本發(fā)明涉及具有抗炎癥及代謝疾病改善功效的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)hac01菌株及其用途，更詳細(xì)而言，涉及具有抗炎癥及代謝疾病改善功效的植物乳桿菌hac01菌株、益生菌制劑、抗炎癥組合物及用于改善代謝疾病的健康食品組合物，所述益生菌制劑、抗炎癥組合物及用于改善代謝疾病的健康食品組合物含有選自所述菌株、所述菌株的培養(yǎng)物、所述培養(yǎng)物的濃縮液及干燥物中的一種以上作為有效成分。
背景技術(shù)：
：：在整個(gè)歷史上，乳桿菌一直被人類(lèi)食用，并且作為對(duì)人體健康產(chǎn)生非常有益影響的微生物，其有用性與日俱增。近來(lái)，對(duì)乳桿菌的研究正積極進(jìn)行，從而不僅作為普通食品，而且作為健康食品及藥品而進(jìn)行開(kāi)發(fā)等，其應(yīng)用范圍正逐步擴(kuò)大。這些乳桿菌棲息在動(dòng)物的腸內(nèi)，分解動(dòng)物攝取的營(yíng)養(yǎng)成分及纖維素等而將其用作能量源，并且生產(chǎn)乳酸及抗生物質(zhì)等而抑制腸內(nèi)有害菌的發(fā)育，從而對(duì)維持腸內(nèi)健康起到重要的作用。此外，乳桿菌還用于促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)及改善飼料利用率、增加對(duì)病的抵抗力、抑制有害細(xì)菌的增殖、減少死亡率、抑制腐爛有毒物質(zhì)的形成及形成各種維生素。然而，若要發(fā)揮上述的功效，從外部流入的乳桿菌應(yīng)不受任何干擾地到達(dá)腸內(nèi)而顯示其功能。為此，在口服時(shí)，由胃酸引起的破壞要小，且對(duì)膽汁酸的耐性要強(qiáng)。肥胖在外觀上的審美方面也成為社會(huì)的話題，但實(shí)際上，肥胖的最嚴(yán)重問(wèn)題是其會(huì)引起健康上的嚴(yán)重危險(xiǎn)，如糖尿病、高血壓等代謝疾病并發(fā)癥等。這種與肥胖的病態(tài)相關(guān)的癥狀為在肥胖個(gè)體中出現(xiàn)的全身性慢性炎癥(systemicchronicinflammation)。炎癥反應(yīng)為在體內(nèi)發(fā)生的免疫機(jī)制之一，當(dāng)局部性發(fā)生時(shí)，其為保護(hù)身體的重要反應(yīng)，使得身體免受外部病原菌或病毒的侵入。然而，由于體內(nèi)免疫反應(yīng)的失衡，使這種炎癥反應(yīng)全身性、慢性地過(guò)度活化時(shí)，會(huì)對(duì)體內(nèi)發(fā)生的代謝作用引起障礙。因肥胖引起的慢性炎癥反應(yīng)是糖尿病、心血管疾病、動(dòng)脈硬化等各種代謝疾病的原因，并且是將肥胖規(guī)定為疾病的最重要的因素。在沒(méi)有因慢性炎癥反應(yīng)引起的繼發(fā)性代謝疾病的病發(fā)時(shí)，肥胖僅為美容上的問(wèn)題，近期世界衛(wèi)生組織也將如糖尿病等顯著降低生活質(zhì)量的、能夠引發(fā)繼發(fā)性代謝疾病的慢性炎癥反應(yīng)列為理由，并把肥胖規(guī)定為疾病。另一方面，韓國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利第2011-0000871號(hào)中公開(kāi)了“具有抗氧化及抗炎癥功效的植物乳桿菌hy7711及含有其作為有效成分的產(chǎn)品，”然而，并沒(méi)有公開(kāi)本發(fā)明的具有抗炎癥及代謝疾病改善功效的植物乳桿菌hac01菌株。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明是根據(jù)上述要求而得出，本發(fā)明人從無(wú)辣味的白泡菜中分離出耐酸性及耐膽汁性強(qiáng)、沒(méi)有生成生物胺的能力、對(duì)抗生素沒(méi)有耐性的植物乳桿菌hac01菌株，并將所述菌株與超高脂肪食物一起經(jīng)口施用給小鼠時(shí)，與對(duì)照組相比，確認(rèn)了炎癥緩解效果和血液中膽固醇、中性脂肪等的水平的降低，從而完成了本發(fā)明。技術(shù)方案為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供具有抗炎癥及代謝疾病改善功效的植物乳桿菌hac01菌株。此外，本發(fā)明提供益生菌制劑，其特征在于，其包含選自所述菌株、所述菌株的培養(yǎng)物、所述培養(yǎng)物的濃縮液及干燥物中的一種以上作為有效成分。此外，本發(fā)明提供抗炎癥組合物，其特征在于，其包含選自所述菌株、所述菌株的培養(yǎng)物、所述培養(yǎng)物的濃縮液及干燥物中的一種以上作為有效成分。此外，本發(fā)明提供用于改善代謝疾病的健康食品組合物，其特征在于，其包含選自所述菌株、所述菌株的培養(yǎng)物、所述培養(yǎng)物的濃縮液及干燥物中的一種以上作為有效成分。有益效果本發(fā)明的具有優(yōu)異的耐酸性及耐膽汁性、對(duì)各種種類(lèi)的抗生素沒(méi)有耐性、沒(méi)有生成生物胺的能力、具有抑制各種引發(fā)炎癥的細(xì)胞因子表達(dá)的功效的植物乳桿菌hac01菌株可以利用為益生菌制劑、緩解慢性炎癥的功能性食品、功能性食品添加劑等，并且期待能夠利用為用于生產(chǎn)各種乳桿菌發(fā)酵乳及發(fā)酵產(chǎn)品的發(fā)酵食品功能性發(fā)酵劑。此外，本發(fā)明的植物乳桿菌hac01菌株可降低血液中葡萄糖、膽固醇及中性脂肪的水平，從而可以應(yīng)用于用于代謝疾病改善的健康食品中，因此期待其能夠具有產(chǎn)業(yè)實(shí)用性。附圖說(shuō)明圖1為用血液分析儀測(cè)定并分析施用本發(fā)明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)hac01的組(hf-lp)、對(duì)照組(hf-pbs)和施用鼠李糖乳桿菌(lactobacillusrhamnosus)gg益生菌作為參考菌株的組(hf-lg)的小鼠血漿中的葡萄糖(a)、膽固醇(b)及中性脂肪(c)的水平的結(jié)果。圖2為對(duì)施用本發(fā)明的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)hac01的組(hf-lp)、對(duì)照組(hf-pbs)和施用鼠李糖乳桿菌gg益生菌作為參考菌株的組(hf-lg)的小鼠的體重變化(a)及內(nèi)臟脂肪量(b)進(jìn)行分析的結(jié)果。圖3為對(duì)施用本發(fā)明的植物乳桿菌hac01的組(hf-lp)、對(duì)照組(hf-pbs)和施用鼠李糖乳桿菌gg益生菌作為參考菌株的組(hf-lg)的小鼠中由小鼠的內(nèi)臟脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪因子中與緩解炎癥相關(guān)的脂聯(lián)素(a)、以及與引發(fā)炎癥相關(guān)的瘦蛋白(b)、單核細(xì)胞趨化蛋白(mcp)-1(c)及白細(xì)胞介素(il，interleukin)-1b(d)的mrna表達(dá)量進(jìn)行分析的結(jié)果。圖4為對(duì)施用本發(fā)明的植物乳桿菌hac01的組(hf-lp)、對(duì)照組(hf-pbs)和施用鼠李糖乳桿菌gg益生菌作為參考菌株的組(hf-lg)的小鼠的脾臟中與抗炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10(a)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(tgf)-β(b)、在調(diào)節(jié)性t細(xì)胞中特異性表達(dá)的foxp3轉(zhuǎn)錄因子(c)、作為與引發(fā)炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子的白細(xì)胞介素-12(d)，腫瘤壞死因子(tnf)-α(e)及白細(xì)胞介素-6(f)的mrna表達(dá)水平變化進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果。圖5為示出用酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)對(duì)施用本發(fā)明的植物乳桿菌hac01的組(hf-lp)、對(duì)照組(hf-pbs)和施用鼠李糖乳桿菌gg益生菌作為參考菌株的組(hf-lg)的小鼠血清中脂聯(lián)素(a)和瘦蛋白(b)的變化量進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。具體實(shí)施方式為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供具有抗炎癥及代謝疾病改善功效的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)hac01菌株。本發(fā)明人從白泡菜中分離出作為乳桿菌的植物乳桿菌，并對(duì)分離出的乳桿菌的耐酸性及耐膽汁性、抗生素耐性及生成生物胺的能力進(jìn)行分析的結(jié)果，確認(rèn)了分離出的乳桿菌顯示出優(yōu)異的耐酸性及耐膽汁性，沒(méi)有抗生素耐性，也沒(méi)有生成生物胺的能力，因此，將所述分離出的菌株命名為植物乳桿菌hac01，并于2014年8月6日保藏于韓國(guó)生命工學(xué)研究院(保藏編號(hào)：kctc12647bp)。對(duì)于本發(fā)明一具體實(shí)施方案的菌株，所述抗炎癥功效可以通過(guò)增加與緩解炎癥相關(guān)的脂聯(lián)素蛋白質(zhì)的水平、降低與引發(fā)炎癥相關(guān)的瘦蛋白的蛋白質(zhì)水平、抑制與引發(fā)炎癥相關(guān)的單核細(xì)胞趨化蛋白-1(mcp-1，monocytechemoattractantprotein-1)、白細(xì)胞介素-1b、白細(xì)胞介素-12的mrna表達(dá)水平來(lái)顯示，但并不限定于此。此外，對(duì)于本發(fā)明一具體實(shí)施方案的菌株，所述代謝疾病改善功效可以為降低血液中的葡萄糖、膽固醇及中性脂肪的水平，但并不限定于此。所述代謝疾病可以為肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血癥、高膽固醇癥、動(dòng)脈硬化癥、脂肪肝和心臟病等，但并不限定于此。此外，本發(fā)明提供益生菌制劑，其特征在于，其含有選自本發(fā)明的植物乳桿菌hac01菌株、所述菌株的培養(yǎng)物、所述培養(yǎng)物的濃縮液及干燥物中的一種以上作為有效成分。本發(fā)明的植物乳桿菌hac01菌株具有優(yōu)異的耐酸性及耐膽汁性(表3)，沒(méi)有生成能夠引發(fā)過(guò)敏性免疫反應(yīng)的生物胺的能力，并且沒(méi)有觀察到對(duì)紅霉素、慶大霉素、氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星及青霉素等抗生素的耐性，從而可有利地用作益生菌制劑。所述益生菌制劑可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，以多種劑型和方法來(lái)制備及施用。例如，本發(fā)明的植物乳桿菌hac01菌株、所述菌株的培養(yǎng)物、所述培養(yǎng)物的濃縮液或干燥物可以與藥劑學(xué)領(lǐng)域中通常使用的載體進(jìn)行混合而制備成粉劑(powder)、液劑(液體和溶液(liquidsandsolutions))、片劑(tablet)、膠囊劑(capsule)、糖漿劑(syrup)、混懸劑(suspension)或顆粒劑(granule)等形式并進(jìn)行施用。作為所述載體，可例舉為粘合劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、賦形劑(vehicle)、加溶劑、分散劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、色素及香料等，但并不限定于此。此外，施用量可根據(jù)在體內(nèi)的有效成分的吸收度、非活性形式的有效成分的比率、排泄速度、受試者的年齡、性別、物種、狀態(tài)及疾病的嚴(yán)重程度等進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。此外，本發(fā)明提供包含所述益生菌制劑的食品。本發(fā)明的所述益生菌制劑包含選自植物乳桿菌hac01菌株、所述菌株的培養(yǎng)物、所述培養(yǎng)物的濃縮液及干燥物中的一種以上作為有效成分。將本發(fā)明的所述益生菌制劑作為食品添加劑來(lái)使用時(shí)，所述益生菌制劑可以直接添加，或者可以與其它食品或食品成分一起使用，并且可以根據(jù)通常的方法來(lái)適當(dāng)使用。有效成分的混合量可以根據(jù)其使用目的(預(yù)防、健康或治療性處理)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。一般在制備食品或飲料時(shí)，相對(duì)于原料，本發(fā)明的益生菌制劑添加量為15重量份以下，優(yōu)選的添加量為10重量份以下。但是，在以健康及衛(wèi)生為目的或以調(diào)節(jié)健康為目的的長(zhǎng)時(shí)間攝取的情況下，混合量可以為上述范圍以下，因安全性方面沒(méi)有任何問(wèn)題，因此也可以使用上述范圍以上的混合量。此外，本發(fā)明提供抗炎癥組合物，其特征在于，其含有選自本發(fā)明的植物乳桿菌hac01菌株、所述菌株的培養(yǎng)物、所述培養(yǎng)物的濃縮液及干燥物中的一種以上作為有效成分。本發(fā)明的抗炎癥組合物可以通過(guò)提高血清中脂聯(lián)素(與緩解炎癥相關(guān))蛋白質(zhì)的水平、降低瘦蛋白(與引發(fā)炎癥相關(guān))蛋白質(zhì)的水平、在作為主要免疫器官的脾臟中抑制與引發(fā)炎癥相關(guān)的mcp-1、白細(xì)胞介素-1b、白細(xì)胞介素-12的mrna的表達(dá)來(lái)顯示抗炎癥功效，但并不限定于此。本發(fā)明的抗炎癥組合物可以為藥學(xué)組合物或健康食品組合物的形式，當(dāng)所述抗炎癥組合物為藥學(xué)組合物時(shí)，可以包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。當(dāng)所述抗炎癥組合物為健康食品組合物形式時(shí)，所述健康食品只要是被攝取用于增加抗炎癥活性，就不受特別的限定。所述健康食品包含耐酸性及耐膽汁性優(yōu)異的植物乳桿菌hac01菌株，因此可以為酸乳、乳酸菌飲料(calpis)、奶酪、黃油等乳桿菌發(fā)酵乳食品或豆腐、大醬、清國(guó)醬、果凍、泡菜等發(fā)酵產(chǎn)品等，但并不限定于此。所述發(fā)酵乳及發(fā)酵產(chǎn)品可以在通常的制備方法中只將菌株替換為本發(fā)明的植物乳桿菌hac01菌株而容易地制備。此外，本發(fā)明提供用于改善代謝疾病的健康食品組合物，其特征在于，其含有選自本發(fā)明的植物乳桿菌hac01菌株、所述菌株的培養(yǎng)物、所述培養(yǎng)物的濃縮液及干燥物中的一種以上作為有效成分。所述健康食品只要被攝取用于預(yù)防或改善代謝疾病，就不受特別的限定。將本發(fā)明的用于改善代謝疾病的健康食品組合物作為食品添加劑使用時(shí)，所述組合物可以直接添加，或者可以與其它食品或食品成分一起使用，并且可根據(jù)通常的方法來(lái)適當(dāng)使用，其中所述用于改善代謝疾病的健康食品組合物含有選自本發(fā)明的植物乳桿菌hac01菌株、所述菌株的培養(yǎng)物、所述培養(yǎng)物的濃縮液及干燥物中的一種以上作為有效成分。有效成分的混合量可根據(jù)其使用目的進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。一般制備食品或飲料時(shí)，相對(duì)于原料，本發(fā)明的組合物添加量為15重量份以下，優(yōu)選的添加量為10重量份以下。但是，以健康及衛(wèi)生為目的或以調(diào)節(jié)健康為目的的長(zhǎng)時(shí)間攝取的情況下，所述混合量可以為上述范圍以下，因安全性方面沒(méi)有任何問(wèn)題，因此也可以使用上述范圍以上的量。所述食品的種類(lèi)不受特別的限定?？商砑铀鼋】凳称方M合物的食品可例舉如包括肉類(lèi)、香腸、面包、巧克力、糖類(lèi)、點(diǎn)心類(lèi)、餅干類(lèi)、比薩餅、拉面、其它面類(lèi)、口香糖類(lèi)、冰淇淋類(lèi)的乳制品等，其包含通常意義上的所有健康食品。本發(fā)明的健康飲料組合物與通常的飲料相同，可以進(jìn)一步含有多種香味劑或甜味劑或天然碳水化合物等作為其它成分。所述天然碳水化合物為如葡萄糖、果糖的單糖，如麥芽糖、蔗糖的二糖，以及如糊精、環(huán)糊精的多糖，如木糖醇、山梨糖醇、赤蘚糖醇等的糖醇。作為甜味劑可以使用如奇異果甜蛋白(thaumatin)、甜菊(stevia)提取物的天然甜味劑或如糖精、阿斯巴甜的合成甜味劑等。以下，根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。但下述實(shí)施例僅用于例示本發(fā)明，本發(fā)明的內(nèi)容并不被下述實(shí)施例所限定。材料及方法菌株的分離及鑒定從制備后經(jīng)過(guò)10～15天以上且ph為4.5以下的白泡菜中分離出乳桿菌。在經(jīng)過(guò)高壓滅菌的袋子中裝入90ml的生理鹽水(0.85％nacl/l)，并加入10g的白泡菜樣品后均勻混合，然后取1ml混合物并加至9ml的生理鹽水中進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)⒎磸?fù)涂抹于mrs固體培養(yǎng)基中3次。之后，在37℃的培養(yǎng)器中培養(yǎng)48小時(shí)以上，之后通過(guò)利用0.3％過(guò)氧化氫的觸酶(catalase)試驗(yàn)和革蘭氏染色法分析了經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的菌。之后將觸酶陰性、革蘭氏陽(yáng)性且為桿(rod)狀的菌定為乳桿菌(lactobacillus)預(yù)備候選菌后進(jìn)行分離。分析被分離菌株的16srdna基因核苷酸序列，并查明分類(lèi)學(xué)上的種(species)。菌株核苷酸序列的查明則委托solgent公司(韓國(guó))來(lái)執(zhí)行。耐酸性及耐膽汁性測(cè)試乳桿菌與食物一起攝取時(shí)，在分泌強(qiáng)胃酸的胃中滯留1小時(shí)左右，然后在十二指腸的高濃度膽汁中滯留2小時(shí)左右后移動(dòng)到腸中。乳桿菌只有在這種惡劣的環(huán)境中存活并進(jìn)入腸中才能粘附在腸中，從而給宿主產(chǎn)生好的影響，并能夠起到作為益生菌的作用。因此，本發(fā)明中實(shí)施了通過(guò)以與人體(胃和十二指腸)環(huán)境相似的條件設(shè)定的模擬胃十二指腸通路(ssdp，simulatedstomachduodenumpassage)方法來(lái)進(jìn)行分離的乳桿菌的耐酸性及耐膽汁性實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)單而言，將分離的植物乳桿菌菌株在mrs液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時(shí)，然后將1ml的菌株培養(yǎng)液裝入經(jīng)過(guò)滅菌的一次性菌管中，并在4℃下以12,000xg離心分離5分鐘后，廢棄上層液并用生理鹽水洗滌細(xì)胞沉淀，所述洗滌過(guò)程反復(fù)實(shí)施2次。之后，去除生理鹽水，將沉淀的菌加入到ph調(diào)節(jié)成3的10ml的mrs液體培養(yǎng)基中后充分混合。在其懸浮液中取1ml進(jìn)行10倍梯度稀釋后，涂抹于mrs固體培養(yǎng)基中并進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定初始菌的cfu(菌落形成單位)/ml，剩余的9ml在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)后，連續(xù)混合4ml的膽汁酸(混合10g的牛膽汁(oxgall)和100ml的蒸餾水并進(jìn)行高壓滅菌后使用)和17ml的十二指腸液(duodenumjuice；6.4g/l的nahco3、0.239g/l的kcl及1.28g/l的nacl與蒸餾水充分混合后，將ph調(diào)節(jié)為7.4，并進(jìn)行高壓滅菌后使用)。在37℃的培養(yǎng)器中培養(yǎng)2小時(shí)后，進(jìn)行10倍梯度稀釋并涂抹于mrs固體培養(yǎng)基中，對(duì)存活的菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。然后，比較經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的初始菌的cfu/ml和3小時(shí)后存活的菌的cfu/ml，并顯示為存活率?？股啬托詼y(cè)試制備用二倍稀釋法以0.025～64μg/ml的濃度加入抗生素(紅霉素(erythromycin)、慶大霉素(gentamycin)、氨芐西林(ampicillin)、四環(huán)素(tetracycline)、氯霉素(chloramphenicol)、鏈霉素(streptomycin)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)及青霉素g(penicilling))的mrs固體培養(yǎng)基。將培養(yǎng)18小時(shí)的植物乳桿菌菌株接種于混有抗生素的固體培養(yǎng)基中，使其達(dá)到105個(gè)/斑點(diǎn)(spot)的密度，然后在37℃下培養(yǎng)24～48小時(shí)并測(cè)定最小抑菌濃度(mic)。生物胺生成測(cè)試制備添加有0.1％的氨基酸前體(l-酪氨酸二鈉鹽(tyrosinedisodiumsalt)、l-組氨酸鹽酸鹽一水合物(histidinemonohydrochloridemonohydrate)、l-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽(ornithinemonohydrochloride)、l-賴氨酸鹽酸鹽(lysinemonohydrochloride))的mrs液體培養(yǎng)基，并接種1％分離的植物乳桿菌于含氨基酸前體的mrs液體培養(yǎng)基后，進(jìn)行5～10次傳代培養(yǎng)，從而活化脫羧酶(decarboxylase)。在脫羧酶培養(yǎng)基(將0.5％的胰蛋白胨、0.5％的酵母提取物、0.5％的肉提取物、0.5％的氯化鈉、0.25％的葡萄糖、0.05％的聚山梨酯(tween)-80、0.02％的硫酸鎂、0.005％的硫酸錳、0.004％的硫酸鐵、0.2％的檸檬酸鹽、0.001％的硫胺素、0.2％的k2po4、0.01％的碳酸鈣、0.005％的吡哆醛-5-磷酸酯(pyridoxal-5-phosphate)、1％的氨基酸、0.006％的溴甲酚紫(bromocresolpurple)及2％的瓊脂混合于蒸餾水后，將ph調(diào)節(jié)為5.3并使用)中涂抹具有活化的酶的菌后，在37℃下培養(yǎng)24～48小時(shí)，確認(rèn)顏色是否變成紫色，從而辨別生成生物胺的能力。脫羧酶培養(yǎng)基中的溴甲酚紫在ph為5.2時(shí)會(huì)呈黃色，但是當(dāng)ph上升到6.8時(shí)，則會(huì)變成紫色。因此，可以利用因生物胺的生成而引起ph上升時(shí)變成紫色來(lái)確認(rèn)生物胺的生成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)購(gòu)買(mǎi)24只7周齡的雄性c57bl/6j小鼠(無(wú)特定病原體)，然后分成如下3組(每組8只)，在23℃、濕度為55±10％、明/暗周期為12小時(shí)的環(huán)境中養(yǎng)殖12小時(shí)。作為微生物對(duì)照組則使用已被商品化的鼠李糖乳桿菌gg(lactobacillusrhamnosusgg，以下稱(chēng)為lgg)。a.超高脂肪食物(60％脂肪)+pbsb.超高脂肪食物(60％脂肪)+分離的菌株c.超高脂肪食物(60％脂肪)+lgg所有小鼠經(jīng)過(guò)第1周的適應(yīng)期后，從本實(shí)驗(yàn)的第1周到第12周，喂食超高脂肪食物和pbs或者喂食混合有菌株的超高脂肪食物，向動(dòng)物經(jīng)口施用總體積為30μl的pbs或者菌種以3x108cfu/日的濃度稀釋于其中的30μlpbs。水和食物以自由采食(ad-libitum)的方式提供。在總共12周的實(shí)驗(yàn)期間，以每周1次的間隔測(cè)量小鼠的體重，在實(shí)驗(yàn)最后一天以頸椎脫位處死小鼠后，取出血液、脾臟、內(nèi)臟脂肪并記錄重量，然后立即保管于-80℃后，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用。生物指標(biāo)分析利用自動(dòng)化學(xué)分析儀(autochemistryanalyzer)(邁瑞bs130，邁瑞醫(yī)療(mindraymedical)，中國(guó))分析了血液中的葡萄糖(glucose)、膽固醇、中性脂肪的量，測(cè)量是在浦項(xiàng)科技園實(shí)施的。此外，血液中的脂聯(lián)素和瘦蛋白的量是使用特定的小鼠elisa試劑盒(komabiotech，韓國(guó))來(lái)測(cè)定的。使用迷你rneasy提取試劑盒(minirneasyextractionkit)(普洛麥格(promega)，美國(guó))，根據(jù)制造公司提示的方法提取內(nèi)臟脂肪和脾臟的總rna后，利用goscript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(goscriptreversetranscriptasekit)(promega)逆轉(zhuǎn)錄成cdna后使用sybr預(yù)混合extaqii(sybrpremixextaqii)(takara，日本)來(lái)確認(rèn)了mrna表達(dá)量。mrna表達(dá)水平分析是使用實(shí)時(shí)pcr分析儀steponeplus(pcranalyzersteponeplus)(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems)，美國(guó))來(lái)進(jìn)行分析的，pcr中使用的引物信息如下述表1中所示。[表1]pcr引物序列信息實(shí)施例1.植物乳桿菌hac01菌株的特性分析由白泡菜中分離的觸酶陰性、革蘭氏陽(yáng)性且為桿狀的菌株的16srdna基因核苷酸序列的結(jié)果，確認(rèn)了其為植物乳桿菌，并將本發(fā)明中分離的菌株命名為植物乳桿菌hac01。使用api50ch試劑盒(生物梅里埃(biomerieux))，并根據(jù)該指南的方法來(lái)實(shí)施，從而確認(rèn)本發(fā)明中分離的植物乳桿菌hac01菌株的糖利用特性。結(jié)果是，本發(fā)明的植物乳桿菌hac01菌株顯示出如下述表2中所示的糖利用特性。[表2]植物乳桿菌hac01菌株的糖利用特性結(jié)果實(shí)施例2.植物乳桿菌hac01菌株的耐酸性及耐膽汁性分析對(duì)本發(fā)明中分離的植物乳桿菌hac01菌株的耐酸性及耐膽汁性進(jìn)行了分析。分析時(shí)，與已熟知的作為益生菌菌株的鼠李糖乳桿菌gg進(jìn)行了比較，并確認(rèn)到本發(fā)明的植物乳桿菌hac01菌株與比較菌株相比，顯示出更優(yōu)異的耐酸性及耐膽汁性(表3)。[表3]植物乳桿菌hac01菌株的耐酸性及耐膽汁性分析結(jié)果實(shí)施例3.植物乳桿菌hac01菌株的抗生素耐性及生物胺生成與否分析對(duì)分離的植物乳桿菌hac01菌株的抗生素耐性進(jìn)行調(diào)查的結(jié)果，確認(rèn)了以最小抑制濃度為基準(zhǔn)，對(duì)紅霉素、慶大霉素、氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星及青霉素共8種抗生素沒(méi)有抗生素耐性(表4)。[表4]植物乳桿菌hac01菌株的抗生素耐性試驗(yàn)結(jié)果此外，對(duì)所述菌株植物乳桿菌hac01菌株的生成生物胺的能力進(jìn)行分析的結(jié)果，確認(rèn)了對(duì)酪氨酸、組胺、腐胺、尸胺均為陰性，從而確認(rèn)了本發(fā)明的菌株沒(méi)有生成能夠引發(fā)過(guò)敏性免疫反應(yīng)的生物胺的能力(表5)。[表5]對(duì)植物乳桿菌hac01菌株生成4種不同生物胺的能力進(jìn)行調(diào)查的結(jié)果實(shí)施例4.植物乳桿菌hac01菌株的抗炎癥效果及代謝疾病改善效果分析將植物乳桿菌hac01菌株與超高脂肪食物一起混合供給小鼠作為飼料后，與對(duì)照組(超高脂肪食物+pbs)及比較組(超高脂肪食物+鼠李糖乳桿菌gg)一起對(duì)血液中葡萄糖、膽固醇及中性脂肪的變化及炎癥相關(guān)因子的表達(dá)變化進(jìn)行了分析。結(jié)果是，在與超高脂肪食物一起攝取本發(fā)明的植物乳桿菌hac01菌株的小鼠血漿中，確認(rèn)了葡萄糖和膽固醇的水平相對(duì)于對(duì)照組低，且與比較組顯示出相似的水平，而另一方面，確認(rèn)了中性脂肪的水平相對(duì)于對(duì)照組及比較組低(圖1)。此外，還確認(rèn)了施用本發(fā)明菌株的小鼠的體重變化及內(nèi)臟脂肪量相對(duì)于對(duì)照組有減少的傾向(圖2)。并且，在提取的小鼠內(nèi)臟脂肪細(xì)胞中，檢測(cè)出作為具有緩解炎癥特性的激素的脂聯(lián)素的mrna表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組和比較組處于較低水平(圖3a)，并且可以確認(rèn)到與引發(fā)炎癥相關(guān)的瘦蛋白、mcp-1及白細(xì)胞介素-1b的mrna表達(dá)水平相對(duì)于比較組及對(duì)照組顯示出顯著低的水平(圖3)。此外，確認(rèn)在作為對(duì)感染或炎癥產(chǎn)生反應(yīng)的重要淋巴器官的脾臟中作為抗炎癥細(xì)胞因子的白細(xì)胞介素-10和tgf-β的mrna表達(dá)水平的結(jié)果，并確認(rèn)與調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的形成、維持及功能相關(guān)的主要轉(zhuǎn)錄因子foxp3的mrna表達(dá)水平，以及作為引發(fā)炎癥的細(xì)胞因子的白細(xì)胞介素-12、tnf-α、白細(xì)胞介素-6的mrna表達(dá)水平的結(jié)果，確認(rèn)了在攝取本發(fā)明的植物乳桿菌hac01菌株的小鼠的脾臟中白細(xì)胞介素-10、tgf-β及foxp3的mrna表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組及比較組高，并且確認(rèn)了引發(fā)炎癥的因子的mrna表達(dá)水平與對(duì)照組及比較組相似或處于較低水平(圖4)。最后通過(guò)elisa對(duì)各組小鼠的血清中作為與引發(fā)炎癥相關(guān)的因子的脂聯(lián)素的水平及瘦蛋白的水平進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果，在攝取本發(fā)明的植物乳桿菌hac01菌株的組中，確認(rèn)到脂聯(lián)素蛋白的量相對(duì)于對(duì)照組及比較組高，而對(duì)于瘦蛋白，確認(rèn)到其蛋白量相對(duì)于對(duì)照組及比較組低(圖5)。[保藏編號(hào)]保藏機(jī)構(gòu)名稱(chēng)：韓國(guó)生命工學(xué)研究院保藏編號(hào)：kctc12647bp保藏日期：20140806序列表<110>韓東大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)株式會(huì)社atogen<120>具有抗炎癥及代謝疾病改善功效的植物乳桿菌hac01菌株及其用途<130>pct1513-cn<160>20<170>kopatentin2.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>1gctctcctttcctgccag18<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>2gagatgcaggtcttcttggtc21<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>3tgacaccaaaaccctcata19<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>4tcattggctatctgcagcac20<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>5cggaaccaaatgagatcagaa21<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>6tgtggaaaaggtagtggatgc21<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>7gaccttccaggatgaggaca20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>8agctcatatgggtccgacag20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>9tgcctgctcttactgactgg20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>10ctgggaagtgggtgcagtta20<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>11cactgatacgcctgagtg18<210>12<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>12gtgagcgctgaatcgaaa18<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>13cccatccccaggagtcttg19<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>14ccatgactaggggcactgta20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>15tcacatctcatctccccaaa20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>16tctgctaacacattgagggg20<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>17actgccagaagaggcactcc20<210>18<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>18cgatcaccccgaagttca18<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>19agttgccttcttgggactga20<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>20cagaattgccattgcacaac20當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12