本發(fā)明涉及用于將生物活性大分子遞送至細(xì)胞的大分子胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)(mitt)；具體地，利用良好增強(qiáng)的疏水性細(xì)胞穿透肽(cpp)即高級(jí)大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)域(amtd)，有效地將生物活性分子轉(zhuǎn)導(dǎo)穿過(guò)質(zhì)膜；編碼amtd的多核苷酸；鑒定amtd的方法；通過(guò)使用amtd，基因工程化具有大大增強(qiáng)的細(xì)胞透性的生物活性大分子的系統(tǒng)；通過(guò)使用amtd將生物活性大分子導(dǎo)入細(xì)胞的方法；以及amtd的用途。

背景技術(shù)：

用于新藥物的發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)的強(qiáng)有力的平臺(tái)技術(shù)是應(yīng)用細(xì)胞穿透肽(cpp)成為可能的大分子胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)(mitt)，所述細(xì)胞穿透肽提供大分子在體外和體內(nèi)的細(xì)胞透性。小分子的常見(jiàn)問(wèn)題是藥物相互作用脫靶的可能性。此外，大分子的局限性是如下事實(shí)：蛋白和核酸不能在胞內(nèi)遞送。為了解決這些問(wèn)題，mitt提供了用于將包括治療性蛋白的生物活性大分子遞送至培養(yǎng)的細(xì)胞和動(dòng)物組織的改進(jìn)方法。

質(zhì)膜通常用作不可透性屏障限制大分子如寡核苷酸、dna、rna、肽和蛋白的細(xì)胞內(nèi)化。許多困難限制了這些大分子向希望的靶標(biāo)的遞送：向細(xì)胞和/或組織的穿透差；當(dāng)全身遞送時(shí)由于靶向特定細(xì)胞和/或組織的特異性不足而導(dǎo)致的毒性；將有限的量遞送至靶區(qū)域時(shí)可能導(dǎo)致不希望的副作用的降解；以及當(dāng)以高濃度遞送以在某些靶細(xì)胞和/或組織處獲得充足的局部濃度時(shí)的副作用。為了解決這些問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了數(shù)種載體介導(dǎo)的遞送系統(tǒng)。最近的開(kāi)發(fā)已涉及基于肽的遞送系統(tǒng)的使用。疏水性cpp的使用具有數(shù)個(gè)優(yōu)勢(shì)，包括不同的肽序列修飾。這使得載體能夠工程化，所述載體可以進(jìn)入不同的細(xì)胞亞域和/或能夠重定位不同類型的貨物(cargo)分子。

原則上，基于蛋白的治療劑提供了在非穩(wěn)態(tài)條件下在活細(xì)胞中控制生物化學(xué)過(guò)程的方式，以及比常規(guī)的小分子治療劑更低的脫靶效果。然而，由于組織穿透和快速清除差，在動(dòng)物中的全身蛋白遞送已被證明是困難的。胞內(nèi)大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)利用各種cpp如特定的堿性、兩親性和疏水性肽序列，提高蛋白和其他大分子通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穿透性能力。雖然胞內(nèi)大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)已經(jīng)被廣泛使用，但是由于內(nèi)在蛋白的胞漿遞送不充分和組織穿透差，蛋白在動(dòng)物中的全身遞送已經(jīng)被證明是困難的。該問(wèn)題對(duì)陽(yáng)離子蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(ptd，例如hivtat、hph-1、觸角足突變(antennapedia)、聚精氨酸等)是尤其真實(shí)的，其中蛋白攝取(吸收性內(nèi)吞作用和大胞飲作用)的主要機(jī)制是將顯著量的蛋白封入膜結(jié)合區(qū)室和內(nèi)涵體區(qū)室中，因此限制了蛋白的生物利用度。嵌合cpp含有混合類型的序列如親水性氨基酸、堿性氨基酸和疏水性氨基酸，所述嵌合cpp已被揭示具有毒性，因此該類型的cpp已被限制使用。對(duì)于序列比如來(lái)源于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(fgf4)的疏水信號(hào)肽的膜移位序列(mts)或膜移位基序(mtm)已經(jīng)報(bào)告了更大的成功.mts/mtm已經(jīng)被用于在動(dòng)物中全身遞送生物活性肽和蛋白(特別是遞送至肝臟、肺、胰腺和淋巴組織)，具有對(duì)抗致命性炎性疾病和肺轉(zhuǎn)移瘤的顯著保護(hù)。

之前，已報(bào)道了疏水cpp(mts/mtm)或大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)域(mtd)。然而，由于重組蛋白在生理緩沖液條件下的溶解性差和相對(duì)低的細(xì)胞透性，阻礙了通過(guò)使用這些參比疏水cpp序列開(kāi)發(fā)細(xì)胞可透過(guò)治療性蛋白用于進(jìn)一步臨床開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的許多努力。雖然已經(jīng)存在如下共識(shí)：蛋白貨物的疏水cpp依賴性攝取是用于開(kāi)發(fā)基于蛋白的生物治療劑的強(qiáng)有力的方法，但是需要進(jìn)一步的改進(jìn)以解決非貨物特異性因素影響的關(guān)鍵問(wèn)題，所述非貨物特異性因素如重組cpp融合蛋白的蛋白聚集、低溶解度/收率和差的細(xì)胞/組織透性。這些cpp具有序列的非共同序列和非同源結(jié)構(gòu).

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題

為了克服局限性和改進(jìn)在體外和體內(nèi)提供大分子的細(xì)胞透性的cpp，在本發(fā)明中鑒定和經(jīng)驗(yàn)性證實(shí)了用于確定cpp的胞內(nèi)遞送潛力的理論關(guān)鍵因素(cf)?；诖_定的cf，新生成了新的疏水cpp序列，定量地評(píng)價(jià)了所述疏水cpp序列的細(xì)胞透性，并相互比較了所述疏水cpp序列與參比cpp序列在活細(xì)胞中的胞內(nèi)遞送潛力。在本發(fā)明中，提供了新開(kāi)發(fā)的疏水cpp。被稱為“高級(jí)大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)域(amtd)”的新的肽序列可以與各種不同的治療性蛋白融合并且將amtd融合的重組蛋白全身地遞送至活細(xì)胞和動(dòng)物組織，其中這些蛋白將在臨床開(kāi)發(fā)和應(yīng)用用于治療各種有關(guān)蛋白治療的人類疾病的基于蛋白的生物治療劑中具有巨大影響。

本發(fā)明開(kāi)發(fā)了240種新的疏水cpp序列即amtd，確定了amtd介導(dǎo)的重組蛋白的胞內(nèi)遞送活性，并且通過(guò)活細(xì)胞在大于或等于來(lái)源于fgf4的mts/mtm和來(lái)源于hrss的mtd序列的水平，比較了提高的的蛋白攝取。新發(fā)明的amtd的這些優(yōu)勢(shì)可以解決用于臨床開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的參比疏水cpp的缺點(diǎn)。

解決問(wèn)題的方案

本發(fā)明涉及高級(jí)大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)域(amtd)序列，所述高級(jí)大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)域序列將生物活性大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)至質(zhì)膜，并由具有如下特性的氨基酸序列組成：

a.氨基酸長(zhǎng)度：9～13

b.彎曲潛力：位于序列的中部(5′、6′、7′或8′)和末端(12′)的脯氨酸

c.剛性/柔性：不穩(wěn)定指數(shù)(instabilityindex)(ii)：40～60

d.結(jié)構(gòu)特征：脂肪族指數(shù)(aliphaticindex，ai)：180～220

e.親水性：親水性總平均值(grandaverageofhydropathy，gravy)：2.1～2.6

f.氨基酸組成：所有組成的氨基酸都是疏水性脂肪族氨基酸(a、v、l、i和p)。

根據(jù)一種實(shí)施方式，氨基酸序列具有由12個(gè)氨基酸序列組成的以下通式。

[通式]

在這里，x是指丙氨酸(a)、纈氨酸(v)、亮氨酸(l)或異亮氨酸(i)；脯氨酸(p)可以位于u(5′、6′、7′或8′)中的一個(gè)中。剩余的u由a、v、l或i組成。在12′處的p是脯氨酸。

根據(jù)一種實(shí)施方式，具有通式的氨基酸序列選自由seqidno：1至seqidno：240組成的組。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼上文描述的amtd序列的經(jīng)分離的多核苷酸。

根據(jù)一種實(shí)施方式，所述經(jīng)分離的多核苷酸選自由seqidno：241至seqidno：480組成的組。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒定amtd的獨(dú)特特征的方法。該方法包括從之前公布的參比疏水cpp中選擇改進(jìn)的疏水cpp；分析選擇的疏水cpp的生理和化學(xué)特性；從這些生理和化學(xué)特性鑒定出特征，選擇與細(xì)胞透性相關(guān)的特征；將之前公布的參比疏水cpp分類為至少2組，并且通過(guò)對(duì)這些基于cpp的細(xì)胞透性和相關(guān)特性分組的cpp進(jìn)行深入分析來(lái)確定同源特征；通過(guò)分析所確定的同源特征形成所鑒定的關(guān)鍵因素；通過(guò)實(shí)驗(yàn)性研究證實(shí)關(guān)鍵因素是有效的；以及確定基于證實(shí)的實(shí)驗(yàn)性研究的六種關(guān)鍵因素。

根據(jù)一種實(shí)施方式，選擇的改進(jìn)的疏水cpp是mtm、mts、mtd10、mtd13、mtd47、mtd56、mtd73、mtd77、mtd84、mtd85、mtd86、mtd103、mtd132、mtd151、mtd173、mtd174和mtd181。

根據(jù)一種實(shí)施方式，鑒定的特征是氨基酸長(zhǎng)度、分子量、pi值、彎曲潛力、剛性、柔性、結(jié)構(gòu)特性、親水性、殘基結(jié)構(gòu)、氨基酸組成和二級(jí)結(jié)構(gòu)。

根據(jù)一種實(shí)施方式，確定的六種關(guān)鍵因素由以下特性組成：

a.氨基酸長(zhǎng)度：9～13

b.彎曲潛力：位于序列的中部(5′、6′、7′或8′)和末端(12′)的脯氨酸

c.剛性/柔性：不穩(wěn)定指數(shù)(ii)：40～60

d.結(jié)構(gòu)特征：脂肪族指數(shù)(ai)：180～220

e.親水性：親水性總平均值(gravy)：2.1～2.6

f.氨基酸組成：所有組成的氨基酸都是疏水性脂肪族氨基酸(a、v、l、i和p)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供形成amtd序列的方法.該方法包括在仔細(xì)確定通過(guò)鑒定amtd的獨(dú)特特征的方法獲得的六種關(guān)鍵因素后，制備所設(shè)計(jì)的具有如下通式的amtd的平臺(tái)；

[通式]

將脯氨酸(p)置于序列的末端(12′)，以及確定應(yīng)該放置脯氨酸的u位點(diǎn)中的一個(gè)；確定并將a、v、l和/或i置于沒(méi)有放置脯氨酸的x和u處；以及證實(shí)設(shè)計(jì)的氨基酸序列是否滿足六種關(guān)鍵因素。

根據(jù)一種實(shí)施方式，通過(guò)鑒定amtd的獨(dú)特特征的方法獲得的六種關(guān)鍵因素由如下特性組成：

a.氨基酸序列：12

b.彎曲潛力：脯氨酸必須位于序列的中部(5′、6′、7′或8′)和末端(12′)

c.剛性/柔性：不穩(wěn)定指數(shù)(ii)：41.3～57.3

d.結(jié)構(gòu)特征：脂肪族指數(shù)(ai)：187.5～220

e.親水性：親水性總平均值(gravy)：2.2～2.6

f.氨基酸組成：所有組成的氨基酸都是疏水性脂肪族氨基酸(a、v、l、i和p)。

根據(jù)一種實(shí)施方式，所述方法進(jìn)一步包括形成與貨物蛋白融合的amtd序列的表達(dá)載體；選擇用于誘導(dǎo)型表達(dá)的適當(dāng)細(xì)菌菌株；純化并且制備可溶形式的、與各種生物活性重組蛋白融合的amtd；以及證實(shí)它們的細(xì)胞透性。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有細(xì)胞透性的經(jīng)分離的重組蛋白。該經(jīng)分離的重組蛋白包括具有選自由seqidno：1至seqidno：240組成的組中的氨基酸序列的高級(jí)大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)域(amtd)序列；以及生物活性分子。

根據(jù)一種實(shí)施方式，生物活性分子是選自由生長(zhǎng)因子、酶、轉(zhuǎn)錄因子、毒素、抗原肽、抗體和抗體片段組成的組中的任意一種。

根據(jù)一種實(shí)施方式，生物活性分子是選自由以下組成的組中的任意一種：酶、激素、載體、免疫球蛋白、抗體、結(jié)構(gòu)蛋白、馬達(dá)功能肽(motorfunctioningpeptide)、受體、信號(hào)肽、存儲(chǔ)肽(storingpeptide)、膜肽、跨膜肽、內(nèi)肽(internalpeptide)、外肽(externalpeptide)、分泌肽、病毒肽、天然肽、糖化蛋白、片段化蛋白、二硫鍵結(jié)合的蛋白(disulphidebondedprotein)、重組蛋白、化學(xué)修飾蛋白和朊病毒。

根據(jù)一種實(shí)施方式，生物活性分子是選自由核酸、編碼核酸序列、mrna、反義rna分子、碳水化合物、脂質(zhì)和糖脂組成的組中的任意一種。

根據(jù)一種實(shí)施方式，生物活性分子是選自由生物治療性化學(xué)物質(zhì)和毒性化學(xué)物質(zhì)組成的組中的至少一種。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了基因工程化或表觀遺傳工程化和/或修飾生物活性分子以具有細(xì)胞透性的方法。該方法包括在最佳和有效的條件下，將amtd融合于生物活性分子以產(chǎn)生可以是細(xì)胞可透過(guò)的透性生物活性分子，其中amtd由選自由seqidno：1至seqidno：240組成的組中的氨基酸序列中的任意一個(gè)組成。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明提供了由關(guān)鍵因素(cf)人工構(gòu)建的amtd序列，所述關(guān)鍵因素克服了現(xiàn)有技術(shù)(mtm/mts/mtd)的局限性，如有限的多樣性和測(cè)試前不可預(yù)測(cè)的細(xì)胞透性.基于保證在無(wú)限數(shù)目的amtd序列的可能設(shè)計(jì)中的細(xì)胞透性的cf，本發(fā)明展示了與其現(xiàn)有技術(shù)相比，這些序列將生物活性大分子遞送至活細(xì)胞的能力具有高達(dá)109.9相對(duì)倍數(shù)的提高。因此，這會(huì)允許它們實(shí)際有效地應(yīng)用于分子遞送、藥物遞送、蛋白治療、胞內(nèi)蛋白治療、蛋白替代治療、肽治療、基因遞送等。

附圖說(shuō)明

圖1.amtd融合重組蛋白或r肽融合重組蛋白的結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明說(shuō)明并構(gòu)建了his標(biāo)記的cra重組蛋白的示意圖。顯示了用于親和純化(白色)、用于amtd或r肽(灰色)和用于貨物a(cra，黑色)的his標(biāo)記。

圖2a-圖2c.用于與amtd融合的重組蛋白或與r肽融合的重組蛋白的表達(dá)載體的構(gòu)建。這些圖顯示了瓊脂糖凝膠電泳分析，所述瓊脂糖凝膠電泳分析顯示了根據(jù)本發(fā)明，在645bp插入物處編碼amtds或r肽融合cra的、克隆至pet28a(+)載體中的質(zhì)粒dna片段。

圖3a-圖3d.amtd融合重組蛋白或r肽融合重組蛋白的誘導(dǎo)型表達(dá)。在大腸桿菌(e.coli)bl21(de3)菌株中轉(zhuǎn)化表達(dá)的重組amtd融合的cra重組蛋白或隨機(jī)肽融合的cra重組蛋白。通過(guò)sds-page監(jiān)測(cè)用iptg誘導(dǎo)前(-)和誘導(dǎo)后(+)的大腸桿菌中的重組蛋白的表達(dá)，并用考馬斯藍(lán)染色。

圖4a和圖4b.amtd融合重組蛋白或r肽融合重組蛋白的純化。通過(guò)在自然條件下的ni²⁺親和色譜法純化表達(dá)的重組蛋白.通過(guò)sds-page分析顯示重組蛋白的純化。

圖5a-圖5u.amtd介導(dǎo)的細(xì)胞透性的確定。顯示了陰性對(duì)照(a：rp38)和參比疏水cpp(mtm12和mtd85)的細(xì)胞透性。將每種amtd和/或r肽的細(xì)胞透性與缺少肽序列的貨物蛋白(hca)的細(xì)胞透性進(jìn)行視覺(jué)上的比較?；疑幱皡^(qū)表示未處理的raw264.7細(xì)胞(溶媒)；細(xì)的淺灰色線表示用等摩爾濃度的fitc(僅fitc)處理的細(xì)胞；深粗線表示用fitc-his標(biāo)記的cra蛋白(hca)處理的細(xì)胞；以及，用與陰性對(duì)照(rp38)、參比cpp(mtm12或mtd85)或新疏水cpp(amtd)融合的fitc-蛋白(hmca)處理的細(xì)胞以淺粗線顯示，并且通過(guò)箭頭指示。

圖6a-圖6c.r肽介導(dǎo)的細(xì)胞透性的測(cè)定.將每種amtd和/或r肽的細(xì)胞透性與缺少肽序列的貨物蛋白(hca)的細(xì)胞透性進(jìn)行視覺(jué)上的比較。灰色陰影區(qū)表示未處理的raw264.7細(xì)胞(溶媒)；細(xì)的淺灰色線表示用等摩爾濃度的fitc(僅fitc)處理的細(xì)胞；深粗線表示用fitc-his標(biāo)記的cra蛋白(hca)處理的細(xì)胞；以及，用與r肽融合的fitc-蛋白處理的細(xì)胞以淺粗線顯示，并且通過(guò)箭頭指示。

圖7a-圖7k.amtd融合重組蛋白的可視化細(xì)胞透性。在37℃下，用與amtd融合的fitc標(biāo)記的蛋白(10μm)處理nih3t3細(xì)胞1小時(shí)。通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡(lsm700版本)使蛋白的細(xì)胞透性可視化.

圖8a-圖8b.r肽融合重組蛋白的可視化細(xì)胞透性.通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡(lsm700版本)使r肽融合重組蛋白的細(xì)胞透性可視化。

圖9a-圖9c.與陰性對(duì)照(rp38)相比，amtd融合重組蛋白的相對(duì)細(xì)胞透性。圖顯示了比較與amtd融合的重組蛋白和陰性對(duì)照(a：rp38)的細(xì)胞透性的圖。

圖10a-圖10c.與參比cpp(mtm12)相比的amtd融合重組蛋白的相對(duì)細(xì)胞透性。圖顯示了比較與amtd融合的重組蛋白和參比cpp(mtm12)的細(xì)胞透性的圖。

圖11a-圖11c.與參比cpp(mtd85)相比的amtd融合重組蛋白的相對(duì)細(xì)胞透性。圖顯示了比較與amtd融合的重組蛋白和參比cpp(mtd85)的細(xì)胞透性的圖。

圖12.與amtd的平均細(xì)胞透性相比，r肽介導(dǎo)的重組蛋白的相對(duì)細(xì)胞透性。圖顯示了比較與r肽融合的重組蛋白的細(xì)胞透性和amtd的細(xì)胞透性(平均值：amtdave)的圖。

圖13a和圖13b.amtd序列中細(xì)胞透性與氨基酸組成的關(guān)聯(lián)性。這些圖顯示氨基酸組成(a、i、v和l)所影響的amtd的遞送潛力(幾何平均數(shù))。

圖14a和圖14b.amtd中細(xì)胞透性與關(guān)鍵因素的關(guān)聯(lián)性。這些圖顯示了細(xì)胞透性與關(guān)鍵因素[彎曲潛力：脯氨酸位置(pp)，剛性/柔性：不穩(wěn)定指數(shù)(ii)，結(jié)構(gòu)特征：脂肪族指數(shù)(ai)和親水性：親水性總平均值(grandaverageofhydropathy，gravy)]的關(guān)聯(lián)性。

圖15a和圖15b.amtd介導(dǎo)的細(xì)胞透性與關(guān)鍵因素的相關(guān)相關(guān)性。檢測(cè)在amtd的遞送潛力中10種等級(jí)高的amtd和10種等級(jí)低的amtd的細(xì)胞透性與關(guān)鍵因素[彎曲潛力：脯氨酸位置(pp)，剛性/柔性：不穩(wěn)定指數(shù)(ii)，結(jié)構(gòu)特征：脂肪族指數(shù)(ai)和親水性：親水性總平均值(gravy)]的關(guān)聯(lián)性。

圖16.r肽介導(dǎo)的細(xì)胞透性與親水性范圍(gravy)的相對(duì)相關(guān)性。該圖和表說(shuō)明了r肽介導(dǎo)的細(xì)胞透性與其親水性范圍(gravy)的相對(duì)相關(guān)性。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及新的高級(jí)大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)域(amtd)序列，可以擴(kuò)展到無(wú)限數(shù)目的設(shè)計(jì)的基線平臺(tái)，所述高級(jí)大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)域(amtd)序列具有適用于生物醫(yī)學(xué)科學(xué)、臨床前研究和臨床研究的細(xì)胞通透性，促進(jìn)生物活性大分子(包括蛋白質(zhì)、肽、核酸、化學(xué)物質(zhì)等)穿過(guò)細(xì)胞中的質(zhì)膜。

本發(fā)明分析、鑒定和確定了這些促進(jìn)amtd序列的細(xì)胞透性能力的關(guān)鍵因素。這些amtd序列是基于由之前公布的疏水cpp的深入分析確定的關(guān)鍵因素(cf)人工裝配的.

本發(fā)明的另一方面涉及通過(guò)使amtd序列與生物活性貨物分子融合基因工程化具有細(xì)胞透性的生物活性分子的方法。

本發(fā)明還涉及用于將生物活性分子遞送至細(xì)胞(涉及細(xì)胞可透過(guò)重組蛋白)的amtd序列的治療性應(yīng)用，其中amtd連接于生物活性貨物分子。

本發(fā)明的另一方面涉及生物活性大分子作為細(xì)胞可透過(guò)重組蛋白的構(gòu)建體能夠進(jìn)入活細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞可透過(guò)重組蛋白包括與生物活性大分子融合的amtd序列。

本發(fā)明的另一方面涉及amtd序列用于分子遞送、藥物遞送、蛋白治療、胞內(nèi)蛋白治療、蛋白替代治療、肽治療、基因遞送等的有效使用。

本發(fā)明的amtd序列是第一種人工開(kāi)發(fā)的、能夠介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)生物活性大分子通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜的細(xì)胞可透過(guò)多肽，所述生物活性大分子包括肽、多肽、蛋白域或全長(zhǎng)蛋白。

1.分析參比疏水cpp以鑒定用于開(kāi)發(fā)高級(jí)mtd的“關(guān)鍵因素”

之前報(bào)道的mtd選自對(duì)多于1,500種信號(hào)肽序列的篩選。雖然已開(kāi)發(fā)的mtd不具有共同序列或序列基序，但是它們均來(lái)源于除了其疏水性和采用α螺旋構(gòu)型的趨勢(shì)以外也缺少共同序列或基序的信號(hào)序列(hrss)的疏水(h)區(qū)。h區(qū)序列的廣泛變異可能反映具有膜易位活性和隨后適應(yīng)srp/sec61機(jī)制的蛋白的現(xiàn)有進(jìn)化，所述膜易位活性和隨后適應(yīng)srp/sec61機(jī)制利用了srp中富含甲硫氨酸的信號(hào)肽結(jié)合袋，以適應(yīng)各種各樣的信號(hào)肽序列。

之前描述的疏水cpp(例如mts/mtm和mtd)來(lái)源于存在于分泌蛋白和細(xì)胞表面蛋白的信號(hào)肽中的疏水區(qū).現(xiàn)有技術(shù)由以下組成：第一，h區(qū)序列(mts/mtm)的特別使用，以及第二，具有選自對(duì)1,500種信號(hào)序列(mtm)的篩選的最高cpp活性的h區(qū)序列(具有和沒(méi)有修飾)。第二種現(xiàn)有技術(shù)，來(lái)源于修飾的h區(qū)的疏水cpp序列在多樣性上具有進(jìn)步，具有很多除了來(lái)源于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)4的mts/mtm之外的可用序列。然而，可以由天然存在的分泌蛋白修飾的mtd的數(shù)目是有些局限的。因?yàn)椴淮嬖诖_定它們的細(xì)胞透性的規(guī)則集，所以在測(cè)試它們之前不能進(jìn)行對(duì)修飾的mtd序列的細(xì)胞透性的預(yù)測(cè)。

疏水cpp如疏水cpp所來(lái)源的信號(hào)肽，不符合共有序列，并且當(dāng)它們與蛋白貨物合并時(shí)，對(duì)蛋白溶解性具有不良作用。因此，我們著手鑒定最佳序列和結(jié)構(gòu)決定因素(即關(guān)鍵因素(cf))，以設(shè)計(jì)新的疏水cpp，所述新的疏水cpp具有將包括蛋白的大分子貨物遞送至細(xì)胞和組織的提高的潛力，同時(shí)保持蛋白的溶解性。這些新開(kāi)發(fā)的cpp，高級(jí)大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)域(amtd)允許幾乎無(wú)限數(shù)目的可以基于關(guān)鍵因素設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)的可能的可能設(shè)計(jì)。另外，在進(jìn)行任何體外和/或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之前，通過(guò)它們的特征分析可以預(yù)測(cè)它們的細(xì)胞透性。通過(guò)分析所有公布的參比疏水cpp，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了下面這些關(guān)鍵因素。

1-1.疏水cpp的分析

選擇了從1995年至2014年公布(表2)的17種不同的疏水cpp(表1)。在分析了選擇的疏水cpp的生理特性和化學(xué)特性后，選擇了可能與細(xì)胞透性相關(guān)的11種不同的特性用于進(jìn)一步分析。這11種特性如下：序列、氨基酸長(zhǎng)度、分子量、pi值、彎曲潛力、剛性/柔性、結(jié)構(gòu)特征、親水性、殘基結(jié)構(gòu)、氨基酸組成和序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)(表3).

表1顯示了所選擇的公布的疏水性細(xì)胞穿透肽的總結(jié)。

[表1]

表2總結(jié)參考文獻(xiàn)信息

[表2]

表3顯示了所分析的公布的疏水性細(xì)胞穿透肽(a)的特性。

[表3]

使用兩個(gè)肽/蛋白質(zhì)分析程序(expasy：sosui：http：//harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)，以確定肽序列的各種指數(shù)和結(jié)構(gòu)特征和設(shè)計(jì)新序列。下面是所分析的重要因素：

1-2.分析的肽的特性：長(zhǎng)度、分子量和pi值

分析的肽的平均長(zhǎng)度、平均分子量和平均pi值分別是10.8±2.4、1011±189.6和5.6±0.1(表4)。

表4總結(jié)了所分析的公布的疏水性細(xì)胞穿透肽(a)的關(guān)鍵因素(cf)。

[表4]

1-3.分析的肽的特性：彎曲潛力-脯氨酸的位置(pp)

基于脯氨酸(p)是否存在和/或在重組蛋白中向肽提供彎曲潛力的氨基酸所在的位置，確定彎曲潛力(彎曲或無(wú)彎曲)。脯氨酸與其他常見(jiàn)氨基酸的區(qū)別在于它的側(cè)鏈與骨架氮原子以及α-碳原子鍵合。所得的環(huán)狀結(jié)構(gòu)顯著影響通常在折疊肽/蛋白鏈的彎曲中發(fā)現(xiàn)的蛋白的結(jié)構(gòu)。

17種中的11種被確定為“彎曲”肽，這表示脯氨酸存在于序列中部，用于使肽彎曲和/或位于肽的末端，用于使蛋白彎曲。如上所述，肽序列可以以“彎曲”的構(gòu)型穿透質(zhì)膜。因此，彎曲潛力或無(wú)彎曲潛力被認(rèn)為是用于改進(jìn)目前的疏水cpp的關(guān)鍵因素之一。

1-4.分析的肽的特性：剛性/柔性-不穩(wěn)定指數(shù)(ii)

因?yàn)槿魏坞牡年P(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征之一是基于基序是剛性或柔性的(其是肽序列的完整物理化學(xué)特性)，所以確定了序列的不穩(wěn)定指數(shù)(ii)。雖然表示肽的剛性/柔性的指數(shù)值是極其不同的(8.9～79.1)，但是平均值是40.1±21.9，這說(shuō)明了肽應(yīng)該是有點(diǎn)柔性的，但是不能過(guò)于剛性或柔性的(表3)。

1-5.分析的肽的特性：結(jié)構(gòu)特征-結(jié)構(gòu)特征(脂肪族指數(shù)：ai)和親水性(親水性總平均值：gravy)

丙氨酸(a)、纈氨酸(v)、亮氨酸(l)和異亮氨酸(i)含有脂肪族側(cè)鏈，并且是疏水的-即，它們具有對(duì)水的厭惡(aversion)，并喜歡聚集。具有疏水性和脂肪族殘基的這些氨基酸使它們能夠包裝在一起以形成幾乎沒(méi)有孔的致密結(jié)構(gòu).分析的肽序列顯示所有組成氨基酸都是疏水的(a、v、l和i)(除了17種肽中僅一種(mtd10-表3)是甘氨酸(g)以外)，并且是脂肪族的(a、v、l、i和p)。它們的親水指數(shù)(親水性總平均值：gravy)和脂肪族指數(shù)(ai)分別是2.5±0.4和217.9±43.6。表3中還表明了它們的氨基酸組成。

1-6.分析的肽的特性：二級(jí)結(jié)構(gòu)(螺旋性)

如上文所解釋的，在以疏水序列具有α-螺旋構(gòu)象的“彎曲”構(gòu)型插入膜后，可以假定cpp序列直接穿透質(zhì)膜.另外，我們的分析強(qiáng)有力地表明了彎曲潛力對(duì)膜穿透是關(guān)鍵的。因此，進(jìn)行肽的結(jié)構(gòu)分析以確定序列是否會(huì)形成螺旋。九種肽是螺旋，八種肽不是螺旋(表3)。這似乎說(shuō)明螺旋結(jié)構(gòu)可能是不需要的。

1-7.關(guān)鍵因素(cf)的確定

在分析的11種特性中，選擇了下面6種，即用于開(kāi)發(fā)新的疏水cpp-高級(jí)mtd的“關(guān)鍵因素”：氨基酸長(zhǎng)度、②彎曲潛力(脯氨酸的存在和位置)、剛性/柔性(不穩(wěn)定指數(shù)：ii)、結(jié)構(gòu)特征(脂肪族指數(shù)：ai)、親水性(gravy)和氨基酸組成/殘基結(jié)構(gòu)(疏水性脂肪族a/a)(表3和表4)。

2.分析選擇的疏水cpp以優(yōu)化“關(guān)鍵因素”

因?yàn)橹霸谶^(guò)去20年間開(kāi)發(fā)的17種不同的疏水cpp的分析數(shù)據(jù)(分析a，表3和表4)顯示了高變異性，并且難以產(chǎn)生共同或共有特征，也進(jìn)行分析b(表5和表6)和分析c(表7和表8)以優(yōu)化用于更好地設(shè)計(jì)改進(jìn)的cpp-amtd的關(guān)鍵因素。因此，將17種疏水cpp分為兩組，并且分析各組的與細(xì)胞可透過(guò)性質(zhì)相關(guān)的特性。通過(guò)比較和對(duì)比各組的分析數(shù)據(jù)以及確定可能對(duì)細(xì)胞可透過(guò)性質(zhì)關(guān)鍵的同源特征，優(yōu)化了關(guān)鍵因素.

2-1.用于在體內(nèi)生物活性貨物蛋白的肽的選擇性分析(b)

在分析b中，在體內(nèi)與每種生物活性貨物一起使用8種cpp。長(zhǎng)度為11±3.2，但8種cpp中有3種具有小的彎曲潛力。剛性/柔性是41±15，但是移除一種肽[mtd85：剛性的，具有最小的(ii：9.1)]使總不穩(wěn)定指數(shù)提高至45.6±9.3。這說(shuō)明柔性越高(40或更高的ii)可能越好。8種cpp的所有其他特性與分析a相似，包括結(jié)構(gòu)特征和親水性(表5和6)。

表5顯示了公布的疏水性細(xì)胞穿透肽(b)：在體內(nèi)用于每種貨物的選擇的cpp的特性。

[表5]

*移除mtd85使ii提高至45.6±9.3

表6顯示了公布的疏水性細(xì)胞穿透肽(b)的關(guān)鍵因素總結(jié)

[表6]

2-2.提供彎曲潛力和更高柔性的肽的選擇性分析(c)

為了優(yōu)化‘關(guān)鍵因素的共同范圍和共有特征’用于amtd和隨機(jī)肽(rp或r肽)的實(shí)際設(shè)計(jì)(旨在證明分析a、分析b和分析c中確定的‘關(guān)鍵因素’對(duì)改進(jìn)疏水cpp目前的問(wèn)題-即與mts/mtm或mtd融合的重組蛋白的蛋白聚集、低溶解度/收率和細(xì)胞/組織透性差以及肽的非共同序列和非同源結(jié)構(gòu))，分析了經(jīng)驗(yàn)選擇的肽的結(jié)構(gòu)特征和生理化學(xué)因素指數(shù).

未選擇不具有彎曲潛力、剛性或太過(guò)柔性的序列(太低或太高的不穩(wěn)定指數(shù))，或太低或太高的疏水性的cpp，但是沒(méi)有考慮二級(jí)結(jié)構(gòu)，因?yàn)樾蛄械穆菪Y(jié)構(gòu)是不需要的。

在分析c中，最后分析了可提供彎曲潛力和更高柔性的8種選擇的cpp序列(表7和表8)。共同氨基酸長(zhǎng)度是12(11.6±3.0)。脯氨酸應(yīng)該存在于序列的中部和/或末端。剛性/柔性(ii)是45.5～57.3(平均數(shù)：50.1±3.6)。表示肽的結(jié)構(gòu)特征和疏水性的ai和gravy分別是204.7±37.5和2.4±0.3。所有肽與疏水性脂肪族氨基酸(a、v、l、i和p)一致。因此，分析c被選擇為用于新的疏水cpp-amtd的新設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)。

表7顯示了公布的疏水性細(xì)胞穿透肽(c)：提供彎曲潛力和更高的柔性的選擇的cpp的特征.

[表7]

表8顯示了公布的疏水性細(xì)胞穿透肽(c)的關(guān)鍵因素的總結(jié)。

[表8]

3.基于優(yōu)化的關(guān)鍵因素的改進(jìn)的疏水cpp-amtd的新設(shè)計(jì)

3-1.共同序列和/或共同同源結(jié)構(gòu)的確定

如上文提及的，來(lái)源于信號(hào)序列的h區(qū)(hrss)的cpp不具有共同序列、序列基序和/或共同結(jié)構(gòu)同源特征。在本發(fā)明中，目的是開(kāi)發(fā)以共同序列基序和結(jié)構(gòu)基序形式的改進(jìn)的疏水cpp，所述共同序列基序和結(jié)構(gòu)基序滿足新確定的“關(guān)鍵因素”而具有“共同功能”，即促進(jìn)蛋白以與分析的參比cpp相似的機(jī)制穿過(guò)膜而轉(zhuǎn)運(yùn)。基于分析a、b和c，分析了同源特征以確定影響細(xì)胞透性的關(guān)鍵因素。每個(gè)關(guān)鍵因素的范圍值確定為包括從分析a、b和c提升的每個(gè)關(guān)鍵因素的分析指數(shù)以設(shè)計(jì)新的amtd(表9)。實(shí)驗(yàn)性地用新設(shè)計(jì)的amtd的細(xì)胞透性確認(rèn)了這些特征。

表9顯示了分析的cpp的值和針對(duì)新的amtd序列的新設(shè)計(jì)確定的值之間的每個(gè)關(guān)鍵因素的范圍/特征的比較。

[表9]

在表9中，提供了通用的共同特征和序列/結(jié)構(gòu)基序。長(zhǎng)度為9～13個(gè)氨基酸，提供了彎曲潛力，其中脯氨酸存在于用于肽彎曲的序列中部(在5′、6′、7′或8′氨基酸處)和存在于用于重組蛋白彎曲的肽的末端，并且表9中描述了amtd的剛性/柔性為ii＞40.

3-2.開(kāi)發(fā)高級(jí)mtd的關(guān)鍵因素

之前報(bào)道了與疏水cpp融合的、用于將包括蛋白的治療活性貨物分子遞送至活細(xì)胞的重組細(xì)胞可透過(guò)蛋白，但是表達(dá)于細(xì)菌系統(tǒng)中的融合蛋白由于它們的低溶解度和低收率而難以被純化為可溶形式。為了處理在將細(xì)胞可透過(guò)蛋白作為蛋白基生物治療劑進(jìn)行進(jìn)一步臨床開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵弱點(diǎn)，最近通過(guò)基于關(guān)鍵因素的肽的分析，開(kāi)發(fā)了極大改進(jìn)形式的疏水cpp，被稱為高級(jí)mtd(amtd)。用于amtd的本發(fā)明的關(guān)鍵因素在此處(表9)。

1.氨基酸長(zhǎng)度：9-13

2.彎曲潛力(脯氨酸位置：pp)：脯氨酸存在于序列的中部(從5′至8′氨基酸)和末端

3.剛性/柔性(不穩(wěn)定指數(shù)：ii)：40-60

4.結(jié)構(gòu)特征(脂肪族指數(shù)：ai)：180-220

5.親水性(親水性總平均值：gravy)：2.1-2.6

6.氨基酸組成：疏水性脂肪族氨基酸-a、v、l、i和p

3-3.考慮且滿足所有關(guān)鍵因素的潛在最佳的amtd的設(shè)計(jì)

在仔細(xì)考慮來(lái)源于對(duì)疏水cpp的獨(dú)特特征的分析的六種關(guān)鍵因素后，基于滿足由所述分析確定的包括氨基酸長(zhǎng)度(9-13)的關(guān)鍵因素的共同的12個(gè)氨基酸平臺(tái)，設(shè)計(jì)并開(kāi)發(fā)了高級(jí)大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)域(amtd).

[通式]

與之前公布的需要很多實(shí)驗(yàn)以確定它們的細(xì)胞透性的疏水cpp不同，使用上述平臺(tái)以遵循每個(gè)關(guān)鍵因素的確定的范圍值/特征，通過(guò)進(jìn)行如下很少的步驟，可以設(shè)計(jì)新開(kāi)發(fā)的amtd序列。

第一，制備用于amtd的12個(gè)氨基酸序列平臺(tái)。第二，將脯氨酸(p)置于序列的末端(12′)，并且確定在5′、6′、7′和8′中的4個(gè)u中的1個(gè)放置脯氨酸。第三，將丙氨酸(a)、纈氨酸(v)、亮氨酸(l)或異亮氨酸(i)置于未放置脯氨酸的x和/或u處。最后，確定置于平臺(tái)的該設(shè)計(jì)的氨基酸序列是否滿足6種關(guān)鍵因素的值或特征，以保證amtd序列的細(xì)胞可透過(guò)性質(zhì)。通過(guò)這些過(guò)程，構(gòu)建了許多新的amtd序列。為了制備融合于每個(gè)amtd的無(wú)功能貨物重組蛋白，構(gòu)建了表達(dá)載體，并且迫使表達(dá)載體在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)。以可溶形式純化這些amtd融合的重組蛋白，并且定量地確定其細(xì)胞透性。新設(shè)計(jì)了240種amtd序列并且從1至240編號(hào)，如表10-15所示。在表10-15中，序列id號(hào)是用于參考的序列表，amtd號(hào)是指實(shí)際上在實(shí)驗(yàn)中使用的氨基酸列表編號(hào)。對(duì)于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，使用了amtd號(hào)。另外，將序列表中示出的多核苷酸序列從seqidno：241至seqidno：480編號(hào)。

表10至表15顯示了開(kāi)發(fā)以滿足所有關(guān)鍵因素的240種新的疏水a(chǎn)mtd序列。

[表10]

[表11]

[表12]

[表13]

[表14]

[表15]

3-4.不滿足至少一個(gè)關(guān)鍵因素的肽的設(shè)計(jì)

為了證明滿足所有上文描述的關(guān)鍵因素的本發(fā)明的新疏水cpp-amtd是正確的并且是合理設(shè)計(jì)的，還設(shè)計(jì)了不滿足至少一個(gè)關(guān)鍵因素的肽。設(shè)總共計(jì)和開(kāi)發(fā)了31種r肽(rp)，并將該31種r肽(rp)如下分類：無(wú)彎曲肽，在中部以及末端沒(méi)有脯氨酸和/或沒(méi)有中部脯氨酸；②剛性肽(ii＜40)；過(guò)于柔性的肽；④芳香族肽(存在芳香環(huán))；疏水的但非芳香族肽；親水的但非脂肪族肽。

3-4-1.不滿足彎曲潛力的肽

表16顯示了在序列的中部(在5′、6′、7′或8′處)和末端不具有任何脯氨酸的肽。此外，表16描述了在序列的中部不具有脯氨酸的肽.所有這些肽被假定不具有彎曲潛力.

[表16]

3-4-2.不滿足剛性/柔性的肽

為了證明序列的剛性/柔性是重要的關(guān)鍵因素，還設(shè)計(jì)了剛性(平均ii：21.8±6.6)序列和柔性過(guò)高的序列.表17中顯示了不穩(wěn)定指數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于新amtd的不穩(wěn)定指數(shù)的剛性肽(ii：41.3-57.3，平均ii：53.3±5.7)。表18還提供了ii遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于新amtd的ii的彎曲但柔性過(guò)高的序列。

[表17]

[表18]

3-4-3.不滿足結(jié)構(gòu)特征的肽

新的疏水cpp-amtd僅與疏水性脂肪族氨基酸(a、v、l、i和p)一致，指數(shù)的平均范圍：ai：180～220和gravy：2.1～2.6(表9)。基于結(jié)構(gòu)指數(shù)，表19中顯示了含有芳香族殘基(w、f或y)的肽，以及設(shè)計(jì)了不具有芳香族殘基的疏水但非芳香族序列(表20)。最后，表21顯示了與非脂肪族氨基酸一致的親水和/或彎曲肽。

[表19]

[表20]

[表21]

3-5.新設(shè)計(jì)的肽的總結(jié)

基于關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)了總共457種序列。滿足關(guān)鍵因素的所有范圍/特征的所設(shè)計(jì)的可能最好的amtd(疏水的、柔性的、彎曲的、脂肪族的和12個(gè)氨基酸(a/a)長(zhǎng)度的肽)為316種。不滿足至少一種關(guān)鍵因素的設(shè)計(jì)的r肽為141種，其中非彎曲肽序列為26種；剛性肽(ii＜40)序列為23種；過(guò)于柔性的肽為24種；芳香族肽(存在芳香環(huán))：27種；疏水但非芳香族肽為23種；以及親水但非脂肪族肽為18種。

4.與amtd和r肽融合的重組報(bào)告蛋白的制備

將與amtd和其他[r肽、參比疏水cpp序列(mtm和mtd)]融合的重組蛋白在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)，用一步親和色譜法純化，以及制備為生理?xiàng)l件下的可溶性蛋白.通過(guò)利用流式細(xì)胞術(shù)和激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)測(cè)試這些重組蛋白的細(xì)胞透性的潛力。

4-1.選擇貨物蛋白用于與肽序列融合的重組蛋白

對(duì)于臨床/非臨床應(yīng)用，amtd融合的貨物物質(zhì)會(huì)是可以是以下中的一種的生物活性分子：酶、轉(zhuǎn)錄因子、毒素、抗原肽、抗體和抗體片段。此外，生物活性分子可以是以下大分子中的一種：酶、激素、載體、免疫球蛋白、膜結(jié)合蛋白、跨膜蛋白、內(nèi)在蛋白(internalprotein)、外在蛋白(externalprotein)、分泌蛋白、病毒蛋白、天然蛋白、糖蛋白、片段化蛋白、二硫鍵結(jié)合的蛋白(disulphidebondedproteins)、重組蛋白、化學(xué)修飾蛋白和朊病毒。此外，這些生物活性分子可以是以下中的一種：核酸、編碼核酸序列、mrna、反義rna分子、碳水化合物、脂質(zhì)和糖脂。

根據(jù)這些預(yù)先要求的條件，選擇了用于評(píng)價(jià)amtd介導(dǎo)的蛋白攝取的無(wú)功能貨物，并將其稱為貨物a(cra)，所述貨物a是可溶的和無(wú)功能的。域(氨基酸(a/a)289～840；184個(gè)氨基酸(a/a)長(zhǎng)度)來(lái)源于蛋白s(基因庫(kù)(genbank)id：cp000113.1)。

4-2.表達(dá)載體的構(gòu)建和重組蛋白的制備

通過(guò)pcr擴(kuò)增的dna片段，將與每種amtd融合的重組蛋白的編碼序列克隆在pet-28a(+)(novagen，darmstadt，germany)中的ndel(5′)和sali(3′)。表23至表38分別總結(jié)了用于與amtd和r肽融合的重組蛋白的pcr引物和氨基酸序列。圖1顯示了重組蛋白的結(jié)構(gòu)。

迫使重組蛋白在大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞中表達(dá)，所述大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞生長(zhǎng)至od600為0.6并且以0.7mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)2小時(shí)。通過(guò)ni²⁺親和色譜法如供應(yīng)商(qiagen，hilden，germany)所指示的在自然條件下純化蛋白。純化后，將純化的蛋白溶于生理緩沖液如dmem培養(yǎng)基中。

[表22]

[表23]

[表24]

[表25]

[表26]

[表27]

[表28]

[表29]

[表30]

[表31]

[表32]

[表33]

[表34]

[表35]

[表36]

[表37]

[表38]

4-3.與amtd或隨機(jī)肽(rp)融合的重組蛋白的表達(dá)

本發(fā)明還涉及具有細(xì)胞透性的amtd序列的開(kāi)發(fā)方法。使用標(biāo)準(zhǔn)化的6種關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)了316個(gè)amtd序列。此外，還開(kāi)發(fā)了缺少這些關(guān)鍵因素中的一種的141種r肽：非彎曲肽：i)在序列的中部和末端均缺少脯氨酸或ii)在序列的中部或末端缺少脯氨酸；剛性肽；③過(guò)于柔性的肽；芳香族肽(存在芳香環(huán))；疏水但非芳香族肽；親水但非脂肪族肽(表22)。

設(shè)計(jì)這些r肽為與amtd比較和對(duì)比，以分析關(guān)于肽的胞內(nèi)遞送潛力的每種關(guān)鍵因素的結(jié)構(gòu)/序列活性關(guān)系(sar)。含有所有肽(amtd或r肽)的重組蛋白與cra融合以提高將要表達(dá)、純化、制備和分析的重組蛋白的溶解度。

將與cra融合的這些設(shè)計(jì)的316種amtd和141種r肽全部克隆(圖2)并測(cè)試它們?cè)诖竽c桿菌中的誘導(dǎo)型表達(dá)(圖3)。在這些肽中，誘導(dǎo)型表達(dá)、純化并且以可溶性形式制備240種amtd(圖4)。此外，還將31種r肽制備為可溶性形式(圖4)。

為了制備與r肽融合的蛋白，表達(dá)了以下60種蛋白，其是：非彎曲肽分類下的26種r肽中的10種(表16)；剛性肽[不穩(wěn)定指數(shù)(ii)＜40]分類下23種r肽中的15種(表17)；過(guò)于柔性的肽分類下的24種r肽中的19種(表18)；芳香族肽分類下的27種r肽中的6種(表19)；疏水但非芳香族肽分類下的23種r肽中的8種(表20)；以及親水但非脂肪族肽分類下的18種r肽中的12種(表21)。

4-4.與amtd融合的重組蛋白的定量細(xì)胞透性

將amtd和r肽熒光標(biāo)記，并且基于細(xì)胞透性的關(guān)鍵因素，通過(guò)使用流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)進(jìn)行比較(圖5至圖8)。在共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)允許視覺(jué)地評(píng)價(jià)胞內(nèi)攝取的同時(shí)，用流式細(xì)胞術(shù)可以定量評(píng)價(jià)融合肽的無(wú)功能貨物重組蛋白的細(xì)胞攝取。分析包括與陰性對(duì)照[rp38]融合的重組蛋白，所述陰性對(duì)照[rp38]具有與amtd(疏水性脂肪族序列)相反的特性(親水性芳香族序列：yynqstcggqcy)。還分析了amtd與陰性對(duì)照的相對(duì)細(xì)胞透性(相對(duì)倍數(shù))(表39和圖9)。

表39顯示了amtd與陰性對(duì)照(a：rp38)的細(xì)胞透性的比較分析。

[表39]

*相對(duì)倍數(shù)(amtd的幾何平均數(shù)與rp38的對(duì)比)

還分析了amtd與參比cpp[b：mtm12(aavllpvllaap)，c：mtd85(avallilav)]的相對(duì)細(xì)胞透性(相對(duì)倍數(shù))(表40和表41)。

表40顯示了amtd與參比cpp(b：mtm12)的細(xì)胞透性的對(duì)比分析。

[表40]

*相對(duì)倍數(shù)(amtd的幾何平均數(shù)與mtm12的對(duì)比)

表41顯示了amtd與參比cpp(c：mtd85)的細(xì)胞透性的對(duì)比分析。

[表41]

*相對(duì)倍數(shù)(amtd的幾何平均數(shù)與mtd85的對(duì)比)

將減去缺少任何肽(rp38或amtd)的裸蛋白(組氨酸標(biāo)記的cra蛋白)的幾何平均數(shù)的陰性對(duì)照(組氨酸標(biāo)記的融合rp38的cra重組蛋白)的幾何平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為相對(duì)倍數(shù)為1。240種amtd與陰性對(duì)照(a類)的相對(duì)細(xì)胞透性顯著增加高達(dá)164倍，平均增加19.6±1.6(表42至表47)。

[表42]

[表43]

[表44]

[表45]

[表46]

此外，與參比cpp(b類：mtm12和c類：mtd85)相比，新的240種amtd的細(xì)胞透性平均分別高13±1.1倍(最大為109.9)和6.6±0.5倍(最大為55.5)(表42至表47)。

[表47]

*相對(duì)倍數(shù)(amtd的幾何平均數(shù)與rp38、mtm12或mtd85的對(duì)比)

此外，將31種r肽的細(xì)胞透性與240種amtd的細(xì)胞透性進(jìn)行了比較(0.3±0.04；表48和表49)。

[表48]

[表49]

*240種amtd中，與a類(rp38)相比amtd的平均相對(duì)倍數(shù)是19.6倍.

總之，amtd的相對(duì)細(xì)胞透性的最大值顯示分別比rp38、mtm12和mtd85的細(xì)胞透性高164.0、109.9和55.5倍.總共240個(gè)amtd序列的平均值中，顯示細(xì)胞透性分別比rp38、mtm12和mtd85的細(xì)胞透性高19.6±1.6、13.1±1.1和6.6±0.5倍(表42至表47).陰性對(duì)照(rp38)相對(duì)于240種amtd的細(xì)胞透性僅為0.3±0.04倍。

4-5.與amtd融合的重組蛋白的胞內(nèi)遞送和定位

通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)，用陰性對(duì)照(rp38)和用之前公布的cpp作為陽(yáng)性對(duì)照參比，測(cè)試與amtd融合的重組蛋白以確定其胞內(nèi)遞送和定位。在37℃下，將nih3t3細(xì)胞暴露于10μm的fitc標(biāo)記的蛋白中1小時(shí)，并用dapi復(fù)染細(xì)胞核。然后，通過(guò)共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞(圖7)。與amtd融合的重組蛋白清楚地顯示了顯著高于參比cpp(mtm12和mtd85)的胞內(nèi)遞送和胞漿定位(圖7)。融合rp38的重組蛋白不顯示內(nèi)化的熒光信號(hào)(圖7a)。此外，如圖8所示，r肽(融合于每種r肽的組蛋白(his)標(biāo)記的cra重組蛋白)顯示更低的或沒(méi)有細(xì)胞透性.

4-6.定量和可視化新開(kāi)發(fā)的amtd的細(xì)胞透性的總結(jié)

融合組氨酸標(biāo)記的amtd的貨物重組蛋白大大提高了它們的溶解度和收率。因此，還測(cè)試了fitc綴合的重組蛋白以定量和可視化蛋白的胞內(nèi)定位，并且證實(shí)了與參比cpp相比更高的細(xì)胞透性。

在之前使用來(lái)源于疏水信號(hào)序列的cpp(即mts/mtm或mtd)的研究中，鑒定并且分析了17種公布的序列的各種特性，如長(zhǎng)度、分子量、pi值、彎曲潛力、剛性、柔性、結(jié)構(gòu)特征、親水性、氨基酸殘基和組成，以及肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。基于序列的這些分析數(shù)據(jù)，發(fā)明了指定為高級(jí)mtd(amtd)的新的人工肽和非天然肽序列，并且用融合amtd的重組蛋白確定了它們?cè)诎麅?nèi)遞送潛力中的功能性活性。

與含有r肽和/或參比cpp(mtm12和mtd85)的重組蛋白相比，融合amtd的重組蛋白促進(jìn)了蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞的能力。根據(jù)結(jié)果，證明了細(xì)胞穿透肽序列的關(guān)鍵因素起到了主要作用，以確定肽通過(guò)穿透質(zhì)膜介導(dǎo)的胞內(nèi)遞送。此外，通過(guò)遵循所有滿足關(guān)鍵因素的原理，可以大大改進(jìn)細(xì)胞透性。

5.amtd在遞送潛力上的結(jié)構(gòu)/序列活性關(guān)系(sar)

在確定新amtd的細(xì)胞透性之后，針對(duì)在選擇的某些新amtd和所有新amtd的每種關(guān)進(jìn)因素分析了結(jié)構(gòu)/序列活性關(guān)系(sar)(圖13至圖16和表50)。

[表50]

5-1.脯氨酸位置：關(guān)于彎曲潛力(脯氨酸位置：pp)，與脯氨酸位置在序列的5′或6′的序列相比，脯氨酸在序列中的7′或8′氨基酸的amtd具有高得多的細(xì)胞透性(圖14a和圖15a)。

5-2.親水性：此外，當(dāng)amtd具有2.1～2.2的gravy(親水性總平均值)時(shí)，這些序列顯示相對(duì)更低的細(xì)胞透性，而具有2.3～2.6gravy的amtd顯示出顯著更高的細(xì)胞透性(圖14b和圖15b).

5-3.r肽sar：對(duì)于amtd的sar，r肽顯示了在細(xì)胞透性中相似的sar相關(guān)性，與它們的脯氨酸位置(pp)和親水性(gravy)相關(guān)。這些結(jié)果證實(shí)了具有高gravy的r肽具有更好的細(xì)胞透性(圖16)。

5-4.氨基酸組成的分析：除了脯氨酸位置和親水性以外，還分析了氨基酸組成的不同。因?yàn)閍mtd是基于關(guān)鍵因素設(shè)計(jì)的，因此每種融合amtd的重組蛋白在組成上具有相同的兩種脯氨酸序列。其他疏水性脂肪族氨基酸(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸)結(jié)合以形成amtd肽序列的剩余部分。

丙氨酸：在氨基酸的組成中，結(jié)果沒(méi)有顯示由于丙氨酸的數(shù)目在amtd遞送潛力方面的顯著不同，因?yàn)樗衋mtd具有3～5個(gè)丙氨酸。然而在序列中，4個(gè)丙氨酸組成顯示最有效的遞送潛力(幾何平均數(shù))(圖13a)。

亮氨酸和異亮氨酸：與此同時(shí)，在amtd序列中的異亮氨酸和亮氨酸的組成顯示氨基酸(i和l)數(shù)目和amtd遞送潛力的反比關(guān)系。序列中更低數(shù)目的異亮氨酸和亮氨酸傾向于具有更高的遞送潛力(幾何平均數(shù))(圖13a和圖13b)。

纈氨酸：相反地，amtd序列的纈氨酸組成顯示與它們的細(xì)胞透性呈正相關(guān)。當(dāng)序列中的纈氨酸數(shù)目低時(shí)，amtd的遞送潛力也相對(duì)地低(圖13b)。

選擇了具有最高的細(xì)胞透性的10種amtd(平均幾何平均數(shù)：2584±126)。序列中纈氨酸的平均數(shù)目是3.5；具有相對(duì)低的細(xì)胞透性(平均幾何平均數(shù)：80±4)的10種amtd平均具有1.9個(gè)纈氨酸氨基酸。序列中纈氨酸的平均數(shù)目降低，同時(shí)它們的細(xì)胞透性也降低，如圖13b所示。與更高細(xì)胞可透過(guò)的amtd組相比，更低的序列的纈氨酸組成平均為1.9。因此，為了獲得高細(xì)胞可透過(guò)序列，序列中應(yīng)該由平均2～4個(gè)纈氨酸組成。

5-5.sar分析的結(jié)論：如圖15所見(jiàn)，檢測(cè)了所有240種amtd的細(xì)胞透性與關(guān)鍵因素：彎曲潛力(pp)、剛性/柔性(ii)、結(jié)構(gòu)特征(ai)和親水性(gravy)、氨基酸長(zhǎng)度和組成的相關(guān)性。通過(guò)該分析，當(dāng)amtd的中部脯氨酸位置在5′或6′處，以及gravy為2.1或更低時(shí)，amtd的細(xì)胞透性傾向于更低(圖15)。此外，在研究10種更高的細(xì)胞可透過(guò)amtd和10種更低的細(xì)胞可透過(guò)amtd后，這些趨勢(shì)清晰地顯示為證實(shí)了細(xì)胞透性與中部脯氨酸位置和親水性的相關(guān)性。

6.關(guān)鍵因素的指數(shù)范圍/特征的實(shí)驗(yàn)性證實(shí)

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和sar分析之前，經(jīng)驗(yàn)性地和實(shí)驗(yàn)性地確定6種關(guān)鍵因素中的5種的范圍和特征也被包括在最初提出的關(guān)鍵因素的指數(shù)范圍和特征中。在新開(kāi)發(fā)的240種amtd的關(guān)鍵因素的指數(shù)范圍和特征方面，彎曲潛力(脯氨酸位置：pp)、剛性/柔性(不穩(wěn)定指數(shù)：ii)、結(jié)構(gòu)特征(脂肪族指數(shù)：ai)、親水性(gravy)、氨基酸長(zhǎng)度和組成均在來(lái)源于對(duì)參比疏水cpp分析的關(guān)鍵因素的特性中。

因此，經(jīng)驗(yàn)性和實(shí)驗(yàn)性地證實(shí)了我們對(duì)設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)新疏水cpp序列為高級(jí)mtd的假設(shè)，并證明了基于關(guān)鍵因素的新amtd原理設(shè)計(jì)是正確的。

[表51]

7.本發(fā)明的總結(jié)

對(duì)于本發(fā)明，基于關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)了240種amtd序列。實(shí)際地確定了所有240種amtd(疏水性、柔性、彎曲、脂肪族和12個(gè)a/a長(zhǎng)度的肽)的定量和可視化的細(xì)胞透性。

為了測(cè)量amtd的細(xì)胞透性，還設(shè)計(jì)并測(cè)試了r肽。如圖13至圖15所見(jiàn)，存在肽的細(xì)胞透性和關(guān)鍵因素的顯著相關(guān)性。從這些關(guān)鍵因素中，我們能夠設(shè)置最有效的細(xì)胞可透過(guò)amtd，其具有12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度；a、v、l、i和p的組成；位于7′或8′和末端(12′)的多個(gè)脯氨酸；41.3～57.3的不穩(wěn)定指數(shù)；187.5～220.0的脂肪族指數(shù)；以及2.2～2.6的親水性(gravy)。

這些檢測(cè)的關(guān)鍵因素在我們?yōu)殛P(guān)鍵因素設(shè)置的范圍內(nèi)，因此我們能夠證實(shí)，與在在過(guò)去的20年間報(bào)道的參比疏水cpp相比，滿足這些關(guān)鍵因素的amtd具有相對(duì)高的細(xì)胞透性和高得多的胞內(nèi)遞送潛力。

8.用通過(guò)amtd實(shí)現(xiàn)的mitt發(fā)現(xiàn)與開(kāi)發(fā)基于蛋白的新生物治療劑用于蛋白治療

廣泛明顯的是許多人類疾病是由導(dǎo)致突變?nèi)绻δ塬@得或功能缺失的缺乏或過(guò)表達(dá)的蛋白導(dǎo)致的。如果在短時(shí)間內(nèi)(可能在1或2小時(shí)內(nèi))可以通過(guò)定量方式遞送生物活性蛋白以替換異常蛋白，那么根據(jù)可能需要蛋白的時(shí)間和方式可以調(diào)節(jié)劑量。本發(fā)明中通過(guò)顯著改進(jìn)新amtd的溶解度和收率(表47)，可以預(yù)期它作為將治療性大分子(如蛋白、肽、核酸和其他化學(xué)化合物)有效遞送至活細(xì)胞以及活哺乳動(dòng)物(包括人)的試劑的實(shí)際潛力。因此，在確定最佳的貨物-amtd關(guān)系之后，利用新amtd池(240種)的新開(kāi)發(fā)的mitt可以用作平臺(tái)技術(shù)，用于發(fā)現(xiàn)與開(kāi)發(fā)基于蛋白的生物治療劑，以獲得胞內(nèi)蛋白治療。

實(shí)施例

提供以下實(shí)施例來(lái)幫助本發(fā)明的實(shí)踐者，以提供對(duì)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)性支持，以及提供模型方案。決不能將這些實(shí)施例理解為限制本發(fā)明.

實(shí)施例1.新的高級(jí)大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)域(amtd)的開(kāi)發(fā)

來(lái)源于信號(hào)序列的h區(qū)(hrsp)的cpp(mts/mtm和mtd)不具有共同序列、序列基序和/或共同結(jié)構(gòu)的同源特征。在本發(fā)明中，目標(biāo)是開(kāi)發(fā)改進(jìn)的疏水cpp，所述疏水cpp以滿足新確定的“關(guān)鍵因素”的共同序列和結(jié)構(gòu)基序格式化為具有“共同功能”，以促進(jìn)蛋白以與分析的cpp相似的機(jī)制轉(zhuǎn)移穿過(guò)質(zhì)膜。

結(jié)構(gòu)基序如下：

在這里，x是指丙氨酸(a)、纈氨酸(v)、亮氨酸(l)或異亮氨酸(i)；脯氨酸(p)可以位于u中的一個(gè)處(5′、6′、7′或8′)。剩余的u由a、v、l或i組成，在12′處的p是脯氨酸。

在表9中，如下提供了通用的共同序列/結(jié)構(gòu)基序。本發(fā)明中的肽的氨基酸長(zhǎng)度為9～13個(gè)氨基酸，大多數(shù)是12個(gè)氨基酸，并且它們的彎曲潛力依賴于用于重組蛋白彎曲的脯氨酸在序列的中部(5′、6′、7′或8′氨基酸)和肽的末端(12′)的存在和定位。針對(duì)amtd的剛性/柔性的不穩(wěn)定指數(shù)為ii＜40，針對(duì)親水性的親水性總平均值(gravy)為約2.2，針對(duì)結(jié)構(gòu)特征的脂肪族指數(shù)(ai)為約200(表9)?；谶@些標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵因素，開(kāi)發(fā)了本發(fā)明中的新的疏水肽序列(稱為高級(jí)大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)域肽(amtd))，并總結(jié)于表10至表15中。

實(shí)施例2.用于與amtd融合的重組蛋白的表達(dá)載體的構(gòu)建

我們新開(kāi)發(fā)的技術(shù)使我們能夠擴(kuò)展用于制備細(xì)胞可透過(guò)重組蛋白的方法。設(shè)計(jì)表達(dá)載體用于與amtd或r肽融合的組氨酸標(biāo)記的cra蛋白.為了構(gòu)建用于重組蛋白的表達(dá)載體，設(shè)計(jì)了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)以擴(kuò)增每種設(shè)計(jì)的與cra融合的amtd或r肽。

將pcr反應(yīng)物(100ng基因組dna、10pmol每種引物、0.2mmdntp混合物、1×反應(yīng)緩沖液和2.5upfu(+)dna聚合酶(doctorprotein，korea))在ndei(5′)和sali(3′)之間的限制性酶切位點(diǎn)消化，該pcr反應(yīng)包括變性(95℃)、退火(62℃)和延伸(72℃)各30秒，共35個(gè)循環(huán)。對(duì)于最后一個(gè)延伸循環(huán)，pcr反應(yīng)物在72℃下保持5分鐘。然后，將它們克隆在pet-28a(+)載體(novagen，madison，wi，usa)的位點(diǎn)上。使用t4dna連接酶在4℃下過(guò)夜進(jìn)行dna連接。將這些質(zhì)粒與大腸桿菌dh5α株的感受態(tài)細(xì)胞于冰上混合10分鐘。在42℃的水浴中熱激混合物90秒后，將該混合物置于冰上2分鐘.然后將添加了lb肉湯培養(yǎng)基的混合物在37℃振蕩培養(yǎng)箱中復(fù)蘇1小時(shí)。將轉(zhuǎn)化體鋪于含卡那霉素(50μg/ml)(biopure，johnson，tn)的lb肉湯瓊脂平板上之后，在37℃下溫育過(guò)夜。從單個(gè)菌落中，提取質(zhì)粒dna，在用ndei和sali限制性酶消化后，通過(guò)使用1.2％瓊脂糖凝膠電泳在645bp處證實(shí)消化的質(zhì)粒dna(圖2)。表23至表30中總結(jié)了與amtd和隨機(jī)肽(r肽)融合的cra重組蛋白的pcr引物。表31至表38中顯示了amtd和r肽引物的氨基酸序列。

實(shí)施例3.與amtd和r肽融合的重組蛋白的誘導(dǎo)型表達(dá)、純化和制備

為了表達(dá)重組蛋白，在大腸桿菌bl21(de3)株中轉(zhuǎn)化用于表達(dá)與陰性對(duì)照[r肽38(rp38)]、參比疏水cpp(mtm12和mtd85)和amtd融合的cra蛋白的pet-28a(+)載體。細(xì)胞在含有卡那霉素(50μg/ml)的lb培養(yǎng)基中于37℃下，在強(qiáng)烈振蕩下生長(zhǎng)，在od600＝0.6時(shí)通過(guò)添加0.7mmiptg(biopure)在37℃下誘導(dǎo)該細(xì)胞2小時(shí)。將誘導(dǎo)的重組蛋白加樣于15％sds-page凝膠上并且用考馬斯亮蘭(instantblue，expedeon，novexin，uk)染色(圖3).

通過(guò)在5000×rpm下離心10分鐘收獲大腸桿菌培養(yǎng)物，并且丟棄上清。將沉淀物重懸于裂解緩沖液(50mmnah2po4，10mm咪唑，300mmnacl，ph8.0)中。使用配備有探頭的超聲波儀(sonicsandmaterials，inc.，newtowen，ct)在冰上對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行超聲處理.在5000×rpm下將細(xì)胞裂解物離心10分鐘以沉淀細(xì)胞碎片后，用裂解緩沖液平衡的ni-nta樹(shù)脂(qiagen，hilden，germany)輕柔地通過(guò)空心柱系統(tǒng)(bio-rad，hercules，ca)溫育上清。在用200ml洗滌緩沖液(50mmnah2po4，20mm咪唑，300mmnacl，ph8.0)洗滌結(jié)合蛋白的樹(shù)脂之后，用洗脫緩沖液(50mmnah2po4，250mm咪唑，300mmnacl，ph8.0)洗脫結(jié)合的蛋白。

在15％sds-page凝膠上分析在自然條件下純化的重組蛋白，并且用考馬斯亮蘭將所述重組蛋白染色(圖4)。將所有重組蛋白對(duì)生理緩沖液透析8小時(shí)以及過(guò)夜，所述生理緩沖液是細(xì)胞培養(yǎng)基(杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco′smodifiedeagle′smedium)：dmem，hyclone，logan，ut)和杜氏磷酸鹽緩沖鹽水(dulbecco′sphosphatebufferedsaline)(dpbs，gibco，grandisland，ny)的1∶1混合物。由克隆的316種amtd和141種r肽，誘導(dǎo)、純化和制備了240種融合amtd的重組蛋白和31種融合r肽的重組蛋白，并且分析了這些重組蛋白的細(xì)胞透性。

實(shí)施例4.重組蛋白的定量細(xì)胞透性的確定

為了定量細(xì)胞透性，根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)(sigma-aldrich，st.louis，mo)，使融合amtd的重組蛋白或融合r肽的重組蛋白綴合于異硫氰酸熒光素(fitc)。將raw264.7細(xì)胞用10μmfitc標(biāo)記的重組蛋白在37℃下處理1小時(shí)，用冷pbs洗滌三次，用0.25％胰蛋白酶/edta(sigma-aldrich，st.louis，mo)在37℃下處理20分鐘以移除細(xì)胞表面結(jié)合蛋白。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(guava，millipore，darmstadt，germany)使用flowjo細(xì)胞計(jì)數(shù)分析軟件分析這些重組蛋白的細(xì)胞透性(圖5至圖6)。測(cè)量amtd的相對(duì)細(xì)胞透性，并且與陰性對(duì)照(rp38)和參比疏水cpp(mtm12和mtd85)比較(表47)。

實(shí)施例5.重組蛋白的細(xì)胞透性和胞內(nèi)定位的確定

對(duì)于細(xì)胞透性的可視化參比，在24孔室載玻片中蓋上蓋玻片培養(yǎng)nih3t3細(xì)胞24小時(shí)，用10μmfitc綴合的重組蛋白在37℃下處理，并且用冷pbs洗滌三次。將處理過(guò)的細(xì)胞用4％多聚甲醛(pfa，junsei，tokyo，japan)在室溫下固定10分鐘，用pbs洗滌三次，并且用vectashield封固介質(zhì)(vectorlaboratories，burlingame，ca)封固，并且用dapi(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)復(fù)染。通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)確定熒光信號(hào)的胞內(nèi)定位(lsm700，zeiss，germany；圖7和圖8)。