本發(fā)明涉及實(shí)施了可以工業(yè)化生產(chǎn)莽草酸那樣的操作的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體、及使用該棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的高效的有機(jī)化合物的制造方法。
背景技術(shù)：
：：莽草酸是分子內(nèi)具有3個(gè)不對(duì)稱碳的光學(xué)活性體，被用作多種藥品、農(nóng)藥、化妝品等的合成原料，特別是，被用作用于化學(xué)合成流感治療藥達(dá)菲(注冊(cè)商標(biāo))的重要起始原料。近年，由于達(dá)菲對(duì)可能在全世界流行的禽流感顯示出有效性，因此作為原料的莽草酸的需求在增加。此外莽草酸可以通過(guò)化學(xué)方法轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)羥基苯甲酸、苯酚等有用的化學(xué)物質(zhì)，還有望作為這些的合成原料。以往，莽草酸通過(guò)從莽草(Illiciumanisatum)、八角(Illiciumverum)等植物的果實(shí)提取而得到，其提取、純化方法繁雜，收率低，另外原料為天然物，因此存在難以穩(wěn)定供給、大量供給的問(wèn)題。另一方面，莽草酸是細(xì)菌、酵母、植物等所具有的芳香族化合物生物合成途徑的重要中間體，可以使用具有該途徑的微生物通過(guò)發(fā)酵法來(lái)生產(chǎn)。目前，已經(jīng)報(bào)道了利用大腸桿菌宿主生產(chǎn)莽草酸(專利文獻(xiàn)1～7)，生成莽草酸的同時(shí)還副生成奎寧酸，其成為妨礙莽草酸純化的主要因素。另外，由于均隨著有氧增殖而生產(chǎn)莽草酸，因此作為原料的葡萄糖大多被用于菌體形成(增殖)，存在作為目標(biāo)物的莽草酸的收率低的問(wèn)題。例如，專利文獻(xiàn)4、6中記載的莽草酸收率為27％，非常低。專利文獻(xiàn)1中記載，來(lái)自葡萄糖的莽草酸的最大收率為43％，但該最大收率并未考慮由丙酮酸再生磷酸烯醇丙酮酸、通過(guò)非磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的葡萄糖攝取等的可能性等，因此認(rèn)為莽草酸的最大理論收率實(shí)際上為86％。由此，上述27％這樣的莽草酸相對(duì)于糖的收率相對(duì)于理論收率為31％這樣的低收率。專利文獻(xiàn)8報(bào)道了：使用弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)，用對(duì)作為4-羥基苯甲酸類似物的4-羥基3-甲氧基苯甲酸具有耐性的突變株生產(chǎn)莽草酸，但突變點(diǎn)未知，莽草酸的生產(chǎn)濃度也低，相對(duì)于糖的收率也未知。專利文獻(xiàn)9、10報(bào)道了使用枯草桿菌(Bacillussubtilis)的芳香族氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株生產(chǎn)莽草酸，但突變點(diǎn)未知，莽草酸的生產(chǎn)濃度也低，相對(duì)于糖的收率也未知?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1：日本專利4669613生物學(xué)的觸媒によゐシキミ酸の合成專利文獻(xiàn)2：日本特表2002-535008生物學(xué)的觸媒によゐシキミ酸の合成專利文獻(xiàn)3：US6613552Biocatalyticsynthesisofshikimicacid專利文獻(xiàn)4：US6472169Biocatalyticsynthesisofshikimicacid專利文獻(xiàn)5：EP1151126Biocatalyticsynthesisofshikimicacid專利文獻(xiàn)6：WO02/29078Biocatalyticsynthesisofshikimicacid專利文獻(xiàn)7：WO2000/044923Biocatalyticsynthesisofshikimicacid專利文獻(xiàn)8：日本特開(kāi)2002-281993シキミ酸の製造方法專利文獻(xiàn)9：US6436664Methodforproducingshikimicacid專利文獻(xiàn)10：日本特開(kāi)2000-287695シキミ酸製造法非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1：BiotechnologyProgress(2003)19，808-814非專利文獻(xiàn)2：MicrobialCellFactories(2013)12：86技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明所要解決的問(wèn)題本發(fā)明的課題在于，提供一種可以以糖類為原料高效生產(chǎn)莽草酸的微生物、及使用該微生物高效制造莽草酸等有機(jī)化合物的方法。用于解決問(wèn)題的方法為了解決上述課題，本發(fā)明人們反復(fù)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)棒狀細(xì)菌實(shí)施以下的(A)～(D)的操作，從而由葡萄糖等以高濃度且高收率生成莽草酸。另外，還發(fā)現(xiàn)在莽草酸生產(chǎn)中一直成為問(wèn)題的奎寧酸的副生成非常少。(A)3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶活性的強(qiáng)化(B)磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)介導(dǎo)的糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取的消失、阻遏、或減少(C)與磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)不同的糖轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取活性、及葡萄糖激酶活性的強(qiáng)化(D)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)活性的強(qiáng)化另外發(fā)現(xiàn)，該棒狀細(xì)菌在有氧且實(shí)質(zhì)上不增殖的條件下反應(yīng)時(shí)，莽草酸的生產(chǎn)效率特別高。本發(fā)明是基于上述見(jiàn)解而完成的，提供以下的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體及有機(jī)化合物的制造方法。項(xiàng)1.一種棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，實(shí)施了下述的(A)、(B)、(C)、及(D)的操作而得：(A)3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶活性的強(qiáng)化，(B)磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)介導(dǎo)的糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取的消失、阻遏、或減少，(C)與磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)不同的糖轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取活性、及葡萄糖激酶活性的強(qiáng)化，(D)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)活性的強(qiáng)化。項(xiàng)2.根據(jù)項(xiàng)1所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其中，二羥丙酮磷酸的磷酸酶活性消失、阻遏或減少。項(xiàng)3.根據(jù)項(xiàng)1或2所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其中，3-脫氫奎寧酸合成酶活性、3-脫氫奎寧酸脫水酶活性、及莽草酸脫氫酶活性中的任意一種以上得到強(qiáng)化。項(xiàng)4.根據(jù)項(xiàng)1～3中任一項(xiàng)所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其中，轉(zhuǎn)酮醇酶活性、及轉(zhuǎn)醛醇酶活性中的任意一種以上得到強(qiáng)化。項(xiàng)5.根據(jù)項(xiàng)1～4中任一項(xiàng)所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其中，莽草酸激酶活性、奎寧酸/莽草酸脫氫酶活性、及3-脫氫莽草酸脫水酶活性中的任意一種以上消失、阻遏或減少。項(xiàng)6.根據(jù)項(xiàng)1～5中任一項(xiàng)所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其具有葡萄糖和選自由木糖、阿拉伯糖及纖維二糖組成的組中的至少1種糖的利用能力。項(xiàng)7.根據(jù)項(xiàng)1～6中任一項(xiàng)所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其中，通過(guò)導(dǎo)入下述的(a)或(b)的DNA，3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶活性得到強(qiáng)化，(a)由序列號(hào)1中記載的堿基序列組成的DNA，(b)由與序列號(hào)1具有90％以上的同一性的堿基序列組成的、編碼3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的DNA。項(xiàng)8.根據(jù)項(xiàng)1～7中任一項(xiàng)所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其中，通過(guò)使編碼磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)的構(gòu)成因子的基因中、編碼組氨酸-可磷酸化蛋白(Histidine-phosphorylatableprotein：HPr)的ptsH、編碼酶I(EnzymeI)的ptsI、及編碼葡萄糖特異性酶II(EnzymeII)的ptsG基因中的一種以上破壞、缺失、或突變，從而PTS介導(dǎo)的糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取消失、阻遏、或減少。項(xiàng)9.根據(jù)項(xiàng)1～8中任一項(xiàng)所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其中，與PTS不同的糖轉(zhuǎn)運(yùn)體為肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)體。項(xiàng)10.根據(jù)項(xiàng)9所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其中，通過(guò)導(dǎo)入下述的(c)或(d)的DNA，肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取活性得到強(qiáng)化，(c)由序列號(hào)2中記載的堿基序列組成的DNA，(d)由與序列號(hào)2具有90％以上的同一性的堿基序列組成的、編碼肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)體的DNA。項(xiàng)11.根據(jù)項(xiàng)1～10中任一項(xiàng)所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其中，通過(guò)導(dǎo)入下述的(e)或(f)的DNA，葡萄糖激酶活性得到強(qiáng)化，(e)由序列號(hào)3、4、或5中記載的堿基序列組成的DNA，(f)由與序列號(hào)3、4、或5具有90％以上的同一性的堿基序列組成的、編碼葡萄糖激酶的DNA。項(xiàng)12.根據(jù)項(xiàng)1～11中任一項(xiàng)所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其中，通過(guò)導(dǎo)入下述的(g)或(h)的DNA，甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性得到強(qiáng)化，(g)由序列號(hào)6中記載的堿基序列組成的DNA，(h)由與序列號(hào)6具有90％以上的同一性的堿基序列組成的、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的DNA。項(xiàng)13.根據(jù)項(xiàng)3～12中任一項(xiàng)所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其中，3-脫氫奎寧酸合成酶活性的強(qiáng)化是通過(guò)下述的(i)或(j)的DNA的導(dǎo)入而實(shí)現(xiàn)的，3-脫氫奎寧酸脫水酶活性的強(qiáng)化是通過(guò)下述的(k)或(l)的DNA的導(dǎo)入而實(shí)現(xiàn)的，莽草酸脫氫酶活性的強(qiáng)化是通過(guò)下述的(m)或(n)的DNA的導(dǎo)入而實(shí)現(xiàn)的，(i)由序列號(hào)7中記載的堿基序列組成的DNA，(j)由與序列號(hào)7具有90％以上的同一性的堿基序列組成的、編碼3-脫氫奎寧酸合成酶的DNA，(k)由序列號(hào)8中記載的堿基序列組成的DNA，(l)由與序列號(hào)8具有90％以上的同一性的堿基序列組成的、編碼3-脫氫奎寧酸脫水酶的DNA，(m)由序列號(hào)9中記載的堿基序列組成的DNA，(n)由與序列號(hào)9具有90％以上的同一性的堿基序列組成的、編碼莽草酸脫氫酶的DNA。項(xiàng)14.根據(jù)項(xiàng)4～13中任一項(xiàng)所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其中，轉(zhuǎn)酮醇酶活性的強(qiáng)化是通過(guò)下述的(o)或(p)的DNA的導(dǎo)入而實(shí)現(xiàn)的，轉(zhuǎn)醛醇酶活性的強(qiáng)化是通過(guò)下述的(q)或(r)的DNA的導(dǎo)入而實(shí)現(xiàn)的，(o)由序列號(hào)10中記載的堿基序列組成的DNA，(p)由與序列號(hào)10具有90％以上的同一性的堿基序列組成的、編碼轉(zhuǎn)酮醇酶的DNA，(q)由序列號(hào)11中記載的堿基序列組成的DNA，(r)由與序列號(hào)11具有90％以上的同一性的堿基序列組成的、編碼轉(zhuǎn)醛醇酶的DNA。項(xiàng)15.根據(jù)項(xiàng)1～14中任一項(xiàng)所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其中，棒狀細(xì)菌為谷氨酸棒狀桿菌。項(xiàng)16.根據(jù)項(xiàng)15所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體，其中，對(duì)谷氨酸棒狀桿菌R(FERMBP-18976)、ATCC13032、或ATCC13869實(shí)施了上述操作。項(xiàng)17.谷氨酸棒狀桿菌SKM7(保藏編號(hào)：NITEBP-01903)。項(xiàng)18.一種有機(jī)化合物的制造方法，其含有下述工序：在含有糖類的反應(yīng)液中培養(yǎng)項(xiàng)1～17中任一項(xiàng)所述的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的工序，以及回收反應(yīng)液中的選自由莽草酸、3-脫氫莽草酸、3-脫氫奎寧酸、原兒茶酸、分支酸、沒(méi)食子酸(gallicacid)、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、鄰氨基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)氨基苯甲酸、苯酚、及鄰苯二酚組成的組中的至少1種有機(jī)化合物的工序。項(xiàng)19.根據(jù)項(xiàng)18中記載的方法，其中，在有氧且棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體不增殖的條件下培養(yǎng)棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體。發(fā)明效果通過(guò)使用對(duì)棒狀細(xì)菌實(shí)施上述特定操作而得到的轉(zhuǎn)化體，可以由葡萄糖等糖類以高濃度且高收率制造莽草酸。另外，由于在以往莽草酸純化時(shí)分離成為問(wèn)題的奎寧酸的副生成得以抑制，因此莽草酸的純化容易進(jìn)行。另外，該棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體也高效地生產(chǎn)由莽草酸代謝生成的有機(jī)化合物、由糖到莽草酸的代謝途徑中存在的化合物。進(jìn)而，就該棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體而言，通過(guò)在增殖抑制條件下且進(jìn)行有氧反應(yīng)，包括莽草酸在內(nèi)的有機(jī)化合物的生產(chǎn)效率進(jìn)一步提高。因此，通過(guò)本發(fā)明，能夠廉價(jià)、大量地生產(chǎn)作為抗流感藥的原料有用的莽草酸等。本發(fā)明中，從莽草酸生產(chǎn)效率的觀點(diǎn)出發(fā)，重要的是使用棒狀細(xì)菌作為宿主及通過(guò)人工操作將特定的基因組合。作為棒狀細(xì)菌的其它優(yōu)點(diǎn)，可以列舉：棒狀細(xì)菌與大腸桿菌不同，不生成內(nèi)毒素；在限制增殖條件下也發(fā)生反應(yīng)，因此無(wú)需在培養(yǎng)液中添加大腸桿菌的增殖通常需要的芳香族氨基酸、4-氨基苯甲酸、4-羥基苯甲酸等；在限制增殖條件下發(fā)生莽草酸生成反應(yīng)，因此糖不用于增殖而是用于目標(biāo)物質(zhì)的生產(chǎn)，從而收率高。附圖說(shuō)明圖1為示出棒狀細(xì)菌中的從糖的攝取至莽草酸等的生產(chǎn)的代謝途徑的圖。具體實(shí)施方式以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。為了使本發(fā)明易于理解，圖1中示意性示出棒狀細(xì)菌中的從糖的攝取至莽草酸等的生產(chǎn)的代謝途徑。(1)莽草酸生產(chǎn)能力得以提高的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體本發(fā)明的莽草酸生產(chǎn)能力得以提高的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體是實(shí)施了下述的(A)、(B)、(C)、及(D)的操作的轉(zhuǎn)化體：(A)3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶活性的強(qiáng)化，(B)磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)介導(dǎo)的糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取的消失、阻遏或減少，(C)與PTS不同的糖轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取活性、及葡萄糖激酶活性的強(qiáng)化，(D)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)活性的強(qiáng)化。DAHP合成酶活性的強(qiáng)化3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶是由赤蘚糖-4-磷酸(E4P)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)來(lái)生成作為芳香族化合物生物合成的共同途徑的初始代謝產(chǎn)物DAHP的酶。DAHP合成酶活性可以通過(guò)下述方式而強(qiáng)化：通過(guò)導(dǎo)入DAHP合成酶基因、或在棒狀細(xì)菌的染色體上的DAHP合成酶基因的調(diào)控序列及基因編碼區(qū)域中導(dǎo)入突變、或者進(jìn)行序列置換，從而使該基因表達(dá)量增加或使該基因產(chǎn)物的活性增大。其中，通過(guò)導(dǎo)入DAHP合成酶基因而強(qiáng)化DAHP合成酶活性的方式簡(jiǎn)便、效率高。對(duì)所導(dǎo)入的DAHP合成酶基因的來(lái)源沒(méi)有特別限定，從莽草酸生產(chǎn)效率高的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選來(lái)自大腸桿菌(Eschelichiacoli)的基因。作為來(lái)自大腸桿菌的DAHP合成酶基因，更優(yōu)選由序列號(hào)1的堿基序列組成的DNA(aroGS180F)。本發(fā)明人們通過(guò)比較研究發(fā)現(xiàn)，該基因?yàn)樵趤?lái)自大腸桿菌的作為DAHP合成酶基因之一的aroG基因中導(dǎo)入有使該基因所編碼的氨基酸序列的第180位的絲氨酸突變?yōu)楸奖彼岬耐蛔?S180F)的基因，其基因產(chǎn)物對(duì)包括芳香族氨基酸在內(nèi)的芳香族化合物的反饋抑制顯示出耐性，并且顯示出高DAHP合成酶活性(未發(fā)表)。另外，本發(fā)明中還可以使用如下DNA：由與序列號(hào)1具有90％以上、尤其是95％以上、尤其是98％以上的同一性的堿基序列組成、編碼具有DAHP合成酶活性的多肽的DNA。本發(fā)明中，堿基序列的同一性是通過(guò)GENETYXver.8(GENETYX株式會(huì)社ゼネテイツクス制)算出的值。另外，本發(fā)明中還可以使用如下DNA：與由序列號(hào)1的互補(bǔ)堿基序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有DAHP合成酶活性的多肽的DNA。本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指：在6×SSC的鹽濃度的雜交溶液中、在50～60℃的溫度條件下雜交16小時(shí)且在鹽濃度0.1×SSC的溶液中進(jìn)行洗滌的條件。本發(fā)明中，DNA所編碼的蛋白質(zhì)為DAHP合成酶這一點(diǎn)可如下確認(rèn)：對(duì)該DNA所編碼的蛋白質(zhì)，測(cè)定DAHP合成酶活性。就DAHP合成酶活性而言，制備在含有20mMBis-Tris丙烷緩沖液(pH6.8)、500μM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)鈉、500μM赤蘚糖-4-磷酸、1mM氯化錳的試驗(yàn)用液中添加有受試酶的反應(yīng)液，測(cè)定表示PEP的吸收(＝2800/M·cm)的232nm的吸光度的減少作為指標(biāo)。將28℃下、1分鐘內(nèi)生成1μmol的DAHP的活性作為1單位的DAHP合成酶活性。另外，本發(fā)明中，棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的DAHP合成酶活性得到強(qiáng)化這一點(diǎn)通過(guò)測(cè)定棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞提取液中的DAHP合成酶活性來(lái)確認(rèn)。PTS介導(dǎo)的糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取的消失/阻遏/減少磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)為僅存在于原核生物中的糖輸送機(jī)制，其特征在于，使葡萄糖等糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取和糖的磷酸化偶聯(lián)進(jìn)行。在大腸桿菌、棒狀細(xì)菌中，PTS在糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取中發(fā)揮著主要作用。PTS由作為通用組件的酶I(EnzymeI)(PEPProteinkinase，PEP蛋白激酶)、HPr(Histidine-phosphorylatableprotein；組氨酸-可磷酸化蛋白)、及作為與各種糖的特異性輸送相關(guān)的膜蛋白的酶II(EnzymeII)構(gòu)成，是以來(lái)自糖酵解的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)為磷酸供體、通過(guò)這些構(gòu)成因子間的磷酸傳遞而將糖以磷酸化體形式向細(xì)胞內(nèi)輸送的系統(tǒng)。但是，就PTS而言，隨著葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)的輸送，消耗作為包括莽草酸在內(nèi)的芳香族化合物的共同前體之一的PEP。因此，為了高效生產(chǎn)莽草酸等芳香族化合物，優(yōu)選利用不消耗PEP的與PTS不同的葡萄糖輸送體系。通過(guò)棒狀細(xì)菌的染色體上的編碼PTS的基因的破壞、缺失、或突變，可以使PTS介導(dǎo)的糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取消失、阻遏、或減少。編碼酶I的基因、編碼Hpr的基因、及編碼酶II的基因中的1個(gè)以上破壞、缺失、或突變即可，優(yōu)選編碼作為PTS的通用組件的Hpr蛋白的基因被破壞、缺失、或突變。作為編碼與葡萄糖輸送相關(guān)的PTS的基因，可以列舉：編碼酶I的ptsI、編碼Hpr的ptsH、編碼酶II的ptsG等。這些中的1個(gè)以上破壞、缺失、或突變即可，優(yōu)選編碼作為PTS的通用組件的Hpr蛋白質(zhì)的ptsH基因被破壞、缺失、或突變。按照使基因的部分序列缺失從而不產(chǎn)生功能正常的蛋白質(zhì)方式制作改變了的缺失型基因，用含有該基因的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌，在缺失型基因和染色體上的基因間引起同源重組，從而可以將染色體上的基因置換為缺失型或破壞型的基因。即使生成由缺失型或破壞型的基因編碼的蛋白質(zhì)，也具有與野生型蛋白質(zhì)不同的立體結(jié)構(gòu)，功能下降或消失。這種利用同源重組的基因置換來(lái)進(jìn)行基因缺失或破壞的方法已經(jīng)建立，包括使用含有溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒、能進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒的方法，利用在宿主內(nèi)不具有復(fù)制起點(diǎn)的自殺載體的方法等(美國(guó)專利第6303383號(hào)、日本特開(kāi)平05-007491號(hào))。本發(fā)明中，棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的PTS介導(dǎo)的糖的輸送活性消失、阻遏、或減少這一點(diǎn)可以如下確認(rèn)：對(duì)于該轉(zhuǎn)化體而言，以通過(guò)PTS輸送的糖(葡萄糖、蔗糖、果糖等)為碳源的生長(zhǎng)消失、阻遏、或被抑制，且這種表型通過(guò)導(dǎo)入正常的pts基因而恢復(fù)。與PTS不同的糖輸送體系介導(dǎo)的糖攝取活性的強(qiáng)化已知在谷氨酸棒狀桿菌中存在與PTS不同的葡萄糖輸送體系(非PTS葡萄糖通透酶)，其在糖的攝取中不消耗PEP。通過(guò)破壞pts基因等阻遏了由PTS介導(dǎo)的糖攝取的谷氨酸棒狀桿菌無(wú)法以葡萄糖為單一碳源進(jìn)行增殖、或增殖能力顯著降低，但使該菌株高表達(dá)非PTS葡萄糖通透酶時(shí)，以葡萄糖為單一碳源的增殖會(huì)恢復(fù)(Ikeda，M.，etal.，IdentificationandapplicationofadifferentglucoseuptakesystemthatfunctionsasanalternativetothephosphotransferasesysteminCorynebacteriumglutamicum.Appl.Microbiol.Biotechnol.90：1443-1451，Lindner，S.N.，etal.，Phosphotransferasesystem-independentglucoseutilizationinCorynebacteriumglutamicumbyinositolpermeasesandglucokinases.Appl.Environ.Microbiol.77：3571-3581)。本發(fā)明中優(yōu)選的是，對(duì)于阻斷了基于PTS的糖輸送的谷氨酸棒狀桿菌而言，通過(guò)強(qiáng)化不會(huì)隨著糖輸送而消耗PEP的非PTS葡萄糖通透酶活性，來(lái)改善葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取及以葡萄糖為碳源的菌增殖。認(rèn)為由此能夠避免與葡萄糖的輸送相伴的PEP消耗，使更多的PEP供于莽草酸等芳香族化合物的生物合成。基于非PTS葡萄糖通透酶的葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取可以通過(guò)下述方式而強(qiáng)化：通過(guò)導(dǎo)入編碼非PTS葡萄糖通透酶的基因、或在棒狀細(xì)菌的染色體上的非PTS葡萄糖通透酶基因(調(diào)控序列或編碼區(qū)域)中導(dǎo)入突變、或者進(jìn)行堿基序列置換，使該基因表達(dá)量增加或使該基因產(chǎn)物的活性增大。其中，通過(guò)導(dǎo)入非PTS葡萄糖通透酶基因而強(qiáng)化葡萄糖的攝取活性的方式簡(jiǎn)便、效率高。對(duì)所導(dǎo)入的非PTS葡萄糖通透酶基因的來(lái)源沒(méi)有特別限定，從莽草酸生產(chǎn)效率高的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選棒狀桿菌屬細(xì)菌，尤其優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌。非PTS葡萄糖通透酶只要在棒狀細(xì)菌內(nèi)發(fā)揮功能即可，可以列舉：來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)體(iolT1、iolT2)、來(lái)自大腸桿菌(Escherichiacoli)的半乳糖通透酶(galP)、來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的葡萄糖易化體蛋白(glf)等。其中，從莽草酸生產(chǎn)效率好的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選強(qiáng)化來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的糖攝取活性。作為來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，可以列舉由序列號(hào)2的堿基序列組成的DNA(iolT1)。另外，本發(fā)明中還可以使用如下DNA：由與序列號(hào)2具有90％以上、尤其是95％以上、尤其是98％以上的同一性的堿基序列組成的、編碼具有肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的多肽的DNA。另外，本發(fā)明中還可以使用如下DNA：與由序列號(hào)2的互補(bǔ)堿基序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的多肽的DNA。本發(fā)明中，DNA所編碼的蛋白質(zhì)為非PTS葡萄糖通透酶這一點(diǎn)可以以下述指標(biāo)來(lái)確認(rèn)：對(duì)于由于ptsH基因破壞等而喪失PTS依賴性葡萄糖輸送能力、以葡萄糖為碳源的生長(zhǎng)下降的宿主細(xì)胞，導(dǎo)入該DNA并使其表達(dá)的轉(zhuǎn)化體的以葡萄糖為碳源的生長(zhǎng)或葡萄糖消耗速度與轉(zhuǎn)化前的細(xì)胞相比提高，而且，其效果不受由pts基因破壞等引起的PTS依賴性糖輸送阻遏的影響。另外，本發(fā)明中，棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的非PTS葡萄糖通透酶活性得到強(qiáng)化這一點(diǎn)可以以下述指標(biāo)來(lái)確認(rèn)：對(duì)于因pts基因破壞等而PTS依賴性葡萄糖輸送能力缺失的宿主細(xì)胞的以葡萄糖為碳源的生長(zhǎng)或葡萄糖消耗速度而言，與基因?qū)肭暗木晗啾?，該棒狀?xì)菌轉(zhuǎn)化體的情況下更高。葡萄糖激酶活性的強(qiáng)化通過(guò)非PTS葡萄糖通透酶攝取到細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖與通過(guò)PTS進(jìn)行的糖輸送不同的是，其未被磷氧化。因此，為了使通過(guò)非PTS葡萄糖通透酶攝取到細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖能夠通過(guò)糖酵解而代謝，首先需要通過(guò)葡萄糖激酶活性而轉(zhuǎn)變成葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖激酶是催化由葡萄糖向葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)變的酶。本發(fā)明中，在強(qiáng)化非PTS葡萄糖通透酶依賴性葡萄糖輸送的同時(shí)，葡萄糖激酶活性得到強(qiáng)化。由此，特征在于，葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取以及其后續(xù)的糖酵解、戊糖磷酸途徑的糖代謝得到促進(jìn)。葡萄糖激酶活性可以通過(guò)下述方式而強(qiáng)化：通過(guò)導(dǎo)入葡萄糖激酶基因而使其高表達(dá)、或者通過(guò)對(duì)染色體上的葡萄糖激酶基因(調(diào)控序列及基因編碼區(qū)域)導(dǎo)入突變或進(jìn)行序列置換而使該基因表達(dá)量增加或使該基因產(chǎn)物的活性增大。在谷氨酸棒狀桿菌R菌株的染色體上，作為葡萄糖激酶基因，至少存在cgR_2067(glk1)、cgR_2552(glk2)及cgR_1739(ppgK)這3種。其中，cgR_2067(glk1)及cgR_2552(glk2)與以ATP為良好底物的葡萄糖激酶具有高同源性；cgR_1739(ppgK)與以多聚磷酸為良好底物的葡萄糖激酶具有高同源性。本發(fā)明中，優(yōu)選這些葡萄糖激酶基因中的1種以上得到強(qiáng)化，更優(yōu)選3種全部得到強(qiáng)化。通過(guò)導(dǎo)入葡萄糖激酶基因來(lái)進(jìn)行葡萄糖激酶活性的強(qiáng)化的方式簡(jiǎn)便、效率好。對(duì)所導(dǎo)入的葡萄糖激酶基因的來(lái)源沒(méi)有特別限定，從莽草酸生產(chǎn)效率好的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選棒狀桿菌屬細(xì)菌，其中優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌。作為來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的葡萄糖激酶基因，可以列舉由序列號(hào)3、序列號(hào)4及序列號(hào)5的堿基序列組成的DNA(分別為glk1、glk2、及ppgK)。另外，本發(fā)明中還可以使用如下DNA：由與序列號(hào)3、4、或5具有90％以上、尤其是95％以上、尤其是98％以上的同一性的堿基序列組成且編碼具有葡萄糖激酶活性的多肽的DNA。另外，本發(fā)明中還可以使用如下DNA：與由序列號(hào)3、4、或5的互補(bǔ)堿基序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有葡萄糖激酶活性的多肽的DNA。本發(fā)明中，DNA所編碼的蛋白質(zhì)為葡萄糖激酶這一點(diǎn)可以通過(guò)測(cè)定該DNA所編碼的蛋白質(zhì)的葡萄糖激酶活性來(lái)確認(rèn)。葡萄糖激酶活性通過(guò)如下操作測(cè)定：在33℃下，在含有100mMTris鹽酸緩沖液(pH7.5)、4mM氯化鎂、1mMATP、0.2mMNADP+、20mM葡萄糖、1U葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的反應(yīng)用混合液中添加酶液而開(kāi)始反應(yīng)，通過(guò)BeckmanDU800分光光度計(jì)(BeckmanCoulter，Inc.制)監(jiān)測(cè)表示NADPH生成的340nm的吸收(＝6220/M·cm)。將33℃下、1分鐘內(nèi)生成1μmol的NADPH的活性作為1單位的葡萄糖激酶活性。另外，本發(fā)明中，棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的葡萄糖激酶活性得到強(qiáng)化這一點(diǎn)通過(guò)測(cè)定該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞提取液中的葡萄糖激酶活性來(lái)確認(rèn)。GAPDH活性的強(qiáng)化甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是將甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)?，3-二磷酸甘油酸的酶。本發(fā)明的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體中，GAPDH活性得到強(qiáng)化。本發(fā)明中，pts基因被破壞且強(qiáng)化了非PTS葡萄糖通透酶介導(dǎo)的葡萄糖的攝取及葡萄糖激酶活性的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體中，作為糖酵解代謝中間體的二羥丙酮磷酸的去磷酸化代謝產(chǎn)物、即二羥基丙酮(DHA)顯著累積。另外，甘油醛-3-磷酸及其上游的糖酵解代謝中間體的細(xì)胞內(nèi)濃度在該棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體中顯著增大。認(rèn)為由GAPDH催化的反應(yīng)階段為該棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體中的依賴糖酵解代謝的糖消耗活性的限速步驟，其結(jié)果引起溢出代謝，引起DHA的累積。因此，本發(fā)明的特征在于，通過(guò)強(qiáng)化該棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的GAPDH活性，解除了糖代謝的限速、促進(jìn)了糖消耗，同時(shí)提高了莽草酸生產(chǎn)能力。本發(fā)明人們的研究組發(fā)現(xiàn)，利用棒狀細(xì)菌在厭氧條件下生產(chǎn)物質(zhì)時(shí)，GAPDH活性會(huì)由于厭氧條件下特異性累積的NADH而受到活性阻遏，通過(guò)糖酵解進(jìn)行的糖消耗受到阻遏(Inui，M.et.al.，MetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7：182-196(2004))。但是，此前并不知道通過(guò)在NADH保持為相對(duì)較低濃度的有氧條件下強(qiáng)化GAPDH活性、糖消耗被活化、與目標(biāo)產(chǎn)物的高效生產(chǎn)有關(guān)。本發(fā)明的特征在于，在NADH保持相對(duì)低濃度的有氧條件下，在依賴已得到強(qiáng)化的非PTS葡萄糖通透酶依賴性糖輸送的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體中，通過(guò)強(qiáng)化GAPDH活性，糖代謝活性顯著提高，使目標(biāo)化合物高效生產(chǎn)。GAPDH活性可以通過(guò)下式方式而強(qiáng)化：通過(guò)導(dǎo)入GAPDH基因而使其高表達(dá)、或者通過(guò)在棒狀細(xì)菌的染色體上的GAPDH基因(調(diào)控序列及基因編碼區(qū)域)中導(dǎo)入突變、或者進(jìn)行序列置換而使該基因表達(dá)量增加或使該基因產(chǎn)物的活性增大。其中，通過(guò)導(dǎo)入GAPDH基因而進(jìn)行GAPDH活性的強(qiáng)化的方式簡(jiǎn)便、效率好。對(duì)所導(dǎo)入的GAPDH基因的來(lái)源沒(méi)有特別限定，從莽草酸生產(chǎn)效率好的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選棒狀桿菌屬細(xì)菌，其中優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌。作為來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的GAPDH基因，可以列舉由序列號(hào)6的堿基序列組成的DNA(gapA)。另外，本發(fā)明中還可以使用如下DNA：由與序列號(hào)6具有90％以上、尤其是95％以上、尤其是98％以上的同一性的堿基序列組成且編碼具有GAPDH活性的多肽的DNA。另外，本發(fā)明中還可以使用如下DNA：與由序列號(hào)6的互補(bǔ)的堿基序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有GAPDH活性的多肽的DNA。本發(fā)明中，DNA所編碼的蛋白質(zhì)為GAPDH這一點(diǎn)可通過(guò)測(cè)定該DNA所編碼的多肽的GAPDH活性來(lái)確認(rèn)。GAPDH活性的測(cè)定可以通過(guò)如下操作進(jìn)行：在33℃下，在含有25mM磷酸緩沖液(pH7.5)、25mM三乙醇胺(pH7.5)、0.2mMEDTA、5mMNAD+、5mM甘油醛-3-磷酸的反應(yīng)用混合液中添加酶液而開(kāi)始反應(yīng)，通過(guò)BeckmanDU800分光光度計(jì)(BeckmanCoulter，Inc.制)監(jiān)測(cè)表示NADH的生成的340nm的吸收(＝6220/M·cm)。將33℃下、1分鐘內(nèi)生成1μmol的NADH的活性作為1單位的GAPDH活性。另外，本發(fā)明中，棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的GAPDH活性得到強(qiáng)化這一點(diǎn)通過(guò)測(cè)定該棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞提取液中的GAPDH活性來(lái)確認(rèn)。二羥丙酮磷酸(DHAP)去磷酸化活性的消失/阻遏/減少DHAP磷酸酶是催化DHAP去磷酸化從而使其轉(zhuǎn)變?yōu)槎u基丙酮(DHA)的酶。本發(fā)明的棒狀細(xì)菌優(yōu)選DHAP磷酸酶活性消失、阻遏、或減少。如上所述，對(duì)于糖向細(xì)胞內(nèi)的攝取依賴于高表達(dá)的非PTS葡萄糖通透酶及葡萄糖激酶的棒狀細(xì)菌莽草酸生產(chǎn)菌株而言，高產(chǎn)作為副產(chǎn)物的DHA。因此認(rèn)為，通過(guò)阻斷其的生成途徑，能夠?qū)⒏嗟奶脊┯诿Р菟岬确枷阕寤衔锏纳?。谷氨酸棒狀桿菌具有HAD(haloaciddehalogenase，鹵酸脫鹵酶)超家族磷酸酶(HdpA)作為催化DHAP的去磷酸化的酶。谷氨酸棒狀桿菌的DHAP磷酸酶活性可以通過(guò)染色體上的DHAP磷酸酶基因(hdpA)的破壞、缺失、或突變而消失、阻遏、或減少。另外，本發(fā)明中，棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的DHAP磷酸酶活性消失、阻遏、或減少這一點(diǎn)可通過(guò)測(cè)定該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞提取液中的DHAP磷酸酶活性來(lái)確認(rèn)。DHAP磷酸酶活性可如下測(cè)定：在33℃下，在含有100mMTris-蘋(píng)果酸緩沖液(pH7.5)、5mM硫酸鎂、5mMDHAP的反應(yīng)用混合液中添加酶液而開(kāi)始反應(yīng)，按照公知方法(Gawronski，J.D.，et.al.，Microtiterassayforglutaminesynthetasebiosyntheticactivityusinginorganicphosphatedetection.Anal.Biochem.327：114-118(2004))對(duì)由DHAP游離的無(wú)機(jī)磷酸離子進(jìn)行比色定量。在該定量值減少或消失時(shí)，判定為二羥丙酮磷酸磷酸酶活性消失、阻遏、或減少。3-脫氫奎寧酸(3-DHQ)合成酶活性、3-DHQ脫水酶活性及莽草酸脫氫酶活性的強(qiáng)化作為芳香族化合物生物合成共同代謝途徑上的最初代謝物質(zhì)的3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)是通過(guò)PEP和E4P的縮合而生成的。DAHP進(jìn)一步通過(guò)基于3-DHQ合成酶、3-DHQ脫水酶、及莽草酸脫氫酶催化的連續(xù)反應(yīng)而轉(zhuǎn)變?yōu)槊Р菟帷?-DHQ合成酶是催化由DAHP轉(zhuǎn)變?yōu)?-脫氫奎寧酸的酶，3-DHQ脫水酶為催化由3-DHQ轉(zhuǎn)變?yōu)?-DHS的酶，莽草酸脫氫酶為催化由3-DHS轉(zhuǎn)變?yōu)槊Р菟岬拿?。本發(fā)明中，通過(guò)強(qiáng)化這些酶活性，能夠強(qiáng)化由DAHP向莽草酸的碳流向、提高莽草酸等目標(biāo)芳香族化合物的生產(chǎn)率。本發(fā)明的棒狀細(xì)菌優(yōu)選這些酶活性中的任意1個(gè)以上得到強(qiáng)化，另外，更優(yōu)選這些活性全部得到強(qiáng)化。3-DHQ合成酶、3-DHQ脫水酶、莽草酸脫氫酶的各酶活性能夠通過(guò)下式方式而強(qiáng)化：通過(guò)導(dǎo)入編碼各酶的基因、或者在編碼各酶的棒狀細(xì)菌的染色體基因(分別為aroB、aroD、及aroE)的調(diào)控序列或基因編碼區(qū)域中導(dǎo)入突變、或者進(jìn)行序列置換而使該基因表達(dá)量增加或使該基因產(chǎn)物的活性增大。其中，通過(guò)導(dǎo)入該酶基因來(lái)進(jìn)行該酶活性的強(qiáng)化的方式簡(jiǎn)便、效率好。對(duì)所導(dǎo)入的各酶基因的來(lái)源沒(méi)有特別限定，從莽草酸生產(chǎn)效率好的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選棒狀桿菌屬細(xì)菌，其中優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌。作為來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的3-DHQ合成酶基因，可以列舉由序列號(hào)7的堿基序列組成的DNA(aroB)；作為3-DHQ脫水酶基因，可以列舉由序列號(hào)8的堿基序列組成的DNA(aroD)；作為莽草酸脫氫酶基因，可以列舉由序列號(hào)9的堿基序列組成的DNA(aroE)。另外，本發(fā)明中還可以使用如下DNA：與由序列號(hào)7、8、或9具有90％以上、尤其是95％以上、尤其是98％以上的同一性的堿基序列組成，且分別編碼具有3-DHQ合成酶、3-DHQ脫水酶、或莽草酸脫氫酶活性的多肽的DNA。另外，本發(fā)明中還可以使用如下DNA：與由序列號(hào)7、8、或9的互補(bǔ)堿基序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且分別編碼具有3-DHQ合成酶、3-DHQ脫水酶、或莽草酸脫氫酶活性的多肽的DNA。本發(fā)明中，DNA所編碼的蛋白質(zhì)為3-DHQ合成酶這一點(diǎn)可通過(guò)測(cè)定該DNA所編碼的蛋白質(zhì)的3-DHQ合成酶活性來(lái)確認(rèn)。3-DHQ合成酶活性按照公知方法(Meudi，S.etal.，DehydroquinatesynthasefromEscherichiacoli，anditssubstrate3-deoxy-D-arabino-heptulosonicacid7-phosphate.Methods.Enzymol.142：306-314(1987))來(lái)測(cè)定。在33℃下，在含有50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、0.2mMDAHP、0.2mMNAD+、1mM氯化鈷(II)六水合物、3-DHQ脫水酶的粗酶液的反應(yīng)用混合液中添加受試酶液而開(kāi)始反應(yīng)，通過(guò)BeckmanDU800分光光度計(jì)(BeckmanCoulter，Inc.制)監(jiān)測(cè)表示通過(guò)與3-DHQ脫水酶的偶聯(lián)反應(yīng)生成的3-DHS的生成的234nm的吸收(＝12000/M·cm)。將33℃下1分鐘內(nèi)生成1μmol的3-DHQ的活性作為1單位的3-DHQ合成酶活性。另外，本發(fā)明中，棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的3-DHQ合成酶活性得到強(qiáng)化這一點(diǎn)通過(guò)測(cè)定該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞提取液中的3-DHQ合成酶活性來(lái)確認(rèn)。本發(fā)明中，DNA所編碼的蛋白質(zhì)為3-DHQ脫水酶這一點(diǎn)可如下確認(rèn)：對(duì)該DNA所編碼的蛋白質(zhì)，測(cè)定3-DHQ脫水酶活性。3-DHQ脫水酶活性按照公知方法(Chaudhuri，S.etal.，3-DehydroquinatedehydratasefromEscherichiacoli.Methods.Enzymol.142：320-324(1987))進(jìn)行。在33℃下，在含有50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、0.5mM3-DHQ的反應(yīng)用混合液中添加受試酶液而開(kāi)始反應(yīng)，通過(guò)BeckmanDU800分光光度計(jì)(BeckmanCoulter，Inc.制)監(jiān)測(cè)表示生成的3-DHS的生成的234nm的吸收(＝12000/M·cm)。將33℃下1分鐘內(nèi)生成1μmol的3-DHS的活性作為1單位的3-DHQ脫水酶活性。另外，本發(fā)明中，棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的3-DHQ脫水酶活性得到強(qiáng)化這一點(diǎn)通過(guò)測(cè)定該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞提取液中的3-DHQ脫水酶活性來(lái)確認(rèn)。本發(fā)明中，DNA所編碼的蛋白質(zhì)為莽草酸脫氫酶這一點(diǎn)如下確認(rèn)：對(duì)該DNA所編碼的蛋白質(zhì)，測(cè)定莽草酸脫氫酶活性。莽草酸脫氫酶活性的測(cè)定按照公知方法(Chaudhuri，S.etal.，ShikimatedehydratasefromEscherichiacoli.Methods.Enzymol.142：315-320(1987))進(jìn)行。在33℃下在含有100mMTris鹽酸緩沖液(pH7.5)、0.2mMNADPH、0.5mM3-脫氫莽草酸的反應(yīng)用混合液中添加受試酶液而開(kāi)始反應(yīng)，通過(guò)BeckmanDU800分光光度計(jì)(BeckmanCoulter，Inc.制)監(jiān)測(cè)與NADPH的消耗相伴的340nm吸收(＝6220/M·cm)的減少。將33℃下1分鐘內(nèi)生成1μmol的莽草酸的活性作為1單元的莽草酸脫氫酶活性。另外，本發(fā)明中，棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的莽草酸脫氫酶活性得到強(qiáng)化這一點(diǎn)通過(guò)測(cè)定該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞提取液中的莽草酸脫氫酶活性來(lái)確認(rèn)。轉(zhuǎn)酮醇酶、轉(zhuǎn)醛醇酶活性的強(qiáng)化糖代謝中，轉(zhuǎn)酮醇酶催化2種反應(yīng)。作為第一個(gè)反應(yīng)，在非氧化性戊糖磷酸途徑中，催化由D-木酮糖-5-磷酸(X5P)向甘油醛-3-磷酸(GAP)的轉(zhuǎn)變和由D-核糖-5-磷酸(R5P)向景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)的轉(zhuǎn)變。這些反應(yīng)是可逆的且是共軛的。另外，就第2個(gè)反應(yīng)而言，轉(zhuǎn)酮醇酶催化由D-果糖-6-磷酸(F6P)向赤蘚糖-4-磷酸(E4P)的轉(zhuǎn)變和由GAP向X5P的轉(zhuǎn)變。這些反應(yīng)是可逆的且是共軛的。另外，在糖代謝中，轉(zhuǎn)醛醇酶催化由GAP向E4P的轉(zhuǎn)變和由S7P向F6P的轉(zhuǎn)變。這些反應(yīng)是共軛的。從而，轉(zhuǎn)酮醇酶、及轉(zhuǎn)醛醇酶與作為芳香族化合物生物合成的前體之一的E4P的生成相關(guān)。認(rèn)為通過(guò)強(qiáng)化這些酶活性，細(xì)胞內(nèi)的E4P的供給增大，莽草酸等芳香族化合物的生產(chǎn)率提高。本發(fā)明的棒狀細(xì)菌優(yōu)選這些酶活性中的任意一個(gè)得到強(qiáng)化，更優(yōu)選兩種活性得到強(qiáng)化。轉(zhuǎn)酮醇酶、及轉(zhuǎn)醛醇酶的各酶活性可以通過(guò)下式方式而強(qiáng)化：通過(guò)導(dǎo)入各酶基因而使其高表達(dá)、或者通過(guò)對(duì)存在于棒狀細(xì)菌的染色體上的各酶基因(調(diào)控序列及基因編碼區(qū)域)導(dǎo)入突變、或者進(jìn)行序列置換而使該基因表達(dá)量增加或該基因產(chǎn)物的活性增大。其中，通過(guò)導(dǎo)入各酶基因而強(qiáng)化酶活性的方式簡(jiǎn)便、效率好。對(duì)所導(dǎo)入的各酶基因的來(lái)源沒(méi)有特別限定，從莽草酸生產(chǎn)效率好的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選棒狀桿菌屬細(xì)菌，其中優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌。作為來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的轉(zhuǎn)酮醇酶基因，可以列舉由序列號(hào)10的堿基序列組成的DNA(tkt)，作為轉(zhuǎn)醛醇酶基因，可以列舉由序列號(hào)11的堿基序列組成的DNA(tal)。另外，本發(fā)明中還可以使用如下DNA：由與序列號(hào)10、或11具有90％以上、尤其是95％以上、尤其是98％以上的同一性的堿基序列組成且分別編碼具有轉(zhuǎn)酮醇酶、或轉(zhuǎn)醛醇酶活性的多肽的DNA。另外，本發(fā)明中還可以使用如下DNA：由與序列號(hào)10、或11的互補(bǔ)的堿基序列組成的DNA在嚴(yán)格條件下雜交、且分別編碼具有轉(zhuǎn)酮醇酶、或轉(zhuǎn)醛醇酶活性的多肽的DNA。本發(fā)明中，DNA所編碼的蛋白質(zhì)為轉(zhuǎn)酮醇酶這一點(diǎn)可以如下確認(rèn)：對(duì)該DNA所編碼的蛋白質(zhì)，測(cè)定轉(zhuǎn)酮醇酶活性。轉(zhuǎn)酮醇酶活性的測(cè)定按照公知方法(Ikeda，M.etal.，CloningofthetransketolasegeneandtheeffectofitsdosageonaromaticaminoacidproductioninCorynebacteriumglutamicum.Appl.Microbiol.Biotechnol.51：201-206(1999))來(lái)進(jìn)行，在按照該方法能夠檢測(cè)到轉(zhuǎn)酮醇酶活性時(shí)，判定為轉(zhuǎn)酮醇酶。另外，本發(fā)明中，棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)酮醇酶活性得到強(qiáng)化這一點(diǎn)通過(guò)測(cè)定該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞提取液中的轉(zhuǎn)酮醇酶活性來(lái)確認(rèn)。本發(fā)明中，DNA所編碼的蛋白質(zhì)為轉(zhuǎn)醛醇酶這一點(diǎn)如下確認(rèn)：對(duì)該DNA所編碼的蛋白質(zhì)，測(cè)定轉(zhuǎn)醛醇酶活性。轉(zhuǎn)醛醇酶活性按照公知方法(Lu，JL.etal.，Metabolicengineeringandcontrolanalysisforproductionofaromatics：Roleoftransaldolase.Biotechnol.Bioeng.53：132-138(1997))來(lái)測(cè)定。另外，本發(fā)明中，棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)醛醇酶活性得到強(qiáng)化這一點(diǎn)通過(guò)測(cè)定該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞提取液中的轉(zhuǎn)醛醇酶活性來(lái)確認(rèn)。莽草酸激酶活性、3-脫氫莽草酸(3-DHS)脫水酶活性及奎寧酸/莽草酸脫氫酶活性的消失、阻遏、減少莽草酸激酶是在芳香族化合物共有代謝途徑中催化由莽草酸向莽草酸-3-磷酸轉(zhuǎn)變的酶，3-脫氫莽草酸脫水酶是催化由3-脫氫莽草酸向原兒茶酸轉(zhuǎn)變的酶，奎寧酸/莽草酸脫氫酶是主要催化由莽草酸向3-脫氫莽草酸的轉(zhuǎn)變的酶。本發(fā)明的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體優(yōu)選這些活性中的1個(gè)以上消失、阻遏、或減少，更優(yōu)選上述全部活性消失、阻遏、或減少。這些酶活性可以通過(guò)棒狀細(xì)菌的染色體上的各酶基因的破壞、缺失、或突變而消失、阻遏、或減少。本發(fā)明中，棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的莽草酸激酶活性消失、阻遏、或減少這一點(diǎn)通過(guò)測(cè)定該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞提取液中的莽草酸激酶活性來(lái)確認(rèn)。莽草酸激酶活性按照公知方法(Feyter，RD.etal.，Shikimatekinasesfrom大腸桿菌K12.Methods.Enzymol.142：355-361(1987))來(lái)測(cè)定，在該測(cè)定值減少或消失時(shí)，判定為莽草酸激酶活性減少、阻遏、或消失。另外，棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的3-DHS脫水酶活性消失、阻遏、或減少這一點(diǎn)通過(guò)測(cè)定該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞提取液中的細(xì)胞提取液中的3-DHS脫水酶活性來(lái)確認(rèn)。3-DHS脫水酶活性按照公知方法(Stroman，P.etal.，Purificationandcharacterizationof3-dehydroshikimatedehydratase，anenzymeintheinduciblequinicacidcatabolicpathwayofNeurosporacrassa.J.Biol.Chem.253：4593-4598(1978))來(lái)測(cè)定，在該測(cè)定值減少或消失時(shí)，判定為3-DHS脫水酶活性減少、阻遏、或消失。另外，棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的奎寧酸/莽草酸脫氫酶活性消失、阻遏、或減少這一點(diǎn)通過(guò)測(cè)定該轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞提取液中的奎寧酸/莽草酸脫氫酶活性來(lái)確認(rèn)?？鼘幩?莽草酸脫氫酶活性按照公知方法(Kubota，T.etal.，CharacterizationofshikimatedehydrogenasehomologsofCorynebacteriumglutamicum.Appl.Microbial.Biotechnol.97：8139-8149(2013))來(lái)測(cè)定，在該測(cè)定值減少或消失時(shí)，判定為奎寧酸/莽草酸脫氫酶活性減少、阻遏、或消失。棒狀細(xì)菌棒狀細(xì)菌為伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)〔Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology、Vol.8、599(1974)〕中定義的一組微生物，只要是在通常的有氧條件下增殖則沒(méi)有特別限定。若列舉具體例子，可以列舉：棒狀桿菌屬菌、短桿菌屬菌、節(jié)桿菌屬菌、分枝桿菌屬菌、微球菌屬菌等。就作為本發(fā)明的宿主微生物的棒狀細(xì)菌而言，其中優(yōu)選棒狀桿菌屬菌。作為棒狀桿菌屬菌，可以列舉：谷氨酸棒狀桿菌、有效棒桿菌(Corynebacteriumefficiens)、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)、耐鹽棒桿菌(Corynebacteriumhalotolerance)、解烷棒桿菌(Corynebacteriumalkanolyticum)等。其中，作為本發(fā)明的宿主微生物，從安全且莽草酸生產(chǎn)率高的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌。作為合適的菌株，可以列舉：谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)R菌株(FERMBP-18976)、ATCC13032菌株、ATCC13869菌株、ATCC13058菌株、ATCC13059菌株、ATCC13060菌株、ATCC13232菌株、ATCC13286菌株、ATCC13287菌株、ATCC13655菌株、ATCC13745菌株、ATCC13746菌株、ATCC13761菌株、ATCC14020菌株、ATCC31831菌株、MJ-233(FERMBP-1497)、MJ-233AB-41(FERMBP-1498)等。這些菌株基于布達(dá)佩斯條約進(jìn)行了國(guó)際保藏，可以為公眾所用。其中，優(yōu)選R菌株(FERMBP-18976)、ATCC13032菌株、ATCC13869菌株。需要說(shuō)明的是，根據(jù)分子生物學(xué)的分類，黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)、散枝短桿菌(Brevibacteriumdivaricatum)、百合棒狀桿菌(Corynebacteriumlilium)等棒狀細(xì)菌的菌名也被統(tǒng)一為谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)〔Liebl，W.etal.，TransferofBrevibacteriumdivaricatumDSM20297T，″Brevibacteriumflavum″DSM20411，″Brevibacteriumlactofermentum″DSM20412andDSM1412，andCorynebacteriumglutamicumandtheirdistinctionbyrRNAgenerestrictionpatterns.Int.J.Syst.Bacteriol.41：255-260.(1991)、駒形和男等，コリネフオルム細(xì)菌の分類(棒狀細(xì)菌的分類)，發(fā)酵和工業(yè)，45：944-963(1987)〕。作為短桿菌屬菌，可以列舉產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacteriumammoniagenes)(例如ATCC6872菌株)等。該菌株基于布達(dá)佩斯條約進(jìn)行了國(guó)際保藏，可以為公眾所用。作為節(jié)桿菌屬菌，可以列舉：球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis)(例如ATCC8010菌株、ATCC4336菌株、ATCC21056菌株、ATCC31250菌株、ATCC31738菌株、ATCC35698菌株)。這些菌株基于布達(dá)佩斯條約進(jìn)行了國(guó)際保藏，可以為公眾所用。作為分枝桿菌屬菌，可以列舉牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)(例如ATCC19210菌株、ATCC27289菌株)。這些菌株基于布達(dá)佩斯條約進(jìn)行了國(guó)際保藏，可以為公眾所用。作為微球菌屬菌，可以列舉：弗氏微球菌(Micrococcusfreudenreichii)(例如No.239菌株(FERMP-13221))、藤黃微球菌(Micrococcusleuteus)(例如No.240菌株(FERMP-13222))、脲微球菌(Micrococcusureae)(例如IAM1010菌株)、玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)(例如IFO3764菌株)。另外，棒狀細(xì)菌也可以是除了上述說(shuō)明的操作以外破壞了例如乳酸(Lactate)脫氫酶(lactatedehydrogenase：ldh)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase：ppc)、蘋(píng)果酸脫氫酶(malatedehydrogenase：mdh)等基因的破壞菌株。其中，優(yōu)選乳酸脫氫酶基因的破壞菌株。該基因破壞菌株由于乳酸脫氫酶基因已被破壞，從而由丙酮酸向乳酸的代謝途徑被阻斷。其中，優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌、特別是R(FERMBP-18976)菌株的乳酸脫氫酶基因的破壞菌株。這樣的基因破壞菌株可以通過(guò)基因工程方法按照常規(guī)方法來(lái)制作。例如，WO2005/010182A1中記載了乳酸脫氫酶基因破壞菌株及其制作方法。戊糖利用能力棒狀細(xì)菌的野生菌株通常不能利用D-木糖、L-阿拉伯糖等戊糖，為了也由戊糖生成莽草酸等有機(jī)化合物，本發(fā)明的棒狀細(xì)菌優(yōu)選可以并行利用D-葡萄糖及戊糖(例如D-木糖、及L-阿拉伯糖中的1種以上)，更優(yōu)選可以并行且同時(shí)利用。通常，在葡萄糖存在下，即使還存在其它糖，微生物也優(yōu)先消耗葡萄糖。與此相對(duì)地，在微生物具有D-葡萄糖及戊糖的平行利用能力時(shí)，在存在兩種糖的條件下則能夠同時(shí)消耗戊糖與葡萄糖，結(jié)果是能夠縮短生產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)所需的時(shí)間。<D-木糖利用能力>作為對(duì)棒狀細(xì)菌賦予D-木糖利用能力的方法，可以列舉例如：導(dǎo)入來(lái)自其它物種的D-木糖代謝相關(guān)基因的方法。原核生物及部分霉菌中的從D-木糖向D-木酮糖-5-磷酸酯的代謝通過(guò)由催化從D-木糖向D-木酮糖的反應(yīng)的木糖異構(gòu)酶(xylA)、及催化從D-木酮糖向D-木酮糖-5-磷酸酯的反應(yīng)的木酮糖激酶(xylB)這2個(gè)酶催化的兩步反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。通過(guò)將編碼這些酶的各基因?qū)氚魻罴?xì)菌，對(duì)棒狀細(xì)菌賦予D-木糖利用能力。例如，本發(fā)明人們已經(jīng)公開(kāi)了如下技術(shù)：在棒狀細(xì)菌中導(dǎo)入作為D-木糖代謝相關(guān)基因的來(lái)自大腸桿菌(Escherichiacoli)的xylA基因及xylB基因，使其表達(dá)，從而賦予D-木糖的利用能力(Appl.Environ.Microbiol.，Vol.72，3418-3428(2006))。本發(fā)明中，也可以導(dǎo)入來(lái)自包括大腸桿菌在內(nèi)的各種物種的xylA基因及xylB基因，對(duì)棒狀細(xì)菌賦予D-木糖利用能力。通常具有D-木糖代謝能力的微生物保有xylA基因及xylB基因。作為xylA基因及xylB基因，優(yōu)選分別獨(dú)立地使用來(lái)自選自由大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌(僅保有xylB基因)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)、耐鹽芽孢桿菌(Bacillushalodurans)、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)、及根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)組成的組中的微生物的xylA基因及xylB基因。其中，更優(yōu)選來(lái)自大腸桿菌的xylA基因及xylB基因。<阿拉伯糖利用能力>通過(guò)在棒狀細(xì)菌中導(dǎo)入編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因(araA)、編碼L-核酮糖激酶的基因(araB)、及編碼L-核酮糖-5-磷酸酯-4-差向異構(gòu)酶的基因(araD)，可以賦予阿拉伯糖利用能力。具有L-阿拉伯糖代謝能力的微生物保有這些基因。可以使用例如來(lái)自大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌ATCC31831、枯草桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、耐鹽芽孢桿菌(Bacillushalodurans)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)、或恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)的araA、araB及araD。進(jìn)而，通過(guò)導(dǎo)入編碼L-阿拉伯糖輸送體系的質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(L-阿拉伯糖質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)體)的基因(araE)，使阿拉伯糖的攝取能力提高，其結(jié)果是，可以進(jìn)一步提高阿拉伯糖利用能力。細(xì)菌中，就以下所示的菌株等報(bào)道了araE基因序列、酶特性?？莶輻U菌(J.Bacteriol.Vol.179，7705-7711(1997))、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)8017(J.Bacteriol.Vol.177，5379-5380(1995))、大腸桿菌(J.Biol.Chem.Vol.263，8003-8010(1988))。本發(fā)明中，優(yōu)選使用來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌ATCC31831、大腸桿菌、枯草桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、或鼠傷寒沙門(mén)氏菌的araE基因。通過(guò)導(dǎo)入L-阿拉伯糖質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，不僅L-阿拉伯糖，連D-木糖的攝取能力也提高，其結(jié)果是，可以進(jìn)一步提高D-木糖利用能力。<纖維二糖利用能力>本發(fā)明的棒狀細(xì)菌優(yōu)選纖維二糖利用能力得到提高，由此，還能夠由纖維二糖生產(chǎn)莽草酸等有機(jī)化合物。例如，可以通過(guò)日本特開(kāi)2004-089029號(hào)中記載的方法對(duì)棒狀細(xì)菌進(jìn)行突變處理，選擇在以纖維二糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上增殖的菌株，從而得到纖維二糖利用能力。作為這樣得到的突變株，可以列舉：FERMP-18977、FERMP-18978(日本特開(kāi)2004-089029)。另外，作為人工纖維二糖利用性重組菌株，可以列舉FERMP-18979(日本特開(kāi)2004-089029號(hào))。用于基因?qū)氲妮d體的構(gòu)建在通過(guò)基因?qū)雭?lái)強(qiáng)化其所編碼的蛋白質(zhì)或酶的活性時(shí)，各DNA可以分別重組到宿主的染色體中、或克隆到可在宿主中擴(kuò)增的合適載體中而導(dǎo)入宿主中。作為質(zhì)粒載體，含有在棒狀細(xì)菌內(nèi)擔(dān)負(fù)自主復(fù)制功能的基因即可。作為其具體例子，可以列舉：來(lái)自乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)2256的pAM330〔日本特開(kāi)昭58-67699號(hào)公報(bào)〕、〔Miwa，K.etal.，Crypticplasmidsinglutamicacid-producingbacteria.Agric.Biol.Chem.48：2901-2903(1984)〕及〔Yamaguchi，R.etal.，DeterminationofthecompletenucleotidesequenceoftheBrevibacteriumlactofermentumplasmidpAM330andtheanalysisofitsgeneticinformation.NucleicAcidsSymp.Ser.16：265-267(1985)〕、來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌ATCC3058的pHM1519〔Miwa，K.etal.，Crypticplasmidsinglutamicacid-producingbacteria.Agric.Biol.Chem.48：2901-2903(1984)〕及pCRY30〔Kurusu，Y.etal.，Identificationofplasmidpartitionfunctionincoryneformbacteria.Appl.Environ.Microbiol.57：759-764(1991)〕、來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌T250的pCG4〔日本特開(kāi)昭57-183799號(hào)公報(bào)〕、〔Katsumata，R.etal.，Protoplasttransformationofglutamate-producingbacteriawithplasmidDNA.J.Bacteriol.159：306-311(1984)〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50〔日本特開(kāi)昭62-166890〕、pEK0、pEC5、pEKEx1〔Eikmanns，B.J.etal.，AfamilyofCorynebacteriumglutamicum/Escherichiacolishuttlevectorsforcloning，controlledgeneexpression，andpromoterprobing.Gene，102：93-98(1991)〕等。作為優(yōu)選的啟動(dòng)子，可以列舉：來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R的甘油醛-3-磷酸脫氫酶A基因(gapA)的啟動(dòng)子PgapA、蘋(píng)果酸脫氫酶基因(mdh)的啟動(dòng)子Pmdh、乳酸脫氫酶A基因(ldhA)的啟動(dòng)子PldhA等，其中優(yōu)選PgapA。作為優(yōu)選的終止子，可以列舉大腸桿菌rRNA操縱子的rrnBT1T2終止子、大腸桿菌的trpA終止子、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)的trp終止子等，其中優(yōu)選rrnBT1T2終止子。轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化方法可以沒(méi)有限制地使用公知方法。作為這樣的公知方法，可以列舉例如：氯化鈣·氯化銣法、磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、電穿孔法等。其中，對(duì)于棒狀細(xì)菌，優(yōu)選電脈沖法，電脈沖法可以通過(guò)公知方法來(lái)進(jìn)行(Kurusu，Y.etal.，Electroporation-transformationsystemforCoryneformbacteriabyauxotrophiccomplementation.Agric.Biol.Chem.，54：443-447(1990))。轉(zhuǎn)化體可以使用通常用于微生物培養(yǎng)的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)。作為該培養(yǎng)基，通?？梢允褂煤刑荚?、氮源、無(wú)機(jī)鹽類、及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等的天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基。作為碳源，可以列舉：葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨醇、甘油等糖質(zhì)或糖醇；乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、馬來(lái)酸或葡糖酸等有機(jī)酸；乙醇、丙醇等醇。碳源可以單獨(dú)使用1種，也可以將2種以上混合。培養(yǎng)基中的這些碳源的濃度通常可以設(shè)為約0.1～10(w/v％)。作為氮源，可以列舉：氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、乙酸銨等無(wú)機(jī)或有機(jī)銨化合物，尿素，氨水，硝酸鈉，硝酸鉀等。另外，也可以使用玉米漿、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白質(zhì)水解物、氨基酸等含氮有機(jī)化合物等。氮源可以單獨(dú)使用1種，此外也可以將2種以上混合使用。培養(yǎng)基中的氮源濃度雖然也根據(jù)所使用的氮化合物而不同，但通常可以設(shè)為約0.1～10(w/v％)。作為無(wú)機(jī)鹽類，可以列舉例如：磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硝酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鈷、或碳酸鈣等。這些無(wú)機(jī)鹽可以單獨(dú)使用1種，此外也可以將2種以上混合使用。培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽類濃度雖然也根據(jù)所使用的無(wú)機(jī)鹽而不同，但通?？梢栽O(shè)為約0.1～1(w/v％)。作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以列舉例如：肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米漿、脫脂奶粉、脫脂大豆鹽酸水解物、或者動(dòng)植物或微生物菌體的提取物以及這些的分解物等，通?？梢栽O(shè)為約0.1～10(w/v％)。進(jìn)而，根據(jù)需要還可以添加維生素類。作為維生素類，可以列舉例如：生物素、硫胺素、吡哆醇、泛酸、肌醇、尼克酸等。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為約6～8。作為優(yōu)選的微生物培養(yǎng)基，可以列舉：A培養(yǎng)基〔Inui，M.etal.，MetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7：182-196(2004)〕、BT培養(yǎng)基〔Omumasaba，C.A.etal.，Corynebacteriumglutamicumglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseisoformswithopposite，ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：91-103(2004)〕等。培養(yǎng)溫度可以設(shè)為約15～45℃，培養(yǎng)時(shí)間可以設(shè)為約1～7天。(2)有機(jī)化合物的制造方法通過(guò)含有以下的工序的方法，可以制造有機(jī)化合物：使上述說(shuō)明的本發(fā)明的棒狀細(xì)菌在含有糖類的反應(yīng)液中反應(yīng)的工序、和回收反應(yīng)液中的有機(jī)化合物的工序。作為有機(jī)化合物，除了莽草酸以外，還可以列舉：3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)、3-脫氫奎寧酸(3-DHQ)、3-脫氫莽草酸(3-DHS)、莽草酸-3-磷酸(shikimate3-phosphate)、5-烯醇式丙酮酰莽草酸3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate3-phosphate)、原兒茶酸(protocatechuicacid)、沒(méi)食子酸(gallicacid)、分支酸(chorismicacid)、預(yù)苯酸(prephenicacid)、苯基丙酮酸(phenylpyruvicacid)、異分支酸(isochorismicacid)、苯丙氨酸(phenylalanine)、L-DOPA(L-dihydroxyphenylalanine)、酪氨酸(tyrosine)、預(yù)酪氨酸(pretyrosine)、色氨酸(tryptophan)等芳香族氨基酸，葉酸(folate、(維生素M)(維生素B9))、甲基萘醌類(menaquinone(維生素K))、對(duì)羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoicacid)或來(lái)自其的泛醌(ubiquinone(CoenzymeQ10))、對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoicacid(維生素H))、對(duì)氨基苯酚(p-aminophenol)、4-氨基-4-脫氧分支酸(4-amino-4-deoxychorismate)、鄰氨基苯甲酸(anthranilicacid)、阿羅酸(arogenate)、腸菌素、生育酚(tocopherol、維生素E)、苯酚(phenol)、鄰苯二酚(catechol)、苯胺(aniline)、cis，cis-粘糠酸(cis，cis-muconate)、3-羧基-cis，cis-粘糠酸(3-carboxy-cis，cis-muconate)、粘糠酸內(nèi)酯(muconolactone)、γ-羧基粘糠酸內(nèi)酯(gamma-carboxymuconolactone)、β-酮己二酸(β-ketoadipate)、肉桂酸(cinnamicacid)、香豆酸(coumaricacid)、香豆素(coumarin)、類黃酮(flavonoid)、類異黃酮(isoflavonoid)、鞣酸(tannin)、苯乙烯基吡喃酮化合物(styrylpyrones)、2，3-二羥基苯甲酸(2，3-dihydroxybenzoicacid)、水楊酸(salycylicacid)等。其中，除了莽草酸以外，優(yōu)選3-脫氫莽草酸、3-脫氫奎寧酸、原兒茶酸、分支酸、沒(méi)食子酸(gallicacid)、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、鄰氨基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)氨基苯甲酸、苯酚、鄰苯二酚。作為糖類，優(yōu)選葡萄糖，除了果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖等單糖類以外，還可以使用可通過(guò)代謝生成葡萄糖的糖類。這樣的糖類包括具有葡萄糖單元的寡糖或多糖類，可以列舉：纖維二糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖、木二糖等二糖類；糊精或可溶性淀粉等多糖類等。另外，例如，作為含有這些原料化合物的原料，還可以使用糖蜜。另外，還可以使用將以下物質(zhì)用糖化酶等糖化而得的、含有葡萄糖等多種糖的糖化液，所述物質(zhì)為：秸稈(稻秸、大麥秸、小麥秸、黑麥秸、燕麥秸等)、甘蔗渣、玉米秸稈等不可食用的農(nóng)產(chǎn)廢棄物，柳枝稷、象草、芒草等能源作物，木屑，舊紙等。微生物的增殖在反應(yīng)之前，優(yōu)選將轉(zhuǎn)化體在有氧條件、溫度約25～40℃下培養(yǎng)約12～48小時(shí)而使其增殖。培養(yǎng)用培養(yǎng)基就反應(yīng)前的轉(zhuǎn)化體的有氧培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基而言，可以使用含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等的天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基。作為碳源，還可以使用：糖類(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖之類的單糖；蔗糖、麥芽糖、乳糖、纖維二糖、木二糖、海藻糖之類的二糖；淀粉之類的多糖；糖蜜等)；甘露醇、山梨醇、木酮糖、甘油之類的糖醇；乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、馬來(lái)酸、葡糖酸之類的有機(jī)酸；乙醇、丙醇之類的醇；正構(gòu)烷烴之類的烴等。碳源可以單獨(dú)使用1種，也可以將2種以上混合使用。作為氮源，可以使用氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、乙酸銨之類的無(wú)機(jī)或有機(jī)銨化合物，尿素，氨水，硝酸鈉，硝酸鉀等。另外，也可以使用玉米漿、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白質(zhì)水解物、氨基酸等含氮有機(jī)化合物等。氮源可以單獨(dú)使用1種，也可以將2種以上混合使用。氮源在培養(yǎng)基中的濃度雖然也根據(jù)所使用的氮化合物而不同，但通常可以設(shè)為約0.1～10(w/v％)。作為無(wú)機(jī)鹽類，可以列舉：磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硝酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鈷、碳酸鈣等。無(wú)機(jī)鹽可以單獨(dú)使用1種，也可以將2種以上混合使用。無(wú)機(jī)鹽類在培養(yǎng)基中的濃度雖然也根據(jù)所使用的無(wú)機(jī)鹽而不同，但通?？梢栽O(shè)為約0.01～1(w/v％)。作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以列舉：肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米漿、脫脂奶粉、脫脂大豆鹽酸水解物、動(dòng)植物或微生物菌體的提取物以及這些分解物等。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在培養(yǎng)基中的濃度雖然也根據(jù)所使用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而不同，但通?？梢栽O(shè)為約0.1～10(w/v％)。進(jìn)而，根據(jù)需要還可以添加維生素類。作為維生素類，可以列舉：生物素、硫胺素(維生素B1)、吡哆醇(維生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為約6～8。作為具體的優(yōu)選的棒狀細(xì)菌用培養(yǎng)基，可以列舉：A培養(yǎng)基〔Inui，M.etal.，MetabolicanalysisofCorynebacteriumglutamicumduringlactateandsuccinateproductionsunderoxygendeprivationconditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7：182-196(2004)〕、BT培養(yǎng)基〔Omumasaba，C.A.etal.，Corynebacteriumglutamicumglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseisoformswithopposite，ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：91-103(2004)〕等。這些培養(yǎng)基中，可以將糖類濃度設(shè)為上述范圍來(lái)使用。反應(yīng)液作為反應(yīng)液，可以使用含有碳源、氮源、及無(wú)機(jī)鹽類等的天然反應(yīng)液或合成反應(yīng)液。作為碳源，可以使用上述說(shuō)明的原料化合物或含有其的糖蜜、糖化液等。另外，作為碳源，除了糖類以外，還可以使用：甘露醇、山梨醇、木酮糖、甘油之類的糖醇；乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、馬來(lái)酸、葡糖酸之類的有機(jī)酸；乙醇、丙醇之類的醇；正構(gòu)烷烴之類的烴等。碳源可以單獨(dú)使用1種，也可以將2種以上混合使用。反應(yīng)液中的原料化合物的濃度優(yōu)選為約1～20(w/v％)，更優(yōu)選為約2～10(w/v％)，進(jìn)一步更優(yōu)選為約2～5(w/v％)。另外，含有原料化合物的總碳源濃度可以設(shè)為約2～5(w/v％)。作為氮源，可以使用：氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、乙酸銨之類的無(wú)機(jī)或有機(jī)銨化合物，尿素，氨水，硝酸鈉，硝酸鉀等。另外，還可以使用玉米漿、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白質(zhì)水解物、氨基酸等含氮有機(jī)化合物等。氮源可以單獨(dú)使用1種，也可以將2種以上混合使用。氮源在反應(yīng)液中的濃度雖然也根據(jù)所使用的氮化合物而不同，但通?？梢栽O(shè)為約0.1～10(w/v％)。作為無(wú)機(jī)鹽類，可以列舉：磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硝酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鈷、碳酸鈣等。無(wú)機(jī)鹽可以單獨(dú)使用1種，也可以將2種以上混合使用。無(wú)機(jī)鹽類在反應(yīng)液中的濃度雖然也根據(jù)所使用的無(wú)機(jī)鹽而不同，但通?？梢栽O(shè)為約0.01～1(w/v％)。進(jìn)而，根據(jù)需要還可以添加維生素類。作為維生素類，可以列舉：生物素、硫胺素(維生素B1)、吡哆醇(維生素B6)、泛酸、肌醇、尼克酸等。反應(yīng)液的pH優(yōu)選為約6～8。作為具體的優(yōu)選的棒狀細(xì)菌用反應(yīng)液，可以列舉上述BT培養(yǎng)基等。這些培養(yǎng)基中，可以將糖類濃度設(shè)為上述范圍來(lái)使用。反應(yīng)條件反應(yīng)溫度、即轉(zhuǎn)化體的生存溫度優(yōu)選為約15～50℃，更優(yōu)選為約25～45℃。若在上述溫度范圍，則可以高效地制造有機(jī)化合物。另外，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為約1～7天，更優(yōu)選為約1～3天。培養(yǎng)可以為分批式、流加式、連續(xù)式中的任意種。其中，優(yōu)選使用溫度、pH、通氣條件、氧濃度可控的分批式發(fā)酵槽(fed-batchfermentor)。反應(yīng)可以在有氧條件下進(jìn)行，也可以在還原條件下進(jìn)行。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體本身的有機(jī)化合物生產(chǎn)能力在有氧條件下更高。作為培養(yǎng)基的溶解氧濃度(D.O.)，優(yōu)選維持在約5％～30％的空氣飽和時(shí)的D.O.。但是，由于在有氧的條件下轉(zhuǎn)化體進(jìn)行增殖，與原料化合物被菌體增殖而消耗的部分相應(yīng)地，有機(jī)化合物的制造效率下降。因此，本發(fā)明中，優(yōu)選在有氧且轉(zhuǎn)化體不增殖的條件下進(jìn)行反應(yīng)。本發(fā)明中，不增殖包含實(shí)質(zhì)上不增殖、或幾乎不增殖。優(yōu)選例如以下方式：使用不影響通過(guò)轉(zhuǎn)化體的目標(biāo)化合物的生成反應(yīng)、但缺乏或限制微生物的增殖所必需的化合物、如生物素、硫胺素等維生素類、金屬鹽、氮源等中的1種以上的反應(yīng)液，來(lái)抑制轉(zhuǎn)化體的增殖。本發(fā)明中，更優(yōu)選使用不添加作為棒狀細(xì)菌的有氧增殖所必需的維生素的、生物素的反應(yīng)液。另外，在還原條件下，棒狀細(xì)菌實(shí)質(zhì)上不增殖，因此與原料化合物未由于增殖而消耗的部分相應(yīng)地，有機(jī)化合物的制造效率提高。還原條件由反應(yīng)液的氧化還原電位來(lái)規(guī)定。反應(yīng)液的氧化還原電位優(yōu)選為約-200mV～-500mV，更優(yōu)選為約-150mV～-500mV。反應(yīng)液的還原狀態(tài)可以簡(jiǎn)便地由刃天青指示劑(若為還原狀態(tài)，則由藍(lán)色褪色為無(wú)色)來(lái)推定，為了準(zhǔn)確，可以使用氧化還原電位差計(jì)(例如BROADLEYJAMES公司制、ORPElectrodes)來(lái)測(cè)定。處于還原條件下的反應(yīng)液的制備方法可以沒(méi)有限制地使用公知方法。例如，可以使用反應(yīng)液用水溶液來(lái)代替蒸餾水等，將其作為反應(yīng)液的液體介質(zhì)，反應(yīng)液用水溶液的制備方法可以參考例如硫酸還原微生物等絕對(duì)厭氧性微生物用培養(yǎng)液制備方法(Pfennig，N.etal.，(1981)：Thedissimilatorysulfate-reducingbacteria，InTheProkaryotes，AHandbookonHabitatsIsolationandIdentificationofBacteria，Ed.byStarr，M.P.etal.，p926-940，Berlin，SpringerVerlag.)、“農(nóng)藝化學(xué)實(shí)驗(yàn)書(shū)第三卷、京都大學(xué)農(nóng)學(xué)部農(nóng)藝化學(xué)教室編、1990年第26次印刷、產(chǎn)業(yè)圖書(shū)株式會(huì)社出版”等，來(lái)得到期望的還原條件下的水溶液。具體而言，可以通過(guò)對(duì)蒸餾水等進(jìn)行加熱處理或減壓處理將溶解氣體除去，從而得到還原條件下的反應(yīng)液用水溶液。此時(shí)，可以通過(guò)在約10mmHg以下、優(yōu)選為約5mmHg以下、更優(yōu)選為約3mmHg以下的減壓下將蒸餾水等處理約1～60分鐘左右、優(yōu)選為約5～40分鐘左右，從而除去溶解氣體、特別是溶解氧，制作還原條件下的反應(yīng)液用水溶液。另外，也可以添加適當(dāng)?shù)倪€原劑(例如，硫代乙醇酸、抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、巰基乙酸、巰基乙酸、谷胱甘肽、硫化鈉等)來(lái)制備還原條件下的反應(yīng)液用水溶液。將這些方法適當(dāng)組合而成的方法也是有效的還原條件的反應(yīng)液用水溶液的制備方法。在還原條件下反應(yīng)時(shí)，優(yōu)選反應(yīng)中也使反應(yīng)液維持還原條件。為了維持反應(yīng)過(guò)程中的還原條件，期望盡可能地防止混入來(lái)自反應(yīng)體系外的氧，具體而言，可以列舉：將反應(yīng)體系用氮?dú)獾炔换顫姎怏w、二氧化碳等密封的方法。作為更有效地防止氧混入的方法，為了在反應(yīng)過(guò)程中使本發(fā)明的有氧性細(xì)菌的菌體內(nèi)的代謝功能高效地發(fā)揮，有時(shí)也需要添加反應(yīng)體系的pH維持調(diào)整液、適當(dāng)添加各種營(yíng)養(yǎng)素溶解液，在這種情況下，預(yù)先從添加溶液中除去氧是有效的。有機(jī)化合物的回收通過(guò)以上述方式進(jìn)行培養(yǎng)，在反應(yīng)液中生產(chǎn)作為目標(biāo)的有機(jī)化合物。通過(guò)回收反應(yīng)液，可以回收作為目標(biāo)的有機(jī)化合物，進(jìn)而，還可以通過(guò)公知方法從反應(yīng)液分離作為目標(biāo)的有機(jī)化合物。作為這種公知方法，可以列舉：離子交換樹(shù)脂法、濃縮法、晶析法、膜分離法、有機(jī)溶劑提取法、各種吸附法等。實(shí)施例[實(shí)施例1]莽草酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建(1)從微生物提取染色體DNA從谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)R(FERMBP-18976)提取染色體DNA如下進(jìn)行：在A培養(yǎng)基[在蒸餾水1L中溶解有(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)FeSO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、維生素分析酪蛋白水解物(vitaminassaycasaminoacid)7g]中，添加50％(w/v)葡萄糖溶液使其最終濃度為4％來(lái)作為碳源，用鉑環(huán)接種細(xì)菌后，在33℃下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增殖期，收集菌體后，用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit、Amersham公司制)按照操作說(shuō)明書(shū)從所收集的菌體回收染色體DNA。從大腸桿菌(大腸桿菌K-12MG1655)提取染色體DNA如下進(jìn)行：在LB培養(yǎng)基[在蒸餾水1L中溶解有胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl5g]中用鉑環(huán)接種細(xì)菌后，在37℃下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增殖期，收集菌體后，用DNA基因組提取試劑盒(商品名：GenomicPrepCellsandTissueDNAIsolationKit、Amersham公司制)按照操作說(shuō)明書(shū)從所收集的菌體回收染色體DNA。(2)克隆載體的構(gòu)建(2-1)pCRB240克隆載體的構(gòu)建通過(guò)以下方法擴(kuò)增含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gapA基因的啟動(dòng)子序列的DNA片段、及含有來(lái)自克隆載體pKK223-3(Pharmacia公司制)的rrnBT1T2雙向終止子序列(此后記作終止子序列)的DNA片段。PCR時(shí)，基于含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的gapA啟動(dòng)子的基因序列(序列號(hào)12：谷氨酸棒狀桿菌gapA啟動(dòng)子序列)及克隆載體pKK223-3(序列號(hào)13：pKK223-3)分別合成了下述成對(duì)引物并使用。谷氨酸棒狀桿菌gapA啟動(dòng)子序列擴(kuò)增用引物(a-1)：5’-CTCTCTGCAGTCGCTCGTCTCATAAAAACGAC-3’(序列號(hào)14)(b-1)：5’-CTCTAAGCTTGTCGACGGATCCGCATGCTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3’(序列號(hào)15)需要說(shuō)明的是，引物(a-1)中添加有PstI限制酶位點(diǎn)，(b-1)中添加有HindIII限制酶位點(diǎn)。pKK223-3rrnB終止子序列擴(kuò)增用引物(a-2)：5’-CTCTGCATGCCTGTTTTGGCGGATGAGAGA-3’(序列號(hào)16)(b-2)：5’-CTCTAAGCTTGTCGACGGATCCAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG-3’(序列號(hào)17)需要說(shuō)明的是，引物(a-2)中添加有SphI限制酶位點(diǎn)，(b-2)中添加有HindIII限制酶位點(diǎn)。實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用由谷氨酸棒狀桿菌R菌株提取的染色體DNA及pKK223-3質(zhì)粒。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增谷氨酸棒狀桿菌gapA啟動(dòng)子序列時(shí)，以引物(a-1)和(b-1)的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增pKK223-3質(zhì)粒rrnB終止子序列時(shí)，以引物(a-2)和(b-2)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的gapA啟動(dòng)子序列的約0.5-kb的DNA片段及含有來(lái)自pKK223-3質(zhì)粒的rrnB終止子序列的約0.4-kb的DNA片段。DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的gapA啟動(dòng)子序列的約0.5-kbDNA片段用限制酶PstI和HindIII切斷后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將含有pBL1ori序列的克隆載體pCRB1[JMolMicrobiolBiotechnol.8(4)：243-254(2004)]用限制酶PstI和HindIII切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的gapA啟動(dòng)子序列的DNA片段10μl和pCRB1質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有氯霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。其結(jié)果是，除了質(zhì)粒pCRB1約4.1-kb的DNA片段以外，還確認(rèn)到來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的gapA啟動(dòng)子序列約0.5-kb的插入片段。將得到的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的gapA啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒命名為L(zhǎng)gap4。然后，將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有來(lái)自pKK223-3質(zhì)粒的rrnB終止子序列的約0.4-kbDNA片段用限制酶SphI和HindIII切斷后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將含有g(shù)apA啟動(dòng)子的克隆載體Lgap4用限制酶SphI和HindIII切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自pKK223-3質(zhì)粒的rrnB終止子序列的DNA片段10μl和Lgap4質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有氯霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。其結(jié)果是，除了質(zhì)粒Lgap4約4.5-kb的DNA片段以外，還確認(rèn)到來(lái)自pKK223-3質(zhì)粒的rrnB終止子序列約0.4-kb的插入片段。將得到的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的gapA啟動(dòng)子序列及來(lái)自pKK223-3質(zhì)粒的rrnB終止子序列的克隆載體命名為pCRB240。(3)莽草酸生產(chǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(3-1)pCRB237質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)以下的PCR法擴(kuò)增含有來(lái)自大腸桿菌K-12菌株的編碼3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶基因的aroG基因的DNA片段。PCR時(shí)，基于含有來(lái)自大腸桿菌K-12菌株的aroG基因的基因序列(序列號(hào)18：大腸桿菌aroG基因)分別合成了下述成對(duì)引物并使用。大腸桿菌aroG基因擴(kuò)增用引物(a-3)：5’-CTCTGATATCATGAATTATCAGAACGACGATTTACGC-3’(序列號(hào)19)(b-3)：5’-CTCTGATATCGACTTATCAGGCCTGTGGTG-3’(序列號(hào)20)需要說(shuō)明的是，引物(a-3)及(b-3)中添加有EcoRV限制酶位點(diǎn)。實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用由大腸桿菌K-12MG1655提取的染色體DNA。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增大腸桿菌aroG基因時(shí)，以引物(a-3)和(b-3)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：變性過(guò)程：98℃10秒退火過(guò)程：55℃5秒延伸過(guò)程：72℃67秒將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到來(lái)自大腸桿菌K-12菌株的aroG基因約1.1-kb的DNA片段。DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有來(lái)自大腸桿菌K-12菌株的aroG基因的約1.1-kbDNA片段用限制酶EcoRV切斷后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將含有g(shù)apA啟動(dòng)子的克隆載體pCRB210[國(guó)際公開(kāi)WO2012/033112]用限制酶EcoRV切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自大腸桿菌K-12菌株的aroG基因的DNA片段10μl和pCRB210質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。其結(jié)果是，除了質(zhì)粒pCRB210約5.1-kb的DNA片段以外，還確認(rèn)到來(lái)自大腸桿菌K-12菌株的aroG基因約1.1-kb的插入片段。將含有來(lái)自大腸桿菌K-12菌株的aroG基因的質(zhì)粒命名為pSKM1。使用上述質(zhì)粒pSKM1，通過(guò)反向PCR法制作將S180位點(diǎn)置換為苯丙氨酸(F)的突變體。PCR時(shí)，為了在aroG基因的S180位點(diǎn)導(dǎo)入突變，基于(序列號(hào)18：大腸桿菌aroG基因)分別合成下述引物并使用。大腸桿菌aroG基因突變導(dǎo)入用引物(a-4)：5’-TTTGTCCGGTCGGCTTCAAAAATG-3’(序列號(hào)21)(b-4)：5’-AAAGCCCTGATGCCAGTTC-3’(序列號(hào)22)實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用含有來(lái)自大腸桿菌K-12菌株的aroG基因的質(zhì)粒pSKM1。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。PCR循環(huán)：變性過(guò)程：98℃10秒退火過(guò)程：60℃5秒延伸過(guò)程：68℃374秒將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到含有來(lái)自大腸桿菌K-12菌株的aroG基因的約6.2-kb的DNA片段。DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物用T4多核苷酸激酶(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行磷酸化處理后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。使用所得到的進(jìn)行了磷酸化處理的DNA片段通過(guò)DNA連接反應(yīng)試劑盒(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行結(jié)合(自身連接)。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[J.Mol.Biol.53：159-162(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，對(duì)該質(zhì)粒的堿基序列進(jìn)行測(cè)序解析，從而確認(rèn)向aroG基因的S180位點(diǎn)導(dǎo)入了突變。將得到的質(zhì)粒命名為pCRB237。需要說(shuō)明的是，將本質(zhì)粒的基因重組的概要綜合示于后述的表1。(3-2)pCRB239質(zhì)粒的構(gòu)建使用上述質(zhì)粒pSKM1通過(guò)反向PCR法制作將P150位點(diǎn)置換為亮氨酸(L)的突變體。PCR時(shí)，為了在aroG基因的P150位點(diǎn)導(dǎo)入突變，基于(序列號(hào)18：大腸桿菌aroG基因)分別合成下述引物并使用。大腸桿菌aroG基因突變導(dǎo)入用引物(a-5)：5’-TACAATATCTCGCTGACCTGATG-3’(序列號(hào)23)(b-5)：5’-GGGTGATCATATCGAGAAACTC-3’(序列號(hào)24)實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用含有來(lái)自大腸桿菌K-12菌株的aroG基因的質(zhì)粒pSKM1。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。PCR循環(huán)：變性過(guò)程：98℃10秒退火過(guò)程：60℃5秒延伸過(guò)程：68℃374秒將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到含有來(lái)自大腸桿菌K-12菌株的aroG基因的約6.2-kb的DNA片段。DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物用T4多核苷酸激酶(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行磷酸化處理后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。使用所得到的進(jìn)行了磷酸化處理的DNA片段通過(guò)DNA連接反應(yīng)試劑盒(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行結(jié)合(自身連接)。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[J.Mol.Biol.53：159-162(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，對(duì)該質(zhì)粒的堿基序列進(jìn)行測(cè)序解析，從而確認(rèn)在aroG基因的P150位點(diǎn)導(dǎo)入了突變。將得到的質(zhì)粒命名為pCRB239。需要說(shuō)明的是，將本質(zhì)粒的基因重組的概要綜合示于表1。(3-3)pCRB238質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)以下的PCR法擴(kuò)增含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的編碼3-脫氫奎寧酸合成酶基因的aroB基因、編碼3-脫氫奎寧酸脫水酶基因的aroD基因及編碼莽草酸脫氫酶基因的aroE基因的DNA片段。PCR時(shí)，基于含有aroB基因的基因序列(序列號(hào)25：谷氨酸棒狀桿菌aroB基因)、含有aroD基因的基因序列(序列號(hào)26：谷氨酸棒狀桿菌aroD基因)及含有aroE基因的基因序列(序列號(hào)27：谷氨酸棒狀桿菌aroE基因)，分別合成了下述成對(duì)引物并使用。谷氨酸棒狀桿菌aroB基因擴(kuò)增用引物(a-6)：5’-CTCTGAATTCATGAGCGCAGCGCAGATTTT-3’(序列號(hào)28)(b-6)：5’-CTCTCCCGGGAAGTGGATAACTTCTAGTCC-3’(序列號(hào)29)需要說(shuō)明的是，引物(a-6)中添加有EcoRI限制酶位點(diǎn)，(b-6)中添加有SmaI限制酶位點(diǎn)。谷氨酸棒狀桿菌aroD基因擴(kuò)增用引物(a-7)：5’-CTCTGAATTCATGCTTGGAAAAATTCTCCTCC-3’(序列號(hào)30)(b-7)：5’-CTCTCCCGGGCTACTTTTTGAGATTTGCCA-3’(序列號(hào)31)需要說(shuō)明的是，引物(a-7)中添加有EcoRI限制酶位點(diǎn)，(b-7)中添加有SmaI限制酶位點(diǎn)。谷氨酸棒狀桿菌aroE基因擴(kuò)增用引物(a-8)：5’-CTCTCCCGGGATAAGGATCAACGAATAAAA-3’(序列號(hào)32)(b-8)：5’-CTCTCTGCAGCTAGTGTTCTTCCGAGATGC-3’(序列號(hào)33)需要說(shuō)明的是，引物(a-8)中添加有SmaI限制酶位點(diǎn)，(b-8)中添加有PstI限制酶位點(diǎn)。實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用由谷氨酸棒狀桿菌R提取的染色體DNA。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增谷氨酸棒狀桿菌aroB基因時(shí)，以引物(a-6)和(b-6)的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增谷氨酸棒狀桿菌aroD基因時(shí)，以引物(a-7)和(b-7)的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增谷氨酸棒狀桿菌aroE基因時(shí)，以引物(a-8)和(b-8)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到谷氨酸棒狀桿菌aroB基因約1.1-kb、谷氨酸棒狀桿菌aroD基因約0.4-kb、谷氨酸棒狀桿菌aroE基因約0.8-kb的DNA片段。各DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因的約1.1-kbDNA片段、含有aroD基因的約0.4-kbDNA片段、含有aroE基因的約0.8-kbDNA片段用限制酶EcoRI和SmaI(aroB基因及aroD基因)或SmaI和PstI(aroE基因)切斷后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將含有Ptac啟動(dòng)子的克隆載體pKK223-3(Pharmacia公司制)用限制酶EcoRI和SmaI(aroB基因及aroD基因)或SmaI和PstI(aroE基因)切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因的各片段10μl和pKK223-3質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)各培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。其結(jié)果是，除了質(zhì)粒pKK223-3約4.6-kb的DNA片段以外，還分別確認(rèn)到來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因約1.1-kb、aroD基因約0.4-kb、aroE基因約0.8-kb的插入片段。將得到的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因的質(zhì)粒命名為pSKM2、將含有aroD基因的質(zhì)粒命名為pSKM3、將含有aroE基因的質(zhì)粒命名為pSKM4。然后，將上述質(zhì)粒pSKM3用限制酶KpnI和SalI切斷，進(jìn)行瓊脂糖電泳后，通過(guò)QIAquick凝膠提取試劑盒(株式會(huì)社Qiagen公司制)從瓊脂糖凝膠回收含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroD基因的約0.7-kb的DNA片段。另外，將含有pCASE1ori序列的克隆載體pCRB22[ApplEnvironMicrobiol.78(3)：865-875(2012)]用限制酶KpnI和SalI切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將來(lái)自pSKM3的基因片段10μl和pCRB22質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒將限制酶分別切斷后，確認(rèn)插入片段。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的araD基因的質(zhì)粒命名為pSKM5。然后，將上述含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因的質(zhì)粒pSKM2用限制酶SalI切斷，進(jìn)行瓊脂糖電泳后，通過(guò)QIAquick凝膠提取試劑盒(株式會(huì)社Qiagen公司制)從瓊脂糖凝膠回收含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因的約1.7-kb的DNA片段。另外，將上述含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroD基因的質(zhì)粒pSKM5用限制酶SalI切斷后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自pSKM2的aroB基因的DNA片段10μl和pSKM5質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)反應(yīng)后使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因及araD基因的質(zhì)粒命名為pSKM6。然后，由上述含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroE基因的質(zhì)粒pSKM4通過(guò)以下的PCR法擴(kuò)增含有aroE基因的DNA片段。PCR時(shí)，基于含有aroE基因的質(zhì)粒pSKM4的基因序列(序列號(hào)34：pSKM4質(zhì)粒序列)分別合成了下述成對(duì)引物并使用。谷氨酸棒狀桿菌aroE基因擴(kuò)增用引物(a-9)：5’-CTCTGGTACCGGCTGTGCAGGTCGTAAATC-3’(序列號(hào)35)(b-9)：5’-CTCTGGTACCCTAGTGTTCTTCCGAGATGC-3’(序列號(hào)36)需要說(shuō)明的是，引物(a-1)及(b-1)中添加有KpnI限制酶位點(diǎn)。實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用含有谷氨酸棒狀桿菌aroE基因的質(zhì)粒pSKM4。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增谷氨酸棒狀桿菌aroE基因時(shí)，以引物(a-9)和(b-9)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：變性過(guò)程：98℃10秒退火過(guò)程：55℃5秒延伸過(guò)程：72℃63秒將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到含有谷氨酸棒狀桿菌aroE基因的約1.0-kb的DNA片段。DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroE基因的約1.0-kbDNA片段用限制酶KpnI切斷后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將上述含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因及araD基因的質(zhì)粒pSKM6用限制酶KpnI切斷后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自pSKM4的aroE基因的DNA片段10μl和pSKM6質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因的質(zhì)粒命名為pSKM7。然后，由上述含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因的質(zhì)粒pSKM7通過(guò)以下的PCR法擴(kuò)增含有aroB基因、aroD基因及aroE基因的DNA片段。PCR時(shí)，基于含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因的質(zhì)粒pSKM7的基因序列(序列號(hào)37：pSKM7質(zhì)粒序列)分別合成了下述成對(duì)引物并使用。谷氨酸棒狀桿菌aroB、aroD、aroE基因擴(kuò)增用引物(a-10)：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(序列號(hào)38)(b-10)：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’(序列號(hào)39)實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因的質(zhì)粒pSKM7。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因時(shí)，以引物(a-10)和(b-10)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：變性過(guò)程：98℃10秒退火過(guò)程：55℃5秒延伸過(guò)程：72℃215秒將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因的約3.6-kb的DNA片段。DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物用T4多核苷酸激酶(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行磷酸化處理后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將含有pBL1ori序列的克隆載體pCRB1[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8(4)：243-254(2004)]用限制酶SmaI切斷后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自pSKM7的aroB基因、aroD基因及aroE基因的DNA片段10μl和pCRB1質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有氯霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroB基因、aroD基因及aroE基因的質(zhì)粒命名為pCRB238。需要說(shuō)明的是，將本質(zhì)粒的基因重組的概要綜合示于表1。[表1]莽草酸生產(chǎn)相關(guān)基因表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)粒名導(dǎo)入基因基因來(lái)源ori抗藥性標(biāo)志pCRB237aroG(S180F)大腸桿菌pCASE1卡那霉素pCRB239aroG(P150L)大腸桿菌pCASE1卡那霉素pCRB238aroB，aroD，aroE谷氨酸棒狀桿菌pBL1氯霉素(4)戊糖磷酸途徑基因表達(dá)強(qiáng)化(4)-1tkt-tal基因無(wú)標(biāo)記(マ一カ一レス)染色體導(dǎo)入用質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)以下的PCR法擴(kuò)增含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的編碼轉(zhuǎn)酮醇酶基因的tkt基因及編碼轉(zhuǎn)醛醇酶基因的tal基因的DNA片段。PCR時(shí)，基于含有tkt基因及tal基因的基因序列(序列號(hào)40：谷氨酸棒狀桿菌tkt-tal基因)分別合成了下述成對(duì)引物并使用。谷氨酸棒狀桿菌tkt-tal基因擴(kuò)增用引物(a-11)：5’-CTCTCATATGACGCTGTCACCTGAAC-3’(序列號(hào)41)(b-11)：5’-CTCTCATATGCTACTTCAGGCGAGCTTC-3’(序列號(hào)42)需要說(shuō)明的是，引物(a-11)及(b-11)中添加有NdeI限制酶位點(diǎn)。實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA示于由谷氨酸棒狀桿菌R菌株提取的染色體DNA。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增谷氨酸棒狀桿菌tkt-tal基因時(shí)，以引物(a-11)和(b-11)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：變性過(guò)程：98℃10秒退火過(guò)程：55℃5秒延伸過(guò)程：72℃225秒將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的tkt-tal基因的約3.4-kb的DNA片段。DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的tkt-tal基因的約3.4-kbDNA片段用限制酶NdeI切斷后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將含有PgapA啟動(dòng)子的克隆載體pCRB209[國(guó)際公開(kāi)WO2012/033112]用限制酶NdeI切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的tkt-tal基因的DNA片段10μl和pCRB209質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。其結(jié)果是，除了質(zhì)粒pCRB209約5.1-kb的DNA片段以外，還確認(rèn)到含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的tkt-tal基因的約3.4-kb的插入片段。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的tkt-tal基因的質(zhì)粒命名為pSKM8。然后，基于已報(bào)道的谷氨酸棒狀桿菌R菌株的增殖中非必需的序列[Appl.Environ.Microbiol.71：3369-3372(2005)](SSI區(qū)域)，來(lái)確定在谷氨酸棒狀桿菌R菌株的染色體中以無(wú)標(biāo)記方式導(dǎo)入tkt-tal基因所必需的DNA區(qū)域。通過(guò)以下的PCR法擴(kuò)增該DNA區(qū)域(SSI9區(qū)域)。PCR時(shí)，基于含有SSI9區(qū)域的基因序列(序列號(hào)43：谷氨酸棒狀桿菌SSI9區(qū)域)分別合成了下述成對(duì)引物并使用。谷氨酸棒狀桿菌SSI9區(qū)域擴(kuò)增用引物(a-12)：5’-CTCTCCTGCAGGTAATGGTGTCGACCGACATC-3’(序列號(hào)44)(b-12)：5’-CTCTCCTGCAGGAAGTTAGATGTGGCTCCGAC-3’(序列號(hào)45)引物(a-12)及(b-12)中添加有Sse8387I限制酶位點(diǎn)。實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用由谷氨酸棒狀桿菌R提取的染色體DNA。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域時(shí)，以引物(a-12)和(b-12)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：變性過(guò)程：98℃10秒退火過(guò)程：55℃5秒延伸過(guò)程：72℃180秒將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域的約3.0-kb的DNA片段。DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域的約3.0-kbDNA片段用限制酶Sse8387I切斷后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將無(wú)標(biāo)記基因?qū)胗觅|(zhì)粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：243-254(2004)、(日本特開(kāi)2006-124440)]用限制酶EcoRV切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域的基因片段10μl和pCRA725質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)各培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。其結(jié)果是，除了質(zhì)粒pCRA725約4.4-kb的DNA片段以外，還確認(rèn)到來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域約3.0-kb的插入片段。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域的質(zhì)粒命名為pSKM9。將上述質(zhì)粒pSKM8用BglII和SphI切斷，進(jìn)行瓊脂糖電泳后，通過(guò)QIAquick凝膠提取試劑盒(株式會(huì)社Qiagen公司制)從瓊脂糖凝膠回收含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的tkt-tal基因的約4.3kb的DNA片段后，通過(guò)DNABluntingKit(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行平滑化。另外，將上述質(zhì)粒pSKM9用限制酶NaeI切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的tkt-tal基因的DNA片段10μl和pSKM9質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。將得到的來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的tkt-tal基因的SSI9區(qū)域?qū)胗觅|(zhì)粒命名為pSKM10。(5)與PTS不同的葡萄糖輸送體系(非PTS葡萄糖通透酶)介導(dǎo)的糖攝取活性的強(qiáng)化(5-1)iolT1基因無(wú)標(biāo)記染色體導(dǎo)入用質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)以下的PCR法擴(kuò)增含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R的iolT1基因的DNA片段，所述iolT1基因編碼作為非PTS葡萄糖通透酶的肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)體基因。PCR時(shí)，基于含有iolT1基因的序列(序列號(hào)46：谷氨酸棒狀桿菌iolT1基因)分別合成了下述成對(duì)引物并使用。谷氨酸棒狀桿菌iolT1基因擴(kuò)增用引物(a-13)：5’-GGAGACCATATGGCTAGTACCTTCATTCAG-3’(序列號(hào)47)(b-13)：5’-CCTATTGCATATGAGTGTGCTTCACTCCCG-3’(序列號(hào)48)需要說(shuō)明的是，引物(a-13)及(b-13)中添加有NdeI限制酶位點(diǎn)。實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用由谷氨酸棒狀桿菌R提取的染色體DNA。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的iolT1基因時(shí)，以引物(a-13)和(b-13)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：變性過(guò)程：98℃10秒退火過(guò)程：55℃5秒延伸過(guò)程：72℃97秒將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的iolT1基因約1.6-kb的DNA片段。各DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。然后，基于已報(bào)道的谷氨酸棒狀桿菌R菌株的增殖中非必需的序列[Appl.Environ.Microbiol.71：3369-3372(2005)](SSI區(qū)域)，來(lái)確定在谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)R菌株的染色體中以無(wú)標(biāo)記方式導(dǎo)入iolT1基因所必需的DNA區(qū)域。通過(guò)以下的PCR法擴(kuò)增該DNA區(qū)域(SSI3區(qū)域)。PCR時(shí)，基于含有SSI3區(qū)域的基因序列(序列號(hào)49：谷氨酸棒狀桿菌SSI3區(qū)域)分別合成了下述成對(duì)引物并使用。谷氨酸棒狀桿菌SSI3區(qū)域擴(kuò)增用引物(a-14)：5’-CTCTGTCGACGAGATCGTACTTCGTAGGC-3’(序列號(hào)50)(b-14)：5’-CTCTGTCGACAGCTCGAAATCGAAGACCG-3’(序列號(hào)51)需要說(shuō)明的是，引物(a-14)及(b-14)中添加有SalI限制酶位點(diǎn)。實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用由谷氨酸棒狀桿菌R提取的染色體DNA。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI3區(qū)域時(shí)，以引物(a-1)和(b-1)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：變性過(guò)程：98℃10秒退火過(guò)程：55℃5秒延伸過(guò)程：72℃181秒將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI3區(qū)域約3.0-kb的DNA片段。各DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI3區(qū)域的約3.0-kbDNA片段用限制酶SalI切斷后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將無(wú)標(biāo)記基因?qū)胗觅|(zhì)粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：243-254(2004)、(日本特開(kāi)2006-124440)]用限制酶SalI切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI3區(qū)域的DNA片段10μl和pCRA725質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。其結(jié)果是，除了質(zhì)粒pCRA725約4.4-kb的DNA片段以外，還確認(rèn)到含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI3區(qū)域的約3.0-kb的插入片段。將得到的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI3區(qū)域的質(zhì)粒命名為pSKM11。然后，為了在上述質(zhì)粒pSKM11的SSI3區(qū)域?qū)胗糜诨蛑亟M的限制酶位點(diǎn)(單一位點(diǎn))而進(jìn)行反向PCR法。PCR時(shí)，基于含有SSI3區(qū)域的基因序列(序列號(hào)49：谷氨酸棒狀桿菌SSI3)分別合成下述成對(duì)引物并使用。谷氨酸棒狀桿菌SSI3區(qū)域限制酶位點(diǎn)導(dǎo)入用引物(a-15)：5’-CTCTAGATCTACCAACTCCCAGAGCC-3’(序列號(hào)52)(b-15)：5’-CTCTAGATCTTTGGCCAGGTCGAACAG-3’(序列號(hào)53)需要說(shuō)明的是，引物(a-15)及(b-15)中添加有BglII限制酶位點(diǎn)。實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI3區(qū)域的質(zhì)粒pSKM11。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI3區(qū)域的質(zhì)粒時(shí)，以引物(a-15)和(b-15)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：變性過(guò)程：98℃10秒退火過(guò)程：60℃5秒延伸過(guò)程：68℃448秒將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI3區(qū)域的約7.5-kb的DNA片段。DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物用BglII處理后，通過(guò)DNA連接反應(yīng)試劑盒(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行結(jié)合(自身連接)。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[J.Mol.Biol.53：159-162(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，對(duì)該質(zhì)粒的堿基序列進(jìn)行測(cè)序解析，從而確認(rèn)在SSI3區(qū)域中導(dǎo)入了BglII限制酶位點(diǎn)。將得到的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI3區(qū)域的質(zhì)粒命名為pSKM12。然后，為了在上述質(zhì)粒pSKM12中導(dǎo)入tac啟動(dòng)子及rrnB終止子，將含有tac啟動(dòng)子的克隆載體pCRB214[FEBSLetters，586(23)：4228-4232(2012)]用BamHI切斷，進(jìn)行瓊脂糖電泳后，通過(guò)QIAquick凝膠提取試劑盒(株式會(huì)社Qiagen公司制)從瓊脂糖凝膠回收連接有tac啟動(dòng)子及rrnB終止子序列的約0.7-kb的DNA片段。另外，將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌株的SSI3區(qū)域的質(zhì)粒pSKM12用BglII切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將由pCRB214回收的含有tac啟動(dòng)子及rrnB終止子的DNA片段10μl和pSKM12質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。將得到的含有tac啟動(dòng)子序列、rrnB終止子序列及SSI3區(qū)域的質(zhì)粒命名為pSKM13。將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的iolT1基因的約1.6-kbDNA片段用限制酶NdeI切斷后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將含有tac啟動(dòng)子序列、rrnB終止子序列及SSI3區(qū)域的克隆載體pSKM13用限制酶NdeI切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的iolT1基因的DNA片段10μl和pSKM13質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)各培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。其結(jié)果是，除了質(zhì)粒pSKM13約8.5-kb的DNA片段以外，還確認(rèn)到來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的iolT1基因約1.6-kb的插入片段。將得到的來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的iolT1基因的SSI3區(qū)域?qū)胗觅|(zhì)粒命名為pSKM14。(6)葡萄糖激酶活性的強(qiáng)化(6-1)葡萄糖激酶基因無(wú)標(biāo)記染色體導(dǎo)入用質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)以下的PCR法擴(kuò)增含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的編碼葡萄糖激酶基因的glk1基因、glk2基因及ppgK基因的DNA片段。PCR時(shí)，基于含有g(shù)lk1基因的序列(序列號(hào)54：谷氨酸棒狀桿菌glk1基因)、含有g(shù)lk2基因的序列(序列號(hào)55：谷氨酸棒狀桿菌glk2基因)及含有ppgK基因的序列(序列號(hào)56：谷氨酸棒狀桿菌ppgK基因)分別合成了下述成對(duì)引物并使用。谷氨酸棒狀桿菌glk1基因擴(kuò)增用引物(a-16)：5’-CTCTGCATGCCACAAAAACCGGCC-3’(序列號(hào)57)(b-16)：5’-CTCTGCATGCCTAGTTGGCTTCCAACACG-3’(序列號(hào)58)需要說(shuō)明的是，引物(a-16)及(b-16)中添加有SphI限制酶位點(diǎn)。谷氨酸棒狀桿菌glk2基因擴(kuò)增用引物(a-17)：5’-CTCTCATATGACTGATCCCACTTGCAC-3’(序列號(hào)59)(b-17)：5’-CTCTCATATGGAGAACAGCGTTTTAGGTGC-3’(序列號(hào)60)需要說(shuō)明的是，引物(a-17)及(b-17)中添加有NdeI限制酶位點(diǎn)。谷氨酸棒狀桿菌ppgK基因擴(kuò)增用引物(a-18)：5’-CTCTCATATGGCGCGCGGCG-3’(序列號(hào)61)(b-18)：5’-CTCTCATATGTTATGGGGTGAGGTGTTGG-3’(序列號(hào)62)需要說(shuō)明的是，引物(a-18)及(b-18)中添加有NdeI限制酶位點(diǎn)。實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用由谷氨酸棒狀桿菌R提取的染色體DNA。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk1基因時(shí)，以引物(a-16)和(b-16)的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增glk2基因時(shí)，以引物(a-17)和(b-17)的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增ppgK基因時(shí)，以引物(a-18)和(b-18)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk1基因的約1.0-kb的DNA片段、含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk2基因的約0.9-kb的DNA片段及含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的ppgK基因的約1.2-kb的DNA片段。各DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk1基因的約1.0-kb用限制酶SphI切斷后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將含有g(shù)apA啟動(dòng)子的克隆載體pCRB240用限制酶SphI切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk1基因的DNA片段10μl和pCRB240質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有氯霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。其結(jié)果是，除了質(zhì)粒pCRB240約5.0-kb的DNA片段以外，還確認(rèn)到來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk1基因約1.0-kb的插入片段。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk1基因的質(zhì)粒命名為pSKM15。然后，將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk2基因的約0.9-kb的DNA片段及含有ppgK基因的約1.2-kb的DNA片段用限制酶NdeI切斷后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將含有g(shù)apA啟動(dòng)子的克隆載體pCRB210[國(guó)際公開(kāi)WO2012/033112]用限制酶NdeI切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk2基因或ppgK基因的DNA片段10μl和pCRB210質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等成分成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)各培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。其結(jié)果是，除了質(zhì)粒pCRB210約5.1-kb的DNA片段以外，在來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk2基因的情況下還確認(rèn)到約0.9-kb的插入片段，在ppgK基因的情況下還確認(rèn)到約1.2-kb的插入片段。將得到的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk2基因的質(zhì)粒命名為pSKM16，將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的ppgK基因的質(zhì)粒命名為pSKM17。然后，基于已報(bào)道的谷氨酸棒狀桿菌R菌株的增殖中非必需的序列[Appl.Environ.Microbiol.71：3369-3372(2005)](SSI區(qū)域)，來(lái)確定在谷氨酸棒狀桿菌R菌株的染色體中以無(wú)標(biāo)記方式導(dǎo)入葡萄糖激酶基因所必需的DNA區(qū)域。通過(guò)以下的PCR法擴(kuò)增該DNA區(qū)域(SSI9、10、6區(qū)域)。PCR時(shí)，基于含有SSI9區(qū)域的基因序列(序列號(hào)63：谷氨酸棒狀桿菌SSI9區(qū)域)、含有SSI10區(qū)域的基因序列(序列號(hào)64：谷氨酸棒狀桿菌SSI10區(qū)域)及含有SSI6區(qū)域的基因序列(序列號(hào)65：谷氨酸棒狀桿菌SSI6區(qū)域)分別合成了下述成對(duì)引物并使用。谷氨酸棒狀桿菌SSI9區(qū)域擴(kuò)增用引物(a-19)：5’-CTCTCCTGCAGGTCCAGTGTGGATCGCAAC-3’(序列號(hào)66)(b-19)：5’-CTCTCCTGCAGGGAGGATATGGTGACTAGCTTG-3’(序列號(hào)67)引物(a-19)及(b-19)中添加有Sse8387I限制酶位點(diǎn)。谷氨酸棒狀桿菌SSI10區(qū)域擴(kuò)增用引物(a-20)：5’-CTCTCCTGCAGGCACCGTTGTCAGCTTCACT-3’(序列號(hào)68)(b-20)：5’-CTCTCCTGCAGGCTGACTGTGGCATACCTCTA-3’(序列號(hào)69)引物(a-20)及(b-20)中添加有Sse8387I限制酶位點(diǎn)。谷氨酸棒狀桿菌SSI6區(qū)域擴(kuò)增用引物(a-21)：5’-CTCTCCTGCAGGTTGGGAACTTAGCTAGGTCG-3’(序列號(hào)70)(b-21)：5’-CTCTCCTGCAGGTGGAATCAGGATCAGATGCG-3’(序列號(hào)71)引物(a-21)及(b-21)中添加有Sse8387I限制酶位點(diǎn)。實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用由谷氨酸棒狀桿菌R提取的染色體DNA。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域時(shí)，以引物(a-19)和(b-19)的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增SSI10區(qū)域時(shí)，以引物(a-20)和(b-20)的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增SSI6區(qū)域時(shí)，以引物(a-21)和(b-21)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域約3.2-kb的DNA片段、SSI10區(qū)域約2.5-kb的DNA片段、SSI6區(qū)域約3.1-kb的DNA片段。各DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域的約3.2-kbDNA片段、含有SSI10區(qū)域的約2.5-kb的DNA片段及含有SSI6區(qū)域的約3.1-kb的DNA片段用限制酶Sse8387I切斷后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將無(wú)標(biāo)記基因?qū)胗觅|(zhì)粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，8：243-254(2004)、(日本特開(kāi)2006-124440)]用限制酶Sse8387I切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域的DNA片段、含有SSI10區(qū)域的DNA片段、或含有SSI6區(qū)域的DNA片段10μl分別與pCRA725質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。其結(jié)果是，除了質(zhì)粒pCRA725約4.4-kb的DNA片段以外，還確認(rèn)到含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域的約3.2-kb的DNA片段、含有SSI10區(qū)域的約2.5-kb的DNA片段及含有SSI6的區(qū)域約3.1-kb的DNA片段的插入片段。將得到的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域的質(zhì)粒命名為pSKM18，將含有SSI10區(qū)域的質(zhì)粒命名為pSKM19，將含有SSI6區(qū)域的質(zhì)粒命名為pSKM20。為了在上述含有SSI9區(qū)域的質(zhì)粒pSKM18及含有SSI6區(qū)域的質(zhì)粒pSKM20中導(dǎo)入用于基因重組的限制酶位點(diǎn)(單一位點(diǎn))而進(jìn)行反向PCR法。PCR時(shí)，基于含有SSI9區(qū)域的基因序列(序列號(hào)63：谷氨酸棒狀桿菌SSI9區(qū)域)、含有SSI6區(qū)域的基因序列(序列號(hào)65：谷氨酸棒狀桿菌SSI6區(qū)域)分別合成了下述成對(duì)引物并使用。谷氨酸棒狀桿菌SSI9區(qū)域限制酶位點(diǎn)導(dǎo)入用引物(a-22)：5’-CTCTGATATCCTTCCTAAACGATGAGCGAG-3’(序列號(hào)72)(b-22)：5’-CTCTGATATCTTGGTCAGTTCAGTCTGGAG-3’(序列號(hào)73)引物(a-22)及(b-22)中添加有EcoRV限制酶位點(diǎn)。谷氨酸棒狀桿菌SSI6區(qū)域限制酶位點(diǎn)導(dǎo)入用引物(a-23)：5’-CTCTAGTACTGCAGATCCATTTCATTGCGC-3’(序列號(hào)74)(b-23)：5’-CTCTAGTACTTGGTGGAATTACACGCACC-3’(序列號(hào)75)引物(a-23)及(b-23)中添加有ScaI限制酶位點(diǎn)。實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用含有SSI9區(qū)域的質(zhì)粒pSKM18及含有SSI6區(qū)域的質(zhì)粒pSKM20。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域的質(zhì)粒時(shí)，以引物(a-22)和(b-22)的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增含有SSI6區(qū)域的質(zhì)粒時(shí)，以引物(a-23)和(b-23)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域的約7.7-kb的DNA片段及含有SSI6區(qū)域的約7.6-kb的DNA片段。各DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有SSI9區(qū)域的DNA片段用限制酶EcoRV處理，將含有SSI6區(qū)域的DNA片段用限制酶ScaI處理，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，通過(guò)DNA連接反應(yīng)試劑盒(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行結(jié)合(自身連接)。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[J.Mol.Biol.53：159-162(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，對(duì)該質(zhì)粒的堿基序列進(jìn)行測(cè)序解析，從而確認(rèn)在SSI9區(qū)域中導(dǎo)入了EcoRV限制酶位點(diǎn)、在SSI6區(qū)域中導(dǎo)入了ScaI限制酶位點(diǎn)。將得到的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的SSI9區(qū)域的質(zhì)粒命名為pSKM21，將含有SSI6區(qū)域的質(zhì)粒命名為pSKM22。將上述質(zhì)粒pSKM15用限制酶PstI和HindIII切斷，進(jìn)行瓊脂糖電泳后，從瓊脂糖凝膠通過(guò)QIAquick凝膠提取試劑盒(株式會(huì)社Qiagen公司制)回收，將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk1基因的約1.9-kb的DNA片段通過(guò)DNABluntingKit(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行平滑化。另外，將上述質(zhì)粒pSKM21用限制酶EcoRV切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk1基因的DNA片段10μl和pSKM21質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。將來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk1基因的染色體SSI9區(qū)域?qū)胗觅|(zhì)粒命名為pSKM23。將上述質(zhì)粒pSKM16用限制酶SalI切斷，進(jìn)行瓊脂糖電泳后，從瓊脂糖凝膠通過(guò)QIAquick凝膠提取試劑盒(株式會(huì)社Qiagen公司制)回收含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk2基因的約1.9-kb的DNA片段。另外，將上述質(zhì)粒pSKM19用限制酶XhoI切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk2基因的DNA片段10μl和pSKM19質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。將來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的glk2基因的染色體SSI10區(qū)域?qū)胗觅|(zhì)粒命名為pSKM24。將上述質(zhì)粒pSKM17用限制酶XbaI和PstI切斷，進(jìn)行瓊脂糖電泳后，從瓊脂糖凝膠通過(guò)QIAquick凝膠提取試劑盒(株式會(huì)社Qiagen公司制)回收含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的ppgK基因的約1.9-kb的DNA片段后，通過(guò)DNABluntingKit(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行平滑化。另外，將上述質(zhì)粒pSKM22用限制酶ScaI切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的ppgK基因的DNA片段10μl和pSKM22質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。將來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的ppgK基因的染色體SSI6區(qū)域?qū)胗觅|(zhì)粒命名為pSKM25。(7)谷氨酸棒狀桿菌的染色體基因破壞用質(zhì)粒的構(gòu)建(7-1)谷氨酸棒狀桿菌R菌株qsuB基因、qsuD基因及hdpA基因破壞用質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)以下的PCR法擴(kuò)增用于構(gòu)建谷氨酸棒狀桿菌R菌株的編碼3-脫氫莽草酸脫水酶的染色體qsuB基因、編碼奎寧酸/莽草酸脫氫酶的qsuD基因及編碼二羥丙酮磷酸磷酸酶(HAD(haloaciddehalogenase，鹵酸脫鹵酶)超家族磷酸酶的hdpA基因的無(wú)標(biāo)記破壞用質(zhì)粒所必需的DNA片段。PCR時(shí)，基于含有qsuB基因的序列(序列號(hào)76：谷氨酸棒狀桿菌qsuB基因)、含有qsuD基因的序列(序列號(hào)77：谷氨酸棒狀桿菌qsuD基因)及含有hdpA基因的序列(序列號(hào)78：谷氨酸棒狀桿菌hdpA基因)分別合成了下述成對(duì)引物并使用。谷氨酸棒狀桿菌qsuB基因擴(kuò)增用引物(a-24)：5’-CTCTGTCGACCTCAGATTGGTTTCGCAGTC-3’(序列號(hào)79)(b-24)：5’-CTGATTGCGCACCAAACCAAGAACGTATCCAAGCAGGTTC-3’(序列號(hào)80)(a-25)：5’-TTGGTTTGGTGCGCAATCAG-3’(序列號(hào)81)(b-25)：5’-CTCTGTCGACTCAACGGTAGGAAGCTCAG-3’(序列號(hào)82)引物(a-24)及(b-25)中添加有SalI限制酶位點(diǎn)。谷氨酸棒狀桿菌qsuD基因擴(kuò)增用引物(a-26)：5’-CTCTGTCGACGTTCTTCGAAGTGGTGGAAC-3’(序列號(hào)83)(b-26)：5’-GTGAGGCAGCTGACATCAAACGTTGAAGCCAAGGTAGAG-3’(序列號(hào)84)(a-27)：5’-TTTGATGTCAGCTGCCTCAC-3’(序列號(hào)85)(b-27)：5’-CTCTGTCGACTGATCACCTTAAAGGGCGAC-3’(序列號(hào)86)引物(a-26)及(b-27)中添加有SalI限制酶位點(diǎn)。谷氨酸棒狀桿菌hdpA基因擴(kuò)增用引物(a-28)：5’-CTCTCTGCAGTTGTGGTAGACCTTGGGTG-3’(序列號(hào)87)(b-28)：5’-AACACCATTGTCCCTGTTTTGG-3’(序列號(hào)88)(a-29)：5’-TCGCCCAAAACAGGGACAATGGTGTTTATTCTGTAGGTCATGGCATTTGC-3’(序列號(hào)89)(b-29)：5’-CTCTTCTAGAATTGCAACACCTGCGATGC-3’(序列號(hào)90)引物(a-28)中添加有PstI，(b-29)中添加有XbaI限制酶位點(diǎn)。實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用由谷氨酸棒狀桿菌R提取的染色體DNA。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增DNA片段qsuB-1時(shí)，以引物(a-24)和(b-24))的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增qsuB-2時(shí)，以引物(a-25)和(b-25))的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增qsuD-1時(shí)，以引物(a-26)和(b-26))的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增qsuD-2時(shí)，以引物(a-27)和(b-27))的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增hdpA-1時(shí)，以引物(a-28)和(b-28))的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增hdpA-2時(shí)，以引物(a-29)和(b-29)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：變性過(guò)程：98℃10秒退火過(guò)程：55℃5秒延伸過(guò)程：72℃50秒將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在qsuB-1的情況下可以檢測(cè)到約0.8-kb的DNA片段；在qsuB-2的情況下可以檢測(cè)到約0.8-kb的DNA片段；在qsuD-1的情況下可以檢測(cè)到約0.7-kb的DNA片段；在qsuD-2的情況下可以檢測(cè)到約0.8-kb的DNA片段；在hdpA-1的情況下可以檢測(cè)到約0.9-kb的DNA片段；在hdpA-2的情況下可以檢測(cè)到約0.9-kb的DNA片段。各DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化?？梢詫⑼ㄟ^(guò)上述PCR擴(kuò)增出的DNA片段qsuB-1、qsuD-1及hdpA-1的3’端約20-bp與DNA片段qsuB-2、qsuD-2及hdpA-2的5’端約20-bp按照序列重疊的方式來(lái)設(shè)計(jì)，通過(guò)使兩DNA片段熱變性后退火而使其連接。實(shí)際的連接反應(yīng)使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。就DNA片段而言，以qsuB-1和qsuB-2、qsuD-1和qsuD-2、hdpA-1和hdpA-2的組合來(lái)混合使用。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。PCR循環(huán)：變性過(guò)程：98℃10秒退火過(guò)程：50℃5秒延伸過(guò)程：68℃90秒將上述作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行15個(gè)循環(huán)。以連接反應(yīng)后的反應(yīng)液為模板，按照以下的條件進(jìn)行第2次PCR。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的qsuB基因時(shí)，以引物(a-24)和(b-25))的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增qsuD基因時(shí)，以引物(a-26)和(b-27))的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增hdpA基因時(shí)，以引物(a-28)和(b-29)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：將上述作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在qsuB基因的情況下可以檢測(cè)到約1.6-kb，在qsuD基因的情況下可以檢測(cè)到約1.5-kb，在hdpA基因的情況下可以檢測(cè)到約1.8-kb的DNA片段。各DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。在通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的qsuB基因的DNA片段及含有qsuD基因的DNA片段的情況下用限制酶SalI切斷，在含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的hdpA基因的DNA片段的情況下用限制酶PstI和XbaI切斷，然后通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將無(wú)標(biāo)記基因破壞用質(zhì)粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：243-254(2004)、(日本特開(kāi)2006-124440)]用限制酶SalI(qsuB基因及qsuD基因)或PstI和XbaI(hdpA基因)切斷后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的qsuB基因的DNA片段、含有qsuD基因的DNA片段或含有hdpA基因的DNA片段10μl和pCRA725質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。將得到的連接反應(yīng)液通過(guò)氯化鈣法[J.Mol.Biol.53：159-162(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)各培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。其結(jié)果是，除了質(zhì)粒pCRA725約4.0-kb的DNA片段以外，在qsuB基因的情況下可以檢測(cè)到約1.6-kb的DNA片段，在qsuD基因的情況下可以檢測(cè)到約1.5-kb的DNA片段，在hdpA基因的情況下可以檢測(cè)到約1.8-kb的DNA片段。將得到的谷氨酸棒狀桿菌R菌株qsuB基因破壞用質(zhì)粒命名為pSKM26，將qsuD基因破壞用質(zhì)粒命名為pSKM27，將hdpA基因破壞用質(zhì)粒命名為pSKM28。(7-2)谷氨酸棒狀桿菌R菌株aroK基因破壞用質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)以下的PCR法擴(kuò)增用于構(gòu)建谷氨酸棒狀桿菌R菌株的編碼莽草酸激酶的染色體aroK基因的無(wú)標(biāo)記破壞用質(zhì)粒所必需的DNA片段。PCR時(shí)，基于含有aroK基因的序列(序列號(hào)91：谷氨酸棒狀桿菌aroK基因)分別合成了下述成對(duì)引物并使用。谷氨酸棒狀桿菌aroK基因擴(kuò)增用引物(a-30)：5’-AGGCATGCGGAGGTGCTCTCTCACGTAA-3’(序列號(hào)92)(b-30)：5’-TCCCCCGGGCGAGCACTACCGCAACCT-3’(序列號(hào)93)(a-31)：5’-TCCCCCGGGCCGGAGGATTTCAGTGCTT-3’(序列號(hào)94)(b-31)：5’-AGGCATGCCACTGCAACGGCATTGCCGT-3’(序列號(hào)95)需要說(shuō)明的是，引物(a-30)及(b-31)中添加有SphI限制酶位點(diǎn)，(a-31)及(b-30)中添加有SmaI限制酶位點(diǎn)。實(shí)際的PCR中，使用Veriti熱循環(huán)儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(寶生物株式會(huì)社制)作為反應(yīng)試劑，以下述條件來(lái)進(jìn)行。模板DNA使用由谷氨酸棒狀桿菌R菌株提取的染色體DNA。反應(yīng)液：將上述物質(zhì)混合，將該50μl的反應(yīng)液供于PCR。*)擴(kuò)增aroK-1時(shí)，以引物(a-30)和(b-30))的組合來(lái)進(jìn)行；擴(kuò)增aroK-2時(shí)，以引物(a-31)和(b-31)的組合來(lái)進(jìn)行。PCR循環(huán)：將以上作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。將上述生成的反應(yīng)液10μl通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可以檢測(cè)到來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroK-1約1.0-kb及aroK-2約1.0-kb的DNA片段。各DNA片段通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)來(lái)純化。將通過(guò)上述PCR擴(kuò)增出的含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroK基因的DNA片段aroK-1約1.0-kb及aroK-2約1.0-kb用限制酶SphI及SmaI切斷后，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化。另外，將無(wú)標(biāo)記基因破壞用質(zhì)粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：243-254(2004)、(日本特開(kāi)2006-124440)]用限制酶SphI切斷，通過(guò)NucleoSpinGelandPCRClean-Up(寶生物株式會(huì)社制)進(jìn)行純化后，利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)進(jìn)行去磷酸化處理。將含有來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroK基因的DNA片段2種各10μl和pCRA725質(zhì)粒片段2μl混合，添加T4DNA連接酶10×緩沖液1μl、T4DNA連接酶(寶生物株式會(huì)社制)1單位等各成分，用滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)到10μl，在15℃下反應(yīng)3小時(shí)使其結(jié)合。使用所得到的連接反應(yīng)液，通過(guò)氯化鈣法[JournalofMolecularBiology，53，159(1970)]轉(zhuǎn)化大腸桿菌HST02，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基[1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化鈉、及1.5％瓊脂]上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶分別切斷，確認(rèn)插入片段。其結(jié)果是，除了質(zhì)粒pCRA725約4.4-kb的DNA片段以外，還確認(rèn)到來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的aroK基因的一部分被刪除的約2.0-kb的插入片段。將得到的谷氨酸棒狀桿菌R菌株aroK基因無(wú)標(biāo)記破壞用質(zhì)粒命名為pCRC329。(8)通過(guò)染色體基因重組構(gòu)建莽草酸生產(chǎn)株無(wú)標(biāo)記染色體基因?qū)胗幂d體pCRA725是在谷氨酸棒狀桿菌R內(nèi)不能復(fù)制的質(zhì)粒。使用谷氨酸棒狀桿菌R菌株的ldhA基因破壞用質(zhì)粒pCRA728[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8(4)：243-254(2004)]，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.54：443-447(1990)及Res.Microbiol.144：181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌X5C1菌株[ApplMicrobiolBiotechnol.81(4)：691-699(2008)]，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖的BT瓊脂培養(yǎng)基[在蒸餾水1L中溶解有(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)FeSO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml，1.5％瓊脂]上。在質(zhì)粒pCRA728與染色體上的同源區(qū)域的單交換菌株的情況下，通過(guò)pCRA728上的卡那霉素耐性基因的表達(dá)而顯示卡那霉素耐性，通過(guò)枯草桿菌(Bacillussubtilis)的sacR-sacB基因的表達(dá)而顯示含蔗糖培養(yǎng)基上的致死性；在雙交換菌株的情況下，通過(guò)pCRA728上的卡那霉素耐性基因的脫落而顯示卡那霉素敏感性，通過(guò)sacR-sacB基因的脫落而顯示含蔗糖培養(yǎng)基上的增殖性。因此，無(wú)標(biāo)記染色體基因破壞菌株顯示出卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性。因此，選擇顯示出卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌株。將該谷氨酸棒狀桿菌R菌株ldhA基因無(wú)標(biāo)記破壞菌株命名為氨酸棒狀桿菌X5C1ΔldhA菌株。然后，使用阿拉伯糖同化基因染色體導(dǎo)入用質(zhì)粒pCRD109[ApplMicrobiolBiotechnol.85(1)：105-115(2009)]，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.，54：443-447(1990)及Res.Microbiol.，144：181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌X5C1ΔldhA菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖的BT瓊脂培養(yǎng)基[BT液體培養(yǎng)基及1.5％瓊脂]上。從培養(yǎng)基上的增殖菌株中選擇顯示卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌株。將該阿拉伯糖同化基因染色體導(dǎo)入菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌A1X5C1ΔldhA菌株。然后，使用阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)體基因染色體導(dǎo)入用質(zhì)粒pCRD108[Appl.Microbiol.Biotechnol.85(1)：105-115(2009)]，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.54：443-447(1990)及Res.Microbiol.144：181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌A1X5C1ΔldhA菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株、涂布在含有10％(W/V)蔗糖的BT瓊脂培養(yǎng)基[BT液體培養(yǎng)基及1.5％瓊脂]上。從培養(yǎng)基上的增殖菌株中選擇顯示卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌株。將該阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)體同化基因染色體導(dǎo)入菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌A1X5C1araEΔldhA菌株。然后，使用谷氨酸棒狀桿菌菌株qsuB基因破壞用質(zhì)粒pSKM26，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.54：443-447(1990)及Res.Microbiol.144：181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌A1X5C1araEΔldhA菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖的BT瓊脂培養(yǎng)基[BT液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。從培養(yǎng)基上的增殖菌株中選擇顯示卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌菌株。將該谷氨酸棒狀桿菌R菌株qsuB基因破壞菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌SKM8菌株。然后，使用谷氨酸棒狀桿菌R菌株qsuD基因破壞用質(zhì)粒pSKM27，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌SKM8菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖的BT瓊脂培養(yǎng)基[BT液體培養(yǎng)基及1.5％瓊脂]上。從培養(yǎng)基上的增殖菌株中選擇顯示卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌株。將該谷氨酸棒狀桿菌R菌株qsuD基因無(wú)標(biāo)記破壞菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌SKM9菌株。然后，使用谷氨酸棒狀桿菌R菌株aroK基因破壞用質(zhì)粒pCRC329，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.Vol.54、443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌SKM9菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT瓊脂培養(yǎng)基[在BT液體培養(yǎng)基中添加有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸各20μg/ml、對(duì)氨基苯甲酸10μg/ml，1.5％瓊脂]上。從培養(yǎng)基上的增殖菌株中選擇顯示卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌株。將該谷氨酸棒狀桿菌R菌株aroK基因無(wú)標(biāo)記破壞菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌SKM1菌株。然后，使用谷氨酸棒狀桿菌R菌株tkt-tal基因染色體導(dǎo)入用質(zhì)粒pSKM10，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.，Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.，Vol.144，181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌SKM1菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT瓊脂培養(yǎng)基上。從培養(yǎng)基上的增殖菌株中選擇顯示卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌株。將該谷氨酸棒狀桿菌R菌株tkt-tal基因無(wú)標(biāo)記染色體導(dǎo)入菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌SKM2菌株。然后，使用谷氨酸棒狀桿菌R菌株iolT1基因染色體導(dǎo)入用質(zhì)粒pSKM14，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.，Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.，Vol.144，181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌SKM2菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT瓊脂培養(yǎng)基上。從培養(yǎng)基上的增殖菌株中選擇顯示卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌株。將該谷氨酸棒狀桿菌R菌株iolT1基因無(wú)標(biāo)記染色體導(dǎo)入菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌LHglc553菌株。然后，使用谷氨酸棒狀桿菌R菌株ptsH基因破壞用質(zhì)粒pCRC809[Microbiology，155(Pt11)：3652-3660(2009)]，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌LHglc553菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT瓊脂培養(yǎng)基上。從培養(yǎng)基上的增殖菌株中選擇顯示卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌株。將該谷氨酸棒狀桿菌R菌株ptsH基因無(wú)標(biāo)記破壞菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌LHglc567菌株。然后，使用谷氨酸棒狀桿菌R菌株ppgK基因染色體導(dǎo)入用質(zhì)粒pSKM25，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.Vol.54、443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌LHglc567菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT瓊脂培養(yǎng)基上。從培養(yǎng)基上的增殖菌株中選擇顯示卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌株。將該谷氨酸棒狀桿菌R菌株ppgK基因無(wú)標(biāo)記染色體導(dǎo)入菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌LHglc594菌株。然后，使用谷氨酸棒狀桿菌R菌株glk1基因染色體導(dǎo)入用質(zhì)粒pSKM23，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.，Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.，Vol.144，181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌LHglc594菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT瓊脂培養(yǎng)基上。從培養(yǎng)基上的增殖菌株中選擇顯示卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌株。將該谷氨酸棒狀桿菌R菌株glk1基因無(wú)標(biāo)記染色體導(dǎo)入菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌LHglc611菌株。然后，使用谷氨酸棒狀桿菌R菌株glk2基因染色體導(dǎo)入用質(zhì)粒pSKM24，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.Vol.54、443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌LHglc611菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT瓊脂培養(yǎng)基上。從培養(yǎng)基上的增殖菌株中選擇顯示卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌株。將該谷氨酸棒狀桿菌R菌株glk2基因無(wú)標(biāo)記染色體導(dǎo)入菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌LHglc618菌株。然后，使用谷氨酸棒狀桿菌R菌株gapA基因染色體導(dǎo)入用質(zhì)粒pCRD906[ApplEnvironMicrobiol.78(12)：4447-4457(2012)]，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌LHglc618菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT瓊脂培養(yǎng)基上。從培養(yǎng)基上的增殖菌株中選擇顯示卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌株。將該谷氨酸棒狀桿菌R菌株gapA基因無(wú)標(biāo)記染色體導(dǎo)入菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌LHglc741菌株。然后，使用谷氨酸棒狀桿菌R菌株hdpA基因破壞用質(zhì)粒pSKM28，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌LHglc741菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT瓊脂培養(yǎng)基上。從培養(yǎng)基上的增殖菌株中選擇顯示卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌株。將該谷氨酸棒狀桿菌R菌株hdpA基因無(wú)標(biāo)記破壞菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌LHglc753菌株。另外，使用谷氨酸棒狀桿菌R菌株gapA基因染色體導(dǎo)入用質(zhì)粒pCRD907[ApplEnvironMicrobiol.78(12)：4447-4457(2012)]，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌SKM2菌株，涂布含有卡那霉素50μg/ml及芳香族氨基酸的A瓊脂培養(yǎng)基[A液體培養(yǎng)基、及1.5％瓊脂]上。將上述培養(yǎng)基上得到的單交換菌株涂布在含有10％(W/V)蔗糖及芳香族氨基酸的BT瓊脂培養(yǎng)基上。從培養(yǎng)基上的增殖菌株中選擇顯示卡那霉素敏感性及含蔗糖培養(yǎng)基增殖性的菌株。將該谷氨酸棒狀桿菌R菌株gapA基因無(wú)標(biāo)記染色體導(dǎo)入菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌LHglc573菌株。[表2]通過(guò)染色體基因重組構(gòu)建莽草酸生產(chǎn)菌株縮略符號(hào)一覽＊tkt-tal：轉(zhuǎn)酮醇酶(tkt)和轉(zhuǎn)醛醇酶(tal)iolT1：肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)體glk1：葡萄糖激酶1glk2：葡萄糖激酶2ppgK：多聚磷酸鹽/ATP依賴性葡萄糖激酶gapA：甘油醛-3-磷酸脫氫酶xylAB：木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶(大腸桿菌)bglF(V317A)A：突變型β-葡糖苷酶(bglF(V317A))和6-磷酸-β-葡糖苷酶(bglA)araBAD：阿拉伯糖異構(gòu)酶、核酮糖激酶和核酮糖-5-磷酸-3-差向異構(gòu)酶)(大腸桿菌)araE：阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(谷氨酸棒狀桿菌31831)ldhA：乳酸脫氫酶AaroK：莽草酸激酶qsuB：3-脫氫莽草酸脫水酶qsuD：奎寧酸/莽草酸脫氫酶ptsH：組氨酸-可磷酸化蛋白hdpA：HAD(haloaciddehalogenase，鹵酸脫鹵酶)超家族磷酸酶aroG(S180F)：抗反饋突變型DAHP(3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸)合成酶(S180F)(大腸桿菌)aroG(P150L)：抗反饋突變型DAHP合成酶(P150L)(大腸桿菌)aroB：3-脫氫奎寧酸合成酶aroD：3-脫氫奎寧酸脫水酶aroE：莽草酸脫氫酶＊無(wú)來(lái)源菌株名的為來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的基因(9)莽草酸生產(chǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入菌株的構(gòu)建使用上述質(zhì)粒pCRB237，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌SKM2菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml的A瓊脂培養(yǎng)基上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)該培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶切斷，確認(rèn)插入質(zhì)粒。其結(jié)果是，確認(rèn)導(dǎo)入了上述制作的質(zhì)粒pCRB237。將得到的菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌SKM3。需要說(shuō)明的是，將本質(zhì)粒的基因重組的概要綜合示于表3。使用上述質(zhì)粒pCRB237及pCRB238，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]分別轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌SKM2菌株、LHglc618菌株、LHglc741菌株、LHglc753菌株及SKM1菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及氯霉素5μg/ml的A瓊脂培養(yǎng)基上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)該培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶切斷，確認(rèn)插入質(zhì)粒。其結(jié)果是，確認(rèn)導(dǎo)入了上述制作的質(zhì)粒pCRB237及pCRB238。將在谷氨酸棒狀桿菌SKM2菌株、LHglc618菌株、LHglc741菌株、LHglc753菌株、及SKM1菌株中分別導(dǎo)入pCRB237及pCRB238而得到的轉(zhuǎn)化體分別命名為谷氨酸棒狀桿菌SKM4菌株、SKM5菌株、SKM6菌株、SKM7菌株、及SKM10菌株。需要說(shuō)明的是，將本質(zhì)粒的基因重組的概要綜合示于表3。使用上述質(zhì)粒pCRB239及pCRB238，通過(guò)電脈沖法[Agric.Biol.Chem.Vol.54，443-447(1990)及Res.Microbiol.Vol.144，181-185(1993)]轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌SKM2菌株及LHglc573菌株，涂布在含有卡那霉素50μg/ml及氯霉素5μg/ml的A瓊脂培養(yǎng)基上。通過(guò)常規(guī)方法對(duì)該培養(yǎng)基上的增殖菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，由培養(yǎng)液提取質(zhì)粒DNA，將該質(zhì)粒用限制酶切斷，確認(rèn)插入質(zhì)粒。其結(jié)果是，確認(rèn)導(dǎo)入了上述制作的質(zhì)粒pCRB239及pCRB238。將得到的菌株命名為谷氨酸棒狀桿菌SKM11菌株及SKM12菌株。將本質(zhì)粒的基因重組的概要綜合示于表3。谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)SKM7保藏于獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心(日本國(guó)千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8(郵編292-0818))(保藏日：2014年7月29日、保藏編號(hào)：NITEBP-01903)。[表3]莽草酸生產(chǎn)試驗(yàn)使用菌株*)在全部菌株中，導(dǎo)入了作為混合糖同化基因的來(lái)自大腸桿菌K-12菌株的xylA基因(木糖異構(gòu)酶)、xylB基因(木酮糖激酶)、araA基因(阿拉伯糖異構(gòu)酶)、araB基因(核酮糖激酶)、araD基因(核酮糖-5-磷酸-3-差向異構(gòu)酶)、來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌R菌株的bglF(V317A)基因(β-糖苷酶)、bglA基因(6-磷酸-β-糖苷酶)及來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌ATCC31831菌株的araE基因(阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)體)?；蛎s略符號(hào)參照表2。[實(shí)施例2]通過(guò)谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)莽草酸使用作為谷氨酸棒狀桿菌R菌株的混合糖同化菌株的、以A1X5C1araEΔldhA菌株為基礎(chǔ)構(gòu)建的莽草酸生產(chǎn)菌株SKM6菌株(參照實(shí)施例1(表3))，按照以下所述的方法使用發(fā)酵罐(エイブル株式會(huì)社制、型號(hào)：BMJ1L)進(jìn)行有氧分批反應(yīng)下的莽草酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。將SKM6菌株接種在含有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸各20μg/ml、對(duì)氨基苯甲酸10μg/ml、卡那霉素50μg/ml、及氯霉素5μg/ml的試管內(nèi)的10mlA液體培養(yǎng)基[在蒸餾水1L中溶解有(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、維生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g]中后，在33℃、有氧條件下進(jìn)行16小時(shí)振蕩培養(yǎng)。將在上述條件下增殖的谷氨酸棒狀桿菌SKM6菌株接種在含有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸各20μg/ml、對(duì)氨基苯甲酸10μg/ml、卡那霉素50μg/ml及氯霉素5μg/ml的容量500ml燒瓶?jī)?nèi)的100mlA液體培養(yǎng)基[在蒸餾水1L中溶解有(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、維生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g]中，在33℃、有氧條件下進(jìn)行16小時(shí)振蕩培養(yǎng)。通過(guò)離心分離(4℃、3000×g、10分鐘)收集在上述條件下增殖的谷氨酸棒狀桿菌SKM6菌株的菌體，將得到的菌體懸浮在1000ml容積的發(fā)酵罐培養(yǎng)槽內(nèi)的含有葡萄糖60g/l、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸各100mg/l、對(duì)氨基苯甲酸50mg/l、卡那霉素50μg/ml、氯霉素5μg/ml、及消泡劑(DisfoamCB-442)5g/l的600mlA(-尿素、3×硫安、5μg/l生物素、2×酵母提取物、2×維生素分析酪蛋白水解物)液體培養(yǎng)基[在蒸餾水1L中溶解有(NH4)2SO421g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4.·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02％(w/v)生物素溶液25μl、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物4g、維生素分析酪蛋白水解物14g]中且使OD610達(dá)到0.5，通過(guò)1000ml容量發(fā)酵罐(エイブル株式會(huì)社制、型號(hào)：BMJ1L)在33℃、pH7.0(通過(guò)添加5.0N氨水來(lái)控制)、通氣量0.6L/min(air、1vvm)、溶解氧濃度(DO)10％(將大氣壓下飽和溶解氧濃度設(shè)為100％)的條件下進(jìn)行18小時(shí)通氣攪拌培養(yǎng)。通過(guò)離心分離(4℃、5000×g、10分鐘)收集在上述條件下增殖的谷氨酸棒狀桿菌SKM6菌株的菌體，將菌體用0.9％氯化鈉水溶液洗滌1次后，按照成為100g濕菌體/L(每體積的培養(yǎng)基中以濕菌體重量計(jì)為10％)的方式懸浮在含有10％葡萄糖的250mlBT(-尿素、-生物素)液體培養(yǎng)基[在蒸餾水1L中溶解有(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml]中，使用1000ml容量發(fā)酵罐(エイブル株式會(huì)社制、型號(hào)：BMJ1L)在33℃、pH7.0(通過(guò)添加5.0N氨水來(lái)控制)、通氣量0.25L/min(air、1vvm)、溶解氧濃度(DO)5％(將大氣壓下飽和溶解氧濃度設(shè)為100％)的條件下進(jìn)行莽草酸生成反應(yīng)。需要說(shuō)明的是，反應(yīng)液中的葡萄糖濃度用葡萄糖傳感器(王子計(jì)測(cè)機(jī)器、BF-5i)來(lái)監(jiān)測(cè)，在葡萄糖耗盡前進(jìn)行補(bǔ)加葡萄糖。培養(yǎng)上清液中的芳香族化合物的代謝物質(zhì)濃度通過(guò)高效液相色譜(ProminenceHPLC裝置(島津制作所制)，COSMOSIL填充柱5C18-AR-II，使用20％甲醇、0.07％高氯酸的流動(dòng)相來(lái)分離)來(lái)分析。將其結(jié)果示于表4。SKM6菌株在莽草酸生成反應(yīng)24小時(shí)后生成480mM(83.6g/l)的莽草酸(莽草酸生成速度20.0mM/h＝3.5g/l/h)、90.3mM(15.5g/l)的3-DHS、及6.9mM(1.3g/l)的3-DHQ。另外，作為大腸桿菌(Escherichiacoli)的莽草酸生產(chǎn)菌株中主要的副產(chǎn)物列舉的奎寧酸(quinate)，其生成極微量(1mM以下)。另外，葡萄糖消耗量為1119mM，就相對(duì)于糖的收率(mol/(mol葡萄糖)，％)而言，莽草酸為42.9％，莽草酸、3-DHS、3-DHQ合計(jì)為51.6％。另外，通過(guò)SKM6菌株進(jìn)行的莽草酸生成反應(yīng)中，未確認(rèn)到菌體的增殖。這些結(jié)果表明，SKM6菌株在使用無(wú)機(jī)鹽基本培養(yǎng)基的不伴有菌體增殖的反應(yīng)工藝中具有非常高的莽草酸生產(chǎn)率及相對(duì)于糖的收率。就SKM6菌株的莽草酸生產(chǎn)率而言，使用基本培養(yǎng)基從糖開(kāi)始的通過(guò)發(fā)酵法的生產(chǎn)率大幅超過(guò)迄今所報(bào)道的生產(chǎn)率最高的大腸桿菌(Escherichiacoli)重組菌株的生產(chǎn)率(E.coliSP1.1pts-/pSC6.090B，莽草酸生產(chǎn)速度1.8g/l/h，莽草酸收率27％、(專利文獻(xiàn)4(US6472169))。另外，上述大腸桿菌的莽草酸生產(chǎn)菌株存在如下嚴(yán)重問(wèn)題：在后續(xù)莽草酸的純化工序中由于難以與莽草酸分離而帶來(lái)阻礙的奎寧酸的副產(chǎn)量多(專利文獻(xiàn)3(US6613552)、專利文獻(xiàn)4(US6472169))、本發(fā)明的SKM6菌株具有幾乎確認(rèn)不到奎寧酸的生成的特征，認(rèn)為具有不妨礙莽草酸的純化工序的優(yōu)點(diǎn)。另一方面，通過(guò)HPLC分析(ProminenceHPLC裝置(島津制作所制)、使用TSK-gelOapak-A柱(東曹株式會(huì)社制)，用水作為流動(dòng)相進(jìn)行分離)對(duì)于反應(yīng)上清液進(jìn)行有機(jī)酸的定量分析的結(jié)果是，如表4所示，SKM6菌株顯著累積通過(guò)作為糖酵解中間代謝產(chǎn)物的二羥丙酮磷酸(DHAP)的去磷酸化而生成的二羥基丙酮(DHA)。關(guān)于除DHA以外的有機(jī)酸，未確認(rèn)到顯著的累積。[實(shí)施例3]二羥丙酮磷酸(DHAP)磷酸酶基因(hdpA)破壞對(duì)莽草酸生產(chǎn)的效果按照實(shí)施例2所述那樣，在SKM6菌株的莽草酸生成反應(yīng)中確認(rèn)到通過(guò)作為糖酵解代謝中間體的二羥丙酮磷酸(DHAP)的去磷酸化而生成的二羥基丙酮(DHA)的顯著累積。由此推測(cè)，通過(guò)阻斷DHA生成途徑來(lái)抑制DHA生成，從而莽草酸生產(chǎn)效率進(jìn)一步增大。為了考察該效果，構(gòu)建了除改變SKM6菌株中的基因以外進(jìn)一步破壞編碼DHAP磷酸酶(HAD(haloaciddehalogenase，鹵酸脫鹵酶)超家族磷酸酶)的hdpA基因的SKM7菌株(參照實(shí)施例1(表3))，對(duì)該菌株通過(guò)與實(shí)施例2相同的條件、方法進(jìn)行莽草酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。如表4所示，SKM7菌株在反應(yīng)24小時(shí)后生成536mM(93.3g/l)的莽草酸(莽草酸生成速度22.3mM/h＝3.9g/l/h)、97.3mM(16.7g/l)的3-DHS、及6.9mM的3-DHQ(1.3g/l)。另外，葡萄糖消耗量為1136mM，就相對(duì)于糖的收率(mol/mol，％)而言，莽草酸為47.2％，莽草酸、3-DHS、3-DHQ合計(jì)為56.3％。該結(jié)果表明，SKM6菌株中，除了實(shí)施基因改變(ptsH基因破壞、非PTS葡萄糖通透酶、葡萄糖激酶、GAPDH的各基因高表達(dá)等)以外，通過(guò)破壞hdpA基因，DHA生成受到抑制，莽草酸生成量及莽草酸相對(duì)于糖的收率增加，同時(shí)與SKM6菌株的這些指標(biāo)相比進(jìn)一步增大(莽草酸生成量增加12％、莽草酸收率增加9％)。與此相對(duì)地，與SMK6菌株同樣地，幾乎確認(rèn)不到奎寧酸的生成。另一方面，如表4所示，根據(jù)有機(jī)酸分析的結(jié)果，SKM7菌株中DHA的生成完全被抑制。除DHA以外的有機(jī)酸也未確認(rèn)到顯著的累積。另外，利用SKM7菌株進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，未確認(rèn)到菌體濃度的變化。根據(jù)以上結(jié)果，SKM7菌株在不伴有菌體增殖的反應(yīng)工藝中顯示出比SKM6菌株更高的莽草酸生產(chǎn)率及相對(duì)于糖的收率。[比較例1]GAPDH活性強(qiáng)化對(duì)莽草酸生產(chǎn)的效果為了考察甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因(gapA)高表達(dá)對(duì)實(shí)施例2所示的SKM6菌株的莽草酸生產(chǎn)能力的貢獻(xiàn)程度，除了不進(jìn)行來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的編碼GAPDH的gapA基因的染色體導(dǎo)入以外，對(duì)于具有與SKM6菌株相同的基因型的SKM5菌株(實(shí)施例1、參照表3)在與實(shí)施例2中記載的莽草酸生產(chǎn)試驗(yàn)相同的方法、條件下進(jìn)行莽草酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。其結(jié)果是，如表4所示，在反應(yīng)24小時(shí)后，SKM5菌株生成394mM(68.6g/l)的莽草酸(莽草酸生成速度16.4mM/h＝2.9g/l/h)、64.5mM(11.1g/l)的3-DHS、及5.9mM的3-DHQ(1.1g/l)。另外，消耗881mM的葡萄糖，就相對(duì)于糖的收率(mol/mol，％)而言，莽草酸為44.7％，莽草酸、3-DHS、3-DHQ合計(jì)為52.7％。該結(jié)果表明，實(shí)施例2中所述的導(dǎo)入有g(shù)apA基因的SKM6菌株的莽草酸生成量(表4)與未導(dǎo)入gapA基因的SKM5菌株的生成量相比增加22％，因此該轉(zhuǎn)化體中的GAPDH基因高表達(dá)使莽草酸的生成顯著增加。需要說(shuō)明的是，SKM6菌株與SKM5菌株相比，葡萄糖的消耗量也大幅增加(27％)，另一方面，莽草酸以及莽草酸、3-DHS、3-DHQ合計(jì)的相對(duì)于糖的收率與SKM5菌株相比降低若干，因此認(rèn)為，SKM6菌株中的莽草酸生產(chǎn)率增加的主要原因?yàn)榕c葡萄糖消耗的增加相伴隨的莽草酸生成速度增加。即表明，GAPDH活性強(qiáng)化通過(guò)活化該轉(zhuǎn)化體中的葡萄糖消耗來(lái)提高莽草酸生產(chǎn)率。需要說(shuō)明的是，測(cè)定SKM5菌株及SKM6菌株的反應(yīng)6小時(shí)后的各菌體的粗酶提取液中的GAPDH活性，結(jié)果如表4所示，SKM6菌株中的GAPDH活性(5.4U/mgprotein)與SKM5菌株的該活性(1.3U/mgprotein)相比，上升約4.3倍，確認(rèn)將gapA導(dǎo)入染色體的SKM6菌株中GAPDH活性得到強(qiáng)化。[比較例2]GAPDH活性強(qiáng)化帶來(lái)的莽草酸生產(chǎn)率提高是非PTS葡萄糖通透酶系強(qiáng)化菌株所特有的效果的驗(yàn)證如比較例1所述，表明除了ptsH基因破壞、iolT1基因高表達(dá)、及葡萄糖激酶基因群(glk1、glk2、ppgK)的高表達(dá)(以下將這些基因改變的組合稱為非PTS葡萄糖通透酶系的強(qiáng)化)以外進(jìn)一步組合糖酵解的GAPDH基因(gapA)的導(dǎo)入·高表達(dá)時(shí)，葡萄糖消耗得到促進(jìn)，莽草酸生產(chǎn)量大幅增加。為了驗(yàn)證該gapA基因高表達(dá)帶來(lái)的莽草酸生產(chǎn)率提高效果是否是非PTS葡萄糖通透酶系的強(qiáng)化菌株所特有的，對(duì)以未破壞ptsH基因、依賴于PTS將葡萄糖攝取細(xì)胞內(nèi)的莽草酸生產(chǎn)菌株為基礎(chǔ)的情況下的gapA基因高表達(dá)的效果進(jìn)行確認(rèn)。如實(shí)施例1(表3)中記載那樣，使用ptsH基因未被破壞的莽草酸生產(chǎn)菌株SKM11菌株、以及除了在高表達(dá)用啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行g(shù)apA基因的染色體導(dǎo)入·高表達(dá)以外具有與SKM11菌株相同的基因型的SKM12菌株(兩菌株中，aroK、qsuB及qsuD基因被破壞，導(dǎo)入了tkt-tal基因及莽草酸生成途徑基因(aroG、aroB、aroD、aroE))，將反應(yīng)使用的菌體濃度設(shè)為50g濕菌體/l(相對(duì)于培養(yǎng)基體積，以濕菌體重量計(jì)為5％)，除此以外，通過(guò)與實(shí)施例2相同的條件、方法進(jìn)行莽草酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。需要說(shuō)明的是，這2個(gè)菌株中導(dǎo)入與其它莽草酸生產(chǎn)菌株的突變點(diǎn)不同的aroG(P150L)基因作為DAHP合成酶基因，其基因產(chǎn)物顯示與aroG(S180F)基因所編碼的DAHP合成酶基本相同的酶特性(對(duì)芳香族氨基酸的反饋抑制耐性)，另外確認(rèn)，導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌時(shí)，對(duì)莽草酸生成賦予同等效果。其結(jié)果如表5所示，在反應(yīng)24小時(shí)后，SKM11菌株生成139mM的莽草酸及24.5mM的3-DHS，與此相對(duì)地，SKM12菌株生成115mM的莽草酸及17.2mM的3-DHS。需要說(shuō)明的是，對(duì)各菌株回收反應(yīng)6小時(shí)后的菌體，測(cè)定這些粗酶提取液中的GAPDH活性，結(jié)果如表5所示，進(jìn)行了gapA基因的染色體導(dǎo)入的SKM12菌株與未導(dǎo)入的SKM11菌株相比，檢測(cè)到高約10倍的GAPDH活性，由此確認(rèn)SKM12菌株中GAPDH活性得到強(qiáng)化。其結(jié)果是，以具有PTS的莽草酸生產(chǎn)菌株為基礎(chǔ)時(shí)，未確認(rèn)到GAPDH活性強(qiáng)化帶來(lái)的糖消耗、及對(duì)莽草酸生成的提升效果。這表明，GAPDH活性強(qiáng)化帶來(lái)的莽草酸生產(chǎn)率的上升是依賴非PTS葡萄糖通透酶進(jìn)行葡萄糖輸送的棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體所特有的效果。[比較例3]非PTS葡萄糖通透酶系強(qiáng)化和GAPDH活性強(qiáng)化對(duì)莽草酸生產(chǎn)的效果為了考察非PTS葡萄糖通透酶系強(qiáng)化(ptsH基因破壞、iolT1基因高表達(dá)、葡萄糖激酶基因(glk1，glk2，ppgK)高表達(dá))及GAPDH活性強(qiáng)化對(duì)實(shí)施例2所示的SKM6菌株的莽草酸生成能力的貢獻(xiàn)程度，不進(jìn)行非PTS葡萄糖通透酶系的強(qiáng)化和GAPDH活性的強(qiáng)化，除此以外，對(duì)于具有與SKM6菌株相同的基因型的SKM4菌株(實(shí)施例1、參照表3)通過(guò)與實(shí)施例2相同的條件、方法進(jìn)行莽草酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)，與SKM6菌株進(jìn)行生產(chǎn)率比較。其結(jié)果如表4所示，SKM4菌株在反應(yīng)24小時(shí)后生成291mM(50.7g/l)的莽草酸(莽草酸生成速度12.1mM/h＝2.1g/l/h)、48.1mM(8.3g/l)的3-DHS、4.7mM(0.9g/l)的3-DHQ。另外，消耗676mM的葡萄糖，就相對(duì)于糖的收率(mol/mol，％)而言，莽草酸為43.0％，莽草酸、3-DHS、3-DHQ合計(jì)為50.8％。即表明，SKM6菌株的莽草酸生產(chǎn)量、及葡萄糖消耗量與SKM4菌株的這些指標(biāo)相比，均增加約65％。該結(jié)果表明，通過(guò)將非PTS葡萄糖通透酶系的強(qiáng)化和GAPDH活性強(qiáng)化組合，伴隨著葡萄糖消耗速度的增大，莽草酸生產(chǎn)率大幅增加。[比較例4]非PTS葡萄糖通透酶系強(qiáng)化對(duì)莽草酸生產(chǎn)的效果若對(duì)上述比較例3中所述的SKM4菌株以及除了SKM4菌株中的基因改變以外還實(shí)施了非PTS葡萄糖通透酶系強(qiáng)化(通過(guò)破壞ptsH基因來(lái)阻斷PTS糖的輸送、iolT1基因高表達(dá)、及葡萄糖激酶(glk1、glk2、ppgK)基因高表達(dá))的SKM5菌株(比較例1)的莽草酸生產(chǎn)率進(jìn)行比較(表4)，SKM5菌株的莽草酸生產(chǎn)量與SKM4菌株的生產(chǎn)量相比，伴隨著葡萄糖消耗量的增加而增加35％，即使單獨(dú)強(qiáng)化非PTS葡萄糖通透酶系，也顯示出莽草酸生成量顯著增加。[表4]通過(guò)發(fā)酵罐反應(yīng)進(jìn)行的莽草酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)(反應(yīng)24小時(shí))[表5]具有PTS的莽草酸生產(chǎn)菌株中GAPDH活性強(qiáng)化的效果(反應(yīng)24小時(shí))[實(shí)施例4]以混合糖為碳源生成莽草酸本發(fā)明中構(gòu)建的莽草酸生產(chǎn)菌株由于導(dǎo)入有混合糖同化基因群，從而除了葡萄糖以外，還能夠與葡萄糖一起同化木糖、阿拉伯糖、纖維二糖(Sasaki，M.，etal，EngineeringofpentosetransportinCorynebacteriumglutamicumtoimprovesimultaneousutilizationofmixedsugars.Appl.Microbiol.Biotechnol.85：105-115(2009))。因此，使用SKM7菌株，使用由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖構(gòu)成的混合糖作為碳源，進(jìn)行莽草酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。莽草酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)中，除了使用含有初始濃度為葡萄糖60g/l、木糖35g/l、阿拉伯糖5g/l的反應(yīng)用培養(yǎng)基作為碳源以外，按照與實(shí)施例2相同的條件下、方法來(lái)進(jìn)行(碳源濃度下降時(shí)，在耗盡前以相同的比率補(bǔ)加上述3種碳源)。其結(jié)果如表6所示，SKM7菌株在反應(yīng)24小時(shí)后生成518mM(90.2g/l)的莽草酸(莽草酸生成速度21.6mM/h＝3.8g/l/h)、122mM(21.0g/l)的3-DHS、及6.7mM(1.3g/l)的3-DHQ。另外，消耗656mM的葡萄糖、497mM的木糖、及75mM的阿拉伯糖，就相對(duì)于糖的收率(mol/mol，％)而言，莽草酸為45.8％，莽草酸、3-DHS、3-DHQ合計(jì)為57.2％。從而表明，SKM7菌株在以由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖組成的混合糖為碳源的反應(yīng)中，也與以葡萄糖為單一碳源時(shí)具有幾乎同等的莽草酸的生產(chǎn)率、及相對(duì)于糖的收率。另外還確認(rèn)，該轉(zhuǎn)化體可以同時(shí)利用這些混合糖。[表6]通過(guò)發(fā)酵罐反應(yīng)進(jìn)行的、以混合糖為碳源的莽草酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)(反應(yīng)24小時(shí))a將各生成量相對(duì)于以葡萄糖換算(6mol的木糖或阿拉伯糖換算為5mol的葡萄糖)的糖消耗量的比率以％表示[比較例5]3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶活性強(qiáng)化對(duì)莽草酸生產(chǎn)的效果為了考察通過(guò)谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體進(jìn)行的莽草酸生成中的、DAHP合成酶活性強(qiáng)化的效果，進(jìn)行了SKM2菌株和SKM3菌株(實(shí)施例1，參照表2、表3)的莽草酸生產(chǎn)率比較。SKM3菌株是除了SKM2菌株中的基因改變(aroK、qsuBqsuD基因破壞、及tkt，tal基因高表達(dá))以外、還通過(guò)質(zhì)粒導(dǎo)入有來(lái)自大腸桿菌的反饋抑制耐性型DAHP合成酶基因(aroG(S180F))的菌株。將SKM2菌株及SKM3菌株接種到含有各20μg/ml的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、及10μg/ml的對(duì)氨基苯甲酸的試管內(nèi)的10mlA液體培養(yǎng)基[在蒸餾水1L溶解有(NH2)2CO2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、0.06％(w/v)Fe2SO4·7H2O+0.042％(w/v)MnSO4·2H2O1ml、0.02％(w/v)生物素溶液1ml、0.01％(w/v)硫胺素溶液2ml、酵母提取物2g、維生素分析酪蛋白水解物7g、葡萄糖40g](需要說(shuō)明的是，SKM3菌株的培養(yǎng)中，添加有卡那霉素50μg/ml(終濃度))中后，在33℃、有氧條件下進(jìn)行16小時(shí)振蕩培養(yǎng)。將在上述條件下增殖的前培養(yǎng)菌體接種到含有各20μg/ml的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、及10μg/ml的對(duì)氨基苯甲酸的試管內(nèi)的10mlA液體培養(yǎng)基(需要說(shuō)明的是，在SKM3菌株的培養(yǎng)中，添加有卡那霉素50μg/ml(終濃度))中且使OD610達(dá)到0.5，在33℃下、有氧條件下進(jìn)行24小時(shí)振蕩培養(yǎng)。將24小時(shí)后的培養(yǎng)液離心分離(4℃，15,000×g，5分鐘)，對(duì)于得到的上清液，通過(guò)高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行包括莽草酸在內(nèi)的芳香族相關(guān)化合物的定量分析。將結(jié)果示于表7。在有氧培養(yǎng)24小時(shí)后，SKM2菌株生成10.2mM的莽草酸、及2.5mM的3-DHS(莽草酸以及莽草酸和3-DHS的合計(jì)值相對(duì)于糖的收率分別為8.6％和10.6％)，SKM3菌株生成18.9mM的莽草酸、及6.6mM的3-DHS(莽草酸以及莽草酸和3-DHS的合計(jì)值相對(duì)于糖的收率分別為16.0％和21.9％)。需要說(shuō)明的是，兩菌株的3-DHQ的生成量均極少(1mM以下)。該結(jié)果表明，通過(guò)來(lái)自大腸桿菌的反饋抑制耐性DAHP合成酶基因(aroG(S180F))的高表達(dá)，莽草酸及3-DHS的生成量大幅增加。[比較例6]莽草酸生成途徑活性強(qiáng)化對(duì)莽草酸生產(chǎn)的效果為了考察利用谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體進(jìn)行的莽草酸生產(chǎn)中，依次催化由DAHP向莽草酸的轉(zhuǎn)變的編碼3-脫氫奎寧酸(3-DHQ)合成酶、3-DHQ脫水酶及莽草酸脫氫酶的莽草酸生成途徑基因群(分別記作aroB、aroD及aroE)的活性強(qiáng)化效果，對(duì)于通過(guò)質(zhì)粒導(dǎo)入該基因群從而使該基因群高表達(dá)的SKM4菌株(參照實(shí)施例1(表3))，按照與上述比較例5相同的條件、方法進(jìn)行莽草酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。(需要說(shuō)明的是，在SKM4菌株的培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加有卡那霉素50μg/ml(終濃度)及氯霉素5μg/ml(終濃度)。)其結(jié)果如表7所示，SKM4菌株生成了28.8mM的莽草酸和4.9mM的3-DHS(莽草酸以及莽草酸和3-DHS的合計(jì)值相對(duì)于糖的收率分別為28.7％和33.0％)。將該結(jié)果與比較例5中所述的未進(jìn)行aroB、aroD、aroE基因?qū)氲腟KM3菌株比較，表明SKM4菌株的莽草酸生成量大幅(52％)增加。另一方面，SKM4菌株的3-DHS生成量與SKM3菌株的該量相比減少26％。這些結(jié)果表明，通過(guò)莽草酸生成途徑基因(aroB，aroD，aroE)的高表達(dá)，由3-DHS向莽草酸的轉(zhuǎn)變得到促進(jìn)，并且莽草酸生產(chǎn)率大幅上升。[比較例7]轉(zhuǎn)酮醇酶以及轉(zhuǎn)醛醇酶活性強(qiáng)化對(duì)莽草酸生產(chǎn)的效果為了考察通過(guò)谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體進(jìn)行的莽草酸生產(chǎn)中、與作為莽草酸的前體物質(zhì)的赤蘚糖-4-磷酸(E4P)的供給有關(guān)的轉(zhuǎn)酮醇酶基因(tkt)、及轉(zhuǎn)醛醇酶基因(tal)的活性強(qiáng)化的效果，對(duì)于SKM1菌株和SKM2菌株、以及SKM10菌株和SKM4菌株(參照實(shí)施例1(表2、表3))的各組合，進(jìn)行莽草酸生產(chǎn)率的比較。對(duì)于SKM1菌株、及SKM10菌株，按照與比較例5相同的條件、方法進(jìn)行莽草酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表7所示，在培養(yǎng)24小時(shí)后，未導(dǎo)入tkt-tal基因的SKM1菌株生成了10.0mM的莽草酸和1.6mM的3-DHS。該結(jié)果表明，SKM1菌株和比較例5中所述的導(dǎo)入有tkt-tal基因的SKM2菌株的莽草酸生成量(表7)幾乎相同。這表明，在這2個(gè)菌株共同的基因型中，并未確認(rèn)到通過(guò)tkt-tal基因?qū)攵姑Р菟嵘闪匡@著增加。另一方面，導(dǎo)入莽草酸生成途徑基因并使其高表達(dá)、但未導(dǎo)入tkt-tal基因的SKM10菌株在培養(yǎng)24小時(shí)后生成了20.2mM的莽草酸和2.0mM的3-DHS，莽草酸相對(duì)于糖的收率為21.7％。將該結(jié)果與比較例6中所述的導(dǎo)入有莽草酸生成途徑基因和tkt-tal基因并使其高表達(dá)的SKM4菌株的生產(chǎn)率(表7)進(jìn)行比較，后者的莽草酸生產(chǎn)量、收率均大幅(分別為43％和32％)增加。這表明，通過(guò)使該莽草酸生成途徑基因(aroG、aroB、aroD、aroE)高表達(dá)而強(qiáng)化了向莽草酸生成途徑的碳流的轉(zhuǎn)化體中，確認(rèn)到tkt-tal基因高表達(dá)帶來(lái)的顯著的莽草酸生產(chǎn)率增加效果。[比較例8]莽草酸激酶基因、3-脫氫莽草酸(3-DHS)脫水酶基因及奎寧酸/莽草酸脫氫酶基因的破壞對(duì)莽草酸生產(chǎn)的效果為了考察在谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體中、通過(guò)破壞分別編碼莽草酸激酶、3-DHS脫水酶及奎寧酸/莽草酸脫氫酶的染色體基因來(lái)阻遏這些酶參與的莽草酸(和3-DHS)消耗相關(guān)代謝時(shí)對(duì)莽草酸生產(chǎn)的效果，對(duì)于A1X5C1araEΔldhA菌株(莽草酸生產(chǎn)菌株的原菌株、混合糖同化菌株)、SKM1菌株、SKM8菌株和SKM9菌株(實(shí)施例1、表3參照)，進(jìn)行莽草酸生產(chǎn)率比較。對(duì)于A1X5C1-araEΔldhA菌株、SKM8菌株和SKM9菌株，除了培養(yǎng)基中未添加抗生物質(zhì)以外，按照與比較例5相同的條件、方法通過(guò)試管培養(yǎng)進(jìn)行莽草酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。其結(jié)果如表7所示，A1X5C1-araEΔldhA菌株、SKM8菌株和SKM9菌株任一者均幾乎未生成莽草酸和3-DHS(分別生成0.3mM和0.1mM)，與此相對(duì)地，SKM1菌株生成了10.0mM的莽草酸和1.6mM的3-DHS。該結(jié)果表明，莽草酸生產(chǎn)菌株的原菌株、qsuB基因破壞菌株和qsuB/qsuD雙基因破壞菌株幾乎不累積莽草酸，與此相對(duì)地，通過(guò)破壞編碼存在于莽草酸的主代謝途徑上的莽草酸激酶的基因(aroK)，莽草酸生成量顯著增加。[表7]通過(guò)試管培養(yǎng)進(jìn)行的莽草酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)(反應(yīng)24小時(shí))產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明方法，可以使用微生物以實(shí)用的效率由葡萄糖等制造莽草酸等有機(jī)化合物。序列表<110>公益財(cái)團(tuán)法人地球環(huán)境產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究機(jī)構(gòu)（ResearchInstituteofInnovativeTechnologyfortheEarth）<120>棒狀細(xì)菌轉(zhuǎn)化體及使用該轉(zhuǎn)化體的有機(jī)化合物的制造方法（Coryneformtransformantandmethodofproducingorganiccompoundsusingthereof）<130>C01F5333<150>JP2014-168646<151>2014-08-21<160>95<170>PatentInversion3.1<210>1<211>1053<212>DNA<213>Escherichiacoli<400>1atgaattatcagaacgacgatttacgcatcaaagaaatcaaagagttacttcctcctgtc60gcattgctggaaaaattccccgctactgaaaatgccgcgaatacggttgcccatgcccga120aaagcgatccataagatcctgaaaggtaatgatgatcgcctgttggttgtgattggccca180tgctcaattcatgatcctgtcgcggcaaaagagtatgccactcgcttgctggcgctgcgt240gaagagctgaaagatgagctggaaatcgtaatgcgcgtctattttgaaaagccgcgtacc300acggtgggctggaaagggctgattaacgatccgcatatggataatagcttccagatcaac360gacggtctgcgtatagcccgtaaattgctgcttgatattaacgacagcggtctgccagcg420gcaggtgagtttctcgatatgatcaccccacaatatctcgctgacctgatgagctggggc480gcaattggcgcacgtaccaccgaatcgcaggtgcaccgcgaactggcatcagggcttttt540tgtccggtcggcttcaaaaatggcaccgacggtacgattaaagtggctatcgatgccatt600aatgccgccggtgcgccgcactgcttcctgtccgtaacgaaatgggggcattcggcgatt660gtgaataccagcggtaacggcgattgccatatcattctgcgcggcggtaaagagcctaac720tacagcgcgaagcacgttgctgaagtgaaagaagggctgaacaaagcaggcctgccagca780caggtgatgatcgatttcagccatgctaactcgtccaaacaattcaaaaagcagatggat840gtttgtgctgacgtttgccagcagattgccggtggcgaaaaggccattattggcgtgatg900gtggaaagccatctggtggaaggcaatcagagcctcgagagcggggagccgctggcctac960ggtaagagcatcaccgatgcctgcatcggctgggaagataccgatgctctgttacgtcaa1020ctggcgaatgcagtaaaagcgcgtcgcgggtaa1053<210>2<211>1476<212>DNA<213>Corynebacteriumglutamicum<400>2atggctagtaccttcattcaggccgacagccctgaaaaaagtaagaagctacccccactc60acagaaggtccgtatagaaagcggctgttctacgttgcactagttgcgacgtttggtggg120ctgctcttcggatatgacaccggagtaatcaacggtgcactcaacccaatgacacgtgag180ctcggactaaccgcgttcaccgagggtgttgtaacttcttccctgctgtttggtgcagca240gctggtgcgatgtttttcggtcgcatttccgacaactggggtcgccggaaaacaatcatc300tcacttgcagtagctttctttgtcggcaccatgatctgcgtgtttgctccatcttttgca360gtaatggttgtcggacgtgtgcttcttggactcgcagttggtggcgcttccactgttgtc420cctgtctacctggctgaacttgctccttttgaaatccgtggctcactggctggccgtaat480gagttgatgattgttgttggtcagctcgcagctttcgtcatcaatgcgattattggaaat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