相關申請

本申請要求2014年7月9日提交的美國臨時申請?zhí)?2/022,538、2014年11月14日提交的美國臨時申請?zhí)?2/079,763和2015年5月27日提交的美國臨時申請?zhí)?2/166,890的優(yōu)先權和權益，上述美國臨時申請中每一者的內容以全文通過引用并入本文。

發(fā)明領域

本發(fā)明提供用于從生物樣品中分離核酸、包括游離(cell-free)dna和/或游離dna和包括至少來自微泡的rna的核酸以及用于從微泡和/或從生物樣品中提取核酸的新型方法和試劑盒。

背景

細胞脫落的膜囊泡統(tǒng)稱為微泡。來自各種細胞來源的微泡已關于蛋白質和脂質含量被廣泛研究。最近，已發(fā)現(xiàn)微泡還含有dna和rna兩者，包括基因組dna、cdna、線粒體dna、微rna(mirna)和信使rna(mrna)。

由于細胞所脫落微泡中含有的遺傳和蛋白質組信息，當前研究指向利用微泡來獲得對這些細胞的狀況的進一步洞悉，例如疾病狀態(tài)或疾病素因。另外，當前研究還指向利用游離dna來獲得對細胞狀況的進一步洞悉。

因此，需要分離游離dna和從生物樣品中分離微泡的方法以及提取高質量核酸的方法，以用于醫(yī)療狀況和疾病的準確診斷。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供用于從樣品中分離游離dna(“cfdna”，還稱作循環(huán)dna)和/或組合分離cfdna和包括至少來自微泡的rna的核酸的方法，所述方法通過將dna、dna和rna和/或微泡捕獲至表面，隨后裂解微泡以釋放其中含有的核酸、特別是rna，并且從捕獲表面洗脫dna和/或dna和包括至少rna的核酸。本領域普通技術人員將理解微泡部分(microvesiclefraction)還包括dna。因此，微泡部分的裂解釋放rna和dna兩者。此外，分離的dna可來自各種來源中的任何一種，包括但不限于核小體和其他游離dna來源。

用于從樣品中分離和提取核酸、例如cfdna和/或dna和包括至少來自樣品的微泡部分的rna的核酸的以前的程序依賴于使用超速離心，例如以多于10,000×g旋轉1-3hr，接著移除上清液，洗滌小丸，裂解小丸和在柱上純化核酸例如dna和/或dna和rna。這些以前德方法展現(xiàn)出若干缺點，諸如緩慢、乏味，經受批間可變性，和不適合于可擴展性。本文提供的用于分離和提取的方法和試劑盒克服了這些缺點，并且提供基于旋轉的柱以用于快速、穩(wěn)健和可容易擴展至大體積的分離和提取。

所述方法和試劑盒使用在本文中稱為“exo52”的以下通用程序來從樣品中分離和提取核酸、例如dna和/或dna和包括至少rna的核酸。首先，使樣品中的核酸例如dna和/或dna和微泡部分結合至諸如膜過濾器的捕獲表面，并且洗滌捕獲表面。然后，使用試劑來執(zhí)行核酸例如dna和/或dna和rna的膜上裂解和釋放。然后，使用plg管執(zhí)行氯仿提取，接著是乙醇調節(jié)。然后，使核酸例如dna和/或dna和rna結合至硅膠柱，洗滌和洗脫。

exo52方法和試劑盒中使用的膜具有大孔并帶正電。在一些實施方案中，在exo52方法和試劑盒中使用多于一個膜，例如，使用兩個或更多個膜。在一些實施方案中，使用三個膜。在exo52方法和試劑盒中使用的膜數(shù)與可一次分析的樣品總體積相關。在一些實施方案中，exo52方法和試劑盒中使用的每層膜處理約1ml樣品。

在一些實施方案中，所述膜是帶正電膜。在一些實施方案中，所述捕獲表面是陰離子交換劑。在一些實施方案中，捕獲表面是具有季胺的陰離子交換劑。在一些實施方案中，捕獲表面是q膜，其為帶正電膜和具有季胺的陰離子交換劑。例如，q膜用季銨官能化，r-ch2-n⁺(ch3)3。在一些實施方案中，膜具有至少3μm的孔徑。

包括微泡部分的樣品的純化使用離子交換技術來執(zhí)行。在一些實施方案中，離子交換技術是選自本文提供的工作實例中所示那些的技術。

在一些實施方案中，用于膜上裂解的試劑是苯酚基試劑。在一些實施方案中，裂解試劑是胍鹽基試劑。在一些實施方案中，裂解試劑是高鹽基緩沖液。在一些實施方案中，裂解試劑是qiazol。在一些實施方案中，裂解試劑是苯酚基裂解試劑，例如qiazol，并且它以約700ul的體積使用。

在一個方面中，用于從生物樣品中提取核酸的方法包括：(a)提供生物樣品；(b)在足夠使微泡部分保留于捕獲表面上或中的條件下使生物樣品與捕獲表面接觸；(c)在微泡處于捕獲表面上或中的同時裂解微泡部分；以及(d)從微泡部分中提取核酸?；蛘?，用于從生物樣品中提取核酸的方法進一步包括在步驟(b)之后從捕獲表面洗脫微泡部分，收集洗脫的微泡部分，并且從洗脫的微泡部分中提取核酸。任選地，洗脫的微泡部分可通過旋轉濃縮器來濃縮以獲得濃縮微泡部分，并且隨后從濃縮微泡部分提取核酸。

在另一個方面中，用于從生物樣品中提取核酸的方法包括：(a)提供生物樣品；(b)在足夠使微泡部分保留于捕獲表面上或中的條件下使生物樣品與捕獲表面接觸；以及(c)在微泡處于捕獲表面上或中的同時洗脫微泡部分。洗脫的微泡部分然后可經處理以用于進一步分析。任選地，洗脫的微泡部分可通過旋轉濃縮器來濃縮以獲得濃縮的微泡部分。在一些實施方案中，隨后從濃縮微泡部分提取核酸。

在一些實施方案中，捕獲表面是膜。在一個方面中，膜包含再生纖維素。例如，膜具有至少1μm的孔徑，諸如在2-5μm之間的范圍內。在一些實施方案中，膜具有在3-5μm之間范圍內的孔徑。在一些實施方案中，膜包含聚醚砜(pes)。

在一些實施方案中，膜帶電。在一些實施方案中，膜帶正電。在一些實施方案中，膜帶負電。

在一些方面中，膜被官能化。例如，膜用季銨官能化r-ch2-n⁺(ch3)3。

在一個實施方案中，捕獲表面包含多于一個膜。在一些實施方案中，捕獲表面包含至少兩個膜，其中每個膜相鄰地緊挨其他一個或更多個膜。在一些實施方案中，捕獲表面包含至少三個膜，其中三個膜中每一個直接彼此相鄰。在一些實施方案中，捕獲表面包含至少四個膜，其中四個膜中每一個直接彼此相鄰。

在一些實施方案中，捕獲表面是微珠。例如，微珠是磁性的?；蛘?，微珠是非磁性的。在又一個實施方案中，微珠用親和配體官能化。

在一些實施方案中，捕獲表面是一種或更多種聚合物的漿液。在一些實施方案中，一種或多種聚合物的漿液成形為微珠。

在一些實施方案中，生物樣品是血漿。在一些實施方案中，生物樣品是血清。在一些實施方案中，生物樣品是尿液。在一些實施方案中，生物樣品是腦脊液。在一些實施方案中，生物樣品是細胞培養(yǎng)上清液。

在一些方面中，本文所述的方法進一步包括使生物樣品與加樣緩沖液接觸。加樣緩沖液的ph在4-8范圍內。在一個方面中，加樣緩沖液具有中性ph。

本文所述的方法提供從微泡中提取核酸。優(yōu)選地，提取的核酸是dna和/或dna和rna。提取的rna可包含信使rna、核糖體rna、轉移rna、或小rna諸如微rna，或者它們的任何組合。

使用各種核酸測序技術來檢測和分析核酸，諸如從來自生物樣品的微泡部分中提取的游離dna和/或rna。由于其中可容易收集微泡的非侵入性質，出于診斷目的對核酸諸如游離dna和/或提取自微泡的核酸進行的分析具有廣泛的含意。使用微泡分析取代侵入性組織活檢將積極影響患者福利，改進進行縱向疾病監(jiān)測的能力，和改進獲得表達譜的能力，甚至當組織細胞并非容易可及時(例如，在卵巢癌或腦癌患者中)也是如此。

在一些實施方案中，本發(fā)明涉及用于對核酸測序技術包括例如下一代測序(ngs)測定法提供過程中控制的組合物和方法，以檢測低頻序列變體。這些控制提供若干技術優(yōu)點。

生物樣品是體液。體液可為分離自受試者身體中任何部位、優(yōu)選外圍位置的液體，包括但不限于：例如，血液，血漿，血清，尿液，痰，脊髓液，腦脊液，胸膜液，乳頭抽吸液，淋巴液，呼吸道、腸道和生殖泌尿道液，淚液，唾液，母乳，來自淋巴系統(tǒng)的液體，精液，腦脊液，器官內系統(tǒng)液，腹水，腫瘤囊液，羊水以及它們的組合。例如，體液是尿液、血液、血清或腦脊液。

在前述方法中的任何一種中，核酸是dna和/或dna和rna。rna的實例包括信使rna、轉移rna、核糖體rna、小rna(非蛋白編碼rna，非信使rna)、微rna、pirna、exrna、snrna和snorna。

在前述方法中的任何一種中，核酸分離自或另外來源于樣品，包括分離自樣品微泡部分的rna。

在前述方法中的任何一種中，核酸是游離核酸，本文還稱為循環(huán)核酸。在一些實施方案中，游離核酸是dna或rna。

現(xiàn)將詳細描述本發(fā)明的各種方面和實施方案。將理解在不脫離本發(fā)明范圍的情況下可作出對細節(jié)的修改。此外，除非在上下文中另外要求，否則單數(shù)術語應包括復數(shù)并且復數(shù)術語應包括單數(shù)。

所有鑒定的專利、專利申請和出版物以引用的方式明顯并入本文，出于描述和公開例如可與本發(fā)明結合使用的此類出版物中所述方法學的目的。這些出版物僅僅提供在本申請的申請日之前的公開內容。在這點上沒有什么應解釋為承認本發(fā)明人由于先前發(fā)明或出于任何其他理由而未經授權先于此類公開。關于日期的所有聲明或關于這些文獻內容的表示都基于申請人可得到的信息，并且不構成關于這些文獻的日期或內容更正的任何承認。

附圖簡述

圖1是展現(xiàn)出使用兩個單獨的規(guī)程來分離微泡部分、釋放微泡核酸以及提取rna和dna的rna和dna分離規(guī)程的一個實施方案的示意圖。

圖2是展現(xiàn)出使用單個規(guī)程來分離微泡部分、釋放微泡核酸以及提取rna和dna的rna和dna分離規(guī)程的另一個實施方案的示意圖。

圖3是顯示出單次提取中用于分離微泡rna和dna的相分離中氯仿濃度的效應的圖表，如通過檢測野生型brafrna和dna所展現(xiàn)的。

圖4是顯示出單次提取中用于分離微泡rna和dna的相分離中氯仿濃度的效應的圖表，如通過檢測gapdhrna和dna所展現(xiàn)的。

圖5是顯示出在相分離中調整ph影響dna提取和檢測的圖表。

圖6是顯示出腦脊液(csf)樣品體積的滴定對微泡rna提取和檢測的影響的圖表。

圖7是顯示出比較來自超速離心和exo60分離方法的微泡rna靶檢測的圖表。

圖8是顯示出針對不同患者csf樣品比較來自超速離心和exo60分離方法的微泡rna靶檢測的圖表?；颊邩悠酚苫颊遡d指定。利用變化的樣品體積。(*)指示死后樣品。

圖9是顯示出csf樣品體積(0.25ml，0.5ml，1.0ml和2.0ml)對不同微泡rna分離和提取方法的影響的圖表。uc(超速離心)、ucsc(尿液過濾方法)和exo60。

圖10是描繪來自相比于尿液循環(huán)干細胞(ucsc)方法而言使用exo70規(guī)程從2個不同尿液樣品進行的提取的rna圖譜的一系列生物分析儀圖。

圖11是顯示出在相比于尿液csc方法而言通過exo70來分離和提取之后rna檢測之間相關性的圖表。

圖12是顯示出在通過exo70或ucsc方法來分離和提取之后不同rna靶檢測的兩個圖表。從分離的微泡部分(exo70或ucsc)和分離后流出物(flow-through)或上清液部分(exo70流或ucsc流)中提取和分析rna。(a)mrna靶；(b)mirna靶。

圖13-223是描繪exo52dna和rna分離和提取方法的靈敏度和特異性、連同與本文中稱作可商購cna試劑盒的可商購循環(huán)核酸分離試劑盒比較的一系列圖表和圖解。

圖13是經設計以評估用和不用plg管來提取dna的研究的示意性表示。

圖14、15、16和17是描繪使用dna/rna分離的初始方法(exo52.1)和可商購試劑盒、用和不用plg管來提取dna的一系列圖表。

圖18和19是描繪使用本公開的方法對比可商購循環(huán)核酸提取試劑盒來提取dna的一系列圖表。

圖20是描繪氯仿滴定對苯酚相的rna和dna分離的影響的圖表。

圖21是經設計以評估氯仿滴定對plg管中苯酚相的rna分離和dna分離的影響的研究的示意性表示。

圖22、23、24、25和26是描繪氯仿滴定對rna分離(圖22)、rna和dna分離(圖23、24)和dna分離(圖25、26)的影響的一系列圖表。

圖27是描繪使用rneasy規(guī)程(不用plg管)和氯仿滴定來分離dna的圖表。

圖28是經設計以評估不用plg管和用氯仿滴定來分離dna的研究的示意性表示。

圖29、30和31是描繪使用rneasy規(guī)程(不用plg管)和氯仿滴定來分離dna的一系列圖表。

圖32是描繪調整氯仿添加共分離dna和rna的圖表。

圖33是經設計以評估不用plg管和用氯仿滴定來分離dna的研究的示意性表示。

圖34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和44是描繪使用rneasy規(guī)程(不用plg管)和氯仿滴定來分離dna的一系列圖表。

圖45是描繪相分離中ph變化對dna分離的影響的圖表。

圖46是經設計以評估用ph滴定自水相分離dna的研究的示意性表示。

圖47是制備ph調節(jié)溶液的方法的示意性表示。

圖48是描繪對分離的rna和dna的nala擴增曲線的圖表。

圖49、50、51、52、53和54是描繪ph滴定對自水相分離dna的影響的一系列圖表。

圖55是描繪氯仿添加是確定水相的dna含量中的主導因素的圖表。

圖56是描繪rna信號不通過增加dna分離而受影響的圖表。

圖57是經設計以評估利用氯仿滴定和具有或不具有添加ph溶液自水相分離dna的研究的示意性表示。

圖58是制備ph調節(jié)溶液的方法的示意性表示。

圖59、60、61、62、63、64、65、66、67和68是描繪具有和不具有添加ph溶液的氯仿滴定對自水相分離dna的影響的一系列圖表。

圖69是描繪4℃或室溫qiazol旋轉步驟對使用可商購試劑盒分離rna的影響的圖表。

圖70是描繪4℃或室溫qiazol旋轉步驟對本公開所述方法的影響的圖表。

圖71和72是經設計以評估使用具有4℃或室溫qiazol旋轉步驟的可商購試劑盒來分離rna的研究的示意性表示和概述。

圖73、74和75是描繪4℃或室溫qiazol旋轉步驟對可商購試劑盒的影響的一系列圖表。

圖76和77是經設計以評估使用具有4℃或室溫qiazol旋轉步驟的exo52方法來分離rna的研究的示意性表示和概述。

圖78和79是描繪4℃或室溫qiazol旋轉步驟對本公開所述方法的影響的一系列圖表。

圖81是經設計以評估在1.5×至2.6×之間的變化的乙醇體積的影響的研究的示意性表示。

圖81和82是描繪在1.5×至2.6×之間的變化的乙醇體積對dna和rna分離的影響的一系列圖表。

圖83是描繪在結合步驟之前室溫下protk消化的結果的圖表。

圖84是經設計以評估在結合步驟之前室溫下protk消化的研究的示意性表示。

圖85和86是描繪在結合步驟之前室溫下protk消化的結果的一系列圖表。

圖87是描繪加樣容量在8ml血漿內的圖表。

圖88是描繪流出物不具有多達8ml血漿的突破點的圖表。

圖89是描繪對外泌體(exosome)和核小體而言不同結合容量的圖表。

圖90是經設計以評估加樣容量的研究的示意性表示。

圖91是描繪對外泌體和核小體而言不同結合容量的圖表。

圖92和93是描繪加樣容量在8ml血漿內的一系列圖表。

圖94是描繪流出物不具有多達8ml血漿的突破點的圖表。

圖95、96和97是描繪改變血漿加樣體積對dna和rna分離的影響的一系列圖表。

圖98是描繪流出物不具有多達8ml血漿的突破點的圖表。

圖99和100是描繪改變血漿加樣體積對dna和rna分離的影響的一系列圖表。

圖101、102、103、104、105和106是描繪對外泌體和核小體而言不同結合容量的一系列圖表。

圖107和108是描繪使用包括本公開所述方法和可商購試劑盒的不同分離技術來分離游離dna(cfdna)的一系列圖表。

圖109是經設計以比較使用本公開的方法與可商購試劑盒分離的cfdna的研究的示意性表示。

圖110和111是經設計以比較使用包括本公開的方法和可商購試劑盒的不同分離技術來分離cfdna的研究的示意性表示和概述。

圖112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122和123是描繪使用包括本公開所述方法和可商購試劑盒的不同分離技術來分離cfdna的一系列圖表。

圖124、125、126、127和128是描繪使用包括本公開的方法和可商購試劑盒的不同分離技術的cfdna拷貝數(shù)的比較的一系列圖和表。

圖129、130和131是經設計以評估使用allprep微量試劑盒來對分離的dna和rna進行下游分析的研究的示意性表示和概述。

圖132、133、134、135和136是描繪使用allprep微量試劑盒來對分離的dna和rna進行下游分析的一系列圖表。

圖137和138是描繪使用包括本公開所述方法和可商購試劑盒的不同分離技術來分離游離dna(cfdna)的一系列圖表。

圖139是經設計以比較使用本公開的方法和可商購試劑盒分離的cfdna的研究的示意性表示。

圖140、141、142、143、144、145和146是描繪使用包括本公開所述方法和可商購試劑盒的不同分離技術來分離游離dna(cfdna)的一系列圖表。

圖147、148和149是經設計以比較使用本公開的方法和可商購試劑盒分離的cfdna的研究的示意性表示。

圖150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169和170是描繪使用包括本公開所述方法和可商購試劑盒的不同分離技術來分離游離dna(cfdna)的一系列圖表。

圖171是描繪本公開所述方法始終勝過可商購cna試劑盒的系列圖表。

圖172、173和174是經設計以比較使用本公開的方法和可商購試劑盒分離的cfdna的研究的示意性表示。

圖175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195和196是描繪使用包括本公開所述方法和可商購試劑盒的不同分離技術來分離游離dna(cfdna)的一系列圖表。

圖197是描繪多個單獨的qiazol洗脫步驟對dna和rna分離的影響的圖表。

圖198是經設計以評估使用多個qiazol洗脫步驟來分離dna和rna的研究的示意性表示。

圖199、200、201和202是描繪多個單獨的qiazol洗脫步驟對dna和rna分離的影響的一系列圖表。

圖203是經設計以評估使用多個qiazol洗脫步驟來分離dna和rna的研究的示意性表示。

圖204、205和206是描繪多個單獨的qiazol洗脫步驟對dna和rna分離的影響的一系列圖表。

圖207是描繪具有乙醇沉淀的雙rneasy加樣步驟對dna和rna分離的影響的圖表。

圖208和209是經設計以評估使用具有乙醇沉淀的雙rneasy加樣步驟來分離dna和rna的研究的示意性表示和概述。

圖210和211是描繪具有乙醇沉淀的雙rneasy加樣步驟對dna和rna分離的影響的一系列圖表。

圖212是描繪不同下游柱對dna和rna分離的影響的圖表。

圖213是經設計以評估使用不同下游柱來分離dna和rna的研究的示意性表示。

圖214、215、216和217是描繪不同下游柱對dna和rna分離的影響的一系列圖表。

圖219是經設計以評估使用多個rneasy洗脫步驟來分離dna和rna的研究的示意性表示。

圖220、221、222和223是描繪多個rneasy洗脫步驟對dna和rna分離的影響的一系列圖表。

圖224是描繪血漿中核酸尺寸分布的一系列圖表。從1ml血漿中完整分離核酸經受rnasea消化(“cfdna”)、dnasei消化(“exorna”)或空白(mock)處理(“exo52”)。在反應提純(cleanup)之后，分離物中存在核酸的尺寸分布通過生物分析儀pico6000分析來測定。

圖225是描繪從2ml血漿中連續(xù)分離核酸的圖表。來自正常健康供體的血漿經過ex052柱，并且留在流出物中的物質使用可商購的exorneasy試劑盒(rna)或可商購的循環(huán)核酸試劑盒(dna)來分離。針對braf、kras和18s基因，作為δct的函數(shù)，將總產量相比于使用(rt)-qpcr的exo52(rna+dna)。誤差棒代表三個重復分離。

圖226是描繪exorna和cidna均大量貢獻從血漿中收獲的總核酸的一系列圖表。來自健康供體的1ml血漿使用可商購的exorneasy試劑盒(rna)或具有逆轉錄步驟(rna+dna)或不具有(dna)的exo52分離來分離。通過rt-qpcr的絕對定量呈現(xiàn)為箱形圖并且指示每毫升血漿的中值拷貝數(shù)，其中個別供體繪制為形狀。

圖227和228是描繪本文提供的exo52方法捕獲總循環(huán)核酸的能力的一系列圖表。將exo52方法與可商購的循環(huán)核酸dna分離試劑盒相比。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供分離游離dna(cfdna)和/或cfdna和包括至少來自微泡的rna的核酸的方法，所述方法通過將dna和微泡捕獲至表面，隨后裂解微泡以釋放其中含有的核酸、特別是rna，并且從捕獲表面洗脫dna和/或dna和包括至少rna的核酸來進行。微泡由真核細胞脫落，或質膜出芽至細胞外部。這些膜囊泡尺寸不均，具有從約10nm變化至約5000nm的直徑。由細胞脫落、直徑＜0.8μm的所有膜囊泡在本文中統(tǒng)稱為“微泡”。這些微泡包括微泡、微泡樣顆粒、前列腺小體(prostasome)、樹突小體(dexosome)、腫瘤小體(texosome)、核外粒體(ectosome)、癌小體(oncosome)、凋亡小體、逆轉錄病毒樣顆粒和人內源性逆轉錄病毒(herv)顆粒。由細胞內多泡體的胞吐釋放的小微泡(直徑大約10nm至1000nm，和更通常30nm至200nm)在本領域被稱為“微泡”。

分離dna和/或dna和包括至少來自微泡的rna的核酸的當前方法包括超速離心，超濾、例如使用100kd過濾器，聚合物沉淀技術，和/或基于尺寸的過濾。然而，存在對替代方法的需要，所述方法對分離微泡和任選地提取其中含有的核酸、優(yōu)選微泡rna高效和有效，以用于各種應用中，包括診斷目的。

稱為exo52dna和/或dna和rna分離方法和/或試劑盒的本文所提供的分離和提取方法和/或試劑盒使用基于旋轉柱的純化過程，所述過程使用結合游離dna和/或微泡的親和膜。本公開的方法和試劑盒允許平行運行大量臨床樣品的能力，在單個柱上使用0.2ml至多達4ml的體積。使用exo52程序分離的游離dna是高純的。分離的rna高純、受囊泡膜保護直至裂解，并且完整囊泡可從exo52膜洗脫。exo52程序能夠從血漿輸入中大致上耗盡所有游離dna，并且當相比于可商購的循環(huán)dna分離試劑盒時dna產量相等或更好。exo52程序能夠從血漿輸入中大致上耗盡所有mrna，并且當相比于超速離心或直接裂解時mrna/mirna產量相等或更好。與可商購試劑盒和/或先前的分離方法對比，exo52方法和/或試劑盒富集mirna的微泡結合部分，并且可容易擴展至大量的輸入材料。此放大能力允許對感性趣、低豐度轉錄物的研究。相比于市場上的其他可商購產品，本公開的方法和試劑盒提供由本文所提供實例所展現(xiàn)的獨特能力。

使用以下通用程序，exo52方法和試劑盒從生物樣品中分離和提取核酸，例如dna和/或dna和包括至少rna的核酸。首先，使包括cfdna和微泡部分的樣品結合至膜過濾器，并且洗滌過濾器。然后，使用苯酚基試劑來執(zhí)行核酸、例如dna和/或dna和rna的膜上裂解和釋放。然后，使用plg管執(zhí)行氯仿提取，接著是乙醇調節(jié)。然后，使核酸、例如dna和/或dna和rna結合至硅膠柱，洗滌并隨后洗脫。然后，提取的核酸、例如dna和/或dna和rna可受進一步分析，例如，使用各種下游分析法中的任何一種。

在一些實施方案中，所述方法包括以下步驟。旋轉柱中含有過濾器。在添加裂解試劑之前，使樣品結合至旋轉柱中的膜過濾器，并且旋轉柱隨后以大約500×g旋轉1min。然后，丟棄流出物，將緩沖液添加至旋轉柱，并且旋轉柱以大約5000×g再次旋轉5min來從柱中移除殘余體積。在此第二旋轉之后丟棄流出物。然后，旋轉柱與苯酚基裂解試劑接觸，并且以大約5000×g旋轉5min來收集含有裂解的微泡和捕獲的cfdna的勻漿。在一些實施方案中，裂解緩沖液是苯酚基裂解緩沖液。例如，裂解緩沖液是裂解試劑(qiagen)。然后，該勻漿經受核酸分離和提取。在一些實施方案中，在核酸分離和提取之前，將用于rna分離效率的對照、諸如q-β或本文所述的任何其他對照摻入勻漿。

在一些實施方案中，根據(jù)以下步驟來分離核酸。在添加裂解試劑之后，隨后將氯仿添加至勻漿，并且劇烈混合溶液持續(xù)短暫時間段。在一些實施方案中，將350μl氯仿添加至勻漿。然后，溶液在4℃下以12,000×g離心5min。然后，將上部水相轉移至新的收集管，并且將2體積的100％乙醇添加至上部水相，并且混合溶液。然后，可使用各種領域公認用于分離和/或提取核酸的方法中的任何一種來處理溶液。

然后，分離的核酸例如dna和/或dna和rna可使用各種下游分析中的任何一種來進行進一步分析。在一些實施方案中，使用dna和rna的組合檢測來提高可行動突變的靈敏度。在循環(huán)核酸中存在多個可檢測突變的潛在來源。例如，活腫瘤細胞是分離自樣品微泡部分的rna和dna的潛在來源，并且死腫瘤細胞是諸如凋亡囊泡dna和來自壞死腫瘤細胞的游離dna的游離dna來源的潛在來源。因為突變核酸在循環(huán)中相對稀少，所以檢測靈敏度的極大化變得非常重要。dna和rna的組合分離遞送綜合的臨床信息來評價疾病進展和患者對療法的響應。然而，與本文提供的方法和試劑盒對比，用于檢測循環(huán)核酸的可商購試劑盒僅能夠從血漿、即從死細胞中分離cfdna。如圖227-228中所示，exo52捕獲所有cfdna，并且組合exorna和cfdna比僅cfdna，exo52顯著檢測到更多拷貝。本領域普通技術人員將理解突變或其他生物標志的更多拷貝導致在鑒別突變和其他生物標志上增強的靈敏度和準確度。

如本文所使用，術語“核酸”指的是dna和rna。核酸可為單鏈或雙鏈的。在一些情況下，核酸是dna。在一些情況下，核酸是rna。rna包括但不限于：信使rna，轉移rna，核糖體rna，非編碼rna，微rna和herv元件。

如本文所使用，術語“生物樣品”指的是含有諸如dna、rna和蛋白質的生物材料的樣品。

在一些實施方案中，生物樣品可適合地包含來自受試者的體液。體液可為分離自受試者身體中任何部位、諸如像外圍位置的液體，包括但不限于：例如，血液，血漿，血清，尿液，痰，脊髓液，腦脊液，胸膜液，乳頭抽吸液，淋巴液，呼吸道、腸道和生殖泌尿道液，淚液，唾液，母乳，來自淋巴系統(tǒng)的液體，精液，器官內系統(tǒng)液，腹水，腫瘤囊液，羊水和細胞培養(yǎng)上清液，以及它們的組合。生物樣品還可包括糞便或盲腸樣品，或從其中分離的上清液。

在一些實施方案中，生物樣品可適合地包含細胞培養(yǎng)上清液。

在一些實施方案中，生物樣品可適合地包含來自受試者的組織樣品。組織樣品可分離自受試者身體中的任何部位。

體液的適合樣品體積在例如約0.1ml至約30ml液體的范圍內。液體體積可取決于幾個因素，例如，所使用液體的類型。例如，血清樣品的體積可為約0.1ml至約4ml，優(yōu)選約0.2ml至4ml。血漿樣品的體積可為約0.1ml至約4ml，優(yōu)選0.5ml至4ml。尿液樣品的體積可為約10ml至約30ml，優(yōu)選約20ml。

盡管本文提供的實例使用血漿樣品，但技術人員將理解這些方法可應用于各種生物樣品。

本公開的方法和試劑盒適合用于源自人受試者的樣品。本公開的方法和試劑盒適合用于源自人受試者的樣品。另外，本公開的方法和試劑盒還適合用于源自人受試者的樣品。本公開的方法和試劑盒適合用于源自諸如嚙齒動物、非人靈長類動物、寵物(例如，貓、狗、馬)和/或農場動物(例如，雞)的非人受試者的樣品。

術語“受試者”意圖包括顯示或預期具有含核酸顆粒的所有動物。在具體實施方案中，受試者為哺乳動物、人或非人靈長類動物、狗、貓、馬、奶牛、其他農場動物、或嚙齒動物(例如小鼠、大鼠、豚鼠等)。人受試者可為不具有可觀測異常、例如疾病的正常人類。人受試者可為具有可觀測異常、例如疾病的人類?？捎^測異?？捎扇祟愖约夯蛴舍t(yī)學專業(yè)人員觀測。術語“受試者”、“患者”和“個體”在本文中可交換使用。

盡管本文提供的工作實例將膜用作捕獲表面，但應理解捕獲表面的規(guī)格、例如微珠或過濾器(本文還稱為膜)不影響本文所提供方法從生物樣品中高效捕獲微泡的能力。

盡管本文提供的實例在提取步驟期間使用氯仿，但本領域普通技術人員將理解在核酸提取期間執(zhí)行與氯仿相同任務的任何化學品均可在本文所提供方法中使用。通過非限制性實例，用于提取步驟中的合適的化學品包括二氯甲烷、甲苯、己烷、mtbe和乙酸乙酯(etoac)。

各式各樣的表面能夠根據(jù)本文所提供的方法來捕獲微泡，但并非所有表面將捕獲微泡(一些表面不捕獲任何東西)。

本公開還描述了使用一次性塑料部件和離心設備來從生物或臨床樣品中分離和濃縮微泡的裝置。例如，所述裝置包括：柱，其包括捕獲表面(即，膜過濾器)；保持器，其將捕獲表面固定在外部釉料和內部管之間；和收集管。外部釉料包含大的網結構以使液體穿過，并且優(yōu)選處于柱的一端。內部管使捕獲表面原位保持，并且優(yōu)選為稍錐體狀。收集管可為可商購的，即，50mlfalcon管。柱優(yōu)選適合于旋轉，即，尺寸與標準離心機和微離心機相容。

在其中捕獲表面是膜的實施方案中，用于從生物樣品中分離微泡部分的裝置包含至少一個膜。在一些實施方案中，所述裝置包括一個、兩個、三個、四個、五個或六個膜。在一些實施方案中，所述裝置包括三個膜。在其中裝置包括多于一個膜的實施方案中，膜在柱的一端處全部直接彼此相鄰。在其中裝置包括多于一個膜的實施方案中，膜彼此全部相同，即，具有相同電荷和/或具有相同官能團。

應注意，通過過濾穿過小于微泡的孔徑來捕獲不是由本文所提供方法捕獲的主要機制。然而，過濾器孔徑仍然非常重要，例如，因為mrna在20nm過濾器上卡住并且不能回收，而微rna可容易地洗脫掉，并且例如因為過濾器孔徑是可利用表面捕獲區(qū)域中的重要參數(shù)。

本文所提供方法使用各種捕獲表面中的任何一種。在一些實施方案中，捕獲表面是膜，本文還稱為過濾器或膜過濾器。在一些實施方案中，捕獲表面是可商購的膜。在一些實施方案中，捕獲表面是帶電的可商購膜。在一些實施方案中，捕獲表面是中性的。在一些實施方案中，捕獲表面選自：pall公司的離子交換膜；sartoriusag的q膜；sartobindq或qmaxih；sartoriusag的d，sartoriusag的sartobind(s)，sartoriusag的q，sartoriusag的ida，sartoriusag的醛，sigma的de81，emdmillipore的快捕(fasttrap)病毒純化柱；thermoscientific*pierce強陽離子和陰離子交換旋轉柱。

在其中捕獲表面帶電的實施方案中，捕獲表面可為選自由以下組成的組的帶電過濾器：0.65um帶正電qpes真空過濾(millipore)，3-5um帶正電qrc旋轉柱過濾(sartorius)，0.8um帶正電qpes國產旋轉柱過濾(pall)，0.8um帶正電qpes注射器過濾(pall)，0.8um帶負電spes國產旋轉柱過濾(pall)，0.8um帶負電spes注射器過濾(pall)，和50nm帶負電尼龍注射器過濾(sterlitech)。優(yōu)選地，帶電過濾器不收容在注射器過濾裝置中，因為在這些實施方案中qiazol/rna更難從過濾器出來。優(yōu)選地，帶電過濾器收容在柱的一端。

在其中捕獲表面是膜的實施方案中，膜可由各種適合的材料制成。在一些實施方案中，膜是聚醚砜(pes)(例如，來自millipore或pall公司)。在一些實施方案中，膜是再生纖維素(rc)(例如，來自sartorius或pierce)。

在一些實施方案中，捕獲表面是帶正電的膜。在一些實施方案中，捕獲表面是q膜，其為帶正電膜和具有季胺的陰離子交換劑。例如，q膜用季銨官能化，r-ch2-n⁺(ch3)3。在一些實施方案中，捕獲表面是帶負電的膜。在一些實施方案中，捕獲表面是s膜，其為帶負電膜和具有磺酸基的陽離子交換劑。例如，s膜用磺酸官能化，r-ch2-so3^-。在一些實施方案中，捕獲表面是d膜，其為具有二乙胺基的弱堿性陰離子交換劑，r-ch2-nh⁺(c2h5)2。在一些實施方案中，捕獲表面是金屬鰲合膜。例如，膜是ida膜，用亞氨基二乙酸-n(ch2cooh^-)2官能化。在一些實施方案中，捕獲表面是多微孔膜，用醛基-cho官能化。在其他實施方案中，膜是弱堿性陰離子交換劑，具有二乙氨基乙基(deae)纖維素。并非所有帶電膜都適合用于本文所提供的方法中，例如，使用sartoriusvivapures膜旋轉柱分離的rna顯示rt-qpcr抑制，并且因此不適合于pcr相關的下游測定法。

在其中捕獲表面帶電的實施方案中，微泡可用帶正電過濾器分離。

在其中捕獲表面帶電的實施方案中，在微泡捕獲期間的ph為ph≤7。在一些實施方案中，ph大于4并且小于或等于8。

在其中捕獲表面是帶正電q過濾器的實施方案中，緩沖體系包括洗滌緩沖液，其包含250mmbistris丙烷，ph6.5-7.0。在其中捕獲表面是帶正電q過濾器的實施方案中，裂解緩沖液是qiazol。在其中捕獲表面是帶正電q過濾器的實施方案中，裂解緩沖液以一體積存在。在其中捕獲表面是帶正電q過濾器的實施方案中，裂解緩沖液以多于一體積存在。

取決于膜材料，膜孔徑范圍為3μm至20nm。

捕獲表面的表面電荷可為正、負或中性。在一些實施方案中，捕獲表面是一個或更多個帶正電微珠。

本文所提供的方法包括裂解試劑。在一些實施方案中，用于膜上裂解的藥劑是苯酚基試劑。在一些實施方案中，裂解試劑是胍鹽(guanidinium)基試劑。在一些實施方案中，裂解試劑是高鹽基緩沖液。在一些實施方案中，裂解試劑是qiazol。

本文所提供的方法包括各種緩沖液，包括加樣和洗滌緩沖液。加樣和洗滌緩沖液可具有高或低離子強度。鹽濃度、例如nacl濃度可為0至2.4m。緩沖液可包括各種組分。在一些實施方案中，緩沖液包括以下組分中一者或多者：tris，bis-tris，bis-tris-丙烷，咪唑，檸檬酸鹽，甲基丙二酸，乙酸，乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺(tea)和磷酸鈉。在本文所提供的方法中，加樣和洗滌緩沖液的ph是重要的。當在加樣之前血漿樣品設定至ph≤5.5時，過濾器趨向于阻塞(血漿將完全不旋轉經過柱)；并且在更高ph下微泡rna回收更低，由于微泡的不穩(wěn)定性。在中性ph下，來自微泡的rna回收是最佳的。在一些實施方案中，使用的緩沖液為1×濃度、2×濃度、3×濃度或4×濃度。例如，加樣或結合緩沖液為2×濃度，而洗滌緩沖液為1×濃度。

在一些實施方案中，所述方法包括一個或更多個洗滌步驟，例如，在使生物樣品與捕獲表面接觸之后。在一些實施方案中，將去污劑添加至洗滌緩沖液來促進移除非特異性結合(即，污染物、細胞碎片和循環(huán)蛋白復合體或核酸)，以獲得更純的微泡部分。適合使用的去污劑包括但不限于：十二烷基硫酸鈉(sds)，tween-20，tween-80，tritonx-100，nonidetp-40(np-40)，，brij-35，brij-58，辛基葡糖苷，辛基葡糖硫苷，chaps或chapso。

在一些實施方案中，捕獲表面、例如膜收容在用于以下的裝置內：用于離心，例如旋轉柱，或用于真空系統(tǒng)，例如真空過濾器保持器，或用于具壓過濾，例如注射器過濾器。在優(yōu)選實施方案中，捕獲表面收容在旋轉柱或真空系統(tǒng)中。

在提取核酸之前從生物樣品中分離微泡因以下理由而有利：1)從微泡中提取核酸提供選擇性分析通過將疾病或腫瘤特異性微泡與液體樣品內的其他微泡分離開所獲得的疾病或腫瘤特異性核酸的機會；2)相比于通過不首先分離微泡而直接從液體樣品中提取核酸所獲得的產量/完整性，含核酸微泡產生核酸物種的顯著更高的產量與更高的完整性；3)可擴展性，例如，檢測以低水平表達的核酸，靈敏度可通過使用本文所述的方法從更大體積的樣品濃縮微泡來提高；4)提取的核酸的更純或更高質量/完整性，因為天然發(fā)現(xiàn)于生物樣品內的蛋白質、脂質、細胞碎片、細胞和其他潛在污染物和pcr抑制劑在核酸提取步驟之前被排除；以及5)可利用核酸提取方法的更多選擇，因為分離的微泡部分比起始樣品體積可具有更小的體積，使得有可能使用小體積柱過濾器來從這些部分或小丸中提取核酸。

本領域中已描述了從生物樣品中分離微泡的數(shù)種方法。例如，在raposo等人的論文(raposo等人，1996)、skog等人的論文(skog等人，2008)和nilsson等人的論文(nilsson等人，2009)中描述了差速離心的方法。在美國專利號6,899,863和6,812,023中描述了離子交換和/或凝膠滲透層析的方法。在美國專利號7,198,923中描述了蔗糖密度梯度或細胞器電泳的方法。在taylor和gerceltaylor的論文(taylor和gercel-taylor，2008)中描述了磁激活細胞分選(macs)的方法。在cheruvanky等人的論文(cheruvanky等人，2007)中描述了納米膜超濾濃縮的方法。在miranda等人的出版物(miranda等人，2010)中描述了percoll梯度分離的方法。此外，微泡可通過微流體裝置從受試者的體液中鑒別和分離(chen等人，2010)。在核酸生物標志的研究和開發(fā)以及商業(yè)應用中，期望以一致、可靠和實用的方式從生物樣品中提取高質量核酸。

因此，本發(fā)明的目的是提供用于從諸如體液的生物樣品中快速和容易地分離含核酸顆粒并且從分離的顆粒中提取高質量核酸的方法。本發(fā)明所述方法可適合于改裝和合并入緊湊裝置或儀器以用于實驗室或臨床環(huán)境、或在實戰(zhàn)中。

在一些實施方案中，在從生物樣品中分離和提取核酸、例如dna和/或dna和rna之前，樣品未經預處理。

在一些實施方案中，在執(zhí)行微泡的分離、純化或富集之前，樣品經受預處理步驟來移除生物樣品中存在的不需要的大顆粒、細胞和/或細胞碎片和其他污染物。預處理步驟可經過一個或更多個離心步驟(例如，差速離心)或一個或更多個過濾步驟(例如，超濾)、或它們的組合來實現(xiàn)。在執(zhí)行多于一個離心預處理步驟的情況下，生物樣品可首先以較低速度并隨后以較高速度離心。需要時，可進行進一步適合的離心預處理步驟。替代地或除一個或更多個離心預處理步驟以外，生物樣品可經過濾。例如，生物樣品可首先以20,000g離心1小時來移除不需要的大顆粒；然后，樣品可過濾，例如，經過0.8μm過濾器。

在一些實施方案中，樣品經預過濾來排除大于0.8μm的顆粒。在一些實施方案中，樣品包括添加劑，諸如edta、檸檬酸鈉、和/或檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡聚糖。優(yōu)選地，樣品不含有肝素，因為肝素可負面影響rt-qpcr和其他核酸分析。在一些實施方案中，在純化以及/或者核酸分離和/或提取之前，樣品與緩沖液混合。在一些實施方案中，緩沖液是xbp緩沖液。

在一些實施方案中，在使生物樣品與捕獲表面接觸之前或之后，執(zhí)行一個或更多個離心步驟來分離微泡并且濃縮分離自生物部分的微泡。例如，樣品在4℃下以20,000g離心1小時。為了移除不需要的大顆粒、細胞和/或細胞碎片，可以約100-500g、優(yōu)選約250-300g的低速離心樣品。替代地或另外，可以更高速度離心樣品。適合的離心速度高達約200,000g；例如約2,000g至低于約200,000g。優(yōu)選高于約15,000g和低于約200,000g或者高于約15,000g和低于約100,000g或者高于約15,000g和低于約50,000g的速度。更優(yōu)選約18,000g至約40,000g或約30,000g、和約18,000g至約25,000g的速度。特別優(yōu)選約20,000g的離心速度。一般而言，離心的適合時間為約5分鐘至約2小時，例如，約10分鐘至約1.5小時，或更優(yōu)選約15分鐘至約1小時。約0.5小時的時間是優(yōu)選的。有時優(yōu)選生物樣品以約20,000g經受離心約0.5小時。然而，上述速度和時間可適合地以任何組合來使用(例如，約18,000g至約25,000g，或約30,000g至約40,000g，持續(xù)約10分鐘至約1.5小時，或持續(xù)約15分鐘至約1小時，或持續(xù)約0.5小時，等等)。一個或更多個離心步驟可在低于環(huán)境溫度下進行，例如在約0-10℃下，優(yōu)選約1-5℃，例如約3℃或約4℃。

在一些實施方案中，在使生物樣品與捕獲表面接觸之前或之后，執(zhí)行一個或更多個過濾步驟?？刹捎镁哂屑s0.1至約1.0μm范圍內的尺寸的過濾器，優(yōu)選約0.8μm或0.22μm。還可使用具有減小孔隙度的過濾器、用連續(xù)過濾來執(zhí)行過濾。

在一些實施方案中，在使生物樣品與捕獲表面接觸之前或之后，執(zhí)行一個或更多個濃縮步驟，以便減少層析階段期間待處理樣品的體積?？赏ㄟ^以高速，例如10,000g與100,000g之間離心樣品來濃縮，以使微泡沉積。這可由一系列差速離心組成。所得小丸中的微泡可用較小體積和在適合緩沖液中重構以用于過程的后續(xù)步驟。濃縮步驟還可通過超濾來執(zhí)行。實際上，這種超濾濃縮生物樣品并且執(zhí)行微泡部分的另外純化。在另一個實施方案中，過濾是超濾，優(yōu)選切向超濾。切向超濾由使溶液在兩個隔室(濾出液和滯留物)之間濃縮和分級組成，兩隔室通過具有確定截止閾的膜分開。該分離通過在滯留物隔室中施加流并且在此隔室與濾出液隔室之間施加跨膜壓力來進行?？墒褂貌煌到y(tǒng)來執(zhí)行超濾，諸如螺旋膜(millipore，amicon)、平板膜或空心纖維(amicon，millipore，sartorius，pall，gf，sepracor)。在本發(fā)明的范圍內，使用具有低于1000kda、優(yōu)選100kda與1000kda之間、或甚至更優(yōu)選100kda與600kda之間的截止閾的膜是有利的。

在一些實施方案中，在使生物樣品與捕獲表面接觸之前或之后，執(zhí)行一個或更多個尺寸排阻層析步驟或凝膠滲透層析步驟。為了執(zhí)行凝膠滲透層析步驟，優(yōu)選使用選自以下的支撐物：二氧化硅，丙烯酰胺，瓊脂糖，葡聚糖，乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物或者它們的混合物，例如瓊脂糖-葡聚糖混合物。例如，此類支撐物包括但不限于：200hr(pharmacia)，tskg6000(tosohaas)或s(pharmacia)。

在一些實施方案中，在使生物樣品與捕獲表面接觸之前或之后，執(zhí)行一個或更多個親和層析步驟。一些微泡還可由某些表面分子來表征。因為微泡形成自細胞質膜的出芽，所以這些微泡通常共享其所來源細胞上發(fā)現(xiàn)的許多相同表面分子。如本文所使用，“表面分子”統(tǒng)指表面上或者微泡膜中或上發(fā)現(xiàn)的抗原、蛋白質、脂質、碳水化合物和標志。這些表面分子可包括例如，受體、腫瘤相關抗原、膜蛋白修飾(例如，糖基化結構)。例如，從腫瘤細胞中出芽的微泡經常在其細胞表面上展示腫瘤相關抗原。因而，親和層析或親和排阻層析還可與本文所提供方法組合使用以從特定供體細胞類型中分離、鑒定和或富集微泡的特定群體(al-nedawi等人，2008；taylor和gercel-taylor，2008)。例如，腫瘤(惡性或非惡性)微泡攜帶腫瘤相關表面抗原，并且可經由這些特異性腫瘤相關表面抗原來檢測、分離和/或富集。在一個實例中，表面抗原是上皮細胞粘附分子(epcam)，其對來自具有長、結腸直腸、胸、前列腺、頭和頸、和肝起源而非血液細胞起源的癌具有特異性(balzar等人，1999；went等人，2004)。另外，腫瘤特異性微泡還可由缺乏某些表面標志諸如cd80和cd86來表征。在這些情況下，具有這些標志的微泡可例如通過親和排阻層析來排除以用于腫瘤特異性標志的進一步分析。親和層析可例如通過使用不同的支撐物、樹脂、微珠、抗體、適體、適體類似物、分子印記的聚合物、或本領域已知特異性靶向微泡上所需表面分子的其他分子來完成。

任選地，在微泡分離或核酸提取之前，對照顆粒可被添加至樣品以充當評估微泡純化和/或核酸提取的效率或質量的內部對照。本文所述的方法提供高效分離和對照顆粒連同微泡部分。這些對照顆粒包括q-β噬菌體、病毒顆粒、或含有可天然存在或由重組dna技術工程化的對照核酸(例如，至少一個對照靶基因)的任何其他顆粒。在一些實施方案中，對照顆粒的量在添加至樣品之前是已知的。對照靶基因可使用實時pcr分析來定量。可使用對照靶基因的定量來確定微泡純化或核酸提取過程的效率或質量。

優(yōu)選地，對照顆粒是q-β噬菌體，本文中稱為“q-β顆?！?。在本文所述方法中使用的q-β顆?？蔀樘烊淮嬖诘牟《绢w?；蚩蔀橹亟M或工程病毒，其中病毒顆粒的至少一個組分(例如，基因組或外殼蛋白的部分)通過本領域已知的重組dna或分子生物學技術來合成。q-β是光滑病毒科家族的成員，特征為由編碼以下四種病毒蛋白的3個基因組成的線性單鏈rna基因組：外殼蛋白，成熟蛋白，裂解蛋白和rna復制酶。由于其與平均微泡尺寸類似，可使用如本文所述相同的用來分離微泡的純化方法從生物樣品中容易地純化q-β。另外，q-β病毒單鏈基因結構的低復雜度有利于其用作基于擴增的核酸分析中的對照。q-β顆粒含有待檢測或測量的對照靶基因或對照靶序列以對樣品中q-β顆粒的量進行定量。例如，對照靶基因是q-β外殼蛋白基因。在將q-β顆粒添加至生物樣品之后，使用本文所述的提取方法，來自q-β顆粒的核酸與來自生物樣品的核酸一起被提取。q-β對照靶基因的檢測可由rt-pcr分析判定，例如，同時利用一個或更多個感興趣的生物標志?？墒褂脤φ瞻谢蛞?0倍稀釋的至少2、3或4個已知濃度的標準曲線來確定拷貝數(shù)?？杀容^檢測的拷貝數(shù)和添加的q-β顆粒的量來確定分離和/或提取過程的質量。

在優(yōu)選實施方案中，在核提取之前將q-β顆粒添加至尿液樣品。例如，在超濾之前和/或在預過濾步驟之后，將q-β顆粒添加至尿液樣品。

在一些實施方案中，將50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1,000或5,000個拷貝的q-β顆粒添加至體液樣品。在優(yōu)選實施方案中，將100個拷貝的q-β顆粒添加至體液樣品?？苫趒-β噬菌體感染靶細胞的能力來計算q-β顆粒的拷貝數(shù)。因此，q-β顆粒的拷貝數(shù)與q-β噬菌體的菌落形成單位相關。

核酸提取

本發(fā)明涉及使用捕獲表面以實現(xiàn)微泡的改進的分離、純化或富集。本文所公開的方法提供高度富集的微泡部分以用于從所述微泡中提取高質量核酸。通過本文所述方法獲得的核酸提取物可用于其中需要或優(yōu)選高質量核酸提取物的各種應用，諸如用于疾病或醫(yī)療狀況的診斷、預后或監(jiān)測中。

最近的研究揭示了微泡內的核酸具有作為生物標志的作用。例如，wo2009/100029尤其描述了使用提取自gbm患者血清中微泡的核酸以實現(xiàn)醫(yī)學診斷、預后和療法評估。wo2009/100029還描述了使用提取自人尿液中微泡的核酸以實現(xiàn)相同目的。使用提取自微泡的核酸被認為潛在地規(guī)避對活檢的需要，突出了微泡生物學的巨大診斷潛能(skog等人，2008)。

分離的微泡的質量或純度可直接影響提取的微泡核酸的質量，然后直接影響用于疾病診斷、預后和/或監(jiān)測的生物標志分析的效率和靈敏度?？紤]到臨床領域中準確和靈敏診斷試驗的重要性，需要從生物樣品中分離高度富集的微泡部分的方法。為了解決此需要，本發(fā)明提供從生物樣品中分離微泡的方法以用于從生物樣品中提取高質量核酸。如本文所顯示的，高度富集的微泡部分通過本文所述的方法從生物樣品中分離，并且其中高質量核酸隨后從高度富集的微泡部分中提取。這些高質量提取核酸可用于測量或評價生物標志的存在或缺少，以輔助疾病或其他醫(yī)療狀況的診斷、預后和/或監(jiān)測。

如本文所使用，關于核酸提取的術語“高質量”意指其中能夠優(yōu)選以大約1∶1至大約1∶2、并且更優(yōu)選大約1∶2的比率檢測到18s和28srrna的提取。理想地，通過本文所述方法獲得的高質量核酸提取物還將具有對于低蛋白生物樣品(例如，尿液)而言大于或等于5、或者對于高蛋白生物樣品(例如，血清)而言大于或等于3的rna完整數(shù)，和來自20ml低蛋白生物樣品或1ml高蛋白生物樣品的大于或等于50pg/ml的核酸產量。

期望高質量rna提取，因為rna降解可不利地影響提取的rna的下游評價，諸如在基因表達和mrna分析中、以及諸如小rna和微rna的非編碼rna的分析中。本文所述的新方法允許從分離自生物樣品的微泡中提取高質量核酸以使得可執(zhí)行微泡內核酸的準確分析。

在從生物樣品中分離微泡之后，可從分離或富集的微泡部分中提取核酸。為了實現(xiàn)此，在一些實施方案中，微泡可首先被裂解。微泡的裂解和核酸的提取可利用本領域已知的各種方法來實現(xiàn)。在一些實施方案中，可根據(jù)本領域已知的標準程序和技術使用苯酚：氯仿來實現(xiàn)核酸提取。此類方法還可利用核酸結合柱來捕獲微泡內含有的核酸。一旦結合，核酸可隨后使用適合破壞核酸與結合柱之間相互作用的緩沖液或溶液來洗脫，從而成功洗脫核酸。

在一些實施方案中，核酸提取方法還包括去除或減輕阻止從生物樣品中提取高質量核酸的不利因素的步驟。此類不利因素是各種各樣的，因為不同生物樣品可含有各種類的不利因素。在一些生物樣品中，諸如過多dna的因素可影響從此類樣品中提取核酸的質量。在其他樣品中，諸如過多內源性rnase的因素可影響從此類樣品中提取核酸的質量。可使用許多試劑和方法來去除這些不利因素。這些方法和試劑在本文中統(tǒng)稱為“提取增強操作”。在一些情況下，提取增強操作可涉及向生物樣品添加核酸提取增強劑。為了去除諸如內源性rnase的不利因素，如本文所定義的此類提取增強劑可包括但不限于：rnase抑制劑，諸如superase-in(可商購自ambion公司)或rnaseinplus(可商購自promega公司)，或以類似方式起作用的其他試劑；蛋白酶(可充當rnase抑制劑)；dnase；還原劑；誘餌底物諸如合成rna和/或載體rna；可結合rnase的可溶受體；小干擾rna(sirna)；rna結合分子，諸如抗rna抗體、堿性蛋白或伴侶蛋白；rnase變性物質，諸如高克分子滲透壓濃度溶液、去污劑，或它們的組合。

例如，提取增強操作可包括在提取核酸之前向生物樣品和/或分離的微泡部分添加rnase抑制劑；優(yōu)選rnase抑制劑具有以下濃度：對于體積等于或大于1μl的樣品而言大于0.027au(1×)；或者，對于等于或大于1μl的樣品而言大于或等于0.135au(5×)；或者，對于等于或大于1μl的樣品而言大于或等于0.27au(10×)；或者，對于等于或多于1μl的樣品而言大于或等于0.675au(25×)；以及或者，對于等于或大于1μl的樣品而言大于或等于1.35au(50×)；其中，1×濃度指的是其中使用0.027au或更多rnase抑制劑來處理分離自1μl或更多體液的微泡的酶促條件，5×濃度指的是其中使用0.135au或更多rnase抑制劑來處理分離自1μl或更多體液的微泡的酶促條件，10×蛋白酶濃度指的是其中使用0.27au或更多rnase抑制劑來處理分離自1μl或更多體液的顆粒的酶促條件，25×濃度指的是其中使用0.675au或更多rnase抑制劑來處理分離自1μl或更多體液的微泡的酶促條件，以及50×蛋白酶濃度指的是其中使用1.35au或更多rnase抑制劑來處理分離自1μl或更多體液的顆粒的酶促條件。優(yōu)選地，rnase抑制劑是蛋白酶，在該情況下，1au是釋放對應于每分鐘1μmol酪氨酸的福林陽性氨基酸和肽的蛋白酶活性。

這些增強劑可以各種方式行使其功能，例如通過抑制rnase活性(例如，rnase抑制劑)，通過蛋白質的遍在降解(例如，蛋白酶)，或通過結合和保護rna的伴侶蛋白(例如，rna結合蛋白)。在所有情況下，此類提取增強劑去除或至少減輕生物樣品中或與分離的顆粒相關聯(lián)的一些或所有不利因素，否則它們將阻止或干擾從分離的顆粒中高質量提取核酸。

在一些實施方案中，可使用所提取18s和28srrna的定量來確定核酸提取的質量。

核酸生物標志的檢測

在一些實施方案中，提取的核酸包含dna和/或dna和rna。在其中提取的核酸包含dna和rna的實施方案中，rna在進一步擴增之前優(yōu)選逆轉錄成互補dna(cdna)。此類逆轉錄可單獨或與擴增步驟組合執(zhí)行。組合逆轉錄和擴增步驟的方法的一個實例是逆轉錄聚合酶鏈式反應(rt-pcr)，其可進一步修飾為定量的，例如如美國專利號5,639,606中所描述的定量rt-pcr，所述專利通過引用并入本文以對此示教。所述方法的另一個實例包括兩個單獨的步驟：逆轉錄以使rna轉換成cdna的第一步和使用定量pcr量化cdna量的第二步驟。如隨后的實施例中所展現(xiàn)的，使用本文所公開的方法提取自含核酸顆粒的rna包括許多種轉錄物，包括但不限于：核糖體18s和28srrna，微rna，轉移rna，與疾病或醫(yī)療狀況相關聯(lián)的轉錄物，和對于醫(yī)療狀況的診斷、預后和監(jiān)測而言重要的生物標志。

例如，rt-pcr分析確定對每個反應的ct(循環(huán)閾)值。在rt-pcr中，通過熒光信號的積累來檢測陽性反應。ct值定義為熒光信號跨越閾(即，超過背景水平)所需的循環(huán)數(shù)。ct水平與樣品中靶核酸或對照核酸的量成反比(即，ct水平越低，樣品中對照核酸的量越大)。

在另一個實施方案中，可使用各種領域公認技術中的任何者，包括但不限于rt-pcr來測量對照核酸的拷貝數(shù)。對照核酸的拷貝數(shù)可使用本領域已知的方法來確定，諸如通過生成和利用校準或標準曲線。

在一些實施方案中，一個或更多個生物標志可為一種遺傳畸變或遺傳畸變的集合，本文中用來指含核酸顆粒內的核酸量以及核酸變體。具體地，遺傳畸變包括但不限于：一個基因(例如，癌基因)或一組基因的過表達，一個基因(例如，腫瘤抑制子基因，諸如p53或rb)或一組基因的低表達，替代地產生一個或一組基因的剪接變體，基因拷貝數(shù)變體(cnv)(例如，dna雙微小體)(hahn，1993)，核酸修飾(例如，甲基化、乙?；土姿峄?，單核苷酸多態(tài)性(snp)，染色體重排(例如，倒位、缺失和重復)，和一個或一組基因的突變(插入、缺失、重復、錯義、無義、同義或任何其他核苷酸變化)，所述突變在許多情況下最終影響基因產物的活性和功能，導致替代的轉錄剪接變體和/或基因表達水平的變化，或者前述任何情況的組合。

分離的顆粒中存在核酸的分析是定量和/或定性的。對于定量分析而言，用本領域已知的方法(下文中描述)測量分離的顆粒內感興趣的特定核酸的相對或絕對量(表達水平)。對于定性分析而言，用本領域已知的方法鑒定分離的微泡內感興趣的特定核酸的物種是野生型還是變體。

本發(fā)明還包括從生物樣品中分離微泡以實現(xiàn)高質量核酸提取的新方法的各種用途：(i)輔助受試者的診斷，(ii)監(jiān)測受試者中疾病或其他醫(yī)療狀況的進展或復發(fā)，或(iii)輔助對于經受或考慮對疾病或其他醫(yī)療狀況治療的受試者而言治療功效的評估；其中確定了得自所述方法的核酸提取物中一種或更多種生物標志的存在或缺少，并且所述一種或更多種生物標志分別與疾病或其他醫(yī)療狀況的診斷、進展或復發(fā)、或治療功效相關聯(lián)。

用于從生物樣品中分離微泡的試劑盒

本發(fā)明的一個方面進一步涉及用于本文所公開方法中的試劑盒。所述試劑盒包含捕獲表面裝置，所述裝置足夠使來自生物樣品的微泡與也存在于生物樣品中的不需要的顆粒、碎片和小分子分離。本發(fā)明還任選地包括用于在分離和任選后續(xù)核酸提取過程中使用前述試劑的說明書。

實施例

盡管本文提供的實施例使用各種膜和裝置以用于離心和/或過濾目的，但要理解的是這些方法可與允許高效捕獲微泡和釋放其中含有的核酸、特別是rna的任何捕獲表面和/或收容裝置一起使用。

實施例1：dna的exo52分離，以及rna和dna的共分離

此實施例展現(xiàn)exo52方法從血漿樣品中分離所有dna的能力。應注意，在本文中呈現(xiàn)的一些附圖中，已使用各種術語來鑒別前驅方法與本文中稱為exo52的分離方法。例如，一些附圖包括諸如舊exo52、exo52.1和它們的變化形式的術語。這些較早版本僅僅提供為比較并且用來展現(xiàn)使用本公開的exo52方法實現(xiàn)了更好的分離。術語exo52.2的使用是其中rna和dna提取在單個管中執(zhí)行的exo52方法。

還可使用exo52柱來從血漿樣品中分離所有dna。利用exo52柱進行除rna之外的dna分離的兩種方法描繪于圖1和圖2中。具體來說，兩種方法之間的差異在于在exo52中rna和dna提取組合于一個管中，以實現(xiàn)可用性的簡易、規(guī)程的流線化和提高可再現(xiàn)性。圖3顯示出exo50rna+dna中1.5ct的增加(exo52)。exo50是用于從生物樣品諸如像血漿中的微泡中分離rna的方法。此方法描述于pct公開號wo2014/107571中。圖4顯示出在相分離期間增加氯仿的量增加了回到水相的dna，以使得利用正常exo50程序來共分離dna。在相分離期間進一步優(yōu)化ph水平也向制備物增加dna，如圖5中所示。

因此，可使用本公開的方法來從血漿樣品中分離所有dna。dna回收自相分離后qiazol裂解的較低疏水相。本公開的方法(例如，如exo52中的兩個管或單個管)對于相同樣品體積而言以類似水平分離rna和dna，并且rna和dna可彼此分離。本公開的這些方法比例如qiagen的可商購分離試劑盒捕獲相同或更多mrna和多得多的mirna。

exo52還可用于rna和dna的共純化。如本文所使用，除非另外指定，否則exo52指的是以下規(guī)程。

樣品制備：exo52程序可用來使用0.2-4ml血漿或血清從外泌體和其他微泡中分離rna和dna。建議僅使用預過濾的血漿或血清，以排除大于0.8μm的顆粒。相容血漿管的清單包括具有添加劑edta、檸檬酸鈉和檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡聚糖的血漿。含有肝素的血漿可抑制rt-qpcr。

然后，將樣品(單獨地或用結合緩沖液稀釋的)加樣于exo52旋轉柱上，并且以500×g旋轉1min。丟棄流出物并且將柱放回同一收集管中。然后，添加洗滌緩沖液，并且exo52柱以5000×g旋轉5min來從柱中移除殘余體積。注意：在離心之后，從收集管中移除exo52旋轉柱以使得柱不接觸流出物。然后，將旋轉柱轉移至全新收集管，并且將700μlqiazol添加至膜。然后，旋轉柱以5000×g旋轉5min來收集含有裂解的外泌體的勻漿。然后，將勻漿轉移至plg管。

然后，將350μl氯仿添加至含有勻漿的管，并且劇烈搖晃15s。然后，將含有勻漿的管在室溫下保持2-3min，接著在4℃下以12,000×g離心5min。在離心之后，如果同一離心機將用于下一離心步驟，則將離心機加熱至室溫(15-25℃)。

將上部水相轉移至新收集管，避免轉移任何中間相物質。然后，添加2體積的100％乙醇，并且通過來回吸液數(shù)次并且不使用離心機來充分混合。然后，將700μl樣品，包括可能已形成的任何沉淀，吸上來至2ml收集管中的rneasyminelute旋轉柱(cat.#1026497)中，接著在室溫下(15-25℃)以≥8000×g(≥10,000rpm)離心15s。丟棄流出物。對樣品的剩余部分重復這些步驟，并且丟棄流出物。

exo52用于從生物樣品中分離和檢測dna。囊泡rna被認為來源于例如病變組織中的活細胞。游離dna(cfdna)被認為來源于例如病變組織中壞死細胞的死細胞。因此，cfdna可用作治療響應的指示物，而rna是抗性突變在上升的指示物。

exo52用于檢測血液中的罕見突變，因為exo52提供了可應用于足夠量核酸的足夠靈敏的方法。生物液體中實際dna和rna分子的量非常有限，并且exo52提供提取血液中所有與突變檢測有關的分子的分離方法，所述突變檢測以對有效下游處理和/或分析足夠小的體積進行。

圖13-223(在僅此實施例中稱為“附圖”)展現(xiàn)出exo52方法的特異性和靈敏度。

研究已表明exo50/52柱結合血漿中的所有dna，但使dna離開苯酚相的程序不產生令人滿意的結果，因為分離程序會變化很大。本文所提供的方法允許從exo50/52柱的膜中可再現(xiàn)和高效地分離和/或提取dna。

利用plg管的exo52分離的三個重復中的兩個顯示出與可商購cfdna試劑盒幾乎相同的ct值。不用plg管的exo52分離的三個重復中的一個顯示出與cfdna試劑盒幾乎相同的ct值。貧化的血漿(不用2×結合緩沖液的血漿exo50流出物)不含有大量dna(18s與正常分離有約9ct差異)。幾乎所有dna結合至exo50柱。

如附圖中所示，向exo52方法添加氯仿允許rna和dna兩者的共分離，并且添加氯仿不損害rna的檢測或分離。

關于rna分離，確定了如果使用rna特異性分析，添加更多氯仿不影響rna分離。當添加更多氯仿時，dna特異性分析將產生較低ct，因為dna在水相中。

關于dna分離，在添加更多氯仿的情況下dna檢測分析的ct在水相分離中升高并且在exo52苯酚相dna分離中降低。

自苯酚相的exo50分離產生最低ct值(＝最高dna產量)。90μl氯仿產生來自苯酚的相最佳的dna產量。

此外，不用plg管，未觀測到dna污染時的氯仿比率大約為0.13×。

如附圖中所示，在pc提取期間，350μl氯仿足夠將所有dna從exo52柱添加至水相。更高的氯仿量可能干擾rna分離。

如附圖中所示，在添加更多氯仿的情況下水相中dna產量升高，而在苯酚相中dna產量降低(exo52dna分離)。相比于自苯酚相的exo52dna分離，自水相分離dna產生更多dna。在移除上部相之后，很少dna呈現(xiàn)為保持在苯酚相中或剩余水相中，因為在不使用plg管的情況下難以移除整個相。在rt反應(最終20μlrt混合物中10μlexo50洗脫物)和1∶2稀釋的exo50洗脫物中dna產量類似。dna似乎不與逆轉錄混合物反應。

使用僅rnagapdh分析重復研究來看是否僅rnagapdh分析受增加的氯仿添加的影響。增加氯仿添加，rna未受影響。還使用gapdh_rna_dna分析進行了研究，其顯示出無rna信號被dna替換(約2ct差異)。

braf分析顯示出通過水相中存在dna，exo50rna部分中信號2×提高。gapdh分析并不顯示exo50rna成分中dna的明顯累加效應，因為所增加的拷貝與rna拷貝相比是微小的。在此rna與dna拷貝之間差異明顯的情況下，可表明無rna信號的替換。

進行研究來確定相分離中ph變化的影響(如果存在的話)。ph的調整提供用于向水相添加dna的替代工具。發(fā)現(xiàn)ph過高干擾rna分離。

高ph似乎擾亂ba。例如，來自10nnaoh樣品的ba圖譜顯示出最高dna峰但極低fu([fu]＝2相比于[fu]＝40)。高ph似乎擾亂rt反應。水相ph升高在exo50dna分離中產生更低ct值，而在exo52dna分離中產生更高值，但相比于氯仿滴定而言苯酚相中留下更高的dna量。

降低ph能夠從exo52苯酚相中移除dna并且富集在水相中。在rt中dna未受損。在最高ph下rna受損。在三個最高ph步驟處ba受影響。

如附圖中所示，氯仿添加是確定水相dna含量的主導因素。高ph的正面效應僅在低氯仿水平下可見。通過將dna添加至水相，rna信號不受影響。

如附圖中所示，不存在ph溶液對dna拷貝數(shù)的累加效應，并且此外所需氯仿量無需變動以將dna帶入水相。樣品相比于不用ph溶液處理的樣品甚至產生更低拷貝數(shù)。只有用90μl處理的樣品產生較高拷貝數(shù)。ph溶液和較高氯仿量不影響rna分離(mrna)。在整個滴定期間，相比于不用ph溶液處理的樣品，用ph溶液處理的樣品產生稍低的拷貝數(shù)(除了90μl氯仿樣品)。

如附圖中所示，在室溫下qiazol旋轉提高水相中dna物質的百分率。當在exo52程序中使用較高量氯仿時情況并非如此。

qiazol離心步驟造成水相中的dna污染，但僅在不用plg管的樣品中。具有在室溫下的離心步驟的plg管樣品還顯示出稍多dna，但拷貝數(shù)低于loq＝32拷貝。離心步驟的溫度不影響mrna和mirna分離。

在室溫下qiazol旋轉不向正常exo52dna分離累加dna。就旋轉溫度而言不存在ct值的差異。離心步驟的溫度不影響mrna和mirna分離。

如附圖中所示，從exo52至rneasy旋轉柱的dna的結合和洗脫并不取決于1.5×體積至2.6×體積范圍內的乙醇濃度。

如附圖中所示，當使用更高乙醇濃度時，exo52的性能不提高。在整個乙醇滴定期間，所有三種分析的ct值保持恒定。rna分離的預調節(jié)步驟中的乙醇濃度不影響cfdna的回收。

如附圖中所示，血漿樣品的蛋白酶k(protk)消化特定導致rna信號損失，但protk處理不影響dna產量，因為對于所有樣品而言獲得了相同ct。

如附圖中所示，exo52的dna加樣容量未達到8ml血漿，因為dna的產量仍線性升高并且流出物中不存在可檢測的dna。這與達到4ml的囊泡線性加樣容量形成對比。流出物(ft)中未檢測到cfdna，但看到rna從2ml向上積累。對于dna而非rna而言，樣品輸出是線性的。rna與dna相比具有不同的飽和點。向程序添加plg盆被發(fā)現(xiàn)略微提高產量。當相比于可商購cna試劑盒時，exo52方法增加rna拷貝。

在一些實施方案中，所述方法使用僅基于硫氰酸胍的提取緩沖液來從exo52柱中提取rna和dna。

如針對rna分離的附圖中所示，rlt+高dtt56℃的2重復中的1個產生預期ct值。重復之間的變化可能已由添加加樣混合物后阻塞了rneasy膜造成。對于rlt+高dtt56℃而言，ba圖譜顯示出對留在柱上的數(shù)據(jù)點極低的rna濃度，但僅一個rna分離產生預期ct值。

如針對dna分離的附圖中所示，對于dna檢測分析而言，allprepdna柱產生非常高的拷貝數(shù)。留在柱上的數(shù)據(jù)點也顯示出非常高的ct值。dna似乎通過allprepdna旋轉柱由高截止(15-30kb)引起丟失。cfdna的尺寸通常在35bp-10kb范圍內。

所述附圖還展現(xiàn)使用各種dna或dna/rna分離程序來分離微rna。與可商購cna試劑盒相比，exo52分離更多mrna和多得多的mirna，并且exo52和cna試劑盒分離相同量的dna。exo52方法似乎從血漿中分離所有dna。

如附圖中所示，exo52始終勝過可商購的循環(huán)核酸(can)試劑盒。在三個不同血漿池、不同cna試劑批、不同操作員和不同樣品來源上，exo52比cna試劑盒具有更好的產量。

exo52方法用于分析來自黑素瘤組群(cohort)的樣品中的cfdna。將使用exo52方法所得的結果與使用可商購cna試劑盒所得的結果比較。cna試劑盒的分析內變化(基于分離相同血漿樣品的不同時間點)高于使用exo52方法觀測到的變化。如附圖中所示，exo52方法的性能等于或優(yōu)于使用可商購試劑盒獲得的性能。

如附圖中所示，在用350μl氯仿的相分離之后，大約15％dna留在有機相中。雙重提取使dna產量提高約15％點。用90μl氯仿相分離(rna)接著利用額外260μl第二提取(總和：350μl氯仿)相比于正常exo52dna提取僅產生約50％dna產量。向相同柱上再加樣經調節(jié)的exo52物質不改進產量。

實施例2.開發(fā)從癌癥血漿中一步分離外泌體rna和游離dna的平臺

癌癥患者血流中的循環(huán)核酸引起醫(yī)學研究的極大興趣，因為所述循環(huán)核酸具有在不需要組織活檢的情況下產生關于患者疾病狀態(tài)和治療選擇的信息的潛能。試圖將生物液體用于突變分析的任何診斷試驗都需要能最大化循環(huán)中腫瘤來源的突變的捕獲的平臺。血漿含有至少兩個核酸的無細胞源：循環(huán)游離dna(cfdna)，生成自凋亡或壞死細胞；以及包括外泌體的胞外囊泡中封裝的rna(exorna)，所述囊泡由身體中的細胞活躍分泌。因為生物液體中核酸的總量非常有限并且腫瘤突變反映在rna和dna兩者，所以設計方法以從血漿樣品中將所有exorna和cfdna共分離至一定體積，所述體積對通過rt-qpcr的有效下游處理和通過ngs的靶向再測序來說足夠小。

圖224-226示出本文中呈現(xiàn)的研究，其展現(xiàn)了以下事實：(i)血漿除游離dna之外還含有游離rna；(ii)exo52是對于從高體積的生物液體中共分離所有exorna和cfdna而言快速、可再現(xiàn)和便利的程序；以及(iii)使用兩者，exorna和cfdna通常使可用于通過qpcr和ngs進行的罕見突變體檢測的分子加倍。

圖227和228是描繪本文提供的exo52方法捕獲總循環(huán)核酸的能力的一系列圖表。將exo52方法與可商購的循環(huán)核酸dna分離試劑盒比較。如圖227-228中所示，exo52捕獲所有cfdna，并且組合exorna和cfdna比僅cfdna，exo52顯著檢測到更多拷貝。圖228還展現(xiàn)了只基于cfdna的分析，患者針對生物標志鑒別為陰性，但利用組合的dna和rna分析，這些患者針對生物標志鑒別為陽性。本領域普通技術人員將理解突變或其他生物標志的更多拷貝導致在鑒別突變和其他生物標記上增強的靈敏度和準確度。

其他實施方案

盡管已結合詳述描述了本發(fā)明，但前面的描述意圖說明而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由隨附權利要求書的范圍來定義。其他方面、優(yōu)點和修改在以下內容的范圍內。