本申請要求2014年8月7日提交的美國專利申請?zhí)?2/034,331的優(yōu)先權(quán)，其被引入本文作為參考。

技術(shù)領域

本申請涉及用于癌癥治療的小分子抑制劑。具體地，其涉及通過抑制蛋白質(zhì)向細胞核中的轉(zhuǎn)運而殺死癌細胞的小分子的應用。

發(fā)明背景

核轉(zhuǎn)運是蛋白質(zhì)穿越核膜孔復合體(NPC)的輸入或輸出。核轉(zhuǎn)運蛋白參與轉(zhuǎn)運過程，并且其決定給定細胞的核轉(zhuǎn)運能力。轉(zhuǎn)運能力可對基因表達、信號轉(zhuǎn)導以及細胞生長和發(fā)育具有直接影響。

核周蛋白β1(Kpnβ1)是參與貨物蛋白和RNA穿越NPC從細胞質(zhì)輸入至核中的核轉(zhuǎn)運蛋白。Kpnβ1是核轉(zhuǎn)運蛋白的核周蛋白β超家族的成員。核周蛋白β蛋白質(zhì)家族的成員超過二十個，其可以充當輸入或輸出受體，介導蛋白質(zhì)的核進入或退出。Kpnβ1，亦稱為輸入蛋白β，是細胞中使包含核定位信號(NLS)的蛋白質(zhì)通過NPC轉(zhuǎn)運到核中的主要核輸入受體。依靠Kpnβ1的核輸入的一般特征在于Kpnβ1銜接蛋白——核周蛋白α(Kpnα)，亦稱為輸入蛋白α——對貨物蛋白上的NLS的識別。在貨物識別之后，Kpnα結(jié)合Kpnβ1并且三元復合體移位至核中。

Crm1抑制劑細霉素B(LMB)是唯一被接受且市售的已知抑制核轉(zhuǎn)運的化合物。近來，Kpnα/β介導型轉(zhuǎn)運的小分子肽模擬物抑制劑在體外篩選中被鑒定，但是，這些抑制劑具有低效力并且不是細胞可透的，因此在體內(nèi)不可觀察到Kpnα/β介導型核輸入的抑制(Ambrus G,Whitby LR,Singer EL,Trott O,Choi E,Olson AJ等，Small molecule peptidomimetic inhibitors of importin alpha/beta mediated nuclear transport.Bioorg Med Chem，2010年11月1日；18(21):7611-20)。

以強親和力結(jié)合Kpnα的肽抑制劑也已被描述，但這些并不直接抑制Kpnβ1(Kosugi S,Hasebe M,Entani T,Takayama S,Tomita M,Yanagawa H.Design of peptide inhibitors for the importin alpha/beta nuclear import path by activity-based profiling.Chem Biol，2008年9月22日；15(9):940-9)。雙氫除蟲菌素是廣譜抗寄生蟲劑，其抑制Kpnα/β復合體，但其不呈現(xiàn)阻斷Kpnβ1單獨介導的輸入(Wagstaff KM,Sivakumaran H,Heaton SM,Harrich D,Jans DA.Ivermectin is a specific inhibitor of importin alpha/beta-mediated nuclear import able to inhibit replication of HIV-1and dengue virus.Biochem J，2012年5月1日；443(3):851-6)。核抑制素1A(Karyostatin 1A)(Hintersteiner M,Ambrus G,Bednenko J,Schmied M,Knox AJ,Meisner NC等，Identification of a small molecule inhibitor of importin beta mediated nuclear import by confocal on-bead screening of tagged one-bead one-compound libraries.ACS Chem Biol，2010年10月15日；5(10):967-79)和Importazole(Soderholm JF,Bird SL,Kalab P,Sampathkumar Y,Hasegawa K,Uehara-Bingen M等，Importazole,a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-beta.ACS Chem Biol，2011年7月15日；6(7):700-8)是Kpnβ1的被鑒定的第一批小分子抑制劑，但是，其脫靶效果還沒有被考察。而且，還沒有核輸入抑制劑已經(jīng)被測試過其抗癌效果。因此，仍需要鑒定新型且有效的Kpnβ1抑制劑和測試抑制劑其抗癌活性。

前文對本發(fā)明背景的論述僅旨在便于理解本發(fā)明。應當理解，該論述不是認可或承認任何提及材料是在本申請優(yōu)先權(quán)日時本領域公知常識的一部分。

發(fā)明概述

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用于治療癌癥的式I化合物或其鹽，

其中R₁是分支或無分支的、任選地用選自胺、咪唑、醇或嗎啉的取代基官能化的C2-C5烷基；并且其中R₂是氫或甲基。

本發(fā)明的這方面的進一步特征允許R₁選自：

乙基、丙基、丁基、異丁基、異戊基、丙醇基和

本發(fā)明的進一步特征允許式I化合物選自：

本發(fā)明的進一步特征允許該化合物用于結(jié)合細胞中的Kpnβ1以及結(jié)合發(fā)生在Kpnβ1的結(jié)合核周蛋白α(Kpnα)和Ran的結(jié)合區(qū)域。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供用于治療癌癥的式II化合物或其鹽。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供用于治療癌癥的式III化合物、其立體異構(gòu)體或鹽。

再進一步特征允許式I、II和/或III的化合物用于抑制蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子如Kpnα、激活蛋白-1(AP-1)、NF-κB/P65和活化T細胞的核因子(NFAT)向細胞(優(yōu)選癌細胞)核中的輸入。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供用于治療癌癥的式IV的化合物或其鹽。

提供用于治療癌癥的式V化合物或其鹽。

提供用于治療癌癥的式VI化合物、其立體異構(gòu)體或鹽。

提供用于治療癌癥的式VII化合物、其立體異構(gòu)體或鹽。

提供用于治療癌癥的式VIII化合物、其立體異構(gòu)體或鹽。

提供用于治療癌癥的式IX化合物、其立體異構(gòu)體或鹽。

提供用于治療癌癥的下式化合物或其鹽，

其中R是

提供用于治療癌癥的式XII化合物或其鹽。

提供用于治療癌癥的式XIII化合物、其立體異構(gòu)體或鹽。

提供用于治療癌癥的式XIV化合物、其立體異構(gòu)體或鹽。

提供用于治療癌癥的式XV化合物或其鹽。

提供用于治療癌癥的式XVI化合物或其鹽。

仍進一步特征允許，在給予有效量的式I至XVI化合物或化合物組合之后，以上式I至XVI化合物、其立體異構(gòu)體或鹽用于誘導細胞凋亡——優(yōu)選在癌細胞中；有效量的給予濃度小于100μM，優(yōu)選小于50μM。

再進一步特征允許式I至XVI化合物用于誘導癌細胞中的細胞凋亡，同時不實質(zhì)性影響非癌細胞——通過給予有效量的式I至XVI化合物或化合物組合。

仍進一步特征允許以上限定的式I至XVI化合物用于治療宮頸、食管、卵巢、乳腺和其它的癌癥。

進一步特征允許式I至XVI化合物用于治療選自以下的腫瘤或癌癥：胃的癌癥、肺的癌癥、肝的癌癥、黑素瘤、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、急性或慢性淋巴細胞性白血癥、多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng)母細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、維爾姆斯氏瘤、宮頸癌、睪丸癌、軟組織肉瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥、膀胱癌、慢性粒細胞性白血病、原發(fā)性腦癌、惡性黑素瘤、小細胞肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、惡性胰腺胰島素瘤、惡性類癌癌(malignant carcinoid carcinoma)、惡性黑素瘤、絨毛膜癌、蕈樣霉菌病、頭或頸癌、骨肉瘤、胰腺癌、急性粒細胞性白血病、毛細胞白血病、成神經(jīng)母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、卡波西氏肉瘤、泌尿生殖癌、甲狀腺癌、食管癌、惡性高鈣血綜合癥、宮頸增生、腎細胞癌、子宮內(nèi)膜癌、真性紅細胞增多癥、特發(fā)性血小板增多癥、腎上腺皮質(zhì)癌、皮膚的癌癥、前列腺癌、喉的癌癥、外陰的癌癥和睪丸的癌癥。

本發(fā)明進一步提供藥物，其特征在于，其包括如上所述的式I至XVI中任一種化合物、其立體異構(gòu)體或藥學可接受的鹽作為活性成分。

本發(fā)明還提供用作藥物的式I至XVI中任一種的化合物、其立體異構(gòu)體或藥學可接受的鹽。

本發(fā)明還進一步提供式I至XVI中任一種的化合物、其立體異構(gòu)體或鹽在制備用于治療癌癥的藥物中的應用，其中R₁是分支或無分支的、任選地用選自胺、咪唑、醇或嗎啉的取代基官能化的C2-C5烷基；并且其中R₂是氫或甲基。

本發(fā)明提供響應患有腫瘤的患者中的Kpnβ1活性抑制來治療患者的腫瘤的方法，包括給予需要這種治療的患者治療有效量的式I至XVI化合物、其立體異構(gòu)體或其鹽的任一種或組合。

本發(fā)明還進一步提供治療癌癥的方法，其包括給予對其有需要的患者治療有效量的式I至XVI中任一種的化合物、其立體異構(gòu)體或藥學可接受的鹽，其中R₁是分支或無分支的、任選地用選自胺、咪唑、醇或嗎啉的取代基官能化的C2-C5烷基；并且其中R₂是氫或甲基。

附圖簡述

現(xiàn)將參考附圖(僅作舉例)對本發(fā)明進行描述，其中：

圖1是顯示用20nM對照siRNA(Ctl siRNA)或KpnB1siRNA轉(zhuǎn)染的宮頸癌(HeLa、SiHa、CaSki、Ms751、C33A)、食管癌(WHCO5)、轉(zhuǎn)化(SVWI38)和非癌(WI38、CCD-1068SK、FG0)細胞系的相對細胞增殖的柱形圖，其中細胞增殖在轉(zhuǎn)染后5天利用MTT試驗監(jiān)測(**p<0.05)；

圖2是顯示在Kpnβ1siRNA轉(zhuǎn)染后Kpnβ1有效敲低(knockdown)的蛋白質(zhì)印跡分析，其中β-微管蛋白充當?shù)鞍踪|(zhì)加載對照；

圖3是用遞增濃度的喹喔啉處理的HeLa癌細胞的細胞活力的作圖(A)和用遞增濃度的苯并咪唑處理的HeLa細胞的細胞活力的作圖(B)；

圖4是顯示未處理細胞樣品和分別用PMA、化合物A、化合物III和化合物II處理的樣品中的核和細胞質(zhì)p65的百分比的柱形圖；

圖5是顯示用化合物A、化合物III和化合物II以IC50和兩倍IC50濃度處理導致PARP裂解(作為凋亡指示)的蛋白質(zhì)印跡分析；

圖6是用遞增濃度的化合物II處理時利用MTT試驗監(jiān)測的HeLa癌細胞(A)以及FG0非癌細胞(B)的細胞增殖的一對作圖；

圖7是用遞增濃度的化合物III處理時利用MTT試驗監(jiān)測的HeLa癌細胞(A)以及非癌細胞FG0(B)的細胞增殖的一對作圖；

圖8是顯示用pEGFP-Kpnα2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CaSki細胞中的GFP-Kpnα2表達的蛋白質(zhì)印跡分析，其中指示了內(nèi)源Kpnα2水平并且β-微管蛋白充當?shù)鞍踪|(zhì)加載對照；

圖9是顯示未處理細胞樣品和用10μM化合物A處理的細胞樣品中的具有細胞質(zhì)GFP-Kpnα2熒光的細胞的百分比的柱形圖(*p<0.05)；

圖10是未處理細胞樣品和用10μM化合物A處理的細胞樣品中的核GFP-Kpnα2熒光的柱形圖(*p<0.05)；

圖11是顯示未處理細胞和用化合物A處理的細胞的蛋白質(zhì)裂解物中Kpnα2和NFY的細胞質(zhì)和核定位的蛋白質(zhì)印跡，其中β-微管蛋白用作細胞質(zhì)負載對照，并且兔抗TATA盒結(jié)合蛋白(TBP)用作核負載對照；

圖12是顯示相對于相同提取物中的TBP、未處理細胞和用化合物A處理的細胞中的Kpnα2和NFY的核蛋白質(zhì)水平的柱形圖，其中實驗按一式三份進行并且示出平均值和平均值的標準誤差(*p<0.05)；

圖13是顯示利用siRNA抑制Kpnβ1表達的蛋白質(zhì)印跡；

圖14是蛋白質(zhì)印跡分析，顯示Kpnβ1表達的siRNA敲低導致Kpnα2和NFY的核定位減少與用化合物A處理所觀察到的相似；

圖15是顯示在以IC50濃度和15μM的化合物A處理后CaSki細胞中的AP1和p65/NFκB轉(zhuǎn)錄活性的劑量依賴性降低的柱形圖(*p<0.05)；

圖16是在存在TPA和離子霉素(+TPA/離子霉素)或不存在TPA和離子霉素(-TPA/離子霉素)并且存在不同濃度的化合物A的情況下培育的、用NFAT報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NFAT轉(zhuǎn)染HeLa細胞的NFAT轉(zhuǎn)錄活性的柱形圖(*p<0.05)；

圖17是在存在TPA和離子霉素(+TPA/離子霉素)或不存在TPA和離子霉素(-TPA/離子霉素)并且存在不同濃度的化合物II的情況下培育的、用NFAT報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NFAT轉(zhuǎn)染HeLa細胞的NFAT轉(zhuǎn)錄活性的柱形圖(*p<0.05)；

圖18是在存在TPA和離子霉素(+TPA/離子霉素)或不存在TPA和離子霉素(-TPA/離子霉素)并且存在不同濃度的化合物III的情況下培育的、用NFAT報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NFAT轉(zhuǎn)染HeLa細胞的NFAT轉(zhuǎn)錄活性的柱形圖(*p<0.05)；

圖19是在存在TPA和離子霉素(+TPA/離子霉素)或不存在TPA和離子霉素(-TPA/離子霉素)并且存在不同濃度的雙氫除蟲菌素(其是Kpnβ1/Kpnα2介導的核轉(zhuǎn)運的一種已知的抑制劑，并且充當陽性對照)的情況下培育的、用NFAT報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NFAT轉(zhuǎn)染HeLa細胞的NFAT轉(zhuǎn)錄活性的柱形圖；

圖20是在存在TPA和離子霉素(+TPA/離子霉素)或不存在TPA和離子霉素(-TPA/離子霉素)并且存在不同濃度的表皮生長因子受體(EGF-R)抑制劑AG1478(其充當陰性對照)的情況下培育的、用NFAT報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NFAT轉(zhuǎn)染HeLa細胞的NFAT轉(zhuǎn)錄活性的柱形圖；

圖21是用遞增濃度的化合物A處理時利用MTT試驗監(jiān)測的CaSki(A)、HeLa(B)、KYSE30(C)和WHCO6(D)癌細胞以及DMB(E)和FG0(F)非癌細胞的細胞增殖的作圖集合；

圖22是在存在10μM化合物A或不存在化合物A的情況下癌細胞(Caski、HeLa、KYSE30和WHCO6)和非癌細胞(FG0和DMB)的細胞增殖的柱形圖；

圖23是在存在或不存在10μM化合物A的情況下生長的HeLa和KYSE30細胞的錨地不依賴性集落形成的照片；

圖24是未處理的CaSki細胞(A)或用10μM化合物A(B)或20μM化合物A(C)處理的CaSki細胞的細胞周期分析；

圖25是基于在存在DMSO、IC50濃度的化合物A和20μM化合物A的情況下進行的細胞周期分析、細胞周期的不同階段中的細胞百分比的柱形圖(*p<0.05)；

圖26是顯示化合物A處理導致PARP裂解(作為凋亡指示)的蛋白質(zhì)印跡分析，其中β-微管蛋白用作蛋白加載對照；

圖27是顯示細胞色素C向細胞質(zhì)中的釋放增加伴隨線粒體細胞色素C水平減少的蛋白質(zhì)印跡分析，表明內(nèi)在凋亡途徑激活，其中β-微管蛋白和過氧化物氧還蛋白3(Prdx3)分別用作細胞質(zhì)和線粒體蛋白的加載對照，并且用于確認部分(fractions)的純度；

圖28是未經(jīng)治療的或每2-3天用媒介(DMSO)或化合物A治療3周的WHCO6荷瘤小鼠中的標準化腫瘤體積的作圖；和，

圖29是在參考圖28描述的治療過程期間每天測量的荷瘤小鼠的體重的作圖。

參考附圖的詳細描述

計算機(in silico)篩選方法揭示了具有結(jié)合和抑制Kpnβ1轉(zhuǎn)運蛋白的潛力的小分子的身份。Kpnβ1蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)的適當區(qū)域被選作目標區(qū)域?？疾霮pnβ1的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，并且Kpnβ1的氨基酸殘基331-364被鑒定為其結(jié)合至RanGTP、SREBP-2和Kpnα2以轉(zhuǎn)運典型含NLS貨物所需的共同區(qū)域。進行針對能夠結(jié)合Kpnβ1的這個區(qū)域并且潛在地干擾其核輸入功能的小分子的計算機篩選。篩選利用由1400萬種化合物組成的文庫進行。對篩選的分子基于其預期結(jié)合親和力進行評分。對分子基于其互補形狀和對上述結(jié)合位點和周圍殘基的極性進行評分。本文進一步描述的式I至XVI的化合物全部被鑒定為潛在的Kpnβ1抑制劑。這些化合物全部都具有每分子至少兩個芳香族區(qū)域，并且參與與結(jié)合位點和其周圍殘基上的互補區(qū)域的范德華(van der Waals)和靜電相互作用。式I至XVI的化合物還包括氫鍵供體，具體地仲胺和伯胺部分；和氫鍵受體，如羰基或醚氧原子或叔胺，其在各自分子上適當定位以便參與與構(gòu)成Kpnβ1上結(jié)合位點和其周圍殘基的部分的互補氫鍵供體和受體的氫鍵合相互作用?；衔颕至XVI已顯示具有抗癌性質(zhì)，使得其可用于癌癥的治療。

在通過篩選方法鑒定并且稍后證實抑制Kpnβ1的化合物中有喹喔啉衍生物。喹喔啉衍生物是重要的一類雜環(huán)化合物，并且喹喔啉結(jié)構(gòu)是裝配用于各種應用的多種衍生化合物的前體。大多數(shù)喹喔啉衍生物是合成的，而僅有若干天然存在。已知一些喹喔啉衍生物具有生物學活性并且用作抗微生物、抗病毒或抗真菌劑。

通式I的喹喔啉衍生物或其鹽現(xiàn)已被發(fā)現(xiàn)具有抗癌性質(zhì)，因此其可用于癌癥治療，

其中R₁是分支或無分支的、任選地用選自胺、咪唑、醇或嗎啉的取代基官能化的C2-C5烷基；并且其中R₂是氫或甲基。

通式I的化合物或其鹽抑制蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子如Kpnα、AP-1、P65、NFAT(已知的Kpnβ1轉(zhuǎn)運蛋白目標)向細胞核中的輸入。

式II化合物——(2S,4S)-1-芐基-4-{[(4-甲氧基萘-1-基)甲基]氨基}-N-甲基吡咯烷-2-甲酰胺——或其鹽的一種(以下稱為化合物II)、和式III化合物——9-[(1-甲基哌啶-3-基)甲氧基]-4-[(6-甲基吡啶-2-基)甲基]-7-(5-甲基噻吩-2-基)-3,5-二氫-2H-1,4-苯并氧雜氮雜——或其立體異構(gòu)體或鹽的一種(以下稱為化合物III)類似地抑制蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子如NFAT和P65/NFKB向至細胞核中的輸入。這些化合物同樣被發(fā)現(xiàn)具有抗癌效果，因此其可被用于癌癥治療。

式IV化合物——({2-[(2-氯苯基)甲氧基]-6H,7H,8H-環(huán)戊并[g]喹啉-3-基}甲基)({2H,3H-咪唑并[2,1-b][1,3]噻唑-6-基甲基})胺——或其鹽(以下稱為化合物IV)具有抗癌效果，從而其可被用于癌癥治療。

以下式V至XVI化合物、其立體異構(gòu)體(適用時)或鹽具有抗癌效果，因此其可用于癌癥治療：

現(xiàn)將進一步描述式I至XVI化合物的抗癌性質(zhì)及其作用方式。如上所述，由計算機篩選鑒定了所有化合物的Kpnβ1(核轉(zhuǎn)運蛋白)結(jié)合親和力。

Kpnβ1依賴性核輸入的特征在于，Kpnβ1銜接蛋白，核周蛋白α(Kpnα)，亦稱為輸入蛋白α，識別貨物蛋白上的NLS。在貨物識別后，Kpnα結(jié)合Kpnβ1并且三元復合體通過Kpnβ1與包括NPC的核孔蛋白(Nups)的相互作用移位至細胞核中。一旦處于NPC的核質(zhì)側(cè)，復合體因RanGTP與Kpnβ1的結(jié)合而解離。RanGTP和Kpnα共享Kpnβ1蛋白上的重疊結(jié)合位點，但RanGTP對該位點具有更高的親和力，因此取代Kpnα，導致貨物蛋白被釋放(Moroianu J,Blobel G,Radu A.Nuclear protein import:Ran-GTP dissociates the karyopherin alphabeta heterodimer by displacing alpha from an overlapping binding site on beta.Proc Natl Acad Sci U S A，1996年7月9日；93(14):7059-62)。在貨物釋放后，RanGTP-Kpnβ1移回細胞質(zhì)中，在此RanGTP被水解成RanGDP并且Kpnβ1被釋放用于另一輪核轉(zhuǎn)運。在Kpnβ1與銜接子(adaptor)一起轉(zhuǎn)運其貨物蛋白時，其可以靠自己發(fā)揮作用——例如在轉(zhuǎn)運固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(SREBP-2)時(Nagoshi E,Imamoto N,Sato R,Yoneda Y.Nuclear import of sterol regulatory element-binding protein-2,a basic helix-loop-helix-leucine zipper(bHLH-Zip)-containing transcription factor,occurs through the direct interaction of importin beta with HLH-Zip.Mol Biol Cell，1999年7月；10(7):2221-33)。

已知Kpnβ1mRNA和蛋白在宮頸腫瘤和細胞系中的表達水平升高(Van der Watt PJ,Maske CP,Hendricks DT,Parker MI,Denny L,Govender D等.The Karyopherin proteins,Crm1 and Karyopherin beta1,are overexpressed in cervical cancer and are critical for cancer cell survival and proliferation.Int J Cancer，2009年4月15日；124(8):1829-4)。啟動子在宮頸癌細胞中更為活躍——因為其被細胞周期調(diào)節(jié)子(E2F)激活(Van der Watt PJ,Ngarande E,Leaner VD.Overexpression of Kpnbeta1and Kpnalpha2Importin Proteins in Cancer Derives from Deregulated E2F Activity.PLoS One 2011；6(11):e27723)。Smith等(2010)發(fā)現(xiàn)Kpnβ1 mRNA在卵巢癌細胞系和轉(zhuǎn)化的卵巢細胞中升高，并且Kuusisto等(2012)也描述在幾種轉(zhuǎn)化的細胞系中Kpnβ1水平升高(Smith ER,Cai KQ,Smedberg JL,Ribeiro MM,Rula ME,Slater C等.Nuclear entry of activated MAPK is restricted in primary ovarian and mammary epithelial cells.PLoS One 2010；5(2):e9295；Kuusisto HV,Wagstaff KM,Alvisi G,Roth DM,Jans DA.Global enhancement of nuclear localization-dependent nuclear transport in transformed cells.FASEB J，2012年3月；26(3):1181-93)。

Kpnβ1水平升高可表明Kpnβ1蛋白與細胞轉(zhuǎn)化和癌癥有關。事實上，癌細胞中Kpnβ1蛋白表達的抑制導致凋亡(Van der Watt等，2009；Angus等，2014)，突出了這種蛋白質(zhì)在癌癥發(fā)展中的作用。但是，非癌細胞中Kpnβ1蛋白表達的抑制對細胞活力僅具有輕微影響(Van der Watt等,2009；Angus L,van der Watt PJ,Leaner VD.Inhibition of the nuclear transporter,Kpnbeta1,results in prolonged mitotic arrest and activation of the intrinsic apoptotic pathway in cervical cancer cells.Carcinogenesis，2014年1月7日)，指出Kpnβ1作為抗癌治療靶的潛在應用(Van der Watt PJ,Stowell CL,Leaner VD.The nuclear import receptor Kpnbeta1and its potential as an anti-cancer therapeutic target.Crit Rev Eukaryot Gene Expr 2013；23(1):1-10)。

通式I的化合物，化合物II和化合物III，抑制Kpnβ1貨物蛋白如p65/NFBK的核輸入，通過凋亡誘導癌細胞的細胞死亡，和抑制癌細胞增殖。

在式I至XVI化合物的抗癌研究期間，使用細胞系和組織培養(yǎng)物：

細胞系和組織培養(yǎng)物

通過將XhoI/BamHI切割的人Kpnα2cDNA片段插入pEGFP-C1(Clontech，Mountain View，CA，USA)中來生成GFP-Kpnα2表達質(zhì)粒(pEGFP-C1-Kpnα2)。將該構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至CaSki宮頸癌細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，ATCC，Rockville，MD，USA)中，通過FACS分析選擇表達適度水平的GFP-Kpnα2的細胞庫，并將其保持在包含10％胎牛血清(FBS)(Gibco，佩斯利，蘇格蘭)、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和200μg/ml G418(Sigma，St Louis，MO，USA)的Dulbecco改良型Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)中。所有其它細胞系都被保持在包含10％FBS、100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的DMEM中——除了正常hTERT永生化人食管上皮細胞EPC2-hTERT(獲自A.K.Rustgi教授(賓夕法尼亞大學(University of Pennysylvania)，費城，USA))，其被培養(yǎng)在補充有50μg/ml牛垂體提取物(BPE)、1ng/ml上皮生長因子(EGF)、和100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的角質(zhì)化細胞無血清培養(yǎng)基(KSFM)中，；和MCF12A良性乳腺癌細胞(獲自ATCC)，其被保持在補充有5％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、20ng/ml EGF(Gibco)、100ng/ml霍亂霉素(Sigma)、10μg/ml胰島素(Gibco)和500ng/ml氫化可的松(Sigma)的50％HAMS F12和50％DMEM中。KYSE30和KYSE150細胞獲自DSMZ(柏林，德國)，并且WHCO1、WHCO5和WHCO6食管癌細胞系獲自R.Veale教授(Jones GJ,Heiss NS,Veale RB,Thornley AL.Amplification and expression of the TGF-alpha,EGF receptor and c-myc genes in four human oesophageal squamous cell carcinoma lines.Biosci Rep，1993年10月；13(5):303-12)。FG0和DMB正常皮膚成纖維細胞獲自醫(yī)學系(Department of Medicine),UCT。除非如上指定，所有其它細胞系均獲自ATCC。

IC50確定如下進行：

將細胞鋪平于96孔板，并用不同濃度的測試化合物處理48小時，然后加入MTT染料3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(Sigma)，并且4小時后利用增溶試劑(10％SLS，在0.01M HCl中)溶解晶體。次日利用BioTek微孔板分光光度計(Winooski，VT，USA)在595nm下測量吸光度，并利用GraphPad Prism生成IC50曲線。

利用siRNA抑制癌細胞中的Kpnβ1表達導致細胞通過凋亡而死亡，而正常細胞中的抑制對細胞生物學僅具有輕微影響。為將此驗證，用Kpnβ1siRNA轉(zhuǎn)染一組細胞系，并在轉(zhuǎn)染后5天監(jiān)測細胞活力。圖1顯示在宮頸癌、食管癌和轉(zhuǎn)化細胞系中Kpnβ1抑制后細胞數(shù)量顯著減少，而非癌細胞相對不受影響。通過蛋白質(zhì)印跡分析確認癌細胞和非癌細胞中的Kpnβ1敲低(圖2)。

在利用siRNA的Kpnβ1抑制后癌細胞被選擇性殺死表明，Kpnβ1的小分子抑制劑可具有相同的效果。特別是，如果抑制劑結(jié)合至對應于Kpnβ1的氨基酸331-363的重疊Ran-和Kpnα2-結(jié)合區(qū)域。Kpnβ1的這個區(qū)域此前經(jīng)鑒定對其功能至關重要，因為其缺失導致Kpnβ1不能將NLS-HSA貨物轉(zhuǎn)運至核中(Moroianu等，1996)。

利用食管癌細胞系(WHCO5和KYSE180)和宮頸癌細胞系(HeLa和CaSki)測試潛在抑制劑化合物對癌細胞活力的影響。細胞活力的MTT試驗揭示，化合物A至K顯示IC50值小于50μM(表1)。

表1.喹喔啉衍生物在食管癌細胞系(WHCO5和KYSE180)和宮頸癌細胞系(HeLa和CaSki)中的IC50值。

化合物A至K的分子結(jié)構(gòu)包括喹喔啉部分和苯并咪唑部分。測試喹喔啉和苯并咪唑?qū)eLA細胞的細胞活力的影響，以確定喹喔啉和苯并咪唑分子分別是否可具有抗癌性質(zhì)(圖3)。在上至6.5mM喹喔啉的濃度范圍內(nèi)沒有觀察到細胞殺傷效果。苯并咪唑在2.078mM的極高IC50濃度下具有細胞殺傷效果。但是，苯并咪唑也可以被認為是無作用的，因為其IC 50遠遠超過利用化合物A至K和當前化學治療藥物所獲得的IC50范圍。

利用宮頸癌細胞系CaSki和HeLa，測試化合物II和III其對癌細胞活力的影響。確定基于這些癌細胞系以及非癌細胞系FG0的IC50值。細胞活力的MTT試驗揭示，兩種化合物均顯示癌細胞殺傷效果，并且IC50值小于50μM(表2和3)。

表2.用化合物II處理的CaSki、HeLa和FG0細胞的IC50值。

表3.用化合物III處理的CaSki、HeLa和FG0細胞的IC50值。

與化合物A相似，化合物II和III抑制Kpnβ1貨物蛋白的核輸入，如圖4所示，其中顯示在細胞未經(jīng)處理、用PMA、化合物A、化合物III或化合物II處理時相對于細胞質(zhì)p65百分比的核p65百分比。

通過圖5所示的PARP裂解觀察到，化合物A以及化合物II和III誘導癌細胞通過凋亡而死亡?；衔颕I和II抑制細胞增殖，如圖6和7中所示，其中顯示在用遞增濃度的化合物II和III處理時利用MTT試驗監(jiān)測的HeLa癌細胞(A)以及FG0非癌細胞(B)的細胞增殖。

利用一組不同來源的細胞系測試化合物IV的細胞殺傷效果。化合物IV殺死宮頸(CaSki，HeLa)、食管(WHCO5，KYSE150)和乳腺來源(MCF12A、MCF7、MDA-MB-231)的癌細胞系和轉(zhuǎn)化細胞系(SVW138)，并且IC50值在大約8與18μM之間的范圍內(nèi)(表4)。

表4.用化合物IV處理的癌細胞、轉(zhuǎn)化細胞和非癌細胞的IC50值。

顯示CasKi宮頸癌細胞的癌細胞殺傷效果的更多化合物列舉在表5中。表5中所列的化合物具有50μM以下的IC50值，其在順鉑的IC50范圍內(nèi)。

表5.用不同化合物處理的CaSki細胞的IC50值。

基于包括上皮和成纖維細胞來源的癌細胞系和正常細胞系在內(nèi)的一組不同細胞系，測試化合物IX–XIII(鹽形式)。利用各個化合物的每一種處理時細胞系的IC50值在表6至10中給出。

表6.用化合物IX處理的癌細胞、轉(zhuǎn)化細胞和非癌細胞的IC50值。

表7.用化合物X處理的癌細胞、轉(zhuǎn)化細胞和非癌細胞的IC50值。

表8.用化合物XI處理的癌細胞、轉(zhuǎn)化細胞和非癌細胞的IC50值。

表9.用化合物XII處理的癌細胞、轉(zhuǎn)化細胞和非癌細胞的IC50值。

表10.用化合物XIII處理的癌細胞、轉(zhuǎn)化細胞和非癌細胞的IC50值。

為了證明通式I的化合物——3-(1H-苯并咪唑-2-基)-1-(3-二甲基氨基丙基)吡咯并[5,4-b]喹喔啉-2-胺(以下稱為“化合物A”)——的抗癌性質(zhì)，現(xiàn)將更詳細地描述其對輸入蛋白的抑制作用。

以下方法被用于研究化合物A的抑制作用：

熒光顯微法

使穩(wěn)定表達GFP-Kpnα2的CaSki細胞在蓋玻片上生長，并且用IC50或20μM的化合物A處理24小時。關于對照，使用等體積的DMSO。將細胞在熒光顯微前用4％多聚甲醛固定，并將細胞核用0.5μg/ml DAPI染色。由于化合物A在GFP通道中發(fā)射熒光，必須通過分離發(fā)射光譜而從GFP信號中排除化合物A信號。使用Zeiss LSM 510Meta共聚焦顯微鏡，并且利用ZEN 2009照相機和關聯(lián)的AxioVision軟件(4.7版)拍攝圖像。利用Zeiss圖像瀏覽器編輯照片。關于定量，利用Image J分析來自各條件的100個細胞。

核和細胞質(zhì)蛋白提取

按照制造商的說明，利用NE-PER核蛋白提取試劑盒(ThermoScientific，Rockford，IL，USA)進行核和細胞質(zhì)蛋白分離(fractionation)。在蛋白質(zhì)提取前，將CaSki細胞用IC50的化合物A處理48小時，或用20nM對照siRNA(sc-37007，Santa Cruz Biotechnology)或Kpnβ1siRNA(sc-35736，Santa Cruz Biotechnology)轉(zhuǎn)染96小時。利用山羊抗核周蛋白α2(C-20)抗體(sc-6917，Santa Cruz Biotechnology)和兔抗NFYA(H-209)抗體(sc-10779，Santa Cruz Biotechnology)進行蛋白質(zhì)印跡分析。抗β-微管蛋白(H-235)抗體(sc-9104，Santa Cruz Biotechnology)被用于細胞質(zhì)蛋白負載對照，并且兔抗TATA盒結(jié)合蛋白(TBP)(N-12)抗體(sc-204，Santa Cruz Biotechnology)被用于核蛋白負載對照。利用Image J進行密度測定。

熒光素酶試驗

為分析AP-1和p65熒光素酶活性，將40000個CaSki細胞鋪于24孔板，并利用0.16μl TransFectinTM脂質(zhì)試劑(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，用50ng的AP1熒光素酶報道基因(reporter)(含有四拷貝的AP-1結(jié)合位點)或50ng的p65熒光素酶報道基因(含有五拷貝的p65結(jié)合位點，Clontech，CA，USA)和5ng的pRL-TK(編碼Renilla熒光素酶，Promega)轉(zhuǎn)染。次日用10或15μM化合物A處理細胞。按照生廠商說明，利用雙熒光素酶R報道基因分析系統(tǒng)(Promega，Madison，WI，USA)，在化合物A處理后24小時測量熒光素酶活性。利用VeritasTM微孔板照度計(Promega)測量熒光素酶讀數(shù)，并將熒光素酶讀數(shù)相對于相同提取物中的Renilla熒光素酶標準化。

為分析NFAT熒光素酶活性，在24孔板中每孔鋪30000個HeLa細胞，并且利用0.4μl GenecellinTM轉(zhuǎn)染試劑(Celtic Molecular Diagnostics，南非)，用50ng GFP-NFAT質(zhì)粒(Addgene質(zhì)粒#24219，Jerry Crabtree所贈(Beals CR，Clipstone NA，Ho SN，Crabtree GR.Nuclear localization of NF-ATc by a calcineurin-dependent，cyclosporin-sensitive intramolecular interaction.Genes Dev，1997年4月1日；11(7):824-34))、50ng NFAT-熒光素酶(Addgene質(zhì)粒#10959，Toren Finkel所贈(Ichida M，F(xiàn)inkel T.Ras regulates NFAT3activity in cardiac myocytes.J Biol Chem，2001年2月2日；276(5):3524-30))和5ng pRL-TK進行轉(zhuǎn)染。NFAT-熒光素酶報告質(zhì)粒包含三個串聯(lián)重復的、IL-2啟動子的30bp片段——已知其結(jié)合NFAT。次日將細胞用10或15μM化合物A處理，并且在過夜培育后，用100nM TPA(Sigma)和1.3μM離子霉素(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)刺激5小時，然后測量熒光素酶活性。

細胞增殖試驗

為分析化合物A處理后的細胞增殖，將5000個細胞/孔鋪于96孔板中，并用5、10或15μM化合物A處理，其后利用MTT每24小時監(jiān)測細胞增殖4天。

細胞周期分析

將CaSki細胞鋪于60mm培養(yǎng)皿中，并用適當濃度的化合物A處理。處理后24小時收集細胞，并在100％乙醇中固定，其后將其用碘化丙啶染色，并利用BD流式細胞儀(BD Biosciences，NJ，USA)分析細胞周期譜。利用ModFit 3.3軟件進行數(shù)據(jù)分析。

PARP裂解分析

用不同濃度的化合物A處理CaSki細胞12小時，然后利用RIPA緩沖液(10mM Tris-Cl，pH 7.4，150mM NaCl，1％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，1％曲拉通(Triton)X-100，1×完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche，曼海姆，德國))收集細胞和細胞漂浮物，并且利用兔抗Parp1/2(H-250)抗體(sc-7150)進行蛋白質(zhì)印跡分析。

線粒體和細胞質(zhì)蛋白提取

使細胞在10cm平板中生長，并用不同濃度的化合物A處理24小時。使細胞溶解于亞細胞分離緩沖液(250mM蔗糖、20mM HEPES、10mM KCl、1.5mM MgCl₂、1mM EDTA、1mM EGTA、1mM DTT和1×完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche))中，通過25G針，并在冰上培育20分鐘。在720g下離心5分鐘后獲得核沉淀物(pellet)。將上清液在10,000g下進一步離心，并將得到的上清液用作細胞質(zhì)部分。將含有線粒體部分的沉淀物在亞細胞分離緩沖液中洗滌，并使其通過25G針。使線粒體部分在10,000g下形成沉淀物，并重懸浮于RIPA緩沖液中。利用小鼠抗細胞色素C抗體(BD Pharmingen，San Diego，CA)進行蛋白質(zhì)印跡分析，并且抗β-微管蛋白(H235)(sc-9104，Santa Cruz)和抗過氧化物氧還蛋白-3(PRDX-3)(P1247，Sigma)抗體分別用作細胞質(zhì)和線粒體部分的蛋白負載對照。

異種移植腫瘤模型

收集WHCO6細胞并將其重懸浮在PBS中。關于腫瘤接種，將癌細胞(每只小鼠5×106)皮下植入至雌性裸鼠的后脅(hind flanks)中。在腫瘤已達到可察覺尺寸后，開始藥物治療，其中荷瘤小鼠被隨機分配并且每2-3天腹膜內(nèi)施以媒介(DMSO)或化合物A(50mg/kg)3周。利用測徑器每周兩次測量腫瘤體積，并且利用下列公式估測腫瘤體積：體積＝(長×寬×寬)/2。在藥物治療開始后3周將小鼠處死。

統(tǒng)計學分析

關于所有數(shù)據(jù)比較，利用Microsoft Excel進行Student t檢驗——除了體內(nèi)研究，其中利用GraphPad Prism 5進行雙程ANOVA檢驗。P值<0.05被認為統(tǒng)計學顯著。

化合物A是一種喹喔啉衍生物，其分子式為C₂₂H₂₃N₇，分子量為385.465g/mol。該化合物以粉末形式獲得，并且可溶于二甲基亞砜(DMSO)。

本領域技術(shù)人員將理解，通式I的化合物及其鹽——其中R₁是分支或無分支的、任選地用選自胺、咪唑、醇或嗎啉的取代基官能化的C2-C5烷基；并且其中R₂是氫或甲基——將具有與化合物A相同或非常相似的作用方式和癌細胞殺傷效果。

化合物A的作用機制和癌細胞殺傷效果在下文結(jié)果章節(jié)被進一步描述。本領域技術(shù)人員將理解，與化合物A在結(jié)構(gòu)上類似的化合物B至K具有與化合物A相同或非常相似的抑制活性和癌細胞殺傷效果?；衔顰至K具有基本上相似的形狀和極性——與Kpnβ1上的結(jié)合位點和其周圍殘基互補。本領域技術(shù)人員將理解，化合物A至K參與基本上相同的與結(jié)合位點和其周圍殘基的范德華相互作用和氫鍵合相互作用，從而與其與其締合或結(jié)合并抑制Kpnβ1活性，從而誘導癌細胞的凋亡。

結(jié)果

GFP-Kpnα2核移位的阻止

利用基于熒光的篩選試驗測試具有細胞殺傷能力的化合物A阻擋核輸入的能力。該試驗基于如下事實：Kpnα在與Kpnβ1的復合體中進入核。Kpnα2(Impα1或Rch1)帶GFP標記(圖8)，并且其定位在用不同化合物處理后通過熒光顯微法監(jiān)測。預期GFP-Kpnα2定位將主要在核；并且在用有效阻擋Kpnβ1介導的核輸入的化合物處理細胞后，GFP-Kpnα2將不能進入核并且將在細胞質(zhì)中積累。利用這種化合物的處理導致GFP-Kpnα2從核錯誤定位至細胞質(zhì)?；衔顰抑制核輸入。注意，化合物A自身具有熒光，因此必須通過分離發(fā)射光譜將化合物熒光信號從GFP-Kpnα2信號中排除。計數(shù)含有細胞質(zhì)GFP-Kpnα2的細胞數(shù)(每個條件計數(shù)超過100個細胞)，并且觀察到在化合物A處理后顯著增加(圖9)，以及GFP-Kpnα2核熒光信號顯著減小(圖10)。

內(nèi)源性Kpnα2和NFY的核輸入減少

為了確認化合物A阻擋核輸入，進行獨立試驗，其中在用化合物A處理細胞后將核和細胞質(zhì)蛋白部分分離。進行蛋白質(zhì)印跡分析以確定內(nèi)源性Kpnα2的定位，因為預期利用核輸入有效抑制劑進行的處理將阻止內(nèi)源性Kpnα2進入核。化合物A處理導致核中的Kpnα2量減少(圖11)。但是，細胞質(zhì)中的Kpnα2量未如預期地增加，這可能因為在不能進入核時Kpnα2的降解增強，或可選地因為其附著于核膜并且因此不被算在核或細胞質(zhì)蛋白部分內(nèi)。

獨立的Kpnβ1貨物NFY-A(Kahle J,Baake M,Doenecke D,Albig W.Subunits of the heterotrimeric transcription factor NF-Y are imported into the nucleus by distinct pathways involving importin beta and importin 13.Mol Cell Biol，2005年7月；25(13):5339-54)的定位也被進行了研究，并且類似地被發(fā)現(xiàn)在化合物A處理后在核部分中減少，支持了化合物A可能阻擋核輸入的發(fā)現(xiàn)(圖11)。重復實驗中的Kpnα2和NFY水平的密度測定定量確認在化合物A處理后核蛋白水平顯著降低(圖12)。為了驗證化合物A處理后所觀察到的帶型如同Kpnβ1抑制后的預期，利用siRNA使Kpnβ1沉默，并分離核和細胞質(zhì)蛋白部分用于蛋白質(zhì)印跡分析。在利用siRNA進行Kpnβ1抑制后，核中的Kpnα2量較少，支持了關于化合物A的結(jié)果。類似地，在Kpnβ1的siRNA轉(zhuǎn)染后，核部分中的NFY量較少(圖13和14)。

阻止轉(zhuǎn)錄因子進入核

由于Kpnβ1介導的核輸入的抑制劑可能影響轉(zhuǎn)錄因子向核中的輸入，在化合物A處理后進行熒光素酶試驗以分析AP-1和p65核活性，因為轉(zhuǎn)錄因子已被證實依靠Kpnβ1進行核輸入(Forwood JK,Lam MH,Jans DA.Nuclear import of Creb and AP-1transcription factors requires importin-beta 1and Ran but is independent of importin-alpha.Biochemistry，2001年5月1日；40(17):5208-17；Liang P,Zhang H,Wang G,Li S,Cong S,Luo Y等.KPNB1,XPO7and IPO8Mediate the Translocation of NF-kappaB/p65into the Nucleus.Traffic 2013年11月；14(11):1132-43)。在CaSki細胞的化合物A處理后測量AP-1和p65-熒光素酶活性，并且如預期，兩者在處理后以劑量依賴性方式降低(圖15)。

轉(zhuǎn)錄因子NFAT也以Kpnβ1依賴性方式(Ishiguro K,Ando T,Maeda O,Ohmiya N,Niwa Y,Goto H.Acetate inhibits NFAT activation in T cells via importin beta1interference.Eur J Immunol 2007年8月；37(8):2309-16)和Crm1依賴性方式(Kehlenbach RH,Dickmanns A,Gerace L.Nucleocytoplasmic shuttling factors including Ran and CRM1mediate nuclear export of NFAT In vitro.J Cell Biol，1998年5月18日；141(4):863-74)在核和細胞質(zhì)之間穿梭。但是，其核-細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運是獨特的，因為其經(jīng)由鈣暴露來調(diào)控(Shibasaki F,Price ER,Milan D,McKeon F.Role of kinases and the phosphatase calcineurin in the nuclear shuttling of transcription factor NF-AT4.Nature，1996年7月25日；382(6589):370-3)，由此其主要在細胞質(zhì)。但是，胞內(nèi)鈣水平增加導致其核積累。Soderholm等(2011)通過熒光顯微法證實，響應鈣離子載體——離子霉素的刺激，通過Kpnβ1抑制核輸入會阻止NFAT-GFP的核積累。

在離子霉素和化合物A處理后，利用通過核NFAT活化的NFAT-熒光素酶報道基因進行核NFAT試驗。利用佛波醇酯TPA共刺激NFAT，因為此前已證實TPA和離子霉素引起NFAT熒光素酶活性的協(xié)同刺激(Northrop JP,Ullman KS,Crabtree GR.Characterization of the nuclear and cytoplasmic components of the lymphoid-specific nuclear factor of activated T cells(NF-AT)complex.J Biol Chem 1993年2月5日；268(4):2917-23)。圖15中所示的AP1和p65熒光素酶試驗揭示了響應化合物A處理的內(nèi)源性AP1和p65活性，而NFAT在HeLa細胞中被異位表達。

結(jié)果顯示，用TPA和離子霉素刺激NFAT轉(zhuǎn)染的HeLa細胞導致NFAT報道基因的激活由于NFAT的核輸入而顯著增加(圖16)。利用化合物A、化合物II和化合物III的處理使NFAT活化以劑量依賴方式顯著減少，可能是由于其抑制NFAT的核輸入(圖16、17和18)。作為陽性對照，用雙氫除蟲菌素處理細胞，雙氫除蟲菌素是一種廣譜抗寄生蟲劑，其近來被發(fā)現(xiàn)抑制核周蛋白α/β介導的核轉(zhuǎn)運(Wagstraff等，2012；Wagstaff KM,Rawlinson SM,Hearps AC,Jans DA.An AlphaScreen(R)-based assay for high-throughput screening for specific inhibitors of nuclear import.J Biomol Screen，2011年2月；16(2):192-200)。NFAT試驗利用雙氫除蟲菌素進行，并且與利用化合物A所獲得的結(jié)果類似，NFAT活性的誘導在雙氫除蟲菌素處理后顯著減少(圖19)。最后，在用AG1478(一種EGF-R抑制劑)處理細胞后測量NFAT活化，沒有觀察到NFAT活化的變化(圖20)。

通過細胞周期停滯和凋亡誘導的癌細胞死亡

為了鑒定具有抗癌活性的核輸入抑制劑，利用不同來源的一組細胞系測試化合物A的細胞殺傷效果。在測試的細胞系中，化合物A沒有顯示對具體癌癥類型的偏好，并且被發(fā)現(xiàn)以大約10μM的IC50殺死宮頸(HeLa、CaSki)、食管(WHCO1、WHCO5、WHCO6)、卵巢(A2780、CP70和OVCAR3)和乳腺來源(MDA-MB-231、MCF7)的癌細胞系(表11)。

表11.用化合物A處理的癌細胞、轉(zhuǎn)化細胞和非癌細胞的IC50值。

重要地，化合物A顯示，相對于非癌成纖維細胞系，在癌細胞系或轉(zhuǎn)化細胞系中毒性升高。其顯示對癌癥或轉(zhuǎn)化的細胞系的選擇性相對于非癌成纖維細胞系高約2倍至3倍。

為了確認化合物A相比于非癌細胞更有效殺死癌細胞，使代表性癌細胞系(宮頸和食管)和非癌細胞系在存在化合物A的情況下生長，并且利用MTT試驗每天測量細胞增殖五天。圖21顯示了癌細胞對化合物A高度敏感，因為在24小時內(nèi)在10和15μM化合物A的濃度下觀察到完全細胞死亡(圖21A-D)。此效果持續(xù)整整5天時間，確認沒有細胞群由該處理恢復。

但是，非癌成纖維細胞在存在10μM化合物A的情況下增殖相對正常，但在15μM化合物A下在24-48小時內(nèi)發(fā)生細胞死亡(圖21E和F)。結(jié)果指出癌和非癌細胞對化合物A的差別敏感性，其中在10μM化合物A處理時，癌細胞發(fā)生100％細胞死亡，而非癌細胞相對不受影響(圖22)。雖然非癌細胞的IC50此前證實為在20-30μM范圍內(nèi)，但由于在細胞增殖試驗中接種了較少細胞，該細胞在15μM時死亡。

響應化合物A處理測量癌細胞的錨地不依賴性增殖，因為以這種方式生長的細胞是更具代表性的體內(nèi)腫瘤細胞。使細胞在多聚血紅素(polyheme)涂覆板上生長，并且利用MTT試驗監(jiān)測處理后9天的細胞增殖。觀察到，宮頸和食管癌細胞在存在10μM化合物A的情況下生長時均不能形成集落，不同于其未處理副本(圖23)，確認了化合物A同時阻擋癌細胞的錨地依賴性和錨地不依賴性增殖的能力。

對化合物A誘導的細胞死亡的機制進行了研究。進行細胞周期分析，并且發(fā)現(xiàn)化合物A處理導致細胞周期的G1階段中細胞百分比增加，和在S和G2/M階段中的細胞百分比相應減少(圖24和25)。細胞周期阻滯的誘導表明凋亡可能被激活；因此通過蛋白質(zhì)印跡分析測量聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP-1)的裂解，作為凋亡的指示。PARP-1在凋亡期間裂解成89和24kDa的片段(Duriez PJ,Shah GM.Cleavage of poly(ADP-ribose)polymerase:a sensitive parameter to study cell death.Biochem Cell Biol 1997；75(4):337-49)?；衔顰處理導致89kDa的裂解PARP的水平增加，與未裂解的Parp(113kDa)的存在減少相關(圖26)。24kDa帶是看不到的。

為了獨立地確認凋亡誘導，研究細胞色素C亞細胞定位，因為其向細胞質(zhì)中的釋放是內(nèi)在線粒體途徑介導的凋亡的一個表征特征。用化合物A處理細胞，并且收集線粒體和細胞質(zhì)蛋白部分用于蛋白質(zhì)印跡分析。值得注意地，化合物A處理導致細胞色素C以劑量依賴方式從線粒體釋放至細胞質(zhì)中(圖27)，表明內(nèi)在線粒體途徑在化合物A處理后被激活并且造成癌細胞死亡。

抑制癌癥異種移植模型中的腫瘤生長

化合物A顯示體外細胞毒性，并且進一步發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)具有抗癌活性——通過小鼠異種移植模型證明。將小鼠接種WHCO6癌細胞，并且在腫瘤達到可察覺尺寸后，每三天用媒介(二甲基亞砜(DMSO))或化合物A治療小鼠，并且監(jiān)測腫瘤尺寸三周?；衔顰處理顯著抑制腫瘤生長(圖28)。小鼠的體重在用化合物A處理的過程中沒有變化，并且小鼠呈現(xiàn)健康，表明沒有經(jīng)歷不良副作用(圖29)。

為了確認化合物A阻擋核輸入的能力，用化合物A處理細胞，并且監(jiān)測Kpnα2(在核輸入途徑中與Kpnβ1形成異源二聚體的輔助蛋白)的定位。因此Kpnα2很大程度上依賴于Kpnβ1以進行其核輸入。而且，Kpnα2進入核的快速穿梭使其成為鑒定核輸入抑制劑的特別有用的工具。在化合物A處理后檢查外源和內(nèi)源Kpnα2，發(fā)現(xiàn)其核定位在存在化合物A的情況下減少，表明化合物A為Kpnβ1核轉(zhuǎn)運的抑制劑。但是，在化合物A處理后分析GFP-Kpnα2時發(fā)現(xiàn)，GFP-Kpnα2錯誤定位至細胞質(zhì)的程度存在差異，例如，一些細胞在化合物A處理后僅顯示細胞質(zhì)GFP-Kpnα2，而其它細胞則顯示核和細胞質(zhì)GFP-Kpnα2。據(jù)報道Kpnα2-Kpnβ1相互作用的本質(zhì)在細胞周期的不同階段發(fā)生改變(Yasuhara N,Takeda E,Inoue H,Kotera I,Yoneda Y.Importin alpha/beta-mediated nuclear protein import is regulated in a cell cycle-dependent manner.Exp Cell Res，2004年7月1日；297(1):285-93)。因此，在實驗中使用異步細胞可導致不同細胞中的不同Kpnα2定位。

此外，已證明Kpnα2可以以Kpnβ1非依賴性方式進入核，可以執(zhí)行其其它非核轉(zhuǎn)運功能，如其對有絲分裂進展的調(diào)控(Miyamoto Y,Hieda M,Harreman MT,Fukumoto M,Saiwaki T,Hodel AE,等人.Importin alpha can migrate into the nucleus in an importin beta-and Ran-independent manner.EMBO J，2002年11月1日；21(21):5833-42)。因此，在不存在Kpnβ1作用的情況下一些Kpnα2仍能夠進入核是可能的。

還分析了化合物A處理后其它Kpnβ1依賴性貨物蛋白的定位，包括轉(zhuǎn)錄因子NFY、AP-1、p65和NFAT，其全部都顯示在化合物A處理后核輸入減少。這些轉(zhuǎn)錄因子在此前研究中都已被證實依賴于Kpnβ1進行核輸入，并且在Kpnβ1抑制后其核輸入的抑制突出了核輸入抑制可影響對癌細胞存活至關重要的細胞過程的程度。

由于發(fā)現(xiàn)化合物A抑制核輸入，分析其細胞殺傷效果，并且發(fā)現(xiàn)癌細胞比非癌細胞對化合物A處理更為敏感。文獻中存在大量證據(jù)證明靶向Crm1的核輸出抑制劑呈現(xiàn)有效的抗癌活性，但對正常細胞僅有輕微影響(Etchin J,Sun Q,Kentsis A,Farmer A,Zhang ZC,Sanda T等.Antileukemic activity of nuclear export inhibitors that spare normal hematopoietic cells.Leukemia，2013年1月；27(1):66-74；Mutka SC,Yang WQ,Dong SD,Ward SL,Craig DA,Timmermans PB等.Identification of nuclear export inhibitors with potent anti-cancer activity in vivo.Cancer Res，2009年1月15日；69(2):510-7；Pathria G,Wagner C,Wagner SN.Inhibition of CRM1-mediated nucleocytoplasmic transport:triggering human melanoma cell apoptosis by perturbing multiple cellular pathways.J Invest Dermatol，2012年12月；132(12):2780-90)。

此外，利用siRNA抑制Kpnβ1還導致選擇性殺死癌細胞，由此在癌細胞中Kpnβ1沉默后誘導凋亡，而非癌細胞中的Kpnβ1抑制對細胞生物學僅具有輕微影響(Van der Watt等，2009)。由于癌癥治療的目標是促進癌細胞死亡，而對正常細胞不造成過多損傷，這種選擇性有利于研發(fā)具有治療潛力的抗核輸入藥物。選擇性可源自癌細胞相對于正常細胞的核轉(zhuǎn)運速率增加，因此對核轉(zhuǎn)運機構(gòu)(machinery)的依賴增加(Kuusisto等，2012)?？蛇x地，對癌細胞的選擇性可能是因為癌細胞相對于正常細胞“準備好(primed)”發(fā)生凋亡(更接近凋亡閾值)(Ni Chonghaile T,Sarosiek KA,Vo TT,Ryan JA,Tammareddi A,Moore VG,等人.Pretreatment mitochondrial priming correlates with clinical response to cytotoxic chemotherapy.Science，2011年11月25日；334(6059):1129-33)。

核輸入的抑制與癌細胞中多種凋亡標志的增加有關。這些包括G1細胞周期停滯、Parp的裂解和細胞色素C從線粒體向細胞質(zhì)中的釋放。細胞色素C釋放是內(nèi)在線粒體介導凋亡途徑的特征，表明化合物A處理導致內(nèi)在凋亡途徑激活。在白血病細胞中的Crm1抑制(Etchin等，2013)以及宮頸癌細胞中利用siRNA的Kpnβ1抑制(Angus等，2014)后，類似地誘導了內(nèi)在凋亡途徑。凋亡可能在核輸入抑制并且因此細胞穩(wěn)態(tài)破壞后通過關鍵蛋白的錯誤定位被誘導。因此，化合物A至K是新型核輸入抑制劑，并且其顯示體外抗癌活性?；衔顰顯示體外和體內(nèi)抗癌活性。

新型核輸入抑制劑具有抗癌效果。具體地，發(fā)現(xiàn)上述式I至XVI的化合物顯示抗癌效果。已證明化合物A通過抑制核輸入和誘導細胞凋亡而顯示抗癌活性。本領域技術(shù)人員將理解，化合物B至K通過與化合物A相同或相似的作用機制誘導細胞凋亡。已證實化合物II和化合物III具有與核輸入抑制相關的抗癌活性。已證明以上表5中所列出的化合物V至XVI具有抗癌活性。

因此提供了通式I化合物(包括化合物A至K)和化合物II至XIV、其立體異構(gòu)體或鹽在治療癌癥中的應用。更具體地，提供了化合物A至K和化合物II至XIV在治療癌癥——具體地，但是不限于，宮頸、食管、卵巢和乳腺的癌癥——中的應用。

更具體地，預期通式I化合物——其中R₁是分支或無分支的、任選地用選自胺、咪唑、醇或嗎啉的取代基官能化的C2-C5烷基；并且其中R₂是氫或甲基——和化合物II-XVI、其立體異構(gòu)體或鹽可用于治療異常生長或腫瘤。

通式I化合物——其中R₁是分支或無分支的、任選地用選自胺、咪唑、醇或嗎啉的取代基官能化的C2-C5烷基；并且其中R₂是氫或甲基——和化合物II-XVI、其立體異構(gòu)體或鹽可用于治療選自下列的惡性腫瘤或癌癥：胃的癌癥、肺的癌癥、肝的癌癥、黑素瘤、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、急性或慢性淋巴細胞性白血癥、多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng)母細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、維爾姆斯氏瘤、宮頸癌、睪丸癌、軟組織肉瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥、膀胱癌、慢性粒細胞性白血病、原發(fā)性腦癌、惡性黑素瘤、小細胞肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、惡性胰腺胰島素瘤、惡性類癌癌、惡性黑素瘤、絨毛膜癌、蕈樣霉菌病、頭或頸癌、骨肉瘤、胰腺癌、急性粒細胞性白血病、毛細胞白血病、成神經(jīng)母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、卡波西氏肉瘤、泌尿生殖癌、甲狀腺癌、食管癌、惡性高鈣血綜合癥、宮頸增生、腎細胞癌、子宮內(nèi)膜癌、真性紅細胞增多癥、特發(fā)性血小板增多癥、腎上腺皮質(zhì)癌、皮膚的癌癥、前列腺癌、喉的癌癥、外陰的癌癥和睪丸的癌癥。

這種用于治療癌癥的應用需要化合物A至K通過在Kpnβ1上結(jié)合核周蛋白α(Kpnα)和GTP結(jié)合核蛋白Ran的的重疊結(jié)合位點處結(jié)合細胞中的Kpnβ1來抑制核轉(zhuǎn)運蛋白Kpnβ1的活性。在治療癌癥中，化合物A至K、化合物II和化合物III在癌細胞中選擇地抑制蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子Kpnα、AP-1、P65、NFAT向細胞核中的輸入并且誘導細胞凋亡。

化合物A至K和化合物II至XIV、其立體異構(gòu)體或鹽中的任一種、或化合物A至K和化合物II至XIV、其立體異構(gòu)體或鹽中的任意兩種或更多種的組合的治療有效濃度根據(jù)化合物而變化，但小于100μM，優(yōu)選小于50μM，最優(yōu)選約10μM。

式I至XIV化合物、其立體異構(gòu)體或藥學上可接受的鹽可以以任何適當方式被給予對其有需要的患者，并且可構(gòu)成藥物的活性成分。這種藥物可包括其它成分，包括佐劑和載體。

式I至XIV化合物、其立體異構(gòu)體或鹽中的任一種、或式I至XIV化合物、其立體異構(gòu)體或鹽中的任意兩種或更多種的組合可以被用作治療癌癥的藥物，并且也可以用于制備用于治療癌癥的藥物。這種藥物可以具有任何適當形式。

因此，還提供治療癌癥的方法，其包括給予對其有需要的患者治療有效量的式I至XIV化合物、其立體異構(gòu)體或鹽中的任一種、或式I至XIV化合物、其立體異構(gòu)體或鹽中的任意兩種或更多種的組合。

考慮宮頸、食管、卵巢和乳腺的癌癥具體地可利用式I至XIV化合物、其立體異構(gòu)體和/或藥學上可接受的鹽中的一種或多種來治療，但是展望上文列舉的其它形式的癌癥也可用這些化合物治療。

貫穿說明書和權(quán)利要求書，除非內(nèi)容另有要求，否則用詞“包括”或變型如“包含”或“含有”將被理解為隱含包括所述整數(shù)或整數(shù)組，而非排除任何其它整數(shù)或整數(shù)組。