相關申請的引用本申請要求于2014年8月25日提交的美國臨時專利申請no.62/041587的優(yōu)先權和權益，其通過引用并入本文用于所有目的。本發(fā)明的一些實施方案涉及官能化β折疊肽(functionalizedβ-sheetpeptide)和官能化β折疊肽介導的膜蛋白的固定化。本發(fā)明的一些實施方案涉及通過這種官能化β折疊肽穩(wěn)定的膜蛋白及其用途。本發(fā)明的一些實施方案涉及包含通過這種官能化β折疊肽穩(wěn)定的蛋白質水通道蛋白(aquaporin)的構建體(construct)及其用途。
背景技術：
：膜蛋白(membraneprotein，mp)包括三分之一的基因組編碼蛋白質，并且執(zhí)行作為受體、轉運蛋白和通道的基本功能。然而，由于其疏水性質，膜蛋白的分離和純化具有挑戰(zhàn)性。常規(guī)地，使用洗滌劑從其天然脂質環(huán)境中溶解mp并使其在水性緩沖液中穩(wěn)定(1)。然而，取決于濃度、離子強度和其他脂質和蛋白質的存在，大多數洗滌劑表現出復雜的相行為。因此，成功重建膜蛋白的方法依賴于洗滌劑的獨特行為。受膜蛋白研究重要性的驅動，過去幾十年里已開發(fā)了多種兩親性試劑來促進膜蛋白的功能和結構研究，這些兩親性試劑包括兩親性聚合物(2)、基于蛋白質的納米盤(3)、基于肽的洗滌劑(4)、麥芽糖新戊二醇洗滌劑(5)等。在早期的工作中，tao和同事報道了對三種β折疊肽(β-sheetpeptide，bp)(即bp1、bp2和bp3)工程化以穩(wěn)定膜蛋白(6)。tao參考文獻通過引用整體并入本文。這些β折疊肽是具有交替的極性和非極性殘基以及每個末端處的辛基側鏈的8氨基酸肽。tao等的β折疊肽具有核心結構乙?；?(辛基)gly-ser-leu-ser-leu-asp-(辛基)gly-asp-nh2(seqidno：1)，并具有不同數目的n-甲基氨基酸，如結構(1)所示：tao等公開的三種構建體bp1、bp2和bp3之間的n-甲基氨基酸的區(qū)別如下：對于bp1(稱為結構(2))，r1＝r3＝h，r2＝me。對于bp2(稱為結構(3))，r1＝r2＝me，r3＝h。對于bp3(稱為結構(4))，r1＝r2＝r3＝me。由于特殊的序列設計，這些β折疊肽在溶液中自組裝成細絲，并在與膜蛋白(mp)締合后重建為β桶(β-barrel)。所述肽長度為八個氨基酸以跨越脂質雙層的疏水區(qū)(約3nm的距離)，并且不受理論限制，認為通過形成有序、穩(wěn)定的β-桶狀結構來隔離膜蛋白的疏水表面。當在無洗滌劑的緩沖液中稀釋時，所得bp：mp復合物阻止膜蛋白聚集。由于鏈間氫鍵相互作用，一旦形成bp：mp復合物，β折疊肽就更不可能從膜蛋白解離。水通道蛋白是以優(yōu)異的選擇性和滲透性使水通過細胞膜的一組整合膜蛋白。更具體地，水通道蛋白選擇性地使水分子進出細胞，同時阻止離子和其他溶質通過。水分子成縱隊穿過通道的孔。水通道的存在提高了膜對水的滲透性，而孔對于帶電物質是不可滲透的，這有助于保持膜相對于周圍環(huán)境的電化學電勢差。如圖1a所示，水通道蛋白使用兩種不同機制的組合來確保僅水分子通過蛋白質。首先，水通道蛋白具有在其中間變窄的沙漏形通道。通道的窄尺寸提供了尺寸限制以幫助控制可以通過通道的分子尺寸。其次，通道內正電荷的存在有助于阻止質子通過通道。水通道蛋白由排列成右旋束的六個跨膜α-螺旋組成。有五個螺旋間環(huán)區(qū)域(a-e)。環(huán)b和e是疏水環(huán)，其含有高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(npa)基序，所述基序與膜的脂質雙層的中間重疊，形成三維沙漏結構，水從其中流過孔。水通道蛋白在細胞膜中形成四聚體，每個單體充當水通道。水可以例如由于水壓或滲透壓沿任一方向流過水通道蛋白的孔。水通道蛋白是高度保守的。參見，例如，erbakan，m.等(2014)。在該論文中進行的序列比對示出在圖1b中，顯示了不同物種中的水通道蛋白之間的高度保守性，包括球形紅細菌(rhodobactersphaeroides)atcc17023(rsaqpz，aba78939.1，seqidno：2)、大腸桿菌(escherichiacoli)k12(ecaqpz，baa08441.1，seqidno：3和glpf，afh13815.1，seqidno：4)、methanobactermarburgensis(aqpm，adl58146.1，seqidno：5)、synecoccocuselongatus(ssaqpz，aam82672.1seqidno：6)、巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)(aqy1，cca39392.1，seqidno：7)、菠菜(spinaciaoleracea)(sopip2；l，aaa99274.2，seqidno：8)和智人(homosapiens)(aqp1，np_932766.1，seqidno：9；aqp4，aah22286.1seqidno：10；aqp9，np_066190.2，seqidno：11)。水通道蛋白家族的許多成員(例如來自大腸桿菌的水通道蛋白z(aqpz))非常穩(wěn)定，可以承受苛刻的條件而不喪失其功能。例如，aqpz抵抗暴露于酸、電壓、洗滌劑和熱的變性。水通道蛋白天然嵌入在疏水性脂質雙層環(huán)境中，并且通常是不能充當膜外部游離分子的不穩(wěn)定蛋白。以前嘗試使用水通道蛋白來凈化水。例如，設計了一種langmuir-blodgett膜，其試圖在薄單層中使用水通道蛋白來凈化水，但是這樣的構造不穩(wěn)定并且難以規(guī)?；?參見例如sun等，2012)。為了提高穩(wěn)定性，將單層束縛到支持物基底上并且使用聚合物墊來抑制振動(參見例如sun等，2013)；然而，這些構建體也被證明是不穩(wěn)定的并且難以生產。相關技術的前述實例及其相關限制旨在是說明性的而非排他性的。在閱讀說明書并研究附圖之后，相關技術的其他限制對于本領域技術人員將變得明顯。技術實現要素：結合系統(tǒng)、工具和方法來描述和示出以下實施方案及其方面，這些系統(tǒng)、工具和方法意在是示例性和說明性的，而不限制范圍。在多個實施方案中，上述問題中的一個或更多個已被減少或消除，而其他實施方案涉及其他改進。本發(fā)明的一個方面提供了一種膜，其被配置為用于選擇性地使期望顆粒穿過所述膜。所述膜具有支持物和與所述支持物締合的多個膜蛋白分子。每個膜蛋白分子通過多個官能化β折疊肽穩(wěn)定。官能化β折疊肽中的至少一些可以共價連接到支持物上。膜蛋白分子可在膜中形成通道，以選擇性地允許所述期望顆粒從其中通過。膜蛋白分子可適于選擇性地運輸期望顆粒穿過膜。在一個示例性實施方案中，膜蛋白分子是水通道蛋白，并且水通道蛋白分子選擇性地運輸水分子穿過膜。支持物可以是聚砜聚合物膜。本發(fā)明的一個方面提供了具有通過多個官能化β折疊肽穩(wěn)定之膜蛋白的復合物?？梢酝ㄟ^將多個官能化β折疊肽中的至少一個上的官能團與固體支持物的綴合來將復合物固定在固體支持物上。在一些方面，官能化β折疊肽具有通用序列(辛基)gly-ser-leu-ser-leu-asp-(辛基)gly-asp(seqidno：1)。氨基酸中的一個或更多個可以是n-甲基氨基酸。官能化β折疊肽可以具有任何合適的官能團，在一些方面，所述官能團可以是疊氮基、炔基、烯基、乙烯基、疊氮基苯基或巰基。官能化β折疊肽可以提供有雙官能交聯(lián)劑，所述雙官能交聯(lián)劑可以含有光反應性官能團。本發(fā)明的一個方面提供了一種選擇性地使一種或更多種期望顆粒通過膜而同時限制一種或更多種污染物通過膜的方法。提供包含通過多個官能化β折疊肽穩(wěn)定之膜蛋白的復合物。通過使多個官能化β折疊肽中的至少一個上的至少一個官能團與膜反應，將膜蛋白偶聯(lián)至膜。使包含期望顆粒和一種或更多種污染物的溶液通過膜，以使得膜蛋白選擇性地使期望顆粒通過膜。在一些方面，膜蛋白是水通道蛋白，并且期望顆粒是水分子。在一些方面，所述方法包括濃縮一種或更多種污染物，其通過使包含一種或更多種污染物的溶液從膜的第一側通過膜到膜的第二側，從而將一種或更多種污染物濃縮在膜的第一側。在一些這樣的實施方案中，污染物是期望產物。本發(fā)明的一個方面提供了形成具有固定的膜蛋白和支持物的復合結構的方法。提供多個官能化β折疊肽。形成膜蛋白和官能化β折疊肽的穩(wěn)定復合物。通過使多個官能化β折疊肽中的至少一個上的至少一個官能團與支持物反應以將膜蛋白固定在支持物上，將膜蛋白與支持物偶聯(lián)。除了上述示例性方面和實施方案之外，通過參考附圖并研究以下詳細描述，另外的方面和實施方案將變得明顯。附圖簡要說明在附圖所引用的圖中示出了示例性實施方案。本文公開的實施方案和圖旨在被認為是說明性的而不是限制性的。圖1a示出了通過水通道蛋白分子的水分子的示意圖。圖1b示出了顯示來自不同物種的水通道蛋白的高度保守性的序列比對。圖2a示出了由官能化β折疊肽介導的示例性膜蛋白的固定的示意圖。圖2b示出了由官能化β折疊肽介導的aqpz與聚合物綴合的示意圖。圖2c示意性地示出了當穩(wěn)定膜蛋白時提出的β折疊肽的結構。圖3示出了制備具有通過官能化β折疊肽束縛的水通道蛋白的聚砜膜的方法的一個示例性實施方案。圖4a和4b示出了在肽的c末端處具有炔官能團之官能化β折疊肽的表征。圖4a示出了這種構建體在磷酸鹽緩沖鹽水中的tem(透射電子顯微鏡)圖像。比例尺為10nm。圖4b示出了對應于圖4a所示圖像的構建體的質譜圖。圖4c示出了本發(fā)明人合成的疊氮基官能化β折疊肽的質譜圖。圖5示出了hplc結果，證明了官能化β折疊肽上炔基的反應。上圖示出了與click-it試劑反應的炔-fbp的熒光hplc洗脫曲線。中間圖示出了僅click-it緩沖液的hplc洗脫曲線。下圖示出了僅click-it染料的hplc洗脫曲線。紅色箭頭表示在炔-fbp和click-it染料之間的點擊反應(clickreaction)中形成的產物。圖6示意性地示出了本發(fā)明人在一個示例性實施方案中用于表達aqpz的pet28a-6his-aqpz質粒構建體。圖7a和7b示出了證明bp1：aqpz的復合物形成及其穩(wěn)定性的實驗。圖7a示出了4周中aqpz/ddm和bp1：aqpz的圓二色性(即，-1，第1周；-2，第2周；-3，第3周以及-4，第4周)。圖7b示出了3周中aqpz/ddm和bp1：aqpz的偽天然12％sds-page。泳道：d：aqpz/ddm；p：bp1：aqpz；l：蛋白質梯。箭頭表示四聚體aqpz(計算的mw：98kda)。圖8a-8c示出了通過cd表征的aqpz/ddm和bp1：aqpz的熱穩(wěn)定性。圖8a示出了在20-90℃的溫度下的aqpz/ddm的cd光譜。圖8b示出了在溫度20-90℃下bp1：aqpz的cd光譜。圖8c示出了在192nm下相對于溫度繪制的歸一化橢圓率。圖9a-9e示出了通過三種不同的官能化β折疊肽穩(wěn)定各種蛋白質。蛋白質是aqpz(圖9a)、f0f1-atp酶(圖9b)、nachbac(圖9c)、chief-mcitrine(圖9d)和ompg(圖9e)。圖10a顯示當通過β折疊肽穩(wěn)定時，f0f1-atp酶保持其功能性，圖10b顯示當通過官能化β折疊肽穩(wěn)定時，f0f1-atp酶保持其功能性。圖11a示出了在具有和不具有aqpz的情況下，通過用于從水中除去氯化鈉的膜的水的通量。圖11b示出了在具有和不具有aqpz的情況下，用于從水中除去氯化鈉的膜的脫鹽率(saltrejection)。圖11c圖示了在250psi的操作壓力下，與引入aqpz的膜相比，不含蛋白質的膜構建體(“原始”)實現的通量和脫鹽率。
發(fā)明內容在下面的說明書中，闡述了具體細節(jié)以便為本領域技術人員提供更透徹的理解。然而，可能沒有詳細地示出或描述周知的元件，以避免不必要地模糊本公開內容。因此，說明書和附圖被認為是說明性的，而不是限制性的。許多膜蛋白的固有功能包括識別和/或操縱特異性靶標。這些識別和/或操縱事件通常是高度靈敏和高度選擇性的。因此，這樣的膜蛋白是用于產生利用特定蛋白質的特定功能的生物傳感器或納米機器的良好候選物。產生這種生物傳感器或納米機器的關鍵步驟是將膜蛋白有效固定在固體支持物上，如聚合物表面、無機固態(tài)表面等。然而，在水性緩沖液中將疏水性脆性膜蛋白以其天然狀態(tài)固定在固體支持物上仍然是一個主要的挑戰(zhàn)。本發(fā)明人現在認為，官能化β折疊肽(functionalizedβ-sheetpeptide，fbp)可以用作穩(wěn)定劑和交聯(lián)劑以介導膜蛋白在固體支持物上的固定，從而產生有用的生物傳感器和/或納米機器。在一些實施方案中，膜蛋白被固定在膜上以提供復合結構，其中膜蛋白選擇性地轉移或允許一種或更多種期望顆粒從膜的第一側通過到膜的第二側。在一些這樣的實施方案中，膜阻止或阻礙其他顆粒從膜的第一側通過到膜的第二側。在一些實施方案中，其他顆粒包含一種或更多種污染物。在一些實施方案中，其他顆粒包含期望濃縮的組分，并且通過使含有這些顆粒的溶液通過膜來濃縮期望濃縮的組分，使得這些顆粒集中在膜的第一側，而溶液的其他組分通過到膜的第二側。如本文所用，術語“顆?！北粡V泛使用并且是指期望選擇性地穿過膜的任何元素或物質。例如，在一些實施方案中，顆粒是分子，例如水、甘油、二氧化碳、糖、有機化合物、dna、rna等。在一些實施方案中，顆粒是離子，例如鈣、鎂等，或離子物質例如鹽。在一些實施方案中，顆?？梢允窃踊騺喸宇w粒，例如電子。如本文所用，術語“污染物”是指期望不允許通過膜的任何元素或物質。例如，在一些實施方案中，污染物是不期望的顆粒，例如特定離子、有機分子、廢產物等。例如，在期望提供凈化水的實施方案中，污染物可以是在海水中發(fā)現的氯化鈉，或期望從水中除去的工業(yè)過程或農業(yè)操作的副產物。在一些實施方案中，污染物是期望濃縮的顆粒，例如通過允許水從溶液中出來，而將待濃縮顆粒包含在膜的第一側，從而濃縮待濃縮顆粒。因此，本文所使用的詞“污染物”不限于不期望的顆粒，而是可以包括期望防止通過膜以濃縮和/或收獲該顆粒的顆粒。本發(fā)明的一個方面提供了官能化β折疊肽(fbp)。在一些實施方案中，官能化β折疊肽(fbp)包含β折疊肽(bp)和連接于所述β折疊肽(bp)的官能團。例如，可以通過將官能團連接到β折疊肽上來產生這種官能化β折疊肽。在一些實施方案中，官能團可以連接到β折疊肽的c末端或β折疊肽的n末端。在其他實施方案中，官能團可以連接到位于肽末端之間的部分。在一些實施方案中，多個官能團可以連接到β折疊肽。例如，官能團可以包括疊氮基、炔基、烯基、乙烯基、疊氮基苯基、巰基或一些其他合適的官能團。在一些實施方案中，通過常規(guī)固相肽合成，在肽序列中的期望位點引入具有期望官能團的經修飾氨基酸來合成官能化β折疊肽。在一些實施方案中，官能化β折疊肽可以包含與tao參考文獻中公開的三種β折疊肽不同的β折疊肽。β折疊肽可以是例如具有交替的疏水和親水殘基的任何合適長度的任何合適的β折疊肽。本發(fā)明的一個方面提供了由官能化β折疊肽(fbp)和膜蛋白(mp)形成的復合物。一旦官能化β折疊肽與膜蛋白形成穩(wěn)定的復合物，官能化β折疊肽上的官能團將允許fbp：mp復合物固定在固體支持物上。例如，如圖2a所示，通過肽修飾將β折疊肽20官能化(例如，用疊氮基官能團，如所示將n3添加到肽的c末端)以提供官能化β折疊肽22。將官能化β折疊肽22與膜蛋白(示出為條帶圖)組合，并且不受理論束縛，認為在膜蛋白的疏水性外表面上組裝成β折疊桶，以提供官能化β折疊肽-膜蛋白(fbp：mp)復合物24。然后將疊氮基-fbp：mp復合物24固定在用炔端基預官能化的固體支持物26上。疊氮基和炔基之間的共價鍵形成將fbp：mp共價固定在固體支持物表面上以提供固定的fbp：mp復合物28。在一些實施方案中，可以進行進一步的研究，例如使用熒光標記的底物或抗體30進行結合表征。如上所述，固體支持物不限于炔官能化固體支持物26，并且可以是任何合適的聚合物表面(例如在膜中澆鑄的聚合物鏈)、無機表面如金表面、一些其他固態(tài)表面或任何其他合適的支持物。如圖2b所示，在一些實施方案中，官能化β折疊肽穩(wěn)定的膜蛋白可以與膜中澆鑄的聚合物鏈綴合。圖2c示意性地示出了官能化β折疊肽可以如何相互作用以形成β折疊結構以穩(wěn)定膜蛋白。不受理論的約束，認為交替的疏水-親水肽序列的疏水殘基與跨膜蛋白的疏水區(qū)相互作用。因此，膜蛋白被官能化β折疊肽穩(wěn)定化并與其形成穩(wěn)定的復合物。所得復合物可以通過使官能化β折疊肽的官能團與支持物上的合適官能團反應而共價錨定于合適的支持物。在一些實施方案中，官能化β折疊肽包含定制序列。例如，肽內的個別氨基酸可以具有不同的官能團，其可以用于調節(jié)fbp：mp復合物的物理化學行為。這些官能團可以用于使fbp：mp復合物彼此交聯(lián)，同時保持蛋白質的功能。在一個示例性實施方案中，這可以進行以產生緊密堆積和高度有序的蛋白質陣列，或者在另一個示例性實施方案中使用長接頭分子來實現松散的網狀結構。例如，在一個示例性實施方案中，將乙烯基官能團引入肽序列內以產生乙烯基官能化β折疊肽。在一個示例性實施方案中，乙烯基官能化β折疊肽具有以下所示的結構(8)。在膜蛋白：乙烯基-bp1復合物形成后，官能化β折疊肽上的乙烯基官能團可以被活化以進行交聯(lián)。這導致形成通過乙烯基官能團交聯(lián)的蛋白質復合物。在一個示例性實施方案中，官能化β折疊肽包含序列乙?；?(辛基)gly-ser-leu-ser-leu-asp-(辛基)gly-asp-nh2(seqidno：l)，其具有通式結構(2)并具有任何合適的官能團。在替選示例性實施方案中，官能化β折疊肽可以具有具交替的極性和非極性殘基和每個末端處的疏水部分的任何合適的序列。在示例的實施方案中在第二個亮氨酸上提供的結構(2)的n-甲基氨基酸在替選實施方案中可以置于不同位置，以任何期望數量組合，或者省略。在一些實施方案中，在特定位置使用的氨基酸可以用具有類似性質的不同的天然存在的氨基酸或經修飾的氨基酸代替。例如，在一些實施方案中，官能化β折疊肽可以具有這樣的序列：其在第一個位置處包含下表1第1欄中列出的任一氨基酸，在第二個位置處包含下表1第2欄中列出的任一氨基酸等等，以提供具有交替的極性和非極性殘基和在肽的每個末端處或附近的疏水部分的β折疊肽。在一些實施方案中，額外的氨基酸可以存在于β折疊肽的c末端或n末端處。例如，在一些實施方案中，可以在β折疊肽的c末端或n末端中的任一者或兩者處提供額外的氨基酸，并且可以選擇這些額外的氨基酸的序列以形成特定的二級結構而不干擾官能化β折疊肽對膜蛋白的穩(wěn)定，和/或可以選擇該序列以包含特定的官能團，例如以促進由官能化β折疊肽穩(wěn)定的膜蛋白的交聯(lián)或表面附著。表1.用于構建官能化β折疊肽的潛在氨基酸序列。在一些實施方案中，通過將表1中所列序列中的氨基酸之一替換成可以更容易官能化的不同氨基酸來在官能化β折疊肽上提供官能團，例如，由于cys含有可容易修飾的游離巰基，所以將位置2的ser替換成cys，或將位置4的ser替換成cys。在一些實施方案中，通過在合成期間在多肽中引入具有合適的官能團的經修飾氨基酸殘基來在官能化β折疊肽上提供官能團。表2示出了在一些示例性實施方案中如何使用經修飾氨基酸修飾官能化β折疊肽的序列。表2中所示的示例性修飾氨基酸僅僅是說明性的，并且本領域技術人員將清楚，可以替代地使用其他經修飾氨基酸。表2.用于構建官能化β折疊肽的示例性的潛在經修飾氨基酸序列。在一些實施方案中，通過在合成期間將具有例如結構(2)、(3)或(4)的肽的氨基酸單體替換成期望的氨基酸單體，實現序列替換，包括上述示例性序列替換，因為相同的反應化學適用于各種不同的氨基酸(即，在例如使用常規(guī)固相肽合成儀的肽合成期間，肽的氨基和進入的氨基酸單體的羧酸基之間形成肽鍵)。在一些實施方案中，使待修飾氨基酸的選擇合理化，使得官能化氨基酸處于溶劑暴露的位置。在一些實施方案中，官能化氨基酸提供在表1所列示例性潛在氨基酸序列的位置2、位置4、位置6或位置8處。在替選實施方案中，多于一個官能化氨基酸可以提供在肽序列內。在一些實施方案中，在肽的n末端或c末端的任一者或兩者處添加經修飾的或非天然存在的氨基酸。在這樣的實施方案中，官能化β折疊肽具有長于八個氨基酸的序列，例如九個氨基酸或十個氨基酸。例如，在一個示例性實施方案中，通過常規(guī)肽合成方法將炔丙基甘氨酸(市售)添加到具有bp1序列的β折疊肽的c末端，以制備具有結構(5)的9氨基酸序列，其具有肽序列乙?；?(辛基)gly-ser-leu-ser-leu-asp-(辛基)gly-asp-(炔丙基)gly-nh2(seqidno：12)。結構(5)的n-甲基氨基酸提供在序列內的第二個亮氨酸上，但是在替選實施方案中可以提供在任何期望的氨基酸殘基上或被省略。在替選實施方案中，可以存在多于一個n-甲基氨基酸。所得序列具有炔丙基官能團并且可以組裝成如圖4a所示的原纖維結構，其指示了β折疊的形成。類似地，可以使用相同的策略引入甘氨酸衍生物和其他經修飾氨基酸，例如烯丙基甘氨酸、環(huán)丙基甘氨酸、疊氮基戊酸氨基酸等。在一些實施方案中，將經修飾的或非天然存在的氨基酸插入肽序列內。在一些這樣的實施方案中，經修飾的或非天然存在的氨基酸是炔丙基甘氨酸、烯丙基甘氨酸、環(huán)丙基甘氨酸、疊氮基-戊酸氨基酸等。在替選實施方案中，除了甘氨酸之外的其他氨基酸也可以被修飾并插入肽中。在一些這樣的實施方案中，可以將一個或更多個額外的氨基酸添加到肽的n末端或c末端中任一者或兩者中。在一些這樣的實施方案中，添加一個或更多個額外的氨基酸以保持肽的交替的極性殘基-非極性殘基序列。在這樣的實施方案中，由于在肽序列中插入至少兩個額外的氨基酸，官能化β折疊肽具有比八個氨基酸長的序列，例如十個氨基酸。在另一個示例性實施方案中，β折疊肽包含疊氮基末端官能化β折疊肽。在一個這樣的示例性實施方案中，β折疊肽包含具有結構(6)的疊氮基末端官能化β折疊肽。結構(6)具有通用肽序列乙?；?疊氮高丙氨酸-(辛基)gly-ser-leu-ser-leu-asp-(辛基)gly-asp-nh2(seqidno：13)。結構(6)包含九個氨基酸。結構(6)的n末端氨基酸是示例性經修飾氨基酸疊氮高丙氨酸(azidohomoalanine)，其是本發(fā)明人根據報道的方法合成的。在結構(6)中，n-甲基提供在第二個亮氨酸上。在替選實施方案中，額外的n-甲基可以提供在肽內，或者一個或更多個n-甲基可以提供在第二個亮氨酸以外的氨基酸上，或者n-甲基可以全部省略。在另一個示例性實施方案中，β折疊肽包含炔末端官能化β折疊肽。在一個這樣的示例性實施方案中，β折疊肽包含具有結構(7)的炔末端官能化β折疊肽，其中炔末端官能團提供在肽的n末端處。結構(7)具有通用肽序列乙酰基-(炔丙基)gly-(辛基)gly-ser-leu-ser-leu-asp-(辛基)gly-asp-nh2(seqidno：14)。結構(7)包含九個氨基酸。在結構(7)中，n-甲基提供在在第二個亮氨酸上。在替選實施方案中，額外的n-甲基可以提供在肽內，或者一個或更多個n-甲基可以提供在第二個亮氨酸以外的氨基酸上，或者n-甲基可以全部省略。在另一個示例性實施方案中，β折疊肽包含烯中間官能化β折疊肽。在一個這樣的示例性實施方案中，β折疊肽包含具有結構(8)的烯中間官能化β折疊肽。結構(8)具有通用肽序列乙?；?(辛基)gly-ser-leu-ser-氨基己烯酸-leu-asp-(辛基)gly-asp-gly-leu-nh2(seqidno：15)。結構(8)包含11個氨基酸。在結構(8)中，在第二亮氨酸上提供n-甲基。在替選實施方案中，額外的n-甲基可以提供在肽內，或者一個或更多個n-甲基可以提供在第二個亮氨酸以外的氨基酸上，或者n-甲基可以全部省略。在替選實施方案中，通過將用于提供烯中間官能化β折疊肽的乙烯基修飾的氨基酸替換成相應炔丙基修飾的氨基酸，提供炔中間官能化β折疊肽。因此，通過在肽序列內的期望位置處引入相應的經修飾氨基酸，可以使任何合適的官能團位于官能化β折疊肽中的任何期望位置。在一些實施方案中，在通過任何合適的化學反應合成之后將β折疊肽官能化。例如，在一些實施方案中，可以將β折疊肽官能化，使得其將通過其氨基和/或羧基形成共價鍵。在一個這樣的示例性實施方案中，β折疊肽中的游離氨基與間苯二胺(mpd)和均苯三甲酰氯(tmc)反應以提供酰胺官能團。酰胺官能團可以與主鏈羰基反應以將β折疊肽共價偶聯(lián)在一起。在另一個這樣的示例性實施方案中，β折疊肽的游離羧基可以與間苯二胺(mpd)反應以形成酰胺官能團，其可以類似地與肽主鏈的羰基共價連接以將β折疊肽共價連接在一起。在一個這樣的實施方案中，共價連接的β折疊肽-膜蛋白復合物形成界面聚合物層，其可以通過氫鍵相互作用偶聯(lián)至膜(例如聚砜膜)以形成聚酰胺-聚砜界面復合膜(參見例如，ghosh等，2009)。復合膜的聚酰胺和聚砜層之間的氫鍵相互作用可以例如通過在澆鑄膜或調節(jié)聚砜膜的表面粗糙度期間添加諸如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)的成孔劑來調節(jié)，其他因素如將聚酰胺層吸附在聚砜上的孔上等也可以增強兩層復合膜之間的相互作用。在一些實施方案中，官能化β折疊肽在任何合適的位置具有官能團。在一些實施方案中，官能團是交聯(lián)官能團。在一些實施方案中，交聯(lián)官能團是疊氮基、炔基、烯基、巰基、疊氮基苯基、乙烯基等。在一些實施方案中，官能團提供在肽的n末端。例如，在具有核心β折疊肽結構(2)的一個示例性實施方案中，官能團提供在肽的乙?；?，使得肽具有通用結構(9)：其中r4可以是任何合適的官能團，包括例如疊氮基、炔基、烯基、巰基、疊氮基苯基、乙烯基等。在一些實施方案中，官能團提供在肽的c末端。例如，在具有核心β折疊肽結構(2)的一個示例性實施方案中，官能團提供在肽的氨基上，使得肽具有通用結構(10)：其中r5可以是任何合適的官能團，包括例如疊氮基、炔基、烯基、巰基、疊氮基苯基、乙烯基等。除了通過在肽合成期間引入具有特定官能團的側鏈來官能化β折疊肽之外，還可以通過使β折疊肽在其脫乙酰形式下在n末端的α-胺處與雙官能交聯(lián)劑反應來官能化。多種這樣的雙官能交聯(lián)劑是市售的或可以容易地合成，例如6-(4′-疊氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-nhs-sanpah，thermofisherscientific)、4，4′-azipentanoate磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-nhs-雙吖丙啶(diazirine)，thermofisherscientific)、2-((4，4′-azipentanamido)乙基)-1，3′-二硫代丙酸琥珀酰亞胺酯(nhs-ss-雙吖丙啶，thermofisherscientific)等。例如，使脫乙?；抡郫B肽與nhs-雙吖丙啶基(sda)雙官能化交聯(lián)劑(thermoscientificpierce)反應將產生在n末端具有光反應性雙吖丙啶官能團的官能化β折疊肽。在與目標膜蛋白形成復合物后，雙吖丙啶-fbp：mp可以通過雙吖丙啶官能團交聯(lián)到固體支持物上。此外，由于該具體實例中的官能團(即雙吖丙啶官能團)是光反應性的，所以可以通過光掩模將雙吖丙啶-fpb：mp固定成期望的圖案。使脫乙?；抡郫B肽(其在一個示例性實施方案中具有bp1的序列)與n-5-疊氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亞胺(anb-nos)(thermoscientificpierce)反應將得到anb修飾的β折疊肽(例如，方案1中所示anb-bp1)，其在n末端具有光反應性芳基-疊氮基官能團。在與目標膜蛋白形成復合物后，anb-bp：mp可以通過芳基-疊氮基官能團交聯(lián)到固體支持物上。此外，由于該具體實例中的官能團(即anb)是光反應性的，因此可以通過光掩模將anb-bp：mp復合物固定化成任何期望的圖案。方案1.非乙?；鵥p1與anb-nos產生可光活化的官能化β折疊肽(fbp1)的反應方案。在一個實施方案中，上述官能化β折疊肽和fbp：mp復合物用于產生區(qū)室化反應器，其基于具有特定功能的膜蛋白(即水通道蛋白)陣列以凈化水。在一個實施方案中，上述官能化β折疊肽和fbp：mp復合物可用于基于膜的過濾器中。這樣的過濾器可以用于水脫鹽(例如，使用fbp：水通道蛋白復合物)，或用于特殊化學品的受控分離，或者可以是使用ph和/或壓力的主動控制的過濾器/閥。在一些實施方案中，使用通過官能化β折疊肽穩(wěn)定的水通道蛋白提供了表面固定的可能性，允許構建用于水凈化應用的新型膜。其上固定有官能化β折疊肽穩(wěn)定之水通道蛋白的基質或支持物應當選擇為與固定的肽-蛋白質復合物相容并促進其固有的功能。在一些實施方案中，其上固定有官能化β折疊肽穩(wěn)定之水通道蛋白的基質是經改性的聚合物(例如聚砜、聚碳酸酯、聚內酯等。在一些實施方案中，其上固定有官能化β折疊肽穩(wěn)定之水通道蛋白的基質是碳納米管網或碳納米管網的復合物。在一些實施方案中，其上固定有官能化β折疊肽穩(wěn)定之水通道蛋白的基質是納米晶體纖維素或納米晶體纖維素的復合物。在一個示例性實施方案中，其上固定有官能化β折疊肽穩(wěn)定之水通道蛋白的基質是聚合物。在一個這樣的示例性實施方案中，聚合物是聚砜。聚砜由于其化學相容性和耐久性而在膜工業(yè)中是眾所周知的，并且其為用于結構改性的良好候選。最初將聚砜官能化以形成疊氮基團，然后與特定比例的天然聚砜澆鑄成膜。使用液相誘導相轉化技術(liquid-inducedphaseinversiontechnique)進行澆鑄。在一些實施方案中，在澆鑄過程中加入成孔劑以形成具有受控尺寸的孔的膜。在一些實施方案中，成孔劑(poredevelopingagent)是聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙二醇(peg)、聚(n，n-甲基丙烯酸二甲氨乙酯(pdmaema)等。任何合適的成孔劑(poreformingagent)均可以使用。在一些實施方案中，孔的直徑尺寸為約5nm至若干μm，例如10μm，包括其間的任何值。在一些實施方案中，所形成的孔的直徑尺寸為約20nm至約200nm，包括其間的任何值，例如，直徑為30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或190nm。在這樣的實施方案中，孔周圍的疊氮基官能團提供了官能化β折疊肽穩(wěn)定之水通道蛋白的特異性連接的起始點。在一些這樣的實施方案中，孔周圍的疊氮基官能團提供了用于連接用于穩(wěn)定水通道蛋白分子的炔丙基修飾的官能化β折疊肽的起始點。因此，水通道蛋白-官能化β折疊肽復合物可以通過溫和點擊化學經由官能化β折疊肽共價交聯(lián)至聚砜底物，得到強健且可擴展的載有蛋白質的仿生反滲透膜。在引入孔的一個示例性實施方案中，在官能化β折疊肽穩(wěn)定的水通道蛋白已經交聯(lián)到聚砜底物之后，進行界面聚合以使通過膜中孔的水(或攜帶一種或更多種污染物的水)的任何泄漏最小化。在一個示例性實施方案中，用于制備疊氮基官能化聚砜膜的psu-ch2n3溶液根據方案2中所述的通用反應制備，例如evram等中所述。方案2.用于制作疊氮基官能化聚砜膜的溶液的制備。在制備psu-ch2n3溶液后，根據圖3所示的通用方法制備聚砜膜。在所示實施方案中，將psu-ch2n3與合適的成孔劑(例如在所示實施方案中的pvp)在合適的溶劑(例如n-甲基-2-吡咯烷酮，nmp)中組合，并攪拌合適的時間(例如在所示實施方案中24小時)。將溶液脫氣，以任何合適的方式(例如通過在所示實施方案中通過自動制膜器)澆鑄成膜，并沖洗以除去過量的反應物(例如在所示的實施方案中通過浸漬在去離子水浴中24小時)。在一些實施方案中，省略了成孔劑。在一個示例性實施方案中，將通過具有bp1的通用結構并具有炔丙基官能團(即具有結構(5))的官能化β折疊肽穩(wěn)定的水通道蛋白分子通過點擊化學偶聯(lián)到疊氮基官能化的聚砜膜，如方案3所示。使用點擊化學進行這種反應在本領域普通技術人員的預期能力范圍內。在本發(fā)明人進行的一個實例中，使用硫酸銅(cuso4·5h2o)和抗壞血酸鈉進行聚砜膜和官能化β-肽之間的點擊化學。將1∶3當量的該催化劑與13當量的炔丙基官能化β折疊肽在二氯甲烷溶劑中混合。將混合物在氬氣氛下在室溫下攪拌12小時。通過溶劑蒸發(fā)回收產物。方案3.炔丙基官能化β折疊肽與疊氮基官能化聚砜膜的反應。在一個示例性實施方案中，其上固定有官能化β折疊肽穩(wěn)定之水通道蛋白的基質是碳納米管(cnt)網。天然碳納米管在性質上是疏水的，并且可以通過自身或與復合材料形成網狀物而組裝成膜，或者可以通過適當的交聯(lián)組裝。為了利用碳納米管網作為用于蛋白質引入的基質，首先進行表面化學以促進綴合反應。在一個示例性實施方案中，通過酸解或等離子體氧化(plasmoxidation)進行氧化以在碳納米管網的表面上提供游離羧基，其可以與具有烯基的胺反應以促進對碳納米管基質的uv交聯(lián)。該策略將在碳納米管網上提供乙烯基官能化，以促進與各種官能團的uv交聯(lián)。碳納米管網與官能化β折疊肽穩(wěn)定之水通道蛋白的交聯(lián)可以通過使用具有乙烯基官能團的官能化β折疊肽使用適當的uv輻射來實現。例如，在一些實施方案中，可以使用具有結構(8)的官能化β折疊肽。在一些實施方案中，所使用的uv輻射波長為300至400nm或其間的任何值，例如310、320、330、340、350、360、370、380或390nm。在一些實施方案中，在官能化β折疊肽穩(wěn)定之水通道蛋白已經偶聯(lián)到碳納米管網之后，可以通過緊密包裝碳納米管纖維來使網致密化，以避免水通道蛋白周圍的任何水泄漏。在一些這樣的實施方案中，可以通過將構建體浸泡在甲醇中并且真空干燥來進行致密化，注意不要使穩(wěn)定化水通道蛋白分子的功能破壞的條件。在一個示例性實施方案中，其上固定有官能化β折疊肽穩(wěn)定之水通道蛋白的基質是納米晶體纖維素。類似于使用碳納米管作為基質，可以使用已建立的技術如fisher酯化對表面上具有大量羥基的納米晶體纖維素基質進行表面活化，以引入羧酸酯官能團，然后引入胺-烯雙官能接頭以提供具有乙烯基官能團的表面(參見例如，habibi，y.(2014))。乙烯基官能團可以使用已建立的化學技術與官能化β折疊肽上提供的合適的官能團進一步反應。根據一些實施方案通過利用膜的表面官能團制備膜并使用具有某些修飾的β折疊肽進行蛋白質穩(wěn)定化可以使得能夠產生能夠再現自然選擇性的仿生膜，從而選擇性地使特定顆粒通過或移動穿過膜。在一些實施方案中，特定顆粒是離子或分子。可以選擇膜蛋白以選擇性地通過或運輸特定顆粒，所述特定顆?？梢允瞧谕碾x子、分子例如水、rna、dna等。例如，habel等(2015)中表1中列出的已經使用二嵌段或三嵌段聚合物體系研究過的任何膜蛋白均可以使用官能化β折疊肽而穩(wěn)定在膜上，并用于運輸其相應的運輸物。因此，丙甲甘肽(alamethicin)、溶血素、nadh還原酶、ompg、ompf或rc可用于運輸電子；丙甲甘肽可用于運輸鈣或鈣黃綠素；ntapq1或ntpip2：1可用于運輸二氧化碳，aqp0、aqp10或sopip2；1可以用于以與本說明書中已經證明的aqpz運輸水的相同方式運輸水；tsx可用于運輸核苷；ompf可用于運輸大的有機分子，例如吖啶橙、百草枯、綠膿菌素、乙酰硫代膽堿(actylthiocholine)、烯酮、elf97、7-adca、pgme、核苷、氨芐青霉素、l-抗壞血酸、co、na2s2o4、onoo-；短桿菌肽a可用于運輸一價陽離子；mlok1可用于運輸鉀；lamb可用于運輸糖，包括麥芽六糖或dna；fhua可用于運輸較大分子，如磺酰羅丹明b、tmb、nad、dna、鈣黃綠素；br、pr或br&atp酶可用于運輸h+；br&cco可用于運輸h+和電子；cco可用于運輸電子，多粘菌素b、溶血素或天蠶抗菌肽a可用于運輸鈣黃綠素。在一些實施方案中，諸如α-溶血素、mspa、ompf或ompg的蛋白質可用于運輸多核苷酸，包括dna和rna。如實施例3.0所述，發(fā)明人已經證明可以使用官能化β折疊肽來穩(wěn)定多種膜蛋白，包括aqpz、chief-mcitrine、nachbac、f0f1-atp酶和ompg。chief-mcitrine與br具有非常相似的結構。ompg與ompf和fhua具有非常相似的結構(即，所有三種蛋白質均具有β折疊桶跨膜結構域)。因此，從本文所述的實驗數據并基于與上面列出的其他膜蛋白的結構相似性，可以可靠地預測，除了aqpz之外，上文列出的蛋白和包括其他水通道蛋白的其他膜蛋白可以使用官能化β折疊肽穩(wěn)定并連接至例如任何合適的膜構建體，用于運輸或引導蛋白質的相應運輸物穿過膜。引入官能化β折疊肽穩(wěn)定之水通道蛋白的膜在許多不同的環(huán)境中具有潛在的應用。例如，在一些實施方案中，引入官能化β折疊肽穩(wěn)定之水通道蛋白的膜可以用于諸如廢水處理，油氣部門中的水凈化，水的脫鹽(例如從鹽水源提供飲用水)的應用，以及在生物技術和食品飲料部門中的應用，例如在乳品工業(yè)中除去細菌或乳清濃縮，水果和蔬菜汁的澄清和濃縮，用于產生淀粉和甜味劑，以及所有行業(yè)中的工藝水回收。在一些實施方案中，引入官能化β折疊穩(wěn)定之水通道蛋白的膜阻斷或阻止鈉離子、氯離子、氨、尿素、染料、農藥、藥物廢物或其他有機化合物通過膜，同時選擇性地允許水通過膜。在一些實施方案中，使用引入官能化β折疊穩(wěn)定之水通道蛋白的膜處理污染的水。在一些實施方案中，污染的水是農業(yè)廢物流。在一些這樣的實施方案中，膜用于除去一種或更多種污染物，包括氨、尿素、農藥、合成肥料、重金屬(包括鉛、砷、硒或汞)，來自藥物和個人護理產品的有機污染物，或來自廢物流的微生物。在一些實施方案中，污染的水是工業(yè)廢物流。在一些這樣的實施方案中，膜用于從廢物流中除去一種或更多種污染物，包括磷酸鹽、硝酸鹽、石棉、多氯聯(lián)苯、汞、鉛、苛性鈉或其他鈉化合物、硫、硫酸、油或石油化學品。參考以下實施例進一步描述了本發(fā)明的一些實施方案，這些實施例旨在是說明性的而不是限制性的。實施例1.0-官能化β折疊肽(fbp)的制備實施例1.1-固相肽合成儀上fbp的化學合成使用具有炔丙基側鏈的氨基酸，本發(fā)明人能夠在固相肽合成儀上合成在c末端具有炔官能團的官能化β折疊肽。當在磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋時，炔-fbp自組裝成絲狀結構，這表明炔-fbp保留了β折疊肽的β折疊形成傾向。合成的炔-官能化β折疊肽具有bp1的結構，但具有c末端炔丙基甘氨酸，即具有結構(5)的乙?；?(辛基)gly-ser-leu-ser-leu-asp-(辛基)gly-asp-(炔丙基)gly-nh2，(seqidno：12)。炔官能化β折疊肽的自組裝示出在圖4a中。圖4b示出了顯示高純度的炔丙基-bp1的正確分子質量的質譜圖。本發(fā)明人還使用類似的策略合成了具有結構(6)的疊氮基-fbp1(seqidno：13)。顯示疊氮基-bp1的正確分子質量的質譜圖示于圖4c中。實施例1.2-確認fbp1上的炔官能團為了證實在實施例1.1中合成的炔-bp1上的炔基的存在和活性功能，本發(fā)明人進行反應以使肽上的炔基與熒光tetrathyrhodamine疊氮化物(click-it試劑盒，lifetechnology)進行點擊反應。然后，發(fā)明人在裝備有熒光檢測器的hplc上運行反應產物。如預期的，不屬于試劑盒組分的另外的熒光峰出現在洗脫曲線上(在圖5的上圖中用箭頭指示的；單獨試劑盒和單獨染料的hplc譜分別顯示在圖5的中間圖和下圖)。因此，本發(fā)明人可以將該峰歸屬于染料標記的炔官能化β折疊肽。實施例2.0-膜蛋白純化和bp：mp復合物的形成發(fā)明人已純化了水通道蛋白(aqpz)并驗證了其功能。aqpz是大腸桿菌周質膜上的水通道。aqpz選擇性地以高速率并基于跨細胞膜的滲透梯度轉移水。如上所述，在水凈化應用中使用水通道蛋白的現有嘗試尚未完全成功。然而，相信根據本公開內容的fbp：aqpz復合物將克服與先前嘗試有關的至少一些缺點。根據標準分子生物學程序，本發(fā)明人已經根據之前的文獻(7)使用正十二烷基β-d-麥芽糖苷(ddm)作為增溶性洗滌劑優(yōu)化了大腸桿菌中重組aqpz的過表達和純化。使用文獻(7)中所述的質粒ptrc10hisaqpz作為模板克隆aqpz編碼基因。向編碼基因中引入一個小的修飾，即編碼arg3的密碼子從aga改變?yōu)閏gt，以提高翻譯效率。在大腸桿菌中，密碼子cgt的使用頻率比aga高10倍。將編碼基因克隆到市售質粒(即novagen的pet28a)中，并將所得質粒構建體pet28a-aqpz用于蛋白質表達。質粒的細節(jié)可以在圖6中找到，并且質粒的全序列提供為seqidno.：16。本發(fā)明人首次證實，可以使用對應于由tao等公開的bp1(即，結構(2))的β折疊肽來用β折疊肽穩(wěn)定純化的aqpz。aqpz的結構由六個跨膜螺旋和兩個跨半膜螺旋構成(8)。對應于該螺旋束結構，ddm溶解的aqpz的圓二色性(cd)光譜顯示特征α-螺旋吸收帶，即在198nm的強正帶和在210nm和224nm的負帶(圖7a)(9)，它們是α-螺旋結構的特征。類似地，bp1：aqpz也在其具有藍移峰的cd譜上顯示出特征α-螺旋吸收帶。不受理論的束縛，認為吸收峰的藍移可歸因于影響局部光學環(huán)境的bp1的結合。此外，在4℃下儲存的bp1：aqpz和aqpz/ddm保持四周的二級結構(圖7a)和至少3周的寡聚狀態(tài)(圖7b，示出偽天然12％sds-page的結果)。本發(fā)明人通過在不同溫度下在cd光譜儀上監(jiān)測其二級結構進一步研究了aqpz/ddm和bp：aqpz的熱穩(wěn)定性。如圖8a-8c所示，與ddm溶解的aqpz類似(圖8a)，bp：aqpz在高達90℃的溫度下保持其二級結構的大部分(約70％)(圖8b；圖8c所示的ddm穩(wěn)定的和β折疊肽穩(wěn)定的aqpz在192nm的歸一化橢圓率)。這種非凡的熱穩(wěn)定性表明bpi：aqpz或fbp1：aqpz將是用于制造仿生水凈化膜的良好候選物，其可暴露于苛刻條件的溫度或環(huán)境污染物(例如鹽、洗滌劑、重金屬等)。實施例3.0-使用官能化β折疊肽穩(wěn)定膜蛋白發(fā)明人已經證明，可以使用官能化β折疊肽穩(wěn)定膜蛋白。所測試的額外膜蛋白包括具有螺旋束整合膜蛋白的三種膜蛋白(chief-mcitrine、nachbac和f0f1-atp酶)以及具有β折疊整合膜蛋白的一種膜蛋白(ompg)。aqpz是螺旋束整合膜蛋白。chief是實驗室設計的光門控陽離子通道，其在用光刺激時運輸質子、鈉離子、鈣離子等。在該具體實施例中，將熒光標簽mcitrine遺傳學地連接于所述蛋白質的c末端以促進純化，產生chief-mcitrine構建體。nachbac是受膜電位調節(jié)的運輸鈉離子的細菌(耐鹽芽孢桿菌(bacillushalodurans))膜蛋白。f0f1-atp酶是當通過跨細胞膜的質子梯度驅動時合成atp的atp合酶(來自芽孢桿菌ps3)。ompg是能夠跨膜運輸大的溶質(如二糖)的細菌孔蛋白(大腸桿菌k12)。每種蛋白質的穩(wěn)定結果分別示于圖9a-9e中。通過分別對應于結構(6)、(7)和(8)的具有bp1序列的三種不同的官能化β折疊肽(疊氮基、炔丙基和乙烯基)穩(wěn)定上述每種蛋白質。示出了每一種蛋白質的cd譜，未進行蛋白質穩(wěn)定化(分別對于aqpq和ompg的不含ddm或不含og)或用ddm穩(wěn)定蛋白質(f0f1-atp酶、nachbac和chief-mcitrine)。本發(fā)明人通過測量其atp水解活性進一步證明當通過官能化β折疊肽穩(wěn)定時，f0f1-atp酶保持其功能。酶促反應中無機磷酸(pi)的產生作為酶活性的指示劑。使用picolorlocktm磷酸檢測試劑盒(innovabiosciences)按照制造商的說明書進行atp酶水解活性。如圖10a所示，當用bp1或ddm穩(wěn)定時，f0f1-atp酶的酶活性(通過水解活性表征)類似。如圖10b所示，當通過具有結構(6)的官能化β折疊肽疊氮基-bp1穩(wěn)定時，f0f1-atp酶也保持水解活性。因此，可以可靠地預測，通過官能化β折疊肽穩(wěn)定化并通過官能化β折疊肽的官能團與膜的反應并入膜中的fof1-atp酶可用于產生人工atp產生系統(tǒng)。當跨容納f0f1-atp酶的膜存在質子梯度時，所述酶將從adp和無機磷酸合成atp，導致在膜的一側產生atp。還可以使酶逆向起作用以從atp的水解產生質子梯度。因此，f0f1-atp酶可以用于合成atp，或者替代地將質子從具有其中并入f0f1-atp酶的膜的一側泵送到膜的另一側。aqpz、nachbac、chief和atp酶都是具有由螺旋束形成的類似跨膜結構域結構的蛋白質。ompg代表不同跨膜結構域結構的實例：β-折疊桶?；谶@樣多組的膜蛋白(包括aqpz)都被官能化β折疊肽成功穩(wěn)定的事實，并且基于不同水通道蛋白之間的高度保守性(例如如圖1b所示)，可以可靠地預測，除aqpz之外的其他水通道蛋白也可以用官能化β折疊肽穩(wěn)定并偶聯(lián)到膜以從水中去除污染物。還可以進一步可靠地預測，官能化β折疊肽可以用于穩(wěn)定和束縛多種膜蛋白以制備有用的蛋白質構建體。如下文實施例4.0所討論的，根據表明當通過官能化β折疊肽穩(wěn)定時f0f1-atp酶保持其活性以及表明可以使用官能化β折疊肽將水通道蛋白并入膜中并且用于提高通過膜的水的通量同時限制鹽通過膜的結果，可以可靠地預測，當通過官能化β折疊肽穩(wěn)定時，其他膜蛋白將保持其功能。例如4.0-評估水通過含水通道蛋白膜的運輸實施例4.1-聚砜膜酶合成按照文獻(yilmaz等，2011)中所述的方案2中所述的通用反應制備疊氮基官能化聚砜膜。在步驟1中，首先在裝配有磁力攪拌器、回流冷凝器和溫度計的圓底燒瓶中，通過溶解在氯仿中完成聚砜的氯甲基化。將溶液在氮氣氛下在50℃下加熱，然后將對甲醛(10g)、三甲基氯硅烷(42.50ml)和氯化錫(iv)(1.75g)加入到聚合物溶液中。一旦反應完成(在50℃下50小時)，在攪拌下將混合物倒入甲醇中，過濾聚合物沉淀，然后用甲醇充分洗滌，最后在真空烘箱中在60-65℃干燥24小時。在步驟2中，然后在置于熱浴的圓底燒瓶中，將氯化聚砜與nan3一起溶解在dmf中，并將反應混合物在65℃下攪拌10小時。將反應混合物冷卻至室溫并在攪拌下倒入甲醇中，過濾分離的聚合物，并用甲醇洗滌。加入聚乙烯吡咯烷酮(pvp)作為成孔劑，之后真空烘箱中在60℃干燥24小時。實施例4.2-合成的仿生膜的分離性質使用根據實施例4.1制備的聚砜膜和具有結構(2)的β折疊肽制備并入β折疊肽穩(wěn)定之aqpz的膜。為了官能化β折疊肽以形成聚酰胺-聚砜復合膜結構，將間苯二胺濃度(mpd)(2重量％)與均苯三甲酰氯(tmc)(0.15重量％)以及aqpz和聚砜膜合并，以在聚砜膜上產生互鎖的界面聚合的聚酰胺層。反應時間(在膜上官能化β折疊肽穩(wěn)定之蛋白質的界面聚合)為15秒，aqpz濃度(存在于用于進行界面聚合的蛋白質溶液中)為0.033mg/ml，具有0.064mg/ml的β折疊肽。除了不存在aqpz之外，在沒有aqpz的情況下測試的膜的條件相同。在標準交叉流反滲透裝置中表征合成的仿生膜的分離性質。簡言之，將具有42cm2的活性表面積的膜試樣安裝在測試池(cf42membranecell，sterlitech)中。以0.8加侖/分鐘的恒定交叉流量泵送進料溶液(25℃下1g/lnacl)(1000ppm)。在樣品收集用于水通量和排除測量之前，在期望的測試壓力下將膜壓緊2小時。使用重量法測定膜滲透通量(jv)，并且基于滲液和給水的電導率測量獲得nacl脫除率(r)。如表3(具有aqpz)和表4(不具有aqpz)中所總結的，并如圖11a、11b和11c所示(圖11c僅示出了250psi操作壓力下的數據)，并入水通道蛋白的構建體中通量(升/平方米/小時，或lmh)(即，通過膜的水的流速)增加，并且在較高的操作壓力下，當存在水通道蛋白時實現更大的脫鹽率。這些結果證明，并入水通道蛋白的膜可用于通過增加通量(即通過膜的水的流速)來增強水與不期望的溶液組分例如氯化鈉的分離，同時保持膜對氯化鈉的排斥(即，同時繼續(xù)阻止氯化鈉通過膜)。表3.并入aqpz的膜構建體的通量和脫鹽率。壓強(psi)通量(lmh)脫鹽率(％)20015.358025019.338530022.999035026.529040029.9290表4.沒有aqpz的對照膜構建體的通量和脫鹽率。壓強(psi)通量(lmh)脫鹽率(％)2003.74852504.86853006.33853507.52854008.0585雖然上面已經討論了多個示例性方面和實施方案，但是本領域技術人員將認識到其某些修改、置換、添加和子組合。因此，與作為整體的說明書的最寬解釋一致，旨在將以下所附權利要求和之后引入的權利要求解釋為包括的所有這樣的修改、置換、添加和子組合。參考文獻以下參考文獻對于本文所描述的主題可能是有意義的。為了所有目的，以下參考文獻中的每一個明確通過引用整體并入本文。1.s.gnidehouetal.，expressioninescherichiacoliandpurificationofhumanrecombinantconnexin-43，afour-passtransmembraneprotein.proteinexpressionandpurification78，174(aug，2011).2.c.tribet，r.audebert，j.l..popot，amphipols：polymersthatkeepmembraneproteinssolubleinaqueoussolutions.procnatlacadsciusa93，15047(dec24，1996).3.t.h.bayburt，y.v.grinkova，s.g.sligar，self-assemblyofdiscoidalphospholipidbilayernanoparticleswithmembranescaffoldproteins.nanoletters2，4(2002).4.x.zhaoetal.，designershortpeptidesurfactantsstabilizegprotein-coupledreceptorbovinerhodopsin.procnatlacadsciusa103，17707(nov21，2006).5.p.s.chaeetal.，maltose-neopentylglycol(mng)amphiphilesforsolubilization，stabilizationandcrystallizationofmembraneproteins.naturemethods7，1003(dec，2010、.6.h.taoetal.，engineerednanostructuredbeta-sheetpeptidesprotectmembraneproteins.naturemethods10，759(aug，2013).7.m.j.borgnia，d.kozono，g.calamita，p.c.maloney，p.agre，functionalreconstitutionandcharacterizationofaqpz，thee.coliwaterchannelprotein.journalofmolecularbiology291，1169(sep3，1999).8.d.f.savage，p.f.egea，y.robles-colmenares，j.d.o′connell，3rd，r.m.stroud，architectureandselectivityinaquaporins：2.5ax-raystructureofaquaporinz.plosbiology1，e72(dec，2003).9.s.m.kelly，t.j.jess，n.c.price，howtostudyproteinsbycirculardichroism.biochimicaetbiophysicaacta1751，119(aug10，2005).10.erbakan，m.，shen，y.-x.，grzelakowski，m.，butler，p.j.，kumar，m.，&curtis，w.r.(2014).molecularcloning，overexpressionandcharacterizationofanovelwaterchannelproteinfromrhodobactersphaeroides.plosone，9(1)，e86830.11.sun，g.，zhou，h.，li，y.，jeyaseelan，k.，armugam，a.，&chung，t.-s.(2012).anovelmethodofaquaporinzincorporationviabinary-lipidlangmuirmonolayers.colloidsandsurfacesb：biointerfaces，89，283-288.12.sun，g.，chung，t.-s.，jeyaseelan，k.，&armugam，a.(2013).alayer-by-layerself-assemblyapproachtodevelopinganaquaporin-embeddedmixedmatrixmembrane.rscadv.，3(2)，473-481.13.evram，e.，eta1.(1997).polymerswithpendantfunctionalgroup.iii.polysulfonescontainingviologengroup.j.macromol.sci.，apureapplchem34：1701-1714.14.habibi，y.(2014).keyadvancesinthechemicalmodificationofnanocelluloses.chemicalsocietyreviews，43(5)，1519-1542.15.habel，j.，hansen，m.，kynde，s.，larsen，n.，midtgaard，s.，jensen，g.，etal.(2015).aquaporin-basedbiomimeticpolymericmembranes：approachesandchallenges.membranes，5(3)，307-351.16.yilmaz，g.etal.(2011).modificationofpolysulfonesbyclickchemistry：amphiphilicgraftcopolymersandtheirproteinadsorptionandcelladhesionproperties.j.pol.sci.：parta：pol.chem.，49，110-117.17.ghoshetal.，“impactsofsupportmembranestruetureandchemistryonpolyamide-polysulfoneinterfacialcompositemembranes”，2009，j.mem.sci，336，140-148.序列表獨立文本本說明書包括電子序列表，其作為本說明書的一部分而明確并入。此序列表包括如下的自由文本：·seqidno：1-bp1-合成肽·seqidno：12-c-炔丙基-bp1-合成肽·seqidno：13-n-疊氮基-bp1-合成肽·seqidno：14-n-炔丙基-bp1-合成肽·seqidno：15-乙烯基-bp1-合成肽·seqidno：16-pet28a-apqz-質粒，用于在大腸桿菌中表達aqpz序列表<110>艾伯塔大學校董<120>官能化β折疊肽穩(wěn)定的膜蛋白、包含其的構建體以及形成和使用其的方法<130>m9170005/twb<150>us62/041,587<151>2014-08-25<160>16<170>patentinversion3.5<210>1<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>mod_res<222>(1)..(1)<223>(辛基)gly<220><221>mod_res<222>(7)..(7)<223>(辛基)gly<400>1xaaserleuserleuaspxaaasp15<210>2<211>243<212>prt<213>球形紅細菌（rhodobactersphaeroides）<400>2metthrlyslysleuleualagluleuleuglythrpheileleuval151015phepheglycysglyalaalavalleumetglyproglnileglymet202530leuglyileserleualapheglyleuserilevalalaalaalatyr354045serleuglyalaileserglyalahisleuasnproalavalserleu505560glypheleumetalaglyargmetprometalaglupheglyglytyr65707580valleualaglnilealaglyalaleuleuglyserleuvalvalphe859095leuilealaserglylysalaglytyrvalleualathraspglyleu100105110glyglnasnglypheglyalaglytyrleuglyglutyrsermetgly115120125alaalaleuilephegluleuilealathrphevalphevalserval130135140ileleualaalathralaserhisvalserseralaserthralaleu145150155160alaglyleualaileglyleuthrleuthrglyilehisleuvalgly165170175ileasnvalthrglyvalservalasnproalaargserleualapro180185190alaleuphevalglyglylysalaleuseraspleutrpvalpheile195200205valalaproleualaglyglyalaalaalaglyleualahisalaser210215220glyphepheargproglyglyilegluproalaproalathrglyala225230235240alathrleu<210>3<211>231<212>prt<213>大腸桿菌<400>3metphearglysleualaalaglucyspheglythrphecysleuval151015pheglyglycysglyseralavalleuproalaglypheprogluleu202530glyileglyphealaglyvalalaleualapheglyleuthrvalleu354045thrmetalaphealavalglyhisileserglyglyhispheasnpro505560alavalthrileglyleutrpalaglyglyargpheproalalysglu65707580valvalglytyrvalilealaglnvalvalglyglyilevalalaala859095alaleuleutyrleuilealaserglylysthrglypheaspalaala100105110alaserglyphealaserasnglytyrglygluhisserproglygly115120125tyrsermetleuseralaleuvalvalgluleuvalleuseralagly130135140pheleuleuvalilehisglyalathrasplysphealaproalagly145150155160phealaproilealaileglyleualaleuthrleuilehisleuile165170175serileprovalthrasnthrservalasnproalaargserthrala180185190valalailepheglnglyglytrpalaleugluglnleutrpphephe195200205trpvalvalproilevalglyglyileileglyglyleuiletyrarg210215220thrleuleuglulysargasp225230<210>4<211>281<212>prt<213>大腸桿菌<400>4metserglnthrserthrleulysglyglncysilealaglupheleu151015glythrglyleuleuilephepheglyvalglycysvalalaalaleu202530lysvalalaglyalaserpheglyglntrpgluileservaliletrp354045glyleuglyvalalametalailetyrleuthralaglyvalsergly505560alahisleuasnproalavalthrilealaleutrpleuphealacys65707580pheasplysarglysvalilepropheilevalserglnvalalagly859095alaphecysalaalaalaleuvaltyrglyleutyrtyrasnleuphe100105110pheaspphegluglnthrhishisilevalargglyservalgluser115120125valaspleualaglythrpheserthrtyrproasnprohisileasn130135140phevalglnalaphealavalglumetvalilethralaileleumet145150155160glyleuileleualaleuthraspaspglyasnglyvalproarggly165170175proleualaproleuleuileglyleuleuilealavalileglyala180185190sermetglyproleuthrglyphealametasnproalaargaspphe195200205glyprolysvalphealatrpleualaglytrpglyasnvalalaphe210215220thrglyglyargaspileprotyrpheleuvalproleupheglypro225230235240ilevalglyalailevalglyalaphealatyrarglysleuilegly245250255arghisleuprocysaspilecysvalvalgluglulysgluthrthr260265270thrprosergluglnlysalaserleu275280<210>5<211>246<212>prt<213>methanobactermarburgensis<400>5metvalserleuthrlysargcysilealaglupheileglythrphe151015ileleuvalphepheglyalaglyseralaalavalthrleumetile202530alaserglyglythrserproasnpropheasnileglyileglyleu354045leuglyglyleuglyasptrpvalalaileglyleualapheglyphe505560alailealaalaseriletyralaleuglyasnileserglycyshis65707580ileasnproalavalthrileglyleutrpservallyslysphepro859095glyarggluvalvalprotyrileilealaglnleuleuglyalaala100105110pheglyserpheilepheleuglncysalaglyileglyalaalathr115120125valglyglyleuglyalathralapropheproglyilesertyrtrp130135140glnalametleualagluvalvalglythrpheleuleumetilethr145150155160ilemetglyilealavalaspgluargalaprolysglyphealagly165170175ileileileglyleuthrvalalaglyileilethrthrleuglyasn180185190ileserglyserserleuasnproalaargthrpheglyprotyrleu195200205asnaspmetilephealaglythrasnleutrpasntyrtyrproile210215220tyrvalileglyproilevalglyalavalleualaalaleuthrtyr225230235240glntyrleuthrserglu245<210>6<211>269<212>prt<213>synechococcuselongatus<400>6metlysmetleuargalaleulyshishistrpproglutyrleuile151015glualatrpglyleuglyleuphemetvalalaalaglyvalvalgly202530thrleuvalphetyrproglnserproalatyrglnalailealaasp354045propheleuglnargvalvalmetglyleuglymetglyleuthrala505560metileilemettyrserprotrpglylysargserglyalahisile65707580asnproalavalthrleuthrphetyrargleulyslysilealaala859095trpaspalaphephetyrvalvalpheglnpheileglyglyleuleu100105110glyvalvalleuvalalapheleuleuglnthrprophethrglnala115120125provalasntyrvalvalthrvalproglylysglnglyalaileval130135140alacysilealaglutyrpheilealavalleumetmetsermetval145150155160leuphethrserasnglnprolysleugluargphethrprophephe165170175alaglycysleuilevalsertyrvalilephegluserproleuser180185190glypheglymetasnproalaargthrvalalaseralaleuproser195200205glyiletrpthralailetrpleutyrpheleualaproilealagly210215220metleuthralaalagluleutyrleuargmetileglyproarglys225230235240ilephecysalalysleutyrhisaspproleutyrargcysilehis245250255cysglyhisleuilehistrphisargprohisleuarg260265<210>7<211>279<212>prt<213>巴斯德畢赤酵母（pichiapastoris）<400>7metproaspilegluasnglnalaalaaspglyglnalagluilelys151015progluaspalaprotyrilethrasnalatyrlysproalatyrala202530argtrpglypheglyseraspservalargasnhispheilealamet354045serglygluphevalglythrpheleupheleutrpseralapheval505560ilealaglnilealaasnglnalaprogluthrproaspglyglyser65707580asnproalaglnleuilemetileserpheglypheglypheglyval859095metvalglyvalpheilethrtyrargvalserglyglyasnleuasn100105110proalavalthrleualaleuvalleualaargalaileproprophe115120125argglyileleumetalaphethrglnilevalalaglymetalaala130135140alaglyalaalaseralametthrproglygluilealaphealaasn145150155160alaleuglyglyglyalaserargthrargglyleupheleugluala165170175pheglythralaileleucysleuthrvalleumetleualavalglu180185190lyshisargalathrtrpphealaprophevalileglyilealaleu195200205leuilealahisleuilecysiletyrtyrthrglyalaglyleuasn210215220proalaargserpheglyproalavalalaalaargserpheproasn225230235240tyrhistrpiletyrtrpleuglyproileleuglyalapheleuala245250255tyrseriletrpglnmettrplystrpleuasntyrglnthrthrasn260265270proglyglnaspseraspala275<210>8<211>281<212>prt<213>菠菜（spinaciaoleracea）<400>8metserlysgluvalsergluglualaglnalahisglnhisglylys151015asptyrvalaspproproproalaprophepheaspleuglygluleu202530lysleutrpserphetrpargalaalailealaglupheilealathr354045leuleupheleutyrilethrvalalathrvalileglyhisserlys505560gluthrvalvalcysglyservalglyleuleuglyilealatrpala65707580pheglyglymetilephevalleuvaltyrcysthralaglyileser859095glyglyhisileasnproalavalthrpheglyleupheleualaarg100105110lysvalserleuleuargalaleuvaltyrmetilealaglncysleu115120125glyalailecysglyvalglyleuvallysalaphemetlysglypro130135140tyrasnglnpheglyglyglyalaasnservalalaleuglytyrasn145150155160lysglythralaleuglyalagluileileglythrphevalleuval165170175tyrthrvalpheseralathraspprolysargseralaargaspser180185190hisvalproileleualaproleuproileglyphealavalphemet195200205valhisleualathrileproilethrglythrglyileasnproala210215220argserpheglyalaalavalilepheasnserasnlysvaltrpasp225230235240aspglntrpilephetrpvalglypropheileglyalaalavalala245250255alaalatyrhisglntyrvalleuargalaalaalailelysalaleu260265270glyserpheargserasnprothrasn275280<210>9<211>269<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>9metalasergluphelyslyslysleuphetrpargalavalvalala151015glupheleualathrthrleuphevalpheileserileglyserala202530leuglyphelystyrprovalglyasnasnglnthralavalglnasp354045asnvallysvalserleualapheglyleuserilealathrleuala505560glnservalglyhisileserglyalahisleuasnproalavalthr65707580leuglyleuleuleusercysglnileserilepheargalaleumet859095tyrileilealaglncysvalglyalailevalalathralaileleu100105110serglyilethrserserleuthrglyasnserleuglyargasnasp115120125leualaaspglyvalasnserglyglnglyleuglyilegluileile130135140glythrleuglnleuvalleucysvalleualathrthraspargarg145150155160argargaspleuglyglyseralaproleualaileglyleuserval165170175alaleuglyhisleuleualaileasptyrthrglycysglyileasn180185190proalaargserpheglyseralavalilethrhisasnpheserasn195200205histrpilephetrpvalglypropheileglyglyalaleualaval210215220leuiletyrasppheileleualaproargserseraspleuthrasp225230235240argvallysvaltrpthrserglyglnvalgluglutyraspleuasp245250255alaaspaspileasnserargvalglumetlysprolys260265<210>10<211>323<212>prt<213>智人<400>10metseraspargprothralaargargtrpglylyscysglyproleu151015cysthrarggluasnilemetvalalaphelysglyvaltrpthrgln202530alaphetrplysalavalthralaglupheleualametleuilephe354045valleuleuserleuglyserthrileasntrpglyglythrglulys505560proleuprovalaspmetvalleuileserleucyspheglyleuser65707580ilealathrmetvalglncyspheglyhisileserglyglyhisile859095asnproalavalthrvalalametvalcysthrarglysileserile100105110alalysservalphetyrilealaalaglncysleuglyalaileile115120125glyalaglyileleutyrleuvalthrproproservalvalglygly130135140leuglyvalthrmetvalhisglyasnleuthralaglyhisglyleu145150155160leuvalgluleuileilethrpheglnleuvalphethrilepheala165170175sercysaspserlysargthraspvalthrglyserilealaleuala180185190ileglypheservalalaileglyhisleuphealaileasntyrthr195200205glyalasermetasnproalaargserpheglyproalavalilemet210215220glyasntrpgluasnhistrpiletyrtrpvalglyproileilegly225230235240alavalleualaglyglyleutyrglutyrvalphecysproaspval245250255gluphelysargargphelysglualapheserlysalaalaglngln260265270thrlysglysertyrmetgluvalgluaspasnargserglnvalglu275280285thraspaspleuileleulysproglyvalvalhisvalileaspval290295300aspargglygluglulyslysglylysaspglnserglygluvalleu305310315320serserval<210>11<211>295<212>prt<213>智人<400>11metglnprogluglyalaglulysglylysserphelysglnargleu151015valleulysserserleualalysgluthrleuserglupheleugly202530thrpheileleuilevalleuglycysglycysvalalaglnalaile354045leuserargglyargpheglyglyvalilethrileasnvalglyphe505560sermetalavalalametalailetyrvalalaglyglyvalsergly65707580glyhisileasnproalavalserleualametcysleupheglyarg859095metlystrpphelysleuprophetyrvalglyalaglnpheleugly100105110alaphevalglyalaalathrvalpheglyiletyrtyraspglyleu115120125metserphealaglyglylysleuleuilevalglygluasnalathr130135140alahisilephealathrtyrproalaprotyrleuserleualaasn145150155160alaphealaaspglnvalvalalathrmetileleuleuileileval165170175phealailepheaspserargasnleuglyalaproargglyleuglu180185190proilealaileglyleuleuileilevalilealaserserleugly195200205leuasnserglycysalametasnproalaargaspleuserproarg210215220leuphethralaleualaglytrpglyphegluvalpheargalagly225230235240asnasnphetrptrpileprovalvalglyproleuvalglyalaval245250255ileglyglyleuiletyrvalleuvalilegluilehishisproglu260265270proaspservalphelysthrgluglnsergluasplysproglulys275280285tyrgluleuservalilemet290295<210>12<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>mod_res<222>(1)..(1)<223>(辛基)gly<220><221>mod_res<222>(7)..(7)<223>(辛基)gly<220><221>mod_res<222>(9)..(9)<223>(炔丙基)gly<400>12xaaserleuserleuaspxaaaspxaa15<210>13<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>mod_res<222>(1)..(1)<223>疊氮高丙氨酸<220><221>mod_res<222>(2)..(2)<223>(辛基)gly<220><221>mod_res<222>(8)..(8)<223>(辛基)gly<400>13xaaxaaserleuserleuaspxaaasp15<210>14<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>mod_res<222>(1)..(1)<223>(炔丙基)gly<220><221>mod_res<222>(2)..(2)<223>(辛基)gly<220><221>mod_res<222>(8)..(8)<223>(辛基)gly<400>14xaaxaaserleuserleuaspxaaasp15<210>15<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>mod_res<222>(1)..(1)<223>(辛基)gly<220><221>mod_res<222>(5)..(5)<223>氨基乙烯酸<220><221>mod_res<222>(8)..(8)<223>(辛基)gly<400>15xaaserleuserxaaleuaspxaaaspglyleu1510<210>16<211>6003<212>dna<213>人工序列<220><223>用于在大腸桿菌中表達aqpz的質粒。<400>16atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaa60ggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctt120tgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagtgcggccgcaagcttta180atcacgcttttccagcagggtccggtaaatcagaccaccgataatgccgccgacaattgg240caccacccagaagaaccacagttgttctaatgcccagccgccctggaagatagcaaccgc300ggtgctgcgcgccgggttaacagaagtgttagtcaccggaatactaattaagtgaatcag360ggttaaggccagaccaatagcgatcggcgcaaaacctgccggcgcgaatttgtcggttgc420gccgtggatcaccaacaggaaacctgcactcaataccagttcaactaccagcgcggaaag480catggaataaccgcctggtgaatgctcgccataaccgttagaagcaaaaccgctggctgc540cgcgtcaaaacccgttttaccactggcaattaaatacagcagcgccgctgcaacaatacc600gccgacaacctgggcaattacgtagccaacgacttcttttgccggaaaacgtccgccagc660ccataaaccaatagtgaccgccgggttaaaatgaccaccagaaatatgaccaacagcaaa720ggccatcgtcagaacggtcagaccgaacgccaacgccacgccggcaaaaccaatgcctaa780ttccgggaagcctgcggccagtacagcactaccacagccaccaaaaacaagccagaaagt840accaaaacattcagctgctaattttctgaacatatggctgccgcgcggcaccaggccgct900gctgtgatgatgatgatgatggctgctgcccatggtatatctccttcttaaagttaaaca960aaattatttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtatta1020atttcgcgggatcgagatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccgg1080cgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggc1140tcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggc1200cgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaa1260cggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcg1320agatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccgg1380aagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagt1440atgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctg1500cgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcg1560tggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctgg1620ccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtg1680ccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgc1740acaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccagg1800atgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctg1860accagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtgg1920agcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctg1980tctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagc2040cgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaa2100tgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgg2160gcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgg2220gatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacagg2280attttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccagg2340cggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgc2400ccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgac2460aggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctcact2520cattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttc2580cggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaa2640ctcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctgg2700agcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaa2760gccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggc2820atggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctgg2880cggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgac2940tgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtt3000tcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatc3060gcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcat3120tgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctca3180caacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctct3240cgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtg3300accaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacg3360cttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgctt3420cacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaa3480aacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccggg3540agcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatg3600acccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcaga3660ttgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaa3720ataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcg3780gctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcagg3840ggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaa3900ggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcg3960acgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccc4020tggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgc4080ctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttc4140ggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccg4200ctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgcc4260actggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacaga4320gttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgc4380tctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaac4440caccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaagg4500atctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactc4560acgttaagggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaa4620ggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattcca4680acatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtg4740cgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggca4800aaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaat4860ttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactca4920ccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtg4980aaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgta5040attgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaata5100acggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaag5160tctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtg5220atttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttg5280gacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtg5340agttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgata5400tgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaagaattaattcatgagc5460ggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccc5520cgaaaagtgccacctgaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttt5580tgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatca5640aaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactatta5700aagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccacta5760cgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcgg5820aaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgaga5880aaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacg5940ctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcg6000cca6003當前第1頁12