本非臨時(shí)性申請(qǐng)依35U.S.C.§119(a)要求2014年9月11日遞交的第62/049,030號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其通過引用被全部并入本申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明有關(guān)于一種醫(yī)藥組合物，且特別有關(guān)于可有效地改善以及治療神經(jīng)退行性疾病，并增加活化細(xì)胞分化為類神經(jīng)元細(xì)胞的比例的醫(yī)藥組合物。

背景技術(shù)：

由于經(jīng)濟(jì)發(fā)展與醫(yī)療衛(wèi)生的進(jìn)步，人類的平均壽命逐年攀升，人口結(jié)構(gòu)的老化已是全球趨勢(shì)。根據(jù)聯(lián)合國(guó)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2012年全球人口達(dá)70.8億，65歲以上人口占全球的7.9％，已是世界衛(wèi)生組織(WHO)所定義的老齡化社會(huì)(Aging society)。伴隨著老齡化人口的增加，神經(jīng)退行性疾病的人數(shù)亦同樣快速增長(zhǎng)，目前全世界至少有400萬人罹患這種疾病。然而，神經(jīng)退行性疾病并非好發(fā)于老年人，約一半的患者在60歲以后發(fā)病，另一半則于60歲之前發(fā)病。神經(jīng)退行性疾病是一種大腦和脊髓的細(xì)胞神經(jīng)元細(xì)胞退化的疾病狀態(tài)，由其神經(jīng)元突觸或其髓鞘的功能喪失導(dǎo)致，將導(dǎo)致功能障礙、行動(dòng)不便或死亡。

帕金森氏病是一種較常在老年人中出現(xiàn)的神經(jīng)性疾病，發(fā)病年齡以五十至七十九歲最常見。而其病理特征為中腦的黑質(zhì)組織內(nèi)的多巴胺細(xì)胞退化死亡，正常黑質(zhì)組織內(nèi)約含二十萬個(gè)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞，多巴胺神經(jīng)可分泌多巴胺，專司控制運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)。這些神經(jīng)少許的退化并不會(huì)引起任何運(yùn)動(dòng)的不協(xié)調(diào)，但當(dāng)退化超過50％時(shí)，便開始出現(xiàn)輕微癥狀，包括肢體顫抖、僵直及動(dòng)作緩慢。神經(jīng)退化愈多，則上述癥狀會(huì)愈嚴(yán)重，最終至完全需人照顧的病廢狀態(tài)；最后可能因呼吸道、泌尿道、褥瘡的感染而死亡。

目前，在帕金森氏癥的發(fā)病初期通過藥物治療供給多巴胺神經(jīng)多巴胺藥物，以便制造出更多的多巴胺來彌補(bǔ)退化的神經(jīng)所減少的制造量。早期的帕金森氏癥患者對(duì)于多巴藥物的療效反應(yīng)皆相當(dāng)不錯(cuò)。但由于帕金森氏癥為進(jìn)行性的疾病，多巴胺神經(jīng)一直在死亡，以至多巴藥物會(huì)愈服用愈多，然后藥效愈來愈差，癥狀就愈來愈嚴(yán)重。許多患者在服用藥物幾年后，便會(huì)出現(xiàn)藥物的副作用，包括幻覺、惡心、腸胃不適，甚至全身不自主的肢體舞蹈等。由于藥物治療于后期已無法控制嚴(yán)重患者的癥狀，因此需用外科手術(shù)來改善患者的生活質(zhì)量。其中，手術(shù)治療則可細(xì)分為以下三種形式：(1)燒灼切開術(shù)，也就是把腦部某些小區(qū)域加熱至80℃，時(shí)間為80秒，使局部的神經(jīng)細(xì)胞失去功能，這些區(qū)域包括蒼白球、視丘以及視丘下核等；(2)埋入電極，與燒灼破壞效果類似，其原理為當(dāng)電極通電后，局部的神經(jīng)細(xì)胞就會(huì)失去功能；以及(3)干細(xì)胞治療手術(shù)，其原理就是補(bǔ)充退化的多巴胺細(xì)胞，便會(huì)一直增長(zhǎng)，使腦內(nèi)多巴胺細(xì)胞增多，改善帕金森氏癥的癥狀。

雖然，過去已有文獻(xiàn)揭露可利用移植干細(xì)胞來治療帕金森氏癥，雖然可以改善帕金森氏癥的癥狀，然而效果并沒有到達(dá)治愈的程度。主要原因包括干細(xì)胞給予到體內(nèi)之后因免疫反應(yīng)而存活率不佳，以及干細(xì)胞給予到體內(nèi)之后分化為多巴胺神經(jīng)元的比例偏低(Cave等，2014)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于上述先前技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明提供一種醫(yī)藥組合物，該醫(yī)藥組合物包含線粒體特化細(xì)胞(MitoCell)，其中該線粒體特化細(xì)胞為當(dāng)歸萃取物預(yù)先處理的脂肪干細(xì)胞，使脂肪干細(xì)胞于體外時(shí)就已趨向類神經(jīng)元細(xì)胞的方向。線粒體特化細(xì)胞被給予到體內(nèi)之后分化為類神經(jīng)元細(xì)胞的比例增加。本發(fā)明醫(yī)藥組合物可有效提高于體內(nèi)分化為類神經(jīng)細(xì)胞的比例并降低所引起的免疫反應(yīng)，并達(dá)到治療帕金森氏癥的目的。

本發(fā)明提供一種線粒體特化細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含當(dāng)歸萃取物。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，其中，當(dāng)歸萃取物包含丁烯基苯酞(butylidenephthalide)。

本發(fā)明提供一種線粒體特化細(xì)胞的制備方法，包含以當(dāng)歸萃取物對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行前處理。

本發(fā)明還提供一種線粒體特化細(xì)胞，該線粒體特化細(xì)胞為經(jīng)當(dāng)歸萃取物處理的干細(xì)胞。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，其中，線粒體特化細(xì)胞為干細(xì)胞。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，其中，線粒體特化細(xì)胞為脂肪干細(xì)胞。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，其中，根據(jù)JC-1熒光染色結(jié)果，線粒體特化細(xì)胞的線粒體膜電位的紅/綠熒光比為6.5～2.7。

本發(fā)明另外提供一種增加類神經(jīng)元的醫(yī)藥組合物，該醫(yī)藥組合物包含50％～90％的線粒體特化細(xì)胞。

本發(fā)明同時(shí)提供一種治療神經(jīng)退行性疾病的方法，該方法包括以下步驟：將線粒體特化細(xì)胞給予至個(gè)體的腦部中。

附圖說明

圖1A-圖1B顯示脂肪干細(xì)胞在不同濃度的當(dāng)歸萃取物下的存活率。

圖2顯示脂肪干細(xì)胞在不同濃度的當(dāng)歸萃取物下的類神經(jīng)元分泌的Nurr1、BDNF增高，代表脂肪干細(xì)胞呈現(xiàn)分化為神經(jīng)細(xì)胞的命運(yùn)走向；而SDF1上升則代表干細(xì)胞歸巢(homing)能力增加，而IL-8基因表達(dá)下降則代表發(fā)炎反應(yīng)降低。

圖3A顯示線粒體特化細(xì)胞的線粒體的藍(lán)/綠熒光比降低，因此，線粒體特化細(xì)胞(MitoCell)的線粒體膜電位已與正常細(xì)胞的線粒體膜電位不相同，圖3B呈現(xiàn)此線粒體特化細(xì)胞仍具有干細(xì)胞的必要特性(CD44/CD105)。

圖4A-圖4B顯示平衡木測(cè)試結(jié)果。結(jié)果顯示，在給予脂肪干細(xì)胞(第3組)或線粒體特化細(xì)胞(MitoCell)(第4組)后的小鼠明顯增加平衡能力，第4組的效果比第3組的效果好。

圖5顯示旋轉(zhuǎn)輪測(cè)試結(jié)果。結(jié)果顯示，在給予脂肪干細(xì)胞(第3組)或線粒體特化細(xì)胞(MitoCell)(第4組)后的小鼠可恢復(fù)小鼠的平衡與協(xié)調(diào)能力，第4組的效果比第3組的效果好。

圖6A-圖6C顯示八通道穿梭箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果顯示，在給予脂肪干細(xì)胞(第3組)或線粒體特化細(xì)胞(MitoCell)(第4組)后的小鼠可以明顯看到其行為能力的恢復(fù)，第4組的效果比第3組的效果好。

圖7顯示大腦切片H&E(Hematoxylin and Eosin)染色結(jié)果，結(jié)果顯示將脂肪干細(xì)胞和線粒體特化細(xì)胞注射給予后，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞并無任何毒性及不會(huì)促進(jìn)大腦的炎癥反應(yīng)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明關(guān)于一種創(chuàng)新的融合蛋白，其包含一生物活性分子以及部份的免疫球蛋白分子。本發(fā)明各方面涉及融合蛋白、包含其的組合物以及制造與使用所揭露的融合蛋白的方法。揭露的融合蛋白應(yīng)用于延長(zhǎng)生物分子在生物中的血清半衰期。

以下提供詳細(xì)說明以協(xié)助本領(lǐng)域具通常知識(shí)者實(shí)施本發(fā)明。本領(lǐng)域具通常知識(shí)者可理解以下說明的實(shí)施例的調(diào)整或變化，在不偏離此處所包含的精神或范疇的情況下，被包含于本發(fā)明中。本發(fā)明說明中使用的術(shù)語僅是用于敘述特定的實(shí)施例而非意圖用作本發(fā)明的限制。以下使用的段落標(biāo)題是為了組織化的目的而非作為說明的內(nèi)容的限制。

當(dāng)歸可通過冷凍干燥、噴霧干燥、蒸發(fā)或加熱干燥等程序進(jìn)行干燥。在本發(fā)明中，當(dāng)歸可為主根、側(cè)根或纖維。當(dāng)歸可利用溶劑進(jìn)行萃取，以獲得當(dāng)歸萃取物。例如，可使用超臨界流體萃取、水萃取或有機(jī)溶劑萃取方法。本發(fā)明的當(dāng)歸萃取物較佳含有丁烯基苯酞(butylidenephthalide)。

本發(fā)明所述的“干細(xì)胞”是指細(xì)胞在未分化或部分分化的狀態(tài)下，具有自我更新的特性，并可具有分化成多種細(xì)胞類型的發(fā)育潛能，而沒有關(guān)于發(fā)育潛能的特定暗示的意義?！案杉?xì)胞”包括胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞。成體干細(xì)胞可分離自各種成體組織，包括血液、骨髓、腦、嗅上皮、皮膚、胰腺、骨骼肌和心臟肌肉。本發(fā)明的干細(xì)胞包括但不限于脂肪干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)嵴干細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、胰干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、內(nèi)皮干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞、腸上皮干細(xì)胞及生殖干細(xì)胞，較佳為脂肪干細(xì)胞。

本發(fā)明提供了線粒體特化細(xì)胞。本發(fā)明的線粒體特化細(xì)胞通過如下的處理而獲得：將干細(xì)胞用含有本發(fā)明的當(dāng)歸萃取物和/或丁烯基苯酞的培養(yǎng)基處理至少1小時(shí)、較佳為2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或24小時(shí)以上、更佳為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天以上。

應(yīng)注意的是，線粒體特化細(xì)胞在經(jīng)當(dāng)歸萃取物處理后，仍具有干細(xì)胞的特征。此外，線粒體特化細(xì)胞在小鼠體內(nèi)可分化為類神經(jīng)元細(xì)胞。

當(dāng)干細(xì)胞經(jīng)當(dāng)歸萃取物處理時(shí)，細(xì)胞的線粒體活化，但所述干細(xì)胞仍具有干細(xì)胞的特性。例如，在處理前、后，在所有經(jīng)處理的干細(xì)胞中均能檢測(cè)到CD44+/CD105+表面標(biāo)記。

本發(fā)明提供一種線粒體特化細(xì)胞的制備方法，包括于培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，其中，該培養(yǎng)基含有當(dāng)歸萃取物。

本發(fā)明另外提供一種線粒體特化細(xì)胞用于制備治療退行性疾病的醫(yī)藥組合物的用途，其特征在于通過注射方式，使線粒體特化細(xì)胞進(jìn)入個(gè)體腦部。

本發(fā)明另外提供一種治療神經(jīng)退行性疾病的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物包含線粒體特化細(xì)胞，其中該醫(yī)藥組合物包含活性劑量為約50％～90％的線粒體特化細(xì)胞、最佳活性劑量為80％～90％的線粒體特化細(xì)胞。

本發(fā)明醫(yī)藥組合物可有效地促進(jìn)腦部神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量及質(zhì)量，以增加個(gè)體的平衡與協(xié)調(diào)能力。本發(fā)明所述的個(gè)體為人類或非人類動(dòng)物(如，小鼠、狗、貓、羊、牛、馬、猴子等)，較佳為人類。

更重要的是，本發(fā)明的線粒體特化細(xì)胞不僅可顯著地提高多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量，更重要的是，還可降低給予線粒體特化細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。線粒體特化細(xì)胞優(yōu)于未經(jīng)處理的干細(xì)胞。

本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可單獨(dú)給藥，或是與其它神經(jīng)元退行性神經(jīng)疾病的治療方法或治療藥物組合。

綜上所述，本發(fā)明的線粒體特化細(xì)胞可增加多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞(特別處于中腦黑質(zhì)區(qū))，具有治療老年神經(jīng)退化相關(guān)疾病(例如帕金森氏癥及阿爾茨海默癥等)的作用。此外，將本發(fā)明的線粒體特化細(xì)胞給予至體內(nèi)所產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)比將脂肪干細(xì)胞給予至體內(nèi)所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)低。

本發(fā)明額外的特定實(shí)施例包括但不限于以下。

實(shí)施例1.線粒體特化細(xì)胞(MitoCell)的培養(yǎng)及前處理

線粒體特化細(xì)胞(MitoCell)是將脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)于脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)液中制備而得到的，其中，脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)液包含Keratinocyte-SFM(1X)Liquid(Gibco)、牛垂體提取物(Gibco)、EGF(Gibco)、N-乙酰-L-半胱氨酸(Sigma)、L-抗壞血酸2-磷酸酯鎂水合物(Sigma)、胎牛血清(HyClone)(10％)，并含有0、5、10、20、40、80、160和320μg/ml的當(dāng)歸萃取物，其中包含所述的丁烯基苯酞。此外，以下所述的線粒體特化細(xì)胞均為經(jīng)當(dāng)歸萃取物處理后的脂肪干細(xì)胞。

參照?qǐng)D1，在培養(yǎng)24小時(shí)后，當(dāng)歸萃取物濃度大于160μg/mL時(shí)，線粒體特化細(xì)胞的存活率下降。在培養(yǎng)48小時(shí)后，當(dāng)歸萃取物濃度大于80μg/mL時(shí)，線粒體特化細(xì)胞的存活率會(huì)下降。

另外，將脂肪干細(xì)胞分別培養(yǎng)于0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5和20μg/mL的當(dāng)歸萃取物中。線粒體特化細(xì)胞中的Nurr1、BDNF、SDF1、IL-8基因的表達(dá)量被檢測(cè)，用以找出最適合處理的劑量。

參照?qǐng)D2，在高濃度(20μg/mL)的當(dāng)歸萃取物下，Nurr1、BDNF與SDF1基因的表達(dá)量增加，但I(xiàn)L-8基因的表達(dá)會(huì)受到抑制。

參照?qǐng)D3，圖3A顯示線粒體特化細(xì)胞的線粒體的JC-1染色紅/綠熒光比例改變。特化細(xì)胞的線粒體膜的電位能已有明顯改變；圖3B顯示由流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體特化細(xì)胞。線粒體特化細(xì)胞具有CD44+/CD105+表達(dá)，顯示線粒體特化細(xì)胞仍具干細(xì)胞特性。20μg/mL的當(dāng)歸萃取物被選擇進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例2.誘導(dǎo)帕金森氏癥小鼠模型的建立

以八周齡，體重約25克左右的C57BL/6雄性小鼠被購買作實(shí)驗(yàn)對(duì)象。小鼠分籠為四組后給予數(shù)天適應(yīng)期，避免小鼠因緊迫、焦慮影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)行與結(jié)果。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的前一天，先進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)觀察分析。手術(shù)前10分鐘給予小鼠4％水合氯醛(cholra hydrate)，劑量是1mL/g/kg體重。小鼠體重大約都在25克，故每次都會(huì)給予0.25毫升的4％水合氯醛。此外，給予異氟醚(isoflurane)以麻醉小鼠，避免小鼠在手術(shù)期間蘇醒。

將1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)用生理食鹽水溶解以用于在小鼠中誘發(fā)帕金森氏癥，經(jīng)由換算，每只小鼠以腹腔注射(I.P.)的方式給予MPTP，一天注射4次，間隔2小時(shí)，劑量為20mg/kg。并以1x10⁶個(gè)細(xì)胞/每只給予帕金森氏癥的實(shí)驗(yàn)組別，如表1所示。

(1)第1組：對(duì)照組，不注射MPTP；

(2)第2組：陰性對(duì)照組，注射MPTP誘導(dǎo)帕金森氏癥后向腦部給予生理鹽水；

(3)第3組：實(shí)驗(yàn)組，注射MPTP誘導(dǎo)帕金森氏癥后向腦部給予1x10⁶個(gè)脂肪干細(xì)胞；

(4)第4組：實(shí)驗(yàn)組，注射MPTP誘導(dǎo)帕金森氏癥后向腦部給予1x10⁶個(gè)線粒體特化細(xì)胞。

實(shí)施例3.手術(shù)前/后神經(jīng)行為學(xué)分析

3.1平衡木測(cè)試

平衡木測(cè)試(Beam walking analysis)用來測(cè)量小鼠的平衡能力，將小鼠放至于80cm的平衡木上，記錄小鼠通過平衡木的時(shí)間以及后腳滑掉的次數(shù)，以分析小鼠的平衡和協(xié)調(diào)。測(cè)試時(shí)間為60秒，若超過60秒小鼠仍無法通過平衡木，仍以60秒計(jì)算。

參照?qǐng)D4A，小鼠注射MPTP以誘導(dǎo)帕金森氏癥(第2組)后，無法完成平衡木測(cè)試。在給予脂肪干細(xì)胞或線粒體特化細(xì)胞后(第3組、第4組)，明顯增加小鼠的平衡能力。

參照?qǐng)D4B，小鼠注射MPTP以誘導(dǎo)帕金森氏癥(第2組)后，其跌倒的次數(shù)增加。在給予脂肪干細(xì)胞或線粒體特化細(xì)胞后(第3組、第4組)，明顯降低小鼠跌倒的次數(shù)。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，線粒體特化細(xì)胞(第3組)相較于脂肪干細(xì)胞(第4組)對(duì)予的小鼠具有較佳的治療效果。

3.2旋轉(zhuǎn)輪測(cè)試

旋轉(zhuǎn)輪測(cè)試(Rotarod analysis)同樣用來測(cè)量小鼠的平衡與協(xié)調(diào)能力，在測(cè)試的前一周，我們將把小鼠放至滾輪上訓(xùn)練，直至小鼠在滾輪上的時(shí)間能夠超過三分鐘，手術(shù)后，再利用旋轉(zhuǎn)輪測(cè)試評(píng)估小鼠治療之后恢復(fù)的平衡能力，滾輪的速度為5rpm。

參照?qǐng)D5A、圖5B，小鼠在注射MPTP以誘導(dǎo)帕金森氏癥(第2組)后，其平衡與協(xié)調(diào)能力明顯下降。然而，在給予脂肪干細(xì)胞或線粒體特化細(xì)胞后(第3組、第4組)，可恢復(fù)小鼠的平衡與協(xié)調(diào)能力，較佳為給予線粒體特化細(xì)胞的小鼠(第4組)。

3.3八通道穿梭箱實(shí)驗(yàn)(Locomotor activity box)

在進(jìn)行監(jiān)測(cè)前，先將小鼠放進(jìn)采樣箱等待10至20分鐘使其適應(yīng)。八通道穿梭箱連接計(jì)算機(jī)，經(jīng)由感應(yīng)顯示并記錄小鼠在30分鐘期間的走動(dòng)(水平位移)、抬頭或攀爬(垂直位移)、以及整體總位移的數(shù)據(jù)，之后匯整數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

參照?qǐng)D6A、圖6B、圖6C，小鼠在注射MPTP以誘導(dǎo)帕金森氏癥(第2組)后，其平衡與協(xié)調(diào)能力明顯下降。然而，在給予脂肪干細(xì)胞或線粒體特化細(xì)胞后(第3組、第4組)，可恢復(fù)小鼠的垂直移動(dòng)次數(shù)(圖6A)、時(shí)間(圖6B)和能力(圖6C)，較佳為給予線粒體特化細(xì)胞的小鼠(第4組)。

小鼠被采用過量麻醉的犧牲法(2至3倍的麻醉劑量)，等待小鼠深度麻醉，開始利用鹽水進(jìn)行灌流，待血液皆沖出后，再用三聚甲醛(paraformaldehyde)灌流至四肢僵硬，進(jìn)行腦部取出的動(dòng)作。

將耳朵后面的皮膚用尖銳直剪刀剪開，再在頭頂皮膚予以垂直剪開，以露出頭骨，用剪刀在小鼠頸部上方剪開，使頸骨與小腦部分連接處斷裂，小心將刀尖深入顱骨向鼻尖剪開，注意不要傷害到腦部。腦部底下掏空，取出整個(gè)腦，并且將鼠腦脫水，之后放置在切腦臺(tái)上，在這之前切腦臺(tái)可先放在冰上預(yù)涼以避免腦部損傷。

去除腦中的小腦與嗅球，將大腦左右兩側(cè)切成兩部分，進(jìn)行OCT(最佳切削溫度；optimal cutting temperature)包埋，而后利用冷凍切片機(jī)得到鼠腦切片。

將取得鼠腦切片用H&E染色，觀察注射脂肪干細(xì)胞和線粒體特化細(xì)胞的腦部細(xì)胞是否有受損或炎癥反應(yīng)，結(jié)果顯示腦部細(xì)胞無受損及發(fā)炎反應(yīng)發(fā)生(圖7)。