本發(fā)明涉及培養(yǎng)生產(chǎn)腈水合酶的微生物的方法、培養(yǎng)生產(chǎn)腈水合酶的微生物的組合物、以及含有糖類和有機(jī)酸的組合物用于培養(yǎng)生產(chǎn)腈水合酶的微生物的用途。在本發(fā)明的上下文中提供的并用于本發(fā)明的組合物特別適用于誘導(dǎo)相應(yīng)微生物的生長和腈水合酶的生產(chǎn)。

背景技術(shù)：

聚丙烯酰胺廣泛用作絮凝劑、用作造紙工業(yè)中的增稠劑、用作三次采油中的添加劑、以及許多其它領(lǐng)域。聚丙烯酰胺的原料通常是其單體丙烯酰胺。原則上，存在兩種不同的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)丙烯酰胺的方法：化學(xué)合成和生物合成，其中由于更溫和的反應(yīng)條件和固有的工藝安全性，生物合成方法呈日益上升趨勢(shì)。由于更溫和的反應(yīng)條件、不存在銅催化劑和腈的定量轉(zhuǎn)化，在生物合成中可以避免昂貴的下游加工步驟例如蒸餾或離子交換，因此導(dǎo)致更廉價(jià)的設(shè)備，顯著降低的設(shè)備藍(lán)圖。

兩種合成方法都使用丙烯腈作為起始物質(zhì)。雖然化學(xué)合成方法使用銅催化劑(例如us4048226，us3597481)，但是生物合成方法使用生物催化劑水合丙烯腈以獲得丙烯酰胺。一般地，這樣的生物催化劑是微生物，其能夠生產(chǎn)酶的腈水合酶(2014年9月30日的iubmb命名法：ec4.2.1.84；cas-no.2391-37-5；也稱為，例如nhase)。生產(chǎn)腈水合酶的微生物廣泛地分布在環(huán)境中，并且包括，例如，作為代表的玫瑰色紅球菌(rhodococcusrhodochrous)、食吡啶紅球菌(rhodococcuspyridinovorans)、紅城紅球菌(rhodococcuserythropolis)、馬紅球菌(rhodococcusequi)、赤紅球菌(rhodococcusruber)、渾濁紅球菌(rhodococcusopacus)、黑曲霉(aspergillusniger)、燕麥?zhǔn)乘峋?acidovoraxavenae)、速生食酸菌(acidovoraxfacilis)、根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)、放射形土壤桿菌(agrobacteriumradiobacter)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、蒼白芽孢桿菌(bacilluspallidus)、史密斯芽孢桿菌(bacillussmithii)、芽孢桿菌br449(bacillusspbr449)、bradyrhizobiumoligotrophicum、bradyrhizobiumdiazoefficiens、大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、新洋蔥伯克霍爾德氏菌(burkholderiacenocepacia)、唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(burkholderiagladioli)、產(chǎn)酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumonia)、棲異地克雷伯菌(klebsiellavariicola)、鷹嘴豆中間根瘤菌(mesorhizobiumciceri)、機(jī)會(huì)中間根瘤菌(mesorhizobiumopportunistum)、中間根瘤菌f28(mesorhizobiumspf28)、莫拉菌屬(moraxella)、pantoeaendophytica、成團(tuán)泛菌(pantoeaagglomerans)、綠針假單胞菌(pseudomonaschlororaphis)、惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)、根瘤菌屬(rhizobium)、沼澤紅假單胞菌(rhodopseudomonaspalustris)、液化沙雷氏菌(serratialiquefaciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(serratiamarcescens)、擬無枝酸菌屬(amycolatopsis)、節(jié)桿菌屬(arthrobacter)、短桿菌屬物種ch1(brevibacteriumspch1)、短桿菌屬物種ch2(brevibacteriumspch2)、短桿菌屬物種r312(brevibacteriumspr312)、蛾短桿菌(brevibacteriumimperiale)、corynebacteriumnitrilophilus、假白喉棒桿菌(corynebacteriumpseudodiphteriticum)、谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)、corynebacteriumhoffmanii、蛾微桿菌(microbacteriumimperiale)、恥垢微桿菌(microbacteriumsmegmatis)、藤黃微球菌(micrococcusluteus)、小球諾卡氏菌(nocardiagloberula)、玫瑰色諾卡氏菌(nocardiarhodochrous)、嗜熱假諾卡氏菌(pseudonocardiathermophila)、木霉屬(trichoderma)、疣孢漆斑菌(myrotheciumverrucaria)、出芽短梗霉(aureobasidiumpullulans)、candidafamata、季也蒙假絲酵母(candidaguilliermondii)、熱帶假絲酵母(candidatropicalis)、黃隱球酵母(cryptococcusflavus)、隱球酵母ufmg-y28(cryptococcusspufmg-y28)、漢遜德巴利酵母(debaryomyceshanseii)、白地霉(geotrichumcandidum)、地霉屬物種jr1(geotrichumspjr1)、有孢漢遜酵母屬(hanseniaspora)、耐熱克魯維酵母(kluyveromycesthermotolerans)、克魯弗畢赤酵母(pichiakluyveri)、紅酵母(rhodotorulaglutinis)、睪丸酮叢毛單胞菌(comomonastestosteroni)、pyrococcusabyssi、激烈熱火球古菌(pyrococcusfuriosus)和美未氏熱火球古菌(pyrococcushorikoshi)。(參見，例如，prasad，biotechnologyadvances(2010)，28(6)：725-741；fr2835531)。酶腈水合酶是鐵或鈷依賴性的(即其具有在其活性中心配位的鐵或鈷原子)，特別地其特征在于其催化丙烯腈轉(zhuǎn)化以通過水合丙烯腈獲得丙烯酰胺的能力(kobayashi，naturebiotechnology(1998)，16：733-736)。

微生物作為將丙烯腈轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺的生物催化劑的能力基本上取決于兩個(gè)參數(shù)：微生物的充分生長及其腈水合酶的生產(chǎn)速率。用于培養(yǎng)生產(chǎn)腈水合酶的微生物的已知發(fā)酵方法面臨幾個(gè)不同的困難，例如，適合生長的高濃度的碳或氮源可能抑制酶生產(chǎn)，所謂的“分解代謝物抑制”(leonova，appliedbiochembiotechnol(2000)，88：231-241)或金屬離子輔因子的抑制作用(ep-b11283256；pei，biotechnologyletters(2013)，35：1419-1424)。這些困難導(dǎo)致在給定時(shí)間段內(nèi)低的腈水合酶活性速率，這是由于低的酶生產(chǎn)速率(即微生物主要生長但仍顯示低的酶生產(chǎn)速率)，或由于低的微生物生長速率(即微生物顯示高生產(chǎn)速率，但仍然有太少的微生物)。

因此，需要一種培養(yǎng)生產(chǎn)腈水合酶的微生物的方法，其允許在短時(shí)間內(nèi)獲得高產(chǎn)率的腈水合酶活性。

這一技術(shù)問題已經(jīng)通過權(quán)利要求中限定的并且如下文所描述和示例的本發(fā)明所克服。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的要點(diǎn)在于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，根據(jù)腈水合酶活性水平，糖類和有機(jī)酸的組合增加生長和腈水合酶的生產(chǎn)速率。不受理論的束縛，據(jù)信通過有機(jī)酸可以改善糖進(jìn)入細(xì)胞中。

因此，本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)生產(chǎn)腈水合酶(nhase)的微生物的方法，其包括以下步驟：

(a)使所述微生物與包含糖(i)和有機(jī)酸(ii)的水性組合物接觸；

(b)在所述(a)的水性組合物中培養(yǎng)所述微生物。

本發(fā)明還涉及通過本文所述和提供的培養(yǎng)方法獲得的或可獲得的微生物。

本發(fā)明還涉及用于培養(yǎng)生產(chǎn)腈水合酶的微生物的組合物，所述組合物包含糖(i)和有機(jī)酸(ii)。

本發(fā)明還涉及包含糖(i)和有機(jī)酸(ii)的組合物用于培養(yǎng)生產(chǎn)腈水合酶的微生物的用途。

在下文中，當(dāng)進(jìn)一步限定和說明根據(jù)本發(fā)明所描述和提供的方法、組合物和組合物用途的各單個(gè)特征(如腈水合酶、微生物、組合物、糖、有機(jī)酸等)時(shí)，這些定義和說明應(yīng)適用于如本文所述和提供的所有本發(fā)明方法、本發(fā)明組合物和本發(fā)明組合物用途。

與本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)相一致，已經(jīng)證實(shí)，一些糖類，相較于其他糖類，看上起與有機(jī)酸組合可以更有效地增加腈水合酶活性(例如，允許微生物的高生長和高酶產(chǎn)量)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，由本發(fā)明上下文中提供和使用的組合物所包含的糖(i)是單糖。此外，在本發(fā)明的上下文中，糖(i)可以是其中碳原子數(shù)為至少5、優(yōu)選至少6的糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖(i)中的碳原子數(shù)是6。包含在本文提供的組合物中和用于本發(fā)明上下文中的糖的具體實(shí)例包括葡萄糖、果糖、核糖和甘露糖；優(yōu)選葡萄糖、果糖或甘露糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖(i)是葡萄糖。

包含在本文提供的用于本發(fā)明的組合物中的有機(jī)酸(ii)可以是，例如，包含不超過3個(gè)羧基、優(yōu)選不超過2個(gè)羧基、并且最優(yōu)選不超過1個(gè)羧基基團(tuán)的有機(jī)酸。根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這樣的有機(jī)酸對(duì)于增加腈水合酶活性特別有效，如在本文中和實(shí)施例中進(jìn)一步描述和例示的。有機(jī)酸(ii)通常不受尺寸限制，但可包含例如不超過6個(gè)碳原子、優(yōu)選不超過4個(gè)碳原子、最優(yōu)選不超過3個(gè)碳原子。本發(fā)明上下文中，有機(jī)酸的具體實(shí)例包括乳酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，有機(jī)酸(ii)選自乳酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸；優(yōu)選選自乳酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸；更優(yōu)選選自乳酸、酒石酸和蘋果酸；最優(yōu)選乳酸。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的和在本發(fā)明的上下文中使用的組合物中所含的糖(i)是葡萄糖，有機(jī)酸(ii)是乳酸。

在本文提供和描述的培養(yǎng)生產(chǎn)腈的微生物的方法中，可以首先根據(jù)步驟(a)使微生物與包含糖(i)(并且還不包含有機(jī)酸(ii))的組合物接觸，然后根據(jù)步驟(b)開始培養(yǎng)微生物，并直到這時(shí)才在微生物培養(yǎng)期間向組合物中加入有機(jī)酸(ii)。另外，反之亦然，在本文提供和描述的培養(yǎng)生產(chǎn)腈的微生物的方法中，可以首先根據(jù)步驟(a)使微生物與包含有機(jī)酸(ii)(并且還不包含糖(i))的組合物接觸，然后根據(jù)步驟(b)開始培養(yǎng)微生物，并直到這時(shí)才在微生物培養(yǎng)期間向組合物中加入糖(i)。換句話說，沒有必要，從培養(yǎng)一開始就在與微生物接觸的組合物中存在糖(i)和有機(jī)酸(ii)兩組分。相反，也可以在開始培養(yǎng)生產(chǎn)腈水合酶的微生物后，將組分(i)和(ii)中的一種或兩種添加到組合物中，只要最終微生物在包含兩種組分的組合物中培養(yǎng)以實(shí)現(xiàn)增加腈水合酶活性的期望效果即可。

本文提供的和在本發(fā)明的上下文中使用的組合物中所含的糖(i)和有機(jī)酸(ii)的比例通常不受限制。本文提供的和在本發(fā)明的上下文中使用的組合物中所含的糖(i)和有機(jī)酸(ii)之間的比例(本文通常以重量/重量比表示)可以為，例如1:9至9:1；2:8至8:2；2.5:7.5至7.5:2.5；3:7至7:3；3.5:6.5至6.5:3.5；4:6至6:4；4.5:5.5至5.5:4.5；或1:1。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物中糖(i)和有機(jī)酸(ii)之間的比例在2:8和9:1之間、優(yōu)選3:7和9:1之間、更優(yōu)選3:7和8:2之間、更優(yōu)選3:7和7.5:2.5之間、最優(yōu)選3:7和7:3之間或1:1和7:3之間。在本發(fā)明的上下文中，這些比例是指，加入到本文提供的和在本發(fā)明的上下文中使用的用于培養(yǎng)生產(chǎn)腈水合酶的微生物的組合物中的糖(i)和有機(jī)酸(ii)的相應(yīng)重量。例如，組合物中的比例可以在生產(chǎn)腈水合酶的微生物的培養(yǎng)期間變化，因?yàn)閮煞N組分可以獨(dú)立地被消耗或更快或更慢地轉(zhuǎn)化，或者因?yàn)榻M分中的一種或兩種在整個(gè)培養(yǎng)過程中以額外量添加。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的和在本發(fā)明的上下文中使用的組合物中所含的糖(i)是葡萄糖，有機(jī)酸(ii)是乳酸，并且組合物中糖(i)和有機(jī)酸(ii)之間的比例在3:7和7:3之間。

根據(jù)本發(fā)明描述和提供和使用的，包含糖(i)和有機(jī)酸(ii)的組合物還可以包含本領(lǐng)域已知的對(duì)培養(yǎng)微生物的組合物有用的其它組分。最優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中，所述組合物是水性組合物。其它組分可以包括例如氮源(例如銨或硝酸鹽，有機(jī)酸如谷氨酸，酵母提取物或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物)、磷源(例如磷酸鹽，其也可以提供緩沖能力)、硫源(例如硫酸鹽)、鈷和/或鐵源(作為nhase的輔因子)、用于表達(dá)腈水合酶的誘導(dǎo)劑例如尿素、其它營養(yǎng)源如鎂，鈣，鋅，錳，銅以及維生素。

本文所述的生產(chǎn)腈水合酶的微生物的培養(yǎng)，特別是在本文提供的方法的步驟(b)中，可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方式進(jìn)行。也就是說，本文提供的和在本文上下文中使用的組合物，除了本文所述的糖(i)和有機(jī)酸(ii)外，還應(yīng)包含允許培養(yǎng)的微生物生長和維持所必需的其它組分。此外，應(yīng)設(shè)定其它參數(shù)，例如溫度、ph、溶解氧濃度、壓力、通氣和攪動(dòng)，以允許在本發(fā)明中培養(yǎng)的微生物生長和維持。在本文上下文中，用于培養(yǎng)本文所述和例示的微生物的典型溫度可以在30℃和40℃之間、優(yōu)選在35℃和38℃之間、最優(yōu)選在36.5℃和37.5℃之間、特別是37℃。然而，也可以根據(jù)在本發(fā)明中培養(yǎng)的微生物，設(shè)定其它溫度。應(yīng)通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中提供緩沖液或通過反饋控制強(qiáng)酸和/或堿的加入，將ph保持在6和8之間、優(yōu)選在6.5和7.5之間。典型的溶解氧濃度值可以在飽和濃度的5％至75％之間、優(yōu)選20％至40％。

在本發(fā)明的上下文中，在根據(jù)本文描述和提供的培養(yǎng)方法培養(yǎng)生產(chǎn)腈水合酶的微生物之后，可以從培養(yǎng)組合物收集微生物并干燥或以其它方式積累。任選地，可以在干燥之前濃縮細(xì)胞懸浮液，例如，通過離心或交叉流過濾(以微量過濾或超濾模式)。在干燥之前，還可以用水或緩沖溶液洗滌細(xì)胞，以從發(fā)酵肉湯中除去殘留物質(zhì)。例如，在培養(yǎng)后，然后可以通過噴霧干燥、流化床干燥、噴霧造?；蚶鋬龈稍飦砀稍镂⑸?，優(yōu)選通過噴霧或冷凍干燥。例如，可以在溫和條件下(例如使用入口溫度為80至150℃、優(yōu)選90至120℃，和出口溫度為，例如35至65℃、優(yōu)選40至50℃)，噴霧干燥細(xì)胞，至殘留水含量為1至10％、優(yōu)選4至8％重量。

在本發(fā)明的上下文中，用包含糖(i)和有機(jī)酸(ii)的組合物培養(yǎng)的生產(chǎn)腈水合酶的微生物可以是能夠生產(chǎn)本文所述的酶腈水合酶的任何微生物。酶腈水合酶是鐵或鈷依賴性的(即其具有在其活性中心配位的鐵或鈷原子)，尤其是其特征在于其催化丙烯腈轉(zhuǎn)化以通過水合丙烯腈獲得丙烯酰胺的能力(kobayashi，naturebiotechnology(1998)，16：733-736)。在本發(fā)明的上下文中使用的這種微生物可以是能夠天然生產(chǎn)腈水合酶的微生物，即天然含有編碼腈水合酶的基因。這樣的微生物也可以是能夠天然生產(chǎn)腈水合酶并且進(jìn)一步被遺傳改造，例如以增加腈水合酶的生產(chǎn)或增加腈水合酶的穩(wěn)定性和/或輸出的微生物。這樣的微生物也可以是天然不能生產(chǎn)腈水合酶并且進(jìn)一步被遺傳改造以穩(wěn)定表達(dá)和生產(chǎn)腈水合酶的微生物。在該上下文中，能夠天然生產(chǎn)腈水合酶的微生物在本領(lǐng)域中是公知的，并且包括，例如，作為代表的玫瑰色紅球菌(rhodococcusrhodochrous)、食吡啶紅球菌(rhodococcuspyridinovorans)、紅城紅球菌(rhodococcuserythropolis)、馬紅球菌(rhodococcusequi)、赤紅球菌(rhodococcusruber)、渾濁紅球菌(rhodococcusopacus)、黑曲霉(aspergillusniger)、燕麥?zhǔn)乘峋?acidovoraxavenae)、速生食酸菌(acidovoraxfacilis)、根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)、放射形土壤桿菌(agrobacteriumradiobacter)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、蒼白芽孢桿菌(bacilluspallidus)、史密斯芽孢桿菌(bacillussmithii)、芽孢桿菌br449(bacillusspbr449)、bradyrhizobiumoligotrophicum、bradyrhizobiumdiazoefficiens、大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、新洋蔥伯克霍爾德氏菌(burkholderiacenocepacia)、唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(burkholderiagladioli)、產(chǎn)酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumonia)、棲異地克雷伯菌(klebsiellavariicola)、鷹嘴豆中間根瘤菌(mesorhizobiumciceri)、機(jī)會(huì)中間根瘤菌(mesorhizobiumopportunistum)、中間根瘤菌f28(mesorhizobiumspf28)、莫拉菌屬(moraxella)、pantoeaendophytica、成團(tuán)泛菌(pantoeaagglomerans)、綠針假單胞菌(pseudomonaschlororaphis)、惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)、根瘤菌屬(rhizobium)、沼澤紅假單胞菌(rhodopseudomonaspalustris)、液化沙雷氏菌(serratialiquefaciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(serratiamarcescens)、擬無枝酸菌屬(amycolatopsis)、節(jié)桿菌屬(arthrobacter)、短桿菌屬物種ch1(brevibacteriumspch1)、地芽孢桿菌rapc8(geobacillussprapc8)、短桿菌屬物種ch2(brevibacteriumspch2)、短桿菌屬物種r312(brevibacteriumspr312)、蛾短桿菌(brevibacteriumimperial)、corynebacteriumnitrilophilus、假白喉棒桿菌(corynebacteriumpseudodiphteriticum)、谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、corynebacteriumhoffmanii、蛾微桿菌(microbacteriumimperiale)、恥垢微桿菌(microbacteriumsmegmatis)、藤黃微球菌(micrococcusluteus)、小球諾卡氏菌(nocardiagloberula)、玫瑰色諾卡氏菌(nocardiarhodochrous)、嗜熱假諾卡氏菌(pseudonocardiathermophila)、木霉屬(trichoderma)、疣孢漆斑菌(myrotheciumverrucaria)、出芽短梗霉(aureobasidiumpullulans)、candidafamata、季也蒙假絲酵母(candidaguilliermondii)、熱帶假絲酵母(candidatropicalis)、黃隱球酵母(cryptococcusflavus)、隱球酵母ufmg-y28(cryptococcusspufmg-y28)、漢遜德巴利酵母(debaryomyceshanseii)、白地霉(geotrichumcandidum)、地霉屬物種jr1(geotrichumspjr1)、有孢漢遜酵母屬(hanseniaspora)、耐熱克魯維酵母(kluyveromycesthermotolerans)、克魯弗畢赤酵母(pichiakluyveri)、紅酵母(rhodotorulaglutinis)、睪丸酮叢毛單胞菌(comomonastestosteroni)、pyrococcusabyssi、激烈熱火球古菌(pyrococcusfuriosus)和美未氏熱火球古菌(pyrococcushorikoshi)。此外，天然不表達(dá)腈水合酶的微生物如埃希氏桿菌(如大腸桿菌)，一旦已經(jīng)被遺傳改造從而穩(wěn)定表達(dá)和生產(chǎn)腈水合物，也可以使用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)腈水合酶的微生物的代表是紅球菌屬(rhodococcus)，例如玫瑰色紅球菌或食吡啶紅球菌。在本上下文中，玫瑰色紅球菌種的代表實(shí)例可以包括在“ncimb41164、ferm-bp1478(j1)、m33或m8下保藏的菌株。此外，在本發(fā)明上下文中，生產(chǎn)腈水合酶的微生物可以是被遺傳改造的微生物，這些微生物天然不含有編碼腈水合酶的基因，但其已被處理，從而含有編碼腈水合酶的多核苷酸(例如，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、綴合或其他本領(lǐng)域已知的適于將多核苷酸轉(zhuǎn)移或插入細(xì)胞的方法，如sambrook和russell2001，molecularcloning：alaboratorymanual，cshpress，coldspringharbor，ny，usa)，從而使得微生物能夠生產(chǎn)腈水合酶。為此目的，可能還需要插入額外的多核苷酸，其可以是分別允許腈水合酶基因或mrna轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的多核苷酸。此類額外的多核苷酸例如可以包括啟動(dòng)子序列、polyt-或polyu-尾，或復(fù)制起點(diǎn)或其它質(zhì)粒-控制序列等。在本上下文中，這種天然地不含有編碼腈水合酶的基因但已被操作以例如含有編碼腈水合酶的多核苷酸的遺傳改造的微生物，可以是原核或真核微生物。這種原核微生物的實(shí)例包括，例如，代表的大腸桿菌種。真核微生物的實(shí)例包括，例如，酵母(例如，釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的和在本發(fā)明的上下文中使用的組合物中所含的糖(i)是葡萄糖，有機(jī)酸(ii)是乳酸，并且生產(chǎn)腈水合酶的微生物是玫瑰色紅球菌，例如，ncimb41164或ferm-bp1478。

在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，生產(chǎn)腈水合酶的微生物是玫瑰色紅球菌，并且組合物中糖(i)和有機(jī)酸(ii)之間的比率為3:7至7:3之間。

在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文提供的和在本發(fā)明的上下文中使用的組合物中所含的糖(i)是葡萄糖，有機(jī)酸(ii)是乳酸，生產(chǎn)腈水合酶的微生物是玫瑰色紅球菌，并且該組合物中糖(i)和有機(jī)酸(ii)的比率為3:7和7:3之間。

在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“腈水合酶”是指能夠催化丙烯腈水合成丙烯酰胺的酶腈水合酶(在本文中也稱為“nhase”)，即其具有腈水合酶活性。在本發(fā)明的上下文中，本發(fā)明意義上的腈水合酶的活性可如下測(cè)定：首先將100μl細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞裂解物、溶解的酶粉末或含有推定的腈水合酶的任何其它制劑，與875μl的50mm磷酸鉀緩沖液和25μl的丙烯腈在25℃下在eppendorf管搖床上以1,000rpm反應(yīng)10分鐘。在10分鐘的反應(yīng)時(shí)間后，抽取樣品并通過加入相同體積的1.4％鹽酸立即淬滅?；旌蠘悠泛螅ㄟ^在10,000rpm下離心1分鐘除去細(xì)胞，通過hplc分析澄清上清液，測(cè)定形成的丙烯酰胺的量。丙烯酰胺的濃度應(yīng)在0.25和1.25mmol/l之間——如果必要，樣品必須相應(yīng)稀釋，并且必須重復(fù)轉(zhuǎn)化。用hplc分析獲得的丙烯酰胺濃度，除以反應(yīng)時(shí)間(其為10分鐘)、并將該值與hplc樣品和原始樣品之間的稀釋因子相乘，從丙烯酰胺的濃度推導(dǎo)出酶活性?；钚?gt;10u/ml，優(yōu)選>100u/ml，更優(yōu)選>1,000u/ml，表示存在功能性表達(dá)的腈水合酶，并被認(rèn)為是腈水合酶活性，因此，是在本發(fā)明上下文中的腈水合酶。例如，本文所用的腈水合酶還包括根據(jù)iubmb命名法(截至2014年9月30日)分類為ec4.2.1.84或cas-no.2391-37-5的酶，以及例如能夠更快地將腈化合物(例如丙烯腈)轉(zhuǎn)化為酰胺化合物(例如丙烯酰胺)的修飾或增強(qiáng)的酶，或可以以更高的產(chǎn)率/時(shí)間比生產(chǎn)的酶，或者更穩(wěn)定的酶，只要它們能夠催化腈化合物(例如丙烯腈)轉(zhuǎn)化(即水合)成酰胺化合物(例如丙烯酰胺)。在本發(fā)明的上下文中，腈水合酶可以是由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與seqidno：1的核苷酸序列(玫瑰色紅球菌腈水合酶的α-亞基)和/或seqidno：3的核苷酸序列(玫瑰色紅球菌腈水合酶的β-亞基)至少70％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％、更優(yōu)選至少96％、更優(yōu)選至少97％、更優(yōu)選至少98％、更優(yōu)選至少99％、更優(yōu)選至少99.5％、最優(yōu)選100％相同的核苷酸序列，或由所述核苷酸序列組成，其中，

seqidno：1的核苷酸序列為：

gtgagcgagcacgtcaataagtacacggagtacgaggcacgtaccaaggcgatcgaaaccttgctgtacgagcgagggctcatcacgcccgccgcggtcgaccgagtcgtttcgtactacgagaacgagatcggcccgatgggcggtgccaaggtcgtggccaagtcctgggtggaccctgagtaccgcaagtggctcgaagaggacgcgacggccgcgatggcgtcattgggctatgccggtgagcaggcacaccaaatttcggcggtcttcaacgactcccaaacgcatcacgtggtggtgtgcactctgtgttcgtgctatccgtggccggtgcttggtctcccgcccgcctggtacaagagcatggagtaccggtcccgagtggtagcggaccctcgtggagtgctcaagcgcgatttcggtttcgacatccccgatgaggtggaggtcagggtttgggacagcagctccgaaatccgctacatcgtcatcccggaacggccggccggcaccgacggttggtccgaggaggagctgacgaagctggtgagccgggactcgatgatcggtgtcagtaatgcgctcacaccgcaggaagtgatcgtatga

其中seqidno：3的核苷酸序列為：

atggatggtatccacgacacaggcggcatgaccggatacggaccggtcccctatcagaaggacgagcccttcttccactacgagtgggagggtcggaccctgtcaattctgacttggatgcatctcaagggcatatcgtggtgggacaagtcgcggttcttccgggagtcgatggggaacgaaaactacgtcaacgagattcgcaactcgtactacacccactggctgagtgcggcagaacgtatcctcgtcgccgacaagatcatcaccgaagaagagcgaaagcaccgtgtgcaagagatccttgagggtcggtacacggacaggaagccgtcgcggaagttcgatccggcccagatcgagaaggcgatcgaacggcttcacgagccccactccctagcgcttccaggagcggagccgagtttctctctcggtgacaagatcaaagtgaagagtatgaacccgctgggacacacacggtgcccgaaatatgtgcggaacaagatcggggaaatcgtcgcctaccacggctgccagatctatcccgagagcagctccgccggcctcggcgacgatcctcgcccgctctacacggtcgcgttttccgcccaggaactgtggggcgacgacggaaacgggaaagacgtagtgtgcgtcgatctctgggaaccgtacctgatctctgcgtga

條件是，由所述多核苷酸編碼的多肽能夠催化丙烯腈水合成丙烯酰胺(即具有腈水合酶活性)，如本文所述和例舉的。同樣在本發(fā)明的上下文中，腈水合酶可以是包含與seqidno：2的氨基酸序列(玫瑰色紅球菌腈水合酶的α-亞基)和/或seqidno：4的氨基酸序列(玫瑰色紅球菌腈水合酶的β-亞基)至少70％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％、更優(yōu)選至少96％、更優(yōu)選至少97％、更優(yōu)選至少98％、更優(yōu)選至少99％、更優(yōu)選至少99.5％、最優(yōu)選100％相同的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列組成的多肽，

其中seqidno：2的氨基酸序列為：

vsehvnkyteyeartkaietllyerglitpaavdrvvsyyeneigpmggakvvakswvdpeyrkwleedataamaslgyageqahqisavfndsqthhvvvctlcscypwpvlglppawyksmeyrsrvvadprgvlkrdfgfdipdevevrvwdssseiryiviperpagtdgwseeeltklvsrdsmigvsnaltpqeviv

其中seqidno：4的氨基酸序列為：

mdgihdtggmtgygpvpyqkdepffhyewegrtlsiltwmhlkgiswwdksrffresmgnenyvneirnsyythwlsaaerilvadkiiteeerkhrvqeilegrytdrkpsrkfdpaqiekaierlhephslalpgaepsfslgdkikvksmnplghtrcpkyvrnkigeivayhgcqiypesssaglgddprplytvafsaqelwgddgngkdvvcvdlwepylisa

條件是所述多肽能夠催化丙烯腈水合成丙烯酰胺，如本文所述和例舉的。

兩個(gè)或更多個(gè)序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)之間的同一性水平可以通過本領(lǐng)域已知的方法例如通過blast分析容易地確定。通常，在本發(fā)明的上下文中，如果待(例如通過序列比較)進(jìn)行比較的兩個(gè)序列(例如，多核苷酸序列或氨基酸序列)在同一性上不同，則術(shù)語“同一性”可以指較短的序列和與所述較短序列匹配的較長序列的那部分。因此，當(dāng)比較的序列不具有相同的長度時(shí)，同一性程度優(yōu)選地可以指較短序列中與較長序列中的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比，或者指在較長序列中與較短序列中的核苷酸序列相同的核苷酸的百分比。在本上下文中，技術(shù)人員容易確定與較短序列匹配的較長序列的部分。此外，如本文所使用的，核酸序列或氨基酸序列的同一性水平可以指相應(yīng)序列的整個(gè)長度，并且優(yōu)選成對(duì)評(píng)估，其中每個(gè)空位計(jì)為一個(gè)錯(cuò)配。序列比較的這些定義(例如，“同一性”值的建立)適用于本文描述和公開的所有序列。

此外，如本文所使用的術(shù)語“同一性”是指，在相應(yīng)序列之間存在功能和/或結(jié)構(gòu)等同。與本文所述的特定核酸/氨基酸序列具有給定同一性水平的核酸/氨基酸序列可以表示這些序列的衍生物/變體，其優(yōu)選具有相同的生物學(xué)功能。它們可以是天然存在的變異，例如來自其他變種，物種等的序列，或可以是突變，并且所述突變可以是天然形成的或可以通過有意誘變產(chǎn)生。此外，變異可以是合成產(chǎn)生的序列。變體可以是天然存在的變體或合成產(chǎn)生的變體或通過重組dna技術(shù)產(chǎn)生的變體。與上述核酸序列的偏差可以通過例如缺失、取代、添加、插入和/或重組產(chǎn)生。術(shù)語“添加”是指在給定序列的末端添加至少一個(gè)核酸殘基/氨基酸，而“插入”是指在給定序列中插入至少一個(gè)核酸殘基/氨基酸。術(shù)語“缺失”是指刪除或去除給定序列中的至少一個(gè)核酸殘基或氨基酸殘基。術(shù)語“取代”是指替換給定序列中的至少一個(gè)核酸殘基/氨基酸殘基。同樣，這里使用的這些定義經(jīng)必要修改后適用于本文提供和描述的所有序列。

通常，如本文所用，術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”或“核酸分子”應(yīng)同義地解釋。通常，核酸分子尤其可以包含dna分子、rna分子、寡核苷酸硫代磷酸酯、取代的核糖寡核苷酸或pna分子。此外，術(shù)語“核酸分子”可以指本領(lǐng)域已知的dna或rna或其雜交物或其任何修飾(對(duì)于修飾的實(shí)例，參見例如us5525711、us4711955、us5792608或ep302175)。多核苷酸序列可以是單鏈或雙鏈、線性或環(huán)狀、天然或合成的、并且沒有任何大小限制。例如，多核苷酸序列可以是基因組dna、cdna、線粒體dna、mrna、反義rna、核酶rna或編碼此類rna的dna或嵌合體(chimeroplast)(gamper,nucleicacidsresearch,2000,28,4332-4339)。所述多核苷酸序列可以是載體、質(zhì)?；虿《綿na或rna的形式。本文還描述了與上述核酸分子互補(bǔ)的核酸分子和能夠與本文所述的核酸分子雜交的核酸分子。本文所述的核酸分子還可以是本發(fā)明上下文中的核酸分子的片段。特別地，這樣的片段是功能片段。這樣的功能片段的實(shí)例是可以用作引物的核酸分子。

一般來說，本發(fā)明涉及本文所述的所有實(shí)施例以及其所有排列和組合。本文描述的任何特定方面或?qū)嵤┓绞讲粦?yīng)被解釋為將本發(fā)明的范圍限制在這些方面或?qū)嵤┓桨浮?/p>

以下實(shí)施例舉例說明本發(fā)明。然而，本發(fā)明不應(yīng)被解釋為受以下實(shí)施例的限制。

實(shí)施例

實(shí)施例1

紅球菌的培養(yǎng)

在微發(fā)酵系統(tǒng)中，針對(duì)不同紅球菌菌株(玫瑰色紅球菌“ciba”(ncimb41164)和玫瑰色紅球菌“j1”(fermbp-1478))，評(píng)估了不同糖/有機(jī)酸比率。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有酵母提取物(biospringer)(1.25g/l)、kh2po4(10g/l)、k2hpo4(10g/l)、(nh4)2so4(1g/l)、mgso4*7h2o(0.375g/l)、cacl2*2h2o(25mg/l)、微量元素溶液(2.5g/l)(參見下文)、co(no3)2(31.2mg/l)、消泡劑p2000(basf)(62.5mg/l)、尿素(7g/l)和谷氨酸銨(2.5g/l)，在h2o中。

微量元素溶液：檸檬酸一水合物(40g/l)、znso4*7h2o(11g/l)、(nh4)2fe(so4)2*6h2o(8.5g/l)、mnso4*h2o(3g/l)和cuso4*5h2o(0.8g/l)，在h2o中。

然后向培養(yǎng)基中補(bǔ)充10g/l碳源(糖、有機(jī)酸或兩者的混合物，如下表所示)。使用h3po4或naoh將ph調(diào)節(jié)至6.6。將培養(yǎng)基直接從冷儲(chǔ)備物接種至od0.05(在600nm測(cè)量)。在biolector微發(fā)酵系統(tǒng)(m2plabs，baesweiler，germany)中使用具有1.5ml工作體積的48孔花板，在37℃下以1,100rpm進(jìn)行培養(yǎng)64小時(shí)。培養(yǎng)后，抽取樣品，用鹽酸淬滅，如實(shí)施例2所述測(cè)定腈水合酶活性。

在下表中，提供了不同菌株和糖/酸比率的相對(duì)腈水合酶活性。將糖作為唯一碳源獲得的腈水合酶活性設(shè)定為100％。

表1：玫瑰色紅球菌“ciba”

表2：玫瑰色紅球菌“j1“

實(shí)施例2

腈水合酶活性的測(cè)定

從實(shí)施例1的培養(yǎng)基中取樣，并用50mmol/lkh2po4緩沖液(ph7.0)1:10(v/v)稀釋。獲得的溶液用50mmol/lkh2po4緩沖液(ph7.0)進(jìn)一步稀釋1:20(v/v)，以達(dá)到培養(yǎng)基的最終稀釋因子1:200。

反應(yīng)：

將875μlkh2po4緩沖液(ph7.0)吸移到2mleppendorf管中。加入100μl稀釋的培養(yǎng)基，并將混合物在恒溫混合器中在25℃下以500rpm預(yù)孵育5分鐘。預(yù)孵育后，通過加入25μl丙烯腈開始反應(yīng)。反應(yīng)在25℃和1,000rpm下進(jìn)行10分鐘。

樣品制備：

在10分鐘的反應(yīng)時(shí)間后，通過將300μl反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到含有300μl的1.4％(m/v)鹽酸的1.5mleppendorf管中來淬滅反應(yīng)。將混合物短暫渦旋并在臺(tái)式離心機(jī)中以10,000rpm離心1分鐘以分離細(xì)胞。將100μl澄清的上清液與900μl水混合。然后通過hplc分析混合物。

hplc分析：

柱：aqua5μc18125a，250×4.60mm(phenomenex)

烘箱溫度：45℃

注射體積：1μl

檢測(cè)：uv210nm

流速：1.0ml/min

溶劑a：25mmol/lkh2po4ph2.5

溶劑b：乙腈

分離：10％b(等度)

保留時(shí)間：丙烯酰胺：分鐘，

hplc值應(yīng)在0.25和1.25mmol/l之間

通過hplc測(cè)定的丙烯酰胺的濃度應(yīng)該在0.25和1.25mmol/l之間。如果這沒有直接達(dá)到，則需要相應(yīng)地調(diào)節(jié)反應(yīng)中使用的細(xì)胞濃度。

腈水合酶活性的測(cè)定：

c：產(chǎn)物物質(zhì)的量[mm](hplc-值)

t：孵育時(shí)間[min]，在該測(cè)試中10分鐘

k：稀釋因子-從初始樣品到hplc樣品的總稀釋度

計(jì)算活性，以ku/l計(jì)

一個(gè)活性單位[u]定義為在1分鐘反應(yīng)時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)1μmol丙烯酰胺。