本申請要求2014年5月30日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/005,013的權(quán)益，所述美國臨時專利申請的內(nèi)容以全文引用方式并入本文。

政府利益聲明

本發(fā)明是在由國家心肺和血液研究所(National Heart,Lung,and Blood Institute)頒發(fā)的基金號5R00HL095929下由政府支持進行的。政府在本發(fā)明中具有某些權(quán)利。

背景技術(shù)：

發(fā)明背景

貫穿本申請，各種出版物由括號中的數(shù)字指代。這些參考文獻的完整引用可在說明書的結(jié)尾處找到。本文提到的這些出版物以及所有專利、專利申請公布和書籍的公開特此以全文引用方式并入本申請，以更充分描述本發(fā)明從屬的領(lǐng)域。

程序性細胞死亡或細胞凋亡是調(diào)控細胞生存和死亡之間關(guān)鍵平衡的基本過程(1)。細胞凋亡失調(diào)導(dǎo)致正常內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，促成諸如癌癥和神經(jīng)變性的疾病(2,3)。細胞凋亡失調(diào)是包括癌癥、心血管疾病和神經(jīng)變性疾病的若干高死亡率人類疾病的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的BCL-2家族包括調(diào)控細胞在線粒體途徑處定型向凋亡的復(fù)雜相互作用網(wǎng)絡(luò)(4,5)。BCL-2家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白二者。促凋亡BCL-2蛋白—BCL-2相關(guān)X蛋白(BAX)和BCL-2同源拮抗物殺傷物(BAK)—誘導(dǎo)線粒體外膜透化并且代表線粒體凋亡的關(guān)鍵守門因子(gatekeeper)和效應(yīng)因子。因此，促凋亡BAX或BAK的抑制損害在包括心肌細胞和神經(jīng)元的終末分化細胞中引發(fā)過早或不需要的細胞死亡的細胞能力。此外，BAX或BAK的激活促進凋亡并且可克服腫瘤細胞對經(jīng)受細胞死亡的抗性和封閉性。

促凋亡BAX是在非凋亡細胞的細胞溶質(zhì)中占主導(dǎo)的BCL-2家族(4,5)的關(guān)鍵效應(yīng)因子成員(6)。在激活后，BAX從細胞溶質(zhì)移位至線粒體以執(zhí)行線粒體外膜的透化并且將凋亡因子(apoptogen)釋放入細胞溶質(zhì)(7,8)，這是線粒體功能障礙和凋亡的“不可返回點”(“point of no return”)(9,10)。

促凋亡BAX是高度受調(diào)控的蛋白，其與觸發(fā)或抑制其激活的促凋亡和抗凋亡BCL-2蛋白相互作用。諸如BCL-2和BCL-X_L的抗凋亡BCL-2蛋白直接抑制激活的BAX，而諸如BIM和BID的促凋亡BCL-2蛋白亞組使用它們的BH3結(jié)構(gòu)域直接觸發(fā)BAX激活。BAX的細胞溶質(zhì)構(gòu)象具有位于其結(jié)構(gòu)的N末端表面的BH3觸發(fā)位點。BAX與釘合(stapled)BIM BH3螺旋經(jīng)過N末端觸發(fā)位點(螺旋α1/α6)的相互作用導(dǎo)致涉及一系列構(gòu)象變化的BAX激活。這些構(gòu)象變化包括α1-α2環(huán)從封閉構(gòu)象置換至開放構(gòu)象以及α2(BH3結(jié)構(gòu)域)和α9螺旋從疏水核心活動化以允許線粒體移位和寡聚化，從而導(dǎo)致線粒體透化。

盡管在理解BAX激活上已有顯著進展，當前關(guān)于BAX調(diào)控機制的知識是有限的。僅理解了激活的BAX是如何通過BAX BH3結(jié)構(gòu)域與抗凋亡BCL-2蛋白的BH3溝相互作用而抑制的。然而，已經(jīng)報道了眾多抑制細胞溶質(zhì)BAX的蛋白，并且已研究了穩(wěn)定BAX的細胞溶質(zhì)形式的翻譯后修飾。出現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明在不需要BAX激活的情況下，BAX在細胞溶質(zhì)與線粒體區(qū)室之間具有高度動態(tài)的定位。然而，不存在細胞溶質(zhì)BAX如何保持在控制之下的結(jié)構(gòu)證據(jù)或任何機制理解。當前的知識局限于完整BAX的結(jié)構(gòu)，完整BAX的NMR結(jié)構(gòu)表明其α9構(gòu)象使蛋白保持無活性細胞溶質(zhì)形式，從而防止蛋白移位至線粒體膜。

最近的研究報道了除全長BAX結(jié)構(gòu)的N末端表面處的激活位點以外，在缺少C末端螺旋α9的截短結(jié)構(gòu)中揭示的第二激活位點，所述截短結(jié)構(gòu)可能模擬BAX的線粒體連接形式(11-14)。雖然BAX激活的早期步驟已確定，但仍缺乏使BAX在細胞溶質(zhì)中保持在控制之下以及調(diào)控BAX激活和移位至線粒體外膜的機制的理解。此外，在細胞溶質(zhì)中和激活過程中BAX采用的構(gòu)象對于理解BAX介導(dǎo)性凋亡和BAX可如何被藥物靶向是關(guān)鍵的。因此，BAX和調(diào)控BAX激活的蛋白，包括其它BCL-2家族成員，是針對開發(fā)新穎療法的集中研究和藥物發(fā)現(xiàn)活動的靶標(15,16)。

通過BAX調(diào)節(jié)細胞死亡可在若干疾病中具有治療益處。與過早或不需要的細胞死亡相關(guān)聯(lián)并且特征為BAX的異常激活、或表達或功能的疾病包括：心血管疾病和病癥(例如，動脈硬化、心力衰竭、心臟移植、動脈瘤、慢性肺病、缺血性心臟病、高血壓、血栓形成、心肌病)，神經(jīng)變性疾病和神經(jīng)障礙(例如，阿爾茨海默(Alzheimer)氏病、帕金森(Parkinson)氏病、亨廷頓(Huntington)氏病、色素性視網(wǎng)膜炎、脊髓性肌萎縮、各種形式的小腦變性、肌萎縮性側(cè)索硬化癥)，免疫病癥(例如，器官移植排斥反應(yīng)、關(guān)節(jié)炎、狼瘡、炎性腸病、克勞恩(Crohn)氏病、哮喘、多發(fā)性硬化癥、糖尿病)，缺血(例如，中風(fēng)、心肌梗塞和再灌注損傷)，不育癥(例如，過早絕經(jīng)、卵巢衰竭或卵泡閉鎖)，血液病癥(例如，范可尼(Fanconi)貧血、再生障礙性貧血、地中海貧血、先天性中性白細胞減少癥、脊髓發(fā)育不良)，腎缺氧，肝炎，哮喘和AIDS。然而，當前不存在通過直接調(diào)節(jié)BAX活性來阻止或激活細胞死亡的小分子療法。存在凋亡途徑的抑制劑，諸如在各種細胞中阻止細胞死亡的半胱天冬酶抑制劑。然而，半胱天冬酶抑制劑在細胞中可得到的不同半胱天冬酶間缺乏特異性，這是對于其成功臨床應(yīng)用的不利因素。BAX的直接激活劑可具體應(yīng)用于癌癥治療中，并且可選擇性地克服癌癥細胞的抗凋亡抗性并使正常細胞免受傷害。同樣地，可應(yīng)用BAX的直接激活劑以在與免疫細胞不受控產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)的自身免疫疾病中促進凋亡。BAX抑制劑可具體應(yīng)用于細胞死亡異常過度的心臟病、CNS障礙疾病以及肝和腎病。

本發(fā)明解決對鑒別用于治療性處理的BAX抑制劑和激活劑的需要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了用于鑒別干擾或促進BAX二聚化、和/或結(jié)合至先前未鑒別出的BAX二聚體結(jié)合位點的試劑的測定方法。本發(fā)明還提供促進或干擾二聚化的試劑。

提供了鑒別用作促進或抑制細胞死亡的候選試劑的試劑的方法，所述方法包括：(a)使試劑與BCL-2相關(guān)X蛋白(BAX)單體或其部分、和/或與BAX二聚體接觸，以及(b)測量試劑是否抑制或促進BAX二聚化；其中相比于試劑缺少時，在試劑存在時BAX單體與其它BAX單體或與BAX單體的部分的結(jié)合減少表明試劑抑制BAX二聚化，其中抑制BAX二聚化的試劑是用于促進細胞死亡的候選試劑；并且其中相比于試劑缺少時，在試劑存在時BAX單體或其部分與其它BAX單體或其部分的結(jié)合增加表明試劑促進BAX二聚化，其中促進BAX二聚化的試劑是用于抑制細胞死亡的候選試劑。

還提供了用于鑒別調(diào)節(jié)BAX活性的試劑的方法，所述方法包括：在試劑存在和缺少時，使BAX的α9螺旋肽與BAX的N末端結(jié)合位點接觸；以及測量BAX的α9螺旋肽與BAX的N末端結(jié)合位點之間的結(jié)合，其中相比于試劑缺少時的結(jié)合，在試劑存在時減少的結(jié)合表明試劑是BAX活性的調(diào)節(jié)劑。

提供了由以下組成的肽：

a)TWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMG(SEQ ID NO:11)，

b)TWQTVTIFVAGVLTASLT(SEQ ID NO:12)，

c)TWQTVTIFVAGVLTA(SEQ ID NO:13)，

d)TWQTVTIFVAGVL(SEQ ID NO:14)，

e)包含序列TXQTXXIFXAG(SEQ ID NO:15)的11-30個氨基酸殘基，其中任何位置處的X可獨立地為任何氨基酸、或天然或非天然化學(xué)修飾氨基酸，

f)包含序列TXQTXXIFXAGVXTA(SEQ ID NO:16)的15-30個氨基酸殘基，其中任何位置處的X可獨立地為任何氨基酸、或天然或非天然化學(xué)修飾氨基酸，或

g)包含序列Y1XY2Y3XXY4Y5XY6Y7(SEQ ID NO:17)的11-30個氨基酸殘基，其中Y1為蘇氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，Y2為谷氨酰胺或保守殘基或非天然氨基酸，其中Y3為蘇氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y4為異亮氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y5為苯丙氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y6為丙氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y7為甘氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中任何位置處的X可獨立地為任何氨基酸、或天然或非天然化學(xué)修飾氨基酸。

提供了調(diào)節(jié)BAX和治療與封閉或不需要的細胞死亡相關(guān)聯(lián)并且特征為BAX的異常激活、表達或功能的疾病和病癥的方法，所述方法包括使BAX與本文所公開的肽中的任何者接觸。

附圖說明

附圖簡要說明

圖1A-1D、BAX形成無活性二聚體構(gòu)象。(A)通過Superdex 200(HR 10/30)凝膠過濾柱分析的重組BAX的代表性尺寸排阻層析(SEC)跡線，顯示出分別在約15.8mL和約14.2mL處的洗脫單體(M)和二聚體(D)峰。(B)通過Superdex200(HR 10/30)凝膠過濾分析重組BAX(rec.BAX)、WT MEF和DKO MEF的細胞溶質(zhì)提取物、和來自用1％Triton X-100處理的來自WT MEF的細胞溶質(zhì)提取物(cyt.BAX+1％Triton)。通過抗BAX免疫印跡分析對應(yīng)于指示分子量的成分和洗脫體積。(C)通過Superdex 75(HR 10/30)凝膠過濾層析分析不同劑量下純化單體重組BAX的二聚化，顯示出分別在約11.8mL和約10.4mL處的洗脫單體(M)和二聚體(D)峰。(D)以不具有和具有指示濃度下基于釘合肽的BAX激活因子BIM SAHB_A2的SEC分離的BAX單體和二聚體的動力學(xué)格式繪制的脂質(zhì)體釋放測定。(A-C)中所示的數(shù)據(jù)代表三個實驗并且(D)中的數(shù)據(jù)是來自四個獨立實驗的平均值。

圖2A-2B、無活性BAX二聚體的晶體結(jié)構(gòu)。(A)BAX二聚體晶體結(jié)構(gòu)的條帶示意圖。顯示出對于每個BAX原聚體的二聚相互作用界面。在結(jié)構(gòu)上描繪出螺旋(α)和環(huán)(L)。二級結(jié)構(gòu)示意圖草圖顯示出BCL-2同源結(jié)構(gòu)域(BH)、跨膜區(qū)(TM)和二聚相互作用界面的位置。(B)與(A)中示意圖相關(guān)的視圖繞垂直軸90度旋轉(zhuǎn)的每個BAX原聚體的條帶示意圖，顯示出N末端和C末端二聚化界面。

圖3A-3E、BAX二聚機制的結(jié)構(gòu)細節(jié)。(A)二聚體中每個BAX原聚體的C末端和N末端相互作用表面的計算真空靜電學(xué)(calculated vacuum electrostatics)，顯示出互補的疏水、極性和帶電殘基的位置。(B)BAX二聚體的草圖示意圖，顯示出由其二聚體相互作用界面標記的原聚體。相互作用殘基以棍示出并且在二聚體相互作用界面的三個不同區(qū)域中突出：(C)二聚界面的疏水核心，涉及一個原聚體的α9殘基I175和F176以及來自α1的殘基M20和A24，來自α6的M137和L141以及來自α1-α2環(huán)的L47和V50，(D)不同BAX原聚體的以下殘基對之間的氫鍵：α6的R145與α9的Q171，α1的E17與α3的M74和E75，以及α1的K21與α3的E75殘基對之間的鹽橋，以及(E)不同BAX原聚體的以下殘基對之間的氫鍵：α1-α2環(huán)的A46與α8的Y164，α1-α2環(huán)的E44與α5的W107，α1-α2環(huán)的D48與α5的N106，以及α1-α2環(huán)的D48與α4-α5環(huán)的R109殘基對之間的鹽橋。

圖4A-4D、BAX的自抑制二聚體調(diào)控BAX激活和凋亡。(A)純化單體重組BAX WT和突變體的二聚化由SEC分析并且通過對觀測的單體和二聚體峰下方的面積進行積分來量化。(B)與BAX WT和突變體重組的未處理DKO MEF的蛋白裂解物進行細胞溶質(zhì)與線粒體的分離，接著是使用Superdex 200(HR 10/30)的SEC。(C)用人BAX WT和突變體瞬時轉(zhuǎn)導(dǎo)的DKO MEF的生存力測定通過膜聯(lián)蛋白-V結(jié)合來測量。相比于BAX WT，所有突變體P值<0.05。(D)BAX WT和BAX P168G細胞用1μΜSTS處理6h；BAX E75K和S184L細胞因更快的細胞死亡而處理3h。分離細胞溶質(zhì)和線粒體成分并通過SEC來分析。(B)和(D)中所示的數(shù)據(jù)代表三個獨立實驗，并且(A)和(C)中的數(shù)據(jù)是來自三個獨立實驗的平均值±SD。

圖5、相比于BAX，確定與BAX相互作用的抗凋亡BCL-2、BCL-X_L和MCL-1蛋白在細胞溶質(zhì)中處于非常低水平并且主要存在于線粒體。MEF的細胞溶質(zhì)和線粒體成分中BAX、BCL-2、BCL-X_L和MCL-1的蛋白水平通過免疫檢測來測定。MEF的細胞溶質(zhì)成分與線粒體成分的分離分別利用b-微管蛋白和VDAC抗體來證實。

圖6A-6B、如利用特異性識別BAX活性構(gòu)象的6A7抗體的免疫沉淀測定法所測定的，二聚體構(gòu)象的細胞溶質(zhì)BAX是無活性的。(A)使用Superdex 200 10/300GL凝膠過濾柱的MEF細胞溶質(zhì)提取物的尺寸排阻層析分析，表明二聚體尺寸的BAX WT的洗脫圖譜(B)BAX WT的成分6和8是6A7陰性的，并且不能與6A7抗體免疫共沉淀。作為陽性對照，用激活BAX并暴露BAX上6A7表位的1％辛基葡糖苷去污劑孵育成分。

圖7、使用交聯(lián)方法檢測BAX二聚化。在指示的BAX濃度下用20×BMH交聯(lián)劑處理15min之后，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中BAX的考馬斯染色。

圖8、來自指示物種的BAX序列的蛋白質(zhì)序列比對。BAX序列的蛋白質(zhì)序列比對顯示出呈淺灰色陰影的相同殘基；呈白色陰影的保守殘基、類似殘基和不同殘基。星號表示每個BAX原聚體中涉及BAX二聚體結(jié)構(gòu)界面處相互作用的殘基的位置。螺旋和環(huán)的二級結(jié)構(gòu)標記基于BAX二聚體的晶體結(jié)構(gòu)。序列從頂部至底部：SEQ ID NO:3(人(Homo sapiens))至SEQ ID NO:10(共有序列)。

圖9A-9C、突變體BAX G67R二聚體的晶體結(jié)構(gòu)指示與在BAX P168G二聚體的結(jié)構(gòu)中所測定的相同的BAX二聚化機構(gòu)。(A)BAX G67R二聚體(淺灰色)和BAX P168G二聚體(更深的灰色)的晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)比對。(B)BAX G67R原聚體(淺灰色)和BAX P168G原聚體(更深的灰色)晶體結(jié)構(gòu)以繞螺旋α5為中心的視圖的結(jié)構(gòu)比對。(C)BAX G67R原聚體(淺灰色)和BAX P168G原聚體(更深的灰色)晶體結(jié)構(gòu)以繞N末端觸發(fā)位點為中心的視圖的結(jié)構(gòu)比對。

圖10A-10C、細胞溶質(zhì)BAX調(diào)控機制的結(jié)構(gòu)見解。A)BAX原聚體:α9復(fù)合體和BAX單體:BIM BH3復(fù)合體以條帶表示的結(jié)構(gòu)比對，顯示出α9螺旋和BIM BH3螺旋向N末端觸發(fā)位點的結(jié)合取向。α1-α2環(huán)在BAX原聚體:α9結(jié)構(gòu)中處于封閉構(gòu)象，并且在BAX單體:BIM BH3結(jié)構(gòu)中處于開放構(gòu)象。B)BAX單體:BIM BH3相互作用和C)BAX原聚體:α9相互作用的草圖示意圖，以棍突出了關(guān)鍵相互作用殘基。指示了色碼。明確來說，在BIM BH3結(jié)合結(jié)構(gòu)(B)中，包含α1的殘基A24、L25、L27和α6的L141、W139、G138、M137的BAX N末端觸發(fā)位點的疏水表面形成與BIM BH3的保守疏水殘基F159、I155、L152和A149的持續(xù)疏水相互作用(還參見圖11B)。另外的穩(wěn)定相互作用在BAX的Q28和Q32與BIM BH3的N160之間發(fā)生，并且互補電荷相互作用在BAX的K21、R134和E131、BIM BH3的E158E、D157和R153殘基之間發(fā)生(圖10B和圖11B)。在二聚體BAX結(jié)構(gòu)(C)中，來自α1的殘基A24、L25、Q28和Q32代替地與同一BAX分子的α1-α2環(huán)的殘基Q52、V50和D48相互作用，產(chǎn)生形成自α1和α1-α2環(huán)定位的替代疏水空腔，這促進與相鄰BAX分子的α9殘基I175和F176的相互作用(還參見圖11A)。封閉的α1-α2環(huán)構(gòu)象還定位環(huán)的極性和帶電殘基以進行穩(wěn)定的分子間相互作用(C)。這些結(jié)構(gòu)見解提供了細胞溶質(zhì)BAX形成自抑制二聚體的強力證據(jù)，所述自抑制二聚體堵塞BAX激活和線粒體移位所需的關(guān)鍵相互作用。

圖11A-11B、結(jié)合至α9(取自BAX P168G二聚體結(jié)構(gòu))和BIM BH3(PDB ID：2KW7)肽的BAX的N末端結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)差異提供了細胞溶質(zhì)BAX調(diào)控的結(jié)構(gòu)見解。BAX的N末端表面以灰色顯示，并且突出了BAX觸發(fā)位點和α1-α2環(huán)的疏水(更淺的灰色)、帶正電(K21、R134和R145)和帶負電(D48和E131)殘基。(A)BAXα9與其疏水殘基的結(jié)合使與α1、α6和α1-α2環(huán)的疏水殘基接觸，從而維持BAX的結(jié)構(gòu)處于無活性構(gòu)象以及α1-α2環(huán)處于封閉構(gòu)象。(B)BIM BH3結(jié)合和其疏水殘基使與α1和α6的疏水殘基接觸，隨后發(fā)生α1-α2環(huán)構(gòu)象變化為開放構(gòu)象以及α1和α6殘基取向變化。此外，在疏水位點的外圍處，BIM BH3具有與α1和α6的帶電殘基的有利靜電相互作用。

圖12、非對稱BAX二聚體晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)分析，揭示了兩個新的BAX相互作用表面形成自抑制二聚體構(gòu)象。BAX單體的C末端螺旋α9與其溶劑不可及的表面-規(guī)范的BH3口袋(右側(cè)α9螺旋)結(jié)合，和與其溶劑可及的表面-另一個BAX分子的BH3觸發(fā)位點(左側(cè)α9螺旋*)結(jié)合。

圖13、調(diào)控通過選擇僅BH3的蛋白觸發(fā)的BAX激活途徑的無活性BAX二聚化的模型。無活性和細胞溶質(zhì)BAX的二聚化提供了BAX激活的關(guān)閉途徑。BAX的直接激活通過與僅BH3的蛋白直接相互作用和BAX單體的觸發(fā)位點(指示的螺旋α1和α6)接合來引發(fā)。BAX的構(gòu)象變化、線粒體移位和自激活繼續(xù)進行并產(chǎn)生BAX單體以組裝線粒體外膜內(nèi)的活性二聚體，并且同寡聚孔釋放諸如細胞色素c的關(guān)鍵致凋亡因子。

圖14A-14B、在通過高劑量激活因子BIM SHAB激活之前，BAX的自抑制二聚形式解離成BAX單體。(A)通過高劑量的觸發(fā)位點結(jié)合因子BIM SHAB，無活性BAX 4MA二聚體被競爭并解離成單體。在使用20μΜDTT來減少內(nèi)部交聯(lián)的BAX 4MA突變體后，BIM SHAB可激活4MA單體以誘導(dǎo)BAX寡聚化。樣品通過Superdex 75(HR 10/30)凝膠過濾層析來分析并且通過對觀測的單體峰下方面積進行積分來量化。所示數(shù)據(jù)代表三個獨立實驗(B)在用提高劑量的BIM SAHB_A處理后，純化的BAX WT二聚體和BAX P168G二聚體的脂質(zhì)體透化測定。相比于BAX WT，BAX P168G二聚體對通過BIM SHAB的激活更有抗性。值得注意地，BIM SHAB_A激活BAX WT二聚體所需的劑量比用來完全激活圖1中BAX WT單體的劑量顯著更高。條形圖表明90min時的最大釋放。數(shù)據(jù)是來自三重進行和重復(fù)三次的實驗的平均值+SD。

圖15、α9螺旋肽的結(jié)構(gòu)，具有與BAX的N末端結(jié)合位點相互作用的標記殘基。

具體實施方式

發(fā)明詳述

提供了鑒別用作促進或抑制細胞死亡的候選試劑的試劑的方法，所述方法包括：

(a)使試劑與BCL-2相關(guān)X蛋白(BAX)單體或其部分、和/或與BAX二聚體接觸，以及

(b)測量試劑是否抑制或促進BAX二聚化；

其中相比于試劑缺少時，在試劑存在時BAX單體與其它BAX單體或與BAX單體的部分的結(jié)合減少表明試劑抑制BAX二聚化，其中抑制BAX二聚化的試劑是用于促進細胞死亡的候選試劑；以及

其中相比于試劑缺少時，在試劑存在時BAX單體或其部分與其它BAX單體或其部分的結(jié)合增加表明試劑促進BAX二聚化，其中促進BAX二聚化的試劑是用于抑制細胞死亡的候選試劑。

試劑可結(jié)合至BAX的N末端結(jié)合位點和/或C末端結(jié)合位點的氨基酸殘基。例如，試劑可在結(jié)合位點殘基S16、E17、Q18、I19、M20、K21、T22、G23、A24、L25、L26、I27、Q28、G29、F30、I31、Q32、D33、R34、A35、G36、R37、M38、G39、G40、E41、A42、P43、E44、L45、A46、L47、D48、P49、V50、P51、Q52、D53、A54、V129、P130、E131、L132、I133、R134、T135、I136、M137、G138、W139、T140、L141、D142、F143、L144、R145、E146和R147中一處或多處結(jié)合至BAX的N末端。替代地，或另外，試劑可在結(jié)合位點殘基N73、M74、E75、L76、D98、M99、F100、S101、D102、G103、N104、F105、N106、W107、G108、R109、I152、Q153、D154、Q155、G156、G157、W158、D159、G160、L161、L162、S163、Y164、F165、G166、T167、P168、T169、W170、Q171、T172、V173、T174、I175、F176、V177、A178、G179、V180、L181、T182、A183、S184、L185、T186、I187、W188、K189K190、M191和G192中一處或多處結(jié)合至BAX的C末端。

在本文所公開方法中的任何者中，對作為二聚體或單體的BAX的測量是使用熒光偏振測定法、尺寸排阻層析(SEC)、聚丙烯酰胺凝膠電泳、動態(tài)光散射和特異性結(jié)合BAX二聚體或BAX單體的抗體中的一者或多者來進行的。

還提供了用于鑒別調(diào)節(jié)BAX活性的試劑的方法，所述方法包括：

在試劑存在和缺少時，使BAX的α9螺旋肽與BAX的N末端結(jié)合位點接觸；以及

測量BAX的α9螺旋肽與BAX的N末端結(jié)合位點之間的結(jié)合，其中相比于試劑缺少時的結(jié)合，在試劑存在時減少的結(jié)合表明試劑是BAX活性的調(diào)節(jié)劑。

在一個實施方案中，試劑是BAX的抑制劑。或者，試劑可為BAX的激活劑。

BAX的α9肽具有氨基酸序列TWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMG(SEQ ID NO:11)。BAX的α9螺旋肽例示于圖15中。在不同的實施方案中，BAX的α9螺旋肽或BAX的N末端結(jié)合位點可固定在固體基質(zhì)上。BAX的α9螺旋肽與BAX的N末端結(jié)合位點之間的結(jié)合可例如使用熒光測定法或表面等離激元共振測定法或免疫共沉淀測定法或NMR測定法來測量。

還公開了鑒別用作BCL-2相關(guān)X蛋白(BAX)的調(diào)節(jié)劑的試劑的方法，所述方法包括：使試劑與BAX接觸，并且測量試劑是否抑制或促進BAX與另一個BAX或其部分的二聚化，其中相比于試劑缺少時，在試劑存在時結(jié)合減少表明試劑抑制BAX二聚化，并且相比于試劑缺少時，在試劑存在時BAX與另一個BAX分子的結(jié)合增加表明試劑促進BAX二聚化。

在本文所公開方法中的任何者中，BAX可為人BAX。

試劑可為例如，小分子、分離肽、合成肽、具有天然或非天然氨基酸或組合的肽基試劑、烴釘合肽(hydrocarbon stapled peptide)、限制性肽(constrained peptide)、大環(huán)(macrocycle)、類肽(peptoid)、模擬肽(peptidomimetic)、折疊體、適體、抗體、單抗體(monobody)、納米抗體、或它們的組合。在實施方案中，試劑是BAX的α9螺旋的模擬肽。

在本文所述方法的實施方案中，試劑是2000道爾頓或更小的小分子。在本文所述方法的實施方案中，試劑是1500道爾頓或更小的小分子。在本文所述方法的實施方案中，試劑是1000道爾頓或更小的小分子。在本文所述方法的實施方案中，試劑是800道爾頓或更小的小分子。在本文所述方法的實施方案中，試劑是2000、1500、1000、800、700、600、500或400道爾頓或更小的小分子。在本文所述方法的實施方案中，試劑是有機小分子。

本文所公開的方法可進一步包括向受試者施用鑒別為促進BAX二聚化或抑制BAX的試劑，所述受試者患有與過早或不需要的細胞死亡相關(guān)聯(lián)并且特征為BAX的異常激活、表達或功能的疾病或病癥；以及測試試劑在治療疾病上的功效。所述方法可進一步包括向患有癌癥的受試者施用鑒別為抑制BAX二聚化或激活BAX的試劑，以及測試試劑在治療癌癥上的功效。

還提供了與BAX的N末端結(jié)合位點相互作用的以下肽：

1.TWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMG(SEQ ID NO:11)(對應(yīng)于BAX的α9)

2.TWQTVTIFVAGVLTASLT(SEQ ID NO:12)

3.TWQTVTIFVAGVLTA(SEQ ID NO:13)

4.TWQTVTIFVAGVL(SEQ ID NO:14)。

突出顯示的氨基酸殘基與BAX的N末端結(jié)合位點相互作用。不與BAX的N末端結(jié)合位點相互作用的其它殘基可突變至任何殘基，但肽序列可仍具有結(jié)合和抑制功能。因此，本發(fā)明提供具有11-30個氨基酸殘基的肽，所述肽包含序列：TXQTXXIFXAG(SEQ ID NO:15)，其中任何位置處的“X”可獨立地為任何氨基酸或非天然氨基酸。在一個實施方案中，具有11-30個氨基酸殘基、包含序列TXQTXXIFXAG(SEQ ID NO:15)的肽不包括SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中的任何者。本發(fā)明還提供具有15-30個氨基酸殘基的肽，所述肽包含序列：TXQTXXIFXAGVXTA(SEQ ID NO:16)，其中任何位置處的“X”可獨立地為任何氨基酸或非天然氨基酸。在一個實施方案中，具有15-30個氨基酸殘基、包含序列TXQTXXIFXAGVXTA(SEQ ID NO:16)的肽不包括SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中的任何者。本發(fā)明還提供具有11-30個氨基酸殘基的肽，所述肽包含序列Y1XY2Y3XXY4Y5XY6Y7(SEQ ID NO:17)，其中Y1為蘇氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，Y2為谷氨酰胺或保守殘基或非天然氨基酸，其中Y3為蘇氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y4為異亮氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y5為苯丙氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y6為丙氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中Y7為甘氨酸或保守氨基酸、或非天然氨基酸，其中任何位置處的X可獨立地為天然或非天然化學(xué)修飾氨基酸的任何氨基酸。優(yōu)選每個序列中至少一個X或一個Y為非天然氨基酸或非天然存在的化學(xué)修飾氨基酸。例如11-30個氨基酸，其意指11-30之間任何數(shù)量的氨基酸，即，11、12、13、14、......29或30個氨基酸殘基。在一個實施方案中，肽由序列TXQTXXIFXAG(SEQ ID NO:15)或序列TXQTXXIFXAGVXTA(SEQ ID NO:16)組成。在不同的實施方案中，相互作用殘基還可突變至將維持與BAX相互作用的保守或類似殘基。在不同的實施方案中，肽可用諸如熒光標記或放射性標記的標記來標記。在一個實施方案中，本文要求保護的肽為化學(xué)合成肽或由重組DNA或cDNA產(chǎn)生的肽。例如，肽可通過液相合成或通過固相合成來制得。肽可例如使用重組DNA或cDNA來合成。在一個實施方案中，肽并不直接得自較大的天然存在BAX蛋白，例如通過消化蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，肽是分離和純化的肽。

提供了抑制BAX的方法，所述方法包括使BAX與本文所公開肽中的任何者接觸。BAX可處于活細胞中，其中優(yōu)選地，BAX的抑制抑制細胞死亡。BAX可處于受試者中，諸如哺乳動物、諸如人，并且將試劑施用于受試者。受試者可患有與過早或不需要的細胞死亡相關(guān)聯(lián)并且特征為BAX的異常激活、表達或功能的疾病或病癥。

與過早或不需要的細胞死亡相關(guān)聯(lián)并且特征為BAX的異常激活、表達或功能的疾病和病癥包括：例如，心血管疾病和病癥(例如，動脈硬化、心力衰竭、心臟移植、動脈瘤、慢性肺病、缺血性心臟病、高血壓、血栓形成、心肌病)，神經(jīng)變性和神經(jīng)疾病和障礙(例如，阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、色素性視網(wǎng)膜炎、脊髓性肌萎縮、各種形式的小腦變性、肌萎縮性側(cè)索硬化癥)，肝疾病和病癥，腎疾病和病癥，免疫病癥(例如，器官移植排斥反應(yīng)、關(guān)節(jié)炎、狼瘡、IBD、克勞恩氏病、哮喘、多發(fā)性硬化癥、糖尿病)，缺血(例如，中風(fēng)、心肌梗塞和再灌注損傷)，不育癥(例如，過早絕經(jīng)、卵巢衰竭或卵泡閉鎖)，血液病癥(例如，范可尼貧血、再生障礙性貧血、地中海貧血、先天性中性白細胞減少癥、脊髓發(fā)育不良)，腎缺氧，肝炎，哮喘和AIDS。與細胞死亡的抑制相關(guān)聯(lián)并且特征為BAX的異常抑制、表達或功能的疾病包括例如，癌癥和自身免疫疾病。

還提供了鑒別用作抑制細胞死亡的候選試劑的試劑的方法，所述方法包括：

在試劑存在和缺少時，使BCL-2相關(guān)X蛋白(BAX)與本文所公開肽的任何者中的一者或多者接觸，以及

測量一種或多種肽與BAX的結(jié)合，

其中相比于試劑缺少時一種或多種肽與BAX的結(jié)合，在試劑存在時一種或多種肽與BAX減少的結(jié)合表明試劑是用于抑制細胞死亡的候選試劑。在一個實施方案中，例如用異硫氰酸熒光素(FITC)來熒光標記肽。

如本文所使用，“BAX”是BCL-2相關(guān)X蛋白。在實施方案中，BAX是哺乳動物型。在優(yōu)選實施方案中，BAX是人BAX。在實施方案中，BAX包含具有以下序列的連續(xù)氨基酸殘基：

MDGSGEQPRGGGPTSSEQIMKTGALLLQGFIQDRAGRMGGEAPELALDPVPQDASTKKLSECLKRIGDELDSNMELQRMIAAVDTDSPREVFFRVAADMFSDGNFNWGRVVALFYFASKLVLKALCTKVPELIRTIMGWTLDFLRERLLGWIQDQGGWDGLLSYFGTPTWQTVTIFVAGVLTASLTIWKKMG(SEQ ID NO:l)。

在本文所述方法的實施方案中，方法可用于鑒別治療性細胞死亡抑制劑。在本文所述方法的實施方案中，方法可用于鑒別治療性細胞死亡激活劑。

除非本文中有另外指示或在上下文中另外明顯地發(fā)生矛盾，否則本文所述各種要素的所有組合都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本發(fā)明將從下文的實驗細節(jié)來更好地理解。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，所論述的特定方法和結(jié)果僅例示本發(fā)明，本發(fā)明如其后所接的權(quán)利要求書中更充分描述。

實驗細節(jié)

材料和方法

試劑—對應(yīng)于BIM的BH3結(jié)構(gòu)域的烴釘合肽、BIM SAHB_A2：N-乙?；?sup>145EIWIAQELRS5IGDS5FNAYYA¹⁶⁴-CONH₂(SEQ ID NO:2)，其中S5代表插入的用于烯烴復(fù)分解的非天然氨基酸，如先前由CPC Scientific描述的進行合成、純化和鑒定(11)。

重組BAX的產(chǎn)生—人BAX野生型和突變體在pTYB1載體(New England Biolabs)中使用標準的基于PCR的克隆策略和基于PCR的定點誘變來產(chǎn)生，并且通過測序來證實構(gòu)建物。重組蛋白以BL21(DE3)密碼子+大腸桿菌菌株來表達并且如先前描述的純化(16)。

尺寸排阻層析—Superdex 75 10/300GL和200 10/300GL(GE Healthcare)柱用于重組蛋白和細胞提取物的尺寸排阻層析。將重組蛋白注入用含有20mM HEPES pH 7.2、150mM KCl、1mM DTT的緩沖液平衡的柱中。將1mg細胞溶質(zhì)或膜提取物施加于在含有10mM Tris、pH 7.5、1mM EGTA、200mM蔗糖和完全蛋白酶抑制劑的緩沖液中平衡的Superdex 200 10/300GL。收集500μL成分，并且每個成分中的30μl通過SDS-PAGE和免疫印跡來分析。所有操作在4℃下進行。還使凝膠過濾分子量標記物(GE Healthcare)經(jīng)過柱以獲得用于估計蛋白質(zhì)分子量的標準曲線。

動態(tài)光散射—各種樣品的動態(tài)光散射使用來自Wyatt Technology的DynaPro801儀器和用于數(shù)據(jù)收集和分析的DYNAMICS v.5.25.44軟件來測量。在從尺寸排阻層析洗脫之后，將蛋白質(zhì)樣品以13,000rpm離心10min并裝至塑料比色皿。通常，對每個100μl樣品獲得五秒的一百個掃描。歸一化的強度對流體動力半徑(nm)在20mM HEPES pH 7.2、150mM KCl、1mM DTT緩沖液中測量。

結(jié)晶—在20mM HEPES pH 7.2、150mM KCl、1mM DTT緩沖液中的均質(zhì)BAX蛋白使用過濾單元(Milipore)來濃縮至10mg/ml。針對BAX野生型和突變體的結(jié)晶條件的初始篩選通過在293K下使用96孔Intelli板(Hampton Research)的坐滴式蒸氣擴散方法(sitting-drop vapor-diffusion)來進行。BAX蛋白在20mM HEPES pH 7.2、150mM KCl、1mM DTT中濃縮至10mg/ml，并且在結(jié)晶建立(setup)之前離心。衍射質(zhì)量桿狀晶體在0.1M Bis-Tris pH 6.5、1.5M硫酸銨中使用24孔VDX板(Hampton Research)經(jīng)由懸滴式蒸氣擴散方法來產(chǎn)生。將1μl蛋白質(zhì)溶液和儲備溶液混合并且對1ml儲備溶液平衡。晶體通過在含有0.1M Bis-Tris pH 6.5、1.5M硫酸銨和25％(v/v)甘油的20μl防冷凍劑溶液中浸泡5s來防冷凍，并且在液氮中快速冷凍。

數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)測定—X射線衍射數(shù)據(jù)收集于國家同步加速器光源(National Synchrotron Light Source)和先進光子源(Advanced Photon Source)中的光束線。所有數(shù)據(jù)利用HKL2000來整合和縮放(19)，并且利用CCP4軟件套件來進行進一步處理(20)。BAX的晶體結(jié)構(gòu)通過將BAX的單體NMR結(jié)構(gòu)(PDB ID：IF16)用作搜索模型的分子置換方法來測定。模型突變至多Ala。使用COOT的多周期模型手動編輯和調(diào)整(21)，接著為通過模擬的退火、能量最小化來細化，和利用REFMAC的個別各向同性B因子細化(22)。螺旋α1與α2之間環(huán)的斷鏈因建模階段的較差衍射數(shù)據(jù)而實現(xiàn)。利用PROCHECK(23)、PISA(24)來驗證最終模型，并且使用PYMOL來給出分子模型(25)。數(shù)據(jù)收集和統(tǒng)計概述于表2中。

NMR樣品和譜—蛋白質(zhì)樣品于5％D₂O中、pH 6.0的25mM磷酸鈉、50mM NaCl溶液中制備。針對BAX P168G單體的骨架¹H、¹³C、¹⁵N分配的相關(guān)性¹H-¹⁵N HSQC、¹H-¹⁵N TROSY譜和三線共振譜：HNCO、HNCA、HNCOCA、HNCACB、HNCOCACB和N¹⁵NNH-NOESY在25℃下于配備有低溫探針的Inova 600MHz NMR譜儀上獲得，使用Topsin處理，并且利用CCPNMR來分析(26)。BAX野生型交叉峰分配如先前報道的來應(yīng)用(11,16)。在指示的摩爾比率下的加權(quán)平均化學(xué)位移差異Δ計算為以p.p.m計的√(ΔδH¹)²+(ΔδN¹⁵/5)²。誤差條的缺少表明無化學(xué)位移差異，或者存在脯氨酸或者重疊和未用于分析中的殘基。根據(jù)標準方法，基于在所有殘基間的平均化學(xué)位移加標準差來計算骨架酰胺化學(xué)位移變化的顯著性閾。

BAX二聚化測定—BAX野生型和突變體在BAX緩沖液(10mM HEPES pH 7、150mM KCl、1mM DTT)中濃縮至約0.5mM并且在20℃下孵育1-3天，之后稀釋至250μl的總體積并且裝填至Superdex 75HR 10/30尺寸排阻柱(GE Healthcare)上。這些條件允許與因BAX激活所致的聚集相比受控的二聚化過程。在4℃下使用0.5ml/min的流速實現(xiàn)單體和二聚BAX的分離。層析譜跡線顯示出分別在約11.8ml和約10.4ml處的單體峰和二聚峰。使用蛋白質(zhì)標準品(GE Healthcare)來校準凝膠過濾峰的分子質(zhì)量。層析譜跡線代表數(shù)個新近SEC純化的單體BAX的獨立制備物。

BAX交聯(lián)—使用通過在冰上用20×BMH孵育指示劑量的BAX 15min接著用1mM DTT淬滅的交聯(lián)方法來檢測二聚化。樣品在90度下變性并且利用SDS-PAGE來分析。

脂質(zhì)體透化測定—脂質(zhì)體由以下摩爾百分率的脂質(zhì)(Avanti Polar Lipids)組成：磷脂酰膽堿48％；磷脂酰乙醇胺28％；磷脂酰肌醇10％；二油?；字＝z氨酸10％；和四油?；牧字?％，并且在擠壓時用ANTS/DPX(Molecular Probe)裝載。BAX(400nM)與指示濃度的BIM SAHB_A2以96孔格式(Corning)組合，并隨后在測定緩沖液(10mM HEPES、pH 7、200mM KCl、5mM MgCl₂和0.2mM EDTA)中添加脂質(zhì)體(來自50mM總脂質(zhì)原液的10μl)至100μl的最終體積。在從脂質(zhì)體釋放至上清液中時，基于當ANTS熒光團與DPX猝滅劑分離時發(fā)生的熒光強度升高來量化ANTS/DPX釋放。在30℃下使用Tecan Infinite M1000讀板機隨時間測量熒光(λ_激發(fā)＝355nm和λ_發(fā)射＝520nm)。90min時ANTS/DPX的釋放百分率計算為釋放百分率＝((F-F₀)/(F₁₀₀-F₀))×100，其中F₀和F₁₀₀分別為基線熒光和最大熒光。使用1％Triton處理來測定每次測定的脂質(zhì)體釋放最大量，并且此值設(shè)定為100％值。

細胞培養(yǎng)、細胞轉(zhuǎn)染和凋亡測定—野生型MEF和SV40轉(zhuǎn)化的Bax^-/-Bak^-/-(DKO)MEF維持在補充有10％FBS、100U ml^-1青霉素/鏈霉素、2mM l-谷氨酰胺、0.1mM MEM非必需氨基酸和50μΜβ-巰基乙醇的DMEM高葡萄糖(Invitrogen)中。通過BAX-IRES-GFP或BAX(P168G)-IRES-GFP質(zhì)粒的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)來實現(xiàn)將BAX和BAX突變體重建入DKO細胞中，接著對GFP陽性細胞進行MoFlo分揀。逆轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生如先前描述的進行(17)。BAX WT和突變體蛋白的可比較的表達通過Western印跡分析證實。對于十字孢堿處理而言，MEF(每個孔5×10⁴)在含血清培養(yǎng)基中接種于六孔透明底板16-18小時，并隨后用1μΜ十字孢堿處理。對于BAX或BAX突變體的瞬時逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)而言，用表達BAX或BAX突變體的逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染DKO MEF 30-36小時。細胞死亡通過膜聯(lián)蛋白-V(BioVision)染色來量化。流式細胞術(shù)使用LSRFortessa(BD Biosciences)來進行，并且使用FACSDiva(BD Biosciences)來分析數(shù)據(jù)。BAX或BAX突變體的表達量通過抗BAXWestern印跡來評估。統(tǒng)計分析的P值使用學(xué)生(Student)t檢驗來獲得。

亞細胞分級—MEF維持在補充有10％FBS、100U ml^-1青霉素/鏈霉素、2mM l-谷氨酰胺、0.1mM MEM非必需氨基酸和50μΜβ-巰基乙醇的DMEM(Invitrogen)中。MEF(每個孔20×10⁶)接種于150mm皿12小時。為了分離細胞溶質(zhì)和線粒體成分，通過Dounce勻漿器在含有10mM Tris、pH 7.5、1mM EGTA、200mM蔗糖和完全蛋白酶抑制劑(Complete Protease Inhibitors)的裂解緩沖液LB中裂解細胞。細胞裂解物以700×g離心10min來去除未裂解的細胞和細胞核。上清液在4℃下以12000×g離心10min，并且所得沉淀物收集為線粒體成分。膜沉淀物被再懸浮于LB+1％CHAPS中。

Western印跡—20μg全細胞蛋白在4-12％NuPage(Invitrogen)凝膠上電泳分離，轉(zhuǎn)移至Immobilon-FL PVDF膜(Millipore)并進行免疫印跡。對于利用Odyssey紅外成像系統(tǒng)(LI-COR Biosciences)的蛋白質(zhì)可視化而言，膜在含有2.5％乳粉的PBS中封閉。一級BAX抗體(Cell Signaling 2772S)在4℃下以1:1,000稀釋孵育過夜。在漂洗之后，用1:5,000稀釋的綴合IRdye800的山羊抗家兔IgG二級抗體(LI-COR Biosciences)孵育膜。利用Odyssey紅外成像系統(tǒng)檢測蛋白。

BAX構(gòu)象變化測定—細胞溶質(zhì)成分經(jīng)受免疫沉淀，接著是針對總BAX的免疫印跡。簡單地說，100-300μg總蛋白被收集并用預(yù)平衡的蛋白質(zhì)GSepharose微珠(Santa Cruz Biotechnology公司)孵育1小時。然后，預(yù)清洗的樣品在4℃下用6A7抗體(6μg/ml)(1:1,000，sc-23959，Santa Cruz Biotechnology)孵育四小時，接著添加預(yù)平衡的蛋白質(zhì)GSepharose微珠1小時。微珠被沉淀、在4℃下用裂解緩沖液漂洗3次，并且通過在90℃下在LDS/DTT上樣緩沖液中加熱微珠10分鐘來洗脫蛋白質(zhì)。免疫沉淀物經(jīng)受電泳和使用抗BAX抗體(1:1,000)(Cell Signaling 2772S)的Western印跡分析。

結(jié)果

本發(fā)明利用了以下發(fā)現(xiàn)：細胞溶質(zhì)BAX形成二聚自抑制形式，所述二聚自抑制形式通過一個原聚體的N末端觸發(fā)位點和包括第二個原聚體的α9的新相互作用C末端表面來介導(dǎo)。這些BAX的相互作用蛋白表面提供了理解BAX抑制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和設(shè)計用于藥理調(diào)節(jié)BAX的藥物的重要見解。發(fā)現(xiàn)了單體野生型BAX(BAX WT)在缺少BH3激活結(jié)構(gòu)域時，如通過尺寸排阻層析(SEC)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)測量的，隨著時間推移可逆地形成二聚體。諸如BAX的α8-α9環(huán)中P168G的單點突變控制螺旋α9活動化，產(chǎn)生SEC的相同二聚峰。BAX P168G形成在室溫下存留數(shù)天的更穩(wěn)定二聚體。

研究了來自小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的重組BAX和細胞溶質(zhì)BAX的構(gòu)象。使用幾丁質(zhì)親和層析接著是尺寸排阻層析(SEC)，從大腸桿菌提取物中純化了重組全長BAX(17)。重組BAX從SEC洗脫，主要在對應(yīng)于單體形式的峰(11,17)并且另外在對應(yīng)于二聚形式的第二相異峰(圖1A,1B)。培養(yǎng)的MEF在緩沖液中不利用去污劑來裂解，并且接著細胞溶質(zhì)和線粒體成分利用SEC的分級來分離。令人驚奇地，使用相同的針對重組BAX的SEC條件，在對應(yīng)于BAX二聚體的成分中洗脫出內(nèi)源性BAX(圖1B)。接下來，用BAX^-/-和BAK^-/-雙缺失(DKO MEF)和在內(nèi)源性水平上穩(wěn)定表達人BAX的MEF重復(fù)SEC，并且再次地，細胞溶質(zhì)BAX顯現(xiàn)為二聚體(圖1B)。為了排除細胞溶質(zhì)BAX是與細胞溶質(zhì)中抗凋亡BCL-2蛋白的異二聚體的可能性，細胞溶質(zhì)和線粒體成分經(jīng)受了Western印跡分析，證實細胞溶質(zhì)中抗凋亡蛋白相比于BAX而言水平非常低并且主要存在于線粒體(圖5)。此外，如通過使用僅識別活性BAX構(gòu)象的6A7抗體的免疫沉淀分析證明的，細胞溶質(zhì)BAX二聚體呈無活性構(gòu)象(圖6)(18)。然而，當用促進BAX激活的去污劑處理細胞溶質(zhì)BAX時，BAX以高分子量顯著呈現(xiàn)，據(jù)推測形成BAX寡聚體。另外，較少部分洗脫為BAX單體，表明BAX激活需要BAX二聚體構(gòu)象的破壞(圖1B)。合起來看，這些結(jié)果證實細胞溶質(zhì)BAX主要采用二聚和無活性構(gòu)象。

為了闡明細胞溶質(zhì)BAX二聚體構(gòu)象的生理作用，研究了BAX二聚化的分子基礎(chǔ)。首先，通過如SEC所顯示的高濃度BAX單體孵育或用BMH交聯(lián)劑處理接著是聚丙烯酰胺凝膠電泳(圖1C，7)，建立了用來可再現(xiàn)地產(chǎn)生足夠量BAX二聚體的方法。SEC的單體和二聚峰通過分別對應(yīng)于BAX單體(約21KD)和二聚體(約42KD)的均相群體的動態(tài)光散射來證實(表1)。在脂質(zhì)體測定中，盡管BAX單體不能夠單獨透化膜，但它在通過烴釘合的BIM BH3螺旋、BIM SAHB_A2激活時激活和誘導(dǎo)膜透化(圖1D)(11,12)。相比之下，單獨的SEC分離的BAX二聚體在脂質(zhì)體透化測定中不顯示誘導(dǎo)膜透化的能力，并且在添加BIM SAHB_A2時它幾乎無活性(圖1D)。因此，BAX二聚體構(gòu)象無活性并且相比于單體BAX而言對激活有抗性，表明BAX二聚體可形成自抑制構(gòu)象。

進行了X射線結(jié)晶學(xué)研究以獲得對無活性BAX二聚體的更深見解。利用野生型BAX和突變體來監(jiān)測SEC二聚體峰的穩(wěn)定性以預(yù)測成功的結(jié)晶。用于衍射的晶體質(zhì)量在與野生型BAX相比產(chǎn)生更穩(wěn)定二聚體的突變體情況下更好。不改變BAX結(jié)構(gòu)但降低α8-α9環(huán)動力學(xué)的BAX P168G突變體成功產(chǎn)生晶體，并且獲得了分辨率的天然X射線數(shù)據(jù)集。通過將全長BAX的NMR結(jié)構(gòu)用作搜索模型的分子置換方法，解析和細化了晶體結(jié)構(gòu)(表2)。非對稱單元含有具有極佳電子密度圖的兩個BAX分子，其中除了N末端非結(jié)構(gòu)化區(qū)的殘基(殘基1-13)和螺旋α1和α2之間非結(jié)構(gòu)化環(huán)的四個殘基(殘基37-40)外，所有BAX殘基可追蹤(圖2)。二聚化界面由保守殘基形成，并且是大范圍的，掩埋了幾乎表面面積(圖2A和8)。值得注意地，BAX二聚體結(jié)構(gòu)揭示了包括對BAX激活關(guān)鍵的兩個結(jié)構(gòu)表面的相互作用的二聚化界面；來自一個BAX原聚體的N末端觸發(fā)位點和來自包括C末端α9螺旋的第二個BAX原聚體的新C末端表面(圖2B,14)。應(yīng)注意的，此二聚體結(jié)構(gòu)和二聚化界面無關(guān)于BAX P168G突變體，因為對螺旋1引入新氫鍵的BH3殘基突變體G67R產(chǎn)生了如通過X射線晶體學(xué)測定的分辨率的相同非對稱二聚體構(gòu)象(圖9，表2)。

在非對稱BAX二聚體結(jié)構(gòu)內(nèi)的BAX原聚體與通過溶液NMR測定的無活性單體BAX結(jié)構(gòu)相似，然而，它們在螺旋取向和環(huán)構(gòu)象上具有顯而易見的差異(骨架r.m.s.d.)(17)。最明顯的差異對應(yīng)于位于包括螺旋α1、α6、α2和α1-α2環(huán)的N末端觸發(fā)位點表面的殘基。此外，與結(jié)合至BIM BH3螺旋的全長BAX結(jié)構(gòu)(骨架r.m.s.d.)(11)的比較表明，在非對稱二聚體中，α1-α2環(huán)呈封閉構(gòu)象，與螺旋α1和α6形成特異性分子內(nèi)接觸，而結(jié)合BIM BH3的BAX結(jié)構(gòu)具有呈開放和活性構(gòu)象的α1-α2環(huán)(11,12)。因此，結(jié)構(gòu)分析表明非對稱二聚體結(jié)構(gòu)含有呈相異但無活性構(gòu)象的兩個BAX分子，與細胞溶質(zhì)無活性BAX二聚體的證據(jù)一致(圖1)。

非對稱BAX二聚體構(gòu)象突出了BAX的兩個新相互作用表面(圖3)。一個BAX原聚體的相互作用表面主要包括先前鑒別的結(jié)合BIM SAHB_A2的BAX觸發(fā)位點殘基與其外圍處的若干額外相互作用(11)。此外，C末端表面處的相互作用位點是包括C末端螺旋α9的新的和未預(yù)見的BAX結(jié)合表面。C末端結(jié)合表面具有來自溶劑暴露的α9疏水殘基的疏水中心，所述疏水殘基由α8、α7、α3、α4-α5環(huán)和α8-α9環(huán)的極性和帶電荷殘基環(huán)繞(圖3A)。N末端結(jié)合表面具有來自溶劑暴露的由帶電荷殘基環(huán)繞的α1、α6和α1-α2環(huán)的疏水殘基形成的疏水中心，其補充C末端結(jié)合表面的帶電荷殘基(圖3A)。二聚化界面的核心是疏水的(圖3B,C)。數(shù)個殘基形成補充螺旋α9與N末端BH3結(jié)合位點的結(jié)合的疏水相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖3C)。然而，若干氫鍵和鹽橋促成二聚體形成和穩(wěn)定性(圖3B,D,E)。因此，疏水的、極性相互作用和鹽橋涉及大范圍和高度互補的二聚化界面。

在BH3結(jié)合至N末端觸發(fā)位點時，α1-α2環(huán)置換成開放構(gòu)象，該構(gòu)象變化對暴露6A7表位(殘基12-24)和BAX激活是必要的(11,12,17,18)(圖10A)。相比之下，在二聚體BAX結(jié)構(gòu)中，α9以保持α1-α2環(huán)構(gòu)象呈封閉和無活性構(gòu)象的取向結(jié)合N末端BH3結(jié)合位點(圖10A)。具體來說，BIM BH3結(jié)合是通過α1和α6的暴露疏水殘基與BIM BH3的保守疏水殘基介導(dǎo)的(圖10B,11A)。然而，在二聚體BAX結(jié)構(gòu)中，許多這些α1殘基被掩埋并且替代地與同一BAX原聚體的α1-α2環(huán)的殘基相互作用。這產(chǎn)生了形成自α1和α1-α2環(huán)定位的替代疏水空腔，其促進與α9的疏水殘基的相互作用(圖10C)。此封閉α1-α2環(huán)構(gòu)象還定位環(huán)的極性和帶電荷殘基，以產(chǎn)生穩(wěn)定化的分子間氫鍵(圖10C,11B)。因此，α1/α6位點和α1-α2環(huán)內(nèi)的這些新相互作用穩(wěn)定了無活性BAX構(gòu)象，封閉進入BAX觸發(fā)位點以及將螺旋α9維持在其自身疏水口袋內(nèi)的位置(圖12)。這些結(jié)構(gòu)見解提供了細胞溶質(zhì)BAX形成自抑制二聚體的強力證據(jù)，所述自抑制二聚體堵塞BAX激活和線粒體移位所需的關(guān)鍵相互作用。

為了確認晶體結(jié)構(gòu)中的二聚化界面和溶液中觀測的BAX二聚體不是先前針對截短BAXΔC21報道的域交換二聚體(13)，使用了稱作4MA的內(nèi)部交聯(lián)突變體(C62S，C126S，V121C，I136C)，4MA對激活有抗性并且不能形成如先前報道的域交換二聚體(13)。正如預(yù)期的，BAX 4MA保留形成BAX二聚體的能力，因為這些突變保持如BAX WT結(jié)構(gòu)中的無活性構(gòu)象(圖4A)。與二聚體晶體結(jié)構(gòu)一致，在二聚化界面處形成關(guān)鍵相互作用的殘基中的突變E75K和T172K或S184L使α9與BH3溝的相互作用不穩(wěn)定，干擾二聚體形成(圖4A)。接下來，測試N末端觸發(fā)位點結(jié)合因子BIM SHAB_A是否可競爭并解離二聚體。分離的BAX 4MA二聚體用或不用增加量的BIM SHAB_A孵育。結(jié)果顯示高劑量的BIM SHAB_A可競爭并解離二聚體成單體(圖14A)。此外，在存在減少內(nèi)部交聯(lián)BAX 4MA突變體的還原劑(DTT)時，BIM SHAB_A還可激活BAX 4MA單體以誘導(dǎo)BAX寡聚化。這些生化數(shù)據(jù)進一步驗證了自抑制二聚BAX作為通過僅BH3蛋白抑制激活的機制。

為了研究BAX二聚化機制的生理作用，著手做了BAX WT和突變體形成自抑制二聚體和調(diào)控BAX激活的能力的研究。DKO MEF在生理表達水平上與BAX WT和突變體重組。P168G突變體形成比BAX WT更穩(wěn)定的自抑制二聚體(圖4A，圖14B)，而E75K和S184L突變體干擾BAX二聚化(圖4A)。與此一致，BAX WT和BAX P168G蛋白二者在細胞溶質(zhì)中僅形成二聚體；然而，BAX E75K和BAX S184L在細胞溶質(zhì)中形成單體(圖4B)。醒目地，BAX突變體與單體BAX的組成型表達顯示出相比于BAX WT在細胞死亡誘導(dǎo)上顯著升高的活性(圖4C)。相比之下，具有更穩(wěn)定細胞溶質(zhì)二聚體的BAX P168G突變體細胞具有相比于BAX WT受損的活性(圖4C)。此外，在十字孢堿處理時，相比于BAX WT，BAX P168G二聚體對在線粒體外膜中經(jīng)受移位和寡聚化更有抗性(圖4D)。然而，在十字孢堿處理時，單體BAX E75K和S184L比對應(yīng)BAX WT二聚體經(jīng)受更快的激活和在線粒體外膜處變換至寡聚體(圖4D)。合起來看，數(shù)據(jù)表明細胞溶質(zhì)BAX可使其構(gòu)象從自抑制二聚體轉(zhuǎn)換至單體，以及單體BAX有利于更快BAX激活和更強效細胞死亡活性，而二聚BAX妨礙BAX激活和最終細胞死亡活性。

在凋亡起始期間，細胞溶質(zhì)BAX通過激活因子僅BH3蛋白與N末端觸發(fā)位點的相互作用激活，接著是N末端構(gòu)象變化和α9從其C末端疏水溝的位移，以便移位至線粒體。此外，在由激活因子僅BH3蛋白(BH3-only protein)進一步激活時，具有從其疏水溝移位的α9的線粒體連接的BAX經(jīng)受N末端構(gòu)象變化(13)。不論BAX激活的步驟，N末端和C末端表面處的構(gòu)象變化是導(dǎo)致膜透化的完全BAX激活所需的。本文的工作表明細胞溶質(zhì)BAX形成自抑制二聚體構(gòu)象來阻止每個原聚體中N末端或C末端的構(gòu)象變化并且維持BAX激活在控制之下(圖13)。細胞中凋亡的誘導(dǎo)應(yīng)需要保證促凋亡信號(例如僅BH3蛋白)超過其表達水平或活性狀態(tài)的隨機波動；因此，BAX自抑制提供了封閉BAX激活和阻止不需要的凋亡的機制。最終，這些結(jié)構(gòu)和功能見解對于藥物調(diào)節(jié)劑的開發(fā)具有重要暗示，所述調(diào)節(jié)劑約束(engage)N末端位點或C末端位點來調(diào)節(jié)特征為過度細胞死亡或存活的疾病中的凋亡(2,3)。

表1.來自尺寸排阻層析洗脫峰的BAX單體和二聚體的代表性動態(tài)光散射數(shù)據(jù)。

表2.數(shù)據(jù)收集和細化的結(jié)構(gòu)統(tǒng)計。

括號中的數(shù)值是針對最高分辨率殼層的。^┼R_對稱＝Σ(I-<I>)/Σ<I>，其中I是對給定折射的強度測量并且<I>是對此折射的多個測量的平均強度。

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