，其位于來自核心的莖的相對末端。在順式作用核酶的實施方案中，核酶含有兩個環(huán)，一個位于莖II(或螺旋II)的末端，而另一個位于莖II(或螺旋III)的末端。

如本文所用，“順式切割錘頭核酶”是這樣的錘頭核酶，其在切割之前由單個多核苷酸構(gòu)成。順式切割錘頭核酶能夠切割自身。

莖(或螺旋)是從核酶核心延伸的核酸基序，其中至少一部分是雙鏈的。在某些實施方案中，在來自核酶核心的莖的相對末端存在環(huán)，并且該環(huán)連接雙鏈莖的兩條鏈。在某些實施方案中，莖包含2至20個互補堿基對。在某些實施方案中，莖包含3、4、5、6、7、8或9個互補堿基對。

在某些實施方案中，莖中至少30％的核苷酸是互補堿基對的一部分。剩余的堿基對可以是錯配的、非互補堿基對，或者可以是凸起的一部分。在某些實施方案中，莖中至少40%的核苷酸是互補堿基對的一部分。在某些實施方案中，莖中至少50%的核苷酸是互補堿基對的一部分。在某些實施方案中，莖中至少60%的核苷酸是互補堿基對的一部分。在某些實施方案中，莖中至少70%的核苷酸是互補堿基對的一部分。在某些實施方案中，莖中至少80%的核苷酸是互補堿基對的一部分。在某些實施方案中，莖中至少90%的核苷酸是互補堿基對的一部分。在某些實施方案中，莖中至少95%的核苷酸是互補堿基對的一部分。在某些實施方案中，莖中至少99%的核苷酸是互補堿基對的一部分。在某些實施方案中，莖中100%的核苷酸是互補堿基對的一部分。

環(huán)是這樣的核苷酸序列，其不與另一鏈配對且位于與核心相對的莖的遠端。在某些實施方案中，環(huán)長度為1至20個核苷酸。在某些實施方案中，環(huán)長度為2至10個核苷酸。在某些實施方案中，環(huán)長度為3至8個核苷酸。環(huán)根據(jù)其附接的莖編號。因此，環(huán)I位于與核心相對的莖I的末端，環(huán)II位于與核心相對的莖II的末端，且環(huán)III位于與核心相對的莖III的末端。

如本文所用，“莖/環(huán)”是指整個莖(或螺旋)，連同該莖內(nèi)的任何凸起和在莖的末端的環(huán)。例如，莖/環(huán)II包括莖II，包括莖II內(nèi)的任何凸起，和環(huán)II。如果莖缺乏環(huán)，則莖/環(huán)是指莖，連同該莖內(nèi)的任何凸起。如本文所用，“凸起”是這樣的核苷酸序列，其不與另一鏈配對且在兩側(cè)上側(cè)接雙鏈核酸序列。在某些實施方案中，凸起位于莖內(nèi)。當凸起位于莖內(nèi)時，所述凸起的核苷酸被認為是莖的一部分。在某些實施方案中，錘頭核酶包含多于一個凸起。在某些實施方案中，莖內(nèi)的凸起位于距核心兩個堿基對處。在某些實施方案中，所述莖的一條或兩條鏈含有凸起。

如本文所用，編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)gRNA的核苷酸序列包含5'末端和3'末端，并且核苷酸序列的5'末端直接偶聯(lián)至螺旋III雙鏈體區(qū)?！爸苯优悸?lián)”意指環(huán)，相對于不存在適配子的活性核酶結(jié)構(gòu)，在環(huán)的兩個殘基之間的僅一個骨架磷酸二酯鍵處中斷，所述骨架磷酸二酯鍵被替換為與適配子的5'和3'末端的磷酸二酯鍵。在適配子調(diào)節(jié)的核酶的活性形式中，信息傳遞結(jié)構(gòu)域的5'和3'殘基與彼此堿基配對以形成雙鏈體區(qū)域，以便保持否則中斷的環(huán)的結(jié)構(gòu)。

本文中的“配體”或“分析物”或語法等同物意指待檢測的任何分子或化合物，并且其可以如本文所述與待設(shè)計和/或選擇的適配子相互作用。合適的配體或分析物包括但不限于小的化學分子諸如環(huán)境或臨床化學品，污染物或生物分子，包括但不限于殺蟲劑，殺昆蟲劑，毒素，治療和濫用藥物，激素，抗生素，抗體，有機材料等。合適的生物分子包括但不限于蛋白(包括酶、免疫球蛋白和糖蛋白)，核酸，脂質(zhì)，凝集素，碳水化合物，激素，全細胞(包括原核細胞(諸如致病性細菌)和真核細胞，包括哺乳動物腫瘤細胞)，病毒，孢子等。作為蛋白的說明性分析物包括但不限于酶；藥物；細胞；抗體；抗原；細胞膜抗原和受體(神經(jīng)、激素、營養(yǎng)物和細胞表面受體)或其天然配體。

錘頭核酶(hRz)是能夠維持磷酸二酯鍵的反式或順式切割的RNA基序。順式作用錘頭核酶(chRz)是催化性RNA，其經(jīng)歷其自身骨架的自我切割以產(chǎn)生兩種RNA產(chǎn)物。順式作用錘頭核酶三個堿基配對的莖和切割所需的殘基的高度保守核心。切割反應(yīng)通過攻擊附接至同一殘基的3'碳的磷原子上的催化位點胞嘧啶的2'羥基氧而進行。這破壞糖磷酸酯骨架并產(chǎn)生2′,3′環(huán)磷酸酯。

自我切割反應(yīng)所需的最小錘頭序列包括約13個保守或不變的“核心”核苷酸，其中大部分不參與形成經(jīng)典的Watson-Crick堿基對。核心區(qū)域側(cè)接莖I、II和III，其通常由經(jīng)典的Watson-Crick堿基對組成，但否則不受序列約束。

反式作用錘頭核酶(thRz)的切割特異性由核酶的雜交臂控制，其以互補方式與底物退火并且直接切割易裂開的磷酸二酯鍵。該活性被特異性指向在裂解三聯(lián)體的第三個核苷酸之后發(fā)生。

本公開主題提供適配子調(diào)節(jié)的反式作用錘頭核酶和適配子調(diào)節(jié)的順式作用錘頭核酶。本適配子調(diào)節(jié)的thRz和chRz是通用類型的核酶，其可以容易地工程改造以響應(yīng)于多種配體，并且可用于許多應(yīng)用中。例如，適配子調(diào)節(jié)的thRz和chRz可以設(shè)計為以配體依賴性方式調(diào)節(jié)靶基因的活性，因此可用于調(diào)節(jié)內(nèi)源或異源基因的表達。

核酶結(jié)構(gòu)域(本文也稱為效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域)可以具有至少兩種構(gòu)象狀態(tài)，即“關(guān)閉”狀態(tài)和“開啟”狀態(tài)，其由其經(jīng)歷自我切割(在chRz的情況下)或切割靶序列(在thRz的情況下)的活性水平(例如反應(yīng)速率)定義。本公開主題的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域可以響應(yīng)于配體與適配子結(jié)構(gòu)域的結(jié)合而在它們的“開啟”和“關(guān)閉”構(gòu)象狀態(tài)之間切換。因此，本公開主題的適配子調(diào)節(jié)的核酶用作開關(guān)，其活性響應(yīng)于配體結(jié)合而“開啟”和“關(guān)閉”。在某些實施方案中，核酶結(jié)構(gòu)域的功能明顯取決于配體的存在或不存在，或者可以顯示更多的劑量-響應(yīng)，如對可用于結(jié)合適配子結(jié)構(gòu)域的配體的濃度的依賴性。

適配子結(jié)合且因此核酶受調(diào)節(jié)的配體的選擇是廣泛的。在某些情況下，所述配體是具有小于2500amu的分子量的小分子。僅僅為了舉例說明，這些可以是天然或非天然存在的分子，包括肽、小有機分子(包括藥物和某些代謝物和中間體、輔因子等)和金屬離子。結(jié)合適配子的示例性配體包括但不限于小分子，諸如藥物、代謝物、中間體、輔因子、過渡態(tài)類似物、離子、金屬、核酸和毒素。適配子還可以結(jié)合天然和合成聚合物，包括蛋白、肽、核酸、多糖、糖蛋白、激素、受體和細胞表面諸如細胞壁和細胞膜。配體與適配子(通常為RNA)的結(jié)合改變與信息傳遞結(jié)構(gòu)域(其隨著核酶結(jié)構(gòu)域中的結(jié)構(gòu)改變而移行(carried over))的堿基配對，并改變其介導磷酸二酯鍵的切割(自我切割或靶序列的切割)的能力。因此，配體結(jié)合影響效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域例如介導基因失活、轉(zhuǎn)錄、翻譯或以其他方式干擾靶基因或mRNA的正?；钚缘哪芰?。

適配子最通常通過針對靶分子的結(jié)合體外選擇而獲得。然而，適配子的體內(nèi)選擇也是可能的。適配子具有能夠在其中相同環(huán)境中的其他物質(zhì)不與核酸復合的環(huán)境中與預期靶分子形成復合物的特異性結(jié)合區(qū)。結(jié)合的特異性在與適配子對于環(huán)境中的其他材料或通常無關(guān)分子的解離常數(shù)相比適配子對于其配體的比較解離常數(shù)(K_d)的方面來定義。配體是以比無關(guān)材料更大的親和力結(jié)合適配子的配體。通常，適配子相對于其配體的K_d是適配子與環(huán)境中的無關(guān)材料或伴隨物質(zhì)的K_d的至少約1/10。甚至更優(yōu)選地，K_d是至少約1/50，更優(yōu)選至少約1/100，最優(yōu)選至少約1/200。適配子通常長度為約10至約300個核苷酸。更通常地，適配子長度為約30至約100個核苷酸。

容易制備結(jié)合多種分子的適配子。這些分子各自可以使用本公開主題的方法用作相關(guān)核酶的調(diào)節(jié)劑。例如，有機分子、核苷酸、氨基酸、多肽、細胞表面上的目標特征、離子、金屬、鹽、糖都已經(jīng)顯示適合于分離可以特異性結(jié)合相應(yīng)配體的適配子。例如，有機染料諸如Hoechst 33258已經(jīng)成功地用作用于體外適配子選擇的靶配體(Werstuck和Green (1998) Science 282:296-298)。其他小有機分子如多巴胺、茶堿、磺酰羅丹明B和纖維二糖也已經(jīng)用作適配子分離中的配體。還已經(jīng)分離了抗生素諸如卡那霉素A、利維霉素、妥布霉素、新霉素B、紫霉素、氯霉素和鏈霉素的適配子。對于識別小分子的適配子的綜述，參見Famulok (1999) Science 9:324-9。

在某些實施方案中，本公開主題的適配子調(diào)節(jié)的核酶的適配子的配體是細胞可滲透的小有機分子。對翻譯沒有一般抑制作用的小有機分子優(yōu)選作為配體。小分子優(yōu)選還表現(xiàn)出足以實現(xiàn)所需水平的翻譯抑制的體內(nèi)持續(xù)性。還可以篩選分子以鑒定在例如口服施用之后是生物可利用的那些。在本公開主題的某些實施方案中，所述配體是無毒的。所述配體可以任選地是藥物，包括例如類固醇。然而，在控制基因表達的一些方法中，優(yōu)選的是，所述配體是藥理學惰性的。在一些實施方案中，所述配體是其在細胞中的存在指示疾病或病理狀況的多肽。在其他實施方案中，適配子的配體是抗生素，諸如氯霉素。在一個替代實施方案中，所述適配子的配體是有機染料，諸如Hoeschst染料33258。在又另一個實施方案中，所述配體可以是金屬離子。在一個具體實施方案中，適配子調(diào)節(jié)的核酸的適配子結(jié)構(gòu)域響應(yīng)于與咖啡因的結(jié)合。

通常通過采用已知的稱為SELEX的體內(nèi)或體外(最通常，體外)選擇技術(shù)(Ellington等人(1990) Nature 346, 818-22；和Tuerk等人(1990) Science 249, 505-10)來開發(fā)結(jié)合特定配體的適配子。制備適配子的方法也描述于，例如，美國專利號5,582,981; PCT公開號WO 00/20040; 美國專利號5,270,163; Lorsch和Szostak (1994) Biochemistry 33:973; Mannironi等人(1997) Biochemistry 36:9726; Blind (1999) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:3606-3610; Huizenga和Szostak (1995) Biochemistry34:656-665; PCT公開號WO 99/54506、WO 99/27133、WO 97/42317和美國專利號5,756,291。

通常，以其最基本的形式，用于鑒定適配子的體外選擇技術(shù)涉及首先制備所需長度的寡核苷酸的大合并物，所述寡核苷酸含有至少一些隨機化或誘變的區(qū)域。例如，用于適配子選擇的普通寡核苷酸合并物可能含有20-100個隨機化核苷酸的區(qū)域，其在兩端側(cè)接可用于PCR引物結(jié)合的限定序列的約15-25個核苷酸長區(qū)域。使用標準PCR技術(shù)擴增寡核苷酸合并物，盡管可以采用允許所選核酸序列的忠實、有效的擴增的任何方式。然后將DNA合并物體外轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄物。RNA轉(zhuǎn)錄物然后可以進行親和色譜法，盡管可以使用允許基于核酸特異性結(jié)合另一分子(例如蛋白或任何靶分子)的能力來選擇核酸的任何方案。在親和色譜法的情況下，將轉(zhuǎn)錄物最通常通過柱或與其上已固定有靶配體的磁珠等接觸。合并物中與配體結(jié)合的RNA分子保留在柱或珠上，而洗掉非結(jié)合序列。然后將結(jié)合配體的RNA分子逆轉(zhuǎn)錄并通過PCR(通常在洗脫后)再次擴增。然后將所選合并物序列通過另一輪相同類型的選擇。通常，將合并物序列通過總共約三至十個迭代輪的選擇程序。然后使用標準程序擴增、克隆和測序cDNA，以鑒定能夠充當靶配體的適配子的RNA分子的序列。一旦已經(jīng)成功鑒定了適配子序列，就可以通過進行額外輪的從包含誘變的適配子序列的寡核苷酸合并物開始的選擇來進一步優(yōu)化適配子。為了用于本公開主題，優(yōu)選在模擬正常生理條件的鹽濃度和溫度存在的情況下選擇適配子用于結(jié)合配體。

技術(shù)人員通常可以選擇合適的配體，而不考慮適配子是否可用。在大多數(shù)情況下，可以獲得由一些本領(lǐng)域普通技術(shù)人員選擇的結(jié)合配體的適配子。體外選擇方法的獨特性質(zhì)允許分離結(jié)合所需配體的合適適配子，盡管完全缺乏關(guān)于什么類型的結(jié)構(gòu)可能結(jié)合所需配體的現(xiàn)有知識。

對于適合用于本公開主題的適配子，適配子對配體的結(jié)合親和力必須足夠強，并且當適配子與其配體結(jié)合時形成的結(jié)構(gòu)必須足夠顯著，以便將本公開主題的適配子調(diào)節(jié)的核酶在“開啟”和“關(guān)閉”狀態(tài)之間切換，或調(diào)節(jié)適配子調(diào)節(jié)的核酶的功能水平。

適配子和相關(guān)配體的締合常數(shù)優(yōu)選使得配體發(fā)揮功能以結(jié)合適配子，并且在施用配體后獲得的配體濃度下具有所需效果。對于體內(nèi)使用，例如，締合常數(shù)應(yīng)當使得結(jié)合在低于血清或其他組織中可以實現(xiàn)的配體濃度下良好發(fā)生。優(yōu)選地，體內(nèi)使用所需的配體濃度也低于可以對生物體具有不期望的效果的濃度。

因此，某些實施方案提供了設(shè)計和選擇響應(yīng)于一種或多種預選或預定配體的適配子或適配子結(jié)構(gòu)域的方法。也可以“調(diào)節(jié)”本發(fā)明的適配子調(diào)節(jié)的核酶，使得它們的切換行為或多或少地響應(yīng)于配體結(jié)合。也可以“調(diào)節(jié)”適配子調(diào)節(jié)的核酶，使得適配子結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力或多或少對其配體敏感。例如，可以改變適配子-調(diào)節(jié)的核酶中的分子內(nèi)雙鏈體形成的熱力學性質(zhì)和其他2°和3°結(jié)構(gòu)，使得適配子結(jié)構(gòu)域或多或少適合于配體結(jié)合，即，諸如可以在解離常數(shù)(K_d)或其他動力學參數(shù)(諸如K_on和K_off速率)中顯現(xiàn)?；蛘?，在雜交和可影響核酶結(jié)構(gòu)域的2°和3°結(jié)構(gòu)的其他分子內(nèi)相互作用的改變后，核酶結(jié)構(gòu)域的變構(gòu)變化可以或多或少響應(yīng)于配體結(jié)合。用于改變核酸結(jié)構(gòu)的熱力學特性的正向工程改造策略是本領(lǐng)域中眾所周知的。例如，增加的互補核酸配對可以增加核酶結(jié)構(gòu)域或適配子結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性。

III.用于治療神經(jīng)變性疾病的方法

本公開主題還提供用于治療神經(jīng)變性疾病、病癥或病況的方法。在一些實施方案中，本公開主題提供用于在有需要的主體中治療眼部神經(jīng)變性疾病的方法，所述方法包括：(a)提供包含一種或多種載體的非天然存在的CRISPR-Cas系統(tǒng)，所述載體包含：i)H1啟動子，其可操作連接至編碼CRISPR-Cas系統(tǒng)向?qū)NA(gRNA)的至少一個核苷酸序列，其中所述gRNA與所述主體的細胞中的DNA分子的靶序列雜交，且其中所述DNA分子編碼在所述細胞中表達的一種或多種基因產(chǎn)物；和ii)在細胞中可操作的調(diào)節(jié)元件，其可操作連接至編碼Cas9蛋白的核苷酸序列，其中組件(i)和(ii)位于所述系統(tǒng)的相同或不同的載體上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且與所述靶序列雜交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改變一種或多種基因產(chǎn)物的表達；和(b)向所述主體施用有效量的所述系統(tǒng)。

“神經(jīng)變性疾病、病癥或病況”意指與神經(jīng)元或其他神經(jīng)細胞諸如視網(wǎng)膜感光細胞的變性或功能障礙相關(guān)的疾病、病癥或病況(包括神經(jīng)病)。神經(jīng)變性疾病、病癥或病況可以是其中可發(fā)生神經(jīng)元的功能降低或功能障礙或神經(jīng)元或其他神經(jīng)細胞的損失的任何疾病、病癥或病況。

此類疾病、病癥或病況包括但不限于青光眼和神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)變性疾病、病癥或病況，諸如以下或與之相關(guān)：肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)、三叉神經(jīng)痛、舌咽神經(jīng)痛、貝爾氏麻痹、重癥肌無力、肌營養(yǎng)不良、進行性肌萎縮、原發(fā)性脊髓側(cè)索硬化(PLS)、假性延髓性麻痹、進行性延髓性麻痹、脊髓性肌萎縮、 遺傳性肌萎縮、無脊椎動物盤綜合征、頸椎病、神經(jīng)叢障礙、胸廓出口破壞綜合征、外周神經(jīng)病、卟啉病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、帕金森氏病、帕金森氏病疊加病、多系統(tǒng)萎縮、進行性核上性麻痹、皮質(zhì)基底節(jié)變性、具有路易小體的癡呆、額顳葉癡呆、脫髓鞘性疾病、吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome)、多發(fā)性硬化、 腓骨肌萎縮癥、朊病毒病、克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、Gerstmann-Straussler-Scheinker綜合征(GSS)、致死性家族失眠癥(FFI)、牛海綿狀腦病(BSE)、皮克氏病、癲癇、和AIDS癡呆復合征。

神經(jīng)系統(tǒng)的其他神經(jīng)變性疾病、病癥或病況，諸如以下或與之相關(guān)：酒精中毒、亞歷山大氏病、阿爾佩氏病、共濟失調(diào)毛細血管擴張癥、Batten病(也稱為Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、卡納萬病、科凱恩氏綜合征、糖尿病性神經(jīng)病變、額顳葉變性、HIV相關(guān)性癡呆、肯尼迪氏病、克臘伯氏病、神經(jīng)軸突病(neuroborreliosis)、Machado-Joseph病(3型脊髓小腦性共濟失調(diào))，濕性或干性黃斑變性、尼曼皮克病、Pelizaeus-Merzbacher病、光感受器變性疾病諸如視網(wǎng)膜色素變性和相關(guān)疾病、Refsum氏病、Sandhoff氏病、Schilder氏病、繼發(fā)于惡性貧血的脊髓的亞急性聯(lián)合變性、Spielmeyer-Vogt- Sjogren-Batten病(也稱為Batten病)、脊髓小腦性共濟失調(diào)(具有不同特征的多種類型)、Steele-Richardson-Olszewski病和脊髓癆。

眼相關(guān)神經(jīng)變性的實例包括但不限于青光眼、格子狀角膜營養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、與濕性或干性AMD相關(guān)的感光器變性、其他視網(wǎng)膜變性諸如視網(wǎng)膜色素變性(RP)、視神經(jīng)脈絡(luò)膜小疣、視神經(jīng)病變和視神經(jīng)炎，諸如由多發(fā)性硬化癥引起的視神經(jīng)炎。在一些實施方案中，所述眼部神經(jīng)變性疾病選自青光眼、視網(wǎng)膜變性和年齡相關(guān)性黃斑變性。在一些實施方案中，所述眼部神經(jīng)變性疾病是視網(wǎng)膜色素變性(RP)。

可以根據(jù)本公開主題預防和治療的不同類型的青光眼的非限制性實例包括原發(fā)性青光眼(也稱為原發(fā)性開角型青光眼，慢性開角型青光眼，慢性單純性青光眼和單純性青光眼)，低眼壓性青光眼，原發(fā)性閉角型青光眼 (也稱為原發(fā)性閉角型青光眼，狹角性青光眼，孔阻滯性青光眼，和急性充血性青光眼)，急性閉角型青光眼，慢性閉角型青光眼，間歇性閉角型青光眼，慢性閉角型開角青光眼(chronic open-angle closure glaucoma)，色素性青光眼，剝脫性青光眼 (也稱為假性剝脫性青光眼或囊膜性青光眼)，發(fā)育性青光眼(例如，原發(fā)性先天性青光眼和嬰幼兒型青光眼)，繼發(fā)性青光眼(例如，炎性青光眼(例如，葡萄膜炎和Fuchs異色性虹膜睫狀體炎)，晶狀體源性青光眼(例如，帶有成熟白內(nèi)障的閉角型青光眼，繼發(fā)于晶狀體囊破裂的晶狀體過敏性青光眼，由于晶狀體毒性網(wǎng)絡(luò)堵塞和晶狀體不全脫位導致的晶狀體溶解性青光眼)，繼發(fā)于眼內(nèi)出血的青光眼(例如，眼前房出血和溶血性青光眼，也稱為紅細胞破碎青光眼)，外傷性青光眼(例如，房角退縮性青光眼，前房角上外傷性退縮，術(shù)后青光眼，無晶狀體性瞳孔阻滯和睫狀環(huán)阻塞性青光眼)，新生血管性青光眼，藥物誘導的青光眼(例如，皮質(zhì)類固醇誘導的青光眼和α-胰凝乳蛋白酶青光眼)，毒性青光眼和與眼內(nèi)腫瘤相關(guān)的青光眼，視網(wǎng)膜脫落，眼的嚴重化學燒傷，和虹膜萎縮。在某些實施方案中，所述神經(jīng)變性疾病、病癥或病況是與過度血管生成無關(guān)的疾病、病癥或病況，例如不是新生血管性青光眼的青光眼。

如本文所用，術(shù)語“病癥”通常是指將受益于用針對鑒定的目標或途徑之一的化合物治療的任何病況，包括可以通過有效量的針對鑒定的目標或途徑之一的化合物或其藥學上可接受的鹽治療的任何疾病、病癥或病況。

如本文所用，術(shù)語“治療”可以包括逆轉(zhuǎn)、減輕、抑制此類術(shù)語適用的疾病、病癥或病況或此類疾病、病癥或病況(例如，引起視網(wǎng)膜感光細胞功能障礙和/或死亡的疾病或病癥)的一種或多種癥狀或表現(xiàn)的進展，預防或降低其可能性。在一些實施方案中，所述治療降低視網(wǎng)膜感光細胞的功能障礙和/或死亡。例如，與經(jīng)歷治療之前的主體中或未經(jīng)歷治療的主體中的視網(wǎng)膜感光細胞的功能障礙和/或死亡相比，所述治療可以使視網(wǎng)膜感光細胞的功能障礙和/或死亡降低至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、33%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、66%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。在一些實施方案中，所述治療完全抑制主體中的視網(wǎng)膜感光細胞的功能障礙和/或死亡。如本文所用，“視網(wǎng)膜感光細胞”是在視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)的能夠光轉(zhuǎn)導的專門類型的神經(jīng)元。在一些實施方案中，至少一種基因產(chǎn)物是視紫紅質(zhì)。

在一些實施方案中，在施用于所述主體之前，將所述系統(tǒng)包裝至單個腺相關(guān)病毒(AAV)顆粒中。在一些實施方案中，施用于所述主體通過視網(wǎng)膜下注射發(fā)生。所述治療、施用或療法可以是連續(xù)的或間歇的。連續(xù)治療、施用或療法是指在至少每天的基礎(chǔ)上治療，而治療不中斷一天或多天。間歇治療或施用，或以間歇方式治療或施用，是指性質(zhì)上不是連續(xù)的、而是周期的治療。根據(jù)本公開的方法的治療可以導致從疾病、病癥或病況的完全緩解或治愈，或者所述疾病的一種或多種癥狀、所述疾病或病況的部分改善，并且可以是暫時的或永久的。術(shù)語“治療”還意欲涵蓋預防、療法和治愈。

術(shù)語“有效量”或“治療有效量”是指足以實現(xiàn)有益或期望結(jié)果的藥劑的量。治療有效量可以根據(jù)以下中的一種或多種而變化：所治療的主體和疾病狀況，主體的體重和年齡，疾病狀況的嚴重性，施用方式等，其可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。該術(shù)語還適用于將通過本文所述的任何一種成像方法為檢測提供圖像的劑量。具體劑量可以根據(jù)以下中的一種或多種而變化：選擇的具體藥劑，待遵循的給藥方案，其是否與其他化合物組合施用，施用時機，待成像的組織以及攜帶其的物理遞送系統(tǒng)。

術(shù)語“主體”和“患者”在本文中可互換使用。通過本公開的方法在其許多實施方案中治療的主體理想地是人主體，但應(yīng)當理解，本文所述的方法關(guān)于旨在包括于術(shù)語“主體”中的所有脊椎動物物種是有效的。因此，“主體”可以包括用于醫(yī)學目的，諸如現(xiàn)有病況或疾病的治療或用于預防病癥或疾病發(fā)作的預防性治療的人主體，或用于醫(yī)學、獸醫(yī)目的或發(fā)展目的的動物主體。合適的動物主體包括哺乳動物，包括但不限于靈長類動物，例如人、猴、猿等；?？苿游?，例如牛、公牛等；綿羊類，例如綿羊等；山羊類，例如山羊等；豬類，例如豬、大豬等；馬科動物，例如馬、驢、斑馬等；貓科動物，包括野生貓和家貓；犬科動物，包括狗；兔類動物，包括兔、野兔等；和嚙齒動物，包括小鼠、大鼠等。動物可以是轉(zhuǎn)基因動物。在一些實施方案中，所述主體是人，包括但不限于胎兒、新生兒、嬰兒、青少年和成年主體。此外，“主體”可以包括患有或疑似患有病況或疾病的患者。

IV. 一般定義

盡管本文采用特定術(shù)語，但它們僅在一般和描述性意義上、而不是為了限制的目的來使用。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所述主題所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。

遵循長期專利法慣例，當在本申請(包括權(quán)利要求)中使用時，術(shù)語“一個/種(a)”，“一個/種(an)”和“該(the)”是指“一個/種或多個/種”。因此，例如，對“主體”的提及包括多個主體，除非上下文清楚地是相反的(例如，多個主體)等等。

在整個說明書和權(quán)利要求中，術(shù)語“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”在非排他的意義上使用，除非上下文另有要求。同樣，術(shù)語“包括”及其語法變體旨在是非限制性的，使得列表中的項目的列舉不排除可以替換或添加至所列項目的其他類似項目。

為了本說明書和所附權(quán)利要求的目的，除非另有說明，在說明書和權(quán)利要求中使用的表示量、尺寸、維度、比例、形狀、制劑、參數(shù)、百分比、參數(shù)、量、特征的所有數(shù)字和其他數(shù)值，應(yīng)當理解為在所有情況下由術(shù)語“約”修飾，即使術(shù)語“約”可能沒有明確地與所述值、量或范圍一起出現(xiàn)。因此，除非相反地指出，以下說明書和所附權(quán)利要中記載的數(shù)值參數(shù)不是且不必是精確的，但可以如期望是近似和/或更大或更小，反映公差、轉(zhuǎn)換因子、舍入值、測量誤差等以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他因素，這取決于尋求由本公開主題所獲得的期望特性。例如，當提及值時，術(shù)語“約”可以意欲包括在一些實施方案中±100％、在一些實施方案中±50％、在一些實施方案中±20％、在一些實施方案中±10％、在一些實施方案中±5％、在一些實施方案中±1％、在一些實施方案中±0.5％且在一些實施方案中±0.1％的從指定量的變化，因為此類變化適于進行公開的方法或使用公開的組合物。

此外，當與一個或多個數(shù)字或數(shù)字范圍結(jié)合使用時，術(shù)語“約”應(yīng)當被理解為是指所有此類數(shù)字，包括范圍內(nèi)的所有數(shù)字，并且通過延伸所述數(shù)值上方和下方的邊界來修飾該范圍。通過端點記載數(shù)值范圍包括所有數(shù)字，例如包含在該范圍內(nèi)的全部整數(shù)(包括其分數(shù))(例如，1至5的記載包括1、2、3、4和5以及其分數(shù)，例如1.5、2.25、3.75、4.1等)和該范圍內(nèi)的任何范圍。

實施例

已經(jīng)包括以下實施例以向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供指導以實施本公開主題的代表性實施方案。鑒于本公開和本領(lǐng)域的一般技術(shù)水平，技術(shù)人員可以理解，以下實施例僅旨在是示例性的，并且在不脫離本公開主題范圍的情況下可以采用許多改變、修飾和變化。以下的合成描述和具體實施例僅意在用于舉例說明的目的，并且不應(yīng)解釋為以任何方式限制通過其他方法制備本公開的化合物。

實施例1

方法

質(zhì)粒構(gòu)建：為了生成表達H1 gRNA的構(gòu)建體(參見下表1、2和3)，將重疊寡核苷酸組裝以產(chǎn)生融合至76bp gRNA支架和pol III終止信號的H1啟動子。在H1啟動子和gRNA支架之間，將BamHI位點并入以允許靶向序列的插入。然后將H1::gRNA支架::pol III終止子序列TOPO克隆入pCR4-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA)，并測序驗證；所得載體為相反取向(參見下文)。為了生成本研究中使用的各種gRNA，將重疊寡核苷酸退火，并通過PCR使用兩步擴增Phusion Flash DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)擴增，隨后使用與2X體積25％ PEG和1.5M NaCl混合的羧化物修飾的Sera-Mag磁珠(Thermo Fisher Scientific)純化。然后將純化的PCR產(chǎn)物重懸浮于H₂O中，并使用NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific)定量。使用Gibson Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA) (Gibson等人(2009) Nature Methods 6:343-345)以AflII消化的用于U6表達的質(zhì)粒(#41824, Addgene, Cambridge MA)或僅對于H1表達描述的質(zhì)粒的BamHI消化的輕微改良形式產(chǎn)生表達gRNA的構(gòu)建體。總反應(yīng)體積從20μl減少至2μl。

細胞培養(yǎng)：通過根據(jù)前面描述的方案(Walker等人(2010) Nat. Commun.1:71; Maruotti等人(2013) Stem Cells Translational Medicine 2:341-354)在10% CO₂/5% O₂培養(yǎng)箱中在mTeSR1培養(yǎng)基(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC)中的生長因子減少的Matrigel(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)上克隆繁殖來維持hESC系H7和IMR-90 iPS細胞(WiCell, Madison WI)。為了傳代，首先將hESC集落與mTesR1中的5μM blebbistatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)孵育，然后在用Accutase (Sigma-Aldrich)處理5-10分鐘之后收集。將細胞塊輕輕地離解成單細胞懸浮液，并通過離心沉淀。此后，將hPSC重懸浮于具有blebbistatin的mTeSR1中，并以約1,000-1,500個細胞/cm²鋪板。傳代之后兩天，用mTeSR1(無blebbistatin)替換培養(yǎng)基并每日更換。

將人胚胎腎(HEK)細胞系293T(Life Technologies, Grand Island, NY)在37℃、5% CO₂/20% O₂下在補充有10％胎牛血清(Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY)和2mM GlutaMAX (Invitrogen)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中維持。

H7細胞的基因靶向：在電穿孔前24小時，在10μM Rho激酶抑制劑(DDD00033325, EMD Millipore, Billerica, MA)中培養(yǎng)hESC細胞。使用Neon試劑盒(Invitrogen)根據(jù)制造商的說明進行電穿孔。簡而言之，在電穿孔當天，將hESC用Accutase (Sigma-Aldrich)消化1-2分鐘，直至集落轉(zhuǎn)移。重要的是，集落不解離成單細胞懸浮液。收集集落之后，將濕沉淀物在冰上保持15分鐘，然后重懸浮于含有基因靶向質(zhì)粒的電穿孔緩沖液中。電穿孔參數(shù)如下：電壓：1400 ms；時間間隔：30 ms；1個脈沖。電穿孔后，將細胞集落緩慢轉(zhuǎn)移至含有10μM Rho激酶抑制劑的mTeSR1培養(yǎng)基中，然后在室溫下保持20分鐘，然后鋪板在Matrigel包被的培養(yǎng)皿上并進一步培養(yǎng)。

為了分析克隆來源的集落，將電穿孔的hESC生長至亞匯合，如前面段落中所述傳代，并以500個細胞/每35mm皿的密度鋪板。隨后，通過手工挑選分離單個集落并進一步培養(yǎng)。

對于293T細胞轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染前24小時將約100,000個細胞/孔接種在24孔板(Falcon, Corning, NY)中。使用Lipofectamine LTX Plus試劑(Invitrogen)根據(jù)制造商推薦的方案一式四份轉(zhuǎn)染細胞。對于24孔板的每個孔，將400ng Cas9質(zhì)粒和200ng gRNA質(zhì)粒與0.5μl Plus試劑和1.5μl Lipofectamine LTX試劑混合。

組成型表達的GFP ESC系的生成：將H7人ESC系(WiCell)保持在Matrigel基質(zhì)上的mTeSR1 (Stem Cell Technologies)培養(yǎng)基中。在細胞傳代前，將細胞進行用blebbistatin的短暫預處理(> 5分鐘)以增加細胞活力，用Accutase處理7分鐘，研磨成單細胞懸浮液，用等體積的mTesR猝滅，以80xg離心5分鐘，重懸浮于含有blebbistatin的mTesR中。將1x10⁶個細胞沉淀，小心去除培養(yǎng)基，并將細胞置于冰上10-15分鐘。將R緩沖液中的10μg含有與AAVS1安全港(safe-harbor)基因座的同源性的AAV-CAGGSEGFP供體載體(#22212, Addgene)加上5μg各hAAVS1 1R + L TALENs (#35431和35432, Addgene)(Hockemeyer等人(2009) Nat. Biotechnol. 27:851-857; Sanjana等人(2012) Nature Protocols 7:171-192)使用Neon轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Life Technologies)以100μl尖端型(tip-type)用以下參數(shù)電穿孔：1500V，20ms脈沖和1脈沖。然后將細胞輕輕地添加至1ml培養(yǎng)基，并在室溫下孵育15分鐘，然后鋪板在含有mTeSR和5μM blebbistatin的Matrigel包被的35mm皿上。2天之后，以1x10⁴的密度接種細胞，之后，用熒光配備的Nikon TS100落射熒光顯微鏡手動選擇時間穩(wěn)定的克隆亞系。

基因組修飾的Surveyor測定和測序分析：對于Surveyor分析，通過將細胞重懸浮于QuickExtract溶液(Epicentre, Madison, WI)中、在65℃下孵育15分鐘、然后在98℃下孵育10分鐘來提取基因組DNA。提取物溶液使用DNA Clean and Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA)清洗并通過NanoDrop (Thermo Fisher Scientific)定量。使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)從100ng基因組DNA擴增圍繞CRISPR靶位點的基因組區(qū)域。合并多個獨立的PCR反應(yīng)物，并使用Qiagen MinElute Spin Column根據(jù)制造商的方案(Qiagen, Valencia, CA)純化。將含有12.5mM Tris-HCl (pH 8.8)、62.5mM KCl和1.875mM MgCl₂中的400ng PCR產(chǎn)物的8μl體積變性并緩慢再退火以允許形成異源雙鏈體：95℃持續(xù)10分鐘，以-1.0℃/秒從95℃斜變至85℃，85℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從85℃斜變至75℃，75℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從75℃斜變至65℃，65℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從65℃斜變至55℃，55℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從55℃斜變至45℃，45℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從45℃斜變至35℃，35℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從35℃斜變至25℃，然后保持在4℃。將1μl Surveyor Enhancer和1μl Surveyor Nuclease (Transgenomic, Omaha, NE)添加至每個反應(yīng)物，在42℃下孵育60分鐘，其后將1μl終止溶液添加至反應(yīng)物。使用DNA 1000芯片(Agilent, Santa Clara, CA)在2100 Bioanalyzer上定量1μl反應(yīng)物。對于凝膠分析，將2μl 6X上樣緩沖液(New England Biolabs)添加至剩余的反應(yīng)物，并上樣至含有溴化乙錠的3％瓊脂糖凝膠上。將凝膠在Gel Logic 200成像系統(tǒng)(Kodak, Rochester, NY)上可視化，并使用ImageJ v. 1.46定量。使用二項式推導的方程計算NHEJ頻率：

%基因修飾=

其中“a”和“b”的值等于背景減去之后的切割片段的積分面積，且“c”等于背景減去之后的未切割PCR產(chǎn)物的積分面積(Guschin等人(2010) Methods in Molecular Biology649:247-256)。

流式細胞術(shù)：在blebbistatin處理之后，通過Accutase處理收獲亞匯合的hESC集落，離解成單細胞懸浮液并沉淀。然后將細胞重懸浮于含有Vybrant DyeCycle紅寶石染料(Invitrogen)的活細胞溶液(Invitrogen)中，并在Accuri C6流式細胞儀(BD Biosciences)上分析。

定量實時qPCR：在轉(zhuǎn)染前24小時，將293T細胞以250,000個細胞/孔接種于12孔板(Falcon)中。使用Lipofectamine LTX與Plus Reagent (Invitrogen)根據(jù)制造商推薦的方案以每孔中用gRNA質(zhì)粒的6劑量滴定一式三份轉(zhuǎn)染細胞：0 ng、31.25ng、62.5ng、125ng、250ng或500ng。轉(zhuǎn)染后48小時，使用RNAzol RT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH)分離總RNA，并使用Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo)純化。將500ng總RNA以dsDNase (ArticZymes; Plymouth Meeting, PA USA)處理以去除殘余的基因組DNA污染，并使用Superscript III逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)遵循制造商的推薦在20μl反應(yīng)中逆轉(zhuǎn)錄。對于每個反應(yīng)，使用0.1μM以下寡核苷酸以引發(fā)每個反應(yīng)；gRNA支架-

CTTCGATGTCGACTCGAGTCAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC(SEQ ID NO:1), U6 snRNA-AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG (SEQ ID NO:2)。加下劃線的支架序列表示為轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性添加的錨定序列。在Biorad CFX 96實時PCR儀中在10μl體積中使用含有250nM寡核苷酸引物的SsoAdvanced? Universal SYBR? Green Supermix (Biorad)和1微升的來自上述的RT反應(yīng)產(chǎn)物的1:15稀釋物進行每個qPCR反應(yīng)。反應(yīng)進行40個循環(huán)，其中95℃變性，54℃退火溫度和60℃延伸步驟。以下引物分別用于檢測向?qū)NA和參考基因：F1for-

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAA (SEQ ID NO:3)和guideRNAscaffrev-

AAGCACCGACTCGGTGCCAC (SEQ ID NO:4)和U6snRNAF-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT (SEQ ID NO:5)和U6snRNARev- ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC (SEQ ID NO:6)。使用Biorad的集成CFX管理軟件計算每個向?qū)NA樣品的相對均一化表達和s.e.m。

生物信息學：為了確定人類基因組中的所有潛在的CRISPR位點，使用定制的Perl轉(zhuǎn)錄物來搜索兩條鏈和23-mer CRISPR序列位點GN₁₉NGG或AN₁₉NGG的重疊出現(xiàn)。為了計算平均值和中值距離值，預測的CRISPR切割位點首先被定義為出現(xiàn)在PAM序列上游的第三和第四堿基之間。在分選序列之后，然后計算基因組中所有相鄰gRNA之間的距離。將該數(shù)據(jù)導入R中以計算平均值和中值統(tǒng)計值，并繪制數(shù)據(jù)。為了計算平均密度，將gRNA切割位點跨越基因組分組(binned)并計算出現(xiàn)頻率。將該數(shù)據(jù)使用ggplot2包或Circos繪制在R中以生成圓形圖(Krzywinski等人(2009) Genome Research 19:1639-1645)。為了計算人類基因中或疾病基因座處的出現(xiàn)率，使用BEDTools utility IntersectBED (Quinlan和Hall (2010) Bioinformatics 26:841-842)來發(fā)現(xiàn)與從UCSC Genome Browser檢索的RefSeq BED文件或來自O(shè)MIM(在線人類孟德爾遺傳(Online Mendelian Inheritance in Man), OMIM.McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, MD), 2013) BED文件重疊的出現(xiàn)率。用于本研究中的基因組是人(hg19)、小鼠(mm10)、大鼠(rn5)、牛(bosTau7)、雞(galGal4)、斑馬魚(dr7)、果蠅(dm3)、秀麗隱桿線蟲(ce10)、釀酒酵母(sacCer3)。

表1.gRNA靶向序列和特性 - eGFP靶向構(gòu)建體，其指示eGFP坐標、gRNA啟動子、5'核苷酸、靶向鏈、PAM基序、GC含量、Tm和熱力學穩(wěn)定性

*基于20 bp靶序列計算

**基于預測的DNA:DNA雜交值針對五個3'核苷酸計算。

表2.gRNA靶向序列和特性 - AAVS-1靶向序列，其指示gRNA啟動子、5'核苷酸、靶向鏈、PAM基序、GC含量、Tm和熱力學穩(wěn)定性

。

表3. RNA靶向序列和特性 - 靶向eGFP的20堿基gRNA構(gòu)建體的序列

。

結(jié)果

為了擴大CRISPR/Cas9靶向的當前限制，測試是否可以使用H1 pol III代替U6作為替代啟動子(Baer等人(1990) Nucleic Acids Res.18:97-103)。因為H1可以表達具有位于+1位置的任一嘌呤(核苷酸R)的轉(zhuǎn)錄物，所以假設(shè)與化膿性鏈球菌Cas9一起，CRISPR靶向空間可以通過允許在AN₁₉NGG和GN₁₉NGG位點兩者處切割而擴大(圖1A)。為了證明H1表達的gRNA的位點特異性切割，開發(fā)了報道分子測定法以測量在H7人胚胎干細胞系(hESC；圖1B)中的AAVS-1基因座處整合的GFP靶基因的CRISPR介導的切割(Hockemeyer等人(2009) Nat.Biotechnol.27:851-857)。將由于編碼序列破壞導致的GFP熒光損失測量為易錯非同源末端連接(NHEJ)頻率的代理物；特別地，所述測定法將低估NHEJ，因為不會檢測到不破壞GFP熒光的框內(nèi)突變或插入缺失(圖1B和圖1C)。H7細胞用等摩爾比的Cas9和gRNA表達質(zhì)粒進行電穿孔，并且在集落形成之后使細胞針對GFP熒光可視化。與陰性對照電穿孔相反，來自測試的U6和H1啟動子的所有g(shù)RNA構(gòu)建體在經(jīng)歷靶向突變的細胞中顯示GFP信號的鑲嵌型損失(圖1C和未顯示的數(shù)據(jù))。用核染色定量總細胞數(shù)使得能夠通過流式細胞術(shù)進行GFP熒光的基于細胞的分析。盡管100％的構(gòu)建體導致NHEJ，如通過GFP熒光的損失所證明，但效率范圍對于U6和H1構(gòu)建體是不同的(圖1C、右圖和未顯示的數(shù)據(jù))。通過從U6或H1啟動子表達gRNA，這證明GFP基因的誘變可以分別在GN₁₉NGG或AN₁₉NGG位點發(fā)生。

為了用另一細胞系證實和拓寬這些結(jié)果，用與上述相同的gRNA構(gòu)建體靶向在相同基因座處表達GFP的表達GFP的HEK-293細胞系。通過Surveyor分析(Qiu等人(2004) BioTechniques 36:702-707)，檢測到一定范圍的因啟動子類型和靶向位置而改變的編輯效率(圖1D和圖2)。通過使用未修飾的IMR90.4誘導的多能細胞(hiPSC)，還證實了通過靶向PPP1R12C基因的內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)的AAVS-1基因座來修飾內(nèi)源基因的能力。以相當?shù)男视^察到來自H1和U6驅(qū)動的gRNA的靶向切割，如通過Surveyor測定法所測量(圖3A、圖3B和圖3C)。

為了確定靶向空間的潛在增加，進行生物信息學分析以評價人類基因組中可用的CRISPR位點。盡管可能預測AN₁₉NGG位點大致以與GN₁₉NGG位點相同的頻率存在，但發(fā)現(xiàn)它們實際上通常高15％(圖4A、圖4B、圖4C、圖4D、圖5A、圖5B、圖5C、圖5D、圖5E和圖5F)；因此將特異性從GN₁₉NGG改變?yōu)镽N₁₉NGG，使可用位點的數(shù)量超過倍增(增加約115％)。有幾個例外(chr16、chr17、chr19、chr20和chr22)，AN₁₉NGG位點以比GN₁₉NGG位點更高的頻率存在于每個染色體上。為了比較平均全基因組靶向密度，針對GN₁₉NGG (59 bp)、AN₁₉NGG (47 bp)和RN₁₉NGG位點(26 bp)計算基因組中相鄰CRISPR位點之間的平均距離(圖4B)。此外，AN₁₉NGG位點在人類基因組中靶向的相關(guān)區(qū)域甚至更富集。發(fā)現(xiàn)人類基因中AN₁₉NGG位點增加20％，并且從OMIM數(shù)據(jù)庫獲得的疾病基因座處增加21％(圖4C)。還檢查了來自人類基因組的1165個miRNA基因，并且發(fā)現(xiàn)這些基因中的221個可以通過一個或多個AN₁₉NGG位點靶向，但不通過GN₁₉NGG位點靶向(數(shù)據(jù)未顯示)?？紤]到同源重組的效率與增加與切割位點的距離負相關(guān)，通過使用H1啟動子的CRISPR靶向位點的增加應(yīng)當促進更精確的基因組靶向和突變校正(Ran等人(2013) Cell 6:1380-1389)。

隨著CRISPR技術(shù)越來越多地用于廣泛范圍的模型生物體的基因組工程改造，確定在其他基因組中使用H1啟動子的潛在影響。對在H1啟動子(鼠；大鼠；雞；牛；和斑馬魚)處具有高基因組保守性的5個其他脊椎動物基因組進行該分析。在所有情況下，發(fā)現(xiàn)AN₁₉NGG與GN₁₉NGG位點相比數(shù)目更高：+9%牛；+14%雞；+19％大鼠；+21％小鼠；和+32％斑馬魚(圖4C)。這種普遍性的一個解釋可能是由于較高的AT含量(圖6A、圖6B、圖6C、圖6D、圖6E和圖6F)。在人類基因組中，將GN₁₉NGG和AN₁₉NGG位點存在率針對AT含量均一化使得頻率更接近于等價，盡管這并不對于所有基因組都成立(圖6A和圖6F)。盡管如此，這證明了使用H1啟動子的效用，其使人類基因組中目前可用的CRISPR靶向空間超過倍增，并且在所有其他測試的基因組中類似。

接下來，證明了用H1啟動子構(gòu)建體靶向內(nèi)源基因中AN₁₉NGG位點的能力。使用H7細胞，靶向MERTK基因座(涉及視網(wǎng)膜色素上皮和巨噬細胞中的吞噬作用，并且當突變時引起視網(wǎng)膜變性(D'Cruz等人(2000) Human Molecular Genetics 9:645-651)的第二個外顯子(圖7A和圖7B)。為了估計整體靶向效率，從電穿孔的細胞群體收獲DNA，并進行Surveyor測定。用兩個獨立的PCR反應(yīng)擴增靶位點周圍的區(qū)域，并計算9.5％和9.7％的插入缺失頻率(圖7B)。接下來，分離42個隨機選擇的克隆，并通過Surveyor分析測試突變(數(shù)據(jù)未顯示)。測序揭示7/42(16.7％)具有在靶PAM位點上游3-4個核苷酸內(nèi)成簇的突變。7個克隆中的6個具有獨特的突變(1個克隆是冗余的)，且這些中的3個是雙等位基因移碼突變，其導致預測的空MERTK等位基因，其通過Western印跡分析證實(圖7C和圖7D)?？傊@些結(jié)果證明有效靶向位于內(nèi)源基因座處的AN₁₉NGG位點的能力。

由于用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的脫靶突變的出現(xiàn)已經(jīng)變得越來越受關(guān)注，所以使用上述GFP gRNA構(gòu)建體作為模型系統(tǒng)來檢查使用H1啟動子如何可能影響脫靶。使用Surveyor分析來檢查生物信息預測為脫靶位點的三個基因座(GFP_11-33、GFP_219-197和GFP_315-293)。這些構(gòu)建體中的兩個(GFP_219-197和GFP_315-293)是GN₁₉NGG靶位點，允許用兩種啟動子表達。通過附加5'-G核苷酸而從U6啟動子表達一種(GFP_11-33)，AN₁₉NGG位點。在檢查的所有三個脫靶基因座中，不能檢測到任何脫靶切割(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，缺乏可檢測的脫靶可能源于GFP gRNA靶的初始選擇，其中基于與其他基因組基因座的低同源性來選擇位點。因此，推斷更嚴格的挑戰(zhàn)是將來自具體已知能夠引發(fā)高水平脫靶命中的靶向位點處的H1和U6啟動子的gRNA表達進行比較(Fu等人(2013) Nat. Biotechnol.31:822–826; Pattanayak等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):839-43; Cho等人(2014) GenomeResearch 24:132-141)。此外，H1啟動子的5'核苷酸靈活性允許直接比較U6和H1啟動子之間靶向 GN₁₉NGG位點的相同gRNA。測試先前從Fu等人(2013)報道的兩個位點：VEGFA位點1(T1)和VEGFA位點3(T3)(表4、圖8A、圖8B、圖8C和圖8D)((Fu等人(2013) Nat.Biotechnol.31:822–826; Cho等人(2014) Genome Research 24:132-141)。因為已經(jīng)顯示增加的gRNA和Cas9濃度導致增加的脫靶命中((Fu等人(2013) Nat. Biotechnol.31:822–826; Pattanayak等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):839-43; Hsu等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):827-32)，推斷來自H1啟動子的較低的gRNA表達水平(Boden等人(2003) Nucleic Acids Res. 31:5033-5038; An等人(2006) Molecular Therapy :TheJournal of the American Society of Gene Therapy 14:494-504; Makinen等人(2006) The Journal of Gene Medicine 8:433-44)也可以減少脫靶效應(yīng)。使用qRT-PCR，測試來自H1和U6啟動子的VEGFA T1gRNA的相對水平，證實來自H1啟動子的預期表達水平降低(圖8A)。對于VEGFA T1位點，測試在靶向基因座以及四個脫靶位點處的切割效率。與U6啟動子相比，在中靶基因座處的切割相當或略微降低；然而，H1啟動子表達的gRNA在檢查的脫靶基因座處顯著更嚴格，表明更高的特異性(脫靶1：8% vs. 25%；脫靶2：不可檢出 vs. 20%；和脫靶4：9% vs. 26%)(表4、圖8A、圖8B、圖8C和圖8D)。在VEGFA T3位點處，檢測到兩個啟動子構(gòu)建體之間相等的靶向(26％)，但用H1啟動子再次觀察到較低水平的脫靶切割(表4、圖8A、圖8B、圖8C和圖8D)。盡管需要進行對H1和U6啟動子表達的gRNA的進一步研究，但數(shù)據(jù)表明來自H1表達的gRNA的可能更大的特異性。

使用H1啟動子方法的額外脫靶相關(guān)優(yōu)點涉及最近描述和有希望的采用用D10A Cas9突變體的協(xié)同偏移切口以減輕潛在脫靶效應(yīng)的方法((Ran等人(2013) Cell 6:1380-1389; Mali等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):833-8)。該方法具有嚴格的靶向需要，因為其需要鑒定在相對鏈上定向且在切割位點的約20 bp內(nèi)的兩個側(cè)接CRISPR位點(Ran等人(2013) Cell 154(6):1380-9)。預期通過使用H1啟動子提供的額外靶向密度有助于鑒定合適的側(cè)接位點。

化膿性鏈球菌Cas9體外和體內(nèi)靶向的累積證據(jù)表明，Cas9:gRNA識別延伸遍及整個20個堿基對靶向位點。首先，在針對gRNA特異性體外測試>10¹²種不同變體中，一項研究發(fā)現(xiàn)+1核苷酸在目標識別中起作用。此外，從該數(shù)據(jù)的位置特異性計算顯示，5'核苷酸在其目標識別中比其3'相鄰者貢獻更大的作用，表明CRISPR特異性的“種子”模型可能過度簡化了PAM近端核苷酸的貢獻(Pattanayak等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):839-4328)。其次，替代用途諸如CRISPR干擾(CRISPRi)(其重新旨在用于轉(zhuǎn)錄抑制的CRISPR系統(tǒng))發(fā)現(xiàn)，gRNA中的5'截短嚴重損害抑制，并且具有錯配核苷酸(諸如用于U6表達的錯配G堿基)的5'延伸也降低抑制效率，表明長度(20nt)和5'核苷酸背景兩者對于適當?shù)腃as9靶向都是重要的(Ran等人(2013) Cell 154(6):1380-9; Mali等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):833-8; Larson等人(2013) Nature Protocols 8:2180-2196; Qi等人(2013) Cell 152:1173-1183; Shan等人(2013) Nat. Biotechnol.31:686-688)。最后，晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進一步支持Cas9中的5'核苷酸的實驗數(shù)據(jù)和重要性，因為gRNA的5'核苷酸和目標DNA的3'末端發(fā)生顯著的接觸(Jinek等人(2014) Science 343:6176); Nishimasu等人(2014) Cell 156:935-949)。

對于增加的靶向空間，已顯示使用替代Cas9蛋白是有效的，如在腦膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitides)和嗜熱鏈球菌(S. thermophiles)中一樣(Hou等人(2013) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110(39):15644-9;Esvelt等人(2013) Nature Methods 10(11):1116-21)。然而，盡管這些替代蛋白的潛能，來自已報道的其他II型系統(tǒng)的PAM限制具有更嚴格的要求(數(shù)據(jù)未顯示；Cong等人(2013) Science 339:819-823; Hou等人(2013) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 110(39):15644-9)。相比之下，預期通過使用H1啟動子的修飾的gRNA表達大大延伸任何Cas9蛋白的靶向庫，而不考慮PAM差異。當定量直系同源Cas9蛋白的各自gRNA靶向(對于腦膜炎奈瑟氏球菌，AN₂₃NNNNGATT vs. GN₂₃NNNNGATT，且對于嗜熱鏈球菌，AN₁₇NNAGAAW vs. N₁₇NNAGAAW)時，發(fā)現(xiàn)具有5'-A核苷酸的gRNA位點增加64％和69％，表明通過使用H1啟動子與替代Cas9蛋白，靶向空間的甚至更大擴展(表5)。如植物中所表明，使用不同的啟動子可以擴展CRISPR位點的頻率。盡管U6啟動子限于5'鳥苷核苷酸，但來自稻的U3啟動子被限制于5'腺苷核苷酸，進一步突出了在不同系統(tǒng)中需要不同啟動子來增加靶向空間(Shan等人(2013) Nat. Biotechnol.31:686-688)。便利地，可以單獨使用H1啟動子來經(jīng)由單一啟動子系統(tǒng)來靶向AN₁₉NGG和GN₁₉NGG位點(以及可能的CN₁₉NGG或TN₁₉NGG位點(Tuschl (2002) Nat. Biotechnol.20:446-448)))(圖9A和圖9B)。這進而可以用于用改變的位點限制來擴大當前和未來的Cas9變體的靶位空間。

通過明智的位點選擇、改進的Cas9變體、優(yōu)化的gRNA結(jié)構(gòu)或其他輔因子增強CRISPR靶向，將可能導致整個靶向序列的特異性增加，使得5'核苷酸的身份更加重要。作為研究工具，這將允許基因組的更大操縱，同時盡可能降低混雜突變，并且對于未來的臨床應(yīng)用，高靶向密度以及高保真目標識別將對于提供安全和有效的療法是最重要的。

表4通過U6或H1表達的gRNA在中靶和脫靶位點處誘導的插入缺失的頻率

。

表5人類基因組中的替代Cas9靶向位點的生物信息學分析。從左向右移動的列表明Cas9來源物種、CRISPR靶位點、未掩蔽的人類基因組中存在的頻率以及重復掩蔽的人類基因組中存在的頻率。在適當值后面以粗體表明百分比增加。

討論

增加CRISPR靶向空間和減少脫靶效應(yīng)的可能性對基因組工程改造具有廣泛的影響。對于增加的靶向空間，已經(jīng)顯示使用替代Cas9蛋白是有效的，如在嗜熱鏈球菌(NNAGAAW)和腦膜炎奈瑟氏球菌(NNNNGATT)中一樣，但來自迄今報道的其他II型系統(tǒng)的PAM限制具有更嚴格的需求，因此當單獨使用時減少可用于靶向的序列空間(數(shù)據(jù)未顯示和Cong等人(2013) Science 339:819-823; Hou等人(2013) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 110(39):15644-9)。相比之下，預期通過使用H1啟動子的修飾的gRNA表達大大延伸任何Cas9蛋白的靶向庫。在植物中，盡管U6啟動子限于5'鳥苷核苷酸，但來自稻的U3啟動子限制于5'腺苷核苷酸。如新近所表明，兩種啟動子的使用可以擴大植物基因組中CRISPR位點的頻率(Shan等人(2013) Nat. Biotechnol.31:686-688)。便利地，可以單獨使用H1啟動子來經(jīng)由單一啟動子系統(tǒng)來靶向脊椎動物基因組中的AN₁₉NGG和GN₁₉NGG位點。這進而可以用于用改變的位點限制來擴大當前和未來的Cas9變體的靶位空間。

與ZFN或TALEN技術(shù)類似，一種減少潛在脫靶效應(yīng)的方法可能是采用以Cas9突變體(D10A)的協(xié)同偏移切口(offset nicking)(Mali等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):833-8; Ran等人(2013) Cell 154(6):1380-9)。這需要鑒定相對鏈上的兩個側(cè)接CRISPR位點，并且將預期由AN₁₉NGG位點提供的額外靶向密度增強該方法。相對于U6啟動子的額外益處還可以是減少假切割；因為幾個研究組已報道增加的gRNA和Cas9濃度與脫靶突變傾向的增加相關(guān)(Pattanayak等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):839-43; Hsu等人(2013) Nat. Biotechnol., 31(9):827-32; Fu等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):822-6)，由H1啟動子提供的較低表達水平可以導致減少的脫靶切割。此外，Pattanayak等人報道Cas9:gRNA識別延伸遍及整個20個堿基對靶向位點(Pattanayak等人(2013) Nat.Biotechnol.31(9):839-43)。在針對gRNA特異性測試>10¹²種不同的變體中，作者發(fā)現(xiàn)+1核苷酸有助于目標識別，表明過度簡化了CRISPR特異性的“種子”模型(PAM近端核苷酸)。通過明智的位點選擇、改進的Cas9變體、優(yōu)化的gRNA結(jié)構(gòu)或其他輔因子增強CRISPR靶向，將可能導致整個23bp靶向序列的特異性增加，使得5'核苷酸的身份更加重要。作為研究工具，這將允許基因組的更大操縱，同時盡可能降低混雜突變，并且對于未來的臨床應(yīng)用，高靶向密度以及高保真目標識別將對于提供安全和有效的療法是最重要的。

實施例2

圖10A、圖10B、圖10C、圖10D和圖10E顯示使用H1啟動子作為雙向啟動子以同時表達Cas9蛋白和向?qū)NA。顯示雙向H1啟動子，其表達Cas9作為向左(負鏈)的pol II轉(zhuǎn)錄物和向?qū)NA作為向右(正鏈)的pol III轉(zhuǎn)錄物?？偙磉_盒約為4.4kb(圖10A)。為了測試從雙向H1構(gòu)建體引導CRISPR介導的切割的能力，將使用靶向eGFP的gRNA的雙向構(gòu)建體克隆至質(zhì)粒中并在表達GFP的人干細胞中表達(圖10B)。目視檢測到GFP的丟失(圖10C；中間圖，箭頭)，表明由于表達構(gòu)建體導致的成功表達和GFP的靶向。還通過Surveyor測定顯示了成功的CRISPR靶向，其中泳道2和3中存在兩個條帶(圖10D)。使用H1啟動子的雙向CRISPR構(gòu)建體生成~4.75b的緊密靶向盒，其在腺相關(guān)病毒的包裝范圍內(nèi)(圖10E)。以橙色顯示SV40終止子，并且所述構(gòu)建體側(cè)接病毒生產(chǎn)所需的反向末端重復(ITR)序列；

方法

質(zhì)粒構(gòu)建：為了生成H1雙向構(gòu)建體，將人密碼子優(yōu)化的Cas9基因和SV40終止子與230bp H1啟動子(SEQ ID NO:54)融合，其中pol II轉(zhuǎn)錄物是內(nèi)源性發(fā)現(xiàn)的(負鏈)。在H1啟動子和gRNA支架之間，將AvrII位點工程改造以允許靶向序列的插入。然后將SV40[rev]::hcas9[rev]::H1::gRNA支架::pol III終止子序列克隆至NdeI/XbaI消化pUC19載體。為了生成本研究中使用的各種gRNA，將重疊寡核苷酸退火，并通過PCR使用兩步擴增Phusion Flash DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)擴增，隨后使用與2X體積25％ PEG和1.5M NaCl混合的羧化物修飾的Sera-Mag磁珠(Thermo Fisher Scientific)純化。然后將純化的PCR產(chǎn)物重懸浮于H₂O中，并使用NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific)定量。使用Gibson Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA) (Gibson等人(2009) Nature Methods 6:343-345)以輕微改良生成表達gRNA的構(gòu)建體?？偡磻?yīng)體積從20μl減少至2μl。

細胞培養(yǎng)：通過根據(jù)前面描述的方案(Walker等人(2010) Nat. Commun.1:71; Maruotti等人(2013) Stem Cells Translational Medicine 2:341-354)在10% CO₂/5% O₂培養(yǎng)箱中在mTeSR1培養(yǎng)基(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC)中的生長因子減少的Matrigel(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)上克隆繁殖來維持hESC系H7和IMR-90 iPS細胞(WiCell, Madison WI)。為了傳代，首先將hESC集落與mTesR1中的5μM blebbistatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)孵育，然后在用Accutase (Sigma-Aldrich)處理5-10分鐘之后收集。將細胞塊輕輕地離解成單細胞懸浮液，并通過離心沉淀。此后，將hPSC重懸浮于具有blebbistatin的mTeSR1中，并以約1,000-1,500個細胞/cm²鋪板。傳代之后兩天，用mTeSR1(無blebbistatin)替換培養(yǎng)基并每日更換。

將人胚胎腎(HEK)細胞系293T(Life Technologies, Grand Island, NY)在37℃、5% CO₂/20% O₂下在補充有10％胎牛血清(Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY)和2mM GlutaMAX (Invitrogen)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中維持。

H7細胞的基因靶向：在電穿孔前24小時，在10μM Rho激酶抑制劑(DDD00033325, EMD Millipore, Billerica, MA)中培養(yǎng)hESC細胞。使用Neon試劑盒(Invitrogen)根據(jù)制造商的說明進行電穿孔。簡而言之，在電穿孔當天，將hESC用Accutase (Sigma-Aldrich)消化1-2分鐘，直至集落轉(zhuǎn)移。重要的是，集落不解離成單細胞懸浮液。收集集落之后，將濕沉淀物在冰上保持15分鐘，然后重懸浮于含有基因靶向質(zhì)粒的電穿孔緩沖液中。電穿孔參數(shù)如下：電壓：1400 ms；時間間隔：30 ms；1個脈沖。電穿孔后，將細胞集落緩慢轉(zhuǎn)移至含有10μM Rho激酶抑制劑的mTeSR1培養(yǎng)基中，然后在室溫下保持20分鐘，然后鋪板在Matrigel包被的培養(yǎng)皿上并進一步培養(yǎng)。

為了分析克隆來源的集落，將電穿孔的hESC生長至亞匯合，如前面段落中所述傳代，并以500個細胞/每35mm皿的密度鋪板。隨后，通過手工挑選分離單個集落并進一步培養(yǎng)。

組成型表達的GFP ESC系的生成：將H7人ESC系(WiCell)保持在Matrigel基質(zhì)上的mTeSR1 (Stem Cell Technologies)培養(yǎng)基中。在細胞傳代前，將細胞進行用blebbistatin的短暫預處理(> 5分鐘)以增加細胞活力，用Accutase處理7分鐘，研磨成單細胞懸浮液，用等體積的mTesR猝滅，以80xg離心5分鐘，重懸浮于含有blebbistatin的mTesR中。將1x10⁶個細胞沉淀，小心去除培養(yǎng)基，并將細胞置于冰上10-15分鐘。將R緩沖液中的10μg含有與AAVS1安全港(safe-harbor)基因座的同源性的AAV-CAGGSEGFP供體載體(#22212, Addgene)加上5μg各hAAVS1 1R + L TALENs (#35431和35432, Addgene)(Hockemeyer等人(2009) Nat. Biotechnol. 27:851-857; Sanjana等人(2012) Nature Protocols 7:171-192)使用Neon轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Life Technologies)以100μl尖端型用以下參數(shù)電穿孔：1500V，20ms脈沖和1脈沖。然后將細胞輕輕地添加至1ml培養(yǎng)基，并在室溫下孵育15分鐘，然后鋪板在含有mTeSR和5μM blebbistatin的Matrigel包被的35mm皿上。2天之后，以1x10⁴的密度接種細胞，之后，用熒光配備的Nikon TS100落射熒光顯微鏡手動選擇時間穩(wěn)定的克隆亞系。

基因組修飾的Surveyor測定和測序分析：對于Surveyor分析，通過將細胞重懸浮于QuickExtract溶液(Epicentre, Madison, WI)中、在65℃下孵育15分鐘、然后在98℃下孵育10分鐘來提取基因組DNA。提取物溶液使用DNA Clean and Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA)清洗并通過NanoDrop (Thermo Fisher Scientific)定量。使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)從100ng基因組DNA擴增圍繞CRISPR靶位點的基因組區(qū)域。合并多個獨立的PCR反應(yīng)物，并使用Qiagen MinElute Spin Column根據(jù)制造商的方案(Qiagen, Valencia, CA)純化。將含有12.5mM Tris-HCl (pH 8.8)、62.5mM KCl和1.875mM MgCl₂中的400ng PCR產(chǎn)物的8μl體積變性并緩慢再退火以允許形成異源雙鏈體：95℃持續(xù)10分鐘，以-1.0℃/秒從95℃斜變至85℃，85℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從85℃斜變至75℃，75℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從75℃斜變至65℃，65℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從65℃斜變至55℃，55℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從55℃斜變至45℃，45℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從45℃斜變至35℃，35℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從35℃斜變至25℃，然后保持在4℃。將1μl Surveyor Enhancer和1μl Surveyor Nuclease (Transgenomic, Omaha, NE)添加至每個反應(yīng)物，在42℃下孵育60分鐘，其后將1μl終止溶液添加至反應(yīng)物。使用DNA 1000芯片(Agilent, Santa Clara, CA)在2100 Bioanalyzer上定量1μl反應(yīng)物。對于凝膠分析，將2μl 6X上樣緩沖液(New England Biolabs)添加至剩余的反應(yīng)物，并上樣至含有溴化乙錠的3％瓊脂糖凝膠上。將凝膠在Gel Logic 200成像系統(tǒng)(Kodak, Rochester, NY)上可視化，并使用ImageJ v. 1.46定量。使用二項式推導的方程計算NHEJ頻率：

%基因修飾 =

其中“a”和“b”的值等于背景減去之后的切割片段的積分面積，且“c”等于背景減去之后的未切割PCR產(chǎn)物的積分面積(Guschin等人(2010) Methods in Molecular Biology649:247-256)。

實施例3

圖11A、圖11B和圖11C顯示生成向?qū)NA的5'末端的錘頭核酶。5'順式-錘頭核酶(SEQ ID NO:49)和gRNA (SEQ ID NO:50)描繪于圖11A中。指示錘頭核酶的序列，且指示對于催化重要的核苷酸(紅色是關(guān)鍵的，橙色是重要的)。通過箭頭指示切割的位置。在核酶切割(下圖)后，釋放所得gRNA，而不限于在新形成的5'位置處的任何核苷酸。顯示表達錘頭-gRNA的構(gòu)建體顯示于圖11B中。啟動子，通常pol III啟動子如U6、H1或T7，可用于表達5'順式-錘頭核酶，其在自我切割后將釋放gRNA。用Surveyor測定法將兩個基因座的靶向顯示于圖11C中(HH1 + CGG PAM序列 = SEQ ID NO:51；HH2 + AGG PAM序列 = SEQ ID NO:52)，其中通過5'順式-錘頭核酶成功裂解(箭頭)。

圖12顯示可調(diào)節(jié)的CRISPR構(gòu)建體，其使用適體酶在特異性適配子存在的情況下處理gRNA。具體而言，圖12描繪與錘頭核酶的螺旋II融合的茶堿適配子(橙色)，形成茶堿適體酶，其為gRNA的5'(藍色)。茶堿的結(jié)合穩(wěn)定了螺旋II，其然后允許錘頭自我切割，并釋放gRNA。gRNA，連同Cas9，現(xiàn)在能夠靶向CRISPR系統(tǒng)的切割。

方法

質(zhì)粒構(gòu)建：為了生成由U6、H1或T7啟動子驅(qū)動的5'順式-錘頭構(gòu)建體，將錘頭序列(GTACGTTTCCTCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAACGCGCTTCGGTGCGTC; SEQ ID NO:53)置于啟動子的下游和gRNA目標和支架的上游。為了形成螺旋I，將與gRNA靶序列互補的10個核苷酸置于錘頭序列的5'，其然后將結(jié)合至gRNA中發(fā)現(xiàn)的互補序列(圖12)。為了生成本研究中使用的各種gRNA，將重疊寡核苷酸退火，并通過PCR使用兩步擴增Phusion Flash DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)擴增，隨后使用與2X體積25％ PEG和1.5M NaCl混合的羧化物修飾的Sera-Mag磁珠(Thermo Fisher Scientific)純化。然后將純化的PCR產(chǎn)物重懸浮于H₂O中，并使用NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific)定量。使用Gibson Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA) (Gibson等人(2009) NatureMethods 6:343-345)以輕微改良生成表達gRNA的構(gòu)建體?？偡磻?yīng)體積從20μl減少至2μl。

細胞培養(yǎng)：通過根據(jù)前面描述的方案(Walker等人(2010) Nat. Commun.1:71; Maruotti等人(2013) Stem Cells Translational Medicine 2:341-354)在10% CO₂/5% O₂培養(yǎng)箱中在mTeSR1培養(yǎng)基(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC)中的生長因子減少的Matrigel(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)上克隆繁殖來維持hESC系H7和IMR-90 iPS細胞(WiCell, Madison WI)。為了傳代，首先將hESC集落與mTesR1中的5μM blebbistatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)孵育，然后在用Accutase (Sigma-Aldrich)處理5-10分鐘之后收集。將細胞塊輕輕地離解成單細胞懸浮液，并通過離心沉淀。此后，將hPSC重懸浮于具有blebbistatin的mTeSR1中，并以約1,000-1,500個細胞/cm²鋪板。傳代之后兩天，用mTeSR1(無blebbistatin)替換培養(yǎng)基并每日更換。

將人胚胎腎(HEK)細胞系293T(Life Technologies, Grand Island, NY)在37℃、5% CO₂/20% O₂下在補充有10％胎牛血清(Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY)和2mM GlutaMAX (Invitrogen)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中維持。

H7細胞的基因靶向：在電穿孔前24小時，在10μM Rho激酶抑制劑(DDD00033325, EMD Millipore, Billerica, MA)中培養(yǎng)hESC細胞。使用Neon試劑盒(Invitrogen)根據(jù)制造商的說明進行電穿孔。簡而言之，在電穿孔當天，將hESC用Accutase (Sigma-Aldrich)消化1-2分鐘，直至集落轉(zhuǎn)移。重要的是，集落不解離成單細胞懸浮液。收集集落之后，將濕沉淀物在冰上保持15分鐘，然后重懸浮于含有基因靶向質(zhì)粒的電穿孔緩沖液中。電穿孔參數(shù)如下：電壓：1400 ms；時間間隔：30 ms；1個脈沖。電穿孔后，將細胞集落緩慢轉(zhuǎn)移至含有10μM Rho激酶抑制劑的mTeSR1培養(yǎng)基中，然后在室溫下保持20分鐘，然后鋪板在Matrigel包被的培養(yǎng)皿上并進一步培養(yǎng)。

為了分析克隆來源的集落，將電穿孔的hESC生長至亞匯合，如前面段落中所述傳代，并以500個細胞/每35mm皿的密度鋪板。隨后，通過手工挑選分離單個集落并進一步培養(yǎng)。

組成型表達的GFP ESC系的生成：將H7人ESC系(WiCell)保持在Matrigel基質(zhì)上的mTeSR1 (Stem Cell Technologies)培養(yǎng)基中。在細胞傳代前，將細胞進行用blebbistatin的短暫預處理(> 5分鐘)以增加細胞活力，用Accutase處理7分鐘，研磨成單細胞懸浮液，用等體積的mTesR猝滅，以80xg離心5分鐘，重懸浮于含有blebbistatin的mTesR中。將1x10⁶個細胞沉淀，小心去除培養(yǎng)基，并將細胞置于冰上10-15分鐘。將R緩沖液中的10μg含有與AAVS1安全港(safe-harbor)基因座的同源性的AAV-CAGGSEGFP供體載體(#22212, Addgene)加上5μg各hAAVS1 1R + L TALENs (#35431和35432, Addgene)(Hockemeyer等人(2009) Nat. Biotechnol. 27:851-857; Sanjana等人(2012) Nature Protocols 7:171-192)使用Neon轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Life Technologies)以100μl尖端型用以下參數(shù)電穿孔：1500V，20ms脈沖和1脈沖。然后將細胞輕輕地添加至1ml培養(yǎng)基，并在室溫下孵育15分鐘，然后鋪板在含有mTeSR和5μM blebbistatin的Matrigel包被的35mm皿上。2天之后，以1x10⁴的密度接種細胞，之后，用熒光配備的Nikon TS100落射熒光顯微鏡手動選擇時間穩(wěn)定的克隆亞系。

基因組修飾的Surveyor測定和測序分析：對于Surveyor分析，通過將細胞重懸浮于QuickExtract溶液(Epicentre, Madison, WI)中、在65℃下孵育15分鐘、然后在98℃下孵育10分鐘來提取基因組DNA。提取物溶液使用DNA Clean and Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA)清洗并通過NanoDrop (Thermo Fisher Scientific)定量。使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)從100ng基因組DNA擴增圍繞CRISPR靶位點的基因組區(qū)域。合并多個獨立的PCR反應(yīng)物，并使用Qiagen MinElute Spin Column根據(jù)制造商的方案(Qiagen, Valencia, CA)純化。將含有12.5mM Tris-HCl (pH 8.8)、62.5mM KCl和1.875mM MgCl₂中的400ng PCR產(chǎn)物的8μl體積變性并緩慢再退火以允許形成異源雙鏈體：95℃持續(xù)10分鐘，以-1.0℃/秒從95℃斜變至85℃，85℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從85℃斜變至75℃，75℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從75℃斜變至65℃，65℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從65℃斜變至55℃，55℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從55℃斜變至45℃，45℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從45℃斜變至35℃，35℃持續(xù)1秒，以-1.0℃/秒從35℃斜變至25℃，然后保持在4℃。將1μl Surveyor Enhancer和1μl Surveyor Nuclease (Transgenomic, Omaha, NE)添加至每個反應(yīng)物，在42℃下孵育60分鐘，其后將1μl終止溶液添加至反應(yīng)物。使用DNA 1000芯片(Agilent, Santa Clara, CA)在2100 Bioanalyzer上定量1μl反應(yīng)物。對于凝膠分析，將2μl 6X上樣緩沖液(New England Biolabs)添加至剩余的反應(yīng)物，并上樣至含有溴化乙錠的3％瓊脂糖凝膠上。將凝膠在Gel Logic 200成像系統(tǒng)(Kodak, Rochester, NY)上可視化，并使用ImageJ v. 1.46定量。使用二項式推導的方程計算NHEJ頻率：

%基因修飾 =

其中“a”和“b”的值等于背景減去之后的切割片段的積分面積，且“c”等于背景減去之后的未切割PCR產(chǎn)物的積分面積(Guschin等人(2010) Methods in Molecular Biology649:247-256)。

實施例4

概述

視網(wǎng)膜色素變性(RP)是一種遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病，其中視網(wǎng)膜感光細胞(視桿細胞和視錐細胞)的功能障礙和死亡導致視力喪失且可能致盲。存在RP的常染色體隱性和常染色體顯性遺傳形式兩者(分別為ARRP和ADRP)。在ARRP中，在負責該疾病的基因的兩個拷貝中都存在突變(對于大多數(shù)基因，該基因的一個拷貝從其母體遺傳，而另一個拷貝從其父體遺傳)。與ARRP相關(guān)的引起疾病的突變通常導致所涉及的基因的功能喪失，即視網(wǎng)膜變性是由于所涉及的基因執(zhí)行其正常功能的能力的喪失。在此類情況下，很清楚，至少在理論上，需要做什么來開發(fā)適當?shù)闹委?- 技術(shù)人員需要替換丟失的基因功能。該方法的典型實例是正在進行的Leber先天性黑蒙病(LCA)的人類治療研究，其中使用腺相關(guān)病毒(AAV)的基因療法來替代引起疾病的缺陷型RPE65基因的功能。

在ADRP中，與ARRP不同，引起疾病的基因的兩個拷貝中僅一個被突變。在大多數(shù)情況下，該單突變基因不會引起視網(wǎng)膜變性，因為其已經(jīng)喪失功能；相反，其引起疾病，因為突變導致產(chǎn)生已經(jīng)獲得新功能(對視桿和/或視錐感光細胞有毒或有害的功能)的基因產(chǎn)物。這種情況使得基因置換策略更復雜，因為引入功能基因是不夠的；有效的療法需要開發(fā)消除從具有毒性突變的基因產(chǎn)生的“壞”基因產(chǎn)物的表達的方法并維持遺傳學家稱為“野生型”(WT)基因的基因的未突變拷貝的功能兩者。

目前，沒有FDA批準的用于ADRP的治療。大多數(shù)正在進行的實驗室和動物研究采取兩步法：1)消除基因的突變和WT拷貝兩者的功能，然后2)通常經(jīng)由AAV介導的基因療法引入WT基因的新的“硬化(hardened)”形式，其對破壞內(nèi)源性WT基因的第一步中使用的療法耐受。

本公開主題提供了用于ADRP治療的新策略，其利用CRISPR/Cas9基因編輯來精確地靶向編輯活生物體的基因組信息，即其允許對一個基因的治療性調(diào)節(jié)。本公開的方法使用CRISPR/Cas9基因編輯來特異性改變引起疾病的基因的突變拷貝，使得其不表達其毒性基因產(chǎn)物，而不影響WT基因的表達。例如，與ADRP相關(guān)的視紫紅質(zhì)基因的突變體形式(P23H)可以被特異性靶向，改變其序列，使得其不再表達毒性基因產(chǎn)物。在一些實施方案中，將CRISPR/Cas9組分在單個AAV病毒顆粒內(nèi)遞送至眼睛。該系統(tǒng)在ADRP的P23H視紫紅質(zhì)小鼠突變體模型中測試。這些研究驗證了基于用于治療ADRP的視網(wǎng)膜細胞的定制基因工程改造的基因療法的新方法。本公開主題適用于ADRP的各種形式以及其他常染色體顯性遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良。

具體目標

視網(wǎng)膜色素變性的常染色體顯性形式(ADRP)構(gòu)成RP的所有病例的約30-40％，并且在ADRP患者中，最常見的突變的RP相關(guān)基因是編碼視桿視色素視紫紅質(zhì)的基因(Dryja等人(1990) The New England Journal of Medicine 323, 1302-1307; Dryja等人(1990) Nature 343, 364-366)。本公開主題提供了通過使用CRISPR/Cas9基因編輯 技術(shù)來治療ADRP的方法(Doudna & Charpentier (2014) Science 346, 1258096; Hsu等人(2014) Cell 157, 1262-1278)，其中RNA引導的Cas9內(nèi)切核酸酶與可定制的小向?qū)NA(gRNA)結(jié)合使用以靶向和切割突變體視紫紅質(zhì)等位基因。易錯非同源末端連接(NHEJ)特異性敲除突變體等位基因的表達，而不影響正常等位基因。所需組分可以通過單個AAV5(在哺乳動物視桿中具有記載的性能的AAV血清型)遞送至光感受器。即使僅出現(xiàn)視紫紅質(zhì)的野生型水平的50％的表達，動物數(shù)據(jù)也表明這足以提供臨床上有用的視桿功能(Liang等人TheJournalofBiological Chemistry 279, 48189-48196)。

盡管通過小鼠和其他動物研究已經(jīng)顯示疾病突變的CRISPR靶向在體外和體內(nèi)是有效的，但所有目前的方法仍然遠離臨床使用，這在很大程度上歸因于遞送限制。AAV載體是眼部基因療法中最常用的病毒載體(Dalkara & Sahel (2014) ComptesRendusBiologies 337, 185-192; Day等人(2014) AdvancesinExperimentalMedicineand Biology 801,687-693; Willett & Bennett (2013) Frontiers in Immunology 4, 261; Dinculescu等人(2005) Human GeneTherapy 16, 649-663)。幾個特征使得AAV成為有吸引力的選擇：所述病毒是非致病性的，其感染分裂和非分裂細胞，表達可以持續(xù)長時間段，并且其對于其在臨床試驗中的安全性、效力和一般缺乏毒性的歷史是特別值得注意的。此外，正在開發(fā)在玻璃體內(nèi)注射后有效靶向感光細胞的變體AAV血清型和啟動子的組合。然而，由于在其當前狀態(tài)下，這些載體觸發(fā)免疫應(yīng)答，并且缺乏對人類大小的眼睛中光感受器的有效的全視網(wǎng)膜趨向性(Kotterman等人(2015) Gene therapy 22, 116-126；Mowat(2014) Gene Therapy 21, 96-105；Dalkara等人(2013) Science Translational Medicine 5, 189ra176)，將聚焦于已經(jīng)良好表征的通過視網(wǎng)膜下注射施用的AAV5載體的用途。

AAV基因組是4.7kb單鏈DNA分子，其可以被修飾以攜帶最多達5.2kb的重組DNA，盡管推動該限制導致降低的包裝效率和缺失的插入(Berns等人(1986) FundamentalVirology, ed B.N.Fields and Knipe, D.M., 545-562 Raven Press)。由于編碼通常使用的Cas9蛋白(4.1kb)本身的基因的大尺寸，通過單個病毒載體遞送gRNA，包括表達所必需的啟動子、終止子和病毒反向末端重復(ITR)序列，目前受到這種AAV包裝能力的限制。實際上，活性CRISPR復合物的重構(gòu)需要共轉(zhuǎn)導，其與單一轉(zhuǎn)導相比效率更低。此外，這需要較大的病毒劑量，其可潛在地誘導較大的免疫應(yīng)答和相關(guān)毒性。此外，可能的是，在人試驗中遞送第二病毒載體會導致FDA批準的額外挑戰(zhàn)。

CRISPR/Cas9技術(shù)的開發(fā)已經(jīng)徹底改革了基因編輯的領(lǐng)域。基因組編輯技術(shù)的早期方法，諸如鋅指核酸酶(ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(TALEN)，賦予生成靶向的基因組修飾并提供準確地校正疾病突變的潛力的能力。盡管有效，但這些技術(shù)受實際限制的阻礙，因為ZFN和TALEN配對都需要合成用于給定DNA靶位點的大且獨特的識別蛋白。許多研究組最近已經(jīng)報道了繞過這些關(guān)鍵限制的通過使用工程改造的II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)的高效基因組編輯(Jinek等人(2012) Science 337, 816-821; Cong等人(2013) Science339, 819-823; Mali等人(2013) Science 339, 823-826)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由將Cas9核酸酶靶向至序列特異性DNA的向?qū)NA(gRNA)構(gòu)成。由于CRISPR/Cas9基因組編輯依賴于用于基因組靶向的短的合成gRNA，而不是如ZFN和TALEN所需的核酸酶內(nèi)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的獨特組合，所以使得制備ZFN和TALEN表達所必需的構(gòu)建體的耗時且繁重的任務(wù)得到消除。生成用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建體是簡單且快速的，并且可以將目標多重化。通過CRISPR系統(tǒng)的切割需要gRNA與20-核苷酸DNA序列的互補堿基配對以及必需的前間區(qū)序列鄰近基序(PAM)（在靶位點的3'處發(fā)現(xiàn)的短核苷酸基序）。在理論上，技術(shù)人員可以使用CRISPR技術(shù)靶向基因組中的任何獨特的N₂₀-PAM序列。目前，最少限制和最常用的Cas9蛋白來自化膿性鏈球菌，其識別序列NGG，因此，CRISPR靶向序列是N₂₀NGG。NGG序列中的簡并 N ，意味著鑒于20個核苷酸(N₂₀)的獨特序列，Cas9會同樣地切割N₂₀AGG、N₂₀TGG、N₂₀CGG和N₂₀GGG，這可以是用于精確靶向等位基因的問題。

對于體內(nèi)視紫紅質(zhì)基因靶向，通過視網(wǎng)膜下施用適當工程改造的AAV5載體將所需CRISPR/Cas9效應(yīng)分子遞送至視桿細胞。已經(jīng)顯示血清型5載體在轉(zhuǎn)導非人靈長類動物(Mancuso等人(2009) Nature 461, 784-787)和犬(Beltran等人(2012) ProceedingsoftheNational Academy of Sciences of the UnitedStatesofAmerica109, 2132-2137)光感受器方面非常有效，且能夠介導視網(wǎng)膜療法。盡管衣殼修飾的AAV載體可以在小鼠中從玻璃體滲透至光感受器(Petrs-Silva等人(2011) MolecularTherapy:the Journal of the American Society of Gene Therapy 19, 293-301)，但迄今為止，它們在狗或非人靈長類動物中不能類似地滲透(未公開的觀察結(jié)果)。

經(jīng)由AAV遞送Cas9和向?qū)NA中的重要挑戰(zhàn)在于表達兩種組分所需的DNA超過AAV的包裝限度，約4.7-4.9kb，而通過常規(guī)方法表達Cas9和gRNA所需的DNA超過5 kb(啟動子，~500bp；spCas9, 4,140bp；Pol II終止子，~250bp；U6啟動子，~315bp；和gRNA，~100bp)。Swiech等人(2015, Nature Biotechnology 33, 102-106)通過使用以下雙載體方法解決了該挑戰(zhàn)：一種AAV載體遞送Cas9，另一種AAV載體遞送gRNA。然而，該研究中的雙AAV方法利用特別小的啟動子，鼠Mecp2啟動子，其盡管在視網(wǎng)膜細胞中表達，但不在視桿中表達(Song等人(2014) Epigenetics & chromatin 7, 17; Jain等人(2010) Pediatric Neurology 43, 35-40)。因此，如構(gòu)建的該系統(tǒng)將不適用于ADRP的大多數(shù)情況。本公開主題提供用于視網(wǎng)膜基因編輯的單一載體方法，其應(yīng)當提高效率，特異性靶向光感受器，并降低來自病毒載量遞送的潛在毒性。

結(jié)果

H1啟動子，而不是更傳統(tǒng)使用的U6啟動子，已經(jīng)用于引導gRNA轉(zhuǎn)錄并且允許可用的CRISPR基因靶向空間的近似倍增(Ranganathan等人(2014) Nature Communications 5, 4516)。值得注意的是，檢測到脫靶切割的較低傾向，表明H1啟動子更有利于治療方法。在這些研究期間，注意到在與內(nèi)源性H1RNA基因緊密接近的基因組中存在蛋白編碼基因(PARP-2)(Baer等人(1990) Nucleic Acids Research 18, 97-103; Myslinski等人(2001) Nucleic Acids Research 29, 2502-2509)。H1RNA(pol III RNA轉(zhuǎn)錄物)和PARP-2基因(pol II轉(zhuǎn)錄物)的起始之間的序列為230bp(圖13)，表明該相對小的序列可以作為緊密的雙向啟動子發(fā)揮功能。據(jù)信這是哺乳動物基因組中唯一的雙向啟動子序列，其可以引導pol II和pol III轉(zhuǎn)錄物，并且可以用于克服將兩種CRISPR組分包裝至單一AAV中的尺寸障礙。

為了開發(fā)H1作為用于雙重Cas9/gRNA表達的雙向pol II/III啟動子的用途，并且因為其poll III活性已經(jīng)被充分表征，產(chǎn)生eGFP報道構(gòu)建體以更好地優(yōu)化其pol II活性(圖14)。人(HEK293)和小鼠細胞(NIH3T3)中的初始結(jié)果證明弱、但可清楚檢測的GFP熒光，表明H1啟動子可以引導pol II表達，盡管弱。使用該GFP報道系統(tǒng)，通過評估系統(tǒng)中的三種可變組分：啟動子序列、5'UTR和終止子序列，pol II表達增加，同時維持啟動子的緊密性。測試來自不同生物體的H1啟動子序列表明，小鼠(176bp)和大鼠(207bp)序列能夠比人H1啟動子驅(qū)動更強的GFP表達(分別為~7倍和~6倍)。然而，由于目標是得到用于人細胞體內(nèi)使用的系統(tǒng)，在可能的情況下使用人啟動子序列。為了評估不同的終止子序列，測試了七種不同的序列，發(fā)現(xiàn)SV40 (240 bp)終止子和49 bp合成聚(A)序列(SPA)(Levitt等人(1989) Genes & Development 3, 1019-1025)對于GFP表達均有功能。盡管通過修飾5'UTR來優(yōu)化翻譯效率以改善報道分子表達，但發(fā)現(xiàn)取自β-球蛋白5'UTR序列的50 bp序列的插入能夠顯著改善報道分子表達。與該概念一致，編碼強Kozak序列的9個堿基(Kozak (1987) Nucleic Acids Research 15, 8125-8148) (5’-GCCGCCACC-3’)的簡單插入足以接近這些水平(圖15)。

基于從這些基于GFP的優(yōu)化實驗得到的信息，使用人H1啟動子序列生成靶向構(gòu)建體以同時表達Cas9蛋白和靶向gRNA。為了測試這些雙向構(gòu)建體在細胞中引導切割的能力，用標準雙質(zhì)粒方法(pCAAGS:Cas9和H1:gRNA)或用表達兩種組分的單質(zhì)粒系統(tǒng)將NIH3T3細胞電穿孔。靶向小鼠基因組中的兩個不同的基因座。在電穿孔之后48小時，收獲基因組DNA，并進行T7 Endo I (T7EI)測定(Ran等人(2013) Nature protocols 8, 2281-2308)以定量基因組修飾的水平。使用T7EI測定法，而不是更傳統(tǒng)的Surveyor測定法，因為已經(jīng)報道其在檢測缺失中更靈敏(Vouillot等人(2015) G3)。據(jù)發(fā)現(xiàn)，可以使用緊密雙向系統(tǒng)將CRISPR切割有效地靶向至這兩個基因座，所述緊密雙向系統(tǒng)為約4.7 kb，完全在AAV的包裝容量內(nèi)(圖16A和圖16B)。進一步證明該靶向策略在人細胞中的適用性和相關(guān)性，在人H7胚胎干細胞系中存在Cas9靶向的數(shù)據(jù)。通過使用小鼠H1啟動子代替人序列和使用SPA終止子代替SV40終止子序列，靶向構(gòu)建體的尺寸在理論上可以再減少200 bp。這些序列減少可以允許更有效的包裝，或潛在地為以下增加空間：可以增強、減少和甚至調(diào)節(jié)Cas9系統(tǒng)的表達的序列修飾；可以對于減少潛在的脫靶效應(yīng)重要的修飾。已經(jīng)生成了具有獨特的限制性位點連同側(cè)接的NotI位點的雙向質(zhì)粒，所述限制性位點允許使用Gibson克隆方法(NEB)進行簡單的目標插入，所述側(cè)接的NotI位點可以被容易地克隆至來自不含AAV輔助者的系統(tǒng)(Agilent)的含有ITR的載體中。

設(shè)計和優(yōu)化Cas9和gRNA啟動子、RNA加工和結(jié)構(gòu)元件，使得它們可以有效地從單個AAV載體系統(tǒng)表達并生成適當?shù)腉MP樣臨床前載體。

通過同時驅(qū)動Cas9和gRNA的表達的雙向H1啟動子的組合和優(yōu)化努力，已經(jīng)在AAV包裝能力下減小CRISPR遞送的尺寸方面已經(jīng)取得了實質(zhì)性進展。來自替代啟動子序列、5'-3'UTR修飾和不同gRNA的各種組合提供了測試靶向效率的潛在譜的工具包。

一旦在尺寸、表達和切割效率方面進一步優(yōu)化構(gòu)建體，它們就可用于生成用于體外和體內(nèi)測試的AAV載體。用于優(yōu)化研究的構(gòu)建體含有允許簡單目標插入的獨特限制性位點，連同允許克隆至含有ITR的載體質(zhì)粒中用于AAV產(chǎn)生的側(cè)接的NotI位點。用于細胞培養(yǎng)和小鼠研究的高滴度GMP樣臨床前AAV5載體可以在獨立的載體生產(chǎn)設(shè)備中使用不含輔助者的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法生成，并通過我們開發(fā)的先前開發(fā)的技術(shù)純化(Dryja等人(1990) The New England Journal of Medicine 323, 1302-1307; Dryja等人(1990) Nature 343, 364-366)。每種病毒制備物可以使用pDG mini-Ad質(zhì)粒DNA輔助系統(tǒng)產(chǎn)生，所述pDG mini-Ad質(zhì)粒DNA輔助系統(tǒng)在最終載體中消除WT腺病毒和能夠復制的AAV的污染。載體通過碘克沙醇梯度離心、隨后Q-柱FPLC色譜來純化。為了建立AAV載體儲備物的GMP樣純度，每種載體可以進行一套標準化的物理和生物測定法，包括評價純度、生物負載、無菌性、含有DNA的顆粒滴度、感染滴度、顆粒與感染性比率和由能夠復制的AAV的潛在污染。

盡管迄今為止的H1啟動子的研究表明低水平的脫靶效應(yīng)(Ranganathan等人(2014) Nature Communications 5,4516)，但因為正在以最終臨床使用的目標開發(fā)構(gòu)建體，應(yīng)當針對潛在的脫靶活性仔細地監(jiān)測它們(Wu等人(2014) Quantitative Biology 2,59-70)。為此目的，可以追尋幾種補充方法。采用生物信息學方法，使用定制的Perl腳本來測定人和小鼠基因組中的所有潛在的CRISPR位點，所述Perl腳本經(jīng)撰寫用于搜索兩條鏈和23-mer CRISPR序列位點的重疊出現(xiàn)率(Ranganathan等人，手稿準備中，2015 )。例如，在人類基因組中，在過濾掉重復序列之后鑒定了137,409,562個CRISPR位點的初始集合。然后根據(jù)定制算法對每個位點評分，所述定制算法基于偏向3'或PAM末端(種子區(qū)域)的23堿基序列的獨特性來分配值(Jinek等人(2012) Science 337:816-821)。最后，通過使用Bowtie (Langmead等人(2009) Genome Biology 10, R25)來將每個CRISPR位點重新比對回基因組上(在整個靶向序列中允許最多達三個堿基錯配)來計算每個位點表現(xiàn)出脫靶效應(yīng)的傾向。使用計算預測的脫靶，可以針對任何假性靶向測試每個gRNA。側(cè)接預測的潛在脫靶位點的PCR引物可用于擴增基因組序列，其然后可以用T7EI測定法測試其切割效率。這將允許針對體外和體內(nèi)優(yōu)化實驗監(jiān)測靶向準確度。小于0.5％脫靶切割將是目標，盡管小于5％將是可接受的。

盡管已經(jīng)聚焦于標準Cas9靶向，但也考慮替代方法，包括靶向替代PAM序列。已經(jīng)報道了Cas9靶向具有除了標準NGG序列以外的NAG的PAM基序(Hsu等人(2013) Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.2647)。已經(jīng)鑒定了人序列中的兩個CRISPR序列和與P23H突變重疊的小鼠基因組中的三個靶向序列，其可以提供額外的靶向位點。盡管預期NAG PAM位點效率低于NGG位點(Zhang等人(2014) Scientific Reports 4, 5405)，但這可以提供滴定劑量的機制，如果確定構(gòu)建體具有顯著的脫靶效應(yīng)，這可以是有價值的。可以最初使用Gibson assembly (NEB)將使用NAG PAM位點的5個序列克隆至pH1v126中。兩種人序列可以與Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染(Lipofectamine 3000)至293細胞中，而小鼠質(zhì)粒可以與Cas9質(zhì)粒電穿孔(Invitrogen, Neon)至NIH3T3細胞中。為了檢測gRNA活性，可以定量通過NHEJ在經(jīng)典NGG以及非經(jīng)典NAG位點之間的Cas9切割位點處引入的插入缺失突變的比率。

也可以使用稱為CRISPRi的替代性治療方法，其利用Cas9的核酸酶-死亡形式(dCas9)來特異性抑制P23H等位基因的表達(Qi等人(2013) Cell 152, 1173-1183; Gilbert等人(2013) Cell 154, 442-451; Larson等人(2013) Nature Protocols 8, 2180-2196; Fuller等人(2014) Advances in Experimental Medicine and Biology 801, 773-781)。代替誘導切割，dCas9保持與DNA序列緊密結(jié)合，并且當靶向在活躍轉(zhuǎn)錄的基因內(nèi)部時，通過位阻機制抑制pol II行進可以導致有效的轉(zhuǎn)錄抑制。通過在不誘導DNA斷裂的情況下實現(xiàn)P23H的治療性阻遏，并且鑒于組成型AAV表達，從基因療法和調(diào)節(jié)障礙觀點兩者來看，轉(zhuǎn)錄抑制劑的AAV5遞送可以是有利的?？梢允褂胵RT-PCR來優(yōu)化CRISPRi的轉(zhuǎn)錄抑制以測量視紫紅質(zhì)的等位基因特異性表達。

使用來自P23H小鼠的原代光感受器培養(yǎng)物驗證開發(fā)的AAV5載體在體外切割和敲除突變體視紫紅質(zhì)等位基因的表達的能力。

原代小鼠感光細胞培養(yǎng)物可用于在進行至動物研究之前體外驗證靶向構(gòu)建體。出生后第2-10天的動物可用于收獲和離解小鼠視網(wǎng)膜以分離細胞用于靶向測定。在人(h) Rho:GFP小鼠中測試構(gòu)建體(Chan等人(2004) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 9109-9114)可以允許進一步優(yōu)化視紫紅質(zhì)靶向。hRho-GFP敲入小鼠含有敲入小鼠視紫紅質(zhì)開放閱讀框的人視紫紅質(zhì)-GFP融合體(圖17)。這種部分人源化的小鼠允許靶向感光細胞中的人特異性序列?？梢园邢蛉藃ho序列，然后可以定量來自光感受器的GFP的損失。盡管靶向視紫紅質(zhì)，但GFP報道分子被同框融合，并且因此熒光的損失充當在上游靶位點的易錯NHEJ的便利代理物。用視網(wǎng)膜細胞電穿孔，常規(guī)實現(xiàn)了10-20％的轉(zhuǎn)染效率，并且為了富集CRISPR修飾的細胞群體，可以基于Cas9熒光報道分子的強度分選轉(zhuǎn)染的群體。已經(jīng)生成了與各種P2A:報道蛋白融合的幾種Cas9構(gòu)建體，其允許監(jiān)測熒光活性，而不損害Cas9活性。使用來自Rho:GFP小鼠的視網(wǎng)膜培養(yǎng)物，可以將Cas9:P2A:mCherry報道分子和靶向gRNA電穿孔。然后，培養(yǎng)24小時之后，可以分選雙陽性細胞，由此富集已轉(zhuǎn)染的光感受器。48小時之后，可以將細胞重懸于QuickExtract緩沖液(Epicentre)中以收獲基因組DNA，并通過T7EI測定法測定基因組修飾。類似地，可以使用來自P23H小鼠的原代光感受器培養(yǎng)物驗證視紫紅質(zhì)突變的靶向。甚至用低水平的轉(zhuǎn)染(10％)，如果構(gòu)建體的靶向效率大于10％，可以使用T7EI測定法來檢測基因組編輯，與初始結(jié)果一致。此外，AAV5載體的使用應(yīng)當產(chǎn)生顯著更高的轉(zhuǎn)導效率。

還將進行中靶和脫靶位點的高分辨率和高靈敏度位點特異性深度測序分析。側(cè)接CRISPR靶位點和預測的脫靶位點的基因組序列可以使用高保真聚合酶(NEB, Phusion)擴增15個循環(huán)，然后使用DNA Clean & Concentrator-5 (Zymo)純化。純化的PCR產(chǎn)物可以擴增5個循環(huán)以附接Illumina P5適配子和樣品特異性條形碼，再次純化，然后通過SYBR綠色熒光定量，在BioAnalyzer上分析，并且最后以等摩爾比合并，然后用MiSeq Personal測序儀測序。為了分析測序數(shù)據(jù)，將300bp末端配對的MiSeq讀數(shù)使用Illumina MiSeq Reporter軟件解多重化，隨后對原始讀數(shù)進行適配子和質(zhì)量修剪。將對所有讀數(shù)針對野生型序列進行比對，并且將通過以下計算NHEJ頻率：100 x (插入缺失讀數(shù)的數(shù)目/插入缺失讀數(shù)的數(shù)目 + WT讀數(shù)的數(shù)目)。

驗證來自SA2的改進載體在視網(wǎng)膜下注入P23H小鼠之后體內(nèi)切割和敲除突變體視紫紅質(zhì)等位基因的表達的能力。

下一步將是證明小鼠中的P23H視紫紅質(zhì)突變的體內(nèi)靶向。從生物信息學努力，已經(jīng)鑒定了與小鼠P23密碼子重疊的高評分CRISPR靶向位點。形式N₂₀NGG的CRISPR位點落在反向鏈上：5’-AGTACTGTGGGTACTCGAAGGGG-3’ (PAM加下劃線)。P23H突變是將CCC脯氨酸密碼子改變?yōu)镃AC組氨酸密碼子的C→A顛換。不幸的是，小鼠P23H突變在CRISPR位點內(nèi)的位置落在NGG PAM基序的N中，在靶向位點中對bp同一性不可知的唯一位置。由于這意味著針對P23H序列的CRISPR將不能區(qū)分野生型和P23H序列，且因此預期靶向?qū)⑶懈顑蓚€等位基因，已經(jīng)基于單核苷酸多態(tài)性(SNP)的發(fā)生率開發(fā)了替代方法。

在人類基因組中報道了~17百萬個SNP(包括單堿基變異、插入缺失、STR、MNP等)(每180bp ~1個)，并且這種變異在個性化基因組醫(yī)學背景中是極其重要的。據(jù)推測，利用自然遺傳變異可能不僅提供特異性靶向小鼠模型中的P23H視紫紅質(zhì)等位基因的方法，而且還證明對于未來的基因組工程改造和治療方法將可能變得更加相關(guān)的概念驗證方法。發(fā)現(xiàn)castaneus(Cast)小鼠在不同于C57BL/6J序列的視紫紅質(zhì)基因的脯氨酸23密碼子內(nèi)含有SNP，并且獲得C57BL/6J遺傳背景上的P23H突變小鼠用于分析。SNP與P23H中的致病性C→A顛換直接相鄰，其提供了用于靶向顯性P23H等位基因、而不靶向野生型視紫紅質(zhì)等位基因的方法。由于P23H突變的背景是C57BL/6J，在一代Cast/P23H繁殖之后，獲得雜合小鼠，其含有CRISPR可靶向的視紫紅質(zhì)P23H等位基因和(由于緊密連接的SNP差異)野生型CRISPR耐受的視紫紅質(zhì)等位基因(其通過位于gRNA目標的“種子”區(qū)域中的位置20處的單個錯配而不同)(圖18A、圖18B和圖18C)。

為了驗證該策略的可行性，生成H1雙向構(gòu)建體，其靶向C57BL/6J脯氨酸23密碼子序列(存在于P23H突變體等位基因中的密碼子序列)或Cast小鼠中的脯氨酸23密碼子序列(將存在于雜合P23H/Cast動物的WT視紫紅質(zhì)等位基因中)。將NIH3T3細胞(其含有C57BL/6J SNP)用兩種構(gòu)建體獨立地電穿孔，分離基因組DNA，然后進行T7EI測定以定量基因組修飾的水平。觀察到特異性視紫紅質(zhì)靶向：僅C57BL/6J(即P23H)定向構(gòu)建體產(chǎn)生顯著切割，其中基因組修飾水平接近50％，鑒于總體電穿孔效率低于80％，這可能是靶向潛能的低估(圖19)。除了驗證視紫紅質(zhì)靶向位點和通過緊密雙向構(gòu)建體引導切割的能力以外，這些結(jié)果證明在SNP/突變體序列特異性發(fā)生的體外切割，作為含有單堿基錯配的基于Cast視紫紅質(zhì)序列的gRNA，未能產(chǎn)生可檢測的Cas9切割。

通常認為CRISPR靶向的限制因素是有效的遞送，并且AAV5介導的遞送已經(jīng)顯示能夠轉(zhuǎn)導大多數(shù)光感受器（甚至大規(guī)模地為眼）。鑒于這種高轉(zhuǎn)導率、在50％或更多的轉(zhuǎn)導細胞中發(fā)生的基因編輯以及2/3的NHEJ事件導致移碼突變，應(yīng)當在多數(shù)視桿和(在進一步優(yōu)化的情況下)在大多數(shù)視桿中實現(xiàn)P23H等位基因表達的敲除。研究表明，這種靶向水平應(yīng)當足以通過直接保存視桿和通過對視錐存活的二次效應(yīng)支持光感受器存活且維持合理好的視覺水平(Leveillard等人(2004) Nature Genetics 36, 755-759; Leveillard & Sahel (2010) Science Translational Medicine 2, 26ps16; Sahel等人(2013) Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie 251, 1669-1677)?？梢詫?yōu)化的病毒在P15視網(wǎng)膜下注射至10只小鼠的一只眼，如先前所述(Mao等人(2012) Advances in Experimental Medicine and Biology 723, 199-205; Mao等人(2012) Human Gene Therapy 23, 356-366; Mao等人(2011) Human Gene Therapy 22, 567-575)?？梢栽谥委熀?、6和12周進行治療的相比于伴侶對照眼的ERG和SDOCT(Bioptigen)分析。假設(shè)在12周時在治療的眼中觀察到功能和結(jié)構(gòu)改善，可以進行長期終生研究?？梢栽谔幩罆r進行組織學分析，其將包括ONL厚度、蛛網(wǎng)圖和用于在外部區(qū)段中正確定位的免疫組化視紫紅質(zhì)測定以及用于視紫紅質(zhì)水平的western印跡。

可以評價AAV5/CRISPR治療的脫靶效應(yīng)。全基因組測序是用于評價脫靶突變的偏倚最少的方法，并且對于證實靶位點將是理想的。可以收獲和離解來自AAV處理和未處理的眼的小鼠視網(wǎng)膜，并且可以用DNeasy血液和組織試劑盒(Qiagen)提取基因組DNA，并用Covaris AFA剪切DNA?？梢詫NA片段末端修復，A加尾并連接至Illumina條形碼化的測序的適配子。連接的產(chǎn)物可以通過PCR擴增以生成條形碼化的全基因組測序文庫，并在HiSeq平臺(Illumina)上以15x的平均覆蓋度測序。然后可以使用Burrows–Wheeler Aligner以具有默認參數(shù)的‘mem’模式(‘bwa mem’)將測序讀取與人參考基因組(hg19/GRCh37)比對。因為每個CRISPR切割事件導致獨特的突變，所以假設(shè)DNA雙鏈斷裂的位點不會導致相同的從頭突變。因此，丟棄由多個樣品共享的所有變體將允許在隨后的生物信息學分析中進行過濾。

參考文獻

說明書中提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻指示本公開主題所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻通過引用并入本文，其程度如同每個單獨的出版物、專利申請、專利和其他參考文獻被具體和單獨地指明通過引用并入。應(yīng)當理解，盡管本文提及了許多專利申請、專利和其他參考文獻，但此類參考文獻并不構(gòu)成承認任何這些文獻形成本領(lǐng)域的公知常識的一部分。

盡管為了清楚理解的目的，已經(jīng)通過舉例說明和實例的方式相當詳細地描述了前述主題，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)實施某些改變和修改。