本發(fā)明尤其涉及作為抗炎劑的化合物(例如，通過抑制以下家族的一個或多個成員：p38促分裂原活化蛋白激酶家族(在本文中稱為p38map激酶抑制劑)，例如其α激酶亞型；syk激酶；和酪氨酸激酶的src家族)。本發(fā)明還涉及該化合物在療法中的用途，包括在單一療法和組合療法中的用途，尤其是在治療炎性疾病中的用途，所述炎性疾病包括肺(例如哮喘和慢性阻塞性肺病(copd))、眼(例如葡萄膜炎或干燥性角結(jié)膜炎(干眼疾病，亦稱為干眼癥(xerophthalmia)))和胃腸道(例如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)的炎性疾病。

本說明書中明顯在先公布的資料的列表或論述不應(yīng)必然被認為承認所述資料是現(xiàn)有技術(shù)的一部分，或者是公知常識。

已鑒定了四種p38mapk同種型(分別為α、β、γ和δ)，各自顯示不同的組織表達模式。發(fā)現(xiàn)p38mapkα和β同種型普遍存在于整個身體中，存在于許多不同的細胞類型，和受許多先前描述的小分子量化合物抑制。由于這些同種型的廣泛的組織分布(其導(dǎo)致所述化合物的脫靶作用)所致，早期類型的抑制劑是高度毒性的。一些更近期鑒定的抑制劑顯示對p38mapkα和β同種型改進的選擇性和具有更寬的安全限度。

認為p38map激酶在許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用，所述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與引發(fā)和維持人類疾病的慢性、持續(xù)性炎癥，所述疾病例如嚴重哮喘、copd和炎性腸病(ibd)。目前有大量文獻證實，p38map激酶被許多促炎細胞因子活化，并且其活化導(dǎo)致更多促炎細胞因子的募集和釋放。事實上，來自一些臨床研究的數(shù)據(jù)證實在用p38map激酶抑制劑治療期間患者的疾病活動的有益改變。例如，smith描述了p38map激酶抑制劑對tnfα(而不是il-8)從人pbmc釋放的抑制作用(smith,s.j.,br.j.pharmacol.,2006,149:393-404)。

還提出了p38map激酶抑制劑在治療copd和ibd中的用途。靶向p38mapkα/β的小分子抑制劑已證明在以下中有效減少炎癥的各種參數(shù)：

-獲自copd患者的細胞和組織，所述患者通常是皮質(zhì)類固醇不敏感的(smith,s.j.,br.j.pharmacol.,2006,149:393-404)；

-來自ibd患者的活檢(docena,g.等,j.trans.immunol.,2010,162:108-115)；和

-體內(nèi)動物模型(underwood,d.c.等,am.j.physiol.,2000,279:l895-902;nath,p.等,eur.j.pharmacol.,2006,544:160-167)。

irusen和其同事還提示了p38mapkα/β通過降低細胞核中的糖皮質(zhì)激素受體(gr)的結(jié)合親和力而參與皮質(zhì)類固醇不敏感性的可能性(irusen,e.等,j.allergyclin.immunol.,2002,109:649-657)。已描述了用許多p38map激酶抑制劑(包括amg548、birb796、vx702、scio469和scio323)對炎性疾病的臨床研究(lee,m.r.和dominguez,c.,currentmed.chem.,2005,12:2979-2994.)。然而，妨礙p38map激酶抑制劑在治療人類慢性炎性疾病中的效用的主要障礙是在患者中觀察到的毒性。其足夠嚴重而導(dǎo)致已進行的許多化合物(包括上文具體提到的那些)從臨床開發(fā)中撤出。

copd是這樣的病況，其中據(jù)報道，基礎(chǔ)炎癥顯著抵抗吸入的皮質(zhì)類固醇的抗-炎性作用。因此，治療copd的較好的策略是開發(fā)同時具有內(nèi)在抗-炎性作用和增加copd患者的肺組織對吸入的皮質(zhì)類固醇的敏感性的能力的干預(yù)。mercado等的近期出版物(2007;americanthoracicsocietyabstracta56)證實，沉默p38mapkγ具有恢復(fù)對皮質(zhì)類固醇的敏感性的潛力。因此，在使用p38map激酶抑制劑以治療copd時，可存在對患者的雙重益處。

診斷患有哮喘或copd的許多患者持續(xù)遭受不受控制的癥狀和其醫(yī)學(xué)病況的惡化，可能導(dǎo)致住院。盡管使用最先進的目前可用的治療方案(包括吸入皮質(zhì)類固醇和長效β-激動劑的組合產(chǎn)品)，但這仍發(fā)生。在過去十年中積累的數(shù)據(jù)表明，未能有效管控肺中疾病的基礎(chǔ)炎性組分是發(fā)生惡化的最可能的原因。鑒于皮質(zhì)類固醇和特別是吸入皮質(zhì)類固醇作為治療哮喘中的抗炎劑的確立的功效，這些發(fā)現(xiàn)引起強烈的研究。得到的研究結(jié)果確定，一些環(huán)境刺激引起患者的肺中的皮質(zhì)類固醇-不敏感的炎性改變。實例是自病毒介導(dǎo)的上呼吸道感染(urti)產(chǎn)生的應(yīng)答，其在增加與哮喘和copd相關(guān)的發(fā)病率中具有特殊的意義。

先前已經(jīng)公開了抑制c-src和syk激酶兩者的活性的化合物是抗鼻病毒復(fù)制的有效試劑(charron,c.e.等,wo2011/158042)，和抑制p59-hck的化合物有效對抗流感病毒復(fù)制(charron,c.e.等,wo2011/070369)。與p38mapk的抑制一起，這些是意欲治療慢性呼吸疾病的患者的化合物所具有的特別有吸引力的性質(zhì)。

某些p38mapk抑制劑還描述為呼吸道合胞病毒的復(fù)制的抑制劑(cassl.等,wo2011/158039)。

ibd的準確病因?qū)W是不確定的，但認為受相互作用以促進針對腔內(nèi)微生物群組分的過度但弱控制的粘膜炎性應(yīng)答的遺傳和環(huán)境因素的支配。該應(yīng)答通過來自外周的炎性嗜中性粒細胞、樹突細胞和t-細胞的浸潤介導(dǎo)。因為其在炎性細胞中普遍存在的表達，p38已成為ibd模型的明顯的研究靶標。在ibd的動物模型和來自ibd患者的人活檢中研究p38抑制劑的功效的結(jié)果表明，p38可能是用于治療ibd的靶標(hove,t.ten等,gut,2002,50:507-512,docena,g.等,j.trans.immunol,.2010,162:108-115)。然而，這些發(fā)現(xiàn)與報告用p38抑制劑沒有作用的其它組不完全一致(malamutg.等,dig.dis.sci,2006,51:1443-1453)。在克羅恩患者中使用p38α抑制劑birb796的臨床研究證實具有c-反應(yīng)蛋白水平改善的潛在臨床益處。然而該改善是暫時的，第8周時返回基線(schreiber,s.等,clin.gastro.hepatology,2006,4:325-334)。在嚴重克羅恩病的患者中研究cni-1493(一種p38和jnk抑制劑)的功效的小型臨床研究顯示在8周期間臨床評分的顯著改善(hommes,d.等gastroenterology.2002122:7-14)。

已知t細胞在介導(dǎo)胃腸道的炎癥中起重要作用。powrie和其同事的先驅(qū)工作證實，幼稚cd4+細胞轉(zhuǎn)移至嚴重缺乏免疫力的免疫缺陷(scid)動物中導(dǎo)致發(fā)生依賴于共生細菌的存在的結(jié)腸炎(powrief.等intimmunol.19935:1461-71)。此外，來自ibd患者的粘膜的研究顯示cd4+細胞的增量調(diào)節(jié)，所述細胞為th1(ifng/il-2)或th2(il5/tgfb)偏好的，這取決于患者患有克羅恩病還是潰瘍性結(jié)腸炎(fussij.等jimmunol.1996157:1261-70.)。類似地，已知t細胞在眼的炎性病癥中起重要作用，數(shù)個研究結(jié)果報告了在貝切特(be?hets)患者的血清中t細胞相關(guān)細胞因子(il-17和il-23)的水平增加(chiw.等investophthalmolvissci.200849:3058-64)。支持這些觀察結(jié)果，direskeneli和其同事證實，在貝切特患者的外周血中th17細胞增加和treg細胞減少(direskenelih.等jallergyclinimmunol.2011128:665-6)。

一種抑制t細胞活化的方法是靶向參與t細胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的活化的激酶。已知syk和src家族激酶在該途徑中起重要作用，其中src家族激酶fyn和lck是在t細胞受體下游待活化的第一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(barberek.等pnas1989,86:3277-81)。它們啟動t細胞受體的酪氨酸磷酸化，導(dǎo)致syk家族激酶zap-70的募集。動物研究顯示，zap-70敲除產(chǎn)生scid表型(chanac.等science.1994,10;264(5165):1599-601)。

用syk抑制劑fostamatinib的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的臨床試驗證實syk作為抗炎靶標的潛力，其中患者顯示臨床結(jié)果改善和il-6和mmp-3的血清水平降低(weinblattme.等arthritisrheum.200858:3309-18)。syk激酶在造血系統(tǒng)的細胞中廣泛表達，最顯著是在b細胞和成熟t細胞中。通過與基于免疫受體酪氨酸的活化基序(itam)相互作用，它在調(diào)節(jié)t細胞和b細胞擴大以及在炎性細胞中介導(dǎo)免疫-受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。syk活化導(dǎo)致il-6和mmp釋放–通常發(fā)現(xiàn)在炎性病癥包括ibd和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中增量調(diào)節(jié)的炎性介質(zhì)(wangyd.等worldjgastroenterol2007;13:5926-5932,litinskyi等cytokine.2006jan33:106-10)。

除了在控制促-炎性途徑的活性的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件中起重要作用之外，目前還認識到，激酶調(diào)節(jié)多種細胞功能的活性，包括dna完整性的保持(shilo,y.naturereviewscancer,2003,3:155-168)和細胞分裂的復(fù)雜過程的共協(xié)調(diào)。事實上，已發(fā)現(xiàn)某些激酶抑制劑(所謂的“olaharski激酶”)改變體外微核形成的頻率(olaharski,a.j.等,ploscomput.biol.,2009,5(7),e1000446;doi:10.1371/journal.pcbi.1000446)。微核形成涉及有絲分裂過程的中斷或與之相關(guān)，因此是不合需要的。發(fā)現(xiàn)糖原合酶激酶3α(gsk3α)的抑制是特別重要的因素，其增加激酶抑制劑促進微核形成的可能性。此外，已報道用rnai抑制激酶gsk3β促進微核形成(tighe,a.等,bmccellbiology,2007,8:34)。

盡管有可能通過將劑量最優(yōu)化和/或通過改變分子的給藥途徑來減弱olaharski激酶例如gsk3α的抑制的不良作用，但鑒定其它在治療上有用的分子將是有利的，所述分子具有低的或可忽略的olaharski激酶例如gsk3α的抑制和/或具有低的或可忽略的有絲分裂過程的中斷(例如，在有絲分裂測定法中所測量)。

公開了抑制一種或多種激酶的多種化合物，包括脲衍生物。這樣的化合物的實例可見于wo99/23091,wo00/041698,wo00/043384,wo00/055139,wo01/36403,wo01/4115,wo02/083628,wo02/083642,wo02/092576,wo02/096876,wo2003/005999,wo2003/068223,wo2003/068228,wo2003/072569,wo2004/014870,wo2004/113352,wo2005/005396,wo2005/018624,wo2005/023761,wo2005/044825,wo2006/015775,wo2006/043090,wo2007/004749,wo2007/053394,wo2013/050756,wo2013/050757,wo2014/027209,wo2014/033446,wo2014/033447,wo2014/033448,wo2014/033449,wo2014/076484,wo2014/140582wo2014/162121,wo2014/162122,wo2014/162126和wo2015/092423。其它實例可見于在以下中公開的論文：

-curr.opin.drugdevel.(2004,7(5),600-616)；

-j.med.chem.(2007,50,4016-4026;2009,52,3881-3891；和2010,53,5639-5655)；

-bioorg.med.chem.lett.(2007,17,354–357;2008,18,3251-3255；2009,19,2386-2391；和2010,20,4819-4824)；

-curr.top.med.chem.(2008,8,1452-1467)；

-bioorg.med.chem.(2010,18,5738-5748)；

-eur.j.pharmacol.(2010,632,93-102)；

-j.chem.inf.model.(2011,51,115-129)；和

-br.j.pharmacol.(2015,172,3805–3816)。

盡管如此，對鑒定和開發(fā)新的激酶抑制劑仍存在需要，特別是適合治療炎癥的替代的p38map激酶抑制劑。尤其需要這樣的抑制劑，其相對于目前可用的治療具有改進的治療潛力，或者具體而言，其顯示優(yōu)良的治療指數(shù)(例如，至少同樣有效的抑制劑，和在一個或多個方面，與之前的藥劑相比在相關(guān)治療劑量下具有更少毒性的抑制劑)。

出人意料的是，目前我們發(fā)現(xiàn)，帶有苯甲酸苯胺的二芳基脲抑制p38map激酶、syk和src家族激酶中的一種或多種，因此具有良好的抗-炎性質(zhì)。

因此，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供式i的化合物，

或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物，

所述化合物在下文中可稱為"本發(fā)明的化合物"。

可提及的藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽和堿加成鹽。這樣的鹽可通過常規(guī)方式形成，例如通過將式i的化合物的游離酸或游離堿形式與一個或多個當(dāng)量的合適的酸或堿任選地在溶劑中或在介質(zhì)中(其中所述鹽為不溶的)反應(yīng)，接著使用標準技術(shù)(例如在真空中、通過冷凍干燥或通過過濾)除去所述溶劑或所述介質(zhì)。鹽還可通過交換呈鹽形式的式i的化合物的反荷離子為另一反荷離子，例如使用合適的離子交換樹脂制備。

藥學(xué)上可接受的鹽的實例包括源自無機酸和有機酸的酸加成鹽，和源自金屬的鹽。

為避免疑惑，式i的化合物可含有呈任一種其天然或非天然同位素形式的規(guī)定的原子。在該方面，可提及的本發(fā)明的實施方案包括這樣的實施方案，其中：

(a)關(guān)于式i的化合物的任何原子，所述化合物不是同位素富集或標記的；和

(b)關(guān)于式i的化合物的一個或多個原子，所述化合物是同位素富集或標記的。

本文對"同位素衍生物"的提及，涉及這兩個實施方案的第二個。在本發(fā)明的具體的實施方案中，式i的化合物是用一種或多種穩(wěn)定同位素進行同位素富集或標記的(關(guān)于化合物的一個或多個原子)。因此，可提及的本發(fā)明的化合物包括，例如用一個或多個原子例如氘等進行同位素富集或標記的式i的化合物。

式i的化合物可顯示互變異構(gòu)現(xiàn)象。所有互變異構(gòu)形式和其混合物包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

除非另外說明，否則本文定義的烷基和烷氧基可以是直鏈的，或者當(dāng)存在足夠數(shù)量(即，最少3個)的碳原子時，可以是支鏈的?？商峒暗木唧w的烷基包括例如，甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、正丁基和叔丁基?？商峒暗木唧w的烷氧基包括例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基。

除非另外說明，否則本文定義的亞烷基可以是直鏈的，或者當(dāng)存在足夠數(shù)量(即，最少2個)的碳原子時，可以是支鏈的。在本發(fā)明的具體的實施方案中，亞烷基是指直鏈亞烷基。

除非另外說明，否則芳基的連接點可以通過環(huán)系統(tǒng)的任何原子。然而，當(dāng)芳基是雙環(huán)或三環(huán)的時，它們通過芳環(huán)與分子的剩余部分連接。c6-14芳基包括苯基、萘基等?？商峒暗谋景l(fā)明的實施方案包括其中芳基是苯基的那些。

除非另外說明，否則術(shù)語"鹵代"包括提及氟代、氯代、溴代或碘代，特別是氟代、氯代或溴代，尤其是氟代或氯代。

式i的化合物具有名稱4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸，但也可稱為化學(xué)名稱4-[[4-[[4-[[5-叔丁基-3-(甲磺酰胺基)-2-甲氧基苯基]-氨基甲?；被鵠-1-萘基]氧基]-2-吡啶基]氨基]-2-甲氧基-苯甲酸。

式i的化合物的鹽的實例包括所有藥學(xué)上可接受的鹽，例如但不限于強無機酸的酸加成鹽，例如hcl、h2so4和hbr鹽(例如hcl或hbr鹽)，和強有機酸例如甲磺酸的加成鹽。

可提及的式i的化合物的具體鹽包括鹽酸鹽和鈉、銨、鈣、鎂、n-甲基葡糖胺((2r,3r,4r,5s)-6-(甲基氨基)-己烷-1,2,3,4,5-五醇)或苯乙芐胺(n-芐基-2-苯乙胺)鹽(例如，鈉或銨鹽)。

因此，可提及的本發(fā)明的實施方案包括4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸的鹽酸鹽、鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽或銨鹽。

可提及的式i的化合物的更具體的鹽包括鹽酸鹽、鈉鹽和銨鹽。

本文對本發(fā)明的化合物(式i的化合物)的提及意欲包括提及所述化合物和所述化合物的所有藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物和/或互變異構(gòu)體，除非上下文明確另外說明。在該方面，可提及的溶劑合物包括水合物。

本發(fā)明的化合物(式i的化合物)是p38map激酶(尤其是α亞型)、syk激酶和src家族激酶，例如src和lck抑制劑，因此可用于藥物，特別是用于治療炎性疾病。因此，可提及的本發(fā)明的進一步的方面包括以下內(nèi)容。

(a)藥物制劑，包含與藥學(xué)上可接受的輔劑、稀釋劑或載體混合的前文定義的式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物。

(b)組合產(chǎn)品，包含

(a)前文定義的式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物，和

(b)另一治療劑，

其中組分(a)和(b)各自與藥學(xué)上可接受的輔劑、稀釋劑或載體混合配制。

在本發(fā)明的該方面，組合產(chǎn)品可以是單一(組合)藥物制劑或分部藥盒(kitofparts)。

因此，本發(fā)明的該方面包括藥物制劑，其包含與藥學(xué)上可接受的輔劑、稀釋劑或載體混合的前文定義的式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物和另一治療劑(所述制劑在下文稱為“組合制劑”)。

還包括分部藥盒，其包含以下組分：

(i)藥物制劑，包含與藥學(xué)上可接受的輔劑、稀釋劑或載體混合的前文定義的式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物；和

(ii)藥物制劑，包含與藥學(xué)上可接受的輔劑、稀釋劑或載體混合的另一治療劑，

所述組分(i)和(ii)各自以合適于彼此聯(lián)合給予的形式提供。

因此，分部藥盒的組分(i)是上文與藥學(xué)上可接受的輔劑、稀釋劑或載體混合的組分(a)。類似地，組分(ii)是上文與藥學(xué)上可接受的輔劑、稀釋劑或載體混合的組分(b)。

(c)用于制備上文方面(a)的藥物制劑的方法，所述方法包括混合前文定義的式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物與藥學(xué)上可接受的輔劑、稀釋劑或載體的步驟。

可提及的本發(fā)明該方面的實施方案包括這樣的實施方案，其中藥學(xué)上可接受的輔劑、稀釋劑或載體是局部可接受的輔劑、稀釋劑或載體(和/或其中所述方法用于制備局部藥物制劑，即適合于局部給予的藥物制劑)。

(d)前文定義的式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物，其用于醫(yī)學(xué)用途(或用作藥物或藥劑)。

(e)前文定義的式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物，或關(guān)于本發(fā)明的方面(a)或(b)定義的藥物制劑或組合產(chǎn)品，其用于治療或預(yù)防炎性疾病。

(f)前文定義的式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物，或

關(guān)于本發(fā)明的方面(a)或(b)定義的藥物制劑或組合產(chǎn)品，

在制備用于治療或預(yù)防炎性疾病的藥物中的用途。

(g)治療或預(yù)防炎性疾病的方法，所述方法包括給予受試者有效量的

前文定義的式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物，或者

關(guān)于本發(fā)明的方面(a)或(b)定義的藥物制劑或組合產(chǎn)品。

(h)敏化受試者對皮質(zhì)類固醇的抗炎性作用的方法，所述方法包括給予所述受試者有效量的

前文定義的式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物，或者

關(guān)于本發(fā)明的方面(a)或(b)定義的藥物制劑或組合產(chǎn)品。

可提及的本發(fā)明該方面的實施方案包括這樣的實施方案，其中所述受試者是已變得對皮質(zhì)類固醇的抗炎性作用不應(yīng)的受試者。

本文提及“預(yù)防炎性疾病”包括提及在之前患有炎性疾病的受試者(例如，之前已接受所述疾病的治療，例如根據(jù)上文(g)中描述的方法的治療的受試者)中預(yù)防這樣的疾病的復(fù)發(fā)(或降低其可能性)。

因此，可提及的本發(fā)明的其它方面包括以下內(nèi)容。

(i)前文定義的式i的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物，或關(guān)于本發(fā)明的方面(a)或(b)定義的藥物制劑或組合產(chǎn)品，其用于在之前已接受炎性疾病的治療(例如，用前文定義的式i的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物，或關(guān)于本發(fā)明的方面(a)或(b)定義的藥物制劑或組合產(chǎn)品治療)的受試者中降低所述疾病的復(fù)發(fā)的可能性。

(j)前文定義的式i的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物，或

關(guān)于本發(fā)明的方面(a)或(b)定義的藥物制劑或組合產(chǎn)品，

在制備藥物中的用途，所述藥物用于在之前已接受炎性疾病的治療(例如，用前文定義的式i的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物，或關(guān)于本發(fā)明的方面(a)或(b)定義的藥物制劑或組合產(chǎn)品治療)的受試者中降低所述疾病的復(fù)發(fā)的可能性。

(k)在之前已接受炎性疾病的治療(例如，用前文定義的式i的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物，或關(guān)于本發(fā)明的方面(a)或(b)定義的藥物制劑或組合產(chǎn)品治療)的受試者中降低所述疾病的復(fù)發(fā)的可能性的方法，所述方法包括給予所述受試者有效量的

前文定義的式i的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物，或

關(guān)于本發(fā)明的方面(a)或(b)定義的藥物制劑或組合產(chǎn)品。

制劑

關(guān)于上文的方面(a)和(b)，可提及的稀釋劑和載體包括合適于胃腸外、口服、局部、粘膜和直腸給藥的那些。

上文的方面(a)和(b)的藥物制劑和組合產(chǎn)品可經(jīng)制備用于例如胃腸外、皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、玻璃體內(nèi)、眼周、眼球后、結(jié)膜下、囊下(sub-tenon)、局部眼或關(guān)節(jié)周圍給藥，特別是呈液體溶液劑、乳劑或混懸劑的形式；用于口服給藥，特別是呈片劑或膠囊劑的形式，和尤其包括目的為提供結(jié)腸靶向的藥物釋放的技術(shù)(patel,m.m.expertopin.drugdeliv.2011,8(10),1247–1258)；用于局部例如經(jīng)肺或鼻內(nèi)給藥，特別是呈粉劑、鼻滴劑或氣霧劑的形式，和經(jīng)皮給藥；用于局部眼給藥，特別是呈溶液劑、乳劑、混懸劑、軟膏劑、植入物/插入物、凝膠劑、膠凍劑或脂質(zhì)體微粒制劑的形式(ghate,d.;edelhauser,h.f.expertopin.drugdeliv.2006,3(2),275–287)；用于眼給藥，特別是呈可生物降解的和不能生物降解的植入物、脂質(zhì)體和納米粒的形式(thrimawithana,t.r.等drugdiscov.today2011,16(5/6),270–277)；用于粘膜給藥至例如頰、舌下或陰道粘膜，和用于直腸給藥，例如呈栓劑或灌腸劑的形式。

上文的方面(a)和(b)的藥物制劑和組合產(chǎn)品可合適地以單位劑型給予，并且可通過制藥領(lǐng)域眾所周知的任何方法制備，例如描述于remington'spharmaceuticalsciences,第17版,mackpublishingcompany,easton,pa.,(1985)。用于胃腸外給予的制劑可包含作為賦形劑的無菌水或鹽水、亞烷基二醇例如丙二醇、聚亞烷基二醇例如聚乙二醇、植物來源的油、氫化萘等。用于經(jīng)鼻給予的制劑可以是固體，和可以包含賦形劑，例如乳糖或葡聚糖，或可以是以鼻滴劑或計量噴霧劑的形式使用的水性或油性溶液劑。對于經(jīng)頰給藥，典型的賦形劑包括糖、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、預(yù)膠化淀粉等。

合適于口服給予的藥物制劑和組合產(chǎn)品可包含一種或多種生理學(xué)上相容的載體和/或賦形劑和可以呈固體或液體形式。片劑和膠囊劑可用以下制備：結(jié)合劑，例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨糖醇、西黃蓍膠或聚乙烯吡咯烷酮；填充劑，例如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨糖醇或甘氨酸；潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；和表面活性劑，例如月桂基硫酸鈉。液體組合物可包含常規(guī)添加劑，例如助懸劑，例如山梨糖醇糖漿、甲基纖維素、糖漿、明膠、羧甲基-纖維素或食用脂；乳化劑，例如卵磷脂或阿拉伯膠；植物油，例如杏仁油、椰子油、魚肝油或花生油；防腐劑，例如丁羥基茴香醚(bha)和丁羥基甲苯(bht)。液體組合物可包封在例如明膠中以提供單位劑型。

固體口服劑型包括片劑、雙片硬殼膠囊劑和軟彈性明膠(seg)膠囊劑。這樣的雙片硬殼膠囊劑可自例如明膠或羥丙基甲基纖維素(hpmc)制備。

干殼制劑通常包含約40%-60%w/w濃度的明膠、約20%-30%濃度的增塑劑(例如甘油、山梨糖醇或丙二醇)和約30%-40%濃度的水。其它材料例如防腐劑、染料、遮光劑和矯味劑也可存在。液體填充材料包括已經(jīng)溶解、增溶或分散的固體藥物(用助懸劑例如蜂蠟、氫化蓖麻油或聚乙二醇4000)或在載體或載體的組合(例如礦物油、植物油、甘油三酯、二醇、多元醇和表面活性劑)中的液體藥物。

本發(fā)明的化合物可局部給予(例如至肺、眼或腸)。因此，上文可提及的方面(a)和(b)的實施方案包括適合于局部給予的藥物制劑和組合產(chǎn)品。這樣的制劑包括其中賦形劑(包括任何輔劑、稀釋劑和/或載體)為局部可接受的那些。

局部給予至肺可通過使用氣霧劑制劑實現(xiàn)。氣霧劑制劑通常包含懸浮或溶解于合適的氣霧劑拋射劑(例如氟氯化碳(cfc)或氫氟化碳(hfc))中的活性成分。合適的cfc拋射劑包括三氯一氟甲烷(拋射劑11)、二氯四氟乙烷(拋射劑114)和二氯二氟甲烷(拋射劑12)。合適的hfc拋射劑包括四氟乙烷(hfc-134a)和七氟丙烷(hfc-227)。拋射劑通常包含總吸入組合物重量的40%-99.5%(例如40%-90%)。制劑可包含賦形劑，其包括共-溶劑(例如乙醇)和表面活性劑(例如卵磷脂、去水山梨糖醇三油酸酯等)。其它可能的賦形劑包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油等。氣霧劑制劑包裝在罐中，合適的劑量通過劑量閥(例如由bespak、valois或3m提供或由aptar、coster或vari提供)來遞送。

局部給予至肺還可通過使用非增壓制劑例如水性溶液劑或混懸劑實現(xiàn)。這可通過噴霧器給予，例如可手持和便攜式的噴霧器，或家用或醫(yī)院用的噴霧器(即非便攜式)。制劑可包含賦形劑，例如水、緩沖液、張度調(diào)節(jié)劑、ph調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和共-溶劑?；鞈乙后w劑和氣霧劑制劑(無論是增壓還是非增壓的)將通常包含呈細粉形式的本發(fā)明的化合物，例如d50為0.5-10μm，例如約1-5μm。粒徑分布可使用d10、d50和d90值表示。粒徑分布的d50中位值定義為以微米計的將分布分成兩半的粒徑。源自激光衍射的測量更準確地描述為體積分布，因此使用該程序獲得的d50值更有意義地稱為dv50值(體積分布的中位值)。本文所用的dv值稱為使用激光衍射測量的粒徑分布。類似地，在激光衍射的情況下使用的d10和d90值意指dv10和dv90值，指的是這樣的粒徑，其中分別地，10%的分布在d10值之下而90%的分布在d90值之下。

局部給予至肺還可通過使用干粉制劑實現(xiàn)。干粉制劑將含有呈細粉形式的本公開內(nèi)容的化合物，通常具有1-10μm的總氣體動力學(xué)中位數(shù)直徑(mmad)或0.5-10μm例如約1-5μm的d50。呈細粉形式的本發(fā)明的化合物的粉劑可通過微粉化過程或類似的尺寸減小過程制備。微粉化可使用氣流粉碎機例如由hosokawaalpine制造的那些來進行。得到的粒徑分布可使用激光衍射測量(例如用malvernmastersizer2000s儀器)。制劑將通常含有局部可接受的稀釋劑，例如乳糖、葡萄糖或甘露醇(優(yōu)選乳糖)，通常具有大的粒徑，例如50μm或更大、例如100μm或更大的mmad，或40-150μm的d50。本文所用的術(shù)語“乳糖”是指含乳糖的組分，包括α-乳糖一水合物、β-乳糖一水合物、無水α-乳糖、無水β-乳糖和無定形乳糖。乳糖組分可通過微粉化、篩分、研磨、壓制、團聚或噴霧干燥加工。還包括呈各種形式的市售可得形式的乳糖，例如lactohale^?(吸入級乳糖；dfepharma)、inhalac^?70(用于干粉吸入器的篩分乳糖；meggle)、pharmatose^?(dfepharma)和respitose^?(篩分吸入級乳糖；dfepharma)產(chǎn)品。在一個實施方案中，乳糖組分選自α-乳糖一水合物、無水α-乳糖和無定形乳糖。優(yōu)選地，乳糖是α-乳糖一水合物。

干粉制劑還可包含其它賦形劑，例如硬脂酸鈉、硬脂酸鈣或硬脂酸鎂。

干粉制劑通常使用干粉吸入器(dpi)裝置來遞送。干粉遞送系統(tǒng)的實例包括旋轉(zhuǎn)式吸入器(spinhaler)、diskhaler、turbohaler、diskus和clickhaler。干粉遞送系統(tǒng)的其它實例包括eclipse、next、rotahaler、handihaler、aeroliser、cyclohaler、breezhaler/neohaler、monodose、flowcaps、twincaps、x-caps、turbospin、elpenhaler、miathaler、twisthaler、novolizer、pressair、ellipta、oriel干粉吸入器、microdose、pulvinal、easyhaler、ultrahaler、taifun、pulmojet、omnihaler、gyrohaler、taper、conix、xcelovair和prohaler。

在一個實施方案中，本發(fā)明的化合物以微粉化的干粉制劑提供，例如進一步包含合適級別的乳糖，任選地連同硬脂酸鎂一起，填充入單劑量裝置例如aeroliser或填充入多劑量裝置例如diskus。

本發(fā)明的化合物還可經(jīng)直腸給予，例如呈栓劑或灌腸劑的形式，其包括水性或油性溶液劑以及混懸劑和乳劑。這樣的組合物按照本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標準程序制備。例如，栓劑可通過將活性成分與常規(guī)栓劑基質(zhì)(例如可可脂或其它甘油酯，例如suppocire)混合制備。在該情況下，將藥物與合適的非刺激性賦形劑混合，所述賦形劑在常溫下是固體，但在直腸溫度下是液體，因此將在直腸中熔化以釋放藥物。這樣的材料是可可脂和聚乙二醇。

一般而言，對于意欲局部給予至眼的呈眼滴劑或眼軟膏劑形式的組合物，抑制劑的總量將為約0.0001至低于4.0%(w/w)。

優(yōu)選地，對于局部眼給藥，按照本發(fā)明給予的組合物將被配制為溶液劑、混懸劑、乳劑和其它劑型。根據(jù)配制的容易性以及患者通過將1-2滴溶液滴入受累的眼睛里容易地給予這樣的組合物的能力，水性溶液劑通常是優(yōu)選的。然而，組合物也可以是混懸劑、粘稠或半粘稠凝膠劑或其它類型的固體或半固體組合物。對于難溶于水的化合物，混懸劑可為優(yōu)選的。

根據(jù)本發(fā)明給予的組合物還可包括各種其它成分，包括但不限于，張度劑、緩沖劑、表面活性劑、穩(wěn)定聚合物、防腐劑、共-溶劑和粘度構(gòu)造劑。本發(fā)明的優(yōu)選的藥物組合物包括具有張度劑和緩沖劑的抑制劑。本發(fā)明的藥物組合物還可任選地包括表面活性劑和/或姑息劑和/或穩(wěn)定聚合物。

可使用各種張度劑以調(diào)節(jié)組合物的張度，對于眼用組合物，優(yōu)選地調(diào)節(jié)至天然眼淚的張度。例如，氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、單糖例如葡萄糖、果糖、半乳糖和/或簡單多元醇例如糖醇甘露醇、山梨醇、木糖醇、拉克替醇、異麥芽糖醇、麥芽糖醇和氫化淀粉水解產(chǎn)物可加入至組合物中以接近生理張度。這樣的張度劑的量將根據(jù)待加入的具體試劑而改變。然而，一般而言，組合物具有足以導(dǎo)致最終組合物具有眼用可接受的滲透壓(通常約150-450mosm，優(yōu)選地250-350mosm和最優(yōu)選地大約290mosm)的量的張度劑。一般而言，本發(fā)明的張度劑將以2-5%w/w(例如，2-4%w/w)的范圍存在。本發(fā)明的優(yōu)選的張度劑包括單糖或糖醇，例如d-甘露醇。

合適的緩沖劑系統(tǒng)(例如，磷酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉或硼酸)可加入至組合物中以阻止在貯存條件下ph改變。具體的濃度將根據(jù)所用的試劑而改變。然而，優(yōu)選地，選擇緩沖劑以維持靶ph在ph5-8的范圍內(nèi)，和更優(yōu)選地靶ph為ph5-7，或靶ph為ph6.5-7.6。

表面活性劑可任選地用于遞送更高濃度的抑制劑。表面活性劑起增溶抑制劑和穩(wěn)定膠體分散液(例如膠束溶液、微乳液、乳液和混懸液)的作用?？扇芜x使用的表面活性劑的實例包括聚山梨醇酯、泊洛沙姆、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚乙二醇蓖麻油、泰洛沙泊、triton和脫水山梨醇單月桂酸酯。用于本發(fā)明的優(yōu)選的表面活性劑具有范圍為12.4-13.2的親水/親脂/平衡"hlb"和對于眼用是可接受的，例如tritonx114和泰洛沙泊。

例如，用于眼睛局部給藥的4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)-苯基)脲基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸或藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物的制劑可包含：

(a)水；

(b)表面活性劑(例如，聚乙二醇40硬脂酸酯)；

(c)張度劑(例如，甘露醇)；和

(d)合適的緩沖劑系統(tǒng)(例如，包含混合物磷酸二氫鹽和磷酸一氫鹽的磷酸鹽緩沖液)，其經(jīng)選擇以保持靶ph在6.5-8的范圍內(nèi)。

在這樣的局部眼用制劑中，以下的一項或多項(例如，全部)可適用：

(i)4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)-苯基)脲基)-萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸以0.001-20mg/ml(例如，0.01-10mg/ml，0.1-2mg/ml，或特別是1mg/ml)的濃度范圍存在；

(ii)表面活性劑(例如，聚乙二醇40硬脂酸酯)以1-10%w/w(例如，2-5%w/w，例如2.5-4%w/w，或特別是3%w/w)存在；

(iii)張度劑(例如，甘露醇)以1-15%w/w(例如，2-10%w/w，例如3-6%w/w，或特別是4.5%w/w)存在；

(iv)用作制劑的組分的緩沖劑系統(tǒng)是水性磷酸鹽緩沖液(例如，10mm水性磷酸鹽緩沖液)，其經(jīng)選擇以保持靶ph在6.5-8.0的范圍內(nèi)(例如，在7.0-7.8，或特別是7.2-7.6的范圍內(nèi))。

可加入本發(fā)明的眼用組合物的其它試劑是緩和劑，其起穩(wěn)定聚合物的作用。穩(wěn)定聚合物應(yīng)該是優(yōu)先用于局部眼用的離子的/帶電荷的實例，更特別地，在其表面上帶負電荷的聚合物，其可顯示(–)10–50mv的ζ-電勢而提供物理穩(wěn)定性并且能夠在水中形成分散液(即水溶性的)。本發(fā)明的優(yōu)選的穩(wěn)定聚合物是0.1–0.5%w/w的一種或多種(如果超過一種)聚電解質(zhì)，其來自交聯(lián)聚丙烯酸酯家族，例如卡波姆、聚卡波非和pemulen(r)，特別是卡波姆974p(聚丙烯酸)。

其它化合物也可加入至本發(fā)明的眼用組合物以增加載體的粘度。粘度增強劑的實例包括但不限于：多糖例如透明質(zhì)酸和其鹽、硫酸軟骨素和其鹽、葡聚糖、纖維素家族的各種聚合物、乙烯基聚合物和丙烯酸聚合物。

局部眼用產(chǎn)品通常以多劑量形式包裝。因此需要防腐劑以防止在使用時的微生物污染。合適的防腐劑包括：苯扎氯銨、氯丁醇、苯扎溴銨、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯基乙基醇、乙二胺四乙酸二鈉、山梨酸、聚季銨鹽-1或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它防腐劑。這樣的防腐劑通常以0.001-1.0%w/v的水平使用。本發(fā)明的單位劑量組合物是無菌的，但通常是不防腐的。因此，這樣的組合物通常不含防腐劑。

醫(yī)學(xué)從業(yè)者或其它技術(shù)人員將能夠確定本發(fā)明的化合物的合適的劑量，因此能夠確定應(yīng)包括在任何特定藥物制劑中的本發(fā)明的化合物的量(無論是呈單位劑型還是其它形式)。

結(jié)合上文(b)中所述的組合產(chǎn)品可提及的本發(fā)明的實施方案包括這樣的實施方案，其中其它治療劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適于治療炎性疾病(例如下文提及的特定疾病)的一種或多種治療劑。

例如，對于治療呼吸病癥(例如copd或哮喘)，其它治療劑是選自以下的一種或多種藥劑：

-類固醇(例如布地奈德、二丙酸氯地米松、丙酸氟替卡松、糠酸莫米松、糠酸氟替卡松；另一實例是環(huán)索奈德)；

-β激動劑，特別是β2激動劑(例如特布他林、沙丁胺醇、沙美特羅、福莫特羅；另一實例是維蘭特羅、奧達特羅、瑞普特羅和非諾特羅)；和

-黃嘌呤(例如茶堿)。

例如，對于治療呼吸病癥(例如copd或哮喘)，其它治療劑是選自以下的一種或多種藥劑：

-毒蕈堿拮抗劑(例如tiotropium、umeclidinium、glycopyrronium、aclidinium和daratropium，這些的任何一種例如作為溴化物鹽)；和

-磷酸二酯酶抑制劑。

此外，對于治療胃腸病癥(例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎)，其它治療劑可以是例如選自以下的一種或多種藥劑：

-5-氨基水楊酸或其前藥(例如柳氮磺吡啶、奧沙拉嗪或巴柳氮)；

-皮質(zhì)類固醇(例如潑尼松龍、甲基潑尼松龍或布地奈德)；

-免疫抑制劑(例如環(huán)孢菌素、他克莫司、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤或6-巰基嘌呤)；

-抗-tnfα抗體(例如，英夫利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗或戈利木單抗)；

-抗-il12/il23抗體(例如，ustekinumab)或小分子il12/il23抑制劑(例如，apilimod)；

-抗-α4β7抗體(例如，vedolizumab)；

-toll-樣受體(tlr)阻斷劑(例如，bl-7040;avecia(cambridge,uk))；

-madcam-1阻斷劑(例如，pf-00547659)；

-針對細胞粘連分子α4-整聯(lián)蛋白的抗體(例如，那他珠單抗)；

-針對il2受體α亞基的抗體(例如，達珠單抗或巴利昔單抗)；

-抗-smad7抗體(例如，mongersen(ged0301;全-p-周(ambo)-2'-脫氧-p-硫代鳥苷?；?(3'→5')-p-硫代胸苷?；?(3'→5')-2'-脫氧-5-甲基-p-硫代胞苷?；?(3'→5')-2'-脫氧-p-硫代鳥苷?；?(3'→5')-2'-脫氧-p-硫代胞苷?；?(3'→5')-2'-脫氧-p-硫代胞苷?；?(3'→5')-2'-脫氧-p-硫代胞苷?；?(3'→5')-2'-脫氧-p-硫代胞苷?；?(3'→5')-p-硫代胸苷?；?(3'→5')-p-硫代胸苷酰基-(3'→5')-2'-脫氧-p硫代胞苷?；?(3'→5')-p-硫代胸苷?；?(3'→5')-2'-脫氧-p-硫代胞苷?；?(3'→5')-2'-脫氧-p-硫代胞苷?；?(3'→5')-2'-脫氧-p-硫代胞苷?；?(3'→5')-2'-脫氧-5-甲基-p-硫代胞苷酰基-(3'→5')-2'-脫氧-p硫代鳥苷?；?(3'→5')-2'-脫氧-p-硫代胞苷?；?(3'→5')-2'-脫氧-p-硫代腺苷?；?(3'→5')-2'-脫氧-p-硫代鳥苷?；?(3'→5')-2'-脫氧胞苷))；

-鞘胺醇1-磷酸受體1(s1p1)調(diào)節(jié)劑(例如，ozanimod((s)-5-(3-(1-((2-羥乙基)氨基)-2,3-二氫-1h-茚-4-基)-1,2,4-噁二唑-5-基)-2-異丙氧基芐腈)、amiselimod(mt1303;2-氨基-2-{2-[4-(庚基氧基)-3-(三氟甲基)苯基]乙基}丙烷-1,3-二醇)或apd334(2-[7-[4-環(huán)戊基-3-(三氟甲基)芐基氧基]-1,2,3,4-四氫環(huán)戊[b]吲哚-3(r)-基]乙酸))；

-jak抑制劑(例如，托法替尼、baricitinib(1-(乙基磺?；?-3-[4-(7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基]-3-氮雜環(huán)丁烷乙腈)、filgotinib(n-[5-[4-[(1,1-二氧代-1,4-噻嗪烷-4-基)甲基]苯基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基]環(huán)丙烷甲酰胺)、peficitinib(4-(((1r,2r,3s,5s,7s)-5-羥基金剛烷-2-基)氨基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺)或r348(見例如us2014/0206708))；

-stat3抑制劑(例如，tak-114;(3e)-1-甲基-3-(2-氧代-1h-吲哚-3-亞基)吲哚-2-酮)；

-受體相互作用蛋白-1(rip1)激酶抑制劑(例如gsk2982772)；

-syk抑制劑和其前藥(例如，fostamatinib和r-406)；

-磷酸二酯酶-4抑制劑(例如，替托司特)；

-hmpl-004；

-益生菌；

-微生物群(microbiome)調(diào)節(jié)劑(例如sgm1019)；

-德沙拉嗪(dersalazine)；

-塞馬莫德(semapimod)/cpsi-2364；和

-蛋白激酶c抑制劑(例如aeb-071)

(例如，對于治療胃腸病癥(例如克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎)，其它治療劑可以是例如，選自以下的一種或多種藥劑：

-5-氨基水楊酸或其前藥(例如柳氮磺吡啶、奧沙拉嗪或巴柳氮)；

-皮質(zhì)類固醇(例如潑尼松龍、甲基潑尼松龍或布地奈德)；

-免疫抑制劑(例如環(huán)孢菌素、他克莫司、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤或6-巰基嘌呤)；

-抗-tnfα抗體(例如，英夫利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗或戈利木單抗)；

-抗-il12/il23抗體(例如，ustekinumab)或小分子il12/il23抑制劑(例如，apilimod)；

-抗-α4β7抗體(例如，vedolizumab)；

-madcam-1阻斷劑(例如，pf-00547659)；

-針對細胞粘連分子α4-整聯(lián)蛋白的抗體(例如，那他珠單抗)；

-針對il2受體α亞基的抗體(例如，達珠單抗或巴利昔單抗)；

-jak3抑制劑(例如托法替尼或r348)；

-syk抑制劑和其前藥(例如，fostamatinib和r-406)；

-磷酸二酯酶-4抑制劑(例如，替托司特)；

-hmpl-004；

-益生菌；

-德沙拉嗪(dersalazine)；

-塞馬莫德(semapimod)/cpsi-2364；和

-蛋白激酶c抑制劑(例如aeb-071)。

對于治療眼病癥(例如葡萄膜炎和干燥性角結(jié)膜炎(干眼))，其它治療劑可以是例如選自以下的一種或多種藥劑：

-皮質(zhì)類固醇(例如地塞米松、潑尼松龍、曲安奈德、二氟潑尼酯或氟輕松)；

-糖皮質(zhì)激素激動劑(例如，mapracorat)；

-免疫抑制劑(例如環(huán)孢菌素、voclosporin、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麥考酚酸莫酯或他克莫司)；

-抗-tnfα抗體(例如，英夫利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗、esba-105或戈利木單抗)；

-抗-il-17a抗體(例如，secukinumab)；

-mtor抑制劑(例如，西羅莫司)；

-vgx-1027；

-腺苷a3受體激動劑(例如，cf-101)；

-lifitegrast；

-il1阻斷劑(例如，ebi-005;hou等pnas2013,110(10),3913-3918)；

-rgn-259(胸腺肽β4)；

-si-614；

-otx-101；

-jnk抑制劑(例如，xg-104)；

-map激酶信號傳導(dǎo)抑制劑(例如，da-6034;{[2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-甲氧基-4-氧代色烯-7-基]氧基}乙酸)；

-粘蛋白刺激物(例如，雷巴米特;2-[(4-氯苯甲?；?氨基]-3-(2-氧代-1h-喹啉-4-基)丙酸)；

-mim-d3(tavilermide；參見例如us2013/0345395)；

-jak抑制劑(例如，托法替尼、baricitinib(1-(乙基磺酰基)-3-[4-(7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基]-3-氮雜環(huán)丁烷乙腈)、filgotinib(n-[5-[4-[(1,1-二氧代-1,4-噻嗪烷-4-基)甲基]苯基]-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基]環(huán)丙烷甲酰胺)、peficitinib(4-(((1r,2r,3s,5s,7s)-5-羥基金剛烷-2-基)氨基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺)或r348(見例如us2014/0206708))；和

-蛋白激酶c抑制劑(例如aeb-071)。

(例如，對于治療眼病癥(例如葡萄膜炎和干燥性角結(jié)膜炎(干眼))，其它治療劑可以是例如，選自以下的一種或多種藥劑：

-皮質(zhì)類固醇(例如地塞米松、潑尼松龍、曲安奈德、二氟潑尼酯或氟輕松)；

-糖皮質(zhì)激素激動劑(例如，mapracorat)；

-免疫抑制劑(例如環(huán)孢菌素、voclosporin、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麥考酚酸莫酯或他克莫司)；

-抗-tnfα抗體(例如，英夫利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗、esba-105或戈利木單抗)；

-抗-il-17a抗體(例如，secukinumab)；

-mtor抑制劑(例如，西羅莫司)；

-vgx-1027；

-腺苷a3受體激動劑(例如，cf-101)；

-lifitegrast；

-jak3抑制劑(例如托法替尼或r348)；和

-蛋白激酶c抑制劑(例如aeb-071))。

在具體的實施方案中，對于治療眼病癥(例如葡萄膜炎和干燥性角結(jié)膜炎(干眼))，其它治療劑可以是例如選自以下的一種或多種藥劑：

-皮質(zhì)類固醇(例如地塞米松、潑尼松龍、曲安奈德、二氟潑尼酯或氟輕松)；

-免疫抑制劑(例如環(huán)孢菌素、voclosporin、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麥考酚酸莫酯或他克莫司)；

-抗-tnfα抗體(例如，英夫利昔單抗、阿達木單抗、賽妥珠單抗、esba-105或戈利木單抗)；

-抗-il-17a抗體(例如，secukinumab)；

-mtor抑制劑(例如，西羅莫司)；

-vgx-1027；

-jak抑制劑(例如，托法替尼、baricitinib、filgotinib、peficitinib或r348)(例如jak3抑制劑，例如托法替尼或r348)；和

-蛋白激酶c抑制劑(例如aeb-071)。

醫(yī)學(xué)用途

本發(fā)明的化合物可用作炎性疾病的單一療法，或用于所述疾病的組合療法。

因此，上文可提及的方面(e)-(g)的實施方案包括這樣的實施方案，其中式i的化合物(或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物)是治療中使用的唯一的藥理學(xué)活性成分。

然而，在上文方面(e)-(g)的其它實施方案中，將式i的化合物(或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物或同位素衍生物)給予受試者，還給予所述受試者一種或多種其它治療劑(例如，其中所述一種或多種其它治療劑如上文關(guān)于組合產(chǎn)品所定義)。

當(dāng)用于本文時，術(shù)語"炎性疾病"特別包括提及以下的任何一種或多種：

(i)具有炎性組分的肺疾病或病癥，例如囊性纖維化、肺動脈高壓、肺結(jié)節(jié)病、特發(fā)性肺纖維變性，或者特別地，copd(包括慢性支氣管炎和肺氣腫)、哮喘或兒科哮喘；

(ii)具有炎性組分的皮膚疾病或病癥，例如特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性皮炎、接觸性皮炎或銀屑??；

(iii)具有炎性組分的鼻疾病或病癥，例如變應(yīng)性鼻炎、鼻炎或鼻竇炎；

(iv)具有炎性組分的眼疾病或病癥，例如結(jié)膜炎、過敏性結(jié)膜炎、青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病、黃斑水腫(包括糖尿病黃斑水腫)、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(crvo)、干性和/或濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)、術(shù)后白內(nèi)障炎癥，或者特別地，干燥性角結(jié)膜炎(干眼，亦稱為干眼癥)、葡萄膜炎(包括后葡萄膜炎、前葡萄膜炎和泛葡萄膜炎)、角膜移植和緣細胞移植排斥；和

(v)具有炎性組分的胃腸疾病或病癥，例如谷蛋白敏感性腸病(腹部疾病)、嗜酸性食管炎、腸移植物對抗宿主病，或者特別地，克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎。

本文對具有炎性組分的疾病的提及包括對涉及炎癥的疾病的提及，無論是否存在所述疾病的其它(非-炎性)癥狀或后果。

根據(jù)本發(fā)明的進一步的方面，提供制備式i的化合物的方法，所述方法包括：

(a)將式ii的化合物，

與式iii的化合物，

其中z¹和z²之一是式iv的結(jié)構(gòu)片段

和z¹和z²的另一個是式v的結(jié)構(gòu)片段

例如在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件下，例如在環(huán)境溫度(例如15-30℃)至約110℃的溫度下，在合適的有機溶劑(例如極性非質(zhì)子溶劑，例如dmf、thf、1,4-二噁烷或其混合物)的存在下反應(yīng)；

(b)將式iia的化合物，

其中z¹如上文所定義，與合適的疊氮化物形成劑(即離去基團和活化的疊氮化物離子的合適來源，例如疊氮磷酸二苯酯；參見例如，tetrahedron1974,30,2151–2157)在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件下，例如在亞環(huán)境溫度至環(huán)境溫度(例如自約-5至5℃的起始溫度至反應(yīng)后的環(huán)境溫度)下在胺堿(例如三乙基胺或空間位阻堿例如n,n-二異丙基乙基胺)和合適的有機溶劑(例如極性非質(zhì)子溶劑，例如dmf、thf、1,4-二噁烷或其混合物)的存在下反應(yīng)，該反應(yīng)之后無需分離，接著中間體酰疊氮化物(具有式z¹-c(o)-n3)的熱重排(例如在加熱下)，例如在環(huán)境溫度(例如15-30℃)下，以原位提供式ii的化合物，該化合物然后與上文定義的式iii的化合物反應(yīng)，提供式i的化合物；

(c)將式iib的化合物，

其中l(wèi)g¹表示合適的離去基團(例如咪唑基、氯或芳基氧基例如苯氧基)和z¹如上文所定義，與如上文定義的式iii的化合物，例如在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件下，例如在環(huán)境溫度(例如自環(huán)境溫度至80℃，例如在約60℃)下，任選地在胺堿(例如三乙基胺或空間位阻堿例如n,n-二異丙基乙基胺)和合適的有機溶劑(例如非質(zhì)子溶劑，例如二氯甲烷或酯，例如乙酸異丙酯)的存在下反應(yīng)；

(d)將式vi的化合物，

其中l(wèi)g²表示合適的離去基團(例如鹵素基團例如氯或溴)，與式vii的化合物，

例如在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件下(例如描述于j.am.chem.soc.2011,133,15686–15696)，例如在升高的溫度(例如50-110℃)下在合適的有機溶劑(例如極性非質(zhì)子溶劑，例如dmf、thf、1,4-二噁烷或其混合物)和任選酸性催化劑(例如磺酸，例如對甲苯磺酸)的存在下反應(yīng)；

(e)將式i的化合物的受保護衍生物在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件下脫保護，其中受保護的衍生物在式i的化合物的o或n原子上帶有保護基(并且為避免疑惑，一種式i的化合物的受保護衍生物可以代表或不代表另一種式i的化合物)。

式i的化合物的受保護衍生物的實例包括以下情況的那些衍生物：

-o原子被芐基保護，其中芐基可通過氫化除去，例如在鈀催化劑(例如pd/c)的存在下；

-羧酸的o原子被烷基(例如甲基、乙基或叔丁基)保護，所述烷基可通過堿水解(例如對于甲基或乙基，通過使用堿金屬氫氧化物例如氫氧化鈉的水解反應(yīng))或酸水解(例如對于叔丁基，通過使用酸例如三氟乙酸的水解反應(yīng))除去。

式i的化合物的受保護衍生物還包括式viia的化合物，

其中q^x表示-c(o)or^4'，和r^4'表示c1-4烷基(例如c4烷基或c1-3烷基，例如甲基)。

式ii的化合物可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法或與其類似的方法制備，例如通過將上文定義的式iia的化合物與疊氮化物形成劑反應(yīng)，接著將中間體酰疊氮化物重排(如上文(b)中所述；參見例如tetrahedron1974,30,2151–2157)。

式iib的化合物可如下制備：將式viii的化合物，

其中l(wèi)g¹如前文定義，與式ix的化合物反應(yīng)，

其中z¹如前文定義，例如在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件下。

式ix的胺可自式iia的羧酸通過上文(b)中所述的路線制備，其中中間體異氰酸酯ii用水水解產(chǎn)生氨基甲酸，其失去二氧化碳以得到ix。同理，中間體異氰酸酯ii可與醇例如叔丁醇反應(yīng)，產(chǎn)生受保護形式的ix。

式iii的化合物(其中z²表示式v的結(jié)構(gòu)片段)或式ix的化合物(其中z¹表示式v的結(jié)構(gòu)片段)可使用流程1中概述的路線合成(參見例如：wo2003/072569;和wo2008/046216)，其中l(wèi)g³和lg⁴表示離去基團，例如鹵素或甲烷磺酰基，和fg表示真實的或潛在的nh2基團，即容易轉(zhuǎn)化成nh2基團的基團，例如硝基或受保護的變體nh–pg²，其中pg²是典型的保護基(參見例如：greene,t.w.;wuts,p.g.m.protectivegroupsinorganicsynthesis;wiley,第四次修訂版,2006;isbn-10:0471697540)，例如，氨基甲酸酯或甲酰胺。順序開始于xi中的lg³經(jīng)堿介導(dǎo)的snar置換為當(dāng)x被堿處理以產(chǎn)生醚xii時形成的aroxide。然后，醚xii的剩余的鹵素或甲烷磺?；〈?lg⁴)(i)在第二個snar反應(yīng)中被置換為式vii的胺；或(ii)通過buchwald偶聯(lián)(參見例如wo2009/017838)被置換為式vii的胺以得到所需的化合物(當(dāng)fg為nh2時)或xiii(當(dāng)fg是硝基或nh–pg²時)。當(dāng)在xiii中fg為硝基時，nh2基團可通過還原反應(yīng)而顯露，通常使用合適的催化劑例如披鈀碳或使用溶解金屬條件例如用在冰乙酸中的鐵，通過氫化進行?；蛘?，當(dāng)fg是保護基時，nh2基團可通過脫保護反應(yīng)顯露。盡管僅描述為在所述順序的最后步驟中發(fā)生，但應(yīng)注意，由fg表示的潛在nh2基團的暴露可在流程1所示的合成路線的任何階段中發(fā)生。

流程1

以類似的方式，其中z¹表示式iv的結(jié)構(gòu)片段的式ix的胺可通過將在式xiiia的化合物中潛在的nh2基團轉(zhuǎn)化成真實的nh2基團來合成，

其中fg’如上文對fg所定義，不同之處在于其不表示nh2。

式vi的化合物可類似于式i的化合物合成(見例如，上文備選的過程(a)-(c))。例如，式vi的化合物可通過將式iix的化合物與式iiix的化合物反應(yīng)制備，其中式iix和iiix的化合物采用與式ii和iii的化合物相同的定義，不同之處在于z¹和z²之一表示前文定義的式iv的結(jié)構(gòu)片段，和z¹和z²的另一個表示式va的結(jié)構(gòu)片段，

。

式viia的化合物可通過類似于本文所述的用于制備式i的化合物的程序制備(參見例如上文過程(a)-(d)和流程1)。

例如，在以下中-co2h基團可被替換為q^x：

-式v的結(jié)構(gòu)片段(得到式vp的結(jié)構(gòu)片段，和相應(yīng)的式iip、iiap、iibp和iiip的化合物，其中z¹和z²分別被替換為z^1p和z^2p，其中z^1p和z^2p之一是上文定義的式iv的結(jié)構(gòu)片段，和z^1p和z^2p的另一個是式vp的結(jié)構(gòu)片段)；或

-式vii的化合物(得到式viip的化合物)。

或者，式viia的化合物可通過將式xiiib的化合物中的基團fg轉(zhuǎn)換為nh2來制備

，

其中fg和q^x如前文所定義(例如，關(guān)于流程1按上文所述，通過轉(zhuǎn)換fg為nh2)，接著與例如式iib的化合物反應(yīng)，其中z¹表示式iv的結(jié)構(gòu)片段。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，式ii、iix和iib表示的化合物通常為反應(yīng)中間體。這些中間體可原位形成并且無需分離與式iii的化合物直接反應(yīng)，以提供式i的化合物。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，對于具有化學(xué)敏感性官能團例如羥基或氨基官能團的任何基團z¹和z²，在上文描述的過程期間使用合適的保護基團可能是需要的。

流程中說明的許多化合物是市售可得的，或可使用引用的程序獲得，或可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)方法容易制備。參見例如regan,j.等;j.med.chem.2003,46,4676–4686、wo2000/043384、wo2007/053346、wo2007/087448、wo2007/089512、wo2009/117080和wo2014/027209。

本文所述的新中間體構(gòu)成本發(fā)明的一個方面。在該方面，本發(fā)明的其它方面涉及：

(i)前文所定義的式ii、iia或iib的化合物，其中z¹表示式v的結(jié)構(gòu)片段，或其鹽或受保護衍生物；

(ii)前文所定義的式iii的化合物，其中z²表示式v的結(jié)構(gòu)片段，或其鹽或受保護衍生物；

(iii)前文所定義的式viia的化合物，或其鹽或受保護衍生物；和

(v)前文所定義的式xiii或xiiib的化合物，或其鹽或受保護衍生物。

式iii、vii、xiii和xiiib的化合物的受保護衍生物包括其中必要的nh2基團(或由fg表示的nh2基團)受保護的那些。在該方面，所述受保護衍生物包括這些化合物的酰胺，或特別是氨基甲酸酯。例如，這些受保護衍生物包括其中nh2基團的h原子被替換為以下基團的化合物：

r’-c(o)-，其中r’是h、c1-8烷基、苯基或芐基，后兩個基團任選地被選自鹵素、羥基、甲基和甲氧基的一個或多個基團取代；或

r’’-o-c(o)-，其中r’’是叔丁基、苯基、芐基或芴基，后三個基團任選地被選自鹵素、羥基、甲基和甲氧基的一個或多個基團取代。

其中r⁴表示-co2h的式ii、iia、iib、iii、vii和xiii的化合物的受保護衍生物另外地(或備選地)包括其中羧基部分受保護的那些。在這方面，所述受保護的衍生物還包括所述化合物的酯(例如，c1-8烷基酯，例如乙基酯或特別是甲基酯)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，其中z²表示式v的結(jié)構(gòu)片段的式iii的化合物可在必要的nh2基團上受保護，和/或當(dāng)r⁴表示-co2h時，在羧基部分上受保護。在該方面，例如，可提及的其中z²表示式v的結(jié)構(gòu)片段的式iii的化合物的具體受保護衍生物包括：

4-((4-((4-氨基萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯；和

4-((4-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯。

4-((4-((4-氨基萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯和4-((4-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯兩者也是式xiiib的化合物(其中q^x表示-co2ch3，和分別地，fg表示nh2或nh-pg²，其中pg²表示叔丁氧基羰基)。

本發(fā)明的備選實施方案涉及化合物，其是：

(i)式iii的化合物的受保護衍生物，其中z²表示式v的結(jié)構(gòu)片段；或

(ii)式xiiib的化合物，或其受保護衍生物，

條件是所述化合物不是：

4-((4-((4-氨基萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯；或

4-((4-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯。

本發(fā)明的另外的實施方案涉及前文所定義的式viia的化合物，條件是所述化合物

(a)是，或

(b)不是

4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯。

本文描述的本發(fā)明的各方面(例如上述化合物、組合、方法和用途)可在治療本文所述病況中具有優(yōu)勢，與現(xiàn)有技術(shù)中已知用于治療這些病況的類似的化合物、組合、方法(治療)或用途或其它方面相比，它們可更適合于醫(yī)師和/或患者，更有效，具有較少毒性，具有更好的選擇性，具有更廣范圍的活性，更有效力，產(chǎn)生較少的副作用，具有更好的藥代動力學(xué)和/或藥效學(xué)特征，具有更合適的固態(tài)形態(tài)學(xué)，具有更好的長期穩(wěn)定性或可具有其它有用的藥理學(xué)性質(zhì)。

另外地(或備選地)，本發(fā)明的化合物可：

-顯示長的作用持續(xù)時間和/或作用持久性(例如，與其它之前公開的p38map激酶抑制劑例如birb796相比)；

-顯示syk的有效抑制(例如，它們針對syk的ic50可為500nm或更低，例如350nm或更低)；

-不強烈抑制gsk3α(例如，它們針對gsk3α的ic50可為1,000nm或更高；例如1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000nm或更高)；

-靶向激酶(kinome)的較小部分，即具有改進的選擇性，如通過降低的kinomescan選擇性評分所示；

-在給藥之間保持相對高的局部藥物濃度(例如，相對于其它之前公開的p38map激酶抑制劑例如birb796，高的局部濃度)；

-顯示特別適合于局部給藥的性質(zhì)(例如在局部給藥后，產(chǎn)生高的靶組織濃度但低的血漿濃度的式(i)的化合物，和/或從血漿快速清除式(i)的化合物，例如因為高的腎或肝提取)；

-細胞顯示很少或沒有β-聯(lián)蛋白誘導(dǎo)和/或有絲分裂抑制；

-在人淋巴細胞體外微核試驗中不產(chǎn)生含有微核的雙核細胞的增加；

-對細胞色素p450超家族的成員顯示很少或沒有時間依賴性抑制；

-與之前公開的p38map激酶抑制劑例如birb796相比，在水的存在下顯示改進的化學(xué)穩(wěn)定性(例如，在含水混合物中在升高的溫度下對水解的穩(wěn)定性)；

-在給予患者后，產(chǎn)生伴隨很少或沒有安全性(例如毒性)顧慮的代謝產(chǎn)物；

-在局部給予后在臨床前物種和人兩者中顯示降低的眼睛刺激或毒性；

-顯示良好的水溶性和/或細胞滲透性；

-在ph范圍7–8的水溶液中用較低量的增溶賦形劑較容易地配制；

-具有高度的結(jié)晶性；和/或

-在固態(tài)時顯示很少或沒有吸濕性。

實驗方法

通用程序

所有原料和溶劑自市售來源獲得，或根據(jù)引用的文獻制備。除非另外說明，否則所有反應(yīng)經(jīng)攪拌。有機溶液經(jīng)無水硫酸鎂常規(guī)干燥。氫化在thalesh-cube流動反應(yīng)器上在所述條件下或在氫氣球下進行。微波反應(yīng)在cemdiscover和smithcreator微波反應(yīng)器中進行，使用可變功率微波輻射加熱至恒定溫度。

正相柱色譜在自動化快速色譜系統(tǒng)例如combiflashcompanion或combiflashrf系統(tǒng)上使用預(yù)填裝的二氧化硅(230-400目，40-63μm)柱常規(guī)進行。scx購自supelco，在使用前用1m鹽酸處理。除非另外說明，否則待純化的反應(yīng)混合物首先用meoh稀釋，和用幾滴acoh調(diào)成酸性。將該溶液直接負載到scx上，用meoh洗滌。然后通過用含1%nh3的meoh洗滌，洗脫所需材料。

分析方法

分析型hplc使用watersxselectcshc18,2.5μm,4.6x30mm柱進行，用含mecn的0.1%甲酸(0.1%甲酸水溶液)的梯度洗脫，或使用watersxbridgebehc18,2.5μm,4.6x30mm柱進行，用含mecn的10mm碳酸氫銨水溶液的梯度洗脫。使用二極管陣列或agilent1100系統(tǒng)上的可變波長檢測器測量洗脫峰的uv譜。

分析型lcms使用watersxselectcshc18,2.5μm,4.6x30mm柱進行，用含mecn的0.1%甲酸(0.1%甲酸水溶液)的梯度洗脫，或使用watersxbridgebehc18,2.5μm,4.6x30mm柱進行，用含mecn的10mm碳酸氫銨水溶液的梯度洗脫。洗脫峰的uv和質(zhì)譜使用agilent1200或agilentinfinity1260lcms上的可變波長檢測器與具有正離子和負離子電噴射的6120單個四極質(zhì)譜儀測量。

制備型hplc使用watersxselectcshc18,5μm,19x50mm柱使用含mecn的0.1%甲酸(0.1%甲酸水溶液)的梯度或含mecn的10mm碳酸氫銨水溶液的梯度進行，或使用watersxbridgebehc18,5μm,19x50mm柱使用含mecn的10mm碳酸氫銨水溶液的梯度進行。在gilson215制備型hplc或varianprepstar制備型hplc上通過可變波長檢測器測量的單波長uv而檢測后，或通過具有正離子和負離子電噴射的zq單個四極質(zhì)譜儀和在watersfractionlynxlcms上的雙波長檢測器測量的質(zhì)量和單波長uv而檢測后，收集流分。

¹hnmr波譜：¹hnmr波譜在brukeravanceiii波譜儀上以400mhz獲得。氯仿-d、二甲基亞砜-d6或四甲基甲硅烷的內(nèi)部標準的中央峰用作參考。

本發(fā)明的化合物的制備

實施例1

4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸

(i)(4-((2-氯吡啶-4-基)氧基)萘-1-基)氨基甲酸叔丁酯

方法1

將4-((2-氯吡啶-4-基)氧基)萘-1-胺(見例如ito,k.等,wo2010/112936,07oct2010;1000mg,3.69mmol)和二碳酸二叔丁酯(750mg,3.44mmol)在t-buoh(10ml)中的混合物在回流下攪拌18h?；旌衔镉盟?15ml)稀釋，和通過過濾收集固體。固體在乙醚中研磨，得到子標題化合物(1002mg)，為淺灰色固體。

¹hnmr(dmso-d6)400mhz,δ:9.37(s,1h),8.28(d,1h),8.16(d,1h),8.82(dd,1h),7.66(d,1h),7.66-7.54(m,2h),7.40(d,1h),7.03(d,1h),6.91(dd,1h),1.52(s,9h).

lcmsm/z371(m+h)⁺(es⁺);369(m-h)^-(es^-)

方法2

將2-氯-4-氟吡啶(33ml,365mmol)加入(4-羥基萘-1-基)氨基甲酸叔丁酯(85g,328mmol)和cs2co3(139g,426mmol)在dmso(600ml)中的混合物，并室溫下攪拌24h。加入水(1l)，將混合物攪拌1h，然后濾出沉淀。以另外的85g規(guī)模的萘酚重復(fù)反應(yīng)。合并的沉淀用水(2l)、乙醚(4x400ml)洗滌，和在70℃在真空下干燥72h，得到子標題化合物(201.6g)，為淺灰色固體。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.38(s,1h),8.28(d,1h),8.16(d,1h),7.82(d,1h),7.67-7.56(m,3h),7.40(d,1h),7.03(d,1h),6.92(dd,1h),1.52(s,9h).

lcmsm/z371(m+h)⁺(es⁺);369(m-h)^-(es^-)

(ii)4-((4-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯

方法1

來自上文步驟(i)的產(chǎn)物(2.0g,5.39mmol)、4-氨基-2-甲氧基苯甲酸甲酯(1.0g,5.52mmol)、binap(300mg,0.482mmol)和碳酸銫(3.5g,10.74mmol)在1,4-二噁烷(30ml)中的懸浮液用氮氣脫氣10min。加入pd2dba3(200mg,0.218mmol)，和將混合物加熱至90℃過夜?；旌衔镉靡颐?60ml)稀釋并過濾。然后濾液用水(2x100ml)和飽和鹽水(50ml)洗滌。有機相經(jīng)干燥(mgso4)、過濾和減壓下濃縮，得到粗產(chǎn)物，為紅色泡沫。粗產(chǎn)物通過色譜在companion(80g柱,20-50%etoac/己烷)上純化，得到子標題化合物(2.34g)，為黃色泡沫。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.38(s,1h),9.36(s,1h),8.18(d,1h),8.14(d,1h),7.83(d,1h),7.54-7.66(m,5h),7.37(d,1h),7.22(dd,1h),6.69(dd,1h),6.15(d,1h),3.74(s,3h),3.71(s,3h),1.53(s,9h).

lcmsm/z516(m+h)⁺(es⁺)

方法2

4-氨基-2-甲氧基苯甲酸甲酯(10.8g,59.6mmol)、來自上文步驟(i)的產(chǎn)物(20.09g,54.2mmol)和碳酸鉀(15g,109mmol)在dmf(300ml)中的混合物用n2脫氣10min。加入brettphosg3預(yù)催化劑(1g,1.103mmol)，將混合物在85℃加熱3h。將混合物冷卻，然后在dcm(500ml)和水(800ml)之間分配。有機層用水(500ml)洗滌，干燥(mgso4)，過濾和在減壓下蒸發(fā)。殘余物用乙醚研磨，過濾和干燥，得到子標題化合物(21.7g)，為灰色固體。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.38(s,1h),9.36(s,1h),8.18(d,1h),8.14(d,1h),7.83(d,1h),7.54-7.66(m,5h),7.38(d,1h),7.22(dd,1h),6.69(dd,1h),6.14(d,1h),3.74(s,3h),3.71(s,3h),1.53(s,9h).

lcmsm/z516(m+h)⁺(es⁺)

(iii)4-((4-((4-氨基萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯

將tfa(7ml,91mmol)加入來自上文步驟(ii)的產(chǎn)物(2.34g,4.08mmol)在dcm(50ml)中的溶液，并將反應(yīng)物攪拌2h。蒸發(fā)溶劑，將殘余物在飽和nahco3溶液(100ml)和dcm(60ml)之間分配。分離有機物，干燥(mgso4)，過濾和蒸發(fā)溶劑，得到子標題化合物(1.5g)，為淺棕色泡沫。

lcmsm/z416(m+h)⁺(es⁺)

(iv)(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)氨基甲酸苯酯

將氯甲酸苯酯(0.750ml,5.98mmol)加入n-(3-氨基-5-(叔丁基)-2-甲氧基苯基)甲磺酰胺(見例如cirillo,p.f.等wo2002/083628,2002年10月24日;1.5g,5.51mmol)和nahco3(1.0g,11.90mmol)在thf(15ml)和dcm(15ml)中的攪拌溶液，并將混合物攪拌2h?；旌衔镉盟?20ml)洗滌，分離有機層，干燥(mgso4)，過濾和蒸發(fā)至棕色泡沫，其在環(huán)己烷(20ml)中攪拌，得到子標題化合物(2.05g)，為無色固體。

lcmsm/z393(m+h)⁺(es⁺);391(m-h)^-(es^-)

(v)4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)-萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯

方法1

在65℃(加熱塊溫度)下將三乙胺(20μl,0.143mmol)加入來自上文步驟(iv)的產(chǎn)物(300mg,0.764mmol)和來自上文步驟(ii)的產(chǎn)物(300mg,0.722mmol)在iproac(15ml)中的溶液，將混合物攪拌過夜。將反應(yīng)物冷卻至室溫，在真空下濃縮，得到淺棕色泡沫。將泡沫在et2o(10ml)中漿化2h，得到的固體通過過濾收集，用另一份et2o洗滌，得到子標題化合物(433mg)，為淺粉色固體。

lcmsm/z358(m+2h)²⁺(es⁺)

方法2

在65℃(加熱塊溫度)下將三乙胺(600μl,4.30mmol)加入來自上文步驟(iv)的產(chǎn)物(9.0g,22.93mmol)和來自上文步驟(iii)的產(chǎn)物(9.0g,21.66mmol)在iproac(300ml)中的溶液，并將混合物攪拌24h。將反應(yīng)物冷卻至室溫，在真空下濃縮，得到棕色泡沫。粗產(chǎn)物通過色譜在companion(330g柱,1-5%meoh/dcm)上純化，得到子標題化合物(13.2g)，為淺粉色固體。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.40(s,1h),9.35(s,1h),916(s,1h),8.93(s,1h),8.31(d,1h),8.17-8.20(m,2h),8.13(d,1h),7.87(d,1h),7.69-7.73(m,1h),7.60-7.63(m,2h),7.53(d,1h),7.41(d,1h),7.24(dd,1h),7.03(d,1h),6.69(dd,1h),6.17(d,1h),3.81(s,3h),3.74(s,3h),3.71(s,3h),3.10(s,3h),1.27(s,9h).

lcmsm/z714(m+h)⁺(es⁺)

(vi)4-((4-((4-(3-(5-(叔丁基)-2-甲氧基-3-(甲基磺酰胺基)苯基)脲基)萘-1-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸

方法1

將氫氧化鋰一水合物(25mg,0.596mmol)在水(3ml)中的水溶液加入來自上文步驟(v)的產(chǎn)物(433mg,0.540mmol)在thf(2ml)和甲醇(1ml)中的溶液，并將混合物在室溫下攪拌過夜。加入氫氧化鋰一水合物(25mg,0.596mmol)，繼續(xù)攪拌另外3天。將混合物在減壓下濃縮，以除去thf和甲醇，然后用水(25ml)稀釋。加入檸檬酸一水合物(250mg,1.190mmol)的水溶液(5ml)，和得到的沉淀通過過濾收集，得到標題化合物(360mg)，為淺粉色固體。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.96(brs,1h),9.39(s,1h),9.31(s,1h),9.14(s,1h),8.91(s,1h),8.30(d,1h),8.19(d,1h),8.18(d,1h),8.12(d,1h),7.87(d,1h),7.71(ddd,1h),7.63(d,1h),7.61(ddd,1h),7.51(d,1h),7.40(d,1h),7.22(dd,1h),7.02(d,1h),6.68(dd,1h),6.16(d,1h),3.81(s,3h),3.75(s,3h),3.10(s,3h),1.27(s,9h).90%純度

lcmsm/z700(m+h)⁺(es⁺)

方法2

向來自上文步驟(v)的產(chǎn)物(33.4g,45.9mmol)在thf(300ml)中的攪拌溶液中加入naoh(6maq.)(85.0ml,510mmol)。加入meoh(60ml)并繼續(xù)攪拌28h。將反應(yīng)物在真空下濃縮，得到黃色固體。將該物質(zhì)懸浮在水(200ml)中，和用6mhcl(100ml)酸化，引起白色固體沉淀。通過過濾收集固體，用水洗滌。將得到的固體在玻璃料上干燥1h，然后在40℃在真空下進一步干燥，得到作為鹽酸鹽的標題化合物，為白色固體。

¹hnmr(鹽酸鹽；400mhz,dmso-d6)δ:9.80(s,1h),9.59(s,1h),9.15(s,1h),9.02(s,1h),8.37(d,1h),8.13-8.18(m,3h),7.86(d,1h),7.70-7.74(m,1h),7.62-7.66(m,2h),7.44(d,1h),7.35(s,1h),7.10(d,1h),7.03(d,1h),6.78(d,1h),6.26(d,1h),3.81(s,3h),3.75(s,3h),3.10(s,3h),1.27(s,9h).

lcmsm/z700(m+h)⁺(es⁺)

將鹽酸鹽以溶于thf的2.0g批次負載至預(yù)調(diào)制的scx樹脂柱上(20g樹脂，在mecn中調(diào)制)。樹脂用mecn洗滌，然后產(chǎn)物釋放在1%nh3/meoh中。將nh3流分合并，在真空下濃縮，得到作為游離酸的標題化合物(30g)，為淺粉色固體。

¹hnmr(游離酸;400mhz,dmso-d6)δ:9.56(s,1h),9.28(s,1h),9.00(s,1h),8.34(d,1h),8.16-8.17(m,2h),8.11(d,1h),7.86(d,1h),7.69-7.71(m,1h),7.57-7.63(m,2h),7.48(d,1h),7.40(d,1h),7.21(dd,1h),7.03(d,1h),6.66(dd,1h),6.16(d,1h),3.81(s,3h),3.73(s,3h),3.09(s,3h),1.27(s,9h).

lcmsm/z700(m+h)⁺(es⁺)

將游離酸(1.0g,1.386mmol)懸浮于naoh(0.057g,1.414mmol)的水溶液(25ml)中。加入meoh(5ml)，將混合物攪拌直至達到均相。得到的溶液用meoh(20ml)稀釋和真空濃縮，得到淺灰色固體。將該物質(zhì)懸浮于mecn(5ml)，向其中加入水(0.5ml)，將懸浮液攪拌過周末。將懸浮液過濾，得到的固體用mecn(2x3ml)洗滌，和在50℃在真空下干燥，得到作為鈉鹽的標題化合物(940mg)，為白色固體。

¹hnmr(鈉鹽；400mhz,dmso-d6)δ:9.68(s,1h),9.07(s,1h),9.02(s,1h),8.35(d,1h),8.08-8.13(m,2h),8.02(d,1h),7.85(d,1h),7.64-7.68(m,1h),7.57-7.61(m,1h),7.37-7.43(m,2h),7.30(s,1h),7.11(dd,1h),7.03(d,1h),6.61(dd,1h),6.12(d,1h),3.80(s,3h),3.65(s,3h),2.96(s,3h),1.25(s,9h).

lcmsm/z700(m+h)⁺(es⁺)

生物試驗：實驗方法

酶結(jié)合測定法(kinomescan)

本文公開的化合物的激酶結(jié)合活性可使用專有的測定法測定，其測量與固定化配體的活性位點定向的競爭結(jié)合(fabian,m.a.等,naturebiotechnol.,2005,23:329-336)。這些測定法可通過discoverx(以前的ambit;sandiego,ca)進行。通過與試驗化合物孵育產(chǎn)生的抑制百分比可相對于非-抑制對照計算。

酶抑制測定法

本文公開的化合物的酶抑制活性通過fret使用用供體和受體熒光團(z-lyte,invitrogenltd.,paisley,uk)標記的合成肽測定。

p38mapkα酶抑制

以下兩個測定法變型可用于測定p38mapkα抑制。

方法1

試驗化合物針對p38mapkα同種型(mapk14:invitrogen)的抑制活性通過測定下游分子mapkap-k2的活化/磷酸化水平間接評價。將p38mapkα蛋白(80ng/ml,2.5μl)與試驗化合物(2.5μl，4μg/ml、0.4μg/ml、0.04μg/ml或0.004μg/ml)在室溫下混合2小時。然后加入p38α無活性靶mapkap-k2(invitrogen,600ng/ml)和fret肽(8μm;mapkap-k2的磷酸化靶)的混合溶液(2.5μl)，然后激酶反應(yīng)通過加入atp(40μm,2.5μl)而開始。將混合物在室溫下孵育1小時。加入顯色劑(蛋白酶,5μl)后1小時，在熒光微板閱讀器(varioskan?flash,thermofisherscientific)上檢測。

方法2

該方法按照與上文方法1相同的步驟，但使用更高濃度的p38mapkα蛋白(2.5μl200ng/ml蛋白代替2.5μl80ng/ml蛋白)，與試驗化合物(以1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml或0.001μg/ml試驗)混合。

p38mapkγ酶抑制

本發(fā)明的化合物對p38mapkγ(mapk12:invitrogen)的抑制活性以與上文描述的類似方式評價。將酶(800ng/ml,2.5μl)與試驗化合物(2.5μl4μg/ml、0.4μg/ml、0.04μg/ml,或0.004μg/ml)在室溫下孵育2小時。然后加入fret肽(8μm,2.5μl)和合適的atp溶液(2.5μl,400μm)至酶/化合物混合物，將全部孵育1小時。加入顯色劑(蛋白酶,5μl)后1小時，在熒光微板閱讀器(varioskan?flash,thermoscientific)上檢測。

c-src和syk酶抑制

本發(fā)明的化合物對c-src和syk酶(invitrogen)的抑制活性以與上文描述的類似方式評價。將相關(guān)的酶(分別為3000ng/ml或2000ng/ml，2.5μl)與試驗化合物(1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml或0.001μg/ml，各自2.5μl)在室溫下孵育2小時。然后加入fret肽(8μm,2.5μl)和合適的atp溶液(2.5μl,800μm對于c-src，和60μmatp對于syk)至酶/化合物混合物，將混合物孵育1小時。加入顯色劑(蛋白酶,5μl)后1小時，在熒光微板閱讀器(varioskan?flash,thermofisherscientific)上檢測。

gsk3α酶抑制

以下兩個測定法變型可用于測定gsk3α抑制。

方法1

本發(fā)明的化合物對gsk3α酶同種型(invitrogen)的抑制活性通過測定靶肽的活化/磷酸化水平來評價。將gsk3-α蛋白(500ng/ml,2.5μl)與試驗化合物(2.5μl4μg/ml、0.4μg/ml、0.04μg/ml或0.004μg/ml)在室溫下混合2小時。然后加入fret肽(8μm,2.5μl)(其為gsk3α的磷酸化靶)和atp(40μm,2.5μl)至酶/化合物混合物，將得到的混合物孵育1小時。加入顯色劑(蛋白酶,5μl)后1小時，在熒光微板閱讀器(varioskan?flash,thermofisherscientific)中檢測。

在所有情況下，位點特異性蛋白酶僅切割非磷酸化肽和消除fret信號。各反應(yīng)的磷酸化水平使用香豆素發(fā)射(供體)與熒光素發(fā)射(受體)的比率來計算，其中高比率表示高磷酸化而低比率表示低磷酸化水平。各反應(yīng)的抑制百分比相對于非抑制對照計算，然后自濃度反應(yīng)曲線計算50%抑制濃度(ic50值)。

方法2

該方法按照與上文方法1相同的步驟，但使用試驗化合物(105分鐘代替2小時)與gsk3-α蛋白的更短的混合時間。此外，使用的試驗化合物的濃度為10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml或0.01μg/ml。

細胞測定法

本發(fā)明的化合物使用以下測定法的一個或多個進行研究。

(a)jurkat細胞的p38mapkα和lck的抑制

將jurkatt細胞在饑餓培養(yǎng)基(rpmi1640+5%fbs)中培養(yǎng)24h，然后進行實驗。收獲細胞，以10x10⁶個細胞/ml再懸浮于饑餓培養(yǎng)基，然后以1x10⁶個細胞/孔置于圓底96孔板。刺激前2h，加入連續(xù)稀釋的試驗化合物(1%最終dmso濃度)。與化合物預(yù)孵育后，細胞用h2o2(0.05%最終)刺激5分鐘。通過在2000rpm離心(3分鐘，4℃)終止反應(yīng)，然后除去上清液，添加100μl的冷卻的固定/透化溶液(bdfix/permkit#554714)。將板在4℃孵育20分鐘，然后離心和用提供的1x洗滌培養(yǎng)基(bdfix/permkit#554714)洗滌。細胞針對cellsignallingtechnology(9211s)提供的磷酸-p38α(t180/182)或r&d(mab7500)提供的磷酸-lck(y394)染色。將抗體在洗滌培養(yǎng)基中稀釋至5μg/ml(r&d)或以1:200(cellsignallingtechnology)稀釋，然后在4℃在暗處孵育1h。用冰冷的洗滌緩沖液3次重復(fù)洗滌后，以1:1000的稀釋度加入第二抗體(抗-兔-fitc#f1362或抗-小鼠-fitc#f2883，兩者都來自sigma)和在4℃在暗處孵育1h。然后將細胞在冷的洗滌緩沖液中洗滌3次，接著最后在冷的pbs中洗滌，重懸于150μl冷的pbs。通過流式細胞術(shù)使用bdaccuric6分析細胞。

(aa)在d-u937細胞中l(wèi)ps-誘導(dǎo)的tnfα/il-8釋放

u937細胞(人單核細胞細胞系)通過與卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(pma;100ng/ml)孵育48-72小時而分化成巨噬細胞型細胞。將細胞與終濃度的試驗化合物預(yù)孵育2小時，然后用0.1μg/ml的lps(來自大腸桿菌:0111:b4,sigma)刺激4小時。收集上清液用于通過夾心elisa(duo-set,r&dsystems)測定tnfα和il-8濃度。tnfα產(chǎn)生的抑制計算為在各濃度的試驗化合物下通過10μg/ml的birb796實現(xiàn)的抑制與溶媒對照相比的百分比。相對50%有效濃度(rec50)從得到的濃度反應(yīng)曲線測定。il-8產(chǎn)生的抑制在各濃度的試驗化合物下通過與溶媒對照比較而計算。50%抑制濃度(ic50)自得到的濃度反應(yīng)曲線測定。

(b)在pbmc細胞中l(wèi)ps-誘導(dǎo)的tnfα/il-8釋放

使用密度梯度(lymphoprep,axis-shieldhealthcare)從全血分離來自健康受試者的外周血單核細胞(pbmc)。將pbmc接種在96孔板中和用所需濃度的化合物處理2小時，然后在正常組織培養(yǎng)條件(37℃，5%co2)下加入1ng/mllps(大腸桿菌0111:b4，來自sigmaaldrich)達24小時。收獲上清液用于通過夾心elisa(duo-set,r&dsystems)測定il-8和tnfα濃度，在熒光微板閱讀器(varioskan?flash,thermofisherscientific)上讀數(shù)。在50%抑制il-8和tnfα產(chǎn)生時的濃度(ic50)從劑量反應(yīng)曲線計算。

(c)在cd3/cd28刺激的pbmc細胞中il-2和ifnγ釋放

來自健康受試者的pbmc自全血使用密度梯度(lymphoprep,axis-shieldhealthcare)分離。將細胞加入用cd3/cd28單克隆抗體的混合物(分別為0.3μg/mlebioscience和3μg/mlbdpharmingen)預(yù)包被的96孔板。然后將所需濃度的化合物加入各孔和在正常組織培養(yǎng)條件下將板放置3天。收獲上清液，通過夾心elisa(duo-set,r&dsystem)測定il-2和ifnγ釋放。ic50從劑量反應(yīng)曲線測定。

(d)在ht29細胞中il-1β-誘導(dǎo)的il-8釋放

將ht29細胞(人結(jié)腸腺癌細胞系)放置在96孔板中(24小時)和用所需濃度的化合物預(yù)處理2小時，然后加入5ng/ml的il-1β(abcam)達24小時。收獲上清液用于通過夾心elisa(duo-set,r&dsystem)定量il-8。ic50從劑量反應(yīng)曲線測定。

(e)在原代巨噬細胞中l(wèi)ps-誘導(dǎo)的il-8和tnfα釋放

來自健康受試者的pbmc從全血使用密度梯度(lymphoprep,axis-shieldhealthcare)分離。將細胞孵育2小時，通過洗滌除去非粘附的細胞。為將細胞分化成巨噬細胞，將它們與5ng/ml的gm-csf(peprotech)一起在正常組織培養(yǎng)條件下孵育7天。然后將所需濃度的化合物加入細胞進行2小時預(yù)處理，然后用10ng/mllps刺激24小時。收獲上清液，il-8和tnfα釋放通過夾心elisa(duo-set,r&dsystem)測定。ic50從劑量反應(yīng)曲線測定。

(f)在beas2b細胞中多聚i:c-誘導(dǎo)的icam-1表達

多聚i:c作為簡單的rna病毒模擬物用于這些研究。將多聚i:c-oligofectamine混合物(1μg/ml多聚i:c,±2%oligofectamine,25μl;分別為invivogenltd.,sandiego,ca和invitrogen,carlsbad,ca)轉(zhuǎn)染至beas2b細胞(人支氣管上皮細胞,atcc)。細胞用終濃度的試驗化合物預(yù)孵育2小時，在細胞表面上的icam1表達水平通過基于細胞的elisa測定。在多聚i:c轉(zhuǎn)染后18小時的時間點，細胞用含4%甲醛的pbs固定，然后內(nèi)源過氧化物酶通過加入含0.1%疊氮化鈉和1%過氧化氫的洗滌緩沖液(100μl,含0.05%tween的pbs:pbs-tween)淬滅。細胞用洗滌緩沖液(3x200μl)洗滌，在用含5%牛奶的pbs-tween(100μl)封閉各孔1小時后，將細胞與含抗-人icam-1抗體(50μl;cellsignallingtechnology,danvers,ma)的1%bsapbs在4℃孵育過夜。

細胞用pbs-tween(3x200μl)洗滌并與第二抗體(100μl;hrp-綴合的抗-兔igg,dakoltd.,glostrup,denmark)一起孵育。然后將細胞與底物(50μl)一起孵育2-20分鐘，接著加入終止溶液(50μl,1nh2so4)。使用分光光度計，通過讀出相對于655nm的參比波長的450nm的吸光度，檢測icam-1信號。然后細胞用pbs-tween(3x200μl)洗滌，在結(jié)晶紫染色(50μl含2%的pbs溶液)和通過含1%sds的蒸餾水溶液(100μl)洗脫后，通過讀出595nm的吸光度檢測各孔中的總細胞數(shù)。測量的od450-655讀數(shù)通過除以各孔中od595讀數(shù)而針對細胞數(shù)校正。在各濃度的試驗化合物下通過與溶媒對照比較，計算icam-1表達的抑制。根據(jù)得到的濃度反應(yīng)曲線，測定50%抑制濃度(ic50)。

(g)細胞有絲分裂測定法

來自健康受試者的外周血單核細胞(pbmc)使用密度梯度(histopaque^?-1077,sigma-aldrich,poole,uk)從全血(quintiles,london,uk)分離。pbmc(3百萬個細胞/樣品)隨后用2%pha(植物血細胞凝集素,sigma-aldrich,poole,uk)處理48小時，接著暴露于各種濃度的試驗化合物20小時。收集前2小時，pbmc用秋水仙胺(0.1μg/ml;invitrogen,paisley,uk)處理以使細胞停止在分裂中期。為觀察有絲分裂的細胞，pbmc通過加入intraprep(50μl;beckmancoulter,france)透化和固定，和用抗-磷酸-組蛋白3(0.26ng/l;#9701;cellsignalling,danvers,ma)和碘化丙啶(1mg/ml;sigma-aldrich,poole,uk)染色，如前所述(muehlbauerp.a.和schulerm.j.,mutationresearch,2003,537:117-130)。使用attune流式細胞儀(invitrogen,paisley,uk)，門控淋巴細胞，觀察熒光。對各處理，相對于溶媒(0.5%dmso)處理，計算有絲分裂的抑制百分比。

(h)鼻病毒-誘導(dǎo)的il-8釋放和icam-1表達

人鼻病毒rv16自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(manassas,va)獲得。通過用hrv感染hela細胞直到80%的細胞發(fā)生細胞病變，產(chǎn)生病毒貯液。

beas2b細胞用hrv以5的moi感染并在33℃孵育2小時，同時輕輕搖動以促進吸收。然后細胞用pbs洗滌，加入新鮮的培養(yǎng)基和細胞孵育另外72小時。收集上清液用于使用duosetelisa顯色試劑盒(r&dsystems,minneapolis,mn)測定il-8濃度。

表達icam-1的細胞表面的水平通過基于細胞的elisa測定。在感染后72小時，細胞用含4%甲醛的pbs固定。在通過加入0.1%疊氮化鈉和1%過氧化氫淬滅內(nèi)源過氧化物酶后，各孔用洗滌緩沖液(含0.05%tween的pbs:pbs-tween)洗滌。在用含5%牛奶的pbs-tween封閉孔1小時后，細胞與含抗-人icam-1抗體的5%bsapbs-tween(1:500)孵育過夜。各孔用pbs-tween洗滌，并與第二抗體(hrp-綴合的抗-兔igg,dakoltd.)一起孵育。通過加入底物和使用分光光度計在450nm與參比波長655nm讀出，檢測icam-1信號。然后各孔用pbs-tween洗滌，在結(jié)晶紫染色和用1%sds溶液洗脫后通過讀出595nm的吸光度，檢測各孔中的總細胞數(shù)。測量的od450-655讀數(shù)通過除以各孔中的od595讀數(shù)對細胞數(shù)進行校正。hrv感染前2小時以及感染后2小時(此時將未感染的hrv洗出)加入化合物。

(i)mrc5細胞中hrv16誘導(dǎo)的細胞病變作用(cpe)的評估

mrc5細胞用hrv16以1的moi在含5%fcs和1.5mmmgcl2的dmem中感染，接著在33℃孵育1小時以促進吸附。吸出上清液，然后加入新鮮的培養(yǎng)基，接著孵育4天。合適時，細胞與化合物或dmso一起預(yù)孵育2小時，在洗出病毒后再次加入化合物和dmso。

在室溫下，吸出上清液和與亞甲基藍溶液(100μl,2%甲醛、10%甲醇和0.175%亞甲基藍)一起孵育2小時。洗滌后，向各孔加入含1%sds的蒸餾水(100μl)，和將板輕輕搖動1-2小時，然后讀出660nm的吸光度。計算各孔的抑制百分比。ic50值從通過連續(xù)稀釋試驗化合物產(chǎn)生的濃度反應(yīng)曲線計算。

(j)原代支氣管上皮細胞中的體外rsv病毒負載

生長在96孔板中的正常人支氣管上皮細胞(nhbec)用rsva2(毒株a2,hpa,salisbury,uk)以0.001的moi在含15mm氯化鎂的lhc8培養(yǎng)基:rpmi-1640(50:50)中感染，和在37℃孵育1小時用于吸附。細胞用pbs(3x200μl)洗滌，然后加入新鮮的培養(yǎng)基(200μl)和繼續(xù)孵育4天。合適時，細胞與化合物或dmso一起預(yù)孵育2小時，然后在病毒洗出后再次加入。

細胞用含4%甲醛的pbs溶液(50μl)一起孵育20分鐘，用wb(3x200μl)(洗滌緩沖液，含0.5%bsa和0.05%tween-20的pbs)洗滌，和與封閉溶液(含5%煉乳的pbs)一起孵育1小時。然后細胞用wb(3x200μl)洗滌和在室溫下用含抗-rsv(2f7)f-融合蛋白抗體(40μl;小鼠單克隆,lot798760,cat.no.ab43812,abcam)的5%bsa/pbs-tween孵育1小時。洗滌后，細胞與含hrp-綴合的第二抗體溶液(50μl)的5%bsa/pbs-tween(lot00053170,cat.no.p0447,dako)一起孵育，然后加入tmb底物(50μl;底物試劑包,lot269472,cat.no.dy999,r&dsystems,inc.)。該反應(yīng)通過加入2nh2so4(50μl)終止，將得到的信號在微板閱讀器(varioskan?flash,thermofisherscientific)中比色測量(od:450nm與參比波長655nm)。

然后洗滌細胞，加入2.5%結(jié)晶紫溶液(50μl;lot8656,cat.no.pl7000,pro-labdiagnostics)達30分鐘。用wb洗滌后，向各孔中加入含1%sds的蒸餾水(100μl)，在振蕩器上將板輕輕搖動1小時，然后讀出595nm的吸光度。測量的od450-655讀數(shù)通過將od450-655除以od595讀數(shù)對細胞數(shù)進行校正。計算各孔的抑制百分比，ic50值根據(jù)自連續(xù)稀釋的化合物產(chǎn)生的濃度反應(yīng)曲線計算。

(k)細胞成活力測定法：mtt測定

將分化的u937細胞與各試驗化合物(終濃度為1μg/ml或10μg/ml，在200μl下文顯示的培養(yǎng)基中)一起以兩個方案預(yù)孵育：第一個方案為在5%fcsrpmi1640培養(yǎng)基中4小時，第二個方案為在10%fcsrpmi1640培養(yǎng)基中24小時。上清液置換為新鮮的培養(yǎng)基(200μl)，向各孔加入mtt貯液(10μl,5mg/ml)。孵育1小時后，除去培養(yǎng)基，向各孔加入dmso(200μl)，將板輕輕搖動1小時，然后讀出550nm的吸光度。相對于溶媒(0.5%dmso)處理，計算各孔的細胞成活力的損失百分比。因此，藥物處理相對于溶媒的細胞成活力的明顯增加作為負百分比顯示。

(l)人活檢測定法

腸粘膜活檢自ibd患者的結(jié)腸的發(fā)炎區(qū)域獲得。將活檢材料切成小塊(2–3mm)，在器官培養(yǎng)室中在37℃在5%co2/95%o2氣氛中在無血清培養(yǎng)基中置于鋼網(wǎng)上。向組織加入dmso對照或所需濃度的試驗化合物，在器官培養(yǎng)室中孵育24小時。收獲上清液用于通過r&delisa測定il-6、il-8、il-1β和tnfα水平。相對于對于dmso對照(100%)測定的細胞因子釋放，計算通過試驗化合物的細胞因子釋放的抑制百分比。

(m)β聯(lián)蛋白在d-u937細胞中的累積

u937細胞(一種人單核細胞細胞系)通過與pma(100ng/ml)一起孵育48-72小時分化成巨噬細胞型細胞。然后將細胞與終濃度的試驗化合物或溶媒一起孵育18小時。通過試驗化合物誘導(dǎo)β-聯(lián)蛋白通過置換培養(yǎng)基為4%甲醛溶液來終止。內(nèi)源過氧化物活性通過與淬滅緩沖液(100μl,含0.1%疊氮化鈉、1%h2o2的pbs，含0.05%tween-20)一起孵育20分鐘中和。細胞用洗滌緩沖液(200μl;含0.05%tween-20的pbs)洗滌，與封閉溶液(200μl;含5%牛奶的pbs)一起孵育1小時，用洗滌緩沖液(200μl)再洗滌，然后與在1%bsa/pbs中的抗-β-聯(lián)蛋白抗體溶液(50μl)(bd,oxford,uk)一起孵育過夜。

用洗滌緩沖液(3x200μl;含0.05%tween-20的pbs)洗滌后，將細胞與含hrp-綴合的第二抗體溶液(100μl)的1%bsa/pbs(dako,cambridge,uk)一起孵育，得到的信號使用tmb底物(50μl;r&dsystems,abingdon,uk)比色測定(od:450nm與參比波長655nm)。該反應(yīng)通過加入1nh2so4溶液(50μl)終止。然后用洗滌緩沖液洗滌細胞，加入2%結(jié)晶紫溶液(50μl)達30分鐘。用洗滌緩沖液(3x200μl)洗滌后，向各孔加入1%sds(100μl)，將板輕輕搖動1小時，然后測量595nm的吸光度(varioskan?flash,thermo-fisherscientific)。

測量的od450-655讀數(shù)通過將od450-655除以od595讀數(shù)對細胞數(shù)進行校正。相對于溶媒計算各孔的誘導(dǎo)百分比，并且將誘導(dǎo)比率與通過包含作為整體定義的參比化合物n-(4-(4-(3-(3-叔丁基-1-對甲苯基-1h-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基氧基)吡啶-2-基)-2-甲氧基乙酰胺(1μg/ml)的標準對照產(chǎn)生的誘導(dǎo)相比進行標準化。

(n)t細胞增殖

來自健康受試者的pbmc使用密度梯度(lymphoprep,axis-shieldhealthcare)從全血分離。按照制造商的說明書(miltenyibiotec130-091-155)，淋巴細胞級分首先針對cd4+t細胞通過負磁細胞分選進行富集。然后按照制造商的說明書(130-045-901)，幼稚cd4+t細胞使用正磁篩選cd45ra+細胞，使用微珠進行分離。將細胞以2x10⁵個細胞/孔在100μlrpmi/10%fbs中置于96孔平底板(corningcostar)中，將25μl的試驗化合物在正常培養(yǎng)基中稀釋至合適的濃度(8x終濃度)和加入至板上的一式兩份的孔中，得到0.03ng/ml–250ng/ml的劑量反應(yīng)范圍。加入dmso作為陰性對照。將板預(yù)孵育2小時，然后用1μg/ml抗-cd3(okt3;ebioscience)刺激。72小時后，各孔中的培養(yǎng)基用150μl含10μmbrdu(roche)的新鮮的培養(yǎng)基置換。16小時后，除去上清液，將板干燥，并且按照制造商的說明書(roche)，通過向各孔中加入100μl的固定/變性溶液達20分鐘使細胞固定。用pbs將板洗滌一次，然后加入抗-brdu檢測抗體和在室溫下孵育90分鐘。然后用提供的洗滌緩沖液將板輕輕洗滌3次，通過加入100μl的底物溶液顯色。反應(yīng)通過加入50μl的1mh2so4終止，和在讀板儀(varioskan^?flash,thermofisherscientific)上讀出450nm的吸光度。ic50從劑量反應(yīng)曲線測定。

(o)在來自ibd患者的cd3/cd28刺激的lpmc細胞中il-2和ifnγ釋放

固有層單核細胞(lpmc)從手術(shù)樣本的發(fā)炎的ibd粘膜或從手術(shù)樣本的正常粘膜如下分離和純化：

粘膜用解剖刀從手術(shù)樣本的較深層移出，切成大小3-4mm的碎片。通過用含1mmedta(sigma-aldrich,poole,uk)的hbss(sigma-aldrich)洗滌組織碎片三次同時使用磁力攪拌器攪拌而除去上皮，每次洗滌后棄去上清液。接著在37℃用1a型膠原酶(1mg/ml;sigma-aldrich)處理樣品1小時，同時攪拌。然后使用100μm細胞過濾器將得到的細胞混懸液過濾，洗滌兩次，再懸浮于含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的rpmi-1640培養(yǎng)基(sigma-aldrich)，和用于細胞培養(yǎng)。

在dmso對照或合適濃度的化合物的存在下，新分離的lpmc(2x10⁵個細胞/孔)用1μg/mlα-cd3/α-cd28刺激48小時。48小時后，除去上清液和通過r&delisa測定tnfα和ifnγ的存在。相對于對dmso對照(100%)測定的細胞因子釋放，計算試驗化合物對細胞因子釋放的抑制百分比。

(p)自ibd患者分離的成肌纖維細胞的細胞因子釋放的抑制

來自發(fā)炎的ibd粘膜的成肌纖維細胞如下分離：

將粘膜切下和棄去，將1mm大小的粘膜樣品在37℃在潮濕的co2孵育箱中在添加20%fbs、1%非必需氨基酸(invitrogen,paisley,uk)、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、50μg/ml慶大霉素和1μg/ml兩性霉素(sigma-aldrich)的dulbecco’s改良的eagle’s培養(yǎng)基(dmem,sigma-aldrich)中培養(yǎng)。將建立的成肌纖維細胞集落接種在25-cm²培養(yǎng)燒瓶中，在添加20%fbs和抗生素的dmem中培養(yǎng)至至少第4代，以提供足夠數(shù)量用于刺激實驗。

以3x10⁵個細胞/孔接種在12孔板中的亞匯合的單層成肌纖維細胞在無血清培養(yǎng)基中在37℃,5%co2中饑餓24h，然后在dmso對照或合適濃度的化合物的存在下培養(yǎng)24h。24小時后，除去上清液和通過r&delisa測定il-8和il-6的存在。相對于對dmso對照(100%)測定的細胞因子釋放，計算試驗化合物對細胞因子釋放的抑制百分比。

(q)人嗜中性粒細胞脫粒

嗜中性粒細胞自人外周血如下分離：

通過靜脈刺穿收集血液，并通過加入1:1edta:無菌磷酸鹽緩沖鹽水(pbs,無ca+/mg+)而抗凝固。加入葡聚糖(3%w/v)(1份葡聚糖溶液對4份血液)，在室溫下將血液放置約20分鐘。上清液在密度梯度(lymphoprep,axis-shieldhealthcare)上小心分層和離心(15分鐘，2000rpm,無制動)。吸出上清液，將細胞沉淀再懸浮于無菌鹽水(0.2%)中不超過60秒(以裂解污染的紅細胞)。然后加入10倍體積的pbs，將細胞離心(5分鐘,1200rpm)。將細胞再懸浮于hbss+(含細胞松弛素b(5μg/ml)和1mmcacl2的hanks緩沖鹽溶液(無酚紅))，獲得5x10⁶個細胞/ml。

向v-底96孔板的各孔中加入5x10⁴個細胞并與合適濃度的試驗化合物(0.3–1000ng/ml)或溶媒(dmso,0.5%終濃度)一起孵育(30分鐘,37℃)。通過加入fmlp(終濃度1μm)刺激脫粒。進一步孵育(30分鐘,37℃)后，通過離心(5分鐘,1500rpm)除去細胞，將上清液轉(zhuǎn)移至平底96孔板。加入等體積的四甲基聯(lián)苯胺(tmb)，10分鐘后，通過加入等體積的硫酸(0.5m)終止反應(yīng)，讀出450nm的吸光度(減去655nm的背景)。50%抑制濃度(ic50)從得到的濃度反應(yīng)曲線測定。

(r)細胞毒性測定法

將1×10⁵個jurkat細胞(永生化的人t淋巴細胞)在100μl培養(yǎng)基(補充有10%胎牛血清的rpmi)中加入96孔板的合適數(shù)量的孔中。向孔中加入1μl的dmso對照(終濃度1.0%v/v)或試驗化合物(終濃度20、5或1μg/ml)，并在37℃,5%co2孵育。24小時后，將板以1200rpm離心3分鐘，棄去上清液。然后將細胞重懸浮于150μl(終濃度7.5μg/ml)的碘化丙啶(pi)/pbs，并在37℃,5%co2孵育15分鐘。15分鐘后，通過流式細胞術(shù)(bdaccuri)使用fl3窗分析細胞。%存活力計算為標準化至dmso對照的在測試孔中pi陰性的細胞的%。

體內(nèi)篩選：藥效學(xué)和抗炎活性

在小鼠中l(wèi)ps誘導(dǎo)的嗜中性粒細胞積聚

向未禁食的balb/c小鼠通過氣管內(nèi)途徑以指定的次數(shù)(在2-8小時范圍內(nèi))給予溶媒或試驗物質(zhì)，然后通過施用lps攻擊刺激炎性反應(yīng)。在t=0時，將小鼠置于暴露室中，暴露于lps(7.0ml,0.5mg/ml溶液，在pbs中)30分鐘。另外8小時后，將動物麻醉，將它們的氣管插管，通過灌注提取balf，然后從它們的肺中經(jīng)過氣管導(dǎo)管抽出1.0ml的pbs。在balf樣品中的總白細胞計數(shù)和白細胞分類計數(shù)使用neubauer血球計測量。balf樣品的細胞離心涂片通過在室溫下以200rpm離心5分鐘制備，并使用diffquik染色系統(tǒng)(dadebehring)染色。使用油浸顯微鏡將細胞計數(shù)。bal中的嗜中性粒細胞數(shù)的數(shù)據(jù)表示為平均值±s.e.m.(平均值的標準誤差)。相對于溶媒處理，計算各處理的嗜中性粒細胞積聚的抑制百分比。

(ii)香煙煙霧模型

使用用于小動物的tobaccosmokeinhalationexperimentsystem(modelsis-cs;sibatascientifictechnology,tokyo,japan)，將a/j小鼠(雄性,5周齡)暴露于香煙煙霧(4%香煙煙霧，用空氣稀釋)30分鐘/天達11天。在最后的香煙煙霧暴露后，將試驗物質(zhì)經(jīng)鼻內(nèi)給予(35μl的溶液，在50%dmso/pbs中)每天一次達3天。最后給藥后12小時，將各動物麻醉，將氣管插管，收集支氣管肺泡灌洗液(balf)。使用抗-小鼠moma2抗體(巨噬細胞)或抗-小鼠7/4抗體(嗜中性粒細胞)，肺泡巨噬細胞和嗜中性粒細胞的數(shù)量通過facs分析(epics^?altraii,beckmancoulter,inc.,fullerton,ca,usa)測定。

(iii)小鼠中dss誘導(dǎo)的結(jié)腸炎

通過用葡聚糖硫酸鈉(dss)處理刺激炎性反應(yīng)前一天(第-1天)，通過口服強飼向未禁食的10-12周齡、雄性bdf1小鼠每日兩次給予溶媒、參考物(5-asa)或試驗化合物。在研究的第0天，在飲用水中給予dss(5%w/v)，接著bid給予溶媒(5ml/kg)、參考(100mg/kg)或試驗化合物(5mg/kg)達7天。含dss的飲用水每3天裝滿一次。在研究期間，每天對動物稱重，進行糞便觀察和基于糞便稠度記錄作為評分。在第+6天處死時，移出大腸，記錄長度和重量。將結(jié)腸切片用于mpo分析以測定嗜中性粒細胞浸潤，或用于組織病理學(xué)評分以確定疾病嚴重性。

(iv)小鼠中tnbs誘導(dǎo)的結(jié)腸炎

通過用2,4,6-三硝基苯磺酸(tnbs)(15mg/ml，在50%乙醇/50%鹽水中)處理刺激炎性反應(yīng)前一天(第-1天)，通過口服強飼向未禁食的10-12周齡、雄性bdf1小鼠每日兩次給予溶媒(5ml/kg)、參考物(布地奈德2.5mg/kg)或試驗化合物(1或5mg/kg)。在研究的第0天，通過塑料導(dǎo)管結(jié)腸內(nèi)給予tnbs(200μl)，bid給予溶媒、參考或試驗化合物持續(xù)2或4天。在研究期間，每天對動物稱重，進行糞便觀察和基于糞便稠度記錄作為評分。在第2天(或第4天)處死時，移出大腸，和記錄長度和重量。將結(jié)腸切片用于組織病理學(xué)評分以確定疾病嚴重性。

(v)小鼠中的過繼轉(zhuǎn)移

在研究第0天，處死雌性balb/c小鼠，獲得脾用于cd45rb^高細胞分離(使用scidibd細胞分離方案)。然后將大約4x10⁵個細胞/mlcd45rb^高細胞經(jīng)腹膜內(nèi)注射(100μl/小鼠)到雌性scid動物。在研究第14天，對小鼠稱重，和基于體重隨機分成治療組。在第14天，化合物以5ml/kg的劑量體積，通過口服強飼bid給予。繼續(xù)治療直到研究第42天，在該點在早晨給予后4小時將動物尸檢。記錄結(jié)腸長度和重量，并用作研究的第二終點，作為結(jié)腸水腫的測量。然后將結(jié)腸分成六個橫切片，其中四個用于組織病理學(xué)評分(第一終點)，兩個經(jīng)勻漿用于細胞因子分析。顯示的數(shù)據(jù)是在首次用于實驗的動物和溶媒動物之間的誘導(dǎo)窗的%抑制，其中越高的抑制意味著越接近于無疾病的首次用于實驗的表型。

(vi)在大鼠中內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎

將雄性lewis大鼠(6-8周齡,charlesriveruklimited)在3個籠中在19-21℃以12小時光/暗周期(07:00/19:00)飼養(yǎng)，飼喂標準的嚙齒動物飼料和隨意飲用水。對未禁食的大鼠稱重，分別在尾部用永久標記鑒別，并接受單次玻璃體內(nèi)給予100ng/動物的lps(大腸桿菌0111:b4，在pbs中制備,sigmaaldrich,uk)至右玻璃體液(5μl劑量體積)，使用32-規(guī)針頭。未治療的大鼠用pbs注射。在lps前1小時，在lps給予時，以及l(fā)ps給予后1、2和4小時，將試驗化合物或溶媒(4%聚乙二醇40硬脂酸酯、4%甘露醇/pbs(ph7.4))通過局部途徑給予到動物的右眼上(10μl)。給予前，將待給予的溶液超聲處理以確保澄清溶液。在lps給藥后6小時，通過過量給予戊巴比妥(經(jīng)過心臟穿刺)將動物安樂死。安樂死后立刻在手術(shù)顯微鏡下通過使用32規(guī)針頭，穿刺前房從大鼠的右眼收集10μl的房水。房水在20μl的pbs中稀釋，立即使用countess自動化細胞計數(shù)器(invitrogen)測量總細胞計數(shù)。在房水收集后，將各動物的右眼摘出，圍繞晶狀體切成前和后切片。將各切片稱重和在500μl無菌磷酸鹽緩沖鹽水中勻漿，接著以12000rpm在4℃離心20分鐘。將得到的上清液分成3個等份和貯藏在-80℃直到隨后通過r&dduosetelisa進行細胞因子分析。

體外和體內(nèi)篩選結(jié)果概述

表1：使用kinomescan^tm技術(shù)，通過leadhunterdiscoverservices(discoverxcorporation,fremont,ca)測定的對于選擇的激酶的離解常數(shù)。

使用kinomescan^tm技術(shù)，通過leadhunterdiscoverservices(discoverxcorporation,fremont,ca)進行的研究確定了實施例1的化合物對激酶b-raf和b-raf(v600e)與它們的標準配體的結(jié)合不具有任何顯著影響。此外，與參比化合物n-(4-(4-(3-(3-叔丁基-1-對甲苯基-1h-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基氧基)吡啶-2-基)-2-甲氧基乙酰胺(wo2010/112936)相比，該化合物顯示改進的選擇性，如通過較低的選擇性評分證明的(表1a)。

表1a：50和500nm的kinomescan選擇性評分數(shù)據(jù)；s(35)=(%ctrl<35的無突變激酶數(shù))/(測試的無突變激酶數(shù))；s(10)=(%ctrl<10的無突變激酶數(shù))/(測試的無突變激酶數(shù))；s(1)=(%ctrl<1的無突變激酶數(shù))/(測試的無突變激酶數(shù))

表1b：來自體外p38mapkα(方法2)、c-src、syk和gsk3α(方法2)抑制測定法的結(jié)果

表2：在受刺激的細胞中細胞因子釋放的抑制(上文測定法(b)、(c)和(d))。

如下表3中所示，在上文測量對pbmc的細胞分裂(有絲分裂)的影響的測定法(g)中，本發(fā)明的實施例的化合物比參比化合物(n-(4-(4-(3-(3-叔丁基-1-對甲苯基-1h-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基氧基)吡啶-2-基)-2-甲氧基乙酰胺;wo2010/112936)具有顯著更低的活性。類似地，本發(fā)明的實施例的化合物具有比參比化合物顯著更低的細胞毒性，顯示了在上文細胞毒性測定法(r)中提高的成活力(表3)。

表3：本發(fā)明的化合物對pbmc的細胞分裂(nt=未測試)和對jurkat細胞成活力的影響

^a參見例如，wo2013/050757中報告的值。

如下表4所示，實施例1的化合物顯著地和劑量依賴性地減少細胞侵潤，如通過降低的細胞計數(shù)和在用玻璃體內(nèi)的內(nèi)毒素lps處理的大鼠眼睛的前段和后段兩者中細胞因子il-1β水平顯示的(見上文測定法(vi))。

表4：實施例1的化合物對在lps刺激的大鼠的眼睛中il-1β水平和細胞計數(shù)的劑量依賴性影響。數(shù)據(jù)報告為均值±sem。

另外的研究概述

禁食狀態(tài)模擬的結(jié)腸液(fasscof)中溶解性的測定

本發(fā)明的化合物在ph6.5的fasscof中的溶解性使用之前報道的方法的改進測定(vertzoni,m.等pharm.res.2010,27,2187–2196)。代替在原始方法中使用的膽汁鹽提取物(所述提取物不再可用)，改進的方法使用?；悄懰徕c(0.15g)、甘膽酸(0.15g)、熊脫氧膽酸(0.05g)、膽酸(0.05g)和甘脫氧膽酸(0.05g)的混合物。這五種膽汁酸用研缽和研杵在一起研磨，以產(chǎn)生白色細粉，如下所述將其摻入fasscof。

fasscof介質(zhì)：將三(羥基甲基)氨基甲烷(tris;0.275g)和馬來酸(0.44g)溶于水(35ml)，得到溶液，其ph通過用0.5mnaoh(約12ml)處理調(diào)整至6.5。然后溶液用水補足至50ml。將該tris/馬來酸鹽緩沖溶液的一部分(約25ml)加入0.5l圓底燒瓶，然后用0.00565g的上述膽汁酸混合物處理。加入磷脂酰膽堿(0.0111g)在dcm(0.15ml)中的溶液和棕櫚酸(0.0013g)在dcm(0.15ml)中的溶液，然后在減壓下在40℃蒸發(fā)有機溶劑，直到實現(xiàn)澄清溶液，沒有可感知的dcm氣味。通過加入tris/馬來酸鹽緩沖液的剩余部分將蒸發(fā)溶液的體積調(diào)整至50ml，然后加入bsa(0.115g)，然后通過輕輕攪拌溶解。

溶解度測定：將試驗化合物懸浮于ph6.5fasscof介質(zhì)中，以得到2–10mg/ml的最大終濃度。將懸浮液在25℃下平衡24h，然后通過玻璃纖維c濾器過濾。然后將濾液適當(dāng)稀釋，用于注入，并參照標準品通過hplc定量。將不同體積的標準品、稀釋和未稀釋的樣品溶液注入，并使用通過在與標準品注入的主峰相同的保留時間下存在的峰的積分確定的峰面積，計算溶解度。

fasscof溶解度顯示在下表5中，其表明實施例化合物顯示在ph6.5的fasscof介質(zhì)中超過0.01mg/ml的溶解度。對于本發(fā)明的實施例的化合物，ph6.5fasscof溶解度優(yōu)于參比化合物a，3-((4-((4-(3-(3-(叔丁基)-1-(對甲苯基)-1h-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基)氧基)嘧啶-2-基)氨基)-5-乙炔基-n-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺{fyfe,m.c.t.,wo2014/140582}的溶解度。

表5：對本發(fā)明的實施例的化合物在ph6.5的fasscof中測量的溶解度。

藥代動力學(xué)參數(shù)測定

由sailifesciences(hinjewadi,pune,india)進行研究以調(diào)查本發(fā)明的化合物的系統(tǒng)藥代動力學(xué)和總結(jié)腸組織分布。具體而言，在單次口服給予化合物后，在雄性c57bl/6小鼠中進行藥代動力學(xué)研究。

表6中錄入的數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明的化合物達到顯著的結(jié)腸濃度，而相比之下，系統(tǒng)血漿或血液暴露極低或可忽略。

表6：以5mg/kg口服給予小鼠本發(fā)明的化合物后獲得的平均血漿或血液濃度(ng/ml)或總結(jié)腸水平(ng/g)。溶媒=在水中制備的0.1%tween80/0.5%甲基纖維素溶液。

表6的略語表

d=給予(給藥)的化合物

m=測量的化合物

mx=基質(zhì)

pl=血漿

bd=血液

tc=總結(jié)腸

herg抑制研究

在essenbioscience(welwyngardencity,england)使用ionworks^tm膜片鉗電生理學(xué)測試本發(fā)明的化合物對humanetherago-go(herg)通道的抑制。

表7：本發(fā)明的化合物的herg抑制數(shù)據(jù)

急性眼刺激/侵蝕研究

急性眼刺激/侵蝕研究的目的是，在白化病新西蘭白兔(開始給藥時13–15周齡；2雄性和2雌性/給藥組)的眼睛中，通過眼途徑(雙側(cè)滴注40μl/眼/滴注)，以每日四次給藥(4小時間隔)，在一個治療日(階段1)或三個連續(xù)治療日(階段2)后，與溶媒(4%w/v聚氧乙烯40硬脂酸酯/4%w/v甘露醇/磷酸鹽緩沖液(ph7.4)溶液)相比，評價兩個選擇的給藥水平(0.1和1.0mg/ml)的實施例1的化合物的可能的刺激或侵蝕潛力。

在研究期間，沒有計劃外的死亡，也沒有試驗物相關(guān)的臨床跡象。此外，對體重沒有影響，對食物消耗也沒有影響。

在階段1中，在滴注溶媒或任何給藥水平的試驗物實施例1制劑后，在所有組中眼睛反應(yīng)主要限于結(jié)膜發(fā)紅(1或2級)和偶然結(jié)膜水腫(1級)和分泌物(discharge)(1級)。這些評分為輕度至中度。在實施例1治療的動物和溶媒對照之間不存在頻率、嚴重性和發(fā)生率方面的差異。結(jié)膜發(fā)紅是最常見的反應(yīng)，并且在開始給藥前仍存在(1級)。在眼睛研究期間已知該局部反應(yīng)自發(fā)發(fā)生在白化病兔中，和涉及動物經(jīng)歷的多種眼睛檢查。在第一次滴注后和之后3天觀察期內(nèi)在所有組中偶然觀察到結(jié)膜水腫和分泌物。此外，在兩個高劑量組兔(1mg/ml)和一個溶媒組雌性的眼睛中偶然和單側(cè)觀察到虹膜充血。在單次治療日后draize檢查證實了角膜的完整性，并且在所有情況下對所有動物而言光動反射是正常的。簡言之，因此認為在單次給藥日后，制劑的局部耐受性是可接受的。在滴注溶媒或包含實施例1的化合物的制劑后觀察到類似的局部反應(yīng)，指示對眼睛耐受的中等的溶媒相關(guān)作用。

在階段2中，在所有組中在滴注溶媒或任何劑量水平的試驗物制劑后，主要眼睛反應(yīng)限于結(jié)膜發(fā)紅(1級)。該評分是輕度的，并且在整個3天治療期間在各組之間在發(fā)生率和頻率方面，觀察到?jīng)]有任何有效差異。在溶媒組中嚴重性(2級)偶然高于試驗物治療組。這種結(jié)膜發(fā)紅是持續(xù)的，在次日的第一次滴注前仍被觀察到。此外，在兩個高劑量組兔和一個溶媒組雌性的眼睛中偶然觀察到虹膜充血。在所有情況下在任何動物中沒有觀察到分泌物。在3天治療期間draize檢查證實了角膜的完整性。在所有情況下對于所有動物而言，光動反射是正常的。簡言之，因此認為制劑的局部耐受性是可接受的，對于3個治療日沒有任何惡化。在僅滴注溶媒或滴注包含實施例1的化合物的制劑后，觀察到類似的局部反應(yīng)，指示對眼睛耐受的中等的溶媒相關(guān)作用。

誘變性評價(細菌逆突變篩選)

由sequani(ledbury,herefordshire,uk)進行研究以體外評價實施例1的化合物在鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)的4個組氨酸依賴性營養(yǎng)缺陷型突變體，菌株ta1535、ta1537、ta98和ta100以及大腸桿菌(escherichiacoli)的1個色氨酸依賴性營養(yǎng)缺陷型突變體wp2uvra中誘導(dǎo)突變的能力。

使用板摻入方法進行突變篩選，并且在s-9mix(源自aroclor1254處理的大鼠的肝臟的肝線粒體后部分)的存在和不存在下進行。將細菌暴露于溶于二甲基亞砜的實施例1的化合物，所述溶劑也用作陰性對照。陽性對照化學(xué)品是在不存在s-9mix時的疊氮化鈉(ta1535和ta100)、9-氨基吖啶(ta1537)、2-硝基芴(ta98)和4-硝基喹啉-n-氧化物(wp2uvra)和在存在s-9mix時的2-氨基蒽(所有菌株)。

在s-9mix的存在和不存在下，在所有菌株中，在板摻入條件下用于突變試驗的實施例1的化合物的劑量是15、50、150、500或1500μg/板。

在板摻入條件下在所有菌株中在s-9mix的存在和不存在下，分析實施例1的化合物，直至1500μg/板的溶解度的限制。

在ta1537和ta98中在s-9mix的存在下以500μg/板，和在所有菌株中在s-9mix的存在和不存在下以1500μg/板，觀察到沉淀。在s-9mix的存在下，在ta98中在500μg/板和1500μg/板時，和在ta1535中在1500μg/板時，平均菌落計數(shù)也有減少，指示試驗物對細菌的毒性。

在板摻入條件下在s-9mix的存在和不存在下，以任何劑量水平的實施例1的化合物，在任何菌株中觀察到的逆轉(zhuǎn)株數(shù)量沒有劑量相關(guān)或統(tǒng)計學(xué)顯著的增加。這表明在試驗條件下對于實施例1的化合物，不存在任何誘變作用。

水解穩(wěn)定性研究

可在dmso和水(3:1)的混合物中以1mg/ml的試驗化合物濃度評價本發(fā)明的化合物的化學(xué)穩(wěn)定性。

通用hplc程序

agilent,watersx-selectc18,2.5μm,4.6x30mm柱,4min方法,5-95%mecn/水(0.1%甲酸)。流速2.5ml/min。柱烘箱溫度40℃。檢測254nm。

樣品制備

將試驗化合物的1.0mg樣品溶于750μl的dmso。緩慢加入水(250μl)，確保無沉淀出現(xiàn)。

記錄穩(wěn)定性

取出50μl等份的試驗溶液和通過5μlhplc注射一式兩份分析。根據(jù)相應(yīng)uv跡線的手工積分，記錄試驗化合物的峰面積。

將試驗溶液加熱至60℃，同時攪拌，在5和24h時間點取出50μl等份用于hplc分析。在所有情況下，使用5μl注射，并且樣品以一式兩份分析。

在兩個隨后的時間點記錄試驗化合物的峰面積，根據(jù)峰面積隨時間的%變化計算%分解。

參比化合物b(3-乙炔基-5-((4-((4-(3-(3-異丙基-1-(對甲苯基)-1h-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基)氧基)嘧啶-2-基)氨基)-n-(2-嗎啉代乙基)苯甲酰胺；cariou,c.a.m.等,wo2014/027209)包括在各穩(wěn)定性研究中，作為對照以驗證研究。

藥物制劑的穩(wěn)定性

如下制備20ml1mg/ml的實施例1化合物的鈉(na)和鹽酸(hcl)鹽的儲液，一式兩份：將合適量的各鹽與包含4.5%甘露醇和3%聚乙二醇40硬脂酸酯的10mmph7.2磷酸鹽緩沖液混合。超聲處理樣品，以得到具有以下性質(zhì)的澄清溶液：重量克分子滲透濃度(mosm/kg):310(na),314(hcl);ph:7.00(na),7.05(hcl)。用20%dmso/水將0.5ml的儲液稀釋至1ml，并注入用于通過hplc進行純度分析。然后將剩余的儲液在hplc管中分成0.5ml等份，并在各種條件下一式兩份貯存。將樣品在5和25℃下貯存，然后在1、2和4周時通過hplc進行分析。將單獨的樣品在40℃下儲存，并在4周時進行分析。下表中顯示的分析表明，實施例1的化合物在5℃下在溶液中是穩(wěn)定的。

縮寫

前綴n-、s-、i-、t-和tert-具有其常用含義：正、仲、異和叔。