本發(fā)明公開了作為對(duì)抗植物病原性絲狀真菌，特別是對(duì)抗灰霉病灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)的生物殺真菌劑的細(xì)菌菌株多粘類芽孢桿菌(paenibacilluspolymyxa)schc33。這種細(xì)菌菌株多粘類芽孢桿菌(p.polymyxa)schc33具有允許其與目前使用的商業(yè)生物殺真菌劑競爭的重要性質(zhì)。其殺真菌活性非常有效并且不依賴于在其中培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基，其對(duì)人或植物無毒，其以monod動(dòng)力學(xué)行為在簡單培養(yǎng)基中快速生長而無底物抑制，以使得其可以容易地以大規(guī)模和低成本生產(chǎn)。除了上述性質(zhì)之外，其孢子形成的能力將允許獲得具備高穩(wěn)定性和長使用壽命的商業(yè)制劑。本發(fā)明的應(yīng)用領(lǐng)域包括在收獲前和收獲后條件下易受植物病原性真菌感染的所有果實(shí)、蔬菜和觀賞植物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種表征為多粘類芽孢桿菌schc33的分離的野生型細(xì)菌菌株，及其作為生物殺真菌劑的用途。該細(xì)菌菌株根據(jù)用于專利目的的布達(dá)佩斯條約保藏于智利微生物遺傳資源中心(cchrgm)。由保藏機(jī)構(gòu)于2014年7月23日授予的保藏號(hào)為rgm2141，所述保藏機(jī)構(gòu)是智利微生物遺傳資源中心(cchrgm)的保藏機(jī)構(gòu)。這種野生型智利天然細(xì)菌從智利的第七大區(qū)馬烏萊的的土壤中分離，并且具有殺死植物病原性真菌灰葡萄孢菌(b.cinerea)的不同的分離和野生型菌株的能力。真菌毒性分子的分泌賦予了所述細(xì)菌的殺真菌能力，所述真菌毒性分子與其所破壞的真菌相互作用并因此抑制分生孢子的萌發(fā)和真菌營養(yǎng)菌絲體的增殖。目前使用的許多生物殺真菌劑可能具有對(duì)人和植物的潛在致病性。相比之下，尚未報(bào)道多粘類芽孢桿菌schc33對(duì)植物或果實(shí)具有致病性或毒性，并且未報(bào)道對(duì)動(dòng)物或人具有致病性。在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，將其接種在藤本植物的葉中，并在20℃下在僅含有1.5％瓊脂(w/v)以保持充分濕度水平的板中孵育7天后，未在這種宿主中產(chǎn)生可見變化。同樣地，當(dāng)將大量菌株接種物(2×1010cfu(colony-formingunit，菌落形成單位))加入到完整或受傷的葡萄中時(shí)，在與上述相同的條件下培養(yǎng)7天后未見影響。本發(fā)明的生物制劑對(duì)應(yīng)于從土壤中分離的野生型細(xì)菌，并且已經(jīng)通過生物化學(xué)、微生物學(xué)、電子顯微鏡和16srdna測序技術(shù)個(gè)體化。多粘類芽孢桿菌schc33是智利的本土菌株，并且是一種對(duì)植物或動(dòng)物非致病性的腐生生物，因此使用其活細(xì)胞作為抗灰葡萄孢菌的生物殺真菌劑是合適的。此外，本發(fā)明涉及包含所述細(xì)菌菌株的組合物或包含所述細(xì)菌菌株的提取物，或者涉及含有由其來源之化合物(例如由所述細(xì)菌菌株分泌的真菌毒性分子)的溶液或混合物，所有這些都能夠保護(hù)植物及其果實(shí)在收獲前和收獲后免于植物病原性微生物的攻擊。本發(fā)明還包括衍生自野生型菌株的具有基本上相同或更優(yōu)良性質(zhì)的任何突變體。此外，本發(fā)明涉及用于制備所述細(xì)菌菌株或其衍生物的方法，并且涉及其在保護(hù)植物，特別是果實(shí)中的應(yīng)用。此外，本發(fā)明提供了使用純菌株多粘類芽孢桿菌schc33來防控真菌性植物病害的制劑。這種細(xì)菌的使用構(gòu)成了合成化學(xué)殺真菌劑的天然替代物，確保了實(shí)現(xiàn)對(duì)由植物病原性真菌引起之病害的防控和消除的更安全的環(huán)境。最后，本發(fā)明提供了含有對(duì)于其生物活性適當(dāng)?shù)男问胶土康乃鼍甑慕M合物?；旌衔锇沟眉?xì)菌附著于其接種之植物的無毒試劑、植物營養(yǎng)素和無害量的防腐劑，所述混合物是液體懸液或通過凍干獲得的粉末形式。
背景技術(shù)：
：在任何類型的植物組織中由植物病原性真菌引起的感染都極具破壞性、傳播迅速并且?guī)缀醢l(fā)生在地球上的任何地方。目前用于控制這些病害的方法主要是基于使用化學(xué)殺真菌劑，盡管由于其大部分是頑拗性分子而使得其具有潛在毒性，但是其仍然被大規(guī)模應(yīng)用，這是因?yàn)槠湓试S相對(duì)有效地防控真菌病害，還因?yàn)槿匀粵]有有效并且環(huán)境安全的替代物?；移咸焰呔侵参锊≡缘亩嗉闹餍院退荔w營養(yǎng)型真菌，其感染具有重大經(jīng)濟(jì)重要性的植物物種，包括果樹、觀賞植物和蔬菜。其產(chǎn)生被稱為灰腐病的病害，在草莓、覆盆子、桃、蘋果、梨、粟子、獼猴桃和葡萄等果實(shí)收獲前后造成嚴(yán)重的問題。在藤本植物中，這種真菌造成葡萄果穗的腐爛，這種病害目前被認(rèn)為是智利出口果實(shí)生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一，因?yàn)槠洳粌H在田地水平造成巨大損失，而且在其儲(chǔ)存和運(yùn)輸期間也造成損失(williamsonb，tudzynskib，tudzynskip，vankanja2007.botrytiscinerea：thecauseofgraymoulddiseasemolplantpathol8：561-80；elad，y.，williamsonbtudzynski，p.和delen，n.編輯.2007.botrytis：biology，pathologyandcontrol.thenetherlands：kluweracademicpublishers)。目前，對(duì)這種重要的植物病原體的防控主要使用化學(xué)殺真菌劑進(jìn)行，然而，近年來已經(jīng)描述了一些對(duì)灰葡萄孢菌具有抗真菌活性的微生物。最有希望的實(shí)例之一是其活性成分是芽孢桿菌(bacillus)屬細(xì)菌，特別是枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)qst713，其由加利福尼亞州davis的agraquestinc.在蔬菜園的土壤樣品中發(fā)現(xiàn)。這種生物殺真菌劑在多個(gè)國家(包括智利)注冊(cè)，其具有低毒性，并在智利和美國于商業(yè)上用于防控病害，例如葡萄中的葡萄白粉病(uncinulanecator)和酸腐病。在專利kr20100024454中，公開了緩病類芽孢桿菌(paenibacilluslentimorbus)cmc3723(保藏號(hào)kacc91379)，除了防止植物病原體的生長之外，其還具有抑制植物中的病原體的能力，特別是梨樹黑星病(peartreescab)(梨黑星病(pearscab))、葡萄孢菌(botrytis)和白腐小核菌(sclerotinumcepivorum)。緩病類芽孢桿菌cmc3723從土壤中分離，并且具有抑制梨黑星菌(venturianashicola)、灰葡萄孢菌、白腐小核菌和尖孢炭疽菌(colletotrichumacutatum)的效果。用于在植物中預(yù)防由這些病原體引起之病害的試劑含有緩病類芽孢桿菌cmc3723的培養(yǎng)物。還公開了用于分離、培養(yǎng)、測定對(duì)抗植物病原性真菌和細(xì)菌的活性、鑒定緩病類芽孢桿菌cmc3723和制備含有其的培養(yǎng)基的方法。在這種情況下，細(xì)菌菌株緩病類芽孢桿菌cmc3723和多粘類芽孢桿菌schc33屬于同一屬，但屬于完全不同的物種。公開kr20090105149公開了具有抗菌活性的多粘類芽孢桿菌nb1和含有其的組合物，其可用于預(yù)防由植物病原體引起的病害。多粘類芽孢桿菌nb1作為針對(duì)植物病原體的拮抗劑，其保藏號(hào)為kfcc11413p。所描述的植物病原體是尖孢炭疽菌、終極腐霉(pythiumultimum)、辣椒疫霉(phytophthoracapsici)、立枯絲核菌(rhizoctoniasolani)ag4、灰葡萄孢菌和尖孢鐮刀菌(fusariumoxysporum)。專利kr20030075092教導(dǎo)了微生物類芽孢桿菌屬sd17，其產(chǎn)生用于植物病害的生物防控的抗真菌劑和用于植物病害的生物防控的組合物，其含有用于有效防控植物中病害的微生物。微生物類芽孢桿菌屬sd17(kctc10016bp)產(chǎn)生用于植物病害的生物防控的抗真菌劑，所述植物病害包括由腐霉屬(pythiumspp.)、立枯絲核菌ag1-1、立枯絲核菌ag2-2、致病疫霉(phytophthorainfestans)或灰葡萄孢菌引起的病害。用于植物病害的生物防控的組合物，其含有：按重量計(jì)5至30％的類芽孢桿菌屬sd17(kctc-10016bp)的培養(yǎng)基；按重量計(jì)0.2至3.0％的對(duì)應(yīng)于酵母提取物的活化孢子萌發(fā)的試劑；按重量計(jì)0.02至0.5％的水溶性顏料；按重量計(jì)1至5％的表面活性劑和添加劑或樹脂。公開ep1241247公開了用于保護(hù)植物抵抗植物病原性細(xì)菌和真菌的拮抗細(xì)菌。所分離的細(xì)菌是物種多粘類芽孢桿菌、綠針假單胞菌(pseudomonaschlororaphis)、惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)、普城沙雷氏菌(serratiaplymuthica)和枯草芽孢桿菌。它們可以作為混合物或單獨(dú)施用，以防治例如以下的植物病害：葡萄中由根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)引起的冠癭病；番茄和卷心菜中由棒狀桿菌屬(corynebacteriumspp.)、丁香假單胞菌(pseudomonassyringae)和野油菜黃單胞菌(xanthomonascampestris)引起的病害；黃瓜和番茄中由灰葡萄孢菌引起的病害；黃瓜和蕃茄中由白粉菌(erysiphales)屬引起的白粉?。稽S瓜、甜瓜和番茄中由尖孢鐮刀菌引起的立枯??；谷物中由麥根腐長蠕孢(helminthosporumsativum)引起的病害；棉花和豆類中由立枯絲核菌引起的根腐?。欢诡愔杏升R整小核菌(sclerotiumrolfsii)引起的病害；蘑菇中的樹狀指孢霉(dactyliumdendroides)等。如果我們將在菌斑對(duì)抗生物測定法中獲得的來自公開ep1241247的多粘類芽孢桿菌抵抗灰葡萄孢菌的抗真菌活性與相同測定條件下的細(xì)菌菌株多粘類芽孢桿菌schc33的抗真菌活性進(jìn)行比較，則菌株schc33產(chǎn)生更大直徑的抑制圈，因此其殺真菌活性更強(qiáng)。附圖說明圖1對(duì)應(yīng)于多粘類芽孢桿菌schc33的掃描電子顯微照片。在(a)中清楚地觀察到由細(xì)菌分泌的物質(zhì)，其對(duì)應(yīng)于由15個(gè)胞外多糖形成的生物膜。在(b)中觀察到被從液體培養(yǎng)物中獲得的橢圓形孢子包圍的桿菌的集中。圖2是多粘類芽孢桿菌schc33的透射電子顯微照片。有分裂細(xì)胞及其相應(yīng)的周生鞭毛。圖3示出了多粘類芽孢桿菌schc33的16srdna的部分核苷酸序列。圖4對(duì)應(yīng)于多粘類芽孢桿菌schc33抵抗灰葡萄孢菌的對(duì)抗生物測定。在(a)中，示出了在無葡萄糖的基本培養(yǎng)基中進(jìn)行的生物測定的結(jié)果。在(b)中，示出了在含有葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行的生物測定的結(jié)果。在圖5中，示出了葡萄葉上灰葡萄孢菌分生孢子的萌發(fā)抑制生物測定的結(jié)果。(a)和(b)對(duì)應(yīng)于陰性對(duì)照。(c)和(d)是陽性對(duì)照。在(e)和(g)中分別示出了對(duì)于1∶10和1∶100的分生孢子：細(xì)菌比例，對(duì)分生孢子萌發(fā)的生物防控效果。在(f)和(h)中分別觀察到對(duì)于1∶10和1∶100的分生孢子：細(xì)菌比例，類芽孢桿菌對(duì)分生孢子萌發(fā)的生物防控效果。圖6示出了對(duì)于初始葡萄糖濃度為2[g/l]的細(xì)菌生長曲線和葡萄糖消耗。在(a)中，示出了隨時(shí)間的生物質(zhì)增加和葡萄糖消耗。(b)對(duì)應(yīng)于生物質(zhì)隨時(shí)間的半對(duì)數(shù)曲線。圖7示出了初始葡萄糖濃度對(duì)多粘類芽孢桿菌schc33的比生長速率的影響的曲線。圖8示出了實(shí)驗(yàn)生長曲線和對(duì)所評(píng)估的動(dòng)力學(xué)模型(monod、moser和tessier模型)的擬合。在圖9中示意性地示出了通過pcr擴(kuò)增并且從中獲得其序列的16srdna的區(qū)域。紅色是用于pcr的引物。藍(lán)色是用于測序的引物。圖10示出了具有恒定通氣的2升生物反應(yīng)器，其用于測定多粘類芽孢桿菌schc33的動(dòng)力學(xué)生長參數(shù)。發(fā)明詳述菌株schc33對(duì)應(yīng)于多粘菌(polymyxa)種和類芽孢桿菌(paenibacillus)屬。其通過微生物學(xué)和生物化學(xué)測試的表征示于表1中。其在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(agar-papa-dextrosa，pda)和mlg培養(yǎng)基(麥芽提取物10g/l，葡萄糖2g/l，瓊脂15g/l)中產(chǎn)生無色素沉著的無色/白色菌落。表1.多粘類芽孢桿菌schc33的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征形狀桿菌革蘭氏染色陽性運(yùn)動(dòng)性(+)色素產(chǎn)生(-)胞外多糖產(chǎn)生(eps)(+)4℃下的生長(+)通過掃描電子顯微術(shù)和透射電子顯微術(shù)對(duì)多粘類芽孢桿菌schc33的超結(jié)構(gòu)表征在光學(xué)顯微術(shù)水平下，培養(yǎng)物由革蘭氏陽性可運(yùn)動(dòng)桿菌構(gòu)成，而在掃描電子顯微術(shù)(microscopíaelectrónicadebarrido，sem)水平下，清楚地觀察到桿菌形態(tài)，細(xì)胞大小長度為3至5μm，直徑為0.5至0.8μm(見圖1)。此外，細(xì)胞簇由對(duì)應(yīng)于胞外多糖(exopolisacáridos，eps)的粘附特性的物質(zhì)結(jié)合，其允許形成生物膜(參見圖1a)，這對(duì)于細(xì)菌粘附到植物表面以保護(hù)其免于植物病原性生物體(細(xì)菌或真菌)的攻擊是非常重要的。通過sem沒有觀察到細(xì)菌附屬物，然而，使用負(fù)染色技術(shù)，可以在透射電子顯微術(shù)(microscopioelectrónicodetransmisión，tem)下檢測到長度約3至5μm的周生鞭毛的存在(參見圖2)，其完全符合對(duì)于這種類型的細(xì)菌所描述的背景(lals.和tabacchionis.2009.ecologyandbiotechnologicalpotentialofpaenibacilluspolymyxa：aminireview，indianj.microbiol49：2-10)。多粘類芽孢桿菌schc33的分子表征除了細(xì)菌的微生物學(xué)和生物化學(xué)表征之外，通過獲得16srdna的一部分核苷酸序列及其隨后的生物信息學(xué)分析來進(jìn)行分子表征。在圖3中示出了多粘類芽孢桿菌schc33的16srdna的部分核苷酸序列(1,255個(gè)核苷酸)。使用blastn將該序列與數(shù)據(jù)庫中的現(xiàn)有序列進(jìn)行比較，產(chǎn)生表2所示的結(jié)果。表2.多粘類芽孢桿菌schc33的16srdna根據(jù)blastn的比對(duì)結(jié)果。指示了由計(jì)算機(jī)程序計(jì)算的參數(shù)的值。因此，微生物學(xué)測試、電子顯微術(shù)、16srdna測序和生物信息學(xué)分析證實(shí)這是一種新的多粘類芽孢桿菌菌株，其從智利的第七大區(qū)馬烏萊的的土壤中分離并命名為schc33。確定多粘類芽孢桿菌schc33對(duì)抗植物病原性真菌灰葡萄孢菌的抗真菌活性進(jìn)行菌斑對(duì)抗生物測定，其中將真菌菌絲體盤置于培養(yǎng)皿的中心，并在其邊緣接種細(xì)菌(參見圖4)。在無葡萄糖的培養(yǎng)基(參見圖4a)和含有這種單糖的培養(yǎng)基(參見圖4b)中都清楚地觀察到真菌的生長抑制圈。此外，如果使用不同的培養(yǎng)基，例如馬鈴薯-葡萄糖瓊脂(pda)；含有0.5％酵母提取物、1％胰蛋白胨和0.5％nacl的luriabertani培養(yǎng)基；含有1.5％麥芽提取物和0.7％酵母提取物的ml培養(yǎng)基等，則殺真菌活性保持完整。如果除了上述培養(yǎng)基外還加入葡萄糖，則對(duì)灰葡萄孢菌的殺真菌活性沒有改變。該結(jié)果是非常相關(guān)的，因?yàn)樵谄渌锾m氏(-)細(xì)菌如普城沙雷氏菌中觀察到，在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中真菌毒性分子的分泌受到了抑制。因此，對(duì)于以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)細(xì)菌生物質(zhì)，可以使用任何培養(yǎng)基。確定多粘類芽孢桿菌schc33抵抗植物組織上灰葡萄孢菌攻擊的保護(hù)能力使用細(xì)菌的兩種已知量107和108cfu/ml，以評(píng)價(jià)與枯草芽孢桿菌qst713(商業(yè)生物殺真菌劑的活性成分)相比的生物防控功效。7天的結(jié)果是令人滿意的，用多粘類芽孢桿菌schc33細(xì)菌獲得了對(duì)植物組織的稍高水平的保護(hù)。陰性對(duì)照表現(xiàn)出小面積壞死，這是由為了促進(jìn)感染所造成的傷口所引起，而其中僅接種真菌分生孢子的陽性對(duì)照遭受了幾乎覆蓋100％葉面積的灰葡萄孢菌感染。在用多粘類芽孢桿菌schc33保護(hù)的葉和用枯草芽孢桿菌qst713保護(hù)的葉兩者中，由真菌引起的損傷程度顯著降低。在多粘類芽孢桿菌schc33的情況下，使用1∶10的分生孢子∶細(xì)菌的比率，則由真菌產(chǎn)生的損傷僅覆蓋20.5％的葉表面，當(dāng)比率為1∶100時(shí)降低至11.7％。在用枯草芽孢桿菌qst713的試驗(yàn)中，分別為：對(duì)于1∶10的比率，由真菌產(chǎn)生的植物組織壞死覆蓋36.9％的葉表面，并且當(dāng)分生孢子∶細(xì)菌比率為1∶100時(shí)降低至15.4％。這些結(jié)果示于表3和圖5中，表明細(xì)菌通過直接接種在容易被灰葡萄孢菌感染的蔬菜田中具有用作生物殺真菌劑的巨大潛力。表3.葡萄葉中損傷表面的結(jié)果在5個(gè)葡萄果穗上確定多粘類芽孢桿菌schc33抵抗灰葡萄孢菌攻擊的保護(hù)能力使用細(xì)菌的2種已知量107和108cfu/ml，在湯姆森無籽品種的葡萄果穗上進(jìn)行抵抗灰葡萄孢菌的保護(hù)生物測定，以評(píng)價(jià)其作為生物防控劑的效力。30天的結(jié)果表現(xiàn)出與在葡萄葉中所示的相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用，因?yàn)閷?duì)于所使用的兩種細(xì)菌的量，通過噴霧接種細(xì)菌的果穗均沒有表現(xiàn)出灰葡萄孢菌之菌絲體的明顯生長。不論是在僅用細(xì)菌(108cfu/ml)接種的果穗中還是在用單獨(dú)無菌水接種的那些中，陰性對(duì)照均沒有顯示出灰葡萄孢菌的存在。此外，這些結(jié)果是細(xì)菌對(duì)于實(shí)驗(yàn)中所使用的果實(shí)無害的清楚證據(jù)，因?yàn)闆]有觀察到形態(tài)學(xué)改變，也沒有觀察到所用葡萄的著色和感官特征的變化。陽性對(duì)照(通過僅用真菌分生孢子噴灑接種的葡萄果穗)顯示明顯的灰葡萄孢菌的感染，明顯地觀察到經(jīng)接種果穗的漿果中真菌菌絲體的營養(yǎng)生長。確定多粘類芽孢桿菌schc33生長的動(dòng)力學(xué)參數(shù)并將結(jié)果調(diào)整到預(yù)建立的模型之一使用2升容量的生物反應(yīng)器，獲得具有不同葡萄糖濃度的5個(gè)細(xì)菌生長曲線。在表4中示出了獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并且在圖6中示出了具有2g/l葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)物的相應(yīng)生長曲線，其中首先獲得與生物質(zhì)隨時(shí)間的形成相關(guān)的曲線，然后將半對(duì)數(shù)曲線用于鑒定細(xì)菌生長的階段。因此，可以看出，沒有潛伏期并且指數(shù)生長期在生長開始時(shí)立即起動(dòng)，這種行為在所進(jìn)行的所有實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中得到了重復(fù)。在整個(gè)指數(shù)生長期期間葡萄糖消耗以恒定速率發(fā)生，實(shí)驗(yàn)中這利用在生長減緩期間保持高葡萄糖濃度(≥1g/l)來實(shí)現(xiàn)。在細(xì)菌生長中通過底物或產(chǎn)物均沒有觀察到抑制，因此對(duì)動(dòng)力學(xué)模型的調(diào)整限于不出現(xiàn)這種情況的那些模型中，在這種情況下為monod、moser和tessier(shulerm.，kargif2002.stoichiometryofmicrobialgrowthandproductformationinbioprocessengineering：basicconcepts，shulerm.，kargif.harlow編：pearson，207-218)。表4.對(duì)于初始葡萄糖濃度為2[g/l]的細(xì)菌生長曲線，從生物質(zhì)增加和葡萄糖消耗獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。獲得圖7所示將比生長速率與培養(yǎng)基中葡萄糖的初始濃度相關(guān)聯(lián)的曲線，使得獲得以葡萄糖作為主要底物生長的該細(xì)菌的內(nèi)在動(dòng)力學(xué)參數(shù)。然而，這些參數(shù)的驗(yàn)證首先需要對(duì)圖8所示的前述3種模型之一的動(dòng)力學(xué)調(diào)整的統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證。在這種情況下，獲得的曲線表現(xiàn)出了根據(jù)文獻(xiàn)的預(yù)期行為，當(dāng)增加底物濃度時(shí)，特定細(xì)菌生長速率持續(xù)增加，直到達(dá)到最大點(diǎn)，之后速率恒定(acevedof.，gentinaj.2004.cinéticadefermentación.infundamentosdeingenieríabioquímica.f.acevedo，j.gentina，a.illanes編.valparaíso：edicionesuniversitariasdevalparaíso，151-168)。對(duì)這3個(gè)動(dòng)力學(xué)模型的評(píng)價(jià)基于如表5所示的相關(guān)統(tǒng)計(jì)參數(shù)，表明使用葡萄糖作為主要底物的多粘類芽孢桿菌schc33的生長擬合為monod型動(dòng)力學(xué)模型，因?yàn)樗蔷哂懈咏?的相關(guān)系數(shù)的模型，同時(shí)也是具有更低的卡方參數(shù)的模型，其相對(duì)于所分析的其他2個(gè)模型具有一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異。然后通過分析monod獲得多粘類芽孢桿菌schc33的內(nèi)在動(dòng)力學(xué)參數(shù)，因此這種細(xì)菌使用葡萄糖作為主要底物的最大比生長速率為μ最大＝0.218小時(shí)-1，其葡萄糖親和常數(shù)為ks＝0.087g/l，從葡萄糖產(chǎn)生生物質(zhì)的產(chǎn)率為yx/s＝0.159[g生物質(zhì)/g葡萄糖]。表5.獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和獲得所評(píng)價(jià)的3個(gè)模型的動(dòng)力學(xué)參數(shù)實(shí)驗(yàn)部分獲取土壤樣品從第七大區(qū)馬烏萊的的農(nóng)業(yè)土壤原位進(jìn)行取樣，將約10個(gè)隨機(jī)樣品送到智利圣地亞哥大學(xué)(universityofsantiagodechile)的真菌病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室，在所述實(shí)驗(yàn)室中將其儲(chǔ)存在室溫下，直到后面使用。獲得細(xì)菌分離株將土壤樣品在67℃下進(jìn)行熱處理48小時(shí)，然后將1克每個(gè)樣品懸浮于1ml無菌蒸餾水中。最后，將1ml每個(gè)樣品的該懸浮液一式三份接種在具有mlg+c培養(yǎng)基(10g/l麥芽提取物，2g/l葡萄糖，15g/l瓊脂，放線菌酮50μg/ml)的培養(yǎng)皿上，獲得不同的菌群，從其中分離菌落并備份以用于以后的分析?？拐婢钚缘臏y定單獨(dú)備份所獲得的多種菌落，并在具有mlg培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上進(jìn)行針對(duì)灰葡萄孢菌ccg149的菌斑對(duì)抗生物測定，后者是來自真菌病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室的高毒力脫病毒株，并在馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(pda)上生長直到完成測試。還在不同組成(主要是有和沒有葡萄糖)的培養(yǎng)基中評(píng)估抗真菌活性的變化。進(jìn)行了兩種類型的生物對(duì)抗。第一種由以下步驟組成：在培養(yǎng)皿的中心植入5mm直徑的菌絲體盤，并在四個(gè)等距點(diǎn)處接種相同量的不同細(xì)菌分離株，并在20℃下觀察生長7天。第二種方法由以下步驟組成：在距離培養(yǎng)皿中心等距點(diǎn)處植入8個(gè)直徑為5mm的菌絲體，在所述菌絲體處接種細(xì)菌分離株。在20℃再次觀察生長7天。作為對(duì)照，通過用無菌水代替細(xì)菌分離株進(jìn)行相同的測試。選擇對(duì)真菌表現(xiàn)出一定程度的抗真菌活性(可觀察到在培養(yǎng)皿中的抑制圈)的所有那些細(xì)菌分離株。隨后，使用均勻分布在培養(yǎng)皿中的分生孢子懸浮液進(jìn)行相似的測定，所述培養(yǎng)皿在20℃下孵育24小時(shí)，以確保樣品在培養(yǎng)基中的正確吸附。然后，將10μl細(xì)菌培養(yǎng)物接種在板的中心，其在液體培養(yǎng)基中600nm處的光密度為0.9，并且在20℃下孵育7天，以觀察對(duì)于灰葡萄孢菌分生孢子的萌發(fā)抑制圈。獲得純細(xì)菌克隆，dna分離，通過pcr擴(kuò)增16srdna和測序從具有增加的抗真菌活性(培養(yǎng)皿中抑制圈≥1cm)的那些細(xì)菌分離株中進(jìn)行連續(xù)稀釋以獲得認(rèn)為是純細(xì)菌菌株的同基因克隆。使用基因組dna商業(yè)試劑盒提取獲得的菌株的基因組dna，隨后使用稱為8f/1392r的真菌通用引物(參見圖9)對(duì)這些樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增，目的是獲得約1400個(gè)堿基對(duì)的特異性16srdna片段。對(duì)于pcr，使用總體積為50μl的10ng基因組dna、0.5μm每種引物、200μmdntp、2.5udna聚合酶、1x反應(yīng)緩沖液和1.5mmmgcl2。循環(huán)由以下步驟組成：在95℃下4.5分鐘的初始變性步驟和95℃下1分鐘、60℃下1分鐘和72℃下2分鐘的40個(gè)循環(huán)，以在72℃下5分鐘的步驟結(jié)束。將pcr產(chǎn)物在1％瓊脂糖(w/v)凝膠電泳中分離。對(duì)于測序，使用引物對(duì)27f/800r(參見圖9)，并且通過blastn分析所獲得的序列。通過電子顯微術(shù)進(jìn)行超結(jié)構(gòu)分析為了獲得允許確定細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)方面的圖像，制備多粘類芽孢桿菌schc33的樣品以用于通過掃描和透射電子顯微術(shù)來可視化并分析。對(duì)于掃描電子顯微鏡(jeoljsm-25-sii)，使用液體細(xì)菌培養(yǎng)物的樣品，其以使用金的金屬遮蔽技術(shù)制備。在透射電子顯微術(shù)的情況下，對(duì)來自液體細(xì)菌培養(yǎng)物的樣品用ph7.0的1％(w/v)磷鎢酸鉀進(jìn)行負(fù)染色，并在在80kv下在phillipstecnai12biotwin顯微鏡上觀察。獲得動(dòng)力學(xué)參數(shù)為了獲得使用葡萄糖作為主要底物的生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)，在lg培養(yǎng)基(酵母提取物5g/l，葡萄糖)中以初始葡萄糖濃度0.1g/l、0.2g/l、0.5g/l、1g/l、2g/l和5g/l進(jìn)行細(xì)菌不連續(xù)生長的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行。如圖10所示，構(gòu)建2升容量的生物反應(yīng)器，空氣進(jìn)料來自20l/分鐘容量壓縮機(jī)并且用2μm過濾器滅菌，取樣器與無菌注射器相連，利用所述無菌注射器獲得細(xì)菌培養(yǎng)物樣品。在所有實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中，，將通氣(1vvm)、溫度(30℃)、ph(5)和攪拌(200rpm)保持恒定于參考文獻(xiàn)推薦的最優(yōu)值處。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)運(yùn)行，將200ml處于生長指數(shù)期的細(xì)菌培養(yǎng)物接種在含有2升培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，將生物反應(yīng)器開始樣品攪拌和通氣的時(shí)刻認(rèn)為是0時(shí)刻。每30分鐘根據(jù)600nm波長下細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度記錄生物質(zhì)的增加，并使用商業(yè)試劑盒測量培養(yǎng)基中所溶解的葡萄糖的減少。當(dāng)使用葡萄糖作為主要底物時(shí)，利用這些數(shù)據(jù)構(gòu)建細(xì)菌生長和葡萄糖攝取隨時(shí)間的圖，將半對(duì)數(shù)曲線圖用于計(jì)算多粘類芽孢桿菌schc33的比生長速率(μ)。另外，由所述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得底物親和力常數(shù)(ks)的值和每份底物的生物質(zhì)產(chǎn)量(yx/s)。調(diào)整至細(xì)菌生長的動(dòng)力學(xué)模型為了將多粘類芽孢桿菌schc33的生長調(diào)整至一種細(xì)菌生長動(dòng)力學(xué)模型，使用在每個(gè)實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中獲得的比生長速率值并且構(gòu)建將葡萄糖的初始濃度與由測量獲得的比生長速率相關(guān)聯(lián)的圖。評(píng)估了三種細(xì)菌生長動(dòng)力學(xué)，其中將不同的數(shù)學(xué)模型向?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)調(diào)整并根據(jù)模型改變一個(gè)或更多個(gè)常數(shù)，通過牛頓法，推算這些常數(shù)將實(shí)驗(yàn)值與使用microsoftoffice插件excelsolver所計(jì)算的那些值之間的殘差平方和(rss)最小化。為了評(píng)估哪個(gè)模型是對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)呈現(xiàn)更好擬合的模型，使用以下統(tǒng)計(jì)參數(shù)：相關(guān)系數(shù)其中：vc：基于模型的計(jì)算值ve：實(shí)驗(yàn)值n：數(shù)據(jù)數(shù)卡方其中：rss：殘差平方和n：數(shù)據(jù)數(shù)n：常數(shù)植物組織中的生物測定使用剛剛收獲的葡萄葉，觀察對(duì)植物組織上分生孢子萌發(fā)的抑制。將葉子用次氯酸鈉溶液0.5％(v/v)洗滌，然后用無菌蒸餾水洗滌。隨后，將其在具有1.5％(w/v)瓊脂的培養(yǎng)皿中孵育，以在測定的7天期間保持水分。使葉子損傷以促進(jìn)感染，然后分別用在液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌培養(yǎng)物和分生孢子懸浮液以1∶10和1∶100的比例接種。作為對(duì)照，除了由僅用無菌水接種的葉組成的對(duì)照和使用名為的商業(yè)生物殺真菌劑的有效成分枯草芽孢桿菌qst713的對(duì)照以外，制備僅用分生孢子接種的葉和僅用細(xì)菌接種的葉(表6)。表6.進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)處理將結(jié)果定量為在20℃下孵育7天時(shí)損傷的葉面積相對(duì)于總表面的百分比。為此，使用imagej軟件(http：//rsb.info.nih.gov/ij/index.html)獲得各自的面積，所有值在20℃下孵育7天后測定。確定多粘類芽孢桿菌schc33抵抗葡萄果穗上灰葡萄孢菌攻擊的保護(hù)能力使用湯姆森無籽葡萄果穗觀察對(duì)果實(shí)上分生孢子萌發(fā)的抑制。將果穗用含有0.5％(v/v)次氯酸鈉的溶液洗滌，然后用無菌蒸餾水洗滌，然后在測定期間的30天在消毒的封閉容器中孵育。用分生孢子和細(xì)菌的懸浮液以1∶10和1∶100(分生孢子í細(xì)菌)的比例接種果穗。作為對(duì)照，僅用分生孢子接種果穗，另一些則僅用細(xì)菌接種，而一組對(duì)照由僅用無菌蒸餾水接種的果穗組成(表7)。表7.進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)處理處理分生孢子懸浮液類芽孢桿菌培養(yǎng)物蒸餾h2o1++-2++-3+--4-+-5--+對(duì)結(jié)果進(jìn)行定性分析，確定果穗表面上是否存在灰葡萄孢菌菌絲體的生長。在20℃下孵育的30天期間進(jìn)行觀察。當(dāng)前第1頁12