本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含作為活性成分的萜類化合物衍生物，所述萜類化合物衍生物具有激活Keap1/Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路的能力，并且具有優(yōu)異的抗炎作用和細(xì)胞保護(hù)作用，其中所述藥物組合物對治療和預(yù)防由氧化應(yīng)激引起的眼病表現(xiàn)出顯著效果。
背景技術(shù)：
：在檢測到在能量代謝過程中產(chǎn)生的活性氧等后，啟動(dòng)宿主防御系統(tǒng)諸如抗氧化酶組、解毒代謝酶組等。Keap1/Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路控制該宿主防御系統(tǒng)的啟動(dòng)。已知Keap1/Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路的激活誘導(dǎo)其靶基因：NAD(P)H:醌氧化還原酶-1(NQO1)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)等(非專利文獻(xiàn)1)。NQO1是異生素代謝的2期酶，并且對于解毒是重要的。HO-1和GCLC已知為典型的抗氧化酶。當(dāng)這些酶量增加或激活時(shí)，細(xì)胞變得對毒物、氧化應(yīng)激、炎癥等具有抗性。因此，激活該信號傳導(dǎo)通路的化合物被認(rèn)為充當(dāng)各種疾病的治療藥物(非專利文獻(xiàn)2至5)。被靶向疾病的具體實(shí)例如下給出。已報(bào)道Nrf2缺陷小鼠在視網(wǎng)膜缺血/再灌注系統(tǒng)中表現(xiàn)出脆弱性(非專利文獻(xiàn)6)。這表明該化合物對眼病的適用性，所述眼病諸如過敏性結(jié)膜疾病、病毒性結(jié)膜炎、翼狀胬肉、角膜感染、角膜內(nèi)皮疾病、白內(nèi)障、葡萄膜炎、白塞氏病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜脫落、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、黃斑病、色素性視網(wǎng)膜炎、青光眼和白內(nèi)障(非專利文獻(xiàn)7和8)。已報(bào)道Nrf2缺陷小鼠表現(xiàn)出對順鉑誘導(dǎo)的腎毒性的脆弱性(非專利文獻(xiàn)9)。這表明該化合物對腎病的適用性，所述腎病諸如急性腎炎、慢性腎炎、急性腎衰竭、慢性腎衰竭、腎病綜合征、IgA腎病、糖尿病性腎病、痛風(fēng)腎、腎硬化、腎盂積水、腎小管間質(zhì)性腎炎和尿道感染(非專利文獻(xiàn)10)。已報(bào)道Nrf2缺陷小鼠表現(xiàn)出對香煙煙霧暴露的脆弱性(非專利文獻(xiàn)11)。這表明該化合物對呼吸系統(tǒng)疾病的適用性，所述呼吸系統(tǒng)疾病諸如支氣管炎、肺炎、胸膜炎、慢性阻塞性肺病、彌漫性泛細(xì)支氣管炎、肺氣腫和哮喘(非專利文獻(xiàn)12和13)。已報(bào)道Nrf2缺陷小鼠當(dāng)用甲硫氨酸/膽堿缺陷膳食飼喂時(shí)可能發(fā)展非酒精性脂肪性肝炎(非專利文獻(xiàn)14)。這表明該化合物對肝病的適用性，所述肝病諸如酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化(非專利文獻(xiàn)2和15)。此外，已報(bào)道Nrf2激活劑在小鼠中表現(xiàn)出低血糖作用(非專利文獻(xiàn)16)。這表明該化合物對糖尿病及其并發(fā)癥(糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病性腎病變和糖尿病性神經(jīng)病變)等的適用性。作為激活Keap1/Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路的物質(zhì)，已報(bào)道花椰菜芽中含有的蘿卜硫素、用于咖喱的姜黃中含有的姜黃素等激活Nrf2并促進(jìn)致癌物的解毒(非專利文獻(xiàn)17)。此外，已報(bào)道由Honda等人發(fā)現(xiàn)的包含甲基2-氰基-3,12-二氧代齊墩果-1,9(11)-二烯-26-酸的5-元環(huán)三萜類化合物(非專利文獻(xiàn)18和專利文獻(xiàn)1至10)激活Keap1/Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路。已報(bào)道這些化合物導(dǎo)致產(chǎn)生幾種抗炎蛋白和抗氧化蛋白(例如，NQO1、HO-1和GCLC)(專利文獻(xiàn)9)。同時(shí)，已經(jīng)設(shè)計(jì)了使用各種基質(zhì)材料的各種形式諸如納米顆粒、微球和棒的藥物組合物，其目的是使對眼后段疾病具有如上所述的抗氧化作用的化合物的藥理作用最大化，同時(shí)減少對患者的施用負(fù)擔(dān)。此外，已對各種DDS技術(shù)(諸如離子電滲療法和微針)的開發(fā)進(jìn)行了研究(非專利文獻(xiàn)19)。這表明在眼病領(lǐng)域中極其需要用于實(shí)現(xiàn)向受影響區(qū)域的藥物遞送、藥物保留和維持以及藥物有效性的專門施用方法?？赡艿牟牧鲜墙饘?、不可降解的塑料和可生物降解的塑料，并且可能的形式是各種形式，諸如微球和棒。聚乳酸或聚(乳酸-共-乙醇酸)是具有優(yōu)異的生物相容性和生物降解性的基質(zhì)材料(非專利文獻(xiàn)20)。由于存在一些具有該基質(zhì)材料作為組分的藥物產(chǎn)品，已經(jīng)明顯地建立了該基質(zhì)材料的實(shí)際應(yīng)用。微球或棒形式是適于作為植入物在玻璃體內(nèi)施用的形狀。盡管如上所述已設(shè)計(jì)了用于預(yù)防或治療眼后段疾病的活性成分(藥物)和各種DDS技術(shù)，但在非常罕見的情況下已發(fā)現(xiàn)具有與DDS技術(shù)相容的特性的藥物。關(guān)于藥物和DDS技術(shù)的組合，只有少數(shù)制品已作為藥物產(chǎn)品推出，而在眼病領(lǐng)域中，僅存在地塞米松的植入物注射。這種困難由各種因素引起，然而，在許多情況下，據(jù)推測歸因于劑量不足，因?yàn)椴蝗菀自谝粋€(gè)劑量中包含維持所需的時(shí)間段所必需的足夠量的藥物。因此，需要開發(fā)對眼后段疾病具有優(yōu)異的預(yù)防和治療效果的化合物，和用于眼后段疾病的藥物組合物，所述藥物組合物含有該化合物作為活性成分，并且能夠以在醫(yī)療實(shí)踐中可接受的長給藥時(shí)間間隔發(fā)揮其預(yù)防和治療效果。引文列表專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:WO99/65478專利文獻(xiàn)2:WO2012/125488專利文獻(xiàn)3:WO2011/130302專利文獻(xiàn)4:WO2009/146216專利文獻(xiàn)5:WO2009/129546專利文獻(xiàn)6:WO2009/129548專利文獻(xiàn)7:WO2009/023232專利文獻(xiàn)8:WO2004/064723專利文獻(xiàn)9:WO2009/089545專利文獻(xiàn)10:WO2013/188818非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1:Int.J.Biochem.Cell.Biol.2012;44:1315-1320非專利文獻(xiàn)2:Clin.Pharmacol.Ther.2012;92:340-348非專利文獻(xiàn)3:Adv.Pharmacol.2012;63:43-79非專利文獻(xiàn)4:Med.Res.Rev.2012;32:687-726非專利文獻(xiàn)5:Mol.Aspects.Med.2011;32:234-246非專利文獻(xiàn)6:FreeRadicBiol.Med.2011;51:216-224非專利文獻(xiàn)7:FrontBiosci.(EliteEd.)2012;4:141-115非專利文獻(xiàn)8:Curr.Med.Chem.2011;18:931-942非專利文獻(xiàn)9:J.Pharmacol.Exp.Ther.2010;335:2-12非專利文獻(xiàn)10:Int.J.Nephrol.2012;321714非專利文獻(xiàn)11:Proc.Natl.Acad.Sci.USA2009;106:250-255非專利文獻(xiàn)12:TrendsMol.Med.2011;17:363-371非專利文獻(xiàn)13:Toxicol.Appl.Pharmacol.2010;244:43-56非專利文獻(xiàn)14:FreeRadicBiol.Med.2010;48:357-371非專利文獻(xiàn)15:J.Nutr.Biochem.2012;23:1201-1206非專利文獻(xiàn)16:J.Biol.Chem.2010;285:40581-40592非專利文獻(xiàn)17:TheJournalofTheJapaneseBiochemicalSociety,2009;81:447-9非專利文獻(xiàn)18:Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998:8:2711-2714非專利文獻(xiàn)19:DrugDiscoveryToday2011:16:1-8非專利文獻(xiàn)20:AdvancedDrugDliveryReviews2013;65:104-120。發(fā)明概述技術(shù)問題本發(fā)明人已經(jīng)對激活Keap1/Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路并可用于預(yù)防和治療眼后段疾病的化合物以及包含所述化合物作為活性成分的藥物組合物進(jìn)行了深入研究，并且因此通過以下發(fā)現(xiàn)而完成了本發(fā)明：特定萜類化合物衍生物具有優(yōu)異的抗炎作用和細(xì)胞保護(hù)作用，且含有所述化合物作為活性成分的特定藥物組合物能夠以醫(yī)療實(shí)踐中可接受的長給藥時(shí)間間隔發(fā)揮其預(yù)防和治療作用。問題的解決方案具體地，本發(fā)明提供(1)由下式(I)代表的萜類化合物衍生物：[式1](2)具有以下物理化學(xué)性質(zhì)的萜類化合物衍生物：1)外觀：無色粉末狀物質(zhì)2)分子式：C32H43NO53)分子量：521(通過ESI質(zhì)譜法測量)4)通過高分辨率LC-ESI質(zhì)譜法測量的精確質(zhì)量[M+H]+如下給出：實(shí)測值：522.32062計(jì)算值：522.321405)1H-核磁共振譜：使用TMS在參照為0.00ppm的氘代氯仿中測量的1H-核磁共振譜(500MHz)如下給出：σ:0.98(3H,s),0.99(3H,s),1.00(3H,s),1.17(3H,s),1.18-1.22(1H,m),1.25(3H,s),1.28-1.30(1H,m),1.33(3H,s),1.49(3H,s),1.51-1.55(1H,m),1.62-1.66(1H,m),1.68-1.71(1H,m),1.69-1.72(1H,m),1.70-1.80(2H,m),1.77-1.79(1H,m),1.76-1.82(2H,m),1.85-1.89(2H,m),2.96(1H,d,J=5.0Hz),3.04(1H,ddd,J=4.0Hz,4.0Hz,14.0Hz),3.49(1H,dd,J=5.0Hz,11.5Hz),3.71(3H,s),5.97(1H,s),8.03(1H,s)ppm6)13C-核磁共振譜：使用TMS在參照為0.00ppm的氘代氯仿中測量的13C-核磁共振譜(125MHz)如下給出：σ:16.4(q),18.2(t),21.4(q),21.5(q),23.9(t),24.6(q),26.6(q),27.0(q),28.1(t),29.1(q),31.1(d),31.6(t),35.8(t),35.9(s),40.1(t),42.0(s),42.5(s),45.0(s),45.7(s),47.7(d),48.9(s),49.0(d),52.1(q),73.7(d),114.3(s),114.6(s),124.0(d),165.5(d),168.5(s),176.6(s),196.5(s),198.7(s)ppm7)高效液相色譜：柱：UnisonUK-C18(4.6mm(直徑)×75mm(長度)；由ImtaktCorp.制造)溶劑：A：含有0.01％甲酸的10mM甲酸銨水溶液B：含有0.01％甲酸的乙腈A/B=用5/5平衡，隨后線性梯度7分鐘，直至A/B=1/9流速：1.0ml/min溫度：40℃檢測：紫外吸收λ=230nm保留時(shí)間：4.3分鐘，(3)由下式(II)代表的萜類化合物衍生物：[式2](4)具有以下物理化學(xué)性質(zhì)的萜類化合物衍生物：1)外觀：無色粉末狀物質(zhì)2)分子式：C32H43NO63)分子量：537(通過ESI質(zhì)譜法測量)4)通過高分辨率LC-ESI質(zhì)譜法測量的精確質(zhì)量[M+H]+如下給出：實(shí)測值：538.31496計(jì)算值：538.316315)1H-核磁共振譜：使用TMS在參照為0.00ppm的氘代氯仿中測量的1H-核磁共振譜(500MHz)如下給出：σ:0.96(3H,s),1.06(3H,s),1.11(3H,s),1.12(3H,s),1.19(3H,s),1.27(3H,s),1.28(3H,s),1.46(1H,d,J=13.0Hz),1.47(1H,d,J=13.0Hz),1.52-1.59(2H,m),1.61-1.65(2H,m),1.66-1.69(1H,m),1.68-1.75(1H,m),1.75(1H,dd,J=3.5Hz,14.5Hz),1.88(1H,brd,J=14.5Hz),1.98(1H,dd,J=5.5Hz,9.5Hz),2.03(1H,dd,J=3.5Hz,14.5Hz),2.38(1H,ddd,J=3.5Hz,14.0Hz,14.0Hz),2.99(1H,d,J=4.5Hz),3.10(1H,brd,J=13.5Hz),3.53(1H,brs),3.69(3H,s),4.34(1H,s),6.09(1H,s)ppm6)13C-核磁共振譜：使用TMS在參照為0.00ppm的氘代氯仿中測量的13C-核磁共振譜(125MHz)如下給出：σ:18.3(t),21.0(q),21.3(q),22.8(q),23.9(q),24.0(q),25.7(t),27.4(q),28.0(q),28.7(t),30.0(t),31.4(t),31.5(d),35.2(s),38.9(t),40.9(s),42.1(s),42.6(d),45.1(s),45.5(s),47.0(s),49.5(d),52.0(q),53.2(s),69.1(d),74.8(d),113.6(s),124.8(d),168.8(s),177.6(s),198.8(s),202.4(s)ppm7)高效液相色譜：柱：UnisonUK-C18(4.6mm(直徑)×75mm(長度)；由ImtaktCorp.制造)溶劑：A：含有0.01％甲酸的10mM甲酸銨水溶液B：含有0.01％甲酸的乙腈A/B=用5/5平衡，隨后線性梯度7分鐘，直至A/B=1/9流速：1.0ml/min溫度：40℃檢測：紫外吸收λ=230nm保留時(shí)間：5.4分鐘，(5)用于生產(chǎn)根據(jù)(1)或(2)所述的化合物的方法，其包括使用由下式(1)代表的化合物作為底物：[式3]在培養(yǎng)基中將該化合物與毛殼菌屬的用于生物轉(zhuǎn)化的菌株一起培養(yǎng)，所述菌株能夠?qū)⑺龌衔镛D(zhuǎn)化為根據(jù)(1)或(2)所述的化合物，并從培養(yǎng)物收集根據(jù)(1)或(2)所述的化合物，(6)根據(jù)(5)所述的用于生產(chǎn)化合物的方法，其中所述用于生物轉(zhuǎn)化的菌株是屬于毛殼菌屬的球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)SANK10312(保藏號NITEBP-1486)，(7)根據(jù)(5)所述的用于生產(chǎn)化合物的方法，其中所述用于生物轉(zhuǎn)化的菌株是屬于毛殼菌屬的毛殼菌種SANK11867(保藏號NITEBP-01916)，(8)用于生產(chǎn)由下式(III)代表的萜類化合物衍生物的方法：[式4]其包括使用由式(1)代表的化合物作為底物，在培養(yǎng)基將該化合物與屬于毛殼菌屬的毛殼菌種SANK11867(保藏號NITEBP-01916)一起培養(yǎng)，所述菌種能夠?qū)⑺龌衔镛D(zhuǎn)化為由式(III)代表的萜類化合物衍生物，并從培養(yǎng)物收集由式(III)代表的萜類化合物衍生物，(9)用于生產(chǎn)根據(jù)(3)或(4)所述的化合物或由式(III)代表的萜類化合物衍生物的方法，其包括通過使用有機(jī)過氧化物的環(huán)氧化反應(yīng)從式(1)的化合物生產(chǎn)由下式(2)代表的化合物：[式5]，隨后使用由式(2)代表的化合物作為底物，在培養(yǎng)基中將該化合物與用于生物轉(zhuǎn)化的菌株一起培養(yǎng)，所述菌株能夠?qū)⑺龌衔镛D(zhuǎn)化為根據(jù)(3)或(4)所述的化合物或由式(III)代表的萜類化合物衍生物，并從培養(yǎng)物收集根據(jù)(3)或(4)所述的化合物或由式(III)代表的萜類化合物衍生物，(10)根據(jù)(9)所述的方法，其中所述用于生物轉(zhuǎn)化的菌株是屬于芽孢桿菌屬的芽孢桿菌種SANK70214(保藏號NITEBP-01914)，(11)根據(jù)(9)所述的方法，其中所述用于生物轉(zhuǎn)化的菌株是屬于芽孢桿菌屬的巨大芽孢桿菌SANK70314(保藏號NITEBP-01915)，(12)根據(jù)(9)所述的方法，其中所述用于生物轉(zhuǎn)化的菌株是通過用編碼以下蛋白(a)、(b)、(c)或(d)的基因轉(zhuǎn)化宿主而獲得的轉(zhuǎn)化體：(a)具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的蛋白(圖11)，(b)具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的蛋白(圖12)，(c)具有通過一個(gè)或若干個(gè)氨基酸的缺失、置換、插入或添加而衍生自蛋白(a)或(b)的氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白，(d)具有與蛋白(a)或(b)的氨基酸序列具有90％或更高序列同一性的氨基酸序列的蛋白，和(e)由在嚴(yán)格條件下與由編碼蛋白(a)或(b)的核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA編碼的蛋白，(13)根據(jù)(12)所述的方法，其中所述宿主是大腸桿菌或細(xì)菌，(14)根據(jù)(13)所述的方法，其中所述細(xì)菌是枯草芽孢桿菌，(15)具有以下核苷酸序列(f)至(j)中的任一種且編碼具有針對由式(2)代表的底物化合物的羥基化酶活性的蛋白的核苷酸序列：(f)SEQIDNO:3中所述的核苷酸序列(圖9)，(g)SEQIDNO:4中所述的核苷酸序列(圖10)，(h)在嚴(yán)格條件下與包含核苷酸序列(f)或(g)中定義的任一核苷酸序列的互補(bǔ)序列的DNA雜交的DNA的核苷酸序列，(i)與核苷酸序列(f)或(g)中定義的任一核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列，和(j)核苷酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性在嚴(yán)格條件下不與包含核苷酸序列(f)或(g)中定義的任一核苷酸序列的互補(bǔ)序列的DNA雜交，但與(f)至(h)中任一項(xiàng)中定義的核苷酸序列序列編碼相同的氨基酸，(16)具有以下核苷酸序列(k)至(n)中的任一種且具有針對由式(2)代表的底物化合物的羥基化酶活性的蛋白：(k)SEQIDNO:5中所述的氨基酸序列(圖11)，(l)SEQIDNO:6中所述的氨基酸序列(圖12)，(m)通過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、置換和/或添加而衍生自氨基酸(k)或(l)中定義的任一氨基酸序列的氨基酸序列，和(n)與氨基酸序列(k)或(l)中定義的任一氨基酸序列具有90％或更高同一性的氨基酸序列，(17)攜帶根據(jù)(15)所述的核苷酸序列的自主復(fù)制或整合復(fù)制的重組質(zhì)粒，(18)通過用根據(jù)(17)所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主而獲得的轉(zhuǎn)化體，(19)通過用根據(jù)(17)所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌而獲得的轉(zhuǎn)化體枯草芽孢桿菌SANK70214T，(20)通過用根據(jù)(17)所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌而獲得的轉(zhuǎn)化體枯草芽孢桿菌SANK70314T，(21)屬于芽孢桿菌屬的芽孢桿菌種SANK70214(保藏號NITEBP-01914)，(22)屬于芽孢桿菌屬的巨大芽孢桿菌SANK70314(保藏號NITEBP-01915)，(23)用于治療或預(yù)防以下疾病的藥物：眼病(眼病是過敏性結(jié)膜疾病、病毒性結(jié)膜炎、翼狀胬肉、角膜感染、干眼癥、角膜病癥(其為角膜上皮病癥和/或角膜內(nèi)皮病癥)、葡萄膜炎、白塞氏病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜脫落、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、黃斑病、色素性視網(wǎng)膜炎、青光眼或白內(nèi)障)，腎病(腎病是急性腎炎、慢性腎炎、急性腎衰竭、慢性腎衰竭、腎病綜合征、IgA腎病、糖尿病性腎病、痛風(fēng)腎、腎硬化、腎盂積水、腎小管間質(zhì)性腎炎、冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)后腎功能降低或尿道感染)，呼吸系統(tǒng)疾病(呼吸系統(tǒng)疾病是支氣管炎、肺炎、胸膜炎、慢性阻塞性肺病、急性肺損傷(ALI)、彌漫性泛細(xì)支氣管炎、肺氣腫或哮喘)，肝病(肝病是酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化或與肝移植相關(guān)的肝功能障礙)，腦病(腦病是阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、腦梗塞或多發(fā)性硬化)，或心臟病(心臟病是心肌梗塞)，所述藥物包含(1)至(4)中任一項(xiàng)所述的萜類化合物衍生物作為活性成分，(24)用于治療或預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物，其包含根據(jù)(1)至(4)中任一項(xiàng)的萜類化合物衍生物或由式(III)代表的萜類化合物衍生物作為活性成分，其中所述緩釋藥物組合物通過在生理?xiàng)l件下緩釋所述萜類化合物衍生物而將其藥理作用維持1周或更長時(shí)間，并且具有可施用于玻璃體的基質(zhì)材料和可施用于玻璃體的形式，(25)用于治療或預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物，其包含由式(III)代表的萜類化合物衍生物作為活性成分，其中所述緩釋藥物組合物通過在生理?xiàng)l件下緩釋所述萜類化合物衍生物而將其藥理作用維持1周或更長時(shí)間，并且具有可施用于玻璃體的基質(zhì)材料和可施用于玻璃體的形式，(26)根據(jù)(24)或(25)所述的用于治療或預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物，其中所述基質(zhì)材料是可生物降解的聚合物，(27)根據(jù)(24)或(25)所述的用于治療或預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物，其中所述基質(zhì)材料是聚乳酸或聚(乳酸-共-乙醇酸)，(28)根據(jù)(24)至(27)中任一項(xiàng)所述的用于治療或預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物，其中所述形式是微球，(29)根據(jù)(24)至(27)中任一項(xiàng)所述的用于治療或預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物，其中所述形式是棒，(30)根據(jù)(24)至(29)中任一項(xiàng)所述的用于治療或預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物，其中所述活性成分的含量是5重量％至80重量％，(31)根據(jù)(242)至(29)中任一項(xiàng)所述的用于治療或預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物，其中所述活性成分的含量是20重量％至60重量％，(32)根據(jù)(24)或(25)所述的用于治療或預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物，其中所述活性成分的含量是20重量％至60重量％，所述緩釋藥物組合物通過在生理?xiàng)l件下緩釋所述活性成分而將其藥理作用維持1周或更長時(shí)間，所述基質(zhì)材料是聚乳酸或乳酸乙醇酸，且形狀是微球或棒，(33)根據(jù)(24)至(32)中任一項(xiàng)所述的用于治療或預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物，其中所述眼后段疾病是年齡相關(guān)性黃斑變性，和(34)根據(jù)(24)至(32)中任一項(xiàng)所述的用于治療或預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物，其中所述眼后段疾病是糖尿病性黃斑水腫和/或視網(wǎng)膜靜脈閉塞。本發(fā)明的萜類化合物衍生物(I)、(II)和(III)(以下也將這些化合物統(tǒng)稱為本發(fā)明的萜類化合物衍生物)可以形成溶劑化物。另外，本發(fā)明的萜類化合物衍生物，當(dāng)放置于空氣中時(shí)，可能吸水，或通過吸收水分而形成水合物。此類溶劑化物或水合物也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明的有利效果本發(fā)明的萜類化合物衍生物具有優(yōu)異的抗炎作用和細(xì)胞保護(hù)作用，且可用作眼病、腎病、呼吸系統(tǒng)疾病、肝病、糖尿病及其并發(fā)癥、特別是眼病的治療藥物。包含本發(fā)明的萜類化合物衍生物作為活性成分的本發(fā)明的緩釋藥物組合物可以通過一個(gè)劑量將其藥理作用維持1周或更長。本發(fā)明的緩釋藥物組合物能夠以醫(yī)療實(shí)踐中可接受的長給藥時(shí)間間隔發(fā)揮其作用，其目的在于預(yù)防和治療眼后段疾病，因此可用作用于治療或預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物。使用本發(fā)明的生物轉(zhuǎn)化菌株的本發(fā)明的制備方法可以以高生物轉(zhuǎn)化率從底物合成本發(fā)明的萜類化合物衍生物。附圖簡述[圖1]圖1顯示萜類化合物衍生物(I)的1H-NMR譜。[圖2]圖2顯示萜類化合物衍生物(I)的1H-13CHSQC譜。[圖3]圖3顯示萜類化合物衍生物(I)的1H-1HNOESY譜。[圖4]圖4顯示萜類化合物衍生物(II)的1H-NMR譜。[圖5]圖5顯示萜類化合物衍生物(II)的1H-13CHSQC譜。[圖6]圖6顯示萜類化合物衍生物(II)的1H-1HNOESY譜。[圖7]圖7顯示SANK7021416SrDNA的部分核苷酸序列(SEQIDNO:1)。[圖8]圖8顯示SANK7031416SrDNA的部分核苷酸序列(SEQIDNO:2)。[圖9]圖9顯示具有羥基化活性的SANK70214的蛋白的DNA序列(SEQIDNO:3)。[圖10]圖10顯示具有羥基化活性的SANK70314的蛋白的DNA序列(SEQIDNO:4)。[圖11]圖11顯示具有羥基化活性的SANK70214的蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:5)。[圖12]圖12顯示具有羥基化活性的SANK70314的蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。[圖13]圖13顯示SANK70214和SANK70314的系統(tǒng)發(fā)生樹。實(shí)施方案的描述本發(fā)明的萜類化合物衍生物可以根據(jù)常規(guī)方法從微生物的培養(yǎng)物中分離和純化，所述微生物能夠?qū)⑻囟ǖ孜锘衔镛D(zhuǎn)化為本發(fā)明的萜類化合物衍生物[在本發(fā)明中，稱為用于生物轉(zhuǎn)化的菌株]。1.底物化合物(1)由下式(1)代表的化合物可用作底物，用于生產(chǎn)本發(fā)明的由式(I)代表的萜類化合物衍生物(以下稱為萜類化合物衍生物(I))和由式(III)代表的萜類化合物衍生物(以下稱為萜類化合物衍生物(III))。[式6]該化合物在Bioorganic&MedicinalChemistryLetters8(1998)2711-2714中的合成方案2中被描述為化合物No.17，并且也被稱為2-氰基-3,12-二氧代齊墩果-1,9-二烯-26(CDDO-Me)。在下文中，該底物化合物也稱為CDDO-Me。CDDO-Me可以根據(jù)Bioorganic&MedicinalChemistryLetters7(1997)1623-1628和Bioorganic&MedicinalChemistryLetters8(1998)2711-2714中描述的合成方法制備。(2)由下式(2)代表的化合物可用作底物，用于生產(chǎn)本發(fā)明的由式(II)代表的萜類化合物衍生物(以下稱為萜類化合物衍生物(II))和由式(III)代表的萜類化合物衍生物。[式7]由式(2)代表的化合物可以通過使用有機(jī)過氧化物的環(huán)氧化反應(yīng)由CDDO-Me產(chǎn)生。所述有機(jī)過氧化物的實(shí)例可以包括但不特別限于過甲酸、過乙酸、過苯甲酸和3-氯過苯甲酸。優(yōu)選3-氯過苯甲酸。2.用于從底物化合物生產(chǎn)本發(fā)明的萜類化合物衍生物的用于生物轉(zhuǎn)化的菌株(1)<SANK10312>用于從底物化合物(1)生產(chǎn)本發(fā)明的萜類化合物衍生物(I)或萜類化合物衍生物(III)的用于生物轉(zhuǎn)化的菌株沒有特別限制，且優(yōu)選為真菌。其實(shí)例包括屬于毛殼菌屬(genusChaetomium)的真菌。所述屬于毛殼菌屬的真菌優(yōu)選為球毛殼霉，更優(yōu)選球毛殼菌SANK10312(保藏號NITEBP-1486)(以下將該菌株稱為“SANK10312”)。SANK10312于2000年11月從京都府的淡水中分離出來。為了鑒定真菌菌株SANK10312，使用以下4種類型的培養(yǎng)基，并且它們的組成如下：<PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)>Nissui馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(由NissuiPharmaceuticalCo.,Ltd.制造)39g蒸餾水1000ml<OA培養(yǎng)基(燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基)>燕麥粉提取物*1000ml瓊脂20g*向30g燕麥粉中添加蒸餾水，并將混合物熬煮2小時(shí)，并通過布過濾，隨后填充至1000ml以制備燕麥粉提取物。<MEA培養(yǎng)基(麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基)>Bacto麥芽提取物(由Becton,DickinsonandCompany制造)30gBactoSoytone(由Becton,DickinsonandCompany制造)3g瓊脂15g蒸餾水1000ml。<CMA培養(yǎng)基(玉米粉瓊脂培養(yǎng)基)>玉米粉瓊脂"Nissui"(由NissuiPharmaceuticalCo.,Ltd.制造)17g蒸餾水1000ml在下面的描述中，根據(jù)Kornerup,A.&Wanscher,J.H.1978.Methuenhandbookofcolour(第3版).EryeMethuen,London指示顏色。SANK10312的真菌學(xué)性質(zhì)如下給出。將SANK10312接種至4種類型的培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基、OA培養(yǎng)基、CMA培養(yǎng)基和MEA培養(yǎng)基)中，并觀察其真菌學(xué)性質(zhì)。PDA培養(yǎng)基中的SANK10312的生長溫度為9至33℃，并且該菌株生長良好，特別是在18至31℃下。SANK10312的真菌學(xué)性質(zhì)如下。通過在28℃下培養(yǎng)10天，OA培養(yǎng)基中的菌落直徑為80mm或更大。菌落薄，由白色和短棉狀菌絲構(gòu)成，并且為灰黃色，其中在稍微遠(yuǎn)離中心的位置處同心圓地從灰棕色至黃棕色。菌落的中心部分在表面上密集地形成小顆粒狀的子囊果，并且是深綠色的。反面是淺黃色至棕橙色，其中在中心部分為橄欖棕色，且在稍微遠(yuǎn)離中心的位置處同心圓地呈深棕色。通過在28℃下培養(yǎng)10天，MEA培養(yǎng)基中的菌落直徑為80mm或更大。菌落薄，由白色和短棉狀菌絲構(gòu)成，且呈褐橙色。既不形成分生孢子，也不形成子囊果。反面與之類似。通過在28℃下培養(yǎng)10天，CMA培養(yǎng)基中的菌落直徑為60mm。菌落非常薄，而在瓊脂表面上只有稀疏的菌絲。菌落的表面顏色幾乎是無色透明的，而反面與之類似。PDA培養(yǎng)基中的SANK10312的生長溫度為9至33℃，并且該菌株生長良好，特別是在18至31℃下。OA培養(yǎng)基中的SANK10312在28℃下在第10天的微觀結(jié)構(gòu)如下：子囊果是深棕色至黑色，具有亞球形至橢圓形，寬度為175至240μm，高度為275至400μm，并且具有由交錯(cuò)菌絲和頂部的孔口組成的外壁。側(cè)毛是直的或略微波形，淡橄欖色，直徑為3.5μm或更小，而在子囊果的上部區(qū)域與末端毛成為一體。大量的末端毛是致密的，且為波形或朝向頂端松散地卷繞，并且整體上具有粗糙表面，具有隔片，和圓形頂端。末端毛基部寬度為3至4μm，且為橄欖色，并且朝向頂端變得更細(xì)和更加淡色。子囊是棍棒形，且為八孢子的。子囊孢子為檸檬形，且未熟時(shí)為淡褐色，而成熟時(shí)則為淡綠色至暗橄欖棕色，且為6.0至9.0×8.0至11.0μm。未觀察到分生孢子。上述真菌學(xué)特征與關(guān)于土壤真菌綱中的Kunze球毛殼菌(ChaetomiumglobosumKunze)的描述(K.H.Domsch,W.Gams和T.-H.Anderson(2007))完全一致。因此，該真菌菌株被鑒定為球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)并命名為球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)SANK10312。將SANK10312在2012年12月18日以保藏號NITEBP-1486國際保藏于NITE專利微生物保藏中心(NPMD)，生物資源中心，國家技術(shù)和評價(jià)研究所(NITEPatentMicroorganismsDepositary(NPMD),BiologicalResourceCenter,NationalInstituteofTechnologyandEvaluation)(地址：2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,Japan)。眾所周知，真菌對自然界中的或通過人工操作(例如，紫外線照射、輻射或化學(xué)試劑處理)的突變敏感。據(jù)推測，本發(fā)明的SANK10312也對此類突變敏感。在本發(fā)明中，SANK10312涵蓋其所有變體。這些變體還涵蓋通過遺傳方法例如重組、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化獲得的那些。具體地，作為用于生產(chǎn)本發(fā)明的萜類化合物衍生物的用于生物轉(zhuǎn)化的菌株的SANK10312、它們的變體以及與其無明顯區(qū)別的真菌菌株都包括在SANK10312中。(2)<SANK11867>用于從底物化合物(1)生產(chǎn)本發(fā)明的萜類化合物衍生物(I)或萜類化合物衍生物(III)的用于生物轉(zhuǎn)化的菌株沒有特別限制，且優(yōu)選為真菌。其實(shí)例可以包括屬于毛殼菌屬(genusChaetomium)的真菌。所述屬于毛殼菌屬的真菌優(yōu)選為毛殼菌種，更優(yōu)選為毛殼菌種SANK11867(保藏號NITEBP-01916)(該菌株被稱為“SANK11867”)。從日本的土壤分離的SANK11867是我們公司的儲備菌株。為了鑒定真菌菌株SANK11867，使用4種類型的培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基、OA培養(yǎng)基、MEA培養(yǎng)基和CMA培養(yǎng)基)用于鑒定真菌菌株SANK10312。在下面的描述中，根據(jù)“Methuenhandbookofcolour”指示顏色。SANK11867的真菌學(xué)性質(zhì)如下給出。將SANK11867接種至4種類型的培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基、OA培養(yǎng)基、CMA培養(yǎng)基和MEA培養(yǎng)基)中，并觀察其真菌學(xué)性質(zhì)。PDA培養(yǎng)基中的SANK11867的生長溫度為5至33℃，并且該菌株生長良好，特別是在13至31℃下。SANK11867的真菌學(xué)性質(zhì)如下。OA培養(yǎng)基中的菌落在20℃下在第10天直徑為80mm或更大。菌落薄，由白色和短棉狀菌絲構(gòu)成，且呈灰黃色。菌落的中心部分在表面上密集地形成小顆粒狀的子囊果，并且是深綠色的。反面具有與表面的顏色相同的顏色。MEA培養(yǎng)基中的菌落在20℃下在第10天直徑為80mm或更大。菌落薄，由白色和短棉狀菌絲構(gòu)成，且呈褐橙色。既不形成分生孢子，也不形成子囊果。反面與之類似。CMA培養(yǎng)基中的菌落在20℃下在第10天直徑為52至55mm。菌落非常薄，而在瓊脂表面上只有稀疏的菌絲。菌落的表面顏色幾乎是無色透明的，而反面與之類似。OA培養(yǎng)基中的SANK11867在28℃下在第10天的微觀結(jié)構(gòu)如下：子囊果是深棕色至黑色，具有亞球形至橢圓形，寬度為145至350μm，高度為225至625μm，并且具有由交錯(cuò)菌絲和頂部的孔口組成的外壁。側(cè)毛是直的或略微波形，淡橄欖色，而在子囊果的上部區(qū)域與末端毛成為一體。大量的末端毛是致密的，且為波形或朝向頂端松散地卷繞，并且整體上具有粗糙表面，具有隔片，和圓形頂端。末端毛基部寬度為2.5至6.5μm，且為橄欖色，并且朝向頂端變得更細(xì)和更加淡色。子囊是棍棒形，且為八孢子的。子囊孢子為檸檬形，且未熟時(shí)為淡褐色，而成熟時(shí)則為淡綠色至暗橄欖棕色，且為8.5至10.5×7.0至8.5μm。未觀察到分生孢子。上述真菌學(xué)特征與關(guān)于土壤真菌綱中的毛殼菌屬的描述(K.H.Domsch,W.Gams和T.-H.Anderson(2007))完全一致。因此，該真菌菌株被鑒定為毛殼菌種并命名為毛殼菌種SANK11867。將SANK11867在2014年8月7日以保藏號NITEBP-01916國際保藏于NITE專利微生物保藏中心(NPMD)，生物資源中心，國家技術(shù)和評價(jià)研究所(NITEPatentMicroorganismsDepositary(NPMD),BiologicalResourceCenter,NationalInstituteofTechnologyandEvaluation)(地址：2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,Japan)。眾所周知，微生物對自然界中的或通過人工操作(例如，紫外線照射、輻射或化學(xué)試劑處理)的突變敏感。據(jù)推測，本發(fā)明的SANK11867也對此類突變敏感。在本發(fā)明中，SANK11867涵蓋其所有變體。這些變體還涵蓋通過遺傳方法例如重組、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化獲得的那些。具體地，作為用于生產(chǎn)本發(fā)明的萜類化合物衍生物的用于生物轉(zhuǎn)化的菌株的SANK11867、其變體以及與其無明顯區(qū)別的真菌菌株都包括在SANK11867中。(3)<SANK70214>用于從底物化合物(2)生產(chǎn)本發(fā)明的萜類化合物衍生物(II)或萜類化合物衍生物(III)的用于生物轉(zhuǎn)化的菌株沒有特別限制，且優(yōu)選為具有羥基化酶活性的細(xì)菌。其實(shí)例可以包括屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌。所述屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌優(yōu)選為芽孢桿菌種，更優(yōu)選為芽孢桿菌種SANK70214(保藏號NITEBP-01914)(以下稱為SANK70214)。SANK7021416SrDNA的部分核苷酸序列顯示于SEQIDNO:1中(圖7)。SANK70214在1997年9月分離自在北海道收集的淡水樣品。為了鑒定細(xì)菌菌株SANK70214，細(xì)菌培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基的組成如下：<TSB(PearlcoreTrypto-SoyBroth)瓊脂培養(yǎng)基>PearlcoreTrypto-SoyBroth(EikenChemicalCo.,Ltd.)30g瓊脂15g蒸餾水1000ml(在高壓滅菌前將pH調(diào)節(jié)至8.0)。下面將描述SANK70214。[1]形態(tài)學(xué)性質(zhì)在TSB培養(yǎng)基(pH8.0)中在28℃下培養(yǎng)24小時(shí)后觀察到的細(xì)菌是細(xì)胞寬度為1μm且長度為4至5μm的桿狀細(xì)菌，并且顯示沒有運(yùn)動(dòng)。[2]培養(yǎng)性質(zhì)在TSB培養(yǎng)基(pH8.0)中在28℃下培養(yǎng)24小時(shí)后的菌落的顏色是半透明乳白色，并且不太發(fā)亮。菌落具有朝向中心以類似凸透鏡形狀凸起的圓形，并且具有光滑的表面和整個(gè)邊緣。[3]生物學(xué)性質(zhì)(1)過氧化氫酶：+(2)生長溫度：14至39℃(3)革蘭氏染色：陽性(4)酸產(chǎn)生(使用API50CH)赤蘚醇：-D-阿拉伯糖：-L-阿拉伯糖：-D-核糖：+L-木糖：+甲基-β-D-吡喃木糖苷：-D-半乳糖：-D-甘露糖：+L-鼠李糖：+衛(wèi)矛醇：-肌醇：-D-山梨醇：-甲基-α-D-吡喃甘露糖苷：-甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷：-N-乙酰葡糖胺：-苦杏仁苷：+水楊苷：+D-乳糖：-D-蜜二糖：-D-松三糖：-D-棉子糖：-淀粉：-糖原：-木糖醇：-龍膽二糖：+D-松二糖：-D-來蘇糖：-D-塔格糖：-D-阿拉伯糖醇：-葡糖酸：-2-酮-葡萄糖酸：-(5)生長pHpH6:+pH7:+pH8:+pH9:+pH10:+(6)在含有NaCl的培養(yǎng)基中的生長0%:+2%:+4%:+6%:+8%:+10%:-。[4]遺傳性質(zhì)(1)G+C含量：40.8%(2)16SrDNA分析：作為將測定的核苷酸序列(1478bp：序列表的SEQIDNO:1)與登記在RibosomalDatabaseProject(RDP)中的各種細(xì)菌菌株的數(shù)據(jù)(Release11，(在2014年3月7日更新))進(jìn)行比較的結(jié)果，與吉氏芽孢桿菌(B.gibsonii)DSM8722的同源性最高，其中同源性值為99.5％。通過Saitou和Nei的鄰接法(SaitouN.和M.Nei,MolecularBiologyandEvolution,4,p.406-425(1987))進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，以獲得圖13中所示的結(jié)果。通過參考Bergey'sManualofSystematicBacteriology,Vol.3(2009年發(fā)布)鑒定具有這些真菌學(xué)性質(zhì)的SANK70214。從16SrDNA的核苷酸序列的分析結(jié)果來看，SANK70214顯示與吉氏芽孢桿菌DSM8722的密切的系譜關(guān)系。SANK70214的形態(tài)學(xué)性質(zhì)、培養(yǎng)性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)和遺傳性質(zhì)與芽孢桿菌屬的那些完全一致。因此，SANK70214被鑒定為屬于芽孢桿菌屬的菌株。SANK70214與顯示與其最接近的系譜關(guān)系的吉氏芽孢桿菌的不同在于利用L-阿拉伯糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-松三糖、D-棉子糖和D-松二糖的碳源。另外，在16SrDNA的核苷酸序列的方面，SANK70214與芽孢桿菌屬的已知細(xì)菌種明顯不同。因此，SANK70214被命名為芽孢桿菌種SANK70214。將SANK70214在2014年8月7日以保藏號NITEBP-01914國際保藏于NITE專利微生物保藏中心(NPMD)，生物資源中心，國家技術(shù)和評價(jià)研究所(NITEPatentMicroorganismsDepositary(NPMD),BiologicalResourceCenter,NationalInstituteofTechnologyandEvaluation)(地址：2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,Japan)。眾所周知，微生物對自然界中的或通過人工操作(例如，紫外線照射、輻射或化學(xué)試劑處理)的突變敏感。據(jù)推測，本發(fā)明的SANK70214也對此類突變敏感。在本發(fā)明中，SANK70214涵蓋其所有變體。這些變體還涵蓋通過遺傳方法例如重組、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化獲得的那些。具體地，作為用于生產(chǎn)本發(fā)明的萜類化合物衍生物的用于生物轉(zhuǎn)化的菌株的SANK70214、其變體以及與其無明顯區(qū)別的細(xì)菌菌株都包括在SANK70214中。(4)<SANK70314>作為用于從底物化合物(2)生產(chǎn)本發(fā)明的萜類化合物衍生物(II)或萜類化合物衍生物(III)的用于生物轉(zhuǎn)化的菌株的屬于芽孢桿菌屬細(xì)菌的另一個(gè)實(shí)例可以優(yōu)選包括巨大芽孢桿菌SANK70314(保藏號NITEBP-01915)(以下稱為SANK70314)。SANK7031416SrDNA的部分核苷酸序列顯示于SEQIDNO:2(圖8)。SANK70314在2013年9月分離自在沖繩縣收集的土壤樣品。為了鑒定細(xì)菌菌株SANK70314，細(xì)菌培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基的組成如下：<NA(Pearlcore營養(yǎng)瓊脂)培養(yǎng)基>Pearlcore營養(yǎng)瓊脂(EikenChemicalCo.,Ltd.)35g蒸餾水1000ml。下面將描述SANK70314。[1]形態(tài)學(xué)性質(zhì)在營養(yǎng)瓊脂(由EikenChemicalCO.,Ltd.制造)中在28℃下培養(yǎng)24小時(shí)后觀察到的細(xì)菌是細(xì)胞寬度為1μm且長度為4至5μm的桿狀細(xì)菌，并且顯示沒有運(yùn)動(dòng)。[2]培養(yǎng)性質(zhì)在營養(yǎng)瓊脂中在28℃下培養(yǎng)24小時(shí)后的菌落的顏色是不透明的乳白色，并且不太發(fā)亮。菌落具有朝向中心以類似凸透鏡形狀凸起的圓形，并且具有光滑的表面和整個(gè)邊緣。[3]生物學(xué)性質(zhì)(1)過氧化氫酶：+(2)生長溫度：13至46℃(3)革蘭氏染色：陽性(4)碳源的利用(使用API50CH)甘油：+赤蘚醇：-D-阿拉伯糖：-D-核糖：+L-木糖：-D-阿東糖醇：-甲基-β-D-吡喃木糖苷：-D-半乳糖：+D-果糖：+L-山梨糖：-L-鼠李糖：-衛(wèi)矛醇：-肌醇：-D-山梨醇：-甲基-α-D-吡喃甘露糖苷：-N-乙酰葡糖胺：+苦杏仁苷：+熊果苷：+D-纖維二糖：+D-麥芽糖：+D-乳糖：-D-蜜二糖：+D-蔗糖：+D-海藻糖：+菊粉：-D-松三糖：+D-棉子糖：+木糖醇：-龍膽二糖：+D-松二糖：+D-來蘇糖：-D-塔格糖：-D-巖藻糖：-L-巖藻糖：-D-阿拉伯糖醇：-L-阿拉伯糖醇：-葡糖酸：-2-酮-葡萄糖酸：-5-酮-葡萄糖酸：-(5)生長pHpH6:+pH7:+pH8:+pH9:-。[4]遺傳性質(zhì)(1)G+C含量：38.0%(2)16SrDNA分析：作為將測定的核苷酸序列(1383bp：序列表的SEQIDNO:2)與登記在RibosomalDatabaseProject(RDP)中的各種細(xì)菌菌株的數(shù)據(jù)(Release11，(在2014年3月7日更新))進(jìn)行比較的結(jié)果，與巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)IAM13418的同源性最高，其中同源性值為99.9%。通過Saitou和Nei的鄰接法(SaitouN.和M.Nei,MolecularBiologyandEvolution,4,p.406-425(1987))進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，以獲得圖13中所示的結(jié)果。通過參考Bergey'sManualofSystematicBacteriology,Vol.3(2009年發(fā)布)鑒定具有這些真菌學(xué)性質(zhì)的SANK70314。從16SrDNA的核苷酸序列的分析結(jié)果來看，SANK70314顯示與巨大芽孢桿菌IAM13418的非常密切的系譜關(guān)系。SANK70314的形態(tài)學(xué)性質(zhì)、培養(yǎng)性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)和遺傳性質(zhì)與巨大芽孢桿菌的那些完全一致。因此，SANK70314被鑒定為巨大芽孢桿菌并命名為巨大芽孢桿菌SANK70314。將SANK70314在2014年8月7日以保藏號NITEBP-01915國際保藏于NITE專利微生物保藏中心(NPMD)，生物資源中心，國家技術(shù)和評價(jià)研究所(NITEPatentMicroorganismsDepositary(NPMD),BiologicalResourceCenter,NationalInstituteofTechnologyandEvaluation)(地址：2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,Japan)。眾所周知，微生物對自然界中的或通過人工操作(例如，紫外線照射、輻射或化學(xué)試劑處理)的突變敏感。據(jù)推測，本發(fā)明的SANK70314也對此類突變敏感。在本發(fā)明中，SANK70314涵蓋其所有變體。這些變體還涵蓋通過遺傳方法例如重組、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化獲得的那些。具體地，作為用于生產(chǎn)本發(fā)明的萜類化合物衍生物的用于生物轉(zhuǎn)化的菌株的SANK70314、其變體以及與其無明顯區(qū)別的細(xì)菌菌株都包括在SANK70314中。(5)<SANK70214的轉(zhuǎn)化菌株和SANK70314的轉(zhuǎn)化菌株>為了從底物化合物(2)生產(chǎn)本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)，從上述微生物測定編碼參與底物化合物(2)的羥基化的蛋白的核苷酸序列，并且可以使用表達(dá)本發(fā)明的蛋白的微生物。具體地，從SANK70214和SANK70314中的每一種測定將底物化合物(2)選擇性羥基化成萜類化合物衍生物(III)的蛋白，并且可以使表達(dá)該蛋白的微生物作用于底物化合物(2)以生產(chǎn)萜類化合物衍生物(III)。<本發(fā)明的蛋白>本發(fā)明的蛋白可以通過獲得和使用編碼該蛋白的基因來制備。以下，將具體描述用于獲得本發(fā)明的基因的方法和用于制備本發(fā)明的蛋白的方法。<用于獲得本發(fā)明的基因的方法>通過常規(guī)方法從SANK70214和SANK70314中的每一種提取基因組DNA，并使用基因組測序儀分析全基因組?？梢澡b定具有羥基化能力的蛋白以獲得本發(fā)明的基因。本發(fā)明的羥基化酶相關(guān)基因的獲得具有不能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員通常嘗試的方法容易地解決的問題。具有將底物化合物(2)轉(zhuǎn)化為萜類化合物衍生物(III)的能力的微生物所屬的芽孢桿菌屬被認(rèn)為在基因組中保留了參與羥基化的多個(gè)基因。此外，參與羥基化的酶的正常功能需要鐵氧還蛋白和向這些酶提供電子的還原酶。因此，似乎難以通過僅使用羥基化酶的基因的通常的Southern雜交或簡并PCR獲得目標(biāo)羥基化酶。因此，通過使用下一代測序儀的基因組分析來全面分析這些基因，以找到本發(fā)明中涉及的羥基化酶的基因的編碼核苷酸序列。由此獲得的編碼具有針對底物化合物(2)的羥基化活性的本發(fā)明的每種蛋白的核苷酸序列顯示于以下(f)、(g)、(h)、(i)或(j)中：(f)編碼具有羥基化活性的SANK70214的蛋白的SEQIDNO:3中所述的核苷酸序列(圖9)，(g)編碼具有羥基化活性的SANK70314的蛋白的SEQIDNO:4中所述的核苷酸序列(圖10)，(h)作為由(f)或(g)代表的DNA的改變形式的DNA，其具有在嚴(yán)格條件下與由(f)或(g)代表的任何DNA雜交的核苷酸序列，且編碼具有針對底物化合物(2)的羥基化活性的蛋白，(i)DNA，其由于遺傳密碼的簡并性在嚴(yán)格條件下不與由(f)或(g)代表的任何DNA雜交，但編碼與由(f)或(g)代表的任何DNA編碼的蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白，和(j)DNA，其具有通過一個(gè)或幾個(gè)堿基的缺失、置換和/或添加而衍生自由(f)代表的DNA的核苷酸序列的核苷酸序列，且編碼具有針對底物化合物(2)的羥基化活性的蛋白。(k)衍生自具有針對底物化合物(2)的羥基化活性的SANK70214的本發(fā)明的蛋白的實(shí)例包括以下蛋白：-具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的蛋白(圖11)，-具有通過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、置換、插入或添加而衍生自SEQIDNO:5的蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白，-具有與SEQIDNO:5的蛋白的氨基酸序列具有90％序列同一性的氨基酸序列的蛋白，和-由在嚴(yán)格條件下與由編碼SEQIDNO:5的蛋白的核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA編碼的蛋白。(l)衍生自具有針對底物化合物(2)的羥基化活性的SANK70314的本發(fā)明的蛋白的實(shí)例包括以下蛋白：-具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的蛋白(圖12)，-具有通過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的缺失、置換、插入或添加而衍生自SEQIDNO:6的蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白，-具有與SEQIDNO:6的蛋白的氨基酸序列具有90％序列同一性的氨基酸序列的蛋白，和-由在嚴(yán)格條件下與由編碼SEQIDNO:6的蛋白的核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA編碼的蛋白。3.本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體通過用蛋白編碼基因(f)、(g)、(h)、(i)或(j)通過通常的基因工程改造方法轉(zhuǎn)染宿主而獲得本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。具體地，制備允許編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體，并且可以用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使得轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以制備轉(zhuǎn)化體。用于從底物化合物(2)生產(chǎn)本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的轉(zhuǎn)化體是表達(dá)將底物化合物(2)羥基化成萜類化合物衍生物(III)的蛋白的轉(zhuǎn)化體。所述轉(zhuǎn)化體沒有特別限制，且優(yōu)選為以大腸桿菌作為宿主表達(dá)蛋白(k)或(l)的轉(zhuǎn)化體，更優(yōu)選以枯草芽孢桿菌作為宿主表達(dá)蛋白(k)或(l)的轉(zhuǎn)化體，進(jìn)一步優(yōu)選枯草芽孢桿菌SANK70214T(以下稱為SANK70212T)或枯草芽孢桿菌SANK70314T(以下稱為SANK70314T)。用于所述轉(zhuǎn)化體的宿主沒有特別限制，并且可以使用微生物、藻類、植物或動(dòng)物。針對轉(zhuǎn)化效率，宿主優(yōu)選為微生物。用作宿主的微生物優(yōu)選為大腸桿菌或枯草芽孢桿菌，更優(yōu)選枯草芽孢桿菌。表達(dá)載體基于的載體可以是可以單獨(dú)或與編碼具有鐵氧還蛋白功能的蛋白的DNA一起將編碼具有針對底物化合物(2)的羥基化活性的蛋白的DNA轉(zhuǎn)移至宿主、使得可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因的任何載體。例如，可以使用具有適合于待轉(zhuǎn)染的宿主類型的啟動(dòng)子或終止子的表達(dá)控制區(qū)且具有復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記等的載體?；蛘撸鲚d體可以是在染色體外自主生長或復(fù)制的載體，諸如質(zhì)粒，或可以是整合至染色體中的載體。轉(zhuǎn)化方法沒有特別限制，只要該方法能夠用目標(biāo)基因轉(zhuǎn)染宿主。例如，可以使用利用鈣離子的方法，一般感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法(JournalofBacteriology,93,1925(1967))、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法(MolecularandGeneralGenetics,168,111(1979))、電穿孔(FEMSMicrobiologyLetters,55,135(1990))或LP轉(zhuǎn)化法(T.Akamatsu和J.Sekiguchi,ArchivesofMicrobiology,1987,146,p.353-357;以及T.Akamatsu和H.Taguchi,Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry,2001,65,4,p.823-829)。可以通過使用選擇標(biāo)記等來選擇攜帶目標(biāo)基因片段的轉(zhuǎn)化體。例如，作為在轉(zhuǎn)化期間將載體來源的藥物抗性基因與目標(biāo)DNA片段一起轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中的結(jié)果，可以通過使用由轉(zhuǎn)化體獲得的藥物抗性作為指標(biāo)來進(jìn)行選擇。或者，目標(biāo)DNA片段的轉(zhuǎn)移也可以通過以基因組作為模板的PCR等來確認(rèn)。4.培養(yǎng)方法和純化方法(本發(fā)明的萜類化合物衍生物的生產(chǎn)和純化)上述用于生物轉(zhuǎn)化的菌株可以使用通常用于生產(chǎn)微生物的次生代謝物的培養(yǎng)基來培養(yǎng)。此類培養(yǎng)基含有微生物可利用的碳源、氮源、無機(jī)鹽、非常少量的生長因子、痕量金屬等。碳源的實(shí)例包括葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、甘油、糊精、燕麥、黑麥、淀粉、馬鈴薯、玉米粉、棉籽油、糖蜜、檸檬酸和酒石酸。這些碳源可以單獨(dú)使用或組合使用。添加的碳源的量通常在培養(yǎng)基量的1至10重量％的范圍內(nèi)。含有蛋白及其水解產(chǎn)物或無機(jī)鹽的物質(zhì)通常用作氮源。此類氮源的實(shí)例包括大豆粉、糠、花生粉、棉籽粉、酪蛋白水解物、Pharmamin、魚粉、玉米漿、蛋白胨、肉提取物、酵母、酵母提取物、麥芽提取物、硝酸鈉、硝酸銨和硫酸銨。這些氮源可以單獨(dú)使用或組合使用。添加的氮源的量通常在培養(yǎng)基量的0.2至10重量％的范圍內(nèi)。另外，可以向培養(yǎng)基中添加能夠提供鈉、鉀、鎂、銨、鈣、磷酸根、硫酸根、氯、碳酸根等離子的鹽。可以向培養(yǎng)基中進(jìn)一步添加微生物可利用的維生素諸如維生素B1和生物素，促進(jìn)真菌體增殖的物質(zhì)諸如硫胺素，以及金屬諸如錳或鉬的鹽。在液體培養(yǎng)基的情況下，可以向培養(yǎng)基中添加消泡劑諸如硅油、聚亞烷基二醇醚、植物油、動(dòng)物油或表面活性劑以防止培養(yǎng)基的發(fā)泡。用于培養(yǎng)用于生物轉(zhuǎn)化的菌株的液體培養(yǎng)基的pH取決于本發(fā)明的真菌菌株和萜類化合物衍生物的pH穩(wěn)定性，等。用于生物轉(zhuǎn)化的菌株的培養(yǎng)溫度取決于本發(fā)明的真菌菌株和萜類化合物衍生物的熱穩(wěn)定性等。在用于生物轉(zhuǎn)化的菌株是SANK10312菌株的情況下，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為9至33℃，更優(yōu)選20至35℃。在用于生物轉(zhuǎn)化的菌株是SANK11867的情況下，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為5至33℃，更優(yōu)選13至31℃。在用于生物轉(zhuǎn)化的菌株是SANK70214的情況下，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為14至39℃，更優(yōu)選20至35℃。在SANK70314的情況下，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為13至46℃，更優(yōu)選20至40℃。在用于生物轉(zhuǎn)化的菌株是SANK70214T的情況下，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為5至50℃，更優(yōu)選27至37℃。在SANK70314T的情況下，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為5至50℃，更優(yōu)選27至37℃。用于培養(yǎng)用于生物轉(zhuǎn)化的菌株的方法的實(shí)例可以包括但不特別限于使用固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法、攪拌培養(yǎng)方法、振蕩培養(yǎng)方法、通氣培養(yǎng)方法和通氣攪拌培養(yǎng)方法。所述培養(yǎng)方法優(yōu)選為攪拌培養(yǎng)方法、振蕩培養(yǎng)方法、通氣培養(yǎng)方法和通氣攪拌培養(yǎng)方法，更優(yōu)選振蕩培養(yǎng)方法。對于工業(yè)規(guī)模的培養(yǎng)，更優(yōu)選通氣攪拌培養(yǎng)方法。用于生物轉(zhuǎn)化的菌株的培養(yǎng)通常使用少量以用于生物轉(zhuǎn)化的菌株的傾斜培養(yǎng)物接種的培養(yǎng)基從種子培養(yǎng)開始，并且通過再次以更大規(guī)模進(jìn)行任選的種子培養(yǎng)，隨后以更大規(guī)模在最后階段主要培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)。在以小規(guī)模培養(yǎng)用于生物轉(zhuǎn)化的菌株的情況下，使用錐形燒瓶等進(jìn)行種子培養(yǎng)，并且如果需要，再次以更大規(guī)模進(jìn)行種子培養(yǎng)，隨后使用錐形燒瓶等進(jìn)行主要培養(yǎng)。在以大規(guī)模培養(yǎng)用于生物轉(zhuǎn)化的菌株的情況下，優(yōu)選使用裝備有攪拌裝置和通氣裝置的發(fā)酵罐或罐。使用此類裝置允許在發(fā)酵罐或罐中制備和滅菌培養(yǎng)基。該方法適用于大規(guī)模生產(chǎn)。添加底物后的用于生物轉(zhuǎn)化的菌株的培養(yǎng)時(shí)間取決于真菌或細(xì)菌菌株。在用于生物轉(zhuǎn)化的菌株是SANK10312的情況下，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為2至14天，更優(yōu)選3至10天。在用于生物轉(zhuǎn)化的菌株是SANK11867的情況下，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為2至14天，更優(yōu)選3至10天。在用于生物轉(zhuǎn)化的菌株是SANK70214的情況下，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為1至10天，更優(yōu)選3至7天。在SANK70314的情況下，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為1至10天，更優(yōu)選1至7天。在用于生物轉(zhuǎn)化的菌株是SANK70214T的情況下，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為1至168小時(shí)，更優(yōu)選2至24小時(shí)。在SANK70314T的情況下，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為1至168小時(shí)，更優(yōu)選8至96小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，可以從獲得的培養(yǎng)物、其中含有的真菌體和/或培養(yǎng)上清液中提取本發(fā)明的萜類化合物衍生物。離心法或使用硅藻土作為助濾劑的過濾法可用于從培養(yǎng)上清液中分離真菌體和其它固體物質(zhì)。對于本發(fā)明的萜類化合物衍生物的提取，可以利用該化合物的物理化學(xué)性質(zhì)。培養(yǎng)濾液或培養(yǎng)上清液中含有的本發(fā)明的萜類化合物衍生物可以用水不混溶的有機(jī)溶劑諸如乙酸乙酯、氯仿、二氯乙烷、二氯甲烷或丁醇或這些溶劑中的兩種或更多種的混合溶劑提取。蒸餾掉有機(jī)溶劑之后，真菌體中含有的本發(fā)明的萜類化合物衍生物可以使用50至90％丙酮水溶液或甲醇水溶液從其中提取，并且以與萜類化合物衍生物存在于培養(yǎng)濾液或培養(yǎng)上清液的情況下相同的方式提取?？梢酝ㄟ^向整個(gè)培養(yǎng)物中添加20至80％、優(yōu)選40至60％、更優(yōu)選50％的丙酮或甲醇來提取整個(gè)培養(yǎng)物中含有的本發(fā)明的萜類化合物衍生物。提取完成后，以硅藻土作為助濾劑過濾提取物，并且可以以與其中萜類化合物衍生物存在于培養(yǎng)濾液或培養(yǎng)上清液中的情況相同的方式從獲得的可溶性物質(zhì)中提取萜類化合物衍生物。用于從提取物中分離本發(fā)明的萜類化合物衍生物的純化可以通過純化技術(shù)諸如吸附色譜法、離子交換色譜法、分配色譜法、反相色譜法或高效液相色譜法(以下稱為HPLC)來進(jìn)行。吸附色譜法如下進(jìn)行：使含有本發(fā)明的萜類化合物衍生物的提取物與吸附劑接觸，以通過吸附除去雜質(zhì)；或吸附本發(fā)明的萜類化合物衍生物以除去雜質(zhì)，隨后洗脫。吸附劑的實(shí)例可以包括活性炭，AmberliteXAD-2，AmberliteXAD-4和AmberliteXAD-16(都由RohmandHaasCompany制造)，以及DiaionHP-20，DiaionHP-21，DiaionHP-20SS，SepabeadsSP-207，SepabeadsSP-850和SepabeadsSP-700(都由MitsubishiChemicalCorp.制造)。用于洗脫本發(fā)明的吸附萜類化合物衍生物的溶劑的實(shí)例可以包括有機(jī)溶劑諸如甲醇、丙酮、丁醇和乙腈及其與水的混合溶液。離子交換色譜法通過利用本發(fā)明的萜類化合物衍生物表現(xiàn)為中性物質(zhì)的事實(shí)來進(jìn)行。具體地，使含有本發(fā)明的萜類化合物衍生物的提取物與例如離子交換載體接觸，以使得當(dāng)本發(fā)明的萜類化合物衍生物從其中通過時(shí)，不需要的物質(zhì)被吸附至載體上。離子交換載體的實(shí)例可以包括DEAE-Sephadex，DEAE-Sepharose，QAE-Sephadex，CM-Sephadex和SP-Sephadex(都由GEHealthcareLifeSciences制造)，DEAE-Toyopearl，QAE-Toyopearl，CM-Toyopearl和SP-Toyopearl(都由TosohCorp.制造)，DuoliteA113LF，DuoliteA116，DuoliteA368S，DuoliteA375LF，DuoliteC20J和DuoliteC433LF(都由DiamondShamrockChemicalCompany制造)，AmberliteIRA-67，AmberliteIRA-98，AmberliteIRA400J，AmberliteIRA458RF，AmberliteIR120B和AmberliteIRC76(都由RohmandHaasCompany制造)和Dowex50WX4，DowexHCR-S，Dowex1×4，Dowex22，Dowex66和DowexSBR-P(由TheDowChemicalCompany制造)。用于分配色譜法的載體的實(shí)例可以包括硅膠、TSKgelToyopearlHW-40F(由TosohCorp.制造)、SephadexLH-20(由GEHealthcareLifeSciences制造)和纖維素(由MerckKGaA制造)。用于反相色譜法的載體的實(shí)例可以包括Cosmosil140C18(由NacalaiTesque,Inc.制造)和ODS-A(由YMCCo.,Ltd.制造)。用于HPLC的柱的實(shí)例可以包括反相柱，諸如ShodexAsahipakODP50-4E(由ShowaDenkoK.K.制造)、YMCpackODS-A(由YMCCo.,Ltd.制造)、CAPCELLPAKUG120(由ShiseidoCo.,Ltd.制造)和UnisonC18(由ImtaktCorp.制造)。本發(fā)明的萜類化合物衍生物可以單獨(dú)或以適當(dāng)?shù)慕M合使用這些純化技術(shù)進(jìn)行分離。如果需要，可以重復(fù)相同的純化技術(shù)?？梢赃x擇適合于純化的方法，諸如柱色譜法、批量色譜法、薄層色譜法，以便進(jìn)行每種純化技術(shù)。獲得的本發(fā)明的萜類化合物衍生物的立體結(jié)構(gòu)源自起始化合物的立體結(jié)構(gòu)。使用核Overhauser效應(yīng)光譜法(NOESY)測定新引入起始化合物的取代基的空間結(jié)構(gòu)。例如，從起始化合物的立體結(jié)構(gòu)、(2)中所述的物理化學(xué)性質(zhì)和下文實(shí)施例1中所述的NOESY的測量結(jié)果測定具有以上(2)中所述的物理化學(xué)性質(zhì)的萜類化合物衍生物(I)的立體結(jié)構(gòu)。同樣地，從起始化合物的空間結(jié)構(gòu)、(4)中所述的物理化學(xué)性質(zhì)、(6)中所述的物理化學(xué)性質(zhì)和下文實(shí)施例3中所述的NOESY的測量結(jié)果測定具有以上(4)中所述的物理化學(xué)性質(zhì)的萜類化合物衍生物(II)的空間結(jié)構(gòu)。5.包含本發(fā)明的萜類化合物衍生物的藥物如上所述純化的本發(fā)明的萜類化合物衍生物具有激活Keap1/Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路的作用，并且具有抗炎作用和細(xì)胞保護(hù)作用。Keap1/Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路的激活誘導(dǎo)其靶基因：NAD(P)H:醌氧化還原酶-1(NQO1)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)等(非專利文獻(xiàn)1)。當(dāng)這些酶的量增加或被激活時(shí)，細(xì)胞變得對毒性、氧化應(yīng)激、炎癥等具有抗性。因此，本發(fā)明的萜類化合物衍生物可用作疾病諸如眼病、腎病、肝病和糖尿病及其并發(fā)癥的預(yù)防或治療劑。眼病的實(shí)例包括疾病諸如過敏性結(jié)膜疾病、病毒性結(jié)膜炎、翼狀胬肉、角膜感染、干眼癥、角膜病癥(其為角膜上皮病癥和/或角膜內(nèi)皮病癥)、葡萄膜炎、白塞氏病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜脫落、視網(wǎng)膜靜脈阻塞(RVO)、中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、黃斑病、色素性視網(wǎng)膜炎、青光眼和白內(nèi)障。腎病的實(shí)例包括由腎臟問題引起的疾病，諸如急性腎炎、慢性腎炎、急性腎衰竭、慢性腎衰竭、腎病綜合征、IgA腎病、糖尿病性腎病、痛風(fēng)腎、腎硬化、腎盂積水、腎小管間質(zhì)性腎炎、冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)后腎功能降低和尿道感染。呼吸系統(tǒng)疾病的實(shí)例包括支氣管炎、肺炎、胸膜炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性肺損傷(ALI)、彌漫性泛細(xì)支氣管炎、肺氣腫和哮喘。肝病的實(shí)例包括酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化和與肝移植相關(guān)的肝功能障礙。腦病的實(shí)例包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、腦梗塞和多發(fā)性硬化(MS)。心臟病的實(shí)例包括心肌梗塞。糖尿病及其并發(fā)癥的實(shí)例包括糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性腎病和糖尿病性神經(jīng)病。在這些疾病中，本發(fā)明的萜類化合物衍生物特別可用作以下疾病的預(yù)防或治療劑：作為眼病的干眼病、角膜病癥(其為角膜上皮疾病和/或角膜內(nèi)皮疾病)、葡萄膜炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫或青光眼；作為腎病的糖尿病性腎?。蛔鳛楹粑兰膊〉穆宰枞苑尾』蚣毙苑螕p傷(ALI)；作為肝病的非酒精性脂肪性肝炎或與肝移植相關(guān)的肝功能障礙；或作為腦病的腦梗塞或多發(fā)性硬化。這些疾病中，本發(fā)明的萜類化合物衍生物進(jìn)一步優(yōu)選作為干眼病的預(yù)防或治療劑、角膜上皮和/或角膜內(nèi)皮病癥的預(yù)防或治療劑、年齡相關(guān)性黃斑變性的預(yù)防或治療劑、糖尿病性黃斑水腫和/或視網(wǎng)膜靜脈阻塞的預(yù)防或治療劑、慢性阻塞性肺病的預(yù)防或治療劑、腦梗塞的預(yù)防或治療劑或多發(fā)性硬化的預(yù)防或治療劑。在使用本發(fā)明的萜類化合物衍生物作為藥物的情況下，該藥物可以以各種形式施用。劑型取決于制劑、年齡、性別、疾病等。例如，口服施用片劑、丸劑、散劑、粉劑、糖漿劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑或膠囊劑。例如，將注射劑靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、玻璃體內(nèi)、前房內(nèi)、結(jié)膜下、至Tenon囊或腹膜內(nèi)施用。將滴眼劑滴入眼睛。眼用軟膏用于眼粘膜。直腸內(nèi)施用栓劑。這些施用方法中的任一種均可以通過施用緩釋藥物組合物來實(shí)現(xiàn)。在使用本發(fā)明的萜類化合物衍生物作為用于眼病的藥物的情況下，口服施用是可能的。然而，一般來講，通常采用滴入眼睛中、玻璃體內(nèi)施用、前房內(nèi)施用、結(jié)膜下施用或向Tenon囊施用，其允許直接施用至作用點(diǎn)。含有本發(fā)明的萜類化合物衍生物作為活性成分的各種藥物組合物可以根據(jù)常規(guī)方法使用通常可用于藥物制劑領(lǐng)域中的常規(guī)添加劑諸如賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、增溶劑、矯味劑和包衣劑來生產(chǎn)。6.包含本發(fā)明的萜類化合物衍生物作為活性成分的用于治療和/或預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物包含本發(fā)明的萜類化合物衍生物作為活性成分的用于治療和/或預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物(以下也稱為本發(fā)明的緩釋藥物組合物)具有可施用至玻璃體的基質(zhì)材料和可施用至玻璃體的形式，并且直接施用至眼睛中。將藥物直接施用至眼睛中給患者帶來很大的負(fù)擔(dān)。本發(fā)明的緩釋藥物組合物可以通過在生理?xiàng)l件下緩釋所述萜類化合物衍生物而將其藥理作用維持1周或更長時(shí)間。因此，可以降低施用頻率，且減輕對患者的負(fù)擔(dān)。本發(fā)明的緩釋藥物組合物誘導(dǎo)參與抑制毒性、氧化應(yīng)激、炎癥等的酶，并因此保護(hù)視網(wǎng)膜組織，并且可用作用于治療或預(yù)防眼后段疾病的局部施用型緩釋藥物組合物。眼后段疾病的實(shí)例包括年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫和糖尿病性視網(wǎng)膜病變。使用可生物降解的聚合物作為本發(fā)明的緩釋藥物組合物的基質(zhì)材料。所述可生物降解的聚合物的實(shí)例包括聚乳酸、聚乙醇酸和聚(乳酸-共-乙醇酸)。優(yōu)選聚乳酸或聚(乳酸-共-乙醇酸)。這些可生物降解的聚合物可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的生產(chǎn)方法來制備，或者可以使用分子量或共聚比不同的各種市售產(chǎn)品(J.BiomaterialsNanobiotechnology2012:3:208-252;和BiomedicalEngineering,TrendsinMaterialsScience,Laskovski,A(Ed.)pp.489-512,InTech,Rijeka,2011)。本發(fā)明的緩釋藥物組合物的形式包括旨在用于以粉末形式緩釋的粉末藥物組合物以及均勻地或以顆粒狀態(tài)分散于基質(zhì)材料中的本發(fā)明的萜類化合物衍生物的棒、片、膜、盤或微囊的緩釋形式。其中，微球或棒形式優(yōu)選為用于治療或預(yù)防眼后段疾病的緩釋藥物組合物的形式。本發(fā)明的緩釋藥物組合物中含有的本發(fā)明的萜類化合物衍生物的量沒有特別限定，且優(yōu)選為5至80重量％，更優(yōu)選20至60重量％。以微球的形式生產(chǎn)本發(fā)明的緩釋藥物組合物的方法的實(shí)例包括在水中的干燥方法(例如，o/w、w/o和w/o/w方法)、相分離方法、噴霧干燥法、使用超臨界流體的造粒法，與之等效的方法，以及下文提及的實(shí)施例中描述的方法(R.T.Liggins,H.M.Burt/InternationalJournalofPharmaceutics222(2001)19-33;K.Andreas等人/ActaBiomaterialia7(2011)1485-1495;J.Herberger等人/JournalofControlledRelease90(2003)181-195;和A.J.Thote,R.B.Gupta/Nanomedicine:Nanotechnology,Biology,andMedicine1(2005)85-90)。以聚合物植入體諸如棒、片、膜、圓盤或微球的形式生產(chǎn)本發(fā)明的緩釋藥物組合物的方法的實(shí)例包括這樣的方法，其涉及適當(dāng)添加表面活性劑或乳化劑作為形成溶劑，和通過使用各種技術(shù)諸如熔融擠出、注射成型、壓縮成型(包括壓片)或輥壓縮使用有機(jī)溶劑將具有所需形狀的緩釋藥物組合物的內(nèi)核加工成所需形狀或結(jié)構(gòu)。使用有機(jī)溶劑諸如丙酮(其被分類為FDA3級溶劑(毒性低且允許通過最少使用而除去殘留溶劑的溶劑))作為成型中使用的有機(jī)溶劑。在不使用有機(jī)溶劑的情況下加工本發(fā)明的緩釋藥物組合物的內(nèi)核的情況下，該加工可以在這樣的條件下進(jìn)行：其中將本發(fā)明的萜類化合物衍生物與整個(gè)基質(zhì)材料可生物降解的聚合物或僅聚合物的特定位點(diǎn)徹底混合，并分散或溶解于其中。7.施用本發(fā)明的萜類化合物衍生物的劑量和頻率本發(fā)明的萜類化合物衍生物的劑量根據(jù)癥狀、年齡等而不同，且對于局部施用，優(yōu)選為0.0001μg/位點(diǎn)至100μg/位點(diǎn)。用于全身施用的劑量優(yōu)選為0.00001mg/kg至10mg/kg。含有本發(fā)明的萜類化合物衍生物作為活性成分的藥物的施用頻率為每天數(shù)次、每天一次或每幾天一次。作為參考，所述緩釋藥物組合物每周施用一次、每四周施用一次、每三個(gè)月施用一次或每六個(gè)月施用一次。接下來，將參考藥物組合物的實(shí)施例、測試實(shí)施例和配制實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明不限于此。實(shí)施例(實(shí)施例1)萜類化合物衍生物(I)和萜類化合物衍生物(III)的生產(chǎn)(用于生物轉(zhuǎn)化的菌株：SANK10312)[式8](1)用于生物轉(zhuǎn)化的毛殼屬菌株的培養(yǎng)將20ml具有下表1中所示的組成的種子培養(yǎng)基置于四個(gè)100-ml錐形燒瓶中的每個(gè)中，在121℃下滅菌20分鐘，然后冷卻至室溫。將1mlSANK10312的孢子懸浮液接種至每個(gè)燒瓶中的培養(yǎng)基中，并在23℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)2天。在下文中，將獲得的培養(yǎng)溶液稱為“種子培養(yǎng)溶液”。(表1)表1.用于SANK10312的種子培養(yǎng)基的組成*1NissanDisfoamCB-442(由NOFCorp.制造)*2pH未調(diào)整。將80ml具有下表2中所示的組成的主要培養(yǎng)基置于13個(gè)500-ml錐形燒瓶中的每個(gè)中，在121℃下滅菌20分鐘，然后冷卻至室溫。將4mlSANK10312的種子培養(yǎng)溶液無菌接種至每個(gè)燒瓶中的培養(yǎng)基中，并在23℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)2天。將0.8ml以10mg/ml的濃度溶解于二甲基亞砜中的CDDO-Me溶液添加至每個(gè)燒瓶中的該培養(yǎng)溶液中，并將混合物在23℃下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中以210rpm再次培養(yǎng)6天。(表2)表2.主要培養(yǎng)基的組成*1NissanDisfoamCB-442(由NOFCorp.制造)*2pH未調(diào)整。(2)萜類化合物衍生物(I)和萜類化合物衍生物(III)的分離在下面給出的條件下通過HPLC監(jiān)測本實(shí)施例中的萜類化合物衍生物(I)和萜類化合物衍生物(III)的行為。柱：UnisonUK-C18(4.6mm(直徑)×75mm(長度)；由ImtaktCorp.制造)溶劑：A：含有0.01％甲酸的10mM甲酸銨水溶液B:含有0.01％甲酸的乙腈A/B=用5/5平衡，隨后線性梯度7分鐘，直至A/B=1/9流速：1.0ml/min檢測：紫外吸收λ=230nm保留時(shí)間：4.3分鐘(萜類化合物衍生物(I))4.9分鐘(萜類化合物衍生物(III))。向1,040ml段落(1)中獲得的培養(yǎng)溶液中添加等量的丙酮，并使混合物在室溫下放置1小時(shí)。然后，通過在減壓下過濾來除去菌絲體，以獲得2,000ml濾液。向該濾液中添加1L乙酸乙酯進(jìn)行液-液分布，以獲得含有目標(biāo)化合物的有機(jī)層。將獲得的有機(jī)層用飽和鹽水洗滌，并經(jīng)無水硫酸鈉干燥，并將溶劑蒸發(fā)至干燥，以獲得549.9mg含有萜類化合物衍生物(I)和萜類化合物衍生物(III)的粉末。將275mg該粉末的等分試樣溶解于1.37ml甲醇中。將0.2ml該溶液的等分試樣施加至預(yù)先用0.01％甲酸水溶液：含有0.01％甲酸的乙腈=45:55的溶劑平衡的HPLC柱(UnisonUS-C18；20mm(直徑)×150mm(長度)；由ImtaktCorp.制造)，隨后用0.01％甲酸水溶液：含有0.01％甲酸的乙腈=45:55的溶劑以18.0ml/min的流速洗脫。在波長λ=230nm處檢測目標(biāo)化合物的紫外吸收。將在9.1分鐘的保留時(shí)間處出現(xiàn)的峰(萜類化合物衍生物(I))和12.3分鐘的保留時(shí)間處出現(xiàn)的峰(萜類化合物衍生物(III))各自分離7次。將每種化合物的級分溶液合并，并在減壓下濃縮，并將獲得的懸浮液凍干，以獲得1.4mg作為無色粉末的萜類化合物衍生物(I)和16.2mg作為無色粉末的萜類化合物衍生物(III)。使用二維核磁共振光譜法(NOESY)測定本發(fā)明的獲得的萜類化合物衍生物(I)的立體結(jié)構(gòu)。在萜類化合物衍生物(I)的二維核磁共振光譜法(NOESY)中，觀察到第19位的β-質(zhì)子和第21位的β-質(zhì)子之間的相關(guān)性。因此確定其立體結(jié)構(gòu)由式(I)所代表。萜類化合物衍生物(I)的物理化學(xué)性質(zhì)的測量值1)外觀：無色粉末狀物質(zhì)2)分子式：C32H43NO53)分子量：521(通過ESI質(zhì)譜法測量)4)通過高分辨率LC-ESI質(zhì)譜法測量的精確質(zhì)量[M+H]+如下給出：實(shí)測值：522.32062計(jì)算值：522.321405)1H-核磁共振譜：使用TMS在參照為0.00ppm的氘代氯仿中測量的1H-核磁共振譜(500MHz)如下給出：σ:0.98(3H,s),0.99(3H,s),1.00(3H,s),1.17(3H,s),1.18-1.22(1H,m),1.25(3H,s),1.28-1.30(1H,m),1.33(3H,s),1.49(3H,s),1.51-1.55(1H,m),1.62-1.66(1H,m),1.68-1.71(1H,m),1.69-1.72(1H,m),1.70-1.80(2H,m),1.77-1.79(1H,m),1.76-1.82(2H,m),1.85-1.89(2H,m),2.96(1H,d,J=5.0Hz),3.04(1H,ddd,J=4.0Hz,4.0Hz,14.0Hz),3.49(1H,dd,J=5.0Hz,11.5Hz),3.71(3H,s),5.97(1H,s),8.03(1H,s)ppm6)13C-核磁共振譜：使用TMS在參照為0.00ppm的氘代氯仿中測量的13C-核磁共振譜(125MHz)如下給出：σ:16.4(q),18.2(t),21.4(q),21.5(q),23.9(t),24.6(q),26.6(q),27.0(q),28.1(t),29.1(q),31.1(d),31.6(t),35.8(t),35.9(s),40.1(t),42.0(s),42.5(s),45.0(s),45.7(s),47.7(d),48.9(s),49.0(d),52.1(q),73.7(d),114.3(s),114.6(s),124.0(d),165.5(d),168.5(s),176.6(s),196.5(s),198.7(s)ppm7)高效液相色譜：柱：UnisonUK-C18(4.6mm(直徑)×75mm(長度)；由ImtaktCorp.制造)溶劑：A：含有0.01％甲酸的10mM甲酸銨水溶液B：含有0.01％甲酸的乙腈A/B=用5/5平衡，隨后線性梯度7分鐘，直至A/B=1/9流速：1.0ml/min溫度：40℃檢測：紫外吸收λ=230nm保留時(shí)間：4.3分鐘8)萜類化合物衍生物(I)的1H-核磁共振譜顯示于圖1中，且其二維核磁共振譜(1H-13CHSQC譜)顯示于圖2中。作為分析1H-核磁共振譜和二維核磁共振譜(1H-13CHSQC譜)的結(jié)果，每個(gè)質(zhì)子的特征如下：第19位的β-質(zhì)子：1.28至1.30ppm(亞甲基)第21位的β-質(zhì)子：3.49ppm(次甲基)9)萜類化合物衍生物(I)的二維核磁共振譜(1H-1HNOESY譜)顯示于圖3中。在圖3中，觀察到19位的β-質(zhì)子和21位的β-質(zhì)子之間的相關(guān)性。因此確定其立體結(jié)構(gòu)由(I)所代表。(實(shí)施例2)萜類化合物衍生物(I)和萜類化合物衍生物(III)的生產(chǎn)(用于生物轉(zhuǎn)化的菌株：SANK11867)(1)用于生物轉(zhuǎn)化的毛殼屬菌株的培養(yǎng)將20ml具有實(shí)施例的表1中所示的組成的種子培養(yǎng)基置于176個(gè)100-ml錐形燒瓶中的每個(gè)中，在121℃下滅菌20分鐘，然后冷卻至室溫。將1mlSANK11867的孢子懸浮液接種至每個(gè)燒瓶中的培養(yǎng)基中，并在23℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)2天。在下文中，將獲得的培養(yǎng)溶液稱為“種子培養(yǎng)溶液”。將80ml具有實(shí)施例的表2中所示的組成的主要培養(yǎng)基置于583個(gè)500-ml錐形燒瓶中的每個(gè)中，在121℃下滅菌20分鐘，然后冷卻至室溫。將4mlSANK11867的種子培養(yǎng)溶液無菌接種至每個(gè)燒瓶中的培養(yǎng)基中，并在23℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)2天。將0.8ml以30mg/ml的濃度溶解于二甲基亞砜中的CDDO-Me溶液添加至每個(gè)燒瓶中的該培養(yǎng)溶液中，并將混合物在23℃下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中以210rpm再次培養(yǎng)6天。(2)萜類化合物衍生物(I)和萜類化合物衍生物(III)的分離在下面給出的條件下通過HPLC監(jiān)測本實(shí)施例中的萜類化合物衍生物(I)和萜類化合物衍生物(III)的行為。柱：UnisonUK-C18(4.6mm(直徑)×75mm(長度)；由ImtaktCorp.制造)溶劑：A：含有0.01％甲酸的10mM甲酸銨水溶液B：含有0.01％甲酸的乙腈A/B=用5/5平衡，隨后線性梯度7分鐘，直至A/B=1/9流速：1.0ml/min檢測：紫外吸收λ=230nm保留時(shí)間：4.3分鐘(萜類化合物衍生物(I))4.9分鐘(萜類化合物衍生物(III))。向42.6L段落(1)中獲得的培養(yǎng)溶液中添加等量的丙酮，并將混合物充分?jǐn)嚢?，然后使其在室溫下放置過夜。然后，通過在減壓下過濾來除去菌絲體，以獲得78L濾液。將該濾液施加至預(yù)先用丙酮洗滌的SepabeadsSP207(2L；由MitsubishiChemicalCorp.制造)柱，然后用水緩沖液置換。將該柱用6L丙酮：水=5:5的混合溶劑洗滌，然后用6L丙酮：水=6:4的混合溶劑洗滌，隨后用6L丙酮：水=7:3的混合溶劑洗脫。向含有目標(biāo)化合物的該洗脫液中添加1.2L水，再添加2.6L乙酸乙酯進(jìn)行液-液分布，以分離含有目標(biāo)化合物的有機(jī)層。將有機(jī)層用飽和鹽水洗滌，然后經(jīng)無水硫酸鈉干燥，然后在減壓下濃縮，以獲得6.92g含有萜類化合物衍生物(I)和萜類化合物衍生物(III)的萃取物。將1.5g該萃取物的等分試樣溶解于5ml甲醇中。將該溶液吸附至ODS-A(7.5g;；由YMCCo.,Ltd.制造)上，并將微型柱用所得載體填充，然后施加至預(yù)先用乙腈：含有0.01%甲酸的水=55:45的混合溶劑平衡的ODS-A(100g；由YMCCo.,Ltd.制造)柱，隨后用與上述相同的混合溶劑以15ml/min的流速洗脫。在波長λ=230nm處檢測目標(biāo)化合物的紫外吸收。將在42.0分鐘的保留時(shí)間處出現(xiàn)的峰(萜類化合物衍生物(I))和50.0分鐘的保留時(shí)間處出現(xiàn)的峰(萜類化合物衍生物(III))各自分離5次。將每種化合物的級分溶液合并，并在減壓下濃縮，以獲得192mg作為無色粉末的萜類化合物衍生物(I)和2.45g含有萜類化合物衍生物(III)的淡黃色粉末。將2.45g含有萜類化合物衍生物(III)的淡黃色粉末溶解于2ml乙腈中。將該溶液施加至預(yù)先用乙腈：水=55:45的混合溶劑緩沖液置換的SepabeadsSP207SS(500ml；由MitsubishiChemicalCorp.制造)柱。將該柱用1,750ml乙腈：水=60:40的混合溶劑洗滌，隨后用2,340ml乙腈：水=65:35的混合溶劑洗脫。將1,200ml含有高純度萜類化合物衍生物(III)的洗脫液的等分試樣在減壓下濃縮，隨后凍干，以獲得2.19g萜類化合物衍生物(III)。(實(shí)施例3)萜類化合物衍生物(II)和萜類化合物衍生物(III)的生產(chǎn)(用于生物轉(zhuǎn)化的菌株：SANK70214)[式9][式10](1)底物化合物(2)的合成[式11]將CDDO-Me(8.00g,15.8mmol)溶解于二氯甲烷(40ml)中。在冰冷卻下向該溶液中添加3-氯過苯甲酸(>65%)(5.04g,19.0mmol)，并將混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。向反應(yīng)混合物中添加飽和碳酸氫鈉水溶液(40ml)，并將混合物在與上述相同的溫度下攪拌15分鐘。向該混合物中進(jìn)一步添加10％硫代硫酸鈉水溶液(40ml)，并將所得混合物在與上述相同的溫度下攪拌5分鐘，隨后用乙酸乙酯萃取。將分離的有機(jī)層用飽和鹽水洗滌，并經(jīng)硫酸鎂干燥，并在減壓下蒸發(fā)掉溶劑。將殘余物通過硅膠柱色譜(正己烷：乙酸乙酯=4:1,v/v)純化，以獲得作為白色無定形固體的底物化合物(2)(8.16g,99%)。ESI-MS;m/z:522(M++1)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.91(3H,s),1.01(3H,s),1.08(3H,s),1.12(3H,s),1.19(3H,s),1.27(3H,s),1.55(3H,s),1.18-2.00(15H,m),2.94(1H,d,J=4.9Hz),3.05(1H,dt,J=13.8,3.7Hz),3.70(3H,s),4.34(1H,s),6.07(1H,s)。高效液相色譜：純度：99.0%柱：Cosmosil5C18-MS-II(6.0mm(直徑)×150mm(長度)；由NacalaiTesque,Inc.制造)溶劑：A：10mM乙酸銨水乳液B：乙腈A/B=15/85等度流速：1.0ml/min溫度：40℃檢測：紫外吸收λ=254nm保留時(shí)間：9.6分鐘。(2)用于生物轉(zhuǎn)化的芽孢桿菌屬菌株的培養(yǎng)將20ml具有下表3中所示的組成的種子培養(yǎng)基置于20個(gè)100-ml錐形燒瓶中的每個(gè)中，在121℃滅菌30分鐘，然后冷卻至室溫。將一個(gè)菌環(huán)的SANK70214菌落接種至每個(gè)燒瓶中的培養(yǎng)基中，并在28℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)24小時(shí)。在下文中，將獲得的培養(yǎng)溶液稱為“種子培養(yǎng)溶液”。(表3)表3.用于SANK70214的種子培養(yǎng)基的組成*1NissanDisfoamCB-442(由NOFCorp.制造)*2滅菌前用NaOH或HCl將pH調(diào)節(jié)至7.2。將80ml具有上表3中所示的組成的主要培養(yǎng)基置于300個(gè)500-ml錐形燒瓶中的每個(gè)中，在121℃下滅菌30分鐘，然后冷卻至室溫。將0.8ml以30mg/ml的濃度溶解于二甲基亞砜中的底物化合物(2)(在段落(1)中合成)的溶液添加至每個(gè)燒瓶中的該培養(yǎng)物溶液中。將0.8mlSANK70214的種子培養(yǎng)溶液無菌接種至每個(gè)燒瓶中的培養(yǎng)基中，并在28℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)5天。(3)萜類化合物衍生物(II)和萜類化合物衍生物(III)的分離在下面給出的條件下通過HPLC監(jiān)測本實(shí)施例中的萜類化合物衍生物(II)和萜類化合物衍生物(III)的行為。柱：UnisonUK-C18(4.6mm(直徑)×75mm(長度)；由ImtaktCorp.制造)溶劑：A：含有0.01％甲酸的10mM甲酸銨水溶液B：含有0.01％甲酸的乙腈A/B=用5/5平衡，隨后線性梯度7分鐘，直至A/B=1/9流速：1.0ml/min檢測：紫外吸收λ=230nm保留時(shí)間：5.4分鐘(萜類化合物衍生物(II))4.9分鐘(萜類化合物衍生物(III))。向22.8L段落(2)中獲得的培養(yǎng)溶液中添加等量的丙酮，并將混合物充分?jǐn)嚢瑁缓笫蛊湓谑覝叵路胖眠^夜。然后，通過壓濾機(jī)除去細(xì)菌細(xì)胞，以獲得42L濾液。將該濾液施加至預(yù)先用丙酮洗滌的SepabeadsSP207(2L；由MitsubishiChemicalCorp.制造)柱，然后用水緩沖液置換。將該柱用14L丙酮：水=5:5的混合溶劑洗滌，然后用6L丙酮：水=6:4的混合溶劑洗滌，隨后用7.2L丙酮：水=7:3的混合溶劑洗脫，并用8L丙酮：水=8:2的混合溶劑進(jìn)一步洗脫。從用丙酮：水=7:3的混合溶劑洗脫的級分中回收4L含有目標(biāo)化合物的洗脫液。向其中添加SepabeadsSP207SS(16ml；由MitsubishiChemicalCorp.制造)。將有機(jī)溶劑蒸發(fā)掉，以將目標(biāo)化合物吸附至樹脂上。將吸附的物質(zhì)施加至預(yù)先用丙酮洗滌的SepabeadsSP207SS(350ml；由MitsubishiChemicalCorp.制造)柱，然后用水緩沖液置換。將該柱用1,200ml乙腈：水=50:50的混合溶劑洗滌，然后用1,050ml乙腈：水=55:45的混合溶劑洗滌，隨后用2,950ml乙腈：水=60:40的混合溶劑洗脫。將920ml含有高純度萜類化合物衍生物(III)的洗脫液的等分試樣中的有機(jī)溶劑蒸發(fā)掉，并將殘余物凍干，以獲得1.58g萜類化合物衍生物(III)。另外，將580ml含有萜類化合物衍生物(II)的洗脫液的等分試樣中的有機(jī)溶劑蒸發(fā)掉，并將殘余物凍干，以獲得120.7mg含有萜類化合物衍生物(II)的粉末。將109mg該粉末的等分試樣溶解于1.0ml二甲基亞砜中。將0.3ml該溶液的等分試樣施加至預(yù)先用0.01％甲酸水溶液：含有0.01％甲酸的乙腈=45:55的溶劑平衡的HPLC柱(UnisonUS-C18；20mm(直徑)X150mm(長度)；由ImtaktCorp.制造)，隨后用0.01％甲酸水溶液：含有0.01％甲酸的乙腈=45:55的溶劑以20.0ml/min的流速洗脫。在波長λ=230nm處檢測目標(biāo)化合物的紫外吸收。將在13.6分鐘的保留時(shí)間處出現(xiàn)的峰(萜類化合物衍生物(II))分離3次。將級分溶液合并，并在減壓下濃縮，并將獲得的懸浮液凍干，以獲得4.5mg作為無色粉末的萜類化合物衍生物(II)。使用二維核磁共振光譜法(NOESY)測定本發(fā)明的獲得的萜類化合物衍生物(II)的立體結(jié)構(gòu)。在萜類化合物衍生物(II)的二維核磁共振光譜法(NOESY)中，觀察到第19位的α-質(zhì)子和第21位的α-質(zhì)子之間的相關(guān)性。因此確定其立體結(jié)構(gòu)由式(II)所代表。萜類化合物衍生物(II)的物理化學(xué)性質(zhì)的測量值1)外觀：無色粉末狀物質(zhì)2)分子式：C32H43NO63)分子量：537(通過ESI質(zhì)譜法測量)4)通過高分辨率LC-ESI質(zhì)譜法測量的精確質(zhì)量[M+H]+如下給出：實(shí)測值：538.31496計(jì)算值：538.316315)1H-核磁共振譜：使用TMS在參照為0.00ppm的氘代氯仿中測量的1H-核磁共振譜(500MHz)如下給出：σ:0.96(3H,s),1.06(3H,s),1.11(3H,s),1.12(3H,s),1.19(3H,s),1.27(3H,s),1.28(3H,s),1.46(1H,d,J=13.0Hz),1.47(1H,d,J=13.0Hz),1.52-1.59(2H,m),1.61-1.65(2H,m),1.66-1.69(1H,m),1.68-1.75(1H,m),1.75(1H,dd,J=3.5Hz,14.5Hz),1.88(1H,brd,J=14.5Hz),1.98(1H,dd,J=5.5Hz,9.5Hz),2.03(1H,dd,J=3.5Hz,14.5Hz),2.38(1H,ddd,J=3.5Hz,14.0Hz,14.0Hz),2.99(1H,d,J=4.5Hz),3.10(1H,brd,J=13.5Hz),3.53(1H,brs),3.69(3H,s),4.34(1H,s),6.09(1H,s)ppm6)13C-核磁共振譜：使用TMS在參照為0.00ppm的氘代氯仿中測量的13C-核磁共振譜(125MHz)如下給出：σ:18.3(t),21.0(q),21.3(q),22.8(q),23.9(q),24.0(q),25.7(t),27.4(q),28.0(q),28.7(t),30.0(t),31.4(t),31.5(d),35.2(s),38.9(t),40.9(s),42.1(s),42.6(d),45.1(s),45.5(s),47.0(s),49.5(d),52.0(q),53.2(s),69.1(d),74.8(d),113.6(s),124.8(d),168.8(s),177.6(s),198.8(s),202.4(s)ppm7)高效液相色譜：柱：UnisonUK-C18(4.6mm(直徑)×75mm(長度)；由ImtaktCorp.制造)溶劑：A：含有0.01％甲酸的10mM甲酸銨水溶液B：含有0.01％甲酸的乙腈A/B=用5/5平衡，隨后線性梯度7分鐘，直至A/B=1/9流速：1.0ml/min溫度：40℃檢測：紫外吸收λ=230nm保留時(shí)間：5.4分鐘。8)萜類化合物衍生物(II)的4H-核磁共振譜顯示于圖1中，且其二維核磁共振譜(1H-13CHSQC譜)顯示于圖5中。作為分析1H-核磁共振譜和二維核磁共振譜(1H-13CHSQC譜)的結(jié)果，每個(gè)質(zhì)子的特征如下：第19位的α-質(zhì)子：1.47ppm(亞甲基)第21位的α-質(zhì)子：3.53ppm(次甲基)9)萜類化合物衍生物(II)的二維核磁共振譜(1H-1HNOESY譜)顯示于圖6中。在圖6中，觀察到第19位的α-質(zhì)子和第21位的α-質(zhì)子之間的相關(guān)性。因此確定其立體結(jié)構(gòu)由(II)所代表。(實(shí)施例4)萜類化合物衍生物(III)的生產(chǎn)(用于生物轉(zhuǎn)化的菌株：SANK70314)(1)用于生物轉(zhuǎn)化的芽孢桿菌屬菌株的培養(yǎng)將20ml下面給出的Trypto-SoyBroth培養(yǎng)基(以下稱為TSB培養(yǎng)基)作為種子培養(yǎng)基置于100-ml錐形燒瓶中，在121℃下滅菌15分鐘，然后冷卻至室溫。將一個(gè)菌環(huán)的SANK70314菌落接種至燒瓶中的培養(yǎng)基中，并在28℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)24小時(shí)。在下文中，將獲得的培養(yǎng)溶液稱為“種子培養(yǎng)溶液”。<TSB培養(yǎng)基(Trypto-SoyBroth培養(yǎng)基)>PearlcoreTrypto-SoyBrothEiken(由EikenChemicalCo.,Ltd.制造)30g蒸餾水1,000ml將100mlTSB培養(yǎng)基作為主要培養(yǎng)基置于500-ml錐形燒瓶中，在121℃下滅菌15分鐘，然后冷卻至室溫。將1.0ml以30mg/ml的濃度溶解于二甲基亞砜中的底物化合物(2)(通過實(shí)施例3(1)中描述的方法合成)的溶液添加至燒瓶中的該培養(yǎng)物溶液中。將1.0mlSANK70314的種子培養(yǎng)溶液無菌接種至燒瓶中的培養(yǎng)基中，并在37℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)3天。(2)萜類化合物衍生物(III)的分離在下面給出的條件下通過HPLC監(jiān)測本實(shí)施例中的萜類化合物衍生物(III)的行為。柱：UnisonUK-C18(4.6mm(直徑)×75mm(長度)；由ImtaktCorp.制造)溶劑：A：含有0.01％甲酸的10mM甲酸銨水溶液B：含有0.01％甲酸的乙腈A/B=用5/5平衡，隨后線性梯度7分鐘，直至A/B=1/9流速：1.0ml/min檢測：紫外吸收λ=230nm保留時(shí)間：4.9分鐘(萜類化合物衍生物(III))。將段落(1)中獲得的培養(yǎng)溶液稀釋至100ml。然后，向其中添加100ml丙酮，并將混合物在室溫下靜置1小時(shí)。將1ml其等分試樣分離并以10000rpm離心10分鐘。將上清液用作培養(yǎng)溶液提取物。將10μl因此制備的培養(yǎng)溶液提取物在上述HPLC條件下進(jìn)行洗脫。在波長λ=230nm處檢測目標(biāo)化合物的紫外吸收。從在4.9分鐘的保留時(shí)間處出現(xiàn)的峰(萜類化合物衍生物(III))的峰面積計(jì)算向底物化合物(2)的轉(zhuǎn)化效率。作為結(jié)果，對于萜類化合物衍生物(III)，確認(rèn)生物轉(zhuǎn)化效率為32％。(實(shí)施例5)從野生菌株克隆SANK70214(1)芽孢桿菌種SANK70214的基因組DNA樣品的制備將100ml由3%PearlcoreTrypto-SoyBroth(由EikenChemicalCo.,Ltd.制造)構(gòu)成的培養(yǎng)基(在高壓滅菌前將pH調(diào)節(jié)至8.0)(以下稱為TSB培養(yǎng)基(pH8.0))置于500-ml錐形燒瓶中，在121℃下滅菌15分鐘，然后冷卻至室溫。將一個(gè)菌環(huán)的SANK70214接種至燒瓶中的培養(yǎng)基中，并在28℃和210rpm的條件下培養(yǎng)15.5小時(shí)。將獲得培養(yǎng)溶液用作種子培養(yǎng)物。將100mlTSB培養(yǎng)基(pH8.0)置于500-ml錐形燒瓶中，在121℃下滅菌15分鐘，然后冷卻至室溫。將1mlSANK70214的種子培養(yǎng)溶液無菌接種至燒瓶中的培養(yǎng)基中，并在28℃和210rpm的條件下培養(yǎng)8小時(shí)。將40ml獲得的培養(yǎng)溶液分配至每個(gè)50-ml錐形管中，并以6,000rpm離心10分鐘以回收細(xì)菌細(xì)胞。由其制備基因組DNA。(2)基因組測序和P450基因的鑒定使用PacBioRSII(由PacificBiosciencesofCalifornia,Inc.制造)和Miseq(由Illumina,Inc.制造)在下一代天然產(chǎn)物化學(xué)技術(shù)研究協(xié)會(huì)(TechnologyResearchAssociationforNextgenerationnaturalproductschemistry)進(jìn)行基因組測序。獲得的序列為4.0Mbp，其中GC含量為40.8％。使用BASysServer2(https://www.basys.ca/server2/basys/cgi/text_search.pl)用堿性芽孢桿菌作為參考序列注釋獲得的基因組序列，以獲得一個(gè)推定的P450核苷酸序列(具有羥基化活性的SANK70214的蛋白的核苷酸序列)(SEQIDNO:3，圖9)。獲得的核苷酸序列保留了Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,20121;22(1):606-609中所述的3種類型的基序。因此，克隆了具有將底物化合物(2)羥基化成本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的活性的蛋白(SEQIDNO:5，圖11)的基因。(3)克隆至大腸桿菌中為了通過PCR擴(kuò)增SANK70214的P450的核苷酸序列，制備F1(GAAGGAGATATACATATGAGTCATGCTGCGAACG)和R1(TGTCGACGGAGCTCTTTAGAATGAAACGGGCAATG)的引物組。使用該引物組和SANK70214作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)采用PrimeSTARMax(由TakaraBioInc.制造)和PCR裝置(由TakaraBioInc.制造，TP350)，并將3階段反應(yīng)重復(fù)30次，所述3階段反應(yīng)涉及在98℃下變性10秒，在55℃下退火5秒，并在72℃下延伸10秒鐘。作為結(jié)果，擴(kuò)增了具有約1.2kb的長度的DNA片段。用提供用于In-Fusion克隆反應(yīng)的CloningEnhancer(由ClontechLaboratories,Inc.制造)處理獲得的約1.2kb的SANK70214DNA片段。為了通過PCR擴(kuò)增用于克隆和表達(dá)的載體pET21b(由Novagen/EMDBiosciences,Inc.制造)，制備F2(ATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC)和R2(AGAGCTCCGTCGACAAGC)的引物組。使用該引物組和pET21b作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)采用PrimeSTARMax(由TakaraBioInc.制造)和PCR裝置(由TakaraBioInc.制造，TP600)，并將3階段反應(yīng)重復(fù)30次，所述3階段反應(yīng)涉及在98℃下變性10秒，在55℃下退火5秒，并在72℃下延伸60秒鐘。作為結(jié)果，擴(kuò)增了具有約5kb的長度的DNA片段。將該P(yáng)CR反應(yīng)溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并切出約5kb的DNA片段，并使用MonofasDNA純化試劑盒I(由GLSciencesInc.制造)回收。將回收的預(yù)先用克隆增強(qiáng)劑處理的約5kb的pET21bDNA片段和約1.2kb長的DNA片段使用In-FusionHD克隆試劑盒(由ClontechLaboratories,Inc.制造)連接，并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(由ToyoboCo.,Ltd.制造)。然后，在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中選擇大腸桿菌。然后，在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的菌落。回收生長的大腸桿菌，并使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(由QiagenN.V.制造)純化質(zhì)粒DNA，以獲得攜帶具有羥基化活性的SANK70214的蛋白的核苷酸序列的質(zhì)粒(pET-SANK70214-01)。(4)克隆至枯草芽孢桿菌168中為了用具有羥基化活性的SANK70214的蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168，將該核苷酸序列重新克隆至pHT01(由MoBiTecGmbH制造)(枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的穿梭載體)中。為了通過PCR擴(kuò)增pET-SANK70214-01中克隆的P450的核苷酸序列，制備F3(AAGGAGGAAGGATCCATGAGTCATGCTGCGAACGTAA)和R3(GACGTCGACTCTAGATTAGAATGAAACGGGCAATG)的引物組。使用該引物組和pET-SANK70214-01作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)采用PrimeSTARMax(由TakaraBioInc.制造)和PCR裝置(由TakaraBioInc.制造，TP350)，并將3階段反應(yīng)重復(fù)30次，所述3階段反應(yīng)涉及在98℃下變性10秒，在55℃下退火5秒，并在72℃下延伸10秒鐘。作為結(jié)果，擴(kuò)增了具有約1.2kb的長度的DNA片段。用提供用于In-Fusion克隆反應(yīng)的CloningEnhancer(由ClontechLaboratories,Inc.制造)處理獲得的約1.2kb的SANK70214DNA片段。為了通過PCR擴(kuò)增pHT01(由MoBiTecGmbH制造)(枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的穿梭載體)，制備F4(TCTAGAGTCGACGTCCCCG)和R4(GGATCCTTCCTCCTTTAATTG)的引物組。使用該引物組和pHT01作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)采用PrimeSTARMax(由TakaraBioInc.制造)和PCR裝置(由TakaraBioInc.制造，TP350)，并將3階段反應(yīng)重復(fù)30次，所述3階段反應(yīng)涉及在98℃下變性10秒，在55℃下退火5秒，并在72℃下延伸60秒鐘。作為結(jié)果，擴(kuò)增了具有約8kb的長度的DNA片段。將該P(yáng)CR反應(yīng)溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并切出約8kb的DNA片段，并使用MonofasDNA純化試劑盒I(由GLSciencesInc.制造)回收。將回收的預(yù)先用克隆增強(qiáng)劑處理的約8kb的pHT01DNA片段和約1.2kb長的DNA片段使用In-FusionHD克隆試劑盒(由ClontechLaboratories,Inc.制造)連接，并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(由ToyoboCo.,Ltd.制造)。然后，在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中選擇大腸桿菌。然后，在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的菌落?；厥丈L的大腸桿菌，并使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(由QiagenN.V.制造)純化質(zhì)粒DNA，以獲得攜帶具有羥基化活性的SANK70214的蛋白的核苷酸序列的質(zhì)粒(pHT01-SANK70214-01)。用獲得的用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌的pHT01-SANK70214-01轉(zhuǎn)化大腸桿菌C600(由ZymoResearchCorp.制造)。然后，在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中選擇大腸桿菌。然后，在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的菌落?；厥丈L的大腸桿菌，并使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(由QiagenN.V.制造)純化質(zhì)粒DNA，以獲得pHT01-SANK70214-01用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌。通過電穿孔用pHT01-SANK70214-01轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168。在含有100μg/ml氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中選擇枯草芽孢桿菌。獲得攜帶HT01-SANK70214-01的枯草芽孢桿菌。將該轉(zhuǎn)化體命名為枯草芽孢桿菌SANK70214T。(實(shí)施例6)從野生型克隆SANK70314(1)巨大芽孢桿菌SANK70314的基因組DNA樣品的制備以與實(shí)施例5相同的方式制備SANK70314的基因組DNA樣品，不同之處在于，使用SANK70314代替SANK70214，并將SANK70314的種子培養(yǎng)溶液的培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為6小時(shí)。(2)基因組測序和P450基因的鑒定使用PacBioRSII(由PacificBiosciencesofCalifornia,Inc.制造)和Miseq(由Illumina,Inc.制造)進(jìn)行基因組測序。獲得的序列為5.4Mbp，其中GC含量為38.0%。使用BASysServer2(https://www.basys.ca/server2/basys/cgi/text_search.pl)用巨大芽孢桿菌作為參考序列注釋獲得的基因組序列，以獲得六個(gè)推定的P450核苷酸序列(具有羥基化活性的SANK70314的蛋白的核苷酸序列)。獲得的P450的核苷酸序列各自保留了Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,20121;22(1):606-609中所述的3種類型的基序。其中，克隆了具有將底物化合物(2)羥基化成本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的活性的蛋白(SEQIDNO:6，圖12)的基因(SEQIDNO:4，圖10)。(3)克隆至大腸桿菌中為了通過PCR擴(kuò)增SANK70314的P450的核苷酸序列，制備F5(GAAGGAGATATACATATGAAAACCGAAAGAGAAAAC)和R5(TGTCGACGGAGCTCTTATACATGTTTACGAATCA)的引物組。使用該引物組和SANK70314作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以與實(shí)施例5相同的方式進(jìn)行隨后的程序，以獲得攜帶具有羥基化活性的SANK70314的蛋白的核苷酸序列的質(zhì)粒(pET-SANK70314-01)。(4)克隆至枯草芽孢桿菌168中為了用具有羥基化活性的SANK70314的蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168，將該核苷酸序列重新克隆至pHT01(由MoBiTecGmbH制造)(枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的穿梭載體)中。為了通過PCR擴(kuò)增pET-SANK70314-01中克隆的P450的核苷酸序列，制備F6(AAGGAGGAAGGATCCATGAAAACCGAAAGAGAAAAC)和R6(GACGTCGACTCTAGATTATACATGTTTACGAATCAATAATTC)的引物組。使用該引物組和pET-SANK70214-01作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)采用PrimeSTARMax(由TakaraBioInc.制造)和PCR裝置(由TakaraBioInc.制造，TP350)，并將3階段反應(yīng)重復(fù)30次，所述3階段反應(yīng)涉及在98℃下變性10秒，在55℃下退火5秒，并在72℃下延伸10秒鐘。作為結(jié)果，擴(kuò)增了具有約1.2kb的長度的DNA片段。用提供用于In-Fusion克隆反應(yīng)的CloningEnhancer(由ClontechLaboratories,Inc.制造)處理獲得的約1.2kb的SANK70314DNA片段。為了通過PCR擴(kuò)增pHT01(由MoBiTecGmbH制造)(枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的穿梭載體)，利用F4(TCTAGAGTCGACGTCCCCG)和R4(GGATCCTTCCTCCTTTAATTG)的引物組。使用該引物組和pHT01作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)采用PrimeSTARMax(由TakaraBioInc.制造)和PCR裝置(由TakaraBioInc.制造，TP350)，并將3階段反應(yīng)重復(fù)30次，所述3階段反應(yīng)涉及在98℃下變性10秒，在55℃下退火5秒，并在72℃下延伸60秒鐘。作為結(jié)果，擴(kuò)增了具有約8kb的長度的DNA片段。將該P(yáng)CR反應(yīng)溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并切出約8kb的DNA片段，并使用MonofasDNA純化試劑盒I(由GLSciencesInc.制造)回收。將回收的預(yù)先用克隆增強(qiáng)劑處理的約8kb的pHT01DNA片段和約1.2kb長的DNA片段使用In-FusionHD克隆試劑盒(由ClontechLaboratories,Inc.制造)連接，并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(由ToyoboCo.,Ltd.制造)。然后，在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中選擇大腸桿菌。然后，在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的菌落。回收生長的大腸桿菌，并使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(由QiagenN.V.制造)純化質(zhì)粒DNA，以獲得攜帶具有羥基化活性的SANK70314的蛋白的核苷酸序列的質(zhì)粒(pHT01-SANK70314-01)。用獲得的用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌的pHT01-SANK70314-01轉(zhuǎn)化大腸桿菌C600(由ZymoResearchCorp.制造)。然后，在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中選擇大腸桿菌。然后，在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的菌落。回收生長的大腸桿菌，并使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(由QiagenN.V.制造)純化質(zhì)粒DNA，以獲得pHT01-SANK70314-01用于轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌。通過電穿孔用pHT01-SANK70314-01轉(zhuǎn)染枯草芽孢桿菌168。在含有100μg/ml氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中選擇枯草芽孢桿菌。獲得攜帶HT01-SANK70314-01的枯草芽孢桿菌。將該轉(zhuǎn)化體命名為枯草芽孢桿菌SANK70314T。(實(shí)施例7)萜類化合物衍生物(III)的生產(chǎn)(用于生物轉(zhuǎn)化的菌株：SANK70214T)(1)SANK70214T的培養(yǎng)將20ml具有下表4中所示的組成的種子培養(yǎng)基置于100-ml錐形燒瓶中，在121℃下滅菌15分鐘，然后冷卻至室溫。將一個(gè)菌環(huán)的SANK70214T菌落接種至燒瓶中的培養(yǎng)基中，并在37℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)24小時(shí)。在下文中，將獲得的培養(yǎng)溶液稱為“種子培養(yǎng)溶液”。[表4]表4.用于SANK70214T的種子培養(yǎng)基的組成*pH未調(diào)整。將100ml具有下表5中所示的組成的主要培養(yǎng)基-1置于500-ml錐形燒瓶中，并在121℃下滅菌30分鐘。然后，向其中無菌添加具有下表6中所示的組成的主要培養(yǎng)基-2，以制備主要培養(yǎng)基。向其中無菌接種1.0mlSANK70214T的種子培養(yǎng)溶液，并在37℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)2小時(shí)。然后，以0.1mM(終濃度)向其中添加IPTG(異丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷)，并將混合物在37℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)1小時(shí)。然后，向其中添加1.0ml以30mg/ml的濃度溶解于二甲基亞砜中的底物化合物(2)(通過實(shí)施例3(1)的方法合成)的溶液，并將混合物在37℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)5小時(shí)。[表5]表5.主要培養(yǎng)基-1的組成(表6)表6.主要培養(yǎng)基-2的組成(2)萜類化合物衍生物(III)的分離在下面給出的條件下通過HPLC監(jiān)測本實(shí)施例中的萜類化合物衍生物(III)的行為。柱：UnisonUK-C18(4.6mm(直徑)×75mm(長度)；由ImtaktCorp.制造)溶劑：A：含有0.01％甲酸的10mM甲酸銨水溶液B：含有0.01％甲酸的乙腈A/B=用5/5平衡，隨后線性梯度7分鐘，直至A/B=1/9流速：1.0ml/min檢測：紫外吸收λ230nm保留時(shí)間：4.9分鐘(萜類化合物衍生物(III))將段落(1)中獲得的培養(yǎng)溶液稀釋至100ml。然后，向其中添加100ml丙酮，并將混合物在室溫下靜置1小時(shí)。將1ml其等分試樣分離并以10,000rpm離心10分鐘。將上清液用作培養(yǎng)溶液提取物。將10μl由此制備的培養(yǎng)溶液提取物在上述HPLC條件下進(jìn)行洗脫。在波長λ=230nm處檢測目標(biāo)化合物的紫外吸收。從在4.9分鐘的保留時(shí)間處出現(xiàn)的峰(萜類化合物衍生物(III))的峰面積計(jì)算向底物化合物(2)的轉(zhuǎn)化效率。作為結(jié)果，對于萜類化合物衍生物(III)，確認(rèn)生物轉(zhuǎn)化效率為77%。(1)SANK70314T的培養(yǎng)將20ml具有實(shí)施例7的表4中所示的組成的種子培養(yǎng)基置于100-ml錐形燒瓶中，在121℃下滅菌15分鐘，然后冷卻至室溫。將一個(gè)菌環(huán)的SANK70314T菌落接種至燒瓶中的培養(yǎng)基中，并在37℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)10小時(shí)。在下文中，將獲得的培養(yǎng)溶液稱為“種子培養(yǎng)溶液”。將100ml具有實(shí)施例7的表5中所示的組成的主要培養(yǎng)基-1置于500-ml錐形燒瓶中，并在121℃下滅菌15分鐘。然后，向其中無菌添加具有上表6中所示的組成的主要培養(yǎng)基-2，以制備主要培養(yǎng)基。向其中無菌接種1.0mlSANK70314T的種子培養(yǎng)溶液，并在37℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)2小時(shí)。然后，以0.1mM(終濃度)向其中添加IPTG，并將混合物在37℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)1小時(shí)。然后，向其中添加1.0ml以30mg/ml的濃度溶解于二甲基亞砜中的底物化合物(2)(通過實(shí)施例3(1)的方法合成)的溶液，并將混合物在37℃和210rpm的條件下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)84小時(shí)。(2)萜類化合物衍生物(III)的分離在下面給出的條件下通過HPLC監(jiān)測本實(shí)施例中的萜類化合物衍生物(III)的行為。柱：UnisonUK-C18(4.6mm(直徑)×75mm(長度)；由ImtaktCorp.制造)溶劑：A：含有0.01％甲酸的10mM甲酸銨水溶液B：含有0.01％甲酸的乙腈A/B=用5/5平衡，隨后線性梯度7分鐘，直至A/B=1/9流速：1.0ml/min檢測：紫外吸收λ=230nm保留時(shí)間：4.9分鐘(萜類化合物衍生物(III))。將段落(1)中獲得的培養(yǎng)溶液稀釋至100ml。然后，向其中添加100ml丙酮，并將混合物在室溫下靜置1小時(shí)。將1ml其等分試樣分離并以10,000rpm離心10分鐘。將上清液用作培養(yǎng)溶液提取物。將10μl由此制備的培養(yǎng)溶液提取物在上述HPLC條件下進(jìn)行洗脫。在波長λ=230nm處檢測目標(biāo)化合物的紫外吸收。從在4.9分鐘的保留時(shí)間處出現(xiàn)的峰(萜類化合物衍生物(III))的峰面積計(jì)算向RNR-0014的轉(zhuǎn)化效率。作為結(jié)果，對于萜類化合物衍生物(III)，確認(rèn)生物轉(zhuǎn)化效率為39%。(實(shí)施例9)作為緩釋藥物組合物的微球的生產(chǎn)本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)用作緩釋藥物組合物中的活性成分。表7中所示的聚乳酸或聚(乳酸-共-乙醇酸)(由WakoPureChemicalIndustries,Ltd.制造)用作基質(zhì)材料。[表7]表7.基質(zhì)材料通過以下方法生產(chǎn)具有10重量％的藥物含量的微球：將本發(fā)明的基質(zhì)材料和萜類化合物衍生物(III)分別以約17％和約1.7%(w/v)的濃度溶解于二氯甲烷中。隨后，將獲得的溶液進(jìn)一步添加至0.05％聚乙烯醇水溶液中，并使用攪拌器形成o/w乳液。在該乳液中，水相的體積為油相的體積的約6.7倍。通過適當(dāng)調(diào)節(jié)用于形成o/w乳液的攪拌速度來控制獲得的微球的粒徑。例如，獲得的微球通過大轉(zhuǎn)數(shù)而具有小粒徑，并且通過小轉(zhuǎn)數(shù)而具有大粒徑。通過采用在水中的干燥方法(o/w法)蒸發(fā)油相中的溶劑。該蒸發(fā)在常壓下用使用磁力攪拌器的攪拌進(jìn)行。通過過濾分離因此獲得的微球。然后，將附著在微球表面上的乳化劑等用純凈水等重復(fù)洗滌幾次。然后，將微球再次分散于蒸餾水(純凈水)中并凍干，以獲得目標(biāo)微球。通過以下方法生產(chǎn)具有30重量％的藥物含量的微球：將本發(fā)明的基質(zhì)材料和萜類化合物衍生物(III)分別以約12％和約5%(w/v)的濃度溶解于二氯甲烷中。隨后，將獲得的溶液進(jìn)一步添加至0.05％聚乙烯醇水溶液中，并使用攪拌器形成o/w乳液。在該乳液中，水相的體積為油相的體積的約6.7倍。使用激光衍射粒徑分布測量裝置(Helos&Cuvette,SympatecGmbH)測量獲得的微球的平均粒徑。測量結(jié)果顯示于表8中。[表8]表8.粒徑分布測量結(jié)果基質(zhì)材料藥物含量(％)X10X50X90PLGA-0005103.7014.424.3PLGA-5020106.5216.927.4PLGA-5020305.8817.127.8PLGA-75201011.127.941.6PLA-0020105.4117.327.3通過下面給出的方法測量獲得的微球中的本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的含量(含藥微球中的藥物的重量分?jǐn)?shù))。將生產(chǎn)的微球(精確稱量約1mg)溶解于二甲基亞砜中以精確地制成1mL。從高效液相色譜(HPLC)的測量值計(jì)算該溶液中含有的本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的量。根據(jù)下式計(jì)算微球中的本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的含量：含量(重量％)=(含有的本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的量的測量值/微球的量)×100。HPLC條件如下：<HPLC條件>儀器：色譜儀(Acquity,WatersCorp.)，UV檢測器(Acquity,WatersCorp.)，數(shù)據(jù)分析儀(Empower,WatersCorp.)HPLC柱：ACQUITYUPLCBEHC181.7μm(2.1mmI.D.x50mm,WatersCorp.)分析時(shí)間：14min流動(dòng)相A：水：乙腈：磷酸(95:5:0.1)流動(dòng)相B：乙腈：水：磷酸(95:5:0.1)流速：0.75mL/min(梯度條件顯示于表9中)柱溫度：約40℃的恒溫樣品溫度：約25℃的恒溫檢測波長：UV-245nm。[表9]表9.梯度條件時(shí)間(min)00.53.56.011.011.114.0流動(dòng)相A(%)8080505018080流動(dòng)相B(%)20205050992020通過該方法測定的藥物含量是從生產(chǎn)微球時(shí)的基質(zhì)材料和藥物的組成計(jì)算的重量比的85％至95％，從而確認(rèn)是定量的。因此，在本發(fā)明中，為了方便起見，以從生產(chǎn)時(shí)的組成計(jì)算的藥物含量指示組成。(實(shí)施例10)作為緩釋藥物組合物的棒狀植入物的生產(chǎn)使用含有PLA-0020作為基質(zhì)材料和10重量％的本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的微球生產(chǎn)棒狀植入物。能夠通過加熱至約200℃來完全熔化微球。用熔化的微球填充金屬管并使其冷卻。然后，取出其所得產(chǎn)物并完全冷卻，以獲得目標(biāo)棒狀植入物(直徑：約1mm)。將獲得的棒狀植入物溶解于二甲基亞砜中，以精確地制成1mg/mL。以與實(shí)施例4相同的方式測量該溶液中含有的萜類化合物衍生物(III)的量，以計(jì)算棒狀植入物中萜類化合物衍生物(III)的含量。通過以下方法生產(chǎn)本實(shí)施例中使用的具有10重量％的藥物含量的微球：將本發(fā)明的基質(zhì)材料和萜類化合物衍生物(III)分別以約17％和約1.7%(w/v)的濃度溶解于二氯甲烷中。隨后，將獲得的溶液進(jìn)一步添加至0.05％聚乙烯醇水溶液中，并使用攪拌器形成o/w乳液。在該乳液中，水相的體積為油相的體積的約6.7倍。(測試實(shí)施例1)NQO1測定培養(yǎng)Hepa1c1c7細(xì)胞(小鼠肝細(xì)胞系，ATCC，目錄號CRL-2026)(5%CO2，37℃)。使用也含有10％滅活的FBS的DMEM(LifeTechnologiesJapanLtd.，目錄號11965-092)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基含有100單位/mL(終濃度)青霉素和100ug/mg(終濃度)鏈霉素。根據(jù)先前報(bào)道(AnalBiochem1998;169:328-;和MethodsEnzymol2004;382:243-)進(jìn)行NQO1測定。將Hepa1c1c7細(xì)胞以10000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中。約24小時(shí)后，用含有萜類化合物衍生物(III)、萜類化合物衍生物(I)或萜類化合物衍生物(II)的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，并進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)約48小時(shí)。制備裂解溶液(含有2mMEDTA和0.8％洋地黃皂苷的溶液)、反應(yīng)溶液(含有0.025Mtris-HCl、0.067％白蛋白、0.01％Tween-20、2U/mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、5μM黃素腺嘌呤二核苷酸、1μM葡萄糖-6-磷酸、30μM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、0.03％3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)和50μM甲萘醌)和終止溶液(含有0.3mM雙香豆素和5mM磷酸二氫鉀的溶液，pH7.4)。除去培養(yǎng)基后，向其中添加50μL裂解溶液，并將混合物在37℃下靜置10分鐘。將反應(yīng)混合物在室溫下進(jìn)一步振蕩10分鐘。向其中添加200μL溶液，并將混合物在室溫下靜置5分鐘。向其中添加50μL終止溶液，并測量490nm處的吸光度。使用Prism(GraphPadSoftware,Inc.,Ver.5)分析測試結(jié)果，以計(jì)算NQO1的活性增加2倍時(shí)的濃度的CD值(雙重NQO1活性的濃度)。每組由3個(gè)孔組成并表示為CD值的平均值。萜類化合物衍生物(III)的CD值是1.0nM，萜類化合物衍生物(I)的CD值是0.3nM，而萜類化合物衍生物(II)的CD值是0.1nM。(測試實(shí)施例2)含有萜類化合物衍生物(III)的微球的體外藥物釋放測試通過實(shí)施例7中描述的方法生產(chǎn)含有10重量％的本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的微球。使眼內(nèi)灌注溶液(OpeguardMA，由SenjuPharmaceuticalCo.,Ltd.制造)含有1w/v%的表面活性劑(Tween80)。向該溶液中添加微球，使得本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的濃度為50μg/mL。將混合物在設(shè)定至37℃的培養(yǎng)箱中攪拌。在溫育開始后1、2、3和7天，將該混合溶液離心(3,750rpm，10分鐘)，并將200μL獲得的上清液與800μL50％乙腈混合。通過HPLC測量溶解的本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的量。HPLC條件與實(shí)施例4中所述的那些相同。當(dāng)將完全溶解的本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的藥物濃度定義為100％時(shí)，計(jì)算本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的溶解速度(％)。計(jì)算結(jié)果顯示于表10中。這些結(jié)果表明所有測試的微球均以持續(xù)的方式釋放藥物。[表10]表10.本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)從微球中溶解的累積速率(％)*藥物組合物中萜類化合物衍生物(III)的含量。(測試實(shí)施例3)含有萜類化合物衍生物(III)的棒狀植入物的體外藥物釋放測試通過實(shí)施例8中描述的生產(chǎn)方法來生產(chǎn)棒狀植入物。使眼內(nèi)灌注溶液(OpeguardMA，由SenjuPharmaceuticalCo.,Ltd.制造)含有1w/v%的表面活性劑(Tween80)。向該溶液中添加棒狀植入物，使得本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的濃度為50μg/mL。將混合物在設(shè)定至37℃的培養(yǎng)箱中攪拌。在溫育開始后1、2、3、7、14、21和28天，將該混合溶液離心(3,750rpm，10分鐘)，并將200μL獲得的上清液與800μL50％乙腈混合。通過HPLC測量溶解的本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的量。HPLC條件與實(shí)施例7中所述的那些相同。用于計(jì)算溶解速率的方法與測試實(shí)施例2中相同。計(jì)算結(jié)果顯示于表11中。這些結(jié)果表明，具有基質(zhì)材料PLGA-5020的棒狀植入物均以持續(xù)的方式釋放藥物。[表11]表11.本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)從棒狀植入物(萜類化合物衍生物(III)的含量：10重量％)中的累積溶解速率(％)(測試實(shí)施例4)含有萜類化合物衍生物(III)的微球在兔眼中的藥代動(dòng)力學(xué)測試使用本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)、本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)-PLA-0005[通過使用PLA-0005作為基質(zhì)材料和將本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)和PLA-0005的混合比率調(diào)節(jié)至1:9來制備]和本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)-PLA-0020[通過使用PLA-0020作為基質(zhì)材料和將本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)和PLA-0020的混合比率調(diào)節(jié)至1:9來制備]中的每一種，以及鹽水作為溶劑來制備懸浮液，使得萜類化合物衍生物(III)的濃度為3mM。向每只白兔(OrientalYeastCo.,Ltd.,Kbl:NZW，雄性，8周齡)玻璃體內(nèi)施用50μL每種懸浮液。在玻璃體內(nèi)施用后，將兔安樂死，并取樣玻璃體內(nèi)液和視網(wǎng)膜。測量這些樣品中含有的萜類化合物衍生物(III)的濃度。結(jié)果顯示于表13和14中。下表12中顯示的數(shù)值由來自4只眼的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。通過LC/MS/MS測量每種組織中的藥物濃度。通過用對應(yīng)于組織重量的10倍的量的純凈水稀釋、隨后均質(zhì)化來預(yù)處理組織，以獲得測量樣品。將含有內(nèi)標(biāo)溶液(IS；尼氟酸)的水/乙腈(1:1)溶液添加至獲得的樣品以提取藥物。然后，將溶液通過過濾器過濾并注射至LC/MS/MS。LC/MS/MS條件如下：<UPLC條件>：WatersAcquityUPLC分析柱：ACQUITYUPLCBEHC181.7μm柱溫度：50℃流動(dòng)相A：95%乙腈(5mM乙酸銨)流動(dòng)相B：5%乙腈(5mM乙酸銨)。(表12)表12.梯度表流速：0.8mL/min。<MS/MS條件>：分析儀器API4000電離模式：ESI離子極性模式：正監(jiān)測離子萜類化合物衍生物(III)(前體離子(m/z):538.5，產(chǎn)物離子(m/z):460)IS(前體離子(m/z):283.2，產(chǎn)物離子(m/z):265)。[表13]表13.本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的玻璃體內(nèi)濃度(nM)(表14)表14.本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的視網(wǎng)膜內(nèi)濃度(ug/g組織)因此，能夠確認(rèn)，通過使用可生物降解聚合物作為基質(zhì)材料顯著維持本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的玻璃體內(nèi)和視網(wǎng)膜內(nèi)濃度。(測試實(shí)施例5)含有萜類化合物衍生物(III)的棒狀植入物在兔眼中的藥代動(dòng)力學(xué)測試生產(chǎn)由本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)-PLGA-5020[通過使用PLGA-5020作為基質(zhì)材料和將本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)和PLGA-5020的混合比率調(diào)節(jié)至1:9來制備]構(gòu)成的微球。使用微球，以及鹽水作為溶劑來制備懸浮液，使得萜類化合物衍生物(III)的濃度為3mM。向每只白兔(OrientalYeastCo.,Ltd.,Kbl:NZW，雄性，8周齡)玻璃體內(nèi)施用50μL該懸浮液。劑量為810μg微球(81μg本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III))。生產(chǎn)由萜類化合物衍生物(III)-PLGA-5020[通過使用PLGA-5020作為基質(zhì)材料和將本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)和PLGA-5020的混合比率調(diào)節(jié)至1:9來制備]構(gòu)成的棒狀植入物，并向每只兔玻璃體內(nèi)施用。劑量為6.5mg棒狀植入物(650ug本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III))。在玻璃體內(nèi)施用后，將兔安樂死，并取樣玻璃體內(nèi)液。測量其中的本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的濃度。結(jié)果顯示于表15中。下表15中顯示的數(shù)值由來自2只眼的平均值表示。確認(rèn)棒狀植入物使藥物在玻璃體中維持28天。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與微球相比，棒狀植入物能夠顯著維持萜類化合物衍生物(III)的玻璃體內(nèi)濃度。(表15)表15.本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的玻璃體內(nèi)濃度(nM)(試驗(yàn)例6)萜類化合物衍生物(III)微球?qū)ν靡暰W(wǎng)膜基因的作用測試視網(wǎng)膜中的Nqo1基因作為Nrf2靶基因的動(dòng)力學(xué)。向每只白兔(OrientalYeastCo.,Ltd.,Kbl:NZW，雄性，8周齡)玻璃體內(nèi)施用50μL微球懸浮液。劑量為810μg微球(81μg本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III))。使用提取試劑盒(由QiagenN.V.制造，RNeasyMini試劑盒，目錄號74106)從取樣自安樂死的兔的視網(wǎng)膜中回收mRNA。使用cDNA合成試劑盒(由GEHealthcareLifeSciences制造，第一鏈cDNA合成試劑盒)從獲得的mRNA制備cDNA。獲得的cDNA使用試劑(由AppliedBiosystems,Inc.制造，TaqMan(R)GeneExpressionMasterMix(目錄號4369016))和探針擴(kuò)增，并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(使用由AppliedBiosystems,Inc.制造的實(shí)時(shí)PCRHT7900)。當(dāng)無玻璃體內(nèi)施用的視網(wǎng)膜中Nqo1基因的表達(dá)水平被定義為1時(shí)，動(dòng)力學(xué)顯示于表16中。下表16中顯示的數(shù)值由2只眼的平均值表示。(表16)表16.視網(wǎng)膜中Nqo1基因的動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)使用PLA-0020(在測試實(shí)施例3中證實(shí)其保持萜類化合物衍生物(III)的高含量)作為基質(zhì)材料比使用PLA-0005作為基質(zhì)材料更強(qiáng)烈地誘導(dǎo)Nrf2靶基因。(試驗(yàn)例7)當(dāng)含量改變時(shí)萜類化合物衍生物(III)微球?qū)ν靡暰W(wǎng)膜基因的作用通過改變微球中含有的化合物的比例來測試視網(wǎng)膜中的Nqo1基因作為Nrf2靶基因的動(dòng)力學(xué)。生產(chǎn)本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)-PLGA-5020[通過使用PLGA-5020作為基質(zhì)材料和將本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)和PLA-0005的混合比率調(diào)節(jié)至1:9(10％重量)或3:7(30％重量)來制備]。使用每種測試樣品并使用鹽水作為溶劑來制備懸浮液，使得萜類化合物衍生物(III)的濃度為3mM。50uL每種懸浮液含有81ug萜類化合物衍生物(III)。向每只白兔(OrientalYeastCo.,Ltd.,Kbl:NZW，雄性，8周齡)玻璃體內(nèi)施用50μL每種懸浮液。在玻璃體內(nèi)施用后，將兔安樂死，并取樣兔視網(wǎng)膜。通過實(shí)時(shí)定量PCR測定的視網(wǎng)膜中Nqo1基因的動(dòng)力學(xué)顯示于表17中。下表17中顯示的數(shù)值由來自4只眼的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。(表17)表17.視網(wǎng)膜中Nqo1基因的動(dòng)力學(xué)據(jù)發(fā)現(xiàn)，即使具有高含量的萜類化合物衍生物(III)的藥物組合物也誘導(dǎo)Nrf2靶基因。玻璃體內(nèi)液中的萜類化合物衍生物(III)的濃度顯示于表18中。下表18中顯示的數(shù)值由來自4只眼的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。(表18)表18.本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的玻璃體內(nèi)濃度(nM)(測試實(shí)施例8)發(fā)揮藥理作用所需的濃度的計(jì)算通過向玻璃體局部施用包含本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)作為活性成分的緩釋藥物組合物，進(jìn)行關(guān)于發(fā)揮藥理作用所需的藥理學(xué)有效濃度的研究。誘導(dǎo)Nrf2靶基因Nqo1的2倍活性時(shí)的濃度用作指標(biāo)(AnalBiochem1988;169:328-)。根據(jù)該方法，通過使用在視網(wǎng)膜中2倍誘導(dǎo)Nrf2靶基因Hmox1的萜類化合物衍生物(III)的濃度作為指標(biāo)來研究人中的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。使用PLA-0020作為基質(zhì)材料生產(chǎn)含有10重量％的本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)的緩釋藥物組合物，并玻璃體內(nèi)施用。關(guān)于Hmox1的時(shí)間依賴性誘導(dǎo)的結(jié)果顯示于表19中。(表19)表19.通過玻璃體內(nèi)施用含有PLA-0020作為基質(zhì)材料的萜類化合物(III)組合物(微球)的視網(wǎng)膜中Nqo1基因的動(dòng)力學(xué)變化從該表中顯而易見，從施用緩釋藥物組合物起，Hmox1的約2倍或更多倍誘導(dǎo)被維持了28天，即約1個(gè)月。接下來，對表現(xiàn)出這些誘導(dǎo)比率所必需的靶組織(視網(wǎng)膜)中的藥物濃度進(jìn)行研究。通過玻璃體內(nèi)施用緩釋藥物組合物而在視網(wǎng)膜中造成藥物濃度的變化顯示于表20中。(表20)表20.萜類化合物衍生物(III)的視網(wǎng)膜內(nèi)濃度(nM)因此，在該測試中施用后，在直到28天(即約1個(gè)月)的所有時(shí)間都滿足Hmox1的兩倍或更多倍誘導(dǎo)。因此，在該測試中，據(jù)發(fā)現(xiàn)，在等于或高于最小視網(wǎng)膜內(nèi)藥物濃度，即施用后1個(gè)月時(shí)的視網(wǎng)膜濃度(來自表14的0.07μM)的濃度，獲得發(fā)揮藥理作用所必需的Hmox1的誘導(dǎo)。從表13確認(rèn)，2倍誘導(dǎo)Hmox1基因1個(gè)月所必需的劑量為81μg/機(jī)體，這是在本測試實(shí)施例中施用的微球中的藥物量。接下來，從該測試的結(jié)果預(yù)測對于人的藥物的劑量。對于人，玻璃體內(nèi)的容量為4mL，對于兔，玻璃體內(nèi)的容量為1.5至2.5mL(InvestOphthalmolVisSci2007;48:2230-)。因此，通過使用約2倍的體積比進(jìn)行校正，可以將兔玻璃體中的藥物濃度外推至人。從用于獲得表13的數(shù)據(jù)的藥物的劑量81μg/機(jī)體(兔)，藥物的必需劑量被計(jì)算為162μg/機(jī)體，前提條件是臨床上期望的藥理作用的持續(xù)時(shí)間是1個(gè)月。另一方面，作為棒狀植入物藥物組合物投放的Ozudex(R)中含有的藥物的量為700μg(InvestOphthalmolVisSci20011;52:80-)。從這些推測包含本發(fā)明的萜類化合物衍生物(III)作為活性成分的藥物組合物能夠以臨床上發(fā)揮其藥理學(xué)作用的量施用所述藥物。保藏號NITEBP-01914NITEBP-01915NITEBP-01916序列表的自由文本SEQIDNO:1：SANK7021416SrDNA的部分核苷酸序列SEQIDNO:2：SANK7031416SrDNA的部分核苷酸序列SEQIDNO:3：具有羥基化活性的SANK70214的蛋白的DNA序列SEQIDNO:4：具有羥基化活性的SANK70314的蛋白的DNA序列SEQIDNO:5：具有羥基化活性的SANK70214的蛋白的氨基酸序列SEQIDNO:6：具有羥基化活性的SANK70314的蛋白的氨基酸序列序列表<110>Daiichisankyo<120>用于治療和預(yù)防眼病的緩釋藥物組合物<130>DSPCT-FP1532<150>JP2014-183854<151>2014-09-10<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1476<212>DNA<213>未知<220><223>芽孢桿菌種<400>1gcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacgtttttgaagcttgctttaaaaacgttagc60ggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctaccttatcgactgggataactccgggaaa120ccggggctaataccggataacatctagcacctcctggtgccggattgaaagagggcttct180tgctctcacgatgagatgggcccgcggcgcattagctagttggagaggtaatggctcccc240aaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacgg300cccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacgg360agcaacgccgcgtgagtgatgaagggtttcggctcgtaaagctctgttatgagggaagaa420cacgtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctcatcagaaagccacggctaac480tacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgt540aaagcgcgcgcaggcggccttttaagtctgatgtgaaatcttgcggctcaaccgcaagcg600gccattggaaactgggaggcttgagtacagaagaggagagtggaattccacgtgtagcgg660tgaaatgcgtagatatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaact720gacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgcc780gtaaacgatgagtgctaggtgttaggggtttcgatgcccgtagtgccgaagttaacacat840taagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggc900ccgcacaagcagtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtc960ttgacatcctttgaccactctggagacagagcttccccttcgggggcaaagtgacaggtg1020gtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgca1080acccttgaccttagttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaa1140ccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacg1200tgctacaatggatggtacaaagggttgcgaagccgcgaggtgaagccaatcccataaagc1260cattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctgcatgaagctggaattgctagtaat1320cgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacac1380cacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttggagccagccgccgaagg1440tgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggta1476<210>2<211>1383<212>DNA<213>巨大芽孢桿菌<400>2gatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcgaactgattagaagcttgct60tctatgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagactggg120ataacttcgggaaaccgaagctaataccggataggatcttctccttcatgggagatgatt180gaaagatggtttcggctatcacttacagatgggcccgcggtgcattagctagttggtgag240gtaacggctcaccaaggcaacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacactgg300gactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggac360gaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgt420tgttagggaagaacaagtacaagagtaactgcttgtaccttgacggtacctaaccagaaa480gccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccgga540attattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggct600caaccgtggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagagaaaagcggaattc660cacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttt720tggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctg780gtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctg840cagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaagga900attgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaa960ccttaccaggtcttgacatcctctgacaactctagagatagagcgttccccttcggggga1020cagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtc1080ccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatttagttgggcactctaaggtga1140ctgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgac1200ctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggctgcaagaccgcgaggtcaagc1260caatcccataaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctg1320gaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacac1380acc1383<210>3<211>1254<212>DNA<213>未知<220><223>芽孢桿菌種<400>3atgagtcatgctgcgaacgtaaaagagaaagtgttaggctttttaagtggaaaaagtgga60gaaaacccgtttcatttatttgctgaactccgagatttgggatcggtcgtctcaatccct120aacccaatgggtgatccaaacaaaaatgcttggatgatcactaagatggatacagcaaca180aaggttctaaaggattcaaaacggttcacggttgatccggcatcgattgaaaaggaaagt240ggatttagagcggaaatggtttcagatccagatgattctcccgataccttttttacaggt300aagtctatggtttttattgacggtattgatcataagcgattgcgaatgctcgtatcgaaa360gcattcactccgaaatatatggaagggttacgtcctcgtatacaggaaatagcagacggt420ttacttgatcaagttgaatcaaaaggtgagatggatcttgtaaaagattacgcctatcct480ctaccgattattgtgatatcagaaatgttaggagtacctaaagaagatcatgaaaatcta540caaatatggtcatcggctatagctaaaggcttaggctgggggaaacaagatccagccgtg600cagcagcatctaaaagattttggagattacacaaagaagcttgtagaaaagaaaagagct660catttagaggatgatctcatcagccagctgatccaaattgaagaagagggagaacgtcta720agtgaagaagagctgatctcgatgattacacttcttatctttgcagggcatgaaacaacg780tctaacctgatcgctacaggtagtatgatgttatttgaccacccggagcaattaaataaa840ttaaaatcaaacctagatctggtaccaactgctgttgaagaacttctgcgttttaacggt900ccttctacaactgtaggcccacgtttcgcaaaggaagatgtgaatatagatggacaagag960atcaaaaaaggagatatgctccttatccttgttaagtcagcgaaccgagatgaagaagtg1020ttctctgattccgaagaattggatgtcagtcgttcaattcaccgacatttagcctttggt1080tttggtatgcatatgtgccttggagctcctttagctcgagtggaaggagacgtcgctttt1140acaacgctcttaaaaaggctaccgaacatagagcttagtattccgcctgaggaagtaaag1200tggcaattcacgctctcaacgcaaggcctttcatcattgcccgtttcattctaa1254<210>4<211>1215<212>DNA<213>巨大芽孢桿菌<400>4atgaaaaccgaaagagaaaacggaatcgtccgtcaagtgaatacgattcaaacaaaagaa60gagcgctttaatcctttttcatggtatgaagagatgagaaacagcgcgcctgtgcgatgg120gatgaagaaaggcaggtatgggatgtttttcactatgatggggtcaaagaagtgctggaa180caaaaaaatattttttcttctgatcgaagacctccacaaaaccaaagacaaactgctcta240ggaacgagcctaattaatattgatccgcctaagcatgctgaaatgagagcgcttgttaat300aaagcttttacgcctaaagcaatgaaagcatgggagcctaaaattgcgcgcattaccgct360gaattattacaagaagttgagcatcttgaagatattgatatagtcgagcatctttcctat420ccgcttccggttatggtaattgccgatattttaggcgtcccgatagaagatcagcgtcag480tttaaagattggtcggatattatcgtagcgggtccatcgaataatgaacgtgaaacgctc540gaaaaattgcagcaagagaaaatgaaagcaaacgatgagttagaaacttacttttatcga600atcattgaagaaaagcgcacgcagccaggagatgatattatttccgtgcttcttcaagca660aaagaagaagggaagcagctaacggatgaagaaatcgtcgggttttccattttgctgctg720attgcaggcaacgaaacaaccacgaacttaatttcaaatacgatttattgtttaatggaa780gataaagcttcttttgaacgactcaaacgagaaaaagaacttttaccttctgcgattgaa840gaagttcttcgctatcgttcacccgttcaggctcttcaccgaatcgtaaaaaaagatgtg900gttcttgcagggaagaaattaaaagcgggcgaacacgtcgttccatggatgggatccgcg960caccgagatgcgcagtattttgaagacccggatgtatttcaaatcgatcgaaagccaaat1020atccatatggcatttggaagagggattcatttttgcttaggagcaccgcttgctcgaata1080gaagcaaaagttatgctggctgaactgattgaccgctatccgcatatggactggagcccg1140gcatttgagttaaagccgattgaaagcacgtttgtgtacgggttagaagaattattgatt1200cgtaaacatgtataa1215<210>5<211>417<212>PRT<213>未知<220><223>芽孢桿菌種<400>5MetSerHisAlaAlaAsnValLysGluLysValLeuGlyPheLeuSer151015GlyLysSerGlyGluAsnProPheHisLeuPheAlaGluLeuArgAsp202530LeuGlySerValValSerIleProAsnProMetGlyAspProAsnLys354045AsnAlaTrpMetIleThrLysMetAspThrAlaThrLysValLeuLys505560AspSerLysArgPheThrValAspProAlaSerIleGluLysGluSer65707580GlyPheArgAlaGluMetValSerAspProAspAspSerProAspThr859095PhePheThrGlyLysSerMetValPheIleAspGlyIleAspHisLys100105110ArgLeuArgMetLeuValSerLysAlaPheThrProLysTyrMetGlu115120125GlyLeuArgProArgIleGlnGluIleAlaAspGlyLeuLeuAspGln130135140ValGluSerLysGlyGluMetAspLeuValLysAspTyrAlaTyrPro145150155160LeuProIleIleValIleSerGluMetLeuGlyValProLysGluAsp165170175HisGluAsnLeuGlnIleTrpSerSerAlaIleAlaLysGlyLeuGly180185190TrpGlyLysGlnAspProAlaValGlnGlnHisLeuLysAspPheGly195200205AspTyrThrLysLysLeuValGluLysLysArgAlaHisLeuGluAsp210215220AspLeuIleSerGlnLeuIleGlnIleGluGluGluGlyGluArgLeu225230235240SerGluGluGluLeuIleSerMetIleThrLeuLeuIlePheAlaGly245250255HisGluThrThrSerAsnLeuIleAlaThrGlySerMetMetLeuPhe260265270AspHisProGluGlnLeuAsnLysLeuLysSerAsnLeuAspLeuVal275280285ProThrAlaValGluGluLeuLeuArgPheAsnGlyProSerThrThr290295300ValGlyProArgPheAlaLysGluAspValAsnIleAspGlyGlnGlu305310315320IleLysLysGlyAspMetLeuLeuIleLeuValLysSerAlaAsnArg325330335AspGluGluValPheSerAspSerGluGluLeuAspValSerArgSer340345350IleHisArgHisLeuAlaPheGlyPheGlyMetHisMetCysLeuGly355360365AlaProLeuAlaArgValGluGlyAspValAlaPheThrThrLeuLeu370375380LysArgLeuProAsnIleGluLeuSerIleProProGluGluValLys385390395400TrpGlnPheThrLeuSerThrGlnGlyLeuSerSerLeuProValSer405410415Phe<210>6<211>404<212>PRT<213>巨大芽孢桿菌<400>6MetLysThrGluArgGluAsnGlyIleValArgGlnValAsnThrIle151015GlnThrLysGluGluArgPheAsnProPheSerTrpTyrGluGluMet202530ArgAsnSerAlaProValArgTrpAspGluGluArgGlnValTrpAsp354045ValPheHisTyrAspGlyValLysGluValLeuGluGlnLysAsnIle505560PheSerSerAspArgArgProProGlnAsnGlnArgGlnThrAlaLeu65707580GlyThrSerLeuIleAsnIleAspProProLysHisAlaGluMetArg859095AlaLeuValAsnLysAlaPheThrProLysAlaMetLysAlaTrpGlu100105110ProLysIleAlaArgIleThrAlaGluLeuLeuGlnGluValGluHis115120125LeuGluAspIleAspIleValGluHisLeuSerTyrProLeuProVal130135140MetValIleAlaAspIleLeuGlyValProIleGluAspGlnArgGln145150155160PheLysAspTrpSerAspIleIleValAlaGlyProSerAsnAsnGlu165170175ArgGluThrLeuGluLysLeuGlnGlnGluLysMetLysAlaAsnAsp180185190GluLeuGluThrTyrPheTyrArgIleIleGluGluLysArgThrGln195200205ProGlyAspAspIleIleSerValLeuLeuGlnAlaLysGluGluGly210215220LysGlnLeuThrAspGluGluIleValGlyPheSerIleLeuLeuLeu225230235240IleAlaGlyAsnGluThrThrThrAsnLeuIleSerAsnThrIleTyr245250255CysLeuMetGluAspLysAlaSerPheGluArgLeuLysArgGluLys260265270GluLeuLeuProSerAlaIleGluGluValLeuArgTyrArgSerPro275280285ValGlnAlaLeuHisArgIleValLysLysAspValValLeuAlaGly290295300LysLysLeuLysAlaGlyGluHisValValProTrpMetGlySerAla305310315320HisArgAspAlaGlnTyrPheGluAspProAspValPheGlnIleAsp325330335ArgLysProAsnIleHisMetAlaPheGlyArgGlyIleHisPheCys340345350LeuGlyAlaProLeuAlaArgIleGluAlaLysValMetLeuAlaGlu355360365LeuIleAspArgTyrProHisMetAspTrpSerProAlaPheGluLeu370375380LysProIleGluSerThrPheValTyrGlyLeuGluGluLeuLeuIle385390395400ArgLysHisVal當(dāng)前第1頁1 2 3