本申請(qǐng)要求提交于2014年6月10日的第62/010,237號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)益，該申請(qǐng)通過引用而全文并入于此。發(fā)明背景1.
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及在環(huán)境溫度下穩(wěn)定血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞。具體而言，本發(fā)明涉及用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑、組合物、制品、試劑盒及方法。2.
背景技術(shù)：
：全血是細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)和多種其它分析物的復(fù)雜混合物。具體來說，血液成分包括但不限于：細(xì)胞，諸如白細(xì)胞(單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及粒細(xì)胞)、紅細(xì)胞、凝血細(xì)胞及循環(huán)腫瘤細(xì)胞；核酸分子，諸如循環(huán)游離DNA(cfDNA)；多肽，諸如脂蛋白、白蛋白及血清蛋白；以及其它多種分析物。紅細(xì)胞或紅血球(RBC)是填充有將氧氣運(yùn)送至全身的血紅蛋白的柔性雙凹面細(xì)胞。RBC是最致密的全血成分，因此例如可通過離心，或甚至通過使其在重力作用下沉降而從全血中輕松分離?？蓪饧?packed)紅細(xì)胞輸送回供體患者(自體輸血)或輸送至具有相容的血型，例如具有合適的A、B、AB、O和rh抗原類型的患者中。白細(xì)胞或白血球(WBC)具有多種細(xì)胞類型，例如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及多形核嗜中性粒細(xì)胞(PMN)，其主要參與免疫應(yīng)答和對(duì)抗感染。通常WBC密度略微小于RBC，并在全血離心期間與血小板一起在RBC上方形成白色的“血沉棕黃層”。血沉棕黃層可以是生長(zhǎng)因子、母細(xì)胞及細(xì)胞因子的有用來源。已經(jīng)報(bào)道了用于在環(huán)境溫度下穩(wěn)定、運(yùn)輸及儲(chǔ)存血液樣品中的細(xì)胞的組合物和方法。目前采用的這些組合物通常不能維持血細(xì)胞的代謝活性，并且穩(wěn)定化的細(xì)胞未保持與在全血中所見的相似的大小和形態(tài)，從而使得利用根據(jù)預(yù)定細(xì)胞大小和形狀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選和計(jì)數(shù)的自動(dòng)化細(xì)胞分離器和計(jì)數(shù)器對(duì)這些細(xì)胞的后續(xù)分析變得復(fù)雜。因此，需要開發(fā)用于使來自血液的細(xì)胞在環(huán)境溫度下穩(wěn)定更長(zhǎng)時(shí)間的新制劑、組合物及方法，所述細(xì)胞保持具有與全血中的該細(xì)胞相似的大小和形態(tài)的完整的和代謝活性的狀態(tài)。通過在環(huán)境溫度下提供完整的、活的、代謝活性的全細(xì)胞至少18天的時(shí)間，本發(fā)明的制劑、組合物及方法有利地克服了上述限制。此外，在基本上儲(chǔ)存的細(xì)胞上表達(dá)的膜結(jié)合的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)保留其在血液樣品中的天然構(gòu)象，這有利于這些細(xì)胞的分析。這些穩(wěn)定的血細(xì)胞可以在不需要冷藏或冷凍的情況下運(yùn)輸及儲(chǔ)存，并且在環(huán)境溫度下穩(wěn)定延長(zhǎng)的時(shí)間段，例如，數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或甚至數(shù)年，從而有利于各種血液成分的定量、分析和/或用于診斷和潛在治療應(yīng)用的用途。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在一些實(shí)施方案中，本文描述了用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑，其中該細(xì)胞在室溫下儲(chǔ)存至少三天的時(shí)間后保持代謝活性。在一些實(shí)施方案中，至少80％的儲(chǔ)存的細(xì)胞在室溫下儲(chǔ)存至少三天的時(shí)間后保持代謝活性。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞保持代謝活性至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天或至少18天。在一些實(shí)施方案中，至少80％的細(xì)胞在室溫下保持代謝活性至少18天的時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，用于使血液樣品中的代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑包含：pH緩沖液；螯合劑；以及肽。在一些實(shí)施方案中，該pH緩沖液選自2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、3-嗎啉基-2-羥基丙磺酸(MOPSO)及其組合。在一些實(shí)施方案中，該肽為二肽或三肽。在一些實(shí)施方案中，該二肽序列為Ala-Gln或Gly-Gly。在一些實(shí)施方案中，該二肽序列為Ala-Gln。在一些實(shí)施方案中，該二肽序列為Gly-Gly。在一些實(shí)施方案中，該三肽序列為Gly-Gly-Gly。在一些實(shí)施方案中，該螯合劑為EDTA。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種代謝活性細(xì)胞選自白細(xì)胞、紅細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其組合。在一些實(shí)施方案中，該制劑包含：pH緩沖液；螯合劑；磷酸酶抑制劑；以及嘌呤。在一些實(shí)施方案中，該磷酸酶抑制劑為絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，該絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶抑制劑為2-甘油磷酸酯。在一些實(shí)施方案中，該嘌呤為腺嘌呤或鳥嘌呤。在一些實(shí)施方案中，該嘌呤為腺嘌呤。在一些實(shí)施方案中，該嘌呤為鳥嘌呤。在一些實(shí)施方案中，該制劑進(jìn)一步包含螯合劑，和選自陽(yáng)離子化合物、兩性離子化合物和肽的至少一種化合物。在一些實(shí)施方案中，該螯合劑為葡萄糖酸鈉。在一些實(shí)施方案中，該兩性離子化合物為式(I)化合物：其中R1、R2和R3獨(dú)立地選自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任選地形成環(huán)，Y為CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A為未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通常在20種天然存在的氨基酸之一種中發(fā)現(xiàn)的任何側(cè)鏈；并且Z為CO2-、SO3-或OPO3-。在一些實(shí)施方案中，該陽(yáng)離子化合物選自：(a)式(II)化合物：其中R1、R2和R3獨(dú)立地選自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任選地形成環(huán)，Y為CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A為未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通常在20種天然存在的氨基酸之一種中發(fā)現(xiàn)的任何側(cè)鏈；Z為CO2A；并且X為藥學(xué)上可接受的陰離子；(b)式(III)化合物：其中R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任選地形成環(huán)，Y為CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A為未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通常在20種天然存在的氨基酸之一種中發(fā)現(xiàn)的任何側(cè)鏈；并且X為藥學(xué)上可接受的陰離子；和(c)式(IV)化合物：其中R1和R2獨(dú)立地選自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基；并且X為藥學(xué)上可接受的陰離子。在一些實(shí)施方案中，式(I)、式(II)或式(III)化合物的R1和R2形成嗎啉基環(huán)、吡咯烷鎓環(huán)、哌啶鎓環(huán)或噁嗪鎓環(huán)。在一些實(shí)施方案中，該兩性離子化合物選自表1中列出的兩性離子化合物。在一些實(shí)施方案中，該陽(yáng)離子化合物選自表1中列出的陽(yáng)離子化合物。在一些實(shí)施方案中，該兩性離子化合物為季內(nèi)鹽(quaternaryinnersalt)。在一些實(shí)施方案中，該季鹽為N,N-二甲基-N-(2-羥乙基)-3-銨-丙酸鹽，或N-乙基-哌啶鎓-4-丁基磺酸鹽。在一些實(shí)施方案中，該兩性離子化合物或陽(yáng)離子化合物選自4-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-4-乙基嗎啉-4-鎓溴化物、N-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3-羥基-N,N-雙(2-羥乙基)丙烷-1-銨溴化物、2-乙氧基-N,N,N-三乙基-2-氧代乙銨溴化物、2-((3-羥基丙基)二甲基銨基)乙酸鹽、2-((2-羥丙基)二甲基銨基)乙酸鹽、2-(2-(羥甲基)-1-甲基哌啶鎓-1-基)乙酸鹽、2-((2-羥乙基)二甲基銨基)乙酸鹽、2-((2,3-二羥基丙基)二甲基銨基)乙酸鹽、1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-4-羥基-1-甲基哌啶鎓溴化物、2-(4-羥基-1-甲基哌啶鎓-1-基)乙酸鹽、2-乙氧基-N-(2-(2-羥基乙氧基)乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙銨溴化物、2-((2-(2-羥基乙氧基)乙基)二甲基銨基)乙酸鹽、2-(雙(2-羥乙基)-(甲基)銨基)乙酸鹽，和4-(2-羥乙基)-4-甲基-2-氧代嗎啉-4-鎓溴化物、2-(雙(2-羥乙基)-(甲基)銨基)乙酸鹽、2-(4-(2-羥乙基)嗎啉基-4-鎓)乙酸鹽、4-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-4-甲基嗎啉-4-鎓溴化物、1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-1-甲基吡咯烷鎓溴化物、2-(芐基(2-羥基-乙基)(甲基)銨基)乙酸鹽、3-(2,3-二羥基丙基)-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓氯化物、1,3-二甲基-1H-咪唑-3-鎓甲基硫酸鹽、N-芐基-2-乙氧基-N,N-二甲基-2-氧代乙銨溴化物、1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-1-甲基哌啶-鎓溴化物、N-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-N,N-二甲基苯銨溴化物、1-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3-羥基-1-甲基哌啶鎓溴化物、3-(2-(2-羥基乙氧基)乙基)-1-甲基-1H咪唑-3-鎓氯化物、3-(2-(2-(2-羥基乙氧基)乙氧基)乙基)-1-甲基-1H-咪唑-3-鎓氯化物、1-甲基-3-十四烷基-1H-咪唑-3-鎓溴化物、N-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-N,N-二甲基環(huán)-己銨溴化物，以及3-((2-羥基-乙基)二甲基-銨基)丙酸鹽。在一些實(shí)施方案中，該肽具有Ala-Gln、Gly-Gly或Gly-Gly-Gly的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，該肽具有Ala-Gln的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，該肽具有Gly-Gly的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，該肽具有Gly-Gly-Gly的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，該制劑進(jìn)一步包含乙酸鹽緩沖液、三氯蔗糖、葡萄糖、氯化鉀、肌醇、N-甲基葡糖胺、氯化鎂或其組合。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種代謝活性細(xì)胞選自白細(xì)胞、紅細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其組合。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種代謝活性細(xì)胞為白細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種代謝活性細(xì)胞為紅細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種代謝活性細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該制劑選自表2中列出的制劑。在某些實(shí)施方案中，該pH緩沖液選自2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)和3-嗎啉基-2-羥基丙磺酸(MOPSO)，該螯合劑為EDTA，并且該肽為二肽或三肽。在某些實(shí)施方案中，該磷酸酶抑制劑為2-甘油磷酸酯，并且該嘌呤為腺嘌呤或鳥嘌呤。在某些實(shí)施方案中，該磷酸酶抑制劑為2-甘油磷酸酯，并且該嘌呤為腺嘌呤。在一些實(shí)施方案中，本文描述了基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的一種或多種代謝活性白細(xì)胞的組合物，該組合物包含與用于一種或多種代謝活性細(xì)胞的基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑相混合的一種或多種代謝活性白細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，將所述一種或多種代謝活性白細(xì)胞純化并儲(chǔ)存在用于基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑中。在一些實(shí)施方案中，本文描述了基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的一種或多種代謝活性紅細(xì)胞的組合物，該組合物包含與用于一種或多種代謝活性細(xì)胞的基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑相混合的一種或多種代謝活性紅細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，將所述一種或多種代謝活性紅細(xì)胞純化并儲(chǔ)存在用于基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑中。在一些實(shí)施方案中，本文描述了基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的一種或多種代謝活性循環(huán)腫瘤細(xì)胞的組合物，該組合物包含與用于使一種或多種代謝活性細(xì)胞基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑相混合的一種或多種代謝活性循環(huán)腫瘤細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，將所述一種或多種代謝活性循環(huán)腫瘤細(xì)胞純化并儲(chǔ)存在用于基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑中。在一些實(shí)施方案中，本文描述了包含容納在采血管內(nèi)的本文所述制劑中的任意一種的制品。在一些實(shí)施方案中，該采血管為抽空的采血管。在一些實(shí)施方案中，本文描述了包含一種所述制品和包裝說明書的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，本文描述了用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的方法，該方法包括：將從受試者采集的血液樣品與如本文提供的、用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑相混合，其中所述一種或多種細(xì)胞在室溫下保持代謝活性至少三天的時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，至少80％的細(xì)胞在室溫下保持代謝活性至少三天的時(shí)間。在該方法的其他實(shí)施方案中，該細(xì)胞保持代謝活性至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天或至少18天。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞在室溫下保持代謝活性至少18天的時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞為白細(xì)胞、紅細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞或其組合。在一些實(shí)施方案中，該受試者為動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，該受試者為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，該受試者為人。在某些實(shí)施方案中，在從受試者采集血液時(shí)將該血液樣品與穩(wěn)定化制劑相混合，以使所述一種或多種代謝活性細(xì)胞基本穩(wěn)定。附圖說明圖1A和1B顯示了3供體研究的FACS散點(diǎn)圖，其證實(shí)本發(fā)明的制劑和組合物能夠使血液樣品中的CD45陽(yáng)性白細(xì)胞在環(huán)境溫度或4℃下在儲(chǔ)存6天后保持穩(wěn)定。圖1A通過示例性制劑與未受保護(hù)的樣品對(duì)比，示出了環(huán)境溫度下的穩(wěn)定化，而圖1B則通過示例性制劑與未受保護(hù)的樣品對(duì)比，示出了4℃下的穩(wěn)定化。圖2A和2B提供了柱狀圖，其證實(shí)與未受保護(hù)的樣品相比，本發(fā)明的制劑和組合物能夠使血液樣品中CD45陽(yáng)性的總白細(xì)胞和由粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞構(gòu)成的活白細(xì)胞群體在4℃下儲(chǔ)存6天后保持穩(wěn)定。圖3A和3B提供了柱狀圖，其證實(shí)與未受保護(hù)的樣品相比，本發(fā)明的制劑和組合物能夠使血液樣品中CD45陽(yáng)性的總白細(xì)胞和由粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞構(gòu)成的活白細(xì)胞群體在室溫下儲(chǔ)存6天后保持穩(wěn)定。圖4顯示了FACS散點(diǎn)圖，其證實(shí)與未受保護(hù)的樣品相比，本發(fā)明的制劑和組合物能夠使血液樣品中的單核細(xì)胞群體在4℃下儲(chǔ)存5天后保持穩(wěn)定。圖5顯示了柱狀圖，其證實(shí)與未受保護(hù)的樣品相比，本發(fā)明的制劑和組合物能夠使血液樣品中的CD4和CD8陽(yáng)性T細(xì)胞/淋巴細(xì)胞在室溫下儲(chǔ)存5天后保持穩(wěn)定。圖6顯示了FACS散點(diǎn)圖，其證實(shí)與未受保護(hù)的樣品相比，本發(fā)明的制劑和組合物能夠使血液樣品中的活CD66b陽(yáng)性粒細(xì)胞群體在室溫下儲(chǔ)存8小時(shí)后保持穩(wěn)定。具體實(shí)施方式根據(jù)本發(fā)明，提供了用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑、組合物、制品、試劑盒及方法。在一個(gè)方面，本文所述的制劑有利地維持與全血中所見的具有相似大小和形狀的、代謝活性的完整活血細(xì)胞(例如，白細(xì)胞、紅細(xì)胞和循環(huán)腫瘤細(xì)胞)的完整性。采用針對(duì)天然野生型膜蛋白質(zhì)、受體和細(xì)胞表面蛋白質(zhì)生成的抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析，可有利地分析這些活細(xì)胞，這在使用使這些細(xì)胞表面蛋白質(zhì)變性的其他儲(chǔ)存制劑時(shí)是不可行的。除非另有定義，否則本文中所采用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所普遍理解的相同的含義。本文提及的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物均通過引用全文并入本文。除非上下文中另有明確規(guī)定，否則如本說明書及隨附的權(quán)利要求書中所用的，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該/所述”包括其復(fù)數(shù)提法。因此，例如，提及“該/所述方法”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀此公開內(nèi)容等之后將會(huì)明白的一種或多種方法和/或本文描述的這種類型的步驟。如本文所使用的“約”在提及可測(cè)值如量、時(shí)距等時(shí)，意在包括指定值的±20％或±10％或±5％或甚至±1％的偏差，因?yàn)榇祟惼顚?duì)于所公開的組合物或?qū)嵤┧_的方法是合適的。用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下穩(wěn)定的制劑和組合物在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞，例如白細(xì)胞、紅細(xì)胞和/或循環(huán)腫瘤細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑。在某些實(shí)施方案中，該細(xì)胞在室溫下保持代謝活性至少三天的時(shí)間。在其他實(shí)施方案中，該細(xì)胞保持代謝活性至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天或至少18天。如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)境溫度”是指平常的室內(nèi)室溫。在一些實(shí)施方案中，環(huán)境溫度為15℃到32℃。在一些實(shí)施方案中，環(huán)境溫度為20℃到27℃。在某些其他實(shí)施方案中，用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑包含：pH緩沖液；螯合劑；以及肽。在一些實(shí)施方案中，該肽為二肽或三肽。在一些實(shí)施方案中，該二肽為丙氨酸-谷氨酰胺。在一些實(shí)施方案中，該二肽為甘氨酸-甘氨酸。在一些實(shí)施方案中，該三肽為甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸。其他制劑包含：pH緩沖液；磷酸酶抑制劑；以及嘌呤。在一些實(shí)施方案中，該嘌呤為腺嘌呤或鳥嘌呤。在一些實(shí)施方案中，這些制劑進(jìn)一步包含陽(yáng)離子化合物、兩性離子化合物或肽中的至少一種和螯合劑。在一些實(shí)施方案中，該制劑進(jìn)一步包含乙酸鹽緩沖液、三氯蔗糖、葡萄糖、氯化鉀、肌醇、N-甲基葡糖胺、氯化鎂或其組合。在另一方面，提供了包含血液樣品的組合物，該血液樣品與如本文提供的穩(wěn)定制劑相混合，以在全血制劑中產(chǎn)生基本穩(wěn)定的白細(xì)胞、紅細(xì)胞或循環(huán)腫瘤細(xì)胞。在其他方面，提供了一種包含與該穩(wěn)定制劑相混合的分離或純化的白細(xì)胞、紅細(xì)胞或循環(huán)腫瘤細(xì)胞的組合物。配制試劑A.pH緩沖液根據(jù)某些實(shí)施方案，本文描述的用于使血液樣品中的一種或多種細(xì)胞基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑和組合物包含一種或多種pH緩沖液。在一些實(shí)施方案中，該pH緩沖液是因其對(duì)抗溶液的pH變化的能力而為本領(lǐng)域所知的大量化合物中的任意化合物，所述溶液諸如在存在pH緩沖液的水溶液。用于包含在穩(wěn)定儲(chǔ)存組合物中的一種或多種具體pH緩沖液的選擇可基于本公開內(nèi)容以及根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)實(shí)踐來進(jìn)行，并且可受到多種因素的影響，包括希望維持的pH、待穩(wěn)定的樣品的性質(zhì)、將采用的溶劑條件、將采用的制劑的其它成分以及其它條件。例如，一般而言，pH緩沖液以在質(zhì)子解離常數(shù)(pKa)的約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0個(gè)pH單位以內(nèi)的pH使用，質(zhì)子解離常數(shù)為緩沖液的一個(gè)特征。pH緩沖液的非限制性實(shí)例包括檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、磺基水楊酸、磺基間苯二甲酸、草酸、硼酸鹽、CAPS(3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸)、CAPSO(3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸)、EPPS(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、HEPES(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、MES(2-(N-嗎啉基)乙磺酸)、MOPS(3-(N-嗎啉基)丙磺酸)、MOPSO(3-嗎啉基-2-羥基丙磺酸)、PIPES(1,4-哌嗪二乙磺酸)、TAPS(N-[三(羥甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸)、TAPSO(2-羥基-3-[三(羥甲基)甲基氨基]-1-丙磺酸)、TES(N-[三(羥甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、bicine(N,N-二(2-羥乙基)甘氨酸)、tricine(N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸)、tris(三(羥甲基)氨基甲烷)以及bis-tris(2-[二(2-羥乙基)氨基]-2-(羥甲基)-1,3-丙二醇)。本文所涵蓋的某些實(shí)施方案，包括表2中列出的大量實(shí)施方案，表征了具有約4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0的pH的制劑。B.陽(yáng)離子化合物和兩性離子化合物在一些實(shí)施方案中，所述制劑包含陽(yáng)離子化合物、兩性離子化合物或其組合。在某些實(shí)施方案中，該兩性離子化合物為季內(nèi)鹽。在某些實(shí)施方案中，用于使血液樣品中的一種或多種細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑，包括表2中所列出的那些制劑中，該季內(nèi)鹽為N,N-二甲基-N-(2-羥乙基)-3-銨-丙酸鹽或N-乙基-哌啶鎓-4-丁基磺酸鹽。在一些實(shí)施方案中，該季鹽為N,N-二甲基-N-(2-羥乙基)-3-銨-丙酸鹽或N-乙基-哌啶鎓-4-丁基磺酸鹽，并且以約1.0–100mg/mL，或1.0–50mg/mL，或約10.0–50mg/ml的濃度存在。在一些實(shí)施方案中，該季內(nèi)鹽為WO2012/018638中公開的那些鹽中的一種或多種。在一些實(shí)施方案中，所述兩性離子化合物為式(I)化合物：其中R1、R2和R3獨(dú)立地選自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任選地形成環(huán)，Y為CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A為未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通常在20種天然存在的氨基酸之一種中發(fā)現(xiàn)的任何側(cè)鏈；并且Z為CO2-、SO3-或OPO3-。在一些實(shí)施方案中，R1和R2形成嗎啉基環(huán)、吡咯烷鎓環(huán)、哌啶鎓環(huán)或噁嗪鎓環(huán)。在一些實(shí)施方案中，所述陽(yáng)離子化合物選自：(a)式(II)化合物：其中R1、R2和R3獨(dú)立地選自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任選地形成環(huán)，Y為CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A為未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通?？稍?0種天然存在的氨基酸之一種中發(fā)現(xiàn)的任何側(cè)鏈；Z為CO2A；并且X為藥學(xué)上可接受的陰離子；(b)式(III)化合物：其中R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基，或者R1和R2任選地形成環(huán)，Y為CH2、CH(A)、CH(A)-CH(A)、CH(A)-CH(A)-CH(A)，其中A為未取代或取代的烷基、芳基、芳基烷基，或通?？稍?0種天然存在的氨基酸之一種中發(fā)現(xiàn)的任何側(cè)鏈；并且X為藥學(xué)上可接受的陰離子；和(c)式(IV)化合物：其中R1和R2獨(dú)立地選自未取代或取代的烷基、未取代或取代的芳基、未取代或取代的芳基烷基；并且X為藥學(xué)上可接受的陰離子。在一些實(shí)施方案中，式(II)或式(III)化合物中的R1和R2形成嗎啉基環(huán)、吡咯烷鎓環(huán)、哌啶鎓環(huán)或噁嗪鎓環(huán)?！巴榛被鶊F(tuán)是指脂肪族烴基團(tuán)。該烷基部分包括“飽和烷基”基團(tuán)，這意味著其不含任何烯烴或炔烴部分。該烷基部分也包括“不飽和烷基”部分，這意味著其含有至少一個(gè)烯烴或炔烴部分。“烯烴”部分是指具有至少一個(gè)碳碳雙鍵的基團(tuán)，而“炔烴”部分是指具有至少一個(gè)碳碳三鍵的基團(tuán)。無論是飽和的還是不飽和的，該烷基部分均包括支鏈、直鏈或環(huán)狀部分。根據(jù)結(jié)構(gòu)，烷基基團(tuán)包括單價(jià)基團(tuán)或雙價(jià)基團(tuán)(即亞烷基)，并且如果是“低級(jí)烷基”則具有1到6個(gè)碳原子。如本文所使用的，C1-Cx包括C1-C2、C1-C3、……C1-Cx。該“烷基”部分任選地具有1到10個(gè)碳原子(本文中無論何時(shí)出現(xiàn)，諸如“1到10”的數(shù)值范圍均指給定范圍內(nèi)的每個(gè)整數(shù)；例如，“1到10個(gè)碳原子”意味著該烷基基團(tuán)選自具有1個(gè)碳原子、2個(gè)碳原子、3個(gè)碳原子等直至且包含10個(gè)碳原子的部分，盡管本定義也涵蓋未指定數(shù)值范圍的術(shù)語(yǔ)“烷基”的出現(xiàn))。本文描述的化合物的烷基基團(tuán)可被指定為“C1-C4烷基”或類似的指定。僅舉例而言，“C1-C4烷基”表示在烷基鏈中具有一個(gè)到四個(gè)碳原子，即，該烷基鏈選自甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基。因此，C1-C4烷基包括C1-C2烷基和C1-C3烷基。烷基基團(tuán)為任選取代的或未取代的。典型的烷基基團(tuán)包括但絕不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“環(huán)”是指任何共價(jià)閉合的結(jié)構(gòu)。環(huán)包括，例如，碳環(huán)(例如芳基和環(huán)烷基)、雜環(huán)(例如雜芳基和非芳族雜環(huán))、芳族(例如芳基和雜芳基)和非芳族(例如環(huán)烷基和非芳族雜環(huán))。環(huán)可以是任選取代的。環(huán)可以是單環(huán)的或多環(huán)的。單獨(dú)使用的或作為如“芳基烷基”、“芳基烷氧基”或“芳氧基烷基”中的較大部分的一部分使用的術(shù)語(yǔ)“芳基”是指單環(huán)的、雙環(huán)的或三環(huán)的碳環(huán)體系，其包括稠環(huán)，其中該體系中的至少一個(gè)環(huán)是芳族的。術(shù)語(yǔ)“芳基”可與術(shù)語(yǔ)“芳環(huán)”互換使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，芳基包括具有6-12個(gè)碳原子的基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，芳基包括具有6-10個(gè)碳原子的基團(tuán)。芳基基團(tuán)的實(shí)例包括苯基、萘基、蒽基、菲基、并四苯基、1,2,3,4-四氫化萘基、1H-茚基、2,3-二氫-1H-茚基等。一種具體的芳基為苯基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，芳基包括茚滿基、萘基、四氫化萘基等，其中該基團(tuán)或連接點(diǎn)在芳環(huán)上。術(shù)語(yǔ)“任選取代的”或“取代的”意指所提及的基團(tuán)可被一個(gè)或多個(gè)另外的基團(tuán)所取代，該另外的基團(tuán)單獨(dú)地且獨(dú)立地選自烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜脂環(huán)、羥基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、烷基亞砜、芳基亞砜、烷基砜、芳基砜、氰基、鹵代、?；?、硝基、鹵代烷基、氟烷基、氨基(包括單取代和雙取代的氨基基團(tuán))及其受保護(hù)的衍生物。舉例而言，可選的取代基可以是LsRs，其中每個(gè)Ls獨(dú)立地選自鍵、-O-、-C(＝O)-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、S(＝O)2NH-、-NHS(＝O)2、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-(取代或未取代的C1-C6烷基)或-(取代或未取代的C2-C6烯基)；并且每個(gè)Rs獨(dú)立地選自H、(取代或未取代的C1-C4烷基)、(取代或未取代的C3-C6環(huán)烷基)、雜芳基或雜烷基。在本文描述的制劑的實(shí)施方案中，包括表2中列出的那些制劑的實(shí)施方案中，所述陽(yáng)離子化合物選自表1的示例性陽(yáng)離子化合物中的一種。在本文描述的制劑的實(shí)施方案中，包括表2中列出的那些制劑的實(shí)施方案中，所述兩性離子化合物選自表1的示例性兩性離子化合物中的一種。表1.用于使血液樣品中的細(xì)胞在環(huán)境溫度下穩(wěn)定的示例性陽(yáng)離子化合物及兩性離子化合物C.肽在某些實(shí)施方案中，本文所述的用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑含有肽。有利地，已確定，在pH緩沖液的存在下，包含穩(wěn)定量例如50mM或200mM的小二肽或三肽的制劑(包括表2中列出的那些)出乎意料地能夠使血液樣品中的代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定，并且穩(wěn)定時(shí)間超過這些細(xì)胞冷藏的時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，該二肽具有氨基酸序列aa-aa，其中aa是20種天然氨基酸或任何非天然氨基酸中的任意氨基酸。在一些實(shí)施方案中，該二肽為丙氨酸-谷氨酰胺。在一些實(shí)施方案中，該二肽為甘氨酸-甘氨酸。在一些實(shí)施方案中，該三肽具有氨基酸序列aa-aa-aa，其中aa是20種天然氨基酸或任何非天然氨基酸中的任意氨基酸。在一些實(shí)施方案中，該三肽為甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸。D.磷酸酶抑制劑在某些實(shí)施方案中，本文所述的用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑可含有磷酸酶抑制劑。在某些實(shí)施方案中，該磷酸酶抑制劑是絲氨酸-蘇氨酸類磷酸酶的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，該磷酸酶抑制劑為2-甘油磷酸酯。在一些實(shí)施方案中，該磷酸酶抑制劑以約1.0–100mM，或約25–75mM，或約50mM的濃度存在。在一些實(shí)施方案中，該磷酸酶抑制劑為2-甘油磷酸酯，并且以約1.0–100mM，或約25–75mM，或約50mM的濃度存在。E.螯合劑根據(jù)某些實(shí)施方案，在用于使血液樣品中的完整活細(xì)胞基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的本文所述組合物中包含螯合劑或螯合物。此類螯合劑因其與金屬陽(yáng)離子絡(luò)合并阻礙該金屬陽(yáng)離子反應(yīng)性的能力而為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。示例性的螯合劑包括二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、反式-1,2-二氨基環(huán)己烷-N,N,N',N'-四乙酸(CDTA)、1,2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、N-(2-羥乙基)亞乙基二胺-N,N',N'-三乙酸、葡萄糖酸鈉和次氮基三乙酸(NTA)。在一些實(shí)施方案中，該螯合劑為葡萄糖酸鈉，并且以約1.0–50mM，或約10–40mM，或約25mM的濃度存在。F.嘌呤在一些實(shí)施方案中，在用于使血液樣品中的完整活細(xì)胞基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的本文所述組合物中包含嘌呤。在一些實(shí)施方案中，該嘌呤為腺嘌呤、鳥嘌呤或二者。在一些實(shí)施方案中，該嘌呤為腺嘌呤。在一些實(shí)施方案中，該嘌呤為鳥嘌呤。用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下穩(wěn)定的示例性制劑在某些實(shí)施方案中，提供了用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑。在某些實(shí)施方案中，用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑包含：pH緩沖液；螯合劑；以及肽。在某些實(shí)施方案中，用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑包含：pH緩沖液；螯合劑；以及二肽或三肽。在某些實(shí)施方案中，用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑包含：pH緩沖液；螯合劑；以及丙氨酸-谷氨酰胺二肽、甘氨酸-甘氨酸二肽或甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸三肽。在某些實(shí)施方案中，用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑包含：pH緩沖液；磷酸酶抑制劑；以及嘌呤。在某些實(shí)施方案中，該磷酸酶抑制劑為絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶抑制劑，該嘌呤為腺嘌呤或鳥嘌呤。在某些實(shí)施方案中，該磷酸酶抑制劑為2-甘油磷酸酯，并且該嘌呤為腺嘌呤。在其他實(shí)施方案中，該制劑進(jìn)一步包含：螯合劑；以及陽(yáng)離子化合物、兩性離子化合物或肽中的至少一種。在其他實(shí)施方案中，該制劑進(jìn)一步包含：葡萄糖酸鈉；以及陽(yáng)離子化合物、兩性離子化合物或肽中的至少一種。在一些實(shí)施方案中，該制劑進(jìn)一步包含乙酸鹽緩沖液、三氯蔗糖、葡萄糖、氯化鉀、肌醇、N-甲基葡糖胺、氯化鎂或其組合。在一些實(shí)施方案中，該兩性離子化合物為季內(nèi)鹽，并且該肽為分別具有Ala-Gln、Gly-Gly或Gly-Gly-Gly氨基酸序列的二肽或三肽。用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的示例性制劑在表2中示出。表2用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下穩(wěn)定的示例性制劑用于使白細(xì)胞、紅細(xì)胞及循環(huán)腫瘤細(xì)胞在環(huán)境溫度下穩(wěn)定的制劑的制備方法用于制備本文所述的用于使血液樣品中的代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑的方法采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)并且一般采用可商購(gòu)的試劑。在一些實(shí)施方案中，將該制劑制備為配制試劑的濃縮原液，例如，2X、5X、10X、20X等的濃縮原液，以便以適當(dāng)?shù)谋壤c血液樣品相混合從而形成所需濃度。表1中公開的陽(yáng)離子化合物和兩性離子化合物可如先前描述的那樣合成及配制，例如，參見WO20120186638。純化的細(xì)胞在一些實(shí)施方案中，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員慣用的公知常規(guī)方法從血液樣品中純化基本穩(wěn)定的一種或多種代謝活性細(xì)胞。用于從血液中純化血細(xì)胞的設(shè)備、試劑盒及方法是公知的。例如，已經(jīng)應(yīng)用多種原理將紅細(xì)胞與各種白細(xì)胞群體分離。傳統(tǒng)上，曾采用梯度分離。梯度分離基于如下原理而起作用：紅細(xì)胞小而致密，并且可以在離心時(shí)形成團(tuán)狀物(pellet)，該團(tuán)狀物通常在諸如Ficoll的物質(zhì)“墊”下方。梯度方法雖然有效，但通常較慢、難以自動(dòng)化、不可再現(xiàn)、收率低，并產(chǎn)生具有較差活力的細(xì)胞。而且，最終產(chǎn)物常含有剩余的紅細(xì)胞污染物，該污染物需要另外的處理步驟(例如，紅細(xì)胞裂解)來去除未充分分離的細(xì)胞。用于分離血液以供功能分析和臨床診斷學(xué)的另一種常用方法為直接RBC裂解。該方法的原理是，RBC對(duì)介質(zhì)的摩爾滲透壓濃度(osmolarity)的變化比WBC更加敏感，使得介質(zhì)或緩沖液的摩爾滲透壓濃度的短暫且快速的變化將裂解比WBC更多的RBC。裂解方法的確有效，但與梯度方法一樣，分離的重現(xiàn)性和剩余WBC細(xì)胞的活力和數(shù)目通常較差并且無法代表整個(gè)群體。這些裂解方法還可伴隨有對(duì)WBC的損傷。最近開發(fā)的一種用于分離血液細(xì)胞亞群的技術(shù)采用磁性顆粒分離血細(xì)胞?；蛘?，采用針對(duì)天然野生型膜蛋白質(zhì)和受體生成的抗體，通過親和色譜法、流式細(xì)胞術(shù)或通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析來純化基本穩(wěn)定的、代謝活性的完整活細(xì)胞，這在使用使這些細(xì)胞蛋白質(zhì)變性的儲(chǔ)存制劑時(shí)是不可行的?？墒褂冕槍?duì)在細(xì)胞表面上表達(dá)的特定腫瘤抗原的、用于捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞群體的抗體分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞，或者可根據(jù)待進(jìn)行的分析及循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)模式，使用特異性抗體針對(duì)特定亞群進(jìn)行選擇?？乖磉_(dá)模式和抗體選擇的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。隨后可將純化的一種或多種代謝活性細(xì)胞在分析之前儲(chǔ)存在本文所述的制劑中延長(zhǎng)的時(shí)間。制品在某些實(shí)施方案中，提供了制品，其中本文描述的制劑(包括表2中列出的那些制劑)中的一種容納在合適的采血管、采血容器或采血器皿中。這些制品可通過在采血時(shí)穩(wěn)定一種或多種細(xì)胞來用于使一種或多種代謝活性細(xì)胞基本穩(wěn)定儲(chǔ)存。在某些實(shí)施方案中，該采血管為具有低于大氣壓的氣壓以抽出預(yù)定體積的全血的抽空采血管。在一些實(shí)施方案中，這些制品在本文描述的試劑盒及方法中使用。試劑盒在一些實(shí)施方案中，本文描述了試劑盒，該試劑盒包含任意一種含有本發(fā)明制劑(包括表2中列出的那些制劑)的制品以及包裝說明書。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒的組件裝在容器中，諸如帶隔室的塑料包圍體中。在一些實(shí)施方案中，該容器具有可嚴(yán)密密封的蓋子，使得該試劑盒的內(nèi)容物可消毒并密封儲(chǔ)存以備后續(xù)使用。用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的方法在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的方法。在某些實(shí)施方案中，該方法包括將血液樣品與本文所述的用于使血液樣品中的代謝活性細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑相混合，其中該細(xì)胞或至少80％的該細(xì)胞在室溫下保持代謝活性至少三天的時(shí)間。在其他實(shí)施方案中，該細(xì)胞保持代謝活性至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天或至少18天。在某些實(shí)施方案中，用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞，例如白細(xì)胞、紅細(xì)胞和/或循環(huán)腫瘤細(xì)胞在環(huán)境溫度下基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑包含：pH緩沖液；螯合劑；以及肽。在一些實(shí)施方案中，該肽為二肽或三肽。在一些實(shí)施方案中，該肽為丙氨酸-谷氨酰胺二肽、甘氨酸-甘氨酸二肽或甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸三肽。在某些其他實(shí)施方案中，用于使血液樣品中的一種或多種代謝活性細(xì)胞基本穩(wěn)定儲(chǔ)存的制劑包含：pH緩沖液；磷酸酶抑制劑；以及嘌呤。在一些實(shí)施方案中，該嘌呤為腺嘌呤或鳥嘌呤。在一些實(shí)施方案中，該制劑進(jìn)一步包含陽(yáng)離子化合物、兩性離子化合物或肽中的至少一種和螯合劑，并且還可進(jìn)一步包含乙酸鹽緩沖液、三氯蔗糖、葡萄糖、氯化鉀、肌醇、N-甲基葡糖胺、氯化鎂或其組合。在一些實(shí)施方案中，該制劑進(jìn)一步包含陽(yáng)離子化合物、兩性離子化合物或肽中的至少一種和螯合劑，并且還進(jìn)一步包含乙酸鹽緩沖液、三氯蔗糖、葡萄糖、氯化鉀、肌醇、N-甲基葡糖胺、氯化鎂或其組合。在某些實(shí)施方案中，該制劑是表2中列出的制劑中的一種。采血管、采血袋、采血容器和采血器皿是本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的，并且已經(jīng)被執(zhí)業(yè)醫(yī)師使用了數(shù)十年。為了使一種或多種代謝活性細(xì)胞基本穩(wěn)定儲(chǔ)存而采集的血液可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常采用的任何方法或設(shè)備如靜脈穿刺或手指針刺來獲取。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)通過靜脈穿刺采集血液時(shí)，在從受試者獲取血液樣品時(shí)，將該制劑置于采血管內(nèi)部，例如抽空的管(VACUTAINER采血管、BectonDickenson或VACUETTE采血管，GreinerBio-One)內(nèi)部。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)通過靜脈穿刺采集血液時(shí)，在抽取后立即或不久，將該制劑添加至已獲得的全血樣品中。如本文描述的方法可采用本文披露的制品及試劑盒。以說明而非限制的方式給出以下實(shí)施例。實(shí)施例1在環(huán)境溫度下穩(wěn)定人血液樣品中完整的代謝活性白細(xì)胞和紅細(xì)胞至少18天本實(shí)施例描述了用于使血液樣品中的白細(xì)胞和/或紅細(xì)胞在環(huán)境溫度下穩(wěn)定至少18天的本發(fā)明制劑和組合物。從知情同意的供體采集人全血加至來自GreinerBio-One(目錄號(hào)455045)的K2-EDTA管中。將1.5mL的每種制劑置于來自GreinerBio-One的3mL空Vacuette管中。將血液合并到單個(gè)容器中，混合并分配至每個(gè)管，其中在每10等份的血液分配至管后進(jìn)行混合。將管蓋好并通過顛倒混合10-12次。將管儲(chǔ)存在75°F(23.9℃)的實(shí)驗(yàn)室中的環(huán)境溫度下。為每種制劑準(zhǔn)備一式兩份的管，并另外分別為室溫對(duì)照和4℃對(duì)照二者準(zhǔn)備兩個(gè)管。用各3mL的血液制備對(duì)照，以便干凈地從樣品等份獲得血漿。4天后，通過冷凍并融化血液兩次，然后將血液1:1稀釋以對(duì)應(yīng)于穩(wěn)定劑向每個(gè)樣品中的添加，以此來裂解未處理的血液。然后對(duì)血液進(jìn)行10倍系列稀釋，以得到10％溶血對(duì)照，然后另外稀釋5倍以得到2％溶血對(duì)照。將2％溶血對(duì)照連續(xù)地1:1稀釋，以得到1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125和0.015625的另外稀釋液。將200微升等份的稀釋液轉(zhuǎn)移至96孔UV-star微量滴定板(GreinerBio-One)，并利用BiotekSynergy2儀器根據(jù)制造商的使用說明取得415nm處的測(cè)量值。將溶血百分比值相對(duì)于415nm處的OD作圖，并用來通過這些點(diǎn)計(jì)算回歸線。通過利用excel獲得定義經(jīng)計(jì)算的回歸線的等式，并使用該線計(jì)算在4、10和18天時(shí)測(cè)試的、來自表2的經(jīng)分析的制劑子集的溶血百分比。表3.確定對(duì)照樣品的溶血百分比的回歸線％溶血#1#2平均值％溶血16.1776.3246.250510.53.1183.2343.1760.50.251.6371.6321.63450.250.1250.8160.8290.82250.1250.06250.4040.4150.40950.06250.031250.2090.2110.210.031250.0156250.110.1190.11450.015625從這些數(shù)據(jù)計(jì)算所得的回歸線，其為y＝0.1603x–0.0055，并且R2值等于0.9999。在每個(gè)條件和時(shí)間點(diǎn)下的樣品制備包括將1mL等份從每個(gè)管中取出并轉(zhuǎn)移至1.5mLEppendorf微量離心管。將管在Eppendorf5417離心機(jī)中以3000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘，并從每個(gè)管中轉(zhuǎn)移250微升等份的血漿層，并在第4天的時(shí)間點(diǎn)以1:1稀釋。對(duì)于包括對(duì)照在內(nèi)的一些制劑，稍后的時(shí)間點(diǎn)需要更大的稀釋度，從而使得讀數(shù)不會(huì)超出標(biāo)度。通過水空白校準(zhǔn)所有測(cè)量，并經(jīng)由用于控制Biotek酶標(biāo)儀的Gen5軟件根據(jù)制造商的使用說明進(jìn)行路徑長(zhǎng)度校準(zhǔn)。將兩個(gè)重復(fù)讀取的溶血百分比取平均。表4列出了對(duì)于所測(cè)試的每個(gè)制劑(來自表2的制劑編號(hào)1-24)，每個(gè)重復(fù)樣品(即，“#1”和“#2”)的值、平均值以及在第4天、第10天和第18天觀察到的溶血百分比。表4.采用表2的示例性制劑穩(wěn)定在環(huán)境溫度下儲(chǔ)存4、10或18天的血液樣品中的細(xì)胞如表4所示，針對(duì)白細(xì)胞和紅細(xì)胞的穩(wěn)定進(jìn)行測(cè)試的示例性制劑的子集同樣阻止了紅細(xì)胞溶血，或在至少18天的相同時(shí)間段內(nèi)優(yōu)于4℃下未經(jīng)保護(hù)而儲(chǔ)存的樣品。實(shí)施例2在環(huán)境溫度下穩(wěn)定在人血液樣品中的白細(xì)胞上表達(dá)的天然細(xì)胞表面蛋白質(zhì)至少六天本實(shí)施例證實(shí)，如通過使用針對(duì)在多種白細(xì)胞的表面上表達(dá)的示例性天然蛋白質(zhì)標(biāo)志物CD45、CD4、CD8和CD66b的抗體的FACS分析所證明的，本發(fā)明的制劑和組合物使血液樣品中的白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及粒細(xì)胞在環(huán)境溫度下穩(wěn)定多達(dá)6天的時(shí)間。A.CD45陽(yáng)性白細(xì)胞使用白細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD45評(píng)價(jià)包含本發(fā)明制劑的全血組合物中白細(xì)胞群體的相對(duì)穩(wěn)定性。以采集在K2-EDTAVACUETTE管中的人全血與表2的制劑33、74、75、76或77的1X原液為1:1的比例，將全血與這些制劑混合。將對(duì)照樣品儲(chǔ)存在室溫(RT)和4℃下。在RT儲(chǔ)存后的第0天、第3天和第6天從儲(chǔ)存中取出實(shí)驗(yàn)和對(duì)照樣品，并根據(jù)制造商的使用說明利用CD45FITC-綴合的抗體對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。通過用BDFACS裂解溶液(目錄號(hào)216667-08-2)或通用的非固定裂解緩沖液將血液樣品處理10分鐘而去除紅細(xì)胞，之后使用1X磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌2次。將剩余的細(xì)胞(主要是白細(xì)胞)懸浮在1XPBS中，并在BDACCURI流式細(xì)胞儀上以100,000個(gè)事件/樣品以及中等流速設(shè)置進(jìn)行分析。按照制造商的使用說明，添加COUNTBRIGHT計(jì)數(shù)珠(LifeTechnologies，目錄號(hào)C36950)以獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)。按照制造商的使用說明添加BDVIA-PROBE(目錄號(hào)555816)以評(píng)估活力。獲得并分析數(shù)據(jù)，以評(píng)價(jià)相對(duì)于CD45-FITC/FL-1熒光的側(cè)向散射。圖1A示出了在室溫儲(chǔ)存后的第0天和第6天，來自對(duì)照樣品的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)。在對(duì)照樣品中，粒細(xì)胞群體分離成兩個(gè)有區(qū)別的群體，一個(gè)具有較高的CD45熒光，一個(gè)具有較低的CD45熒光。在未受保護(hù)的對(duì)照中，粒細(xì)胞群體的粒度(granularity)改變，這通過SSC的降低而得到證實(shí)。在采集后的第6天，制劑74和76中幾乎無粒度變化，并且不存在粒細(xì)胞群體的分離。制劑74和76中的粒細(xì)胞群體在第0天與第6天之間僅需要輕微的門(gate)調(diào)整，而未受保護(hù)的對(duì)照需要較大的門控(gating)變化。另外，在第6天，未受保護(hù)的樣品中不存在門控的確定的單核細(xì)胞群體，而這些群體在第0天以及制劑74和76中在第6天是是歧異的。圖1B示出了在4℃儲(chǔ)存后的第0天和第6天，來自對(duì)照樣品的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)。與室溫研究類似，到第6天，未受保護(hù)樣品中的單核細(xì)胞群體發(fā)生位移，使得門控不可靠。制劑74和75使單核細(xì)胞群體維持，具有較小的門控位移。與第0天的值相比，在4℃下的第6天，制劑33、74、75和77導(dǎo)致了粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的高回收率(>60％)(圖2A)。這些粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中有很多(30-87％)在第6天是存活的(圖2B)。與第0天的值相比，在室溫下的第6天，制劑33、74、75和77導(dǎo)致了粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的高回收率(45->100％)(圖3A)。這些粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中有很多(>20％)在第6天是存活的(圖3B)。B.CD45陽(yáng)性單核細(xì)胞將采集在K2-EDTA管中的人全血與等體積(1mL)的1X濃度的表2的制劑76相混合。在分析前，將樣品在室溫下儲(chǔ)存0或6天。將未處理的對(duì)照樣品儲(chǔ)存在4℃下并與測(cè)試樣品平行處理。按照制造商的使用說明添加抗CD45-FITC抗體。用BDFACS裂解溶液(目錄號(hào)216667-08-2)裂解紅細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，并重懸浮在200μL的1XPBS中。將剩余的細(xì)胞(主要是白細(xì)胞)懸浮在PBS中并在BDACCURI流式細(xì)胞儀上以100,000個(gè)事件/樣品進(jìn)行分析，獲取了所有數(shù)據(jù)并將分析限制于相對(duì)于CD45-FITC/FL-1熒光的側(cè)向散射。如圖4所示，制劑76能夠在4℃下穩(wěn)定單核細(xì)胞，而在未受保護(hù)的對(duì)照中單核細(xì)胞群體未能被準(zhǔn)確門控。C.CD4和CD8陽(yáng)性T細(xì)胞/淋巴細(xì)胞將采集在K2-EDTA管中的人全血與1X濃度的表2的制劑33和制劑77相混合。在分析前，將樣品在室溫下儲(chǔ)存0或5天。將未處理的對(duì)照樣品儲(chǔ)存在4℃下并與測(cè)試樣品平行處理。按照制造商的推薦添加抗CD4-FITC抗體和抗CD8-APC抗體。用BDFACS裂解溶液(目錄號(hào)216667-08-2)裂解紅細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，并重懸浮在200μL的1XPBS中。將剩余的細(xì)胞懸浮在1XPBS中，并在BDACCURI流式細(xì)胞儀上以100,000個(gè)事件/樣品進(jìn)行分析。將分析限制于相對(duì)于CD45-FITC/FL-1熒光的側(cè)向散射。如圖5所示，在4℃下到第5天時(shí)，CD4和CD8陽(yáng)性淋巴細(xì)胞的數(shù)目減少至第0天的值的約20％(未受保護(hù)樣品)。在制劑33和制劑77中，在第5天時(shí)存在超過兩倍的CD4和CD8陽(yáng)性淋巴細(xì)胞。D.CD66b陽(yáng)性粒細(xì)胞將采集在K2-EDTA管中的人全血與1X濃度的表2的制劑33或制劑77相混合。在分析前，將樣品在室溫下儲(chǔ)存6小時(shí)。將未處理的對(duì)照樣品儲(chǔ)存在4℃下并與測(cè)試樣品平行處理。按照制造商的推薦添加抗CD66b-FITC抗體和BDVIAPROBE，以分別標(biāo)記粒細(xì)胞并評(píng)估細(xì)胞活力。用BDFACS裂解溶液(目錄號(hào)216667-08-2)裂解紅細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，并重懸浮在200μL的1XPBS中。將剩余的細(xì)胞懸浮在1XPBS中，并在BDACCURI流式細(xì)胞儀上以100,000個(gè)事件/樣品進(jìn)行分析。將分析限制于CD66b-FITC/FL-1熒光上的門控，然后評(píng)價(jià)相對(duì)于活力的FSC(FL3熒光)。如圖6所示，與未受保護(hù)的對(duì)照相比，制劑33能夠使血液樣品中的完整粒細(xì)胞在環(huán)境溫度下穩(wěn)定8小時(shí)的時(shí)間。在該實(shí)驗(yàn)中，未受保護(hù)的樣品中70％的粒細(xì)胞在8小時(shí)后是存活的，而用制劑33穩(wěn)定的粒細(xì)胞在8小時(shí)后有98.8％是存活的。這些結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明制劑和組合物使活的、完整的CD66b陽(yáng)性粒細(xì)胞得以穩(wěn)定的能力。除非上下文另有要求，否則在本說明書和權(quán)利要求書通篇中，詞語(yǔ)“包含”及其變化形式(其可與“包括”、“含有”或“特征在于”互換使用)是包含性或開放式語(yǔ)言，并且不排除另外的、未列舉的要素或方法步驟。短語(yǔ)“由……組成”排除權(quán)利要求中未指明的任何要素、步驟或成分。短語(yǔ)“基本由……組成”將權(quán)利要求的范圍限制于指明的物質(zhì)或步驟以及那些實(shí)質(zhì)上不影響所請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明的基本特性及新特性的物質(zhì)或步驟。本公開內(nèi)容涵蓋對(duì)應(yīng)于這些短語(yǔ)中每一個(gè)的范圍的本發(fā)明組合物及方法的實(shí)施方案。因此，包含所列舉的要素或步驟的組合物或方法涵蓋其中組合物或方法基本由這些要素或步驟組成或者由這些要素或步驟組成的具體實(shí)施方案。本說明書通篇提及的“一個(gè)實(shí)施方案”或“實(shí)施方案”或“方面”意指與該實(shí)施方案相關(guān)聯(lián)地描述的具體特征、結(jié)構(gòu)或特性包含在本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案中。因此，短語(yǔ)“在一個(gè)實(shí)施方案中”或“在實(shí)施方案中”在本說明書全文各處的出現(xiàn)并不一定都指的是同一個(gè)實(shí)施方案。此外，這些具體特征、結(jié)構(gòu)或特性可以在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中以任何合適的方式組合。以上描述的各種實(shí)施方案可進(jìn)行組合以提供進(jìn)一步的實(shí)施方案?？筛鶕?jù)以上詳述的說明對(duì)實(shí)施方案作出這些和其它改變?？傊谒降臋?quán)利要求中，所采用的術(shù)語(yǔ)不應(yīng)解釋為將權(quán)利要求限制于說明書和權(quán)利要求書中公開的具體實(shí)施方案，而應(yīng)解釋為包括這些權(quán)利要求所請(qǐng)求保護(hù)的所有可能的實(shí)施方案以及等同方案的全部范圍。因此，權(quán)利要求不受公開內(nèi)容的限制。從前述內(nèi)容應(yīng)當(dāng)理解，雖然本文出于說明的目的已描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可作出多種修改。因此，本發(fā)明除了隨附的權(quán)利要求外不受限制。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3