根據(jù)35U.S.C.§119(e)，本申請(qǐng)要求于2014年7月24日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第62/028,664號(hào)，于2014年8月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第62/044,103號(hào)以及于2015年4月24日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第62/152,575號(hào)的權(quán)益，將上述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)通過引用整體并入本文。關(guān)于序列表的聲明與本申請(qǐng)相關(guān)的序列表以文本格式提供，代替紙印本，并且在此通過引用并入說明書。含有序列表的文本文件的名稱是BLBD_037_03WO_ST25.txt。文本文件為124KB，創(chuàng)建于2015年7月23日，并且經(jīng)EFS-Web以電子方式與說明書文件同時(shí)提交。背景
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療B細(xì)胞相關(guān)病況的改進(jìn)的組合物和方法。更具體地，本發(fā)明涉及包含人源化的抗BCMA抗體或其抗原結(jié)合片段的改進(jìn)的嵌合抗原受體(CAR)，經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)這些CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞以及這些組合物在有效治療B細(xì)胞相關(guān)病況中的用途。相關(guān)技術(shù)的描述一些重大疾病涉及B淋巴細(xì)胞，即B細(xì)胞。B細(xì)胞生理學(xué)異常還可導(dǎo)致自身免疫性疾病包括但不限于全身性紅斑狼瘡(SLE)的發(fā)展。B細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化導(dǎo)致癌癥，包括但不限于淋巴瘤，例如多發(fā)性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。大多數(shù)患有B細(xì)胞惡性腫瘤(包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多發(fā)性骨髓瘤(MM))的患者是癌癥死亡率的重要貢獻(xiàn)者。B細(xì)胞惡性腫瘤對(duì)不同形式的治療的應(yīng)答是混合的。由于毒副作用，治療B細(xì)胞惡性腫瘤的傳統(tǒng)方法(包括化療和放療)效用有限。用抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗CD23、抗CD52、抗CD80以及抗HLA-DR治療性抗體進(jìn)行的免疫療法提供了有限的成功，部分原因是不良的藥代動(dòng)力學(xué)特性、血清蛋白酶對(duì)抗體的快速清除和腎小球的濾過以及有限滲入腫瘤部位和癌細(xì)胞上靶抗原的表達(dá)水平。由于CART細(xì)胞的不良的體內(nèi)擴(kuò)增、細(xì)胞在輸入之后的快速消失以及令人失望的臨床活性，試圖使用表達(dá)嵌合抗原受體(CAR)的遺傳修飾的細(xì)胞也具有有限的成功。簡(jiǎn)要概述本發(fā)明大體提供用于產(chǎn)生T細(xì)胞療法的改進(jìn)的載體以及使用所述載體的方法。更具體地，本發(fā)明提供人源化的抗BCMACAR分子及其在治療、預(yù)防或改善B細(xì)胞相關(guān)病況中的用途。不希望受任何具體理論的束縛，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，某些人源化的抗BCMACAR引起抗原非依賴性(“強(qiáng)化的(tonic)”)的細(xì)胞因子釋放，該特征將使得人源化的抗BCMACAR不適用于T細(xì)胞療法。出人意料地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可以通過改變至少人源化的抗BCMACAR的跨膜結(jié)構(gòu)域的一種或多種特性使得某些人源化的抗BCMACART細(xì)胞的強(qiáng)化的細(xì)胞因子釋放成為抗原依賴的。在多個(gè)實(shí)施方案中，提供嵌合抗原受體(CAR)，其包含：胞外結(jié)構(gòu)域；跨膜結(jié)構(gòu)域；一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；以及初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)構(gòu)域包含能結(jié)合人BCMA(B細(xì)胞成熟抗原)多肽的一個(gè)或多個(gè)表位的人源化的抗BCMA抗體或其抗原結(jié)合片段。在具體實(shí)施方案中，能結(jié)合人BCMA多肽的人源化的抗BCMA抗體或抗原結(jié)合片段選自：駱駝Ig、IgNAR、Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、F(ab)’3片段、Fv、單鏈Fv抗體(“scFv”)、雙-scFv、(scFv)2、微型抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、二硫鍵穩(wěn)定的Fv蛋白(“dsFv”)以及單結(jié)構(gòu)域抗體(sdAb，納米抗體)。在另外的實(shí)施方案中，能結(jié)合人BCMA多肽的人源化的抗BCMA抗體或抗原結(jié)合片段是scFv。在一些實(shí)施方案中，人源化的抗BCMA抗體或其抗原結(jié)合片段包含SEQIDNO：1-3中任一項(xiàng)所示出的一種或多種CDR。在具體實(shí)施方案中，人源化的抗BCMA抗體或其抗原結(jié)合片段包含SEQIDNO：4-6中任一項(xiàng)所示出的一種或多種CDR。在某些實(shí)施方案中，人源化的抗BCMA抗體或其抗原結(jié)合片段包含SEQIDNO：7-9中任一項(xiàng)所示出的可變輕鏈序列。在具體實(shí)施方案中，可變輕鏈序列包含SEQIDNO：1-3中所示出的CDR序列。在其它實(shí)施方案中，人源化的抗BCMA抗體或其抗原結(jié)合片段包含SEQIDNO：10-14中任一項(xiàng)所示出的可變重鏈序列。在另外的實(shí)施方案中，可變重鏈序列包含SEQIDNO：4-6中所示出的CDR序列。在其它實(shí)施方案中，跨膜結(jié)構(gòu)域來自選自下述的多肽：T細(xì)胞受體的α鏈、β鏈或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154以及PD1。在一些實(shí)施方案中，跨膜結(jié)構(gòu)域來自選自下述的多肽：CD8α、CD4、CD45、PD1和CD152的多肽。在一些實(shí)施方案中，跨膜結(jié)構(gòu)域來自PD1。在一些實(shí)施方案中，跨膜結(jié)構(gòu)域來自CD152。在某些實(shí)施方案中，跨膜結(jié)構(gòu)域來自CD8α。在具體實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來自選自下述的共刺激分子：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2CSLP76、TRIM以及ZAP70。在具體實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來自選自下述的共刺激分子：CD28、CD134和CD137。在另外的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來自選自下述的共刺激分子：CD28、CD134和CD137。在另外的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來自CD28。在具體實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來自CD134。在其它實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來自CD137。在某些實(shí)施方案中，CAR包含鉸鏈區(qū)多肽。在其它實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)來自選自下述的多肽：CD8α、PD1和CD152。在其它實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)多肽包含PD1的鉸鏈區(qū)。在其它實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)多肽包含CD152的鉸鏈區(qū)。在其它實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)多肽包含CD8α的鉸鏈區(qū)。在其它實(shí)施方案中，CAR包含來自PD1的鉸鏈區(qū)多肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方案中，CAR包含來自CD152的鉸鏈區(qū)多肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方案中，CAR包含來自CD8α的鉸鏈區(qū)多肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，CAR包含間隔區(qū)。在另外的實(shí)施方案中，間隔區(qū)多肽包含IgG1或IgG4的CH2和CH3區(qū)域。在具體實(shí)施方案中，CAR包含信號(hào)肽。在其它實(shí)施方案中，信號(hào)肽包含IgG1重鏈信號(hào)多肽、CD8α信號(hào)多肽或者人GM-CSF受體α信號(hào)肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：15-29、71和73中任一項(xiàng)所示出的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：15中所示出的氨基酸序列。在具體實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：16中所示出的氨基酸序列。在某一實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：17中所示出的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：18中所示出的氨基酸序列。在又一實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：19中所示出的氨基酸序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：20中所示出的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：21中所示出的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：22中所示出的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：23中所示出的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：24中所示出的氨基酸序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：25中所示出的氨基酸序列。在某一實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：26中所示出的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：27中所示出的氨基酸序列。在又一實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：28中所示出的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：29中所示出的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：71中所示出的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，CAR包含SEQIDNO：73中所示出的氨基酸序列。在多個(gè)實(shí)施方案中，提供編碼本文所考慮的CAR的多核苷酸。在多個(gè)具體實(shí)施方案中，提供編碼CAR的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列在SEQIDNO：30-44、70和72的任一項(xiàng)中示出。在多個(gè)實(shí)施方案的某些中，提供包含多核苷酸的載體，所述多核苷酸編碼本文所考慮的CAR或者如SEQIDNO：30-44、70和72的任一項(xiàng)所中示出。在某些實(shí)施方案中，載體是表達(dá)載體。在另外的實(shí)施方案中，載體是附加型載體。在具體實(shí)施方案中，載體是病毒載體。在其它實(shí)施方案中，載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在其它實(shí)施方案中，載體是慢病毒載體。在另外的實(shí)施方案中，慢病毒載體選自基本由下述組成的組：人類免疫缺陷病毒1(HIV-1)；人類免疫缺陷病毒2(HIV-2)；維斯納-梅迪(VMV)病毒；山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)；馬傳染性貧血病毒(EIAV)；貓免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在具體實(shí)施方案中，載體包含左端(5’)逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR、Psi(Ψ)包裝信號(hào)、中央聚嘌呤序列/DNA瓣片(flap)(cPPT/FLAP)、逆轉(zhuǎn)錄病毒輸出元件；與編碼本文所考慮的CAR的多核苷酸可操作地連接的啟動(dòng)子；以及右端(3’)逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR。在其它實(shí)施方案中，CAR包含異源聚腺苷酸化序列。在一些實(shí)施方案中，CAR包含乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(HPRE)或者土撥鼠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)。在某些實(shí)施方案中，5’LTR的啟動(dòng)子被異源啟動(dòng)子替換。在其它實(shí)施方案中，異源啟動(dòng)子為巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子或者猿猴病毒40(SV40)啟動(dòng)子。在具體實(shí)施方案中，5’LTR或3’LTR為慢病毒LTR。在具體實(shí)施方案中，3’LTR包含一個(gè)或多個(gè)修飾。在一些實(shí)施方案中，3’LTR包含一個(gè)或多個(gè)缺失。在某些實(shí)施方案中，3’LTR為自失活的(SIN)LTR。在一些實(shí)施方案中，聚腺苷酸化序列是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化序列或者信號(hào)兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列。在另外的實(shí)施方案中，編碼本文所考慮的CAR的多核苷酸包含優(yōu)化的Kozak序列。在其它實(shí)施方案中，與編碼本文所考慮的CAR的多核苷酸可操作地連接的啟動(dòng)子選自：巨細(xì)胞病毒即刻早期基因啟動(dòng)子(CMV)、延長(zhǎng)因子1α啟動(dòng)子(EF1-α)、磷酸甘油酸激酶-1啟動(dòng)子(PGK)、泛素C啟動(dòng)子(UBQ-C)、巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子/雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(CAG)、多瘤增強(qiáng)子/單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子(MC1)、β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(β-ACT)、猿猴病毒40啟動(dòng)子(SV40)、以及骨髓增生性肉瘤病毒增強(qiáng)子、負(fù)控制區(qū)缺失的dl587rev引物結(jié)合位點(diǎn)取代的(MND)啟動(dòng)子。在多個(gè)實(shí)施方案中，提供包含本文所考慮的載體的免疫效應(yīng)細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，免疫效應(yīng)細(xì)胞選自T淋巴細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞。在多個(gè)實(shí)施方案中，提供包含本文所考慮的免疫效應(yīng)細(xì)胞以及生理上可接受的賦形劑的組合物。在多個(gè)實(shí)施方案中，提供產(chǎn)生包含本文所考慮的CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞的方法，所述方法包括向免疫效應(yīng)細(xì)胞中引入包含編碼CAR的多核苷酸的載體。在另外的實(shí)施方案中，所述方法還包括通過使免疫效應(yīng)細(xì)胞與能結(jié)合CD3的抗體以及能結(jié)合CD28的抗體接觸而刺激所述細(xì)胞并誘導(dǎo)所述細(xì)胞增殖，從而產(chǎn)生免疫效應(yīng)細(xì)胞群。在具體實(shí)施方案中，在引入載體之前刺激所述免疫效應(yīng)細(xì)胞并誘導(dǎo)其增殖。在某些實(shí)施方案中，免疫效應(yīng)細(xì)胞包括T淋巴細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，免疫效應(yīng)細(xì)胞包括NK細(xì)胞。在多個(gè)實(shí)施方案中，提供治療有需要的對(duì)象中的B細(xì)胞相關(guān)病況的方法，所述方法包括向所述對(duì)象施用治療有效量的組合物，所述組合物包含本文所考慮的抗BCMACART細(xì)胞以及任選地包含藥學(xué)可接受的賦形劑。在其它實(shí)施方案中，B細(xì)胞相關(guān)病況是多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、具有不確定的惡性潛能的B細(xì)胞增殖、淋巴瘤樣肉芽腫病、移植后淋巴增生性病癥、免疫調(diào)節(jié)病癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、特發(fā)性血小板減少性紫癜、抗磷脂綜合征、恰加斯氏病、格雷夫斯氏病、韋格納肉芽腫、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、斯耶格倫氏綜合征、尋常天皰瘡、硬皮病、多發(fā)性硬化、抗磷脂綜合征、ANCA相關(guān)性小血管炎、古德帕斯徹病、川崎病、自身免疫性溶血性貧血以及急進(jìn)性腎小球腎炎、重鏈疾病、原發(fā)性或免疫細(xì)胞相關(guān)淀粉樣變性或者意義未明的單克隆丙種球蛋白血癥。在其它實(shí)施方案中，B細(xì)胞相關(guān)病況是B細(xì)胞惡性腫瘤。在某些實(shí)施方案中，B細(xì)胞惡性腫瘤是多發(fā)性骨髓瘤(MM)或者非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在某些實(shí)施方案中，MM選自：明顯多發(fā)性骨髓瘤、冒煙型多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞白血病、非分泌型骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨孤立性漿細(xì)胞瘤以及髓外漿細(xì)胞瘤。在一些實(shí)施方案中，NHL選自：伯基特淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(CLL/SLL)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性大細(xì)胞淋巴瘤、前體B淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤以及套細(xì)胞淋巴瘤。在具體實(shí)施方案中，B細(xì)胞相關(guān)病況是漿細(xì)胞惡性腫瘤。在其它實(shí)施方案中，B細(xì)胞相關(guān)病況是自身免疫性疾病。在另外的實(shí)施方案中，自身免疫性疾病是全身性紅斑狼瘡。在某些實(shí)施方案中，B細(xì)胞相關(guān)病況是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在具體實(shí)施方案中，B細(xì)胞相關(guān)病況是特發(fā)性血小板減少性紫癜或重癥肌無力或自身免疫性溶血性貧血。附圖的幾個(gè)視圖的簡(jiǎn)要描述圖1顯示了人源化的抗B細(xì)胞成熟抗原(抗BCMA)CAR構(gòu)建體的示意圖。圖2顯示了與表達(dá)BCMA的K562細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后，抗BCMACART細(xì)胞釋放的IFNγ的量。圖3顯示了與表達(dá)BCMA的K564細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)的抗BCMACART細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。圖4顯示了轉(zhuǎn)導(dǎo)有小鼠(抗BCMA-02)或人源化的(抗BCMA抗-BCMA-10、抗抗BCMA-11、抗抗BCMA-31)CAR序列的T細(xì)胞中抗BCMACAR的表達(dá)。圖5顯示了與表達(dá)少量或大量BCMA的K562BCMA細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系(RPMI-8226、NCI-H929)或者BCMA陰性細(xì)胞系(K562、HDLM-2)共培養(yǎng)24小時(shí)之后，抗BCMACART細(xì)胞釋放的IFNγ的量。圖6顯示了與K564-BCMA細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)的表達(dá)抗BCMACAR的T細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。圖7顯示了在含有人血清但缺乏BCMA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的表達(dá)人源化的抗BCMA-10CAR構(gòu)建體的T細(xì)胞的抗原非依賴性的細(xì)胞因子釋放。圖8顯示了在含有人血清但缺乏BCMA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的表達(dá)人源化的抗BCMA-10CAR構(gòu)建體的T細(xì)胞的抗原非依賴性的細(xì)胞因子釋放。圖9顯示了抗BCMA-02CAR構(gòu)建體、抗BCMA-10CAR構(gòu)建體、抗BCMA-10.2CAR構(gòu)建體以及抗BCMA-10.5CAR構(gòu)建體的示意圖。圖10顯示了與表達(dá)BCMA的K562細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)之后，抗BCMA-10CART細(xì)胞、抗BCMA-10.2CART細(xì)胞或者抗BCMA-10.5CART細(xì)胞釋放的IFNγ的量。圖11顯示了培養(yǎng)24小時(shí)之后，表達(dá)小鼠抗BCMA-02CAR的T細(xì)胞或者表達(dá)人源化的抗BCMA-10CAR、抗BCMA-10.2CAR或抗BCMA-10.5CAR的T細(xì)胞釋放的強(qiáng)化的IFNγ的量的比較。序列標(biāo)識(shí)符的簡(jiǎn)要描述SEQIDNO：1-3示出了本文所考慮的抗BCMACAR的示例性輕鏈CDR序列的氨基酸序列。SEQIDNO：4-6示出了本文所考慮的抗BCMACAR的示例性重鏈CDR序列的氨基酸序列。SEQIDNO：7-9示出了本文所考慮的抗BCMACAR的示例性輕鏈序列的氨基酸序列。SEQIDNO：10-14示出了本文所考慮的抗BCMACAR的示例性重鏈序列的氨基酸序列。SEQIDNO：15-29、71和73示出了本文所考慮的示例性抗BCMACAR的氨基酸序列。SEQIDNO：30-44、70和72示出了編碼本文所考慮的示例性抗BCMACAR的多核苷酸序列。SEQIDNO:45示出了人BCMA的氨基酸序列。SEQIDNO：46-56示出了多種接頭的氨基酸序列。SEQIDNO：57-69示出了蛋白酶切割位點(diǎn)和自切割多肽切割位點(diǎn)的氨基酸序列。詳細(xì)描述A.綜述本發(fā)明大體涉及用于治療B細(xì)胞相關(guān)病況的改進(jìn)的組合物和方法。本文使用的術(shù)語“B細(xì)胞相關(guān)病況”涉及包括不適當(dāng)?shù)腂細(xì)胞活性以及B細(xì)胞惡性腫瘤的病況。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及利用遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的B細(xì)胞相關(guān)病況的改進(jìn)的過繼細(xì)胞療法。遺傳方法提供了增強(qiáng)癌細(xì)胞的免疫識(shí)別和清除的潛在方式。一種有前景的策略是對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造以表達(dá)將細(xì)胞毒性重定向至癌細(xì)胞的嵌合抗原受體(CAR)。然而，用于治療B細(xì)胞病癥的既有的過繼細(xì)胞免疫療法存在危害體液免疫的嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)榧?xì)胞靶向在所有B細(xì)胞或者大部分B細(xì)胞上表達(dá)的抗原。因此，此類療法不是臨床上期望的，故而本領(lǐng)域仍有使體液免疫幸免的更有效的B細(xì)胞相關(guān)病況的療法的需求。本文公開的改進(jìn)的組合物和過繼細(xì)胞療法方法提供了遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其可以容易地被擴(kuò)增，在體內(nèi)顯示出長(zhǎng)期持久性，并通過靶向表達(dá)B細(xì)胞成熟抗原(BCMA，也被稱為CD269或腫瘤壞死因子受體超家族成員17；TNFRSF17)的B細(xì)胞降低體液免疫的損傷。BCMA是腫瘤壞死因子受體超家族成員(參見，例如Thompson等人，J.Exp.Medicine,192(1):129-135,2000；以及Mackay等人，Annu.Rev.Immunol,21:231-264,2003)。BCMA能結(jié)合B細(xì)胞活化因子(BAFF)和增殖誘導(dǎo)配體(APRIL)(參見，例如Mackay等人，2003；以及Kalled等人，ImmunologicalReviews,204:43-54,2005)。在非惡性細(xì)胞中，已報(bào)道BCMA主要在漿細(xì)胞以及成熟B細(xì)胞亞集中表達(dá)(參見，例如Laabi等人，EMBOJ.,77(1):3897-3904,1992；Laabi等人，NucleicAcidsRes.,22(7):1147-1154,1994；Kalled等人，2005；O'Connor等人，J.Exp.Medicine,199(1):91-97,2004；以及Ng等人，J.Immunol.,73(2):807-817,2004)。缺乏BCMA的小鼠是健康的，并且具有正常的B細(xì)胞數(shù)目，但是長(zhǎng)壽的漿細(xì)胞的存活受損(參見，例如O'Connor等人，2004；Xu等人，Mol.Cell.Biol,21(12):4067-4074,2001；以及Schiemann等人，Science,293(5537):2111-2114,2001)。BCMARNA在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞和其它淋巴瘤中普遍被檢測(cè)到，并且一些研究者在來自多發(fā)性骨髓瘤患者的漿細(xì)胞表面上檢測(cè)到了BCMA蛋白(參見，例如Novak等人，Blood,103(2):689-694,2004；Neri等人，ClinicalCancerResearch,73(19):5903-5909,2007；Bellucci等人，Blood,105(10):3945-3950,2005；以及Moreaux等人，Blood,703(8):3148-3157,2004)。在多個(gè)實(shí)施方案中，與包含小鼠抗體序列的抗BCMACAR相比，包含人源化的抗BCMA抗體序列的CAR高度有效；經(jīng)受穩(wěn)健的體內(nèi)擴(kuò)增；以及識(shí)別表達(dá)BCMA的人B細(xì)胞，并顯示出針對(duì)表達(dá)BCMA的B細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，大幅修飾小鼠抗人BCMA抗體序列部分(包括結(jié)構(gòu)上的以及小的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域)未大幅改變?nèi)嗽椿目笲CMACART細(xì)胞的功能，并且與表達(dá)參照人源化的抗BCMACAR的T細(xì)胞相比，通過至少改變?nèi)嗽椿目笲CMACAR的跨膜結(jié)構(gòu)域可以增加或降低人源化的抗BCMACART細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放性能。在具體實(shí)施方案中，人源化的抗BCMACAR導(dǎo)致出人意料的高度抗原非依賴性的或者強(qiáng)化的細(xì)胞因子釋放。在具體實(shí)施方案中，改變產(chǎn)生抗原非依賴性的細(xì)胞因子釋放的人源化的抗BCMACAR的跨膜結(jié)構(gòu)域，以使與表達(dá)未改變的人源化的抗BCMACAR的T細(xì)胞相比，改變的人源化的抗BCMACART細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)性能(例如，細(xì)胞因子釋放)變?yōu)榛旧鲜强乖蕾囆缘?。在某些?shí)施方案中，改變產(chǎn)生抗原非依賴性的細(xì)胞因子釋放的人源化的抗BCMACAR的跨膜結(jié)構(gòu)域，以使與表達(dá)未改變的人源化的抗BCMACAR的T細(xì)胞相比，改變的人源化的抗BCMACART細(xì)胞變?yōu)榛旧鲜强乖蕾囆缘?，或者在不存在抗原的情況下釋放大幅降低的細(xì)胞因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含人源化的抗BCMA抗體或抗原結(jié)合片段、跨膜結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的CAR。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)本文所考慮的CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞。表達(dá)CAR的T細(xì)胞在本文被稱為CART細(xì)胞或者CAR修飾的T細(xì)胞。在多個(gè)實(shí)施方案中，將本文所考慮的遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞施用于患有B細(xì)胞相關(guān)病況例如與B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病或B細(xì)胞惡性腫瘤的患者。除非明確指明相反，否則本發(fā)明的實(shí)施將采用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的常規(guī)化學(xué)、生物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的方法，出于示例的目的，下文描述了其中的一些。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中被充分解釋。參見，例如，Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(第3版,2001)；Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版,1989)；Maniatis等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(1982)；Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley和Sons,2008年7月更新)；ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePub.Associates和Wiley-Interscience；Glover,DNACloning:APracticalApproach,vol.I&II(IRLPress,Oxford,1985)；Anand,TechniquesfortheAnalysisofComplexGenomes,(AcademicPress,NewYork,1992)；TranscriptionandTranslation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)；Perbal,APracticalGuidetoMolecularCloning(1984)；Harlow和Lane,Antibodies,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1998)CurrentProtocolsinImmunologyQ.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober,eds.,1991)；AnnualReviewofImmunology；以及期刊專著如AdvancesinImmunology。B.定義除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。盡管在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中可以使用與本文描述的方法和材料類似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了組合物、方法和材料的優(yōu)選實(shí)施方案。出于本發(fā)明的目的，下文定義了以下術(shù)語。冠詞“一個(gè)/一種(a)”、“一個(gè)/一種(an)”和“所述(the)”在本文用來指“一個(gè)/一種”或者指“一個(gè)以上/一種以上”(即，指“至少一個(gè)/一種”或者指一個(gè)或多個(gè)/一種或多種)所述冠詞的語法對(duì)象。舉例來說，“元素”意指一個(gè)元素或者一個(gè)或多個(gè)元素?？蛇x的(例如“或者”)的使用應(yīng)被理解為意指可選項(xiàng)中的一項(xiàng)、兩項(xiàng)或其任何組合。術(shù)語“和/或”應(yīng)被理解為意指可選項(xiàng)中的一項(xiàng)或兩項(xiàng)。本文使用的術(shù)語“約”或者“大約”指與參照量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長(zhǎng)度相比，改變至多15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“約”或“大約”指參照量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長(zhǎng)度周圍±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或者±1％的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長(zhǎng)度范圍。在整個(gè)說明書中，除非上下文另有要求，單詞“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”將被理解為暗示包括指定的步驟或元素或者步驟或元素的組，但不排除任何其它步驟或元素或者步驟或元素的組。“由......組成”意指包括且限于短語“由......組成”之后的任何內(nèi)容。因此，短語“由......組成”表示列出的元素是必需或強(qiáng)制的，并且不可以存在其它元素?！盎旧嫌?.....組成”意指包括在短語之后列出的任何元素，且限于不干擾或者不促進(jìn)本公開針對(duì)所列元素所指明的活性或作用的其它元素。因此，短語“基本上由......組成”表示所列元素是必需的或強(qiáng)制的，但是不存在極大地影響所列元素的活性或作用的其它元素。在整個(gè)說明書中提及的“一個(gè)實(shí)施方案”、“實(shí)施方案”、“具體實(shí)施方案”、“相關(guān)實(shí)施方案”、“某些實(shí)施方案”、“另外的實(shí)施方案”或“其它實(shí)施方案”或者以上的組合意指，結(jié)合實(shí)施方案所描述的具體特征、結(jié)構(gòu)或特性被包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案中。因此，前述短語在整個(gè)說明書的多個(gè)地方的出現(xiàn)不一定全部指相同的實(shí)施方案。而且，可以在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，以任意合適的方式將具體的特征、結(jié)構(gòu)或特性進(jìn)行組合。也應(yīng)理解，在一個(gè)實(shí)施方案中積極敘述的特征作為在具體實(shí)施方案中將所述特征排除在外的基礎(chǔ)。C.嵌合抗原受體在多個(gè)實(shí)施方案中，提供了將免疫效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性重定向至B細(xì)胞的遺傳改造的受體。這些遺傳改造的受體在本文被稱為嵌合抗原受體(CAR)。CAR是這樣的分子：將基于抗體的對(duì)期望抗原(例如BCMA)的特異性與T細(xì)胞受體活化胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組合，以產(chǎn)生顯示出特異性的抗BCMA細(xì)胞免疫活性的嵌合蛋白。本文使用的術(shù)語“嵌合的”描述了由不同蛋白的部分組成或者由來自不同來源的DNA組成。本文所考慮的CAR包含能結(jié)合BCMA的胞外結(jié)構(gòu)域(也被稱為結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。CAR的抗BCMA抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶細(xì)胞表面上的BCMA的銜接導(dǎo)致CAR的聚集，并向包含CAR的細(xì)胞遞送活化刺激。CAR的主要特性是其使免疫效應(yīng)細(xì)胞的特異性重定向，從而引發(fā)增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生、吞噬作用或者能夠以主要組織相容性復(fù)合物(MHC)非依賴性的方式介導(dǎo)表達(dá)靶抗原的細(xì)胞的細(xì)胞死亡的分子的產(chǎn)生的能力，其利用單克隆抗體、可溶性配體或細(xì)胞特異性共受體的細(xì)胞特異性靶向能力。在多個(gè)實(shí)施方案中，CAR包含含有人源化的BCMA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域；跨膜結(jié)構(gòu)域；一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；以及初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方案中，CAR包含胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域；一個(gè)或多個(gè)鉸鏈結(jié)構(gòu)域或間隔結(jié)構(gòu)域；跨膜結(jié)構(gòu)域；一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；以及初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含人源化的抗BCMA抗體或其抗原結(jié)合片段。1.結(jié)合結(jié)構(gòu)域在具體實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含能特異性結(jié)合B細(xì)胞上表達(dá)的人BCMA多肽的人源化的抗BCMA抗體或者其抗原結(jié)合片段。本文使用的術(shù)語“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”、“胞外結(jié)構(gòu)域”、“胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域”、“抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域”和“胞外抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域”可互換使用，并且提供了了具有特異性結(jié)合目標(biāo)靶抗原(例如BCMA)的能力的CAR。結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以源自天然來源、合成來源、半合成來源或者重組來源。本文使用的術(shù)語“特異性結(jié)合親和力(specificbindingaffinity)”或“特異性結(jié)合(specificallybinds)”或“特異性結(jié)合(specificallybound)”或“特異性結(jié)合(specificbinding)”或“特異性靶向(specificallytarget)”描述了抗BCMA抗體或其抗原結(jié)合片段(或者包含抗BCMA抗體或其抗原結(jié)合片段的CAR)以高于背景結(jié)合的結(jié)合親和力與BCMA的結(jié)合。如果結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或者包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的CAR或含有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)以例如大于或等于約105M-1的親和力或Ka(即，具體的結(jié)合相互作用的平衡締合常數(shù)，單位為1/M)與BCMA結(jié)合或締合，則其與BCMA“特異性結(jié)合”。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或其融合蛋白)以大于或等于約106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1的Ka與靶標(biāo)結(jié)合?！案哂H和力”結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或其單鏈融合蛋白)指Ka為至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1或更高的那些結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？蛇x地，親和力可以被定義為具體結(jié)合相互作用的平衡解離常數(shù)(Kd)，單位為M(例如，10-5M至10-13M或更低)。使用常規(guī)的技術(shù)，可以容易地測(cè)定本公開的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽和CAR蛋白的親和力，例如，通過競(jìng)爭(zhēng)性ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)，或通過結(jié)合締合，或利用標(biāo)記配體的位移分析(displacementassay)，或者使用表面等離子共振裝置(如BiacoreT100，其可獲自Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)或光學(xué)生物傳感器技術(shù)(如可分別獲自Corning和PerkinElmer的EPIC系統(tǒng)或EnSpire)(還參見，例如，Scatchard等人(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；和美國(guó)專利第5,283,173號(hào)、第5,468,614號(hào)或同等物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，特異性結(jié)合的親和力高于背景結(jié)合約2倍、高于背景結(jié)合約5倍、高于背景結(jié)合約10倍、高于背景結(jié)合約20倍、高于背景結(jié)合約50倍、高于背景結(jié)合約100倍或者高于背景結(jié)合約1000倍或者更高。在具體實(shí)施方案中，CAR的胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗體或其抗原結(jié)合片段?！翱贵w”指這樣的結(jié)合劑：其為至少包含輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)的多肽，所述免疫球蛋白可變區(qū)特異性識(shí)別并結(jié)合抗原的表位，所述抗原如含有抗原決定簇(如由免疫細(xì)胞所識(shí)別的那些)的肽、脂質(zhì)、多糖或核酸。“抗原(Ag)”指能夠刺激動(dòng)物中產(chǎn)生抗體或T細(xì)胞應(yīng)答的化合物、組合物或物質(zhì)，包括注射進(jìn)動(dòng)物或者被動(dòng)物吸收的組合物(如包含癌癥特異性蛋白的組合物)?？乖c特異性體液免疫或細(xì)胞免疫的產(chǎn)物反應(yīng)，包括由異源抗原如本申請(qǐng)所公開的抗原所誘導(dǎo)的產(chǎn)物。在具體實(shí)施方案中，靶抗原是BCMA多肽的表位?！氨砦弧被颉翱乖瓫Q定簇”指結(jié)合劑能結(jié)合的抗原區(qū)。表位可以由連續(xù)的氨基酸形成或者通過蛋白的三級(jí)折疊而并置的非連續(xù)氨基酸形成。由連續(xù)的氨基酸形成的表位在暴露于變性溶劑時(shí)通常保留，而通過三級(jí)折疊形成的表位在用變性溶劑處理時(shí)通常喪失。表位通常包含在單一空間構(gòu)象中的至少3個(gè)氨基酸，并且更通常至少5個(gè)、約9個(gè)或者約8-10個(gè)氨基酸?？贵w包括其抗原結(jié)合片段，如駱駝Ig、IgNAR、Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、F(ab)’3片段、Fv、單鏈Fv蛋白(“scFv”)、雙scFv、(scFv)2、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、二硫鍵穩(wěn)定的Fv蛋白(“dsFv”)和單結(jié)構(gòu)域抗體(sdAb，納米抗體)以及負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的全長(zhǎng)抗體的部分。該術(shù)語還包括遺傳改造的形式，如嵌合抗體(例如，人源化的鼠抗體)、異源綴合抗體(如雙特異性抗體)及其抗原結(jié)合片段。也參見PierceCatalog和Handbook,1994-1995(PierceChemicalCo.,Rockford,IL)；Kuby,J.,Immunology，第3版，W.H.Freeman&Co.,NewYork,1997。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解以及如本文別處所述，完整的抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。各重鏈由可變區(qū)以及第一恒定區(qū)、第二恒定區(qū)和第三恒定區(qū)組成，而各輕鏈由可變區(qū)和恒定區(qū)組成。哺乳動(dòng)物的重鏈被分為α、δ、ε、γ和μ。哺乳動(dòng)物的輕鏈被分為λ或κ。包含α、δ、ε、γ和μ重鏈的免疫球蛋白被分為免疫球蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG和IgM。完整的抗體形成“Y”形。Y的莖部由結(jié)合在一起的兩條重鏈的第二和第三恒定區(qū)(以及對(duì)于IgE和IgM，第四恒定區(qū))組成，并在鉸鏈處形成二硫鍵(鏈間)。重鏈γ、α和δ具有由三個(gè)串聯(lián)(排成一列)Ig結(jié)構(gòu)域組成的恒定區(qū)以及用于增加靈活性的鉸鏈區(qū)；重鏈μ和ε具有由四個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成的恒定區(qū)。第二和第三恒定區(qū)分別被稱為“CH2結(jié)構(gòu)域”和“CH3結(jié)構(gòu)域”。Y的各臂均包含與單一輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)結(jié)合的單一重鏈的可變區(qū)和第一恒定區(qū)。輕鏈和重鏈的可變區(qū)負(fù)責(zé)抗原結(jié)合。輕鏈和重鏈可變區(qū)含有被三個(gè)高變區(qū)，也被稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”間隔的“框架”區(qū)，也被稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法，如通過根據(jù)Kabat等人(Wu,TT和Kabat,E.A.,JExpMed.132(2):211-50,(1970)；Borden,P.和KabatE.A.,PNAS,84:2440-2443(1987)；(參見,Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,1991,在此將其通過引用并入)的序列，或者通過根據(jù)Chothia等人(Chothia,C.和Lesk,A.M.,JMol.Biol.,196(4):901-917(1987),Chothia,C.等人,Nature,342:877-883(1989))的結(jié)構(gòu)來限定或鑒定CDR。不同輕鏈或重鏈的框架區(qū)的序列在物種(如人)內(nèi)相對(duì)保守?？贵w的框架區(qū)(其為組成的輕鏈和重鏈的組合框架區(qū))用于在三維空間中定位和對(duì)齊CDR。CDR主要負(fù)責(zé)與抗原表位結(jié)合。各鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號(hào)，并且通常還通過特定CDR所位于的鏈來確定。因此，位于抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)的CDR被稱作CDRH1、CDRH2和CDRH3，而位于抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)的CDR被稱作CDRL1、CDRL2和CDRL3。具有不同特異性(即，針對(duì)不同抗原的不同結(jié)合位點(diǎn))的抗體具有不同的CDR。盡管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內(nèi)只有有限數(shù)量的氨基酸位置直接參與抗原結(jié)合。CDR內(nèi)的這些位置被稱為特異性決定殘基(SDR)。適用于構(gòu)建本文所考慮的人源化的抗BCMACAR的輕鏈CDR的示例性實(shí)例包括但不限于SEQIDNO：1-3中所示出的CDR序列。適用于構(gòu)建本文所考慮的人源化的抗BCMACAR的重鏈CDR的示例性實(shí)例包括但不限于SEQIDNO：4-6中所示出的CDR序列。提及“VH”或“VH”，指免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，包括抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文所公開的其它抗體片段的重鏈可變區(qū)。提及“VL”或“VL”，指免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，其包括抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文所公開的其它抗體片段的輕鏈可變區(qū)?！皢慰寺】贵w”是由B淋巴細(xì)胞的單一克隆或者由轉(zhuǎn)染有單一抗體的輕鏈和重鏈基因的細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如通過骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞的融合體制備雜交的抗體形成細(xì)胞來產(chǎn)生單克隆抗體。單克隆抗體包括人源化單克隆抗體?！扒逗峡贵w”具有來自一個(gè)物種(如人)的框架殘基和來自另外物種(如小鼠)的CDR(其通常賦予抗原結(jié)合)。在具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榍逗峡贵w或其抗原結(jié)合片段。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體是能特異性結(jié)合人BCMA多肽的人源化抗體(如人源化單克隆抗體)或其片段?！叭嗽椿笨贵w是包括人框架區(qū)和來自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被稱為“供體”，并且提供框架的人免疫球蛋白被稱為“接受體”。在一個(gè)實(shí)施方案中，在人源化的免疫球蛋白中，所有的CDR均來自供體的免疫球蛋白。不需要存在恒定區(qū)，但是如果存在，其必須與人免疫球蛋白的恒定區(qū)基本上相同，即至少約85-90％相同，如約95％或者更多的相同。因此，可能除了CDR，人源化免疫球蛋白的所有部分均與天然的人免疫球蛋白序列的相應(yīng)部分基本相同。人源化的單克隆抗體或者其它單克隆抗體可以具有對(duì)于抗原結(jié)合或者其它的免疫球蛋白功能基本上無影響的其它保守氨基酸置換?？梢酝ㄟ^遺傳改造的方法構(gòu)建人源化抗體(參見例如，美國(guó)專利第5,585,089號(hào))。在具體實(shí)施方案中，人源化的抗BCMA抗體或其抗原結(jié)合片段，包括但不限于：駱駝Ig(駱駝科抗體(VHH))、IgNAR、Fab片段、Fab’片段、F(ab)’2片段、F(ab)’3片段、Fv、單鏈Fv抗體(“scFv”)、雙-scFv、(scFv)2、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、二硫鍵穩(wěn)定的Fv蛋白(“dsFv”)和單結(jié)構(gòu)域抗體(sdAb，納米抗體)。本文使用的“駱駝Ig”或“駱駝科VHH”指重鏈抗體的最小的已知抗原結(jié)合單元(Koch-Nolte等人,FASEBJ.,21:3490-3498(2007))?！爸劓溈贵w”或“駱駝科抗體”指含有兩個(gè)VH結(jié)構(gòu)域且不含輕鏈的抗體(RiechmannL.等人,J.Immunol.Methods231:25–38(1999)；WO94/04678；WO94/25591；美國(guó)專利第6,005,079號(hào))。“免疫球蛋白新抗原受體”的“IgNAR”指由一個(gè)可變的新抗原受體(VNAR)結(jié)構(gòu)域和五個(gè)恒定的新抗原受體(CNAR)結(jié)構(gòu)域的同源二聚體組成的來自鯊魚免疫庫的抗體類型。IgNAR代表一些基于最小的已知免疫球蛋白的蛋白支架，并且高度穩(wěn)定，且具有高效結(jié)合的特性。固有的穩(wěn)定性可以歸因于(i)基礎(chǔ)的Ig支架，與存在于鼠抗體中的常規(guī)抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域相比，其存在大量帶電荷的且親水表面暴露的殘基；和(ii)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)環(huán)中的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)特征，包括環(huán)間二硫橋和環(huán)內(nèi)氫鍵形式。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生被稱為“Fab”片段的兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段和剩余的“Fc”片段，各“Fab”片段均含有單一抗原結(jié)合位點(diǎn)，“Fc”片段的名字反映了其易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生F(ab’)2片段，其含有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且仍能夠交聯(lián)抗原?！癋v”是含有完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈Fv種類由緊密非共價(jià)締合的一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。在單鏈Fv(scFv)種類中，一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可以通過柔性肽接頭共價(jià)連接，以使輕鏈和重鏈能夠以與雙鏈Fv種類中的結(jié)構(gòu)類似的“二聚”結(jié)構(gòu)締合。在該構(gòu)型中，各可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)高變區(qū)(HVR)相互作用，以限定VH-VL二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。共同地，六個(gè)HVR賦予抗體抗原結(jié)合特異性。然而，甚至單一可變結(jié)構(gòu)域(或者僅包含三個(gè)對(duì)抗原具有特異性的HVR的Fv的一半)也具有識(shí)別并結(jié)合抗原的能力，盡管具有低于整個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的親和力。Fab片段含有重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且還含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。Fab’片段與Fab片段的不同之處在于，在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基端添加了幾個(gè)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab’-SH是本文對(duì)其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基具有游離的巰基的Fab’的命名。F(ab’)2抗體片段最初作為在其間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab’片段對(duì)而產(chǎn)生?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)體也是已知的。術(shù)語“雙鏈抗體”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，所述片段在同一多肽鏈(VH-VL)中包含與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。通過使用太短而不能使同一鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，結(jié)構(gòu)域被迫與另一鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并且產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙鏈抗體可以是二價(jià)的或雙特異性的。雙鏈抗體更充分地描述于例如，EP404,097；WO1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等人，PNASUSA90:6444-6448(1993)。三鏈抗體和四鏈抗體也描述于Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)。“單結(jié)構(gòu)域抗體”或“sdAb”或“納米抗體”指由抗體重鏈的可變區(qū)(VH結(jié)構(gòu)域)或抗體輕鏈的可變區(qū)(VL結(jié)構(gòu)域)組成的抗體片段(Holt,L.等人，TrendsinBiotechnology,21(11):484-490)?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈上且處于任一方向(例如，VL-VH或VH-VL)。通常，scFv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，所述接頭使scFv能夠形成用于抗原結(jié)合的期望結(jié)構(gòu)。對(duì)于scFv的綜述，參見，例如，Pluckthün,inThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,Rosenburg和Moore編輯,(Springer-Verlag,NewYork,1994),pp.269-315。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)閟cFv并且可以是鼠scFv、人scFv或者人源化的scFv?？捎蓪?duì)期望靶點(diǎn)具有特異性的雜交瘤的V區(qū)基因克隆單鏈抗體。此類雜交瘤的產(chǎn)生已經(jīng)是常規(guī)的。可用于克隆可變區(qū)重鏈(VH)和可變區(qū)輕鏈(VL)的技術(shù)描述于，例如Orlandi等人，PNAS,1989；86:3833-3837中。在具體實(shí)施方案中，抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域是能結(jié)合人BCMA多肽的人源化的scFv。適用于構(gòu)建本文所考慮的抗BCMACAR的可變重鏈的示例性實(shí)例包括但不限于SEQIDNO：10-14中示出的氨基酸序列。適用于構(gòu)建本文所考慮的抗BCMACAR的可變輕鏈的示例性實(shí)例包括但不限于SEQIDNO：7-9中示出的氨基酸序列。示例性的人源化抗BCMA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域是對(duì)BCMA具有特異性的免疫球蛋白可變區(qū)，其包含至少一個(gè)人框架區(qū)?！叭丝蚣軈^(qū)”指人免疫球蛋白可變區(qū)的野生型(即天然存在的)框架區(qū)；人免疫球蛋白可變區(qū)的改變的框架區(qū)，該區(qū)域中少于約50％(例如，優(yōu)選少于約45％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)的氨基酸缺失或被置換(例如，用非人免疫球蛋白框架區(qū)相應(yīng)位置處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基)；或者非人免疫球蛋白可變區(qū)的改變的框架區(qū)，該區(qū)域中少于約50％(例如，少于45％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)的氨基酸缺失或被置換(例如，在暴露的殘基的位置處和/或用人免疫球蛋白框架區(qū)相應(yīng)位置處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基)，以在一方面降低免疫原性。在某些實(shí)施方案中，人框架區(qū)為人免疫球蛋白可變區(qū)的野生型框架區(qū)。在某些其它實(shí)施方案中，人框架區(qū)是在1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或者更多個(gè)位置處具有氨基酸缺失或置換的人免疫球蛋白可變區(qū)的改變的框架區(qū)。在其它實(shí)施方案中，人框架區(qū)是在1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或者更多個(gè)位置處具有氨基酸缺失或置換的非人免疫球蛋白可變區(qū)的改變的框架區(qū)。在具體實(shí)施方案中，BCMA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含選自下述的至少1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種或8種人框架區(qū)(FR)：人輕鏈FR1、人重鏈FR1、人輕鏈FR2、人重鏈FR2、人輕鏈FR3、人重鏈FR3、人輕鏈FR4和人重鏈FR4。可以存在于BCMA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的人FR還包括本文所提供的示例性FR的變體，其中所述示例性FR的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或者更多個(gè)氨基酸被置換或缺失。在某些實(shí)施方案中，人源化的抗BCMA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含(a)含有人輕鏈FR1、人輕鏈FR2、人輕鏈FR3和人輕鏈FR4的人源化輕鏈可變區(qū)，以及(b)含有人重鏈FR1、人重鏈FR2、人重鏈FR3和人重鏈FR4的人源化重鏈可變區(qū)。本文提供的BCMA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域還包含1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或6個(gè)CDR。此類CDR可以是選自輕鏈的CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重鏈的CDRH1、CDRH2和CDRH3的非人CDR或改變的非人CDR。在某些實(shí)施方案中，BCMA特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含(a)含有輕鏈CDRL1、輕鏈CDRL2和輕鏈CDRL3的輕鏈可變區(qū)，以及(b)含有重鏈CDRH1、重鏈CDRH2和重鏈CDRH3的重鏈可變區(qū)。2.接頭在某些實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR在各結(jié)構(gòu)域之間可以包含接頭殘基，例如為了分子的適當(dāng)間隔和構(gòu)象而添加的接頭殘基。在具體實(shí)施方案中，接頭是可變區(qū)連接序列?！翱勺儏^(qū)連接序列”是這樣的氨基酸序列：其連接VH和VL結(jié)構(gòu)域并提供與兩個(gè)亞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相互作用可兼容的間隔功能，以使產(chǎn)生的多肽保留與含有相同的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體相同的對(duì)相同靶分子的特異性結(jié)合親和力。本文所考慮的CAR可以包含1、2、3、4或5個(gè)或者更多個(gè)接頭。在具體實(shí)施方案中，接頭的長(zhǎng)度是約1個(gè)至約25個(gè)氨基酸、約5個(gè)至約20個(gè)氨基酸或約10個(gè)至約20個(gè)氨基酸或者任意介于中間的氨基酸長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，接頭的長(zhǎng)度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個(gè)或者更多個(gè)氨基酸。接頭的示例性實(shí)例包括甘氨酸聚合物(G)n；甘氨酸-絲氨酸聚合物(G1-5S1-5)n，其中n是至少1、2、3、4或5的整數(shù)；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-絲氨酸聚合物；以及本領(lǐng)域已知的其它柔性接頭。甘氨酸和甘氨酸-絲氨酸聚合物相對(duì)非結(jié)構(gòu)化，并且因此可以作為融合蛋白(如本文所描述的CAR)的結(jié)構(gòu)域之間的中性系鏈(neutraltether)。甘氨酸甚至比丙氨酸更顯著地接近空間，并且比具有更長(zhǎng)側(cè)鏈的殘基受到更少的限制(參見Scheraga,Rev.ComputationalChem.11173-142(1992))。普通技術(shù)人員將理解，在具體實(shí)施方案中，CAR的設(shè)計(jì)可以包含完全或部分柔性的接頭，使得接頭可以包含柔性接頭以及賦予較小柔性結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)部分以提供期望的CAR結(jié)構(gòu)。其它示例性接頭包括但不限于下述氨基酸序列：GGG；DGGGS(SEQIDNO：46)；TGEKP(SEQIDNO：47)(參見，例如，Liu等人,PNAS5525-5530(1997))；GGRR(SEQIDNO：48)(Pomerantz等人.1995,同上)；(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4或5(SEQIDNO：49)(Kim等人,PNAS93,1156-1160(1996)；EGKSSGSGSESKVD(SEQIDNO：50)(Chaudhary等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQIDNO：51)(Bird等人,1988,Science242:423-426)，GGRRGGGS(SEQIDNO：52)；LRQRDGERP(SEQIDNO：53)；LRQKDGGGSERP(SEQIDNO：54)；LRQKd(GGGS)2ERP(SEQIDNO：55)。可選地，可以使用能夠模建DNA-結(jié)合位點(diǎn)和肽自身的計(jì)算機(jī)程序(Desjarlais&Berg,PNAS90:2256-2260(1993),PNAS91:11099-11103(1994))或者通過噬菌體展示方法合理地設(shè)計(jì)柔性接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭包含下述氨基酸序列：GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQIDNO:56)(Cooper等人，Blood,101(4):1637-1644(2003))。3.間隔結(jié)構(gòu)域在具體實(shí)施方案中，CAR的結(jié)合結(jié)構(gòu)域之后是一個(gè)或多個(gè)“間隔結(jié)構(gòu)域”，所述“間隔結(jié)構(gòu)域”指這樣的區(qū)域：其使抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域遠(yuǎn)離效應(yīng)細(xì)胞的表面，以能夠進(jìn)行適當(dāng)?shù)募?xì)胞/細(xì)胞接觸、抗原結(jié)合和活化(Patel等人,GeneTherapy,1999；6:412-419)。鉸鏈結(jié)構(gòu)域可以源自天然來源、合成來源、半合成來源或重組來源。在某些實(shí)施方案中，間隔結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于，一個(gè)或多個(gè)重鏈恒定區(qū)，例如CH2和CH3。間隔結(jié)構(gòu)域可以包含天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)或改變的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，間隔結(jié)構(gòu)域包含IgG1或IgG4的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。4.鉸鏈結(jié)構(gòu)域通常，CAR的結(jié)合結(jié)構(gòu)域之后是一個(gè)或多個(gè)“鉸鏈結(jié)構(gòu)域”，其在將抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域定位于遠(yuǎn)離效應(yīng)細(xì)胞表面以能夠進(jìn)行適當(dāng)?shù)募?xì)胞/細(xì)胞接觸、抗原結(jié)合和活化方面發(fā)揮作用。CAR通常在結(jié)合結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)之間包含一個(gè)或多個(gè)鉸鏈結(jié)構(gòu)域。鉸鏈結(jié)構(gòu)域可以源自天然來源、合成來源、半合成來源或重組來源。鉸鏈結(jié)構(gòu)域可以包含天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)或改變的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的氨基酸序列?！案淖兊你q鏈區(qū)”指(a)具有高至30％的氨基酸改變(例如，高至25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸置換或缺失)的天然存在的鉸鏈區(qū)，(b)具有高至30％的氨基酸改變(例如，高至25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸置換或缺失)的長(zhǎng)度為至少10個(gè)氨基酸(例如，至少12、13、14或15個(gè)氨基酸)的天然存在的鉸鏈區(qū)的一部分，或者(c)包含核心鉸鏈區(qū)的天然存在的鉸鏈區(qū)的一部分(其長(zhǎng)度可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸，或者至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸)。在某些實(shí)施方案中，天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基可被一個(gè)或多個(gè)其它氨基酸殘基(例如，一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基)置換。可選地或此外，改變的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)可以具有野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的脯氨酸殘基被其它氨基酸殘基(例如，絲氨酸殘基)置換。適用于本文所描述的CAR的其它示例性鉸鏈結(jié)構(gòu)域包括源自1型膜蛋白(如CD8α、CD4、CD28、PD1、CD152和CD7)胞外區(qū)的鉸鏈區(qū)，其可以是來自這些分子的野生型鉸鏈區(qū)，或者可以是改變了的鉸鏈區(qū)。在另一實(shí)施方案中，鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含PD1、CD152或CD8α鉸鏈區(qū)。5.跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域“跨膜結(jié)構(gòu)域”是CAR的一部分，其使胞外結(jié)合部分和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域融合，并且使CAR錨定至免疫效應(yīng)細(xì)胞的質(zhì)膜上。TM結(jié)構(gòu)域可以源自天然來源、合成來源、半合成來源或重組來源。TM結(jié)構(gòu)域可以源自(即至少包括下述的跨膜結(jié)構(gòu)域)：T細(xì)胞受體的α鏈、β鏈或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154以及PD1。在具體實(shí)施方案中，TM結(jié)構(gòu)域是合成的，并且主要包含疏水殘基，如亮氨酸和纈氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含源自PD1、CD152或CD8α的TM結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含源自PD1、CD152或CD8α的TM結(jié)構(gòu)域以及優(yōu)選長(zhǎng)度為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸的短的寡肽或多肽接頭，所述接頭連接CAR的TM結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。基于甘氨酸-絲氨酸接頭提供特別合適的接頭。6.胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域在具體實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域?！鞍麅?nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”指CAR的一部分，其參與將有效的抗BCMACAR結(jié)合人BCMA多肽的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)免疫效應(yīng)細(xì)胞的內(nèi)部，以引發(fā)效應(yīng)細(xì)胞的功能，例如活化、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、增殖和細(xì)胞毒活性，包括細(xì)胞毒性因子至CAR結(jié)合的靶細(xì)胞的釋放或者用與胞外CAR結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗原引發(fā)的其它細(xì)胞應(yīng)答。術(shù)語“效應(yīng)功能”指免疫效應(yīng)細(xì)胞的特化功能。T細(xì)胞的效應(yīng)功能，例如，可以是細(xì)胞溶解活性或者輔助或者包括細(xì)胞因子的分泌在內(nèi)的活性。因此，術(shù)語“胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”指轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)功能信號(hào)并指導(dǎo)細(xì)胞執(zhí)行特化功能的蛋白部分。雖然通常可以采用整個(gè)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，但是在許多情況下，不必使用整個(gè)結(jié)構(gòu)域。就使用胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的截短部分而言，此類截短部分可以用于代替整個(gè)結(jié)構(gòu)域，只要其能轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)功能信號(hào)。術(shù)語胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域意指包括足以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)功能信號(hào)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的任何截短部分。已知，通過單獨(dú)的TCR產(chǎn)生的信號(hào)不足以完全活化T細(xì)胞，并且還需要次級(jí)信號(hào)或共刺激信號(hào)。因此，T細(xì)胞活化可以認(rèn)為是由兩種不同類型的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的：初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其通過TCR(例如，TCR/CD3復(fù)合物)起始抗原依賴性的初級(jí)活化；和共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其以抗原非依賴性的方式起作用以提供次級(jí)或共刺激信號(hào)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含含有一個(gè)或多個(gè)“共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”和“初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以刺激的方式或抑制的方式調(diào)控TCR復(fù)合物的初級(jí)活化。以刺激方式起作用的初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以包含被稱為免疫受體酪氨酸活化基序或ITAM的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基序。在本發(fā)明中特別有用的含有ITAM的初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的示例性實(shí)例包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，CAR包含CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。胞內(nèi)初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以以任意順序串聯(lián)連接至跨膜結(jié)構(gòu)域的羧基端。本文所考慮的CAR包含一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以增強(qiáng)表達(dá)CAR受體的T細(xì)胞的效力和擴(kuò)增。本文使用的術(shù)語“共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”或“共刺激結(jié)構(gòu)域”指共刺激分子的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。共刺激分子是抗原受體或Fc受體之外的細(xì)胞表面分子，其在抗原結(jié)合時(shí)提供T淋巴細(xì)胞的高效活化和功能所需的第二信號(hào)。此類共刺激分子的示例性實(shí)例包括：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2CSLP76、TRIM以及ZAP70。在一個(gè)實(shí)施方案中，CAR包含選自CD28、CD137和CD134的一個(gè)或多個(gè)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在另一實(shí)施方案中，CAR包含CD28和CD137共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。而在另一實(shí)施方案中，CAR包含CD28和CD134共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，CAR包含CD137和CD134共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，CAR包含CD137共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，CAR包含CD134共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，CAR包含CD28共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR包含能特異性結(jié)合B細(xì)胞上表達(dá)的BCMA多肽的人源化的抗BCMA抗體或其抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，CAR包含能結(jié)合BCMA多肽的人源化的抗BCMAscFv、跨膜結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、以及初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述跨膜結(jié)構(gòu)域源自選自下述的多肽：T細(xì)胞受體的α鏈β鏈或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154以及PD1；所述一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來自選自下述的共刺激分子：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2CSLP76、TRIM以及ZAP70；所述初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d。在一個(gè)實(shí)施方案中，CAR包含能結(jié)合BCMA多肽的人源化的抗BCMAscFv、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域選自：IgG1鉸鏈/CH2/CH3、IgG4鉸鏈/CH2/CH3、PD1鉸鏈、CD152鉸鏈以及CD8α鉸鏈；所述跨膜結(jié)構(gòu)域源自選自下述的多肽：T細(xì)胞受體的α鏈、β鏈或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154以及PD1；所述一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來自選自下述的共刺激分子：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2CSLP76、TRIM以及ZAP70；所述初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d。在一個(gè)實(shí)施方案中，CAR包含能結(jié)合BCMA多肽的人源化的抗BCMAscFv、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、短的寡肽或多肽接頭、一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域選自：IgG1鉸鏈/CH2/CH3、IgG4鉸鏈/CH2/CH3、PD1鉸鏈、CD152鉸鏈以及CD8α鉸鏈；所述跨膜結(jié)構(gòu)域源自選自下述的多肽：T細(xì)胞受體的α鏈、β鏈或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154以及PD1；所述短的寡肽或多肽接頭的長(zhǎng)度優(yōu)選為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸，其連接CAR的TM結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；所述一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來自選自下述的共刺激分子：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2CSLP76、TRIM以及ZAP70；所述初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d。在具體實(shí)施方案中，CAR包含能結(jié)合BCMA多肽的人源化的抗BCMAscFv；包含IgG1鉸鏈/CH2/CH3多肽和CD8α多肽的鉸鏈結(jié)構(gòu)域；包含約3個(gè)至約10個(gè)氨基酸的多肽接頭的CD8α跨膜結(jié)構(gòu)域；CD137胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方案中，CAR包含能結(jié)合BCMA多肽的人源化的抗BCMAscFv；包含CD8α多肽的鉸鏈結(jié)構(gòu)域；包含約3個(gè)至約10個(gè)氨基酸的多肽接頭的CD8α跨膜結(jié)構(gòu)域；CD134胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方案中，CAR包含能結(jié)合BCMA多肽的人源化的抗BCMAscFv；包含CD8α多肽的鉸鏈結(jié)構(gòu)域；包含約3個(gè)至約10個(gè)氨基酸的多肽接頭的CD8α跨膜結(jié)構(gòu)域；CD28胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方案中，CAR包含能結(jié)合BCMA多肽的人源化的抗BCMAscFv；包含PD1鉸鏈多肽的鉸鏈結(jié)構(gòu)域；包含約3個(gè)至約10個(gè)氨基酸的多肽接頭的PD1或CD152跨膜結(jié)構(gòu)域；CD137胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方案中，CAR包含能結(jié)合BCMA多肽的人源化的抗BCMAscFv；包含PD1鉸鏈多肽的鉸鏈結(jié)構(gòu)域；包含約3個(gè)至約10個(gè)氨基酸的多肽接頭的PD1或CD152跨膜結(jié)構(gòu)域；CD134胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方案中，CAR包含能結(jié)合BCMA多肽的人源化的抗BCMAscFv；包含PD1鉸鏈多肽的鉸鏈結(jié)構(gòu)域；包含約3個(gè)至約10個(gè)氨基酸的多肽接頭的PD1或CD152跨膜結(jié)構(gòu)域、CD28胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方案中，CAR包含能結(jié)合BCMA多肽的人源化的抗BCMAscFv；包含CD152鉸鏈多肽的鉸鏈結(jié)構(gòu)域；包含約3個(gè)至約10個(gè)氨基酸的多肽接頭的PD1或CD152跨膜結(jié)構(gòu)域；CD137胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方案中，CAR包含能結(jié)合BCMA多肽的人源化的抗BCMAscFv；包含CD152鉸鏈多肽的鉸鏈結(jié)構(gòu)域；包含約3個(gè)至約10個(gè)氨基酸的多肽接頭的PD1或CD152跨膜結(jié)構(gòu)域；CD134胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在具體實(shí)施方案中，CAR包含能結(jié)合BCMA多肽的人源化的抗BCMAscFv；包含CD152鉸鏈多肽的鉸鏈結(jié)構(gòu)域；包含約3個(gè)至約10個(gè)氨基酸的多肽接頭的PD1或CD152跨膜結(jié)構(gòu)域；CD28胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。此外，與未修飾的T細(xì)胞或者經(jīng)修飾以表達(dá)其它CAR的T細(xì)胞相比，本文所考慮的CAR的設(shè)計(jì)使得表達(dá)所述CAR的T細(xì)胞能夠具有改善的擴(kuò)增、長(zhǎng)期持久性和細(xì)胞毒性能。D.多肽本發(fā)明部分考慮CAR多肽及其片段，包含所述CAR多肽及其片段的細(xì)胞和組合物，以及表達(dá)多肽的載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，提供包含SEQIDNO：15-29、71和73的任一項(xiàng)中所示出的一種或多種CAR的多肽。除非指明相反，“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白”可互換使用，并且根據(jù)常規(guī)含義，即，為氨基酸的序列。多肽不限于特定的長(zhǎng)度，例如，它們可以包含全長(zhǎng)蛋白序列或者全長(zhǎng)蛋白的片段，并且可以包括多肽的翻譯后修飾(例如，糖基化、乙?；⒘姿峄?以及天然存在和非天然存在的本領(lǐng)域已知的其它修飾。在多個(gè)實(shí)施方案中，本文所考慮的CAR多肽在蛋白的N末端包含信號(hào)(或前導(dǎo))序列，其共翻譯或翻譯后引導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)移?？捎糜诒疚墓_的CAR的合適的信號(hào)序列的示例性實(shí)例包括但不限于IgG1重鏈信號(hào)多肽、CD8α信號(hào)多肽或人GM-CSF受體α信號(hào)多肽?？梢允褂枚喾N熟知的重組和/或合成技術(shù)中的任何技術(shù)來制備多肽。具體地，本文所考慮的多肽涵蓋本公開的CAR，或者具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、添加和/或置換的本文所公開的CAR的序列。本文使用的“分離的肽”或“分離的多肽”等指從細(xì)胞環(huán)境以及從與細(xì)胞的其它組分的締合物體外分離和/或純化的肽或多肽分子，即其不與體內(nèi)物質(zhì)明顯締合。類似地，“分離的細(xì)胞”指獲自體內(nèi)組織或器官且基本不含胞外基質(zhì)的細(xì)胞。多肽包括“多肽變體”。多肽變體與天然存在的多肽的不同之處可以在于一個(gè)或多個(gè)置換、缺失、添加和/或插入。此類變體可以是天然存在的或者例如通過對(duì)上述多肽序列中的一種或多種進(jìn)行修飾而合成產(chǎn)生的。例如，在具體實(shí)施方案中，通過向CAR多肽的結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈、TM結(jié)構(gòu)域、共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或者初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域引入一個(gè)或多個(gè)置換、缺失、添加和/或插入而改進(jìn)CAR的結(jié)合親和力和/或其它生物性能是可取的。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包括與其具有至少約65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸同一性的多肽。多肽包括“多肽片段”。多肽片段指具有天然存在的或重組產(chǎn)生的多肽的氨基端缺失、羧基端缺失和/或內(nèi)部缺失或置換的多肽，其可以是單體或多聚體。在某些實(shí)施方案中，多肽片段可以包含至少5個(gè)至約500個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸鏈。將理解，在某些實(shí)施方案中，片段的長(zhǎng)度為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400或450個(gè)氨基酸。特別有用的多肽片段包括功能結(jié)構(gòu)域，包括抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者片段。在人源化的抗BCMA抗體的情況下，有用的片段包括但不限于：重鏈或輕鏈的CDR區(qū)、CDR3區(qū)；重鏈或輕鏈的可變區(qū)；包含兩個(gè)CDR的抗體鏈或可變區(qū)的一部分等。多肽還可以被框內(nèi)融合或者綴合至接頭或其它序列，以便于多肽的合成、純化或鑒定(例如，多聚His)，或者以增強(qiáng)多肽與固體支持物的結(jié)合。如以上所注意到的，可以以多種方式改變本發(fā)明的多肽，包括氨基酸的置換、缺失、截短和插入。此類操作的方法在本領(lǐng)域通常是已知的。例如，可以通過DNA中的突變制備參照多肽的氨基酸序列變體。用于誘變和核苷酸序列改變的方法在本領(lǐng)域眾所周知。參見，例如，Kunkel(1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82:488-492)；Kunkel等人(1987,MethodsinEnzymol,154:367-382)；美國(guó)專利第4,873,192號(hào)；Watson,J.D.等人(MolecularBiologyoftheGene)，第四版，Benjamin/Cummings,MenloPark,Calif.,1987)以及其中所引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于不影響目的蛋白的生物活性的適當(dāng)氨基酸置換的指導(dǎo)可見于Dayhoff等人(1978)AtlasofProteinSequenceandStructure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模式。在某些實(shí)施方案中，變體將包含保守性置換?！氨Ｊ匦灾脫Q”是這樣的置換，其中氨基酸被置換為具有類似性能的另一氨基酸，使得肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將預(yù)期多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)實(shí)質(zhì)上不變。可以對(duì)本發(fā)明的多核苷酸和多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，并仍然獲得編碼具有期望特性的變體或衍生多肽的功能分子。當(dāng)期望改變多肽的氨基酸序列以產(chǎn)生等同的甚至是改進(jìn)的本發(fā)明的變體多肽時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員例如可以，例如根據(jù)表1改變編碼DNA序列的密碼子中的一個(gè)或多個(gè)。表1-氨基酸密碼子利用本領(lǐng)域眾所周知的計(jì)算機(jī)程序(如DNASTARTM軟件)，可以發(fā)現(xiàn)關(guān)于確定哪些氨基酸殘基可被置換、插入或缺失而不消除生物活性的指導(dǎo)。優(yōu)選地，本文公開的蛋白變體中的氨基酸變化是保守的氨基酸變化，即相似帶電荷的氨基酸或不帶電荷的氨基酸的置換。保守的氨基酸變化涉及在側(cè)鏈上的相關(guān)的氨基酸家族之一的置換。天然存在的氨基酸通常分為四個(gè)家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、非極性氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不帶電荷的極性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)被共同分類為芳香族氨基酸。在肽或蛋白中，氨基酸的合適的保守性置換對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的，并且通?？梢赃M(jìn)行置換而不改變產(chǎn)生的分子的生物活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，一般而言，在多肽的非必要區(qū)域內(nèi)的單一氨基酸置換實(shí)質(zhì)上不改變生物活性(參見，例如Watson等人，MolecularBiologyoftheGene，第4版，1987,TheBenjamin/CummingsPub.Co.,p.224)。示例性的保守性置換描述于美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/241,647號(hào)中，將其公開內(nèi)容通過引用并入本文。在作出此類變化時(shí)，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。本領(lǐng)域普遍理解氨基酸的親水指數(shù)在賦予蛋白的相互作用生物功能中的重要性(Kyte和Doolittle,1982，通過引用并入本文)?；诟靼被岬氖杷院碗姾商匦灾付ㄆ溆H水指數(shù)(Kyte和Doolittle,1982)。這些數(shù)值為：異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(–0.4)；蘇氨酸(–0.7)；絲氨酸(–0.8)；色氨酸(–0.9)；酪氨酸(–1.3)；脯氨酸(–1.6)；組氨酸(–3.2)；谷氨酸(–3.5)；谷氨酰胺(–3.5)；天冬氨酸(–3.5)；天冬酰胺(–3.5)；賴氨酸(–3.9)以及精氨酸(–4.5)。本領(lǐng)域已知，某些氨基酸可以被具有類似親水指數(shù)或得分的其它氨基酸置換，并仍獲得具有類似生物活性的蛋白，即仍獲得生物功能等同的蛋白。在作出此類變化時(shí)，優(yōu)選置換親水指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸，特別優(yōu)選置換±1內(nèi)的氨基酸，以及甚至更特別優(yōu)選置換±0.5內(nèi)的氨基酸。本領(lǐng)域還理解，可以基于親水性有效地作出相似氨基酸的置換。如美國(guó)專利第4,554,101號(hào)所詳細(xì)描述的，為氨基酸殘基指定下述親水性數(shù)值：精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(–0.4)；脯氨酸(–0.5±1)；丙氨酸(–0.5)；組氨酸(–0.5)；半胱氨酸(–1.0)；甲硫氨酸(–1.3)；纈氨酸(–1.5)；亮氨酸(–1.8)；異亮氨酸(–1.8)；酪氨酸(–2.3)；苯丙氨酸(–2.5)；色氨酸(–3.4)。據(jù)理解，氨基酸可被置換為具有類似親水性數(shù)值的另一氨基酸，并仍獲得生物學(xué)等同的蛋白，特別是免疫學(xué)等同的蛋白。在此類變化中，優(yōu)選置換親水性數(shù)值在±2內(nèi)的氨基酸，特別優(yōu)選置換在±1內(nèi)的氨基酸，以及甚至更特別優(yōu)選置換在±0.5內(nèi)的氨基酸。如以上所述，氨基酸的置換可以基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。多肽變體還包括糖基化形式、與其它分子的聚集綴合物，以及與不相關(guān)的化學(xué)部分的共價(jià)綴合物(例如，聚乙二醇化的分子)。如本領(lǐng)域所知，可以通過將官能團(tuán)與存在于氨基酸鏈內(nèi)或位于N-端或C-端殘基處的基團(tuán)連接來制備共價(jià)變體。變體還包括等位基因變體、物種變體和突變蛋白(mutein)。不影響蛋白功能活性的區(qū)域的截短或缺失也是變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)期望表達(dá)兩種或更多種多肽時(shí)，可以通過如本文別處所討論的IRES序列隔開編碼所述多肽的多核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，兩種或更多種多肽可以表達(dá)為包含一個(gè)或多個(gè)自切割多肽序列的融合蛋白。本發(fā)明的多肽包括融合多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，提供融合多肽和編碼融合多肽的多核苷酸，例如CAR。融合多肽和融合蛋白指包含至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)或十個(gè)或更多個(gè)多肽區(qū)段的多肽。融合多肽通常是C-端至N-端連接，但是它們也可以是C-端至C-端、N-端至N-端、或者N-端至C-端連接。融合蛋白的多肽可以是任意順序或指定的順序。融合多肽或融合蛋白還可以包括保守修飾的變體、多態(tài)變體、等位基因、突變體、子序列以及種間同系物，只要保留融合多肽的期望轉(zhuǎn)錄活性。可以通過化學(xué)合成方法或者通過兩個(gè)部分之間化學(xué)鍵合來產(chǎn)生融合多肽，或者通常可以使用其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備融合多肽。將包含融合多肽的連接的DNA序列與如本文別處所討論的合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件可操作地連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合伴侶包含有助于以比天然重組蛋白更高的產(chǎn)率表達(dá)蛋白的序列(表達(dá)增強(qiáng)子)。可以選擇其它融合伴侶，以增加蛋白的溶解性或者使蛋白能夠靶向期望的胞內(nèi)區(qū)室或者促進(jìn)融合蛋白通過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。融合多肽還可以在本文所描述的各多肽結(jié)構(gòu)域之間包含多肽切割信號(hào)。此外，多肽位點(diǎn)可以置于任何接頭肽序列中。示例性的多肽切割信號(hào)包括多肽切割識(shí)別位點(diǎn)，如蛋白酶切割位點(diǎn)、核酸酶切割位點(diǎn)(例如，罕見限制性酶識(shí)別位點(diǎn)、自切割核酶識(shí)別位點(diǎn))和自切割病毒寡肽(參見deFelipe和Ryan,2004.Traffic,5(8)；616-26)。合適的蛋白酶切割位點(diǎn)和自切割肽對(duì)技術(shù)人員來說是已知的(參見，例如，Ryan等人,1997.J.Gener.Virol.78,699-722；Scymczak等人(2004)NatureBiotech.5,589-594)。示例性的蛋白酶切割位點(diǎn)包括但不限于以下的切割位點(diǎn)：馬鈴薯Y病毒(potyvirus)NIa蛋白酶(例如，煙草蝕紋病毒蛋白酶)、馬鈴薯Y病毒HC蛋白酶、馬鈴薯Y病毒P1(P35)蛋白酶、byovirusNIa蛋白酶、byovirusRNA-2-編碼的蛋白酶、口蹄疫病毒L蛋白酶、腸病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、小RNA病毒(picorna)3C蛋白酶、豇豆花葉病毒24K蛋白酶、線蟲傳多面體病毒(nepovirus)24K蛋白酶、RTSV(水稻東格魯球狀病毒)3C-樣蛋白酶、PYVF(歐防風(fēng)黃點(diǎn)病毒)3C-樣蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa和腸激酶。由于其高的切割嚴(yán)緊性，在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選TEV(煙草蝕紋病毒)蛋白酶切割位點(diǎn)，例如，EXXYXQ(G/S)(SEQIDNO：57)，例如ENLYFQG(SEQIDNO：58)和ENLYFQS(SEQIDNO：59)，其中X代表任何氨基酸(TEV切割發(fā)生在Q和G之間或者Q和S之間)。在具體實(shí)施方案中，自切割肽包括獲自以下的那些多肽序列：馬鈴薯Y病毒和心病毒2A肽、FMDV(口蹄疫病毒)、馬鼻炎病毒A、明脈扁刺蛾β四體病毒(Thoseaasignavirus)和豬捷申病毒。在某些實(shí)施方案中，自切割多肽位點(diǎn)包含2A或2A-樣位點(diǎn)、序列或結(jié)構(gòu)域(Donnelly等人,2001.J.Gen.Virol.82:1027-1041)。表2：示例性的2A位點(diǎn)包括下述序列：SEQIDNO：60LLNFDLLKLAGDVESNPGPSEQIDNO：61TLNFDLLKLAGDVESNPGPSEQIDNO：62LLKLAGDVESNPGPSEQIDNO：63NFDLLKLAGDVESNPGPSEQIDNO：64QLLNFDLLKLAGDVESNPGPSEQIDNO：65APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPSEQIDNO：66VTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTSEQIDNO：67LNFDLLKLAGDVESNPGPSEQIDNO：68LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPSEQIDNO：69EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP在優(yōu)選實(shí)施方案中，本文所考慮的多肽包含CAR多肽。E.多核苷酸在優(yōu)選實(shí)施方案中，提供編碼一種或多種CAR多肽的多核苷酸，例如SEQIDNO：30-44、70和72。本文使用的術(shù)語“多核苷酸”或“核酸”指信使RNA(mRNA)、RNA、基因組RNA(gRNA)、正鏈RNA(RNA(+))、負(fù)鏈RNA(RNA(-))、基因組DNA(gDNA)、互補(bǔ)DNA(cDNA)或重組DNA。多核苷酸包括單鏈和雙鏈多核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸包括與本文所描述的任何參照序列(參見，例如，序列表)具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸或變體，通常，其中所述變體維持參照序列的至少一種生物活性。在多個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明部分考慮包含多核苷酸的表達(dá)載體、病毒載體和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒以及包含所述表達(dá)載體、病毒載體和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的組合物和細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明多肽的至少約5、10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、500、1000、1250、1500、1750或2000個(gè)或者更多個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，以及所有中間長(zhǎng)度的多核苷酸。將容易理解，本背景中的“中間長(zhǎng)度”意指所引用的數(shù)值之間的任意長(zhǎng)度，如6、7、8、9等；101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。本文使用的術(shù)語“多核苷酸變體”和“變體”等，指與參照多核苷酸序列呈現(xiàn)大幅度序列同一性的多核苷酸，或者在其后所定義的嚴(yán)緊條件下與參照序列雜交的多核苷酸。這些術(shù)語包括與參照多核苷酸相比，添加或缺失了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，或者用不同核苷酸替代一個(gè)或多個(gè)核苷酸的多核苷酸。在這點(diǎn)上，本領(lǐng)域很好理解的是，可以對(duì)參照多核苷酸進(jìn)行某些改變，包括突變、添加、缺失和置換，借此改變的多核苷酸保留參照多核苷酸的生物功能或活性。本文使用的敘述“序列同一性”或者例如，包含“與…50％相同的序列”，指在比較窗中以逐個(gè)核苷酸或逐個(gè)氨基酸為基礎(chǔ)的序列相同的程度。因此，可以通過以下步驟計(jì)算“序列同一性百分比”：對(duì)比較窗中兩條最佳比對(duì)的序列進(jìn)行比較，確定兩條序列中存在相同核酸堿基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數(shù)目以得到匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗中的總位置數(shù)(即，窗大小)，并且將結(jié)果乘以100，以產(chǎn)生序列同一性百分比。包括與本文所描述的任何參照序列具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽變體維持參照多肽的至少一種生物活性。用于描述兩條或更多條多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系的術(shù)語包括“參照序列”、“比較窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”以及“大幅度同一性”?！皡⒄招蛄小钡拈L(zhǎng)度為至少12個(gè)，但經(jīng)常為15至18個(gè)，并且通常為至少25個(gè)單體單元，所述單體單元包括核苷酸和氨基酸殘基。因?yàn)閮蓷l多核苷酸可以各自包含(1)兩條多核苷酸之間類似的序列(即，僅完整多核苷酸序列的一部分)和(2)兩條多核苷酸之間不同的序列，所以通常通過比較“比較窗”中的兩條多核苷酸的序列來進(jìn)行兩條(或者更多條)多核苷酸之間的序列比較，從而鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性?！氨容^窗”指至少6個(gè)連續(xù)位置，通常約50個(gè)至約100個(gè)，更通常約100個(gè)至約150個(gè)連續(xù)位置的概念性區(qū)段，其中在將兩條序列最佳比對(duì)后，將序列與相同連續(xù)位置數(shù)的參照序列進(jìn)行比較。為了兩條序列的最佳比對(duì)，比較窗可以包含與參照序列(其不包含添加或缺失)相比約20％或更少的添加或缺失(即，空位)?？梢酝ㄟ^算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施(威斯康星遺傳學(xué)軟件包版本7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,WI,USA)或通過檢驗(yàn)以及由所選擇的各種方法中的任何方法所產(chǎn)生的最佳比對(duì)(即，在比較窗中產(chǎn)生最高百分比同源性)，進(jìn)行比對(duì)比較窗的序列的最佳比對(duì)。還可以參考如例如由Altschul等人,1997,Nucl.AcidsRes.25:3389所公開的BLAST程序家族。序列分析的詳細(xì)討論可見于Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&SonsInc,1994-1998,第15章的第19.3單元。本文所使用的“分離的多核苷酸”指已從在天然存在狀態(tài)下位于其側(cè)翼的序列純化的多核苷酸，例如，已從通常與DNA片段鄰近的序列中移出的DNA片段?！胺蛛x的多核苷酸”也指互補(bǔ)DNA(cDNA)、重組DNA或者在自然中不存在且通過人為處理制備的其它多核苷酸。描述多核苷酸的方向的術(shù)語包括：5’(通常為具有游離的磷酸基團(tuán)的多核苷酸的末端)和3’(通常為具有游離的羥基(OH)的多核苷酸的末端)?？梢砸?’至3’的方向或者以3’至5’的方向?qū)Χ嗪塑账嵝蛄羞M(jìn)行注釋。對(duì)于DNA和mRNA，5’至3’的鏈被指定為“正義鏈”、“正鏈”或“編碼鏈”，因?yàn)槠湫蛄信c前信使RNA(前mRNA)的序列相同[除了在RNA中為尿嘧啶(U)而在DNA中為胸腺嘧啶(T)]。對(duì)于DNA和mRNA，互補(bǔ)的3’至5’鏈?zhǔn)潜籖NA聚合酶轉(zhuǎn)錄的鏈，其被指定為“模板鏈”、“反義鏈”、“負(fù)鏈”或“非編碼鏈”。本文使用的術(shù)語“反向”指以3’至5’方向書寫的5’至3’序列，或者以5’至3’方向書寫的3’至5’序列。術(shù)語“互補(bǔ)”和“互補(bǔ)性”指通過堿基配對(duì)規(guī)則關(guān)聯(lián)的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，DNA序列5’AGTCATG3’的互補(bǔ)鏈?zhǔn)?’TCAGTAC5’。后一序列通常被寫作5’端在左且3’端在右的反向互補(bǔ)序列5’CATGACT3’。與序列的反向互補(bǔ)序列相同的序列被稱為回文序列?；パa(bǔ)性可以是“部分的”，其中根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)則僅一些核酸的堿基匹配。或者，核酸之間可以具有“完全”或“全部”的互補(bǔ)性。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，存在許多編碼如本文所述的多肽或其變體片段的核苷酸序列。這些多核苷酸中的一些與任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。盡管如此，本發(fā)明特別考慮，由于密碼子使用的差異而改變的多核苷酸，例如對(duì)于人和/或靈長(zhǎng)類密碼子選擇最佳化的多核苷酸。此外，也可以使用包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因是由于一個(gè)或多個(gè)突變?nèi)绾塑账岬娜笔?、添加?或置換而改變的內(nèi)源基因。本文使用的術(shù)語“核酸盒”指可以表達(dá)RNA，并且隨后表達(dá)蛋白的載體內(nèi)的遺傳序列。核酸盒包含目的基因，例如CAR。核酸盒在載體內(nèi)被定位并繼而確定方向，以使盒內(nèi)的核酸可以轉(zhuǎn)錄為RNA，并且當(dāng)必要時(shí)，翻譯為蛋白或多肽，經(jīng)受轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的活性所需的合適的翻譯后修飾，以及通過靶向合適的胞內(nèi)區(qū)室而被易位至對(duì)于生物活性而言合適的區(qū)室或者分泌至胞外區(qū)室。優(yōu)選地，盒具有適于準(zhǔn)備插入載體中的3’和5’端，例如其在各端具有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸盒包含用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤的嵌合抗原受體的序列。可將盒移出并插入質(zhì)?；虿《据d體中作為單一單元。在具體實(shí)施方案中，多核苷酸包括至少一種目的多核苷酸。本文使用的術(shù)語“目的多核苷酸”指編碼多肽(即目的多肽)的、被插入表達(dá)載體中期望表達(dá)的多核苷酸。載體可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種目的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，目的多核苷酸編碼在疾病或病癥的治療或預(yù)防中提供治療效果的多肽。目的多核苷酸以及由其編碼的多肽包括編碼野生型多肽的多核苷酸，以及其功能變體和片段。在具體實(shí)施方案中，功能變體與相應(yīng)的野生型參照多核苷酸或多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％或者至少99％的同一性。在某些實(shí)施方案中，功能變體或片段具有相應(yīng)的野生型多肽的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或者至少90％的生物活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，目的多核苷酸不編碼多肽，但是作為轉(zhuǎn)錄miRNA、siRNA或shRNA、核酶或者其它抑制性RNA的模板。在多個(gè)其它實(shí)施方案中，多核苷酸包含編碼CAR的目的多核苷酸和一種或多種其它目的多核苷酸，所述其它目的多核苷酸包括但不限于抑制性核酸序列包括但不限于：siRNA、miRNA、shRNA和核酶。本文使用的術(shù)語“siRNA”或“短干擾RNA”指在動(dòng)物中介導(dǎo)序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默、翻譯抑制、轉(zhuǎn)錄抑制或者表觀RNAi的過程的短多核苷酸序列(Zamore等人，2000,Cell,101,25-33；Fire等人，1998,Nature,391,806；Hamilton等人，1999,Science,286,950-951；Lin等人，1999,Nature,402,128-129；Sharp,1999,Genes&Dev.,13,139-141；以及Strauss,1999,Science,286,886)。在某些實(shí)施方案中，siRNA包含含有相同的核苷數(shù)的第一鏈和第二鏈；然而，第一鏈和第二鏈?zhǔn)瞧频?，以使第一鏈和第二鏈上的兩個(gè)末端核苷與互補(bǔ)鏈上的殘基不配對(duì)。在某些情況下，不配對(duì)的兩個(gè)核苷是胸苷殘基。siRNA應(yīng)當(dāng)包含與靶基因足夠同源的區(qū)域，并且就核苷酸而言應(yīng)當(dāng)有足夠的長(zhǎng)度，以使siRNA或其片段可以介導(dǎo)靶基因的下調(diào)。因此，siRNA包含與靶RNA至少部分互補(bǔ)的區(qū)域。siRNA與靶標(biāo)之間不必存在完全互補(bǔ)性，但是一致性必須足以使siRNA或其切割產(chǎn)物能夠指導(dǎo)序列特異性沉默，例如通過靶RNA的RNAi切割。在反義鏈中，與靶鏈的互補(bǔ)性或同源程度是最關(guān)鍵的。盡管經(jīng)常期望完全互補(bǔ)性，特別是在反義鏈中，但是一些實(shí)施方案包括與靶RNA的一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配，優(yōu)選10、8、6、5、4、3、2個(gè)或者更少的錯(cuò)配。錯(cuò)配在末端區(qū)是最耐受的，并且如果存在，優(yōu)選存在于一個(gè)或多個(gè)末端區(qū)中，例如在5’和/或3’端的6、5、4或3個(gè)核苷酸內(nèi)。有義鏈僅需要與反義鏈足夠互補(bǔ)，以維持分子的整體雙鏈特征。此外，siRNA可被修飾或者包含核苷類似物。siRNA的單鏈區(qū)可被修飾或者包含核苷類似物，例如發(fā)卡結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)未配對(duì)區(qū)(例如連接兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)的區(qū)域)可以具有修飾或者核苷類似物。使siRNA的一個(gè)或多個(gè)3’端或5’端例如針對(duì)核酸外切酶穩(wěn)定的修飾，或者利于反義siRNA物質(zhì)進(jìn)入RISC的修飾也是有益的。修飾可以包括C3(或C6、C7、C12)氨基接頭、硫醇接頭、羧基接頭、非核苷酸間隔物(C3、C6、C9、C12、無堿基、三甘醇、六甘醇)、特殊的生物素試劑或熒光素試劑，所述試劑作為亞磷酰胺存在并具有另一DMT保護(hù)的羥基，以允許在RNA合成期間進(jìn)行多次偶聯(lián)。siRNA各鏈的長(zhǎng)度可以等于或者少于30、25、24、23、22、21或20個(gè)核苷酸。鏈的長(zhǎng)度優(yōu)選為至少19個(gè)核苷酸。例如，各鏈的長(zhǎng)度可以是21至25個(gè)核苷酸。優(yōu)選的siRNA具有17、18、19、29、21、22、23、24或25個(gè)核苷酸對(duì)的雙鏈區(qū)以及一個(gè)或多個(gè)2-3個(gè)核苷酸的懸突，優(yōu)選一個(gè)或兩個(gè)2-3個(gè)核苷酸的3’懸突。本文使用的術(shù)語“miRNA”或“微RNA”指20-22個(gè)核苷酸的小的非編碼RNA，通常由被稱為前miRNA的～70個(gè)核苷酸折返(foldback)RNA前體結(jié)構(gòu)切割而來。miRNA以兩種方式之一負(fù)調(diào)控其靶標(biāo)，這取決于miRNA與靶標(biāo)之間的互補(bǔ)性程度。首先，能以完全或幾乎完全的互補(bǔ)性結(jié)合編碼蛋白的mRNA序列的miRNA誘導(dǎo)RNA介導(dǎo)的干擾(RNAi)通路。通過與其mRNA靶標(biāo)的3’非翻譯區(qū)(UTR)內(nèi)的不完全互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合而發(fā)揮其調(diào)控作用的miRNA，通過RISC復(fù)合物在翻譯水平明顯地抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，所述RISC復(fù)合物與用于RNAi通路中的復(fù)合物類似或者可能相同。與翻譯控制一致，利用該機(jī)制的miRNA降低其靶基因的蛋白水平，但是這些基因的mRNA水平僅受到很小影響。miRNA涵蓋天然存在的miRNA以及可以特異性地靶向任何mRNA序列的人工設(shè)計(jì)的miRNA。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)表達(dá)為人miRNA(例如miR-30或miR-21)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的短發(fā)卡RNA構(gòu)建體。該設(shè)計(jì)向發(fā)卡構(gòu)建體添加了Drosha加工位點(diǎn)，并且已經(jīng)顯示極大地增加了敲低效率(Pusch等，2004)。發(fā)卡莖部由22-nt的dsRNA(例如反義鏈與期望的靶標(biāo)具有完全互補(bǔ)性)和來自人miR的15-19-nt的環(huán)組成。當(dāng)與無微RNA的常規(guī)shRNA設(shè)計(jì)相比時(shí)，在發(fā)卡的任一側(cè)或者兩側(cè)添加miR環(huán)和miR30側(cè)翼序列導(dǎo)致所表達(dá)的發(fā)卡的Drosha和Dicer加工增加10倍以上。增加的Drosha和Dicer加工轉(zhuǎn)化為更多的siRNA/miRNA產(chǎn)生和所表達(dá)發(fā)卡的更高效能。本文使用的術(shù)語“shRNA”或“短發(fā)卡RNA”指由自身互補(bǔ)的RNA單鏈形成的雙鏈結(jié)構(gòu)。含有與靶基因的編碼序列或非編碼序列的一部分相同的核苷酸序列的shRNA構(gòu)建體對(duì)于抑制是優(yōu)選的。還發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于靶序列具有插入、缺失和單位點(diǎn)突變的RNA序列對(duì)于抑制是有效的。抑制性RNA與靶基因的一部分之間具有高于90％的序列同一性，或者甚至100％的序列同一性是優(yōu)選的。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，shRNA的雙鏈形成部分的長(zhǎng)度為至少20、21或22個(gè)核苷酸，例如與通過Dicer依賴性的切割產(chǎn)生的RNA產(chǎn)物大小一致。在某些實(shí)施方案中，shRNA構(gòu)建體的長(zhǎng)度為至少25、50、100、200、300或400個(gè)堿基。在某些實(shí)施方案中，shRNA構(gòu)建體的長(zhǎng)度為400-800個(gè)堿基。shRNA構(gòu)建體對(duì)環(huán)序列和環(huán)大小的變異高度耐受。本文使用的術(shù)語“核酶”指能夠?qū)Π衜RNA進(jìn)行位點(diǎn)特異性切割的催化活性的RNA分子。已經(jīng)描述了一些亞型，例如錘頭狀核酶和發(fā)卡狀核酶?？梢酝ㄟ^在非催化堿基處用脫氧核糖核苷酸置換核糖核苷酸來增強(qiáng)核酶的催化活性和穩(wěn)定性。盡管在位點(diǎn)特異的識(shí)別序列處切割mRNA的核酶可用于破壞特定的mRNA，但是優(yōu)選使用錘頭狀核酶。錘頭狀核酶在由與靶mRNA形成互補(bǔ)堿基對(duì)的側(cè)翼區(qū)所指示的位置處切割mRNA。唯一的要求是靶mRNA具有下述雙堿基序列：5’-UG-3’。錘頭狀核酶的構(gòu)建和產(chǎn)生在本領(lǐng)域眾所周知。如本文別處所描述的，遞送包含siRNA、miRNA、shRNA或核酶的目的多核苷酸的優(yōu)選方法包括一種或多種調(diào)控序列，如例如強(qiáng)組成型polIII啟動(dòng)子(例如人U6snRNA啟動(dòng)子、小鼠U6snRNA啟動(dòng)子、人和小鼠H1RNA啟動(dòng)子以及人tRNA-val啟動(dòng)子)或者強(qiáng)組成型polII啟動(dòng)子。本發(fā)明的多核苷酸(不考慮編碼序列本身的長(zhǎng)度)可以與本文別處所公開的或者本領(lǐng)域已知的其它DNA序列組合，使得它們的總長(zhǎng)度可以大大改變，所述其它DNA序列如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子、非翻譯區(qū)(UTR)、信號(hào)序列、Kozak序列、聚腺苷酸化信號(hào)、另外的限制性酶位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)、重組酶識(shí)別位點(diǎn)(例如LoxP、FRT和Att位點(diǎn))、終止密碼子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)以及編碼自切割多肽、表位標(biāo)簽的多核苷酸。因此考慮，可以采用幾乎任意長(zhǎng)度的多核苷酸片段，其中總長(zhǎng)度優(yōu)選受制備的便利性和在預(yù)期的重組DNA方案中的使用的限制。可以使用本領(lǐng)域已知且可用的各種很好建立的技術(shù)中的任一種來制備、操作和/或表達(dá)多核苷酸。為了表達(dá)期望的多肽，可以將編碼多肽的核苷酸序列插入適當(dāng)?shù)妮d體中。載體的實(shí)例是質(zhì)粒、自主復(fù)制序列和轉(zhuǎn)座元件。另外的示例性載體包括但不限于，質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、人工染色體(如酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC))、細(xì)菌噬菌體(如λ噬菌體或M13噬菌體)以及動(dòng)物病毒?？捎米鬏d體的動(dòng)物病毒類的實(shí)例包括但不限于：逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒(例如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒和乳頭多瘤空泡病毒(例如SV40)。表達(dá)載體的實(shí)例是用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pClneo載體(Promega)；用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的pLenti4/V5-DESTTM、pLenti6/V5-DESTTM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)。在具體實(shí)施方案中，可以將本文所公開的嵌合蛋白的編碼序列連接進(jìn)此類表達(dá)載體中，以用于嵌合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。在具體實(shí)施方案中，載體是附加型載體或者維持在染色體外的載體。本文使用的術(shù)語“附加型”指這樣的載體：其能夠復(fù)制，但不整合進(jìn)宿主染色體DNA，并且也未從分裂的宿主細(xì)胞逐漸喪失，也意味著所述載體在染色體外復(fù)制或者附加型復(fù)制。將載體改造以包含編碼來自嗜淋巴皰疹病毒(lymphotrophicherpesvirus)或γ皰疹病毒、腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒或者酵母的DNA復(fù)制起點(diǎn)或者“ori”的序列，特別是與EBV的oriP對(duì)應(yīng)的嗜淋巴皰疹病毒或γ皰疹病毒的復(fù)制起點(diǎn)。在具體方面，嗜淋巴皰疹病毒可以是愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)、卡波氏肉瘤皰疹病毒(KSHV)、松鼠猴皰疹病毒(Herpesvirussaimiri)(HS)或者馬利克病病毒(MDV)。愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)和卡波氏肉瘤皰疹病毒(KSHV)也是γ皰疹病毒的實(shí)例。通常，宿主細(xì)胞包含活化復(fù)制的病毒復(fù)制反式激活蛋白。存在于表達(dá)載體中的“控制元件”或“調(diào)控序列”是載體的那些非翻譯區(qū)---復(fù)制起點(diǎn)、選擇盒、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、翻譯起始信號(hào)(ShineDalgarno序列或Kozak序列)、內(nèi)含子、聚腺苷酸化序列、5’和3’非翻譯區(qū)---其與宿主細(xì)胞蛋白相互作用以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。此類元件在強(qiáng)度和特異性方面可以不同。根據(jù)所利用的載體系統(tǒng)和宿主，可以使用多種合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括普遍存在的啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在具體實(shí)施方案中，用于實(shí)施本發(fā)明的載體(包括但不限于表達(dá)載體和病毒載體)將包含外源、內(nèi)源或異源控制序列，如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子?！皟?nèi)源”控制序列是與基因組中的指定的基因天然連接的序列?！巴庠础笨刂菩蛄惺峭ㄟ^遺傳操作的方法(即，分子生物學(xué)技術(shù))處于與基因并置，以使該基因的轉(zhuǎn)錄由連接的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子指導(dǎo)的序列?！爱愒础笨刂菩蛄惺莵碜耘c進(jìn)行遺傳操作的細(xì)胞不同物種的外源序列。本文使用的術(shù)語“啟動(dòng)子”指RNA聚合酶能結(jié)合的多核苷酸(DNA或RNA)的識(shí)別位點(diǎn)。RNA聚合酶起始并轉(zhuǎn)錄與啟動(dòng)子可操作地連接的多核苷酸。在具體實(shí)施方案中，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子包含位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游大約25至30個(gè)堿基處的富含AT的區(qū)域和/或存在于轉(zhuǎn)錄開始上游70至80個(gè)堿基處的另一序列，CNCAAT區(qū)，其中N可以是任意核苷酸。術(shù)語“增強(qiáng)子”指這樣的DNA區(qū)段：其含有能夠提供增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄且在某些情況下可以獨(dú)立于其相對(duì)于另一控制序列的方向而起作用的序列。增強(qiáng)子可以與啟動(dòng)子和/或其它增強(qiáng)子元件協(xié)同地或疊加地起作用。術(shù)語“啟動(dòng)子/增強(qiáng)子”指含有能夠提供啟動(dòng)子和增強(qiáng)子功能的序列的DNA區(qū)段。術(shù)語“可操作地連接”指并置，其中所描述的組分處于允許其以它們預(yù)期的方式起作用的關(guān)系中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語指核酸表達(dá)控制序列(如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)和第二多核苷酸序列(例如，目的多核苷酸)之間的功能連接，其中表達(dá)控制序列指導(dǎo)與第二序列對(duì)應(yīng)的核酸的轉(zhuǎn)錄。本文使用的術(shù)語“組成型表達(dá)控制序列”指不斷地或連續(xù)地允許可操作地連接的序列的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。組成型表達(dá)控制序列可以分別是允許在多種細(xì)胞和組織類型中表達(dá)的“普遍存在的”啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或者啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，或者是允許在有限種類的細(xì)胞和組織類型中表達(dá)的“細(xì)胞特異性”、“細(xì)胞類型特異性”、“細(xì)胞譜系特異性”或“組織特異性”的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或者啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。適合用于本發(fā)明的具體實(shí)施方案中的示例性的普遍存在的表達(dá)控制序列包括但不限于：巨細(xì)胞病毒(CMV)即刻早期啟動(dòng)子、病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒(RSV)LTR、單純皰疹病毒(HSV)(胸苷激酶)啟動(dòng)子、來自牛痘病毒的H5、P7.5和P11啟動(dòng)子、延伸因子1-α(EF1a)啟動(dòng)子、早期生長(zhǎng)應(yīng)答因子1(EGR1)、鐵蛋白H(FerH)、鐵蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、真核翻譯起始因子4A1(EIF4A1)、熱休克70kDa蛋白5(HSPA5)、熱休克蛋白90kDaβ成員1(HSP90B1)、熱休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驅(qū)動(dòng)蛋白(β-KIN)、人ROSA26基因座(Irions等人,NatureBiotechnology25,1477-1482(2007))、泛素C啟動(dòng)子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子/雞β-肌動(dòng)蛋白(CAG)啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子以及骨髓增生性肉瘤病毒(myeloproliferativesarcomavirus)增強(qiáng)子、負(fù)控制區(qū)缺失的dl587rev引物-結(jié)合位點(diǎn)取代的(MND)啟動(dòng)子(Challita等人,JVirol.69(2):748-55(1995))。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含MND啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含含有人EF1a基因的第一內(nèi)含子的EF1a啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含缺乏人EF1a基因的第一內(nèi)含子的EF1a啟動(dòng)子。在具體實(shí)施方案中，從T細(xì)胞特異性啟動(dòng)子表達(dá)含有CAR的多核苷酸是可取的。本文使用的“條件性表達(dá)”可以指任何類型的條件性表達(dá)，包括但不限于可誘導(dǎo)的表達(dá)；可阻遏的表達(dá)；在具有特定生理學(xué)、生物學(xué)或疾病狀態(tài)等的細(xì)胞或組織中的表達(dá)。該定義并非意圖排除細(xì)胞類型或組織特異性的表達(dá)。本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供目的多核苷酸的條件性表達(dá)，例如通過使細(xì)胞、組織、有機(jī)體等經(jīng)歷引起多核苷酸表達(dá)或者引起由目的多核苷酸編碼的多核苷酸的表達(dá)增加或減少的處理或條件來控制表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子/系統(tǒng)的示例性實(shí)例包括但不限于，類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如用于編碼糖皮質(zhì)激素或雌激素受體的基因的啟動(dòng)子(可通過用對(duì)應(yīng)的激素處理來可誘導(dǎo)的))、金屬硫蛋白啟動(dòng)子(metallothioninepromoter)(可通過用不同的多種重金屬處理來可誘導(dǎo)的)、MX-1啟動(dòng)子(可通過干擾素可誘導(dǎo)的誘導(dǎo))、“GeneSwitch”米非司酮調(diào)控系統(tǒng)(Sirin等人,2003,Gene,323:67)、cumate誘導(dǎo)型基因開關(guān)(WO2002/088346)、四環(huán)素依賴性調(diào)控系統(tǒng)等。也可以通過使用位點(diǎn)特異性DNA重組酶實(shí)現(xiàn)條件性表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，載體包含至少一個(gè)(通常兩個(gè))位點(diǎn)用于通過位點(diǎn)特異性重組酶介導(dǎo)的重組。本文使用的術(shù)語“重組酶”或“位點(diǎn)特異性重組酶”包括參與重組反應(yīng)(涉及一個(gè)或多個(gè)(例如，2個(gè)，3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、7個(gè)、10個(gè)、12個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、50個(gè)等)重組位點(diǎn))的分割的或整合的蛋白、酶、輔因子或相關(guān)蛋白，其可以是野生型蛋白(參見Landy,CurrentOpinioninBiotechnology3:699-707(1993))，或者其突變體、衍生物(例如，含有重組蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段和變體。適合用于本發(fā)明具體實(shí)施方案中的重組酶的示例性實(shí)例包括但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解離酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1以及ParA。載體可以包含用于多種位點(diǎn)特異性重組酶中的任一種的一個(gè)或多個(gè)重組位點(diǎn)。應(yīng)當(dāng)理解，位點(diǎn)特異性重組酶的靶位點(diǎn)另外是載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體)整合所需的任何位點(diǎn)。本文使用的術(shù)語“重組序列”、“重組位點(diǎn)”或者“位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)”指重組酶識(shí)別并結(jié)合的特定核酸序列。例如，Cre重組酶的一個(gè)重組位點(diǎn)是loxP，其為34個(gè)堿基對(duì)的序列，其包含兩個(gè)13個(gè)堿基對(duì)的反向重復(fù)序列(作為重組酶的結(jié)合位點(diǎn))，側(cè)翼為8個(gè)堿基對(duì)的核心序列(參見Sauer,B.,CurrentOpinioninBiotechnology5:521-527(1994)的圖1)。其它示例性loxP位點(diǎn)包括但不限于：lox511(Hoess等人，1996；Bethke和Sauer,1997)、lox5171(LeeandSaito,1998)、lox2272(Lee和Saito,1998)、m2(Langer等人，2002)、lox71(Albert等人，1995)和lox66(Albert等人，1995)。FLP重組酶的合適的識(shí)別位點(diǎn)包括但不限于：FRT(McLeod等人，1996)，F(xiàn)1、F2、F3(Schlake和Bode,1994)，F(xiàn)4、F5(Schlake和Bode,1994)，F(xiàn)RT(LE)(Senecoff等人，1988)，F(xiàn)RT(RE)(Senecoff等人，1988)。識(shí)別序列的其它實(shí)例為attB、attP、attL和attR序列，它們由重組酶酶λ整合酶(例如)識(shí)別。SSR僅介導(dǎo)異型位點(diǎn)(heterotypicsite)attB(長(zhǎng)度為34bp)與attP(長(zhǎng)度為39bp)之間的重組(Groth等，2000)。分別以噬菌體整合酶在細(xì)菌和噬菌體基因組上的附著位點(diǎn)命名的attB和attP，均含有可能被同源二聚體結(jié)合的不完全反向重復(fù)序列(Groth等，2000)。產(chǎn)物位點(diǎn)attL和attR針對(duì)其它介導(dǎo)的重組呈有效惰性(Belteki等人，2003)，這使得反應(yīng)不可逆。對(duì)于催化插入，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，攜帶attB的DNA插入基因組attP位點(diǎn)比attP位點(diǎn)插入基因組attB位點(diǎn)更容易(Thyagarajan等人，2001；Belteki等人，2003)。因此，典型的策略是通過同源重組將攜帶attP的“對(duì)接位點(diǎn)”放入限定的基因座，然后其與插入的攜帶attB的進(jìn)入序列配對(duì)。本文使用的“內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)”或“IRES”指這樣的元件：其促進(jìn)內(nèi)部核糖體直接進(jìn)入順反子(蛋白編碼區(qū))的起始密碼子如ATG，從而導(dǎo)致基因不依賴于帽的翻譯。參見，例如Jackson等人，1990.TrendsBiochemSci15(12):477-83)以及Jackson和Kaminski.1995.RNA1(10):985-1000。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明所考慮的載體包含編碼一種或多種多肽的一個(gè)或多個(gè)目的多核苷酸。在具體實(shí)施方案中，為了實(shí)現(xiàn)多種多肽各自的有效翻譯，多核苷酸序列可以被一個(gè)或多個(gè)IRES序列或者編碼自切割多肽的多核苷酸序列間隔。本文使用的術(shù)語“Kozak序列”指極大地促進(jìn)mRNA與核糖體的小亞基初步結(jié)合并增加翻譯的短核苷酸序列。共有的Kozak序列為(GCC)RCCATGG，其中R是嘌呤(A或G)(Kozak,1986.Cell.44(2):283-92，以及Kozak,1987.NucleicAcidsRes.15(20):8125-48)。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明所考慮的載體包含含有共有的Kozak序列并編碼期望的多肽(例如CAR)的多核苷酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，多核苷酸或包含所述多核苷酸的細(xì)胞利用自殺基因(包括可誘導(dǎo)的自殺基因)來降低直接的毒性和/或不受控制的增殖的風(fēng)險(xiǎn)。在具體方面，自殺基因?qū)τ诤兴龆嗪塑账峄蛘呒?xì)胞的宿主不具有免疫原性。可以使用的自殺基因的某些實(shí)例為半胱天冬酶-9或半胱天冬酶-8或者胞嘧啶脫氨酶?？梢允褂锰囟ǖ亩刍瘜W(xué)誘導(dǎo)物(CID)來活化半胱天冬酶-9。在某些實(shí)施方案中，載體包含引起本發(fā)明的免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如T細(xì)胞)對(duì)在體內(nèi)的陰性選擇敏感的基因區(qū)段?！瓣幮赃x擇”意為由于個(gè)體體內(nèi)條件的改變，輸入的細(xì)胞可被消除。陰性選擇表型可以由插入賦予對(duì)施用的物質(zhì)(例如化合物)的敏感性的基因而導(dǎo)致。陰性選擇基因在本領(lǐng)域是已知的，并且包括尤其是以下基因：賦予更昔洛韋(ganciclovir)敏感性的單純皰疹病毒I型胸苷激酶(HSV-ITK)基因(Wigler等，Cell11:223,1977)；細(xì)胞次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)基因，細(xì)胞腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT)基因以及細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶(Mullen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。在一些實(shí)施方案中，遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞(如T細(xì)胞)包含多核苷酸，所述多核苷酸還包含使得能夠在體外選擇陰性選擇表型細(xì)胞的陽性標(biāo)志物。陽性選擇標(biāo)志物可以是這樣的基因：當(dāng)被引入宿主細(xì)胞時(shí)，其表達(dá)允許對(duì)攜帶所述基因的細(xì)胞進(jìn)行陽性選擇的顯性表型。該類基因在本領(lǐng)域是已知的，并且包括尤其是賦予對(duì)潮霉素B的抗性的潮霉素-B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)、編碼對(duì)抗生素G418的抗性的來自Tn5的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo或aph)、二氫葉酸還原酶(DHFR)基因、腺苷脫氨酶基因(ADA)以及多重耐藥(MDR)基因。優(yōu)選地，陽性選擇標(biāo)志物和陰性選擇元件相連，以使陰性選擇元件的喪失也必定伴隨著陽性選擇標(biāo)志物的喪失。甚至更優(yōu)選地，將陽性選擇標(biāo)志物和陰性選擇標(biāo)志物融合，以使一種的喪失強(qiáng)制性地導(dǎo)致另一種的喪失。產(chǎn)生作為表達(dá)產(chǎn)物的賦予以上所述的期望的陽性和陰性選擇性能的多肽的融合多核苷酸的實(shí)例是潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)。該基因的表達(dá)產(chǎn)生了這樣的多肽，其賦予用于體外陽性選擇的潮霉素B抗性，以及用于體內(nèi)陰性選擇的更昔洛韋敏感性。參見LuptonS.D.等人，Mol.andCell.Biology11:3374-3378,1991。此外，在優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼嵌合受體的本發(fā)明的多核苷酸位于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包含融合基因，特別是賦予用于體外陽性選擇的潮霉素B抗性以及用于體內(nèi)陰性選擇的更昔洛韋敏感性的那些融合基因，例如以上Lupton,S.D.等人(1991)中所述的HyTK逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。也參見S.D.Lupton的PCTUS91/08442和PCT/US94/05601的出版物，其描述了使用來源于將顯性陽性選擇標(biāo)志物與陰性選擇標(biāo)志物融合的雙功能選擇融合基因。優(yōu)選的陽性選擇標(biāo)志物來源于選自hph、nco和gpt的基因，以及優(yōu)選的陰性選擇標(biāo)志物來源于選自胞嘧啶脫氨酶、HSV-ITK、VZVTK、HPRT、APRT和gpt的基因。特別優(yōu)選的標(biāo)志物是雙功能選擇融合基因，其中陽性選擇標(biāo)志物來源于hph或neo，而陰性選擇標(biāo)志物來源于胞嘧啶脫氨酶或者TK基因或者選擇標(biāo)志物?？烧T導(dǎo)的自殺基因F.病毒載體在具體實(shí)施方案中，用編碼CAR的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，例如慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(例如免疫效應(yīng)細(xì)胞)。例如，用編碼CAR的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞，所述CAR包含能結(jié)合BCMA多肽的人源化的抗BCMA抗體或其抗原結(jié)合片段，以及CD3ζ、CD28、4-1BB、Ox40或其任何組合的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。因此，這些轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可以引發(fā)CAR介導(dǎo)的細(xì)胞毒性應(yīng)答。逆轉(zhuǎn)錄病毒是用于基因遞送的常用工具(Miller,2000,Nature.357:455-460)。在具體實(shí)施方案中，將逆轉(zhuǎn)錄病毒用于向細(xì)胞遞送編碼嵌合抗原受體(CAR)的多核苷酸。本文使用的術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄病毒”指這樣的RNA病毒：其將其基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄為線性雙鏈DNA拷貝，隨后將其基因組DNA共價(jià)整合進(jìn)宿主基因組。一旦病毒被整合進(jìn)宿主基因組，其被稱為“原病毒”。原病毒作為RNA聚合酶II的模板，并指導(dǎo)編碼產(chǎn)生新病毒顆粒所需的結(jié)構(gòu)蛋白和酶的RNA分子的表達(dá)。適于用于具體實(shí)施方案的示例性逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈維鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)、長(zhǎng)臂猿白血病病毒(GaLV)、貓白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗云德鼠白血病病毒、鼠干細(xì)胞病毒(MSCV)和勞氏肉瘤病毒(RSV))以及慢病毒。本文使用的術(shù)語“慢病毒”指復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄病毒組(或?qū)?。示例性的慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV1型和HIV2型)；維斯納-梅迪病毒(VMV)；山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)；馬傳染性貧血病毒(EIAV)；貓免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選基于HIV的載體骨架(即，HIV順式作用序列元件)。在具體實(shí)施方案中，將慢病毒用于向細(xì)胞遞送包含CAR的多核苷酸?？蓪⒛孓D(zhuǎn)錄病毒載體，以及尤其是慢病毒載體用于實(shí)施本發(fā)明的具體實(shí)施方案。因此，本文使用的術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄病毒”或“逆轉(zhuǎn)錄病毒載體”分別意為包括“慢病毒”和“慢病毒載體”。術(shù)語“載體”在本文用來指能夠轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)運(yùn)另外的核酸分子的核酸分子。轉(zhuǎn)移的核酸通常被連接至例如插入載體核酸分子中。載體可以包含指導(dǎo)在細(xì)胞中的自主復(fù)制的序列，或者可以包含足以允許整合進(jìn)宿主細(xì)胞DNA的序列。有用的載體包括，例如，質(zhì)粒(例如，DNA質(zhì)?；騌NA質(zhì)粒)、轉(zhuǎn)座子、粘粒、細(xì)菌人工染色體和病毒載體。有用的病毒載體包括，例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。如對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言明顯的是，術(shù)語“病毒載體”廣泛用于指包含通常促進(jìn)核酸分子的轉(zhuǎn)移或整合進(jìn)細(xì)胞基因組的病毒來源的核酸元件的核酸分子(例如，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒)，或者指介導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)移的病毒顆粒。病毒顆粒通常包含各種病毒組分，并且有時(shí)還包含除核酸之外的宿主細(xì)胞組分。術(shù)語病毒載體可以指能夠?qū)⒑怂徂D(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞的病毒或病毒顆粒，或者指轉(zhuǎn)移的核酸本身。病毒載體和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒含有主要源自病毒的結(jié)構(gòu)和/或功能遺傳元件。術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄病毒載體”指含有主要源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)和功能遺傳元件或其部分的病毒載體或質(zhì)粒。術(shù)語“慢病毒載體”指含有主要源自慢病毒的結(jié)構(gòu)和功能遺傳元件或其部分(包括LTR)的病毒載體或質(zhì)粒。術(shù)語“雜合載體”指含有逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒)序列和非慢病毒序列的載體、LTR或其它核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，雜合載體指包含用于逆轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、整合和/或包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，慢病毒)序列的載體或轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。在具體實(shí)施方案中，術(shù)語“慢病毒載體”、“慢病毒表達(dá)載體”可以用來指慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和/或感染性慢病毒顆粒。當(dāng)在本文提及諸如克隆位點(diǎn)、啟動(dòng)子、調(diào)控元件、異源核酸等的元件時(shí)，應(yīng)理解，這些元件的序列以RNA形式存在于本發(fā)明的慢病毒顆粒中，以及以DNA形式存在于本發(fā)明的DNA質(zhì)粒中。在原病毒的各端是稱為“長(zhǎng)末端重復(fù)序列”或“LTR”的結(jié)構(gòu)。術(shù)語“長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)”指位于逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA末端的堿基對(duì)結(jié)構(gòu)域，在其天然序列背景中，所述堿基對(duì)結(jié)構(gòu)域是直接的重復(fù)序列并且含有U3、R和U5區(qū)。LTR通常對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因的表達(dá)(例如，基因轉(zhuǎn)錄本的促進(jìn)、起始和聚腺苷酸化)以及病毒復(fù)制提供基本功能。LTR含有眾多調(diào)控信號(hào)，包括轉(zhuǎn)錄控制元件、聚腺苷酸化信號(hào)以及病毒基因組的復(fù)制和整合所需的序列。將病毒LTR分為稱為U3、R和U5的三個(gè)區(qū)域。U3區(qū)含有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子元件。U5區(qū)是引物結(jié)合位點(diǎn)和R區(qū)之間的序列，并且含有聚腺苷酸化序列。R(重復(fù))區(qū)的側(cè)翼是U3和U5區(qū)。LTR由U3、R和U5區(qū)構(gòu)成，并且出現(xiàn)在病毒基因組的5’端和3’端。鄰近5’LTR的是基因組逆轉(zhuǎn)錄所需的序列(tRNA引物結(jié)合位點(diǎn))以及病毒RNA有效包裝成顆粒所需的序列(Psi位點(diǎn))。本文使用的術(shù)語“包裝信號(hào)”或“包裝序列”指位于逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組內(nèi)的序列，其是將病毒RNA插入病毒衣殼或顆粒所必需的，參見例如，Clever等人,1995.J.ofVirology,Vol.69,No.4；pp.2101–2109。數(shù)種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體利用病毒基因組衣殼化所需的最小包裝信號(hào)(也被稱作psi[Ψ]序列)。因此，本文使用的術(shù)語“包裝序列”、“包裝信號(hào)”、“psi”和符號(hào)“Ψ”被用來指病毒顆粒形成期間，逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA鏈衣殼化所需的非編碼序列。在多個(gè)實(shí)施方案中，載體包含修飾的5’LTR和/或3’LTR。LTR的任一者或二者可以包含一個(gè)或多個(gè)修飾，包括但不限于，一個(gè)或多個(gè)缺失、插入或置換。通常對(duì)3’LTR進(jìn)行修飾以通過使病毒復(fù)制缺陷，來提高慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的安全性。本文使用的術(shù)語“復(fù)制缺陷”指不能夠完全有效復(fù)制以致于不能產(chǎn)生感染性病毒顆粒(例如，復(fù)制缺陷型慢病毒子代)的病毒。術(shù)語“可復(fù)制(replication-competent)”指能夠復(fù)制以致于病毒的病毒復(fù)制能夠產(chǎn)生感染性病毒顆粒(例如，可復(fù)制的慢病毒子代)的野生型病毒或突變病毒?！白允Щ睢?SIN)載體指復(fù)制缺陷型載體，例如被稱作U3區(qū)的右端(3’)LTR增強(qiáng)子-啟動(dòng)子區(qū)被修飾(例如，通過缺失或置換)以阻止第一輪病毒復(fù)制之后的病毒轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體。這是因?yàn)?，在病毒?fù)制期間右端(3’)LTRU3區(qū)被用作左端(5’)LTRU3區(qū)的模板，因此在無U3增強(qiáng)子-啟動(dòng)子的情況下不能形成病毒轉(zhuǎn)錄本。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，對(duì)3’LTR進(jìn)行修飾以使U5區(qū)被例如理想的多聚(A)序列替換。應(yīng)當(dāng)注意到，本發(fā)明也包括對(duì)LTR的修飾，如對(duì)3’LTR、5’LTR或者3’和5’LTR二者的修飾。通過用異源啟動(dòng)子替換5’LTR的U3區(qū)以在病毒顆粒產(chǎn)生期間驅(qū)動(dòng)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄來提供另外的安全性增強(qiáng)。可以使用的異源啟動(dòng)子的實(shí)例包括，例如猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)(例如，即刻早期)啟動(dòng)子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子和單純皰疹病毒(HSV)(胸苷激酶)啟動(dòng)子。典型的啟動(dòng)子能夠以Tat非依賴性的方式驅(qū)動(dòng)高水平的轉(zhuǎn)錄。該替換降低了重組以產(chǎn)生可復(fù)制的病毒的可能性，因?yàn)樵诓《井a(chǎn)生系統(tǒng)中不存在完整的U3序列。在某些實(shí)施方案中，異源啟動(dòng)子在控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄方式方面具有另外的優(yōu)勢(shì)。例如，異源啟動(dòng)子可以是可誘導(dǎo)的，使得僅當(dāng)誘導(dǎo)因子存在時(shí)，發(fā)生病毒基因組的全部或部分轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)因子包括但不限于，培養(yǎng)宿主細(xì)胞的一種或多種化合物或者生理?xiàng)l件，如溫度或pH。在一些實(shí)施方案中，病毒載體包含TAR元件。術(shù)語“TAR”指位于慢病毒(例如，HIV)LTR的R區(qū)的“反式激活反應(yīng)”遺傳元件。該元件與慢病毒反式激活因子(tat)遺傳元件相互作用以增強(qiáng)病毒復(fù)制。然而，在5’LTR的U3區(qū)被異源啟動(dòng)子替換的實(shí)施方案中，該元件不是必需的?！癛區(qū)”指逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR內(nèi)的區(qū)域，其開始于加帽基團(tuán)起點(diǎn)處(即，轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn))并結(jié)束于緊接多聚A序列的起點(diǎn)之前。R區(qū)也被限定為側(cè)翼為U3和U5區(qū)。在逆轉(zhuǎn)錄期間，R區(qū)在允許新生DNA從基因組的一端轉(zhuǎn)移至另一端中發(fā)揮作用。本文使用的術(shù)語“FLAP元件”指這樣的核酸，其序列包含逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，HIV-1或HIV-2)的中央聚嘌呤序列和中央終止序列(cPPT和CTS)。合適的FLAP元件描述于美國(guó)專利第6,682,907號(hào)和Zennou等人,2000,Cell,101:173。在HIV-1逆轉(zhuǎn)錄期間，位于中央聚嘌呤序列(cPPT)的正鏈DNA的中央起始和在中央終止序列(CTS)處的中央終止導(dǎo)致三鏈DNA結(jié)構(gòu)：HIV-1中央DNA瓣片的形成。雖然不希望被任何理論束縛，DNA瓣片可以作為慢病毒基因組核輸入的順式作用決定子和/或可以增加病毒的滴度。在具體實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體骨架在載體中目的異源基因的上游或下游包含一個(gè)或多個(gè)FLAP元件。例如，在具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒包含F(xiàn)LAP元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含分離自HIV-1的FLAP元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒轉(zhuǎn)移載體包含一個(gè)或多個(gè)輸出元件。術(shù)語“輸出元件”指順式作用轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，其調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄本從細(xì)胞的核至細(xì)胞胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。RNA輸出元件的實(shí)例包括但不限于，人免疫缺陷病毒(HIV)rev應(yīng)答元件(RRE)(參見例如，Cullen等人,1991.J.Virol.65:1053；和Cullen等人,1991.Cell58:423)和乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(HPRE)。通常，RNA輸出元件置于基因的3’UTR內(nèi)，并且可以作為一個(gè)或多個(gè)拷貝插入。在具體實(shí)施方案中，通過將轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件、高效的聚腺苷酸化位點(diǎn)以及任選地轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)并入載體來增加病毒載體中異源序列的表達(dá)。多種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件可以在蛋白水平增加異源核酸的表達(dá)，例如，土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE；Zufferey等人,1999,J.Virol.,73:2886)；存在于乙型肝炎病毒中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(HPRE)(Huang等人,Mol.Cell.Biol.,5:3864)等(Liu等人,1995,GenesDev.,9:1766)。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含諸如WPRE或HPRE的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體缺乏或者不包含諸如WPRE或HPRE的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，因?yàn)樵谝恍┣闆r下，這些元件增加了細(xì)胞轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)和/或不會(huì)大幅度或顯著增加mRNA轉(zhuǎn)錄本的量或者增加mRNA的穩(wěn)定性。因此，在一些實(shí)施方案中，作為增加的安全度量，本發(fā)明的載體缺乏或者不包含WPRE或HPRE。指導(dǎo)異源核酸轉(zhuǎn)錄本的高效終止和聚腺苷酸化的元件增加異源基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)通常存在于聚腺苷酸化信號(hào)的下游。在具體實(shí)施方案中，載體在編碼待表達(dá)多肽的多核苷酸的3’處包含聚腺苷酸化序列。本文使用的術(shù)語“多聚A位點(diǎn)”或“多聚A序列”表示通過RNA聚合酶II指導(dǎo)新生RNA轉(zhuǎn)錄本終止和聚腺苷酸化的DNA序列。通過將多聚A尾添加至編碼序列的3’端，聚腺苷酸化序列可以促進(jìn)mRNA的穩(wěn)定性，并且因此有助于翻譯效率的提高。重組轉(zhuǎn)錄本的高效聚腺苷酸化是所希望的，因?yàn)槿狈Χ嗑跘尾的轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定且被快速降解。可以用于本發(fā)明的載體中的多聚A信號(hào)的示例性實(shí)例包括理想的多聚A序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)、牛生長(zhǎng)激素多聚A序列(BGHpA)、兔β-球蛋白多聚A序列(rβgpA)或者本領(lǐng)域已知的其它合適的異源或內(nèi)源多聚A序列。在某些實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體還包含一個(gè)或多個(gè)絕緣子元件。絕緣子元件可以有助于保護(hù)慢病毒表達(dá)的序列(例如治療性多肽)不受整合位點(diǎn)的影響，這可由存在于基因組DNA中的順式作用元件介導(dǎo)，并導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的序列的表達(dá)失調(diào)(即位置效應(yīng)；參見，例如Burgess-Beusse等人，2002,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,99:16433；和Zhan等人，2001,Hum.Genet.,109:471)。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移載體在3’LTR處包含一個(gè)或多個(gè)絕緣子元件，并且在原病毒整合進(jìn)宿主基因組時(shí)，通過3’LTR復(fù)制，所述原病毒在5’LTR或3’LTR處均包含一個(gè)或多個(gè)絕緣子。用于本發(fā)明的合適的絕緣子包括但不限于雞β-球蛋白絕緣子(參見，Chung等人，1993.Cell74:505；Chung等人，1997.PNAS94:575；以及Bell等人，1999.Cell98:387，通過引用并入本文)。絕緣子元件的實(shí)例包括但不限于來自β-球蛋白基因座的絕緣子，如雞HS4。根據(jù)本發(fā)明的某些具體實(shí)施方案，病毒載體骨架序列中的大部分或者全部來源于慢病毒，例如HIV-1。然而，應(yīng)當(dāng)理解，可以使用多種不同來源的逆轉(zhuǎn)錄病毒和/或慢病毒序列或者將其進(jìn)行組合，并且在某些慢病毒序列中可以包含許多置換和改變，而不損害轉(zhuǎn)移載體執(zhí)行本文所述的功能的能力。此外，各種慢病毒載體在本領(lǐng)域是已知的，參見Naldini等人，(1996a、1996b和1998)；Zufferey等人，(1997)；Dull等人，1998,美國(guó)專利第6,013,516號(hào)和第5,994,136號(hào)，可對(duì)其中的許多進(jìn)行改變以產(chǎn)生本發(fā)明的病毒載體或轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包含與編碼CAR多肽的多核苷酸可操作地連接的啟動(dòng)子。載體可以含有一個(gè)或多個(gè)LTR，其中任一LTR包含一個(gè)或多個(gè)修飾，如一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、添加或缺失。載體還可以包含增加轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的一個(gè)或多個(gè)輔助元件(例如，cPPT/FLAP)、病毒包裝信號(hào)(例如，Psi(Ψ)包裝信號(hào)、RRE)和/或增加治療性基因表達(dá)的其它元件(例如，多聚(A)序列))，并且可以任選地包含WPRE或HPRE。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體包含左端(5’)逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；中央聚嘌呤序列/DNA瓣片(cPPT/FLAP)；逆轉(zhuǎn)錄病毒輸出元件；與編碼本文所考慮的CAR多肽的多核苷酸可操作地連接的在T細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子；和右端(3’)逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；以及任選地包含WPRE或HPRE。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體包含左端(5’)逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；逆轉(zhuǎn)錄病毒輸出元件；與編碼本文所考慮的CAR多肽的多核苷酸可操作地連接的在T細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子；右端(3’)逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；和多聚(A)序列；以及任選地包含WPRE或HPRE。在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含下述的慢病毒載體：左端(5’)LTR；cPPT/FLAP；RRE；與編碼本文所考慮的CAR多肽的多核苷酸可操作地連接的在T細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子；右端(3’)LTR；和聚腺苷酸化序列；以及任選地WPRE或HPRE。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含下述的慢病毒載體：左端(5’)HIV-1LTR；Psi(Ψ)包裝信號(hào)；cPPT/FLAP；RRE；與編碼本文所考慮的CAR多肽的多核苷酸可操作地連接的在T細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子；右端(3’)自失活(SIN)HIV-1LTR；和兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列；以及任選地WPRE或HPRE。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含下述的載體：至少一個(gè)LTR；中央聚嘌呤序列/DNA瓣片(cPPT/FLAP)；逆轉(zhuǎn)錄病毒輸出元件；和與編碼本文所考慮的CAR多肽的多核苷酸可操作地連接的在T細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子；以及任選地WPRE或HPRE。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含下述的載體：至少一個(gè)LTR；cPPT/FLAP；RRE；與編碼本文所考慮的CAR多肽的多核苷酸可操作地連接的在T細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子；和聚腺苷酸化序列；以及任選地WPRE或HPRE。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供至少一個(gè)SINHIV-1LTR；Psi(Ψ)包裝信號(hào)；cPPT/FLAP；RRE；與編碼本文所考慮的CAR多肽的多核苷酸可操作地連接的在T細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子；和兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列；以及任選地WPRE或HPRE?！八拗骷?xì)胞”包括用本發(fā)明的重組載體或多核苷酸在體內(nèi)、離體或者在體外電穿孔、轉(zhuǎn)染、感染或者轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以包括包裝細(xì)胞、生產(chǎn)細(xì)胞和用病毒載體感染的細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，向需要治療的對(duì)象施用用本發(fā)明的病毒載體感染的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“靶細(xì)胞”與宿主細(xì)胞可互換使用，并且指期望的細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染的、感染的或者轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是T細(xì)胞。大規(guī)模病毒顆粒的產(chǎn)生通常是達(dá)到合理的病毒滴度所必需的。通過將轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染至包含病毒結(jié)構(gòu)基因和/或輔助基因的包裝細(xì)胞系中產(chǎn)生病毒顆粒，所述病毒結(jié)構(gòu)基因和/或輔助基因例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因或者其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基因。本文使用的術(shù)語“包裝載體”指缺乏包裝信號(hào)，并包含編碼一種、兩種、三種、四種或者更多種病毒結(jié)構(gòu)基因和/或輔助基因的多核苷酸的表達(dá)載體或病毒載體。通常，包裝載體包含于包裝細(xì)胞中，并經(jīng)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染被引入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。可以經(jīng)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染將本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒轉(zhuǎn)移載體引入包裝細(xì)胞系，以產(chǎn)生生產(chǎn)細(xì)胞或細(xì)胞系。可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法將本發(fā)明的包裝載體引入人細(xì)胞或細(xì)胞系，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括，例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔。在一些實(shí)施方案中，將包裝載體與顯性選擇標(biāo)志物一同引入細(xì)胞，隨后在存在合適的藥物的情況下進(jìn)行選擇，并分離克隆，所述顯性選擇標(biāo)志物如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、殺稻瘟菌素(blastocidin)、博萊霉素(zeocin)、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA?？梢岳缤ㄟ^IRES或自切割的病毒肽將選擇標(biāo)志物基因與由包裝載體編碼的基因物理連接。病毒包膜蛋白(env)決定了最終可被由細(xì)胞系產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染和轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的范圍。在慢病毒如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIV的情況下，env蛋白包括gp41和gp120。優(yōu)選地，由本發(fā)明的包裝細(xì)胞表達(dá)的病毒env蛋白在與病毒gag和pol基因不同的載體上編碼，正如之前所描述的?？捎糜诒景l(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的env基因的示例性實(shí)例包括但不限于：MLV包膜、10A1包膜、BAEV包膜、FeLV-B包膜、RD114包膜、SSAV包膜、埃博拉病毒包膜、仙臺(tái)病毒包膜、FPV(雞瘟病毒)包膜和流感病毒包膜。類似地，可以使用編碼來自RNA病毒(例如，小RNA病毒科、杯狀病毒科(Coronaviridae)、星狀病毒科、披膜病毒科、黃病毒科、冠狀病毒科、副粘液病毒科、彈狀病毒科、絲狀病毒科、正粘病毒科、布尼亞病毒科、沙粒病毒科、呼腸孤病毒科、雙RNA病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科的RNA病毒家族)包膜以及來自DNA病毒(嗜肝DNA病毒科、圓環(huán)病毒科、小DNA病毒科、乳頭多瘤空泡病毒科、腺病毒科、皰疹病毒科、痘病毒科(Poxyiridae)以及虹彩病毒科的家族)的包膜的基因。代表性的實(shí)例包括：FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、狂犬病毒、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10以及EIAV。在其它實(shí)施方案中，用于假型包裝(pseudotyping)本發(fā)明的病毒的包膜蛋白包括但不限于任何下述病毒的包膜蛋白：A型流感病毒(如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1(禽流感病毒))、B型流感病毒、C型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、輪狀病毒、諾瓦克病毒組的任何病毒、腸道腺病毒、細(xì)小病毒、登革熱病毒、猴痘病毒、單股負(fù)鏈病毒、狂犬病毒屬(如狂犬病毒、拉各斯蝙蝠病毒、莫科拉病毒、杜文黑基病毒、歐洲蝙蝠病毒1型&2型以及澳大利亞蝙蝠病毒)、暫時(shí)熱病毒屬、水泡病毒屬、水泡性口炎病毒(VSV)、皰疹病毒(如單純皰疹病毒1型和2型、水痘帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)、人皰疹病毒(HHV)、人皰疹病毒6型和8型)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、乳頭瘤病毒、鼠γ皰疹病毒、沙粒病毒(如阿根廷出血熱病毒、玻利維亞出血熱病毒、薩比亞相關(guān)出血熱病毒(Sabia-associatedhemorrhagicfevervirus)、委內(nèi)瑞拉出血熱病毒、拉沙熱病毒、馬丘波病毒)、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)、布尼亞病毒科(Bunyaviridiae)(如克里米亞-剛果出血熱病毒、漢坦病毒、引起腎綜合征出血熱的病毒、裂谷熱病毒)、絲狀病毒科(線狀病毒)(包括埃博拉出血熱病毒和馬爾堡出血熱病毒)、黃病毒科(包括卡薩諾爾森林病病毒、鄂木斯克出血熱病毒、引起蜱傳腦炎的病毒)和副粘液病毒科(如亨德拉病毒和立百病毒)、大天花和小天花(天花)、甲病毒(如委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒)、SARS相關(guān)的冠狀病毒(SARS-CoV)、西尼羅病毒、任何引起腦炎的病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生用VSV-G糖蛋白假型包裝的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒)的包裝細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“假型(pseudotype)”或“假型包裝”指病毒包膜蛋白已被具有更優(yōu)特性的其它病毒的包膜蛋白替代的病毒。例如，可用水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白對(duì)HIV進(jìn)行假型包裝，這允許HIV感染更廣范圍的細(xì)胞，因?yàn)镠IV包膜蛋白(由env基因編碼)通常使病毒靶向CD4+遞呈細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用VSV-G對(duì)慢病毒包膜蛋白進(jìn)行假型包裝。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生用VSV-G包膜糖蛋白進(jìn)行假型包裝的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒)的包裝細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“包裝細(xì)胞系”用于指這樣的細(xì)胞系：其不包含包裝信號(hào)，但是穩(wěn)定或者瞬時(shí)表達(dá)病毒顆粒正確包裝所必需的病毒結(jié)構(gòu)蛋白和復(fù)制酶(例如gag、pol和env)。可將任何合適的細(xì)胞系用于制備本發(fā)明的包裝細(xì)胞。通常，細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生包裝細(xì)胞系的細(xì)胞是人細(xì)胞?？梢允褂玫暮线m的細(xì)胞系包括，例如，CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、C3H10T1/2細(xì)胞、FLY細(xì)胞、Psi-2細(xì)胞、BOSC23細(xì)胞、PA317細(xì)胞、WEHI細(xì)胞、COS細(xì)胞、BSC1細(xì)胞、BSC40細(xì)胞、BMT10細(xì)胞、VERO細(xì)胞、W138細(xì)胞、MRC5細(xì)胞、A549細(xì)胞、HT1080細(xì)胞、293細(xì)胞、293T細(xì)胞、B-50細(xì)胞、3T3細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、Saos-2細(xì)胞、Huh7細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、W163細(xì)胞、211細(xì)胞以及211A細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，包裝細(xì)胞為293細(xì)胞、293T細(xì)胞或者A549細(xì)胞。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是A549細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“生產(chǎn)細(xì)胞系”指能夠產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的細(xì)胞系，包括包裝細(xì)胞系和包含包裝信號(hào)的轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建體。感染性病毒顆粒和病毒儲(chǔ)液的產(chǎn)生可以利用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。制備病毒儲(chǔ)液的方法在本領(lǐng)域是已知的，并且由例如Y.Soneoka等人(1995)Nucl.AcidsRes.23:628-633和N.R.Landau等人(1992)J.Virol.66:5110-5113闡明。可以利用常規(guī)技術(shù)從包裝細(xì)胞中收集感染性病毒顆粒。例如，如本領(lǐng)域所知的，可以通過細(xì)胞裂解或者收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液來收集感染性顆粒。任選地，如果需要，可將收集的病毒顆粒進(jìn)行純化。合適的純化技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言眾所周知。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體，通過病毒感染而非轉(zhuǎn)染的手段遞送基因或其它多核苷酸序列被稱為“轉(zhuǎn)導(dǎo)”。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過感染和原病毒整合將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，如果靶細(xì)胞(例如T細(xì)胞)包含使用病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過感染被遞送至細(xì)胞的基因或其它多核苷酸序列，則其被“轉(zhuǎn)導(dǎo)”。在具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞在其細(xì)胞基因組中包含通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體遞送的一種或多種基因或者其它多核苷酸序列。在具體實(shí)施方案中，向?qū)ο笫┯糜帽磉_(dá)一種或多種多肽的本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞，以治療和/或預(yù)防B細(xì)胞惡性腫瘤。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案可被使用的涉及病毒載體在基因療法中的應(yīng)用的其它方法可見于，例如Kay,M.A.(1997)Chest111(6Supp.):138S-142S；Ferry,N.和Heard,J.M.(1998)Hum.GeneTher.9:1975-81；Shiratory,Y.等人(1999)Liver19:265-74；Oka,K.等人(2000)Curr.Opin.Lipidol.11:179-86；Thule,P.M.和Liu,J.M.(2000)GeneTher.7:1744-52；Yang,N.S.(1992)Crit.Rev.Biotechnol.12:335-56；Alt,M.(1995)J.Hepatol.23:746-58；Brody,S.L.和Crystal,R.G.(1994)Ann.N.Y.Acad.Sci.716:90-101；Strayer,D.S.(1999)ExpertOpin.Investig.Drugs8:2159-2172；Smith-Arica,J.R.和Bartlett,J.S.(2001)Curr.Cardiol.Rep.3:43-49；以及Lee,H.C.等人(2000)Nature408:483-8。G.遺傳修飾的細(xì)胞在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮被遺傳修飾以表達(dá)本文所考慮的CAR的細(xì)胞，其用于治療B細(xì)胞相關(guān)病況。本文使用的術(shù)語“遺傳改造的”或“遺傳修飾的”指將DNA或RNA形式的額外的遺傳物質(zhì)添加至細(xì)胞的總遺傳物質(zhì)中。術(shù)語“遺傳修飾的細(xì)胞”、“修飾的細(xì)胞”和“重定向的細(xì)胞”可互換使用。本文使用的術(shù)語“基因療法”指為恢復(fù)、校正或改變基因的表達(dá)，或者出于表達(dá)治療性多肽例如CAR的目的，將DNA或RNA形式的額外的遺傳物質(zhì)引入細(xì)胞的總遺傳物質(zhì)中。在具體實(shí)施方案中，將本文所考慮的CAR引入免疫效應(yīng)細(xì)胞，并在其中表達(dá)，以將其特異性重定向至目的靶抗原，例如BCMA多肽?！懊庖咝?yīng)細(xì)胞”是具有一種或多種效應(yīng)功能(例如，細(xì)胞毒性細(xì)胞殺傷活性、細(xì)胞因子的分泌、ADCC和/或CDC的誘導(dǎo))的免疫系統(tǒng)的任何細(xì)胞。本發(fā)明的免疫效應(yīng)細(xì)胞可以是自體同源的/自體的(“自身”)或者非自體的(“非自身”，例如同種異體的、同基因的或者異基因的)?！氨疚氖褂玫摹白泽w同源的(autologous)”指來自同一對(duì)象的細(xì)胞。本文使用的“同種異體的(allogeneic)”指與相比較的細(xì)胞在遺傳學(xué)上不同的相同物種的細(xì)胞。本文使用的“同基因的(syngeneic)”指與相比較的細(xì)胞在遺傳學(xué)上相同的不同對(duì)象的細(xì)胞。本文使用的“異基因(xenogeneic)”指與相比較的細(xì)胞不同物種的細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞是同種異體的。與本文所考慮的CAR一起使用的示例性的免疫效應(yīng)細(xì)胞包括T淋巴細(xì)胞。術(shù)語“T細(xì)胞”或“T淋巴細(xì)胞”是本領(lǐng)域公認(rèn)的，并且意圖包括胸腺細(xì)胞、未成熟的T淋巴細(xì)胞、成熟的T淋巴細(xì)胞、靜止的T淋巴細(xì)胞或活化的T淋巴細(xì)胞。T細(xì)胞可以是輔助性T(Th)細(xì)胞，例如輔助性T1(Th1)細(xì)胞或者輔助性T2(Th2)細(xì)胞。T細(xì)胞可以是輔助性T細(xì)胞(HTL；CD4+T細(xì)胞)CD4+T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL；CD8+T細(xì)胞)、CD4+CD8+T細(xì)胞、CD4-CD8-T細(xì)胞或者T細(xì)胞的任何其它子集。適用于具體實(shí)施方案的其它示例性T細(xì)胞群包括初始T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解的，其它細(xì)胞也可被用作具有本文所述的CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞。具體而言，免疫效應(yīng)細(xì)胞還包括NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。免疫效應(yīng)細(xì)胞還包括效應(yīng)細(xì)胞的祖細(xì)胞，其中可以在體內(nèi)或體外將此類祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化為免疫效應(yīng)細(xì)胞。因此，在具體實(shí)施方案中，免疫效應(yīng)細(xì)胞包括免疫效應(yīng)細(xì)胞的祖細(xì)胞，如包含在源自臍帶血、骨髓或動(dòng)員外周血的CD34+細(xì)胞群內(nèi)的造血干細(xì)胞(HSC)，當(dāng)在對(duì)象中施用時(shí)，所述祖細(xì)胞分化為成熟的免疫效應(yīng)細(xì)胞，或者其可在體外被誘導(dǎo)分化為成熟的免疫效應(yīng)細(xì)胞。如本文所使用的，經(jīng)遺傳改造以包含BCMA特異性CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞可被稱為“BCMA特異性重定向的免疫效應(yīng)細(xì)胞”。本文使用的術(shù)語“CD34+細(xì)胞”指在其細(xì)胞表面表達(dá)CD34蛋白的細(xì)胞。本文使用的“CD34”指通常作為細(xì)胞-細(xì)胞粘附因子并參與T細(xì)胞進(jìn)入淋巴結(jié)的細(xì)胞表面糖蛋白(例如唾液粘蛋白)。CD34+細(xì)胞群含有造血干細(xì)胞(HSC)，當(dāng)向患者施用時(shí)，所述造血干細(xì)胞分化并貢獻(xiàn)了所有造血譜系，包括T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞。本發(fā)明提供制備表達(dá)本文所考慮的CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)分離自個(gè)體的免疫效應(yīng)細(xì)胞，以使免疫效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)本文所述的一種或多種CAR。在某些實(shí)施方案中，免疫效應(yīng)細(xì)胞分離自個(gè)體，并且對(duì)其進(jìn)行遺傳修飾而不進(jìn)行進(jìn)一步的體外操作。然后可將此類細(xì)胞直接再施用回所述個(gè)體。在其它實(shí)施方案中，在對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)CAR之前，將其首先在體外活化并刺激，從而增殖。就這一點(diǎn)而言，可在在進(jìn)行遺傳修飾(即轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染，以表達(dá)本文所考慮的CAR)之前和/或之后培養(yǎng)免疫效應(yīng)細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，在對(duì)本文所述的免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行體外操作或者遺傳修飾之前，從對(duì)象獲得細(xì)胞來源。在具體實(shí)施方案中，CAR修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞包括T細(xì)胞。T細(xì)胞可獲自多種來源，包括但不限于：外周血單核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織以及腫瘤。在某些實(shí)施方案中，可以利用技術(shù)人員已知的多種技術(shù)(如沉積，例如FICOLLTM分離)從收集自對(duì)象的血液?jiǎn)挝猾@得T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過血漿分離置換法(apheresis)獲得來自個(gè)體循環(huán)血的細(xì)胞。血漿分離置換法的產(chǎn)物通常含有淋巴細(xì)胞，包括T細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、B細(xì)胞、其它有核白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以對(duì)通過血漿分離置換法收集的細(xì)胞進(jìn)行洗滌，以移除血漿級(jí)分，并將細(xì)胞置于合適的緩沖劑或介質(zhì)中用于隨后處理?？梢杂肞BS或者用缺乏鈣、鎂以及大部分二價(jià)陽離子(如果不是所有其它二價(jià)陽離子)的其它合適的溶液洗滌細(xì)胞。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，如通過使用半自動(dòng)流通式離心機(jī)，來完成洗滌步驟。例如，Cobe2991細(xì)胞處理器、BaxterCytoMate等。洗滌之后，可在多種生物相容的緩沖劑或者含有或不含緩沖劑的其它鹽溶液中重懸細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，可在細(xì)胞直接重懸的培養(yǎng)基中移除血漿分離置換法樣品中不想要的組分。在某些實(shí)施方案中，通過裂解紅細(xì)胞并耗盡單核細(xì)胞(例如，通過經(jīng)PERCOLLTM梯度離心)，從外周血單核細(xì)胞(PBMC)分離T細(xì)胞?？梢酝ㄟ^陽性或陰性選擇技術(shù)進(jìn)一步分離表達(dá)下述標(biāo)志物中的一種或多種的特定T細(xì)胞亞群：CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過陽性或陰性選擇技術(shù)進(jìn)一步分離表達(dá)CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO的特定T細(xì)胞亞群。例如，可以用針對(duì)陰性選擇的細(xì)胞特有的表面標(biāo)志物的抗體組合來完成通過陰性選擇的T細(xì)胞群的富集。本文使用的一種方法是經(jīng)負(fù)磁性免疫粘附或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分選和/或選擇，所述負(fù)磁性免疫粘附或流式細(xì)胞術(shù)利用針對(duì)被陰性選擇的細(xì)胞上存在的細(xì)胞表面標(biāo)志物的單克隆抗體的混合物。例如，為了通過陰性選擇富集CD4+細(xì)胞，單克隆抗體混合物通常包含針對(duì)CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗體。也可將流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞分選用于分離本發(fā)明使用的目的細(xì)胞群?？梢允褂帽疚乃紤]的方法，對(duì)PBMC直接進(jìn)行遺傳修飾，以表達(dá)CAR。在某些實(shí)施方案中，在PBMC分離之后，進(jìn)一步分離T淋巴細(xì)胞；以及在某些實(shí)施方案中，在進(jìn)行遺傳修飾和/或擴(kuò)增之前或之后，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和輔助性T淋巴細(xì)胞均可被分選為初始T細(xì)胞亞群、記憶T細(xì)胞亞群和效應(yīng)T細(xì)胞亞群。可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得CD8+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，通過鑒定與那些CD8+細(xì)胞類型中的每一種相關(guān)的細(xì)胞表面抗原，將CD8+細(xì)胞進(jìn)一步分選為初始細(xì)胞、中樞記憶型細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，初始CD8+T淋巴細(xì)胞的特征為初始T細(xì)胞的表型標(biāo)志物的表達(dá)，所述表型標(biāo)志物包括CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA。在具體實(shí)施方案中，記憶T細(xì)胞存在于CD8+外周血淋巴細(xì)胞的CD62L+和CD62L-子集中。在用抗CD8和抗CD62L抗體染色之后，PBMC被分選為CD62L-CD8+和CD62L+CD8+級(jí)分。在一些實(shí)施方案中，中樞記憶型T細(xì)胞表達(dá)的表型標(biāo)志物包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和CD127，并且對(duì)于顆粒酶B而言是陰性的。在一些實(shí)施方案中，中樞記憶型T細(xì)胞為CD45RO+T細(xì)胞、CD62L+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)于CD62L、CCR7、CD28和CD127而言是陰性的，并且對(duì)于顆粒酶B和穿孔素而言是陽性的。在某些實(shí)施方案中，將CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步分選為亞群。例如，可以通過鑒定具有細(xì)胞表面抗原的細(xì)胞群，將CD4+輔助性T細(xì)胞分選為初始細(xì)胞、中樞記憶型細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。通過標(biāo)準(zhǔn)方法可以獲得CD4+淋巴細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，初始CD4+T淋巴細(xì)胞為CD45RO-T細(xì)胞、CD45RA+T細(xì)胞、CD62L+CD4+T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，中樞記憶型CD4+細(xì)胞為CD62L陽性和CD45RO陽性的。在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)CD4+細(xì)胞為CD62L和CD45RO陰性的?？梢允褂靡阎姆椒?，在分離之后，對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞(如T細(xì)胞)進(jìn)行遺傳修飾，或者可在進(jìn)行遺傳修飾之前，在體外活化并擴(kuò)增(或者在祖細(xì)胞的情況下，分化)免疫效應(yīng)細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，將免疫效應(yīng)細(xì)胞(如T細(xì)胞)用本文所考慮的嵌合抗原受體進(jìn)行遺傳修飾(例如，用包含編碼CAR的核酸的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo))，然后在體外進(jìn)行活化并擴(kuò)增。在多個(gè)實(shí)施方案中，可以使用如例如美國(guó)專利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041；以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20060121005中所述的方法，在進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)CAR之前或之后，將T細(xì)胞活化并擴(kuò)增。通常，通過與表面接觸來擴(kuò)增T細(xì)胞，該表面連接有刺激CD3TCR復(fù)合物相關(guān)信號(hào)的物質(zhì)和刺激T細(xì)胞表面上的共刺激分子的配體。通過使T細(xì)胞群與固定于表面上的抗CD3抗體或其抗原結(jié)合片段或者抗CD2抗體接觸，或者通過使T細(xì)胞群與蛋白激酶C激活劑(例如苔蘚抑素)以及鈣離子載體接觸，可以刺激T細(xì)胞群。也考慮T細(xì)胞表面的輔助分子的共刺激。在具體實(shí)施方案中，在含有合適的細(xì)胞因子(如IL-2、IL-7和/或IL-15)的培養(yǎng)基中，使PBMC或分離的T細(xì)胞與通常被連接至珠子或其它表面的刺激劑和共刺激劑(如抗CD3和抗CD28抗體)接觸。為了刺激CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞的增殖，使用抗CD3抗體和抗CD28抗體?？笴D28抗體的實(shí)例包括9.3,B-T3,XR-CD28(Diacione,Besancon,France)，其可以同本領(lǐng)域眾所周知的其它方法一樣來使用(Berg等人，TransplantProc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人，J.ImmunolMeth.227(1-2):53-63,1999)。與同一珠子相連的抗CD3抗體和抗CD28抗體作為“替代的”抗原遞呈細(xì)胞(APC)。在其它實(shí)施方案中，可以利用如US6040177、US5827642和WO2012129514中所述的那些方法，用飼養(yǎng)細(xì)胞以及合適的抗體和細(xì)胞因子來活化T細(xì)胞并刺激其增殖。在其它實(shí)施方案中，通過改造K562、U937、721.221、T2和C1R細(xì)胞來制備人工APC(aAPC)，以指導(dǎo)多種共刺激分子和細(xì)胞因子的穩(wěn)定表達(dá)和分泌。在具體實(shí)施方案中，K32或U32aAPC用于指導(dǎo)一種或多種基于抗體的刺激分子在AAPC細(xì)胞表面上的展示。aAPC上基因的多種組合的表達(dá)使得能夠準(zhǔn)確確定人T細(xì)胞活化的需求，以使aAPC能夠適用于具有特定生長(zhǎng)需求和不同功能的T細(xì)胞子集的最優(yōu)增殖。相比于天然APC的使用，aAPC支持功能性的人CD8T細(xì)胞的離體生長(zhǎng)和長(zhǎng)期擴(kuò)增，而不需要添加外源生長(zhǎng)因子?？梢酝ㄟ^表達(dá)多種共刺激分子的aAPC來擴(kuò)增T細(xì)胞群，所述共刺激分子包括但不限于：CD137L(4-1BBL)、CD134L(OX40L)和/或CD80或CD86。最后，aAPC為擴(kuò)增遺傳修飾的T細(xì)胞和維持CD8T細(xì)胞上的CD28的表達(dá)提供高效平臺(tái)。在此，將WO03/057171和US2003/0147869中提供的aAPC通過引用整體并入。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，向?qū)ο笫┯弥螅D(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+細(xì)胞在體內(nèi)分化為成熟的免疫效應(yīng)細(xì)胞，通常，所述對(duì)象為最初分離所述細(xì)胞的對(duì)象。在另一實(shí)施方案中，可在暴露于本文所述的CAR之前或者用本文所述的CAR進(jìn)行遺傳修飾之后，根據(jù)之前所述的方法(Asheuer等人，2004；Imren等人，2004)，用下述細(xì)胞因子中的一種或多種在體外刺激CD34+細(xì)胞：Flt-3配體(FLT3)、干細(xì)胞因子(SCF)、巨核細(xì)胞生長(zhǎng)和分化因子(TPO)、IL-3和IL-6。本發(fā)明提供用于治療癌癥的修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞群，所述修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞包含本文所公開的CAR。例如，從獲自被診斷患有本文所述的B細(xì)胞惡性腫瘤的患者(自體供體)的外周血單核細(xì)胞(PBMC)制備修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞群。PBMC形成可以是CD4+、CD8+或者CD4+及CD8+的異源T淋巴細(xì)胞群。PBMC還可以包含其它細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，如NK細(xì)胞或NKT細(xì)胞?？蓪y帶本文所考慮的CAR的編碼序列的表達(dá)載體引入人供體T細(xì)胞群、NK細(xì)胞群或NKT細(xì)胞群。除了利用抗CD3抗體和/或抗CD28抗體和IL-2或者如本文別處所述的本領(lǐng)域已知的任何其它方法進(jìn)行細(xì)胞活化之外，可以利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)攜帶表達(dá)載體的成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞進(jìn)行分選，以分離CD3陽性T細(xì)胞，然后進(jìn)一步增殖，從而增加這些表達(dá)CAR蛋白的T細(xì)胞的數(shù)目。使用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)Ρ磉_(dá)CAR蛋白的T細(xì)胞進(jìn)行低溫保藏，用于儲(chǔ)存和/或制備在人對(duì)象中使用的T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在非人的動(dòng)物來源的產(chǎn)物(如胎牛血清(fetalcalfserum)和胎牛血清(fetalbovineserum))不存在的情況下進(jìn)行T細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)、培養(yǎng)和/或擴(kuò)增。由于異源PBMC群是遺傳修飾的，因此得到的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞是包含本文所考慮的靶向BCMA的CAR的異源的修飾細(xì)胞群。在又一實(shí)施方案中，可將例如一種、兩種、三種、四種、五種或者更多種不同的表達(dá)載體的混合物用于對(duì)供體的免疫效應(yīng)細(xì)胞群進(jìn)行遺傳修飾，其中各載體編碼本文所考慮的不同嵌合抗原受體蛋白。得到的修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞形成混合的修飾細(xì)胞群，其中修飾的細(xì)胞中的一部分表達(dá)多種不同的CAR蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供儲(chǔ)存表達(dá)遺傳修飾的鼠CAR蛋白、人CAR蛋白或人源化CAR蛋白的免疫效應(yīng)細(xì)胞(其靶向BCMA蛋白)的方法，其包括將免疫效應(yīng)細(xì)胞低溫保藏，以使所述細(xì)胞在解凍時(shí)仍可存活。可以通過本領(lǐng)域已知的方法低溫保藏表達(dá)CAR蛋白的免疫效應(yīng)細(xì)胞的級(jí)分，為受B細(xì)胞相關(guān)病況困擾的患者的未來治療提供此類細(xì)胞的永久來源。當(dāng)需要時(shí)，為了更多此類細(xì)胞，可以使低溫保藏的轉(zhuǎn)化的免疫效應(yīng)細(xì)胞解凍、生長(zhǎng)并擴(kuò)增。本文所使用“低溫保藏(cryopreserving)”指通過冷卻至零度以下的溫度(如(通常)77K或-196℃(液氮的沸點(diǎn)))保存細(xì)胞。通常在零度以下的溫度下使用低溫保護(hù)劑，以防止被保存的細(xì)胞受到由于在低溫下凍存或升溫至室溫導(dǎo)致的損害。低溫保護(hù)劑和最佳冷卻速率可以保護(hù)免受細(xì)胞損傷?？梢允褂玫牡蜏乇Ｗo(hù)劑包括但不限于二甲基亞砜(DMSO)(Lovelock和Bishop,Nature,1959；183:1394-1395；Ashwood-Smith,Nature,1961；190:1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷(Rinfret,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1960；85:576)和聚乙二醇(Sloviter和Ravdin,Nature,1962；196:48)。優(yōu)選的冷卻速率為1°至3℃/分鐘。在至少兩個(gè)小時(shí)之后，T細(xì)胞達(dá)到-80℃的溫度，并且可將其直接置于液氮(-196℃)中，以在如長(zhǎng)期的低溫儲(chǔ)存容器中永久儲(chǔ)存。H.組合物和制劑本文所考慮的組合物可以包含本文所考慮的一種或多種多肽、多核苷酸、包含多核苷酸的載體、遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞等。組合物包括但不限于藥物組合物?！八幬锝M合物”指在藥學(xué)可接受的或生理學(xué)可接受的溶液中配制的組合物，其用于向細(xì)胞或動(dòng)物單獨(dú)施用或者與一種或多種其它治療形式組合施用。也將理解，如果需要，也可將本發(fā)明的組合物與其它物質(zhì)組合施用，所述其它物質(zhì)如例如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素、小分子、化學(xué)治療劑、前藥、藥物、抗體或其它各種藥學(xué)活性劑。對(duì)于也可包含于組合物中的其它組分幾乎無限制，條件是另外的物質(zhì)不會(huì)不利地影響組合物提供預(yù)期療法的能力。短語“藥學(xué)可接受的”在本文用來指這樣的化合物、材料、組合物和/或劑型：在合理的醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)，其適于與人和動(dòng)物的組織接觸使用而無過度的毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或者其它問題或并發(fā)癥，與合理的益處/風(fēng)險(xiǎn)比相對(duì)應(yīng)。本文使用的“藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”包括但不限于已被美國(guó)食品和藥品管理局批準(zhǔn)為可接受用于人或家養(yǎng)動(dòng)物的任何佐劑、載體、賦形劑、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、增味劑、表面活性劑、潤(rùn)濕劑、分散劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、等張劑、溶劑、表面活性劑或者乳化劑。示例性的藥學(xué)可接受的載體包括但不限于：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；可可脂、蠟、動(dòng)物和植物油脂、石蠟、硅酮、膨潤(rùn)土、硅酸、氧化鋅；油類，如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇類，如丙二醇；多元醇，如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯類，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等張鹽水；林格氏液；乙醇；磷酸鹽緩沖液；以及藥學(xué)制劑中采用的任何其它相容的物質(zhì)。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含一定量的本文所考慮的表達(dá)CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“量”指達(dá)到有益的或期望的預(yù)防性或治療性結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的遺傳修飾的治療性細(xì)胞(例如T細(xì)胞)的“有效量(anamounteffective)”或者“有效量(aneffectiveamount)”。“預(yù)防有效量”指有效實(shí)現(xiàn)期望的預(yù)防性結(jié)果的遺傳修飾的治療性細(xì)胞的量。通常但不一定，由于在疾病之前或者在疾病的早期階段在對(duì)象中使用預(yù)防性劑量，因此預(yù)防有效量低于治療有效量。遺傳修飾的治療性細(xì)胞的“治療有效量”可以根據(jù)諸如以下的因素而變化：個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，以及干細(xì)胞和祖細(xì)胞在所述個(gè)體中引發(fā)期望的應(yīng)答的能力。治療有效量也是這樣的量：其中病毒或轉(zhuǎn)導(dǎo)的治療性細(xì)胞的任何毒性作用或有害作用被治療有益效果超過。術(shù)語“治療有效量”包括有效“治療”對(duì)象(例如患者)的量。當(dāng)標(biāo)明治療量時(shí)，待施用的本發(fā)明的組合物的精確量可以由醫(yī)師通過考慮個(gè)體的年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉(zhuǎn)移的程度以及患者(對(duì)象)的病況的差異來確定。通?？梢砸?guī)定，包含本文所述的T細(xì)胞的藥物組合物可以以102至1010個(gè)細(xì)胞/kg體重，優(yōu)選105至106個(gè)細(xì)胞/kg體重的劑量，包括這些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值的劑量施用。細(xì)胞數(shù)將取決于組合物預(yù)期的最終用途以及其內(nèi)包括的細(xì)胞的類型。對(duì)于本文提供的用途，細(xì)胞的體積通常是升或更少，可以是500mL或更少，甚至是250mL或100mL或者更少。因此期望的細(xì)胞的密度通常大于106個(gè)細(xì)胞/ml，以及通常大于107個(gè)細(xì)胞/ml，通常為108個(gè)細(xì)胞/ml或更大?？梢詫⑴R床相關(guān)數(shù)目的免疫細(xì)胞分配成多次輸入，所述多次輸入累積等于或超過105、106、107、108、109、1010、1011或1012個(gè)細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面，特別是由于所有的輸入細(xì)胞將被重定向至特定的靶抗原，可以施用范圍為106/千克的較低數(shù)目的細(xì)胞(每例患者106-1011個(gè))?？梢砸赃@些范圍內(nèi)的劑量多次施用表達(dá)CAR的細(xì)胞組合物。細(xì)胞相對(duì)于經(jīng)歷治療的患者可以是同種異體的、同基因的、異基因的或自體同源的。若需要，治療還可以包括施用如本文所描述的有絲分裂原(例如，PHA)或淋巴因子、細(xì)胞因子和/或趨化因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-18和TNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1α等)以增強(qiáng)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。通常，包含本文所述活化或擴(kuò)增的細(xì)胞的組合物可以用于治療和預(yù)防在免疫受損的個(gè)體中發(fā)生的疾病。具體而言，將包含本文所考慮的CAR修飾的T細(xì)胞的組合物用于B細(xì)胞惡性腫瘤的治療。本發(fā)明的CAR修飾的T細(xì)胞可以單獨(dú)施用，或者可以作為與載體、稀釋劑、賦形劑和/或與其它組分(如IL-2)或其它細(xì)胞因子或細(xì)胞群組合的藥物組合物施用。在具體實(shí)施方案中，本文所考慮的藥物組合物包含一定量的與一種或多種藥學(xué)或生理學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合的遺傳修飾的T細(xì)胞。包含表達(dá)CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞群(如T細(xì)胞)的本發(fā)明的藥物組合物可以包含緩沖劑，如中性緩沖鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑，如EDTA或谷胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；以及防腐劑。優(yōu)選地，將本發(fā)明的組合物配制為腸胃外施用，例如血管內(nèi)(靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi))施用、腹膜內(nèi)施用或肌肉內(nèi)施用。液體藥物組合物，無論其為溶液、懸液或其它類似形式，均可以包含下述中的一種或多種：無菌稀釋劑，如用于注射的水、鹽溶液(優(yōu)選生理鹽水)、林格氏液、等張氯化鈉、固定油(如可作為溶劑或懸浮介質(zhì)的合成的甘油單酯或甘油二酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖劑，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)張度的試劑，如氯化鈉或葡萄糖?？蓪⒛c胃外制劑包封在由玻璃或塑料制得的安瓿、一次性注射器或多劑量瓶中。可注射的藥物組合物優(yōu)選是無菌的。在具體實(shí)施方案中，本文所考慮的組合物包含單獨(dú)地或與一種或多種治療劑組合的有效量的表達(dá)CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞。因此，表達(dá)CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞組合物可以單獨(dú)施用或者與其它已知的癌癥療法組合施用，所述其它已知的癌癥療法如放療、化療、移植、免疫療法、激素療法、光動(dòng)力療法等。還可將組合物與抗生素組合施用。在本領(lǐng)域，可以接受此類治療劑作為本文所述的具體疾病狀態(tài)(如具體的癌癥)的標(biāo)準(zhǔn)治療?？紤]的示例性的治療劑包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、類固醇、NSAID、DMARD、抗炎劑、化療劑、放療劑、治療性抗體或者其它活性劑和輔助劑。在某些實(shí)施方案中，可將包含本文公開的表達(dá)CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞的組合物與多種化療劑聯(lián)合施用。化療劑的示例性實(shí)例包括：烴化劑，如噻替哌和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)；烴基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮雜環(huán)丙烷(aziridine)，如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺(ethylenimine)和甲基蜜胺類(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三輕甲蜜胺(trimethylolomelamineresume)；氮芥類(nitrogenmustard)，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌二醇氮芥、異環(huán)磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥、美法侖、新恩比興(novembichin)、膽甾醇對(duì)苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼氮芥、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放線菌素、安曲霉素、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C(cactinomycin)、卡奇霉素、卡柔比星(carabicin)、洋紅霉素、嗜癌菌素、色霉素、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素、地拖比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊達(dá)比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲佐菌素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU；雄激素，如卡普睪酮、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolonepropionate)、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺類，如氨魯米特、米托坦、曲洛斯坦；葉酸補(bǔ)充物，如亞葉酸(frolinicacid)；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；阿莫斯汀(bestrabucil)；比生群；依達(dá)曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞(elformithine)；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；硝氨丙吖啶；噴司他??；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼；雷佐生(razoxane)；西左喃；鍺螺胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2、2’,2”-三氯三乙胺；尿烷(urethan)；長(zhǎng)春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司??；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；阿糖胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；噻替派；紫衫烷，例如紫杉醇(Bristol-MyersSquibbOncology，Princeton，N.J.)和多西紫衫醇(doxetaxel)(Rhne-PoulencRorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物，如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春花堿；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春瑞濱；諾維本(navelbine)；諾消靈(novantrone)；替尼泊苷；道諾霉素；氨基蝶呤；希羅達(dá)(xeloda)；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥氨酸(difluoromethylomithine)(DMFO)；視黃酸衍生物，如TargretinTM(蓓薩羅丁)、PanretinTM(阿利維a酸)；ONTAKTM(地尼白介素-2(denileukindiftitox))；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他濱；以及上述任一種的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。該定義中還包括調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)癌癥的作用的抗激素劑，如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑類、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、可莫昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮和托瑞米芬(法樂通)；以及抗雄激素，如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及以上任一種的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物?？蓪⒍喾N其它治療劑與本文所述的組合物聯(lián)合使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，將包含表達(dá)CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞的組合物與抗炎劑一同施用?？寡讋┗蚩寡姿幇ǖ幌抻冢侯惞檀己吞瞧べ|(zhì)激素(包括倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氫化可的松、氫化可的松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、潑尼松龍、潑尼松、曲安西龍)；非甾類抗炎藥(NSAID)，包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、來氟米特、抗TNF藥物、環(huán)磷酰胺以及麥考酚酯。其它示例性NSAID選自布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox-2抑制劑(如(羅非昔布)和(塞來考昔))以及唾液酸化劑(sialylate)。示例性的鎮(zhèn)痛藥選自醋氨酚、羥考酮、曲馬朵(tramadol)或鹽酸丙氧吩(proporxyphenehydrochloride)。示例性的糖皮質(zhì)激素選自可的松、地塞米松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、潑尼松龍或者潑尼松。示例性的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑包括針對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物(例如，CD4、CD5等)的分子、細(xì)胞因子抑制劑如TNF拮抗劑(例如依那西普阿達(dá)木單抗和英夫利昔單抗)、趨化因子抑制劑和粘附分子抑制劑。生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑包括單克隆抗體以及重組形式的分子。示例性的DMARD包括咪唑硫嘌呤、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、來氟米特、柳氮磺吡啶、羥氯喹、Gold(口服(金諾芬)和肌肉內(nèi)施用)以及米諾環(huán)素。.適于與本文所考慮的CAR修飾的T細(xì)胞組合的治療性抗體的示例性實(shí)例包括但不限于：巴維昔單抗(bavituximab)、貝伐單抗(阿伐斯汀)、比伐單抗(bivatuzumab)、博納吐單抗(blinatumomab)、可那木單抗(conatumumab)、達(dá)雷木單抗(daratumumab)、度利戈妥單抗(duligotumab)、達(dá)西珠單抗(dacetuzumab)、達(dá)妥珠單抗(dalotuzumab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)(HuLuc63)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、英達(dá)妥昔單抗(indatuximab)、奧英妥珠單抗(inotuzumab)、lorvotuzumab、魯卡木單抗(lucatumumab)、米拉圖珠單抗(milatuzumab)、moxetumomab、奧卡土珠單抗(Ocaratuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、司妥昔單抗(siltuximab)、替妥木單抗(teprotumumab)以及烏妥昔單抗(ublituximab)。在某些實(shí)施方案中，將本文所述的組合物與細(xì)胞因子聯(lián)合施用。本文使用的“細(xì)胞因子”意為由一種細(xì)胞群釋放，作為細(xì)胞間的介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白的上位術(shù)語。此類細(xì)胞因子的實(shí)例為淋巴因子、單核因子和常規(guī)的多肽類激素。細(xì)胞因子包括：生長(zhǎng)激素，如人生長(zhǎng)激素、N-甲硫氨酰人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原(prorelaxin)；糖蛋白類激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體生成素(LH)；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepaticgrowthfactor)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；催乳素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和-β；繆勒管抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整合素；促血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子，如NGF-β；血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II；紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素，如干擾素-α、β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)；和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘤壞死因子如TNFα或TNF-β；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。本文使用的術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然來源或者來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白，以及天然序列的細(xì)胞因子的生物活性等同物。I.治療方法本文所考慮的遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞提供了改進(jìn)的用于治療B細(xì)胞相關(guān)病況的過繼性免疫療法的方法，所述B細(xì)胞相關(guān)病況包括但不限于免疫調(diào)節(jié)性病況和血液惡性腫瘤。在具體實(shí)施方案中，通過用本文所考慮的CAR遺傳修飾原代免疫效應(yīng)細(xì)胞，而使原代免疫效應(yīng)細(xì)胞的特異性重定向至B細(xì)胞。在多個(gè)實(shí)施方案中，將含有編碼CAR的特定多核苷酸的病毒載體用于遺傳修飾免疫效應(yīng)細(xì)胞，所述CAR包含能結(jié)合BCMA多肽的人源化的抗BCMA抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域、連接CAR的TM結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的短的寡肽或多肽接頭、一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及初級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種類型的細(xì)胞療法，其中對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)靶向表達(dá)BCMA的B細(xì)胞的CAR，并且將CART細(xì)胞輸入至有需要的接受者。輸入的細(xì)胞能夠殺傷接受者中引起疾病的B細(xì)胞。與抗體療法不同，CART細(xì)胞能夠在體內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生能夠?qū)е鲁掷m(xù)的癌癥治療的長(zhǎng)期持久性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的CART細(xì)胞經(jīng)受穩(wěn)健的體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)增，并且可以持續(xù)延長(zhǎng)的時(shí)間量。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的CART細(xì)胞發(fā)展為能夠再活化以抑制任何額外的腫瘤形成或生長(zhǎng)的特異性記憶T細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，將包含含有本文所考慮的CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞的組合物用于治療與異常的B細(xì)胞活性相關(guān)的病況?？梢允褂冒疚乃紤]的CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行治療、預(yù)防或改善的病況的示例性實(shí)例包括但不限于：全身性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、自身免疫性溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、抗磷脂綜合征、恰加斯氏病、格雷夫斯氏病、韋格納肉芽腫、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、斯耶格倫氏綜合征、尋常天皰瘡、硬皮病、多發(fā)性硬化、抗磷脂綜合征、ANCA相關(guān)性小血管炎、古德帕斯徹病、川崎病以及急進(jìn)性腎小球腎炎。修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞也可應(yīng)用于漿細(xì)胞病癥，如重鏈疾病、原發(fā)性或免疫細(xì)胞相關(guān)淀粉樣變性以及意義未明的單克隆丙種球蛋白血癥(MGUS)。本文使用的“B細(xì)胞惡性腫瘤”指如下文所討論的在B細(xì)胞(一類免疫系統(tǒng)細(xì)胞)中形成的癌癥類型。在具體實(shí)施方案中，將包含本文所考慮的CAR修飾的T細(xì)胞的組合物用于治療血液惡性腫瘤，包括但不限于B細(xì)胞惡性腫瘤，如例如多發(fā)性骨髓瘤(MM)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。多發(fā)性骨髓瘤是成熟漿細(xì)胞的B細(xì)胞惡性腫瘤，其形態(tài)學(xué)特征為這些類型的細(xì)胞的單克隆的致瘤性轉(zhuǎn)化。這些漿細(xì)胞在BM中增殖，并且可侵襲鄰近的骨，以及有時(shí)侵襲血液。多發(fā)性骨髓瘤的變體形式包括：明顯的多發(fā)性骨髓瘤、冒煙型多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞白血病、非分泌型骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨孤立性漿細(xì)胞瘤和髓外漿細(xì)胞瘤(參見，例如Braunwald等人(編輯),Harrison’sPrinciplesofInternalMedicine，第15版(McGraw-Hill2001))。非霍奇金淋巴瘤涵蓋一大組淋巴細(xì)胞(白細(xì)胞)的癌癥。非霍奇金淋巴瘤可以發(fā)生于任何年齡，并且通常具有淋巴結(jié)大于正常淋巴結(jié)、發(fā)熱和體重減輕的特點(diǎn)。存在多種不同類型的非霍奇金淋巴瘤。例如，非霍奇金淋巴瘤可以分為侵襲性的(快速生長(zhǎng)的)和惰性的(緩慢生長(zhǎng)的)。盡管非霍奇金淋巴瘤可以來源于B細(xì)胞和T細(xì)胞，但是本文使用的術(shù)語“非霍奇金淋巴瘤”與“B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤”可互換使用。B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括：伯基特淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(CLL/SLL)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性大細(xì)胞淋巴瘤、前體B淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤以及套細(xì)胞淋巴瘤。發(fā)生于骨髓或干細(xì)胞移植之后的淋巴瘤通常為B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤。慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)為引起未成熟的白細(xì)胞(稱為B淋巴細(xì)胞或B細(xì)胞)緩慢增加的惰性(緩慢生長(zhǎng)的)癌癥。癌細(xì)胞經(jīng)血液和骨髓擴(kuò)散，并且也可影響淋巴結(jié)和其它器官，如肝臟和脾臟。CLL最終引起骨髓衰竭。有時(shí)，在疾病晚期，該疾病被稱為小淋巴細(xì)胞淋巴瘤。在具體實(shí)施方案中，提供方法，其包括將治療有效量的本文所考慮的表達(dá)CAR的免疫效應(yīng)細(xì)胞或者包含該免疫效應(yīng)細(xì)胞的組合物，單獨(dú)或者與一種或多種治療劑組合施用于需要的患者。在某些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的細(xì)胞用于治療處于發(fā)展為與異常的B細(xì)胞活性相關(guān)的病況或B細(xì)胞惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)的患者。因此，本發(fā)明提供治療或預(yù)防與異常的B細(xì)胞活性相關(guān)的病況或B細(xì)胞惡性腫瘤的方法，其包括向需要的對(duì)象施用治療有效量的本文所考慮的CAR修飾的細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“個(gè)體”和“對(duì)象”通?？苫Q使用，并且指顯示出可用基因療法載體、基于細(xì)胞的治療以及本文別處公開的方法進(jìn)行治療的疾病、病癥或病況的癥狀的任何動(dòng)物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)象包括顯示出可用基因療法載體、基于細(xì)胞的治療以及本文別處公開的方法進(jìn)行治療的血液系統(tǒng)疾病、病癥或病況(例如，B細(xì)胞惡性腫瘤)的癥狀的任何動(dòng)物。合適的對(duì)象(例如，患者)包括實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物以及家養(yǎng)動(dòng)物或?qū)櫸?如貓或狗)。包括非人的靈長(zhǎng)類，并且優(yōu)選人患者。典型的對(duì)象包括患有B細(xì)胞惡性腫瘤、已確診患有B細(xì)胞惡性腫瘤或者處于患有B細(xì)胞惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的人患者。本文使用的術(shù)語“患者”指已確診患有可用基因療法載體、基于細(xì)胞的治療以及本文別處公開的方法進(jìn)行治療的具體疾病、病癥或病況的對(duì)象。本文使用的“治療(treatment)”或“治療(treating)”包括對(duì)疾病或病理病況的癥狀或病理的任何有益或期望的效果，并且甚至可以包括待治療的疾病或病況的一種或多種可測(cè)量的標(biāo)志物的最低降低。治療可以任選地包括疾病或病況的癥狀的減輕或改善，或者疾病或病況的進(jìn)展的延遲?！爸委煛辈灰欢ㄖ讣膊』虿r或者其相關(guān)癥狀的完全根除或治愈。本文使用的“預(yù)防(prevent)”和類似的詞(如“預(yù)防(prevented)”、“預(yù)防(preventing)”等)指用于預(yù)防、抑制或降低疾病或病況發(fā)生或復(fù)發(fā)的可能性的方法。其也指延遲疾病或病況的發(fā)作或復(fù)發(fā)或者延遲疾病或病況的癥狀的發(fā)生或復(fù)發(fā)。如本文所使用的，“預(yù)防”及類似的詞也包括在疾病或病況發(fā)作或復(fù)發(fā)之前，降低疾病或病況的強(qiáng)度、影響、癥狀和/或負(fù)擔(dān)?！霸鰪?qiáng)”或“促進(jìn)”或者“增加”或“擴(kuò)展”通常指，與由媒介物或?qū)φ辗肿?組合物引起的應(yīng)答相比，本文所考慮的組合物(例如編碼CAR的遺傳修飾的T細(xì)胞或載體)產(chǎn)生、引發(fā)或引起更強(qiáng)的生理性應(yīng)答(即下游效應(yīng))的能力。除了從本領(lǐng)域的理解和本文的描述顯而易見的之外，可測(cè)量的生理性應(yīng)答可以包括T細(xì)胞擴(kuò)增、活化、持續(xù)性的增加和/或殺傷癌細(xì)胞的能力的增加?！霸黾拥摹被颉疤岣叩摹绷客ǔ椤敖y(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的”量，并且可以包括由媒介物或?qū)φ战M合物產(chǎn)生的應(yīng)答的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或者更多倍(例如500倍、1000倍)(包括其間且超過1的所有整數(shù)和小數(shù)，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加?！敖档?decrease)”或“減低(lower)”或者“變少(lessen)”或“減少(reduce)”或者“減弱(abate)”通常指，與由媒介物或?qū)φ辗肿?組合物引起的應(yīng)答相比，本文所考慮的組合物產(chǎn)生、引發(fā)或引起較小的生理性應(yīng)答(即，下游效應(yīng))的能力。“降低”或“減少的”量通常為“統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的”量，并且可以包括由媒介物、對(duì)照組合物產(chǎn)生的應(yīng)答(參照應(yīng)答)或者特定細(xì)胞系中的應(yīng)答的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或者更多倍(例如500倍、1000倍)(包括其間且超過1的所有整數(shù)和小數(shù)，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的降低?！熬S持(maintain)”或“保持(preserve)”或“維持(maintenance)”或“無變化(nochange)”或“無實(shí)質(zhì)變化(nosubstantialchange)”或“無實(shí)質(zhì)減少(nosubstantialdecrease)”通常指，與由媒介物、對(duì)照分子/組合物引起的應(yīng)答或者與特定細(xì)胞系中的應(yīng)答相比，本文所考慮的組合物在細(xì)胞中產(chǎn)生、引發(fā)或者引起較小的生理性應(yīng)答(即，下游效應(yīng))的能力。相當(dāng)?shù)膽?yīng)答是與參照應(yīng)答沒有顯著不同或者可測(cè)量的不同的應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療需要的對(duì)象中的B細(xì)胞相關(guān)病況的方法包括，施用有效量(例如治療有效量)的包含本文所考慮的遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的組合物。施用的量和頻率將由諸如患者的情況以及患者疾病的類型和嚴(yán)重性等因素決定，盡管適當(dāng)?shù)膭┝靠捎膳R床試驗(yàn)確定。在某些實(shí)施方案中，下述是可取的：向?qū)ο笫┯没罨拿庖咝?yīng)細(xì)胞，隨后再次抽血(或者實(shí)施血漿分離置換法)，根據(jù)本發(fā)明活化由此得到的免疫效應(yīng)細(xì)胞，并且對(duì)患者再輸入這些活化并擴(kuò)增的免疫效應(yīng)細(xì)胞。可以每隔幾周多次實(shí)施該過程。在某些實(shí)施方案中，可以使來自10cc至400cc血液抽取物的免疫效應(yīng)細(xì)胞活化。在某些實(shí)施方案中，使來自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc或者400cc或者更多血液抽取物的免疫效應(yīng)細(xì)胞活化。未受理論束縛，可將該多次抽血/多次再輸入方案用于選出某些免疫效應(yīng)細(xì)胞群?？梢砸匀魏畏奖愕姆绞竭M(jìn)行本文所考慮的組合物的施用，包括通過氣霧劑吸入、注射、攝取、輸注、植入或者移植。在優(yōu)選實(shí)施方案中，腸胃外施用組合物。本文使用的短語“腸胃外施用(parenteraladministration)”和“腸胃外施用(administeredparenterally)”指不同于腸內(nèi)和局部施用的施用模式，通常通過注射施用，并且包括但不限于：血管內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、瘤內(nèi)、心臟內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)和胸骨內(nèi)注射以及輸入。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過直接注射至腫瘤、淋巴結(jié)或者感染部位將本文所考慮的組合物施用于對(duì)象。在一個(gè)實(shí)施方案中，向需要的對(duì)象施用有效量的組合物，以增加對(duì)象針對(duì)B細(xì)胞相關(guān)病況的細(xì)胞免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以包括由能夠殺傷感染的細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及輔助性T細(xì)胞的應(yīng)答。也可誘導(dǎo)主要由能夠活化B細(xì)胞從而導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生的輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答?？蓪⒍喾N技術(shù)用于分析由本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的類型，其在本領(lǐng)域被充分描述，例如，由JohnE.Coligan,AdaM.Kruisbeek,DavidH.Margulies,EthanM.Shevach,WarrenStrober(2001)JohnWiley&Sons,NY,N.Y編著的CurrentProtocolsinImmunology。在T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷的情況下，CAR配體的結(jié)合起始CAR至T細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致多條T細(xì)胞信號(hào)通路的活化，這誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生或者釋放能夠通過多種機(jī)制誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的蛋白。這些T細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)制包括(但不限于)胞內(nèi)細(xì)胞毒性顆粒由T細(xì)胞至靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、T細(xì)胞分泌能夠直接(或者經(jīng)其它殺傷效應(yīng)細(xì)胞的募集間接)誘導(dǎo)靶細(xì)胞殺傷的促炎性細(xì)胞因子以及T細(xì)胞表面上的死亡受體配體(例如FasL)的上調(diào)，所述死亡受體配體在與靶細(xì)胞上的其同源死亡受體(例如Fas)結(jié)合之后誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療確診患有B細(xì)胞相關(guān)病況的對(duì)象的方法，其包括從被診斷患有表達(dá)BCMA的B細(xì)胞相關(guān)病況的對(duì)象中移出免疫效應(yīng)細(xì)胞，用包含編碼本文所考慮的CAR的核酸的載體對(duì)所述免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，從而產(chǎn)生修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞群，以及將修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞群施用于同一對(duì)象。在優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫效應(yīng)細(xì)胞包含T細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)對(duì)象中的靶細(xì)胞群的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的方法，其包括向?qū)ο笫┯帽磉_(dá)核酸構(gòu)建體的免疫效應(yīng)細(xì)胞群的步驟，所述核酸構(gòu)建體編碼CAR分子。施用本文所述的細(xì)胞組合物的方法包括有效導(dǎo)致再引入離體遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞或者再引入遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞祖細(xì)胞的任何方法，所述離體遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞在對(duì)象中直接表達(dá)本發(fā)明的CAR，所述遺傳修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞祖細(xì)胞在被引入對(duì)象時(shí)分化為表達(dá)CAR的成熟的免疫效應(yīng)細(xì)胞。一種方法包括用根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體離體轉(zhuǎn)導(dǎo)外周血T細(xì)胞，并使轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞返回至對(duì)象。將本說明書中引用的所有出版物、專利申請(qǐng)和授權(quán)專利通過引用并入本文，如同明確且單獨(dú)地指示將各單獨(dú)的出版物、專利申請(qǐng)或者授權(quán)專利通過引用并入。盡管出于清楚理解的目的，通過示例和實(shí)例的方式一定程度上詳細(xì)地描述了上述發(fā)明，但是根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，可對(duì)本發(fā)明作出某些改變和修改，而不脫離所附的權(quán)利要求書的精神或范圍，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。僅通過示例性的方式而不是通過限制性的方式提供下述實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地識(shí)別可被改變或修改以得到基本相類似的結(jié)果的多個(gè)非關(guān)鍵參數(shù)實(shí)施例實(shí)施例1抗BCMACAR的構(gòu)建將含有人源化的抗BCMAscFv抗體的CAR設(shè)計(jì)為含有：與抗BCMAscFv可操作地連接的MND啟動(dòng)子、來自CD8α的鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域以及CD137共刺激結(jié)構(gòu)域，之后是CD3ζ鏈的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。圖1?？笲CMACAR包含用于在免疫效應(yīng)細(xì)胞表面表達(dá)的CD8α信號(hào)肽(SP)序列?？笲CMACAR的多核苷酸序列在SEQIDNO：30至44、70和72中示出；抗BCMACAR的多肽序列在SEQIDNO：15至29、71和73中示出；以及載體圖譜在圖1中顯示。表3至5顯示了多種示例性抗BCMACAR慢病毒載體的多個(gè)核苷酸區(qū)段的身份、Genbank參考、來源名稱以及引用。表3表4表5實(shí)施例2人源化的抗BCMACAR的高通量篩選開發(fā)了微培養(yǎng)分析以快速篩選抗BCMACAR。微培養(yǎng)分析可以對(duì)15-20種CAR修飾的T細(xì)胞(CART細(xì)胞)進(jìn)行比較。將外周血單核細(xì)胞(PBMC)在24孔板的含有IL-2(CellGenix)以及CD3和CD28特異性的抗體(MiltenyiBiotec)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以起始T細(xì)胞的生長(zhǎng)。在培養(yǎng)7天之后，擴(kuò)增的T細(xì)胞>99％是CD3陽性的T細(xì)胞。通過慢病毒對(duì)擴(kuò)增自PBMC的T細(xì)胞進(jìn)行修飾以表達(dá)抗BCMACAR。在培養(yǎng)起始之后1天，以1:1的比例(體積：體積)向PBMC培養(yǎng)物中添加瞬時(shí)慢病毒上清液。在利用倒置光學(xué)顯微鏡的情況下變?yōu)楣鈱W(xué)匯合之后，用包含IL-2的新鮮培養(yǎng)基按需要將培養(yǎng)物分開。培養(yǎng)12天之后，收獲CART細(xì)胞，并對(duì)CAR表達(dá)和功能進(jìn)行評(píng)估。通過流式細(xì)胞術(shù)，利用與CAR的單鏈可變片段部分反應(yīng)的抗體(山羊抗小鼠Ig(GAM),LifeTechnologies)來分析T細(xì)胞表面上CAR的表達(dá)。三名單獨(dú)的正常供體中的15種CAR各自的平均表達(dá)顯示于表6中。CAR的表達(dá)是相當(dāng)?shù)?，范圍?7％至63％CAR陽性T細(xì)胞。對(duì)多種CAR構(gòu)建體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(在表6中表示為VCN)進(jìn)行測(cè)試。通過PCR，使用擴(kuò)增整合的病毒的引物來分析VCN。表6實(shí)施例3CART細(xì)胞的抗原特異反應(yīng)性在與BCMA陽性細(xì)胞系共培養(yǎng)之后，對(duì)抗原特異反應(yīng)性進(jìn)行檢驗(yàn)。將抗BCMACART細(xì)胞與BCMA改造的K562(K562-BCMA)細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)。通過ELISA，由IFN-γ至上清液的釋放來分析抗BCMACART細(xì)胞與K562-BCMA的反應(yīng)性。測(cè)試的所有人源化的抗BCMACART細(xì)胞均釋放相似量的IFNγ，并且該量與親本小鼠抗BCMACAR相當(dāng)。圖2。相比之下，在含有未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞或者CD19特異性CART細(xì)胞的培養(yǎng)物中未檢測(cè)到IFNγ，這證實(shí)CART細(xì)胞的BCMA特異性是與K562-BCMA細(xì)胞的反應(yīng)性所需的。在另一組實(shí)驗(yàn)中，對(duì)表達(dá)五種人源化的抗BCMACAR之一的T細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞溶解活性進(jìn)行檢驗(yàn)。將抗BCMACART細(xì)胞與K562-BCMA細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)。五種人源化的抗BCMACART細(xì)胞在三種T細(xì)胞：腫瘤比例中，顯示出類似的針對(duì)K562-BCMA的細(xì)胞溶解活性。圖3。出人意料地，測(cè)試的所有人源化的抗BCMACART細(xì)胞均顯示出強(qiáng)于親本小鼠抗BCMACART細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。實(shí)施例4人源化的抗BCMACART細(xì)胞的表型和功能在可直接擴(kuò)展至大的臨床制備工藝的培養(yǎng)系統(tǒng)中，對(duì)三種人源化的抗BCMA構(gòu)建體(抗BCMA-10、抗BCMA-11、抗BCMA-31)的表型和功能進(jìn)行評(píng)估。簡(jiǎn)言之，在靜態(tài)瓶的含有IL-2(CellGenix)以及CD3和CD28特異性抗體(MiltenyiBiotec)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在培養(yǎng)起始之后1天，添加2x108個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的編碼抗BCMACAR的慢病毒。通過添加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基使抗BCMACART細(xì)胞維持在對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)總共持續(xù)10天。從三名正常供體(800290、800309、801269)擴(kuò)增轉(zhuǎn)導(dǎo)有小鼠抗BCMACAR(BCMA-02)、三種人源化的抗BCMACAR或者缺乏信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的抗CD19CAR(CAR19Δ)的T細(xì)胞。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，對(duì)CART細(xì)胞的CAR表達(dá)以及抗原和腫瘤細(xì)胞反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)估。通過流式細(xì)胞術(shù)，使用與CAR的單鏈可變片段部分反應(yīng)的抗體(山羊抗小鼠Ig(GAM),LifeTechnologies)來分析T細(xì)胞表面上抗BCMACAR的表達(dá)。圖4。對(duì)于小鼠(msBCMA-02)或者人源化序列(抗BCMA-10、抗BCMA-11、抗BCMA-31)均觀察到相當(dāng)?shù)腃AR表達(dá)。在所有三名供體之間，未觀察到小鼠或人源化的抗BCMACAR表達(dá)的顯著性差異(表7)。表7抗BCMACART細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率無顯著性差異。通過PCR使用擴(kuò)增整合的病毒的引物分析的載體拷貝數(shù)(VCN)在所有抗BCMACART細(xì)胞中是相當(dāng)?shù)?表8)。表8.對(duì)抗BCMACART細(xì)胞與BCMA陽性細(xì)胞系和腫瘤的反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)估。在抗BCMACART細(xì)胞與K562-BCMA(表達(dá)少量或者大量的BCMA)細(xì)胞或多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系(RPMI-8226、NCI-H929)共培養(yǎng)之后觀察到相當(dāng)?shù)腎FNγ釋放，但是與BCMA陰性細(xì)胞系(HDLM-2、K562)共培養(yǎng)之后未觀察到相當(dāng)?shù)腎FNγ釋放。圖5。對(duì)表達(dá)抗BCMACAR的T細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性進(jìn)行檢驗(yàn)。將抗BCMACART細(xì)胞與K562-BCMA細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)。測(cè)試的所有抗BCMACART細(xì)胞均引起相當(dāng)?shù)腒562-BCMA細(xì)胞的細(xì)胞毒性。圖6。實(shí)施例5人源化的抗BCMACART細(xì)胞中強(qiáng)化的細(xì)胞因子釋放在具體實(shí)施方案中，抗BCMACAR分子可在不存在刺激的情況下釋放細(xì)胞因子。在缺乏其抗原存在的情況下，在體外培養(yǎng)之后，可以觀察到抗原非依賴性的(“強(qiáng)化的”)細(xì)胞因子釋放。觀察到來自經(jīng)改造以表達(dá)人源化的抗BCMA-10CAR的T細(xì)胞的強(qiáng)化的細(xì)胞因子釋放。人源化的抗BCMA10來源于小鼠抗BCMA-02，以降低由對(duì)小鼠序列的免疫反應(yīng)引起的潛在免疫原性?？笲CMA-02與抗BCMA-10CAR分子之間總共存在少于20％的序列差異。盡管存在這些變化，但是在小鼠抗BCMA-02與人源化的抗BCMA-10之間未觀察到CAR表達(dá)或者對(duì)BCMA抗原的反應(yīng)性的差異(圖5和表7)。在BCMA不存在的情況下，人源化的抗BCMA-10CART細(xì)胞仍釋放顯著更多的炎性細(xì)胞因子。圖7。在含有人血清但缺乏任何BCMA的培養(yǎng)基中將小鼠抗BCMA-02或者人源化的抗BCMA-10CART細(xì)胞培養(yǎng)過夜。使用多元珠方法(multiplexbeadapproach)(Luminex分析)測(cè)定釋放至上清液中的12種細(xì)胞因子的水平。5x104個(gè)人源化的抗BCMA-10CART細(xì)胞釋放高至5ng/ml的炎性細(xì)胞因子，包括MIP1α、MIP1β、IFNγ、GMCSF、IL-8和TNFα。相同量的小鼠抗BCMA-02CART細(xì)胞釋放少于200pg/ml。這兩種CAR修飾均影響抗炎性細(xì)胞因子(包括IL-10和IL-4)的釋放。在用抗CD19CART細(xì)胞進(jìn)行治療的患者中，強(qiáng)化的細(xì)胞因子釋放引起由過度細(xì)胞因子釋放導(dǎo)致的已知毒性的問題。即使在不存在BCMA抗原的情況下，從人源化的抗BCMA-10CART細(xì)胞觀察到的高度抗原非依賴性的、強(qiáng)化的細(xì)胞因子釋放仍可以引起患者中毒性水平的細(xì)胞因子。為產(chǎn)生人源化的抗BCMA-10而對(duì)小鼠抗BCMA-02進(jìn)行的序列改變可以引入在小鼠抗BCMA-02T細(xì)胞中未見的對(duì)人血清中的蛋白的新生的反應(yīng)性。對(duì)人血清蛋白的反應(yīng)性可以解釋人源化的抗BCMA-10中觀察到的“強(qiáng)化的”細(xì)胞因子釋放。使小鼠抗BCMA-02和人源化的抗BCMA-10CART細(xì)胞在含有胎牛血清而不是人血清的培養(yǎng)基中靜置48小時(shí)。將CART細(xì)胞換至含有人血清的培養(yǎng)基中，并且將釋放的IFNγ的量與胎牛血清中維持的培養(yǎng)物相比較。培養(yǎng)基不影響CART細(xì)胞的IFN-γ釋放。在小鼠抗BCMA-02CART細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束時(shí)未檢測(cè)到IFNγ，而人源化的抗BCMA10培養(yǎng)物含有約4ng/mlIFNγ，不管培養(yǎng)基為何(圖8)。小鼠抗BCMA-02CART細(xì)胞中反應(yīng)性的缺乏不是由于T細(xì)胞功能障礙。兩種抗BCMACART細(xì)胞均與板固定化的BCMA反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例6調(diào)整人源化的抗BCMACART細(xì)胞中的細(xì)胞因子釋放含有小鼠序列的CAR具有引起非期望的免疫應(yīng)答的潛能。CAR臨床試驗(yàn)中的軼事證據(jù)提示，這些免疫應(yīng)答可以限制一些患者中CART細(xì)胞的效力。小鼠序列的人源化是降低對(duì)小鼠序列的免疫應(yīng)答的策略。然而人源化的抗BCMA-10CAR引入強(qiáng)化的炎性釋放。使用CD8α跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)⒖笲CMA-10CART細(xì)胞的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域連接至T細(xì)胞表面。對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)域的身份及其對(duì)CAR分子二聚化的影響以及隨后在抗原不存在的情況下的活化進(jìn)行檢驗(yàn)。構(gòu)建抗BCMA-10CAR分子，以用CTLA-4(抗BCMA-10.2)或者PD-1(抗BCMA-10.5)跨膜結(jié)構(gòu)域替換CD8α跨膜結(jié)構(gòu)域(圖9)。通過將與IgG1Fc-PE綴合的重組人BCMA蛋白染色以及使用流式細(xì)胞術(shù)分析，將抗BCMA-10.2和抗BCMA-10.5的表達(dá)與抗BCMA-10的表達(dá)進(jìn)行比較。表9顯示了來自兩種代表性的正常供體T細(xì)胞的結(jié)果，其中觀察到所有三種CAR分子的穩(wěn)健的表面表達(dá)。表9構(gòu)建體供體1供體2抗BCMA-1090.487.7抗BCMA-10.286.286.7抗BCMA-10.576.278.0對(duì)抗BCMACART細(xì)胞與BCMA陽性的K562細(xì)胞系的反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)估。在抗BCMA-10、抗BCMA-10.2或抗BCMA-10.5與K562-BCMA細(xì)胞共培養(yǎng)之后，觀察到相當(dāng)?shù)腎FNγ釋放(圖10)。這些數(shù)據(jù)顯示，將跨膜結(jié)構(gòu)域變?yōu)閬碜訡TLA-4或PD-1的序列不影響抗BCMA-10CART細(xì)胞的反應(yīng)性。通過測(cè)量與小鼠抗BCMA-02或者人源化的抗BCMA-10、抗BCMA-10.2或抗BCMA-10.5的過夜培養(yǎng)物的上清液中的IFNγ來評(píng)估強(qiáng)化的細(xì)胞因子釋放。如之前所觀察到的，抗BCMA-02培養(yǎng)物含有少量的IFNγ。來自抗BCMA-10培養(yǎng)物的上清液含有較高量的IFNγ?？笲CMA-10.2和抗BCMA-10.5培養(yǎng)物含有與抗BCMA-02相當(dāng)?shù)?，并且低于抗BCMA-10CART細(xì)胞水平的IFNγ水平(圖11)。這些數(shù)據(jù)提示，改變跨膜結(jié)構(gòu)域可以在不影響CART細(xì)胞的抗原反應(yīng)性的情況下降低強(qiáng)化的細(xì)胞因子的釋放。一般而言，在下述權(quán)利要求中，所使用的術(shù)語不應(yīng)當(dāng)被解釋為將權(quán)利要求限制于說明書和權(quán)利要求中所公開的具體實(shí)施方案，而應(yīng)當(dāng)被解釋為包括所有可能的實(shí)施方案以及此類權(quán)利要求被賦予的等同物的全部范圍。因此，權(quán)利要求不受本公開的限制。序列表<110>藍(lán)鳥生物公司理查德·摩根凱文·弗里德曼<120>BCMA嵌合抗原受體<130>BLBD-037/03WO<150>US62/028,664<151>2014-07-24<150>US62/044,103<151>2014-08-29<150>US62/152,575<151>2015-04-24<160>73<170>PatentInversion3.5<210>1<211>15<212>PRT<213>鼠<400>1ArgAlaSerGluSerValSerValIleGlyAlaHisLeuIleHis151015<210>2<211>7<212>PRT<213>鼠<400>2LeuAlaSerAsnLeuGluThr15<210>3<211>9<212>PRT<213>鼠<400>3LeuGlnSerArgIlePheProArgThr15<210>4<211>5<212>PRT<213>鼠<400>4AspTyrSerIleAsn15<210>5<211>17<212>PRT<213>鼠<400>5TrpIleAsnThrGluThrArgGluProAlaTyrAlaTyrAspPheArg151015Gly<210>6<211>8<212>PRT<213>鼠<400>6AspTyrSerTyrAlaMetAspTyr15<210>7<211>111<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化的抗BCMA抗體輕鏈<400>7AspIleValLeuThrGlnSerProAlaSerLeuAlaValSerLeuGly151015GluArgAlaThrIleAsnCysArgAlaSerGluSerValSerValIle202530GlyAlaHisLeuIleHisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnProPro354045LysLeuLeuIleTyrLeuAlaSerAsnLeuGluThrGlyValProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSer65707580SerLeuGlnAlaGluAspAlaAlaIleTyrTyrCysLeuGlnSerArg859095IlePheProArgThrPheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105110<210>8<211>111<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化的抗BCMA抗體輕鏈<400>8AspIleValLeuThrGlnSerProAlaSerLeuAlaValSerLeuGly151015GluArgAlaThrIleAsnCysArgAlaSerGluSerValSerValIle202530GlyAlaHisLeuIleHisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnProPro354045LysLeuLeuIleTyrLeuAlaSerAsnLeuGluThrGlyValProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSer65707580SerLeuGlnAlaGluAspAlaAlaIleTyrSerCysLeuGlnSerArg859095IlePheProArgThrPheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105110<210>9<211>111<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化的抗BCMA抗體輕鏈<400>9AspIleValLeuThrGlnSerProAlaSerLeuAlaMetSerLeuGly151015GluArgAlaThrIleSerCysArgAlaSerGluSerValSerValIle202530GlyAlaHisLeuIleHisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnProPro354045LysLeuLeuIleTyrLeuAlaSerAsnLeuGluThrGlyValProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSer65707580ArgValGlnAlaGluAspAlaAlaIleTyrSerCysLeuGlnSerArg859095IlePheProArgThrPheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105110<210>10<211>117<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化的抗BCMA抗體重鏈<400>10GlnValGlnLeuValGlnSerGlySerGluLeuLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspTyr202530SerIleAsnTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleAsnThrGluThrArgGluProAlaTyrAlaTyrAspPhe505560ArgGlyArgPheValPheSerLeuAspThrSerValSerThrAlaTyr65707580LeuGlnIleSerSerLeuLysAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAspTyrSerTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeu100105110ValThrValSerSer115<210>11<211>117<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化的抗BCMA抗體重鏈<400>11GlnValGlnLeuValGlnSerGlySerGluLeuLysLysProGlyGlu151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspTyr202530SerIleAsnTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyTrpIleAsnThrGluThrArgGluProAlaTyrAlaTyrAspPhe505560ArgGlyArgPheValPheSerLeuAspThrSerValSerThrAlaTyr65707580LeuGlnIleSerSerLeuLysAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLeuAspTyrSerTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeu100105110ValThrValSerSer115<210>12<211>117<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化的抗BCMA抗體重鏈<400>12GlnValGlnLeuValGlnSerGlySerGluLeuLysLysProGlyGlu151015SerValLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspTyr202530SerIleAsnTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet35404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