相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2014年9月29日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?2/056,852的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)利，這些都通過引用并入本文，如同完整闡述。與本申請(qǐng)一起以電子方式提交的標(biāo)題為“sequencelisting”的序列表創(chuàng)建于2015年9月29日，具有159,500字節(jié)大小，也通過引用并入本文，如同完整闡述。政府支持聲明本發(fā)明是在由高級(jí)能源研究計(jì)劃署arpa-e頒發(fā)的獎(jiǎng)勵(lì)號(hào)為de-ar0000042的政府支持下完成的。政府對(duì)本發(fā)明具有一定的權(quán)利。本文的公開內(nèi)容涉及具有優(yōu)化的編碼改變的葡聚糖水合二激酶(glucanwaterdikinase)的內(nèi)源核酸序列和具有升高的淀粉水平的基因改良植物。本發(fā)明還涉及優(yōu)化的編碼改變的葡聚糖水合二激酶的核酸序列，優(yōu)化內(nèi)源核酸的方法，提高植物中的淀粉水平的方法以及制備和繁殖基因改良植物的方法。
背景技術(shù)：
：在白天，植物在營(yíng)養(yǎng)組織中合成淀粉并在晚上降解淀粉來動(dòng)員產(chǎn)生的糖以支持植物的能量需求。在夜間，營(yíng)養(yǎng)型植物細(xì)胞表達(dá)一系列酶以啟動(dòng)中間淀粉的動(dòng)員。使淀粉磷酸化的葡聚糖水合二激酶(“gwd”)是這些酶之一。gwd的轉(zhuǎn)錄水平顯示出經(jīng)歷了晝夜波動(dòng)(smithetal.plantphys.preview,april29,2014)。增加生物質(zhì)的淀粉含量可以增加動(dòng)物飼料中的能量含量(卡路里)或提高從生物質(zhì)中提取葡萄糖以用于乙醇或其他生化制品的生產(chǎn)。存在不同的用于操縱植物特性的分子方法。幾乎所有的方法都依賴于通過轉(zhuǎn)化過程將新的、合成的或重組的核酸插入至植物中。因此，插入的核酸可以編碼核糖核酸(rna)或蛋白質(zhì)，它們可以被轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)從而改變植物表型。在許多情況下，核酸可以編碼異源蛋白或產(chǎn)生更多的內(nèi)源蛋白。類似地，轉(zhuǎn)化的核酸可以產(chǎn)生通過多種機(jī)制(例如，rna干擾、反義rna等)降低內(nèi)源基因的表達(dá)從而“沉默”基因并產(chǎn)生其產(chǎn)物的rna。在所有情況下，插入植物中的核酸以顯性方式表達(dá)，即，它的存在對(duì)植物的特性具有直接的影響。最近，已經(jīng)證明通過在生物體中表達(dá)編碼改變蛋白質(zhì)(例如核酸酶)的脫氧核糖核酸(dna)的核酸，生物體的基因組可以被永久地改變，即使在插入的核酸已經(jīng)被除去以及內(nèi)源基因優(yōu)化之后。以這種方式，可能不僅產(chǎn)生有益的顯性性狀，而且產(chǎn)生具有非常特異性的靶向突變作為產(chǎn)生有益的隱性性狀(recessivetrait)的基礎(chǔ)，而這本來是非常難以用于商業(yè)應(yīng)用的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展。目前，在行栽作物(rowcrops)的商業(yè)用途中尚沒有使用核酸酶產(chǎn)生的隱性性狀。使用核酸酶產(chǎn)生的隱性性狀先前已在植物和植物細(xì)胞中證明，但是在完全發(fā)育的多細(xì)胞玉米和高粱植物(包括雜交玉米和高粱)中未見。像顯性性狀(dominanttraits)一樣，隱性性狀可能具有商業(yè)價(jià)值，并且可能具有優(yōu)于顯性性狀的特定商業(yè)優(yōu)勢(shì)(特別是安全和監(jiān)管方面的益處)。這種隱性性狀將需要新的繁殖、跟蹤和傳遞性狀的方法，特別是在雜交作物中。顯性性狀特別是在雜交和交叉授粉作物如玉米中的一個(gè)問題是它們很容易地轉(zhuǎn)移到相同物種的其他品系。在世界上的一些地區(qū)中，農(nóng)民至少生產(chǎn)部分他們自己的用于種植的種子，這為將顯性性狀培育至農(nóng)民現(xiàn)有的品系中提供了機(jī)會(huì)，而無需向技術(shù)所有者付費(fèi)。已建立的性狀商業(yè)模式目前需要種子和性狀購買者向性狀提供者支付特許權(quán)使用費(fèi)，并且許可證通常將性狀的使用限于單一種植并且禁止育種。對(duì)于很多性狀，監(jiān)測(cè)無授權(quán)的育種幾乎是不可能的，并且在世界上的一些地方發(fā)生大量的性狀的未經(jīng)授權(quán)的性狀轉(zhuǎn)移(盜用，pirating)。根據(jù)性狀，盜用或?qū)⑿誀钷D(zhuǎn)移到可用品系中而不向技術(shù)所有者付費(fèi)是一項(xiàng)容易的工作，并且對(duì)于技術(shù)提供者來說難以檢測(cè)。例如，抗蟲性或農(nóng)藝性狀，它們的使用不需要任何其他材料，例如，除草劑抗性或特定肥料，如果它們已經(jīng)轉(zhuǎn)移到不同品系中，是幾乎不可能檢測(cè)的?？梢援a(chǎn)生后代，并且育種者可以使用商業(yè)上可以獲得的測(cè)試條對(duì)其進(jìn)行跟蹤，或者如果該性狀賦予了易獲得的表型，可以通過表型進(jìn)行跟蹤。因?yàn)樾誀钍秋@性的，所以對(duì)于農(nóng)民使用而言在子代中它可能不需要是純合的(homozygous)，從而能夠很容易繼續(xù)育種和在技術(shù)許可者不知曉的情況下使用。與顯性性狀相反，隱性性狀在作物中需要是純合的，以便進(jìn)行表型觀察或易于評(píng)分。簡(jiǎn)單的測(cè)試條可能不可用于跟蹤性狀的分子基礎(chǔ)，并且通過使用核酸酶產(chǎn)生的隱性性狀的精準(zhǔn)育種可能至少需要使用聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)進(jìn)行檢測(cè)。在這種情況下，攜帶該性狀的純合親本的異交(outcross)所產(chǎn)生的后代將不顯示該性狀，并且在擴(kuò)大育種、跟蹤和一些情況下，雜交組合(hybridcrosses)將被要求使用該性狀。這使得技術(shù)的盜用比使用顯性性狀顯得更昂貴和困難。制備、維持和提供隱性性狀的過程需要在顯性性狀的生產(chǎn)中所不必要的額外的步驟，因此，在種子和性狀的生產(chǎn)中需要使用新的方法?；诤刑囟ɑ蛲蛔兊膬?yōu)化基因的隱性性狀也可以具有超過使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備的顯性性狀的監(jiān)管優(yōu)勢(shì)。因?yàn)檫@樣的隱性性狀可能不包含任何新引入的異源dna，在世界的許多地區(qū)，它可能不會(huì)被作為轉(zhuǎn)基因作物而被監(jiān)管。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：一方面，本發(fā)明涉及一種基因工程植物(geneticallyengineeredplant)，該基因工程植物含有編碼改變的葡聚糖水合二激酶的工程核酸(engineerednucleicacid)，其中，與含有野生型葡聚糖水合二激酶的具有相同遺傳背景的植物相比，該植物具有升高的淀粉水平。一方面，本發(fā)明涉及一種基因工程改造植物的方法，以使其含有改變的葡聚糖水合二激酶。該方法包括將含有編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中的靶序列的至少一個(gè)植物細(xì)胞與含有編碼能夠誘導(dǎo)靶序列上的雙鏈斷裂的核酸酶的第一核酸的載體接觸。該方法還包括選擇在靶序列中具有改變的植物細(xì)胞。該方法還包括從植物細(xì)胞再生包含改變的基因工程植物。一方面，本發(fā)明涉及一種提高植物中淀粉水平的方法。該方法包括表達(dá)編碼能夠誘導(dǎo)靶序列上雙鏈斷裂的核酸酶的核酸，其中，所述靶序列是編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因的序列。該方法還包括選擇與含有野生型葡聚糖水合二激酶的具有相同遺傳背景的植物相比，在靶序列中具有改變并且具有升高的淀粉水平的純合植物。一方面，本發(fā)明涉及一種農(nóng)業(yè)加工的方法。該方法包括表達(dá)編碼能夠誘導(dǎo)靶序列上的雙鏈斷裂的核酸酶的核酸，其中，所述靶序列為編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中的序列。該方法可以包括選擇與含有野生型葡聚糖水合二激酶的具有相同遺傳背景的植物相比，在靶序列中具有改變并且具有升高的淀粉水平的純合植物。該方法還可以包括對(duì)所述純合植物進(jìn)行加工。一方面，本發(fā)明涉及一種制備動(dòng)物飼料的方法。該方法包括表達(dá)編碼能夠誘導(dǎo)靶序列上的雙鏈斷裂的核酸酶和核酸，其中，所述靶序列是編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因的序列。該方法可以包括與含有野生型葡聚糖水合二激酶的具有相同遺傳背景的植物相比，選擇在靶序列中具有改變并且具有升高的淀粉水平的純合植物。該方法還可以包括進(jìn)行選自由以下所組成的組中的至少一個(gè)步驟：收獲(harvesting)、排水(bailing)、粉碎(shredding)、干燥(drying)、青貯(ensiling)、造粒(pelletizing)、與可食用的纖維素源結(jié)合和與植物生物質(zhì)結(jié)合。一方面，本發(fā)明涉及一種制備對(duì)于工程核酸純合的基因工程植物的方法，該工程核酸編碼改變的葡聚糖水合二激酶，所述方法包括進(jìn)行任意一種本文所述的對(duì)含有改變的葡聚糖水合二激酶的植物進(jìn)行基因工程的方法。一方面，本發(fā)明涉及一種合成的核酸啟動(dòng)子(nucleicacidpromoter)，所述核酸啟動(dòng)子與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性(identity)的序列，所述參考序列選自由：seqidno：78(mzu3.8)、seqidno：79(zmu3)、seqidno：82(zmu3p1)、seqidno：84(zmu3p2)和seqidno：86(mzu3.8p)所組成的組中。一方面，本發(fā)明涉及一種含有編碼cas9核酸酶的第一工程核酸序列的基因構(gòu)建體。所述cas9核酸酶能夠切割包含在編碼植物中葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源核酸中的靶序列。一方面，本發(fā)明涉及一種鑒定樣品中編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因的修飾序列的試劑盒。所述試劑盒含有第一引物和第二引物。所述第一引物和所述第二引物能夠擴(kuò)增包含在編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中的靶序列。所述靶序列含有與選自seqidno：1-4、75、170-184、186、187、189-193的參考序列具有至少90％同一性的核酸序列。所述試劑盒還可以含有一種或多種組件用于檢測(cè)靶序列擴(kuò)增區(qū)域的修飾。所述修飾(modification)可以是編碼本文所述的任意基因工程植物中的葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因的修飾序列(modifiedsequence)。一方面，本發(fā)明涉及一種鑒定樣品中編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因的修飾序列的方法。該方法包括將樣品與第一引物和第二引物進(jìn)行接觸。該方法包括擴(kuò)增包含在編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中的靶序列。所述靶序列含有與選自seqidno：1-4、75、170-184、186、187、189-193的參考序列具有至少90％同一性的核酸序列。該方法還包括檢測(cè)靶序列的修飾。所述修飾可以是編碼本文所述的任意基因工程植物中的葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因的修飾序列。附圖說明結(jié)合附圖閱讀將會(huì)更好地理解以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的詳細(xì)描述。出于說明的目的，圖中顯示的是具體的實(shí)施方式。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明并不局限于顯示出的具體設(shè)置和方法。在附圖中：圖1顯示了用于表達(dá)大范圍核酸酶(meganuclease)的載體pag4715。圖2顯示了用于表達(dá)大范圍核酸酶的載體pag4716。圖3顯示了突變體的pcr檢測(cè)。圖4顯示了描述通過使用載體pag4715和pag4716產(chǎn)生的突變的純合子、雜合子和半合子玉米植物群之間的淀粉含量(mg淀粉/g干重)的圖表。品系195、20、19、18、9和6為對(duì)照植物。圖5顯示了gwd敲除的玉米突變體的綠色組織中的淀粉含量：柱1是野生型(wt)植物，柱2是m17，柱3是m18，柱4是m1，柱5是m20，柱6是m13/m12，柱7是m9，柱8是m7/m11，柱9是m4/m14，柱10是m11/m12，柱11是m15，柱12是m14，柱13是m11，柱14是m11/m10，柱15是m13。圖6顯示了gwd敲除的(gwdko)大范圍核酸酶穗軸(cobs)中的淀粉染色。圖7顯示了用于表達(dá)zmcas9的載體pag4800。圖8顯示了用于表達(dá)sgrna支架(scaffold)和zmcas9的載體pag4804。圖9顯示了pag4804玉米事件(maizeevents)中的淀粉積累。圖10顯示了pag4806玉米事件中的淀粉積累。圖11顯示了源自玉米事件4716_164的靶向突變m20的自交和異交的示意圖。圖12顯示了來自自交t04716_164m20植株的t1子代的基因分型。圖13顯示了來自異交t04716_164m20植株的t1子代的基因分型。圖14顯示了來自異交4716_164m20植株的t1子代的基因分型。具體實(shí)施方式以下描述中使用的特定術(shù)語僅為了方便而并非限制。本文使用的“工程核酸序列”、“工程多核苷酸”、“工程寡核苷酸”、“工程dna”或“工程rna”是指與自然界中的任意一種均不同的核酸、多核苷酸(polynucleotide)、寡核苷酸(oligonucleotide)、dna或rna，其具有與自然界中任意一種所不同的序列或者自然界中尚未發(fā)現(xiàn)的化學(xué)修飾。所述“工程核酸序列”、“工程多核苷酸”、“工程寡核苷酸”、“工程dna”或“工程rna”可以是合成的核酸序列、合成的多核苷酸、合成的寡核苷酸、合成的dna或合成的rna。工程核酸的定義包括但不限于使用生物技術(shù)工具產(chǎn)生的dna序列。這些工具包括但不限于重組dna技術(shù)、化學(xué)合成或核酸酶的定向使用(所謂的“基因組編輯”或“基因優(yōu)化”技術(shù))。本文所用的“內(nèi)源核酸”是指天然存在于生物體或基因組中的核酸、多核苷酸、寡核苷酸、dna或rna。內(nèi)源核酸可以是內(nèi)源基因。本文所用的“改變的蛋白質(zhì)”是指與天然存在的生物體，例如親本生物體中所含的氨基酸序列相比含有至少一個(gè)氨基酸發(fā)生變化或缺失的蛋白質(zhì)、多肽、寡肽或肽。改變的蛋白質(zhì)可以保留或缺乏原始序列的生物活性。本文所用的“可操作地連接(operablylinked)”是指兩種或多種生物分子以相對(duì)于彼此的方式結(jié)合，以使所述生物分子能夠進(jìn)行正常功能。對(duì)于兩個(gè)或多個(gè)核酸序列，“可操作地連接”是指所述核酸序列以相對(duì)于彼此的方式結(jié)合，以使所述序列能夠進(jìn)行正常功能。例如，對(duì)于多肽，如果表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白(preprotein)，編碼前序列或分泌型前導(dǎo)體的核苷酸(nucleotide)序列與用于多肽的核苷酸序列可操作地連接；如果其影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列與編碼序列可操作地連接；如果其被定位以促進(jìn)核糖體與核酸結(jié)合，核酸核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列可操作地連接。本文所用的遺傳背景定義為植物中所有基因或特定基因(例如，除基因工程修飾之外的所有基因)集合的總和。相同物種的植物可以被稱為具有相同基因或相同遺傳背景的植物?；蚬こ讨参锟梢园ū疚乃龅墓こ毯怂峄蚨嗪塑账幔橇硗膺€具有與相同遺傳背景的非基因工程植物相同的基因。用于權(quán)利要求和說明書相應(yīng)部分的詞“一種”(a)和“一個(gè)”(one)，除特別聲明外，定義為包括一個(gè)或多個(gè)引用項(xiàng)。該術(shù)語包括以上特別提到的詞、其派生詞和類似含義的詞。短語“至少一種”之后列出的兩項(xiàng)或多項(xiàng)，如“a、b或c”，意思為a、b或c中的任意單獨(dú)的一個(gè)以及它們?nèi)我獾慕M合。一種實(shí)施方式包括基因工程植物，該基因工程植物含有編碼改變的葡聚糖水合二激酶的工程核酸。與具有相同遺傳背景但含有野生型(wt)gwd的植物相比，基因工程植物具有升高的淀粉水平。與包含在具有相同遺傳背景的植物中的野生型(wt)gwd相比，改變的gwd的活性可以被降低?；趙tgwd的水平，降低的水平可以是20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％?？梢酝ㄟ^監(jiān)測(cè)植物中的淀粉含量，例如，通過使用本文實(shí)施例3中所述的傅里葉變換近紅外(ft-nir)技術(shù)來檢測(cè)gwd的活性。改變的gwd可能是無活性的。增加的淀粉水平表明gwd的活性降低。在一種實(shí)施方式中，基因工程植物中的工程核酸可以含有內(nèi)源核酸，所述內(nèi)源核酸包括編碼gwd蛋白但與野生型植物相比具有一種或多種修飾的gwd基因的至少一個(gè)等位基因。所述修飾可以通過對(duì)植物或其原種(ancestors)進(jìn)行基因工程改造實(shí)現(xiàn)。所述內(nèi)源核酸可以是工程植物中g(shù)wd基因的一個(gè)或多個(gè)等位基因。所述修飾可以位于gwd的編碼序列中。所述內(nèi)源核酸可以含有以下序列、基本上由以下序列組成或由以下序列組成：與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列，所述參考序列選自seqidno：1(zmgwd編碼序列)或seqidno：2(sbgwd編碼序列)。所述工程核酸可以包括相對(duì)于內(nèi)源核酸的至少一個(gè)突變。與內(nèi)源核酸相比，所述突變可以包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入。與天然核酸相比，突變可以包括核苷酸的缺失。與內(nèi)源核酸相比，突變可以包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代。突變可以是幾個(gè)突變的組合。所述至少一個(gè)突變可以在靶序列內(nèi)與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性，所述參考序列選自seqidno：1(zmgwd編碼序列)、seqidno：2(sbgwd編碼序列)、seqidno：3(zmgwd外顯子24+內(nèi)含子)、seqidno:4(sbgwd外顯子24+內(nèi)含子)、seqidno：91(gwde1a)、seqidno：92(gwde24b)、seqidno：93(gwde24c)、seqidno：94(gwde25a)、seqidno：182(zmgwd外顯子24)、seqidno：183(sbgwd外顯子24)、seqidno：184(sbgwd外顯子7)和seqidno：189(zmgwd外顯子25)。在一種實(shí)施方式中，基因工程植物中的工程核酸可以是內(nèi)源核酸，所述內(nèi)源核酸包括編碼gwd蛋白但具有通過對(duì)植物或其原種進(jìn)行基因工程改造制備得到的具有一個(gè)或多個(gè)修飾的gwd基因的至少一個(gè)等位基因。內(nèi)源基因可以是工程植物中g(shù)wd基因的一個(gè)或多個(gè)等位基因。修飾可以位于gwd的編碼序列中。內(nèi)源核酸可以含有以下序列、基本上由以下序列組成或由以下序列組成：與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列，所述參考序列選自seqidno：1(zmgwd編碼序列)或seqidno：2(sbgwd編碼序列)。工程核酸可以包括相對(duì)于內(nèi)源核酸的至少一個(gè)突變。與內(nèi)源核酸相比，突變可以包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入。與天然核酸相比，突變可以包括核苷酸的缺失。與內(nèi)源核酸相比，突變可以包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代。突變可以是幾個(gè)突變的組合。所述至少一個(gè)突變可以在與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的靶序列內(nèi)，所述參考序列選自seqidno：1(zmgwd編碼序列)、seqidno：2(sbgwd編碼序列)、seqidno：3(zmgwd外顯子24+內(nèi)含子)、seqidno：4(sbgwd外顯子24+內(nèi)含子)、seqidno：91(gwde1a)、seqidno：92(gwde24b)、seqidno：93(gwde24c)、和seqidno：94(gwde25a)、seqidno：182(zmgwd外顯子4)、seqidno：183(sbgwd外顯子24)、seqidno：184(sbgwd外顯子7)和seqidno：189(zmgwd外顯子25)。在一種實(shí)施方式中，基因工程植物中的工程核酸含有玉米gwd基因的外顯子24經(jīng)過修飾的序列。工程核酸可以含有以下序列、基本上由以下序列組成或由以下序列組成：與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的多核苷酸，所述參考序列選自seqidno：12-40、114-118、119-120和131–146，其包含玉米gwd基因中的突變。在一種實(shí)施方式中，基因工程植物中的工程核酸可以含有在野生型zmgwd基因(seqidno：1)的區(qū)域內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)修飾的修飾序列，所述修飾序列位于3030核苷酸(nt，堿基)至3243nt。在一種實(shí)施方式中，基因工程植物中的工程核酸可以含有在野生型zmgwd基因(seqidno：1)的從3157nt至3213nt的位置內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)修飾的修飾序列。在一種實(shí)施方式中，基因工程植物中的工程核酸可以含有在野生型zmgwd基因外顯子24(seqidno：3)的從81nt至160nt的位置內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)修飾的修飾序列。在一種實(shí)施方式中，基因工程植物中的zmgwd基因可以含有相對(duì)于野生型zmgwd基因(seqidno：1)具有序列變化的修飾序列，其選自seqidno：12-40、114-118、119-120和131-146中的一個(gè)。具有位于變化位置之外的變化的zmgwd序列可以與seqidno：1的相應(yīng)區(qū)域具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性。所述變化可以與seqidno：12-40、114-118、119-120和131-146中的一個(gè)相同或不同。在一種實(shí)施方式中，基因工程植物中的工程核酸可以含有高粱gwd基因的外顯子24的經(jīng)修飾的序列。工程核酸可以含有以下序列、基本上由以下序列組成或由以下序列組成：與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列，所述參考序列選自seqidno：106(sb4715_1((wt+ins)_外顯子24)和seqidno：107(sb4715_2(wt+del)_外顯子24)，這些是在高粱gwd基因的外顯子24上的突變體。在一種實(shí)施方式中，基因工程植物的工程核酸可以含有在野生型sbgwd基因(seqidno：2)的3030nt至3243nt位置內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)修飾的修飾序列?；蚬こ讨参锏墓こ毯怂峥梢院性谝吧蛃bgwd基因(seqidno：2)的736nt至969nt位置內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)修飾的修飾序列。改變的gwd可以由本文中任意一種工程核酸編碼。在一種實(shí)施方式中，基因工程植物可以含有改變的玉米(zeamays)gwd(zmgwd)。改變的zmgwd可以含有以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性，所述參考序列選自seqidno:45-73(zmgwd突變蛋白m1-m29)、121-125(zmgwd突變蛋白m32-m36)、126-127(zmgwd突變蛋白m38-m39)和147-162(zmgwd突變蛋白m40-m55)。在一種實(shí)施方式中，基因工程植物中的改變的zmgwd蛋白可以含有在野生型zmgwd蛋白(seqidno：43)的1040氨基酸(aa)至1120aa的位置內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)修飾的修飾序列。基因工程植物中的改變的zmgwd蛋白可以含有在野生型zmgwd蛋白(seqidno：43)的1054aa至1081aa的位置內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)修飾的修飾序列?；蚬こ讨参镏械母淖兊膠mgwd蛋白可以含有在野生型zmgwd蛋白(seqidno：43)的1011aa至1057aa的位置內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)修飾的修飾序列。基因工程植物中的改變的zmgwd蛋白可以含有在野生型zmgwd蛋白(seqidno：43)的1082aa至1116aa的位置內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)修飾的修飾序列。在一種實(shí)施方式中，基因工程植物中的zmgwd蛋白可以含有相對(duì)于野生型zmgwd蛋白(seqidno：43)具有序列變化的的修飾序列，其選自seqidno：45-73(zmgwd突變蛋白m1-m29)、121-125(zmgwd突變蛋白m32-m36)、126-127(zmgwd突變蛋白m38-m39)和147-162(zmgwd突變蛋白m40-m55)中的一個(gè)。具有位于變化位置之外的變化的zmgwd序列可以與seqidno：43的相應(yīng)區(qū)域具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性。所述變化可以與seqidno：45-73(zmgwd突變蛋白m1-m29)、121-125(zmgwd突變蛋白m32-m36)、126-127(zmgwd突變蛋白m38-m39)和147-162(zmgwd突變蛋白m40-m55)中的一個(gè)相同或不同。在一種實(shí)施方式中，基因工程植物可以含有改變的高粱(sorghumbicolor)gwd(sbgwd)。改變的sbgwd可以包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列組成或由以下氨基酸序列組成：與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性，所述參考序列選自seqidno：194(sbgwd突變蛋白sb4715_1wt+ins)和seqidno：195(sbgwd突變蛋白sb4715_2wt+del)。本文的核酸、核苷酸序列、蛋白或氨基酸序列可以被分離、純化、化學(xué)合成或通過重組dna技術(shù)產(chǎn)生。所有這些方法是本領(lǐng)域公知的。在一種實(shí)施方式中，基因工程植物可以是任何類型的植物?；蚬こ讨参锟梢允堑幌抻趩巫尤~植物(monocotyledonousplant)、雙子葉植物(dicotyledonousplant)、c4植物、c3植物、玉米(corn)、大豆(soybean)、水稻(rice)、甘蔗(sugarcane)、甜菜(sugarbeet)、高粱(sorghum)、柳枝稷(switchgrass)、芒草(miscanthus)、桉樹(eucalyptus)、小麥、苜蓿(alfalfa)、柳樹(willow)或楊樹(poplar)?；蚬こ讨参锟梢詠碜阅茉醋魑?energycropplant)、飼料作物(foragecropplant)或食物作物(foodcropplant)。所述能源作物植物可以是玉米植物、柳枝稷植物、高粱植物、楊樹植物或芒草植物。所述飼料作物植物可以是玉米植物、苜蓿植物、高粱植物或大豆植物。所述食物作物植物可以是玉米植物、小麥植物、大豆植物、水稻植物或番茄植物。基因工程植物可以是轉(zhuǎn)基因植物或突變植物?；蚬こ讨参锟梢允寝D(zhuǎn)基因植物或突變植物的子代(progeny)，或轉(zhuǎn)基因植物或突變植物的后代(descendant)?；蚬こ讨参锟梢允窃诰幋agwd的基因的核酸序列中具有一個(gè)或多個(gè)突變的常規(guī)突變體，其導(dǎo)致gwd的表達(dá)受抑制或gwd的活性降低。所述突變可以是gwd編碼基因序列中核酸的缺失、插入或取代。與具有相同遺傳背景但表達(dá)野生型gwd的非突變植物相比，常規(guī)突變體可以具有改變的營(yíng)養(yǎng)性淀粉水平。如本文所用，基因工程植物可以指完整的轉(zhuǎn)基因植物或突變植物或其部分。該部分可以是但不限于葉、莖、花、芽、花瓣、子房、果實(shí)或種子中的一種或多種。該部分可以是來自轉(zhuǎn)基因植物或突變植物的愈傷組織(callus)?；蚬こ讨参锟梢詮霓D(zhuǎn)基因植物或突變植物的部分或者從植株再生?；蚬こ讨参锟梢允堑谝晦D(zhuǎn)基因植物和第二轉(zhuǎn)基因植物或非轉(zhuǎn)基因植物的有性雜交的產(chǎn)物，其中，產(chǎn)物植物保留了被引入至第一轉(zhuǎn)基因植物的工程核酸?；蚬こ讨参锟梢允堑谝煌蛔冎参锖偷诙峭蛔冎参锏挠行噪s交的產(chǎn)物，其中，產(chǎn)物植物保留了被引入第一突變植物的突變。轉(zhuǎn)基因植物或突變植物可以是本文所述的轉(zhuǎn)基因植物或突變植物中的任意一種。在一種實(shí)施方式中，提供了含有改變的葡聚糖水合二激酶的植物的基因工程方法。所述方法可以包括將至少一種含有編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中的靶序列的植物細(xì)胞與載體接觸。所述載體可以含有編碼能夠誘導(dǎo)靶序列上的單鏈斷裂或雙鏈斷裂的核酸酶的第一核酸。載體可以通過轉(zhuǎn)化或以其他基因工程的方式被引入植物。轉(zhuǎn)化可以為使用含有編碼核酸酶的第一核酸的載體的農(nóng)桿菌(agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。如前所述，核酸酶可以切割靶序列(puchtaetal.,1993；wrightetal.,2005；wehrkamp-richteretal.,2009；congetal.,2013；belhajetal.,2013，全部通過引用并入本文，如同完整闡述)。核酸酶可以是但不限于大范圍核酸酶、cas9核酸酶、鋅指核酸酶(zincfingernuclease)或轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease)。如本文所述，所述核酸酶可以是大范圍核酸酶。大范圍核酸酶可以引入單鏈或雙鏈dna斷裂并且具有長(zhǎng)度為14至40個(gè)核苷酸的識(shí)別位點(diǎn)，提供良好的特異性。對(duì)于大范圍核酸酶用于靶向修飾的用途，參見rosenetal.,2006；wehrkamp-richteretal.,2009；djukanovicetal.,2013，全部通過引用并入本文，如同完整闡述。大范圍核酸酶可以是laglidadg歸巢核酸內(nèi)切酶(lhe)。laglidadg歸巢核酸內(nèi)切酶(lhes)是天然的基因靶向蛋白，其編碼序列存在于內(nèi)含子或內(nèi)含肽(intein)中。參見arnouldetal.,2011，全部通過引用并入本文，如同完整闡述。大范圍核酸酶可以是i-crei歸巢核酸內(nèi)切酶。如本文所用，i-crei歸巢核酸內(nèi)切酶是天然存在于萊茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)的葉綠體中的大范圍核酸酶，并且是含有對(duì)于核酸酶酶活性很重要的單一序列基序(motif)的被充分表征的蛋白質(zhì)。參見heathetal.,1997，全部通過引用并入本文，如同完整闡述。i-crei核酸內(nèi)切酶適用于蛋白質(zhì)工程，并且被用于包括植物在內(nèi)的若干物種中的靶向基因組修飾。參見rosenetal.,2006；arnouldetal.,2007；djukanovicetal.,2013，全部通過引用并入本文，如同完整闡述。大范圍核酸酶可以是i-dmoi、i-scei、e-dmei或dmocre?？梢允褂闷渌蠓秶怂崦?。大范圍核酸酶可以由與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列編碼，所述參考序列選自由seqidno：108(4715_大范圍核酸酶)和seqidno：109(4716_大范圍核酸酶)所組成的組。在一種實(shí)施方式中，所述核酸酶可以是cas9核酸酶。所述cas9核酸酶是在規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，crispr)/crispr相關(guān)蛋白9(cas9)系統(tǒng)中使用的核酸酶(congetal.,2013；belhajetal.,2013，兩者均通過引用并入本文，如同完整闡述)。crispr/cas9是基因組編輯技術(shù)，由于它的低成本、高效率和對(duì)技術(shù)人員來說相對(duì)簡(jiǎn)單，所以該技術(shù)有潛力成為各種物種基因組編輯的可選技術(shù)，但是其尚未被證明通過使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化可以在多細(xì)胞植物中起作用。crispr/cas9系統(tǒng)可以包括cas9核酸酶和單引導(dǎo)rna(singleguiderna,sgrna)。本文的cas9核酸酶可以由與seqidno：74(cas9核酸酶)或seqidno：75(zmcas9)的參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列編碼。所述核酸酶可以對(duì)能夠使核酸酶切割靶序列的序列具有親和力，或者可以通過使用sgrna將其引導(dǎo)至靶序列。本文的載體可以進(jìn)一步含有編碼sgrna的第二核酸序列。內(nèi)源基因的靶向修飾可以通過在植物細(xì)胞中表達(dá)cas9和sgrna來進(jìn)行。sgrna嵌合體分子可以含有非翻譯的crisprrna(crrna)，一個(gè)與具有3bp前間區(qū)序列鄰近基序(protospaceradjacentmotif，pam)序列的靶基因組dna序列互補(bǔ)的20bp間隔序列(jineketal.,2012，通過引入并入本文，如同完整闡述)。cas9核酸酶可以從植物例如擬南芥(arabidopsis)、玉米、煙草、水稻、小麥和高粱中的ppdk、camv35s、肌動(dòng)蛋白或泛素啟動(dòng)子表達(dá)。sgrna可以主要從rna聚合酶iii啟動(dòng)子u6或u3和從rna聚合酶ii啟動(dòng)子camve35s表達(dá)(belhajetal.,2013；upadhyayetal.,2014，二者通過引用并入本文，如同完整闡述)。sgrna可以從本文所述的seqidno：78(mzu3.8)、seqidno：79(zmu3)、zmu3p1(seqidno：82)、zmu3p2(seqidno：84)或zmu3.8啟動(dòng)子(seqidno：86)表達(dá)。所述啟動(dòng)子可以與seqidno：78(mzu3.8)、seqidno：79(zmu3)、zmu3p1(seqidno：82)、zmu3p2(seqidno：84)或zmu3.8啟動(dòng)子(seqidno：86)中的一種具有70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性。所述啟動(dòng)子可以具有等于seqidno：78(mzu3.8)、seqidno：79(zmu3)、zmu3p1(seqidno：82)、zmu3p2(seqidno：84)或zmu3.8啟動(dòng)子(seqidno：86)中的一種的核苷酸長(zhǎng)度的長(zhǎng)度。比seqidno：78(mzu3.8)、seqidno：79(zmu3)、zmu3p1(seqidno：82)、zmu3p2(seqidno：84)或zmu3.8啟動(dòng)子(seqidno：86)更短的啟動(dòng)子的同一性百分?jǐn)?shù)可以如上所述沿著較短啟動(dòng)子的長(zhǎng)度。cas9核酸酶可以將單鏈斷裂或雙鏈dna斷裂引入包含在基因組dna中的內(nèi)源核酸中。隨后，由cas9在基因組dna中引入的斷裂可以通過兩種不同的機(jī)制nhej(非同源末端連接)和hr(同源重組)(symingtonandgautier，2011，通過引用并入本文，如同完整闡述)進(jìn)行修復(fù)。在一種實(shí)施方式中，所述核酸酶可以是轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，talen)。本文所用的talen是指來自黃單胞菌屬(xanthomonas)的蛋白質(zhì)。talen是可程序化運(yùn)行的融合蛋白，其包含與foki核酸內(nèi)切酶的dna切割結(jié)構(gòu)域融合的tal效應(yīng)子的工程dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域(bochandbonas，2010；christianetal.,2010；joungandsander，2013；lietal.,所有這些文獻(xiàn)通過引用并入本文，如同完整闡述)。這些嵌合蛋白可以以成對(duì)的兩個(gè)單體起作用，以將foki核酸內(nèi)切酶靶向作用于基因組內(nèi)用于dna切割的特定dna序列?？梢孕揎梩aldna結(jié)合結(jié)構(gòu)域以識(shí)別不同的序列(cermaketal.,2011，其通過引用并入本文，如同完整闡述)。在一種實(shí)施方式中，所述核酸酶可以是鋅指核酸酶。(wrightetal.,2005；shuklaetal.,2009，二者通過引用并入本文，如同完整闡述)。在一種實(shí)施方式中，所述核酸酶可以是任何其他的適用于靶序列的靶向修飾的核酸酶。所述靶序列可以為靶基因。所述靶基因可以是植物天然的內(nèi)源基因。所述靶序列可以是植物的gwd基因。所述靶序列可以被包含在seqidno：1(zmgwd編碼序列)或seqidno：2(sbgwd編碼序列)內(nèi)。靶序列可以是包含在編碼gwd的內(nèi)源核酸的外顯子中的任何核酸序列。所述靶序列可以被包含在編碼玉米gwd的內(nèi)源核酸的外顯子中。所述靶序列可以包含在編碼高粱gwd的內(nèi)源核酸的外顯子中。靶序列可以包含在編碼gwd的內(nèi)源核酸的外顯子1、外顯子7、外顯子24或外顯子25中。所述靶序列可以是大范圍核酸酶的靶序列。所述靶序列可以含有以下序列、基本上由以下序列組成或由以下序列組成：與seqidno：41(大范圍核酸酶gwd-9/10x.272靶序列(pag4715))或seqidno：42(大范圍核酸酶gwd-7/8x靶序列(pag4716))具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列。所述靶序列可以是cas9核酸酶的靶序列。所述靶序列可以含有以下序列、基本上由以下序列組成或由以下序列組成：與seqidno：91(gwde1a)、seqidno：92(gwde24b)、seqidno：93(gwde24c)或seqidno：94(gwde25a)具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列。所述sgrna能夠結(jié)合靶序列，所述靶序列選自由seqidno：91(gwde1a)、seqidno：92(gwde24b)、seqidno：93(gwde24c)和seqidno：94(gwde25a)所組成的組。所述靶序列可以是與sgrna雜交的任何序列。所述核酸酶可以對(duì)能夠使核酸酶切割靶序列的序列具有親和力，或者可以通過使用sgrna將其引導(dǎo)至靶序列。一旦表達(dá)，核酸酶將在靶序列中引起單鏈或雙鏈dna斷裂。例如，核酸酶可以切斷短片段，然后可以通過細(xì)胞的dna修復(fù)機(jī)制進(jìn)行部分修復(fù)，但是在靶序列內(nèi)留下?lián)p傷。修復(fù)的靶序列可以包括改變。所述改變可以包括突變。所述突變可以是靶序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、缺失或取代中的至少一種。所述突變可以是無效突變(nullmutation)。如本文所用，術(shù)語“無效突變”是指基因中的突變，能夠?qū)е缕洳槐晦D(zhuǎn)錄成rna或翻譯成功能性蛋白質(zhì)。由于靶序列中的突變，天然核酸序列可以編碼改變的gwd。改變的gwd的活性可以被降低。降低的水平可以是野生型gwd活性水平的20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，其可以通過使用本文實(shí)施例3中所述的傅里葉變換近紅外(ft-nir)技術(shù)來監(jiān)測(cè)植物中的淀粉含量進(jìn)行檢測(cè)。改變的gwd可能是無活性的。與具有相同遺傳背景的非基因工程植物相比，基因工程植物具有升高的淀粉水平。所述方法可以包括選擇含有靶序列的改變的植物細(xì)胞。所述方法可以包括從植物細(xì)胞再生含有所述改變的植物。所述基因工程植物對(duì)于該改變可以是純合的。所述基因工程植物對(duì)于所述改變可以是雜合的。本文中的基因工程植物對(duì)于含有突變的基因可以是雜合的。所述基因可以包括編碼改變的gwd的工程核酸。雜合植物可以含有編碼野生型、未改變的gwd的內(nèi)源基因的等位基因。當(dāng)編碼gwd的基因的至少一個(gè)等位基因缺失時(shí)，所述雜合植物還可以包括半合子植物。雜合植物可以在表型上與野生型植物無法區(qū)分，并且可以不具有升高的淀粉水平。為了產(chǎn)生具有升高的淀粉水平的純合植物，雜合的基因工程植物可以進(jìn)行自交?？梢詮倪@樣的雜交獲得子代。所述子代可以包括純合子、雜合子和野生型植物。雜合植物可以在表型上與野生型植物無法區(qū)分。所述方法可以包括分析所述子代是否存在所述改變，并選擇含有所述改變的子代植物。在一種實(shí)施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括為了相同的改變將雜合的基因工程植物與另一個(gè)雜合的基因工程植物雜交。該方法可以包括選擇對(duì)于該改變是純合的第一子代植物。所述方法可以進(jìn)一步包括將基因工程植物與相同遺傳背景的野生型植物雜交?？梢詮倪@樣的雜交獲得子代。子代可以包括雜合植物和野生型植物。所述方法可以包括選擇對(duì)于所述改變是雜合的第一子代植物。所述方法可以進(jìn)一步包括使第一雜合子代植物自交和選擇對(duì)于該改變是純合的第二子代植物。本文的基因工程植物對(duì)于含有突變的基因來說可以是純合的或雜合的，并且可以含有編碼核酸酶的轉(zhuǎn)基因。所述編碼核酸酶的轉(zhuǎn)基因可以在上述雜交過程中分離。一種實(shí)施方式包括生產(chǎn)對(duì)于編碼蛋白質(zhì)的工程核酸是純合的基因工程植物的方法。工程核酸可以編碼隱性性狀。所述隱性性狀可以包括基因的切割的內(nèi)源靶序列。所述隱性性狀僅可以在不含有基因的未改變的野生型等位基因的植物中觀察到。該方法可以包括通過修飾內(nèi)源核酸的序列以制備工程核酸。該方法還可以包括將隱性性狀育種至其他作物品系中。該方法可以包括保持作物品系的性狀。該方法可以包括產(chǎn)生純合子代。該方法可以包括制備具有隱性性狀的雜種種子。一種實(shí)施方式包括通過本文所述的任意一種方法獲得的基因工程植物。一種實(shí)施方式包括提高植物中淀粉水平的方法。該方法可以包括在植物中表達(dá)編碼大范圍核酸酶的核酸。該方法可以包括在植物中表達(dá)編碼talen的核酸。該方法可以包括表達(dá)編碼cas9核酸酶的第一核酸和編碼靶向特定序列的所需引導(dǎo)rna的第二核酸。核酸在植物中的表達(dá)可以改變內(nèi)源dna序列的功能或編碼。核酸在植物中的表達(dá)可以改變植物中g(shù)wd的活性和淀粉代謝。所述植物可以是本文中的任意轉(zhuǎn)基因或突變植物。所述植物可以是轉(zhuǎn)基因植物或突變植物的子代。核酸可以包含在基因構(gòu)建體中。該方法可以包括制備本文中的任意基因工程植物。所述基因工程植物或其子代可以是通過本文的方法得到的淀粉水平升高的的植物。具有編碼大范圍核酸酶的核酸的基因構(gòu)建體可以在所述方法中的任意點(diǎn)被表達(dá)，所述大范圍核酸酶可以滅活或抑制參與植物中淀粉動(dòng)員的gwd蛋白的表達(dá)。所述核酸可以在處理植物的步驟之前表達(dá)。所述核酸可以在處理植物的步驟期間表達(dá)。所述表達(dá)可以被誘導(dǎo)。在表達(dá)核酸時(shí)，與具有相同遺傳背景但缺少一個(gè)或多個(gè)基因構(gòu)建體的非基因工程植物中的淀粉水平相比，所述基因工程植物可以具有改變的營(yíng)養(yǎng)性淀粉水平。本文的任意基因工程植物可以由農(nóng)業(yè)加工方法、制備動(dòng)物飼料的方法或飼喂動(dòng)物的方法提供。提供基因工程植物的步驟可以包括從生產(chǎn)它的另一方獲得。提供的步驟可以包括制備基因工程植物。所述基因工程植物可以是轉(zhuǎn)基因植物或突變植物。提供的步驟可以包括通過將植物與本文的任意一種基因構(gòu)建體接觸以進(jìn)行轉(zhuǎn)化。提供的步驟可以包括通過本文所述的任何方法或已知方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物。提供的步驟可以包括將植物與含有編碼核酸酶的多核酸的基因構(gòu)建體接觸之后，通過在植物中瞬時(shí)表達(dá)的核酸酶識(shí)別的切割位點(diǎn)切割編碼參與淀粉代謝的蛋白的基因以對(duì)植物進(jìn)行基因工程改造。提供的步驟還可以包括從具有改變的營(yíng)養(yǎng)性淀粉水平的基因工程植物的組織再生植物。提供的步驟可以包括獲得來自自花授粉或基因工程植物與非基因工程植物之間的異花授粉產(chǎn)生的基因工程植物的子代。提供的步驟可以包括獲得純合的子代。所述純合的子代可以是近交植物。所述純合的子代可以是雜交植物?；蚬こ讨参锟梢员挥糜诙喾N后續(xù)方法或用途。提供的步驟可以包括購得所述基因工程植物。提供的步驟可以包括使基因工程植物可用于進(jìn)一步加工步驟。提供步驟可以包括使基因工程植物可用于作為動(dòng)物飲食的部分。在農(nóng)業(yè)加工方法中，基因工程植物可以是具有升高的淀粉水平經(jīng)改造的原料和/或表達(dá)一種或多種多糖降解酶的原料。所述原料可以包括單獨(dú)的或與其他組分組合的任何基因工程植物。所述其他組分可以包括其他植物材料。農(nóng)業(yè)加工可以包括操作或轉(zhuǎn)換任何農(nóng)業(yè)原料，包括用于特定產(chǎn)品或用途的基因工程植物。農(nóng)業(yè)加工可以包括干燥基因工程植物。農(nóng)業(yè)加工可以包括發(fā)酵基因工程植物。農(nóng)業(yè)加工可以包括使用一種或多種外源酶水解基因工程植物以獲得生化產(chǎn)物。所述外源酶可以是木質(zhì)素降解酶、纖維素降解酶或半纖維素降解酶。所述外源酶可以是糖苷酶、木聚糖酶、纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-木糖苷酶、阿魏酸酯酶(feruloylesterases)、β-葡糖苷酶和淀粉酶。所述外源酶可以從供應(yīng)商處購買，并且可以包括可以從杰能科國(guó)際公司(genencorinternational，羅切斯特，紐約)獲得的accellerase1000、accellerase1500、accelerasetriotm和accellerasexy。所述外源酶可以包括來自諾維信公司(novozymes，丹麥)的cellic、ctec、htec。所述外源酶可以包括淀粉降解酶。所述外源酶可以包括淀粉酶或轉(zhuǎn)化酶。所述農(nóng)業(yè)加工方法可以包括同時(shí)糖化和發(fā)酵可溶性糖以生產(chǎn)乙醇。本文所述的農(nóng)業(yè)加工方法可以包括收獲具有升高的淀粉水平的基因工程植物，以用作農(nóng)業(yè)加工的原料。該方法可以包括將基因工程植物與植物生物質(zhì)相結(jié)合。所述植物生物質(zhì)可以包括非基因工程植物。所述植物生物質(zhì)可以是基因工程植物生物質(zhì)。所述基因工程植物生物質(zhì)可以表達(dá)多糖降解酶。通過將基因工程植物與表達(dá)多糖降解酶的植物生物質(zhì)組合，本文所述的方法可以不需要苛刻的預(yù)處理，以提高纖維素細(xì)胞壁對(duì)外源酶的易接近性。本文的方法可以利用用于表達(dá)細(xì)胞壁降解酶的植物生物質(zhì)的固結(jié)預(yù)處理和水解的任何方法和組合物，所述細(xì)胞壁降解酶于2012年3月7日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?3/414,627的美國(guó)專利申請(qǐng)和2012年3月7日提交的申請(qǐng)?zhí)枮閜ct/us2012/028132的國(guó)際專利申請(qǐng)中進(jìn)行描述，均通過引用并入本文，如同完整闡述。具有改變的升高的淀粉水平的植物在2011年6月27日提交的申請(qǐng)?zhí)枮閜ct/us2011/041991的國(guó)際專利申請(qǐng)、2013年3月19日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?3/806,654的美國(guó)專利和2013年3月11日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?3/793,078的美國(guó)專利申請(qǐng)中進(jìn)行了描述，全部通過引用并入本文，如同完整闡述?；蚬こ讨参锟梢砸灾苽鋭?dòng)物飼料的方法提供。制備動(dòng)物飼料可以包括將基因工程植物與動(dòng)物飼料(包括但不限于玉米、谷物、大豆和/或其他飼料)相結(jié)合。制備動(dòng)物飼料可以包括青貯基因工程植物，以制備青貯飼料。制備動(dòng)物飼料可以包括將基因工程植物與酒糟(distillers’grains)組合。制備動(dòng)物飼料可以包括將基因工程植物造粒成飼料顆粒。制備動(dòng)物飼料可以包括將基因工程植物與可食用纖維源組合。制備動(dòng)物飼料可以包括將基因工程植物與蛋白質(zhì)源組合。制備動(dòng)物飼料可以包括將基因工程植物與一種或多種作為能量源的碳水化合物組合。制備動(dòng)物飼料可以包括將基因工程植物與本文所述的一種或多種外源酶組合。農(nóng)業(yè)加工方法或制備動(dòng)物飼料的方法還可以包括收獲(harvesting)、打包(baling)、研磨(grinding)、碾磨(milling)、切碎(chopping)、減小尺寸、粉碎(crushing)、從原料中提取組分、純化原料的組分或部分、提取或純化淀粉、將多糖水解成寡糖或單糖、原料的化學(xué)轉(zhuǎn)化或化學(xué)催化。在一種實(shí)施方式中，提供了在營(yíng)養(yǎng)組織中含有升高的淀粉水平的動(dòng)物飼料制劑。動(dòng)物飼料制劑可以被用于通過飼喂動(dòng)物具有升高的淀粉水平的植物材料以提高牛奶和牛肉產(chǎn)量。發(fā)酵過程中可用的易發(fā)酵的糖可以由本文的實(shí)施方式提供。生物燃料的生產(chǎn)可以通過提供易發(fā)酵的糖來加強(qiáng)。提供易發(fā)酵的糖的方法和加強(qiáng)生物燃料的生產(chǎn)的方法作為本文的實(shí)施方式提供。動(dòng)物飼料制劑可以含有一種或多種本文中的基因工程植物。動(dòng)物飼料制劑可以包括本文的制備動(dòng)物飼料的方法的產(chǎn)物。具有升高的營(yíng)養(yǎng)性淀粉水平的作物可以具有多種用途和效用。在一種實(shí)施方式中，提供了來自相對(duì)于野生型植物積累營(yíng)養(yǎng)性淀粉升高水平的植物中的生物質(zhì)。所述生物質(zhì)可以來自本文中的任何基因工程植物或其子代。這些植物可以具有作為用于發(fā)酵過程或動(dòng)物飼料應(yīng)用的原料的附加值。例如，在典型的纖維素工藝中，存在于生物質(zhì)中的多糖，例如，纖維素和半纖維素，被水解成單糖，然后可以通過微生物將其發(fā)酵成乙醇、丁醇、異丁醇、脂肪酸或其他烴類。由于生物質(zhì)的難降解性，從聚合物如纖維素和半纖維素中釋放單糖通常需要使用苛刻的預(yù)處理?xiàng)l件和使用相對(duì)昂貴的酶混合物進(jìn)行水解。類似的情況發(fā)生在食用飼料，包括青貯玉米，作為營(yíng)養(yǎng)和能量來源的反芻動(dòng)物中。在反芻動(dòng)物中，飼料被咀嚼并移動(dòng)至瘤胃中，在其中纖維多糖，如纖維素和半纖維素，被瘤胃菌群中的微生物水解和發(fā)酵。這些有機(jī)物產(chǎn)生被動(dòng)物吸收并代謝的脂肪酸，為動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)。在反芻動(dòng)物消化或生物燃料處理中，存在于生物質(zhì)中的任何淀粉代表易于發(fā)酵的糖(即葡萄糖)的額外來源，其對(duì)水解較不耐受并且可以通過淀粉酶或溫和的化學(xué)處理非常容易地釋放。結(jié)果生物質(zhì)中存在的淀粉量的任何增加將同時(shí)增加可回收的可發(fā)酵糖的量。含有升高水平的淀粉的生物質(zhì)在飼料應(yīng)用中可能具有更大的價(jià)值，其中，將植物材料喂養(yǎng)給家畜或奶畜。同樣，存在于該材料中的過量淀粉比纖維素材料更容易被大多數(shù)動(dòng)物消化，與具有普通水平的淀粉的生物質(zhì)相比，每單位生物質(zhì)提供更多的能量。實(shí)施方式包括將本文所述的植物用于這些方法中的任意一種。本文中的方法，包括前面段落中的那些，可以包括下述內(nèi)容中的至少一種：改造植物以產(chǎn)生基因工程植物、種植基因工程植物、收獲基因工程植物、按照其他飼料作物將其加工(例如，減小飼料的尺寸、青貯、使用接種劑處理、與其他飼料組分組合，或造粒)用于動(dòng)物飼料應(yīng)用、或以與用于纖維素加工中使用的處理方式類似的方式發(fā)酵基因工程植物。所使用的纖維素加工步驟可以包括通過酶促或化學(xué)水解或消化來預(yù)處理和水解多糖成其組分糖。本文的方法中可以提供本段落中闡述的任何一個(gè)步驟，一組步驟或所有步驟。一種實(shí)施方式包括基因構(gòu)建體，旨在實(shí)施改變植物中營(yíng)養(yǎng)性淀粉水平的策略。所述基因構(gòu)建體可以含有編碼能夠切割編碼gwd的內(nèi)源核酸中的靶序列的核酸酶的第一工程核酸序列。所述第一工程核酸可以編碼本文所述的任何一種核酸酶。所述基因構(gòu)建體還可以含有編碼sgrna的第二工程核酸序列。所述第二工程核酸可以編碼本文所述的任何一種sgrna。所述基因構(gòu)建體可以含有與第一工程核酸序列或第二工程核酸可操作地連接的啟動(dòng)子。所述可操作地連接的啟動(dòng)子可以允許編碼核酸酶的第一工程核酸序列或編碼sgrna的第二工程核酸序列的轉(zhuǎn)錄。第一工程核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯可以被稱為核酸酶的表達(dá)。一旦表達(dá)，所述核酸酶可以切割內(nèi)源核酸的靶序列。所述內(nèi)源核酸可以編碼gwd。所述第二核酸序列的轉(zhuǎn)錄可以導(dǎo)致識(shí)別內(nèi)源核酸內(nèi)的靶序列的sgrna的產(chǎn)生，并將cas9核酸酶引導(dǎo)至靶標(biāo)以使其斷裂。所述基因構(gòu)建體可以含有編碼核定位信號(hào)的區(qū)域。本文所使用的seqidno：135核定位信號(hào)(nuclearlocalizationsignal，nls)是指核蛋白內(nèi)的堿性氨基酸序列的短基序。某些蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到核仁(nucleolus)中以發(fā)揮其特定功能，通過核包膜發(fā)生，并涉及核孔復(fù)合物(npc)(wagneretal.,1990，通過引用并入本文，如同完整闡述)。在該過程中，核定位信號(hào)(nls)發(fā)揮重要的作用，因?yàn)樗鼈儽徽J(rèn)為被npc受體識(shí)別，隨后通過核孔復(fù)合體轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。nls屬于若干定義的類別之一(garcia-bustosetal.,1991，通過引用并入本文，如同完整闡述)。nls可以是來自猿猴病毒40大t抗原的sv40nls，由于其在各種包括植物在內(nèi)的生物體中的活性而在靶向基因組修飾的實(shí)驗(yàn)中被集中使用(kalderonetal.,1984；raikhel，1992，這些都通過引用并入本文，如同完整闡述)。sv40nls可以由與seqidno：163的參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的核酸序列編碼。svnls可以含有以下序列、基本上由以下序列組成或由以下序列組成：與seqidno：196的參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。所述nls可以是植物特異性nls序列。還描述了所述植物特異性nls序列，例如，在玉米調(diào)節(jié)蛋白o(hù)paque-2和r(varagonaetal.,1992；shiehetal.,1993，兩者通過引用并入本文，如同完整闡述)。所述植物特異性nls可以由與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核酸序列編碼，所述參考序列選自由seqidno：164(nls1)、165(nls3)、166(nls4)、167(nls5)和168(nls6)所組成的組。所述植物特異性nls可以含有以下序列、基本上由以下序列組成或由以下序列組成：與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自由seqidno：128(nls1)、129(nls3)、130(nls4)、169(nls5)和170(nls6)所組成的組。所述nls序列可以是衍生的nls序列。nls序列或其衍生物可以被用于將大范圍核酸酶、zfn、talen或cas9蛋白靶向作用于植物細(xì)胞核中以用于靶向基因組修飾。一個(gè)或多個(gè)nls序列可以與所述核酸酶的氨基酸序列相融合。所述基因構(gòu)建體可以進(jìn)一步含有與編碼核酸酶的核酸可操作地連接的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列(也稱為調(diào)節(jié)元件)。啟動(dòng)子可以是任何種類的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其僅當(dāng)暴露于特定的化學(xué)或環(huán)境刺激時(shí)才啟動(dòng)編碼核酸酶的核酸的轉(zhuǎn)錄。所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子，其在大多數(shù)細(xì)胞、組織和器官中以及在許多但不一定是所有發(fā)育階段期間在整個(gè)植物中提供核酸或多核酸序列的轉(zhuǎn)錄。所述啟動(dòng)子可以對(duì)特定發(fā)育階段、器官或組織具有特異性。組織特異性啟動(dòng)子可以能夠在特定植物組織中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄?？梢员唤M織特異性啟動(dòng)子靶向作用的植物組織可以為但不限于莖、葉、毛狀體(trichomes)、花藥(anther)或種子。本文的組成型啟動(dòng)子可以是水稻泛素3啟動(dòng)子(osubi3p)或玉米泛素啟動(dòng)子(zmubi1)。其他已知的組成型啟動(dòng)子可以是本文的基因構(gòu)建體的一部分，并且包括但不限于花椰菜花葉病毒(cauliflowermosaicvirus，camv)35s啟動(dòng)子、夜香樹黃化卷曲病毒啟動(dòng)子(cestrumyellowleafcurlingvirus，cmp)或cmp短型(cmps)、二磷酸核酮糖羧化酶小亞基啟動(dòng)子(rubiscosmallsubunitpromoter)、水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(riceactinpromoter，osact1p)和玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶啟動(dòng)子(maizephosphoenolpyruvatecarboxylasepromoter，zmpepcp)。所述啟動(dòng)子可以是來自玉米的合成的核酸啟動(dòng)子。所述來自玉米的合成的核酸啟動(dòng)子可以含有以下序列、基本上由以下序列組成或由以下序列組成：與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列，所述參考序列選自由seqidno：78(mzu3.8)、seqidno：79(zmu3)、zmu3p1(seqidno：82)、zmu3p2(seqidno：84)或zmu3.8啟動(dòng)子(seqidno：86)所組成的組。所述合成的核酸啟動(dòng)子可以具有等于seqidno：78(mzu3.8)、seqidno：79(zmu3)、zmu3p1(seqidno：82)、zmu3p2(seqidno：84)或zmu3.8啟動(dòng)子seqidno：86)中的一種的核苷酸長(zhǎng)度的長(zhǎng)度。比seqidno：78(mzu3.8)、seqidno：79(zmu3)、zmu3p1(seqidno：82)、zmu3p2(seqidno：84)或zmu3.8啟動(dòng)子seqidno：86)短的啟動(dòng)子的同一性百分?jǐn)?shù)可以如上所述沿著較短啟動(dòng)子的長(zhǎng)度。一種實(shí)施方式包括本文所述的任何一種合成的核酸啟動(dòng)子。所述合成的核酸啟動(dòng)子可以與第一工程核酸或第二改造核酸分子可操作地連接，并且可以轉(zhuǎn)錄激活所述第一或第二工程核酸。作為轉(zhuǎn)錄激活的結(jié)果，所述第一或第二工程核酸可以在植物中組成型表達(dá)。本文的基因構(gòu)建體中的調(diào)節(jié)元件可以是終止子。終止子能夠終止轉(zhuǎn)錄。終止子序列可以被包括在表達(dá)盒(expressioncassette)的轉(zhuǎn)錄單元的3'端。所述轉(zhuǎn)錄單元可以編碼核酸酶。所述終止子可以是來源于在多種植物基因中發(fā)現(xiàn)的終止子。所述終止子可以是來自根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)的胭脂堿合酶(nos)或章魚堿合酶(ocs)基因的終止子序列。所述終止子可以是釀膿鏈球菌(s.pyogenes)cas9終止子(seqidno：88)。所述終止子可以是zmu3t終止子(seqidno：89)。所述終止子序列可以是來自camv的camv35s終止子，或顯示出可以終止植物中轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄的任何3'utr序列。例如，所述終止子可以是玉米pepc終止子(3'utr)。所述基因構(gòu)建體可以被包括在載體中。所述基因構(gòu)建體可以被整合到基因工程植物的基因組中。所述基因構(gòu)建體可以在基因工程植物中瞬時(shí)表達(dá)。所述基因構(gòu)建體可以被用于植物的轉(zhuǎn)化。所述基因構(gòu)建體可以被用于農(nóng)桿菌(agrobacterium)介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化。所述基因構(gòu)建體可以通過任何已知的方法用于轉(zhuǎn)化植物，例如，粒子轟擊或直接dna攝取。所述基因構(gòu)建體可以被克隆并被并入載體中。一種實(shí)施方式包括含有本文的基因構(gòu)建體并適用于基因工程改造植物的載體。所述載體可以是中間載體。所述載體可以是轉(zhuǎn)化載體。并入了本文的基因構(gòu)建體的載體還可以含有另外的基因元件，例如，促進(jìn)分子克隆的多克隆位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記物以促進(jìn)選擇。包含在載體中的選擇性標(biāo)記物可以是來自大腸桿菌(escherichiacoli)的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(pmi)基因，其賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞利用甘露糖生長(zhǎng)的能力。包含在載體中的選擇性標(biāo)記包括但不限于賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(npt)基因、賦予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因或賦予草甘膦抗性的烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasegene)基因。所述載體可以是在2013年3月11日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?3/793,078的美國(guó)專利申請(qǐng)中描述的任何載體。全部通過引用并入本文，如同完整闡述。所述載體可以包括編碼本文所述的任何一種核酸酶的基因構(gòu)建體。所述載體可以含有與seqidno：108(大范圍核酸酶4715)或seqidno：109(大范圍核酸酶4716)的參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核酸序列。所述載體可以含有與seqidno：75(zmcas9)的參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核酸序列。所述載體可以含有與參考序列具有與至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列，所述參考序列選自由seqidno：95(zmu3p1：sgrna_gwde24b)、seqidno：96(zmu3p2：sgrna_gwde24b)、seqidno：97(zmu3.8p：sgrna_gwde24b)、seqidno：98(zmu3p2：sgrna_gwde24c)、seqidno：99(zmu3p2：sgrna_gwde25a)和seqidno：100(zmu3p2：sgrna_gwde1a)所組成的組。本文所述的載體或基因構(gòu)建體可以含有工程核酸。所述載體可以是pag4715(圖1)、pag4716(圖2)或其修飾，使用本文另外描述的對(duì)應(yīng)物代替任何一處注釋標(biāo)志。在圖1和2中注釋的常規(guī)載體元件可以被本文中描述的或本領(lǐng)域已知的對(duì)應(yīng)物替代。一種實(shí)施方式包括工程核酸，該工程核酸含有以下序列、基本上由以下序列組成或由以下序列組成：與seqidno：41(大范圍核酸酶gwd-9/10x.272靶序列(pag4715))或seqidno：42(大范圍核酸酶gwd-7/8x靶序列(pag4716))具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列。一種實(shí)施方式包括工程核酸序列，該工程核酸序列含有以下序列、基本上由以下序列組成或由以下序列組成：與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列，所述參考序列選自由seqidno：91(gwde1a)、seqidno：92(gwde24b)、seqidno：93(gwde24c)和seqidno：94(gwde25a)所組成的組。一種實(shí)施方式包括具有如本文所列的任意一個(gè)工程核酸或其互補(bǔ)序列中如前所述序列的工程核酸。在一種實(shí)施方式中，提供了具有與本文所列任何核酸的序列或其互補(bǔ)序列的核酸雜交的序列的工程核酸。在一種實(shí)施方式中，雜交條件是低嚴(yán)格度條件。在一種實(shí)施方式中，雜交條件是中嚴(yán)格度條件。在一種實(shí)施方式中，雜交條件是高嚴(yán)格度條件。用于優(yōu)化雜交方案的雜交方案和方法的實(shí)例如下列書籍所述：molecularcloning，t.maniatis，e.f.fritsch,andj.sambrook，coldspringharborlaboratory，1982；和currentprotocolsinmolecularbiology，f.m.ausubel，r.brent，r.e.kingston,d.d.moore，j.g.seidman,j.a.smith,k.struhl，volume1，johnwiley&sons，2000，其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文，如同完整闡述。中等條件包括以下內(nèi)容：在含有6×檸檬酸鹽緩沖鹽水(ssc；amresco公司，梭倫，俄亥俄州)、0.5％十二烷基硫酸鈉(sds；amresco公司，梭倫，俄亥俄州)、5xdenhardt溶液(amresco公司，梭倫，俄亥俄州)和變性鮭精dna(invitrogenlifetechnologies公司，卡爾斯巴德，加拿大)的溶液中，在68℃下預(yù)處理裝載有dna樣品的濾器2-4小時(shí)。雜交在具有以下變化的相同溶液中進(jìn)行：0.01medta(amresco公司，梭倫，俄亥俄州)、100μg/ml鮭魚精dna和5-20×106cpm的32p-標(biāo)記的或熒光標(biāo)記的探針。將濾膜在雜交混合物中孵育16-20小時(shí)，然后在含有2xssc和0.1％sds的溶液中洗滌15分鐘。使用含有0.1×ssc和0.5％sds的溶液代替洗滌溶液以進(jìn)行第二次洗滌，并在低于tm(熔融溫度，℃)的20℃至29℃下再孵育2小時(shí)。tm＝81.5+16.61log10([na+]/(1.0+0.7[na+]))+0.41(％[g+c])-(500/n)-p-f。[na+]＝鈉離子的摩爾濃度。％[g+c]＝dna序列中g(shù)+c堿基的百分比。n＝以堿基計(jì)的dna序列長(zhǎng)度。p＝對(duì)于錯(cuò)配的堿基對(duì)％的溫度校正(～1℃/1％錯(cuò)配)。f＝甲酰胺濃度校正(＝0.63℃/1％甲酰胺)。過濾器暴露于成像器或通過放射自顯影進(jìn)行顯影。低嚴(yán)格度條件是指在37℃至60℃之間的低溫下的雜交條件，并且在更高的[na+](高達(dá)0.825m)和低于tm40℃至48℃的溫度下進(jìn)行的第二次洗滌。高嚴(yán)格度是指在高于68℃的高溫下的雜交條件，并且在低于tm5℃至10℃的溫度下在[na+]＝0.0165至0.0330m進(jìn)行第二次洗滌。在一種實(shí)施方式中，提供了工程核酸，該工程核酸具有沿著其長(zhǎng)度與具有本文所述的任何一種序列的核酸或其補(bǔ)體的連續(xù)部分(contiguousportion)具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列。所述連續(xù)部分可以為本文所述序列或其補(bǔ)體的全長(zhǎng)。確定兩種氨基酸序列或兩種核酸序列的同一性百分?jǐn)?shù)可以包括比對(duì)和比較兩種序列相應(yīng)位置的氨基酸殘基或核苷酸。如果兩種序列的所有位置被完全相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)，則所述序列被認(rèn)為具有100％同一性。同一性百分?jǐn)?shù)可以使用smithwaterman算法測(cè)量(smithtf,watermanms1981“identificationofcommonmolecularsubsequences,”jmolbiol147：195-197，其通過引用并入本文，如同完整闡述)。一種實(shí)施方式包括工程核酸、工程多核苷酸或工程寡核苷酸，其具有如本文所列的任意一種核酸或其互補(bǔ)序列中所示的序列的一部分。這些工程核酸、工程多核苷酸或工程寡核苷酸可以具有10至全長(zhǎng)、10至5000、10至4900、10至4800、10至4700、10至4600、10至4500、10至4400、10至4300、10至4200、10至4100、10至4000、10至3900、10至3800、10至3700、10至3600、10至3500、10至3400、10至3300、10至3200、10至3100、10至3000、10至2900、10至2800、10至2700、10至2600、10至2500、10至2400、10至2300、10至2200、10至2100、10至200010至1900、10至1800、10至1700、10至1600、10至1500、10至1400、10至1300、10至1200、10至1100、10至1000、10至900、10至800、10至700、10至600、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、10至90、10至80、10至70、10至60、10至50、10至40、10至35、10至30、10至25、10至20、10至15、或20至30個(gè)核苷酸、或10、15、20或25個(gè)核苷酸。具有在上述范圍之一內(nèi)的長(zhǎng)度的工程核酸、工程多核苷酸或工程寡核苷酸可以具有在所述范圍內(nèi)(包括端點(diǎn))的任何特定長(zhǎng)度。所述核苷酸長(zhǎng)度可以起始于參考序列(即，本文中的任何一個(gè)核酸)中的任何單一位置，其中，足夠的核苷酸跟隨在單一位置之后以適應(yīng)所列出的長(zhǎng)度。在一種實(shí)施方式中，雜交探針或引物與核酸具有85至100％、90至100％、91至100％、92至100％、93至100％、94至100％、95至100％、96至100％、97至100％、98至100％、99至100％或100％互補(bǔ)，所述核酸與探針和引物的長(zhǎng)度相同，并且具有選自在本文所列的任何一種核酸中所述部分序列內(nèi)的核苷酸的長(zhǎng)度相當(dāng)于探針或引物長(zhǎng)度的序列。在一種實(shí)施方式中，雜交探針或引物沿著其長(zhǎng)度與相應(yīng)長(zhǎng)度的具有本文所列的任意一種核酸中所述序列的核酸雜交。在一種實(shí)施方式中，雜交條件是低嚴(yán)格度的。在一種實(shí)施方式中，雜交條件是中嚴(yán)格度的。在一種實(shí)施方式中，雜交條件是高嚴(yán)格度的。一種實(shí)施方式包括用于鑒定樣品中編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因的修飾序列的試劑盒。所述試劑盒可以含有第一引物和第二引物。所述第一引物和第二引物能夠擴(kuò)增包含在編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中的靶序列。所述靶序列可以含有與選自seqidno：1-4、75、170-184、186、187、189-193的參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核酸序列。所述試劑盒可以進(jìn)一步含有一個(gè)或多個(gè)用于檢測(cè)靶序列的擴(kuò)增區(qū)域中的修飾的組件。所述試劑盒可以包含含有選自seqidno：6、7、9、11、101、103、105、110和111的核酸序列的第一引物。所述試劑盒可以包含含有選自seqidno：5、8、10、102和104的核酸序列的第二引物。所述試劑盒可以包含含有seqidno：6的核酸序列的第一引物和含有seqidno：5的核酸序列的第二引物。所述試劑盒可以包含含有seqidno：7的核酸序列的第一引物和含有seqidno：8的核酸序列的第二引物。所述試劑盒可以包含含有seqidno：9的核酸序列的第一引物和含有seqidno：10的核酸序列的第二引物。所述試劑盒可以包含含有seqidno：11的核酸序列的第一引物和含有seqidno：13的核酸序列的第二引物。所述試劑盒可以包含含有seqidno：110的核酸序列的第一引物和含有seqidno：13的核酸序列的第二引物。所述試劑盒可以包含含有seqidno：111的核酸序列的第一引物和含有seqidno：112的核酸序列的第二引物。所述試劑盒可以包含含有seqidno：105的核酸序列的第一引物和含有seqidno：13的核酸序列的第二引物。所述第一引物和第二引物能夠擴(kuò)增靶序列以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。所述擴(kuò)增產(chǎn)物可以含有修飾的靶序列。所述修飾的靶序列能夠在高嚴(yán)格度條件下與含有選自seqidno：12-40、114-116、188-189、19-120和131-162的序列的核酸序列雜交。所述修飾的靶序列可以被用作用于診斷在編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中具有突變的基因工程植物的探針。樣品可以包括來自目前存在的植物物質(zhì)(plantmatter)的核酸的任何樣品。所述樣品可以包括任何植物物質(zhì)。所述植物物質(zhì)可以來自植物或其部分。所述植物材料可以來自動(dòng)物飼料或食物。一種實(shí)施方式提供了鑒定樣品中編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因的修飾的序列的方法。該方法可以包括將樣品與第一引物和第二引物接觸。該方法可以包括擴(kuò)增含有被包含在編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中的靶序列的合成的多核苷酸。所述靶序列可以是被包含在編碼本文所述的葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中的任何靶序列。所述第一引物和第二引物能夠擴(kuò)增靶序列以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。所述擴(kuò)增產(chǎn)物可用于確定由有性雜交或自交產(chǎn)生的植物是否在靶序列中含有一個(gè)或多個(gè)修飾并診斷特異性突變體。來自突變植物的樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度可以不同于來自具有相同遺傳背景的野生型植物的樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度。來自突變體樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物可以進(jìn)一步用于在高嚴(yán)格度條件下與包含編碼突變蛋白的特定區(qū)域的合成的多核苷酸雜交的探針。該方法可以包括進(jìn)一步檢測(cè)至少一種探針與靶序列的特異性區(qū)域的雜交。制備基因工程植物的方法、提高植物中淀粉水平的方法、農(nóng)業(yè)加工方法、制備動(dòng)物飼料的方法和用于生產(chǎn)對(duì)于編碼改變的葡聚糖水合二激酶的工程核酸是純合的基因工程植物的方法可以包括本文所述的檢測(cè)方法，作為制備基因工程植物和/或鑒定包含本文中基因工程核酸的植物或植物生物質(zhì)的部分。以下列表包括本發(fā)明的特定實(shí)施方式。但是該列表不是限制性的，并且不排除替代實(shí)施方式或本文另外描述的實(shí)施方式。在下列實(shí)施方式列表中描述的同一性百分?jǐn)?shù)是指沿著參考序列的全長(zhǎng)所列舉序列的同一性。實(shí)施方式1、一種合成的核酸啟動(dòng)子，該核酸啟動(dòng)子與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性，所述參考序列選自由seqidno：78(mzu3.8)、seqidno：79(zmu3)、seqidno：82(zmu3p1)、seqidno：84(zmu3p2)和seqidno：86(mzu3.8p)所組成的組。2、一種基因構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有編碼cas9核酸酶的第一工程核酸序列，其中，所述cas9核酸酶能夠切割植物中編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源核酸中的靶序列。3、實(shí)施方式2中的基因構(gòu)建體，其中，第一合成的核酸序列與seqidno：74(cas9核酸酶)或seqidno：75(zmcas9)的參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性。4、實(shí)施方式2和實(shí)施方式3中的一項(xiàng)或兩項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其中，第一核酸與編碼至少一個(gè)核定位信號(hào)(nls)的多核苷酸序列融合。5、實(shí)施方式2-4中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其中，編碼核定位信號(hào)的多核苷酸序列選自seqidno：163-168。6、實(shí)施方式2-5中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其進(jìn)一步含有編碼sgrna的第二工程核酸序列，并且所述sgrna能夠結(jié)合靶序列。7、實(shí)施方式6中的基因構(gòu)建體，其中，所述第二工程核酸含有與參考序列至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的序列，所述參考序列選自seqidno：135(zmu3p1：sgrna_gwde24b)、seqidno：136(zmu3p2：sgrna_gwde24b)、seqidno：137(zmu3.8p：sgrna_gwde24b)、seqidno：138(zmu3p2：sgrna_gwde24c)、seqidno：139(zmu3p2：sgrna_gwde25a)和seqidno：40(zmu3p2：sgrna_gwde1a)。8、實(shí)施方式2-7中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其中，靶序列與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性，所述參考序列選自由seqidno：91(gwde1a)、seqidno：92(gwde24b)、seqidno：93(gwde24c)和seqidno：94(gwde25a)所組成的組。9、實(shí)施方式2-8中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其進(jìn)一步含有與第一工程核酸可操作地連接的第一啟動(dòng)子和與第二工程核酸可操作地連接的第二啟動(dòng)子。10、實(shí)施方式9中的基因構(gòu)建體，其中，所述第一啟動(dòng)子或第二啟動(dòng)子為實(shí)施方式1中的合成的核酸啟動(dòng)子。11、實(shí)施方式2-10中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其進(jìn)一步含有終止子。12、實(shí)施方式11中的基因構(gòu)建體，其中，所述終止子含有與seqidno：88具有至少90％同一性的核酸序列。13、一種基因構(gòu)建體，該基因構(gòu)建體含有編碼核酸酶的工程核酸序列，其中，所述核酸酶能夠切割包含在編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源核酸中的靶序列。14、實(shí)施方式13中的基因構(gòu)建體，其中，所述核酸酶是由與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列編碼的大范圍核酸酶，所述參考序列選自由seqidn：164(4715_大范圍核酸酶)和seqidno：165(4716_大范圍核酸酶)所組成的組。15、實(shí)施方式13-14中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其中，所述靶序列含有seqidno：41(大范圍核酸酶gwd-9/10x.272)或seqidno：42(大范圍核酸酶3egwd-7/8x)的多核苷酸。16、實(shí)施方式13-15中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因構(gòu)建體，該基因構(gòu)建體含有至少一種調(diào)節(jié)元件，其中，所述調(diào)節(jié)元件選自啟動(dòng)子、終止子和增強(qiáng)子。17、一種載體，該載體含有實(shí)施方式2-16中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因構(gòu)建體。18、一種基因工程植物，該基因工程植物含有編碼改變的葡聚糖水合二激酶的工程核酸，并且與具有相同遺傳背景的非基因工程植物相比具有升高的淀粉水平。19、實(shí)施方式18中的基因工程植物，其中，與具有相同遺傳背景的非基因工程植物中的野生型葡聚糖水合二激酶相比，改變的葡聚糖水合二激酶的活性降低。20、實(shí)施方式18中的基因工程植物，其中，所述改變的葡聚糖水合二激酶是無活性的。21、實(shí)施方式18-20中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的基因工程植物，其中，所述工程核酸是編碼葡聚糖水合二激酶的基因的一個(gè)等位基因的內(nèi)源核酸的修飾序列。22、實(shí)施方式18-21中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因工程植物，其中，植物中編碼葡聚糖水合二激酶的基因的所有等位基因具有工程核酸的序列。23、實(shí)施方式18-22中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因工程植物，其中，所述內(nèi)源核酸含有與seqidno：1(zmgwd編碼序列)或seqidno：2(sbgwd編碼序列)的參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％,同一性的序列。24、實(shí)施方式18-23中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的基因工程植物，其中，所述工程核酸含有選自以下至少一種的突變：編碼野生型gwd的核酸的內(nèi)源性序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、缺失或取代。25、實(shí)施方式24中的基因工程植物，其中，內(nèi)源核酸中的靶序列中的突變與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性，所述參考序列選自seqidno：3(zmgwd外顯子24+內(nèi)含子)、seqidno：4(sbgwd外顯子24+內(nèi)含子)、seqidno：182(zmgwd外顯子24)、seqidno：183(sbgwd外顯子24)、seqidno：184(sbgwd外顯子7)和seqidno：189(zmgwd外顯子25)。26、實(shí)施方式18-25中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因工程植物，其中，內(nèi)源核酸中的靶序列中的突變與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性，所述參考序列選自由seqidno：91(gwde1a)、seqidno：92(gwde24b)、seqidno：93(gwde24c)和seqidno：94(gwde25a)所組成的組。27、實(shí)施方式18-26中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因工程植物，其中，所述工程核酸含有與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的多核苷酸，所述參考序列選自由seqidno：12-40(zmgwd突變-外顯子24)所組成的組。28、實(shí)施方式18-26中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因工程植物，其中，所述工程核酸含有與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的多核苷酸，所述參考序列選自由seqidno：114-118、188、131-146(zmgwd突變-外顯子24)和119-120(zmgwd突變-外顯子25)所組成的組。29、實(shí)施方式18-25中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因工程植物，其中，所述工程核酸含有與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的多核苷酸，所述參考序列選自由seqidno：106(sb4715_1((wt+ins)_外顯子24)和seqidno：107(sb4715_2(wt+del)_外顯子24)所組成的組。30、實(shí)施方式16-28中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)基因工程植物，其中，所述改變的葡聚糖水合二激酶含有與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自由seqidno：45-73(zmgwd突變蛋白m1-m29)所組成的組。31、實(shí)施方式16-25中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)基因工程植物，其中，所述改變的葡聚糖水合二激酶含有與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自由seqidno：121-125(zmgwd突變蛋白m32-m36)、126-127(zmgwd突變蛋白m38-m39)和147-162(zmgwd突變蛋白m40-m55)所組成的組。32、實(shí)施方式18-26中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因工程植物，其中，所述改變的葡聚糖水合二激酶含有與參考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的同一性的氨基酸序列，所述參考序列選自seqidno：82(sbgwd突變蛋白sb4715_1wt+ins)或seqidno：83(sbgwd突變蛋白sb4715_2wt+del)。33、實(shí)施方式18-33中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因工程植物，其中，所述植物選自：由單子葉植物、雙子葉植物、c4植物、c3植物、番茄、甜菜、甘蔗、桉樹，柳樹、楊樹、玉米、高粱、小麥、苜蓿、大豆、水稻、芒草和柳枝稷所組成的組。34、一種基因工程植物，該基因工程植物含有實(shí)施方式2-16中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因構(gòu)建體。35、一種用于產(chǎn)生基因工程植物的方法，該方法包括：使用實(shí)施方式17的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；選擇表達(dá)核酸酶并含有編碼改變的葡聚糖水合二激酶的工程核酸的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生基因工程植物，其中，與具有相同遺傳背景的非基因工程植物相比，基因工程植物或其子代具有升高的淀粉水平。36、實(shí)施方式35中的方法，其中，所述核酸酶為大范圍核酸酶。37、實(shí)施方式35中的方法，其中所述核酸酶為cas9核酸酶。38、一種用于基因改造含有改變的葡聚糖水合二激酶的植物的方法，該方法包括：將含有編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中的靶序列的至少一個(gè)植物細(xì)胞與含有編碼能夠誘導(dǎo)靶序列上的單鏈或雙鏈斷裂的核酸酶的第一核酸的載體接觸；選擇含有所述靶序列改變的植物細(xì)胞；再生含有來自植物細(xì)胞的改變的基因工程植物。39、實(shí)施方式38中的方法，其中，所述基因工程植物對(duì)于所述改變是純合的。40、實(shí)施方式38的方法，其中，所述基因工程植物對(duì)于所述改變是雜合的。41、實(shí)施方式40的方法，該方法還包括使雜合的基因工程植物自交，或雜交至具有相同改變的另一雜合的基因工程植物，并且選擇對(duì)于所述改變是純合的第一子代植物。42、實(shí)施方式40的方法，該方法還包括將基因工程植物與具有相同遺傳背景的野生型植物雜交，并且選擇對(duì)于所述改變是雜合的第一子代植物。43、實(shí)施方式42的方法，該方法還包括使所述第一雜合子代植物自交和選擇對(duì)于所述改變是純合的第二子代植物。44、實(shí)施方式38-43中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中，所述改變是選自靶序列中至少一個(gè)核苷酸的插入、缺失或取代中的至少一種的突變。45、實(shí)施方式44的方法，其中，所述突變是無效突變。46、實(shí)施方式38-44中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中，與具有相同遺傳背景的非基因工程植物相比，所述基因工程植物或其子代具有升高的淀粉水平。47、實(shí)施方式38-46中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中，所述核酸酶選自由大范圍核酸酶、cas9核酸酶、鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)物核酸酶所組成的組。48、實(shí)施方式47的方法，其中，所述核酸酶是大范圍核酸酶，并且由與參考序列具有至少90％同一性的序列編碼，所述參考序列選自由seqidno：108(4715_大范圍核酸酶)和seqidno：109(4716_大范圍核酸酶)所組成的組。49、實(shí)施方式48的方法，其中，所述大范圍核酸酶能夠切割含有seqidno：41(4715_wwd-9/10x.272的靶標(biāo))或seqidno：42(4716_3egwd-7/8x276的靶標(biāo))的多核苷酸的靶序列。50、實(shí)施方式47的方法，其中，所述核酸酶為cas9核酸酶。51、實(shí)施方式50的方法，其中，所述cas9核酸酶由與seqidno：74(cas9核酸酶)或seqidno：75(zmcas9)具有至少90％同一性的核酸編碼。52、實(shí)施方式51的方法，其中，所述編碼cas9核酸酶的核酸與至少一個(gè)核定位信號(hào)(nls)融合，并且所述nls具有選自seqidno：163-168的多核苷酸序列。53、實(shí)施方式38-47和50-52中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述載體還含有編碼sgrna的第二核酸序列。54、實(shí)施方式53的方法，其中，所述sgrna能夠結(jié)合靶序列，并且所述靶序列選自由seqidno：91(gwde1a)、seqidno：92(gwde24b)、seqidno：93(gwde24c)和seqidno：94(gwde25a)所組成的組。55、實(shí)施方式53-54中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中，所述第二核酸含有與seqidno：95(zmu3p1：sgrna_gwde24b)、seqidno：96(zmu3p2：sgrna_gwde24b)、seqidno：97(zmu3.8p：sgrna_gwde24b)、seqidno：98(zmu3p2：sgrna_gwde24c)、seqidno：99(zmu3p2：sgrna_gwde25a)和seqidno：100(zmu3p2：sgrna_gwde1a)具有至少90％同一性的序列。56、實(shí)施方式38-55中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中，所述載體還含有與第一核酸或第二核酸可操作地連接的核酸啟動(dòng)子。57、實(shí)施方式56的方法，其中，所述核酸啟動(dòng)子含有與參考序列具有至少90％同一性的序列，所述參考序列選自由seqidno：78(mzu3.8)、seqidno：79(zmu3)，seqidno：82(zmu3p1)、seqidno：84(zmu3p2)和seqidno：86(mzu3.8)所組成的組。58.由實(shí)施方式38-57中任意一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的基因工程植物，或其子代或其后代，其中，在所述植物、其子代或其后代中含有所述改變。59、實(shí)施方式58的基因工程植物，該基因工程植物與具有相同遺傳背景的含有野生型葡聚糖水合二激酶的植物相比具有升高的淀粉水平。60、一種提高植物中淀粉水平的方法，該方法包括在植物中表達(dá)核酸，所述核酸編碼能夠誘導(dǎo)靶序列上的雙鏈斷裂的核酸酶，并且選擇含有靶序列改變的和具有升高的淀粉水平的純合植物，其中，所述靶序列被包含在僅編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中。61、一種農(nóng)業(yè)加工的方法，該方法包括：在植物中表達(dá)編碼能夠誘導(dǎo)靶序列上的雙鏈斷裂的核酸酶的核酸，其中，所述靶序列被包含在編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中；選擇含有靶序列中的改變并且具有升高的淀粉水平的純合植物；和加工所述純合植物，其中，所述加工包括一種或多種選自收獲、排水、粉碎、干燥、發(fā)酵、使用化學(xué)品水解、使用外源酶水解和與植物生物質(zhì)組合的步驟。該方法還可以包括用于產(chǎn)生實(shí)施方式63-71中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因工程植物的方法。62、一種制備動(dòng)物飼料的方法，該方法包括：在植物中表達(dá)編碼能夠誘導(dǎo)靶序列上的雙鏈斷裂的核酸酶的核酸，其中，所述靶序列被包含在編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中；選擇含有靶序列中的改變并且具有升高的淀粉水平的純合植物；和進(jìn)行選自由以下步驟所組成的組：收獲、排水、粉碎、干燥、青貯、造粒、與可食用纖維源組合、以及與植物生物質(zhì)組合。該方法還可以包括用于產(chǎn)生實(shí)施方式63-71中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因工程植物的方法。63、一種用于產(chǎn)生含有編碼改變的葡聚糖水合二激酶的工程核酸的基因工程植物的方法，該方法包括修飾植物中編碼葡聚糖水合二激酶的基因的至少一個(gè)等位基因的內(nèi)源核酸序列，其中，修飾的工程核酸是工程核酸，并且修飾的植物是基因工程植物。64、實(shí)施方式63的方法，其中，所述基因工程植物對(duì)于含有突變的基因是純合的，并且所有等位基因含有所述工程核酸的序列。65、實(shí)施方式63的方法，其中，所述基因工程植物對(duì)于含有所述突變的基因是雜合的。66、實(shí)施方式63或65中的任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，該方法還包括將所述基因工程植物自交并獲得子代。67、實(shí)施方式63-65中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，該方法還包括將所述基因工程植物與具有相同遺傳背景的非基因工程植物雜交并獲得子代。68、實(shí)施方式66-67中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，該方法包括分析子代中改變的葡聚糖水合二激酶的存在并選擇含有突變的子代植物。69、實(shí)施方式63的方法，該方法包括實(shí)施方式18-34和58-59中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因工程植物。70、實(shí)施方式63的方法，其中，所述修飾的步驟通過使用實(shí)施方式35-36中任意一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行。71、實(shí)施方式63的方法，其中，所述修飾的步驟通過使用實(shí)施方式2-16中任意一項(xiàng)的基因構(gòu)建體進(jìn)行。72、一種用于鑒定樣品中編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因的修飾序列的試劑盒，其中，所述試劑盒含有第一引物和第二引物，其中，所述第一引物和第二引物能夠擴(kuò)增包含在編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中的靶序列。所述靶序列含有與選自seqidno：1-4、75、171-187、189-193的參考序列具有至少90％同一性的核酸序列73、實(shí)施方式72的試劑盒，該試劑盒還包含一個(gè)或多個(gè)用于檢測(cè)靶序列的擴(kuò)增區(qū)域中的修飾的組件。74、實(shí)施方式72-73任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的試劑盒，其中，所述第一引物含有選自seqidno：6、7、9、11、101、103、105、110和111的核酸序列。75、實(shí)施方式72-74中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的試劑盒，其中，所述第二引物含有選自seqidno：5、8、10、102和104的核酸序列。76、實(shí)施方式72-75中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的試劑盒，其中，第一引物和第二引物能夠擴(kuò)增靶序列以產(chǎn)生含有修飾的靶序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。77、實(shí)施方式73-76中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的試劑盒，其中，所述擴(kuò)增的靶序列含有選自seqidno：12-40、106-107、114-120、131-146和188的序列。78、實(shí)施方式72-76中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的試劑盒，其中，所述修飾的靶序列能夠在高嚴(yán)格度條件下與含有選自seqidno：12-40、106-107、114-120、131-146和188的序列的核酸序列雜交。79、實(shí)施方式72-78中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的試劑盒，其中，所述樣品含有來源于在編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中具有至少一個(gè)突變的基因工程植物物質(zhì)。80、一種鑒定樣品中編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因的修飾序列的方法，該方法包括：將樣品與第一引物和第二引物接觸；擴(kuò)增包含在編碼葡聚糖水合二激酶的內(nèi)源基因中的靶序列，并且所述靶序列含有與參考序列具有至少90％同一性的核酸序列，所述參考序列選自seqidno：1-4、75、170-184、186、187、189-193；和檢測(cè)靶序列中的修飾。81、實(shí)施方式79的方法，其中，所述靶序列中的修飾含有選自seqidno：12-40、106-107、114-120、131-146和188的序列。該鑒定方法可以被加入實(shí)施方式60-71中的任意一項(xiàng)或多項(xiàng)?？梢酝ㄟ^由本問的一種或多種其他實(shí)施方式的一個(gè)或多個(gè)要素(element)補(bǔ)充實(shí)施方式，和/或使用本文的一種或多種其他實(shí)施方式的一個(gè)或多個(gè)要素代替一種實(shí)施方式中的一個(gè)或多個(gè)要素形成本文進(jìn)一步地的實(shí)施方式。實(shí)施例提供以下非限制性的實(shí)施例來說明具體的實(shí)施方式。全部實(shí)施方式均可以由來自以下一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的一處或多處細(xì)節(jié)補(bǔ)充，和/或一種實(shí)施方式中的一個(gè)或多個(gè)要素可以用一個(gè)或多個(gè)以下實(shí)施例的一處或多處細(xì)節(jié)代替。實(shí)施例1基于大范圍核酸酶的玉米和高粱基因組中的gwd基因的修飾設(shè)計(jì)靶向gwd外顯子24的大范圍核酸酶構(gòu)建體，其接近預(yù)測(cè)的編碼的酶的活性位點(diǎn)，目的是引入使gwd失活的突變(無效突變)。在玉米和高粱中鑒定和表征大范圍核酸酶誘導(dǎo)的gwddna突變體。為了改造具有針對(duì)玉米和高粱基因組中的gwd基因的特異性的i-crei歸巢內(nèi)切核酸酶，從玉米和高粱的之前注釋的全長(zhǎng)gwd基因中選擇兩個(gè)核苷酸序列。所述序列選擇是基于玉米和高粱序列之間的高核苷酸序列同一性(95％核苷酸序列同一性)的存在以及兩種作物的外顯子#24中存在gwd蛋白活性所需的序列基序。目的是以這樣的方式研發(fā)兩個(gè)大范圍核酸酶構(gòu)建體，使得它們中的每一個(gè)將特異性用于玉米和高粱中的gwd修飾。使用大范圍核酸酶方法在選擇的gwd序列處的靶向基因組修飾將導(dǎo)致缺乏活性位點(diǎn)的gwd蛋白變體(從含有編碼序列的幀錯(cuò)位表達(dá)的截短的蛋白質(zhì)或修飾的蛋白質(zhì))的表達(dá)，因此是催化失活的。將如下所示的zmgwd(玉米)和sbgwd(高粱)的選定序列提供給precisionbiosciences公司，用于設(shè)計(jì)大范圍核酸酶gwd9-10x.272和gwd7-8x.226。大范圍核酸酶gwd-9/10x.272(pag4715)的靶序列是：atccttgtggcaaagagtgtca(seqidno：41)。大范圍核酸酶gwd-7/8x.226靶序列(pag4716)的靶序列是：gtagttggtgtaattacacctg(seqidno：42)。被設(shè)計(jì)的大范圍核酸酶識(shí)別的外顯子24內(nèi)的dna序列加下劃線。大寫字母的序列顯示外顯子24，而小寫字母的序列表示側(cè)翼內(nèi)含子。雙下劃線的“cat”密碼子編碼對(duì)gwd蛋白活性至關(guān)重要的組氨酸殘基。＞zmgwd_外顯子24aagtgatactagtgaccctctccacaattttatgcgaaccacagaaattaataatatattctattactctgcacctgacatctggctcctgctatcagttggcaggttataagcccggttgaagtatcaggttatgtggttgtggttgatgagttacttgctgtccagaacaaatcttatgataaaccaaccatccttgtggcaaagagtgtcaagggagaggaagaaataccagatggagtagttggtgtaattacacctgatatgccagatgttctgtctgtgtcagtccgagcaaggaatagcaaggtttatcttcacagctatgttgcaagatttcttgaattttttctcttgtattgatgttgacatactagctttttcctaat(seqidno：3)＞sbgwd_外顯子24aagtggtactagtgacctctccacagttttatgtgaaccacagaaattaaatatgataatatattctattactctgcacctgacatctggctcctgataacagttggcaggttataagcccagttgaagtatcaggttatgtggttgtggttgatgagttacttgctgtccagaacaaatcttatgataaaccaaccatccttgtggcaaagagtgtcaagggagaggaagaaataccagatggagtagttggtgtaattacacctgatatgccagatgttctgtccgtgtcagtccgagcaaggaatagcaaggtttattttcacagttatgttgcaagctttctcagattttttttcttgtatcgatgttgacataccagttttttcctaat(seqidno：4)使用clustal軟件比對(duì)選擇的zmgwd和sbgwd序列(larkinmaetal.，2007；goujonmetal.，2010，二者均通過引用并入本文，如同完整闡述)。clustal2.1多序列比對(duì)用于表達(dá)大范圍核酸酶的植物轉(zhuǎn)化載體的研發(fā)：由precisionbiosciences公司提供的大范圍核酸酶序列g(shù)wd-9/10x.272[seqidno：108]和gwd-7/8x.226[seqidno：109]，通過使用pcr方法在5'端添加bamhi限制性位點(diǎn)，在3'端添加avrii位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步修飾。隨后，將gwd-9/10x.272和gwd-7/8x.226核苷酸序列作為在玉米泛素1基因啟動(dòng)子和nos轉(zhuǎn)錄終止子序列之間的bamhi-avrii片段克隆到pag4500載體中，以分別產(chǎn)生植物轉(zhuǎn)化載體pag4715和pag4716。圖1和圖2顯示了pag4715和pag4716載體的各自的圖譜。參考圖1和圖2，pag4715和4716含有玉米泛素啟動(dòng)子(zmubi1)、玉米泛素內(nèi)含子(zmubi1內(nèi)含子)和用作轉(zhuǎn)錄終止子的聚腺苷酸化信號(hào)nost。兩種載體還含有作為選擇性標(biāo)記物的磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(pmi)、atnls(核定位序列)、zmkozak、mubqmono、t-dna右和左邊界(分別為rb和lb)、鏈球菌乙酰轉(zhuǎn)移酶(streptothricinacetyltransferase)基因和賦予鏈霉素抗性的氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶(aada)基因。pag4715含有g(shù)wd9-10x.272大范圍核酸酶序列[seqidno：108]，pag4716含有g(shù)wd7-8x.226大范圍核酸酶序列[seqidno：109]。pag4715和pag4716被用于在玉米和高粱中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因事件和突變體。本文使用的靶蛋白、基因、突變體和載體的序列列于表1中。表1序列描述實(shí)施例2將talens應(yīng)用于靶向高粱基因組中g(shù)wd基因的修飾在高粱gwd基因(sbgwd)的外顯子7和24的每一個(gè)中選擇兩對(duì)dna序列用于研發(fā)四個(gè)定制的taldna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其將與截短的foki核酸酶序列融合。選擇高粱外顯子24是因?yàn)槠浜術(shù)wd活性位點(diǎn)，并且為了與玉米中的其他內(nèi)源性dna編輯技術(shù)進(jìn)行比較，例如，大范圍核酸酶和crisp/cas9技術(shù)。在gwd基因序列的上游區(qū)域選擇高粱外顯子7用于產(chǎn)生更短的截短形式的gwd蛋白。使用專有程序在lifetechnologies網(wǎng)站上進(jìn)行dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列的選擇。融合到截短foki內(nèi)切核酸酶的用于靶向gwd基因的外顯子7和24中的高粱基因組修飾的兩對(duì)taldna結(jié)合結(jié)構(gòu)域由lifetechnologies構(gòu)建。每對(duì)talen將在相應(yīng)的gwd位點(diǎn)識(shí)別基因組dna序列的上鏈和下鏈，以靶向作用于foki核酸酶進(jìn)行dna切割。選擇用于基于talen的gwd修飾的sbgwd核苷酸序列。sbgwd_外顯子7序列位于sbgwd編碼序列(seqidno：2)的736-969nt內(nèi)：＞sbgwd_外顯子7gaggagtatgaagctgcacgagctgagttaatagaggaattaaatagaggtgtttctttagagaagcttcgagctaaattgacaaaaacacctgaagcacctgagtcagatgaacgtaaatctcctgcatctcgaatgcccgttgataaacttccagaggaccttgtacaggtgcaggcttatataaggtgggagaaagcgggcaagccaaattatcctcctgagaagcaactg(seqidno：184)sbgwd_外顯子24序列位于sbgwd編碼序列(seqidno：2)的3030-3243nt內(nèi)：＞sbgwd_外顯子24ttggcaggttataagcccagttgaagtatcaggttatgtggttgtggttgatgagttacttgctgtccagaacaaatcttatgataaaccaaccatccttgtggcaaagagtgtcaagggagaggaagaaataccagatggagtagttggtgtaattacacctgatatgccagatgttctgtccgtgtcagtccgagcaaggaatagcaag(seqidno：183)每個(gè)外顯子中下劃線的序列代表所選的taldna結(jié)合位點(diǎn)，左側(cè)序列對(duì)dna上鏈?zhǔn)翘禺愋缘模覀?cè)序列靶向作用于dna下鏈。編碼對(duì)于gwd蛋白活性具有催化重要性的組氨酸殘基的密碼子是雙下劃線的，并且在外顯子24內(nèi)是粗體。對(duì)于外顯子7或外顯子24特異性的talen將各自成對(duì)被克隆至基于pag4500的植物轉(zhuǎn)化載體中。實(shí)施例3植物轉(zhuǎn)化和分析玉米和高粱轉(zhuǎn)化：使用質(zhì)粒psb1操作手冊(cè)中所述的方案提取來自農(nóng)桿菌的dna。使用qiagendneasyplantmini試劑盒(69140)提取植物dna。根據(jù)negrottodetal.plantcellrep19:798；ishidayetal.1996natbiotech14:74，使用gwd大范圍核酸酶靶向構(gòu)建體pag4715和/或pag4716轉(zhuǎn)化玉米和高粱胚，全部通過引用并入本文，如同完整闡述。簡(jiǎn)言之，將攜帶合適的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的lba4404農(nóng)桿菌細(xì)胞接種于來自野生型axb玉米的胚發(fā)生愈傷組織。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的未成熟玉米胚胎的轉(zhuǎn)化按照negrottod等描述的那樣進(jìn)行。使用先前報(bào)道的步驟(ishidayetal.1996natbiotech14：745；hieiyetal.1994plantj6:271；hieiyandkomarit2006plantcelltissueorgancult.85:27；komaritetal.1996plantj10:165)，將用于gwd大范圍核酸酶的表達(dá)盒克隆到能夠與根癌土壤桿菌菌株lba4404的三親交配中的psb1載體重組的中間載體的kpni-ecori位點(diǎn)。將玉米(zeamays栽培品種hiii，a188或b73)母本植株在溫室中在28℃的日光下生長(zhǎng)16小時(shí)。從籽粒中分離出未成熟的合子胚，并用含有目標(biāo)基因的土壤桿菌溶液接種。接種后，未成熟胚在組織培養(yǎng)過程中生長(zhǎng)10-12周。對(duì)具有葉和根的發(fā)育良好的幼苗進(jìn)行取樣用于pcr分析，以鑒定含有目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植物。用水沖洗pcr陽性和生根的植物以洗去瓊脂培養(yǎng)基，并將其移植到土壤中并在溫室中生長(zhǎng)以產(chǎn)生種子和秸稈。根據(jù)gao等,2005的方案進(jìn)行高粱轉(zhuǎn)化。根據(jù)elkonin和pakhomova，2000進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的再生。使用質(zhì)粒psb1操作手冊(cè)中描述的方案提取來自農(nóng)桿菌的dna。使用qiagendneasyplantmini試劑盒(69140)提取植物dna。10×te+十二烷基肌酸鈉(sarkosyl)-用于96孔板的植物dna分離：簡(jiǎn)言之，將costar研磨塊裝填3/4的葉樣品，將一個(gè)5mm鋼珠加入具有樣品的每個(gè)孔中，并使用存儲(chǔ)墊施用器以密封所述塊。在研磨前或直至處理時(shí)間，將樣品在-80℃下儲(chǔ)存至少30分鐘。為了處理，使用klecko粉碎機(jī)和安全研磨機(jī)以最大速度將樣品研磨45秒。將密封移除并丟棄。使用多通道移液器和無菌溶液槽向每個(gè)樣品中加入300微升的10×te+十二烷基肌酸鈉緩沖液(5ml1mtris、1ml0.5medta，0.5g十二烷基肌酸鈉，46mlddh2o)。將板在振蕩器上以300rpm溫育10min，并以4000rpm旋轉(zhuǎn)3分鐘。除去上清液并棄去，將沉淀重懸于1×te緩沖液中。將150微升樣品等分試樣加入96孔pct板中。所述pcr板用鋁箔密封。為了獲得最佳結(jié)果，在同一天進(jìn)行dna分離和pcr。轉(zhuǎn)基因診斷pcr反應(yīng)設(shè)置：“完全”pcr反應(yīng)混合物如下：15μl2×gotaqmm(gotaqgreenmastermix(promega#m712)、3μl目標(biāo)基因特異的正向和反向引物組合(每個(gè)以10μm混合)、2μl制備的dna和水，以將體積調(diào)節(jié)至30μl。將每孔的28微升“完全”pcr反應(yīng)混合物等分到pcr板(fisher，#14230236)中，將2微升植物dna樣品分裝到pcr板的每個(gè)孔中。在每個(gè)pcr反應(yīng)中使用陽性對(duì)照和無模板陰性對(duì)照。土壤桿菌dna對(duì)照品在te緩沖液中以1:100稀釋以產(chǎn)生清晰的帶，pcr板用密封墊(costar#6555)和滾輪，在bioradptc-100熱循環(huán)儀上進(jìn)行pcr。熱循環(huán)程序如下：1)95℃-3min；30個(gè)循環(huán)95℃-30sec，55℃-30sec，72℃-45sec；72℃-5min；10℃(保持)，和2)90℃30min和10℃(保持)。將每個(gè)12微升的pcr反應(yīng)物加入到readyagarose96plus凝膠-3％(biorad#161-3062)上并在約100v下電泳20分鐘，然后用配備quantityone軟件的biorad凝膠系統(tǒng)觀察。快速負(fù)載的50bpdna梯狀條帶(nebn0473s)用于鑒定pcr片段的大小。使用10×tbe緩沖液(promegav4251)。使用傅里葉變換近紅外(ft-nir)技術(shù)在線監(jiān)測(cè)活玉米葉的淀粉含量：玉米葉組織中的淀粉含量是動(dòng)物飼料和生物燃料生產(chǎn)的重要因素。常用的gopod測(cè)定不適用于在活組織中的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，因?yàn)樵摐y(cè)定是侵入性的，需要物理組織樣品，以及密集的勞動(dòng)?；谔烊坏矸酆陀衩兹~淀粉或玉米粉(濕和干)的干混物的ft-nir光譜的淀粉含量的預(yù)測(cè)模型使用偏最小二乘回歸來進(jìn)行研發(fā)。三個(gè)關(guān)鍵因素決定了ft-nir技術(shù)成功應(yīng)用于快速化學(xué)表征：準(zhǔn)確和可重復(fù)的近紅外光譜采集、可靠的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)和穩(wěn)健的化學(xué)計(jì)量分析。為了分析，使用以下材料：分光光度計(jì)(perkinelmerspectrumonents沃爾瑟姆，馬薩諸塞州)、(版本10.2.，camosoftware公司，伍德布里奇，新澤西州)、烘箱、hi-maize抗性淀粉(honeyville，布里格姆市，猶他州)和淀粉(產(chǎn)品編號(hào)s516-500，fisherscientific)。使用去離子水將所有空白和測(cè)試樣品稀釋10倍，并使用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶(gopod)比色測(cè)定法(megazymeinternational，威克洛，愛爾蘭)測(cè)定未反應(yīng)的淀粉含量。樣品制備：通過將一定重量比例的抗性淀粉(honeyville，布里格姆市，猶他州)與淀粉(產(chǎn)品編號(hào)s516-500，fisherscientific)混合以制備共計(jì)56個(gè)具有0-33％淀粉含量的干淀粉混合物樣品。honeyville產(chǎn)品含有從通過傳統(tǒng)植物育種產(chǎn)生的高直鏈淀粉玉米雜種中分離的hi-maize260(ingredion，布里奇沃特，紐澤西州)抗性淀粉，并且含有33％可消化的或血糖淀粉。收集來自不同活的玉米植物的在一定年齡或具有不同淀粉積累的150個(gè)綠葉樣品。將100個(gè)樣品烘干并將50個(gè)樣品未干燥(“濕”)。將葉片樣品研磨至0.5mm并儲(chǔ)存在塑料樣品袋中用于濕度平衡。使用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量水分含量。淀粉測(cè)定：使用gopod測(cè)定分析淀粉共混物、濕和干綠色組織或玉米粉樣品的淀粉含量。ft-nir光譜的掃描、處理和分析：掃描-將大約5g碾磨的樣品倒入較小的nira杯中，調(diào)平，并在每次掃描之間手動(dòng)旋轉(zhuǎn)掃描16次。用單獨(dú)的子樣品重復(fù)該程序5次，并將得到的光譜掃描取平均值。共計(jì)56個(gè)淀粉共混物樣品用于建立淀粉模型。在校準(zhǔn)設(shè)置中使用36個(gè)樣本，在驗(yàn)證設(shè)置中使用14個(gè)樣本，在測(cè)試設(shè)置中使用6個(gè)樣本。使用100個(gè)玉米葉或種子樣品建立干粉碎的綠色組織或粉末模型。對(duì)于校準(zhǔn)、驗(yàn)證和測(cè)試，分別使用72、20和8個(gè)樣品。使用49個(gè)玉米葉或玉米種子樣品建立濕磨玉米模型。36個(gè)樣品用于校準(zhǔn)，10個(gè)樣品用于驗(yàn)證，并且3樣品用于測(cè)試設(shè)置。使用ft-nir光譜-(版本10.2.，camosoftware公司，伍德布里奇，新澤西州)的處理和分析來處理和分析光譜數(shù)據(jù)，建立和驗(yàn)證校準(zhǔn)，并測(cè)試回歸模型。使用乘法散射校正(msc)和基于二階導(dǎo)數(shù)的平滑技術(shù)，例如，savitzky-golay(sg)技術(shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。使用msc與sg二階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理光譜數(shù)據(jù)組合的部分最小二乘模型被研發(fā)用于淀粉共混物和碾磨的綠色組織或磨碎的玉米。表2中顯示了校準(zhǔn)、驗(yàn)證和測(cè)試樣品的測(cè)量和預(yù)測(cè)(msc+二階導(dǎo)數(shù)模型)淀粉含量的實(shí)施例。表2測(cè)量的和預(yù)測(cè)的(msc+二階導(dǎo)數(shù)模型)校準(zhǔn)、驗(yàn)證和測(cè)試樣品的淀粉含量r2：淀粉共混物：校準(zhǔn)：0.98，驗(yàn)證：0.97，預(yù)測(cè)：0.97干玉米粉：校準(zhǔn)：0.86，驗(yàn)證：0.80，預(yù)測(cè)：0.80濕玉米粉：校準(zhǔn)：0.94，驗(yàn)證：0.80，預(yù)測(cè)：0.75實(shí)施例4在玉米和高粱gwd基因中大范圍核酸酶誘導(dǎo)的dna突變的鑒定和表征目標(biāo)基因(goi)陽性玉米和高粱轉(zhuǎn)化體的鑒定：從使用pag4715或pag4716轉(zhuǎn)化的玉米和高粱植物的葉子取樣，提取dna，并篩選存在被包含在pag4715或pag4716中的大范圍核酸酶轉(zhuǎn)基因。玉米和高粱轉(zhuǎn)化體的篩選：使用pcr擴(kuò)增的gwddna序列的序列分析，篩選分別攜帶pag4715或pag4716轉(zhuǎn)基因的被稱為4715或4716植物的gwd突變。gwd的pcr擴(kuò)增：使用表3所示的zmgwdmega-2和sbgwdmega-2引物擴(kuò)增外顯子24上的大范圍核酸酶靶向區(qū)周圍的dna序列。表3用于基因分型4715和4716植物的引物將引物組在無核酸酶的水中稀釋至終濃度為5μm。如上所述進(jìn)行pcr反應(yīng)。使用我們的pmi55程序(95℃，2min；30個(gè)循環(huán)[95℃，30sec；55℃，30sec；72℃，45sec；72℃，8min)在eppendorfmastercyclerpros(eppendorf)上運(yùn)行pcr樣品。在bio-radreadyagarose96plusgels，tbe(#161-3062)上分離pcr樣品，并用bio-rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行可視化。圖3示出了顯示4715和4716事件的條帶或分別成功并入來自pag4715或pag4716的轉(zhuǎn)基因的凝膠的實(shí)例。參考該圖，移位的gwd條帶表明在gwd大范圍核酸酶靶向位點(diǎn)處存在潛在的插入和缺失(插入缺失，indel)，并且用星號(hào)標(biāo)記。gwdindel等位基因的dna序列表征：初始gwdpcr產(chǎn)物的測(cè)序-使用用于擴(kuò)增的相同引物(zmgwdmega-2或sbgwdmega-2)，在beckmancoultergenomics(36cherryhilldr，danvers，ma01923)上對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序允許gwd基因座、野生型、純合突變體和雜合突變體的三種不同遺傳結(jié)果之間存在差異。野生型在204或208bpgwdpcr片段內(nèi)沒有突變，純合子帶有插入缺失突變，雜合體帶有g(shù)wdpcr片段的無法解析的序列區(qū)(表明至少存在一處插入缺失)。單個(gè)gwd等位基因的克隆和測(cè)序。為了開始克隆，使用與來自雜合植物的dna相同的如上所述的引物組(zmgwdmega-2或sbgwdmega-2)，使用pcr擴(kuò)增gwd，以表征單個(gè)gwd等位基因。如上所述，通過在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行8μlpcr產(chǎn)物以確認(rèn)pcr擴(kuò)增，剩余的22μlpcr反應(yīng)物使用qiagenpcr純化試劑盒(28104；qiagen，馬里蘭州，美國(guó))進(jìn)行純化，并用30μl洗脫緩沖液(eb)洗脫。使用具有onetop10感受態(tài)大腸桿菌(k4500-01；lifetechnologies)的ta克隆試劑盒根據(jù)方案克隆純化的pcr產(chǎn)物。對(duì)于克隆過程，將4μl純化的pcr產(chǎn)物用于連接，將連接物在冰上孵育至少10min，將50μl每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)物接種在lb羧芐青霉素(50μg/ml)x-gal板上。使用無菌移液器的槍頭從每個(gè)反應(yīng)中挑取8個(gè)大腸桿菌菌落，并轉(zhuǎn)移到20μl含有羧芐青霉素的無菌液體lb中。然后使用與上述相同的引物組(zmgwdmega-2或sbgwdmega-2)和2μl每種稀釋的大腸桿菌克隆培養(yǎng)物通過pcr擴(kuò)增gwd。確認(rèn)pcr產(chǎn)物并如上所述進(jìn)行測(cè)序。表4描述了zmgwd大范圍核酸酶事件的接合性、突變類型和位置。在表4中，zmgwd突變編號(hào)為1-28。野生型(wt)植物是指兩個(gè)gwd野生型等位基因。半合子事件是指一個(gè)gwd突變體等位基因和一個(gè)gwd野生型等位基因。雜合事件是指兩個(gè)不同的gwd突變體等位基因。純合事件是指兩個(gè)相同的gwd突變體等位基因。表4zmgwd大范圍核酸酶事件的接合性和突變使用vectorntiadvance(版本11.5；lifetechnologies)將每個(gè)克隆的dna序列與野生型(wt)gwd進(jìn)行比較。比較野生型zmgwd和sbgwd的dna序列和轉(zhuǎn)基因事件，并顯示在以下文件中：zmgwd大范圍核酸酶突變體dna序列比對(duì)；zmgwd大范圍核酸酶突變蛋白序列比對(duì)；sbgwd大范圍核酸酶突變體dna序列比對(duì)；sbgwd大范圍核酸酶突變蛋白序列比對(duì)。如下所示，來自三個(gè)pcr產(chǎn)物的序列的比對(duì)表明了將玉米突變體m5和m26與野生型序列zmgwd外顯子24區(qū)分開的插入和缺失。用于zmgwd的玉米突變體m5和m26的clustalo(1.2.1)多重序列比對(duì)：zmgwd外顯子24zmgwd外顯子24zmgwd外顯子24zmgwd外顯子24zmgwd外顯子24zmgwd外顯子24zmgwd外顯子24zmgwd外顯子24來自28個(gè)pcr產(chǎn)物的序列的以下比對(duì)表明了區(qū)別玉米突變體m1-m4、m6-m25和m27-m29與野生型序列zmgwd外顯子24(seqidno：1(zmgwd)的3030-3243nt)的修飾(例如，缺失和插入)：用于玉米突變體m1-m4、m6-m25和m27-m29的clustalo(1.2.1)多重序列比對(duì)：zmgwd外顯子24zmgwd外顯子24zmgwd外顯子24分析來自29個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米事件和野生型植物的gwd的氨基酸序列，并且顯示在野生型zmgw(seqidno：185)蛋白中在氨基酸1040-1120位置的缺失和插入，將該蛋白與以下玉米突變體區(qū)分開：zmgwd_m1(seqidno：45)、zmgwd_m2(seqidno：46)、zmgwd_m3(seqidno：47)、zmgwd_m4(seqidno：48)、zmgwd_m5(seqidno：49)、zmgwd_m6(seqidno：50)、zmgwd_m7(seqidno：51)、zmgwd_m8(seqidno：52)、zmgwd_m9(seqidno：53)、zmgwd_m10(seqidno：54)、zmgwd_m11(seqidno：55)、zmgwd_m12(seqidno：56)、zmgwd_m13(seqidno：57)、zmgwd_m14(seqidno：58)、zmgwd_m15(seqidno：59)、zmgwd_m16(seqidno：60)、zmgwd_m17(seqidno：61)、zmgwd_m18(seqidno：62、zmgwd_m19(seqidno：63)、zmgwd_m20(seqidno：4)、zmgwd_m21(seqidno：65)、zmgwd_m22(seqidno：66)、zmgwd_m23(seqidno：67)、zmgwd_m24(seqidno：68)、zmgwd_m25(seqidno：69)、zmgwd_m26(seqidno：70)、zmgwd_m27(seqidno：71)、zmgwd_m28(seqidno：72)和zmgwd_m29(seqidno：73)。zmgwd(seqidno：43)氨基酸1040-11120的clustalo(1.2.1)多重序列比對(duì)：對(duì)于高粱，使用兩個(gè)大范圍核酸酶構(gòu)建體產(chǎn)生gwd突變，4715和4716。第一代(t0)轉(zhuǎn)化的植物可以產(chǎn)生純合的gwd突變體、半合子(wt+突變)gwd突變體或雜合(兩個(gè)不同的突變體，例如，等位基因1+等位基因2)gwd突變體。使用以下縮寫：del＝缺失；ins＝插入；sub＝取代；sbgwdcds是野生型序列。例如，序列名“sb4715_1(wt+ins)”具有以下含義：sb4715是高粱中的構(gòu)建體；1是轉(zhuǎn)基因事件：wt+ins表明t0事件4715_1對(duì)于攜帶wtgwd等位基因和插入(ins)gwd等位基因的gwd突變是半合子的。相同的構(gòu)建體被用于玉米(zm)的轉(zhuǎn)化。高粱雙色(sb)gwd序列和高粱雙色gwd突變體sb475_1(wt+ins)和sb4715_2(wt+del)之間的clustal核酸比對(duì)顯示與野生型sbgwd序列相比突變體序列的改變。sbgwd_外顯子24序列位于sbgwd編碼序列(seqidno：2)的3030-3243nt內(nèi)。sb475_1(wt+ins)的序列含有在sbgwd的位置3139-3149中的13個(gè)核苷酸插入和在sbgwd的位置3133-3136的核苷酸取代。如下所示，來自3個(gè)pcr產(chǎn)物的序列的比對(duì)表明了區(qū)分sb4715_1(wt+ins)和sb4715_2(wt+del)與sbgwd外顯子24區(qū)域的插入和缺失。clustalo(1.2.1)多重序列比對(duì)：使用序列野生型sbgwd(seqidno：44)進(jìn)行大范圍核酸酶突變蛋白氨基酸序列的預(yù)測(cè)。實(shí)施例5.突變植物積累升高水平的綠色組織淀粉在第一代(t0)轉(zhuǎn)化的玉米和高粱gwd大范圍核酸酶植物中測(cè)定淀粉。收集組織、干燥并研磨成細(xì)粉末。通過標(biāo)準(zhǔn)方法(smithamandzeemansc，quantificationofstarchinplanttissues(2006)natprotocols1：11342-1345，其通過引用并入本文，如同完整闡述)測(cè)定淀粉含量。通過改編來自megazyme國(guó)際愛爾蘭有限公司(megazyme試劑盒和試劑；貨號(hào)k-tsta)的方案測(cè)定總淀粉含量。簡(jiǎn)單地說，建立85℃和50℃的加熱塊。將5至15mg干燥的碾磨組織置于1.5ml防沸騰微量離心管中。向每個(gè)管中加入1毫升70％乙醇，渦旋混合樣品并沉淀。向每個(gè)樣品中加入400微升溶液1。所述溶液1含有1ml的熱穩(wěn)定性α-淀粉酶和29ml的100mm乙酸鈉緩沖液，ph5.0。將樣品重懸并渦旋。將樣品在85℃下孵育12分鐘，并在室溫下冷卻5分鐘。將300微升的gopod試劑(megazyme試劑盒，貨號(hào)k-tst)預(yù)先加入至平底96孔測(cè)定板的每個(gè)孔中。將10微升樣品加入到每個(gè)孔中，并與也被加入至它們各自孔中的1μl，5μl，10μl和20μl葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(1mg/ml)相比較。將板在50℃下孵育20min。在510nm測(cè)定吸光值。參考圖4。圖4顯示了與野生型植物wt_195、wt_18和wt_6相比，突變體4715_20(兩個(gè)突變體等位基因)、4716_7(m1)、4716_1(m1)、4716_18(m20)、4716_12(m3/m8)、4716_23(m15)、4716_28(未表征)、4716_3m9/m6)、4716_22(m5/m11)、4716_24(m2/m14)、24716_25(m10/m28)、4716_15(m11/m12)、4716_5(m7/m11)、4716_6(m4/m14)、4716_27(m11/m10)、4716_4(m11/m12)、4716_26(m11/m12)、4716_2(m15)、4716_13(m14)、4716_13(m14)、4716_11(m11/m10)、4716_8(m11)、4716_10(m11/m10)和4716_14(m13)具有升高的淀粉水平。許多純合和雜合事件在葉中表現(xiàn)出大于20重量％的淀粉增加量。基于不同組織中淀粉積累的加權(quán)平均值，我們估計(jì)總植物淀粉(不包括谷物)為約10％(重量/重量)。使用rna干擾技術(shù)，先前在玉米中觀察到的水平顯著升高，盡管在那些實(shí)驗(yàn)中測(cè)量到低轉(zhuǎn)錄豐度。這是令人驚訝的結(jié)果，因?yàn)轭A(yù)期基于rnai的沉默在植物中將式明顯的并且具有與基因缺失或敲除策略相同的效果。圖5顯示了所選擇的半合、純合和雜合事件的綠色組織淀粉。圖5顯示了轉(zhuǎn)基因玉米事件m17(4715_14)、m18(4715_15)、m1(4716_1)、m20(4716_18)、m3/m12(4716_12)、m9(4716_3)、m7/m11(4716_5)、m4/m14(4716_6)、m11/m12(4716_4)、m15(4716_2)、m14(4716_13)、m11(4716_8)、m11/m10(4716_10)、m13(4716_14)與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誻t(4716_9)相比，具有升高的淀粉水平。觀察到數(shù)個(gè)事件(4716_13(m14)、4715_15(m11/m12)和4716_6(m4/m14)具有高于平均的生物質(zhì)的量。實(shí)施例6.gwd敲除(gwdko)的穗軸具有升高的淀粉水平t0gwdko和野生型(wt)玉米突變體品系自交，培育至成熟，干燥，并進(jìn)行橫切以進(jìn)行染色。將穗軸切片用lugol's溶液(5％ki)染色4min，并用h2o過夜脫色。分析突變事件4716_13、4716_26、4716_167、4716_164、4716_9和4716-153的淀粉含量。結(jié)果如表5所示。表5突變品系中的淀粉含量構(gòu)建體_事件接合性綠色組織淀粉秸稈淀粉4716_13純合子229.738.54716_26雜合子220.735.34716_167雜合子112.031.74716_164半合子30.54.04716_9野生型18.88.44716_153野生型5.71.2參考表5和圖6，表明與半合子(4716_164)和野生型(4716_9和4716_153)穗軸相比，純合的(4716_13)和雜合的(4716_26和4716_167)穗軸具有加深的淀粉染色。實(shí)施例7.crispr/cas玉米轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建為了構(gòu)建cas9表達(dá)盒，選擇含有n端和c端at核定位序列(nls)的化膿性鏈球菌cas9蛋白序列以及緊接在第一個(gè)atg密碼子之后的3xflag序列(jiangetal.，2013)(seqidno：74)用于在玉米中表達(dá)。在玉米中表達(dá)的含有兩個(gè)sv40核定位序列(以粗體字母表示)和3xflag序列在n-末端部分(下劃線序列)的化膿性鏈球菌cas9的序列如下所示：mdykdhdgdykdhdtdykddddkmagthgvpaadkkysigldigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggdrgg(seqidno：74)將序列反向翻譯并且優(yōu)化玉米密碼子以產(chǎn)生zmcas9(seqidno：75)。優(yōu)化的zmcas9核苷酸序列由genscript合成。將zmcas9作為在玉米泛素1啟動(dòng)子(zmubi1p)和胭脂堿合酶轉(zhuǎn)錄終止子(nost)序列之間的bamhi-avrii片段克隆到pag4500中以產(chǎn)生pag4800。關(guān)于構(gòu)建sgrna盒的工作包括：1)鑒定和分離玉米rna聚合酶iii啟動(dòng)子以促進(jìn)sgrna的表達(dá)；2)sgrna支架的設(shè)計(jì)與合成；和3)選擇靶基因和該基因內(nèi)的20bp特異性序列，用于將cas9核酸內(nèi)切酶引導(dǎo)至其靶位點(diǎn)。在1994年，leader等報(bào)道了關(guān)于編碼u3小核rna(u3snrna)的玉米序列的首次描述，他從玉米基因組dna文庫中分離出mzu3.8基因(genebank登錄號(hào)z29641)(seqidno：76)，并表明了mzu3.8u3snrna在玉米原生質(zhì)體中表達(dá)。使用blastn算法和z29641序列搜索玉米遺傳學(xué)和基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(http://www.maizegdb.org/)，我們鑒定了標(biāo)記為zmu3(seqidno：77)的玉米u(yù)3的同源序列。所述zmu3位于玉米染色體8上并且被包含在具有核苷酸配位163620300-163621800的序列內(nèi)。mzu3.8(seqidno：78)和zmu3(seqidno：79)的推導(dǎo)啟動(dòng)子區(qū)的clustal2.1多核苷酸序列比對(duì)顯示在兩個(gè)序列之間具有93.8％的同一性。clustal2.1多重序列比對(duì)：使用pcr方法，采用正向引物ob2297(seqidno：80)和反向引物ob2299(seqidno：81)，隨后從玉米品系axb的玉米基因組dna中分離出758bp的zmu3啟動(dòng)子(zmu3p1)(seqidno：82)。正向引物ob2297在其5'端包括asisi限制性位點(diǎn)以利于將sgrna盒克隆至基于pag4500的載體中。類似地，使用在其5'端含有asisi限制性位點(diǎn)的正向引物ob2343(seqidno：83)，分離出較短的398bp形式的玉米u(yù)3啟動(dòng)子(zmu3p2)(seqidno：84)，用于測(cè)試截短的玉米u(yù)3啟動(dòng)子的效率。使用在其5'端具有swai限制酶位點(diǎn)的正向引物ob2351(seqidno：85)擴(kuò)增zmu3p2的另外的變體。此外，使用在leader等(1994)公開的mzu3.8序列上設(shè)計(jì)的長(zhǎng)引物，顯示其在玉米原生質(zhì)體中表達(dá)，合成308bp對(duì)照啟動(dòng)子片段zmu3.8p(seqidno：86)。該zmu3.8p序列還包括5'端的asisi限制性位點(diǎn)。將所有擴(kuò)增的啟動(dòng)子變體克隆到pcr-bluntii-topo載體(lifetechnologies)中，并通過完全測(cè)序證實(shí)其完整性。本文的sgrna支架設(shè)計(jì)基于sgrna嵌合體的已被公開的組織(larsonetal.,2013)，并且含有42bpcas9柄發(fā)夾(seqidno：87)，其后連有41bp化膿性鏈球菌終止子(seqidno：88)。為了提高玉米中轉(zhuǎn)錄終止的效率，從zmu3snrna(seqidno：77)中分離37bp的推導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄終止子序列zmu3t(seqidno：89)，并將其融合在化膿性鏈球菌終止子(seqidno：no：88)的下游。使用長(zhǎng)引物和具有校對(duì)讀取活性的kodxtremedna聚合酶通過pcr合成120bpsgrna支架(seqidno：90)。在兩個(gè)pcr擴(kuò)增的sgrna主鏈dna片段的3'末端添加snabi或asci限制性位點(diǎn)以利于進(jìn)一步克隆。將以這種方式合成的sgrna支架dna片段克隆到pcr-bluntii-topo載體中并驗(yàn)證序列。為了測(cè)試玉米中crispr/cas系統(tǒng)的效率，選擇編碼gwd的玉米基因用于初始靶向修飾。玉米gwd基因早期已經(jīng)被注釋過，并在正義和反義dna鏈上篩選an19ngg靶序列的存在。an19ngg序列中的5'末端“a”表示在u3rna聚合酶iii啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始處的保守的“腺嘌呤”核苷酸，位于3'末端的“ngg”序列對(duì)應(yīng)于crispr/cas系統(tǒng)活性原生質(zhì)體-相鄰基序(pam)序列。在外顯子1、24和25以及其側(cè)翼內(nèi)含子中鑒定的候選靶序列針對(duì)玉米gdb進(jìn)一步篩選，以消除在玉米基因組內(nèi)具有多重同一性命中的序列。這項(xiàng)工作已經(jīng)完成，以盡量減少crispr/cas系統(tǒng)脫靶活性的可能性。在該分析中，在larson等(2013年)提出的blastn程序中僅使用靶序列的種子序列(12bp)加上兩個(gè)相鄰的pam核苷酸。選擇外顯子1以產(chǎn)生幾乎完全的gwd敲除，而選擇外顯子24和25以產(chǎn)生缺乏由外顯子24編碼的活性位點(diǎn)的gwd變體。最終的19bpgwd靶序列(seqidno：131-134)，其被鑒定用于sgrna研發(fā)，如表6所示。表6gwd基因靶序列及其對(duì)應(yīng)的seqidno使用kodxtremedna聚合酶通過融合pcr的方式將玉米u(yù)3啟動(dòng)子的三種變體中的每一種、選擇的gwd靶序列和sgrna骨架組裝在一起，以構(gòu)建六個(gè)sgrna表達(dá)盒(seqidno：135-140)。將pcr擴(kuò)增的片段克隆到pcr-bluntii-topo載體中，并通過測(cè)序驗(yàn)證合成的sgrna表達(dá)盒的完整性。pcr合成的sgrna盒的列表如表7所示。表7合成的sgrna表達(dá)盒及其對(duì)應(yīng)的seqidnoseqidnosgrna表達(dá)盒側(cè)翼限制性位點(diǎn)95zmu3p1:sgrna_gwde24basisi-snabi96zmu3p2:sgrna_gwde24basisi-snabi97zmu3.8p:sgrna_gwde24basisi-snabi98zmu3p2:sgrna_gwde24casisi-snabi99zmu3p2:sgrna_gwde25aswai-asci100zmu3p2:sgrna_gwde1aasisi-snabi隨后將組裝的sgrna盒作為asisi-snabi片段克隆到pag4800中以構(gòu)建載體pag4804-4809(表8)。表8用于玉米crispr/case系統(tǒng)研發(fā)的載體及其seqidno通過將作為swai-asci片段的zmu3p2：sgrna_gwde25a盒克隆到pag4807中構(gòu)建一個(gè)含有兩個(gè)sgrna表達(dá)盒的另外的載體pag4817。通過將cas9核酸內(nèi)切酶靶向作用于位于玉米gwd基因和側(cè)翼外顯子24內(nèi)相距364bp的兩個(gè)不同位點(diǎn)，該載體被構(gòu)建用于完全去除gwd外顯子24。為了研發(fā)用于玉米的crisp/cas系統(tǒng)而構(gòu)建的植物轉(zhuǎn)化載體pag4800和pag4804的圖譜顯示在圖7-8中。如圖7所示，pag4800載體含有cas9表達(dá)盒和pmi表達(dá)盒。所述cas9表達(dá)盒含有核苷酸序列zmcas9(seqidno：75)。所述zmcas9是編碼cas9的化膿性鏈球菌基因的玉米密碼子優(yōu)化的序列，其被融合到兩個(gè)atnls的5'末端和3'末端以及緊接在第一個(gè)atg密碼子之后的3xflag序列。zmcas9編碼在用于在玉米中表達(dá)的氮末端部分含有兩個(gè)at核定位序列和3xflag序列的化膿性鏈球菌cas9蛋白(seqidno：74)。所述cas9盒還含有zmubi1啟動(dòng)子、zmubi1內(nèi)含子、mubqmono前導(dǎo)序列和nost終止子。所述pmi盒含有pmi基因、zmubi1啟動(dòng)子、mubqmono、zmkozak前導(dǎo)序列和nost終止子。如圖8所示，pag4804載體含有g(shù)wde24b-sgrna支架盒、cas9表達(dá)盒和pmi表達(dá)盒。所述gwde24b-sgrna支架盒含有zmu3p1啟動(dòng)子、gwded24序列、sgrna支架和zmu3t終止子。所述cas9表達(dá)盒含有在5'末端和3'末端與兩個(gè)atnls融合的zmcas9和緊接在第一個(gè)atg密碼子之后的3xflag序列。所述cas9盒還含有zmubi1啟動(dòng)子、zmubi1內(nèi)含子、mubqmono前導(dǎo)序列和nost終止子。所述pmi盒含有pmi基因、zmubi1啟動(dòng)子，mubqmono、zmkozak前導(dǎo)序列和nost終止子。實(shí)施例8.crispr/cas誘導(dǎo)的突變植物的產(chǎn)生crispr/cas和玉米nls大范圍核酸酶誘導(dǎo)的玉米gwd基因突變的鑒定和表征根據(jù)實(shí)施例3中所述的方案進(jìn)行玉米植物轉(zhuǎn)化。篩選crispr/cas誘導(dǎo)的突變，其與實(shí)施例3中描述的篩選大范圍核酸酶誘導(dǎo)的突變方法相似，除了用于基因分型的引物和識(shí)別突變。表9描述了用于crispr/cas植物基因分型的引物，包括4804-4806、4804-6引物組；將gwd24b-f替換為gwde24a-f的4809、4817和4804-6引物組和圍繞gwd大范圍核酸酶靶向區(qū)域的用于擴(kuò)增dna序列的引物，其包括4804-4807、4804-7mut引物；4817、2856/2858引物；4837-4839，371/429引物。表9用于基因分型4804、4805、4806、4817、4837、4838和4839植物和擴(kuò)增圍繞gwd外顯子24靶向區(qū)域的dna序列的引物與之前的分析類似，使用vectorntiadvance(版本11.5；lifetechnologies)將每個(gè)突變體的dna序列與wtgwd進(jìn)行比較。突變體dna序列描述于表10中。已經(jīng)產(chǎn)生了攜帶靶向作用于gwd基因區(qū)域的基因編輯構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因玉米植物，并且正在分析gwd基因的靶區(qū)域中的突變。gwd突變和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)列于表11-14中。在這些表中，攜帶兩個(gè)不同gwd突變等位基因(雜合子)的事件用-1或-2標(biāo)記，以表示單個(gè)等位基因。內(nèi)含子序列以小寫字母表示，外顯子24或25用大寫字母表示。因?yàn)閜ag4817靶向作用于zmgwd內(nèi)的兩個(gè)不同位置，所以為4817_2和4817_52提供了兩個(gè)突變。第一靶序列位于外顯子24的5'末端的上游，插入至該靶位點(diǎn)的額外的“t”顯示為在內(nèi)含子23特異的小寫字母內(nèi)的大寫字母“t”(參見m37序列)。m37是4817_2和4817_52中的相同修飾。由crispr/cas9引入的所有修飾被突出顯示(粗黑色＝插入；灰色＝缺失)，并且缺失的核苷酸由點(diǎn)顯示。刪除或插入的核苷酸的相應(yīng)數(shù)目呈現(xiàn)在表11和12的最后一列中。類似地，突出顯示m32-m39的推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列的所有改變。在翻譯閱讀框架移位和翻譯早期終止的情況下，與野生型gwd不同的所有氨基酸也被突出顯示，蛋白質(zhì)的末端用星號(hào)(*)表示。表10crispr/cas9在單個(gè)轉(zhuǎn)基因4804、4806和4817事件中誘導(dǎo)的突變突變事件和等位基因m324804_2,4804_3-2,4804_4-1,4804_5-2,4806_1m334804_3-1,4804_5-1,4804_7-1m344804_4-2m354804_6m364804_7-2m37,m384817_2m37,m394817_52表11單個(gè)4804和4806事件中crispr/cas9誘導(dǎo)的突變的核苷酸序列*野生型zmgwd是外顯子24的81-160nt的區(qū)域(seqidno：3)表12單個(gè)4817事件中crispr/cas9誘導(dǎo)突變的核苷酸序列*野生型zmgwd是外顯子24的81-160nt的區(qū)域(seqidno：3)表13在crispr/cas9突變體4804和4806中外顯子24的部分推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列*野生型zmgwd外顯子24是野生型zmgwd(seqidno：43)的1011-1057氨基酸(aa)的區(qū)域表14在crispr/cas9突變體4817中外顯子25的部分推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列**野生型zmgwd外顯子25是野生型zmgwd(seqidno：43)的1082-1116aa的區(qū)域玉米nls大范圍核酸酶誘導(dǎo)的突變的表征為了構(gòu)建玉米nls大范圍核酸酶構(gòu)建體pag4837-4839，使用來自opaque2(hicksetal.,pnas，1995)(表15)的玉米nls序列替換pag4716中的病毒sv40nls序列。觀察到玉米gwd基因的外顯子24中誘導(dǎo)的突變的大的變異。這些突變包括1至114個(gè)核苷酸的取代、缺失和插入(表16-17)。nls變體的間接評(píng)估的效率被估計(jì)為含有g(shù)wd基因的靶區(qū)域中的任何修飾的事件數(shù)除以分析的事件的總數(shù)(表15)。每個(gè)評(píng)估的nls序列支持誘導(dǎo)突變的產(chǎn)生，其中nls3和nls4是最有效的。表15含有植物來源的nls序列的大范圍核酸酶構(gòu)建體表16在4837、4838和4839事件中zmgwd基因的外顯子24中的玉米nls大范圍核酸酶誘導(dǎo)的代表性突變的列表*野生型zmgwd是seqidno：1的3157-3213nt的區(qū)域。表17在crispr/cas9突變體4837、4838和4839中外顯子24的部分推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列*野生型zmgwd外顯子24是seqidno：43的1054-1081aa的區(qū)域。綠色組織淀粉的測(cè)定測(cè)定crispr/cas和玉米nls大范圍核酸酶品系的綠葉組織中的淀粉。根據(jù)實(shí)施例3中所述的方案測(cè)定從40天齡事件收獲的葉組織的淀粉。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了我們的crispr/cas靶向系統(tǒng)和玉米nls大范圍核酸酶基因編輯構(gòu)建體的效果。表18crispr/cas和玉米nls大范圍核酸酶品系中的淀粉含量表19crispr/cas和玉米nls大范圍核酸酶4837、4838和4839品系中的淀粉含量參考表18和19，觀察到許多事件表現(xiàn)出高淀粉含量，其范圍為約3％-27.8％。實(shí)施例10.綠色組織淀粉的測(cè)定測(cè)定所有crispr/cas細(xì)胞系在綠葉組織以及干燥的秸稈葉、莖和穗軸中的淀粉。根據(jù)實(shí)施例3描述的方案測(cè)定從40天齡的crispr/cas事件收獲的葉組織的淀粉。圖9說明了pag4804玉米事件中的淀粉積累。如圖9所示，所有7個(gè)t0玉米4804事件具有高淀粉含量，其范圍為9.6-27.8％，這表明所有當(dāng)前未解析的gwd序列是兩個(gè)不同gwd突變的結(jié)果，而不是一個(gè)野生型和一個(gè)突變體等位基因(半合子)。圖10說明了pag4806玉米事件中的淀粉積累。如圖10所示，t0玉米4806事件都具有低淀粉含量，這表明一個(gè)未解析的gwd序列是半合子。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了本文的crispr/cas靶向系統(tǒng)的功效，其包括新的gwd引導(dǎo)rna靶向序列和用于表達(dá)引導(dǎo)rna的新u3啟動(dòng)子。實(shí)施例11.用于優(yōu)良近交基因滲入和測(cè)試的隱性突變的育種用于精確dna基因工程和誘變的新方法的出現(xiàn)提供了產(chǎn)生用于研發(fā)新的和具有有益植物性狀的靶向隱性突變和顯性突變的手段。這些方法中的一些包括用大范圍核酸酶、talens和crispr/cas系統(tǒng)靶向基因的特定區(qū)域。跟蹤和推進(jìn)靶向突變對(duì)性狀研發(fā)提出了新的挑戰(zhàn)，因?yàn)榕c傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植物性狀不同，它們不攜帶顯性t-dna表達(dá)盒和選擇標(biāo)記物。使用本文所述的talens、zfn、大范圍核酸酶和crispr/cas方法產(chǎn)生玉米和高粱中的靶向突變可以導(dǎo)致產(chǎn)生用于篩選和育種這些獨(dú)特植物性狀的新方法。實(shí)施例12.跟蹤和育種靶向突變轉(zhuǎn)化(t0)生成基因型：使用所述方法鑒定的基因特異性突變導(dǎo)致具有三種不同基因型中的一種的第一代轉(zhuǎn)化(t0)植物：1)一個(gè)野生型基因等位基因和一個(gè)突變等位基因，2)兩個(gè)不同的突變等位基因，或3)兩個(gè)相同的突變等位基因。這些突變型等位基因組合分別被稱為半合子、雜合子和純合子。跟蹤靶向突變的分子方法：相對(duì)于野生型序列，靶向dna突變(例如，取代、缺失、插入或組合)的特定序列的特征是，當(dāng)將突變育種至其他品系時(shí)，或通過育種擴(kuò)大現(xiàn)有品系時(shí)，可以使用本文所述的方法跟蹤。為了區(qū)分t0和t1+(來源于t0親本品系及其以后的子代)分離群體中的野生型、半合子、雜合子和純合子，可以使用至少五種方法。這些方法包括：1)使用凝膠電泳對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行pcr以進(jìn)行大小分離，2)使用限制酶消化和凝膠電泳進(jìn)行pcr以產(chǎn)生突變特異性限制模式，3)使用直接測(cè)序進(jìn)行pcr，4)使用克隆和測(cè)序進(jìn)行pcr，和5)使用結(jié)合或不結(jié)合突變位點(diǎn)的引物進(jìn)行pcr。來自野生型或工程的、改變的或優(yōu)化的內(nèi)源核酸的純合dna序列將容易通過靶向或突變區(qū)域中的pcr、大小測(cè)定和/或dna測(cè)序來分析。相反，具有不同等位基因的dna序列可能導(dǎo)致由于兩個(gè)等位基因序列(例如，野生型和突變體或兩個(gè)不同的突變體)的差異而難以使用測(cè)序、pcr或大小測(cè)定來分析的序列的一部分序列。來自這些類型的靶向事件的pcr產(chǎn)物將需要進(jìn)行克隆以分離和有效地對(duì)每個(gè)等位基因進(jìn)行測(cè)序。一旦已經(jīng)確認(rèn)了靶向突變的序列，就建立了用于跟蹤的突變特異性分子策略。如前所述，該策略將取決于突變的特征。在跟蹤本文中產(chǎn)生的gwd突變時(shí)，針對(duì)本文所述的每種突變和工程內(nèi)源(優(yōu)化的)核酸研發(fā)pcr特異性反應(yīng)。育種雜交和自交：使用轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的靶向突變產(chǎn)生的性狀的主要目標(biāo)是通過從轉(zhuǎn)基因中分離所需的突變來分離突變。這可以通過遺傳雜交來實(shí)現(xiàn)，并且通過異交(更高頻率的回收轉(zhuǎn)基因陰性的突變植物)是最有效的，其涉及將t0花粉交叉到非轉(zhuǎn)基因植物的雌性組分。這也可以使用自交以較低的頻率完成，其包括自花授粉(使用t0花粉授粉同一t0植株)。近緣授粉(sibbing)是另一種選擇，并且涉及兩個(gè)基因相同的植物之間的雜交，這將預(yù)期與自交的結(jié)果相同。攜帶靶向突變的t0植物可以自交以產(chǎn)生純合植物，并且根據(jù)t0接合性將導(dǎo)致不同數(shù)量和類型的子代。純合t0植物將產(chǎn)生100％純合子代，半合子t0植物對(duì)于突變等位基因以1:2:1(純合：半合子：野生型)分離，雜合t0植物將以1:2:1(純合靶向等位基因1：雜合：純合靶向等位基因2)。攜帶靶向突變的t0植物也可以異交到其他品系中，并且根據(jù)t0接合性將導(dǎo)致不同數(shù)量和類型的子代。純合t0植物將產(chǎn)生100％半合子代，半合子t0植物將產(chǎn)生50％半合子代和50％野生型子代，雜合t0植物將產(chǎn)生半合子代，50％具有靶向等位基因和50％具有靶向等位基因2。因?yàn)樗衪0植物都攜帶轉(zhuǎn)基因，轉(zhuǎn)基因插入位置是最常見的不同，并且轉(zhuǎn)基因插入的數(shù)目可以不同，所以轉(zhuǎn)基因的分離模式在每個(gè)t0轉(zhuǎn)化事件/植物之間具有顯著變化的可能性。為了鑒定轉(zhuǎn)基因陰性植物，可以將pcr應(yīng)用于與t0植物進(jìn)行任意雜交(自交、近緣或異交)的子代。轉(zhuǎn)基因陰性植物將通過不存在轉(zhuǎn)基因特異性pcr產(chǎn)物來鑒定。然后使用在t0植物的初始表征期間定義的分子診斷方法篩選轉(zhuǎn)基因陰性植物的靶向突變。然后可以保持和培育從轉(zhuǎn)基因分離的靶向突變，用于測(cè)試和基因滲入(introgressions)，繼續(xù)使用性狀特異性分子診斷方案。用于靶向突變的跟蹤和育種程序的實(shí)例：本文描述了用于靶向突變的分子跟蹤和育種過程。本文描述了來自玉米(m20，來自事件4716_164的zmgwd_m20)的gwd基因的跟蹤。該部分內(nèi)容和其他大范圍核酸酶誘導(dǎo)的玉米和高粱中的靶向突變的產(chǎn)生和初始序列表征已經(jīng)在本文的實(shí)施例中描述。t04716_164植物最初對(duì)m20突變是半合的，并攜帶未知數(shù)量的t-dna插入。m20突變是在zmgwd的外顯子24中的隱性單堿基對(duì)(bp)缺失，其導(dǎo)致在野生型序列中的mluci限制酶位點(diǎn)處的突變。這種小尺寸缺失需要使用具有凝膠電泳的mlucirflp，因?yàn)槠洳荒軆H通過凝膠電泳與野生型區(qū)分。圖11顯示了來自于玉米事件4716_164的靶向突變m20的自交和異交的示意圖。如圖11所示，t04716_164植物自交和異交，分別產(chǎn)生用于功效測(cè)試和基因滲入的子代。為了鑒定來自t0自交親本的純合m20子代，使用大范圍核酸酶靶向基因和gwd基因的靶區(qū)域進(jìn)行pcr。圖12顯示了來自自交t04716_164m20植物的t1子代的基因分型。如圖12所示，來自大范圍核酸酶goi和zmgwd靶區(qū)域的pcr產(chǎn)物使用mluci消化，在5％聚丙烯酰胺上分離并使用溴化乙錠染色。這顯示了不攜帶t-dna(大范圍核酸酶)但對(duì)于m20是純合的植物。維持這些植物用于測(cè)試。為了鑒定來自t0異型親本的半合子m20子代，進(jìn)行選擇性標(biāo)記基因、pmi、大范圍核酸酶基因和靶區(qū)域的pcr，然后進(jìn)行3％瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色。這也允許鑒定t-dna陰性植物。圖13顯示了來自異型t04716_164m20植物的t1子代的基因分型。然后對(duì)來自t-dna陰性植物的相同pcr產(chǎn)物進(jìn)行mluci限制性消化，并在使用溴化乙錠染色的5％聚丙烯酰胺凝膠上將它們分離。圖14說明來自異型4716_164m20植物的t1子代的基因分型。維持這些植物用于進(jìn)一步基因滲入和將來的測(cè)試。參考文獻(xiàn)an,getal.,2005.reversegeneticapproachesforfunctionalgenomicsofrice.plantmolecularbiology,59(1),pp.111–23.在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16217606[accessedjuly25,2012]可以獲得。arnoulds,perezc,cabaniolsjp,smithj,goublea,grizots,epinatjc,duclerta,duchateaup,paquesf.(2007)engineeredi-creiderivativescleavingsequencesfromthehumanxpcgenecaninducehighlyefficientgenecorrectioninmammaliancells.j.mol.biol.371:49–65.arnoulds,delendac,grizots,desseauxc,paquesf,silvagh,smithj.(2011)thei–creimeganucleaseanditsengineeredderivatives:applicationsfromcellmodificationtogenetherapy.proteineng.des.sel.24:27–31.belhajk,chaparro-garciaa,kamouns,nekrasovv.(2013)plantgenomeeditingmadeeasy:targetedmutagenesisinmodelandcropplantsusingthecrispr/cassystem.plantmethods9:39-48.bochj.&bonasu.(2010)xanthomonasavrbs3family-typeiiieffectors:discoveryandfunction.annu.rev.phytopathol.48:419–436.cermakt,doyleel,christianm,wangl,zhangy,schmidtc,ballerja,somianv,bogdanoveaj,voytasdf.(2011)efficientdesignandassemblyofcustomtalenandothertaleffector-basedconstructsfordnatargeting.nucleicacidsres.39:e82chi-hamcletal.,2010.theintellectualpropertylandscapeforgenesuppressiontechnologiesinplants.naturebiotechnology,28(1):32-36.christian,metal.,2010.targetingdnadouble-strandbreakswithtaleffectornucleases.genetics,186(2),pp.757–61.在http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi？artid＝2942870&tool＝pmcentrez&rendertype＝abstract[accessedjuly14,2012]可以獲得。congl,ranfa,coxd,lins,barrettor,habibn,hsupd,wux,jiangw,marraffinila,zhangf.(2013)multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.science339:819–823.djukanovicv,smithj,lowek,yangm,gaoh,joness,nicholsonmg,westa,lapej,bidneyd,falcosc,jantzd,lyznikla.(2013)male-sterilemaizeplantsproducedbytargetedmutagenesisofthecytochromep450-likegene(ms26)usingare-designedi–creihomingendonuclease.theplantjournal76:888–899.elkoninla,pakhaomovanv.(2000)influenceofnitrogenandphosphorusoninductionembryogeniccallusofsorghum.plantcelltissueandorganculture61:115-123.frizzia&huangs,2010.tappingrnasilencingpathwaysforplantbiotechnology.plantbiotechnologyjournal,8(6),pp.655–77.在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20331529[accessedjuly24,2012]可以獲得。gaoz,xiex,lingy,muthukrishnans,lianggh.(2005)agrobacteriumtumefaciens-mediatedsorghumtransformationusingamannoseselection.plantbiotechnologyjournal,3,pp.591-599.garcia-bustosj,heitmanj,hallmn(1991)nuclearproteinlocalization.biochimbiophysacta1071:83-101.gasiunasg,barrangour,horvathp,siksnysv.(2012)cas9–crrnaribonucleoproteincomplexmediatesspecificdnacleavageforadaptiveimmunityinbacteria.procnatlacadsciusa.109(39):2579-2586.goujonmetal.,2010anewbioinformaticsanalysistoolsframeworkatembl-ebi(2010)nucleicacidsresearchjul,38suppl:w695-9doi:10.1093/nar/gkq313heathpj,stephenskm,monnatrjjr.,stoddardbl.(1997)thestructureofi-crel,agroupiintron-encodedhomingendonuclease.nat.struct.biol.4:468-76.jinekm,chylinskik,fonfarai,hauerm,doudnaja,charpentiere.(2012)aprogrammabledual-rna-guideddnaendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.science337:816–821.joungjk&sanderjd.(2013)talens:awidelyapplicabletechnologyfortargetedgenomeediting.naturereviews(molcellbiol)14:49-55.kalderond,richardsonwd,markhamaf,smithae(1984)sequencerequirementsfornuclearlócationofsimianvirus401argetantigen.nature311:33-38.larkinmaetal.,2007clustalwandclustalxversion2bioinformatics,23(21):2947-2948.doi:10.1093/bioinformatics/btm404larsonmh,gilbertla,wangx,limwa,weissmanjs,qils.(2013)crisprinterference(crispri)forsequence-specificcontrolofgeneexpression.nat.protoc.8(11):2180-2196.leaderdj,connellys,filipowiczw,brownjws.(1994)characterisationandexpressionofamaizeu3snrnagene.biochimicaetbiophysicaacta1219:145-147.liangz,zhangk,chenk,gaoc.(2014)targetedmutagenesisinzeamaysusingtalensandthecrispr/cassystem.journalofgeneticsandgenomics41:63-68.lit,huangs,jiangwz,wrightd,spaldingmh,weeksdp,yangb.(2011)talnucleases(talns):hybridproteinscomposedoftaleffectorsandfokidna-cleavagedomain.nucleicacidsres.39:359–372.maniatist,fritschefandj.sambrookj,1982.molecularcloningcoldspringharborlaboratory.puchtah,du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